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特開2024-3791エリスリトール資化能欠損変異トリコデルマ属菌、及びこれを用いた目的物質の製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024003791
(43)【公開日】2024-01-15
(54)【発明の名称】エリスリトール資化能欠損変異トリコデルマ属菌、及びこれを用いた目的物質の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/15 20060101AFI20240105BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240105BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20240105BHJP
【ＦＩ】
C12N1/15 ZNA
C12P21/02 C
C12N15/31
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023104612
(22)【出願日】2023-06-27
(31)【優先権主張番号】P 2022102704
(32)【優先日】2022-06-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】一瀬 桜子
(72)【発明者】
【氏名】柴田 望
(72)【発明者】
【氏名】高橋 史員
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA05
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA20
4B065AA70X
4B065AA70Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BB06
4B065BB40
4B065CA24
(57)【要約】
【課題】エリスリトール資化能欠損変異トリコデルマ属菌、及び当該変異トリコデルマ属菌を用いた目的物質の製造。
【解決手段】エリスリトール資化能が低下又は消失した変異トリコデルマ属菌であって、下記（Ａ）～（Ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドの発現が低下又は消失しており：（Ａ）配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；（Ｂ）配列番号４のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；（Ｃ）配列番号６のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び、（Ｄ）配列番号８のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、かつ、目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に連結されたエリスリトール誘導性プロモーターを導入されている、
変異トリコデルマ属菌。
【選択図】なし
【解決手段】エリスリトール資化能が低下又は消失した変異トリコデルマ属菌であって、下記（Ａ）～（Ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドの発現が低下又は消失しており：（Ａ）配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；（Ｂ）配列番号４のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；（Ｃ）配列番号６のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び、（Ｄ）配列番号８のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、かつ、目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に連結されたエリスリトール誘導性プロモーターを導入されている、
変異トリコデルマ属菌。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
エリスリトール資化能が低下又は消失した変異トリコデルマ属菌であって、
下記（Ａ）～（Ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドの発現が低下又は消失しており：
（Ａ）配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｂ）配列番号４のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｃ）配列番号６のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
（Ｄ）配列番号８のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
かつ、目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に連結されたエリスリトール誘導性プロモーターを導入されている、
変異トリコデルマ属菌。
下記（Ａ）～（Ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドの発現が低下又は消失しており：
（Ａ）配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｂ）配列番号４のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｃ）配列番号６のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
（Ｄ）配列番号８のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
かつ、目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に連結されたエリスリトール誘導性プロモーターを導入されている、
変異トリコデルマ属菌。
【請求項2】
下記（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が低下又は消失している、請求項１記載の変異トリコデルマ属菌：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号３のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子；
（ｃ）配列番号５のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子；及び
（ｄ）配列番号７のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子。
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号３のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子；
（ｃ）配列番号５のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子；及び
（ｄ）配列番号７のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子。
【請求項3】
エリスリトール資化能が親トリコデルマ属菌と比べて５０％以下に低下している、請求項１又は２記載の変異トリコデルマ属菌。
【請求項4】
前記トリコデルマ属菌がトリコデルマ・リーセイ又はその変異株である、請求項１～３のいずれか１項記載の変異トリコデルマ属菌。
【請求項5】
前記エリスリトール誘導性プロモーターが、下記（i）及び（ii）から選択されるＤＮＡからなる、請求項１～４のいずれか１項載の変異トリコデルマ属菌：
（i）配列番号１３～１６のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；及び
（ii）配列番号１３～１６のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
（i）配列番号１３～１６のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；及び
（ii）配列番号１３～１６のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項記載の変異トリコデルマ属菌を、エリスリトールを含有する培地で培養すること；及び
該培養で得られた培養物から目的物質を回収すること、
を含む、目的物質の製造方法。
該培養で得られた培養物から目的物質を回収すること、
を含む、目的物質の製造方法。
【請求項7】
前記培地が初期濃度０．００１～１０％（ｗ／ｖ）のエリスリトールを含有する、請求項６記載の方法。
【請求項8】
前記培地に含まれる炭素源がセルラーゼ非誘導性炭素源である、請求項６又は７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、エリスリトール資化能欠損変異トリコデルマ属菌、及びこれを用いた目的物質の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
トリコデルマ属菌は、セルラーゼ、キシラナーゼなどの酵素を多量に生産することができ、セルロース分解酵素生産用微生物として以前より注目されてきた（非特許文献１）。例えば、トリコデルマ・リーセイは、タンパク質生産能力が高く、ヒトや他の微生物由来の異種タンパク質の生産への利用が期待される（非特許文献２を参照）。
【0003】
微生物を用いて目的タンパク質を工業生産する際には、グルコースやセルロースなどの炭素源を多量に使用する。一方、高濃度の炭素源存在条件下では菌は浸透圧ストレスを受け、その結果タンパク質生産性を低下させる（非特許文献３）。浸透圧ストレスによる目的物質生産性の低下を防ぐために、培養中における菌の浸透圧ストレスを低減させることが望まれる。酵母及び糸状菌アスペルギルス・ニデュランスでは、浸透圧ストレスを受けると細胞内でグリセロールやエリスリトールなどの糖アルコールを生成して菌細胞の浸透圧耐性を高め、浸透圧ストレスを回避することが報告されている（非特許文献４、５）。
【0004】
トリコデルマ・リーセイを用いてセルロース系原料からエリスリトールを生産する検討が従来行われている（非特許文献６）。一方で、トリコデルマ・リーセイがエリスリトールを資化し、かつその資化速度はグルコースと同等以上であることが報告されている（非特許文献７）。トリコデルマ属菌のエリスリトール資化経路は未解明であるが、本発明者らは、トリコデルマ属菌で働くエリスリトール誘導性プロモーターを発見した（特許文献１）。トリコデルマ属菌では、生産されたエリスリトールは再度資化され、細胞内にはエリスリトールは長時間保持されないと考えられる。実際、先行文献中においてもトリコデルマ・リーセイは数ｍｇ／Ｌ程度のエリスリトール生産しか達成できていない（非特許文献６）。特許文献２には、エリスリトール合成のための改変微生物において、トリコデルマ・リーセイのエリスルロースキナーゼ（配列番号１９）、エリスリトールイソメラーゼ１及び２（配列番号２３及び２５）などをコードする遺伝子を不活性化させることが好ましいことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特願２０２１－１７８７７８
【特許文献2】欧州特許出願公開第３９２９２９９号
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】化学と生物, 2012, 50(8):592-599, 2012
【非特許文献2】Appl Biochem Biotechnol, 2011, 165(5-6):1169-1177
【非特許文献3】Fungal Biol, 2010, 114(10):855-862
【非特許文献4】日本醸造協会誌, 2010, 105(10):618-627
【非特許文献5】J Bacteriol, 1986, 168(3):1358-1365
【非特許文献6】AMB Express, 2014, 4:34
【非特許文献7】Appl Environ Microbiol, 2006, 72(3):2126-2133
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
非特許文献４、５に記載される酵母及びアスペルギルスのように、トリコデルマ属菌においても細胞内にエリスリトールを効率的に蓄積させることができれば、培地中の炭素源に起因する菌細胞への浸透圧ストレスを低減でき、浸透圧ストレスによる目的物質の生産性低下を改善できると期待される。さらに、本発明者らは以前に、トリコデルマ属菌で働くエリスリトール誘導性プロモーターを発見し、また当該プロモーターが、トリコデルマ属菌のセルラーゼ発現プロセスを促進することなく目的物質の遺伝子の発現を誘導できるので、目的物質をより高純度で生産することを可能にすることを見出した（特許文献１）。当該エリスリトール誘導性プロモーターを用いた目的物質の生産においても、目的物質の発現を効率的に誘導するために、宿主トリコデルマ属菌にエリスリトールを蓄積させることが望ましい。
【0008】
本発明は、エリスリトール資化能欠損変異トリコデルマ属菌、及び当該変異トリコデルマ属菌を用いた目的物質の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0009】
一態様において、本発明は、エリスリトール資化能が低下又は消失した変異トリコデルマ属菌であって、下記（Ａ）～（Ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドの発現が低下又は消失しており：
（Ａ）配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｂ）配列番号４のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｃ）配列番号６のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
（Ｄ）配列番号８のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
かつ、目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に連結されたエリスリトール誘導性プロモーターを導入されている、
変異トリコデルマ属菌、
を提供する。
別の一態様において、本発明は、前記変異トリコデルマ属菌を用いた目的物質の製造方法を提供する。
（Ａ）配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｂ）配列番号４のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｃ）配列番号６のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
（Ｄ）配列番号８のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
かつ、目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に連結されたエリスリトール誘導性プロモーターを導入されている、
変異トリコデルマ属菌、
を提供する。
別の一態様において、本発明は、前記変異トリコデルマ属菌を用いた目的物質の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【0010】
本発明により提供されるエリスリトール資化能欠損変異トリコデルマ属菌は、培養培地中の炭素源による浸透圧ストレスに対する耐性が向上しており、さらに、細胞内にエリスリトールをより高濃度で蓄積することができるので、エリスリトール誘導性プロモーターを用いた目的物質の製造に有利である。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】エリスリトール、グルコース又はソルビトール添加後の遺伝子の相対発現量。（Ａ）１２２０７９遺伝子、（Ｂ）６８４６６遺伝子、（Ｃ）６８６０６遺伝子、（Ｄ）６８５８５遺伝子。０ｈ：添加直後、２ｈ：添加２時間後。
【図2】１２２０７９遺伝子、６８４６６遺伝子、６８６０６遺伝子、及び６８５８５遺伝子欠損トリコデルマ属変異株の培養物に対するエリスリトール添加後における培養上清中エリスリトール濃度。
【図3】１２２０７９遺伝子、６８４６６遺伝子、６８６０６遺伝子、及び６８５８５遺伝子欠損トリコデルマ属変異株における細胞内へのエリスリトール蓄積による１２２０７９遺伝子の発現量への影響。
【図4】１２２０７９遺伝子、６８４６６遺伝子、６８６０６遺伝子、及び６８５８５遺伝子欠損トリコデルマ属変異株における細胞内へのエリスリトール蓄積による６８４６６遺伝子の発現量への影響。
【図5】１２２０７９遺伝子、６８４６６遺伝子、６８６０６遺伝子、及び６８５８５遺伝子欠損トリコデルマ属変異株における細胞内へのエリスリトール蓄積による６８６０６遺伝子の発現量への影響。
【図6】１２２０７９遺伝子、６８４６６遺伝子、６８６０６遺伝子、及び６８５８５遺伝子欠損トリコデルマ属変異株における細胞内へのエリスリトール蓄積による６８５８５遺伝子の発現量への影響。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
【0013】
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹ Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【0014】
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の同一性をいう。
【0015】
本明細書における「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列」とは、好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１個又は２個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列をいう。本明細書において、アミノ酸残基の「付加」には、配列の一末端及び両末端へのアミノ酸残基の付加が含まれる。本明細書における「１又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列」とは、好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列をいう。本明細書において、ヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端へのヌクレオチドの付加が含まれる。
【0016】
本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、遺伝子の「上流配列」「下流配列」とは、それぞれＤＮＡセンス鎖において該遺伝子の５'側及び３'側に位置する配列をいう。例えば、「遺伝子の上流に連結されたプロモーター」とは、ＤＮＡセンス鎖において遺伝子の５'側にプロモーターが存在することを意味する。
【0017】
本明細書において、遺伝子と、プロモーター等の制御領域との「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
【0018】
本明細書において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞に元から存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」ヌクレオチド又はＤＮＡとは、細胞に外部から導入されたヌクレオチド又はＤＮＡである。外来ヌクレオチド又はＤＮＡは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種ヌクレオチド又は異種ＤＮＡ）であってもよい。
【0019】
本明細書において、「エリスリトール資化関連遺伝子」とは、その発現が低下又は消失することで、トリコデルマ属菌細胞のエリスリトール資化能が低下又は消失する遺伝子として定義される。トリコデルマ属菌のエリスリトール資化能は、例えば以下の方法により測定することができる：エリスリトールを単一炭素源として含む培地でトリコデルマ属菌を培養し、該菌の生育速度を測定すること；エリスリトールを含む培地でトリコデルマ属菌を培養しながら、適時培地中のエリスリトール濃度を測定して、該菌へのエリスリトールの取り込み速度を求めること、エリスリトールを含む培地でトリコデルマ属菌を所定の時間培養した後、菌体内のエリスリトール量を測定して、菌に取り込まれたエリスリトールが別の物質に代謝されずにエリスリトールとして蓄積する量を求めること、など。
【0020】
本明細書において、「プロモーター活性」とは、ＤＮＡ（遺伝子）のｍＲＮＡへの転写を促進する活性を意味する。プロモーター活性は、適当なレポーター遺伝子を用いることにより確認することができる。例えば、プロモーターの下流に検出可能なタンパク質をコードするＤＮＡ、すなわち、レポーター遺伝子を連結し、そのレポーター遺伝子の遺伝子産物の生産量を測定することにより、プロモーター活性を確認可能である。レポーター遺伝子の例としては、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）遺伝子、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β－ラクタマーゼ遺伝子、ＥｔｂＣ（２，３－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｅｎｅ １，２－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子等の発色基質に対して作用する酵素の遺伝子や、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子等の蛍光タンパク質の遺伝子、などが挙げられる。あるいは、プロモーター活性は、レポーター遺伝子から転写されたｍＲＮＡの発現量をシークエンシング、定量ＲＴ－ＰＣＲ等で測定することによっても確認することができる。
【0021】
本明細書において、「エリスリトール誘導性プロモーター」とは、エリスリトール存在下でプロモーター活性を有するプロモーターをいい、好ましくは、エリスリトール存在下で、エリスリトール非存在下、又はセルロース、グルコースもしくはソルビトール存在下の場合の４０倍以上、好ましくは５０倍以上、より好ましくは１００倍以上、標的遺伝子（すなわち該プロモーターが作動可能に連結した遺伝子）のｍＲＮＡの発現を誘導することができるプロモーターをいう。
【0022】
本発明者らは、トリコデルマ属菌から、エリスリトール非添加条件下ではほとんど発現せず、エリスリトール添加条件下において著しく発現が向上する遺伝子を特定した。これらの遺伝子を欠失させた菌株では、細胞内にエリスリトールが蓄積した。これらの遺伝子は、トリコデルマ属菌のエリスリトール資化に関わる遺伝子であると推定される。トリコデルマ属菌を用いた目的物質の生産において、上記のエリスリトール資化関連遺伝子を欠失させた変異トリコデルマ属菌をエリスリトール含有培地で培養して、細胞内にエリスリトールを蓄積させれば、培地中の炭素源に起因する浸透圧ストレスを低減することができ、浸透圧ストレスによるトリコデルマ属菌における目的物質の生産性低下を改善することができる。
【0023】
また、トリコデルマ属菌などの糸状菌を用いた目的物質の生産においては、細胞本来のセルラーゼ生産プロセスを促進することなく、目的物質を生産することが望まれる。本発明者らは以前に、トリコデルマ属菌で働くエリスリトール誘導性プロモーターを発見した（特許文献１）。エリスリトールは、トリコデルマ属菌細胞が本来有するセルロース系バイオマス分解酵素の発現を誘導しない（特許文献１の実施例を参照）。上記のエリスリトール資化関連遺伝子を欠失させた変異トリコデルマ属菌に、該エリスリトール誘導性プロモーターと作動可能に連結させた目的遺伝子を導入し、これをエリスリトール含有培地で培養すれば、細胞内に蓄積したエリスリトールが、細胞本来のセルラーゼ発現誘導プロセスを促進することなく、該エリスリトール誘導性プロモーターを介して目的遺伝子の発現を選択的に誘導することを可能にする。したがって、本発明は、トリコデルマ属菌において目的物質をより高純度かつ高収量で生産することを可能にする。
【0024】
本発明は、エリスリトール資化能欠損変異トリコデルマ属菌を提供する。本発明のエリスリトール資化能欠損変異トリコデルマ属菌（以下、単に「本発明の変異トリコデルマ属菌」とも称する）は、エリスリトール資化能が低下又は消失するように改変されたトリコデルマ属菌である。本発明の変異トリコデルマ属菌は、エリスリトール資化能（トリコデルマ属菌を培養する培地にエリスリトールを添加した２時間後の、該培地中におけるＨＰＬＣで測定したエリスリトール残存量に基づいて算出されるエリスリトール減少率）が、親トリコデルマ属菌（該エリスリトール資化能が欠損する改変をされる前のトリコデルマ属菌）と比べて、好ましくは５０％以下、より好ましくは７０％以下、さらに好ましくは９０％以下に低下している。
【0025】
好ましい一実施形態において、本発明の変異トリコデルマ属菌は、エリスリトール資化に関連するポリペプチドの発現が低下又は消失するように改変された変異トリコデルマ属菌である。別の好ましい一実施形態において、本発明の変異トリコデルマ属菌は、エリスリトール資化に関連する遺伝子の発現が低下又は消失するように改変された変異トリコデルマ属菌である。後述の実施例１に示すとおり、トリコデルマ属菌におけるエリスリトール資化関連遺伝子として以下の遺伝子が特定された。また、以下の遺伝子にコードされるポリペプチドは、トリコデルマ属菌におけるエリスリトール資化に関連するポリペプチドである。なお本明細書におけるトリコデルマ属菌の遺伝子の名称は、Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｆｕｎｇｉデータベース（fungi.ensembl.org/Trichoderma_reesei/Info/Index/）に従って特定されている。
GENE ID SEQ ID:No 推定機能
GENE PEPTIDE
TRIREDRAFT_122079 １ ２ predicted_protein
TRIREDRAFT_68466 ３ ４ glycerone_kinase
TRIREDRAFT_68606 ５ ６ triose-phosphate_isomerase
TRIREDRAFT_68585 ７ ８ galactose-6-phosphate_isomerase
GENE ID SEQ ID:No 推定機能
GENE PEPTIDE
TRIREDRAFT_122079 １ ２ predicted_protein
TRIREDRAFT_68466 ３ ４ glycerone_kinase
TRIREDRAFT_68606 ５ ６ triose-phosphate_isomerase
TRIREDRAFT_68585 ７ ８ galactose-6-phosphate_isomerase
【0026】
したがって、本発明の変異トリコデルマ属菌において発現が低下又は消失しているエリスリトール資化に関連するポリペプチドの例としては、下記（Ａ）～（Ｄ）が挙げられる：
（Ａ）配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｂ）配列番号４のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｃ）配列番号６のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
（Ｄ）配列番号８のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドの例としては、それぞれ、配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
（Ａ）配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｂ）配列番号４のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｃ）配列番号６のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
（Ｄ）配列番号８のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドの例としては、それぞれ、配列番号２、４、６又は８のアミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
【0027】
また本発明の変異トリコデルマ属菌において発現が低下又は消失しているエリスリトール資化関連遺伝子の例としては、下記（ａ）～（ｄ）が挙げられる：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号３のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子；
（ｃ）配列番号５のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子；及び、
（ｄ）配列番号７のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子。
配列番号１、３、５又は７のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子の例としては、それぞれ、配列番号１、３、５又は７のヌクレオチド配列に対して１又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなる遺伝子が挙げられる。
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号３のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子；
（ｃ）配列番号５のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子；及び、
（ｄ）配列番号７のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子。
配列番号１、３、５又は７のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子の例としては、それぞれ、配列番号１、３、５又は７のヌクレオチド配列に対して１又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなる遺伝子が挙げられる。
【0028】
一実施形態において、本発明の変異トリコデルマ属菌においては、前記（Ａ）～（Ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドの発現が低下又は消失していればよい。別の一実施形態において、本発明の変異トリコデルマ属菌においては、前記（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が低下又は消失していればよい。一実施形態において、本発明の変異トリコデルマ属菌は、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子の発現量が、親トリコデルマ属菌と比べて、好ましくは５０％以下、より好ましくは７０％以下、さらに好ましくは９０％以下に低下している。遺伝子の発現量は、リアルタイムＰＣＲによって定量することができる。
【0029】
本発明の変異トリコデルマ属菌の親トリコデルマ属菌の例としては、トリコデルマ・リーセイ、トリコデルマ・ロンジブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・ハリジアウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ヴィリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）などが挙げられ、好ましくはトリコデルマ・リーセイ及びその変異株が挙げられる。例えば、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株及びその変異株、好ましくは、トリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７株（ＡＴＣＣ６６５８９）、トリコデルマ・リーセイＰＣＤ－１０株（ＦＥＲＭ Ｐ－８１７２）、トリコデルマ・リーセイＥ１ＡＢ１株（ＪＮ１３株という場合もある）又はそれらの変異株などを、親トリコデルマ属菌として好ましく用いることができる。Ｅ１ＡＢ１株は、トリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７株に対し、ｅｇｌ１プロモーターを用いてアスペルギルス・アキュリータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）由来のβ－グルコシダーゼ（ＢＧＬ）を発現させた株である（Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１６，８２：８９－９５、及びＷＯ２０１３／１１５３０５の実施例１～３を参照）。
【0030】
トリコデルマ属菌におけるエリスリトール資化に関連する遺伝子又はポリペプチドの発現を低下又は消失させるための方法としては、例えば、該トリコデルマ属菌細胞中のエリスリトール資化関連遺伝子を欠失又は不活性化させること、該遺伝子から転写されたｍＲＮＡを不活性化すること、又は該遺伝子のｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害すること、などが挙げられる。トリコデルマ属菌細胞中の標的遺伝子を欠失又は不活性化させる方法としては、該標的遺伝子のヌクレオチド配列の一部もしくは全部をゲノム中から除去するか又は他のヌクレオチド配列と置き換える方法、該標的遺伝子の配列中に他のポリヌクレオチド断片を挿入する方法、該標的遺伝子の転写開始領域又は翻訳開始領域に変異を与える方法、などが挙げられる。
【0031】
好適には、該標的遺伝子のヌクレオチド配列の一部もしくは全部を欠失させる。より具体的な例としては、トリコデルマ属菌細胞のゲノム上のエリスリトール資化関連遺伝子、又はその転写開始領域もしくは翻訳開始領域を部位特異的に欠失又は不活性化させる方法、及び、トリコデルマ属菌細胞中の遺伝子にランダムな欠失又は不活性化変異を与えた後、所望の変異を有する細胞を選択する方法が挙げられる。ゲノム上の標的領域への突然変異導入や、ヌクレオチド配列の除去、置換もしくは挿入のための具体的な手法としては、部位特異的変異導入、相同組換え法、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１－６８）などを挙げることができる。細胞中の遺伝子をランダムに欠失又は不活性化させる方法としては、不活性化した遺伝子をランダムにクローニングしたＤＮＡ断片を細胞に導入し、該細胞のゲノム上の遺伝子との間に相同組換えを起こさせる方法、細胞に紫外線、γ線等を照射して突然変異を誘発する方法などが挙げられる。必要に応じて、突然変異導入したトリコデルマ属菌について、エリスリトール資化能の評価、又は遺伝子解析を行い、所望の変異を有するものを選択する。エリスリトール資化能の評価の手順は、前述したとおりである。
【0032】
細胞中の標的遺伝子のｍＲＮＡを不活性化させる方法としては、ｓｉＲＮＡを用いた標的特異的なｍＲＮＡ阻害が挙げられる。ｓｉＲＮＡの基本的な手順は当業者によく知られており（例えば、特表２００７－５１２８０８号公報参照）、またｓｉＲＮＡのための試薬又はキットが市販されている。当業者は、公知の文献や市販の製品のマニュアルに基づいて、所望の標的特異的なｓｉＲＮＡを調製し、標的ｍＲＮＡを阻害することができる。
【0033】
本発明の変異トリコデルマ属菌は、目的物質の製造に利用することができる。典型的には、本発明の変異トリコデルマ属菌を宿主として、これに目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子を導入し、発現させることで、目的物質を製造することができる。導入した遺伝子の発現を促進するために、該遺伝子を、トリコデルマ属菌で働くプロモーターと作動可能に連結させることが好ましい。
【0034】
好ましい実施形態において、本発明の変異トリコデルマ属菌は、エリスリトール資化に関連するポリペプチドの発現が低下又は消失しており、かつ、目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に作動可能に連結されたエリスリトール誘導性プロモーターを導入された、組換えトリコデルマ属菌である。該エリスリトール誘導性プロモーターとしては、以下の（i）～（ii）から選択されるＤＮＡであって、エリスリトール存在下でプロモーター活性を有するＤＮＡが挙げられる。
（i）配列番号１３～１６のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；及び、
（ii）配列番号１３～１６のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
配列番号１３～１６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡの例としては、それぞれ、配列番号１３～１６のヌクレオチド配列に対して１又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挙げられる。
（i）配列番号１３～１６のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；及び、
（ii）配列番号１３～１６のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
配列番号１３～１６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡの例としては、それぞれ、配列番号１３～１６のヌクレオチド配列に対して１又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挙げられる。
【0035】
配列番号１３～１６のプロモーターは、本発明者らにより見出された、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来のプロモーターであり、それぞれ、前述した配列番号１～４のエリスリトール資化関連遺伝子のプロモーターである（特許文献１）。配列番号１３～１６のプロモーターは、トリコデルマ属菌において初めて見出されたエリスリトール誘導性プロモーターである。
【0036】
前記エリスリトール誘導性プロモーターの取得方法としては、特に制限されず、通常の化学合成法又は遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１３～１６のヌクレオチド配列に基づいて、前記プロモーターＤＮＡを人工合成することができる。ＤＮＡの人工合成には、例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社等から提供される市販のＤＮＡ合成サービスを利用することができる。あるいは、前記プロモーターは、トリコデルマ・リーセイ等のトリコデルマ属菌からクローニングすることができる。
【0037】
前記エリスリトール誘導性プロモーターはまた、配列番号１３～１６のヌクレオチド配列のＤＮＡに突然変異を導入することによって製造することができる。突然変異導入の手法としては、例えば、紫外線照射及び部位特異的変異導入法が挙げられる。突然変異導入したＤＮＡからエリスリトール存在下でプロモーター活性を有するものを選択することによって、エリスリトール誘導性プロモーターを取得することができる。例えば、変異導入したＤＮＡの下流にレポーター遺伝子を作動可能に連結し、エリスリトール存在下で該レポーター遺伝子の発現量解析を行うことにより、エリスリトール誘導性プロモーターのＤＮＡを選択することができる。
【0038】
前述の手法を用いることによって、配列番号１３～１６のヌクレオチド配列、又はそれらと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるエリスリトール誘導性プロモーター、又は、配列番号１３～１６の配列に対して１又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなるエリスリトール誘導性プロモーターを取得することができる。
【0039】
前記エリスリトール誘導性プロモーターに、目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子（以下、目的遺伝子という）を作動可能に連結する。例えば、目的遺伝子と、その上流に連結されたエリスリトール誘導性プロモーターとを含むＤＮＡ断片を構築することができる。該ＤＮＡ断片には、前記プロモーター及び目的遺伝子の他に、該プロモーターの転写活性を向上させるようなシスエレメント、又はターミネーターが含まれていてもよい。さらに、該ＤＮＡ断片は、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性マーカー遺伝子などの選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。好ましくは、該目的遺伝子と該エリスリトール誘導性プロモーターとを含むＤＮＡ断片は、該目的遺伝子を発現するためのエリスリトール誘導性遺伝子発現カセットである。該ＤＮＡ断片は、両末端に制限酵素認識配列を有するように構築することができる。該制限酵素認識配列を使用して、該ＤＮＡ断片をベクターに導入することができる。例えば、ベクターを制限酵素で切断し、そこに、端部に制限酵素切断配列を有する該ＤＮＡ断片を添加することによって、該目的遺伝子とエリスリトール誘導性プロモーターをベクターに導入することができる（制限酵素法）。
【0040】
前記目的遺伝子とエリスリトール誘導性プロモーターを含むＤＮＡ断片は、宿主細胞のゲノムに直接導入してもよい。例えば、該ＤＮＡ断片を、宿主細胞のゲノムにおける目的遺伝子の上流に導入してもよい。また例えば、前述した目的遺伝子とエリスリトール誘導性プロモーターとを含む遺伝子発現カセットを、宿主細胞のゲノムに導入してもよい。
【0041】
あるいは、前記エリスリトール誘導性プロモーターを、目的遺伝子の発現を可能とする発現ベクターに組み込むことで、当該目的遺伝子の発現を転写レベルで向上させることができる発現ベクターが得られる。該発現ベクターにおいては、該エリスリトール誘導性プロモーターは、該目的遺伝子の上流に作動可能に連結され得る。該発現ベクターは、宿主細胞のゲノムに導入するためのベクターであっても、ゲノム外に保持されるベクターであってもよい。宿主細胞内で複製可能なものが好ましい。
【0042】
ベクターの例としては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ（－）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＵＣ１８／１９、ｐＵＣ１１８／１１９等のｐＵＣ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＥＴ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケア）、ｐＣｏｌｄ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）、ｐＵＢ１１０（Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８６，１５（２）：９３－１０３）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ）、ｐＲＳ４０３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＭＷ２１８／２１９（ニッポンジーン）、ｐＲＩ９０９／９１０等のｐＲＩ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＢＩ系ベクター（クロンテック）、ＩＮ３系ベクター（インプランタイノベーションズ）、ｐＰＴＲ１／２（タカラバイオ）、ｐＤＪＢ２（Ｇｅｎｅ，１９８５，３６：３２１－３３１）、ｐＡＢ４－１（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，１９８７，２０６：７１－７５）、ｐＬｅｕ４（Ｇｅｎｅ，１９８９，８４：３３５－３４３）、ｐＰｙｒ２２５（Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００２，２６８：３９７－４０６）、ｐＦＧ１（Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ，１９９０，１８：４４７－４５１）、酵母発現ベクターｐＮＡＮ８１４２（Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９６，６０：３８３－３８９）、ｐＭＡ９１（Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９８，６２：１６１５－１６１８）、などが挙げられる。
【0043】
本発明の変異トリコデルマ属菌に導入される目的遺伝子は、本発明の変異トリコデルマ属菌を用いて製造したい目的物質、又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子であればよい。該目的遺伝子は、異種発現産物をコードする異種遺伝子であっても、外部から導入された同種由来の遺伝子であっても、宿主である変異トリコデルマ属菌が本来有する発現産物をコードする遺伝子であっても、その他の任意のタンパク質、ペプチド、核酸などをコードする遺伝子であってもよい。目的物質の例としては、酵素、ホルモン、サイトカイン、その他生理活性ペプチド、トランスポーター、ノンコーディングＲＮＡなどが挙げられる。酵素の例としては、酸化還元酵素（Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、転移酵素（Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、加水分解酵素（Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、脱離酵素（Ｌｙａｓｅ）、異性化酵素（Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、合成酵素（Ｌｉｇａｓｅ又はＳｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、などが挙げられ、好ましい例としては、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ等のセルロース系バイオマス分解酵素、エキソグルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、β－グルコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、マンナーゼ、アラビナーゼ、ガラクターゼ、アミラーゼなどが挙げられ、より好ましくはセルラーゼ又はヘミセルラーゼである。該ヘミセルラーゼの例としては、キシラナーゼ、β－キシロシダーゼ、α－アラビノフラノシダーゼなどが挙げられ、このうちキシラナーゼが好ましい。
【0044】
前記目的遺伝子とエリスリトール誘導性プロモーターを含む発現ベクター又はＤＮＡ断片を、一般的な形質転換法、例えばエレクトロポレーション法、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、パーティクル・ガン法、アグロバクテリウム法等を用いて宿主である本発明の変異トリコデルマ属菌に導入することによって、本発明の組換えトリコデルマ属菌を得ることができる。
【0045】
得られた組換えトリコデルマ属菌をエリスリトール存在下で培養して、前記エリスリトール誘導性プロモーターの制御下で目的遺伝子を発現させ、目的物質を生産させる。目的物質の例は前述したとおりである。
【0046】
前記組換えトリコデルマ属菌の培養条件は、該組換えトリコデルマ属菌の細胞の増殖及び目的物質の生産が可能な条件であれば特に限定されない。該培養に使用される培地は、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンなど、トリコデルマ属菌の増殖及び目的物質の生産に通常必要な成分を含む限り、合成培地、天然培地のいずれでもよい。該培養物中のエリスリトールの濃度は、培地中の初期濃度として、０．００１～１０％（ｗ／ｖ）が好ましく、０．１～１０％（ｗ／ｖ）がより好ましい。
【0047】
培地に添加する炭素源としては、トリコデルマ属菌細胞本来のセルラーゼ発現誘導プロセスの刺激を避けるため、セルラーゼ非誘導性炭素源を用いることが望ましい。例えば、グルコース、フラクトース等のセルラーゼ非誘導性の糖質、ソルビトールのような糖アルコール、エタノール、グリセロールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などを炭素源として使用することができる。細胞のカタボライト抑制をより低減しつつ、目的物質を生産するために、グルコース等のセルラーゼ非誘導性炭素源を流加しながら細胞を培養してもよい。このとき、該セルラーゼ非誘導性炭素源、例えばグルコースを、窒素源であるアンモニア水、又はアンモニウム塩を含有する水溶液に溶解させ、該溶解液を該培地に流加して培養することが、培養効率や培養中の泡立ちを抑制できる点から好ましい。
【0048】
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩、アミン等の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物のような天然窒素源などが挙げられる。無機塩としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、炭酸カリウムなどが挙げられる。ビタミンとしては、ビオチンやチアミンなどが挙げられる。さらに必要に応じて、前記組換えトリコデルマ属菌が生育に要求する物質を添加することができる。
【0049】
培養は、好ましくは振とう培養や通気攪拌培養のような好気的条件で行う。培養温度は好ましくは１０℃以上、より好ましくは２０℃以上、より好ましくは２５℃以上であり、且つ好ましくは５０℃以下、より好ましくは４２℃以下、より好ましくは３５℃以下である。また、好ましくは１０～５０℃、より好ましくは２０～４２℃、より好ましくは２５～３５℃である。培養時のｐＨは３～９、好ましくは４～５である。培養時間は、１０時間～１０日間、好ましくは２～７日間である。
【0050】
培養後、培養物から目的物質を回収することにより、目的物質を取得することができる。必要に応じて、回収した目的物質をさらに精製してもよい。培養物から目的物質を回収又は精製する方法は、特に限定されず、公知の回収又は精製方法に従って行えばよい。例えば、培養物を回収し、必要に応じて超音波や加圧等による菌体破砕処理を行い、次いで傾斜法、ろ過、遠心分離などにより細胞成分を除去した後、残った目的物質を含む画分を回収すればよい。あるいは、目的物質をコードする遺伝子に、トリコデルマ属菌で機能する分泌シグナルペプチドを作動可能に連結させることによって、該目的物質を細胞外に分泌生産させることができる。
【0051】
必要に応じて回収した画分を透析、塩析、イオン交換法、蒸留、溶剤抽出等の方法、又はこれらの組み合わせにかけることで、目的物質を精製することができる。本発明による目的物質の製造方法において、組換えトリコデルマ属菌の培養及び目的物質の回収は、回分式、半回分式及び連続式のいずれの方法で行ってもよい。
【0052】
本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、方法等をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【0053】
〔１〕エリスリトール資化能が低下又は消失した変異トリコデルマ属菌であって、下記（Ａ）～（Ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドの発現が低下又は消失している、変異トリコデルマ属菌：
（Ａ）配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｂ）配列番号４のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｃ）配列番号６のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
（Ｄ）配列番号８のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
〔２〕好ましくは、下記（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が低下又は消失している、〔１〕記載の変異トリコデルマ属菌：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号３のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子；
（ｃ）配列番号５のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子；及び
（ｄ）配列番号７のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子。
〔３〕好ましくは、エリスリトール資化能が親トリコデルマ属菌と比べて５０％以下に低下している、〔１〕又は〔２〕記載の変異トリコデルマ属菌。
〔４〕好ましくは、前記エリスリトール資化能が、トリコデルマ属菌を培養する培地にエリスリトールを添加した２時間後の該培地中におけるＨＰＬＣで測定したエリスリトール残存量に基づいて算出される、エリスリトール減少率として規定される、〔３〕記載の変異トリコデルマ属菌。
〔５〕好ましくは、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子の発現量が親トリコデルマ属菌と比べて５０％以下に低下している、〔２〕記載の変異トリコデルマ属菌。
〔６〕前記トリコデルマ属菌がトリコデルマ・リーセイ又はその変異株である、〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載の変異トリコデルマ属菌。
〔７〕好ましくは、目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に連結されたエリスリトール誘導性プロモーターを導入されている、〔１〕～〔６〕のいずれか１項記載の変異トリコデルマ属菌。
〔８〕好ましくは、前記エリスリトール誘導性プロモーターが、下記（i）及び（ii）から選択されるＤＮＡからなる、〔７〕記載の変異トリコデルマ属菌：
（i）配列番号１３～１６のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；及び
（ii）配列番号１３～１６のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
〔９〕好ましくは、前記目的物質が、酵素、ホルモン、サイトカイン、生理活性ペプチド、トランスポーター、又はノンコーディングＲＮＡである、〔７〕又は〔８〕記載の変異トリコデルマ属菌。
〔１０〕前記酵素が、
好ましくは、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、脱離酵素、異性化酵素、又は合成酵素であり、
より好ましくは、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、エキソグルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、β－グルコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、マンナーゼ、アラビナーゼ、ガラクターゼ、又はアミラーゼであり、
さらに好ましくは、セルラーゼ又はヘミセルラーゼであり、
かつ
該ヘミセルラーゼが、好ましくはキシラナーゼ、β－キシロシダーゼ、又はα－アラビノフラノシダーゼである、
〔９〕記載の変異トリコデルマ属菌。
〔１１〕前記〔７〕～〔１０〕のいずれか１項記載の変異トリコデルマ属菌を、エリスリトールを含有する培地で培養すること；及び
該培養で得られた培養物から目的物質を回収すること、
を含む、目的物質の製造方法。
〔１２〕好ましくは、前記培地が初期濃度０．００１～１０％（ｗ／ｖ）のエリスリトールを含有する、〔１１〕記載の方法。
〔１３〕好ましくは、前記培地に含まれる炭素源がセルラーゼ非誘導性炭素源である、〔１１〕又は〔１２〕記載の方法。
〔１４〕好ましくは、前記セルラーゼ非誘導性炭素源が、グルコース、フラクトース、糖アルコール、アルコール類、又は有機酸類である、〔１３〕記載の方法。
〔１５〕好ましくは、前記培養中に、アンモニア水又はアンモニウム塩を含有する水溶液にグルコースを溶解させた溶解液が前記培地に流加される、〔１１〕又は〔１２〕記載の方法。
（Ａ）配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｂ）配列番号４のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｃ）配列番号６のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
（Ｄ）配列番号８のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
〔２〕好ましくは、下記（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が低下又は消失している、〔１〕記載の変異トリコデルマ属菌：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号３のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子；
（ｃ）配列番号５のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子；及び
（ｄ）配列番号７のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる遺伝子。
〔３〕好ましくは、エリスリトール資化能が親トリコデルマ属菌と比べて５０％以下に低下している、〔１〕又は〔２〕記載の変異トリコデルマ属菌。
〔４〕好ましくは、前記エリスリトール資化能が、トリコデルマ属菌を培養する培地にエリスリトールを添加した２時間後の該培地中におけるＨＰＬＣで測定したエリスリトール残存量に基づいて算出される、エリスリトール減少率として規定される、〔３〕記載の変異トリコデルマ属菌。
〔５〕好ましくは、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子の発現量が親トリコデルマ属菌と比べて５０％以下に低下している、〔２〕記載の変異トリコデルマ属菌。
〔６〕前記トリコデルマ属菌がトリコデルマ・リーセイ又はその変異株である、〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載の変異トリコデルマ属菌。
〔７〕好ましくは、目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に連結されたエリスリトール誘導性プロモーターを導入されている、〔１〕～〔６〕のいずれか１項記載の変異トリコデルマ属菌。
〔８〕好ましくは、前記エリスリトール誘導性プロモーターが、下記（i）及び（ii）から選択されるＤＮＡからなる、〔７〕記載の変異トリコデルマ属菌：
（i）配列番号１３～１６のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；及び
（ii）配列番号１３～１６のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
〔９〕好ましくは、前記目的物質が、酵素、ホルモン、サイトカイン、生理活性ペプチド、トランスポーター、又はノンコーディングＲＮＡである、〔７〕又は〔８〕記載の変異トリコデルマ属菌。
〔１０〕前記酵素が、
好ましくは、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、脱離酵素、異性化酵素、又は合成酵素であり、
より好ましくは、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、エキソグルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、β－グルコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、マンナーゼ、アラビナーゼ、ガラクターゼ、又はアミラーゼであり、
さらに好ましくは、セルラーゼ又はヘミセルラーゼであり、
かつ
該ヘミセルラーゼが、好ましくはキシラナーゼ、β－キシロシダーゼ、又はα－アラビノフラノシダーゼである、
〔９〕記載の変異トリコデルマ属菌。
〔１１〕前記〔７〕～〔１０〕のいずれか１項記載の変異トリコデルマ属菌を、エリスリトールを含有する培地で培養すること；及び
該培養で得られた培養物から目的物質を回収すること、
を含む、目的物質の製造方法。
〔１２〕好ましくは、前記培地が初期濃度０．００１～１０％（ｗ／ｖ）のエリスリトールを含有する、〔１１〕記載の方法。
〔１３〕好ましくは、前記培地に含まれる炭素源がセルラーゼ非誘導性炭素源である、〔１１〕又は〔１２〕記載の方法。
〔１４〕好ましくは、前記セルラーゼ非誘導性炭素源が、グルコース、フラクトース、糖アルコール、アルコール類、又は有機酸類である、〔１３〕記載の方法。
〔１５〕好ましくは、前記培養中に、アンモニア水又はアンモニウム塩を含有する水溶液にグルコースを溶解させた溶解液が前記培地に流加される、〔１１〕又は〔１２〕記載の方法。
【実施例0054】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0055】
実施例１ エリスリトール資化関連遺伝子の特定
（１）ＲＮＡｓｅｑ解析による発現解析
トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＰＣ－３－７株を胞子数１×１０5個／ｍＬとなるように培地に植菌し、２８℃、２２０ｒｐｍにて振とう培養した（プリス社製ＰＲＸＹｇ－９８Ｒ）。培地組成は以下の通りであった。３％セルロース、０．１４％（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０３％ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０３％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ、０．０５％ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ８０、０．１％ Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ２、１．２８％クエン酸水素二アンモニウム、５０ｍＭ酒石酸バッファー（ｐＨ４．０）（％はいずれもｗ／ｖ％）。Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ２は以下のとおり調製した：６ｍｇ Ｈ3ＢＯ3、２６ｍｇ（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ、１００ｍｇ ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、４０ｍｇ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、８ｍｇ ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、２００ｍｇ ＺｎＣｌ2を蒸留水にて１００ｍＬにメスアップした。上記条件で７２時間培養した後、培地にエリスリトールを終濃度０．２ｗ／ｖ％となるように添加した。さらに８時間培養した後、菌を回収した。コントロールとして、エリスリトール非存在下で、上記条件で８０時間培養した菌を用いた。
（１）ＲＮＡｓｅｑ解析による発現解析
トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＰＣ－３－７株を胞子数１×１０5個／ｍＬとなるように培地に植菌し、２８℃、２２０ｒｐｍにて振とう培養した（プリス社製ＰＲＸＹｇ－９８Ｒ）。培地組成は以下の通りであった。３％セルロース、０．１４％（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０３％ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０３％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ、０．０５％ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ８０、０．１％ Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ２、１．２８％クエン酸水素二アンモニウム、５０ｍＭ酒石酸バッファー（ｐＨ４．０）（％はいずれもｗ／ｖ％）。Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ２は以下のとおり調製した：６ｍｇ Ｈ3ＢＯ3、２６ｍｇ（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ、１００ｍｇ ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、４０ｍｇ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、８ｍｇ ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、２００ｍｇ ＺｎＣｌ2を蒸留水にて１００ｍＬにメスアップした。上記条件で７２時間培養した後、培地にエリスリトールを終濃度０．２ｗ／ｖ％となるように添加した。さらに８時間培養した後、菌を回収した。コントロールとして、エリスリトール非存在下で、上記条件で８０時間培養した菌を用いた。
【0056】
回収した菌から全ＲＮＡを抽出し（ＱＩＡＧＥＮ社ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ使用）、抽出した全ＲＮＡをＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ ｖ３キット（イルミナ）に供することで次世代シーケンサーライブラリ（ｃＤＮＡライブラリ）を構築した。得られたｃＤＮＡライブラリをＭｉｓｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（３００ｃｙｃｌｅ）（イルミナ）を用いたＭｉｓｅｑシステムによってシーケンシングした。得られたシーケンス情報を、ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈを用いて、Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｆｕｎｇｉデータベース（fungi.ensembl.org/Trichoderma_reesei/Info/Index/）から取得したＴ．ｒｅｅｓｅｉ ＱＭ６ａのＣＤＳ配列に対してマッピングした。各遺伝子について、マッピングされたリード数を遺伝子の長さと総リード数で補正した値であるＲＰＫＭ（Ｒｅａｄｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ）を求めた。得られたＲＰＫＭに基づいて各遺伝子の発現量を解析した。その結果、ＲＰＫＭ値がコントロールと比較してエリスリトール添加条件において５０倍以上高発現しており、コントロール条件でほとんど発現していない遺伝子として、１２２０７９（ＴＲＩＲＥＤＲＡＦＴ＿１２２０７９）、６８４６６（ＴＲＩＲＥＤＲＡＦＴ＿６８４６６）、６８６０６（ＴＲＩＲＥＤＲＡＦＴ＿６８６０６）及び６８５８５（ＴＲＩＲＥＤＲＡＦＴ＿６８５８５）の４遺伝子が見出された（表１）。
【0057】
【表1】
【0058】
（２）リアルタイムＰＣＲによる発現解析
（１）で見出された４遺伝子の発現誘導のエリスリトール特異性をリアルタイムＰＣＲによって検証した。検証には、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ ＰＣ－３－７株をｅｇｌ１プロモーターでＡａＢＧＬ１を高発現させるように改変して得られたＴ．ｒｅｅｓｅｉ Ｅ１ＡＢ１株（Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１６，８２：８９－９５）を用いた。Ｅ１ＡＢ１株を胞子数１×１０5個／ｍＬとなるように植菌し、２８℃、２２０ｒｐｍにて振とう培養した（プリス社製ＰＲＸＹｇ－９８Ｒ）。培地組成は以下の通りであった。１％グルコース、０．１４％（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０３％ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０３％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ、０．０５％ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ８０、０．１％ Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ２、１．２８％クエン酸水素二アンモニウム、５０ｍＭ酒石酸バッファー（ｐＨ４．０）（％はいずれもｗ／ｖ％）。Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ２の組成は前記（１）のとおりであった。上記条件で４８時間培養した後、培地にエリスリトール、グルコース又はソルビトールを終濃度０．２ｗ／ｖ％となるように添加した。エリスリトール添加の直後（０ｈ）及び２時間後（２ｈ）に菌を回収した。コントロールには、培養４８時間後に何も炭素源を添加せずに合計５０時間培養した菌を用いた。
（１）で見出された４遺伝子の発現誘導のエリスリトール特異性をリアルタイムＰＣＲによって検証した。検証には、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ ＰＣ－３－７株をｅｇｌ１プロモーターでＡａＢＧＬ１を高発現させるように改変して得られたＴ．ｒｅｅｓｅｉ Ｅ１ＡＢ１株（Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１６，８２：８９－９５）を用いた。Ｅ１ＡＢ１株を胞子数１×１０5個／ｍＬとなるように植菌し、２８℃、２２０ｒｐｍにて振とう培養した（プリス社製ＰＲＸＹｇ－９８Ｒ）。培地組成は以下の通りであった。１％グルコース、０．１４％（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０３％ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０３％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ、０．０５％ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ８０、０．１％ Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ２、１．２８％クエン酸水素二アンモニウム、５０ｍＭ酒石酸バッファー（ｐＨ４．０）（％はいずれもｗ／ｖ％）。Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ２の組成は前記（１）のとおりであった。上記条件で４８時間培養した後、培地にエリスリトール、グルコース又はソルビトールを終濃度０．２ｗ／ｖ％となるように添加した。エリスリトール添加の直後（０ｈ）及び２時間後（２ｈ）に菌を回収した。コントロールには、培養４８時間後に何も炭素源を添加せずに合計５０時間培養した菌を用いた。
【0059】
回収した菌から抽出したＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成した（ＴａＫａＲａ社ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔTM II １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ使用）。合成したｃＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲ解析を行った。（アジレント・テクノロジー、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩＩ Ｕｌｔｒａ－Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＱＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘｅｓ使用）。リアルタイムＰＣＲには表２のプライマーを使用した。相対定量法（ΔΔＣｔ法）により各遺伝子の発現量を求めた。ノーマライズ遺伝子には解糖系酵素の１つであるホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子ｐｇｋ１（ＴＲＩＲＥＤＲＡＦＴ＿２１４０６）を用いた。
【0060】
【表2】
【0061】
ｐｇｋ１遺伝子の発現量に対する各遺伝子の相対的発現量を図１（Ａ）～（Ｄ）に示した。エリスリトールの添加直後（０ｈ）と比較して、添加２時間後（２ｈ）では４遺伝子の発現量が大幅に上昇した。一方、コントロール、及びグルコース又はソルビトール添加条件では、４遺伝子の発現量の上昇は認められなかった。このことから、１２２０７９、６８４６６、６８６０６及び６８５８５の４遺伝子がエリスリトール特異的に発現誘導されることが示された。これら４遺伝子はエリスリトール資化関連遺伝子であると推定された。
【0062】
実施例２ エリスリトール資化関連遺伝子欠損用プラスミドの構築
トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにて、以下の４つのＤＮＡ断片を調製した。断片１：１２２０７９遺伝子を含むＤＮＡ（配列番号９）、断片２：６８４６６遺伝子を含むＤＮＡ（配列番号１０）、断片３：６８６０６遺伝子を含むＤＮＡ（配列番号１１）、及び断片４：６８５８５遺伝子を含むＤＮＡ（配列番号１２）。これらのＤＮＡ断片をｐＵＣ１１８（タカラバイオ）のＨｉｎｃＩＩ制限酵素切断点に挿入し、プラスミドｐＵＣ－１２２０７９、ｐＵＣ－６８４６６、ｐＵＣ－６８６０６及びｐＵＣ－６８５８５を構築した。構築した各プラスミドを鋳型として、以下の４つのＤＮＡ断片を調製した。断片５：ｐＵＣ－１２２０７９を鋳型として増幅した約５．２ｋｂｐの断片、断片６：ｐＵＣ－６８４６６を鋳型として増幅した約５．０ｋｂｐの断片、断片７：ｐＵＣ－６８６０６を鋳型として増幅した約４．８ｋｂｐの断片、断片８：ｐＵＣ－６８５８５を鋳型として増幅した約４．８ｋｂｐの断片。形質転換用選択マーカーとして、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのゲノムＤＮＡを鋳型として断片９：ｐｙｒ４遺伝子（ＴＲＩＲＥＤＲＡＦＴ＿７４０２０）の上流約１．０ｋｂｐからＯＲＦ及び下流約０．３ｋｂｐまでの領域（約２．７ｋｂｐ）を調製した。さらに、選択マーカーの脱落のために断片９の上流及び下流にそれぞれ約０．７ｋｂｐの断片１０と約１．０ｋｂｐの断片１１を結合させることで、形質転換用選択マーカーカセットを調製した。調製した形質転換用選択マーカーカセットと断片５～８をそれぞれ結合させることで、遺伝子欠損用プラスミドｐＵＣ－Δ１２２０７９－ｐｙｒ４、ｐＵＣ－Δ６８４６６－ｐｙｒ４、ｐＵＣ－Δ６８６０６－ｐｙｒ４ 及びｐＵＣ－Δ６８５８５－ｐｙｒ４を構築した。ＤＮＡ断片の結合はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（タカラバイオ）のプロトコルに従って実施し、使用したプライマーを表３に示す。
トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにて、以下の４つのＤＮＡ断片を調製した。断片１：１２２０７９遺伝子を含むＤＮＡ（配列番号９）、断片２：６８４６６遺伝子を含むＤＮＡ（配列番号１０）、断片３：６８６０６遺伝子を含むＤＮＡ（配列番号１１）、及び断片４：６８５８５遺伝子を含むＤＮＡ（配列番号１２）。これらのＤＮＡ断片をｐＵＣ１１８（タカラバイオ）のＨｉｎｃＩＩ制限酵素切断点に挿入し、プラスミドｐＵＣ－１２２０７９、ｐＵＣ－６８４６６、ｐＵＣ－６８６０６及びｐＵＣ－６８５８５を構築した。構築した各プラスミドを鋳型として、以下の４つのＤＮＡ断片を調製した。断片５：ｐＵＣ－１２２０７９を鋳型として増幅した約５．２ｋｂｐの断片、断片６：ｐＵＣ－６８４６６を鋳型として増幅した約５．０ｋｂｐの断片、断片７：ｐＵＣ－６８６０６を鋳型として増幅した約４．８ｋｂｐの断片、断片８：ｐＵＣ－６８５８５を鋳型として増幅した約４．８ｋｂｐの断片。形質転換用選択マーカーとして、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのゲノムＤＮＡを鋳型として断片９：ｐｙｒ４遺伝子（ＴＲＩＲＥＤＲＡＦＴ＿７４０２０）の上流約１．０ｋｂｐからＯＲＦ及び下流約０．３ｋｂｐまでの領域（約２．７ｋｂｐ）を調製した。さらに、選択マーカーの脱落のために断片９の上流及び下流にそれぞれ約０．７ｋｂｐの断片１０と約１．０ｋｂｐの断片１１を結合させることで、形質転換用選択マーカーカセットを調製した。調製した形質転換用選択マーカーカセットと断片５～８をそれぞれ結合させることで、遺伝子欠損用プラスミドｐＵＣ－Δ１２２０７９－ｐｙｒ４、ｐＵＣ－Δ６８４６６－ｐｙｒ４、ｐＵＣ－Δ６８６０６－ｐｙｒ４ 及びｐＵＣ－Δ６８５８５－ｐｙｒ４を構築した。ＤＮＡ断片の結合はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（タカラバイオ）のプロトコルに従って実施し、使用したプライマーを表３に示す。
【0063】
【表3】
【0064】
構築したプラスミドをコンピテントセルＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）へと形質転換し、アンピシリン耐性株として得られた形質転換体の中から、コロニーＰＣＲにより目的の遺伝子が挿入されたプラスミドを保持する菌株を選別した。選別した形質転換体はアンピシリン添加ＬＢ培地を用いて培養後（３７℃、１日間）、得られた菌からプラスミドをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＥａｓｙＰｕｒｅ（マッハライ・ナーゲル）を用いて回収、精製した。
【0065】
実施例３ エリスリトール資化関連遺伝子欠損変異トリコデルマ属株の作製
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ Ｅ１ＡＢ１（Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１６，８２：８９－９５）のΔｐｙｒ４株に対して、実施例２で構築したプラスミドの形質転換を行った。導入はプロトプラストＰＥＧ法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２０１２，１０９（１）：９２－９９）で行った。形質転換体は、ｐｙｒ４遺伝子を選択マーカーとして、選択培地（２％ グルコース、１．１Ｍ ソルビトール、２％ アガー、０．５％（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２％ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ５．５）、０．０６％ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０６％ ＣｓＣｌ2、０．０６％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１％ Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ １（％はいずれもｗ／ｖ％）にて選抜した。Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ １は以下のとおり調製した：０．５ｇ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．２ｇ ＣｏＣｌ2、０．１６ｇ ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．１４ｇ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏを蒸留水にて１００ｍＬにメスアップした。選抜した形質転換体を植え継ぎにより安定化した後、コロニーＰＣＲにより目的の遺伝子が安定に保持された菌株をさらに選別した。選別した変異株を、それぞれ１２２０７９欠損株（Δ１２２０７９）、６８４６６欠損株（Δ６８４６６）、６８６０６欠損株（Δ６８６０６）及び６８５８５欠損株（Δ６８５８５）とした。
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ Ｅ１ＡＢ１（Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１６，８２：８９－９５）のΔｐｙｒ４株に対して、実施例２で構築したプラスミドの形質転換を行った。導入はプロトプラストＰＥＧ法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２０１２，１０９（１）：９２－９９）で行った。形質転換体は、ｐｙｒ４遺伝子を選択マーカーとして、選択培地（２％ グルコース、１．１Ｍ ソルビトール、２％ アガー、０．５％（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２％ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ５．５）、０．０６％ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０６％ ＣｓＣｌ2、０．０６％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１％ Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ １（％はいずれもｗ／ｖ％）にて選抜した。Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ １は以下のとおり調製した：０．５ｇ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．２ｇ ＣｏＣｌ2、０．１６ｇ ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．１４ｇ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏを蒸留水にて１００ｍＬにメスアップした。選抜した形質転換体を植え継ぎにより安定化した後、コロニーＰＣＲにより目的の遺伝子が安定に保持された菌株をさらに選別した。選別した変異株を、それぞれ１２２０７９欠損株（Δ１２２０７９）、６８４６６欠損株（Δ６８４６６）、６８６０６欠損株（Δ６８６０６）及び６８５８５欠損株（Δ６８５８５）とした。
【0066】
実施例４ 変異トリコデルマ属株のエリスリトール資化性の検証
（１）変異株の培養
実施例３で作製した変異トリコデルマ属株を培養し、エリスリトール資化性を検証した。前培養として、５００ｍＬのフラスコに培地を５０ｍＬ仕込み、実施例２で作製した菌株の胞子を１×１０5個／ｍＬとなるよう植菌し、２８℃、２２０ｒｐｍにて振とう培養した（プリス社製ＰＲＸＹｇ－９８Ｒ）。培地組成は以下の通りである。１％ グルコース、０．１４％（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０３％ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０３％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ、０．０５％ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ８０、０．１％ Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ２、５０ｍＭ酒石酸バッファー（ｐＨ４．０）（％はいずれもｗ／ｖ％）。Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ２は以下のとおり調製した：６ｍｇ Ｈ3ＢＯ3、２６ｍｇ（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ、１００ｍｇ ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、４０ｍｇ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、８ｍｇ ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、２００ｍｇ ＺｎＣｌ2を蒸留水にて１００ｍＬにメスアップした。
（１）変異株の培養
実施例３で作製した変異トリコデルマ属株を培養し、エリスリトール資化性を検証した。前培養として、５００ｍＬのフラスコに培地を５０ｍＬ仕込み、実施例２で作製した菌株の胞子を１×１０5個／ｍＬとなるよう植菌し、２８℃、２２０ｒｐｍにて振とう培養した（プリス社製ＰＲＸＹｇ－９８Ｒ）。培地組成は以下の通りである。１％ グルコース、０．１４％（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０３％ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０３％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ、０．０５％ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ８０、０．１％ Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ２、５０ｍＭ酒石酸バッファー（ｐＨ４．０）（％はいずれもｗ／ｖ％）。Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ２は以下のとおり調製した：６ｍｇ Ｈ3ＢＯ3、２６ｍｇ（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ、１００ｍｇ ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、４０ｍｇ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、８ｍｇ ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、２００ｍｇ ＺｎＣｌ2を蒸留水にて１００ｍＬにメスアップした。
【0067】
４８時間の前培養後、ジャーファーメンターとしてＢＴＲ－２５ＮＡ１Ｓ－８Ｍ（バイオット）を用いて本培養を行った。上記前培養液を１％（ｖ／ｖ％）植菌し、２４時間培養を行った。炭素源としてはグルコースを２％の濃度で使用し、その他の培地成分は以下のものを使用した。０．４２％（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０３％ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０３％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ、０．０５％ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ８０、０．１％ Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ２、０．２％ Ａｎｔｉｆｏａｍ ＰＥ－Ｌ。ジャーファーメンターの設定は以下の通りである。温度：２８℃、通気量：０．５ｖｖｍ、ｐＨ：４．５（５％ アンモニア水で調整）、撹拌数：７００ｒｐｍ。培養２４時間後に終濃度０．２％ エリスリトールとなるようエリスリトールを添加し、添加後０、２、４、８時間の時点での培養上清及び菌を回収した。
【0068】
（２）培養上清中のエリスリトールの定量
（１）で回収した培養液１ｍＬを１５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清をフィルターＤＩＳＭＩＣ－１３ＣＰ（０．２μｍセルロースアセテート膜、ＡＤＶＡＮＴＥＣ）に通すことで菌体を除去した。ＨＰＬＣに供する培養上清は、３７ｍＭ硫酸にて適宜希釈した後、アクロプレップ９６フィルタープレート（０．２μｍＧＨＰ膜、日本ポール）を用いて不溶物の除去を行った。ＨＰＬＣによる分析条件を以下に示す。
分析装置：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ－Ｉ ＬＣ－２０３０Ｃ ３Ｄ ｐｌｕｓ（島津製作所）
分析カラム：ＩＣＳｅｐ ＩＣＥ ＩＯＮ ３００ ７．８ｍｍＩ．Ｄ．×３００ｍｍ（ＣＯＮＣＩＳＥ ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ）
溶離液：０．０１Ｎ 硫酸
流速：０．５ｍＬ／分
カラム温度：５０℃
検量線は、既知濃度のエリスリトール溶液を同様にして分析することで作成し、作成した検量線に基づいて培養上清中のエリスリトールの濃度を算出した。
（１）で回収した培養液１ｍＬを１５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清をフィルターＤＩＳＭＩＣ－１３ＣＰ（０．２μｍセルロースアセテート膜、ＡＤＶＡＮＴＥＣ）に通すことで菌体を除去した。ＨＰＬＣに供する培養上清は、３７ｍＭ硫酸にて適宜希釈した後、アクロプレップ９６フィルタープレート（０．２μｍＧＨＰ膜、日本ポール）を用いて不溶物の除去を行った。ＨＰＬＣによる分析条件を以下に示す。
分析装置：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ－Ｉ ＬＣ－２０３０Ｃ ３Ｄ ｐｌｕｓ（島津製作所）
分析カラム：ＩＣＳｅｐ ＩＣＥ ＩＯＮ ３００ ７．８ｍｍＩ．Ｄ．×３００ｍｍ（ＣＯＮＣＩＳＥ ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ）
溶離液：０．０１Ｎ 硫酸
流速：０．５ｍＬ／分
カラム温度：５０℃
検量線は、既知濃度のエリスリトール溶液を同様にして分析することで作成し、作成した検量線に基づいて培養上清中のエリスリトールの濃度を算出した。
【0069】
Ｅ１ＡＢ１株では、エリスリトール添加後４時間目の時点で培養上清中のエリスリトールが完全に消失するのに対して、１２２０７９欠損株（Δ１２２０７９）、６８４６６欠損株（Δ６８４６６）、６８６０６欠損株（Δ６８６０６）及び６８５８５欠損株（Δ６８５８５）の全ての変異株で、添加後２時間目以降のエリスリトール資化速度がＥ１ＡＢ１株よりも低下しており、Δ１２２０７９、Δ６８６０６及びΔ６８５８５株では添加後８時間の時点でも培養上清中にエリスリトールが残存していた（図２）。このことから、１２２０７９遺伝子、６８４６６遺伝子、６８６０６遺伝子又は６８５８５遺伝子を欠損させることで、糸状菌のエリスリトールの資化性が低下することが示された。
【0070】
実施例５ 欠損変異株の細胞内エリスリトール蓄積量の測定
実施例３で作製した変異株について、ガスクロマトグラフィー-質量分析計（ＧＣ－ＭＳ）を用いて、菌細胞内へのエリスリトールの蓄積量を測定した。実施例４（１）でエリスリトール添加後４時間目と８時間目に回収した培養液５ｍＬに冷エタノール７ｍＬを添加し、速やかに－３０℃にて冷却した。冷却した培養液を５，０００ｇ、４℃で５分間遠心し、上清を取り除いたところに冷６０％メタノール５ｍＬを加え、懸濁することで沈殿した菌を洗浄した。菌の洗浄操作を２回行った後、－８０℃で凍結させた。凍結した菌を凍結乾燥させた。凍結乾燥した菌をマルチビーズショッカー（安井器械）を用いて破砕し、破砕した菌５ｍｇに内部標準として３７μＭアジピン酸が含まれたメタノール０．５ｍＬを加えてよく懸濁し、氷冷したクロロホルム０．５ｍＬと水０．２ｍＬを加えて良く撹拌した。１４，０００×ｇ、４℃で５分間遠心し、上清０．５ｍＬを回収した。得られた上清を遠心エバポレーターを用いて乾固させた。
実施例３で作製した変異株について、ガスクロマトグラフィー-質量分析計（ＧＣ－ＭＳ）を用いて、菌細胞内へのエリスリトールの蓄積量を測定した。実施例４（１）でエリスリトール添加後４時間目と８時間目に回収した培養液５ｍＬに冷エタノール７ｍＬを添加し、速やかに－３０℃にて冷却した。冷却した培養液を５，０００ｇ、４℃で５分間遠心し、上清を取り除いたところに冷６０％メタノール５ｍＬを加え、懸濁することで沈殿した菌を洗浄した。菌の洗浄操作を２回行った後、－８０℃で凍結させた。凍結した菌を凍結乾燥させた。凍結乾燥した菌をマルチビーズショッカー（安井器械）を用いて破砕し、破砕した菌５ｍｇに内部標準として３７μＭアジピン酸が含まれたメタノール０．５ｍＬを加えてよく懸濁し、氷冷したクロロホルム０．５ｍＬと水０．２ｍＬを加えて良く撹拌した。１４，０００×ｇ、４℃で５分間遠心し、上清０．５ｍＬを回収した。得られた上清を遠心エバポレーターを用いて乾固させた。
【0071】
乾固したサンプルに４０ｍｇ／ｍＬメトキシアミンを含むピリジンを２０μＬ加え、３０℃、８００ｒｐｍで９０分間反応させた後、ＭＳＴＦＡ＋１％ ＴＭＣＳを８０μＬ加え、３７℃、８００ｒｐｍで３０分間反応させた。反応後のサンプルを遮光条件で室温にてクーリングした後、ＧＣ－ＭＳ分析に供した。ＧＣ－ＭＳの分析条件を以下に示す。
分析装置：Ａｇｉｌｅｎｔ ７８９０Ａ ＧＣ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
カラム：ＤＢ－５ＭＳ＋ＤＧ ３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
気化室温度：２５０℃
注入方法：スプリット注入（スプリット比 ５０：１）
オーブン温度：６０℃で３．５分保持後、１０℃／ｍｉｎで昇温、３２５℃で１０分保持
カラム流量：ヘリウムガス １．１４ｍＬ／ｍｉｎ
インターフェイス：２５０℃
イオン源：２００℃
検量線は、既知濃度のエリスリトール溶液に１００μＭアジピン酸溶液を１００μＬ添加したものを同様にして分析することで作成し、作成した検量線に基づいて菌細胞内のエリスリトール蓄積量を算出した。
分析装置：Ａｇｉｌｅｎｔ ７８９０Ａ ＧＣ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
カラム：ＤＢ－５ＭＳ＋ＤＧ ３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
気化室温度：２５０℃
注入方法：スプリット注入（スプリット比 ５０：１）
オーブン温度：６０℃で３．５分保持後、１０℃／ｍｉｎで昇温、３２５℃で１０分保持
カラム流量：ヘリウムガス １．１４ｍＬ／ｍｉｎ
インターフェイス：２５０℃
イオン源：２００℃
検量線は、既知濃度のエリスリトール溶液に１００μＭアジピン酸溶液を１００μＬ添加したものを同様にして分析することで作成し、作成した検量線に基づいて菌細胞内のエリスリトール蓄積量を算出した。
【0072】
Ｅ１ＡＢ１株及び欠損変異株の乾燥菌体１ｍｇ当たりの細胞内エリスリトール濃度（ｎｍｏｌ／ｍｇ－ｄｒｙ ｃｅｌｌ）を求めた結果、Ｅ１ＡＢ１株ではエリスリトール添加後４時間目の時点で細胞内にエリスリトールがほとんど検出されず、８時間目の時点では検出限界以下の値となり、菌細胞内に取り込まれたエリスリトールが速やかに資化されていた（表４）。一方欠損変異株では、エリスリトール添加後４時間目の時点で細胞内へのエリスリトールの蓄積が認められ、８時間目の時点でも細胞内にエリスリトールがＥ１ＡＢ１株の約１００倍以上検出され、菌細胞に取り込まれたエリスリトールが資化されずに細胞内に蓄積していた（表４）。以上の結果から、１２２０７９遺伝子、６８４６６遺伝子、６８６０６遺伝子又は６８５８５遺伝子を欠損させることで、菌細胞内へのエリスリトールの蓄積量を増加させることができることが示された。
【0073】
【表4】
【0074】
実施例６ 欠損変異株におけるエリスリトール資化関連遺伝子の発現解析
実施例３で作製した変異トリコデルマ属株について、細胞内へのエリスリトール蓄積によるエリスリトール資化関連遺伝子の発現量への影響をリアルタイムＰＣＲによって検証した。実施例４（１）で回収した菌から抽出したＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成した（ＴａＫａＲａ社ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔTM II １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ使用）。合成したｃＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲ解析を行った。（アジレント・テクノロジー、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩＩ Ｕｌｔｒａ－Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＱＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘｅｓ使用）。リアルタイムＰＣＲ用のプライマーには表２に示したものを用いた。相対定量法（ΔΔＣｔ法）により各遺伝子の発現量を求めた。ノーマライズ遺伝子には解糖系酵素の１つであるホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子ｐｇｋ１（ＴＲＩＲＥＤＲＡＦＴ＿２１４０６）を用いた。
実施例３で作製した変異トリコデルマ属株について、細胞内へのエリスリトール蓄積によるエリスリトール資化関連遺伝子の発現量への影響をリアルタイムＰＣＲによって検証した。実施例４（１）で回収した菌から抽出したＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成した（ＴａＫａＲａ社ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔTM II １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ使用）。合成したｃＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲ解析を行った。（アジレント・テクノロジー、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩＩ Ｕｌｔｒａ－Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＱＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘｅｓ使用）。リアルタイムＰＣＲ用のプライマーには表２に示したものを用いた。相対定量法（ΔΔＣｔ法）により各遺伝子の発現量を求めた。ノーマライズ遺伝子には解糖系酵素の１つであるホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子ｐｇｋ１（ＴＲＩＲＥＤＲＡＦＴ＿２１４０６）を用いた。
【0075】
ｐｇｋ１遺伝子の発現量に対する各遺伝子の相対的発現量を図３～６に示した。親株であるＥ１ＡＢ１株では、エリスリトール添加直後（０ｈ）と比較して添加後２時間の時点で４つのエリスリトール資化関連遺伝子の発現量の上昇が認められたが、添加後４時間目以降では全ての遺伝子の発現量が添加後２時間の時点と比較して著しく低下した。一方、欠損変異株であるΔ１２２０７９、Δ６８４６６、Δ６８６０６及びΔ６８５８５では、添加後２時間目において４つ遺伝子の発現の上昇が確認され、さらに添加後４時間目及び８時間目においてもＥ１ＡＢ１株とは異なり非常に高い発現量を示した。このことから、１２２０７９遺伝子、６８４６６遺伝子、６８６０６遺伝子又は６８５８５遺伝子を欠損させることで、エリスリトール資化関連遺伝子の発現量及び発現持続性が向上することが示された。
【0076】
実施例７ エリスリトール誘導性プロモーター連結遺伝子導入組換え株の作製
実施例３で作製した変異トリコデルマ属株に、エリスリトール誘導性プロモーターと連結したキシラナーゼＸＹＮ３遺伝子を導入して、エリスリトール誘導性にＸＹＮ３を発現する組換え株を作製した。
実施例３で作製した変異トリコデルマ属株に、エリスリトール誘導性プロモーターと連結したキシラナーゼＸＹＮ３遺伝子を導入して、エリスリトール誘導性にＸＹＮ３を発現する組換え株を作製した。
【0077】
（１）遺伝子導入用プラスミドの構築
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにて、以下の６つのＤＮＡ断片を調製した。
断片１２：１２２０７９遺伝子の上流約１．０ｋｂｐのプロモーター領域（配列番号１３）
断片１３：６８４６６遺伝子の上流約０．８ｋｂｐのプロモーター領域（配列番号１４）
断片１４：６８６０６遺伝子の上流約０．８ｋｂｐのプロモーター領域（配列番号１５）
断片１５：６８５８５遺伝子の上流約０．８ｋｂｐのプロモーター領域（配列番号１６）
断片１６：キシラナーゼ遺伝子ｘｙｎ３（ＴＲＩＲＥＤＲＡＦＴ＿１２０２２９）のコード領域から下流０．５ｋｂｐまでの領域
断片１７：ｐｙｒ４遺伝子（ＴＲＩＲＥＤＲＡＦＴ＿７４０２０）の上流約１．０ｋｂｐからＯＲＦ及び下流約０．３ｋｂｐまでの領域（約２．４ｋｂｐ）
断片の増幅に使用したプライマーを表５に示した。
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにて、以下の６つのＤＮＡ断片を調製した。
断片１２：１２２０７９遺伝子の上流約１．０ｋｂｐのプロモーター領域（配列番号１３）
断片１３：６８４６６遺伝子の上流約０．８ｋｂｐのプロモーター領域（配列番号１４）
断片１４：６８６０６遺伝子の上流約０．８ｋｂｐのプロモーター領域（配列番号１５）
断片１５：６８５８５遺伝子の上流約０．８ｋｂｐのプロモーター領域（配列番号１６）
断片１６：キシラナーゼ遺伝子ｘｙｎ３（ＴＲＩＲＥＤＲＡＦＴ＿１２０２２９）のコード領域から下流０．５ｋｂｐまでの領域
断片１７：ｐｙｒ４遺伝子（ＴＲＩＲＥＤＲＡＦＴ＿７４０２０）の上流約１．０ｋｂｐからＯＲＦ及び下流約０．３ｋｂｐまでの領域（約２．４ｋｂｐ）
断片の増幅に使用したプライマーを表５に示した。
【0078】
【表5】
【0079】
断片１６及び１７を結合してＸＹＮ３－ｐｙｒ４を作製した。次いでＸＹＮ３－ｐｙｒ４と断片１～４のそれぞれを結合した。得られた断片をそれぞれｐＵＣ１１８（タカラバイオ）のＨｉｎｃＩＩ制限酵素切断点に挿入することで、４つのベクターｐＵＣ－Ｐ１２２０７９－ＸＹＮ３－ｐｙｒ４、ｐＵＣ－Ｐ６８４６６－ＸＹＮ３－ｐｙｒ４、ｐＵＣ－Ｐ６８６０６－ＸＹＮ３－ｐｙｒ４及びｐＵＣ－Ｐ６８５８５－ＸＹＮ３－ｐｙｒ４を構築した。ＤＮＡ断片の結合はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（タカラバイオ）のプロトコルに従って実施した。構築したプラスミドをコンピテントセルＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）へと形質転換し、アンピシリン耐性株として得られた形質転換体の中から、コロニーＰＣＲにより目的の遺伝子が挿入されたプラスミドを保持する菌株を選別した。選別した形質転換体はアンピシリン添加ＬＢ培地を用いて培養し（３７℃、１日間）、得られた菌からプラスミドをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＥａｓｙＰｕｒｅ（マッハライ・ナーゲル）を用いて回収及び精製した。
【0080】
（２）ＸＹＮ３発現組換えトリコデルマ属株の作製
実施例３で作製した変異トリコデルマ属株に対して再度形質転換を行うために、０．２％の５－フルオロオロチン酸（５－ＦＯＡ）一水和物が含まれるＰＤＡ培地を用いて再度５－ＦＯＡ耐性を獲得し生育する株を選抜した。Δ１２２０７９、Δ６８４６６、Δ６８６０６及びΔ６８５８５をそれぞれ５－ＦＯＡ含有培地に塗布し、生育してきた株をΔ１２２０７９Δｐｙｒ４、Δ６８４６６Δｐｙｒ４、Δ６８６０６Δｐｙｒ４及びΔ６８５８５Δｐｙｒ４として取得した。取得した株及びＥ１ＡＢ１Δｐｙｒ４に対して、（１）で作製したプラスミドをプロトプラストＰＥＧ法にて導入した。形質転換体は、ｐｙｒ４遺伝子を選択マーカーとして、選択培地（２％ グルコース、１．１Ｍ ソルビトール、２％ アガー、０．５％（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２％ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ５．５）、０．０６％ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０６％ ＣｓＣｌ2、０．０６％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１％ Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ １（％はいずれもｗ／ｖ％）にて選抜した。選抜した形質転換体を植え継ぎにより安定化した後、コロニーＰＣＲにより目的の遺伝子が安定に保持された菌株をさらに選別した。
実施例３で作製した変異トリコデルマ属株に対して再度形質転換を行うために、０．２％の５－フルオロオロチン酸（５－ＦＯＡ）一水和物が含まれるＰＤＡ培地を用いて再度５－ＦＯＡ耐性を獲得し生育する株を選抜した。Δ１２２０７９、Δ６８４６６、Δ６８６０６及びΔ６８５８５をそれぞれ５－ＦＯＡ含有培地に塗布し、生育してきた株をΔ１２２０７９Δｐｙｒ４、Δ６８４６６Δｐｙｒ４、Δ６８６０６Δｐｙｒ４及びΔ６８５８５Δｐｙｒ４として取得した。取得した株及びＥ１ＡＢ１Δｐｙｒ４に対して、（１）で作製したプラスミドをプロトプラストＰＥＧ法にて導入した。形質転換体は、ｐｙｒ４遺伝子を選択マーカーとして、選択培地（２％ グルコース、１．１Ｍ ソルビトール、２％ アガー、０．５％（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２％ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ５．５）、０．０６％ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０６％ ＣｓＣｌ2、０．０６％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１％ Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ １（％はいずれもｗ／ｖ％）にて選抜した。選抜した形質転換体を植え継ぎにより安定化した後、コロニーＰＣＲにより目的の遺伝子が安定に保持された菌株をさらに選別した。
【0081】
実施例８ 組換え株による目的タンパク質生産
（１）組換え株の培養によるＸＹＮ３生産
実施例７で作製したΔ１２２０７９からの組換え株及びＥ１ＡＢ１からの組換え株を培養し、エリスリトール誘導によるタンパク質生産を行った。培養では、５００ｍＬのフラスコに培地を５０ｍＬ仕込み、実施例７で作製した組換え株の胞子を１×１０5個／ｍＬとなるよう植菌し、２８℃、２２０ｒｐｍにて振とう培養した（プリス社製ＰＲＸＹｇ－９８Ｒ）。培地組成は以下の通りであった。１％グルコース、０．１４％（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０３％ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０３％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ、０．０５％ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ８０、０．１％ Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ １。培養４８時間後に、培地にエリスリトールを終濃度０．２ｗ／ｖ％となるように添加し、培養液を回収した。さらに４時間及び２４時間培養した後、再度培養液を回収した。
（１）組換え株の培養によるＸＹＮ３生産
実施例７で作製したΔ１２２０７９からの組換え株及びＥ１ＡＢ１からの組換え株を培養し、エリスリトール誘導によるタンパク質生産を行った。培養では、５００ｍＬのフラスコに培地を５０ｍＬ仕込み、実施例７で作製した組換え株の胞子を１×１０5個／ｍＬとなるよう植菌し、２８℃、２２０ｒｐｍにて振とう培養した（プリス社製ＰＲＸＹｇ－９８Ｒ）。培地組成は以下の通りであった。１％グルコース、０．１４％（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０３％ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０３％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ、０．０５％ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ８０、０．１％ Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ １。培養４８時間後に、培地にエリスリトールを終濃度０．２ｗ／ｖ％となるように添加し、培養液を回収した。さらに４時間及び２４時間培養した後、再度培養液を回収した。
【0082】
（２）ＸＹＮ３活性測定
（１）で回収した培養液中のキシラナーゼ（ＸＹＮ３）活性をｐＮＰ（ｐ－Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）法にて測定した。培養上清を希釈して酵素溶液を調製した。１ｍＭ ｐＮＰ－β－Ｘｙｌｏｂｉｏｓｉｄｅ溶液（５０ｍＭ Ｎａ－ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ５．０）を基質溶液とした。酵素溶液２０μＬに基質溶液８０μＬを加えて５０℃で１０分間反応後、１００μＬの１Ｍ Ｎａ2Ｃｏ3溶液を加えて反応停止させた。その後４２０ｎｍの吸光度を測定した。ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌを用いて同様の操作を行うことで、検量線を作製した。１分間に１μｍｏｌのｐＮＰを遊離させる酵素量を１Ｕと定義し、各培養液中のＸＹＮ３の活性を求めた。その結果、Ｅ１ＡＢ１株を宿主とする１２２０７９プロモーター誘導性ＸＹＮ３発現株（Ｅ１ＡＢ１Ｐ１２２０７９）、６８４６６プロモーター誘導性ＸＹＮ３発現株（Ｅ１ＡＢ１Ｐ６８４６６）及び６８５８５プロモーター誘導性ＸＹＮ３発現株（Ｅ１ＡＢ１Ｐ６８５８５）では、エリスリトール添加直後０時間の時点と比較して、添加４時間後の時点でＸＹＮ３の活性が向上しているものの、２４時間後の時点では４時間後と同等又は僅かに高い活性を示した（表６）。
（１）で回収した培養液中のキシラナーゼ（ＸＹＮ３）活性をｐＮＰ（ｐ－Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）法にて測定した。培養上清を希釈して酵素溶液を調製した。１ｍＭ ｐＮＰ－β－Ｘｙｌｏｂｉｏｓｉｄｅ溶液（５０ｍＭ Ｎａ－ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ５．０）を基質溶液とした。酵素溶液２０μＬに基質溶液８０μＬを加えて５０℃で１０分間反応後、１００μＬの１Ｍ Ｎａ2Ｃｏ3溶液を加えて反応停止させた。その後４２０ｎｍの吸光度を測定した。ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌを用いて同様の操作を行うことで、検量線を作製した。１分間に１μｍｏｌのｐＮＰを遊離させる酵素量を１Ｕと定義し、各培養液中のＸＹＮ３の活性を求めた。その結果、Ｅ１ＡＢ１株を宿主とする１２２０７９プロモーター誘導性ＸＹＮ３発現株（Ｅ１ＡＢ１Ｐ１２２０７９）、６８４６６プロモーター誘導性ＸＹＮ３発現株（Ｅ１ＡＢ１Ｐ６８４６６）及び６８５８５プロモーター誘導性ＸＹＮ３発現株（Ｅ１ＡＢ１Ｐ６８５８５）では、エリスリトール添加直後０時間の時点と比較して、添加４時間後の時点でＸＹＮ３の活性が向上しているものの、２４時間後の時点では４時間後と同等又は僅かに高い活性を示した（表６）。
【0083】
一方、Δ１２２０７９を宿主とする１２２０７９プロモーター誘導性ＸＹＮ３発現株（Δ１２２０７９Ｐ１２２０７９）、６８４６６プロモーター誘導性ＸＹＮ３発現株（Δ１２２０７９Ｐ６８４６６）及び６８５８５プロモーター誘導性ＸＹＮ３発現株（Δ１２２０７９Ｐ６８５８５）では、エリスリトール添加４時間後のＸＹＮ３活性がＥ１ＡＢ１株を宿主とするプロモーター誘導性ＸＹＮ３発現株よりも高い活性を示し、さらに２４時間後においては４時間後と比較して約２．５倍以上高い活性を示した（表６）。６８６０６プロモーター誘導性ＸＹＮ３発現株（Δ１２２０７９Ｐ６８６０６）も、上昇率はわずかではあるが、エリスリトール添加によってＸＹＮ３活性が上昇した。さらに、Δ６８４６６、Δ６８６０６及びΔ６８５８５を宿主とする６８４６６プロモーター誘導性ＸＹＮ３発現株（それぞれΔ６８４６６Ｐ６８４６６、Δ６８６０６Ｐ６８４６６及びΔ６８５８５Ｐ６８４６６）をそれぞれ実施例９の方法で培養し、培養上清中のＸＹＮ３活性を測定した結果、Ｅ１ＡＢ１株を宿主とするＸＹＮ３発現株（Ｅ１ＡＢ１Ｐ６８４６６）と比較して高いＸＹＮ３活性を示した（表７）。さらに、上記欠損変異株Δ１２２０７９、Δ６８４６６、Δ６８６０６及びΔ６８５８５の全てにおいて、４つのエリスリトール誘導性プロモーターＰ１２２０７９、Ｐ６８４６６、Ｐ６８６０６及びＰ６８５８５の各々に連結された遺伝子がエリスリトールの添加に応答して転写が誘導され、発現が長時間にわたって維持されることが確認された。したがって、該欠損変異株において該エリスリトール誘導性プロモーターの下流に目的遺伝子を連結することで、エリスリトール存在下で目的遺伝子の転写を長時間にわたって誘導することが可能となると考えられた。以上の結果から、エリスリトール資化関連遺伝子欠損変異株は、エリスリトール誘導性プロモーターを用いてタンパク質発現を誘導させることで、高いタンパク質生産性を示すことが示された。
【0084】
【表6】
【0085】
【表7】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】