知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特開2024-37641微粒子の凝集反応または凝集阻害反応を用いたウイルスの力価の判定方法、およびウイルス分離株の抗原性解析法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024037641
(43)【公開日】2024-03-19
(54)【発明の名称】微粒子の凝集反応または凝集阻害反応を用いたウイルスの力価の判定方法、およびウイルス分離株の抗原性解析法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/569 20060101AFI20240312BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20240312BHJP
C12M 1/34 20060101ALN20240312BHJP
【ＦＩ】
G01N33/569 L
G01N33/543 581A
C12M1/34 D
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】書面
(21)【出願番号】P 2022153084
(22)【出願日】2022-09-07
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和３年度～令和５年度、厚生労働行政推進調査事業費補助金 新興・再興感染症及び予防接種政策推進研究事業「新型及び季節性インフルエンザに係る流行株の予測等に資するサーベイランス及びゲノム解析に関する研究」研究代表者長谷川秀樹、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】591222245
【氏名又は名称】国立感染症研究所長
(72)【発明者】
【氏名】中村 一哉
(72)【発明者】
【氏名】小林 淳
(72)【発明者】
【氏名】松山 州徳
【テーマコード（参考）】
4B029
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB13
4B029FA09
4B029GA03
(57)【要約】
【課題】 ウイルス力価と抗体価とを、生細胞を用いずに簡単な器具と操作によって短期間に定量できる方法を提供すること。
【解決手段】 判定対象のウイルスの受容体分子を表面に担持した微粒子と、検体とを混合し、凝集反応または凝集阻害反応により力価を判定する方法による。
【選択図】図１
【解決手段】 判定対象のウイルスの受容体分子を表面に担持した微粒子と、検体とを混合し、凝集反応または凝集阻害反応により力価を判定する方法による。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
判定対象のウイルスの受容体分子を表面に担持した微粒子と、検体とを混合し、凝集反応または凝集阻害反応により力価を判定する方法。
【請求項2】
ウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり、受容体分子が、アンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチドであり、微粒子が、ポリスチレンの微粒子である請求項１に記載の方法。
【請求項3】
アンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチドが、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）またはＢ３８－ＣＡＰであり、ポリスチレンの微粒子が、ラテックスビーズである請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記微粒子と、前記検体とを、試験プレートのウェル内で混合し、凝集の陽性と陰性の状態を観察し、ウイルスの力価を判定する方法であって、
前記試験プレートの列のｎ個のウェルに、緩衝液でａｎ毎（ａｎ＝２ｎ、ｎは１以上の整数である。）に希釈した検体を入れ、さらに微粒子を含有する溶液を加えて混合し、少なくとも１時間静置し、凝集させ、凝集の陽性と陰性の状態を観察することで、ウイルスの力価を判定する請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
前記試験プレートの列のｎ個のウェルに、緩衝液でａｎ毎（ａｎ＝２ｎ、ｎは１以上の整数である。）に希釈した検体を入れ、さらに微粒子を含有する溶液を加えて混合し、少なくとも１時間静置し、凝集させ、凝集の陽性と陰性の状態を観察することで、ウイルスの力価を判定する請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記微粒子と、前記検体とを、試験プレートのウェル内で混合し、凝集の陽性と陰性の状態を観察し、抗体の力価を判定する方法であって、
前記試験プレートの列のｎ個のウェルに、緩衝液でａｎ毎（ａｎ＝１０×２ｎ－１、ｎは１以上の整数である。）に希釈した検体を入れ、ウイルスを含有する溶液を一定量加えて混合し、少なくとも１時間静置し、微粒子を含有する溶液を加えて混合し、室温で静置し、凝集させ、凝集阻止の陽性と陰性の状態を観察することで、抗体の力価を判定する請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
前記試験プレートの列のｎ個のウェルに、緩衝液でａｎ毎（ａｎ＝１０×２ｎ－１、ｎは１以上の整数である。）に希釈した検体を入れ、ウイルスを含有する溶液を一定量加えて混合し、少なくとも１時間静置し、微粒子を含有する溶液を加えて混合し、室温で静置し、凝集させ、凝集阻止の陽性と陰性の状態を観察することで、抗体の力価を判定する請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ウイルスの表面タンパク質に結合するリガンド（受容体分子）を担持させた微粒子、および該微粒子を用いた凝集反応によるウイルス力価（ウイルス量）の判定方法に関する。また本発明は、抗ウイルス抗体による凝集阻害効果を使用した抗体価（中和抗体量と同意であり、抗体の力価ともいう。）の判定方法、さらにこれを利用したウイルス分離株の抗原性解析法に関する。
【背景技術】
【0002】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、出現してから変異を繰り返し、間欠的な流行拡大を起こしている。そのため、今後も定期流行を引き起こす主要呼吸器感染症ウイルスとして存在し続ける可能性が危惧されている。
【0003】
そこで、将来的にワクチン株の選定や更新が必要となった場合に野外流行株の抗原性評価が有用であり、また、ワクチンの事後評価には相応の検体数スループットに対応できる抗体価の判定方法が有用である。さらにウイルス感染症の診断や治療のために、ウイルス力価および抗体価を容易に判定できる方法が有用であることから、これらの判定方法が検討されている。
【0004】
例えば、コウモリに由来する細胞であって、ＳＶ４０，（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０）ラージＴ抗原遺伝子を導入した長期継代可能な細胞株を用い、該細胞株とウイルスとを共培養し、細胞変性効果を指標に行うことでウイルス力価を判定する方法が開示されている。さらに該細胞株とウイルス含有血清とを共培養し、細胞変性効果を指標に行うことでウイルスに対する抗体価を判定する方法が開示されている（例えば特許文献１参照。）。
【0005】
しかしながら、この方法ではラージＴ抗原遺伝子を導入したコウモリ由来の生細胞が必要であり、また細胞を培養する必要があることから、簡単な器具と操作によってウイルス力価や抗体価は得られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開２００８－２６３９６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の課題は、ウイルス力価と抗体価とを、生細胞を用いずに簡単な器具と操作によって短期間に判定でき、さらにウイルス分離株の抗原性解析法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、これらの課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、ウイルスの受容体分子を担持させた微粒子を用いることで、生細胞を用いずにウイルスの存否を判定することができ、ウイルス感染細胞におけるウイルスの増殖性に影響されずに、短期間に、ウイルス価、抗体価を判定できる手法を見出し、本発明を完成させた。
【0009】
本発明の構成は以下の通りである。
［１］判定対象のウイルスの受容体分子を表面に担持した微粒子と、検体とを混合し、凝集反応または凝集阻害反応により力価を判定する方法。
［２］ウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり、受容体分子が、アンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチドであり、微粒子が、ポリスチレンの微粒子である前記［１］に記載の方法。
［３］アンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチドが、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）またはＢ３８－ＣＡＰであり、ポリスチレンの微粒子が、ラテックスビーズである前記［２］に記載の方法。
［４］前記微粒子と、前記検体とを、試験プレートのウェル内で混合し、凝集の陽性と陰性の状態を観察し、ウイルスの力価を判定する方法であって、
前記試験プレートの列のｎ個のウェルに、緩衝液でａｎ毎（ａｎ＝２ｎ、ｎは１以上の整数である。）に希釈した検体を入れ、さらに微粒子を含有する溶液を加えて混合し、少なくとも１時間静置し、凝集させ、凝集の陽性と陰性の状態を観察することで、ウイルスの力価を判定する前記［１］に記載の方法。
［５］前記微粒子と、前記検体とを、試験プレートのウェル内で混合し、凝集の陽性と陰性の状態を観察し、抗体の力価を判定する方法であって、
前記試験プレートの列のｎ個のウェルに、緩衝液でａｎ毎（ａｎ＝１０×２ｎ－１、ｎは１以上の整数である。）に希釈した検体を入れ、ウイルスを含有する溶液を一定量加えて混合し、少なくとも１時間静置し、微粒子を含有する溶液を加えて混合し、室温で静置し、凝集させ、凝集阻止の陽性と陰性の状態を観察することで、抗体の力価を判定する前記［１］に記載の方法。
［１］判定対象のウイルスの受容体分子を表面に担持した微粒子と、検体とを混合し、凝集反応または凝集阻害反応により力価を判定する方法。
［２］ウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり、受容体分子が、アンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチドであり、微粒子が、ポリスチレンの微粒子である前記［１］に記載の方法。
［３］アンジオテンシン変換酵素２活性を有するポリペプチドが、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）またはＢ３８－ＣＡＰであり、ポリスチレンの微粒子が、ラテックスビーズである前記［２］に記載の方法。
［４］前記微粒子と、前記検体とを、試験プレートのウェル内で混合し、凝集の陽性と陰性の状態を観察し、ウイルスの力価を判定する方法であって、
前記試験プレートの列のｎ個のウェルに、緩衝液でａｎ毎（ａｎ＝２ｎ、ｎは１以上の整数である。）に希釈した検体を入れ、さらに微粒子を含有する溶液を加えて混合し、少なくとも１時間静置し、凝集させ、凝集の陽性と陰性の状態を観察することで、ウイルスの力価を判定する前記［１］に記載の方法。
［５］前記微粒子と、前記検体とを、試験プレートのウェル内で混合し、凝集の陽性と陰性の状態を観察し、抗体の力価を判定する方法であって、
前記試験プレートの列のｎ個のウェルに、緩衝液でａｎ毎（ａｎ＝１０×２ｎ－１、ｎは１以上の整数である。）に希釈した検体を入れ、ウイルスを含有する溶液を一定量加えて混合し、少なくとも１時間静置し、微粒子を含有する溶液を加えて混合し、室温で静置し、凝集させ、凝集阻止の陽性と陰性の状態を観察することで、抗体の力価を判定する前記［１］に記載の方法。
【発明の効果】
【0010】
本発明の微粒子を用いた凝集反応の試験を行うことによって、生細胞を用いずにウイルス存否の判定や、ウイルス力価を判定することができる。
また本発明の微粒子を用いた凝集阻止反応の試験を行うことによって、生細胞を用いずに抗体価を判定することができる。
また本発明のウイルス分離株の抗原性解析法を用いることで、コントロールとした参照株と目的とするウイルス分離株とが、抗原的に乖離しているのか、類似しているのかを判定することができる。
また本発明の微粒子を用いた凝集阻止反応の試験を行うことによって、生細胞を用いずに抗体価を判定することができる。
また本発明のウイルス分離株の抗原性解析法を用いることで、コントロールとした参照株と目的とするウイルス分離株とが、抗原的に乖離しているのか、類似しているのかを判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】 凝集反応用の微粒子の製造と微粒子の凝集反応の概念図
【図2】 微粒子の凝集反応を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス力価を判定する方法の概念図
【図3】 微粒子の凝集阻止反応を用いた抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗体価を判定する方法の概念図
【図4】 微粒子の凝集阻止試験のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株の抗原性解析への応用への概念図
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0013】
本発明は、判定対象のウイルスの受容体分子を表面に担持した微粒子と、検体とを、混合し、凝集反応または凝集阻害反応により力価を判定する方法である。
【0014】
＜ウイルス＞
空気、水、土、ヒト、ヒト以外の動物に潜んでいる病原体が体内に侵入することによって引き起こされる病気が感染症である。本発明の力価の判定対象となるウイルスは、この感染症を引き起こすウイルスである。具体的には、インフルエンザウイルス、ノロウイルス、コロナウイルスなどである。
空気、水、土、ヒト、ヒト以外の動物に潜んでいる病原体が体内に侵入することによって引き起こされる病気が感染症である。本発明の力価の判定対象となるウイルスは、この感染症を引き起こすウイルスである。具体的には、インフルエンザウイルス、ノロウイルス、コロナウイルスなどである。
【0015】
＜インフルエンザウイルス＞
インフルエンザウイルスは、オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属し，Ａ，Ｂ，Ｃの３型がある。流行的な広がりを見せるのはＡ型とＢ型である。Ａ型とＢ型ウイルス粒子表面には、赤血球凝集素（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）という糖蛋白があり、これらが感染防御免疫の標的抗原となっている。とくにＡ型では、ＨＡには１５種類、ＮＡには９種類の抗原性の異なる亜型が存在し、これらの様々な組み合わせを持つウイルスが、ヒト以外にもブタやトリなどその他の宿主に広く分布している。
インフルエンザウイルスは、オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属し，Ａ，Ｂ，Ｃの３型がある。流行的な広がりを見せるのはＡ型とＢ型である。Ａ型とＢ型ウイルス粒子表面には、赤血球凝集素（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）という糖蛋白があり、これらが感染防御免疫の標的抗原となっている。とくにＡ型では、ＨＡには１５種類、ＮＡには９種類の抗原性の異なる亜型が存在し、これらの様々な組み合わせを持つウイルスが、ヒト以外にもブタやトリなどその他の宿主に広く分布している。
【0016】
＜ノロウイルス＞
ノロウイルス（ＮｏＶ）はカリシウイルス科ノロウイルス属に属する急性胃腸炎の原因となるウイルスである。ウイルスの粒子は、直径約３８ｎｍの二十面体対称でエンベロープはない。ゲノムは線状非分節型プラス一本鎖ＲＮＡ約７，５００塩基長でＯＲＦ１～ＯＲＦ３を含む。ＯＲＦ１はＮＳ１／２とＮＳ３～ＮＳ７，ＯＲＦ２は、ＶＰ１、ＯＲＦ３はＶＰ２をコードしている。ＶＰ１はＳドメインとＰドメインからなり抗原性を決定する。
ノロウイルス（ＮｏＶ）はカリシウイルス科ノロウイルス属に属する急性胃腸炎の原因となるウイルスである。ウイルスの粒子は、直径約３８ｎｍの二十面体対称でエンベロープはない。ゲノムは線状非分節型プラス一本鎖ＲＮＡ約７，５００塩基長でＯＲＦ１～ＯＲＦ３を含む。ＯＲＦ１はＮＳ１／２とＮＳ３～ＮＳ７，ＯＲＦ２は、ＶＰ１、ＯＲＦ３はＶＰ２をコードしている。ＶＰ１はＳドメインとＰドメインからなり抗原性を決定する。
【0017】
＜コロナウイルス＞
コロナウイルスは、ウイルス学的にはニドウイルス目・コロナウイルス亜科・コロナウイルス科に分類される。脂質二重膜のエンベロープの中にヌクレオカプシドタンパク質に巻き付いたプラス鎖の一本鎖ＲＮＡのゲノムがあり、エンベロープ表面には、スパイクタンパク質、エンベロープタンパク質、膜タンパク質が配置されている。ウイルスゲノムの大きさは、ＲＮＡウイルスの中では最大サイズの３０ｋｂである。遺伝学的特徴からα、β、γ、δのグループに分類される。ＨＣｏＶ－２２９ＥとＨＣｏＶ－ＮＬ６３はαコロナウイルスに、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１はβコロナウイルスに分類されている。
コロナウイルスは、ウイルス学的にはニドウイルス目・コロナウイルス亜科・コロナウイルス科に分類される。脂質二重膜のエンベロープの中にヌクレオカプシドタンパク質に巻き付いたプラス鎖の一本鎖ＲＮＡのゲノムがあり、エンベロープ表面には、スパイクタンパク質、エンベロープタンパク質、膜タンパク質が配置されている。ウイルスゲノムの大きさは、ＲＮＡウイルスの中では最大サイズの３０ｋｂである。遺伝学的特徴からα、β、γ、δのグループに分類される。ＨＣｏＶ－２２９ＥとＨＣｏＶ－ＮＬ６３はαコロナウイルスに、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１はβコロナウイルスに分類されている。
【0018】
＜＜ウイルスの受容体分子（レセプター）＞＞
ウイルスは、ヒトの細胞表面にある特定の構造を持つ受容体分子に結合することで、ヒトに感染することができる。
ウイルスは、ヒトの細胞表面にある特定の構造を持つ受容体分子に結合することで、ヒトに感染することができる。
【0019】
＜インフルエンザウイルスの受容体分子＞
インフルエンザウイルスの受容体分子は、シアリルラクトサミン構造を有する糖鎖からなる分子である。すなわち，Ａ，Ｂ型インフルエンザウイルスＨＡが認識する受容体糖鎖は，シアル酸を非還元末端に持つシアリルラクト系ＩＩ［Ｓｉａα２－６（３）Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－］糖鎖を基本とし、Ｓｉａα２－３（６）Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃβ１－，Ｓｉａα２－３（６）Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃβ１－等の骨格にも結合する。
インフルエンザウイルスの受容体分子は、シアリルラクトサミン構造を有する糖鎖からなる分子である。すなわち，Ａ，Ｂ型インフルエンザウイルスＨＡが認識する受容体糖鎖は，シアル酸を非還元末端に持つシアリルラクト系ＩＩ［Ｓｉａα２－６（３）Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－］糖鎖を基本とし、Ｓｉａα２－３（６）Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃβ１－，Ｓｉａα２－３（６）Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃβ１－等の骨格にも結合する。
【0020】
＜ノロウイルスの受容体分子＞
ノロウイルスの受容体分子は、ウイルスの遺伝子型によって異なる分子との結合活性が様々報告されている。代表的なものとしては組織血液型抗原上に存在するフコース、ガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミンといった糖鎖分子である。
ノロウイルスの受容体分子は、ウイルスの遺伝子型によって異なる分子との結合活性が様々報告されている。代表的なものとしては組織血液型抗原上に存在するフコース、ガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミンといった糖鎖分子である。
【0021】
＜コロナウイルスの受容体分子＞
コロナウイルスの受容体分子は、ウイルス種によって異なる。例えば、本発明に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体分子は、アンジオテンシン変換酵素２（以下、ＡＣＥ２と略記する。）である。レニン－アンジオテンシン系（ＲＡＳ，ｒｅｎｉｎ－ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ｓｙｓｔｅｍ）内のＩ型膜貫通型メタロカルボキシペプチダーゼであり、人間細胞の細胞膜に存在する酵素領域を持つ膜タンパク質である。ＡＣＥ２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶのレセプターであることが確認されている。また，ＡＣＥ２は、２０１９年に中国で出現した新型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスにおいて侵入レセプターとして機能し、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因となっている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のＡＣＥ２への強力な結合は，ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＭＰＲＳＳ２）によるタンパク質分解的切断とともに，細胞内へのウイルスの侵入、ウイルスの複製および細胞間の感染を促進する。ＡＣＥ２は内皮細胞からＡＤＡＭ１７（ジシンテグリンおよびメタロプロテアーゼ１７）が介在する脱落（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）を受け，細胞外ドメインが循環血液中に放出される。この可溶性ＡＣＥ２はウイルス粒子が表面に結合した完全長ＡＣＥ２の結合を防ぐことで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２や他のコロナウイルスの競合的インターセプターとして機能する可能性がある。また、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｂ３８菌株の遺伝子産物の一つである蛋白構造を持つ酵素Ｂ３８－ＣＡＰが、ヒトＡＣＥ２と酷似していることから、コロナウイルスの受容体分子として利用できる可能性がある。
コロナウイルスの受容体分子は、ウイルス種によって異なる。例えば、本発明に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体分子は、アンジオテンシン変換酵素２（以下、ＡＣＥ２と略記する。）である。レニン－アンジオテンシン系（ＲＡＳ，ｒｅｎｉｎ－ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ｓｙｓｔｅｍ）内のＩ型膜貫通型メタロカルボキシペプチダーゼであり、人間細胞の細胞膜に存在する酵素領域を持つ膜タンパク質である。ＡＣＥ２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶのレセプターであることが確認されている。また，ＡＣＥ２は、２０１９年に中国で出現した新型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスにおいて侵入レセプターとして機能し、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因となっている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のＡＣＥ２への強力な結合は，ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＭＰＲＳＳ２）によるタンパク質分解的切断とともに，細胞内へのウイルスの侵入、ウイルスの複製および細胞間の感染を促進する。ＡＣＥ２は内皮細胞からＡＤＡＭ１７（ジシンテグリンおよびメタロプロテアーゼ１７）が介在する脱落（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）を受け，細胞外ドメインが循環血液中に放出される。この可溶性ＡＣＥ２はウイルス粒子が表面に結合した完全長ＡＣＥ２の結合を防ぐことで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２や他のコロナウイルスの競合的インターセプターとして機能する可能性がある。また、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｂ３８菌株の遺伝子産物の一つである蛋白構造を持つ酵素Ｂ３８－ＣＡＰが、ヒトＡＣＥ２と酷似していることから、コロナウイルスの受容体分子として利用できる可能性がある。
【0022】
＜微粒子＞
微粒子、特に高分子材料からなる微粒子は、臨床血液検査などにおいて特定のタンパク質やウイルスを検出するためのマーカーとして使用されている。微粒子に抗体を担持させ、特定のタンパク質やウイルスを挟み込むことにより、複合体を形成し、凝集物がウェル内部の液中や壁一面に広がった状態となる。検出の対象となるタンパク質やウイルスが存在しない場合には、複合体を形成しないことから凝集は起こらず、ウェル内に沈降する。この方法を用いることでウイルスや抗体の濃度を判定することができる。本発明に用いる微粒子は、液中においてウイルスと特異的に結合する受容体分子をコーティングできることが必要である。微粒子としては、ポリスチレン系高分子からなる微粒子を挙げることができ、具体的にはラテックスビーズが利用できる。
微粒子、特に高分子材料からなる微粒子は、臨床血液検査などにおいて特定のタンパク質やウイルスを検出するためのマーカーとして使用されている。微粒子に抗体を担持させ、特定のタンパク質やウイルスを挟み込むことにより、複合体を形成し、凝集物がウェル内部の液中や壁一面に広がった状態となる。検出の対象となるタンパク質やウイルスが存在しない場合には、複合体を形成しないことから凝集は起こらず、ウェル内に沈降する。この方法を用いることでウイルスや抗体の濃度を判定することができる。本発明に用いる微粒子は、液中においてウイルスと特異的に結合する受容体分子をコーティングできることが必要である。微粒子としては、ポリスチレン系高分子からなる微粒子を挙げることができ、具体的にはラテックスビーズが利用できる。
【0023】
本発明で用いられるラテックスビーズは特に制限はないが、例えば、ＭＢＬライフサイエンス社製「ＩＭＭＵＴＥＸ（商品名）」（公称直径：０．０５～０．４６μｍ）、藤倉化成（株）製ラテックス微粒子（粒子径：１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍの３種。）、積水メディカル株式会社製「ナノピア（商品名）」、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製「ラテックスビーズ」（粒子径：０．８μｍ）が利用できる。
【0024】
＜ウイルスの力価（ウイルス力価）の判定方法＞
検体は、ウイルスを含有する溶液である。
微粒子、ウイルスの受容体分子が担持されたラテックス微粒子である。
試験プレートの列のｎ個のウェルに、緩衝液（具体的にはＰＢＳを使用。）でａｎ毎（ａｎ＝２ｎ、ｎは１以上の整数である。具体的にはｎが１、２、３、４、５、６、７、及び８に対応するａｎ＝２、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６）に希釈した検体を入れ、さらに一定量の微粒子を含有する溶液を加えて混合し、１～２４時間、好ましくは２～１５時間、より好ましくは６～１５時間静置し、凝集の状態を観察することで、ウイルス力価を判定することができる（力価判定ライン）。陰性対照はウイルスなしの検体を使用する。
検体は、ウイルスを含有する溶液である。
微粒子、ウイルスの受容体分子が担持されたラテックス微粒子である。
試験プレートの列のｎ個のウェルに、緩衝液（具体的にはＰＢＳを使用。）でａｎ毎（ａｎ＝２ｎ、ｎは１以上の整数である。具体的にはｎが１、２、３、４、５、６、７、及び８に対応するａｎ＝２、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６）に希釈した検体を入れ、さらに一定量の微粒子を含有する溶液を加えて混合し、１～２４時間、好ましくは２～１５時間、より好ましくは６～１５時間静置し、凝集の状態を観察することで、ウイルス力価を判定することができる（力価判定ライン）。陰性対照はウイルスなしの検体を使用する。
【0025】
＜抗体の力価（抗体価）の判定方法＞
検体は、血清である。
微粒子は、ウイルスの受容体分子が担持されたラテックス微粒子である。
試験プレートの列のｎ個のウェルに、緩衝液でａｎ毎（ａｎ＝１０×２ｎ－１、ｎは１以上の整数である。具体的にはｎが１、２、３、４、５、６、７、及び８に対応するａｎ＝１０、２０、４０、８０、１６０、３２０、６４０、１２８０）に希釈した検体を入れ、さらに一定量のウイルスを加えて、混合し、室温で１時間程度静置し、さらに一定量の微粒子を含有する溶液を加えて混合し、室温で静置する。静置時間は特に限定されないが、１～２４時間程度静置させる。凝集阻止効果の状態を観察し、抗体の力価を判定する。
凝集対照は血清なし、沈降対照はＰＢＳと微粒子を含有する溶液を使用する。
検体は、血清である。
微粒子は、ウイルスの受容体分子が担持されたラテックス微粒子である。
試験プレートの列のｎ個のウェルに、緩衝液でａｎ毎（ａｎ＝１０×２ｎ－１、ｎは１以上の整数である。具体的にはｎが１、２、３、４、５、６、７、及び８に対応するａｎ＝１０、２０、４０、８０、１６０、３２０、６４０、１２８０）に希釈した検体を入れ、さらに一定量のウイルスを加えて、混合し、室温で１時間程度静置し、さらに一定量の微粒子を含有する溶液を加えて混合し、室温で静置する。静置時間は特に限定されないが、１～２４時間程度静置させる。凝集阻止効果の状態を観察し、抗体の力価を判定する。
凝集対照は血清なし、沈降対照はＰＢＳと微粒子を含有する溶液を使用する。
【0026】
＜分離株の抗原性解析＞
抗原性比較の基準となるコントロール（参照株）を利用する以外は、抗体の力価（抗体価）の判定方法と同様に判定した。参照株のウイルスに対する抗体価（相同抗体価）と、抗原性解析対象のウイルス株に対する抗体価を比較して、お互いに抗原的に近いのか乖離しているのかを評価する。
抗原性比較の基準となるコントロール（参照株）を利用する以外は、抗体の力価（抗体価）の判定方法と同様に判定した。参照株のウイルスに対する抗体価（相同抗体価）と、抗原性解析対象のウイルス株に対する抗体価を比較して、お互いに抗原的に近いのか乖離しているのかを評価する。
【実施例0027】
以下、実施例、比較例を用いて、本願発明を詳細に説明する。
【0028】
＜＜使用器具、試薬、ウイルス＞＞
・微粒子（ラテックス微粒子）：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製「ラテックスビーズ」（粒子径０．８μｍ）。
・試験プレート：ビオラモ社製の９６ウェルプレート
・血清：国立感染症研究所で作製、入手したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスター抗血清。
・ＰＢＳ：塩化ナトリウム８．００（ｇ／Ｌ）、リン酸水素２ナトリウム・１２水和物 ２．８９（ｇ／Ｌ）、リン酸水素カリウム ０．２０（ｇ／Ｌ）、塩化カリウム ０．２０（ｇ／Ｌ）を精製水で１Ｌにメスアップし、０．２２μｍフィルターで濾過して使用。
・ウイルス：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（国立感染症研究所から入手）。
・微粒子（ラテックス微粒子）：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製「ラテックスビーズ」（粒子径０．８μｍ）。
・試験プレート：ビオラモ社製の９６ウェルプレート
・血清：国立感染症研究所で作製、入手したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスター抗血清。
・ＰＢＳ：塩化ナトリウム８．００（ｇ／Ｌ）、リン酸水素２ナトリウム・１２水和物 ２．８９（ｇ／Ｌ）、リン酸水素カリウム ０．２０（ｇ／Ｌ）、塩化カリウム ０．２０（ｇ／Ｌ）を精製水で１Ｌにメスアップし、０．２２μｍフィルターで濾過して使用。
・ウイルス：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（国立感染症研究所から入手）。
【0029】
実施例１
（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の力価（ウイルス力価）の判定）
検体は、国立感染症研究所から供試されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含有する溶液を用いた。
ラテックス微粒子（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体分子であるヒトＡＣＥ２を、４℃で２４時間程度混合することにより担持させた。
次に１種類の検体毎に、２、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６倍になるようにＰＢＳで希釈し、９６ウェルプレートの列のウェルに５０μｌ入れ、さらにそれぞれのウェルに５０μｌの微粒子溶液を加えて混合し、一晩（約１２時間）静置し、凝集の状態を目視で確認した（図２の上図）。１１種類の検体を使用し、１つのコントロール（陰性対照：ウイルスなし）を使用した。結果の模式図を図２の下図に示す。
図２において、「●」が凝集陽性ウェルであり、「◎」が凝集陰性（沈降）ウェルであり、「－」が、力価判定ラインである。また、１～１１が検体であり、１２がコントロールである。
（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の力価（ウイルス力価）の判定）
検体は、国立感染症研究所から供試されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含有する溶液を用いた。
ラテックス微粒子（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体分子であるヒトＡＣＥ２を、４℃で２４時間程度混合することにより担持させた。
次に１種類の検体毎に、２、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６倍になるようにＰＢＳで希釈し、９６ウェルプレートの列のウェルに５０μｌ入れ、さらにそれぞれのウェルに５０μｌの微粒子溶液を加えて混合し、一晩（約１２時間）静置し、凝集の状態を目視で確認した（図２の上図）。１１種類の検体を使用し、１つのコントロール（陰性対照：ウイルスなし）を使用した。結果の模式図を図２の下図に示す。
図２において、「●」が凝集陽性ウェルであり、「◎」が凝集陰性（沈降）ウェルであり、「－」が、力価判定ラインである。また、１～１１が検体であり、１２がコントロールである。
【0030】
比較例１
（従来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の力価（ウイルス力価）の判定）
ＢＳＬ３施設において、９６ウェル培養プレートに播種されたＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞に、感染性のあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を緩衝液（具体的には細胞培養用培地Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍを使用。）でａｎ毎（ａｎ＝１０ｎ、ｎは１以上の整数である。具体的にはｎが１、２、３、４、５、６、７、及び８に対応するａｎ＝１０１～１０８）に希釈して接種し、感染細胞に誘導されるＣＰＥ（細胞変性効果）の出現の有無を顕微鏡下で観察した。その結果、３日経過後にＣＰＥを観察できた。
（従来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の力価（ウイルス力価）の判定）
ＢＳＬ３施設において、９６ウェル培養プレートに播種されたＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞に、感染性のあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を緩衝液（具体的には細胞培養用培地Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍを使用。）でａｎ毎（ａｎ＝１０ｎ、ｎは１以上の整数である。具体的にはｎが１、２、３、４、５、６、７、及び８に対応するａｎ＝１０１～１０８）に希釈して接種し、感染細胞に誘導されるＣＰＥ（細胞変性効果）の出現の有無を顕微鏡下で観察した。その結果、３日経過後にＣＰＥを観察できた。
【0031】
実施例２
（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗体の力価（抗体価）の判定）
検体は、国立感染症研究所から供試されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染ハムスターから得られた血清を用いた。
ラテックス微粒子（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体分子であるｈＡＣＥ２を、４℃で２４時間程度混合することにより担持させた。
次に１種類の検体である血清毎に、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０、６４０、１２８０倍になるようにＰＢＳで希釈し、９６ウェルプレートの列のウェルに２５μｌ入れ、さらにそれぞれのウェルに２５μｌのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを含む溶液を加えて、混合し、室温で１時間程度静置し、さらに５０μｌの微粒子溶液を加えて混合し、一晩（約１２時間）静置し、凝集阻害の状態を目視で確認した（図３）。１０種類の検体を使用し、１つのコントロール（参照株）を使用した。結果の模式図を図３の下図に示す。
図３において、「◎」が凝集阻止陽性ウェルであり、「●」が凝集阻止陰性（凝集）ウェルであり、「－」が、力価判定ラインである。また、１～１１が検体であり、１２が対象列である
凝集対照は血清なし、沈降対照はＰＢＳと微粒子を含有する溶液を使用した。
（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗体の力価（抗体価）の判定）
検体は、国立感染症研究所から供試されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染ハムスターから得られた血清を用いた。
ラテックス微粒子（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体分子であるｈＡＣＥ２を、４℃で２４時間程度混合することにより担持させた。
次に１種類の検体である血清毎に、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０、６４０、１２８０倍になるようにＰＢＳで希釈し、９６ウェルプレートの列のウェルに２５μｌ入れ、さらにそれぞれのウェルに２５μｌのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを含む溶液を加えて、混合し、室温で１時間程度静置し、さらに５０μｌの微粒子溶液を加えて混合し、一晩（約１２時間）静置し、凝集阻害の状態を目視で確認した（図３）。１０種類の検体を使用し、１つのコントロール（参照株）を使用した。結果の模式図を図３の下図に示す。
図３において、「◎」が凝集阻止陽性ウェルであり、「●」が凝集阻止陰性（凝集）ウェルであり、「－」が、力価判定ラインである。また、１～１１が検体であり、１２が対象列である
凝集対照は血清なし、沈降対照はＰＢＳと微粒子を含有する溶液を使用した。
【0032】
比較例２
（従来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗体価（抗体の力価）の判定）
１種類の検体である血清毎に、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０、６４０、１２８０倍になるように緩衝液（具体的には細胞培養用培地Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍを使用。）で希釈したものを９６ウェルプレートの列のウェルに５０μｌ入れ、さらにそれぞれのウェルにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを含む溶液を５０μｌ加えて混合し、室温で１時間程度静置した。この血清希釈液とウイルス液の混合液を別途９６ウェル培養プレートに播種されたＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞に接種し感染細胞に誘導されるＣＰＥ（細胞変性効果）の出現の有無を継時的に顕微鏡下で観察した。
その結果、抗体によるウイルス感染阻害が生じなかったウェルでは接種後３日経過後にＣＰＥが出現する一方で、抗体によってウイルス感染が阻害されたウェルでは接種後１週間経過してもＣＰＥが出現しなかった。ＣＰＥが出現しなかったウェル列のうち最も大きい血清希釈倍数をもって、その検体の抗体価とした。
（従来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗体価（抗体の力価）の判定）
１種類の検体である血清毎に、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０、６４０、１２８０倍になるように緩衝液（具体的には細胞培養用培地Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍを使用。）で希釈したものを９６ウェルプレートの列のウェルに５０μｌ入れ、さらにそれぞれのウェルにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを含む溶液を５０μｌ加えて混合し、室温で１時間程度静置した。この血清希釈液とウイルス液の混合液を別途９６ウェル培養プレートに播種されたＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞に接種し感染細胞に誘導されるＣＰＥ（細胞変性効果）の出現の有無を継時的に顕微鏡下で観察した。
その結果、抗体によるウイルス感染阻害が生じなかったウェルでは接種後３日経過後にＣＰＥが出現する一方で、抗体によってウイルス感染が阻害されたウェルでは接種後１週間経過してもＣＰＥが出現しなかった。ＣＰＥが出現しなかったウェル列のうち最も大きい血清希釈倍数をもって、その検体の抗体価とした。
【0033】
実施例３
実施例２の結果を用いて、分離株株抗原性解析を行った。
具体的な方法については、図４を用いて説明する。縦には、参照株と抗原性解析対象供試分離株であるＡ～Ｊ株と対照株が示されている。横には、１０～１２８０の抗体価が示されている。
ここで、例えば、参照株との抗体価（相同抗体価）３２０に比し、Ｆ～Ｊ株との抗体価は低値（４０以下）であるため、参照株とＦ～Ｊ株とは互いに抗原的に乖離していると判定した。
実施例２の結果を用いて、分離株株抗原性解析を行った。
具体的な方法については、図４を用いて説明する。縦には、参照株と抗原性解析対象供試分離株であるＡ～Ｊ株と対照株が示されている。横には、１０～１２８０の抗体価が示されている。
ここで、例えば、参照株との抗体価（相同抗体価）３２０に比し、Ｆ～Ｊ株との抗体価は低値（４０以下）であるため、参照株とＦ～Ｊ株とは互いに抗原的に乖離していると判定した。
【産業上の利用可能性】
【0034】
本発明のウイルスに係る力価を判定する方法を用いることで、生細胞を用いずにウイルス存否の判定が容易にできることから、ウイルスの存否判定の簡易キットとすることが可能である。またウイルス抗原液を併用し抗体価を判定する方法を用いて患者血清中の抗体存否判定のキットとすることが可能である。
【符号の説明】
【0035】
１：リガンド吸着用担体用の微粒子
２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２受容体分子（ヒトＡＣＥ２）
３：Ｔａｇ
４：ヒトＡＣＥ２を担持した微粒子
５：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２
６：凝集塊
２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２受容体分子（ヒトＡＣＥ２）
３：Ｔａｇ
４：ヒトＡＣＥ２を担持した微粒子
５：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２
６：凝集塊
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
