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特開2024-37778生物学的に関連する直交サイトカイン／受容体対

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024037778

(43)【公開日】2024-03-19

(54)【発明の名称】生物学的に関連する直交サイトカイン／受容体対

(51)【国際特許分類】

C07K 14/55 20060101AFI20240312BHJP

C12N 15/26 20060101ALN20240312BHJP

【ＦＩ】

C07K14/55 ZNA

C12N15/26

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023204147

(22)【出願日】2023-12-01

(62)【分割の表示】P 2020571337の分割

【原出願日】2019-03-08

(31)【優先権主張番号】15/916,689

(32)【優先日】2018-03-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】515158308

【氏名又は名称】ザボードオブトラスティーズオブザレランドスタンフォードジュニアユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100114557

【弁理士】

【氏名又は名称】河野英仁

(74)【代理人】

【識別番号】100078868

【弁理士】

【氏名又は名称】河野登夫

(72)【発明者】

【氏名】ガルシア，キーナンクリストファー

(72)【発明者】

【氏名】ソコロスキー，ジョナサン

(72)【発明者】

【氏名】ピクトン，ローラ

(57)【要約】（修正有）

【課題】操作された直交サイトカイン受容体／リガンド対、およびその使用方法を提供する。
【解決手段】操作されたヒトＩＬ－２ポリペプチドは、（ｉ）天然ヒトＣＤ１２２への大幅に低減された結合を有し、かつ（ｉｉ）残基Ｔ５１、Ｒ８１において天然タンパク質以外のアミノ酸による少なくとも１つのアミノ酸置換を含むか、またはアミノ酸置換Ｍ２３Ａを含み、かつ（ｉｉｉ）Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０のそれぞれにおいてアミノ酸置換を含む。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）天然ヒトＣＤ１２２への大幅に低減された結合を有し、かつ（ｉｉ）残基Ｔ５１、Ｒ８１において天然タンパク質以外のアミノ酸による少なくとも１つのアミノ酸置換を含むか、またはアミノ酸置換Ｍ２３Ａを含み、かつ（ｉｉｉ）Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０のそれぞれにおいてアミノ酸置換を含む、操作されたヒトＩＬ－２ポリペプチド。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

細胞、特に免疫細胞を分化させ、固有の機能を発達させ、数を拡大させるための操作は、臨床的に非常に関心があるものである。特にサイトカインおよびケモカインを含む、これらの活性に影響を与える多くのタンパク質因子が当該技術分野で既知である。しかしながら、これらのシグナル伝達分子はまた、操作のために標的化されていない細胞に多面的効果も有するため、標的細胞集団におけるシグナル伝達を選択的に活性化する方法が望ましい。特に、制御された挙動を行うためのＴ細胞の操作は関心があるものである。例えば、養子免疫療法において、Ｔ細胞は、血液から単離され、エクスビボで処理され、患者に再注入される。Ｔ細胞は、癌細胞、細胞内病原体、および自己免疫に関与する細胞の認識および殺傷などの治療用途で使用するために操作されている。

【0002】

細胞に基づく療法における重要な課題は、内因性シグナル伝達経路から保護され、非標的内因性細胞に影響を与えず、患者に一度投与されると制御され得る、活性化、拡大などの所望の挙動を養子移入細胞に操作することである。これは、発達可塑性、ならびに環境因子がＴ細胞の運命、機能、および局在化を決定する際に果たす巨大な影響のために、Ｔ細胞工学に特に関連がある。

【0003】

タンパク質を操作して、天然タンパク質またはリガンドの影響から独立した、または直交する様式で修飾リガンドに結合し、応答する能力は、タンパク質工学における重大な課題を構成する。これまで、類似の自然相互作用に直交する多数の合成リガンド－オルソログ受容体対が作製されている。この作業に使用されるタンパク質の中には、核ホルモン受容体およびＧタンパク質結合受容体が含まれる。合成小分子リガンドによって活性化される受容体を操作するために広範な作業が行われたにもかかわらず、生物学的に関連するタンパク質の対の操作は依然として重大な課題である。

【発明の概要】

【0004】

操作された直交サイトカイン受容体／リガンド対、およびその使用方法が提供される。操作された（直交）サイトカインは、対応物操作された（直交）受容体に特異的に結合する。結合すると、直交受容体は、天然細胞要素を介して形質導入されるシグナル伝達を活性化して、その天然応答を模倣するが、直交受容体を発現する操作された細胞に特異的な生物学的活性を提供する。直交受容体は、直交サイトカインの天然対応物を含む、内因性対応物サイトカインへの大幅に低減した結合を示す一方で、直交サイトカインは、直交受容体の天然対応物を含む、任意の内因性受容体への大幅に低減した結合を示す。いくつかの実施形態において、直交受容体に対する直交サイトカインの親和性は、天然受容体に対する天然サイトカインの親和性と同等である。

【0005】

直交サイトカイン受容体対を操作するためのプロセスは、（ａ）天然サイトカインへの結合を妨害するために、天然受容体にアミノ酸変化を操作するステップ、（ｂ）受容体結合のための接触残基において天然サイトカインに選択的アミノ酸変化を有する複数のサイトカイン類似体を生成するステップ、（ｃ）オルソログ受容体に結合するサイトカインオルソログについて選択するステップ、（ｄ）天然受容体に顕著に結合するオルソログサイトカインを廃棄するステップ、またはステップ（ｃ）および（ｄ）の代わりとなるもの、（ｅ）オルソログサイトカインに結合する受容体オルソログについて選択するステップ、（ｆ）天然サイトカインに結合するオルソログ受容体を廃棄するステップを含む。好ましい実施形態において、サイトカイン／受容体複合体の構造に関する知識を使用して、部位特異的またはエラーが発生しやすい突然変異誘発のためのアミノ酸位置を選択する。好都合に、酵母ディスプレイ系が選択プロセスに使用され得るが、他のディスプレイおよび選択方法も有用である。

【0006】

いくつかの実施形態において、本発明の直交受容体の導入によって細胞が修飾されている操作された細胞が提供される。この目的には、任意の細胞が使用され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞、細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔ_Ｈ１、Ｔ_Ｈ２、Ｔ_Ｈ９、Ｔ_Ｈ１１、Ｔ_Ｈ２２、Ｔ_ＦＨ、制御性Ｔ細胞、例えば、Ｔ_Ｒ１、天然Ｔ_Ｒｅｇ、誘導性Ｔ_Ｒｅｇ、メモリーＴ細胞、例えば、中央メモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞、およびＣＡＲ－Ｔ細胞を含むそのようなＴ細胞の操作された変異型などを含むが、これらに限定されないＴ細胞である。他の実施形態において、操作された細胞は、幹細胞、例えば、造血幹細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、または樹状細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、対象に移行する前に、エクスビボ手順で遺伝子組換えされる。操作された細胞は、療法のための単位用量で提供することができ、意図されるレシピエントに関して同種、自己等であり得る。

【0007】

いくつかの実施形態において、直交受容体をコードするポリヌクレオチドコード配列を含むベクターが提供され、コード配列は、所望の細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結される。様々なベクター、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、ミニサークルベクターが当該技術分野で既知であり、この目的のために使用され得、これらのベクターは、標的細胞ゲノムに組み込まれ得るか、またはエピソームにより維持され得る。ベクターをコードする受容体は、受容体に結合し、それを活性化する直交サイトカインをコードするベクターと組み合わせて、キットにおいて提供され得る。いくつかの実施形態において、直交サイトカインのコード配列は、高発現プロモーターに作動可能に連結され、産生のために最適化され得る。他の実施形態において、直交受容体をコードするベクターが、患者への投与のためにパッケージ化された、例えば、単位用量（例えば、予め充填されたシリンジ）で、直交サイトカインの精製組成物で提供されるキットが提供される。またいくつかの他の実施形態において、直交受容体をコードするベクターが、細胞における直交受容体の発現、ならびに自己分泌直交サイトカイン受容体シグナル伝達を可能にするために同じ細胞による分泌を意図した直交サイトカインの発現も可能にするために直交サイトカインをコードするベクターで提供されるキットが提供される。

【0008】

いくつかの実施形態において、治療方法が提供され、本方法は、操作された細胞集団をそれを必要とするレシピエントに導入することを含み、細胞集団は、本発明の直交受容体をコードする配列の導入により修飾されている。細胞集団は、エクスビボで操作され得、通常、レシピエントに関して自己または同種である。いくつかの実施形態において、導入された細胞集団は、操作された細胞の投与後、インビボで同族直交サイトカインと接触させられる。本発明の利点は、直交サイトカインと天然受容体との間の交差反応性の欠如である。

【0009】

本発明は、添付の図面と併せて読んだときに、以下の詳細な説明から最もよく理解される。一般的な慣行に従い、図面の様々な特徴は原寸ではないことが強調される。むしろ、様々な特徴の寸法は、明確にするために任意に拡大または縮小される。図面には以下の図が含まれる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】Ｔ細胞の拡大を制御するための直交ＩＬ－２／ＩＬ－２受容体対を示す。

【図2】直交ＩＬ－２／ＩＬ－２Ｒβ対を操作するためのワークフローを示す。

【図3】直交マウスＩＬ－２Ｒβ変異型の配列を示す。

【図4】ｍＩＬ－２ＲβＨ１３４ＤＹ１３５Ｆ変異は、ｗｔｍＩＬ－２結合を抑制する。

【図5】直交ＩＬ－２／ＩＬ－２Ｒβ対を操作するためのワークフローを示す。

【図6】特徴付けられた直交マウスＩＬ－２変異型の配列を示す。

【図7】ｏｒｔｈｏＩＬ－２変異型は、野生型ＩＬ－２およびＩＬ－２Ｒβ相互作用と同様またはそれ以上の親和性でｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒβに結合する。

【図8】ｏｒｔｈｏＩＬ－２変異型は、野生型ＣＤ２５陽性およびＣＤ２５陰性脾細胞に対して鈍化した活性（ｐｈｏｓｐｈｏＳＴＡＴ５）を示す。

【図9】ｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒ発現マウスＣＴＬＬ－２Ｔ細胞の生成を示す。

【図10】ｏｒｔｈｏＩＬ－２変異型の第１のセットは、ｏｒｔｈｏＴ細胞に対して選択的である。

【図11】ｏｒｔｈｏＩＬ－２変異型は、ｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒβ発現ＣＴＬＬ－２細胞上で選択的ＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する。

【図12】ｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒβ（Ｈ１３４ＤＹ１３５Ｆ）を発現するように操作された初代リンパ節由来Ｔ細胞を示す。

【図13】ｏｒｔｈｏＩＬ－２変異型は、ｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒβ発現初代マウスＴ細胞上で選択的ＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する。

【図14】ｏｒｔｈｏＩＬ－２変異型は、野生型Ｔ細胞と比較して、ｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒβ発現ＣＴＬＬ－２細胞の選択的細胞成長を誘導する。

【図15】マウスおよびヒト参照ＩＬ－２Ｒβ／ＩＬ－２配列のアライメントを示す。ヒトＩＬ－２Ｒβの部分配列は、配列番号１、残基１～２３５として提供され、マウスＩＬ－２Ｒβの部分配列は、配列番号２、残基１～２３８として提供される。マウスＩＬ－２は、配列番号３として提供される。ヒトＩＬ－２は、配列番号４として提供される。

【図16A】直交ヒトＩＬ－２対の酵母進化を示す。野生型（青色ヒストグラム）には結合するが、ｏｒｔｈｏ（赤色ヒストグラム）ヒトＩＬ－２ＲβＨ１３３ＤＹ１３４Ｆ変異四量体には結合しない酵母ディスプレイ野生型ヒトＩＬ－２のＦＡＣＳ分析を示す。

【図16B】直交ヒトＩＬ－２対の酵母進化を示す。ヒトＩＬ－２Ｒβ ＨＹ変異体に近接しているか、または接触していると予測されるＩＬ－２残基をランダム化するヒトＩＬ－２変異体（約１^８の変異体）のライブラリを、酵母の表面上にディスプレイした。一連の陽性（ｏｒｔｈｏｈＩＬ－２Ｒβに対して）および陰性（野生型ｈＩＬ－２Ｒβに対して）両方の選択を連続して繰り返した後、ｏｒｔｈｏ（赤色ヒストグラム）には結合するが野生型（青色ヒストグラム）ヒトＩＬ－２Ｒβ四量体には結合しない酵母ディスプレイヒトＩＬ－２変異体を得た。

【図16C】直交ヒトＩＬ－２対の酵母進化を示す。ｏｒｔｈｏｈＩＬ－２変異体をその後単離し、酵母ライブラリから配列決定した。ｏｒｔｈｏｈＩＬ－２Ｒβに結合可能なｏｒｔｈｏｈＩＬ－２配列の収束を示す変異のコンセンサスセットが同定された。

【図16D】直交ヒトＩＬ－２対の酵母進化を示す。ｏｒｔｈｏｈＩＬ－２変異体をその後単離し、酵母ライブラリから配列決定した。ｏｒｔｈｏｈＩＬ－２Ｒβに結合可能なｏｒｔｈｏｈＩＬ－２配列の収束を示す変異のコンセンサスセットが同定された。

【図17】マウスにおける直交ＩＬ－２Ｒｂ発現Ｔ細胞の選択的拡大または生存増加を示すために使用されたインビボマウスモデルを示す。ドナー細胞を、ＣＤ４５．２を発現する野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脾臓から単離し、ＣＤ３／ＣＤ２８でエクスビボで活性化し、直交ＩＬ－２Ｒｂ－ＩＲＥＳ－ＹＦＰをコードするレトロウイルスで形質導入し、１００ＩＵ／ｍＬのｍＩＬ－２中で２日間拡大させ、マウスＣＤ８Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して精製した。野生型（ＣＤ４５．２陽性、ＹＦＰ陰性）および直交ＩＬ－２Ｒｂ発現Ｔ細胞（ＣＤ４５．２陽性、ＹＦＰ陽性）の約１：１混合物を、レシピエントＢＬ６．Ｒａｇ２^－／－ × ＩＬ２ｒｇ^－／－ＣＤ４５．１マウスに、後眼窩注射を介して養子移入した。ＰＢＳ、野生型ｍＩＬ－２（１５０，０００ＩＵ／マウス）、またはｏｒｔｈｏＩＬ－２クローン１Ｇ１２／１４９（１，０００，０００ＩＵ／マウス）を、Ｔ細胞移行直後（Ｄ０）から毎日ＩＰ注射し、２４時間間隔で５日間連続して（最大Ｄ４）注射した。マウスをＤ５およびＤ７で屠殺し、マウスの血液および脾臓中の総ドナーＴ細胞数をフローサイトメトリーによって定量化した。

【図18A】レシピエントマウスにおけるドナーＴ細胞の拡大を定量化するために使用されたゲーティング戦略を示す。マウス血液からの単一細胞懸濁液を調製し、ドナーＴ細胞を同定するために、ＣＤ４５．２－パシフィックブルーで、４Ｃで１時間染色した。フローサイトメトリー細胞の直前に、生／死除外のためのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の１：２０００希釈とともにインキュベートした。細胞を、前方および側方散乱（ＳＳＣ－ＡｖＦＳＣ－Ａ）、一重項（ＦＳＣ－ＡｖＦＳＣ－Ｈ）、生細胞（ＰＩ陰性）に基づいてゲーティングし、野生型Ｔ細胞（ＣＤ４５．２陽性、ＹＦＰ陰性）および直交Ｔ細胞（ＣＤ４５．２陽性、ＹＦＰ陽性）の総数をＦＡＣＳを介して定量化した。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｐｒｉｓｍを使用した一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。

【図18B】レシピエントマウスにおけるドナーＴ細胞の拡大を定量化するために使用されたゲーティング戦略を示す。マウス脾臓からの単一細胞懸濁液を調製し、ドナーＴ細胞を同定するために、ＣＤ４５．２－パシフィックブルーで、４Ｃで１時間染色した。フローサイトメトリー細胞の直前に、生／死除外のためのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の１：２０００希釈とともにインキュベートした。細胞を、前方および側方散乱（ＳＳＣ－ＡｖＦＳＣ－Ａ）、一重項（ＦＳＣ－ＡｖＦＳＣ－Ｈ）、生細胞（ＰＩ陰性）に基づいてゲーティングし、野生型Ｔ細胞（ＣＤ４５．２陽性、ＹＦＰ陰性）および直交Ｔ細胞（ＣＤ４５．２陽性、ＹＦＰ陽性）の総数をＦＡＣＳを介して定量化した。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｐｒｉｓｍを使用した一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。

【図19】ｏｒｔｈｏＩＬ－２クローン１Ｇ１２／１４９は、マウスにおいて、野生型Ｔ細胞ではなく、直交を選択的に拡大する。図１８に記載されるように、フローサイトメトリーを介して、血液中（１０^３細胞／ｕＬ）および脾臓（脾臓当たりの細胞の総数）の野生型および直交Ｔ細胞の数を定量化した。直交Ｔ細胞と野生型Ｔ細胞との比率は、直交Ｔ細胞の総数を血液および脾臓中の野生型Ｔ細胞の総数で除することによって決定した。１を超える比率は、直交Ｔ細胞の選択的拡大を示し、これは、ｏｒｔｈｏＩＬ－２クローン１Ｇ１２／１４９で達成される。５日目（上）および７日目（下）の血液（左）および脾臓（右）中の生細胞の総数を、フローサイトメトリーを介して定量化した。野生型ＩＬ－２での処理は、ＰＢＳ対照と比較して野生型およびｏｒｔｈｏＴ細胞の両方の拡大をもたらすが、ｏｒｔｈｏＩＬ－２クローン１Ｇ１２／１４９での処理は、野生型Ｔ細胞上で活性が制限されたｏｒｔｈｏＴ細胞を選択的に拡大する。

【図20A】直交ＩＬ－２は、直交ＩＬ－２ＲβＴ細胞上で選択的活性を有する。ＩＬ－２ＫＯＮＯＤマウスから単離され、ｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒβを発現するようにウイルス形質導入された初代脾臓由来マウスＴ細胞のＦＡＣＳ分析であり、これは、ＩＲＥＳ－ＹＦＰレポーターおよびＩＬ－２Ｒβの表面染色を使用して確認することができる。

【図20B】直交ＩＬ－２は、直交ＩＬ－２ＲβＴ細胞上で選択的活性を有する。Ｔ細胞はまた、野生型ＩＬ－２Ｒβの発現も保持する。ｏｒｔｈｏＩＬ－２は、ｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒβ発現Ｔ細胞上で選択的ＳＴＡＴ５リン酸化を誘導し、野生型Ｔ細胞上で活性なしに鈍化した。

【図21A】直交ＩＬ－２は、インビトロで直交ＩＬ－２Ｒβ Ｔ細胞を選択的に拡大する。ＩＲＥＳ－ＹＦＰを使用して確認することができる、ｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒβを発現するようにウイルス形質導入された初代脾臓由来マウスＴ細胞のＦＡＣＳ分析。形質導入および非形質導入Ｔ細胞の混合物を、様々な濃度の野生型、ｏｒｔｈｏＩＬ－２クローン１Ｇ１２、または３Ａ１０で５日間培養し、ＦＡＣＳで分析した。ＩＬ－２は、野生型およびｏｒｔｈｏＴ細胞の両方を拡大するが、ｏｒｔｈｏＩＬ－２３Ａ１０で培養されると、ｏｒｔｈｏＴ細胞のみが拡大する一方で、ｏｒｔｈｏＩＬ－２１Ｇ１２は、野生型Ｔ細胞上で有意に低減された活性を有するｏｒｔｈｏＴ細胞を選択的に拡大する。１００ｎＭのＩＬ－２、６４ｐＭのｏｒｔｈｏＩＬ－２１Ｇ１２、および１０μＭのｏｒｔｈｏＩＬ－２３Ａ１０における培養に対応するＦＡＣＳプロットを示す。

【図21B】直交ＩＬ－２は、インビトロで直交ＩＬ－２Ｒβ Ｔ細胞を選択的に拡大する。サイトカインの増加濃度で５日間培養した後の野生型ならびにｏｒｔｈｏＩＬ－２クローン１Ｇ１２および３Ａ１０に対する野生型およびｏｒｔｈｏＴ細胞増殖用量応答。ＩＬ－２は、等しい効力で野生型およびｏｒｔｈｏＴ細胞の両方を拡大し、ｏｒｔｈｏＩＬ－２１Ｇ１２は、ｏｒｔｈｏＴ細胞を選択的に拡大し、ｏｒｔｈｏＩＬ－２３Ａ１０は、ｏｒｔｈｏＴ細胞を特異的に拡大する。

【図22A】インビトロでＹＴ細胞において発現されるｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒを介したｏｒｔｈｏヒトＩＬ－２シグナルを示す。２０分間の刺激後のＳＴＡＴ５リン酸化の用量応答を示す。Ｓｔａｔ５のリン酸化は、（ＹＦＰ－、ＷＴ）なし、または（ＹＦＰ＋、ｏｒｔｈｏ）ヒトｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒｂとともに、ヒトＣＤ２５（ＹＴ＋）を発現するＹＴヒトＮＫ細胞株において測定された。ヒトＩＬ－２のマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）融合物を、ＲＰＭＩ完全培地において滴定し、細胞に添加した。ＷＴ（ＹＦＰ－）およびｏｒｔｈｏＲｂ（ＹＦＰ＋）細胞のＡＰＣ－ｐＳｔａｔ５染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、サイトカインの濃度に対してプロットし、Ｐｒｉｓｍ５（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ）モデルに適合させた。１Ｃ７を、他のタンパク質とは別の日に実行し、両日とも野生型ＩＬ－２染色の実行に正規化した。全てのデータは、平均（ｎ＝３）±ＳＤとして提示される。

【図22B】インビトロでＹＴ細胞において発現されるｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒを介したｏｒｔｈｏヒトＩＬ－２シグナルを示す。２０分間の刺激後のＳＴＡＴ５リン酸化の用量応答を示す。Ｓｔａｔ５のリン酸化は、（ＹＦＰ－、ＷＴ）なし、または（ＹＦＰ＋、ｏｒｔｈｏ）ヒトｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒｂとともに、ヒトＣＤ２５（ＹＴ＋）を発現するＹＴヒトＮＫ細胞株において測定された。直交変異型１Ａ１のマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）融合物を、ＲＰＭＩ完全培地において滴定し、細胞に添加した。ＷＴ（ＹＦＰ－）およびｏｒｔｈｏＲｂ（ＹＦＰ＋）細胞のＡＰＣ－ｐＳｔａｔ５染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、サイトカインの濃度に対してプロットし、Ｐｒｉｓｍ５（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ）モデルに適合させた。１Ｃ７を、他のタンパク質とは別の日に実行し、両日とも野生型ＩＬ－２染色の実行に正規化した。全てのデータは、平均（ｎ＝３）±ＳＤとして提示される。

【図22C】インビトロでＹＴ細胞において発現されるｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒを介したｏｒｔｈｏヒトＩＬ－２シグナルを示す。２０分間の刺激後のＳＴＡＴ５リン酸化の用量応答を示す。Ｓｔａｔ５のリン酸化は、（ＹＦＰ－、ＷＴ）なし、または（ＹＦＰ＋、ｏｒｔｈｏ）ヒトｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒｂとともに、ヒトＣＤ２５（ＹＴ＋）を発現するＹＴヒトＮＫ細胞株において測定された。１Ｃ７のマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）融合物を、ＲＰＭＩ完全培地において滴定し、細胞に添加した。ＷＴ（ＹＦＰ－）およびｏｒｔｈｏＲｂ（ＹＦＰ＋）細胞のＡＰＣ－ｐＳｔａｔ５染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、サイトカインの濃度に対してプロットし、Ｐｒｉｓｍ５（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ）モデルに適合させた。１Ｃ７を、他のタンパク質とは別の日に実行し、両日とも野生型ＩＬ－２染色の実行に正規化した。全てのデータは、平均（ｎ＝３）±ＳＤとして提示される。

【図22D】インビトロでＹＴ細胞において発現されるｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒを介したｏｒｔｈｏヒトＩＬ－２シグナルを示す。２０分間の刺激後のＳＴＡＴ５リン酸化の用量応答を示す。Ｓｔａｔ５のリン酸化は、（ＹＦＰ－、ＷＴ）なし、または（ＹＦＰ＋、ｏｒｔｈｏ）ヒトｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒｂとともに、ヒトＣＤ２５（ＹＴ＋）を発現するＹＴヒトＮＫ細胞株において測定された。ＳＱＶＬＫＡのマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）融合物を、ＲＰＭＩ完全培地において滴定し、細胞に添加した。ＷＴ（ＹＦＰ－）およびｏｒｔｈｏＲｂ（ＹＦＰ＋）細胞のＡＰＣ－ｐＳｔａｔ５染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、サイトカインの濃度に対してプロットし、Ｐｒｉｓｍ５（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ）モデルに適合させた。１Ｃ７を、他のタンパク質とは別の日に実行し、両日とも野生型ＩＬ－２染色の実行に正規化した。全てのデータは、平均（ｎ＝３）±ＳＤとして提示される。

【図22E】インビトロでＹＴ細胞において発現されるｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒを介したｏｒｔｈｏヒトＩＬ－２シグナルを示す。２０分間の刺激後のＳＴＡＴ５リン酸化の用量応答を示す。Ｓｔａｔ５のリン酸化は、（ＹＦＰ－、ＷＴ）なし、または（ＹＦＰ＋、ｏｒｔｈｏ）ヒトｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒｂとともに、ヒトＣＤ２５（ＹＴ＋）を発現するＹＴヒトＮＫ細胞株において測定された。ＳＱＶＫｑＡのマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）融合物を、ＲＰＭＩ完全培地において滴定し、細胞に添加した。ＷＴ（ＹＦＰ－）およびｏｒｔｈｏＲｂ（ＹＦＰ＋）細胞のＡＰＣ－ｐＳｔａｔ５染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、サイトカインの濃度に対してプロットし、Ｐｒｉｓｍ５（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ）モデルに適合させた。１Ｃ７を、他のタンパク質とは別の日に実行し、両日とも野生型ＩＬ－２染色の実行に正規化した。全てのデータは、平均（ｎ＝３）±ＳＤとして提示される。

【図23A】ｏｒｔｈｏヒトＩＬ－２Ｒは、ｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒを発現するヒトＰＢＭＣを優先的に拡大する。ヒトＰＢＭＣを単離し、活性化し、ＩＲＥＳＹＦＰ（ＹＦＰ＋）とともにｏｒｔｈｏヒトＩＬ－２Ｒβを含有するレトロウイルスで形質転換した。総生細胞に対するＹＦＰ＋細胞の初期比率は、２０％であった。５×１０^５の細胞を、１日目に指定された濃度のＭＳＡ－ヒトＩＬ－２（丸）またはｏｒｔｈｏ変異型ＭＳＡ－ＳＱＶＬＫＡ（菱形）、ＭＳＡ－ＳＱＶＬｑＡ（正方形）、またはＭＳＡ－１Ａ１（三角形）とともに播種し、３日目に同じ濃度を再供給した。５日目に、プレートをフローサイトメトリーにより読み取った。総生細胞に対するＹＦＰ＋（ｏｒｔｈｏ発現）細胞の比率を計算し、平均（ｎ＝４）±ＳＤを濃度に対してプロットした。直交サイトカインは、同じ濃度で野生型ＭＳＡ－ｈＩＬ－２ほどの総細胞成長を支持することができなかった。

【図23B】ｏｒｔｈｏヒトＩＬ－２Ｒは、ｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒを発現するヒトＰＢＭＣを優先的に拡大する。ヒトＰＢＭＣを単離し、活性化し、ＩＲＥＳＹＦＰ（ＹＦＰ＋）とともにｏｒｔｈｏヒトＩＬ－２Ｒβを含有するレトロウイルスで形質転換した。総生細胞に対するＹＦＰ＋細胞の初期比率は、２０％であった。５×１０^５の細胞を、１日目に指定された濃度のＭＳＡ－ヒトＩＬ－２（丸）またはｏｒｔｈｏ変異型ＭＳＡ－ＳＱＶＬＫＡ（菱形）、ＭＳＡ－ＳＱＶＬｑＡ（正方形）、またはＭＳＡ－１Ａ１（三角形）とともに播種し、３日目に同じ濃度を再供給した。５日目に、プレートをフローサイトメトリーにより読み取った。総生細胞数（平均（ｎ＝４）±ＳＤ）を、サイトカイン濃度に対してプロットした。直交サイトカインは、同じ濃度で野生型ＭＳＡ－ｈＩＬ－２ほどの総細胞成長を支持することができなかった。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本開示をより容易に理解するために、ある特定の用語および語句が、以下および本明細書全体を通して定義される。本明細書に提供される定義は、非限定的であり、発明の時点で当業者が既知であることを考慮して読まれるべきである。

【0012】

定義
本方法および組成物を記載する前に、本発明は記載の特定の方法または組成物に限定されず、そのため、勿論、異なる場合があることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することを意図するものではないことも理解されたい。

【0013】

ある範囲の値が提供される場合、その範囲の上限と下限との間に、文脈上明確に指示されない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在値も具体的に開示されることが理解される。記載された範囲内の任意の記載された値または介在値と、その記載された範囲内の任意の他の記載された値または介在値との間のより小さい各範囲は、本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して範囲内に含まれても除外されてもよく、より小さい範囲に限界のいずれかが含まれる、限界のいずれも含まれない、または限界の両方が含まれる各範囲もまた、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界により、本発明に包含される。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限界の一方または両方を除外する範囲も本発明に含まれる。

【0014】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似または等価の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、いくつかの可能性があるかつ好ましい方法および材料をここで説明する。本明細書で言及される全ての刊行物は、引用された刊行物に関連して方法および／または材料を開示し、説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、矛盾が生じる場合には、組み込まれた刊行物のいかなる開示にも優先することを理解されたい。

【0015】

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上別途明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「細胞（ａｃｅｌｌ）」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「ペプチド（ｔｈｅｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は、１つ以上のペプチドおよびその等価物、例えば、当業者に既知のポリペプチドなどへの言及を含む。

【0016】

本明細書において論じられる刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書におけるいかなるものも、本発明が、先行発明によりそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は実際の公開日とは異なる可能性があり、これらは独立して確認する必要があり得る。

【0017】

サイトカイン受容体およびリガンド対には、以下の受容体が含まれるが、これらに限定されない。

【0018】

【表1-1】

【0019】

【表1-2】

【0020】

「オルソログ」または「直交サイトカイン／受容体対」は、（ａ）天然サイトカインまたは同族受容体に対して大幅に低減された親和性を示し、かつ（ｂ）対応物操作された（直交）リガンドまたは受容体に特異的に結合するようにアミノ酸変化によって修飾される、遺伝子操作されたタンパク質対を指す。直交リガンドの結合時に、直交受容体は、天然細胞要素を介して形質導入されるシグナル伝達を活性化して、その天然応答を模倣するが、直交受容体を発現する操作された細胞に特異的な生物学的活性を提供する。

【0021】

直交受容体は、その同族天然サイトカインリガンドへの大幅に低減された結合を示す一方で、直交サイトカインは、その同族天然受容体（複数可）への大幅に低減された結合を示す。いくつかの実施形態において、同族直交受容体に対する直交サイトカインの親和性は、天然受容体に対する天然サイトカインの親和性と同等であり、例えば、天然サイトカイン受容体対親和性の少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％である親和性を有し、例えば、天然受容体に対する天然サイトカインの親和性の少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍以上高くてもよい。

【0022】

本明細書で使用される場合、「結合しない」または「結合することができない」は、検出可能な結合、またはわずかな結合、すなわち、天然リガンドよりもはるかに低い結合親和性を有することを指す。親和性は、様々な濃度の非標識リガンドの存在下で、単一濃度の標識リガンドを用いて受容体の結合を測定する競合結合実験によって決定することができる。典型的には、非標識リガンドの濃度は、少なくとも６桁の大きさにわたって異なる。競合結合実験により、ＩＣ_５０が決定され得る。本明細書で使用される場合、「ＩＣ_５０」は、受容体と標識されたリガンドとの間の会合の５０％の阻害に必要とされる非標識リガンドの濃度を指す。ＩＣ_５０は、リガンド－受容体結合親和性の指標である。低ＩＣ_５０は高親和性を表し、一方高ＩＣ_５０は低親和性を表す。

【0023】

本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」という用語は、１つの分子が別の分子に結合する選択性または親和性の程度を指す。結合対（例えば、リガンド／受容体、抗体／抗原、抗体／リガンド、抗体／受容体結合対）の文脈において、結合対の第１の分子は、結合対の第１の分子が試料中に存在する他の成分に有意な量で結合しない場合、結合対の第２の分子に特異的に結合すると言われる。第２の分子に対する第１の分子の親和性が、試料中に存在する他の成分に対する第１の分子の親和性よりも少なくとも２倍大きい、少なくとも１０倍大きい、少なくとも２０倍大きい、または少なくとも１００倍大きい場合、結合対の第２の分子に特異的に結合すると言われる。結合対の第１の分子が抗体である特定の実施形態において、抗体は、結合対の第２の分子に対する抗体の親和性が、例えば、スキャチャード分析によって決定されるとき、約１０^９リットル／モルよりも大きい、あるいは、約１０^１０リットル／モルよりも大きい、約１０^１１リットル／モルよりも大きい、約１０^１２リットル／モルよりも大きい場合、結合対の第２の分子（例えば、タンパク質、抗原、リガンド、または受容体）に特異的に結合する（Ｍｕｎｓｅｎ，ｅｔａｌ．１９８０Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０－２３９）。特異的結合は、競合ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイ、および／またはＫＩＮＥＸＡ（登録商標）アッセイを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の技法を使用して評価され得る。

【0024】

本明細書で使用される場合、「大幅に低減した結合を示す」という用語は、その同族受容体の天然に生じる形態に対する直交リガンドの結合と比較した直交リガンドの直交受容体への結合の親和性に関して使用される。本発明の実施において、この用語は、大幅に低減された結合が天然に生じる受容体に関して天然に生じるリガンドと比較した直交リガンドの比較結合および活性を説明するために使用されることを示す。直交リガンドは、直交リガンドが天然に生じるリガンドの２０％未満、あるいは約１０％未満、あるいは約８％未満、あるいは約６％未満、あるいは約４％未満、あるいは約２％未満、あるいは約１％未満、あるいは約０．５％未満で受容体の天然形態に結合する場合、リガンドの天然形態に関して大幅に低減した結合を示す。同様に、直交受容体は、リガンドの天然形態が天然に生じる受容体の２０％未満、あるいは約１０％未満、あるいは約８％未満、あるいは約６％未満、あるいは約４％未満、あるいは約２％未満、あるいは約１％未満、あるいは約０．５％未満で受容体の直交形態に結合する場合、リガンドの天然形態に関して大幅に低減した結合を示す。

【0025】

直交ＩＬ－２ポリペプチドは、天然ＩＬ－２Ｒβを介して大幅に低減した活性化を示す。活性は、例えば、ＣＴＬＬ－２マウス細胞傷害性Ｔ細胞を使用する細胞増殖アッセイにおいて測定されてもよく、Ｇｅａｒｉｎｇ，Ａ．Ｊ．Ｈ．ａｎｄＣ．Ｂ．Ｂｉｒｄ（１９８７）ｉｎＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓａｎｄＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ．Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｍ．Ｊ．ｅｔａｌ．（ｅｄｓ）：ＩＲＬＰｒｅｓｓ．２９５を参照されたい。組換えヒトＩＬ－２の特異的活性は、約２．１×１０^４ＩＵ／μｇであり、これは、ＷＨＯ国際基準の組換えヒトＩＬ－２（ＮＩＢＳＣコード：８６／５００）に対して較正される。直交ヒトＩＬ－２は、同等のアッセイにおいて、ＷＨＯ国際標準（ＮＩＢＳＣコード：８６／５００）ヒトＩＬ－２ポリペプチドの２０％未満、あるいは約１０％未満、あるいは約８％未満、あるいは約６％未満、あるいは約４％未満、あるいは約２％未満、あるいは約１％未満、あるいは約０．５％未満の活性を有し得る。

【0026】

ポリペプチドまたはＤＮＡ配列に関して本明細書で使用される場合、「同一性」という用語は、２つの分子間の配列同一性を指す。２つのアミノ酸または２つのヌクレオチド配列間の類似性は、同一位置数の一次関数である。一般に、配列は、最高順序一致が得られるように整列される。必要に応じて、ＧＣＳプログラムパッケージなどの公開技法および広く利用可能なコンピュータプログラムを使用して計算することができる（Ｄｅｖｅｒｅｕ× ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２：３８７，１９８４），ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｊ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０）。配列同一性は、配列分析ソフトウェア、例えば、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒ（１７１０ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＡｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５）のＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐの配列分析ソフトウェアパッケージなどの配列分析ソフトウェアを使用して、そのデフォルトパラメータを用いて測定することができる。

【0027】

「ポリペプチド」、「タンパク質」、または「ペプチド」という用語は、その長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関係なく、アミノ酸残基の任意の鎖を指す。

【0028】

本明細書における「タンパク質変異型」または「変異タンパク質」または「変異ポリペプチド」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾により野生型タンパク質と異なるタンパク質を意味する。親ポリペプチドは、天然に生じるもしくは野生型（ＷＴ）ポリペプチドであり得るか、またはＷＴポリペプチドの修飾形であり得る。変異ポリペプチドという用語は、ポリペプチド自体、ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードする核酸配列を指し得る。好ましくは、変異ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾、例えば、親と比較して約１～約１０個のアミノ酸修飾、好ましくは約１～約５つのアミノ酸修飾を含む。変異型は、野生型タンパク質と少なくとも約９９％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９０％同一であり得る。

【0029】

本明細書で使用される場合、「親ポリペプチド」、「親タンパク質」、「前駆体ポリペプチド」、または「前駆体タンパク質」とは、後に変異ポリペプチドを生成するように修飾される非修飾ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、野生型（または天然）ポリペプチドであってもよい。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指し得る。

【0030】

本明細書における「野生型」または「ＷＴ」または「天然」とは、対立遺伝子変異を含む、自然界に見られるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質、ポリペプチド、抗体、免疫グロブリン、ＩｇＧ等は、人の手によって修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。

【0031】

「レシピエント」、「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、診断、治療、または療法が所望される任意の哺乳類対象、特にヒトを指す。治療の目的のための「哺乳動物」とは、ヒト、家畜、および農場動物、ならびに動物園、スポーツ、またはペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等を含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。

【0032】

本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、疾患または障害を予防、治療、または管理するために十分な治療剤、例えば、養子Ｔ細胞または直交サイトカインのその量を指す。治療有効量は、疾患の発症を遅延させるもしくは最小限にする、例えば、癌の拡散を遅延させるもしくは最小限にするために十分な治療剤の量、または関心の受容体からのシグナル伝達を減少もしくは増加させるために効果的な量を指し得る。治療有効量はまた、疾患の治療または管理において治療的利益を提供する治療剤の量も指し得る。さらに、本発明の治療剤に関して治療有効量とは、単独で、または他の療法と組み合わせて、疾患の治療または管理において治療的利益を提供する治療剤の量を意味する。

【0033】

本明細書で使用される場合、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、および「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、予防剤または治療剤の投与の結果としての、対象における障害の１つ以上の症状の再発または発症の予防を指す。

【0034】

本明細書で使用される場合、「組み合わせ」という用語は、２つ以上の予防剤および／または治療剤の使用を指す。「併用」という用語の使用は、障害を有する対象に予防剤および／または治療剤が投与される順序を制限しない。第１の予防剤または治療剤は、障害を有する対象への第２の予防剤または治療剤の投与の前に（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間前）、それと同時に、またはその後に（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間後）投与することができる。

【0035】

インターロイキン２（ＩＬ－２）は、主に活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生される多能性サイトカインであり、正常な免疫応答の産生において重要な役割を果たす。ＩＬ－２は、活性化Ｔリンパ球の増殖および拡大を促進し、Ｂ細胞の成長を増強し、単球およびナチュラルキラー細胞を活性化する。これらの活性により、ＩＬ－２が試験され、癌の承認された治療として使用される（ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））。ヒトＩＬ－２は、１５３のアミノ酸の前駆体ポリペプチドとして合成され、そこから２０個のアミノ酸が除去され、成熟分泌ＩＬ－２を生成する。本明細書で使用される場合、「ＩＬ－２」は、天然または野生型ＩＬ－２を指す。成熟ヒトＩＬ－２は、Ｆｕｊｉｔａ，ｅｔ．ａｌ，ＰＮＡＳＵＳＡ，８０，７４３７－７４４１（１９８３）に記載されるように、１３３個のアミノ酸配列（追加の２０のＮ末端アミノ酸からなるシグナルペプチドを減じて）として生じる。ヒトＩＬ－２のアミノ酸配列は、受託番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｌｏｃａｔｏｒ）ＮＰ＿０００５７７．２下でＧＥＮＢＡＮＫに見出される。ヒトＩＬ－２（配列番号４）およびマウスＩＬ－２（配列番号３）、ヒトＩＬ－２Ｒβ（配列番号１）、およびマウスＩＬ－２Ｒβ（配列番号２）の参照配列を図１５に提示する。

【0036】

ＩＬ－２は、ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）との相互作用時に細胞シグナル伝達経路を開始することによって、Ｔリンパ球の生存および分化を支持する。ＩＬ－２は、癌および自己免疫を含むいくつかのヒト疾患を治療するために臨床的に、ならびに移植されたＴ細胞の生存を促進するために、養子Ｔ細胞療法のアジュバントとして使用される。しかしながら、ＩＬ－２はまた、オフターゲット細胞型を活性化することによって並列効果も有し得る。

【0037】

ＩＬ－２の活性を特定のＴ細胞サブセットに指向するために、本発明は、操作された直交ＩＬ－２およびＩＬ－２受容体対を提供する。細胞上で発現される直交ＩＬ－２受容体に結合したとき、直交ＩＬ－２は、強力なＳＴＡＴ５リン酸化、および直交ＩＬ－２Ｒベータを発現するように操作されたＴ細胞のインビトロ増殖を誘導することによって、野生型ＩＬ－２の活性を再現する。直交ＩＬ－２は、エクスビボ培養した野生型ＣＤ２５陽性または陰性マウスＴ細胞に関して、それぞれ、大幅に低減された結合を有する。本開示の研究は、自然界に存在しない相互作用を作り出すためのサイトカイン受容体界面のリモデリングが、無差別（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕ）サイトカインの活性を関心のＴ細胞サブセットに指向するための実行可能な戦略であり、それによって、遺伝子操作を介してＴ細胞機能を正確に制御することを可能にすることを示す。

【0038】

ＩＬ－２に加えて、ＩＬ－１５およびＩＬ－７はまた、リンパ系恒常性も調節し、養子Ｔ細胞療法を増強するためのアジュバントとしても使用されてきた。ＩＬ－２およびＩＬ－１５は、同じＩＬ－２Ｒ－ベータ鎖を共有する。ＩＬ－２を直交させるために使用される同一の直交ＩＬ－２Ｒ－ベータに対して、直交ＩＬ－１５を選択することができる。ＩＬ－７は、直交化の標的である別個のＩＬ－７Ｒ－アルファ鎖を利用する。

【0039】

いくつかの実施形態において、直交サイトカイン、例えば直交ＩＬ－２を追加の分子にコンジュゲートして、所望の薬理学的特性、例えば半減期の延長をもたらすことができる。一実施形態において、直交ＩＬ－２は、ＩｇＧ、アルブミン、または他の分子のＦｃドメインに融合して、例えば、当該技術分野で既知のペグ化、グリコシル化などによって、その半減期を延長することができる。いくつかの実施形態において、直交サイトカインは、ポリエチレングリコール分子にコンジュゲートされるか、または「ＰＥＧ化」される。直交サイトカインリガンドにコンジュゲートされたＰＥＧの分子量としては、５ｋＤａ～８０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧが挙げられるがこれらに限定されず、いくつかの実施形態において、ＰＥＧは約５ｋＤａの分子量を有し、いくつかの実施形態において、ＰＥＧは約１０ｋＤａの分子量を有し、いくつかの実施形態において、ＰＥＧは約２０ｋＤａの分子量を有し、いくつかの実施形態において、ＰＥＧは約３０ｋＤａの分子量を有し、いくつかの実施形態において、ＰＥＧは約４０ｋＤａの分子量を有し、いくつかの実施形態において、ＰＥＧは約５０ｋＤａの分子量を有し、いくつかの実施形態において、ＰＥＧは約６０ｋＤａの分子量を有し、いくつかの実施形態において、ＰＥＧは約８０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、分子量は、約５ｋＤａ～約８０ｋＤａ、約５ｋＤａ～約６０ｋＤａ、約５ｋＤａ～約４０ｋＤａ、約５ｋＤａ～約２０ｋＤａである。好ましい実施形態において、（表１を参照してポリペプチドの命名が行われる）直交リガンドは、１Ａ１のペグ化形態、１Ｃ７のペグ化形態、ＳＱＶＬＫＡのペグ化形態、および／またはＳＱＶＬｑＡのペグ化形態であり、各場合において、ＰＥＧは、約５ｋＤａ、あるいは１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、あるいは３０ｋＤａ、あるいは４０ｋＤａ、あるいは４０ｋＤａ、あるいは５０ｋＤａ、あるいは３０ｋＤａの分子量を有する。ポリペプチド配列にコンジュゲートされたＰＥＧは、直鎖状または分岐状であり得る。ＰＥＧは、直交ポリペプチドに直接、またはリンカー分子を介して結合され得る。生物学的化合物のＰＥＧ化を達成するために必要なプロセスおよび化学反応は、当該技術分野で周知である。

【0040】

直交ＩＬ－２は、当該技術分野で既知の方法を使用して、例えば、Ｎ末端アセチルトランスフェラーゼ、および例えば、アセチルＣｏＡとの酵素反応によって、Ｎ末端でアセチル化され得る。直交ＩＬ－２は、例えば、リジンアセチルトランスフェラーゼとの酵素反応によって、１つ以上のリジン残基でアセチル化され得る。例えば、Ｃｈｏｕｄｈａｒｙｅｔａｌ．（２００９）．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３２５（５９４２）：８３４－８４０を参照されたい。

【0041】

Ｆｃ融合はまた、インビボで代替のＦｃ受容体媒介特性を与えることができる。「Ｆｃ領域」は、ＩｇＧをパパインで消化することによって産生されるＩｇＧＣ末端ドメインと相同である天然に生じるまたは合成のポリペプチドであり得る。ＩｇＧＦｃは、約５０ｋＤａの分子量を有する。オルソログＩＬ－２ポリペプチドは、Ｆｃ領域全体、またはそれが一部であるキメラポリペプチドの循環半減期を延長する能力を保持するより小さい部分を含むことができる。加えて、全長または断片化Ｆｃ領域は、野生型分子の変異型であり得る。すなわち、それらは、ポリペプチドの機能に影響を与えても与えなくてもよい変異を含有することができ、以下にさらに記載されるように、天然活性は、全ての場合において必要ではないか、または所望されない。

【0042】

他の実施形態において、直交ポリペプチドは、ＦＬＡＧ配列などの抗原タグとして機能するポリペプチドを含むことができる。ＦＬＡＧ配列は、本明細書に記載されるように、ビオチン化された非常に特異的な抗ＦＬＡＧ抗体によって認識される（Ｂｌａｎａｒｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：１０１４，１９９２；ＬｅＣｌａｉｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：８１４５，１９９２も参照されたい）。いくつかの実施形態において、キメラポリペプチドは、Ｃ末端ｃ－ｍｙｃエピトープタグをさらに含む。

【0043】

上述したように、本発明の直交タンパク質は、キメラポリペプチドの一部として存在し得る。上述の異種ポリペプチドに加えて、またはその代わりに、本発明の核酸分子は、「マーカー」または「レポーター」をコードする配列を含有することができる。マーカーまたはレポーター遺伝子の例としては、β－ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ１、Ｇ４１８ｒ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ヒドロマイシン－Ｂ－ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃｚ（β－ガラクトシダーゼをコードする）、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が挙げられる。本発明の実施に関連する多くの標準手順と同様に、当業者は、追加の有用な試薬、例えば、マーカーまたはレポーターの機能を果たすことができる追加の配列を認識する。

【0044】

直交サイトカインおよび受容体は、サイトカインの他の位置（例えば、直交操作に関与する位置以外の位置）における保存的修飾および置換も含み得る。そのような保存的置換としては、ＤａｙｈｏｆｆｉｎＴｈｅＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ５（１９７８）およびＡｒｇｏｓｉｎＥＭＢＯＪ．，８：７７９－７８５（１９８９）によって記載されるものが挙げられる。例えば、グループＩ：ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｉｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、グループＩＩ：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ、グループＩＩＩ：ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、グループＩＶ：ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ、グループＶ：ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ、およびグループＶＩ：ａｓｐ、ｇｌｕのグループのうちの１つに属するアミノ酸は、保存的変化を表す。各場合において、追加の修飾の導入は、修飾されたポリペプチドが投与される生物における修飾されたポリペプチドの抗原性の任意の増加を最小限にするように評価され得る。

【0045】

「Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ３および／またはＴ細胞抗原受容体の発現を特徴とし得る哺乳類免疫エフェクター細胞を指し、この細胞は、直交サイトカイン受容体を発現するように操作され得る。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞、細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔ_Ｈ１、Ｔ_Ｈ２、Ｔ_Ｈ９、Ｔ_Ｈ１１、Ｔ_Ｈ２２、Ｔ_ＦＨ、制御性Ｔ細胞、例えば、Ｔ_Ｒ１、天然Ｔ_Ｒｅｇ、誘導性Ｔ_Ｒｅｇ、メモリーＴ細胞、例えば、中央メモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞から選択される。

【0046】

本発明の一実施形態において、直交受容体を発現するＴ細胞は、キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ－Ｔ」細胞）を表面発現するように修飾されたＴ細胞である。本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体Ｔ細胞」および「ＣＡＲ－Ｔ細胞」という用語は、キメラ抗原受容体を発現するように組換え修飾されたＴ細胞を指すために互換的に使用される。本明細書で使用される場合、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、直交ＩＬ－２Ｒβポリペプチドを発現させるように操作されてもよい。本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」および「ＣＡＲ」という用語は、配列においてアミノからカルボキシ末端に配置される複数の機能ドメイン：（ａ）抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、（ｂ）膜貫通ドメイン（ＴＤ）、および（ｃ）１つ以上の細胞質シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）を含むポリペプチドを指すように互換的に使用され、前述のドメインは、１つ以上のスペーサードメインによって任意選択的に連結され得る。ＣＡＲはまた、細胞表面上のＣＡＲの翻訳後処理および提示中に従来除去されるシグナルペプチド配列もさらに含み得る。本発明の実施に有用なＣＡＲは、当該技術分野で周知の原理に従って調製される。例えば、２０１０年６月２２日に発行されたＥｓｈｈａａｒらの米国特許第７，７４１，４６５Ｂ１号、Ｓａｄｅｌａｉｎら（２０１３）ＣａｎｃｅｒＤｉｓｃｏｖｅｒｙ３（４）：３８８－３９８、ＪｅｎｓｅｎａｎｄＲｉｄｄｅｌｌ（２０１５）ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３３：９－１５、Ｇｒｏｓｓら（１９８９）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８６（２４）：１００２４－１００２８、Ｃｕｒｒａｎら（２０１２）ＪＧｅｎｅＭｅｄ１４（６）：４０５－１５を参照されたい。本発明の直交受容体を組み込むように修飾され得る市販のＣＡＲ－Ｔ細胞製品の例としては、アキシカブタゲンシロロイセル（ＧｉｌｅａｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから市販されているＹｅｓｃａｒｔａ（登録商標）として販売されている）およびチサゲンレクロイセル（Ｎｏｖａｒｔｉｓから市販されているＫｙｍｒｉａｈ（登録商標）として販売されている）が挙げられる。

【0047】

本明細書で使用される場合、抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）という用語は、標的細胞の表面上で発現された抗原に特異的に結合するポリペプチドを指す。ＡＢＤは、標的細胞の表面上に発現される１つ以上の抗原に特異的に結合する任意のポリペプチドであり得る。ある特定の実施形態では、標的細胞抗原は、腫瘍抗原である。ＣＡＲのＡＢＤによって標的化され得る腫瘍抗原の例としては、限定されないが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＵＣ１、ＣＤ１２３、ＦＬＴ３、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ３３、ＩＬ１ＲＡＰ、ＣＬＬ１（ＣＬＥＣ１２Ａ）ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソテリン、ｃ－Ｍｅｔ、糖脂質Ｆ７７、ＦＡＰ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＡＧＥＡ３、５Ｔ４、ＷＴ１、ＫＧ２Ｄリガンド、葉酸受容体（ＦＲａ）、およびＷｎｔ１抗原を含む群から選択される１つ以上の抗原が挙げられる。

【0048】

一実施形態において、ＡＢＤは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、ペプチドリンカーによって共有結合された抗体の免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域からなるポリペプチドである（Ｂｉｒｄ，ｅｔａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３－４２６、Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔａｌ．（１９８８）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８５：５８７９－５８８３、Ｓ－ｚＨｕ，ｅｔａｌ．（１９９６）ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，５６，３０５５－３０６１）。モノクローナル抗体配列に基づくｓｃＦｖの生成は、当該技術分野で周知である。例えば、ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｔｏｃｏｌｓＨａｎｄｂｏｏｋ，ＪｏｈｎＭ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｅｄ．（２００２）ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓＳｅｃｔｉｏｎ１５０“ＢａｃｔｅｒｉａｌＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＳｉｎｇｌｅ－ＣｈａｉｎＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓを参照されたい。ｓｃＦｖの調製に使用される抗体は、当該技術分野で周知の技法、例えば、ファージディスプレイおよび指向進化により特定の望ましい特徴（例えば増強された親和性）を有するそれらの分子について選択するように最適化され得る。いくつかの実施形態において、ＡＢＤは、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、抗ＰＳＡｓｃＦｖ、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ、抗ＣＥＡｓｃＦｖ、抗ＥＧＦＲｓｃＦｖ、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩｓｃＦｖ、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ｓｃＦｖ、抗ＭＡＧＥｓｃＦｖ、抗５Ｔ４ｓｃＦｖ、または抗Ｗｎｔ１ｓｃＦｖを含む。別の実施形態において、ＡＢＤは、標的細胞由来抗原、特に腫瘍抗原によるラクダまたはラマの免疫化によって得られる単一ドメイン抗体である。例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｓ．（２００１）ＲｅｖｉｅｗｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７４：２７７－３０２を参照されたい。あるいは、ＡＢＤは、教示または１９９９年１１月１２日に発行されたＷｉｇｌｅｒらの米国特許第６３０３３１３Ｂ１号、２００４年２月２４日に発行されたＫｎａｐｐｉｋらの米国特許第６，６９６，２４８Ｂ１号、Ｂｉｎｚ，ｅｔａｌ．（２００５）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２３：１２５７－１２６８、およびＢｒａｄｂｕｒｙ，ｅｔａｌ．（２０１１）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２９：２４５－２５４に実質的に従う、ペプチドライブラリの生成、および所望の標的細胞抗原結合特性を有する化合物の単離により、全面的に合成により生成され得る。

【0049】

ＡＢＤは、２つ以上の標的抗原に対して親和性を有し得る。例えば、本発明のＡＢＤは、キメラ二重特異性結合メンバーを含んでもよい、すなわち、第１の標的細胞発現抗原および第２の標的細胞発現抗原への特異的結合を提供することができる。キメラ二重特異性結合メンバーの非限定的な例としては、二重特異性抗体、二重特異性コンジュゲートモノクローナル抗体（ｍａｂ）_２、二重特異性抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ）_２、二重特異性ｓｃＦｖ、二重特異性ダイアボディ、一本鎖二重特異性ダイアボディ等）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、二重特異性コンジュゲート単一ドメイン抗体、それらのマイカボディ（ｍｉｃａｂｏｄｉｅｓ）、および変異体などが挙げられる。キメラ二重特異性結合メンバーの非限定的な例には、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２０１２）ＭＡｂｓ．４（２）：１８２－１９７、Ｓｔａｍｏｖａｅｔａｌ．（２０１２）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１（２），１７２－１９８、Ｆａｒｈａｄｆａｒｅｔａｌ．（２０１６）ＬｅｕｋＲｅｓ．４９：１３－２１、Ｂｅｎｊａｍｉｎｅｔａｌ．ＴｈｅｒＡｄｖＨｅｍａｔｏｌ．（２０１６）７（３）：１４２－５６、Ｋｉｅｆｅｒｅｔａｌ．ＩｍｍｕｎｏｌＲｅｖ．（２０１６）２７０（１）：１７８－９２、Ｆａｎｅｔａｌ．（２０１５）ＪＨｅｍａｔｏｌＯｎｃｏｌ．８：１３０、Ｍａｙｅｔａｌ．（２０１６）ＡｍＪＨｅａｌｔｈＳｙｓｔＰｈａｒｍ．７３（１）：ｅ６－ｅ１３に記載のそれらのキメラ二重特異性薬剤も含まれる。いくつかの実施形態において、キメラ二重特異性結合メンバーは二価の一本鎖ポリペプチドである。例えば、Ｔｈｉｒｉｏｎ，ｅｔａｌ．（１９９６）ＥｕｒｏｐｅａｎＪ．ｏｆＣａｎｃｅｒＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ５（６）：５０７－５１１、ＤｅＫｒｕｉｆａｎｄＬｏｇｅｎｂｅｒｇ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２７１（１３）７６３０－７６３４、およびＫａｙ，ｅｔａｌ．ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＰａｔｅｎｔＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｕｍｂｅｒ２０１５／０３１５５６６ｐｕｂｌｉｓｈｅｄＮｏｖｅｍｂｅｒ５，２０１５を参照されたい。いくつかの場合において、キメラ二重特異性結合メンバーは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）であり得る。ＢｉＴＥは、一般に、抗原を特異的結合メンバー（例えば、ｓｃＦｖ）に結合する特異的結合メンバー（例えば、ｓｃＦｖ）を、ＣＤ３などのＴ細胞分子に特異的な第２の結合ドメインと融合させることによって作製される。いくつかの場合において、キメラ二重特異性結合メンバーは、ＣＡＲＴ細胞アダプターであり得る。本明細書で使用される場合、「ＣＡＲＴ細胞アダプター」とは、ＣＡＲの抗原認識ドメインに結合し、ＣＡＲを第２の抗原に再指向する発現された二重特異性ポリペプチドを意味する。一般に、ＣＡＲＴ細胞アダプターは、結合領域を有し、１つはそれが指向されるＣＡＲ上のエピトープに特異的であり、第２のエピトープは結合パートナーに指向され、結合されると、ＣＡＲを活性化する結合シグナルを形質導入する。有用なＣＡＲＴ細胞アダプターとしては、例えばＫｉｍｅｔａｌ．（２０１５）ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ．１３７（８）：２８３２－５、Ｍａｅｔａｌ．（２０１６）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１１３（４）：Ｅ４５０－８、およびＣａｏｅｔａｌ．（２０１６）ＡｎｇｅｗＣｈｅｍＩｎｔＥｄＥｎｇｌ．５５（２６）：７５２０－４に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0050】

いくつかの実施形態において、リンカーポリペプチド分子は、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間のＣＡＲに任意選択的に組み込まれ、抗原結合を容易にする。例えば、ＭｏｒｉｔｚａｎｄＧｒｏｎｅｒ（１９９５）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２（８）５３９－５４６を参照されたい。一実施形態において、リンカーは、免疫グロブリンからのヒンジ領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のうちのいずれか１つからのヒンジ、特にヒトタンパク質配列である。代替物としては、免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域およびＣＤ３の一部が挙げられる。ＡＢＤがｓｃＦｖである場合、ＩｇＧヒンジを用いてもよい。いくつかの実施形態において、リンカーは、ｎが１、２、３、４、５等であり、いくつかの実施形態において、ｎが３である、アミノ酸配列（Ｇ_４Ｓ）_ｎを含む。

【0051】

本発明の実施に有用なＣＡＲは、ＡＢＤ（または用いられる場合、リンカー）を、ＣＡＲの細胞内細胞質ドメインに結合する膜貫通ドメインをさらに含む。膜貫通ドメインは、真核生物細胞膜において熱力学的に安定している任意のポリペプチド配列からなる。膜貫通（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｓｐａｎｎｉｎｇ）ドメインは、天然に生じる膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインに由来し得るか、または合成であり得る。合成膜貫通ドメインを設計する際には、アルファ－らせん状構造を好むアミノ酸が好ましい。ＣＡＲの構築に有用な膜貫通ドメインは、アルファ－らせん状二次構造を有する形成を好む約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２２、２３、または２４個のアミノ酸からなる。アルファ－らせん状立体構造を好むようにａを有するアミノ酸は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｐａｃｅ，ｅｔａｌ．（１９９８）ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ７５：４２２－４２７を参照されたい。アルファらせん状立体構造において特に好ましいアミノ酸は、メチオニン、アラニン、ロイシン、グルタミン酸、およびリジンである。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８等のＩ型膜貫通タンパク質からの膜貫通ドメインに由来し得る。

【0052】

ＣＡＲポリペプチドの細胞質ドメインは、１つ以上の細胞内シグナルドメインを含む。一実施形態において、細胞内シグナルドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質配列および抗原受容体結合後にシグナル伝達を開始する共受容体、ならびにその機能誘導体および亜断片を含む。Ｔ細胞受容体ζ鎖に由来するものなどの細胞質シグナル伝達ドメインが、キメラ受容体と標的抗原との結合後にＴリンパ球増殖およびエフェクター機能のための刺激シグナルを生成するために、ＣＡＲの一部として用いられる。細胞質シグナル伝達ドメインの例としては、ＣＤ２７の細胞質ドメイン、ＣＤ２８の細胞質ドメインＳ、ＣＤ１３７の細胞質ドメイン（４－１ＢＢおよびＴＮＦＲＳＦ９とも称される）、ＣＤ２７８の細胞質ドメイン（ＩＣＯＳとも称される）、ＰＩ３キナーゼのｐ１１０α、β、またはδ触媒サブユニット、ヒトＣＤ３ζ－鎖、ＣＤ１３４の細胞質ドメイン（ＯＸ４０およびＴＮＦＲＳＦ４とも称される）、ＦｃεＲ１γおよびβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇα）鎖、Ｂ２９（Ｉｇβ）鎖等、ＣＤ３ポリペプチド（δ、Δ、およびε）、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＺＡＰ７０等）、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ等）、ならびにＣＤ２、ＣＤ５、およびＣＤ２８等のＴ細胞形質導入に関与する他の分子が挙げられるが、これらに限定されない。

【0053】

いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、共刺激ドメインも提供し得る。「共刺激ドメイン」という用語は、一次特異的刺激を増大する二次非特異的活性化機構を提供する、ＣＡＲの刺激ドメイン、典型的にはエンドドメインを指す。共刺激ドメインは、メモリー細胞の増殖、生存、または発達を増強するＣＡＲの一部を指す。共刺激の例としては、Ｔ細胞受容体を介した抗原特異的シグナル伝達後の抗原非特異的Ｔ細胞共刺激、およびＢ細胞受容体を介したシグナル伝達後の抗原非特異的Ｂ細胞共刺激が挙げられる。共刺激、例えば、Ｔ細胞共刺激、および関与する因子は、Ｃｈｅｎ＆Ｆｌｉｅｓ（２０１３）ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ１３（４）：２２７－４２に記載されている。本開示のいくつかの実施形態において、ＣＳＤは、ＴＮＦＲスーパーファミリー、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０のメンバーのうちの１つ以上、またはそれらの組み合わせを含む。

【0054】

ＣＡＲは、多くの場合、第１、第２、第３、または第４世代と称される。第１世代のＣＡＲという用語は、細胞質ドメインが、単一のシグナル伝達ドメイン、例えば、ＩｇＥＦｃεＲＩγに対する高親和性受容体に由来するシグナル伝達ドメインまたはＣＤ３ζ鎖のみを介して抗原結合からのシグナルを伝達するＣＡＲを指す。ドメインは、抗原依存性Ｔ細胞活性化のための１つまたは３つの免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（複数可）［ＩＴＡＭ（複数可）］を含有する。ＩＴＡＭに基づく活性化シグナルは、Ｔ細胞に、抗原結合に応答して標的腫瘍細胞および分泌サイトカインを溶解する能力を付与する。第２世代のＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナルに加えて共刺激シグナルを含む。送達された共刺激シグナルの偶発的送達は、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞によって誘導されるサイトカイン分泌および抗腫瘍活性を増強する。共刺激ドメインは、通常、ＣＤ３ζドメインに対して近位の膜である。第３世代のＣＡＲは、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＯＸ４０、または４－１ＢＢシグナル伝達領域を含む３つのシグナル伝達ドメインを含む。第４世代では、または「装甲車」ＣＡＲＴ細胞は、免疫活性を増強するために分子および／または受容体を発現または遮断するようにさらに遺伝子組換えされる。

【0055】

本発明のＣＡＲに組み込むことができる、含む細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、（アミノからカルボキシに）、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ、ＣＤ２８－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ、ＣＤ２８－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ、４１ＢＢ－ＣＤ－２８－－ＣＤ３ζ、および４１ＢＢ－ＣＤ３ζが挙げられる。

【0056】

ＣＡＲという用語は、限定されないが、分割ＣＡＲ、ＯＮスイッチＣＡＲＳ、二重特異性またはタンデムＣＡＲ、阻害性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ）、および誘導性多能性幹（ｉＰＳ）ＣＡＲ－Ｔ細胞を含むＣＡＲ変異型を含む。

【0057】

「分割ＣＡＲ」という用語は、細胞外部分、ＡＢＤ、およびＣＡＲの細胞質シグナル伝達ドメインが２つの別個の分子上に存在するＣＡＲを指す。ＣＡＲ変異型はまた、分割ＣＡＲの２つの部分の条件付きヘテロ二量体化が薬理学的に制御される、例えば分割ＣＡＲを含む、条件的に活性化可能なＣＡＲであるＯＮスイッチＣＡＲも含む。ＣＡＲ分子およびその誘導体（すなわち、ＣＡＲ変異型）は、例えば、ＰＣＴ出願第ＵＳ２０１４／０１６５２７号、同第ＵＳ１９９６／０１７０６０号、同第ＵＳ２０１３／０６３０８３号、Ｆｅｄｏｒｏｖｅｔａｌ．ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ（２０１３）；５（２１５）：２１５ｒａ１７２、Ｇｌｉｅｎｋｅｅｔａｌ．ＦｒｏｎｔＰｈａｒｍａｃｏｌ（２０１５）６：２１、Ｋａｋａｒｌａ＆Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ５２ＣａｎｃｅｒＪ（２０１４）２０（２）：１５１－５、Ｒｉｄｄｅｌｌｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＪ（２０１４）２０（２）：１４１－４、Ｐｅｇｒａｍｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＪ（２０１４）２０（２）：１２７－３３、Ｃｈｅａｄｌｅｅｔａｌ．ＩｍｍｕｎｏｌＲｅｖ（２０１４）２５７（１）：９１－１０６、Ｂａｒｒｅｔｔｅｔａｌ．ＡｎｎｕＲｅｖＭｅｄ（２０１４）６５：３３３－４７、Ｓａｄｅｌａｉｎｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＤｉｓｃｏｖ（２０１３）３（４）：３８８－９８、Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｍｅｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１０）９５６３０４に記載されており、それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0058】

「二重特異性またはタンデムＣＡＲ」という用語は、一次ＣＡＲの活性を増幅または阻害のいずれかを行うことができる二次ＣＡＲ結合ドメインを含むＣＡＲを指す。

【0059】

「阻害キメラ抗原受容体」または「ｉＣＡＲ」という用語は、本明細書において、ｉＣＡＲの結合が二重抗原標的化を使用して、二次ＣＡＲ結合ドメインの阻害シグナル伝達ドメインを備えた第２の抑制性受容体の結合を介して活性ＣＡＲの活性化を停止させ、一次ＣＡＲ活性化の阻害をもたらすＣＡＲを指すように互換的に使用される。阻害性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ）は、阻害性受容体シグナル伝達モジュールの活性化によりＣＡＲ－Ｔ細胞活性を調節するように設計される。このアプローチは、２つのＣＡＲの活性を組み合わせ、そのうちの１つは、活性化受容体によって活性化されるＣＡＲ－Ｔ細胞の応答を制限するドミナントネガティブシグナルを生成する。ｉＣＡＲは、正常組織によってのみ発現される特定の抗原に結合したときに、対抗活性化因子ＣＡＲの応答をオフにすることができる。このようにして、ｉＣＡＲ－Ｔ細胞は、癌細胞を健康な細胞と区別し、抗原選択的様式で形質導入Ｔ細胞の機能を可逆的に遮断することができる。ｉＣＡＲにおけるＣＴＬＡ－４またはＰＤ－１細胞内ドメインは、Ｔリンパ球上で阻害シグナルを誘発し、サイトカイン産生の減少、標的細胞溶解の効率の低下、およびリンパ球運動の変化をもたらす。

【0060】

「タンデムＣＡＲ」または「ＴａｎＣＡＲ」という用語は、２つの異なる腫瘍関連抗原の独立した結合に応答して刺激または共刺激シグナルを送達するように設計された２つのキメラ受容体の結合を介して、Ｔ細胞の二重特異性活性化を媒介するＣＡＲを指す。

【0061】

典型的には、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、上記教示に実質的に従った、ＣＡＲをコードする発現ベクターによる形質導入によって組換え修飾されたＴ細胞である。

【0062】

細胞は、操作のために患者自身のＴ細胞を使用して調製され得る。その結果として、対象に対して投与される細胞の集団は、必然的に可変である。加えて、ＣＡＲ－Ｔ細胞薬剤は可変であるため、そのような薬剤に対する応答は異なり得、したがって、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療を施す前に薬理免疫抑制またはＢ細胞枯渇により管理される療法関連毒性の継続的な監視および管理を伴う。そのような免疫抑制レジメンの例は、全身性コルチコステロイド（例えば、メチルプレドニゾロン）を含む。Ｂ細胞枯渇の療法としては、血清免疫グロブリンレベルの正常レベルを回復するための確立された臨床投薬ガイドラインによる免疫グロブリン静注（ＩＶＩＧ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞療法の投与前に、対象は任意選択的にリンパ球枯渇レジメンを受ける場合がある。そのようなリンパ球枯渇レジメンの一例は、フルダラビン（４日間、１日３０ｍｇ／ｍ^２静脈内［ＩＶ］）およびシクロホスファミド（フルダラビンの第１の用量から開始して２日間、１日５００ｍｇ／ｍ^２ＩＶ）の対象への投与からなる。

【0063】

本明細書に記載の構築物で操作するために有用なＴ細胞には、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはこれらの組み合わせが含まれる。対象またはドナーから収集された上述される操作のためのＴ細胞は、所望の細胞を濃縮する技法によって細胞の混合物から分離され得るか、または分離することなく操作および培養され得る。適切な溶液が、分散または懸濁のために使用され得る。そのような溶液は、一般に、低濃度の、通常５～２５ｍＭの許容される緩衝液とともに、ウシ胎仔血清または他の天然に生じる因子で好都合に補充された、平衡塩溶液、例えば、通常の生理食塩水、ＰＢＳ、ハンクス平衡塩溶液等である。好都合な緩衝液には、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液等が挙げられる。親和性分離のための技法には、抗体コーティングされた磁気ビーズを使用する磁気分離、親和性クロマトグラフィー、モノクローナル抗体に結合した、またはモノクローナル抗体、例えば、補体および細胞毒素とともに使用される細胞傷害性剤、ならびに固体マトリックス、例えば、プレートに結合した抗体を用いた「パニング」、または他の好都合な技法が含まれ得る。正確な分離をもたらす技法には、多色チャネル、低角度および鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなどの、様々な程度の精巧さを有し得る蛍光活性化細胞選別機が含まれる。細胞は、死細胞に関連する染料（例えば、ヨウ化プロピジウム）を用いることによって、死細胞に対して選択され得る。選択された細胞の生存能に過度に有害ではない任意の技法が用いられ得る。親和性試薬は、上記に示される細胞表面分子に特異的な受容体またはリガンドであり得る。抗体試薬に加えて、ペプチド－ＭＨＣ抗原およびＴ細胞受容体対、ペプチドリガンドおよび受容体、エフェクターおよび受容体分子などを使用してもよい。

【0064】

分離した細胞は、細胞の生存能を維持する任意の適切な培地に収集することができ、通常、収集チューブの底部に血清のクッションを有する。様々な培地が市販されており、細胞の性質に従って使用されてもよく、頻繁に胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）で補充されるｄＭＥＭ、ＨＢＳＳ、ｄＰＢＳ、ＲＰＭＩ、イフコス培地等を含む。収集され、任意選択的に濃縮された細胞集団は、遺伝子組換えのために直ちに使用され得るか、または液体窒素温度で凍結および保存され得、解凍して再使用することができる。通常、１０％のＤＭＳＯ、５０％のＦＣＳ、４０％のＲＰＭＩ１６４０培地に細胞を保存する。

【0065】

いくつかの実施形態において、操作された細胞は、免疫細胞、例えば、治療を必要とする個体から単離された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の複合混合物を含む。例えば、ＹａｎｇａｎｄＲｏｓｅｎｂｅｒｇ（２０１６）ＡｄｖＩｍｍｕｎｏｌ．１３０：２７９－９４，“ＡｄｏｐｔｉｖｅＴＣｅｌｌＴｈｅｒａｐｙｆｏｒＣａｎｃｅｒ、Ｆｅｌｄｍａｎｅｔａｌ（２０１５）ＳｅｍｉｎＯｎｃｏｌ．４２（４）：６２６－３９ “ＡｄｏｐｔｉｖｅＣｅｌｌＴｈｅｒａｐｙ－Ｔｕｍｏｒ－ＩｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｔ－ＣｅｌｌＲｅｃｅｐｔｏｒｓ，ａｎｄＣｈｉｍｅｒｉｃＡｎｔｉｇｅｎＲｅｃｅｐｔｏｒｓ”、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌＮＣＴ０１１７４１２１，“ＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙＵｓｉｎｇＴｕｍｏｒＩｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｆｏｒＰａｔｉｅｎｔｓＷｉｔｈＭｅｔａｓｔａｔｉｃＣａｎｃｅｒ”、Ｔｒａｎｅｔａｌ．（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ３４４（６１８４）６４１－６４５，“Ｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙｂａｓｅｄｏｎｍｕｔａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃＣＤ４＋Ｔｃｅｌｌｓｉｎａｐａｔｉｅｎｔｗｉｔｈｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃａｎｃｅｒ”を参照されたい。

【0066】

いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞は、治療される個体に関して同種であり、例えば、臨床試験ＮＣＴ０３１２１６２５、ＮＣＴ０３０１６３７７、ＮＣＴ０２４７６７３４、ＮＣＴ０２７４６９５２、ＮＣＴ０２８０８４４２を参照されたい。概説については、Ｇｒａｈａｍｅｔａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌｓ．７（１０）Ｅ１５５を参照されたい。いくつかの実施形態において、同種操作されたＴ細胞は、完全にＨＬＡ適合される。しかしながら、全ての患者が完全に適合したドナーを有するわけではなく、ＨＬＡ型に依存しない全ての患者に好適な細胞製品が代替物を提供する。一般的な「既製」のＴ細胞製品は、採取および製造の均一性において利点を提供する。

【0067】

対象またはドナーから収集された上述される操作のためのＴ細胞は、所望の細胞を濃縮する技法によって細胞の混合物から分離され得るか、または分離することなく操作および培養され得る。適切な溶液が、分散または懸濁のために使用され得る。そのような溶液は、一般に、低濃度の、通常５～２５ｍＭの許容される緩衝液とともに、ウシ胎仔血清または他の天然に生じる因子で好都合に補充された、平衡塩溶液、例えば、通常の生理食塩水、ＰＢＳ、ハンクス平衡塩溶液等である。好都合な緩衝液には、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液等が挙げられる。親和性分離のための技法には、抗体コーティングされた磁気ビーズを使用する磁気分離、親和性クロマトグラフィー、モノクローナル抗体に結合した、またはモノクローナル抗体、例えば、補体および細胞毒素とともに使用される細胞傷害性剤、ならびに固体マトリックス、例えば、プレートに結合した抗体を用いた「パニング」、または他の好都合な技法が含まれ得る。正確な分離をもたらす技法には、多色チャネル、低角度および鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなどの、様々な程度の精巧さを有し得る蛍光活性化細胞選別機が含まれる。細胞は、死細胞に関連する染料（例えば、ヨウ化プロピジウム）を用いることによって、死細胞に対して選択され得る。選択された細胞の生存能に過度に有害ではない任意の技法が用いられ得る。親和性試薬は、上記に示される細胞表面分子に特異的な受容体またはリガンドであり得る。抗体試薬に加えて、ペプチド－ＭＨＣ抗原およびＴ細胞受容体対、ペプチドリガンドおよび受容体、エフェクターおよび受容体分子などを使用してもよい。分離した細胞は、細胞の生存能を維持する任意の適切な培地に収集することができ、通常、収集チューブの底部に血清のクッションを有する。様々な培地が市販されており、細胞の性質に従って使用されてもよく、頻繁に胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）で補充されるｄＭＥＭ、ＨＢＳＳ、ｄＰＢＳ、ＲＰＭＩ、イフコス培地等を含む。収集され、任意選択的に濃縮された細胞集団は、遺伝子組換えのために直ちに使用され得るか、または液体窒素温度で凍結および保存され得、解凍して再使用することができる。通常、１０％のＤＭＳＯ、５０％のＦＣＳ、４０％のＲＰＭＩ１６４０培地に細胞を保存する。操作された細胞は、任意の好都合な投与経路によって、通常は血管内に、任意の生理学的に許容される培地において対象に注入され得るが、それらはまた、細胞が成長のために適切な部位を見つける可能性がある他の経路によって導入されてもよい。通常、少なくとも１×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０^７細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０^８細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０^９細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０^１０細胞／ｋｇ以上が投与され、通常、収集中に得られるＴ細胞の数によって制限される。

【0068】

本発明の実施に使用される同種Ｔ細胞は、移植片対宿主病を低減するように遺伝子組み換えされ得る。例えば、本発明の操作された細胞は、遺伝子編集技法によって達成されるＴＣＲαβ受容体ノックアウトであり得る。ＴＣＲαβはヘテロ二量体であり、それが発現されるためにアルファおよびベータ鎖の両方が存在する必要がある。単一の遺伝子がアルファ鎖（ＴＲＡＣ）をコードするが、ベータ鎖をコードする遺伝子は２つ存在し、したがって、ＴＲＡＣ遺伝子座ＫＯはこの目的のため欠失されている。この欠失を達成するために、いくつかの異なるアプローチ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、メガヌクレアーゼ、操作されたＩ－ＣｒｅＩホーミングエンドヌクレアーゼ等が使用されている。例えば、Ｅｙｑｕｅｍｅｔａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ５４３：１１３－１１７（ＴＲＡＣコード配列がＣＡＲコード配列に置き換えられる）、およびＧｅｏｒｇｉａｄｉｓｅｔａｌ．（２０１８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２６：１２１５－１２２７（ＣＡＲをＴＲＡＣ遺伝子座に直接組み込むことなく、クラスター化された規則的な配置の短い回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９によるＴＲＡＣ妨害と連結したＣＡＲ発現）を使用した。ＧＶＨＤを予防するための代替戦略は、Ｔ細胞を修飾して、例えば、ＴＣＲ阻害分子としてＣＤ３ζの切断型を使用して、ＴＣＲαβシグナル伝達の阻害剤を発現させる。

【0069】

本発明の実施において有用なＴ細胞の調製は、任意選択的に、上述のＣＡＲポリペプチドをコードする核酸配列と組み合わせて、直交受容体をコードする核酸配列を含む発現ベクターで単離されたＴ細胞を形質転換することによって達成される。ＣＡＲおよび直交受容体をコードする核酸配列はそれぞれ、別個の発現ベクター上に提供され得、各核酸配列は、標的細胞におけるＣＡＲおよび直交受容体の発現を達成するために１つ以上の発現制御要素に作動可能に連結され、ベクターは標的細胞に共トランスフェクトされる。あるいは、ＣＡＲおよび直交受容体をコードする核酸配列を、それぞれ、１つ以上の発現制御要素の制御下で各核酸配列を単一のベクター上に提供して、関連核酸配列の発現を達成してもよい。あるいは、両方の核酸配列は、ベクターからの２つの配列の共発現を容易にする介在または下流制御要素を有する単一プロモーターの制御下にあり得る。

【0070】

エクスビボＴ細胞活性化は、細胞に基づくＴ細胞活性化、抗体に基づく活性化、または様々なビーズに基づく活性化試薬を使用した活性化を含む、当該技術分野で十分に確立された手順によって達成することができる。細胞に基づくＴ細胞活性化は、Ｔ細胞を、樹状細胞などの抗原提示細胞、または照射されたＫ５６２細胞などの人工抗原提示細胞に曝露することによって達成され得る。可溶性抗ＣＤ３モノクローナル抗体を用いたＴ細胞表面ＣＤ３分子の抗体に基づく活性化は、ＩＬ－２の存在下でのＴ細胞活性化も支持する。

【0071】

一般に、本発明のＴ細胞は、ＣＤ３ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤（例えば、抗ＣＤ３抗体）およびＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤（例えば、抗ＣＤ２８抗体）を提供する表面と接触する細胞を培養することによって拡大される。ビーズに基づくＴ細胞活性化は、臨床使用のためのＣＡＲ－Ｔ細胞の調製のために当該技術分野で受け入れられている。Ｔ細胞のビーズに基づく活性化は、限定されないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）ＣＴＳＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＣＤ３／２８（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．ＣａｒｌｓｂａｄＣＡ）またはＭｉｌｔｅｎｙｉＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰＥｘｐＡｃｔＴｒｅｇビーズまたはＭｉｌｔｅｎｙｉＭＡＣＳＧＭＰＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）ＣＤ３／２８ビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．）を含む市販のＴ細胞活性化試薬を使用して達成され得る。Ｔ細胞培養に適切な条件は当該技術分野で周知である。Ｌｉｎ，ｅｔａｌ．（２００９）Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ１１（７）：９１２－９２２；Ｓｍｉｔｈ，ｅｔａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎｉｃａｌ＆ＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ４：ｅ３１ｐｕｂｌｉｓｈｅｄｏｎｌｉｎｅ１６Ｊａｎｕａｒｙ２０１５。標的細胞は、成長を支持するために必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％ＣＯ_２）で維持される。

【0072】

直交受容体またはＣＡＲ－Ｔ細胞を発現する直交受容体が成長因子受容体である場合、直交受容体に対するリガンドの使用により、直交受容体発現ＣＡＲ－Ｔ細胞もまた、形質導入および非形質導入細胞のバックグラウンドまたは混合集団から選択的に拡大することができる。一実施形態において、直交受容体は、直交ＩＬ－２受容体であり、そのような細胞の拡大に有用な直交ＩＬ－２化合物は、表１に提供される群から選択される直交ＩＬ－２である。

【0073】

本方法において、直交タンパク質、特に直交サイトカインは、組換え法によって産生することができる。直交受容体は、操作される細胞に、発現ベクター上に導入され得る。直交タンパク質をコードするＤＮＡは、操作プロセス中に設計どおりに様々な供給源から得ることができる。

【0074】

アミノ酸配列変異型は、本明細書に記載されるように、コード配列に適切なヌクレオチド変化を導入することによって調製される。そのような変異型は、上述のように、残基の挿入、置換、および／または指定された欠失を表す。挿入、置換、および／または指定された欠失を任意に組み合わせて、最終構築物に到達するように作製されるが、但し、最終構築物が本明細書に定義される所望の生物学的活性を有することを条件とする。

【0075】

組換えタンパク質の発現を達成するために、直交タンパク質（および／またはＣＡＲ）をコードする核酸が、発現のために複製可能なベクターに挿入される。多くのそのようなベクターが利用可能である。ベクターの成分としては、一般に、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列うちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターとしては、ウイルスベクター、プラスミドベクター、組込み型ベクター（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇｖｅｃｔｏｒ）などが挙げられる。

【0076】

Ｔ細胞における直交受容体および任意選択的にＣＡＲの発現のための発現ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであり得る。プラスミドは、非ウイルスベクターの例である。標的細胞のトランスフェクションを容易にするために、標的細胞を非ウイルスベクターで直接曝露してもよく、非ウイルスベクターの取り込みを容易にする条件下で曝露してもよい。哺乳類細胞による外来核酸の取り込みを容易にする条件の例は、当該技術分野で周知であり、化学的手段（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）など、Ｔｈｅｒｍｏ－ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、高塩、および磁場（エレクトロポレーション）を含むが、これらに限定されない。

【0077】

一実施形態において、非ウイルスベクターは、非ウイルス送達系において提供され得る。非ウイルス送達系は典型的には、標的細胞の核酸カーゴによる形質導入を容易にする複合体であり、核酸は、陽イオン脂質（ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ）、界面活性剤、生物学的製剤（ゼラチン、キトサン）、金属（金、磁気鉄）、および合成ポリマー（ＰＬＧ、ＰＥＩ、ＰＡＭＡＭ）などの薬剤と複合体化される。非ウイルス送達系の多くの実施形態は、当該技術分野で周知であり、脂質ベクター系（Ｌｅｅｅｔａｌ．（１９９７）ＣｒｉｔＲｅｖＴｈｅｒＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔ．１４：１７３－２０６）、ポリマーコーティングされたリポソーム（Ｍａｒｉｎら、米国特許第５，２１３，８０４号、１９９３年５月２５日発行、Ｗｏｏｄｌｅら、米国特許第５，０１３，５５６号、１９９１年５月７日発行）、カチオン性リポソーム（Ｅｐａｎｄら、米国特許第５，２８３，１８５号、１９９４年２月１日発行、Ｊｅｓｓｅｅ，Ｊ．Ａ．、米国特許第５，５７８，４７５号、１９９６年１１月２６日発行、Ｒｏｓｅら、米国特許第５，２７９，８３３号、１９９４年１月１８日発行、Ｇｅｂｅｙｅｈｕら、米国特許第５，３３４，７６１号、１９９４年８月２日発行）を含む。

【0078】

別の実施形態において、発現ベクターはウイルスベクターであり得る。ウイルスベクター系をＣＡＲおよび直交受容体の発現に用いる場合、レトロウイルスまたはレンチウイルス発現ベクターが好ましい。特に、ウイルスベクターは、ガンマレトロウイルス（Ｐｕｌｅ，ｅｔａｌ．（２００８）ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ１４（１１）：１２６４－１２７０）、自己不活性化レンチウイルスベクター（Ｊｕｎｅ，ｅｔａｌ．（２００９）ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ９（１０）：７０４－７１６）、ならびにＮＮａｌｄｉｎｉ，ｅｔａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７２：２６３－２６７、Ｎａｌｄｉｎｉ，ｅｔａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡＶｏｌ．９３，ｐｐ．１１３８２－１１３８８、Ｄｕｌｌ，ｅｔａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７２（１１）：８４６３－８４７１、Ｍｉｌｏｎｅ，ｅｔａｌ．（２００９）１７（８）：１４５３－１４６４、Ｋｉｎｇｓｍａｎら、米国特許第６，０９６，５３８号、２０００年８月１日発行、およびＫｉｎｇｓｍａｎら、米国特許第６，９２４，１２３号、２００５年８月２日発行に記載されているレトロウイルスベクターである。本発明の一実施形態において、ＣＡＲ発現ベクターは、ＯｘｆｏｒｄＢｉｏｍｅｄｉｃａから入手可能なＬｅｎｔｉｖｅｃｔｏｒ（登録商標）レンチウイルスベクターである。

【0079】

発現ベクターを有するＴ細胞の形質導入は、ウイルスベクターを有する宿主Ｔ細胞との共インキュベーション、エレクトロポレーション、および／または化学的に増強された送達を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で周知の技法を用いて達成され得る。

【0080】

直交タンパク質は、直接的なものだけでなく、異種ポリペプチド、例えば、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換えにより産生され得る。一般に、シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはベクターに挿入されるコード配列の一部であり得る。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識され処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）シグナル配列である。哺乳類細胞発現において、天然シグナル配列が使用され得るか、または同じまたは関連する種の分泌されたポリペプチド、ならびにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルからのシグナル配列などの他の哺乳類シグナル配列が好適であり得る。

【0081】

発現ベクターは通常、選択可能なマーカーとも称される選択遺伝子を含有する。この遺伝子は、選択的培養培地で成長した形質転換された宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培養培地中では生存しない。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するか、（ｂ）栄養要求性欠損（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ）を補完するか、または（ｃ）複合培地から入手不可能な重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。

【0082】

発現ベクターは、宿主生物によって認識され、直交タンパク質コード配列に作動可能に連結されるプロモーターを含有する。プロモーターは、それらが作動可能に連結される特定の核酸配列の転写および翻訳を制御する構造遺伝子の開始コドンの上流（５’）に位置する非翻訳配列（一般に、約１００～１０００ｂｐ以内）である。そのようなプロモーターは典型的には、誘導性および構成的の２つのクラスに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件のいくつかの変化、例えば、栄養素の存在もしくは不在、または温度の変化に応答して、それらの制御下にあるＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始するプロモーターである。様々な潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。

【0083】

哺乳類宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鳥痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス（マウス幹細胞ウイルスなど）、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）、または免疫グロブリンプロモーターから、ヒートショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御され得るが、但し、そのようなプロモーターが宿主細胞系と適合性であることを条件とする。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として好都合に得られる。

【0084】

高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって多くの場合増加する。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増加させるＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常、約１０～３００ｂｐである。エンハンサーは、比較的配向および位置に依存せず、転写単位の５’および３’、イントロン内、ならびにコード配列自体内に見出されている。現在、哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ－フェトタンパク質、およびインスリン）からの多くのエンハンサー配列が既知である。しかしながら、典型的には、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーを使用する。例としては、複製起点の後半側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後半側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、コード配列の５’または３’位で発現ベクターにスプライシングされ得るが、好ましくは、プロモーターから部位５’に位置する。

【0085】

真核宿主細胞に使用される発現ベクターは、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有する。そのような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および時折３’の非翻訳領域から一般的に入手可能である。上記に列挙される成分のうちの１つ以上を含有する好適なベクターの構築は、標準的な技法を用いる。

【0086】

本明細書のベクターにおけるＤＮＡのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、または高等真核生物の細胞である。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、マウスＬ細胞（Ｌ－Ｍ［ＴＫ－］、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－２６４８）、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）、ヒト胚腎臓株（２９３細胞または懸濁培養における成長のためにサブクローニングされた２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ１０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）、サル腎臓細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣＣＣＬ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）、ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、およびヒト肝細胞腫株ＨｅｐＧ２）である。

【0087】

操作されたＴ細胞を含む宿主細胞を、直交ＩＬ－２またはＩＬ－２Ｒ発現のために上述の発現ベクターでトランスフェクトすることができる。細胞は、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択する、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に改変された従来の栄養素培地中で培養され得る。哺乳類宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞を培養するために適している。これらの培地のいずれかは、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または表皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質、微量元素、およびグルコース、または同等のエネルギー源で補充され得る。任意の他の必要な補足剤は、当業者に既知である適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明らかである。

【0088】

核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれたときに「作動可能に連結される」。例えば、シグナル配列のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されるか、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結されるか、またはリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結される」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合、連続しており、読み取り相（ｒｅａｄｉｎｇｐｈａｓｅ）にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続している必要はない。

【0089】

組換え産生された直交ポリペプチドは、分泌されたポリペプチドとして培養培地から回収することができるが、宿主細胞溶解物から回収することもできる。フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）などのプロテアーゼ阻害剤は、精製中にタンパク質分解を阻害するためにも有用であり得、抗生物質は、外来性汚染物質の成長を防止するために含まれ得る。様々な精製ステップが当該技術分野で既知であり、例えば、親和性クロマトグラフィーが使用される。親和性クロマトグラフィーは、生物学的巨大分子中に通常存在する高度に特異的な結合部位を使用し、特定のリガンドに結合するそれらの能力に応じて分子を分離する。共有結合は、リガンドをタンパク質試料に明白に提示する様式で、リガンドを不溶性多孔質支持媒体に結合させ、それによって、１つの分子種の天然の生体特異的結合を使用して、混合物から第２の種を分離および精製する。抗体が、親和性クロマトグラフィーで一般的に使用される。サイズ選択ステップも使用することができ、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィーまたは分子ふるいクロマトグラフィーとしても知られる）を使用して、それらのサイズに従ってタンパク質を分離する。ゲル濾過では、タンパク質溶液を半透過性多孔質樹脂で充填されたカラムに通す。半透過性樹脂は、カラムで分離することができるタンパク質のサイズを決定する様々な孔径を有する。また、関心があるものはカチオン交換クロマトグラフィーである。

【0090】

直交サイトカイン組成物は、当該技術分野で既知の方法を使用して、濃縮、濾過、透析等され得る。治療用途のために、適切な操作された直交受容体を含むサイトカインが、哺乳動物に投与され得る。投与は、静脈内、ボーラスとして、または一定期間にわたる継続的な注入であり得る。代替的な投与経路としては、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、髄腔内、経口、局所、または吸入経路が挙げられる。直交サイトカインはまた、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内、もしくは病変周囲経路によって、またはリンパに好適に投与され、局所的および全身的な治療効果を発揮する。

【0091】

そのような剤形は、本質的に非毒性かつ非治療的である生理学的に許容される担体を包含する。そのような担体の例としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、緩衝液物質、例えば、リン酸、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、およびＰＥＧなどが挙げられる。局所またはゲルに基づく形態のポリペプチドの担体としては、多糖類、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウムまたはメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ＰＥＧ、およびウッドワックスアルコールが挙げられる。全ての投与について、従来のデポー形態が好適に使用される。そのような形態としては、例えば、マイクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、石膏、吸入形態、鼻スプレー、舌下錠剤、および持続放出調製物が挙げられる。ポリペプチドは、典型的には、約０．１μｇ／ｍｌ～１００μｇ／ｍｌの濃度で、そのようなビヒクル中に製剤化される。

【0092】

本開示のオルソログＩＬ－２ポリペプチドが「実質的に純粋」である場合、それらは、少なくとも約６０重量％（乾燥重量）の関心のポリペプチド、例えば、オルソログＩＬ－２アミノ酸配列を含有するポリペプチドであり得る。例えば、ポリペプチドは、少なくとも約７５重量％、約８０重量％、約８５重量％、約９０重量％、約９５重量％、または約９９重量％の関心のポリペプチドであり得る。純度は、任意の適切な標準方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析によって測定することができる。

【0093】

本発明の別の実施形態において、上述の状態の治療に有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器およびラベルを含む。好適な容器として、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、状態の治療に有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能な止め具を有する静脈注射用溶液袋またはバイアルであり得る）。組成物中の活性剤は、直交サイトカインである。容器上のまたは容器に関連するラベルは、組成物が、選択された状態を治療するために使用されることを示す。さらなる容器（複数可）には、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、またはデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を保持し得る製造品が提供され得る。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ、および使用説明書を有する添付文書を含む、商業的およびユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。

【0094】

本明細書で使用される場合、「癌」（または「癌性」）、「過剰増殖性」、および「腫瘍性」という用語は、自律成長（例えば、急速に増殖する細胞成長を特徴とする異常な段階または状態）の能力を有する細胞を指す。過剰増殖性および腫瘍性疾患段階は、病理学的（例えば、疾患段階を特徴付けるかもしくは構成する）に分類され得るか、またはそれらは、非病理学的（例えば、正常からの逸脱として、しかし疾患段階とは関連しない）に分類され得る。本用語は、組織病理学的種類または侵襲性の段階にかかわらず、全ての種類の癌性成長または発癌性プロセス、転移性組織、または悪性形質転換細胞、組織、もしくは器官を含むことを意味する。「病理学的過剰増殖性」細胞は、悪性腫瘍成長を特徴とする疾患段階において生じる。非病理学的過剰増殖性細胞の例としては、創傷修復に関連する細胞の増殖が挙げられる。「癌」または「腫瘍」という用語は、肺、乳房、甲状腺、リンパ腺およびリンパ系組織、胃腸器官、ならびに生殖泌尿器系に影響を与えるものを含む様々な器官系の悪性腫瘍、ならびに一般に、ほとんどの結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌および／または睾丸腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸癌、ならびに食道癌などの悪性腫瘍を含むと考えられる腺癌を指すように使用される。

【0095】

「癌」という用語は、当技術分野で認識され、呼吸器系癌、胃腸系癌、生殖泌尿器系癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌、および黒色腫を含む上皮または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。「腺癌」は、腺組織に由来するか、または腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成する癌を指す。

【0096】

腫瘍細胞の例としては、ＡＭＬ、ＡＬＬ、ＣＭＬ、副腎皮質癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆道癌、膀胱癌、骨癌、骨転移、脳癌、中枢神経系（ＣＮＳ）癌、末梢神経系（ＰＮＳ）癌、乳癌、子宮頸癌、小児期の非ホジキンリンパ腫、結腸および直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍ファミリー（例えば、ユーイング肉腫）、眼癌、胆嚢癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭および下咽頭癌、肝臓癌、肺癌、肺カルチノイド腫瘍、非ホジキンリンパ腫、男性乳癌、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性障害、鼻腔および副鼻癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔および口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、黒色腫皮膚癌、非黒色腫皮膚癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮癌（例えば、子宮肉腫）、移行上皮癌、膣癌、外陰部癌、中皮腫、扁平細胞または類表皮癌、気管支腺腫、絨毛癌、頭頸部癌、奇形癌、またはワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症が挙げられるが、これらに限定されない。癌細胞が非癌細胞と比較してＣＤ４７の発現の増加を示す任意の癌は、対象の方法および組成物によって治療されるために好適な癌である。

【0097】

本発明の組成物および方法は、追加の治療剤と組み合わせることができる。例えば、治療される疾患、障害、または状態が腫瘍性疾患（例えば、癌）である場合、本発明の方法は、従来の化学療法剤、またはチェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ１またはＰＤＬ１阻害剤）もしくは治療用モノクローナル抗体（例えば、Ａｖａｓｔｉｎ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）などの他の生物学的抗癌薬と組み合わせてもよい。

【0098】

腫瘍性疾患の治療に有用であるとして当該技術分野で同定される化学剤の例としては、アビトレキサート、アドリアマイシン、アドルシル、アムサクリン、アスパラギナーゼ、アントラサイクリン、アザシチジン、アザチオプリン、ｂｉｃｎｕ、ブレノキサン、ブスルファン、ブレオマイシン、カンプトサー、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン、セルビジン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、コスメゲン、シタラビン、シトサール（ｃｙｔｏｓａｒ）、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エレンス、エルスパール（ｅｌｓｐａｒ）、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、フルダラ、ゲムシタビン、ゲムザール、ハイカムチン、ヒドロキシ尿素、ハイドラレア（ｈｙｄｒｅａ）、イダマイシン、イダルビシン、イホスファミド、イフェックス（ｉｆｅｘ）、イリノテカン、ランビス（ｌａｎｖｉｓ）、リューケラン、ロイスタチン、マツラン（ｍａｔｕｌａｎｅ）、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、ムタマイシン（ｍｕｔａｍｙｃｉｎ）、ミレラン（ｍｙｌｅｒａｎ）、マイロサール（ｍｙｌｏｓａｒ）、ナベルビン、ニペント（ｎｉｐｅｎｔ）、ノバントロン、オンコビン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パラプラチン、ペントスタチン、プラチノール、プリカマイシン、プロカルバジン、プリントール（ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ）、ラリトレキセド（ｒａｌｉｔｒｅｘｅｄ）、タキソテレ（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、タキソール、テニポシド、チオグアニン、トムデックス（ｔｏｍｕｄｅｘ）、トポテカン、バルルビシン、ベルバン（ｖｅｌｂａｎ）、ベプシド、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ＶＰ－１６、およびブモン（ｖｕｍｏｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0099】

併用投与され得る標的治療薬としては、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、メシル酸イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ、ＳＴＩ－５７１としても知られる）、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ、ＺＤ１８３９としても知られる）、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａとして販売されている）、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）、ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ）、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ）、ニロチニブ（Ｔａｓｉｇｎａ）、およびボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）、ジャカフィ（ルキソリチニブ）；ヤヌスキナーゼ阻害剤、例えば、トファシチニブ；ＡＬＫ阻害剤、例えば、クリゾチニブ；Ｂｃｌ－２阻害剤、例えば、オバトクラックス、ベンクレキタ、およびゴシポール；ＦＬＴ３阻害剤、例えば、ミドスタウリン（Ｒｙｄａｐｔ）；ＩＤＨ阻害剤、例えば、ＡＧ－２２１；ＰＡＲＰ阻害剤、例えば、イニパリブおよびオラパリブ；ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば、ペリホシン、ＶＥＧＦ受容体２阻害剤、例えば、アパチニブ；［Ｄ－Ｌｙｓ（６）］－ＬＨＲＨに連結したＡＮ－１５２（ＡＥＺＳ－１０８）ドキソルビシン；Ｂｒａｆ阻害剤、例えば、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、およびＬＧＸ８１８；ＭＥＫ阻害剤、例えば、トラメチニブ；ＣＤＫ阻害剤、例えば、ＰＤ－０３３２９９１およびＬＥＥ０１１；Ｈｓｐ９０阻害剤、例えば、サリノマイシン；ならびに／または低分子薬物コンジュゲート、例えば、ビンタフォリド；セリン／トレオニンキナーゼ阻害剤、例えば、テムシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ）、エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ）、ベムラフェニブ（Ｚｅｌｂｏｒａｆ）、トラメチニブ（Ｍｅｋｉｎｉｓｔ）、およびダブラフェニブ（Ｔａｆｉｎｌａｒ）を挙げることができるが、これらに限定されない。

【0100】

腫瘍性疾患の治療に有用であるとして当該技術分野で同定される生物学的薬剤の例としては、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニスト、例えば、ＩＬ－１２、ＩＮＦα、または抗上皮成長因子受容体、放射線療法、イリノテカン；テトラヒドロ葉酸塩代謝拮抗薬、例えば、ペメトレキセド；腫瘍抗原に対する抗体、モノクローナル抗体および毒素の複合体、Ｔ細胞アジュバント、骨髄移植、または抗原提示細胞（例えば、樹状細胞療法）、抗腫瘍ワクチン、複製能があるウイルス、腫瘍成長の付加的または相乗的抑制を達成するためのシグナル伝達阻害剤（例えば、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）またはＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、または免疫調節剤、シクロオキシゲナーゼ－２（ＣＯＸ－２）阻害剤、ステロイド、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）およびＥｎｂｒｅｌ（登録商標））、インターフェロン－β１ａ（Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）、およびインターフェロン－β１ｂ（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）、ならびに当該技術分野の臨床医に容易に理解される既知の化学療法治療レジメンで実施されている前述のうちの１つ以上の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0101】

抗ＣＤ９３ＡＢＤポリペプチドまたは操作された細胞と組み合わせて投与され得る腫瘍特異的モノクローナル抗体としては、リツキシマブ（ＭａｂＴｈｅｒａまたはリツキサンとして販売されている）、アレムツズマブ、パニツムマブ、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ）等を挙げることができるが、これらに限定されない。

【0102】

いくつかの実施形態において、本発明の組成物および方法は、免疫チェックポイント療法と組み合わせることができる。免疫チェックポイント療法の例としては、ＰＤ１のＰＤＬ１および／またはＰＤＬ２への結合の阻害剤が挙げられる。ＰＤ１のＰＤＬ１および／またはＰＤＬ２への阻害剤は、当該技術分野で周知である。ＰＤ１のＰＤＬ１および／またはＰＤＬ２への結合を妨げる市販のモノクローナル抗体の例としては、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）、ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＢｒｉｓｔｏｌＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ，ＰｒｉｎｃｅｔｏｎＮＪから市販されている）、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）ＭＫ－３４７５、ランブロリズマブ、ＭｅｒｃｋａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，ＫｅｎｉｌｗｏｒｔｈＮＪから市販されている）、およびアテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ，ＳｏｕｔｈＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏＣＡ）が挙げられる。ＰＤ１阻害抗体の追加の例としては、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ピディリズマブ（ＣＴ－０１１、ＣｕｒｅＴｅｃｈ）、ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ１１０５、ＢｒｉｓｔｏｌＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ）、およびアベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＭｅｒｃｋＳｅｒｏｎｏ／Ｐｆｉｚｅｒ）、およびＳＨＲ－１２１０（Ｉｎｃｙｔｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる抗体ＰＤ１経路阻害剤は、２０１２年７月１０日に発行された米国特許第８，２１７，１４９号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、２０１２年５月１日に発行された米国特許第８，１６８，７５７号（ＭｅｒｃｋＳｈａｒｐａｎｄＤｏｈｍｅＣｏｒｐ．）、２０１１年８月３０日に発行された米国特許第８，００８，４４９号（Ｍｅｄａｒｅｘ）、２０１１年５月１７日に発行された米国特許第７，９４３，７４３号（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）に記載されている。さらに、低分子ＰＤ１のＰＤＬ１および／またはＰＤＬ２への阻害剤は、当該技術分野で既知である。例えば、ＳａｓｉｋｕｍａｒらのＷＯ２０１６１４２８３３Ａ１およびＳａｓｉｋｕｍａｒらのＷＯ２０１６１４２８８６Ａ２、ＢＭＳ－１１６６およびＢＭＳ－１００１（Ｓｋａｌｎｉａｋ，ｅｔａｌ（２０１７）Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ８（４２）：７２１６７－７２１８１）を参照されたい。

【0103】

他の実施形態において、本発明の方法が感染症の治療に使用される。本明細書で使用される場合、「感染」という用語は、生物（すなわち、対象）の少なくとも１つの細胞が感染性因子によって感染する任意の段階を指す（例えば、対象は、細胞内病原体感染、例えば、慢性細胞内病原体感染を有する）。本明細書で使用される場合、「感染性因子」という用語は、感染した生物の少なくとも１つの細胞におけるＣＤ４７発現の増加を誘導する外来生物学的実体（すなわち、病原体）を指す。例えば、感染性因子としては、細菌、ウイルス、原虫、および真菌が挙げられるが、これらに限定されない。細胞内病原体は特に関心があるものである。感染疾患は、感染性因子によって引き起こされる障害である。ある特定の条件下では、いくつかの感染性因子は、認識可能な症状または疾患を引き起こさないが、変化した条件下で症状または疾患を引き起こす可能性がある。主題の方法は、例えば、ウイルス感染、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ヒトパピローマウイルス等；細胞内細菌感染、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａｓｐ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ等；および細胞内原虫病原体、例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｓｐ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｓｐ．、Ｇｉａｒｄｉａｓｐ．、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｓｐ．、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｐ等を含むがこれらに限定されない慢性病原体感染の治療に使用され得る。

【0104】

治療は、他の活性剤と組み合わせることができる。抗生物質のクラスとしては、ペニシリン、例えば、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、オキサシリン、カルベニシリン、ナフシリン、アンピシリン等；β－ラクタマーゼ阻害剤、セファロスポリン、例えば、セファクロール、セファゾリン、セフロキシム、モキサラクタム等と組み合わせたペニシリン；カルバペネム；モノバクタム；アミノグリコシド；テトラサイクリン；マクロライド；リンコマイシン；ポリミキシン；スルホンアミド；キノロン；クロラムフェニコール；メトロニダゾール；スペクチノマイシン；トリメトプリム；バンコマイシン等が挙げられる。サイトカイン、例えば、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子α、インターロイキン１２等も含まれ得る。抗ウイルス剤、例えば、アシクロビル、ガンシクロビル等も、治療に使用され得る。

【0105】

さらに他の実施形態において、制御性Ｔ細胞は、自己免疫疾患の治療のために操作される。炎症性疾患および炎症に関連する疾患のスペクトルは広く、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、および自己免疫性肝炎などの自己免疫疾患；インスリン依存性真性糖尿病、変形性関節症（ＯＡ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、および黄斑変性症などの変性疾患を含む。

【0106】

大半ではなくても、多くの自己免疫および炎症性疾患は、例えば、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ１７などの複数のＴ細胞型を伴う。自己免疫疾患は、自己のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、および／または身体内の器官、組織、もしくは細胞型（例えば、膵臓、脳、甲状腺、もしくは胃腸管）の損傷および／または機能不全を引き起こす他の自己分子を異常に標的として、疾患の臨床症状を引き起こすＴおよびＢリンパ球を特徴とする。自己免疫疾患としては、特定の組織に影響を与える疾患、ならびに複数の組織に影響を与える可能性がある疾患が挙げられ、これらの疾患は、部分的には、応答が特定の組織に限定される抗原または体内に広く分布する抗原に指向されるかどうかに依存し得る。

【0107】

【0108】

直交サイトカインおよび受容体対は、関心の任意のサイトカインから選択されてもよい。直交サイトカイン受容体対を操作するためのプロセスは、（ａ）天然サイトカインへの結合を妨害するために天然受容体にアミノ酸変化を操作するステップ、（ｂ）受容体結合のために接触残基における天然サイトカインにアミノ酸変化を操作するステップ、（ｃ）直交受容体に結合するサイトカインオルソログについて選択するステップ、（ｄ）天然受容体に結合するオルソログサイトカインを廃棄するステップ、または（ｅ）直交サイトカインに結合する受容体オルソログについて選択するステップ、（ｆ）天然サイトカインに結合するオルソログ受容体を廃棄するステップを含み得る。好ましい実施形態において、サイトカイン／受容体複合体の構造に関する知識を使用して、部位特異的またはエラーが発生しやすい突然変異誘発のためのアミノ酸位置を選択する。好都合に、酵母ディスプレイ系が選択プロセスに使用され得るが、他のディスプレイおよび選択方法も有用である。

【0109】

場合によっては、アミノ酸変化は親和性成熟によって得られる。「親和性成熟」ポリペプチドは、改変（複数可）を有しない親ポリペプチドと比較して、同族直交受容体に対する直交ポリペプチドの親和性の改善をもたらす１つ以上の残基中に１つ以上の改変（複数可）を有するポリペプチドであり、その逆もまた同様である。親和性成熟は、「親」ポリペプチドと比較して、結合親和性を少なくとも約１０～５０％、１００％、１５０％以上、または１～５倍増加させるために行うことができる。本発明の操作された直交サイトカインは、上記で論じられるように直交受容体を活性化するが、天然受容体の大幅に低減された結合および活性化を有し、例えば、直交サイトカインは、好適なアッセイ条件下で十分な量の分子を使用してＥＬＩＳＡおよび／またはＦＡＣＳ分析によって評価されるとき、対応する天然サイトカインとの競合阻害において約５％未満の阻害を示し得る。

【0110】

本発明のいくつかの実施形態において、直交受容体は、ＩＬ－２受容体の鎖、すなわち、インターロイキン２受容体アルファ（ＩＬ－２Ｒα；ＣＤ２５）、インターロイキン２受容体ベータ（ＩＬ－２Ｒβ；ＣＤ１２２）、およびインターロイキン２受容体ガンマ（ＩＬ－２Ｒγ；ＣＤ１３２；共通のガンマ鎖）から選択されるポリペプチドである。いくつかの特定の実施形態において、直交受容体は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、およびＩＬ－１５からのシグナル伝達に関与するＣＤ１３２である。他の特定の実施形態において、直交受容体は、ＩＬ－２およびＩＬ－１５からのシグナル伝達に関与するＣＤ１２２である。直交受容体は、通常、対応物直交サイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５等と対合する。

【0111】

いくつかの特定の実施形態において、直交受容体はＣＤ１２２である。いくつかのそのような実施形態では、直交受容体は、ＣＤ２５および／またはＣＤ１３２も発現し得るＴ細胞またはＮＫ細胞に導入される。修飾されたＣＤ１２２タンパク質の核酸コード配列およびタンパク質組成物が提供される。本発明において、ＣＤ１２２は、天然ＩＬ－２への結合に関与する位置において、天然配列のアミノ酸を非天然アミノ酸で置換することによって、または天然アミノ酸の欠失によって、天然サイトカインの結合を妨害するために操作される。いくつかの実施形態において、アミノ酸は、非保存的変化で置換される。置換または欠失の関心の位置としては、ヒトＣＤ１２２（ｈＣＤ１２２）のＲ４１、Ｒ４２、Ｑ７０、Ｋ７１、Ｔ７３、Ｔ７４、Ｖ７５、Ｓ１３２、Ｈ１３３、Ｙ１３４、Ｆ１３５、Ｅ１３６、Ｑ２１４が挙げられるが、これらに限定されない。置換または欠失の関心の位置としては、マウスＣＤ１２２（ｍＣＤ１２２）のＲ４２、Ｆ６７、Ｑ７１、Ｓ７２、Ｔ７４、Ｓ７５、Ｖ７６、Ｓ１３３、Ｈ１３４、Ｙ１３５、Ｉ１３６、Ｅ１３７、Ｒ２１５が挙げられるが、これらに限定されない。

【0112】

いくつかの実施形態において、ＣＤ１２２は、マウスタンパク質のＱ７１、Ｔ７４、Ｈ１３４、Ｙ１３５、またはヒトタンパク質のＱ７０、Ｔ７３、Ｈ１３３、Ｙ１３４から選択される位置の１つでまたは組み合わせで置換される。いくつかの実施形態において、操作されたタンパク質は、ｍＣＤ１２２Ｈ１３４およびＹ１３５、またはｈＣＤ１２２Ｈ１３３およびＹ１３４におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、酸性アミノ酸、例えば、アスパラギン酸および／またはグルタミン酸に対するものである。特定のアミノ酸置換としては、ｍＣＤ１２２置換Ｑ７１Ｙ、Ｔ７４Ｄ、Ｔ７４Ｙ、Ｈ１３４Ｄ、Ｈ１３４Ｅ、Ｈ１３４Ｋ、Ｙ１３５Ｆ、Ｙ１３５Ｅ、Ｙ１３５Ｒ、およびｈＣＤ１２２変化Ｑ７０Ｙ、Ｔ７３Ｄ、Ｔ７３Ｙ、Ｈ１３３Ｄ、Ｈ１３３Ｅ、Ｈ１３３Ｋ、Ｙ１３４Ｆ、Ｙ１３４Ｅ、Ｙ１３４Ｒが挙げられるが、これらに限定されない。直交サイトカインの選択は、直交受容体の選択によって異なり得る。

【0113】

直交受容体がＣＤ１２２であるいくつかの実施形態において、直交サイトカインは、ＩＬ－２、またはＩＬ－１５である。サイトカインは、例えば、酵母ディスプレイ進化、エラーが発生しやすいまたは標的突然変異誘発などによって、直交受容体への結合について選択され得る。選択された直交配列の代表的なセットを図６に示す。

【0114】

いくつかの実施形態において、直交サイトカインはＩＬ－２である。いくつかの実施形態において、マウスＩＬ－２（ｍＩＬ－２）については、Ｈ２７、Ｌ２８、Ｅ２９、Ｑ３０、Ｍ３３、Ｄ３４、Ｑ３６、Ｅ３７、Ｒ４１、Ｎ１０３のうちのいずれか１つ、ヒトＩＬ－２（ｈＩＬ－２）については、Ｑ１３、Ｌ１４、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｇ２７、Ｒ８１、Ｎ８８のうちのいずれか１つのアミノ酸残基のうちの１つ以上は、天然タンパク質のアミノ酸以外のアミノ酸で置換されるか、またはその位置で欠失される。いくつかのそのような実施形態において、アミノ酸置換のセットは、Ｅ２９、Ｑ３０、Ｍ３３、Ｄ３４、Ｑ３６、およびＥ３７（ｍＩＬ－２について）、そしてｈＩＬ－２については、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｒ８１のうちの１つ以上から選択される。

【0115】

いくつかの実施形態において、ｍＩＬ－２のアミノ酸置換は、［Ｈ２７Ｗ］、［Ｌ２８Ｍ、Ｌ２８Ｗ］、［Ｅ２９Ｄ、Ｅ２９Ｔ、Ｅ２９Ａ］、［Ｑ３０Ｎ］、［Ｍ３３Ｖ、Ｍ３３Ｉ、Ｍ３３Ａ］、［Ｄ３４Ｌ、Ｄ３４Ｍ］、［Ｑ３６Ｓ、Ｑ３６Ｔ、Ｑ３６Ｅ、Ｑ３６Ｋ、Ｑ３６Ｅ］、［Ｅ３７Ａ、Ｅ３７Ｗ、Ｅ３７Ｈ、Ｅ３７Ｙ、Ｅ３７Ｆ、Ｅ３７Ａ、Ｅ３７Ｙ］、［Ｒ４１Ｋ、Ｒ４１Ｓ］、［Ｎ１０３Ｅ、Ｎ１０３Ｑ］のうちの１つ以上、そしてｈＩＬ－２については、［Ｑ１３Ｗ］、［Ｌ１４Ｍ、Ｌ１４Ｗ］、［Ｅ１５Ｄ、Ｅ１５Ｔ、Ｅ１５Ａ、Ｅ１５Ｓ］、［Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｑ］、［Ｌ１９Ｖ、Ｌ１９Ｉ、Ｌ１９Ａ］、［Ｄ２０Ｌ、Ｄ２０Ｍ］、［Ｑ２２Ｓ、Ｑ２２Ｔ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ２２Ｋ、Ｑ２２Ｅ］、［Ｍ２３Ａ、Ｍ２３Ｗ、Ｍ２３Ｈ、Ｍ２３Ｙ、Ｍ２３Ｆ、Ｍ２３Ｑ、Ｍ２３Ｙ］、［Ｇ２７Ｋ、Ｇ２７Ｓ］、［Ｒ８１Ｄ、Ｒ８１Ｙ］、［Ｎ８８Ｅ、Ｎ８８Ｑ］、［Ｔ５１Ｉ］のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換のセットは、ｍＩＬ－２については、［Ｑ３０Ｎ、Ｍ３３Ｖ、Ｄ３４Ｎ、Ｑ３６Ｔ、Ｅ３７Ｈ、Ｒ４１Ｋ］、［Ｅ２９Ｄ、Ｑ３０Ｎ、Ｍ３３Ｖ、Ｄ３４Ｌ、Ｑ３６Ｔ、Ｅ３７Ｈ］、［Ｅ２９Ｄ、Ｑ３０Ｎ、Ｍ３３Ｖ、Ｄ３４Ｌ、Ｑ３６Ｔ、Ｅ３７Ａ］、および［Ｅ２９Ｄ、Ｑ３０Ｎ、Ｍ３３Ｖ、Ｄ３４Ｌ、Ｑ３６Ｋ、Ｅ３７Ａ］、そしてｈＩＬ－２については、［Ｈ１６Ｎ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｎ、Ｑ２２Ｔ、Ｍ２３Ｈ、Ｇ２７Ｋ］、［Ｅ１５Ｄ、Ｈ１６Ｎ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｔ、Ｍ２３Ｈ］、［Ｅ１５Ｄ、Ｈ１６Ｎ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｔ、Ｍ２３Ａ］、および［Ｅ１５Ｄ、Ｈ１６Ｎ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ａ］、またはそれらの保存的変異型の置換のセットのうちの１つを含む。

【0116】

いくつかの実施形態では、ｈＩＬ－２のアミノ酸置換は、［Ｅ１５Ｓ、Ｅ１５Ｔ、Ｅ１５Ｑ、Ｅ１５Ｈ］、［Ｈ１６Ｑ］、［Ｌ１９Ｖ、Ｌ１９Ｉ］、［Ｄ２０Ｔ、Ｄ２０Ｓ、Ｄ２０Ｍ、Ｄ２０Ｌ］、［Ｑ２２Ｋ、Ｑ２２Ｎ］、［Ｍ２３Ｌ、Ｍ２３Ｓ、Ｍ２３Ｖ、Ｍ２３Ｔ］のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、ｈＩＬ－２のコンセンサス変異セットは、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ／Ｓ／Ｍ；Ｑ２２Ｋ；Ｍ２３Ｌ／Ｓ］である。いくつかの実施形態では、ｈＩＬ－２のコンセンサス変異セットは、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ／Ａ］、および任意選択的にＱ２２Ｋである。

【0117】

いくつかの実施形態において、アミノ酸置換のセットは、ｈＩＬ－２については、［Ｅ１５Ｓ；Ｈ１６Ｑ；Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｔ／Ｓ；Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ｌ／Ｓ］、［Ｅ１５Ｓ；Ｈ１６Ｑ；Ｌ１９Ｉ；Ｄ２０Ｓ；Ｑ２２Ｋ；Ｍ２３Ｌ］、［Ｅ１５Ｓ；Ｌ１９Ｖ；Ｄ２０Ｍ；Ｑ２２Ｋ；Ｍ２３Ｓ］、［Ｅ１５Ｔ；Ｈ１６Ｑ；Ｌ１９Ｖ；Ｄ２０Ｓ；Ｍ２３Ｓ］、［Ｅ１５Ｑ；Ｌ１９Ｖ；Ｄ２０Ｍ；Ｑ２２Ｋ；Ｍ２３Ｓ］、［Ｅ１５Ｑ；Ｈ１６Ｑ；Ｌ１９Ｖ；Ｄ２０Ｔ；Ｑ２２Ｋ；Ｍ２３Ｖ］、［Ｅ１５Ｈ；Ｈ１６Ｑ；Ｌ１９Ｉ；Ｄ２０Ｓ；Ｑ２２Ｋ；Ｍ２３Ｌ］、［Ｅ１５Ｈ；Ｈ１６Ｑ；Ｌ１９Ｉ；Ｄ２０Ｌ；Ｑ２２Ｋ；Ｍ２３Ｔ］、［Ｌ１９Ｖ；Ｄ２０Ｍ；Ｑ２２Ｎ；Ｍ２３Ｓ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｄ、Ｔ５１Ｉ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ｑ、Ｒ８１Ｙ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｑ２２Ｋ、Ｍ２３Ａ］、［Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ｑ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ｌ、Ｍ２３Ａ］の置換のセットのうちの１つを含む。

【0118】

本発明の直交受容体の導入によりレシピエントまたはドナーからの細胞を操作し、操作された細胞を同族直交サイトカインと接触させることにより直交受容体を刺激することによって、細胞応答を増強させるための方法が提供される。主題の方法は、生物学的試料から単離され得るか、または前駆細胞の供給源からインビトロで得ることができる、標的細胞、例えば、Ｔ細胞、造血幹細胞等を得るステップを含む。細胞は、直交受容体をコードする配列を含む発現ベクターで形質導入またはトランスフェクトされ、このステップは任意の好適な培養培地において行うことができる。

【0119】

いくつかの実施形態において、本発明の直交受容体の導入によって細胞が修飾されている操作された細胞が提供される。この目的には、任意の細胞が使用され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞、細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔ_Ｈ１、Ｔ_Ｈ２、Ｔ_Ｈ９、Ｔ_Ｈ１１、Ｔ_Ｈ２２、Ｔ_ＦＨ、制御性Ｔ細胞、例えば、Ｔ_Ｒ１、天然Ｔ_Ｒｅｇ、誘導性Ｔ_Ｒｅｇ、メモリーＴ細胞、例えば、中央メモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞等を含むが、これらに限定されないＴ細胞である。他の実施形態において、操作された細胞は、幹細胞、例えば、造血幹細胞またはＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、対象に移行する前に、エクスビボ手順で遺伝子組換えされる。操作された細胞は、療法のための単位用量で提供することができ、意図されるレシピエントに関して同種、自己等であり得る。

【0120】

細胞、例えば、対象から収集された細胞は、所望の細胞を濃縮する技法によって細胞の混合物から分離され得る。適切な溶液が、分散または懸濁のために使用され得る。そのような溶液は、一般に、低濃度の、通常５～２５ｍＭの許容される緩衝液とともに、ウシ胎仔血清または他の天然に生じる因子で好都合に補充された、平衡塩溶液、例えば、通常の生理食塩水、ＰＢＳ、ハンクス平衡塩溶液等である。好都合な緩衝液には、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液等が含まれる。あるいは、操作された細胞株、拡大された同種細胞などが操作のために使用される。

【0121】

親和性分離のための技法には、抗体コーティングされた磁気ビーズを使用する磁気分離、親和性クロマトグラフィー、モノクローナル抗体に結合した、またはモノクローナル抗体、例えば、補体および細胞毒素とともに使用される細胞傷害性剤、ならびに固体マトリックス、例えば、プレートに結合した抗体を用いた「パニング」、または他の好都合な技法が含まれ得る。正確な分離をもたらす技法には、多色チャネル、低角度および鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネル等の、様々な程度の精巧さを有し得る蛍光活性化細胞選別機が含まれる。細胞は、死細胞に関連する染料（例えば、ヨウ化プロピジウム）を用いることによって、死細胞に対して選択され得る。選択された細胞の生存能に過度に有害ではない任意の技法が用いられ得る。親和性試薬は、上記に示される細胞表面分子に特異的な受容体またはリガンドであり得る。抗体試薬に加えて、ペプチド－ＭＨＣ抗原およびＴ細胞受容体対、ペプチドリガンドおよび受容体、エフェクターおよび受容体分子などを使用してもよい。

【0122】

分離した細胞は、細胞の生存能を維持する任意の適切な培地に収集することができ、通常、収集チューブの底部に血清のクッションを有する。様々な培地が市販されており、細胞の性質に従って使用されてもよく、頻繁に胎仔ウシ血清で補充されるｄＭＥＭ、ＨＢＳＳ、ｄＰＢＳ、ＲＰＭＩ、イフコス培地等を含む。

【0123】

収集され、任意選択的に濃縮された細胞集団は、直ちに使用され得るか、または液体窒素温度で凍結および保存され得、解凍して再使用することができる。通常、１０％のＤＭＳＯ、５０％のＦＣＳ、４０％のＲＰＭＩ１６４０培地に細胞を保存する。

【0124】

いくつかの実施形態において、直交受容体をコードするコード配列を含むベクターが提供され、コード配列は、所望の細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結される。様々なベクター、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、ミニサークルベクターが当該技術分野で既知であり、この目的のために使用され得、これらのベクターは、標的細胞ゲノムに組み込まれ得るか、またはエピソームにより維持され得る。ベクターをコードする受容体は、受容体に結合し、それを活性化する直交サイトカインをコードするベクターと組み合わせて、キットにおいて提供され得る。いくつかの実施形態において、直交サイトカインのコード配列は、高発現プロモーターに作動可能に連結され、産生のために最適化され得る。他の実施形態において、直交受容体をコードするベクターが、患者への投与のためにパッケージ化された、例えば、単位用量で、直交サイトカインの精製組成物で提供されるキットが提供される。

【0125】

【0126】

細胞がインビトロで直交サイトカインと接触させられる場合、サイトカインは、天然細胞機構、例えば、アクセサリータンパク質、共受容体などを利用し得る、受容体からのシグナル伝達を活性化するために十分な用量および期間にわたって操作された細胞に添加される。任意の好適な培養培地が使用され得る。このように活性化された細胞は、抗原特異性の決定、サイトカインプロファイルなどに関する実験目的を含む任意の所望の目的のために、およびインビボでの送達のために使用され得る。

【0127】

接触がインビボで行われる場合、直交ＩＬ－２β受容体を発現するように修飾されたＣＡＲ－Ｔ細胞を含むがこれに限定されない有効用量の操作された細胞を、直交サイトカイン、例えばＩＬ－２の投与と組み合わせて、または投与前に、レシピエントに注入し、それらの天然環境、例えば、リンパ節等においてＴ細胞に接触させる。投薬量および頻度は、薬剤、投与方法、サイトカインの性質などに応じて異なり得る。そのようなガイドラインが個々の状況に応じて調整されることが当業者によって理解される。投薬量は、局所投与、例えば、経鼻、吸入等、または全身投与、例えば、ｉ．ｍ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｖ．などのために変更されてもよい。一般に、少なくとも約１０^４の操作された細胞／ｋｇ、少なくとも約１０^５の操作された細胞／ｋｇ、少なくとも約１０^６の操作された細胞／ｋｇ、少なくとも約１０^７の操作された細胞／ｋｇ以上が投与される。

【0128】

操作された細胞がＴ細胞である場合、強化された免疫応答は、レシピエントに存在する標的細胞に対する、例えば、腫瘍細胞、感染細胞の除去に対するＴ細胞の細胞溶解応答の増加、自己免疫疾患の症状の減少などとして現れ得る。

【0129】

操作されたＴ細胞は、例えば、ヒト治療のための治療的使用に好適な医薬組成物において提供され得る。そのような細胞を含む治療製剤は、水溶液の形態で、凍結されるか、または生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤との投与のために調製され得る（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ１６ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。細胞は、良好な医療行為と一致する様式で、製剤化、投薬、および投与される。この文脈において考慮する要因には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および医師に既知である他の要因が含まれる。

【0130】

細胞は、任意の好適な手段、通常は非経口的手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内（ボーラスまたは緩徐注入）、動脈内、腹腔内、髄腔内、または皮下投与が含まれる。

【0131】

操作されたＴ細胞は、通常は血管内に、任意の生理学的に許容される培地において対象に注入され得るが、それらはまた、細胞が成長のために適切な部位を見つける可能性がある任意の他の部位に導入されてもよい。通常、少なくとも１×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０^７細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０^８細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０^９細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０^１０細胞／ｋｇ以上が投与され、通常、収集中に得られるＴ細胞の数によって制限される。

【0132】

例えば、本発明の実施で使用するための細胞の投与の典型的な範囲は、療法過程ごとに、対象体重１ｋｇ当たり約１×１０^５～５×１０^８の生細胞の範囲である。したがって、体重に応じて調整した場合、ヒト対象における生細胞の投与の典型的な範囲は、療法過程ごとに、約１×１０^６～約１×１０^１３生細胞、あるいは約５×１０^６～約５×１０^１２生細胞、あるいは約１×１０^７～約１×１０^１２生細胞、あるいは約５×１０^７～約１×１０^１２生細胞、あるいは約１×１０^８～約１×１０^１２生細胞、あるいは約５×１０^８～約１×１０^１２生細胞、あるいは約１×１０^９～約１×１０^１２生細胞の範囲である。一実施形態において、細胞の用量は療法過程ごとに２．５～５×１０^９生細胞の範囲内である。

【0133】

療法過程は、一定の期間にわたって単回用量または複数回用量であり得る。いくつかの実施形態において、細胞は単回用量で投与される。いくつかの実施形態において、細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、２１、２８、３０、６０、９０、１２０、または１８０日の期間にわたって投与される２回以上の分割用量で投与される。そのような分割投薬プロトコルで投与される操作された細胞の量は、各投与において同じであり得るか、または異なるレベルで提供され得る。一定期間にわたる複数日投薬プロトコルは治療の有害作用および上記で論じられるようなそれらの調節を含む治療に対する対象の応答を考慮して、細胞の投与を監視する当業者（例えば、医師）によって提供され得る。

【0134】

例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の現在の臨床実践において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、一般に、リンパ球枯渇（例えば、アレムツズマブ（モノクローナル抗ＣＤ５２）、プリン類似体などの投与による）と組み合わせて投与され、宿主免疫回復前までにＣＡＲ－Ｔ細胞の拡大を容易にする。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞はアレムツズマブに対する耐性のために修飾されてもよい。本発明の一態様において、ＣＡＲ－Ｔ療法と関連して現在用いられるリンパ球枯渇は、本発明の直交リガンド発現ＣＡＲ－Ｔによって除去または低減され得る。上述のように、リンパ球枯渇は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の拡大を可能にするために一般的に用いられる。しかしながら、リンパ球枯渇は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の主な副作用にも関連する。直交リガンドは、特定のＴ細胞集団を選択的に拡大する手段を提供するため、直交リガンド発現ＣＡＲ－Ｔの投与前のリンパ球枯渇の必要性を低減し得る。本発明は、直交リガンド発現ＣＡＲ－Ｔの投与前に、低減されたリンパ球枯渇を行わずに、または行う、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の実施を可能にする。

【0135】

一実施形態では、本発明は、直交リガンドＣＡＲ－Ｔの投与前にリンパ球枯渇を行わずに直交リガンド発現ＣＡＲ－Ｔを投与することによって、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法による治療に適している疾患、障害、または状態（例えば、癌）に罹患している対象を治療する方法を提供する。一実施形態において、本発明は、異常な細胞集団（例えば、腫瘍）の存在に関連する疾患、障害に罹患している哺乳類対象の治療方法を提供し、該細胞集団は、１つ以上の表面抗原（例えば、腫瘍抗原（複数可））の発現を特徴とし、本方法は、（ａ）個体からＴ細胞を含む生物学的試料を得るステップと、（ｂ）Ｔ細胞の存在のために生物学的試料を濃縮するステップと、（ｃ）Ｔ細胞を、ＣＡＲをコードする核酸配列および直交受容体をコードする核酸配列を含む１つ以上の発現ベクターでトランスフェクトするステップであって、ＣＡＲの抗原標的化ドメインは、異常な細胞集団上に存在する少なくとも１つの抗原に結合することができる、ステップと、（ｄ）エクスビボで直交受容体発現ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団を拡大するステップと、（ｅ）薬学的に有効な量の直交受容体発現ＣＡＲ－Ｔ細胞を哺乳動物に投与するステップと、（ｆ）ＣＡＲ－Ｔ細胞上に発現される直交受容体に選択的に結合するリガンドを使用して、直交受容体発現ＣＡＲ－Ｔ細胞の成長を調節するステップとを含む。一実施形態において、前述の方法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法過程の開始前の哺乳動物のリンパ球枯渇または免疫抑制に関連する。別の実施形態では、前述の方法は、哺乳動物のリンパ球枯渇および／または免疫抑制を行うことなく実施される。

【0136】

好ましい製剤は、意図される投与方法および治療用途に依存する。組成物は、所望の製剤に応じて、動物またはヒト投与のための医薬組成物を製剤化するために一般的に使用されるビヒクルとして定義される、薬学的に許容される非毒性担体または希釈剤を含むこともできる。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響を与えないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理学的リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。加えて、医薬組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、または非毒性、非治療的、非免疫原性安定剤なども含み得る。

【0137】

さらにいくつかの他の実施形態において、医薬組成物は、タンパク質などの大きく、ゆっくりと代謝される巨大分子、キトサンなどの多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびコポリマー（ラテックス官能化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、アガロース、セルロースなど）、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、ならびに脂質凝集体（油滴またはリポソームなど）も含み得る。

【0138】

許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに非毒性であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリドなど；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。

【0139】

インビボ投与のために使用される製剤は、典型的には、滅菌である。本発明の組成物の滅菌は、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成され得る。

【0140】

典型的には、組成物は、液体溶液または懸濁液としてのいずれかで注射剤として調製され、注射前の液体ビヒクル中の溶液または懸濁液に好適な固体形態も調製され得る。調製物はまた、上記で論じられるように、アジュバント効果の増強のためにリポソーム、またはポリラクチド、ポリグリコリド、もしくはコポリマーなどの微粒子に乳化されるか、または封入することもできる。Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７，１９９０ａｎｄＨａｎｅｓ，ＡｄｖａｎｃｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖｉｅｗｓ２８：９７－１１９，１９９７を参照されたい。本発明の薬剤は、活性成分の持続的または脈動的放出を可能にするような様式で製剤化され得るデポー注射またはインプラント調製物の形態で投与され得る。医薬組成物は、一般に、減菌で実質的に等張として、米国食品医薬品局の全ての適正製造基準（ＧｏｏｄＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇＰｒａｃｔｉｃｅ）（ＧＭＰ）の規制に完全に準拠して製剤化される。

【0141】

本方法で使用するためのキットも提供される。主題のキットは、直交サイトカイン受容体をコードする発現ベクター、または発現ベクターを含む細胞を含む。キットは、同族直交サイトカインをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、成分は、任意の好都合なパッケージ（例えば、スティックパック、用量パック等）で、剤形（例えば、治療上有効な剤形）、液体、または固体形態で提供される。細胞の選択またはインビトロ誘導のための試薬、例えば、成長因子、分化剤、組織培養試薬なども提供され得る。

【0142】

上記の成分に加えて、主題のキットは、主題の方法を実施するための説明書をさらに含み得る（ある特定の実施形態において）。これらの説明書は、様々な形態で主題のキットに存在してもよく、そのうちの１つ以上がキットに存在し得る。これらの説明書が存在し得る１つの形態は、好適な媒体または基材、例えば、情報が印刷される１枚の紙（複数可）、キットのパッケージ、添付文書などの印刷情報としてである。これらの説明書のさらに別の形態は、情報が記録されたコンピュータ可読媒体、例えば、ディスケット、コンパクトディスク（ＣＤ）、フラッシュドライブなどである。存在し得るこれらの説明書のさらに別の形態は、離れた場所で情報にアクセスするためにインターネットを介して使用され得るウェブサイトアドレスである。

【0143】

いくつかの実施形態において、主題の組成物、方法、およびキットを使用して、Ｔ細胞媒介免疫応答を増強する。いくつかの実施形態において、免疫応答は、標的細胞、例えば、癌細胞、感染細胞、自己免疫疾患に関与する免疫細胞などを枯渇または調節することが望ましい状態に指向される。

【0144】

いくつかの実施形態では、状態は、慢性感染、すなわち、最大１週間、２週間等の期間内に宿主免疫系によってクリアされない感染である。場合によっては、慢性感染は、病原体遺伝的要素を宿主ゲノム、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス等に組み込むことを伴う。他の場合には、慢性感染、例えば、ある特定の細胞内細菌または原虫病原体は、宿主細胞内に存在する病原体細胞に起因する。加えて、いくつかの実施形態において、感染は、ヘルペスウイルスまたはヒトパピローマウイルスと同様に潜伏期にある。

【0145】

本発明の方法は、治療の不在下での除去と比較して、宿主生物のＴエフェクター細胞による感染細胞のより効果的な殺傷を提供し、したがって、病原体の生活環の細胞内相に指向され得る。本方法は、治療の有効性について患者を監視することをさらに含み得る。監視は、感染の臨床兆候、例えば、発熱、白血球数等を測定し、かつ／または病原体の存在について直接監視してもよい。

【0146】

いくつかの実施形態において、状態は癌である。本明細書で使用される「癌」という用語は、細胞の異常な、制御されていない成長によって引き起こされる様々な状態を指す。「癌細胞」と称される、癌を引き起こすことができる細胞は、制御されていない増殖、不死、転移可能性、急速な成長および増殖速度、ならびに／またはある特定の典型的な形態学的特徴などの特徴的な特性を有する。癌は、限定されないが、腫瘍（複数可）の存在の検出（例えば、臨床的または放射線学的手段によって）、腫瘍内または別の生物学的試料から（例えば、組織生検から）の細胞の検査、癌を示す血液マーカーの測定、および癌を示す遺伝子型の検出を含む、いくつかの方法のうちのいずれかで検出され得る。しかしながら、上記の検出方法のうちの１つ以上における否定的な結果は、必ずしも癌の不在を示すものではなく、例えば、癌治療に対する完全な応答を示した患者は、その後の再発によって証明されるように、依然として癌を有し得る。

【0147】

本発明はここで十分に説明されてきたが、本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく様々な変更および修正が行われ得ることは当業者には明らかである。

【0148】

実験
直交ＩＬ－２およびＩＬ－２Ｒβ
ここでは、エクスビボ養子細胞療法の設定において、所望の細胞サブセットの選択的拡大を可能にする操作されたサイトカインおよび受容体を伴う発明を説明する。特定の発明は、サイトカインインターロイキン－２（ＩＬ－２）およびその受容体であるＩＬ－２Ｒβ鎖（ＩＬ－２Ｒβ）について記載されており、これは、養子細胞療法におけるＴ細胞の特定の拡大を可能にし、したがって、免疫療法における満たされていないニーズに対処する。本明細書に記載のアプローチは、骨髄および幹細胞移植、ならびに多くの他のモダリティを含む、細胞が特定の受容体－リガンド対によって刺激される養子細胞療法の任意の設定に一般化することができる。

【0149】

直交ＩＬ－２およびＩＬ－２Ｒβリガンド－受容体対が具体的に記載される。ＩＬ－２のオルソログ形およびＩＬ－２Ｒβのオルソログ形は、それらの野生型対応物ではなく、互いに特異的に結合する。直交ＩＬ－２Ｒβに対する様々な親和性度で、複数の直交ＩＬ－２変異型配列が提供される。直交ＩＬ－２Ｒβを発現するように操作されたＴ細胞の直交ＩＬ－２依存性シグナル伝達およびＴ細胞増殖が示される。

【0150】

ＩＬ－２は、それぞれ、エフェクターＴ細胞および制御性Ｔ細胞の拡大を促進するその能力により、癌および自己免疫の治療のための魅力的な生物学的製剤である。しかしながら、ＩＬ－２のこの多面的な性質、ならびにオフターゲット毒性が、診療所でのその使用を制限する。ＩＬ－２の免疫刺激および免疫抑制特性を切り離す能力は、ＩＬ－２免疫療法の優れた形態を提供し得る。

【0151】

本明細書に示されることは、直交ＩＬ－２Ｒβを発現するようにＴ細胞を操作する能力である。これらの操作されたＴ細胞は、下流シグナル伝達分子（例えば、ＳＴＡＴ５）のリン酸化、およびＴ細胞増殖をもたらす、直交ＩＬ－２に応答することが示される。野生型Ｔ細胞における直交ＩＬ－２の活性は、野生型ＩＬ－２の活性と比較して完全に抑制されるか、または著しく鈍化される。したがって、直交ＩＬ－２／ＩＬ－２受容体対を使用した選択的Ｔ細胞拡大が示される。

【0152】

直交ＩＬ－２／ＩＬ－２受容体対の適用には、癌療法のための腫瘍反応性細胞傷害性Ｔ細胞、感染症および／または癌のためのＮＫ細胞、ならびに自己免疫障害患のための制御性Ｔ細胞の選択的拡大が挙げられるが、これらに限定されない。

【0153】

ＩＬ－２Ｒβへの結合を完全に除去しないが妨害する変異により、中間体（ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒγ）または高親和性野生型ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒα、Ｒβ、Ｒγ）に対する鈍化した親和性を有するＩＬ－２変異型はまた、例えば、自己免疫疾患の治療において、ＩＬ－２Ｒα高細胞に対するオルソログＩＬ－２の活性を選択的に標的化するために有用である。ＩＬ－２Ｒβ鎖に対する親和性が除去されているが、ＩＬ－２Ｒαへの結合を保持し、したがって、高親和性ＩＬ－２Ｒ形成を阻害することによって野生型ＩＬ－２との競合アンタゴニストとして機能するＩＬ－２変異型は、自己免疫疾患または移植片対宿主病を治療するために有用である。

【0154】

Ｔ細胞の拡大を制御するための直交ＩＬ－２／ＩＬ－２受容体対を生成および利用する全体的な概念を、図１の概略図に示す。図２は、構造情報に基づく突然変異誘導を使用して、野生型ＩＬ－２への結合を欠くＩＬ－２Ｒβオルソログを生成するステップを含む、ワークフローを提示する。野生型ＩＬ－２へのＩＬ－２Ｒβ結合を妨害すると予測される変異は、酵母に基づくスクリーニングアッセイを使用して実験的に確認され、表面プラズモン共鳴により精製された組換えタンパク質を使用してさらに検証される。このアプローチを使用して、野生型ＩＬ－２への結合を妨害するいくつかのＩＬ－２Ｒβ点変異が記載され、これらの受容体変異型の各々は、直交受容体として機能し得る。単一点変異はまた、１つ、２つ以上の追加の点変異と組み合わせて、より大きなＩＬ－２Ｒβオルソログのライブラリを生成してもよい。

【0155】

直交マウスＩＬ－２Ｒβ変異型の配列を図３に示す。これらの変異を、組み合わせた変異が野生型ＩＬ－２結合を妨害する限り、単一点変異またはそれらの任意の組み合わせとして使用して、１つ、２つ、３つ以上の点変異を有するＩＬ－２Ｒβオルソログを生成することができる。

【0156】

図４は、野生型ｍＩＬ－２結合を抑制するアミノ酸変化Ｈ１３４Ｄ、Ｙ１３５Ｆを含むｍＩＬ－２Ｒβ変異型の特徴付けを示す。これらの２つの残基は、既知のＩＬ－２相互作用ホットスポット（ＲｉｎｇＡｅｔａｌ，ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ（２０１２）１３：１１８７－９５）であり、変異が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により野生型ＩＬ－２結合を妨害することを確認した。

【0157】

図５は、直交ＩＬ－２／ＩＬ－２Ｒβ対を操作するためのワークフローを示す。ＩＬ－２Ｒβ直交オルソログアミノ酸残基に近接しているか、またはそれと接触している残基をランダム化するＩＬ－２のオルソログライブラリが生成される。酵母ディスプレイを使用して、オルソログＩＬ－２Ｒβに結合するＩＬ－２変異型について選択し、野生型ＩＬ－２Ｒβに結合するクローンを廃棄する。部位特異的またはエラーが発生しやすい突然変異誘発を使用してこのプロセスを繰り返し、野生型ＩＬ－２Ｒβではなくオルソログへの差次的結合特性を有するＩＬ－２変異型を生成してもよい。このアプローチを使用して、１）酵母ディスプレイされた直交ＩＬ－２変異型の無傷の構造的完全性を示すＩＬ－２Ｒα鎖（緑色の曲線）への結合を保持し、２）直交ＩＬ－２Ｒβ（オレンジ色の曲線）に結合するが、３）野生型ＩＬ－２Ｒβ（青色の曲線）には結合しないＩＬ－２オルソログのライブラリを生成した。

【0158】

特徴付けられる直交マウスＩＬ－２変異型の配列を図６に示す。マウスＩＬ－２およびＩＬ－２Ｒβならびにヒト対応物のアライメントを図１５に示す。これらの４つの配列は、天然または野生型配列の参照を提供する。直交マウスＩＬ－２／ＩＬ－２Ｒβ対を作製するために改変されたアミノ酸残基は、主にヒトにおいて保存される。したがって、直交マウスＩＬ－２およびＩＬ－２Ｒβ配列は、ヒトＩＬ－２およびＩＬ－２Ｒβタンパク質に容易に翻訳され得る。

【0159】

図７に示されるように、ｏｒｔｈｏＩＬ－２変異型は、野生型ＩＬ－２およびＩＬ－２Ｒβ相互作用と同様またはそれ以上の親和性でｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒβに結合する。可溶性直交ＩＬ－２または野生型ＩＬ－２タンパク質を、野生型またはｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒβでコーティングしたセンサチップ上に流した。結合を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定し、１：１結合モデルを使用して曲線を適合させた。図８に示されるように、ｏｒｔｈｏＩＬ－２変異型は、野生型ＣＤ２５陽性およびＣＤ２５陰性脾細胞に対して鈍化した活性（ｐｈｏｓｐｈｏＳＴＡＴ５）を示す。

【0160】

ｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒβ発現マウスＣＴＬＬ－２Ｔ細胞の生成を図９に示す。完全長直交受容体をコードする遺伝子でのレンチウイルス形質導入により、直交ＩＬ－２Ｒβ（ｏｒｔｈｏＣＴＬＬ－２）を発現する不死化マウスＴ細胞株（ＣＴＬＬ－２）を作製した。形質導入細胞を、非形質導入細胞に対して毒素であるピューロマイシンを用いて選択し、野生型および直交ＩＬ－２Ｒβの両方を発現する安定したＣＴＬＬ－２細胞株を得た。この細胞株はまた、ＣＤ２５およびＣＤ１３２に対して陽性であり、したがって、高親和性ＩＬ－２受容体複合体を発現するＴ細胞を表す。細胞表面ＩＬ－２Ｒβ（ＣＤ１２２）を検出するために使用される抗体は、野生型とｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒβとを区別しない。したがって、野生型細胞とｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒβ ＣＴＬＬ－２細胞との間の平均蛍光強度の増加は、これらの細胞が直交受容体を発現することを示唆する。これは、ｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒβを発現するために使用される同じベクターによってコードされる、ピューロマイシンに対するそれらの耐性によってさらに支持される。

【0161】

図１０に示されるように、ｏｒｔｈｏＩＬ－２変異型の第１のセットは、ｏｒｔｈｏＴ細胞に対して選択的である。直交ＩＬ－２シグナル伝達を調べるために、操作されていない（野生型）または形質導入されたいずれかのＣＴＬＬ－２細胞モデルを利用して、直交ＩＬ－２Ｒβ（ｏｒｔｈｏ）も発現させた。次いで、ＳＴＡＴ５のリン酸化を誘導する野生型または様々な直交ＩＬ－２クローンの能力（ＩＬ－２依存性シグナル伝達の定量的読み出し）を決定した。野生型細胞と比較して、直交ＩＬ－２Ｒβ発現細胞上で選択的ＳＴＡＴ５リン酸化を誘導するいくつかの直交ＩＬ－２変異型を同定した。選択クローンの用量応答曲線を図１１に示す。

【0162】

ｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒβ（Ｈ１３４ＤＹ１３５Ｆ）を発現するように操作された初代リンパ節由来Ｔ細胞。我々の不死化マウスＴ細胞モデルに加えて、マウスリンパ節および脾臓細胞の単離、ＣＤ３／ＣＤ２８での活性化、続いて完全長直交受容体をコードする遺伝子のレトロウイルス形質導入により、初代マウスＴ細胞を発現するｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒβも生成した。この構築物はまた、ＦＡＣＳを介してＹＦＰ発現を分析することによって形質導入の確認を可能にする、ＩＲＥＳ、続いて蛍光タンパク質ＹＦＰも含有する。マウスＴ細胞はまた、図１２に示されるように、高親和性ＩＬ－２受容体複合体（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ１２２、およびＣＤ１３２）も発現する。

【0163】

図１３に示されるように、ｏｒｔｈｏＩＬ－２変異型は、ｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒβ発現初代マウスＴ細胞上で選択的ＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する。

【0164】

ｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒβを介して選択的にシグナル伝達するｏｒｔｈｏＩＬ－２変異型（図１１）はまた、野生型ＣＴＬＬ－２細胞と比較して、ｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒβを発現するＣＴＬＬ－２細胞の選択的拡大を誘導する（図１４）。

【0165】

直交ＩＬ－２工学的アプローチを、ヒトＩＬ－２およびヒトＩＬ－２Ｒβにも適用した。これらの残基が、マウスとヒトとの間で高度に保存されているため、マウスｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒβを作製するために使用されたＨ１３３ＤＹ１３４Ｆ変異をヒトＩＬ－２Ｒβに導入した。実際、野生型ｈＩＬ－２Ｒβは酵母ディスプレイされた野生型ＩＬ－２に結合するが、ｈＩＬ－２Ｒβ Ｈ１３３ＤＹ１３４Ｆ変異体（ｏｒｔｈｏ－ｈＩＬ－２Ｒβ）は、野生型ＩＬ－２への検出可能な結合を欠く（図１５）。Ｈ１３３ＤＹ１３４Ｆ変異に接触しているか、またはそれに近接していると予測される残基をランダム化することによって、酵母の表面上にディスプレイされるヒトＩＬ－２変異体のライブラリを作製し、野生型ヒトＩＬ－２Ｒβではなくｏｒｔｈｏに結合したＩＬ－２変異型について選択した。このスキームは、マウスＩＬ－２直交対を操作するために用いられたものと同一であり、ヒト対において成功した。戦略を図１６に示す。図１６Ｃに示されるように、ｏｒｔｈｏｈＩＬ－２Ｒβに結合可能なｏｒｔｈｏｈＩＬ－２配列の収束を示す変異のコンセンサスセットが同定された。

【0166】

本発明のポリペプチドは、インビボでも活性である。図１７～１９に示されるように、マウスモデルを使用して、マウスにおける直交ＩＬ－２Ｒｂ発現Ｔ細胞の選択的拡大または生存増加を示した。ｏｒｔｈｏＩＬ－２クローン１Ｇ１２／１４９がマウスにおいて野生型Ｔ細胞ではなく直交を選択的に拡大することを示す。野生型ＩＬ－２での処理は、ＰＢＳ対照と比較して野生型およびｏｒｔｈｏＴ細胞の両方の拡大をもたらすが、ｏｒｔｈｏＩＬ－２クローン１Ｇ１２／１４９での処理は、野生型Ｔ細胞上で活性が制限されたｏｒｔｈｏＴ細胞を選択的に拡大する。

【0167】

実施例２
ヒトＩＬ－２オルソログ
材料および方法
タンパク質産生。野生型ヒトＩＬ－２をコードするＤＮＡを、親和性精製のためにＣ末端８ｘＨＩＳタグを含む昆虫発現ベクターｐＡｃＧＰ６７－Ａにクローニングした。マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）をコードするＤＮＡを、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ５２２４１）から購入し、ｈＩＬ－２のＮ末端とＭＳＡのＣ末端との間の融合物としてｐＡｃＧＰ６７－Ａにクローニングした。活性スクリーンから単離されたｏｒｔｈｏヒトＩＬ－２の変異型を、ＧＢｌｏｃｋ（ＩＤＴ）として合成し、オーバーラップ伸長によりｐＡｃＧＰ６７－Ａ－ＭＳＡベクターにクローニングした。

【0168】

分泌のためにＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（登録商標）バキュロウイルス発現系（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、昆虫発現ＤＮＡ構築物を、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ（ＨｉｇｈＦｉｖｅ（登録商標））細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクトし、Ｎｉ－ＮＴＡにより澄清した上清から精製し、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ－２００カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーを行い、減菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に製剤化した。タンパク質を濃縮し、－８０℃で保存した。

【0169】

哺乳類発現ベクター。完全長ヒトＣＤ２５をレンチウイルスベクターｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＳＣ－ＥＦ１－Ｐｕｒｏ（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にクローニングした。Ｈ１３３ＤおよびＹ１３４Ｆ変異を導入する変異誘発プライマーを使用して、オーバーラップ伸長ＰＣＲによって完全長ｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒβをクローニングするために、完全長ヒトＩＬ－２ＲβをコードするｃＤＮＡを鋳型として使用した。得られたＰＣＲ産物を、レトロウイルスベクターｐＭＳＣＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＹＦＰにクローニングした。

【0170】

細胞培養。ＹＴ－ＮＫ様細胞株は、ＫｙｏｔｏＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＪｕｎｊｉＹｏｄｏｉ博士によって寛大に提供された。ＹＴ細胞を、ｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＳＣ－ＥＦ１－Ｐｕｒｏ－ｈＣＤ２５レンチウイルスで形質導入し、完全長ヒトＣＤ２５（ＹＴ＋）を安定して発現するＹＴ細胞を、１０μｇ／ｍＬのピューロマイシンにおいて選択した。ＹＴ＋細胞を、ｐＭＳＣＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＹＦＰ－ｏｒｔｈｏ－ヒト－Ｒβを含有するレトロウイルスで形質導入し、ＦＡＣＳにより選別して、ＹＦＰ＋（ｏｒｔｈｏ）集団を純度まで濃縮した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＳｔａｎｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＤｒ．ＩｒｖｉｎｇＷｅｉｓｓｍａｎ’ｓｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって寛大に提供された。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％のＬ－グルタミン（Ｌ－ｇｌｕ）、および１％のペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）で補充されたＤＭＥＭにおいて維持した。ＹＴ細胞を、ＲＰＭＩ完全（ＲＰＭＩ＋ＧｌｕｔａＭａｘ＋１０％のＦＢＳ、１％のＬ－Ｇｌｕ、１％のＮａＰｙｒ、１％のＮＥＡＡ、１８ｍＭのＨＥＰＥＳ、および１％のｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）において維持した。

【0171】

レンチウイルスおよびレトロウイルス産生。第３世代パッケージングベクターを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてレンチウイルスを産生した。簡潔に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０ｃｍ組織培養皿当たり５×１０^６細胞の密度で播種し、完全培地（ＤＭＥＭ、１０％のＦＢＳ、１％のＬ－Ｇｌｕ、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）において５～７時間接着させた。上清を除去し、低ＦＢＳ（５％）ＤＭＥＭ（１０ｍＬ）で補充し、細胞を、製造業者の推奨に従ってＸ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ（登録商標）ＨＰＤＮＡトランスフェクション試薬（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を使用して、４：２：１比のｐＣＤＨ：ｐｓＰＡＸ２：ｐＭＤ２Ｇでトランスフェクトし、完全培地において３７℃で一晩培養した。培地を除去し、７．５ｍＬの低ＦＢＳＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ、５％のＦＢＳ、１％のＬ－Ｇｌｕ、１％のＰ／Ｓ）で補充し、レンチウイルスを２４および４８時間後に上清から収集し、プールし、０．４５μｍフィルタを通して澄清し、ＰＥＧ－ｉｔウイルス沈殿溶液（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏ）で沈殿させ、ペレット化し、元の体積の１／１００で完全培地に再懸濁し、液体窒素中で急速冷凍し、－８０℃で保存した。

【0172】

レトロウイルスは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生された。簡潔に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０ｃｍ組織培養皿当たり５×１０^６細胞の密度で播種し、完全培地（ＤＭＥＭ、１０％のＦＢＳ、１％のＬ－Ｇｌｕ、１％のＰ／Ｓ）において５～７時間接着させた。上清を除去し、低ＦＢＳＤＭＥＭ（１０ｍＬ）で補充し、細胞を、製造業者の推奨に従ってＸ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ（登録商標）ＨＰを使用して、１．５：１比のｐＭＳＣＶレトロウイルスベクターおよびｐＣＬ１０Ａパッケージングベクター（ＮｏｖｕｓＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）（Ｄｒ．ＭｅｌｉｓｓａＭｃＣｒａｃｋｅｎ，ＳｔａｎｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙの寛容な贈与）でトランスフェクトし、低ＦＢＳＤＭＥＭにおいて一晩培養した。培地を除去し、７．５ｍＬの低ＦＢＳＤＭＥＭで補充し、さらに２４時間培養した。培地を収集し、０．４５μｍのフィルタを使用して澄清し、－８０℃で保存するために液体窒素において急速冷凍した。培地を補充し（低ＦＢＳＤＭＥＭ）、細胞をさらに２４時間培養し、ウイルスを収集し、上記のように保存した。

【0173】

ＩＬ－２の酵母ディスプレイ。ヒトＩＬ－２を、Ａｇａ２のＣ末端とＩＬ－２のＮ末端との間に３Ｃプロテアーゼ切断部位を保有するｐＣＴ３０２ベクター、ならびにＮ末端ｃＭｙｃエピトープタグを使用して、Ａｇａ２のＣ末端への融合によって酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＥＢＹ１００の表面上にディスプレイした。簡潔に、コンピテントなＥＢＹ１００を、酵母ディスプレイされたｈＩＬ－２をコードするプラスミドでエレクトロポレーションし、３０℃でＳＤＣＡＡ選択培地において一晩回収した。形質転換酵母をＳＤＣＡＡにおいて１回継代し、対数期の酵母培養物をペレット化し、１．０のＯＤ６００で１０％のＳＤＣＡＡを含有するＳＧＣＡＡ誘導培地に再懸濁し、２０℃で２４時間培養した。機能性ｈＩＬ－２の表面発現を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識抗ｃＭｙｃｍＡｂ（１：１００希釈；細胞シグナル伝達）および野生型ｈＩＬ－２ＲβのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識ストレプトアビジン（ＳＡ）四量体（５００ｎＭＳＡ）で酵母を染色することによって、ＦＡＣＳにより確認した。

【0174】

ヒトＩＬ－２変異酵母ディスプレイライブラリ生成。部位特異的ライブラリを、ライブラリ３（Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３）：（配列番号１０）５’－ＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＴＧＮＨＫＮＨＫＴＴＡＣＴＴＮＨＫＮＨＫＴＴＡＮＨＫＮＨＫＡＴＴＴＴＧＡＡＴＧＧＡＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＡＴＣＣＣＡＡＡＣＴＣ－３’ライブラリ４（Ｅ１５，Ｈ１６，Ｌ１９，Ｄ２０，Ｍ２３，Ｎ８８）：（配列番号１１）５’－ＧＴＴＣＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＴＧＮＨＫＮＨＫＴＴＡＣＴＴＮＨＫＮＨＫＴＴＡＣＡＧＮＨＫＡＴＴＴＴＧＡＡＴＧＧＡＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＡＴＣＣ－３’，（配列番号１２）５’－ＣＣＣＡＧＧＧＡＣＴＴＡＡＴＣＡＧＣＮＨＫＡＴＣＡＡＣＧＴＡＡＴＡＧＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＡＡＡＧＧＧ－３’の縮重コドンを有するプライマーを使用したアセンブリＰＣＲによって作製した。

【0175】

（配列番号１３）５’－ＣＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＧＧＧＣＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＣＧＧＣＧＧＡ－３’，（配列番号１４）５’－ＧＴＡＧＣＴＧＴＧＴＴＴＴＣＴＴＴＧＴＡＧＡＡＣＴＴＧＡＡＧＴＡＧＧＴＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＴＣＧＧＡＣＣＣＴＧＧ－３’，（配列番号１５）５’－ＣＴＴＡＡＡＴＧＴＧＡＧＣＡＴＣＣＴＧＧＴＧＡＧＴＴＴＧＧＧＡＴＴＣＴＴＧＴＡＡＴＴＡＴＴＡＡＴＴＣＣＡＴＴＣＡＡＡＡＴ－３’，（配列番号１６）５’－ＣＣＡＧＧＡＴＧＣＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＧＴＴＴＴＡＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧ－３’，（配列番号１７）５’－ＧＡＧＧＴＴＴＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＡＧＡＣＡＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＴＴＣＡＧＴＴＣＴＧＴＧＧＣＣＴＴＣＴＴＧＧＧＣ－３’，（配列番号１８）５’－ＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＴＧＣＴＡＡＡＴＴＴＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣ－３’，（配列番号１９）５’－ＧＡＴＴＡＡＧＴＣＣＣＴＧＧＧＴＣＴＴＡＡＧＴＧＡＡＡＧＴＴＴＴＴＧＣＴＴＴＧＡＧＣＴＡＡＡＴＴＴＡＧＣＡＣＴＴＣＣＴＣ－３’，（配列番号２０）５’－ＣＡＧＣＡＴＡＴＴＣＡＣＡＣＡＴＧＡＡＴＧＴＴＧＴＴＴＣＡＧＡＴＣＣＣＴＴＴＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＣＴＡＴＴＡＣＧＴＴＧ－３’，（配列番号２１）５’－ＧＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＧＡＡＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＴＧＴＡＧＡＡＴＴＴＣＴＧＡＡＣ－３’，（配列番号２２）５’－ＧＡＧＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＡＡＧＧＴＡＡＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＣＡＡＴＧＧＴＴＧＣＴＧ－３’，（配列番号２３）５’－ＧＡＴＴＡＣＣＴＴＴＴＧＴＣＡＡＡＧＣＡＴＣＡＴＣＴＣＡＡＣＡＣＴＡＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＡＡＣ－３’，（配列番号２４）５’－ＧＡＴＣＴＣＧＡＧＣＡＡＧＴＣＴＴＣＴＴＣＧＧＡＧＡＴＡＡＧＣＴＴＴＴＧＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＡＧＣＧＧ－３’のプライマーを全てのライブラリにおいて使用した。

【0176】

変異したＩＬ－２遺伝子ＰＣＲ産物を、ＰｆｕＵｌｔｒａＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ）および各プライマーの等モル混合物を使用して組み立てた。ＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して、プライマー（配列番号２５）５’－ＣＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＧＧＧＣＧＧＴＴＣ－３’および（配列番号２６）５’－ＣＧＡＡＧＡＡＧＡＣＴＴＧＣＴＣＧＡＧＡＴＣ－３’を使用して、産物ＤＮＡをさらにＰＣＲ増幅した。得られた組み立てられたＰＣＲ産物をゲル精製し、直線化ｐＣＴ３０２ベクターを用いてＥＢＹ－１００酵母にエレクトロポレーションして、約２×１０^８形質転換体のライブラリを得た。

【0177】

直交ＩＬ－２の進化。ｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒに特異的に結合する酵母クローンの選択は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）およびＦＡＣＳの組み合わせを使用して行った。第１回目の選択は、ライブラリ多様性の約１０倍の２×１０^９酵母で行い、全ての形質転換体の１００％の網羅率を確実にした。用いられた全体的な戦略は、最初に、ｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒβに結合する全ての完全長ｈＩＬ－２変異型のライブラリを濃縮し（１～３回目）、後続回で、負の選択を使用して、野生型ＩＬ－２Ｒβに結合するＩＬ－２クローンを除去し、ｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒβの濃度を減少させて、高親和性でｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒβに結合するＩＬ－２クローンを濃縮することであった。

【0178】

酵母に基づく結合および機能スクリーン。単一の酵母クローンを、ＳＤＣＡＡプレート上での培養、および単一コロニー抽出または単一細胞ＦＡＣＳの両方により、１００μＬのＳＤＣＡＡを含有する９６ウェル丸底組織培養プレートに単離し、振盪インキュベーターにおいて３０℃で一晩培養した。酵母クローンを、９６ディープウェルＶ底プレートのウェル当たり１．５ｍＬのＳＤＣＡＡにおいて３０℃でさらに２４時間さらに拡大させた後、同様に１．５ｍＬおよび９６ディープウェルＶ底プレートにおいて、１．０の開始ＯＤ６００で、振盪インキュベーターにおいて、１０％のＳＤＣＡＡを含有するＳＧＣＡＡ培地において２０℃で７２時間誘導した。誘導した酵母をペレット化し、ＰＢＳで１回洗浄し、２００μＬ／ウェルの切断培地（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．２ｍＭのＴＣＥＰ、２０μｇ／ｍＬの３Ｃプロテアーゼを含有するＲＰＭＩ）に再懸濁し、攪拌しながら室温で５分間インキュベートし、続いて、攪拌せずに４℃で一晩インキュベートした。酵母をペレット化し、上清を、９６ウェルの０．４５μｍの酢酸セルロースフィルタプレート（カタログ７７００－２８０８、ＧＥＨｅａｔｈｃａｒｅ）を通して澄清した。ＹＴ＋（野生型およびｏｒｔｈｏ発現）およびＹＴ－を、ＩＬ－２Ｒシグナル伝達方法の項に記載されるように播種し、変異体ＩＬ－２クローンを含有する５０μＬの澄清した酵母上清を添加し、３７℃で２０分間インキュベートし、反応を終了させ、以下に記載されるようにｐＳＴＡＴ５を定量化した。ｐＳＴＡＴ５＋の野生型またはｏｒｔｈｏＹＴ細胞の割合を、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）（ＴｒｅｅＳｔａｒＩｎｃ．，ＡｓｈｌａｎｄＯＲ）を使用して定量化し、ｏｒｔｈｏＹＴ＋細胞上で選択的または特異的活性を有するクローンを選択するために使用した。

【0179】

ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のレトロウイルス形質導入。白血球除去チャンバはＳｔａｎｆｏｒｄＢｌｏｏｄＣｅｎｔｅｒから入手した。血液を滅菌の５０ｍｌの円錐チューブ（約７ｍｌ）中に排出し、ＰＢＳ＋２％のＦＢＳを合計３４ｍｌまで添加した。密度勾配培地（１５ｍｌ、Ｆｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅＰｌｕｓ，ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ，１７－１４４０－０３）を２つのＳｅｐＭａｔｅ（登録商標）－５０チューブ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、１５４５０）に充填し、１７ｍｌの希釈細胞をピペットでそっと上部に移した。ＳｅｐＭａｔｅ（登録商標）チューブを、室温で１５分間、１２００×ｇで回転させた。ＰＢＭＣを含有する上層を新しいチューブに注ぎ、ＲＰＭＩを５０ｍｌまで添加した。細胞を、１２００ｒｐｍで５分間回転させてペレット化した。ペレットを、１０ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液（ＧｉｂｃｏＡ１０４９２－０１）に４分間再懸濁し、ＲＰＭＩ完全で４０ｍｌまでクエンチした。細胞を再びペレット化し、１５ｍＬのＲＰＭＩ完全に懸濁し、計数した。細胞（１×１０^６）を、２４ウェル組織培養皿の各ウェルに播種し、２５ｕＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＨｕｍａｎＴ－ＡｃｔｉｖａｔｏｒＣＤ３／ＣＤ２８（カタログ番号１１１３１Ｄ）および１００Ｕ／ｍｌのｈＩＬ－２を各ウェルに添加した。細胞を、３７℃で４８時間、インキュベーター中で活性化させた。

【0180】

活性化したヒトＰＢＭＣを、１０μｇ／ｍＬのポリブレンおよび１００ＩＵ／ｍＬのｈＩＬ－２を含有する非濃縮レトロウイルス上清（ウェル当たり約２ｍＬ）を使用して、３２℃および２５００ＲＰＭで１．５時間、スピンフェクションにより形質導入した（ＢｅｒｇｇｒｅｎＷＴ，ＬｕｔｚＭ，ＭｏｄｅｓｔｏＶ．ＧｅｎｅｒａｌＳｐｉｎｆｅｃｔｉｏｎＰｒｏｔｏｃｏｌ．２０１２Ｄｅｃ１０．Ｉｎ：ＳｔｅｍＢｏｏｋ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ（ＭＡ）：ＨａｒｖａｒｄＳｔｅｍＣｅｌｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ；２００８を参照されたい）。ウイルス上清をそっと吸引し、１００ＩＵ／ｍＬのｈＩＬ－２を含有する新鮮なＲＰＭＩ完全培地で置き換え、３７℃で２４時間培養した。細胞をピペットでそっと取ることにより採取し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を磁石で除去した。細胞を遠心分離によりペレット化し、１００ＩＵ／ｍＬのｈＩＬ－２を含有する新しいＲＰＭＩ完全培地に１×１０^６細胞／ｍＬの密度で再懸濁し、さらに下流の細胞アッセイの前に３７℃で一晩拡大させた。

【0181】

ＳＴＡＴ５のリン酸化によるＩＬ－２Ｒシグナル伝達。細胞内ｐＳＴＡＴ５によるＩＬ－２およびｏｒｔｈｏＩＬ－２シグナル伝達の定量化を行った。活発に成長するＹＴ＋およびＹＴ＋ｏｒｔｈｏ細胞をペレット化し、５０／５０比で組み合わせ、５０μＬの温かい培地中に、超低結合９６ウェル丸底プレート（カタログ７００７；Ｃｏｓｔａｒ）のウェル当たり５×１０^５細胞の密度で播種した。野生型またはｏｒｔｈｏＩＬ－２の連続希釈を含有する５０μＬ培地を３７℃で２０分間添加することによって細胞を刺激し、撹拌しながら室温（ＲＴ）で１０分間１．５％のパラホルムアルデヒドで固定することによって反応を終了させた。細胞をペレット化し、デカントし、氷上で２００μＬの１００％氷冷メタノールで少なくとも３０分間透過処理するか、または－８０℃で一晩インキュベートした。固定された透過処理した細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、細胞内リン酸化ＳＴＡＴ５を、ＦＡＣＳ緩衝液において：５０に希釈されたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識抗ＳＴＡＴ５ｐＹ６９４（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出し、暗所で１時間４℃でインキュベートした。細胞を洗浄し、ハイスループットオートサンプラー（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）を備えたＣｙｔｏＦＬＥＸ（登録商標）で分析した。データは平均蛍光強度を表し、点は、Ｐｒｉｓｍ５（登録商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して対数（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ）モデルに適合させた。全てのデータは、平均（ｎ＝３）±ＳＤとして提示される。

【0182】

インビトロ初代ヒトＰＢＭＣ増殖アッセイ。野生型およびｏｒｔｈｏ形質導入Ｔ細胞の混合物を含有するヒト末梢血単球細胞を遠心分離によって収集し、ｈＩＬ－２を欠くＲＰＭＩ完全培地に再懸濁し、９６ウェル丸底組織培養プレートにおいてウェル当たり５０，０００細胞（５０μＬ中）の密度で播種した（１日目）。細胞成長を、野生型またはｏｒｔｈｏＩＬ－２（５０μＬ）の連続希釈液を総体積１００μＬまで添加することにより刺激し、３７℃で２日間培養した。３日目に、細胞に追加の１００μＬ体積の新しいサイトカインを供給し、さらに２日間培養した。５日目に、０．５μｇ／ｍＬの最終濃度まで５０μＬのＤＡＰＩを添加し、ハイスループットサンプラーを備えたＣｙｔｏＦＬＥＸ（登録商標）を使用して、各試験集団の細胞数をＦＡＣＳにより定量化した。設定された体積内の生細胞の総数を、ＦＳＣおよびＳＳＣならびにＤＡＰＩ陰性に基づいて、生細胞のゲーティング後に得た。データを、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）（ＴｒｅｅＳｔａｒＩｎｃ．）を使用して分析した。データは、サイトカインの濃度に対してプロットされた総生細胞数を表すか、またはサイトカインの濃度に対してプロットされたｏｒｔｈｏ細胞と総生細胞との比率として表される。データは、平均（ｎ＝４）±ＳＤとして提示される。

【0183】

図２２に示されるように、インビトロでＹＴ細胞においてｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒを介したｏｒｔｈｏヒトＩＬ－２シグナルが発現される。図２３に示されるように、ｏｒｔｈｏヒトＩＬ－２は、ｏｒｔｈｏＩＬ－２Ｒを発現するヒトＰＢＭＣを優先的に拡大する。ヒトＰＢＭＣを単離し、活性化し、ＩＲＥＳＹＦＰ（ＹＦＰ＋）とともにｏｒｔｈｏヒトＩＬ－２Ｒβを含有するレトロウイルスで形質転換した。総生細胞に対するＹＦＰ＋細胞の初期比率は、２０％であった。５×１０^５の細胞を、１日目に指定された濃度のＭＳＡ－ヒトＩＬ－２（丸）またはｏｒｔｈｏ変異型ＭＳＡ－ＳＱＶＬＫＡ（菱形）、ＭＳＡ－ＳＱＶＬｑＡ（正方形）、またはＭＳＡ－１Ａ１（黒色の三角形）とともに播種し、３日目に同じ濃度を再供給した。５日目に、プレートをフローサイトメトリーにより読み取った。（Ａ）総生細胞に対するＹＦＰ＋（ｏｒｔｈｏ発現）細胞の比率を計算し、平均（ｎ＝４）±ＳＤを濃度に対してプロットした（左）。（Ｂ）総生細胞数（平均（ｎ＝４）±ＳＤ）も、サイトカイン濃度に対してプロットした（右）。直交サイトカインは、同じ濃度で野生型ＭＳＡ－ｈＩＬ－２ほど多くの細胞成長を支持しなかったが、ｏｒｔｈｏ発現Ｔ細胞を強く拡大することにおいて選択的であった。

【0184】

直交ｈＩＬ－２タンパク質において行われるアミノ酸置換は、以下の表１に示される。

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【表2】