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▶ イェダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024037822
(43)【公開日】2024-03-19
(54)【発明の名称】小胞体ターゲッティングシグナル
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20240312BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240312BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240312BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240312BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240312BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12N5/10
C12N1/15
C12N1/19
C12P21/02 A
【審査請求】有
【請求項の数】17
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023207322
(22)【出願日】2023-12-07
(62)【分割の表示】P 2020540815の分割
【原出願日】2019-01-31
(31)【優先権主張番号】257269
(32)【優先日】2018-01-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IL
(71)【出願人】
【識別番号】516040109
【氏名又は名称】イェダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＹＥＤＡ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＣＯ．ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】ａｔ ｔｈｅ Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ９５， ７６１０００２ Ｒｅｈｏｖｏｔ， Ｉｓｒａｅｌ
(74)【代理人】
【識別番号】100133503
【弁理士】
【氏名又は名称】関口 一哉
(72)【発明者】
【氏名】ゲルスト，ジェフリー イー
(72)【発明者】
【氏名】リム，リシャ チウ ジン
(72)【発明者】
【氏名】ピルペル，イツハク
(72)【発明者】
【氏名】オレンダー，ツヴィヤ
(72)【発明者】
【氏名】ダハリー，ドゥヴィール
(72)【発明者】
【氏名】コーエン‐ゾンタグ，オスナット
(57)【要約】 （修正有）
【課題】単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【解決手段】転写単位を含む単離されたポリヌクレオチドが開示され、転写単位は、（ｉ）興味の対象である分泌タンパク質をコードする核酸配列、（ｉｉ）配列番号２に記載の小胞体（ＥＲ）ターゲッティング配列であって、前記興味の対象である分泌タンパク質にとって異種であるＥＲターゲッティング配列、（ｉｉｉ）プロモータ、及び（ｉｖ）転写終結部位を含む。
【選択図】図６Ｂ
【解決手段】転写単位を含む単離されたポリヌクレオチドが開示され、転写単位は、（ｉ）興味の対象である分泌タンパク質をコードする核酸配列、（ｉｉ）配列番号２に記載の小胞体（ＥＲ）ターゲッティング配列であって、前記興味の対象である分泌タンパク質にとって異種であるＥＲターゲッティング配列、（ｉｉｉ）プロモータ、及び（ｉｖ）転写終結部位を含む。
【選択図】図６Ｂ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
興味の対象である天然の分泌ヒトタンパク質をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記核酸配列が、配列番号２に示される配列を含む小胞体（ＥＲ）ターゲッティング配列を含むようにコドン最適化されており、前記ＥＲターゲッティング配列が、興味の対象である天然の分泌成熟タンパク質のコーディング配列にある、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項2】
興味の対象の前記タンパク質が、ワクチンのタンパク質である、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項3】
前記ＥＲターゲッティング配列が、配列番号５に示される配列をコードするヌクレオチドを含まない、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項4】
前記ＥＲターゲッティング配列が、配列番号６に示される配列を含まない、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項5】
前記ＥＲターゲッティング配列が、配列ＴＧの５を超える連続したリピートを含まない、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項6】
前記ＥＲターゲッティング配列が、配列ＮＮＹの少なくとも１５の連続したリピートを含み、Ｎが任意の塩基であり、Ｙがピリミジンである、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項7】
前記ＥＲターゲッティング配列が１０を超える連続したチミンを含まない、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項8】
デオキシリボヌクレオチドを含む、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項9】
ｍＲＮＡ転写物である、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド
【請求項10】
請求項１～９のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含み、真菌種及び哺乳類種からなる群から選択される種のものである、細胞。
【請求項11】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１０に記載の細胞。
【請求項12】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロマイセス・セレビシエ）細胞である、請求項１０に記載の細胞。
【請求項13】
請求項１～８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む発現構築物。
【請求項14】
細胞培養物の細胞において興味の対象である天然の分泌タンパク質を発現させる方法であって、
（ａ）細胞を含む細胞培養物を得ることと、
（ｂ）前記細胞培養物の前記細胞に、請求項１～９のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドを導入し、それにより興味の対象である天然の分泌タンパク質を発現させることであって、前記細胞が、真菌種又は哺乳類種のものである、興味の対象である天然の分泌タンパク質を発現させることと、を含む、
細胞培養物の細胞において興味の対象である天然の分泌タンパク質を発現する方法。
（ａ）細胞を含む細胞培養物を得ることと、
（ｂ）前記細胞培養物の前記細胞に、請求項１～９のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチドを導入し、それにより興味の対象である天然の分泌タンパク質を発現させることであって、前記細胞が、真菌種又は哺乳類種のものである、興味の対象である天然の分泌タンパク質を発現させることと、を含む、
細胞培養物の細胞において興味の対象である天然の分泌タンパク質を発現する方法。
【請求項15】
哺乳類種の前記細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項16】
真菌種の前記細胞が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロマイセス・セレビシエ）細胞を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項17】
興味の対象である前記天然の分泌タンパク質を単離し、それにより興味の対象である天然の分泌タンパク質を生成することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願）
この出願は、２０１８年１月３１日に提出されたイスラエル特許出願第２５７２６９号からの優先権の利益を主張するもので、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
この出願は、２０１８年１月３１日に提出されたイスラエル特許出願第２５７２６９号からの優先権の利益を主張するもので、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、組換えタンパク質、より特定すれば、ただし排他的ではないものとして、分泌された組換えタンパク質の発現を増強する方法に関する。
【背景技術】
【0003】
ｍＲＮＡターゲティングと局在化された翻訳は、タンパク質合成の空間的及び時間的な制御を実現させる重要な機構である。特定の細胞内区画へのｍＲＮＡの送達は、様々な生物や細胞型における極性の確立に大きな役割を果たしており、細胞の適切な機能に重要であることが示された。興味深いことに、ｍＲＮＡの局在性は、多くの場合、ｍＲＮＡ配列内に埋め込まれたシス作用性エレメント（ジップコード）によって管理される（Ｍａｒｔｉｎ及びＥｐｈｒｕｓｓｉ、２００９；Ｂｕｘｂａｕｍら、２０１４）。ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）は、かかる配列を認識し、分子モータと一緒に作用して、ｍＲＮＡを目標に指向させる。
【0004】
小胞体（ＥＲ）は、分泌及び膜（ＳＭＰ；セクレトーム）タンパク質の合成部位である。ドグマによれば、ＳＭＰをコードするｍＲＮＡ（ｍＳＭＰ）は、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）経路によって実行される、異なる翻訳依存的機構によってＥＲに送達される。このモデルによれば、タンパク質翻訳は細胞質で始まり、ＳＭＰ転写物に対し翻訳が行われると、そのポリペプチドのアミノ末端に存在するシグナルペプチドが翻訳リボソームの出口トンネルから出現し、ＳＲＰによって認識される。次いで、ＳＲＰがＥＲ膜上のその受容体に動員され、細胞質からＥＲへのリボソーム－ｍＲＮＡ新生タンパク質鎖複合体の移行が起こる。そこで、翻訳リボソームがトランスロコンと相互作用して、共翻訳タンパク質の転座とｍＲＮＡの固定を可能にする。したがって、ＳＲＰモデルは、ｍＳＭＰを、ＥＲ転座プロセスにおける能動的な役割を伴わない区画として説明している。
【0005】
しかしながら、複数の証拠情報は、ＥＲへのｍＲＮＡの送達のためのさらなる経路があることを示唆している。第一に、ＳＲＰ経路が失われても、酵母や哺乳類細胞が死に至ることはなく、また、膜タンパク質合成や、細胞質とＥＲとの間における全体的ｍＲＮＡ分布に大きな影響を与ることもなかった。第二に、細胞質ゾルポリソームとＥＲ結合ポリソームとの間における可溶性タンパク質及び膜タンパク質をコードするｍＲＮＡの分布のゲノム全域にわたる分析により、２つの画分のｍＲＮＡの組成に有意な重複があることが立証され、細胞質タンパク質をコードするｍＲＮＡがＥＲで広範に表示されていることが示された。これは、コードされたシグナル配列を欠くｍＲＮＡがＥＲに局在する可能性があることを意味する。これらの所見と一致して、シグナル配列の除去及び翻訳の阻害により、ＥＲへのｍＳＭＰの局在は妨害されなかった（Ｐｙｈｔｉｌａら、２００８；Ｃｈｅｎら、２０１１；Ｋｒａｕｔ－Ｃｏｈｅｎら、２０１３）。第三に、セクレトームタンパク質のサブセットは、ＳＲＰに依存しない経路でＥＲに局在することが知られている。これらのタンパク質は、細胞質ゾルで翻訳された後、ＥＲに移行すると考えられている。ＥＲ結合リボソームの特定のプルダウンのための技術を利用した研究（Ｊａｎら、２０１４）では、ＥＲ膜上のＳＲＰ非依存性タンパク質をコードするｍＲＮＡとの比較において、ＳＲＰ依存性タンパク質をコードするｍＲＮＡの濃縮には有意差がないことが判明した。さらに、リボソームのサブセットは、シグナル配列の出現前にＥＲに到達できた。これらの観察についての考えられる説明は、ｍＲＮＡが、ＳＲＰに依存しない機構でリボソームの前にＥＲに到達することであり得る。ＥＲへのｍＲＮＡターゲティングがシグナルペプチドの出現まで開始されない場合、膜結合リボソームはシグナルペプチドの上流の転写物の部分を翻訳していないはずである。しかしながら、翻訳している膜結合リボソームは転写物全体に均一に分布していることが判明したため、これは当てはまらない（Ｃｈａｒｔｒｏｎら、２０１６）。これは、ｍＲＮＡが翻訳開始前にＥＲに局在していることを示唆している。
【0006】
ｍＲＮＡ内の明確なシス－エレメントであってそれをＥＲに指向させるものを識別することは困難であったが、ｍＳＭＰの特定の配列特性が識別されている。例えば、シグナル配列をコードする領域の配列分析により、この配列内にＡ以外の伸長部を作成するためのアデニンの使用率が低いことが明らかになった（Ｐａｌａｚｚｏら、２００７）。さらに、膜タンパク質をコードするｍＲＮＡは、細胞質タンパク質をコードするｍＲＮＡと比較して、ウラシルの濃縮度が高く、ピリミジンの使用率も高い（Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎら、１９７９；Ｐｒｉｌｕｓｋｙ及びＢｉｂｉ、２００９；Ｋｒａｕｔ－Ｃｏｈｅｎ及びＧｅｒｓｔ、２０１０；Ｐｏｌｙａｎｓｋｙら、２０１３）。これらの所見は、ＥＲ局在モチーフが、ｍＲＮＡ分子の配列組成において、より拡散した全般的な形状で存在する可能性を高める。
【発明の概要】
【0007】
本発明の一実施態様によれば、転写単位を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記転写単位が、
（ｉ）興味の対象である分泌タンパク質をコードする核酸配列；
（ｉｉ）配列番号２に記載の小胞体（ＥＲ）ターゲッティング配列であって、前記興味の対象である分泌タンパク質にとって異種であるＥＲターゲッティング配列；
（ｉｉｉ）プロモータ；及び
（ｉｖ）転写終結部位であって、興味の対象であるタンパク質をコードする前記核酸配列及び前記ＥＲターゲッティング列が前記プロモータと前記転写終結部位との間に配置されているものとする、転写終結部位
を含み、
前記ＥＲターゲッティング配列が前記興味の対象であるタンパク質をコードする核酸配列に含まれるとき、前記核酸配列は、前記ＥＲターゲッティング配列を含むようにコドン最適化されているものとする、単離されたポリヌクレオチドが提供される。
（ｉ）興味の対象である分泌タンパク質をコードする核酸配列；
（ｉｉ）配列番号２に記載の小胞体（ＥＲ）ターゲッティング配列であって、前記興味の対象である分泌タンパク質にとって異種であるＥＲターゲッティング配列；
（ｉｉｉ）プロモータ；及び
（ｉｖ）転写終結部位であって、興味の対象であるタンパク質をコードする前記核酸配列及び前記ＥＲターゲッティング列が前記プロモータと前記転写終結部位との間に配置されているものとする、転写終結部位
を含み、
前記ＥＲターゲッティング配列が前記興味の対象であるタンパク質をコードする核酸配列に含まれるとき、前記核酸配列は、前記ＥＲターゲッティング配列を含むようにコドン最適化されているものとする、単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【0008】
本発明の一実施態様によれば、本明細書に記載の方法に従ってタンパク質を発現させ、タンパク質を単離し、それによりタンパク質を生成することを含む、タンパク質を生成する方法が提供される。
【0009】
本発明の一実施態様によれば、本明細書に記載のポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡが提供される。
【0010】
本発明の一実施態様によれば、本明細書に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む細胞が提供される。
【0011】
本発明の一実施態様によれば、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む発現構築物が提供される。
【0012】
本発明の一実施態様によれば、配列番号２に示される核酸配列及びクローニング部位を含む発現構築物であって、前記クローニング部位へ興味の対象であるタンパク質をコードする配列を挿入した時、細胞での発現に続いて、興味の対象であるタンパク質をコードし、前記核酸配列の転写物をさらに含むｍＲＮＡが転写されるように、前記クローニング部位の位置が選択されるものとし、前記配列番号２が、タンパク質をコードする配列に含まれないものとする、発現構築物が提供される。
【0013】
本発明の一実施態様によれば、細胞でタンパク質を発現させる方法であって、本明細書に記載の単離されたポリヌクレオチドを細胞に導入し、それによりタンパク質を発現させることを含む方法が提供される。
【0014】
一実施形態によれば、ＥＲターゲッティング配列は、興味の対象である分泌タンパク質をコードするヌクレオチドを含まない。
【0015】
本発明の実施形態によれば、ＥＲターゲッティング配列は、配列番号５に示される配列をコードするヌクレオチドを含まない。
【0016】
本発明の実施形態によれば、ＥＲターゲッティング配列は、配列番号６に示される配列を含まない。
【0017】
本発明の実施形態によれば、ＥＲターゲッティング配列は、配列ＴＧの５つを超える連続したリピートを含まない。
【0018】
本発明の実施形態によれば、ＥＲターゲッティング配列は、配列ＮＮＹの少なくとも１５の連続したリピートを含み、Ｎは任意の塩基であって、Ｙはピリミジンであるものとする。
【0019】
本発明の実施形態によれば、ＥＲターゲッティング配列は、１０を超える連続したチミンを含まない。
【0020】
本発明の実施形態によれば、ＥＲターゲッティング配列は、興味の対象であるタンパク質をコードする核酸配列に対し３’に配置される。
【0021】
本発明の実施形態によれば、ＥＲターゲッティング配列核酸配列は、興味の対象であるタンパク質をコードする核酸配列に対し５’に配置される。
【0022】
本発明の実施形態によれば、転写単位はさらにシグナルペプチド配列をコードする。
【0023】
本発明の実施形態によれば、シグナルペプチド配列は、興味の対象であるタンパク質にとって異種である。
【0024】
本発明の実施形態によれば、興味の対象であるタンパク質はヒトタンパク質である。
【0025】
本発明の実施形態によれば、興味の対象であるタンパク質は、抗体、インスリン、インターフェロン、成長ホルモン、エリスロポエチン、成長ホルモン、卵胞刺激ホルモン、第ＶＩＩＩ因子、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）アルファ・ガラクトシダーゼＡ及びグルコセレブロシダーゼからなる群から選択される。
【0026】
本発明の実施形態によれば、細胞は、細菌種、真菌種、植物種、昆虫種及び哺乳類種からなる群から選択される種のものである。
【0027】
本発明の実施形態によれば、細菌種の細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を含む。
【0028】
本発明の実施形態によれば、哺乳類種の細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む。
【0029】
本発明の実施形態によれば、真菌種の細胞はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロマイセス・セレビシエ）細胞を含む。
【0030】
本発明の実施形態によれば、発現構築物は、細胞内で興味の対象であるタンパク質を発現するのに適したプロモータをさらに含む。
【0031】
本発明の実施形態によれば、細胞は、細菌種、真菌種、植物種、昆虫種及び哺乳類種からなる群から選択される種のものである。
【0032】
本発明の実施形態によれば、細菌種の細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を含む。
【0033】
本発明の実施形態によれば、哺乳類種の細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む。
【0034】
本発明の実施形態によれば、真菌種の細胞はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロマイセス・セレビシエ）細胞を含む。
【0035】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び／又は科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似又は同等の方法及び材料を本発明の実施形態の実施又は試験に使用することができるが、具体例としての方法及び／又は材料を以下に説明する。矛盾する場合は、定義を含む特許明細書が優先されることになる。さらに、材料、方法、及び例は、単なる例示であり、必ずしも限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【0036】
本発明のいくつかの実施形態について、添付の図面を参照しながら、単なる一例として、本明細書で説明する。ここで細部にわたって図面を具体的に参照すると、示されている詳細は、例としてのものであり、本発明の実施形態の具体的な検討のためのものであることが強調されている。この点で、図面と共に行われる説明により、本発明の実施形態がどのように実施され得るかが当業者に明らかになる。
図中：
図中：
【0037】
【図1A】ＳＥＣＲｅＴＥのしきい値として使用するためのＮＮＹリピートの数の決定。図１Ａは、ＳＥＣＲｅＴＥ数と転写物の長さの相関関係を示す。ＳＥＣＲｅＴＥスコアの合計は、各酵母遺伝子（５９０４スコア）について、示されたしきい値に従って、３つのフレームすべてで転写物配列に存在する連続したＮＮＹリピートの数を数えることによって計算された。散布図は、ＳＥＣＲｅＴＥスコアと遺伝子長の相関関係を表す。ＳＥＣＲｅＴＥスコアは、１０ＮＮＹリピートのしきい値（ＳＥＣＲｅＴＥ１０）を超える遺伝子長とは相関しない。Ｒスコアはピアソン相関係数を表す。
【図1B】ＳＥＣＲｅＴＥのしきい値として使用するためのＮＮＹリピートの数の決定。図１Ｂにおいて、ＳＥＣＲｅＴＥモチーフは、非セクレトームタンパク質よりもセクレトームタンパク質をコードするｍＲＮＡの方が豊富である。ＳＥＣＲｅＴＥの存在は、示されたしきい値に従って、セクレトーム（青）及び非分泌（灰色）タンパク質をコードするｍＲＮＡでスコア化された。バーは、示されたしきい値でのＳＥＣＲｅＴＥ陽性転写物の割合を表す。ＳＥＣＲｅＴＥの存在量は、セクレトームのｍＲＮＡで有意に高くなっている。＊ｐ≦２．２８Ｅ－１３。
【図1C】ＳＥＣＲｅＴＥのしきい値として使用するためのＮＮＹリピートの数の決定。図１Ｃにおいて、ＳＥＣＲｅＴＥ１０は、セクレトーム転写物を区別する能力を最大にする。示されたしきい値ごとにＲＯＣ曲線をプロットした。セクレトーム転写物は「真陽性」セットとして使用され、非セクレトーム転写物は「真陰性」セットとして使用された。ＳＥＣＲｅＴＥ１０のＡＵＣ（曲線下面積）が最高であった。
【図2A】ｍＳＭＰにおけるＳＥＣＲｅＴＥの存在量は、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）による影響を受けない。図２Ａについて、ＳＥＣＲｅＴＥは、コドンの２番目の位置に豊富に存在する。ＳＥＣＲｅＴＥの存在量を、各コドン位置について個別に計算した。ｍＳＭＰにおけるＳＥＣＲｅＴＥの存在量は２番目のコドン位置で最も顕著であるが、３番目の位置でも有意差が検出された、＊ｐ≦９．９Ｅ－１０。
【図2B】ｍＳＭＰにおけるＳＥＣＲｅＴＥの存在量は、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）による影響を受けない。図２Ｂにおいて、ＳＥＣＲｅＴＥはまた、可溶性セクレトームタンパク質をコードするｍＲＮＡに豊富に存在する。ＳＥＣＲｅＴＥ１０の存在を、ＴＭＤ含有タンパク質と可溶性分泌タンパク質について別々に調べた。可溶性分泌タンパク質（ＴＭＤ不含有セクレトーム；シアン色）をコードするｍＲＮＡがＳＥＣＲｅＴＥを含む割合は、ＴＭＤの有無にかかわらず（ＴＭＤ含有非セクレトーム；濃灰色、ＴＭＤ不含有非セクレトーム；薄灰色）、非セクレトーム転写物と比較して高くなっている。３番目のコドン位置（ＮＮＹ）では、可溶性分泌タンパク質の割合はＴＭＤ含有セクレトームタンパク質よりも大きく、有意である（＊ｐ≦３．０３Ｅ－３）。
【図2C】ｍＳＭＰにおけるＳＥＣＲｅＴＥの存在量は、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）による影響を受けない。図２Ｃについては、ＴＭＤ配列の除去後、３番目の位置にはＳＥＣＲｅＴＥが豊富に存在する。ＳＥＣＲｅＴＥ１０の存在を、コード化ＴＭＤが除去された後、膜タンパク質をコードするｍＲＮＡでスコア化した。ＳＥＣＲｅＴＥ１０は、ＴＭＤ配列を除去した後でも、セクレトームタンパク質（青色）をコードするｍＲＮＡの３番目の位置（ＮＮＹ）で、非セクレトームタンパク質（灰色）の場合よりも有意に多く存在する。＊ｐ＝０．０１。
【図3A】細胞壁タンパク質ではＳＥＣＲｅＴＥが高度に濃縮されている。図３Ａは、ＳＥＣＲｅＴＥ１０を含む遺伝子についてのＧＯアノテーション分析を示す。細胞壁タンパク質及び膜タンパク質をコードする遺伝子は、最高かつ最も顕著な濃縮スコアを示す。
【図3B】細胞壁タンパク質ではＳＥＣＲｅＴＥが高度に濃縮されている。図３Ｂは、ＳＥＣＲｅＴＥ１５を含む遺伝子についてのＧＯアノテーション分析を示す。細胞壁タンパク質をコードする遺伝子では、ＳＥＣＲｅＴＥが最も濃縮されている。
【図3C】細胞壁タンパク質ではＳＥＣＲｅＴＥが高度に濃縮されている。図３Ｃは、遺伝子の異なる群におけるＳＥＣＲｅＴＥ１０の存在量を示す。細胞壁に局在するように注釈が付けられたタンパク質をコードするｍＲＮＡの９０％超がＳＥＣＲｅＴＥを含んでいる。高いＳＥＣＲｅＴＥ存在量はまた、尾部アンカー型（ＴＡ）タンパク質を除く他のセクレトーム群でも認められた。ミトコンドリアｍＲＮＡ（Ｍｉｔｏ）はＳＥＣＲｅＴＥの存在量が少ない。バーの上の数字は、各群の遺伝子の数を表す。
【図3D】細胞壁タンパク質ではＳＥＣＲｅＴＥが高度に濃縮されている。図３Ｄは、細胞壁転写物のＭＥＭＥ分析を示す。ＳＥＣＲｅＴＥに似たモチーフが、ＭＥＭＥを使用して細胞壁転写物で明らかにされた。ｘ軸上の数字は、基数を示す。
【図4A】ＳＥＣＲｅＴＥは、ヒトゲノムに含まれている。図４Ａについては、ＳＥＣＲｅＴＥ１０は、ヒトにおけるセクレトーム遺伝子を分類する能力を最大にする。示されたしきい値ごとにＲＯＣ曲線をプロットした。セクレトーム遺伝子を真陽性セットとして、非セクレトーム遺伝子を真陰性セットとして使用した。ＳＥＣＲｅＴＥ１０のＡＵＣ（曲線下面積）が最高であった。
【図4B】ＳＥＣＲｅＴＥは、ヒトゲノムに含まれている。図４Ｂについて、ＳＥＣＲｅＴＥは、ヒトセクレトームタンパク質のｍＲＮＡに非常に豊富に存在する。ＳＥＣＲｅＴＥ１０存在量を、各コドン位置について個別に計算した。ヒトｍＳＭＰにおけるＳＥＣＲｅＴＥ存在量は、コドンの２番目の位置で最も顕著であるが、３番目の位置でも非常に有意な差が検出された。＊ｐ≦３．７３Ｅ－６８Ｃ。ＳＥＣＲｅＴＥは、ヒトの可溶性セクレトームタンパク質をコードするｍＲＮＡに非常に豊富に存在する。
【図4C】ＳＥＣＲｅＴＥは、ヒトゲノムに含まれている。ＳＥＣＲｅＴＥ１０の存在を、ＴＭＤ含有タンパク質と可溶性分泌タンパク質について別々に調べた。可溶性分泌タンパク質（ＴＭＤ不含有セクレトーム；シアン色）をコードするｍＲＮＡがＳＥＣＲｅＴＥを含む割合は、ＴＭＤの有無にかかわらず（ＴＭＤ含有非セクレトーム；濃灰色、ＴＭＤ不含有非セクレトーム；薄灰色）、非セクレトーム転写物と比較して高くなっている。ＳＥＣＲｅＴＥが３番目の位置にある可溶性分泌タンパク質の割合は、ＴＭＤ含有非セクレトームタンパク質（ＮＮＹ）の割合よりも大きく、顕著である。バーの上の数字は、各群の遺伝子の数を表す。＊ｐ≦３．４９Ｅ－１２。
【図4D】ＳＥＣＲｅＴＥは、ヒトゲノムに含まれている。図４Ｄは、遺伝子の異なる群におけるＳＥＣＲｅＴＥ１０の存在量を示す。尾部アンカー型（ＴＡ）タンパク質を除く他のセクレトームタンパク質群では、高いＳＥＣＲｅＴＥ存在量が観察された。ミトコンドリアｍＲＮＡ（Ｍｉｔｏ）はＳＥＣＲｅＴＥの存在量が少ない。バーの上の数字は、各群の遺伝子の数を表す。
【図4E】ＳＥＣＲｅＴＥは、ヒトゲノムに含まれている。図４Ｅは、バチルス・サブティリス（枯草菌、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるＳＥＣＲｅＴＥ１０の存在量を示す。ＳＥＣＲｅＴＥ１０の存在量をスコア化したところ、非セクレトーム（Ｎｏｎ－Ｓｅｃ）タンパク質をコードする遺伝子との比較において、セクレトームタンパク質（すなわち、ＳＳ＆ＴＭＤ、ＴＭＤ、及びＳＳ）をコードする遺伝子をコードするｍＲＮＡで高いことが観察された。バーの下の数字は、各群の遺伝子の数を表す。
【図5A】内因性タンパク質及び外因性タンパク質の分泌レベルは、ＳＥＣＲｅＴＥ強度による影響を受ける。図５Ａにおいて、ＳＥＣＲｅＴＥは、スクロース上で成長する能力を高めている。ＷＴ、ｓｕｃ２Δ、ＳＵＣ２（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ及びＳＵＣ２（－）ＳＥＣＲｅＴＥの酵母がスクロース上で成長する能力を、落下試験によって調べた。細胞をグルコース含有ＹＰＤ培地で対数中期まで増殖させた後、系列希釈してスクロース含有合成培地又はＹＰＤに平板培養した。フォトドキュメンテーションの前に、細胞を２日間増殖させた。ＳＵＣ２（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞はより良い成長を示したがＳＵＣ２（－）ＳＥＣＲｅＴＥ変異体は、ＷＴ細胞よりも成長の低下を示した。ｓｕｃ２Δ細胞は、スクロース含有培地では成長できなかった。
【図5B】内因性タンパク質及び外生タンパク質の分泌レベルは、ＳＥＣＲｅＴＥ強度による影響を受ける。図５Ｂにおいて、ＳＥＣＲｅＴＥはインベルターゼの分泌を増強している。Ａからの示された株をインベルターゼ分泌アッセイにかけた。内部インベルターゼ活性及び分泌インベルターゼ活性の両方を、グルコース抑制解除後に単位で測定した。両活性ともＳＵＣ２（－）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞で減少し、ＳＵＣ２（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞で上昇していた。エラーバーは、３回の実験の反復からの標準偏差を表す。＊ｐ＜０．０５。
【図5C】内因性タンパク質及び外生タンパク質の分泌レベルは、ＳＥＣＲｅＴＥ強度による影響を受ける。図５Ｃにおいて、ＳＥＣＲｅＴＥは、カルコフロールホワイトで成長する能力を高めている。ＷＴ、ｈｓｐ１５０Δ、ＨＳＰ１５０（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ、及びＨＳＰ１５０（－）ＳＥＣＲｅＴＥの細胞がＣＦＷ上で成長する能力を、落下試験で調べた。細胞をＹＰＤ上で対数中期まで増殖させた後、系列希釈し、ＹＰＤ単独又はＣＦＷを含むＹＰＤプレート上に平板培養し、３０℃でインキュベートした。フォトドキュメンテーションの前に、細胞を２日間増殖させた。ＨＳＰ１５０（－）ＳＥＣＲｅＴＥ変異体はＷＴ細胞と比較して過感受性を呈したが、ＨＳＰ１５０（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞は感受性が低かった。ＣＦＷを含む培地ではｈｓｐ１５０Δ細胞の成長が不十分であった。
【図5D】内因性タンパク質及び外生タンパク質の分泌レベルは、ＳＥＣＲｅＴＥ強度による影響を受ける。図５Ｄにおいて、ＳＥＣＲｅＴＥはＨｓｐ１５０分泌を高めている。Ｃからの示された株をＨｓｐ１５０分泌アッセイにかけた。細胞を対数中期まで３７℃で４時間増殖させ、抗Ｈｓｐ１５０抗体を使用したウエスタン分析によりライゼート（内部）又は培地（外部）で検査した。外部Ｈｓｐ１５０は、ＨＳＰ１５０（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ株では増加したが、ＷＴと比較してＨＳＰ１５０（－）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞では減少していた。内部Ｈｓｐ１５０は、ＷＴ細胞との比較において、ＨＳＰ１５０（－）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞で減少し、ＨＳＰ１５０（＋）ＥＲＴＭ細胞でもわずかに減少していた。内部Ｈｓｐ１５０も外部Ｈｓｐ１５０も、ｈｓｐ１５０Δ細胞由来のライゼート又は培地でそれぞれ検出されなかった。バンドの強度を、ＩｍａｇｅＪを使用して定量化し、下記ヒストグラムに示した。グラフは、ＷＴの強度に対する全試料の強度の比率を表す。
【図5E】内因性タンパク質及び外生タンパク質の分泌レベルは、ＳＥＣＲｅＴＥ強度による影響を受ける。図５Ｅにおいて、ＳＥＣＲｅＴＥは、ハイグロマイシンＢで成長する能力を高めている。ＷＴ、ｃｃｗ１２Δ、及びＣＣＷ１２（－）ＳＥＣＲｅＴＥの細胞がＨＢで成長する能力を、落下試験で調べた。細胞をグルコース含有ＹＰＤ培地で対数中期まで増殖させた後、系列希釈し、ＨＢ含有ＹＰＤ又はＹＰＤのみに平板培養した。フォトドキュメンテーションの前に、細胞を２日間増殖させた。ＣＣＷ１２（－）ＳＥＣＲｅＴＥ株は、ＷＴ細胞と比較してＨＢストレスに対する感受性が高かった。ｃｃｗ１２Δ細胞は、ＨＢを含む培地では増殖できなかった。
【図5F】内因性タンパク質及び外因性タンパク質の分泌レベルは、ＳＥＣＲｅＴＥ強度による影響を受ける。図５Ｆにおいて、ＳＥＣＲｅＴＥは、外因性タンパク質ＳＳＧＡＳ１－ＧＦＰの分泌を高めている。プラスミドからＳＳＧＡＳ１－ＧＦＰ３’ＵＴＲＧＡＳ１（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ、ＳＳＧＡＳ１－ＧＦＰ、ＳＳＧＡＲ２－ＧＦＰ、ＧＦＰ、及びＳＳＧＡＳ１－ＬａｃＺを発現する酵母を、２％ラフィノースを含む合成培地で対数中期まで増殖させ、４時間３％ガラクトース含有培地にシフトした。異なる株から発現されたタンパク質を培地からＴＣＡ沈殿させ、沈殿物をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した。ＧＦＰは抗ＧＦＰ抗体で検出され、Ｈｓｐ１５０は抗Ｈｓｐ１５０抗体で検出され、ローディングコントロールとして使用された。バンド強度を、ＩｍａｇｅＪを使用して定量化し、強度をＳＳＧＡＳ１－ＧＦＰ分泌と比較してスコア化した。ＳＥＣＲｅＴＥを含むように変異導入されたＧＡＳ１ ３’ＵＴＲを不可すると、ＳＳ－Ｇａｓ１の分泌が改善され、ＳＳＫＡＲ２－ＧＦＰの分泌と同等となった。ＳＳを欠くＧＦＰは分泌されず、ＳＳＧＡＳ１－ＬａｃＺが陰性対照として使用された。
【図6A】ＳＥＣＲｅＴＥは、ＥＲへのＳＵＣ２ ｍＲＮＡの局在化を高める。図６Ａは、ｓｍＦＩＳＨを使用した、内因的に発現したＳＵＣ２（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ ｍＲＮＡ及びＳＵＣ２（－）ＳＥＣＲｅＴＥ ｍＲＮＡの可視化を示す。プラスミドからＷＴ ＳＵＣ２、ＳＵＣ２（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ、又はＳＵＣ２（－）ＳＥＣＲｅＴＥ及びＳｅｃ６３－ＧＦＰを内因的に発現する酵母を、２％グルコースを含むＳＣ培地で対数中期まで増殖させた後、細胞を低グルコース含有培地（０．０５％グルコース）にシフトし、ＳＵＣ２発現を誘導した。細胞を、ＳＵＣ２に相補的な非重複ＴＡＭＲＡ標識ＦＩＳＨプローブを使用して、ｓｍＦＩＳＨ標識用に処理した。
【図6B】ＳＥＣＲｅＴＥは、ＥＲへのＳＵＣ２ ｍＲＮＡの局在化を高める。図６Ｂは、ＥＲへのＳＵＣ２（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ ｍＲＮＡ及びＳＵＣ２（－）ＳＥＣＲｅＴＥ ｍＲＮＡの局在化の定量化を示す。共局在化されている、共局在化されていない、又はＳｅｃ６３－ＧＦＰ標識ＥＲに隣接している顆粒のパーセンテージを各細胞でスコア化した。ヒストグラムは、各株に関する少なくとも約６０の細胞と約２５０のＳＵＣ２顆粒についての平均スコアを示す、＊ｐ＝０．０１９。
【図7A】潜在的ＳＥＣＲｅＴＥ結合タンパク質の同定。図７Ａは、ＲＮＡ結合タンパク質プルダウン試験におけるＳＥＣＲｅＴＥ１０含有転写物の同定を示す。示されたＲＢＰに結合した総ｍＲＮＡからのＳＥＣＲｅＴＥ１０含有ｍＲＮＡの数と割合を示す。ヒストグラムの作成に使用されたマイクロアレイ分析データは、（Ｃｏｌｏｍｉｎａら、２００８；Ｈａｓｅｇａｗａら、２００８；Ｈｏｇａｎら、２００８）に公開された。
【図7B】潜在的ＳＥＣＲｅＴＥ結合タンパク質の同定。図Ｂは、潜在的ＳＥＣＲｅＴＥ結合パートナーの同定を示す。ＷＴ細胞並びに示されたＲＢＰ（例、Ｗｈｉ３、及びＫｈｄ１）をコードする遺伝子について欠失させたＷＴ細胞又はＨＳＰ１５０（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞を、３０℃でＹＰＤにおいて対数中期まで増殖させた後、系列希釈し、固体ＹＰＤ培地又はＣＦＷ含有ＹＰＤのいずれかに平板培養した。酵母をフォトドキュメンテーションの２日前から成長させた。
【図8】ＳＥＣＲｅＴＥはタンパク質の分泌において積極的な役割を演じる。ＳＥＣＲｅＴＥ含有転写物（１）はＳＢＰに結合し（２）、ＥＲへのｍＲＮＡターゲッティングを誘導し（３）、及び／又はｍＲＮＡの安定化をもたらす（４）。ＥＲへのターゲッティングにより、空間的調節とｍＲＮＡの安定化がもたらされ得（５）、それに続いてタンパク質産生（６）と分泌（７）の増加を招く可能性がある。
【図9A】ＳＥＣＲｅＴＥの存在量は、コドン組成に依存的ではない。ＳＥＣＲｅＴＥのコドン使用に対する依存性を評価するために並べ替え分析を行った。そのために、コドン組成を維持し、配列をランダムに１０００回シャッフルし直した。ＳＥＣＲｅＴＥ１０がランダムに現れる確率を評価するために、Ｚスコアを各遺伝子について計算した（Ｚスコアの計算については、材料と方法を参照）。Ｚスコアが高いほど、ＳＥＣＲｅＴＥがランダムに現れる可能性が低くなる。図９Ａにおいて、セクレトームをコードするｍＲＮＡにおけるＳＥＣＲｅＴＥの濃縮は、コドン組成に依存していない。Ｚスコアの分布プロットは、非セクレトームタンパク質の場合よりもセクレトームタンパク質をコードするｍＲＮＡについての値の方が高いことを示している。
【図9B】ＳＥＣＲｅＴＥの存在量は、コドン組成に依存的ではない。ＳＥＣＲｅＴＥのコドン使用に対する依存性を評価するために並べ替え分析を行った。そのために、コドン組成を維持し、配列をランダムに１０００回シャッフルし直した。ＳＥＣＲｅＴＥ１０がランダムに現れる確率を評価するために、Ｚスコアを各遺伝子について計算した（Ｚスコアの計算については、材料と方法を参照）。Ｚスコアが高いほど、ＳＥＣＲｅＴＥがランダムに現れる可能性が低くなる。図９Ｂにおいて、可溶性及び膜のセクレトーム転写物の両方をコードするｍＲＮＡにおけるＳＥＣＲｅＴＥ濃縮は、コドン組成とは無関係である。Ｚスコアの分布プロットは、非セクレトームタンパク質（すなわち、ＴＭＤ含有又は不含有）の場合よりも、セクレトームタンパク質（ｍＳＭＰ、ＴＭＤ含有又はＴＭＤ不含有のいずれか）をコードするｍＲＮＡについての方が高い値を示す。
【図9C】ＳＥＣＲｅＴＥの存在量は、コドン組成に依存的ではない。ＳＥＣＲｅＴＥのコドン使用に対する依存性を評価するために並べ替え分析を行った。そのために、コドン組成を維持し、配列をランダムに１０００回シャッフルし直した。ＳＥＣＲｅＴＥ１０がランダムに現れる確率を評価するために、Ｚスコアを各遺伝子について計算した（Ｚスコアの計算については、材料と方法を参照）。Ｚスコアが高いほど、ＳＥＣＲｅＴＥがランダムに現れる可能性が低くなる。図９Ｃにおいて、コドンの２番目と３番目の位置でのＳＥＣＲｅＴＥの濃縮は、コドン使用とは無関係である。有意なＺスコアの割合（すなわち、１．９６以上）は、非セクレトームタンパク質の場合よりもセクレトームタンパク質をコードするｍＲＮＡについての方が大きくなっている。
【図9D】ＳＥＣＲｅＴＥの存在量は、コドン組成に依存的ではない。ＳＥＣＲｅＴＥのコドン使用に対する依存性を評価するために並べ替え分析を行った。そのために、コドン組成を維持し、配列をランダムに１０００回シャッフルし直した。ＳＥＣＲｅＴＥ１０がランダムに現れる確率を評価するために、Ｚスコアを各遺伝子について計算した（Ｚスコアの計算については、材料と方法を参照）。Ｚスコアが高いほど、ＳＥＣＲｅＴＥがランダムに現れる可能性が低くなる。図９Ｄにおいて、コドンの２番目と３番目の位置でのＳＥＣＲｅＴＥの濃縮は、コドン使用とＴＭＤの存在の両方と無関係である。有意なＺスコアの割合（すなわち、１．９６以上）は、ＴＭＤの有無にかかわらず、非セクレトームタンパク質の場合よりもセクレトームタンパク質をコードするｍＲＮＡについての方が大きくなっている。
【図10A】ＳＵＣ２、ＨＳＰ１５０、及びＣＣＷ１２におけるＳＥＣＲｅＴＥ及びＳＥＣＲｅＴＥの変異の説明。グラフは、天然及び変異型のＳＥＣＲｅＴＥ遺伝子における連続する１０のＮＮＹリピートのしきい値を使用するか（下方の図）又は使用せずに（上方の図）遺伝子の長さに沿って見出されたＮＮＹリピートの数を比較している。図１０Ａは、ＳＵＣ２に関するものである。
【図10B】ＳＵＣ２、ＨＳＰ１５０、及びＣＣＷ１２におけるＳＥＣＲｅＴＥ及びＳＥＣＲｅＴＥの変異の説明。グラフは、天然及び変異型のＳＥＣＲｅＴＥ遺伝子における連続する１０のＮＮＹリピートのしきい値を使用するか（下方の図）又は使用せずに（上方の図）遺伝子の長さに沿って見出されたＮＮＹリピートの数を比較している。図１０Ｂは、ＨＳＰ１５０に関するものである。
【図10C】ＳＵＣ２、ＨＳＰ１５０、及びＣＣＷ１２におけるＳＥＣＲｅＴＥ及びＳＥＣＲｅＴＥの変異の説明。グラフは、天然及び変異型のＳＥＣＲｅＴＥ遺伝子における連続する１０のＮＮＹリピートのしきい値を使用するか（下方の図）又は使用せずに（上方の図）遺伝子の長さに沿って見出されたＮＮＹリピートの数を比較している。図１０Ｃは、ＣＣＷ１２に関するものである。
【図11A】ＳＥＣＲｅＴＥにおける変異は、必ずしもｍＲＮＡレベルに影響を与えるわけではない。示された株における天然又は変異型ＳＵＣ２、ＣＣＷ１２、及びＨＳＰ１５０のｍＲＮＡレベルをｑＲＴ－ＰＣＲによって定量化した。倍率変化を、ＷＴレベルと比較して計算した。図１１Ａにおいて、ＳＵＣ２ ｍＲＮＡレベルは、ＳＥＣＲｅＴＥ変異によって改変されている。細胞を２％グルコース含有ＳＣ培地において３０℃で対数中期まで増殖させた後、細胞を低グルコース培地に１．５時間シフトした。採取及びＲＮＡ抽出の後、分泌タンパク質をコードするＳＵＣ２の長い転写物を増幅するために使用されるプライマー。アクチンのプライマーを正規化に使用した。ＳＵＣ２（－）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞はＷＴよりも低いＳＵＣ２ ｍＲＮＡレベルを示し、ＳＵＣ２（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞はより高いレベルを示した。エラーバーは、３つの生物学的反復の標準偏差を表す。
【図11B】ＳＥＣＲｅＴＥにおける変異は、必ずしもｍＲＮＡレベルに影響を与えるわけではない。示された株における天然又は変異型ＳＵＣ２、ＣＣＷ１２、及びＨＳＰ１５０のｍＲＮＡレベルをｑＲＴ－ＰＣＲによって定量化した。倍率変化を、ＷＴレベルと比較して計算した。図１１Ｂにおいて、ＣＣＷ１２ ｍＲＮＡレベルは、ＳＥＣＲｅＴＥ変異によって改変されていない。細胞をＹＰＤ培地において対数中期まで３０℃で増殖させた後、採取し、ＲＮＡ抽出を行った。ＵＢＣ６の増幅に使用したプライマーを正規化に使用した。ＳＥＣＲｅＴＥ改変の結果として、ＣＣＷ１２ ｍＲＮＡレベルが大幅に変更されることはなかった。
【図11C】ＳＥＣＲｅＴＥにおける変異は、必ずしもｍＲＮＡレベルに影響を与えるわけではない。示された株における天然又は変異型ＳＵＣ２、ＣＣＷ１２、及びＨＳＰ１５０のｍＲＮＡレベルをｑＲＴ－ＰＣＲによって定量化した。倍率変化を、ＷＴレベルと比較して計算した。図１１Ｃにおいて、ＨＳＰ１５０ ｍＲＮＡレベルは、ＳＥＣＲｅＴＥ変異によって改変されていない。酵母株を、ＹＰＤ培地において２６℃又は３７℃のいずれかで対数中期まで増殖させた後、採取とＲＮＡ抽出を行った。ＵＢＣ６を正規化に使用した。ＨＳＰ１５０ ｍＲＮＡレベルが、ＳＥＣＲｅＴＥ改変の結果として大幅に変更されることはなかった。
【図12A】潜在的ＳＥＣＲｅＴＥ結合タンパク質の同定。ＷＴ細胞と、示されたＲＢＰ［例Ｐｕｆ２、Ｓｈｅ２］をコードする遺伝子を欠失させたＷＴ細胞又はＨＳＰ１５０（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞のいずれかを、３０℃でＹＰＤにおいて対数中期まで増殖させた後、系列希釈し、固体ＹＰＤ培地又はＣＦＷ含有ＹＰＤへの平板培養を行った。酵母をフォトドキュメンテーションの２日前から成長させた。
【図12B】潜在的ＳＥＣＲｅＴＥ結合タンパク質の同定。ＷＴ細胞と、示されたＲＢＰ［例Ｐｕｆ１］をコードする遺伝子を欠失させたＷＴ細胞又はＨＳＰ１５０（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞のいずれかを、３０℃でＹＰＤにおいて対数中期まで増殖させた後、系列希釈し、固体ＹＰＤ培地又はＣＦＷ含有ＹＰＤへの平板培養を行った。酵母をフォトドキュメンテーションの２日前から成長させた。
【発明を実施するための形態】
【0038】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、組換えタンパク質、より特定すれば、ただし排他的ではないものとして、分泌された組換えタンパク質の発現を増強する方法に関する。
【0039】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の説明に記載されるか、又は実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されるものではないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、又は様々な方法で実施又は実行することができる。
【0040】
タンパク質を適切な目標に向けて選別することは、細胞組織と正常な機能にとって重要である。タンパク質の局在に関する情報は、タンパク質配列（タンパク質ターゲティング配列など）内に存在する可能性があるが、ｍＲＮＡの空間的局在も、正しいタンパク質の細胞内ターゲティングにとって重要な場合があり得る。
【0041】
本発明者らは、すべての分泌タンパク質及び膜タンパク質（ＳＭＰ）の特性を明らかにする特徴を特定し、１０を超える連続したＮＮＹリピートからなる反復モチーフを発見した。本明細書で「ＳＥＣＲｅＴＥ」と呼ばれるこのモチーフは、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）含有タンパク質をコードする転写物に限定されないが、原核生物（例、バチルス・スブティリス（枯草菌、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））から酵母（サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ））、さらにはヒトに至る、すべてのセクレトーム転写物により高い存在量で見出され得る（図１Ａ～図１Ｃ及び図４Ａ～図４Ｅ）。
【0042】
ＳＥＣＲｅＴＥの生理学的関連性について、ＳＭＰをコードする３つのｍＲＮＡ：ＳＵＣ２、ＨＳＰ１５０、及びＣＣＷ１２の濃縮度を変更することによって調査した（図５）。アミノ酸配列は突然変異によって変更されなかったが、これらの遺伝子の機能性は変更された。ＳＵＣ２ ＳＥＣＲｅＴＥ変異体は、ＷＴ細胞との比較においてスクロース含有培地で成長率の変化を呈し、すなわち、モチーフ強度が低下すると成長が低下し、モチーフ強度が上昇すると成長が向上した（図５Ａ）。この結果は、インベルターゼの合成と分泌の両方の減少又は増加とそれぞれ対応していた（図５Ａ、図５Ｂ）。ＨＳＰ１５０ ＳＥＣＲｅＴＥ変異体の挙動も異なっており、すなわちＨＳＰ１５０（－）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞は、ＷＴ細胞と比較してＣＦＷに対してより高い感受性を示したが、ＨＳＰ１５０（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞はさらなる抵抗を示した（図５Ｃ）。同様に、ＣＣＷ１２（－）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞はＨＢに対して過度の感受性を示した（図５Ｅ）。
【0043】
これらの所見は、ＳＥＣＲｅＴＥが細胞から分泌されるタンパク質の量を調節する上で重要な生物学的役割を果たすという概念を裏付けている。これは、ＳＥＣＲｅＴＥモチーフを含むＧａｓ１ ３’ＵＴＲを付加すると分泌が大幅に強化される外因性基質ＳＳ（ＧＡＳ１）－ＧＦＰを使用して検証された（図５Ｆ）。さらに、ＳＥＣＲｅＴＥを強化すると、タンパク質の産生と分泌が増加するだけでなく、ＥＲへのＳＵＣ２転写物の局在性も高められた（図６）。
【0044】
結果として、本教示は、このモチーフが組換えタンパク質産生を改善するために使用され得ることを示唆する。
【0045】
したがって、本発明の第１の実施態様によれば、転写単位を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記転写単位が：
（ｉ）興味の対象である分泌タンパク質をコードする核酸配列；
（ｉｉ）配列番号２に記載の小胞体（ＥＲ）ターゲッティング配列であって、前記興味の対象である分泌タンパク質にとって異種であるＥＲターゲッティング配列；
（ｉｉｉ）プロモータ；及び
（ｉｖ）転写終結部位であって、興味の対象であるタンパク質をコードする前記核酸配列及び前記ＥＲターゲッティング列が前記プロモータと前記転写終結部位との間に配置されているものとする、転写終結部位
を含み、
前記ＥＲターゲッティング配列が前記興味の対象であるタンパク質をコードする前記核酸配列に含まれるとき、前記核酸配列が、前記ＥＲターゲッティング配列を含むようにコドン最適化されているものとする、単離されたポリヌクレオチドが提供される。
（ｉ）興味の対象である分泌タンパク質をコードする核酸配列；
（ｉｉ）配列番号２に記載の小胞体（ＥＲ）ターゲッティング配列であって、前記興味の対象である分泌タンパク質にとって異種であるＥＲターゲッティング配列；
（ｉｉｉ）プロモータ；及び
（ｉｖ）転写終結部位であって、興味の対象であるタンパク質をコードする前記核酸配列及び前記ＥＲターゲッティング列が前記プロモータと前記転写終結部位との間に配置されているものとする、転写終結部位
を含み、
前記ＥＲターゲッティング配列が前記興味の対象であるタンパク質をコードする前記核酸配列に含まれるとき、前記核酸配列が、前記ＥＲターゲッティング配列を含むようにコドン最適化されているものとする、単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【0046】
「単離されたポリヌクレオチド」という語句は、単離されたＤＮＡ分子（すなわち、デオキシリボヌクレオチドを含む）の形態で提供される一本鎖又は二本鎖の核酸配列を指す。
【0047】
「転写単位」という用語は、転写に必要な配列と一緒になった、単一のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡの配列を指す。典型的には、転写単位は、プロモータ、興味の対象であるタンパク質をコードする配列、及びターミネータを含む。
【0048】
これらのエレメントのそれぞれについては、本明細書において以下で個別に説明する。
興味の対象であるタンパク質をコードする核酸配列：
興味の対象であるタンパク質をコードする核酸配列：
【0049】
興味の対象であるタンパク質は、通常、分泌されたタンパク質である。一実施形態において、タンパク質はヒトタンパク質であるが、本発明では他の種からのタンパク質についても検討する。
【0050】
主題の組成物及び方法を使用することによって生産され得る興味の対象である例示的なタンパク質には、ある特定の天然及び組換えヒトホルモン（例、インスリン、成長ホルモン、インスリン様成長因子１、卵胞刺激ホルモン、及び絨毛性ゴナドトロピン）、造血タンパク質（例、エリスロポエチン、Ｃ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＩＬ－１１）、血栓性及び止血性タンパク質（例、組織プラスミノーゲン活性化因子及び活性化タンパク質Ｃ）、免疫学的タンパク質（例、インターロイキン）、抗体及び他酵素（例、デオキシリボヌクレアーゼＩ）が含まれるが、これらに限定される訳ではない。主題の組成物及び方法によって生産され得る例示的なワクチンには、様々なインフルエンザウイルス（例、Ａ型、Ｂ型及びＣ型、並びにＡ型インフルエンザに関するＨ５Ｎ２、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２などの各型についての様々な血清型）、ＨＩＶ、肝炎ウイルス（例、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型又はＤ型肝炎）、ライム病、及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対するワクチンが含まれるが、これらに限定される訳ではない。異種生産タンパク質診断の例には、セクレチン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、ＨＩＶ抗原、及びＣ型肝炎抗原が含まれるが、これらに限定される訳ではない。
【0051】
興味の対象である他の例示的なタンパク質には、サイトカイン、ケモカイン、リンホカイン、リガンド、受容体、ホルモン、酵素、抗体及び抗体フラグメント、並びに成長因子が含まれ得るが、これらに限定される訳ではない。受容体の非限定的な例には、ＴＮＦＩ型受容体、ＩＬ－１受容体ＩＩ型、ＩＬ－１受容体拮抗物質、ＩＬ－４受容体及び任意の化学的又は遺伝的に改変された可溶性受容体が含まれる。酵素の例には、アセチルコリンエステラーゼ、ラクターゼ、活性化プロテインＣ、第ＶＩＩ因子、コラゲナーゼ（例：Ｓａｎｔｙｌの名称でＡｄｖａｎｃｅ Ｂｉｏｆａｃｔｕｒｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより市販されている）、アガルシダーゼ－ベータ（例、ＧｅｎｚｙｍｅによりＦａｂｒａｚｙｍｅの名称で市販されている）、ドルナーゼアルファ（例、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈによりＰｕｌｍｏｚｙｍｅの名称で市販されている）、アルテプラーゼ（例、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈによりＡｃｔｉｖａｓｅの名称で市販されている）、ペグ化アスパラギナーゼ（例：Ｏｎｃａｓｐａｒという名称でＥｎｚｏｎにより市販されている）、アスパラギナーゼ（例、ＭｅｒｃｋからＥｌｓｐａｒの名称で市販されている）、及びイミグルセラーゼ（例、Ｃｅｒｅｄａｓｅという名称でＧｅｎｚｙｍｅにより市販されている）が含まれる。特定のポリペプチド又はタンパク質の例としては、コラーゲン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン・ベータ（ＩＦＮ－ベータ）、インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮガンマ）、インターフェロン・ガンマ誘導因子Ｉ（ＩＧＩＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＩＧＦ－ベータ）、ＲＡＮＴＥＳ（活性化時に調節され、正常なＴ細胞が発現し、おそらく分泌される）、マクロファージ炎症性タンパク質（例：ＭＩＰ－１－アルファ及びＭＩＰ－１－ベータ）、リーシュマニア伸長開始因子（ＬＥＩＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、成長因子、例、表皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン２（ＮＴ ２）、ニューロトロフィン３（ＮＴ－３）、ニューロトロフィン－４（ＮＴ－４）、ニューロトロフィン－５（ＮＴ－５）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ＴＮＦアルファＩＩ型受容体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン及び可溶性糖タンパク質（例、ｇｐ１２０及びｇｐ１６０糖タンパク質）があるが、これらに限定される訳ではない。ｇｐ１２０糖タンパク質は、ヒト免疫不全ウイルス（ＷＩＶ）エンベロープタンパク質であり、ｇｐ１６０糖タンパク質は、ｇｐ１２０糖タンパク質の既知の前駆体である。他の例には、セクレチン、ネシリチド（ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ｈＢＮＰ））及びＧＹＰ－Ｉが含まれる。
【0052】
興味の対象である他の例示的なタンパク質には、限定される訳ではないが、クラスＡのロドプシン様受容体、例えばムスカリン性（Ｍｕｓｃａｔｉｎｉｃ）（Ｍｕｓｅ．）アセチルコリン脊椎動物１型、ムスカリン性アセチルコリン脊椎動物２型、ムスカリン性アセチルコリン脊椎動物３型、ムスカリン性アセチルコリン脊椎動物４型；アドレナリン受容体（アルファ・アドレナリン受容体１型、アルファ・アドレナリン受容体２型、ベータ・アドレナリン受容体１型、ベータ・アドレナリン受容体２型、ベータ・アドレナリン受容体３型、ドーパミン脊椎動物１型、ドーパミン脊椎動物２型、ドーパミン脊椎動物３型、ドーパミン脊椎動物４型、ヒスタミン１型、ヒスタミン２型、ヒスタミン３型、ヒスタミン４型、セロトニン１型、セロトニン２型、セロトニン３型、セロトニン４型、セロトニン５型、セロトニン６型、セロトニン７型、セロトニン８型、他のセロトニン型、微量アミン、アンジオテンシン１型、アンジオテンシン２型、ボンベシン、ブラジキニン（Ｂｒａｄｙｋｆｆｉｎ）、Ｃ５ａアナフィラトキシン、Ｆｉｎｅｔ－ｌｅｕ－ｐｈｅ、ＡＰＪ様、インターロイキン８型Ａ、インターロイキン８型Ｂ、インターロイキン８型その他、Ｃ－Ｃケモカイン１型～１１型及び他の型、Ｃ－－Ｘ－－Ｃケモカイン（２型～６型など）、Ｃ－Ｘ３－Ｃケモカイン、コレシストキニンＣＣＫ、ＣＣＫタイプＡ、ＣＣＫタイプＢ、ＣＣＫその他、エンドセリン、メラノコルチン（メラノサイト刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、メラノコルチンホルモン）、ダフィー抗原、プロラクチン放出ペプチド（ＧＰＲ１０）、ニューロペプチドＹ（１型～７型）、ニューロペプチドＹ、ニューロペプチドＹその他、ニューロテンシン、オピオイド（タイプＤ、Ｋ、Ｍ、Ｘ）、ソマトスタチン（１型～５型）、タキキニン（物質Ｐ（ＮＫ１）、物質Ｋ（ＮＫ２）、ニューロメジンＫ（ＮＫ３）、タキキニン様１、タキキニン様２、バソプレシン／バソトシン（１型～２型）、バソトシン、オキシトシン／メソトシン、コノプレシン、ガラニン様、プロテイナーゼ活性化様、オレキシン＆ニューロペプチドＦＦ、ＱＲＦＰ、ケモカイン受容体様、ニューロメジンＵ様（ニューロメジンＵ、ＰＲＸアミド）、ホルモンタンパク質（卵胞刺激ホルモン、ルトロピン絨毛性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、ゴナドトロピンＩ型、ゴナドトロピンＩＩ型）、（ロド）オプシン（（Ｒｈｏｄ）ｏｐｓｉｎ）、ロドプシン脊椎動物（１型～５型）、ロドプシン脊椎動物５型、ロドプシン節足動物、ロドプシン節足動物１型、ロドプシン節足動物２型、ロドプシン節足動物３型、ロドプシン軟体動物、ロドプシン、嗅覚器（嗅覚器１１ ｆａｍ １～１３）、プロスタグランジン（プロスタグランジンＥ２サブタイプＥＰ １、プロスタグランジンＥ２／Ｄ２サブタイプＥＰ２、プロスタグランジンＥ２サブタイプＥＰ３、プロスタグランジンＥ２サブタイプＥＰ４、プロスタグランジンＦ２－アルファ、プロスタサイクリン、トロンボキサン、アデノシン１型～３型、プリン受容体、プリン受容体Ｐ２ＲＹ１－４，６，１１ ＧＰＲ９１、プリン受容体Ｐ２ＲＹ５，８，９，１０ ＧＰＲ３５，９２，１７４、プリン受容体Ｐ２ＲＹ１２－１４ ＧＰＲ８７（ＪＤＰ－グルコース）、カンナビノイド、血小板活性化因子、ゴナドトロピン放出ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモンＩ型、ゴナドトロピン放出ホルモンＩＩ型、脂質動員ホルモン様、コラゾニン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン及び分泌促進物質、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン分泌促進物質、成長ホルモン分泌促進物質様、脱皮誘発ホルモン（ＥＴＨＲ）、メラトニン、リゾスフィンゴ脂質及びＬＰＡ（ＥＤＧ）、スフィンゴシン１－リン酸Ｅｄｇ－１、リゾホスファチジン酸Ｅｄｇ－２、スフィンゴシン１－リン酸Ｅｄｇ－３、リゾホスファチジン酸Ｅｄｇ４、スフィンゴシン１－リン酸Ｅｄｇ－５、スフィンゴシン１－リン酸Ｅｄｇ－６、リゾホスファチジン酸Ｅｄｇ－７、スフィンゴシン１－リン酸Ｅｄｇ－８、Ｅｄｇ他のロイコトリエンＢ４受容体、ロイコトリエンＢ４受容体ＢＬＴ１、ロイコトリエンＢ４受容体ＢＬＴ２、クラスＡオーファン／その他、推定的神経伝達物質、ＳＲＥＢ、Ｍａｓ癌原遺伝子及びＭａｓ関連（ＭＲＧ）、ＧＰＲ４５様、システイニルロイコトリエン、Ｇタンパク質共役胆汁酸受容体、遊離脂肪酸受容体（ＧＰ４０、ＧＰ４１、ＧＰ４３）、クラスＢのセクレチン様、カルシトニン、コルチコトロピン放出因子、胃抑制ペプチド、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン、副甲状腺ホルモン、ＰＡＣＡＰ、セクレチン、血管作動性腸管ポリペプチド、ラトロフィリン、ラトロフィリン１型、ラトロフィリン２型、ラトロフィリン３型、ＥＴＬ受容体、脳特異的血管新生阻害剤（ＢＡＩ）、メトセラ様タンパク質（ＭＴＨ）、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ（ＣＥＬＳＲ）、巨大Ｇタンパク質共役型受容体、クラスＣの代謝型グルタミン酸／フェロモン、代謝型グルタミン酸Ｉ群～ＩＩＩ群、カルシウム感知型様、細胞外カルシウム感知型、フェロモン、カルシウム感知型その他、推定的フェロモン受容体、ＧＡＢＡ－Ｂ、ＧＡＢＡ－Ｂサブタイプ１、ＧＡＢＡ－Ｂサブタイプ２、ＧＡＢＡ－Ｂ様、オーファンＧＰＲＣ５、オーファンＧＰＣＲ６、セブンレスタンパク質の花嫁（Ｂｒｉｄｅ ｏｆ ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＢＯＳＳ）、味覚受容体（ＴｉＲ）、クラスＤの真菌フェロモン、真菌フェロモンＡ因子様（ＳＴＥ２、ＳＴＥ３）、真菌フェロモンＢ様（ＢＡＲ、ＢＢＲ、ＲＣＢ、ＰＲＡ）、クラスＥのｃＡＭＰ受容体、眼の白化タンパク質、ｆｒｉｚｚｌｅｄ（フリズルド）／平滑化ファミリー、ｆｒｉｚｚｌｅｄ Ａ群（Ｆｚ １及び２及び４及び５及び７－９）、ｆｒｉｚｚｌｅｄ Ｂ群（Ｆｚ ３及び６）、ｆｒｉｚｚｌｅｄ Ｃ群（その他）、鋤鼻受容体、線虫の化学受容体、昆虫の嗅覚受容体、並びにクラスＺの古細菌／細菌／真菌のオプシンを含むＧＰＣＲが含まれ得る。
【0053】
興味の対象であるポリペプチドは、生物活性ペプチドであり得る。例としては：ＢＯＴＯＸ、Ｍｙｏｂｌｏｃ、Ｎｅｕｒｏｂｌｏｃ、Ｄｙｓｐｏｒｔ（又はボツリヌス菌神経毒の他の血清型）、アルグルコシダーゼ・アルファ、ダプトマイシン、ＹＨ－１６、絨毛性ゴナドトロピン・アルファ、フィルグラスチム、セトロレリクス、インターロイキン－２、アルデスロイキン、テセロイキン（ｔｅｃｅｌｅｕｌｉｎ）、デニロイキンジフチトクス、インターフェロン・アルファ－ｎ３（注射用）、インターフェロン・アルファ－ｎｌ、ＤＬ－８２３４、インターフェロン、Ｓｕｎｔｏｒｙ（ガンマ－１ａ）、インターフェロン・ガンマ、サイモシン・アルファ１、タソネルミン、ＤｉｇｉＦａｂ、ＶｉｐｅｒａＴＡｂ、ＥｃｈｉＴＡｂ、ＣｒｏＦａｂ、ネシリチド、アバタセプト、アレファセプト、Ｒｅｂｉｆ、エプトテルミンアルファ、テリパラチド（骨粗鬆症）、注射用カルシトニン（骨疾患）、カルシトニン（経鼻、骨粗鬆症）、エタネルセプト、ヘモグロビングルタマー２５０（ウシ）、ドロトレコギン・アルファ、コラゲナーゼ、カルペリチド、組換えヒト表皮増殖因子（局所用ゲル、創傷治癒）、ＤＷＰ４０１、ダルベポエチン・アルファ、エポエチン・オメガ、エポエチン・ベータ、エポエチン・アルファ、デシルジン、レピルジン、ビバリルジン、ノナコグ・アルファ、Ｍｏｎｏｎｉｎｅ、エプタコグ・アルファ（活性化）、組換え第ＶＩＩＩ因子＋ＶＷＦ、レコンビナート、組換え第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子（組換え体）、Ａｌｐｈｎｍａｔｅ、オクトコグ・アルファ、第ＶＩＩＩ因子、パリフェルミン、Ｉｎｄｉｋｉｎａｓｅ、テネクテプラーゼ、アルテプラーゼ、パミテプラーゼ、レテプラーゼ、ナテプラーゼ、モンテプラーゼ、フォリトロピン・アルファ、ｒＦＳＨ、ｈｐＦＳＨ、ミカファンギン、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、ナルトグラスチム、セルモレリン、グルカゴン、エキセナチド、プラムリンチド、イミグルセラーゼ（ｉｎｉｇｌｕｃｅｒａｓｅ）、ガルスルファーゼ、Ｌｅｕｃｏｔｒｏｐｉｎ、モルグラモスチム（ｍｏｌｇｒａｍｏｓｔｉｒｎ）、酢酸トリプトレリン、ヒストレリン（皮下埋込み体、Ｈｙｄｒｏｎ）、デスロレリン、ヒストレリン、ナファレリン、ロイプロリド徐放型デポー剤（ＡＴＲＩＧＥＬ）、ロイプロリド埋込み型（ＤＵＲＯＳ）、ゴセレリン、ソマトロピン、Ｅｕｔｒｏｐｉｎ、ＫＰ－１０２プログラム、ソマトロピン、ソマトロピン、メセカルミン（成長不全）、エンフビルチド（ｅｎｌｆａｖｉｒｔｉｄｅ）、Ｏｒｇ－３３４０８、インスリングラルギン、インスリングルリジン、インスリン（吸入薬）、インスリンリスプロ、インスリンデテミル（ｄｅｔｅｒｎｉｒ）、インスリン（口腔、ＲａｐｉｄＭｉｓｔ）、メカセルミンリンファバート、アナキンラ、セルモロイキン、９９ｍＴｃ－アプシタイド注射剤、ｍｙｅｌｏｐｉｄ、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ、酢酸グラチラマー、Ｇｅｐｏｎ、サルグラモスチム、オプレルベキン、ヒト白血球由来アルファインターフェロン、Ｂｉｌｉｖｅ、インスリン（組換え体）、組換えヒトインスリン、インスリンアスパルト、メカセルミン（ｍｅｃａｓｅｎｉｎ）、Ｒｏｆｅｒｏｎ－Ａ、インターフェロン－アルファ２、Ａｌｆａｆｅｒｏｎｅ、インターフェロン・アルファコン－１、インターフェロン・アルファ、Ａｖｏｎｅｘの組換えヒト黄体形成ホルモン、ドルナーゼ・アルファ、トラフェルミン、ジコノチド、タルチレリン、ジボテルミンアルファ、アトシバン、ベカプレルミン、エプチフィバチド、Ｚｅｍａｉｒａ、ＣＴＣ－１１１、Ｓｈａｎｖａｃ－Ｂ、ＨＰＶワクチン（四価）、オクトレオチド、ランレオチド、アンセスチム（ａｎｃｅｓｔｉｒｎ）、アガルシダーゼ・ベータ、アガルシダーゼ・アルファ、ラロニダーゼ、酢酸プレザチド銅（局所用ゲル）、ラスブリカーゼ、ラニビズマブ、Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ、ＰＥＧ－イントロン、Ｔｒｉｃｏｍｉｎ、組換えハウスダストダニアレルギー脱感作注射、組換えヒト副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）１～８４（ｓｃ、骨粗鬆症）、エポエチン・デルタ、トランスジェニック抗トロンビンＩＩＩ、Ｇｒａｎｄｉｔｒｏｐｉｎ、Ｖｉｔｒａｓｅ、組換えインスリン、インターフェロン－アルファ（経口トローチ）、ＧＥＭ－２１Ｓ、バプレオチド、イズルスルファーゼ、オマパトリラト（ｏｍｎａｐａｔｒｉｌａｔ）、組換え血清（ｓｅｒｕｒｎ）アルブミン、セルトリズマブペゴール、グルカルピダーゼ、ヒト組換えＣ１エステラーゼ阻害剤（血管浮腫）、ラノテプラーゼ、組換えヒト成長ホルモン、エンフビルチド（無針注射、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ ２０００）、ＶＧＶ－１、インターフェロン（アルファ）、ルシナクタント、アビプタジル（吸入、肺疾患）、イカチバント、エカランチド、オミガナン、Ａｕｒｏｇｒａｂ、酢酸ペキシガナン、ＡＤＩ－ＰＥＧ－２０、ＬＤＩ－２００、デガレリクス、シントレデキンベスドトクス（ｃｉｎｔｒｅｄｅｌｉｎｂｅｓｕｄｏｔｏｘ）、Ｆａｖｌｄ、ＭＤＸ－１３７９、ＩＳＡｔｘ－２４７、リラグルチド、テリパラチド（骨粗鬆症）、チファコギン、ＡＡ４５００、Ｔ４Ｎ５リポソームローション、カツマキソマブ、ＤＷＰ４１３、ＡＲＴ－１２３、Ｃｈｒｙｓａｌｉｎ、デスモテプラーゼ、アメジプラーゼ、コリフォリトロピンアルファ、ＴＨ－９５０７、テズグルチド、Ｄｉａｍｙｄ、ＤＷＰ－４１２、成長ホルモン（徐放型注射）、組換えＧ－ＣＳＦ、インスリン（吸入用、ＡＩＲ）、インスリン（吸入用、Ｔｅｃｈｎｏｓｐｈｅｒｅ）、インスリン（吸入用、ＡＥＲｘ）、ＲＧＮ－３０３、ＤｉａＰｅｐ２７７、インターフェロン・ベータ（Ｃ型肝炎ウイルス感染（ＨＣＶ））、インターフェロン・アルファ－ｎ３（経口）、ベラタセプト、経皮インスリンパッチ、ＡＭＧ－５３１、ＭＢＰ－８２９８、Ｘｅｒｅｃｅｐｔ、オペバカン、ＡＩＤＳＶＡＸ、ＧＶ－１００１、ＬｙｍｐｈｏＳｃａｎ、ランピルナーゼ、Ｌｉｐｏｘｙｓａｎ、ルスプルチド、ＭＰ５２（ベータ型リン酸三カルシウム担体、骨再生）、メラノーマワクチン、シプロイセル－Ｔ、ＣＴＰ－３７、Ｉｎｓｅｇｉａ、ビテスペン、ヒトトロンビン（凍結、外科的出血）、トロンビン、ＴｒａｎｓＭＩＤ、アルフィメプラーゼ、Ｐｕｒｉｃａｓｅ、テルリプレシン（静脈内、肝腎症候群）、ＥＵＲ－１００８Ｍ、組換えＦＧＦ－Ｉ（注入用、血管疾患）、ＢＤＭ－Ｅ、ロチガプチド、ＥＴＣ－２１６、Ｐ－１１３、ＭＢＩ－５９４ＡＮ、デュラマイシン（吸入用、嚢胞性線維症）、ＳＣＶ－０７、ＯＰＩ－４５、エンドスタチン、アンギオスタチン、ＡＢＴ－５１０、ボーマン－バーク型阻害物質濃縮物、ＸＭＰ－６２９、９９ｍＴｃ－Ｈｙｎｉｃ－アネキシンＶ、カハラリドＦ、ＣＴＣＥ－９９０８、テベレリクス（徐放型）、オザレリクス、ロミデプシン（ｒｏｒｎｉｄｅｐｓｉｎ）、ＢＡＹ－５０４７９８、インターロイキン４、ＰＲＸ－３２１、Ｐｅｐｓｃａｎ、イボクタデキン、ｒｈラクトフェリン、ＴＲＵ－０１５、ＩＬ－２１、ＡＴＮ－１６１、シレンジタイド、アルブフェロン、Ｂｉｐｈａｓｉｘ、ＩＲＸ－２、オメガ・インターフェロン、ＰＣＫ－３１４５、ＣＡＰ－２３２、パシレオチド、ｈｕＮ９０１－ＤＭＩ、卵巣がん免疫療法ワクチン、ＳＢ－２４９５５３、Ｏｎｃｏｖａｘ－ＣＬ、ＯｎｃｏＶａｘ－Ｐ、ＢＬＰ－２５、ＣｅｒＶａｘ－１６、マルチエピトープペプチドメラノーマワクチン（ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００、チロシナーゼ）、ネミフィチド、ｒＡＡＴ（吸入用）、ｒＡＡＴ（皮膚科用）、ＣＧＲＰ（吸入用、喘息）、ペグスネルセプト、サイモシンベータ４、プリチデプシン、ＧＴＰ－２００、ラモプラニン、ＧＲＡＳＰＡ、ＯＢＩ－１、ＡＣ－１００、サケカルシトニン（経口、エリゲン）、カルシトニン（経口、骨粗鬆症）、エキサモレリン、カプロモレリン、Ｃａｒｄｅｖａ、ベラフェルミン、１３１Ｉ－ＴＭ－６０１、ＫＫ－２２０、Ｔ－１０、ウラリチド、デペレスタット、ヘマタイド、Ｃｈｒｙｓａｌｉｎ（局所用）、ｒＮＡＰｃ２、組換え第ＶＩＩＩ因子（ＰＥＧ化リポソーム）、ｂＦＧＦ、ＰＥＧ化組換えスタフィロキナーゼバリアント、Ｖ－１０１５３、ＳｏｎｏＬｙｓｉｓ Ｐｒｏｌｙｓｅ、ＮｅｕｒｏＶａｘ、ＣＺＥＮ－００２、膵島細胞新生治療、ｒＧＬＰ－１、ＢＩＭ－５１０７７、ＬＹ－５４８８０６、エキセナチド（制御放出型、Ｍｅｄｉｓｏｒｂ）、ＡＶＥ－００１０、ＧＡ－ＧＣＢ、アボレリン、ＡＯＤ－９６０４、酢酸リナクロチド（ｌｉｎａｃｌｏｔｉｄｅ ｅａｃｅｔａｔｅ）、ＣＥＴｉ－１、Ｈｅｍｏｓｐａｎ、ＶＡＬ（注射用）、速効型インスリン（注射用、Ｖｉａｄｅｌ）、鼻内用インスリン、インスリン（吸入用）、インスリン（経口、エリゲン）、組換えメチオニルヒトレプチン、ピトラキンラ（皮下注射、湿疹）、ピトラキンラ（吸入型乾燥粉末、喘息）、Ｍｕｌｔｉｋｉｎｅ、ＲＧ－１０６８、ＭＭ－０９３、ＮＢＩ－６０２４、ＡＴ－００１、ＰＩ－０８２４、Ｏｒｇ－３９１４１、Ｃｐｎ１０（自己免疫疾患／炎症）、タラクトフェリン（局所用）、ｒＥＶ－１３１（眼科用）、ｒＥＶ－１３１（呼吸器疾患）、経口用組換えヒトインスリン（糖尿病）、ＲＰＩ－７８Ｍ、オプレルベキン（経口）、ＣＹＴ－９９００７ ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＤＴＹ－００１、バラテグラスト、インターフェロン・アルファ－ｎ３（局所用）、ＩＲＸ－３、ＲＤＰ－５８、Ｔａｕｆｅｒｏｎ、胆汁酸塩刺激リパーゼ、Ｍｅｒｉｓｐａｓｅ、アルカリホスファターゼ（ａｌａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ＥＰ－２１０４Ｒ、Ｍｅｌａｎｏｔａｎ－ＩＩ、ブレメラノチド、ＡＴＬ－１０４、組換えヒトマイクロプラスミン、ＡＸ－２００、ＳＥＭＡＸ、ＡＣＶ－１、Ｘｅｎ－２１７４、ＣＪＣ－１００８、ダイノルフィンＡ、ＳＩ－６６０３、ＬＡＢ ＧＨＲＨ、ＡＥＲ－００２、ＢＧＣ－７２８、マラリアワクチン（ビロソーム、ＰｅｖｉＰＲＯ）、ＡＬＴＵ－１３５、パルボウイルスＢ１９ワクチン、インフルエンザワクチン（組換えノイラミインダーゼ）、マラリア／ＨＢＶワクチン、炭疽病ワクチン、Ｖａｃｃ－５ｑ、Ｖａｃｃ－４ｘ、ＨＩＶワクチン（経口）、ＨＰＶワクチン、Ｔａｔ類毒素、ＹＳＰＳＬ、ＣＨＳ－１３３４０、ＰＴＨ（１－３４）リポソームクリーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、Ｏｓｔａｂｏｌｉｎ－Ｃ、ＰＴＨアナログ（局所用、乾癬）、ＭＢＲＩ－９３．０２、ＭＴＢ７２Ｆワクチン（結核）、ＭＶＡ－Ａｇ８５Ａワクチン（結核）、ＦＡＲＡ０４、ＢＡ－２１０、組換え疫病ＦＩＶワクチン、ＡＧ－７０２、ＯｘＳＯＤｒｏｌ、ｒＢｅｔＶ１、Ｄｅｒ－ｐ１／Ｄｅｒ－ｐ２／Ｄｅｒ－ｐ７アレルゲンターゲッティングワクチン（チリダニアレルギー）、ＰＲ１ペプチド抗原（白血病）、突然変異ｒａｓワクチン、ＨＰＶ－１６ Ｅ７リポペプチドワクチン、ラビリンチンワクチン（腺癌）、ＣＭＬワクチン、ＷＴ１ペプチドワクチン（がん）、ＩＤＤ－５、ＣＤＸ－１１０、Ｐｅｎｔｒｙｓ、Ｎｏｒｅｌｉｎ、ＣｙｔｏＦａｂ、Ｐ－９８０８、ＶＴ－１１１、イクロカプチド、テルベルミン（皮膚科用、糖尿病性足部潰瘍）、ルピントリビル、レティキュロース、ｒＧＲＦ、Ｐ１Ａ、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、ＡＣＥ－０１１、ＡＬＴＵ－１４０、ＣＧＸ－１１６０、アンジオテンシン治療用ワクチン、Ｄ－４Ｆ、ＥＴＣ－６４２、ＡＰＰ－０１８、ｒｈＭＢＬ、ＳＣＶ－０７（経口、結核）、ＤＲＦ－７２９５、ＡＢＴ－８２８、ＥｒｂＢ２特異的免疫毒素（抗がん剤）、ＤＴ３ＳＳＩＬ－３、ＴＳＴ－１００８８、ＰＲＯ－１７６２、Ｃｏｍｂｏｔｏｘ、コレシストキニン－Ｂ／ガストリン受容体結合ペプチド、１１１Ｉｎ－ｈＥＧＦ、ＡＥ－３７、トラスニズマブ（ｔｒａｓｎｉｚｕｍａｂ）－ＤＭ１、アンタゴニストＧ、ＩＬ－１２（組換え）、ＰＭ－０２７３４、ＩＭＰ－３２１、ｒｈＩＧＦ－ＢＰ３、ＢＬＸ－８８３、ＣＵＶ－１６４７（局所用）、Ｌ－１９ベースの放射線免疫治療薬（がん）、Ｒｅ－１８８－Ｐ－２０４５、ＡＭＧ－３８６、ＤＣ／１５４０／ＫＬＨワクチン（がん）、ＶＸ－００１、ＡＶＥ－９６３３、ＡＣ－９３０１、ＮＹ－ＥＳＯ－１ワクチン（ペプチド）、ＮＡ１７．Ａ２ペプチド、メ
ラノーマワクチン（パルス抗原治療薬）、前立腺がんワクチン、ＣＢＰ－５０１、組換えヒトラクトフェリン（ドライアイ）、ＦＸ－０６、ＡＰ－２１４、ＷＡＰ－８２９４Ａ（注射用）、ＡＣＰ－ＨＩＰ、ＳＵＮ－１１０３１、ペプチドＹＹ［３－３６］（肥満、鼻内）、ＦＧＬＬ、アタシセプト、ＢＲ３－Ｆｃ、ＢＮ－００３、ＢＡ－０５８、ヒト副甲状腺ホルモン１－３４（経鼻、骨粗鬆症）、Ｆ－１８－ＣＣＲ１、ＡＴ－１１００（セリアック病／糖尿病）、ＪＰＤ－００３、ＰＴＨ（７－３４）リポソームクリーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、デュラマイシン（眼科用、ドライアイ）、ＣＡＢ－２、ＣＴＣＥ－０２１４、糖ペグ化（ＧｌｙｃｏＰＥＧｙｌａｔｅｄ）エリスロポエチン、ＥＰＯ－Ｆｃ、ＣＮＴＯ－５２８、ＡＭＧ－１１４、ＪＲ－０１３、第ＸＩＩＩ因子、アミノカンディン、ＰＮ－９５１、７１６１５５、ＳＵＮ－Ｅ７００１、ＴＨ－０３１８、ＢＡＹ－７３－７９７７、テベレリクス（即放型）、ＥＰ－５１２１６、ｈＧＨ（制御放出型、Ｂｉｏｓｐｈｅｒｅ）、ＯＧＰ－Ｉ、シフビルチド、ＴＶ－４７１０、ＡＬＧ－８８９、Ｏｒｇ－４１２５９、ｒｈＣＣ１０、Ｆ－９９１、チモペンチン（肺疾患）、ｒ（ｍ）ＣＲＰ、肝臓選択性インスリン、スバリン、Ｌ１９－ＩＬ－２融合タンパク質、エラフィン（ｅｌａｆｉｎ）、ＮＭＫ－１５０、ＡＬＴＵ－１３９、ＥＮ－１２２００４、ｒｈＴＰＯ、トロンボポエチン受容体アゴニスト（血小板減少症）、ＡＬ－１０８、ＡＬ－２０８、神経成長因子アンタゴニスト（疼痛）、ＳＬＶ－３１７、ＣＧＸ－１００７、ＩＮＮＯ－１０５、経口型テリパラチド（エリゲン）、ＧＥＭ－ＯＳ１、ＡＣ－１６２３５２、ＰＲＸ－３０２、ＬＦｎ－ｐ２４融合ワクチン（Ｔｈｅｒａｐｏｒｅ）、ＥＰ－１０４３、肺炎連鎖球菌（Ｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）小児ワクチン、マラリアワクチン、Ｂ群髄膜炎菌ワクチン、新生児Ｂ群連鎖球菌ワクチン、炭疽病ワクチン、ＨＣＶワクチン（ｇｐＥ１＋ｇｐＥ２＋ＭＦ－５９）、中耳炎治療薬、ＨＣＶワクチン（コア抗原＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ）、ｈＰＴＨ（１－３４）（経皮用、ＶｉａＤｅｒｍ）、７６８９７４、ＳＹＮ－１０１、ＰＧＮ－００５２、アビスクミン、ＢＩＭ－２３１９０、結核ワクチン、マルチエピトープチロシナーゼペプチド、がんワクチン、エンカスチム、ＡＰＣ－８０２４、ＧＩ－５００５、ＡＣＣ－００１、ＴＴＳ－ＣＤ３、血管標的化ＴＮＦ（固形腫瘍）、デスモプレシン（口腔制御放出型）、オネルセプト、及びＴＰ－９２０１が挙げられる。
ラノーマワクチン（パルス抗原治療薬）、前立腺がんワクチン、ＣＢＰ－５０１、組換えヒトラクトフェリン（ドライアイ）、ＦＸ－０６、ＡＰ－２１４、ＷＡＰ－８２９４Ａ（注射用）、ＡＣＰ－ＨＩＰ、ＳＵＮ－１１０３１、ペプチドＹＹ［３－３６］（肥満、鼻内）、ＦＧＬＬ、アタシセプト、ＢＲ３－Ｆｃ、ＢＮ－００３、ＢＡ－０５８、ヒト副甲状腺ホルモン１－３４（経鼻、骨粗鬆症）、Ｆ－１８－ＣＣＲ１、ＡＴ－１１００（セリアック病／糖尿病）、ＪＰＤ－００３、ＰＴＨ（７－３４）リポソームクリーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、デュラマイシン（眼科用、ドライアイ）、ＣＡＢ－２、ＣＴＣＥ－０２１４、糖ペグ化（ＧｌｙｃｏＰＥＧｙｌａｔｅｄ）エリスロポエチン、ＥＰＯ－Ｆｃ、ＣＮＴＯ－５２８、ＡＭＧ－１１４、ＪＲ－０１３、第ＸＩＩＩ因子、アミノカンディン、ＰＮ－９５１、７１６１５５、ＳＵＮ－Ｅ７００１、ＴＨ－０３１８、ＢＡＹ－７３－７９７７、テベレリクス（即放型）、ＥＰ－５１２１６、ｈＧＨ（制御放出型、Ｂｉｏｓｐｈｅｒｅ）、ＯＧＰ－Ｉ、シフビルチド、ＴＶ－４７１０、ＡＬＧ－８８９、Ｏｒｇ－４１２５９、ｒｈＣＣ１０、Ｆ－９９１、チモペンチン（肺疾患）、ｒ（ｍ）ＣＲＰ、肝臓選択性インスリン、スバリン、Ｌ１９－ＩＬ－２融合タンパク質、エラフィン（ｅｌａｆｉｎ）、ＮＭＫ－１５０、ＡＬＴＵ－１３９、ＥＮ－１２２００４、ｒｈＴＰＯ、トロンボポエチン受容体アゴニスト（血小板減少症）、ＡＬ－１０８、ＡＬ－２０８、神経成長因子アンタゴニスト（疼痛）、ＳＬＶ－３１７、ＣＧＸ－１００７、ＩＮＮＯ－１０５、経口型テリパラチド（エリゲン）、ＧＥＭ－ＯＳ１、ＡＣ－１６２３５２、ＰＲＸ－３０２、ＬＦｎ－ｐ２４融合ワクチン（Ｔｈｅｒａｐｏｒｅ）、ＥＰ－１０４３、肺炎連鎖球菌（Ｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）小児ワクチン、マラリアワクチン、Ｂ群髄膜炎菌ワクチン、新生児Ｂ群連鎖球菌ワクチン、炭疽病ワクチン、ＨＣＶワクチン（ｇｐＥ１＋ｇｐＥ２＋ＭＦ－５９）、中耳炎治療薬、ＨＣＶワクチン（コア抗原＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ）、ｈＰＴＨ（１－３４）（経皮用、ＶｉａＤｅｒｍ）、７６８９７４、ＳＹＮ－１０１、ＰＧＮ－００５２、アビスクミン、ＢＩＭ－２３１９０、結核ワクチン、マルチエピトープチロシナーゼペプチド、がんワクチン、エンカスチム、ＡＰＣ－８０２４、ＧＩ－５００５、ＡＣＣ－００１、ＴＴＳ－ＣＤ３、血管標的化ＴＮＦ（固形腫瘍）、デスモプレシン（口腔制御放出型）、オネルセプト、及びＴＰ－９２０１が挙げられる。
【0054】
ある特定の実施形態において、興味の対象であるタンパク質は、酵素又はその生物学的活性フラグメントである。好適な酵素には、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、およびリガーゼが含まれるが、これらに限定される訳ではない。ある特定の実施形態において、異種産生タンパク質は、酵素委員会（ＥＣ）クラス１の酵素、例えば、ＥＣ １．１～１．２１、又は１．９７のいずれかからの酵素である。酵素はまた、ＥＣクラス２、３、４、５、又は６からの酵素であり得る。例えば、酵素は、ＥＣ ２．１～２．９、ＥＣ ３．１～３．１３、ＥＣ ４．１～４．６、ＥＣ ４．９９、ＥＣ ５．１～５．１１、ＥＣ ５．９９、又はＥＣ ６．１～６．６のいずれかから選択され得る。
【0055】
別の実施形態において、興味の対象であるタンパク質は抗体である。
【0056】
本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、実質的に無傷の抗体分子を指す。
【0057】
本明細書で使用される場合、「抗体フラグメント」という語句は、抗原のエピトープに結合することができる抗体（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はＶＨ及びＶＬなどの単一ドメイン分子など）の機能的フラグメントを指す。
プロモータ：
プロモータ：
【0058】
本明細書で使用する場合、「プロモータ」という用語は、転写の開始時にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識され、（直接的又は間接的に）結合された結果、転写されたＤＮＡに相補的なＲＮＡ分子を生成させるＤＮＡ配列などの任意の核酸配列を指す。プロモータは通常、転写されるタンパク質コーディング配列の前にある５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の上流にあり、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ及び転写因子などの他のタンパク質の結合部位として機能する領域を有することで、機能し得るように結合された配列の転写を開始させる。プロモータは、それ自体が、機能し得るように結合された遺伝子の転写を調節するシスエレメント又はエンハンサードメインなどのサブエレメント（すなわち、プロモータモチーフ）を含み得る。プロモータ及び連結された５’ＵＴＲは、「プロモータ領域」とも呼ばれる。
【0059】
本発明のこの実施態様のプロモータは、構成的又は誘導性であり得る。
【0060】
本発明のこの実施形態での使用に適した構成的プロモータには、ほとんどの環境条件下及びほとんどの細胞型で機能的である（すなわち、転写を指令することができる）配列、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＳＶ－４０初期プロモータ、ＳＶ－４０後期プロモータ、メタロチオネインプロモータ、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモータ、ラウス肉腫ウイルスプロモータ及びポリヘドリンプロモータなどが含まれる。
【0061】
本発明のこの実施形態での使用に適した誘導性プロモータには、例えば、テトラサイクリン誘導性プロモータ（Ｓｒｏｕｒ，Ｍ．Ａ．ら、２００３．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．９０：３９８－４０５）又はＩＰＴＧが含まれる。
【0062】
酵母においては、米国特許出願第５，９３２，４４７号に開示されているように、若干の構成的又は誘導性プロモータを使用することができる。別法として、外来ＤＮＡ配列の酵母染色体への組み込みを促進するベクターを使用することができる。
【0063】
植物での発現が必要な場合、コーディング配列の発現は、若干のプロモータによって駆動され得る。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡプロモータ及び１９Ｓ ＲＮＡプロモータなどのウイルスプロモータ［Ｂｒｉｓｓｏｎら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１－５１４］、又はＴＭＶに対するコートタンパク質プロモータ［Ｔａｋａｍａｔｓｕら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：３０７－３１１］を使用することができる。別法として、植物プロモータ、例えばＲＵＢＩＳＣＯの小さなサブユニット［Ｃｏｒｕｚｚｉら（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：１６７１－１６８０及びＢｒｏｇｌｉら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８－８４３］又は熱ショックプロモータ、例えば大豆ｈｓｐ１７．５－Ｅ又はｈｓｐ１７．３－Ｂ［Ｇｕｒｌｅｙら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９－５６５］などを使用することができる。
転写終結部位：
転写終結部位：
【0064】
本明細書で使用する場合、「転写終結部位」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼによる転写終結を指令するＤＮＡ配列を指す。前記配列はまた、転写されたＲＮＡの転写後切断及びポリアデニル化を指令することができる。特定の実施形態において、転写終結配列は、ポリアデニル化／終結配列と呼ばれるポリアデニル化シグナルを含む。好ましい実施形態では、終結配列は、ＳＶ４０ウイルスに由来する。
配列番号２に記載の小胞体（ＥＲ）ターゲティング配列：
配列番号２に記載の小胞体（ＥＲ）ターゲティング配列：
【0065】
本発明のこの実施態様のＥＲターゲッティング配列は、ＥＲへの結合した配列の局在化を助ける。一実施形態では、ＥＲターゲッティング配列は、結合した配列のＥＲへの取り込みを促進する。
【0066】
この配列のＮＮＹリピートは、少なくとも７回（配列番号１の場合）、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回又はそれ以上繰り返される。
【0067】
特定の実施形態によれば、ＮＮＹリピートは少なくとも１０回繰り返される（配列番号２の場合）。
【0068】
特定の実施形態では、ＮＮＹリピートのＮはピリミジンである。別の実施形態では、ＮＮＹリピートのＮはプリンである。すべての実施形態において、ＮＮＹ反復のＹは、ピリミジンである。
【0069】
特定の実施形態によれば、ＥＲターゲッティング配列は、興味の対象であるタンパク質をコードするヌクレオチドを含まない。
【0070】
さらに別の実施形態によれば、ＥＲターゲッティング配列は、配列番号５に示される配列をコードするヌクレオチドを含まない。（ＫＤＥＬ）。
【0071】
好ましくは、ＥＲターゲッティング配列は、配列番号６に示される配列（ａｇｃ ｔａｃａｃｃｃａｃｃ ａｃｃｔｃａｔｃｔａ ｃｃｔｃｔａｃ）を含まない。
【0072】
さらに、一実施形態では、ＥＲターゲッティング配列は、配列ＴＧの５つを超える連続したリピートを含まない。
【0073】
好ましくは、ＥＲターゲッティング配列は、１０、１５、２０、２５、３０又はそれ以上の連続するチミンを含まない。
【0074】
好ましくは、ＥＲターゲッティング配列は、１０、１５、２０、２５、３０又はそれ以上の連続するシトシンを含まない。
【0075】
ＥＲターゲッティング配列は、興味の対象である分泌タンパク質に対して異種（すなわち、内因性ではない）であり、すなわち、興味の対象であるタンパク質をコードする（又はその発現を調節する）天然配列の一部ではない。
【0076】
これらのエレメントはそれぞれ、興味の対象であるタンパク質をコードする核酸配列及びＥＲターゲッティング配列がプロモータと転写終結部位との間に配置されるように配置される。このようにして、興味の対象であるタンパク質をコードし、さらにＥＲターゲティング配列を含むｍＲＮＡ転写物が生成される。
【0077】
一実施形態において、本発明のこの実施態様のＥＲターゲッティング配列は、興味の対象であるタンパク質をコードする配列に対し３’に配置される。別の実施形態において、本発明のこの実施態様のＥＲターゲッティング配列は、興味の対象であるタンパク質をコードする配列に対し５’に配置される。さらなる実施形態において、ＥＲターゲッティング配列は、興味の対象であるタンパク質をコードする配列においてコードされる。
【0078】
好ましくは、ＥＲターゲッティング配列が興味の対象であるタンパク質をコードする核酸配列に含まれるとき、タンパク質の核酸配列は、ＥＲターゲッティング配列を含むようにコドン最適化される。したがって、興味の対象であるタンパク質のアミノ酸配列は、天然のアミノ酸配列と同一である。
【0079】
「コドン最適化」という語句は、ＥＲターゲッティング配列がタンパク質のアミノ酸配列に影響を与えることなくＤＮＡ配列内でコードされるように、構造遺伝子又はそのフラグメント内で使用するための適切なＤＮＡヌクレオチドの選択を指す。したがって、最適化された遺伝子又は核酸配列は、ＥＲターゲッティング配列を含むコドンを利用するために、天然又は天然に存する遺伝子のヌクレオチド配列が改変されている遺伝子を指す。
【0080】
本発明のこの実施態様の転写単位は、シグナルペプチド配列をコードする配列をさらに含み得る。
【0081】
本明細書で使用する場合、「シグナルペプチド」という語句は、ポリペプチドのアミノ末端に枠内で結合されたペプチドを指し、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に導く。
【0082】
シグナル配列は通常、タンパク質配列に対しＮ末端に位置する。シグナル配列は通常、成熟タンパク質には存在しない。シグナル配列は通常、タンパク質が輸送された後、シグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。
【0083】
１つの実施形態によれば、ポリペプチドは、配列番号３（ＡＴＧＴＴＧＴＴＴＡＡＡＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡＡＡＧＴＴＡＧＣＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＣＧＣＡＡＣＴＧＣＧＧＡＣ）に示される配列を有するシグナルペプチドをコードする。
【0084】
一実施形態において、シグナルペプチド配列は、興味の対象であるタンパク質にとって内因性である。別の実施形態において、シグナルペプチド配列は、興味の対象であるタンパク質にとって異種である（すなわち、天然ではない、又は外因性、非内因性である）。
【0085】
様々な原核細胞又は真核細胞を、本発明のポリペプチドを発現させるための宿主発現系として使用することができる。これらには、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、真菌細胞（例、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞）、植物細胞（例、タバコ）、昆虫細胞（鱗翅目細胞）及び他の哺乳類細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）が含まれるが、これらに限定される訳ではない。
【0086】
細胞は、細胞培養物の一部、生物全体、又は生物の一部であり得る。
【0087】
本明細書で使用される「植物」という用語は、種子、苗条、茎、根（塊茎を含む）、及び植物細胞、組織及び器官を含む、植物全体、植物の祖先及び子孫及び植物の一部分を含む。植物は、懸濁培養、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、配偶体、胞子体、花粉、及び小胞子を含むあらゆる形態であり得る。本発明の方法において特に有用な植物には、緑色植物亜界（Ｖｉｒｉｄｉｐｌａｎｔａｅ）のスーパーファミリーに属するすべての植物、特に、飼料若しくは飼料マメ科植物、観賞用植物、食用作物、樹木、又は低木を含む単子葉植物及び双子葉植物が含まれる。藻類及び他の非緑色植物亜界もまた、本発明の方法に使用することができる。
【0088】
ヒトインターフェロン・ベータ１ａの発現のために検討される細胞には、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれる。
【0089】
ヒトインターフェロン・ベータ１ｂの発現のために検討される細胞には、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が含まれる。
【0090】
ヒトインターフェロン・ガンマの発現のために検討される細胞には、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が含まれる。
【0091】
ヒト成長ホルモンの発現のために検討される細胞には、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が含まれる。
【0092】
ヒトインスリンの発現のために検討される細胞には、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が含まれる。
【0093】
インターロイキンＩＩの発現のために検討される細胞には、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が含まれる。
【0094】
卵胞刺激ホルモンの発現のために検討される細胞には、例えば、ＣＨＯ細胞が含まれる。
【0095】
細胞系で本発明のポリヌクレオチドからポリペプチドを発現させるために、ポリヌクレオチドを核酸発現ベクターに連結する。
【0096】
本発明のこの実施形態による発現ベクターは、このベクターを原核生物、真核生物、又は好ましくは両方における複製及び組込みに適したもの（例、シャトルベクター）にする追加の配列を含み得る。典型的なクローニングベクターは、転写及び翻訳開始配列（例えば、プロモータ、エンハンサー）並びに転写及び翻訳ターミネータ（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。
【0097】
真核生物のプロモータには、通常、ＴＡＴＡボックスと上流のプロモータエレメントという２タイプの認識配列が含まれている。転写開始部位の２５～３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ合成を開始するように指令することに関与していると考えられている。他の上流プロモータエレメントは、転写が開始される速度を決定する。
【0098】
エンハンサーエレメントは、結合された同種又は異種プロモータから最大１，０００倍まで転写を刺激することができる。エンハンサーは、転写開始部位の下流又は上流に配置されると活性を呈する。ウイルスに由来する多くのエンハンサーエレメントは、幅広い宿主範囲を有し、様々な組織で活性を呈する。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは多くの細胞型に適している。本発明に適した他のエンハンサー／プロモータの組合せには、ポリオーマウイルス、ヒト若しくはマウスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウス白血病ウイルス、マウス若しくはラウス肉腫ウイルス及びＨＩＶなどの様々なレトロウイルスからの長期リピートに由来するものが含まれる。Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ａｎｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（エンハンサー及び真核生物発現）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｎ．Ｙ．１９８３を参照、これについては参照により本明細書に組み込まれる。
【0099】
本発明の発現ベクターから発現されたポリペプチドの翻訳効率を高めるために、ポリアデニル化配列を発現ベクターに加えることもできる。正確かつ効率的なポリアデニル化には、２つの異なる配列エレメントが必要とされる：ポリアデニル化部位の下流に位置するＧＵ又はＵの豊富な配列と、１１～３０ヌクレオチド上流に位置する、高度に保存された６ヌクレオチドの配列、ＡＡＵＡＡＡ。本発明に適した終結及びポリアデニル化シグナルには、ＳＶ４０に由来するものが含まれる。
【0100】
既に記載されたエレメントに加えて、本発明の発現ベクターは、典型的には、クローン化された核酸の発現レベルを増加させるか、または組換えＤＮＡを保持する細胞の同定を容易にすることを目的とする他の特殊化エレメントを含み得る。例えば、若干の動物ウイルスは、許容細胞型におけるウイルスゲノムの染色体外複製を促進するＤＮＡ配列を含んでいる。これらのウイルスレプリコンを保持するプラスミドは、適切な因子がプラスミド上で、または宿主細胞のゲノムとともに運ばれる遺伝子によって提供される限り、エピソームで複製される。
【0101】
ベクターは真核生物のレプリコンを含んでいても含んでいなくてもよい。真核生物のレプリコンが存在する場合、ベクターは、適切な選択マーカーを使用して真核生物の細胞で増幅可能である。ベクターが真核生物レプリコンを含まない場合、エピソーム増幅は不可能である。代わりに、組換えＤＮＡは操作が加えられた細胞のゲノムに組み込まれ、プロモータが目的の核酸の発現を指令する。
【0102】
レトロウイルスなどの真核生物ウイルスからの調節エレメントを含む発現ベクターも、本発明によって使用することができる。ＳＶ４０ベクターには、ｐＳＶＴ７及びｐＭＴ２が含まれる。ウシパピローマウイルスに由来するベクターにはｐＢＶ－１ＭＴＨＡが含まれ、エプスタインバーウイルスに由来するベクターにはｐＨＥＢＯ及びｐ２Ｏ５が含まれる。他の例示的なベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、及びＳＶ－４０初期プロモータ、ＳＶ－４０後期プロモータ、メタロチオネインプロモータ、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモータ、ラウス肉腫ウイルスプロモータ、ポリヘドリンプロモータ、又は真核細胞での発現に有効であることが示されている他のプロモータの指令下でタンパク質の発現を可能にする他の任意のベクターが含まれる。
【0103】
酵母では、米国特許出願第５，９３２，４４７号で開示されているように、構成的又は誘導性プロモータを含む若干のベクターを使用することができる。別法として、外来ＤＮＡ配列の酵母染色体への組み込みを促進するベクターを使用することができる。
【0104】
植物発現ベクターが使用される場合、コーディング配列の発現は、若干のプロモータによって駆動され得る。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡプロモータ及び１９Ｓ ＲＮＡプロモータなどのウイルスプロモータ［Ｂｒｉｓｓｏｎら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１－５１４］、又はＴＭＶに対するコートタンパク質プロモータ［Ｔａｋａｍａｔｓｕら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：３０７－３１１］を使用することができる。別法として、植物プロモータ、例えばＲＵＢＩＳＣＯの小さなサブユニット［Ｃｏｒｕｚｚｉら（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：１６７１－１６８０及びＢｒｏｇｌｉら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８－８４３］又は熱ショックプロモータ、例えば大豆ｈｓｐ１７．５－Ｅ又はｈｓｐ１７．３－Ｂ ［Ｇｕｒｌｅｙら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９－５６５］などを使用することができる。これらの構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション及び当業者に周知の他の技術を使用して植物細胞に導入され得る。例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ及びＷｅｉｓｓｂａｃｈ、１９８８、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩＩＩ、ｐｐ ４２１－４６３を参照。
【0105】
哺乳類発現ベクターの例には、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／－）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／－）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能）、ｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ－ＲＳＶ及びｐＢＫ－ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能）、ｐＴＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能）、及びそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定される訳ではない。
【0106】
一実施形態において、発現ベクターは、本発明のＥＲターゲッティング配列（例、配列番号１又は配列番号２に示されるもの）及びクローニング部位を含む核酸配列を含み、前記クローニング部位へ興味の対象であるタンパク質をコードする配列を挿入したとき、細胞での発現に続いて、興味の対象であるタンパク質をコードするｍＲＮＡが転写されるように、前記クローニング部位の位置が選択されるものとし、前記ＥＲターゲティング配列は、興味の対象である既知タンパク質をコードする配列の一部ではない、例えば、Ｋｒａｕｔ ＣｏｈｅｎらＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ２４、３０６９－３０８４において開示されているように、ＭＲＬ１－３をコードすることはないものとする。合成されたｍＲＮＡは、ＥＲターゲティング配列の転写産物を含む。
【0107】
「クローニング部位」という用語は、ＤＮＡを挿入することができるベクター上の位置を指す。「マルチクローニング部位」又は「ｍｃｓ」という用語は、ベクター上の規定された遺伝子座（制限部位）での挿入を可能にする任意の１つ又は若干の異なる制限酵素部位を含む合成ＤＮＡ配列を指す。「固有のクローニング部位」という用語は、所与のＤＮＡ配列で一度出現するクローニング部位を指す。
【0108】
本発明の発現ベクターを細胞に導入するために様々な方法を使用することができる。そのような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク（１９８９、１９９２）、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、バルチモア、メリーランド（１９８９）、Ｃｈａｎｇら、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、アナーバー、ミシガン（１９９５）、Ｖｅｇａら、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、アナーバー、ミシガン（１９９５）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ、バターワース、ボストン、マサチューセッツ（１９８８）及びＧｉｌｂｏａら［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４（６）：５０４－５１２、１９８６］に全般的に記載されており、例えば、安定した又は一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション及び組換えウイルスベクターによる感染が含まれる。加えて、正負選択法については、米国特許第５，４６４，７６４号および第５，４８７，９９２号を参照。
【0109】
形質転換された細胞は、大量の組換えポリペプチドの発現を可能にする有効な条件下で培養される。有効な培養条件には、タンパク質生産を可能にする有効な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨ、及び酸素条件が含まれるが、これらに限定される訳ではない。有効な培地は、本発明の組換えポリペプチドを生産するために細胞が培養される任意の培地を指す。かかる培地は、典型的には、同化可能な炭素、窒素及びリン酸供給源、並びに適切な塩、無機質、金属及びビタミンなどの他の栄養素を有する水溶液を含む。本発明の細胞は、慣用的発酵バイオリアクター、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイター皿及びペトリ皿で培養され得る。培養は、組換え細胞に適した温度、ｐＨ、及び酸素含有量で実施され得る。かかる培養条件は、当業者の専門知識の範囲内である。
【0110】
培養における所定の時間の後、組換えポリペプチドの回収が行われる。
【0111】
本明細書で使用される「組換えポリペプチドを回収する」という語句は、ポリペプチドを含む発酵培地全体を集めることを指し、分離又は精製の追加的段階を含める必要はない。
【0112】
したがって、本発明のポリペプチドを、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、及び分別可溶化などであるがこれらに限定されない様々な標準タンパク質精製技術を使用して精製することができる。
【0113】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、±１０％を指す。
【0114】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語及びそれらの同根語は、「含むが、それに限定される訳ではない」ことを意味する。
【0115】
「～からなる」という用語は、「～を含み、かつ～に限定される」を意味する。
【0116】
「～から本質的になる」という用語は、組成物、方法又は構造が追加の成分、段階及び／又は部分を含み得るが、ただし追加の成分、段階及び／又は部分が、特許請求の範囲での組成物、方法又は構造の基本的かつ新規な特性を実質的に変更しない場合に限ることを意味する。
【0117】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の言及事項を含む。例えば、用語「化合物」又は「少なくとも１つの化合物」は、それらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。
【0118】
本出願全体を通して、本発明の様々な実施形態は、範囲形式で提示され得る。範囲形式での説明は、単に便宜及び簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、すべての可能な部分範囲とその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載には、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの具体的に開示された部分範囲、及びその範囲内の個々の数、例えば１、２、３、４、５及び６が含まれると見なすべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【0119】
本明細書で数値範囲が示される場合は常に、示された範囲内の任意の引用された数字（分数又は整数）をすべて含むことを意味する。第１の表示数と第２の表示数との間の「範囲に及ぶ／範囲」及び第１の表示数「から」第２の表示数「までの範囲に及ぶ／範囲」という語句は、本明細書では互換的に使用されており、第１の表示数及び第２の表示数並びにそれらの間のすべての分数と整数の数字を含むことを意味する。
【0120】
本明細書で使用する場合、「方法」という用語は、化学、薬理学、生物学、生化学及び医療の技術の実践者に既知であるか、又は彼らにより既知の方法、手段、技法及び手順から容易に開発された方法、手段、技法及び手順を含むがこれらに限定されない、所与の課題を達成するための方法、手段、技法及び手順を指す。
【0121】
特定の配列リストを参照するとき、かかる参照は、例えば配列決定エラー、クローニングエラー、又は塩基置換、塩基欠失又は塩基付加をもたらす他の変更に起因する、軽微な配列変動を含むものとしてその相補配列に実質的に対応する配列も包含すると理解されるべきであるが、ただしかかる変動の頻度は、５０ヌクレオチド中１未満、あるいは１００ヌクレオチド中１未満、あるいは２００ヌクレオチド中１未満、あるいは５００ヌクレオチド中１未満、あるいは、１０００ヌクレオチド中１未満、あるいは５，０００ヌクレオチド中１未満、あるいは１０，０００ヌクレオチド中１未満であるものとする。
【0122】
本出願に開示されている任意の配列識別番号（配列番号）は、その配列番号がＤＮＡ配列形式又はＲＮＡ配列形式でのみ表現されている場合であっても、その配列番号が言及されている文脈に応じて、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列のいずれかを指し得ることが理解されよう。
【0123】
明確にするため別個の実施形態の文脈で記載されている本発明のある特定の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることは理解されよう。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で記載されている本発明の様々な特徴は、別々に、又は任意の適切な部分的組合せで、又は本発明の記載された任意の他の実施形態で適切なものとして提供され得る。様々な実施形態の文脈で記載されるある特定の特徴は、実施形態がそれらのエレメントなしでは機能しない場合を除いて、それらの実施形態の不可欠な特徴と見なされるべきではない。
【0124】
上記で説明され、以下の特許請求の範囲の項で請求される本発明の様々な実施形態及び実施態様は、以下の実施例において実験的裏付けが得られる。
【実施例0125】
次に、以下の実施例を参照して、上記の説明と共に本発明のいくつかの実施形態を非限定的な方法で説明する。
【0126】
概して、本明細書で使用される命名法及び本発明で利用される実験室手順には、分子、生化学、微生物学及び組換えＤＮＡ技術が含まれる。かかる技術は文献で全面的に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ～ＩＩＩ巻Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、バルチモア、メリーランド（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら（編）「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」、１～４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号、第４，６８３，２０２号、第４，８０１，５３１号、第５，１９２，６５９号及び第５，２７２，０５７号に記載されている方法論；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｉ～ＩＩＩ巻Ｃｅｌｌｉｓ、Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ－Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ、ニューヨーク（１９９４）、第３版；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ～ＩＩＩ巻 Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら（編）、「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ及びＬａｎｇｅ、ノーウォーク、コネチカット（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ及びＳｈｉｉｇｉ（編）、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、ニューヨーク（１９８０）参照；利用可能なイムノアッセイは、特許及び科学文献に広範囲に記載されている。例えば米国特許第３，７９１，９３２；３，８３９，１５３；３，８５０，７５２；３，８５０，５７８；３，８５３，９８７；３，８６７，５１７；３，８７９，２６２；３，９０１，６５４；３，９３５，０７４；３，９８４，５３３；３，９９６，３４５；４，０３４，０７４；４，０９８，８７６；４，８７９，２１９；５，０１１，７７１及び５，２８１，５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｇａｉｔ、Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ、Ｂ．Ｄ．、及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ、Ｂ．Ｄ．、及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｐｅｒｂａｌ、Ｂ．、（１９８４）及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、１～３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、カリフォルニア（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照；それらのすべては、参照により本明細書に完全に記載されているかのように組み込まれる。他の一般的な参考文献は、この文書全体を通して記載されている。その中の手順は、当技術分野で周知であると考えられており、読者の便宜のために提供されている。そこに含まれるすべての情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
材料及び方法
酵母株、ゲノム操作、及び成長条件
材料及び方法
酵母株、ゲノム操作、及び成長条件
【0127】
酵母を、標準的な増殖培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％デキストロース）又は２％グルコースを含む合成培地［例：合成完全（ＳＣ）及びアミノ酸又はヌクレオチド塩基を欠く選択的ＳＣドロップアウト培地］（Ｈａｉｍ及びＧｅｒｓｔ、２００９）のいずれかにおいて指示温度で増殖させた。ＷＴ（ＢＹ４７４１）細胞でＮＡＴ抗生物質耐性遺伝子を使用する欠失株は、標準的なＬｉＯＡｃ形質転換手順を使用して作成され、合成固体培地での選択用にノルセオトリシン（１００μｇ／ｍｌ）が使用された。ＳＥＣＲｅＴＥ変異株を作成するために、ＳＥＣＲｅＴＥ遺伝子フラグメントを、最初の変異導入塩基から最後の変異導入塩基まで適切な修飾を加えて設計し、ｇＢｌｏｃｋ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、コーラビル、アイオワ、米国）として合成するか又はｐＵＣ５７－ＡＭＰベクター（Ｂｉｏ Ｂａｓｉｃ Ｉｎｃ．）にクローン化した。（－）ＳＥＣＲｅＴＥ株及び（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ株の両方を生成した。ＳＵＣ２（－）ＳＥＣＲｅＴＥ株、ＳＵＣ２（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ株及びＣＣＷ１２（－）ＳＥＣＲｅＴＥ株を、ゲノムオリゴヌクレオチド組換えのｄｅｌｉｔｔｏ ｐｅｒｆｅｔｔｏ法（Ｓｔｏｒｉｃｉ及びＲｅｓｎｉｃｋ、２００６）を使用して、ＢＹ４７４１バックグラウンドゲノムで構築し、ｐＧＫＳＵからのＣＯＲＥカセット（Ｓｔｏｒｉｃｉ及びＲｅｓｎｉｃｋ、２００６）を、ＳＥＣＲｅＴＥ遺伝子フラグメントの部位に対応するゲノム領域に最初に組み込んだ。ＣＯＲＥカセットには、Ｉ－ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼ部位と別個の誘導性Ｉ－ＳｃｅＩ遺伝子を有するＵＲＡ３選択マーカーが含まれている。ＣＣＷ１２（－）ＳＥＣＲｅＴＥのＳＥＣＲｅＴＥ遺伝子フラグメントを、目的のゲノム遺伝子座の外側の領域とＣＯＲＥカセットの両方に対し２０塩基の相同性を含むプライマー配列を使用して、合成ｇＢｌｏｃｋから増幅した。増幅されたＳＥＣＲｅＴＥ遺伝子フラグメントを、その後、追加の組込み段階を介して、目的のゲノム部位においてＣＯＲＥカセットと置き換えた。代わりに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してＨＳＰ１５０変異株を生成した。ＨＳＰ１５０（－）ＳＥＣＲｅＴＥ及びＨＳＰ１５０（＋）ＳＥＣＲｅＴＥを、ＢＹ４７４１ゲノムで作成した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９手順では、ｐＦＡ６－ＮａｔＭＸ６からのＮＡＴカセットを使用して、ＳＥＣＲｅＴＥ遺伝子フラグメントに対応する天然ゲノム領域を欠失させた。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドベクターを、Ｃａｓ９遺伝子、ＮＡＴカセットをターゲッティングするガイドＲＮＡ、及びＬＥＵ２選択マーカーを発現するように設計した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドを、増幅されたＳＥＣＲｅＴＥ遺伝子フラグメントと同時形質転換して、ＮＡＴカセットを置き換えた。標準的なＬｉＯＡｃベースのプロトコルを、プラスミド及びＰＣＲ産物の酵母への形質転換用に使用した。次いで、形質転換細胞を選択培地で２～４日間増殖させた。ＰＣＲを使用して各段階で正しい組込みを検証し、最終段階で、（－）ＳＥＣＲｅＴＥ配列又は（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ配列の正確な組込みをＤＮＡ配列決定によって確認した。
定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）
定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）
【0128】
ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ酵母ＲＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＲＮＡを一晩培養物から抽出及び精製した。各試料について、２μｇの精製ＲＮＡを、ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン、米国）で３７℃で２時間処理し、推奨メーカー条件のもとモロニーマウス白血病ウイルスＲＴ ＲＮａｓｅ Ｈ（－）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して逆転写（ＲＴ）を行った。ＮＣＢＩ Ｐｒｉｍｅｒ－Ｂｌａｓｔ（Ｙｅら、２０１２）を使用して、１つのアンプリコン（６０～７０ｂｐ）のみを生成するようにプライマー対を設計した。プライマーの各対について標準曲線を作成し、プライマー効率を測定した。すべての反応セットを３回繰り返し、それぞれに陰性対照（Ｈ２Ｏ）を含めた。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０デバイスとＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）、Ｗａｌｔｈａｍ、マサチューセッツ、米国）を使用してｑＲＴ－ＰＣＲを行った。メーカーの指定どおりに、２段階のｑＲＴ－ＰＣＲサーモサイクリングパラメータを使用した。融解曲線の分析により、個々のリアルタイムＰＣＲ産物の特異性を評価したところ、各リアルタイムＰＣＲ産物の単一のピークが明らかになった。ＡＣＴ１又はＵＢＣ６ ＲＮＡを正規化に使用し、倍率変化をＷＴ細胞に対して計算した。
落下試験増殖アッセイ
落下試験増殖アッセイ
【0129】
ＹＰＤ培地で酵母菌株を対数増殖中期まで増殖させ、その後、新鮮な培地で系列希釈を５回（各１０倍）行うことにより、落下試験アッセイを行った。細胞を異なる条件のプレートにスポットし、フォトドキュメンテーションの前に４８時間インキュベートした。カルコフロールオホワイト（ＣＦＷ）又はハイグロマイシンＢ（ＨＢ）の感受性について、２５μｇ／ｍｌ ＨＢ又は５０μｇ／ｍｌ ＣＦＷ（ＤＭＳＯに溶解、Ｒａｍ及びＫｌｉｓ（２００６）の要領で調製）を含むＹＰＤプレートに細胞をスポットし、上記で述べたプロトコルに従って試験した。
Ｈｓｐ１５０及びＧＦＰ分泌アッセイ
Ｈｓｐ１５０及びＧＦＰ分泌アッセイ
【0130】
Ｈｓｐ１５０分泌の誘導のために、株を２６℃で一晩ＹＰＤにおいて増殖させ、ＹＰＤ培地で０．２ Ｏ．Ｄ．６００単位に希釈し、次に３７℃でインキュベートして対数期まで増殖させた。ＧＦＰ分泌のために、炭素供給源としてラフィノースを含む合成選択培地で酵母を３０℃で０．２ ＯＤ６００までＯ／Ｎ増殖させ、ＹＰ－Ｇａｌで０．２ ＯＤ ＯＤ６００単位に希釈し、３０℃で対数中期（０．６～０．８ＯＤ６００）まで増殖させた。次に、１．８ｍｌの培養液を各株から採取し、室温にて１９００×ｇで３分間遠心分離した。トリクロロ酢酸（１００％ｗ／ｖ）タンパク質沈殿を上清で行い、０．１ Ｍ ＮａＯＨを使用したタンパク質抽出をペレットで行った（Ｚｈａｎｇら、２０１１）。試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離し、電気泳動によりニトロセルロース膜にブロットし、ウサギ抗Ｈｓｐ１５０（１：１０，０００希釈；Ｊｕｓｓｉ Ｊａｎｔｔｉ（ＶＴＴ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ヘルシンキ）から寄贈］抗体又はモノクローナルマウス抗ＧＦＰ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ペンツベルク、ドイツ）抗体とのインキュベーション、続いて、抗ウサギペルオキシダーゼ結合抗体（１：１０，０００、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による強化化学発光（ＥＣＬ）検出システムを使用した視覚化によって検出した。タンパク質分子質量を評価するために、タンパク質マーカー（ＥｘｃｅｌＢａｎｄ ３色の広範囲タンパク質マーカーＰＭ２７００、ＳＭＯＢｉＯ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、台湾、新竹）を使用した。
インベルターゼアッセイ
インベルターゼアッセイ
【0131】
インベルターゼ分泌を、以前に記載された要領で測定した（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ及びＬａｍｐｅｎ、１９７５）。インベルターゼアッセイのための細胞調製を、（Ｎｏｖｉｃｋ 及びＳｃｈｅｋｍａｎ、１９７９）記載の要領で行った。プロトコルを（Ｔｒｏｙ ＡＡ、２０１４）に基づいて最適化した。内部及び外部の活性を、５４０ｎｍでの吸収に基づいて単位で表した（１Ｕ＝１μｍｏｌグルコース放出／分／ＯＤ単位）。
単一分子ＦＩＳＨ
単一分子ＦＩＳＨ
【0132】
Ｓｅｃ６３－ＧＦＰを発現する酵母細胞を対数増殖中期まで増殖させ、低グルコース含有培地［０．１％グルコース］に１．５時間シフトして、ＳＵＣ２発現を誘導した。ホルムアルデヒド（最終濃度３．７％）を４５分間加えて、細胞を同じ培地に固定した。細胞を、１．２Ｍソルビトールを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４で２回穏やかに洗浄した後、細胞を１ｍｌの新しく調製したスフェロプラスト緩衝液［０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４、１．２Ｍソルビトール、２０ｍＭリボヌクレオシドバナジル錯体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ）、１×完全プロテアーゼ阻害剤カクテル、２８ｍＭβ－メルカプトエタノール、１２０Ｕ／ｍｌ ＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼ阻害剤、及びザイモラーゼ（１０ｋＵ／ｍｌ）］中、３０℃で３０分間スフェロプラスト化した。スフェロプラストを４℃、１３００×ｇで４分間遠心分離し、１．２Ｍソルビトールを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４で２回洗浄した。次にスフェロプラストを７０％エタノールに再懸濁し、４℃で１時間インキュベートした。その後、細胞を１３００×ｇ、４℃で４分間遠心分離し、ＷＡＳＨ緩衝液（０．３Ｍ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、及び１０％ホルムアミド）で洗浄し、０．３Ｍ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０％デキストラン硫酸、１０％ホルムアミド、２ｍＭリボヌクレオシドバナジル錯体、及びＳＵＣ２用のＴＡＭＲＡ標識Ｓｔｅｌｌａｒｉｓプローブミックス（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎｏｖａｔｏ、カリフォルニア）を含むハイブリダイゼーション混合物と、暗所において３０℃で一晩インキュベートした。。プローブのハイブリダイゼーション後、標識されたスフェロプラストを１３００×ｇで遠心分離し、ハイブリダイゼーション溶液を吸引し、スフェロプラストをＷＡＳＨ緩衝液中３０℃で３０分間インキュベートした。次に細胞を遠心分離し、０．３Ｍ塩化ナトリウムと３０ｍＭクエン酸ナトリウムを含む溶液に再懸濁した。ＥＲとのＳＵＣ２ ｍＲＮＡ共局在を、ＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎイメージングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ、イサクア、ワシントン、米国）を使用して視覚化した。画像をデコンボリューションによって処理した。
コンピュータ分析：
ＳＥＣＲｅＴＥスコアの計算
コンピュータ分析：
ＳＥＣＲｅＴＥスコアの計算
【0133】
ＳＥＣＲｅＴＥスコアの計算を、Ｐｅｒｌプログラミング言語を使用して実行した。モチーフ数を計算するために、ある特定のしきい値を超えるＮＮＹリピートの数を、３つの異なる位置（すなわち、ＹＮＮ、ＮＹＮ、ＮＮＹ、ここでＮは任意のヌクレオチドであり、Ｙはピリミジンである）についてカウントした。
遺伝子オントロジー
遺伝子オントロジー
【0134】
セクレトームの定義は（Ａｓｔら、２０１３）によるもので、この群には、ＴＭＤ及び／又はシグナル配列を含み、ミトコンドリアではないすべての遺伝子が含まれる。ＴＭＨＭＭツールを使用して、ＴＭＤ含有タンパク質を定義した。細胞壁と尾部アンカー型遺伝子を、ＵｎｉＰｒｏｔに従って定義した。（Ｊａｎら、２０１４）からのデータを使用して、他の遺伝子群を定義し、ヒトＧＯ用語を定義した。ＧＯ Ｓｌｉｍ Ｍａｐｐｅｒツール（ＳＧＤ）（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂｄｏｔｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅｄｏｔｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＧＯ／ｇｏＳｌｉｍＭａｐｐｅｒｄｏｔｐｌ）を使用して、ＥＲＴＭ１０－及びＥＲＴＭ１５－陽性遺伝子を分類した
並べ替え検定分析
並べ替え検定分析
【0135】
並べ替え分析では、各遺伝子配列をランダムに１０００回シャッフルし、シャッフルされた配列ごとにＳＥＣＲｅＴＥをスコア化した。ＳＥＣＲｅＴＥがランダムに出現する確率を評価するために、次の式に従って各遺伝子についてＺスコアを計算した：Ｚ＝（観測値－平均値）／ＳＴＤ。観測値は、遺伝子配列から測定された値である。（遺伝子のＳＥＣＲｅＴＥスコアなど）。平均値は、遺伝子のすべてのシャッフルされた配列についての平均ＳＥＣＲｅＴＥスコアである。ＳＴＤは、遺伝子のすべてのシャッフルされた配列からのＳＥＣＲｅＴＥスコアの標準偏差である。
細胞壁モチーフの同定
細胞壁モチーフの同定
【0136】
モチーフ検索を、ｍｅｍｅ－ｓｕｉｔｅｄｏｔｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｍｅｍｅにあるＭＥＭＥスーツ（Ｂａｉｌｅｙら、２００９）によって実行した。
結果
酵母セクレトームタンパク質をコードするｍＲＮＡにおけるピリミジンリピートモチーフの同定
結果
酵母セクレトームタンパク質をコードするｍＲＮＡにおけるピリミジンリピートモチーフの同定
【0137】
疎水性残基をコードするコドンは２番目の位置でピリミジンが豊富であるため（Ｐｒｉｌｕｓｋｙ及びＢｉｂｉ、２００９年）、本発明者らは、コーディング領域とＵＴＲ領域において３つのヌクレオチド（すなわち、ＹＮＮ、ＮＹＮ、又はＮＮＹ）ごとに連続したピリミジンリピートの存在について酵母でのセクレトームタンパク質をコードするｍＲＮＡを調べた。まず、本発明者らは、どれだけのピリミジンリピートが、非セクレトームタンパク質をコードするｍＲＮＡからセクレトームタンパク質をコードするｍＲＮＡを最もよく区別できるかを決定した。そのために、ｍＲＮＡ転写物に沿ったリピートの数を、定義されたしきい値（例、５、７、１０、１２、及び１５リピート）に従ってスコア化した。遺伝子長とリピートの存在との間に相関関係があるかどうかを決定するために、本発明者らはこれらの２つのパラメータを比較した（図１Ａ）。定義されたしきい値を使用した配列分析に基づいて、本発明者らは、これらのリピートを「分泌促進シス調節ターゲッティングエレメント」（ＳＥＣＲｅＴＥ）、いわゆるＳＥＣＲｅＴＥ５、７、１０、１２、及び１５として暫定的に定義した。示されているように（図１Ａ）、ＳＥＣＲｅＴＥ５とＳＥＣＲｅＴＥ７についてのＳＥＣＲｅＴＥ数と遺伝子長との間には直接的な相関関係が存在する。しかしながら、遺伝子長に対する依存性は、ＳＥＣＲｅＴＥ１０よりも大幅に低下している（図１Ａ）。これは、１０回以上の連続したリピートの存在がランダムな現象ではなく、重要であり得ることを意味する。
【0138】
１０を超えるＳＥＣＲｅＴＥリピート（ＳＥＣＲｅＴＥ１０など）がタンパク質分泌においてある役割を果たすならば、Ａｓｔらにしたがって定義されている（Ａｓｔら、２０１３）ところによると、セクレトームタンパク質をコードするｍＲＮＡがより多く存在すると予測され得る。この可能性を試験するために、本発明者らは完全な酵母ゲノムをセクレトーム及び非セクレトームの２つの群に分け、各群でＳＥＣＲｅＴＥを含む転写物の割合を計算した。本発明者は、非セクレトームタンパク質をコードする転写物とは対照的に、セクレトームタンパク質をコードする転写物が７より大のＳＥＣＲｅＴＥモチーフ（図１Ｂ）で濃縮されていることを発見した。セクレトームと非セクレトームの転写物の間における最も有意な分離をもたらすリピート数を試験するために、本発明者らは、受信者操作特性（ＲＯＣ）分析を使用してｍＳＭＰを分類する能力についての様々なしきい値を評価した（Ｈａｎｌｅｙ及びＭｃＮｅｉｌ、１９８２）。正真正銘のセクレトームタンパク質をコードする転写物を真陽性セットとして使用し、非セクレトームタンパク質をコードする転写物を真陰性として定義した。明らかに（図１Ｃ）、ＳＥＣＲｅＴＥ１０しきい値により、非セクレトーム転写物からセクレトーム転写物が最大限で区別された。ＳＥＣＲｅＴＥ１０は遺伝子長への依存性を示さず、セクレトームと非セクレトームの転写物間の最も有意な分離を示したため、本発明者らは、後続の分析でモチーフの存在を定義するためのしきい値としてそれを使用した。
ｍＳＭＰにおけるＳＥＣＲｅＴＥの存在量はＴＭＤの存在に左右されない
ｍＳＭＰにおけるＳＥＣＲｅＴＥの存在量はＴＭＤの存在に左右されない
【0139】
ｍＲＮＡ配列をコードするＴＭＤは、主にコドン（ＮＹＮ）の２番目の位置にあるウラシル（Ｕ）で濃縮されている（Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎら、１９７９；Ｐｒｉｌｕｓｋｙ及びＢｉｂｉ、２００９）。ほとんどのセクレトームタンパク質にはＴＭＤが含まれているため、それらの存在のみが、セクレトーム転写物におけるモチーフの濃縮の理由である可能性がある。ｍＳＭＰにおけるＳＥＣＲｅＴＥ濃縮が単にコード化されたＴＭＤの存在によるものではないかどうかを確認するために、本発明者らは、ピリミジン（Ｙ）がＳＥＣＲｅＴＥ１０エレメントにおいてトリプレットのどの位置：１番目（ＹＮＮ）、２番目（ＮＹＮ）又は３番目（ＮＮＹ）にあるかを決定した。本発明者らは、コーディング配列（すなわち、開始コドンから停止コドンまで）のみを使用して、ＵＴＲを使用せずに、ＳＥＣＲｅＴＥ１０の存在量を各位置について個別に計算した。シグナルは２番目の位置（図２Ａ；ＮＹＮ）に存在するが、予想どおり、コドンの３番目の位置（図２Ａ；ＮＮＹ）にも豊富である。後者の発見は、ＴＭＤがｍＳＭＰにおけるＳＥＣＲｅＴＥ濃縮に影響を与える唯一の要因ではない可能性があることを意味する。対照的に、ＳＥＣＲｅＴＥ１０エレメントは、１番目の位置ではあまり表示されていない（図２Ａ、ＹＮＮ）。
【0140】
次に、本発明者らは、ＴＭＤ含有タンパク質と可溶性分泌タンパク質を別々にコードするｍＲＮＡにＳＥＣＲｅＴＥ１０が存在するかどうかを確認した。予想通り、可溶性分泌タンパク質をコードする転写物より、ＴＭＤ含有セクレトームタンパク質をコードする多くの転写物が、２番目の位置（ＮＹＮ）にＳＥＣＲｅＴＥ１０を含んでいる（図２Ｂ）。しかしながら、３番目の位置（ＮＮＹ）における可溶性分泌タンパク質をコードするＳＥＣＲｅＴＥ１０含有転写物の割合はさらに高くなる。これは、コード化されたＴＭＤ領域とは無関係に、転写物におけるＳＥＣＲｅＴＥ１０濃縮についての説得力のある証拠を提供している。同様に、ＴＭＤが膜タンパク質をコードするｍＲＮＡの配列から人為的に削除された場合、セクレトーム遺伝子は２番目の位置ＳＥＣＲｅＴＥ１０（図２Ｃ；ＮＹＮ）で濃縮されなくなったが、３番目の位置でのＳＥＣＲｅＴＥ１０の濃縮は非常に高いままであった（図２Ｃ；ＮＮＹ）。
ＳＥＣＲｅＴＥの存在量はコドン組成に依存しない
ＳＥＣＲｅＴＥの存在量はコドン組成に依存しない
【0141】
ＳＥＣＲｅＴＥの濃縮は、転写物のコドン構成に起因する可能性がある。この可能性を確認するために、本発明者らは並べ替え検定分析を行った。この場合、各遺伝子配列はランダムに１０００回シャッフルされ、コドン組成は一定のままであった。次に、本発明者らは、各遺伝子についてのＳＥＣＲｅＴＥ１０のＺスコア（すなわち、平均値からの標準偏差の数）を計算して、シグナルがランダムに現れる確率を評価した。セクレトーム遺伝子及び非セクレトーム遺伝子におけるＺスコア分布を見ると、ｍＳＭＰでのＳＥＣＲｅＴＥの濃縮はランダムな現象ではなく、コドン組成に依存していないと結論付けることができる（図９Ａ）。この結論は、膜タンパク質と可溶性タンパク質の両方をコードするｍＳＭＰに当てはまる（図９Ｂ）。本発明者らはまた、各コドン位置について別々に分析を行った。そのために、本発明者らは、有意なＺスコア（≧１．９６）を有する遺伝子の割合を各位置について個別に計算した。有意なＺスコアを有する遺伝子の割合は、コドンの２番目と３番目の位置の両方で非セクレトーム遺伝子よりもセクレトーム遺伝子の方が大きい（図９Ｃ）ことから、ＳＥＣＲｅＴＥがそれらの位置で顕著に濃縮されているという概念が強化される。この調査結果はＴＭＤの存在に左右されない。これは、有意なＺスコアを有する遺伝子の割合が、可溶性及びＴＭＤ含有非セクレトーム転写物よりも、可溶性及びＴＭＤ含有の両セクレトーム転写物の方が大きかったためである（図９Ｄ）。
遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析
遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析
【0142】
ＳＥＣＲｅＴＥ含有遺伝子の集団で過剰に表現されているこれらの遺伝子カテゴリーを決定するために、遺伝子オントロジー（ＧＯ）エンリッチメント分析を行った。ＳＥＣＲｅＴＥ１０陽性遺伝子をＧＯエンリッチメントについて検索したとき（すべての酵母遺伝子をバックグラウンドとして使用）、当然のことながら、膜タンパク質の濃縮スコアが高いことが判明した（濃縮倍率＝１．６７）（図３Ａ）。最もＳＥＣＲｅＴＥに富む遺伝子カテゴリーは、細胞壁タンパク質を含むものであった（濃縮倍率＝１．８）（図３Ａ）。１５ ＮＮＹリピートがしきい値としての役割を果たしたとき、細胞壁タンパク質カテゴリーの濃縮倍率変化は４．８倍に増加した（図３Ｂ）。ＳＥＣＲｅＴＥで濃縮されたｍＲＮＡについてさらに特性確認するために、本発明者らは、セクレトーム及び非セクレトームを部分群に分け、各カテゴリーでＳＥＣＲｅＴＥ１０を含む転写物の割合を計算した。ＧＯ分析と一致することに、細胞壁タンパク質をコードするｍＲＮＡの９０％超がＳＥＣＲｅＴＥ１０エレメントを保有しており、細胞壁タンパク質にはＳＥＣＲｅＴＥが最も豊富に存在していた（図３Ｃ）。本発明者らは、ＴＭＤ及びシグナル配列（ＳＳ）領域の両方をコードするタンパク質のｍＲＮＡの８６％、並びにＴＭＤをコードするセクレトームｍＲＮＡの８４％にＳＥＣＲｅＴＥ１０が含まれていることを発見した（図３Ｃ）。これらのうち、尾部アンカー型（ＴＡ）タンパク質をコードするｍＲＮＡにおいては、セクレトームにＳＥＣＲｅＴＥ１０を含む転写物の数が最も少ない（図３Ｃ）。ＴＡタンパク質は、細胞質ゾルで翻訳された後、代替経路（ＧＥＴ）を介してＥＲに移行することが知られており（Ｓｈａｒｐ及びＬｉ、１９８７；Ｓｔｅｆａｎｏｖｉｃ及びＨｅｇｄｅ、２００７；Ｄｅｎｉｃ、２０１２）、それらの転写物はＥＲ膜では濃縮されていない（Ｊａｎら、２０１４；Ｃｈａｒｔｒｏｎら、２０１６）。これは、ＳＥＣＲｅＴＥがＥＲで翻訳を受けているｍＲＮＡにより多く含まれていることを意味し得る。対照的に、非セクレトームタンパク質（すなわち、ミトコンドリア及び細胞核）の転写産物は、ＳＥＣＲｅＴＥエレメントの存在量が最も少ない（図３Ｃ）。
【0143】
ＳＥＣＲｅＴＥは細胞壁タンパク質をコードするｍＲＮＡに非常に豊富に存在するため、本発明者らは、それが不偏モチーフ検索ツールを使用して発見され得るかどうかを知りたいと考えた。そのために、ＭＥＭＥを使用して細胞壁タンパク質のｍＲＮＡ配列を分析し、ｍＲＮＡモチーフを同定した。得られた最も重要な結果は、Ｕ又はＣを使用したＳＥＣＲｅＴＥ１０リピートと非常によく似ていた（図３Ｄ）。重要なことに、本発明者らは、このｍＲＮＡモチーフ内においてタンパク質モチーフを検出しなかったことから、ＳＥＣＲｅＴＥエレメントがタンパク質配列に依存している可能性が排除された。
ｍＳＭＰにおけるＳＥＣＲｅＴＥ濃縮は、原核生物と高等真核生物の両方で見られる
ｍＳＭＰにおけるＳＥＣＲｅＴＥ濃縮は、原核生物と高等真核生物の両方で見られる
【0144】
保存又は収斂進化は、重要性を強く示すものである。ｍＳＭＰにおけるＳＥＣＲｅＴＥ濃縮が高等生物及び下等生物（例えば、ヒト及び枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））で見られるかどうかを確認するために、本発明者らはこれらのゲノムを分析した。ヒトでは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと同様に、ＳＥＣＲｅＴＥ１０は、ＲＯＣ分析に基づくと、セクレトームタンパク質と非セクレトームタンパク質をコードするＲＮＡの間で最も顕著な分離を示した（図４Ａ）。ＳＥＣＲｅＴＥ１０が遺伝子長と相関しないことを確認した後、１０ ＮＮＹリピートがＳＥＣＲｅＴＥモチーフの存在を定義するためのしきい値としての役割を果たした。酵母と同様に、ＳＥＣＲｅＴＥは、非セクレトーム転写物と比較して、セクレトーム転写物の２番目と３番目のコドンの位置に豊富に存在する（図４Ｂ）。また、ＴＭＤを有するか又は欠いている非セクレトーム転写物と比較して、ＴＭＤを欠いている高い割合のセクレトーム転写物がＳＥＣＲｅＴＥを含んでいる（図４Ｃ）。興味深いことに、細胞壁タンパク質に相当するＧＰＩアンカー型タンパク質をコードする転写物では、ＳＥＣＲｅＴＥが高度に濃縮されていることが判明した。対照的に、尾部アンカー型遺伝子、並びにミトコンドリア及び細胞核の遺伝子は、酵母で見られるように、ＳＥＣＲｅＴＥの存在量が低くなっている（図４Ｄ）。多量のＳＥＣＲｅＴＥ１０が、非セクレトームタンパク質をコードする遺伝子と比較して、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのセクレトームタンパク質をコードする遺伝子で検出された（図４Ｅ）。
ＳＥＣＲｅＴＥにおける変異は内因性セクレトームタンパク質の分泌に影響を与える
ＳＥＣＲｅＴＥにおける変異は内因性セクレトームタンパク質の分泌に影響を与える
【0145】
ＳＥＣＲｅＴＥの重要性をさらに理解し、酵母細胞の生理機能に対するその重要性を検証するために、本発明者らは、選択された遺伝子におけるシグナルを上昇又は減少させることによってその関連性を調べた。３つの代表的な遺伝子を、それらの比較的短い遺伝子長、それらの欠失時に検出可能な表現型、及び様々な生理学的経路におけるそれらの機能に基づいて選択した。これらの遺伝子には、可溶性の分泌型ペリプラズム酵素をコードするＳＵＣ２、可溶性培地タンパク質をコードするＨＳＰ１５０、及びＧＰＩアンカー型細胞壁タンパク質をコードするＣＣＷ１２が含まれる。遺伝子の全体的なＳＥＣＲｅＴＥシグナルを、３番目のコドン位置にあるＡ又はＧをそれぞれＴ又はＣで置き換えることにより増加させ、それにより、遺伝子全体に沿ったＳＥＣＲｅＴＥの存在が濃縮された［（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ］。ＴをＡに、又はＣをＧに変換する逆の置換により、全体的なＳＥＣＲｅＴＥシグナルを減少させた［（－）ＳＥＣＲｅＴＥ］。重要なことに、これらの変更は、コード化されたアミノ酸配列に変更が加えられることなく、確実にｍＲＮＡ配列のＳＥＣＲｅＴＥ属性のみが変更されるように設計された。さらに、ｍＲＮＡ二次構造の安定性の変化は許容範囲内に保たれ、コドン適応指数（ＣＡＩ）は０．８～１．０の最適範囲内にとどまっていた（Ｓｈａｒｐ及びＬｉ、１９８７）。ＳＵＣ２、ＨＳＰ１５０、及びＣＣＷ１２におけるＳＥＣＲｅＴＥ変異について、図１０に示すように（Ａ～Ｃ、それぞれ上部と下部）、１ ＮＮＹリピート又は１０ ＮＮＹリピートのいずれかの最小しきい値を使用して、遺伝子長に沿って示す。
ＳＵＣ２におけるＳＥＣＲｅＴＥ変異により、インベルターゼ分泌が変化する
ＳＵＣ２におけるＳＥＣＲｅＴＥ変異により、インベルターゼ分泌が変化する
【0146】
ＳＵＣ２は、５’末端のみが異なる、短いものと長いものの２つの異なるｍＲＮＡから翻訳された異なる形態のインベルターゼをコードする。長い方のｍＲＮＡはシグナル配列を含む分泌タンパク質をコードするが、シグナル配列は細胞質タンパク質をコードする短いアイソフォームから省かれている。分泌されたＳｕｃ２発現はグルコース抑制を受ける。しかしながら、誘導条件下（すなわち、グルコース枯渇）では、Ｓｕｃ２は、分泌経路を通って細胞のペリプラズム空間に輸送される。そこで、Ｓｕｃ２はスクロースからグルコース及びフルクトースへの加水分解を触媒するが、この酵素活性は、酵母がスクロースを炭素源として利用する能力に関与しており、細胞の内側及び外側の両方で、生化学的アッセイ（すなわち、インベルターゼ活性）によって測定され得る。Ｓｕｃ２機能に対するＳＥＣＲｅＴＥ変異の影響について、落下試験によって変異体がスクロース含有培地で成長する能力を調べることにより試験した。興味深いことに、スクロースプレート上でのＳＵＣ２（－）ＳＥＣＲｅＴＥの成長率は低下しており、ＹＰＤプレートでは成長の変化は検出されなかったにもかかわらず、ＳＵＣ２（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ変異体はＷＴ細胞と比較してより良い成長を示した（図５Ａ）。これらの調査結果は、ＳＥＣＲｅＴＥ強度がＳｕｃ２の分泌に影響を与えることを示唆している。Ｓｕｃ２分泌のこれらの変化は、ＳＵＣ２転写、Ｓｕｃ２産生、及び／又は改変された分泌速度の変化に起因する可能性がある。可能性を区別するために、ＷＴ細胞、ｓｕｃ２Δ、及びＳＵＣ２ ＳＥＣＲｅＴＥ変異体をインベルターゼアッセイにかけた。インベルターゼアッセイは、スクロースから生成されるグルコースの量を計算することにより、分泌されたＳｕｃ２及び内部Ｓｕｃ２の定量を可能にする。予想通り、グルコース抑制条件下（例えば２％グルコース）では、分泌されたＳｕｃ２と内部Ｓｕｃ２の両方のレベルが非常に低かった。分泌された酵素の発現を促進するために、細胞を低グルコース（例えば、０．０５％グルコース）含有培地で培養すると、ＳＥＣＲｅＴＥの変化により、分泌されたＳｕｃ２レベルが変化した。落下試験の結果に対応することに、ＷＴ細胞と比較して、ＳＵＣ２（－）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞では分泌型インベルターゼの有意な減少が検出されたが、Ｓｕｃ２（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞では有意な増加が検出された。Ｓｕｃ２Δ細胞からのＳｕｃ２分泌は検出されなかった（図５Ｂ、分泌）。ＳＥＣＲｅＴＥ変異がＳｕｃ２分泌の効率に影響を与えるが、合成には影響しない場合、Ｓｕｃ２の蓄積がＳＵＣ２（－）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞で発生すると予想されることになる。同様に、内部インベルターゼの減少がＳＵＣ２（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞で生じると予想されることになる。しかしながら、Ｓｕｃ２（－）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞ではＳｕｃ２の内部量が減少し、Ｓｕｃ２（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞ではわずかに増加したため、これは当てはまらなかった（図５Ｂ、内部）。これらの所見は、ＳＵＣ２におけるＳＥＣＲｅＴＥの変更がタンパク質の産生に影響を与える可能性があることを示唆している。
ＳＥＣＲｅＴＥ変異はＨｓｐ１５０分泌と細胞壁安定性を変化させる
ＳＥＣＲｅＴＥ変異はＨｓｐ１５０分泌と細胞壁安定性を変化させる
【0147】
次に、本発明者らは、ＨＳＰ１５０におけるＳＥＣＲｅＴＥの重要性を研究することを望んだ。Ｈｓｐ１５０は外側細胞壁の構成成分であり、Ｈｓｐ１５０の正確な機能は不明であるが、細胞壁の安定性とカルコフロールホワイト（ＣＦＷ）やコンゴレッド（ＣＲ）などの細胞壁摂動剤に対する抵抗性が必要とされる。ｈｓｐ１５０Δ細胞は細胞壁ストレスに対する感受性が高いが、Ｈｓｐ１５０の過剰産生により細胞壁の完全性が高められる（Ｈｓｕら、２０１５）。Ｈｓｐ１５０は増殖培地に効率的に分泌され、その発現は熱ショックを与えられると増加する（Ｒｕｓｓｏら、１９９２、１９９３））。ＨＳＰ１５０におけるＳＥＣＲｅＴＥの変更の影響について、ＷＴ細胞及びｈｓｐ１５０Δ細胞との比較において、追加されたＣＦＷに対するＨＳＰ１５０（－）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞及びＨＳＰ１５０（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞の感受性を試験することによる落下試験で調べた。図５Ｃからわかるように、ＨＳＰ１５０（－）ＳＥＣＲｅＴＥ株はＷＴ細胞と比較してＣＦＷに対し高い感受性を示したが、ＨＳＰ１５０（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ株はＣＦＷに対し高い抵抗性を示した。予想通り、ｈｓｐ１５０Δ細胞はＣＦＷに最も影響を受けやすい（図５Ｃ）。ＨＳＰ１５０株はまた、変異タンパク質のレベルを測定するためにウエスタンブロット分析に供された。ＨＳＰ１５０の分泌は熱ショックで上昇するため（Ｒｕｓｓｏら、１９９２、１９９３）、タンパク質抽出前に細胞を３７℃で培養した。成長培地と細胞の両方からタンパク質を抽出し、それぞれ外部と内部のタンパク質レベルを検出した。培地に分泌されたＨｓｐ１５０の量は、ＷＴ細胞と比較して、ＨＳＰ１５０（－）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞では減少し、ＨＳＰ１５０（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞では上昇していた（図５Ｄ）。Ｓｕｃ２と同様に、Ｈｓｐ１５０の内部量は、ＷＴ細胞と比較して、ＨＳＰ１５０（－）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞でも減少していた（図５Ｄ）。これは、ＳＥＣＲｅＴＥ強度の低下によって分泌自体が大幅に弱められたわけではないことを意味し得る。ＨＳＰ１５０（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞におけるＨｓｐ１５０の内部量はＷＴ細胞のそれに類似していたため、ＨＳＰ１５０におけるＳＥＣＲｅＴＥの改変もタンパク質産生に影響を与える可能性が高いと結論付けることができる。
ＣＣＷ１２におけるＳＥＣＲｅＴＥ変異は細胞壁の安定性を変える
ＣＣＷ１２におけるＳＥＣＲｅＴＥ変異は細胞壁の安定性を変える
【0148】
ＣＣＷ１２は、新たに合成された細胞壁の領域に局在し、出芽やシュムー形成中に壁の安定性を維持するグリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型細胞壁タンパク質をコード化する。ＣＣＷ１２の欠失は、ハイグロマイシンＢ（ＨＢ）などの細胞壁不安定化剤に対する過剰な感受性を引き起こすことが示された（Ｒａｇｎｉら、２００７、２０１１）。ＣＣＷ１２ではＳＥＣＲｅＴＥスコアが非常に高いため、信号をさらに増やすことは不可能であった。したがって、本発明者らは、ＣＣＷ１２（－）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞のみを生成し、ＨＢ含有プレートで増殖するそれらの能力について試験した。ＨＳＰ１５０（－）ＳＥＣＲｅＴＥで見られるように（図５Ｃ）、ＣＣＷ１２（－）ＳＥＣＲｅＴＥ変異は、ＷＴ細胞と比較して（図５Ｅ）、細胞の細胞壁摂動に対する感受性を高めることがわかった。
ＳＥＣＲｅＴＥ添加は外因性ナイーブタンパク質の分泌に影響を与える
ＳＥＣＲｅＴＥ添加は外因性ナイーブタンパク質の分泌に影響を与える
【0149】
ＳＥＣＲｅＴＥの添加により外因性タンパク質の分泌を改善させ得ることは、その重要性の実質的な証拠となるだけでなく、タンパク質配列を変更せずに組換えタンパク質の分泌を改善するための有用な低コストの産業用ツールをもたらす可能性がある。それを試験するために、本発明者らは、５’末端にコードされたＧａｓ１のＳＳ（ＳＳＧａｓ１）を有するＧＦＰ転写物構築物を使用した。ＳＳＧａｓＩは、培地へのＧＦＰタンパク質の分泌を可能にするが、その分泌はＳＳＫａｒ２などの他のＳＳ融合ＧＦＰタンパク質と比較して効率的ではなかった（図５Ｆ）。ＳＳＧａｓ１の分泌を潜在的に改善するために、本発明者らは、ＳＥＣＲｅＴＥを含むＧａｓ１の改変された３’ＵＴＲ配列を付加した［すなわち、ここで、すべてのＡとＧがそれぞれＴとＣに置き換えられた；ＳＳＧａｓＩ－３’ＵＴＲＧＡＳＩ（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ］。次に、本発明者らは、ＧＦＰの培地への分泌に対するＳＥＣＲｅＴＥ添加の影響を試験した。本発明者らは、ＧａｓＩ－ＧＦＰの３’ＵＴＲにＳＥＣＲｅＴＥを付加すると、ＳＳＧａｓＩ－ＧＦＰと比較して、培地へのＧＦＰ分泌が改善され、ＳＳＫａｒ２－ＧＦＰの場合と同様であることを見出した（図５Ｆ）。
ｍＲＮＡレベルに対するＳＥＣＲｅＴＥ変異の影響
ｍＲＮＡレベルに対するＳＥＣＲｅＴＥ変異の影響
【0150】
タンパク質レベルは（－）ＳＥＣＲｅＴＥ及び（＋）ＳＥＣＲｅＴＥの変異によって改変され得るため（図５Ｂ、Ｄ、及びＦ）、本発明者らは、遺伝子転写又はｍＲＮＡ安定性の変化が関与するかどうかを調べた。ＳＵＣ２、ＨＳＰ１５０、及びＣＣＷ１２のｍＲＮＡレベルがＳＥＣＲｅＴＥ強度による影響を受けるかどうかを確認するために、定量的リアルタイム（ｑＲＴ）ＰＣＲが採用された。ＳＵＣ２（－）ＳＥＣＲｅＴＥ ｍＲＮＡレベルはＳＵＣ２ ＷＴ細胞よりもほぼ３０％低く、ＳＵＣ２（＋）ＥＲＴＭレベルはＷＴよりも約５０％高いことがわかった（図Ｓ３Ａ）。ｍＲＮＡレベルのこの変化は、ＳＵＣ２（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ変異体がタンパク質産生を増加させ、したがって、スクロース含有培地でよりよく成長することができる原因であり得る（図５Ａ、Ｂ）。
【0151】
ＳＥＣＲｅＴＥ変異がＨＳＰ１５０ ｍＲＮＡレベルに及ぼす影響も調べた。興味深いことに、ＨＳＰ１５０（－）ＳＥＣＲｅＴＥのｍＲＮＡレベルはＷＴに類似しているが、ＨＳＰ１５０（＋）ＳＥＣＲｅＴＥのｍＲＮＡレベルはわずかに低下していることがわかった（図１１Ｂ）。したがって、ＳＥＣＲｅＴＥの改変によるＨｓｐ１５０タンパク質レベルとＣＦＷに対する感受性の変化は（図５Ｃ及びＤ）、ｍＲＮＡレベルの変化によって説明されない。同様に、ＣＣＷ１２（－）ＳＥＣＲｅＴＥにおけるＳＥＣＲｅＴＥの変異は、そのｍＲＮＡレベルに有意な変化を引き起こさなかった（図１１Ｃ）。したがって、ＣＣＷ１２（－）ＳＥＣＲｅＴＥのＨＢに対する感受性の増加（図５Ｅ）は、ＣＣＷ１２ ｍＲＮＡの減少によるものではない。
ＳＥＣＲｅＴＥ変異がＳＵＣ２ ｍＲＮＡの局在に及ぼす影響
ＳＥＣＲｅＴＥ変異がＳＵＣ２ ｍＲＮＡの局在に及ぼす影響
【0152】
ＳＥＣＲｅＴＥがｍＲＮＡの局在性を決定する役割を有するかどうかを試験するために、本発明者らは、特定の蛍光プローブを使用して単一分子ＦＩＳＨ（ｓｍＦＩＳＨ）によってＳＵＣ２ ｍＲＮＡを視覚化し、ＥＲとのＳＵＣ２ ｍＲＮＡ共局在のレベルに対するＳＥＣＲｅＴＥ改変の影響を試験した。本発明者らは、Ｓｅｃ６３－ＧＦＰをＥＲマーカーとして使用し、ＥＲと共局在又は非共局在するか、ＥＲに隣接していた１細胞あたりの顆粒のパーセンテージを計算した。ＳＵＣ２（－）ＳＥＣＲｅＴＥ ｍＲＮＡ顆粒とＳｅｃ６３－ＧＦＰとの間における共局在のレベルは、ＷＴ ＳＵＣ２ ｍＲＮＡ顆粒と比較してわずかに減少していることがわかった（図６Ａ及びＢ）。対照的に、ＷＴ ＳＵＣ２ ｍＲＮＡと比較して、ＳＵＣ２（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ ｍＲＮＡ顆粒とＥＲの共局在のレベルで、約５０％の有意な増加が観察された（図６Ａ及びＢ）。これらの調査結果は、ＳＥＣＲｅＴＥがＳＵＣ２ ｍＲＮＡのＥＲへのターゲティングにおいて役割を演じることを示唆している。
潜在的なＳＥＣＲｅＴＥ結合タンパク質の同定
潜在的なＳＥＣＲｅＴＥ結合タンパク質の同定
【0153】
ＳＥＣＲｅＴＥの役割をさらに解明するには、その結合パートナー、おそらくＲＢＰを特定することが不可欠である。以前は、酵母において４０を超える既知ＲＢＰに結合しているｍＲＮＡを同定するために大規模なアプローチが使用されていた（Ｃｏｌｏｍｉｎａら、２００８；Ｈａｓｅｇａｗａら、２００８；Ｈｏｇａｎら、２００８）。潜在的なＳＥＣＲｅＴＥ結合タンパク質（ＳＢＰ）のリストを取得するために、本発明者らは、ＳＥＣＲｅＴＥで高度に濃縮されたｍＲＮＡに結合するＲＢＰのデータセットを検索した。各ＲＢＰについて、本発明者らは、ＳＥＣＲｅＴＥ１０を含む結合された転写物の割合を計算した。ＳＥＣＲｅＴＥ１０含有ｍＲＮＡの大部分に結合することがわかっているＲＢＰには、Ｂｆｒ１、Ｗｈｉ３、Ｐｕｆ１、Ｐｕｆ２、Ｓｃｐ１６０、及びＫｈｄ１（図７Ａ）が含まれ、すべてｍＳＭＰに結合することが以前に示されていた。どの候補がＳＥＣＲｅＴＥに結合するかを試験するために、ＷＴ又はＨＳＰ１５０（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞のいずれかで、これらのＲＢＰにおける各遺伝子を欠失させた。本発明者らは、真正ＳＢＰの欠失によりＣＦＷに対する感受性が付与され得、ＣＦＷ含有プレートで観察されたＷＴとＨＳＰ１５０（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ細胞との間における成長率の違いが排除され得ると仮定した（図５Ｃ）。ＰＵＦ１、ＰＵＦ２、又はＳＨＥ２が欠失された場合、ＨＳＰ１５０（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ株は、ＷＴ細胞よりもＣＦＷに対してさらに高い抵抗性を示すことがわかった（図１２）。この効果の欠如の１つの考えられる説明は、これらのＲＢＰがＨＳＰ１５０を結合しないか、他のＳＢＰで冗長化していることである。しかしながら、ＷＨＩ３又はＫＨＤ１のいずれかの欠失により、ＣＦＷ含有プレート上のＷＴとＨＳＰ１５０（＋）ＳＥＣＲｅＴＥ株の差異が排除されることがわかった（図７Ｂ）。これは、Ｗｈｉ３とＫｈｄ１が、ＨＳＰ１５０ ｍＲＮＡとおそらく他のセクレトームｍＲＮＡに結合し、ＷＴ細胞単独でさえ、それらの非存在下ではＣＦＷに対してより高い感受性を示したことを示唆している（図７Ｂ）。
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【0154】
本発明をその特定の実施形態に関連させて説明してきたが、多くの代替、修正及び変形が当業者に明らかであることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神及び広い範囲内にあるそのようなすべての代替、修正、及び変形を包含するものとする。
【0155】
この明細書で言及されているすべての出版物、特許、及び特許出願は、個々の出版物、特許、又は特許出願が参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、本出願における参考文献の引用又は特定は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。節の見出しが使用されている限りにおいて、それらは必ずしも限定的であると解釈されるべきではない。
【0156】
さらに、この出願の優先権書類は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【配列表】