特開 2024-36987 ｐ６２タンパク質のリン酸化促進剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024036987

(43)【公開日】2024-03-18

(54)【発明の名称】ｐ６２タンパク質のリン酸化促進剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 8/86 20060101AFI20240311BHJP

   A61K 31/77 20060101ALI20240311BHJP

   A61P 39/06 20060101ALI20240311BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240311BHJP

   A61Q 17/04 20060101ALI20240311BHJP

   A61P 17/16 20060101ALI20240311BHJP

【ＦＩ】

A61K8/86

A61K31/77

A61P39/06

A61P43/00 105

A61Q17/04

A61P17/16

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022141585

(22)【出願日】2022-09-06

(71)【出願人】

【識別番号】517221435

【氏名又は名称】ジェイ－ネットワーク，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100095267

【弁理士】

【氏名又は名称】小島 高城郎

(74)【代理人】

【識別番号】100124176

【弁理士】

【氏名又は名称】河合 典子

(72)【発明者】

【氏名】三好 達郎

(72)【発明者】

【氏名】ブライアン・チャールズ・ケラー

(72)【発明者】

【氏名】児玉 朗

【テーマコード（参考）】

4C083

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C083AC421

4C083AC422

4C083BB51

4C083CC02

4C083CC19

4C083DD23

4C083EE12

4C083EE13

4C083EE16

4C083EE17

4C086AA01

4C086AA02

4C086FA02

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA17

4C086MA21

4C086MA63

4C086NA14

4C086ZB01

4C086ZB21

(57)【要約】

【課題】ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を利用することによって、ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１タンパク質のリン酸化を促進する。
【解決手段】ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として含み、前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１タンパク質のリン酸化促進剤である。前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、ジミリスチン酸グリセロールＰＥＧ－１２（ＧＤＭ１２）、ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ－１２（ＧＤＳ１２）、ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ－２３（ＧＤＳ２３）、ジパルミチン酸グリセロールＰＥＧ－２３（ＧＤＰ２３）、及びジオレイン酸グリセロールＰＥＧ－１２（ＧＤＯ１２）からなる群から選択される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として含み、前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、以下の構造式を有し、長鎖脂肪酸におけるＲの炭素数が１１～２３の範囲内であり、ポリエチレングリコール鎖におけるｎが１１～４６の範囲内である、ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１タンパク質のリン酸化促進剤。

【化1】

【請求項2】

前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、ジミリスチン酸グリセロールＰＥＧ－１２（ＧＤＭ１２）、ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ－１２（ＧＤＳ１２）、ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ－２３（ＧＤＳ２３）、ジパルミチン酸グリセロールＰＥＧ－２３（ＧＤＰ２３）、及びジオレイン酸グリセロールＰＥＧ－１２（ＧＤＯ１２）からなる群から選択される、請求項１に記載のｐ６２／ＳＱＳＴＭ１タンパク質のリン酸化促進剤。

【請求項3】

前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、溶液状態で表皮内に浸透する、請求項１又は２に記載のｐ６２／ＳＱＳＴＭ１タンパク質のリン酸化促進剤。

【請求項4】

前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、ベシクル状態で表皮内に浸透する、請求項１又は２に記載のｐ６２／ＳＱＳＴＭ１タンパク質のリン酸化促進剤。

【請求項5】

請求項１又は２に記載のｐ６２／ＳＱＳＴＭ１タンパク質のリン酸化促進剤を用いた、Ｎｒｆ２の発現増強剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１タンパク質のリン酸化部位のリン酸化を促進する物質に関する。

【背景技術】

【0002】

生体内では、本来、酸化ストレスに対する防御機構である「生体内抗酸化システム」を備えることによって生体機能の恒常性を維持している。当該システムは、細胞内の活性酸素種（Reactive Oxygen Species：ＲＯＳ）を始めとする酸化ストレスを解毒する抗酸化酵素及び抗酸化タンパク質の遺伝子の発現を誘導する。主要な生体内抗酸化システムの一つにＮｒｆ２－Ｋｅａｐ１経路がある。Ｎｒｆ２は抗酸化物質の遺伝子を発現する転写因子であり、Ｋｅａｐ１はＮｒｆ２を抑制制御するタンパク質である。非酸化ストレス条件下では、細胞質においてＫｅａｐ１がＮｒｆ２と複合体を形成しかつＮｒｆ２を常に分解することでその活性化を抑制している。細胞が酸化ストレスや親電子物質に曝露されると、Ｋｅａｐ１のチオール基が酸化されることでＮｒｆ２との結合が阻害され、Ｎｒｆ２はＫｅａｐ１から離脱して核内へと移行する。核内においてＮｒｆ２は、抗酸化物質応答要素（ＡＲＥ）に結合することによって抗酸化因子の発現を亢進する。

【0003】

他の生体内防御システムとして、細胞内の異常物質を分解する選択的オートファジーが知られている。選択的オートファジーのアダプター因子として知られるｐ６２／ＳＱＳＴＭ１タンパク質（以下「ｐ６２」と略称する）は、Ｋｅａｐ１に対して結合可能なドメインであるＫｅａｐ１相互作用領域（Keap1-interacting region：ＫＩＲ）を有する（特許文献１、非特許文献１）。しかしながら、ｐ６２のＫｅａｐ１への結合親和性はＮｒｆ２のそれに比べて非常に低いため、通常はＫｅａｐ１とＮｒｆ２の結合に影響しない。

【0004】

ｐ６２は複数のリン酸化ドメインを有し、選択的オートファジーの過程でそれらのドメインがリン酸化される。近年、ｐ６２のＫＩＲにあるセリン（Ｓｅｒ）３５１（マウスの場合。ヒトの場合はＳｅｒ３４９）がリン酸化されると、リン酸化ｐ６２のＫｅａｐ１に対する結合親和性が、Ｎｒｆ２のＫｅａｐ１に対するそれと同程度に増強される結果、Ｋｅａｐ１がリン酸化ｐ６２と結合し、同時にＮｒｆ２はＫｅａｐ１から離脱して安定化することが明らかとなった（特許文献２、非特許文献２、３、４）。すなわち、Ｋｅａｐ１は、そのチオール基が酸化される以外に、リン酸化ｐ６２によってもＮｒｆ２との結合が阻害され、Ｎｒｆ２がＫｅａｐ１から離脱できる。このリン酸化ｐ６２が関わる経路においても、Ｎｒｆ２－Ｋｅａｐ１経路と同様に、核内に移行したＮｒｆ２は抗酸化因子の発現を亢進する。なお、Ｎｒｆ２により発現する因子の中にはｐ６２も含まれるため、リン酸化ｐ６２の生成により減少したｐ６２を補充するポジティブフィードバックが働く。

【0005】

ここで、上記とは直接関連しないが、リン脂質と界面活性剤とからなる閉鎖小胞体（ベシクル）が知られている。これはリポソームとも称される。特許文献３には、リン脂質に替えて、ジアシルグリセロールポリエチレングリコール付加物（以下「ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物」と称する場合がある）を主体とする脂質を用い、水又は界面活性剤と混合することによって、自発的にベシクルを形成させる調製方法が提示されている。このようなベシクルは、それらの内部や表面にタンパク質や抗体などの目的物質を封入又は結合させて生体内の細胞に送達するドラッグデリバリーシステムに利用されている。

【0006】

ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を脂質とするベシクルは、その表面が親水性のＰＥＧ鎖で覆われた形態を有しており、生体内への浸透性と血中での安定性が良好である。特許文献４には、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物からなるベシクルの表面に荷電要素を結合させて正帯電させることにより、表皮の角層への浸透性と貯留性を向上させることが記載されている。

【0007】

さらに特許文献５は、目的物質の担体としてではなく、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物自体の新規に見出された生体内での作用に基づいた抗酸化物質の発現増強剤を開示している。特許文献５によれば、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加は、細胞内のＮｒｆ２の発現を増強させる作用を有する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】国際公開第２０１１／０８３６３７号

【特許文献2】特開２０１４－１１３１２４号公報

【特許文献3】特許第４４９７７６５号公報

【特許文献4】特許第６２９７７３７号公報

【特許文献5】特許第６８６０７３９号公報

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Komatsu, M., Kurokawa, H., Waguri, S. et al.: The selective autophagy substrate p62 activates the stress responsive transcription factor Nrf2 through inactivation of Keap1. Nat. Cell Biol., 12, 213-223 (2010)

【非特許文献2】Takamura, A., Komatsu, M., Hara, T. et al.: Autophagy-deficient mice develop multiple liver tumors. Genes Dev., 25, 795-800 (2011)

【非特許文献3】Inami, Y., Waguri, S., Sakamoto, A. et al.: Persistent activation of Nrf2 through p62 in hepatocellular carcinoma cells. J. Cell Biol., 193, 275-284 (2011)

【非特許文献4】Ichimura, Y., Waguri, S., Sou, Y.S.. et al.(2013):Phosphorylation of P62 activetes the Keap1-Nrf2 pathway during selective autophagy. Molecular Cell, 51, 618-631.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

上記知見によれば、ｐ６２がリン酸化することによって、いわばリン酸化ｐ６２－Ｋｅａｐ１－Ｎｒｆ２経路によるＮｒｆ２活性化を生じ、それによって核内に移行したＮｒｆ２による抗酸化因子の発現が増強される。このＮｒｆ２活性化は、酸化ストレス条件下でのＫｅａｐ１－Ｎｒｆ２経路によるＮｒｆ２活性化とは異なる経路である。
ｐ６２のリン酸化は、通常、細胞内のリン酸化酵素（ｍＴＯＲＣ１等）により生じる。また、そのようなｐ６２のリン酸化は、異常タンパク質凝集体や細胞内に侵入した病原菌などを捕捉し分解するための選択的オートファジー経路の一部として生じている。

【0011】

しかしながら、現時点では、ｐ６２のリン酸化を外部からの物質投与によって意図的に促進させる試みはなされておらず、またそのような物質も提示されていない。

【0012】

本発明の目的は、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物に関して新たに見出された特性の利用であり、特に、生体内のｐ６２タンパク質のリン酸化を促進し、それによってＮｒｆ２の発現を増強することである。

【課題を解決するための手段】

【0013】

上記の目的を達成するために本発明は、以下の構成を提供する。
本発明の態様は、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として含み、前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、以下の構造式を有し、長鎖脂肪酸におけるＲの炭素数が１１～２３の範囲内であり、ポリエチレングリコール鎖におけるｎが１１～４６の範囲内である、ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１タンパク質のリン酸化促進剤である。
また、本発明の別の態様は、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として含み、前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、以下の構造式を有し、長鎖脂肪酸におけるＲの炭素数が１１～２３の範囲内であり、ポリエチレングリコール鎖におけるｎが１１～４６の範囲内である、ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１タンパク質のリン酸化促進方法である。

【0014】

【化1】

【0015】

好ましくは、前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、ジミリスチン酸グリセロールＰＥＧ－１２（ＧＤＭ１２）、ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ－１２（ＧＤＳ１２）、ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ－２３（ＧＤＳ２３）、ジパルミチン酸グリセロールＰＥＧ－２３（ＧＤＰ２３）、及びジオレイン酸グリセロールＰＥＧ－１２（ＧＤＯ１２）からなる群から選択される。

【0016】

好ましくは、前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、溶液状態で表皮内に浸透される。
好ましくは、前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、ベシクル状態で表皮内に浸透される。

【0017】

本発明はさらに、上記のｐ６２／ＳＱＳＴＭ１タンパク質のリン酸化促進剤を用いた、Ｎｒｆ２の発現増強剤を提供する。

【発明の効果】

【0018】

本発明によれば、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として含む、ｐ６２タンパク質のリン酸化促進剤が実現される。また、本発明によれば、そのようなｐ６２タンパク質のリン酸化促進剤を用いたＮｒｆ２の発現増強剤が実現される。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】図１は、ＧＤＳ２３についての各時間におけるウェスタンブロットのバンド画像である。

【図2】図２は、ＧＤＳ２３についての各時間におけるウエスタンブロット定量解析結果を示すグラフである。

【図3】図３は、ＧＤＭ１２についての各時間におけるウェスタンブロットのバンド画像である。

【図4】図４は、ＧＤＭ１２についての各時間におけるウエスタンブロット定量解析結果を示すグラフである。

【図5】図５は、ＧＤＳ１２についての各時間におけるウェスタンブロットのバンド画像である。

【図6】図６は、ＧＤＳ１２についての各時間におけるウエスタンブロット定量解析結果を示すグラフである。

【図7】図７は、Ｎｒｆ２の免疫染色の共焦点レーザー顕微鏡の撮像である。

【図8】図８は、各時間における定量解析結果を示すグラフである。

【図9】図９は、ウェスタンブロットのバンド画像である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

以下、図面を参照しつつ、本発明の実施の形態を説明する。
本発明は、ジアシルグリセロールポリエチレングリコール付加物（ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物）において新たに見出された特性を利用してなされたものである。ここで新たに見出された特性は、ヒトの生体内のｐ６２／ＳＱＳＴＭ１タンパク質のリン酸化を促進する作用である。

【0021】

本発明に関する脂質分子であるジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の構造式を概略的に示す。

【0022】

【化2】

【0023】

ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物は、３つの炭素を有するグリセロール骨格部（ＣＨ_２ＣＨＣＨ_２）と、骨格部の３つの炭素のうち末端の１つの炭素に結合した直鎖型ポリエチレングリコールであるＰＥＧ鎖と、３つの炭素のうち他の２つの炭素にそれぞれ結合した同種の長鎖脂肪酸（ＣＯＯＲ）とから構成されている。ＰＥＧ鎖の部分が親水性であり、長鎖脂肪酸の部分が疎水性である。

【0024】

以下の説明において特定のジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を表すとき、長鎖脂肪酸の種類と、ＰＥＧ鎖のｎの数に基づいて、"［ジ］＋［長鎖脂肪酸名］＋［グリセロール］＋［ＰＥＧ－ｎ］"と称する。例えば、長鎖脂肪酸がステアリン酸、ＰＥＧ鎖のｎが２３の場合は、"ジステアリン酸ＰＥＧ－２３"である。また、特定のジアシルグリセロールＰＥＧ付加物をさらに略称で示す場合もある。

【0025】

長鎖脂肪酸におけるＲの炭素数は、１１～２３の範囲内とすることができる。この範囲に含まれる長鎖脂肪酸は、例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、又はオレイン酸などである。ＰＥＧ鎖のｎの数は、１１～４６の範囲内とすることができる。本発明に関係するジアシルグリセロールＰＥＧ付加物として、以下のものを例示することができる。括弧内に、融点と略称を示す。
・ジミリスチン酸グリセロールＰＥＧ－１２（２５．０℃：ＧＤＭ１２）
・ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ－１２（４０．０℃：ＧＤＳ１２）
・ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ－２３（３９．８℃：ＧＤＳ２３）
・ジパルミチン酸グリセロールＰＥＧ－２３（３１．２℃：ＧＤＰ２３）
・ジオレイン酸グリセロールＰＥＧ－１２ （２５．０℃：ＧＤＯ１２）

【0026】

上述した通り、生体内の、酸化ストレスに対する防御機構としてＮｒｆ２－Ｋｅａｐ１経路がよく知られている。非酸化ストレス条件下ではＮｒｆ２とＫｅａｐ１は細胞質で複合体を形成すると同時に、Ｎｒｆ２はＫｅａｐ１により常時分解され不活性化されている。生体が酸化ストレスを受けると、Ｋｅａｐ１が活性酸素種や親電子物質によってチオール基が酸化することで死活化する。その結果、Ｎｒｆ２がＫｅａｐ１から離脱して活性化し、細胞の核内に移行し、抗酸化酵素を産生する。

【0027】

一方、選択的オートファジーのアダプター因子として知られるｐ６２は、そのＫｅａｐ１相互作用領域がリン酸化することによってＫｅａｐ１との結合性が増加する。これによりＫｅａｐ１は、チオール基の酸化を受けることなくリン酸化ｐ６２と結合する。その結果、Ｎｒｆ２がＫｅａｐ１から離脱して活性化し、細胞の核内に移行し、抗酸化酵素等を産生する。これは、上記の酸化ストレスによるＮｒｆ２活性化経路とは異なる、リン酸化ｐ６２に関わるＮｒｆ２の活性化経路である。

【0028】

発明者らは、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物をヒトの表皮細胞に適用することによって、ｐ６２のリン酸化が促進されることを見出した。この生体の細胞内におけるｐ６２のリン酸化促進作用は、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物について新たに見出された作用であり、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の新たな特性といえる。ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物とｐ６２との関係は、これまで全く知られていない。ｐ６２のリン酸化の促進は、リン酸化ｐ６２とＫｅａｐ１の結合の促進を意味する。言い換えると、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物は、リン酸化ｐ６２が関わるＮｒｆ２の活性化経路に寄与することができる。

【0029】

本発明は、このジアシルグリセロールＰＥＧ付加物において新たに見出された特性を利用して、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分とする、ｐ６２のリン酸化促進剤を提供する。これは、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を用いたｐ６２のリン酸化促進方法ということもできる。

【0030】

ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物には複数の種類があるが、生体に適用する場合、一種のみで用いてもよく、又は複数種を組み合わせて用いてもよい。

【0031】

細胞内のｐ６２は、通常、一定量に維持されている。本発明によれば、ヒトの表皮内に到達したジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、それが無い場合に比べて、ｐ６２のリン酸化を促進することによってＫｅａｐ１からのＮｒｆ２の離脱を促進し、Ｎｒｆ２が細胞の核内に移行する。この過程は、後述する試験によって確認された。Ｎｒｆ２の活性化によって抗酸化酵素等が産生される結果、外部からの酸化ストレス、例えば、紫外線や大気汚染物質による表皮内の細胞損傷を軽減又は防止することが可能となる。

【0032】

したがって、本発明によれば、例えばジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分とする化粧品又は医薬品の提供も期待される。

【0033】

ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物をヒトの表皮内に到達させる方法の１つとして、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を水又は所定の溶媒に溶解させた溶液状態で表皮内に到達させる方法がある。例えば、リン酸緩衝食塩水PBS(-)を溶媒とする所定の濃度のジアシルグリセロールＰＥＧ付加物溶液を調製し、皮膚表面に塗布することで表皮内に浸透させることができる。塗布された溶液は、最上層の角層内に浸透し、さらに角層の下の顆粒層へと浸透する。そして、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物は、浸透した表皮内の各層において当該層の細胞に存在するｐ６２のリン酸化を促進する。

【0034】

好適な方法では、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物をベシクル状態で表皮内に到達させることができる。そのようなベシクルは、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の二重層、又は、二重層が複数重なった多重層からなる閉じた球殻として形成されており、親水性のＰＥＧ鎖が最外層の表面に配置されている。ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物のベシクルを調製し、それを皮膚表面に塗布することで表皮内に浸透させることができる。表皮内に到達した後にベシクルが分解し、個々の分子に分離することで、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物自体の作用を発揮することができる。

【0035】

従来のドラッグデリバリーシステムでは、ベシクルの材料であるジアシルグリセロールＰＥＧ付加物は、目的物質の単なるキャリアと考えられてきたが、本発明では、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物自体を有効成分として利用する。したがって、本発明では、通常のドラッグデリバリーシステムにおいてベシクルに組み込まれる目的物質は、基本的に不要である。本発明では、水とジアシルグリセロールＰＥＧ付加物のみを混合して形成したベシクルを表皮内に浸透させることによって、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物自体が、細胞内のｐ６２のリン酸化促進剤として機能することができる。

【0036】

幾つかのジアシルグリセロールＰＥＧ付加物は、所定の温度で水と混合することにより、自発的にベシクルを形成する（特許文献３）。例えば、２質量％のＧＤＭ１２又はＧＤＯ１２を９８質量％の脱イオン水に室温で混合し撹拌することにより、ＧＤＭ１２又はＧＤＯ１２のベシクルの懸濁液が得られる。別の例として、２質量％のＧＤＳ１２又はＧＤＳ２３を４５～５５℃で溶解させてから、４５～５５℃の９８質量％の脱イオン水に混合し撹拌することにより、ＧＤＳ１２又はＧＤＳ２３のベシクルの懸濁液が得られる。さらに別の例として、２質量％のＧＤＰ２３を３７℃で溶解させてから、３７℃の９８質量％の脱イオン水に混合し撹拌することにより、ＧＤＰ２３のベシクルの懸濁液が得られる。室温よりも高い温度で得られた懸濁液を室温に冷却しても、ベシクルは安定している。

【0037】

別の例として、水に替えて、種々の物質の水溶液とジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を混合撹拌することによって形成したベシクルを用いる場合も、本発明の範囲に含まれるその場合、水溶液に含まれる物質に、別の機能をもたせることもできる。

【0038】

ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物により形成されたベシクルの大きさは、例えば、直径が約２０～３００ｎｍである。特に、直径２０～４０ｎｍの範囲内の微細化ベシクルは、表皮への浸透性が良好であるので好適である。このような微細化ベシクルは、例えば、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を、別の脂質であるスクワラン及びコレステロールと混合することによって得ることができる（特許文献５）。

【0039】

さらに別の例として、水又は水溶液とジアシルグリセロールＰＥＧ付加物とを混合撹拌することによって形成したベシクルの表面を、例えばカチオン性界面活性剤などの荷電要素で修飾して用いる場合も、本発明の範囲に含まれる。特許文献４には、正帯電したベシクルが、特に表皮への浸透性と貯留性に優れていることが記載されている。

【0040】

ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として含む化粧品や医薬品は、例えば、水溶液、乳液、ゲル、クリーム等の多様な形態で提供することができる。

【0041】

以下、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物によるｐ６２のリン酸化促進作用に関する試験データを示す。
（１）ｐ６２のリン酸化促進作用の確認試験
（１－１）試験方法
２４ｗｅｌｌプレートに培地（HuMedia-KG2培地：クラボウ製）を用い、正常ヒト表皮角化細胞（NHEK：クラボウ製）を１．０×１０^５cells／wellの細胞密度で播種した。続いて、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で２４時間培養した。その後、培地（HuMedia-KB2：クラボウ製）を用いて、異なる３種のジアシルグリセロールＰＥＧ付加物をそれぞれ添加した試料を、３７℃、５％ＣＯ_２条件下でそれぞれ培養した。各試料のジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の種類、添加量、及び培養時間を表１に示す。培養時間０は、比較例である。

【0042】

【表1】

【0043】

各時間経過後の各試料に対してウエスタンブロット法を適用してｐ６２及びリン酸化ｐ６２の各タンパク質を検出した。先ず、１０％メルカプトエタノール含有ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行ってタンパク質を抽出した。タンパク質抽出液は、ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動で分離し、セミドライ法でメンブレンへタンパク質を転写した。その後、各抗体を用いて、ｐ６２及びリン酸化ｐ６２（ｐｐ６２）の各タンパク質を定量した。内部標準としてＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素）を用いた。使用した各抗体と、その希釈率及び由来種等を表２に示す。

【0044】

【表2】

【0045】

解析は、各目的タンパク質の量を、同一試料における内部標準であるＧＡＰＤＨ（コントロール）の量の値でそれぞれ補正した後、コントロールの補正値を１としたときの各試料の補正値をそれぞれ算出した（以下の試験でも同様）。

【0046】

（１－２）試験結果
図１及び図２はＧＤＳ２３についての、図３及び図４はＧＤＭ１２についての、図５及び図６はＧＤＳ１２についての試験結果を示している。
図１、図３、及び図５は、各試料についての各時間におけるウェスタンブロットのバンド画像である。
図２、図４、及び図６は、各試料についての各時間におけるウエスタンブロット定量解析結果を示すグラフである。これらのデータは、平均±S.D.（ｎ＝４）、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（Dunnet検定）である。

【0047】

ＧＤＳ２３、ＧＤＭ１２、及びＧＤＳ１２の各試料を正常ヒト表皮角化細胞にそれぞれ添加して数時間培養した結果、いずれの場合もリン酸化ｐ６２が増加し、ｐ６２には変化は見られなかった。リン酸化ｐ６２の増加は、ｐ６２がリン酸化されたためと考えられる。一方、ｐ６２の減少分は新たなｐ６２が産生されて補充されたと考えられる。このｐ６２の補充機構として、リン酸化ｐ６２にＫｅａｐ１が結合することによって離脱したＮｒｆ２により発現する因子の中にｐ６２も存在するというポジティブフィードバックが含まれるとされている。この試験によって、ＧＤＳ２３、ＧＤＭ１２、及びＧＤＳ１２の各々によるｐ６２のリン酸化促進作用が確認できた。ｐ６２のリン酸化は、この試験条件下において、ＧＤＳ２３については１２時間の培養以降に、ＧＤＭ１２及びＧＤＳ１２については１８時間の培養以降に有意に起きることが確認された。

【0048】

（２）Ｎｒｆ２の活性化及び核内移行の確認試験
免疫染色法を用いて、ｐ６２のリン酸化後のＮｒｆ２の核内移行の確認試験を行った。この試験には、ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ－２３（ＧＤＳ２３）を用いた。
（２－１）試験方法
正常ヒト表皮角化細胞（NHEK：クラボウ製）を２５ｍｍφポリリジンコーティングカバーガラス（松浪硝子工業株式会社）に２×１０^４cells／wellの細胞密度で播種した。続いて、培地（HuMedia-KG2：クラボウ製）を用いて３７℃、５％ＣＯ_２条件下で５日間培養した。その後、５０μＭのＧＤＳ２３含有培地（HuMedia-KB2：クラボウ製）及びコントロールとして培地（HuMedia-KB2：クラボウ製）のみを添加し、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で２４時間培養した。

【0049】

試料を除去後、カバーガラスを４％ホルムアルデヒド溶液（PBS(-)に溶解）で１０分間処理することで透過処理を行った。また、５０ｍＭ塩化アンモニウム（PBS(-)に溶解）を１０分間処理し、細胞の洗浄を行った。その後、１０％Normal Goat Serum（３％BSA含有PBS(-)に溶解）を室温で１時間処理し、ブロッキングを行った。
続いて、一次抗体（rabbit Anti-Nrf2 monoclonal antibody、３％BSA含有PBS(-)を用いて１／１００に希釈）を４℃で１晩処理し、一次抗体反応を行った。さらに、PBS(-)により洗浄後、二次抗体（goat anti-rabbit IgG (Alexa Fluor 488)、３％BSA含有PBS(-)を用いて１／４００に希釈）を室温、暗所で処理し、二次抗体反応を行った。
PBS(-)にて洗浄後、２．０μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）により室温、暗所で１０分間処理し、核染色を行った。染色後、カバーガラスを共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。
観察したレーザー条件は以下の通りである。
・レーザー強度：ＤＡＰＩ４５％、Alexa 488 ５０％
・レーザー強度：ＤＡＰＩ５５％、Alexa 488 ５５％

【0050】

（２－２）試験結果
図７に、Ｎｒｆ２の免疫染色の共焦点レーザー顕微鏡の撮像を示す。５０μＭのＧＤＳ２３で細胞を処理し、ｐ６２のリン酸化が有意に起こる１２時間後、特に１８時間後以降の２４時間後にＮｒｆ２の免疫染色を観察したところ、ＧＤＳ２３で処理しなかったコントロールに比べてＧＤＳ２３処理試料は、Ｎｒｆ２が細胞の核内で多く発現していることが分かる。この結果からＮｒｆ２が核内へ移行し、活性化していることが確認できた。

【0051】

（３）Ｋｅａｐ１とリン酸化ｐ６２の結合によるＮｒｆ２の活性化の確認試験
リン酸化ｐ６２とＫｅａｐ１との結合を阻害する阻害剤（Ｋ６７）を用いて、リン酸化ｐ６２のＫｅａｐ１との結合作用を阻害したときのＮｒｆ２活性化の抑制（Ｋｅａｐ１とリン酸化ｐ６２との結合が妨げられてＮｒｆ２がＫｅａｐ１から離脱できない）作用を確認した。この試験には、ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ－２３（ＧＤＳ２３）を用いた。

【0052】

（３－１）試験方法
＜方法１＞
９６ｗｅｌｌプレートに培地（HuMedia-KG2：クラボウ製）を用い正常ヒト表皮角化細胞（NHEK：クラボウ製）を２．０×１０^４ cells／wellの細胞密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で半日培養した。次に培地（HuMedia-KB2：クラボウ製）を用いて２５μＭのＫ６７(Sigma-Aldrich製)を調製し、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で１４時間培養した。続いて、培地（HuMedia-KB2：クラボウ製）を用いて５０μＭのＧＤＳ２３を調製し、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で２４時間又は３０時間培養した。

【0053】

試料を除去後、PBS(-)で洗浄を行い、ＲＮＡ精製キット（RNeasy Mini kit：QIAGEN社）を用いてＲＮＡを抽出した。さらにＰＣＲ装置（PCR Thermal Cycler Dice：タカラバイオ株式会社）を用いて逆転写反応を行うことでｃＤＮＡを合成した。その後、ＰＣＲ用試薬（SYBR （登録商標）Green Master Mix：Thermo FisherScientific社)を加え、ＰＣＲ装置（StepOne Real-Time PCR System：Applied Biosystems社)を用いてｍＲＮＡの定量をΔΔＣｔ法にて行った。内部標準（コントロール）としてＧＡＰＤＨの発現量の値で補正した。

【0054】

＜方法２＞
２４ｗｅｌｌプレートに培地（HuMedia-KG2：クラボウ製）を用い正常ヒト表皮角化細胞（NHEK：クラボウ製）を１．０×１０^５cells/wellの細胞密度で播種した。培地（HuMedia-KB2：クラボウ製）を用いて２５μＭのＫ６７(Sigma-Aldrich製)を調製し、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で１４時間培養した。続いて、培地（HuMedia-KB2：クラボウ製）を用いて５０μＭのジステアリン酸グリセロールＰＥＧ－２３（ＧＤＳ２３）を調製し、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で２４時間又は３０時間培養した。

【0055】

各時間後、１０％メルカプトエタノール含有ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行って細胞からタンパク質を抽出した。そして、タンパク質抽出液は、ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行って分離し、セミドライ法でメンブレンへタンパク質を転写した。その後、各抗体を用いてタンパク量を定量した。内部標準（コントロール）としてＧＡＰＤＨのタンパク量の値で補正した。

【0056】

（３－２）試験結果
図８は、＜方法１＞による、ＨＯ－１（Heme Oxygenase-1：ヘムオキシゲナーゼ）及びＧＣＬＣ（Glutamate-Cysteine Ligase Catalytic subunit (GCLC)：γグルタミルシステイン合成酵素）の定量解析結果を示すグラフである。ＨＯ－１は、ヘム分解律速酵素及び細胞を酸化ストレスによる傷害から守る細胞保護タンパクである。図８においては、平均±S.D.（ｎ＝４）、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．０００１（Tukey検定）である。

【0057】

図９は、＜方法２＞による、ＨＯ－１及びＮＱＯ１（NAD(P)H Quinone Oxidoreductase-1：酸化還元酵素）のウェスタンブロットのバンド画像である。

【0058】

ＧＤＳ２３のみで処理した細胞では、Ｎｒｆ２の活性化により亢進される抗酸化遺伝子及び抗酸化タンパク質の産生量がコントロールに比べて非常に大きかった。それに対し、予めＫ６７で処理した後にＧＤＳ２３で処理した細胞では、Ｎｒｆ２の活性化により亢進される抗酸化遺伝子及び抗酸化タンパク質の産生量が低下した。これらにより、ＧＤＳ２３での処理によってｐ６２のリン酸化が促進されることでＮｒｆ２がＫｅａｐ１から離脱し活性化されること、及び、ｐ６２がリン酸化されてもＫｅａｐ１との結合が阻害された場合はＮｒｆ２の活性化が起こらないことが確認された。

【0059】

以上、実施例を参照して本発明を説明したが、本発明はこれらの実施例に限られるものではなく、これらから自明の変形例も本発明に含まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】