特開 2024-36617 病原体検出方法およびキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024036617

(43)【公開日】2024-03-15

(54)【発明の名称】病原体検出方法およびキット

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/686 20180101AFI20240308BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALI20240308BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/686 Z

C12Q1/6876 Z

【審査請求】有

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024017293

(22)【出願日】2024-02-07

(62)【分割の表示】P 2020015569の分割

【原出願日】2020-01-31

(71)【出願人】

【識別番号】000001993

【氏名又は名称】株式会社島津製作所

(71)【出願人】

【識別番号】504179255

【氏名又は名称】国立大学法人 東京医科歯科大学

(71)【出願人】

【識別番号】515281156

【氏名又は名称】日本テクノサービス株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】304028726

【氏名又は名称】国立大学法人 大分大学

(71)【出願人】

【識別番号】503359821

【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所

(71)【出願人】

【識別番号】599055382

【氏名又は名称】学校法人東邦大学

(74)【代理人】

【識別番号】100179969

【弁理士】

【氏名又は名称】駒井 慎二

(72)【発明者】

【氏名】四方 正光

(72)【発明者】

【氏名】二宮 健二

(72)【発明者】

【氏名】清水 則夫

(72)【発明者】

【氏名】高瀬 博

(72)【発明者】

【氏名】望月 學

(72)【発明者】

【氏名】外丸 靖浩

(72)【発明者】

【氏名】中野 聡子

(72)【発明者】

【氏名】杉田 直

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 崇

(57)【要約】

【課題】単一の容器の中で組織片に含まれる病原体の核酸分離工程とＰＣＲ緩衝液の調製工程を同時に行う、簡便なＰＣＲ法による分析方法、および該分析方法に用いられるキットを提供すること。
【解決手段】下記（１）から（５）の工程を含む病原体の検出方法。
（１）病原体を含む組織片を、タンパク質分解酵素を含むＰＣＲ緩衝液に添加し検体混合液を得る工程（１）
（２）前記検体混合液を、第１の温度で加熱する工程（２）
（３）さらに第２の温度で加熱する工程（３）
（４）前記工程（３）で得られた液の一部をＤＮＡポリメラーゼおよび１種また
は２種以上のＰＣＲプライマー対を含むＰＣＲ反応用固体組成物に添加し、ＰＣＲを実行する工程（４）
（５）前記工程（４）で生成したＰＣＲ産物を検出する工程（５）
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記（１）から（５）の工程を含む病原体の検出方法。
（１）病原体を含む組織片を、タンパク質分解酵素を含むＰＣＲ緩衝液に添加し検体混合液を得る工程（１）
（２）前記検体混合液を、第１の温度で加熱する工程（２）
（３）さらに第２の温度で加熱する工程（３）
（４）前記工程（３）で得られた液の一部をＤＮＡポリメラーゼおよび１種また
は２種以上のＰＣＲプライマー対を含むＰＣＲ反応用固体組成物に添加し、ＰＣＲを実行する工程（４）
（５）前記工程（４）で生成したＰＣＲ産物を検出する工程（５）

【請求項2】

前記工程（２）の第１の温度が、３７℃以上６０℃以下である請求項１に記載の検出方法。

【請求項3】

前記工程（３）の第２の温度が、９０℃以上９５℃以下である請求項１に記載の検出方法。

【請求項4】

前記組織片が角膜または眼脂である請求項１に記載の検出方法。

【請求項5】

病原体が、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、クラミジア、淋菌およびアカントアメーバからなる群より選ばれる、請求項１に記載の病原体の検出方法。

【請求項6】

前記タンパク質分解酵素がプロテイナーゼＫである請求項１に記載の病原体の検出方法。

【請求項7】

前記工程（５）のＰＣＲ産物の測定がリアルタイムＰＣＲで行われる請求項１に記載の病原体の検出方法。

【請求項8】

下記（１）および（２）を含む病原体の検出用キット。
（１）タンパク質分解酵素を含むＰＣＲ緩衝液を備えた検体採取容器
（２）ＤＮＡポリメラーゼおよび１種または２種以上のＰＣＲプライマー対を含むＰＣＲ反応用固体組成物を備えた少なくとも１以上のＰＣＲ反応容器

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、組織片中に存在する病原体の検出方法に関する。また本発明は病原体の検出に用いるキットに関する。

【背景技術】

【0002】

病原体の増幅および検出に関する技術には、様々な方法が用いられている。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと称する場合がある）を利用するＰＣＲ法の他、転写-逆転写協奏反応（以下、ＴＲＣと称する場合がある）法、転写媒介性増幅（以下、ＴＭＡと称する場合がある）法、核酸配列ベース増幅（以下、ＮＡＳＢＡと称する場合がある）法、ループ媒介性等温増幅（以下、ＬＡＭＰと称する場合がある）法、スマート増幅プロセス（以下、ＳＭＡＰと称する場合がある）法、等温キメラプライマー開始核酸増幅（以下、ＩＣＡＮと称する場合がある）法などが知られている。

【0003】

なかでもＰＣＲ法は、特定のＤＮＡ断片だけを選択的に増幅させることができること、極めて微量な検体溶液でも実施が可能なこと、増幅に要する時間が比較的短いこと、および、プロセスが単純で、例えば全自動の卓上用装置で増幅できること、等の利点から、広く研究や臨床に応用されている方法である。

【0004】

例えば、ぶどう膜炎の診断においても、ＰＣＲ法が活用されている。ぶどう膜炎は眼内に炎症を起こす疾患の総称であり、重症例では、高率に失明などの視覚障害を引き起こす。しかし、感染性ぶどう膜炎と非感染性ぶどう膜炎との鑑別は、臨床所見のみでは困難である場合があり、診断の遅れまたは不適切な治療により症状が重篤化する症例が存在する。

【0005】

感染性ぶどう膜炎の原因となる病原体としては、ウイルス、細菌、真菌、原虫などが挙げられるが、ウイルスを原因とする感染性ぶどう膜炎の発症頻度が最も高い。これらの病原体を個別に検出するために、微量でかつ迅速なＰＣＲ法が利用されている。

【0006】

被験者から採取した生体試料中の病原体の有無や遺伝子型の検出をＰＣＲ法により行う際に用いられる、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、プローブを同一容器に収容したキットが知られている（例えば、特許文献１）。このようなキットを用いることで、生体試料から精製した核酸を当該容器に分注することで簡便かつ迅速にＰＣＲ法を行うことができる。

【0007】

しかしながら、被験者から採取した生体試料には酵素反応を阻害する物質が多量に存在している。この酵素反応を阻害する物質はＰＣＲを阻害するため、事前に酵素反応を阻害する物質を除く必要がある。ＰＣＲ法により病原体の検出を行うためには、生体試料中の酵素反応を阻害する物質を除いたり、生体試料中のＤＮＡを精製したりする前処理が必要であった。

【0008】

上記前処理を行う煩雑さを低減させ、生体試料の前処理なしでもＰＣＲが阻害されず、ＰＣＲ法により病原体の検出を可能とする技術として、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（登録商標）技術も知られている（例えば、非特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】特許第６０８２１４１号公報

【非特許文献1】Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３７，６７４－６８０ （２０００）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

上記方法は通常、病原体が血液や体液等、液体中に存在する場合に適用される。一方、角膜炎のように角膜のような組織片中に病原体が存在している場合、検体試料は組織片と一緒に採取される。したがって、組織片中の病原体をＰＣＲ法により分析するためには、まず組織片から病原体の核酸を分離する必要がある。

【0011】

組織片から病原体の核酸を分離する方法として、組織片の主成分はタンパク質であることからタンパク質を分解するタンパク質分解酵素、たとえばプロテイナーゼＫを含む緩衝液に組織片を添加し、組織片のタンパク質を消化する方法が知られている。しかしながらタンパク質分解酵素はタンパク質を分解すると同時にＤＮＡポリメラーゼも分解するため、タンパク質分解酵素とＤＮＡポリメラーゼとを共存させることはできない。またＰＣＲを実施する前にタンパク質分解酵素を失活させる必要があるが、ＤＮＡポリメラーゼが共存しているとＤＮＡポリメラーゼも失活してしまう可能性がある。

【0012】

したがってタンパク質分解酵素とＤＮＡポリメラーゼとは別々の反応器に入れておく必要があり、上記の方法のようにＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ緩衝液に直接検体試料である組織片を添加しＰＣＲ法による病原体の核酸の分析を行うことはできない。

【0013】

また、組織片をタンパク質分解酵素で分解して病原体の核酸を分離し、その後タンパク質分解酵素を失活させ、失活させた緩衝液を、ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ緩衝液に添加するが、タンパク質分解酵素を含む緩衝液とＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ緩衝液とは組成が異なるため、添加後のＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ緩衝液の組成に変化が生じ、後のＰＣＲが上手く進行しない場合がある。
そのため、ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ緩衝液への添加量は限られ、病原体の核酸量を増やすためには、検体試料として使用する試験片の量を増やしたりする必要がある。

【0014】

本発明の目的は、組織片から病原体の核酸を分離するために使用するタンパク質分解酵素を含む緩衝液と、ＰＣＲ緩衝液を別々にせず共通化し（ＰＣＲ緩衝液にタンパク質分解酵素を入れる）、単一の容器の中で組織片中の病原体の核酸分離工程とＰＣＲ緩衝液の調製工程を同時に行うことで、簡便にＰＣＲ法により組織片に含まれる病原体の核酸を簡便に分析する分析方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0015】

すなわち、本発明は、下記（１）から（５）の工程を含む病原体の検出方法に関する。
（１）病原体を含む組織片を、タンパク質分解酵素を含むＰＣＲ緩衝液に添加し検体混合液を得る工程（１）
（２）前記検体混合液を、第１の温度で加熱する工程（２）
（３）さらに第２の温度で加熱する工程（３）
（４）前記工程（３）で得られた液の一部をＤＮＡポリメラーゼおよび１種また
は２種以上のＰＣＲプライマー対を含むＰＣＲ反応用固体組成物に添加し、ＰＣＲを実行する工程（４）
（５）前記工程（４）で生成したＰＣＲ産物を検出する工程（５）

【発明の効果】

【0016】

本発明によれば、単一の容器の中で組織片に含まれる病原体の核酸分離工程とＰＣＲ緩衝液の調製工程を同時に行う、簡便なＰＣＲ法による分析方法、および該分析方法に用いられるキットを提供することができる。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明の方法は病原体を含む組織片に適用される。組織片とは、角膜または眼脂である。

【0018】

また病原体とは、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、クラミジア、淋菌およびアカントアメーバからなる群より選ばれる。

【0019】

上記病原体を含む組織片を綿棒等で擦り採り、擦り採った病原体を含む組織片をＰＣＲ緩衝液およびタンパク質分解酵素を含む液（以下、前処理溶液と称する場合がある、ＤＮＡポリメラーゼは含まない）へ添加する（以下、工程（１）と称する場合がある）。病原体を含む組織片が付着した綿棒等を上記前処理用液内へ浸すことにより、病原体を含む組織片を前処理溶液に添加することができる。

【0020】

ＰＣＲ緩衝液の組成は、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２およびｄＮＴＰミックス（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰからなる混合物）を含むトリス緩衝液である。
ＫＣｌの濃度範囲は好ましくは３５～７５ｍＭ、より好ましくは約５０ｍＭ程度である。ＭｇＣｌ２の濃度範囲は好ましくは１～４ｍＭ、より好ましくは約１．５ｍＭ程度である。ｄＮＴＰミックスに含まれるｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰの濃度範囲はそれぞれ、好ましくは５０～５００μＭであり、より好ましくは約２００μＭである。

【0021】

病原体を含む組織片の添加量は好ましくは０．５ｍｇ～５ｍｇであり、より好ましくは０．５ｍｇ～３ｍｇであり、さらに好ましくは約１ｍｇ程度である。

【0022】

上記工程（１）により得られた検体混合液を第１の温度で加熱する（以下工程（２）と称する場合がある）。第１の温度で加熱することによりタンパク質分解酵素によりタンパク質が分解される。タンパク質を効率的に分解する観点から第１の温度は ３７℃以上 ６０℃以下が好ましい。

【0023】

工程（２）は、組織片のタンパク質がほぼ完全に分解するまで行えばよく、例えば、３０分から６０分程度が好ましい。

【0024】

工程（２）の後、上記第１の温度で加熱された液を、さらに第２の温度で加熱する（以下、工程（３）と称する場合がある）。第２の温度で加熱することによりタンパク質分解酵素が失活する。タンパク質分解酵素を効率的に失活する観点から第２の温度は ９０℃以上 ９５℃以下が好ましい。

【0025】

工程（３）は、タンパク質分解酵素がほぼ完全に失活するまで行えばよく、例えば、５分から１０分程度が好ましい。

【0026】

工程（３）で第２の温度で加熱された液の一部は、別途用意されたＤＮＡポリメラーゼおよび１種または２種以上のＰＣＲプライマー対を含むＰＣＲ反応用固体組成物に添加され、ＰＣＲ反応が実行される（以下、工程（４）と称する場合がある）。

【0027】

上記工程（４）により被検体である病原体のＤＮＡが増幅される。前記ＤＮＡポリメラーゼは、好熱性細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであり、例えば、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、ＫＯＤ、Ｐｆｕおよびこれらの変異体が挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼによる非特異的増幅を避けるという観点から、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼを使用してもよい。ホットスタートＤＮＡポリメラーゼとしては、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体が結合したＤＮＡポリメラーゼまたは酵素活性部位を熱感受性化学修飾したＤＮＡポリメラーゼが挙げられ、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体が結合したＤＮＡポリメラーゼが好ましい。

【0028】

複数の病原体のＤＮＡを同時に検出できるという観点から、１種または２種以上のＰＣＲプライマー対を含むＰＣＲ反応用固体組成物を２以上用意し、前記工程（３）で得られたタンパク質分解酵素を失活した液の一部をそれぞれのＰＣＲ反応用固体組成物に添加する方法が好ましい。例えば前記工程（３）で得られたタンパク質分解酵素を失活した液を、ＰＣＲプライマー対を含む複数のＰＣＲ反応用固体組成物に添加し、ＰＣＲを行うことにより、複数の病原体のＤＮＡを同時に検出することができる。

【0029】

工程（４）で用いられるＰＣＲプライマー対の例として、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、クラミジア、淋菌およびアカントアメーバを検出するためのＰＣＲプライマー対が挙げられる。

【0030】

上記ＰＣＲ反応用固体組成物は２種以上を組み合わせたＰＣＲプライマーを含んでいてもよい。これにより、一つのＰＣＲ反応用個体組成物で２種以上の病原体のＤＮＡを検出することができる。検出の迅速性の観点から、２種以上のＰＣＲプライマー対を組み合わせたＰＣＲ反応用固体組成物を用いることが好ましい。

【0031】

検体量を節約し、複数の病原体のＤＮＡを同時に増幅する方法としてマルチプレックスＰＣＲが提案されている（Sugita S, et al. Br J Ophthalmol. 2008;92:928-932.およびSugita S, et al. Ophthalmology. 2013;120:1761-1768.）。マルチプレックスＰＣＲは、ひとつのＰＣＲ反応系において複数のＰＣＲプライマー対を使用することにより、複数の遺伝子領域を同時に増幅する方法である。この方法では、検体量の節約ができることに加えて、複数の病原体を同時に検出することができるという利点がある。しかしながら、ＰＣＲを実施する前に、検体から核酸を抽出する必要がある。また、マルチプレックスＰＣＲにおいては、それぞれのＰＣＲプライマー対による標的遺伝子領域の増幅が、ひとつのＰＣＲ反応系において良好に進行するように、使用するプライマーの設定および反応条件の検討が必要である。

【0032】

上記工程（４）で用いられるＰＣＲ反応用固体組成物は、通常、凍結乾燥により調製されるが、これら固体組成物に含まれる酵素などの活性が維持される限りにおいて、凍結乾燥に限定されない。固体組成物とすることにより、前記工程（３）で得られたタンパク質分解酵素を失活させた液を添加するだけで、ＰＣＲを開始することができるので、測定操作が簡便なものとなる。また、使用する前の保管も簡易なものとなる。

【0033】

上記工程（４）におけるＰＣＲ反応用固体組成物は、ＰＣＲ増幅産物を蛍光検出するための１種または２種以上の蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含むことが、検出精度の観点から好ましい。ＰＣＲ反応用固体組成物が１種のＰＣＲプライマー対を含む場合には、後述するようなリアルタイム測定するための蛍光色素は１種類でよいが、２種以上のＰＣＲプライマー対を含む場合は、２種以上の異なる蛍光色素が必要となる。この蛍光色素の例としては、６－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（以下、ＦＡＭと称する場合がある）、６－ｃａｒｂｏｘｙ－Ｘ－ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（以下、ＲＯＸと称する場合がある）、Ｃｙａｎｉｎｅ系色素（以下、Ｃｙ５と称する場合がある）および４，７，２’，４’，５’，７’－ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏ－６－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（以下、ＨＥＸと称する場合がある）が挙げられる。オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列は、ＰＣＲ増幅産物の配列データーベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）の塩基配列情報に基づいて適宜、設計することができる。

【0034】

上述したＰＣＲ反応用固体組成物に、工程（３）で得られた第２の温度で加熱された液を添加すると、ＰＣＲ反応用固体組成物が溶解し、サーマルサイクリングを行うことでＰＣＲが進行する。ＰＣＲ条件（温度、時間およびサイクル数）の設定は、想定される病原体のＤＮＡの種類等により、適宜設定される。ＰＣＲが進行し病原体のＤＮＡが工程（３）で得られた第２の温度で加熱された液に入っていれば、後述のＰＣＲ産物を検出する工程で陽性の結果が得られ、疾患の診断や、疾患の発症リスクの判定などが行われる。

【0035】

前記工程（４）の結果生成したＰＣＲ産物を検出する（以下、工程（５）と称する場合がある）。
ＰＣＲ産物を検出する方法は、例えば、アガロースゲルを用いた電気泳動法、熱融解曲線による検出、蛍光検出等の方法が挙げられる。また検出の迅速性の観点からリアルタイム測定と呼ばれる検出方法が好ましい。

【0036】

ＰＣＲ産物のリアルタイム測定は、リアルタイムＰＣＲとも呼ばれる。リアルタイムＰＣＲでは、通常ＰＣＲ増幅産物を蛍光により検出する。蛍光検出方法には、インターカレーター性蛍光色素を用いる方法および蛍光標識プローブを用いる方法がある。インターカレーター性蛍光色素の例は、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉが挙げられる。インターカレーター性蛍光色素は、ＰＣＲによって合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、ＰＣＲ増幅産物の生成量を測定することができる。

【0037】

蛍光標識プローブとしては、加水分解プローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ、サイクリングプローブなどが挙げられる。加水分解プローブは、５'末端が蛍光色素で、また３'末端がクエンチャー物質で修飾されたオリゴヌクレオチドである。加水分解プローブは、ＰＣＲのアニーリングステップで鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制される。その後の伸長反応ステップで、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのもつ５'→３'エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型ＤＮＡにハイブリダイズした加水分解プローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる蛍光の発生の抑制が解除されて蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、増幅産物の生成量を測定することができる。

【0038】

前記蛍光色素の例としては、上述した蛍光色素と同様な蛍光色素が挙げられる。前記クエンチャーの例としては、ＴＡＭＲＡ（登録商標）、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ、登録商標）１、ＢＨＱ２、ＭＧＢ－Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）およびＤＡＢＣＹＬなどが挙げられる。２種以上の標的核酸を区別して検出するためには、それぞれ異なる蛍光色素で標識した２種以上のオリゴヌクレオチドプローブ（例えば加水分解プローブ）を用いてＰＣＲを行うことが、検出精度の観点から好ましい。

【0039】

ＰＣＲ産物のリアルタイム測定の場合、使用する蛍光色素に対応した蛍光フィルターを用いてＰＣＲ産物の増幅曲線をモニターすることで、ＰＣＲの進行状況をリアルタイムで確認することができる。ＰＣＲサイクル数に応じて蛍光強度が増加する場合には、病原体のＤＮＡの存在が陽性であると判定され、一方、ＰＣＲにおいて蛍光強度が増加しない場合は陰性であると判定される。

【0040】

ＰＣＲ法の場合、試薬の入れ間違いなどのヒューマンエラーが生じる可能性が高くなり、誤った検出結果を与えることが指摘されている。ヒューマンエラー以外にも、以前に行った核酸増幅反応の増幅産物が、新たに行う核酸増幅反応の容器内に混入する（コンタミネーション）ことにより、偽陽性等が生じる場合がある。

【0041】

また核酸の増幅および検出を行うとき、実際には陽性であるにもかかわらず、何らかの原因で陰性の結果（偽陰性）が出る場合がある。このような偽陰性の結果は本来検出すべき核酸が検出されていないということから、偽陰性をできるだけ防止する必要がある。

【0042】

上記偽陽性や偽陰性を防止する観点から、本発明の病原体の検出方法において、前記工程（３）で得られた液の一部を、ＤＮＡポリメラーゼ、陽性コントロール核酸およびＰＣＲ反応コントロール核酸を含むＰＣＲコントロール用固体組成物に添加し、ＰＣＲを実行する工程（以下、工程（６）と称する場合がある）、および前記工程（６）で生成したＰＣＲ産物を検出する工程（以下、工程（７）と称する場合がある）をさらに含むことが好ましい。

【0043】

上記工程（６）で用いる陽性コントロール核酸は、被検病原体の定量（絶対定量や相対定量）にも有用である。絶対定量に用いる場合は、例えば、既知濃度の陽性コントロール核酸の測定結果に基づいて検量線を作成することにより、未知濃度の病原体の定量を精度よく行うことができる。また、相対定量に用いる場合は、例えば、一定濃度に達するまでに要するサイクル数を、陽性コントロール核酸と被検病原体の間で比較し、１サイクルで２倍に増幅するＰＣＲ原理に基づいて、相対的な濃度差を算出することもできる。

【0044】

上記陽性コントロール核酸は被検病原体から、予め抽出、増幅させたものでもよいし、別途、異なる生物種から抽出したものでもよい。また陽性コントロール核酸は人工的に合成した核酸であってもよい。

【0045】

上記陽性コントロール核酸は、検体病原体に含まれていると考えられる核酸が好ましく、ハウスキーピング遺伝子が上記効果の観点からより好ましい。
ハウスキーピング遺伝子としては、ＴＡＴＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、ＴＢＰと称する場合がある）遺伝子、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（以下、ＧＡＰＤＨと称する場合がある）遺伝子、β-アクチン遺伝子、β2-マイクログロブリン遺伝子、ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １（以下、ＨＰＲＴ １と称する場合がある）、１８ＳｒＲＮＡ遺伝子、5-ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（以下、ＡＬＡＳと称する場合がある）遺伝子、βグロンビン（β-ｇｌｏｂｉｎ）遺伝子、Ｇｌｕｃｏｓｅ－6－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（以下、Ｇ６ＰＤと称する場合がある）遺伝子、β－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ（以下、ＧＵＳＢと称する場合がある）遺伝子、ｉｍｐｏｒｔｉｎ８（以下、ＩＰＯ８と称する場合がある）遺伝子、ｐｏｒｐｈｏｂｉｌｉｎｏｇｅｎ ｄｅａｍｉｎａｓｅ（以下、ＰＢＧＤと称する場合がある）遺伝子、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｋｉｎａｓｅ １（以下、ＰＧＫ１と称する場合がある）遺伝子、ｐｅｐｔｉｄｙｌｐｒｏｌｙｌ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ Ａ（以下、ＰＰＩＡと）遺伝子、ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ１３ａ（以下、ＲＰＬ１３Ａと称する場合がある）遺伝子、ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌａｒｇｅ Ｐ０（以下、ＲＰＬＰ０と称する場合がある）遺伝子、ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ａ（以下、ＳＤＨＡと称する場合がある）遺伝子、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（以下、ＴＦＲＣと称する場合がある）遺伝子、３－ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ／ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ５－ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ, ｚｅｔａ（以下、ＹＷＨＡＺと称する場合が）遺伝子などが挙げられる。

【0046】

上記工程（６）で用いられるＰＣＲ反応コントロール核酸は、陽性の増幅曲線を示すことで分析が正しく行われた、すなわち、被検病原体が上記ＰＣＲ反応用固体組成物に正しく添加されたことを示す指標となる。
ＰＣＲ反応コントロール核酸は被検病原体から、予め抽出、増幅させたものでもよいし、別途、異なる生物種から抽出したものでもよい。またＰＣＲ反応コントロール核酸は人工的に合成した核酸であってもよい。

【0047】

上記ＰＣＲコントロール核酸は、被検病原体に含まれている核酸が好ましく、ハウスキーピング遺伝子が上記効果の観点からより好ましい。
ハウスキーピング遺伝子としては、上記陽性コントロール核酸と同じ核酸が例示できるが、陽性コントロール核酸とは異なる核酸を用いるのが、被検病原体が正しくＰＣＲ反応用固体組成物に添加されたことを確認するという観点から好ましい。

【0048】

上記工程（６）で用いられるＰＣＲコントロール用固体組成物は上述のＰＣＲ個体組成物と同様に、凍結乾燥により調製されるが、これら固体組成物に含まれる酵素などの活性が維持される限りにおいて、凍結乾燥に限定されない。固体組成物とすることにより、前記工程（３）で得られたタンパク質分解酵素を失活させた液を添加するだけで、ＰＣＲを開始することができるので、測定操作が簡便なものとなる。また、使用する前の保管も簡易なものとなる。

【0049】

上記工程（７）でＰＣＲ産物を検出する方法は、上記工程（５）と同様、例えば、アガロースゲルを用いた電気泳動法、熱融解曲線による検出、蛍光検出等の方法が挙げられる。
また検出の迅速性の観点からリアルタイム測定と呼ばれる検出方法が好ましい。工程（５）と工程（７）のＰＣＲ産物を検出する方法は同じであることが、操作の簡略化から好ましい。

【0050】

たとえば工程（５）、工程（７）ともリアルタイムＰＣＲで行った場合、ＰＣＲサイクル数に応じて上記陽性コントロール核酸の蛍光強度が増加すれば、病原体が間違いなく工程（４）に供されていると判断される。
またＰＣＲサイクル数に応じて上記ＰＣＲ反応コントロール核酸の蛍光強度が増加すれば、病原体が間違いなく工程（４）に供されているとともに、ＤＮＡポリメラーゼおよびＰＣＲプライマー対が正常に働いていると判断できる。したがって、病原体の存在が陰性であるとの判定の信頼性が向上する。

【0051】

検出精度の観点から、陽性コントロール核酸とＰＣＲ反応コントロール核酸の組み合わせとして、ＧＡＰＤＨおよびＴＢＰの組み合わせが好ましい。ＧＡＰＤＨは、ハウスキーピング遺伝子として、多くの組織や細胞中に共通して一定量発現する遺伝子であり、ＰＣＲの進行を確認する陽性コントロールとして使用する。ＴＢＰは、ＴＡＴＡボックスと呼ばれるＤＮＡ配列に結合する基本転写因子であり、細胞数を反映するので、細胞が採取され、検体に含まれることを確認するＰＣＲ反応コントロールとして使用する。

【0052】

上記検出方法を効率的に行うために、本発明はさらに、下記（１）および（２）を含む病原体の検査用キットを提供する。
（１）ＰＣＲ緩衝液およびタンパク質分解酵素を備えた検体採取容器
（２）ＤＮＡポリメラーゼおよび１種または２種以上のＰＣＲプライマー対を含むＰＣＲ反応用固体組成物を備えた少なくとも１以上のＰＣＲ反応容器
上記検査用キットは、ごく少量の検体を採取し、上述した各工程に従って複数の標的核酸を検査する場合に、効率的に検査を行うことを可能とする。

【0053】

本発明の検査用キットはＰＣＲ緩衝液およびタンパク質分解酵素を備えた検体採取容器を含む。含まれるＰＣＲ緩衝液およびタンパク質分解酵素は上記したとおりである。検体検出容器の形状、大きさ等については特に制限はなく、取り扱いが簡便で耐薬品性に優れる材質が好ましい。また視認性に優れる材質が好ましい。取扱性の観点から蓋付の容器が好ましい。

【0054】

上記検体採取容器内に病原体を含む組織片を擦り採った綿棒等を浸漬し、検体採取容器内の液と病原体を含む組織片とを混合することで、検体混合液が得られる。得られた検体混合液を含む検体採取容器は、そのまま第１の温度で加熱され、続いて第２の温度で加温される。

【0055】

本発明の検査用キットは、ＤＮＡポリメラーゼおよび１種または２種以上のＰＣＲプライマー対を含むＰＣＲ反応用固体組成物を備えたＰＣＲ反応容器を少なくとも一つ以上含む。前記検体採取容器で第２の温度で加熱された液の一部を採取し、前記ＰＣＲ反応容器に必要量滴下し、上述のとおりサーマルサイクリングを行うことで、ＰＣＲ反応容器内でＰＣＲ反応が進行し、病原体が検体中に存在していれば、病原体の増幅が行われる。

【0056】

ＰＣＲ反応用固体組成物に含まれるＤＮＡポリメラーゼおよび１種または２種以上のＰＣＲプライマー対は上述のとおりである。またＰＣＲ反応用固体組成物についても上述のとおりである。
また上記ＰＣＲ反応容器は、上述のＰＣＲ増幅産物を蛍光検出するための１種または２種以上の蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含むＰＣＲ反応用固体組成物を含んでいてもよい。検体の量を削減できるという観点から、複数のＰＣＲプライマー対、および／または２種以上の蛍光色素を含有するＰＣＲ反応用固体組成物を用いることが好ましい。

【0057】

ＰＣＲ反応容器の数は、検体病原体、ＰＣＲ反応用固体組成物に含まれるＰＣＲプライマー対の種類の数によって、適宜、設定される。取扱性の観点から蓋付の容器が好ましい。

【0058】

本発明の検査用キットは、偽陽性や偽陰性を防止する観点から、さらにＤＮＡポリメラーゼ、陽性コントロール核酸およびＰＣＲ反応コントロール核酸を含むＰＣＲコントロール用固体組成物を備えたＰＣＲ反応コントロール容器を含んでもよい。前記検体採取容器で第２の温度で加熱された液の一部を採取し、前記ＰＣＲ反応コントロール容器に必要量滴下し、上述のとおりサーマルサイクリングを行うことで、ＰＣＲ反応コントロール容器内でＰＣＲ反応が進行し、陽性コントロール核酸およびＰＣＲ反応コントロール核酸の増幅が行われる。

【0059】

ＰＣＲ反応コントロール用固体組成物に含まれるＤＮＡポリメラーゼ、陽性コントロール核酸およびＰＣＲ反応コントロール核酸は上述のとおりである。またＰＣＲ反応コントロール用個体組成物についても上述のとおりである。
ＰＣＲ反応コントロール容器は１つでも２以上でもよい。操作の簡便性の観点から、ＰＣＲ反応コントロール容器は１つであることが好ましい。一方、ＰＣＲ反応の結果をより確度の高いものとするという観点から、ＰＣＲ反応コントロール容器は２つ以上が好ましい。標的核酸の種類の数、検体の量等からＰＣＲ反応コントロール容器の数は適宜設定される。また上記ＰＣＲ反応コントロール容器は、上述のＰＣＲ増幅産物を蛍光検出するための１種または２種以上の蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含むＰＣＲコントロール用固体組成物を含んでいてもよい。

【0060】

上記検査用キットにより得られたＰＣＲ産物は、電気泳動法、熱融解曲線による検出、蛍光検出等の分析方法に供され、分析される。

【0061】

上記検体採取容器、ＰＣＲ反応容器、ＰＣＲ反応コントロール容器は材質、形状、容量等が互いに異なっていてもよいし、同じでもよい。材質については取り扱いが簡便で耐薬品性に優れる材質が好ましい。また視認性に優れる材質が好ましい。これら材質の例としては、ガラス、ポリプロピレン等が挙げられる。

【0062】

形状、容量等は例えば、取り扱いの観点からすべて同じであることが好ましいが、色彩、符号、番号等により各容器を識別できるようしておくことが検体や各混合物の添加漏れ等のヒューマンエラーを抑制する観点から好ましい。
各容器に使用されるものとしては、複数のチューブを連結したチューブストリップが挙げられ、ウェルが連結されたチューブストリップが好ましい。数は通常、２から１２、好ましくは２から１０、より好ましくは２から８である。

【実施例0063】

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらによって限定されない。

【実施例0064】

［感染性角膜炎陽性検体の検出］
感染性角膜炎が疑われる患者から得られた検体の角膜または眼脂を、１８０μＬの前処理液（タンパク質分解酵素を含むＰＣＲ緩衝液）と混合した。混合後の前処理液の組成は、２００μｇ／ｍＬ ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ、０.０５％（w/v）非イオン性界面活性剤、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ２、３５ｍＭ ＫＣｌおよびそれぞれ２００μＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）とした。前処理後の液をＰＣＲ反応用固体組成物を含む８連チューブストリップの各チューブに２０μＬずつ分注した。ストリップチューブ内のＰＣＲ反応用固体組成物は、ＤＮＡポリメラーゼ、およびチューブ毎に異なるＰＣＲ増幅産物を蛍光検出するための蛍光色素標識したオリゴヌクレオチドプローブおよびＰＣＲプライマー対を含む。

【0065】

病原体の検出用ＰＣＲプライマー対として、以下の塩基配列のものを使用した。
ＧＡＰＤＨ遺伝子検出用プライマー対
（フォワード）5'-tgtgctcccactcctgatttc-3'（配列番号１）
（リバース）5'-cctagtcccagggctttgatt-3'（配列番号２）
TBP遺伝子検出用プライマー対
（フォワード）5'-gcaccactccactgtatccc-3'（配列番号３）
（リバース）5'-cccagaactctccgaagctg-3'（配列番号４）
ＨＳＶ-１検出用プライマー対
（フォワード）5'-cgcatcaagaccacctcctc-3'（配列番号５）
（リバース）5'-gtcagctcgtgRttctg-3'（配列番号６）
増幅する標的遺伝子：ＵＬ２７
ＶＺＶ検出用プライマー対
（フォワード）5'-tcactaccagtcatttctatccatctg-3'（配列番号７）
（リバース）5'-gaaaacccaaaccgttctcgag-3'（配列番号８）
増幅する標的遺伝子：ＯＲＦ２９
アデノウイルス検出用プライマー対
（フォワード1）5'-tgggcgtacatgcacatc-3'（配列番号９）
（フォワード2）5'-gtggtcttacatgcacatc-3'（配列番号９）
（フォワード3）5'-atggtcttacatgcacatc-3'（配列番号９）
（フォワード4）5'-tgggcatacatgcacatc-3'（配列番号９）
（フォワード5）5'-tgggcttacatgcacatc-3'（配列番号９）
（リバース1）5'-cgggcgaactgcacca-3'（配列番号１０）
（リバース2）5'-cgggcaaactgcacca-3'（配列番号１０）
（リバース3）5'-cgggcgaattgcacca-3'（配列番号１０）
（リバース4）5'-cgggcaaattgcacca-3'（配列番号１０）
（リバース5）5'-cgggcaaactgcacga-3'（配列番号１０）
増幅する標的遺伝子：
クラミジア検出用プライマー対
（フォワード）5'-gaaaagaacccttgttaagggag-3'（配列番号１１）
（リバース）5'-cttaactccctggctcatcatg-3'（配列番号１２）
増幅する標的遺伝子：
淋菌検出用プライマー対
（フォワード）5'-ggaaagtaatcagatgaaaccagttc-3'（配列番号１３）
（リバース）5'-ggatcggtatcactcgctct-3'（配列番号１４）
増幅する標的遺伝子：
アカントアメーバ検出用プライマー対
（フォワード1）5'-tcaaagcaggcagatYcaatt-3'（配列番号１７）
（フォワード2）5'-tcaaagcaggcagatttaacca-3'（配列番号１７）
（リバース）5'-gtcctattccattatcccatgctaa-3'（配列番号１８）
増幅する標的遺伝子：

【0066】

ＰＣＲによる増幅産物を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブは、５'末端が蛍光色素ＲＯＸで標識されたものを使用した。使用したすべてのオリゴヌクレオチドプローブは、３'末端がクエンチャー物質ＢＨＱで修飾されたものを使用した。プローブの塩基配列は以下のものを使用した。
ＧＡＰＤＨ遺伝子検出用プローブ
5'-aaaagagctaggaaggacaggcaacttggc-3'（配列番号２３）（ＲＯＸ標識）
TBP遺伝子検出用プローブ
5'-acccccatcactcctgccacgc-3'（配列番号２４）（ＲＯＸ標識）
ＨＳＶ-１検出用プローブ
5'-tggcaacgcggcccaac-3'（配列番号２５）（ＲＯＸ標識）
ＶＺＶ検出用プローブ
5'-tgtctttcacggaggcaaacacgt-3'（配列番号２６）（ＲＯＸ標識）
アデノウイルス検出用プローブ
5'-caggaYgcYtcggagta-3'（配列番号２７）（ＲＯＸ標識）
クラミジア検出用プローブ
5'-caaaaggcacgccgtcaac-3'（配列番号２８）（ＲＯＸ標識）
淋菌検出用プローブ
5'-gaaacacgccaatgaggggcatgat-3'（配列番号２９）（ＲＯＸ標識）
アカントアメーバ検出用プローブ
5'- ctgccaccgaatac-3'（配列番号３１）（ＲＯＸ標識）

【0067】

検体を処理したＰＣＲ緩衝液により溶解したＰＣＲ反応用固体組成物を含む８連チューブストリップは、リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、加水分解プローブ法によりＰＣＲ反応をモニターした。ＰＣＲ条件として、９５℃／１０秒間の初期変性を行い、次いで９５℃／５秒間－６０℃／２０秒間のＰＣＲを４５サイクル行った。対象とする病原微生物の存在（陽性）または非存在（陰性）は、Ｃｑ値（増幅曲線が閾値線（Threshold Line）と交差するサイクル数）を基に判断した。また、対照として、各検体よりＤＮＡを精製した後、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法によってコピー数を定量した。

【0068】

本発明の方法により測定した病原体について、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法と比較した。また、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法による定量値と本発明の方法により測定したＣｑ値との相関を調べた。

【0069】

以上の結果、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法で定量することのできた陽性検体は、本発明の方法を用いて測定した場合でもすべて陽性であった。また、ＨＳＶ－１、ＶＺＶ、アデノウイルス、クラミジア、淋菌およびアカントアメーバが同定されていることが示された。また、定量値とＣｑ値の間に相関性があることが示された。