特開 2024-37996 細胞リプログラミング

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024037996

(43)【公開日】2024-03-19

(54)【発明の名称】細胞リプログラミング

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20240312BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20240312BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20240312BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240312BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10

C12Q1/04 ZNA

C12N5/071

C12N15/12

【審査請求】有

【請求項の数】19

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023215034

(22)【出願日】2023-12-20

(62)【分割の表示】P 2021209469の分割

【原出願日】2016-12-23

(31)【優先権主張番号】2015905349

(32)【優先日】2015-12-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

(71)【出願人】

【識別番号】518224495

【氏名又は名称】モグリファイ リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100152308

【弁理士】

【氏名又は名称】中 正道

(74)【代理人】

【識別番号】100201558

【弁理士】

【氏名又は名称】亀井 恵二郎

(74)【代理人】

【識別番号】100125081

【弁理士】

【氏名又は名称】小合 宗一

(72)【発明者】

【氏名】フィラス、ジェイバー

(72)【発明者】

【氏名】ポロ、ジョゼ

(72)【発明者】

【氏名】ゴフ、ジュリアン

(72)【発明者】

【氏名】林崎 良英

(72)【発明者】

【氏名】ラッカム、オーウェン

(57)【要約】      （修正有）

【課題】１つの細胞タイプから他の細胞タイプに転換する方法及び組成物を提供する。
【解決手段】ソース細胞を標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を有する細胞に転換するのに必要な転写因子を決定する方法であって：－前記ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプ中の遺伝子の差次的発現を決定するステップと；－前記差次的遺伝子発現に基づいて、少なくとも１つのネットワークに亘って、前記ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプの各々における各転写因子（ＴＦ）に関するネットワークスコアを決定するステップであって、前記ネットワークは、遺伝子発現に影響する相互作用の情報を含む、ステップと；－ネットワークスコアと差次的遺伝子発現との情報の組み合わせに基づいて前記ＴＦをランク付けし、それによりソース細胞から標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を有する細胞への転換のための転写因子のセットを特定するステップと、を含む、方法とする。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ソース細胞を標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を有する細胞に転換するのに必要な転写因子を決定する方法であって：
－前記ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプ中の遺伝子の差次的発現を決定するステップと；
－前記差次的遺伝子発現に基づいて、少なくとも１つのネットワークに亘って、前記ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプの各々における各転写因子（ＴＦ）に関するネットワークスコアを決定するステップであって、前記ネットワークは、遺伝子発現に影響する相互作用の情報を含む、ステップと；
－ネットワークスコアと差次的遺伝子発現との情報の組み合わせに基づいて前記ＴＦをランク付けし、それによりソース細胞から標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を有する細胞への転換のための転写因子のセットを特定するステップと、を含む、方法。

【請求項2】

前記ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプ中の各差次的発現遺伝子に関する遺伝子スコアを決定するステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記遺伝子スコアが、前記差次的発現のｌｏｇ倍数変化と調整Ｐ値との組み合わせである、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記遺伝子スコアが、好ましくは背景に対する、ツリーベースの方法を使用して計算される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記ネットワークが、タンパク質－ＤＮＡ相互作用、タンパク質－ＤＮＡ及び／又はタンパク質－ＲＮＡ相互作用の情報を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記ネットワークが、遺伝子の転写因子及び調節領域の間の相互作用の情報を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記調節領域が、遺伝子のプロモーター領域である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

更に、遺伝子スコアを決定する前に、各遺伝子に関する発現データを収集するステップを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

更に、各細胞タイプからの前記ランク付けリストから、転写的に重複性のＴＦを除去するステップを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

ソース細胞を標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を有する細胞に転換するのに必要な転写因子を決定する方法であって：
－前記ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプ中の各遺伝子に関する発現データを収集するステップと；
－各サンプル中の各遺伝子に関するツリーベースの背景に対する差次的発現を計算した後、前記ｌｏｇ倍数変化及び調整Ｐ値を遺伝子スコアと組み合わせるステップと；
－各ＴＦ上に中心を置く少なくとも１つのサブネットワークに亘って、遺伝子スコアの加重和を実行することにより、各ＴＦに関するネットワークスコアを計算するステップと；－遺伝子スコアとネットワークスコアとの組み合わせに基づいて前記ＴＦをランク付けするステップと；
－各細胞タイプからのランク付けリストの比較に基づいて、任意の２つの細胞タイプ間の転換のための転写因子のセットを計算するステップと；場合により
－前記リストから転写的に重複性のＴＦを除去するステップと、を含み、
それにより、標的細胞タイプへのソース細胞タイプの転換に必要な前記転写因子を決定する、方法。

【請求項11】

ソース細胞をリプログラミングする方法であって、前記ソース細胞における１つ又は転写因子、又はその変異体のタンパク質発現を増大させることを含み、前記ソース細胞は、標的細胞の少なくとも１つの特徴を有するようにリプログラミングされ：
－前記ソース細胞は、皮膚線維芽細胞、上皮角化細胞、胚性幹細胞、単球又は心臓線維芽細胞からなる群から選択され；
－前記標的細胞は、軟骨細胞、毛包、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ－細胞、造血性（ｈａｅｍｏｐｏｅｉｔｉｃ）幹細胞（ＨＳＣ）、脂肪の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、骨髄の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆体、骨格筋細胞、平滑筋細胞及び胎児心筋細胞からなる群から選択され；
－前記転写因子は、表４に列挙したものの１つ以上である、方法。

【請求項12】

標的細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞をソース細胞から生成する方法であって：
－ソース細胞において１つ以上の転写因子、又はその変異体の量を増大させることと；
－標的細胞を分化させるのに十分な時間及び条件下で、前記ソース細胞を培養し；それにより標的細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞をソース細胞から生成することと、を含み：
－前記ソース細胞は、皮膚線維芽細胞、上皮角化細胞、胚性幹細胞、単球又は心臓線維芽細胞からなる群から選択され；
－前記標的細胞は、軟骨細胞、毛包、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ（ナチュラルキラー）－細胞、造血性（ｈａｅｍｏｐｏｅｉｔｉｃ）幹細胞（ＨＳＣ）、脂肪の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、骨髄の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆体、骨格筋細胞、平滑筋細胞及び胎児心筋細胞からなる群から選択され；
－前記転写因子は、表４に列挙したものの１つ以上である、方法。

【請求項13】

１つ以上の転写因子、又はその変異体の量が、ソース細胞において、前記ソース細胞を前記転写因子の発現を増大させる剤と接触させることにより増大される、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記剤が：ヌクレオチド配列、タンパク質、アプタマー及び小分子、リボソーム、ＲＮＡｉ剤及びペプチド－核酸（ＰＮＡ）並びにその類似体又は変異体からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

１つ以上の転写因子の量が、表４に列挙される転写因子タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を導入することにより増大される、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記ソース細胞が皮膚線維芽細胞であり、
（ａ）前記標的細胞が軟骨細胞であり、前記転写因子がＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２及びＡＨＲの任意の１つ以上であり；
（ｂ）前記標的細胞が毛包であり、前記転写因子がＺＩＣ１、ＰＲＲＸ２、ＲＡＲＢ、ＶＤＲ、ＦＯＸＤ１及びＣＲＥＢ３の任意の１つ以上であり；
（ｃ）前記標的細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞であり、前記転写因子がＲＯＲＡ、ＬＥＦ１、ＪＵＮ、ＦＯＳ及びＢＡＣＨ２の任意の１つ以上であり；
（ｄ）前記標的細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞であり、前記転写因子がＲＯＲＡ、ＦＯＳ、ＳＭＡＤ７、ＪＵＮ及びＲＵＮＸ３の任意の１つ以上であり；
（ｅ）前記標的細胞がＮＫ細胞であり、前記転写因子がＲＯＲＡ、ＳＭＡＤ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ及びＮＦＡＴＣ２の任意の１つ以上であり；
（ｆ）前記標的細胞がＨＳＣであり、前記転写因子がＭＹＢ、ＧＡＴＡ１、ＧＦＩ１及びＧＦＩ１Ｂの任意の１つ以上であり；
（ｇ）前記標的細胞が脂肪のＭＳＣであり、前記転写因子がＮＯＴＣＨ３、ＨＩＣ１、ＩＤ１、ＥＳＲＲＡ、ＩＲ１、ＳＩＸ５、ＳＲＥＢＦ１及びＳＮＡＩ２の任意の１つ以上であり；
（ｈ）前記標的細胞が骨髄のＭＳＣであり、前記転写因子がＳＩＸ１、ＩＤ１、ＨＯＸＡ７、ＦＯＸＣ２、ＨＯＸＡ９、ＭＡＦＢ及びＩＲＸ５の任意の１つ以上であり；
（ｉ）前記標的細胞がオリゴデンドロサイト前駆体であり、前記転写因子がＮＫＸ２－１、ＡＮＫＲＤ１、ＦＯＸＡ２、ＣＤＨ１、ＺＦＰ４２、ＩＧＦ１、ＩＣＡＭ１及びＦＯＳの任意の１つ以上であり；
（ｊ）前記標的細胞が骨格筋細胞であり、前記転写因子がＭＹＯＧ、ＨＩＣ１、ＭＹＯＤ１、ＦＯＸＤ１、ＰＩＴＸ３、ＳＩＸ２、ＨＯＸＡ７及びＪＵＮＢの任意の１つ以上であり；
（ｋ）前記標的細胞が平滑筋細胞であり、前記転写因子がＧＡＴＡ６、ＬＩＦ、ＪＵＮＢ、ＣＲＥＢ３、ＭＥＩＳ１及びＰＢＸ１の任意の１つ以上であり；
（ｌ）前記標的細胞が胎児心筋細胞であり、前記転写因子がＢＭＰ１０、ＧＡＴＡ６、ＴＢＸ５、ＦＨＬ２、ＮＫＸ２－５、ＨＡＮＤ２、ＧＡＴＡ４及びＰＰＡＲＧＣ１Ａの任意の１つ以上であり、
（ｍ）前記標的細胞が星状細胞であり、前記転写因子がＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＡＲＮＴ２、Ｅ２Ｆ５、ＰＢＸ１、ＳＭＡＤ１及びＲＵＮＸ２の任意の１つ以上であり；
（ｎ）前記標的細胞が上皮細胞であり、前記転写因子がＦＯＳ、ＤＢＰ、ＨＥＳ１、ＦＯＸＡ２、ＥＳＲＲＡ、ＣＤＨ１、ＦＯＸＱ１及びＰＡＸ６の任意の１つ以上であり；
（ｏ）前記標的細胞が内皮細胞であり、前記転写因子がＳＯＸ１７、ＳＭＡＤ１、ＴＡＬ１、ＩＲＦ１、ＴＣＦ７Ｌ１、ＭＸＤ４及びＪＵＮＢの任意の１つ以上であり；又は
（ｐ）前記標的細胞が角化細胞であり、前記転写因子がＦＯＸＱ１、ＳＯＸ９、ＭＡＦＢ、ＣＤＨ１、ＦＯＳ及びＲＥＬの任意の１つ以上である、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記ソース細胞が上皮角化細胞であり、
（ａ）前記標的細胞が軟骨細胞であり、前記転写因子がＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＴＧＦＢ３、ＦＯＸＣ１及びＳＩＸ２の任意の１つ以上であり；
（ｂ）前記標的細胞が毛包であり、前記転写因子がＲＵＮＸ１Ｔ１、ＺＩＣ１、ＰＲＲＸ１、ＭＳＸ１、ＥＢＦ１、ＦＯＸＤ１及びＲＵＮＸ２の任意の１つ以上であり；
（ｃ）前記標的細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞であり、前記転写因子がＲＯＲＡ、ＬＥＦ１、ＪＵＮ、ＦＯＳ及びＮＲ３Ｃ１の任意の１つ以上であり；
（ｄ）前記標的細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞であり、前記転写因子がＲＯＲＡ、ＦＯＳ、ＳＭＡＤ７、ＪＵＮ及びＲＵＮＸ３の任意の１つ以上であり；
（ｅ）前記標的細胞がＮＫ細胞であり、前記転写因子がＲＯＲＡ、ＳＭＡＤ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＮＦＡＴＣ２及びＲＵＮＸ３の任意の１つ以上であり；
（ｆ）前記標的細胞がＨＳＣであり、前記転写因子がＭＹＢ、ＧＡＴＡ１、ＧＦＩ１及びＧＦＩ１Ｂの任意の１つ以上であり；
（ｇ）前記標的細胞が脂肪のＭＳＣであり、前記転写因子がＴＷＩＳＴ１、ＨＩＣ１、ＩＤ１、ＭＳＸ１、ＩＲＦ１、ＨＯＸＢ７、ＳＮＡＩ２及びＥ２Ｆ１の任意の１つ以上であり；
（ｈ）前記標的細胞が骨髄のＭＳＣであり、前記転写因子がＳＩＸ１、ＴＷＳＩＴ１、ＩＤ１、ＨＭＯＸ１、ＦＯＸＣ２及びＨＯＸＡ７の任意の１つ以上であり；
（ｉ）前記標的細胞がオリゴデンドロサイト前駆体細胞であり、前記転写因子がＮＫＸ２－１、ＡＮＫＲＤ１、ＺＦＰ４２、ＦＯＳ、ＩＧＦ１、ＩＣＡＭ１、ＦＯＸＡ２及びＣＤ
Ｈ１の任意の１つ以上であり；
（ｊ）前記標的細胞が骨格筋細胞であり、前記転写因子がＭＹＯＧ、ＭＹＯＤ１、ＲＦ１、ＰＩＴＸ３、ＨＯＸＡ７、ＦＯＸＤ１及びＳＯＸ８の任意の１つ以上であり；
（ｋ）前記標的細胞が平滑筋細胞であり、前記転写因子がＩＲＦ１、ＧＡＴＡ６、ＬＩＦ及びＭＥＩＳ１の任意の１つ以上であり；
（ｌ）前記標的細胞が内皮細胞であり、前記転写因子がＳＯＸ１７、ＴＡＬ１、ＳＭＡＤ１、ＩＲＦ１、ＴＣＦ７Ｌ１及びＨＯＸＢ７の任意の１つ以上であり；又は
（ｍ）前記標的細胞が上皮細胞であり、前記転写因子がＮＯＴＣＨ１、ＨＲ、ＤＢＰ、ＯＴＸ１、ＥＳＲＲＡ、ＦＯＸＱ１、ＰＡＸ６及びＩＲＸ５の任意の１つ以上である、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記ソース細胞が胚性幹細胞であり、
（ａ）前記標的細胞が軟骨細胞であり、前記転写因子がＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６及びＮＦＫＢ１の任意の１つ以上であり；
（ｂ）前記標的細胞が毛包であり、前記転写因子がＴＷＩＳＴ１、ＺＩＣ１、ＮＲ２Ｆ２、ＰＲＲＸ１、ＮＦＫＢ１及びＡＨＲの任意の１つ以上であり；
（ｃ）前記標的細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞であり、前記転写因子がＲＯＲＡ、ＬＥＦ１、ＪＵＮ、ＦＯＳ及びＢＡＣＨ２の任意の１つ以上であり；
（ｄ）前記標的細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞であり、前記転写因子がＲＯＲＡ、ＦＯＳ、ＳＭＡＤ７及びＪＵＮの任意の１つ以上であり；
（ｅ）前記標的細胞がＮＫ細胞であり、前記転写因子がＲＯＲＡ、ＳＭＡＤ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ及びＮＦＡＴＣ２の任意の１つ以上であり；
（ｆ）前記標的細胞がＨＳＣであり、前記転写因子がＭＹＢ、ＩＬ１Ｂ、ＫＬＦ１、ＧＡＴＡ１、ＧＦＩ１、ＧＦＩ１Ｂ及びＮＦＥ２の任意の１つ以上であり；
（ｇ）前記標的細胞が脂肪のＭＳＣであり、前記転写因子がＴＷＩＳＴ１、ＳＮＡＩ２、ＩＲＦ１、ＭＸＤ４、ＮＦＫＢ１、ＭＳＸ１、ＨＯＸＢ７及びＥＳＲＲＡの任意の１つ以上であり；
（ｈ）前記標的細胞が骨髄のＭＳＣであり、前記転写因子がＩＲＦ１、ＲＵＮＸ１、ＣＥＢＰＢ、ＡＨＲ、ＦＯＸＣ２及びＨＯＸＡ９の任意の１つ以上であり；
（ｉ）前記標的細胞がオリゴデンドロサイト前駆体細胞であり、前記転写因子がＮＫＸ２－１、ＡＮＫＲＤ１、ＦＯＸＡ２、ＬＭＯ３、ＦＯＳ、ＩＧＦ１、ＩＣＡＭ１及びＣＤＨ１の任意の１つ以上であり；
（ｊ）前記標的細胞が骨格筋細胞であり、前記転写因子がＭＹＯＧ、ＩＲＦ１、ＭＹＯＤ１、ＦＯＸＤ１、ＮＦＫＢ１、ＪＵＮＢ及びＨＯＸＡ７の任意の１つ以上であり；
（ｋ）前記標的細胞が平滑筋細胞であり、前記転写因子がＩＲＦ１、ＮＦＫＢ１、ＪＵＮＢ、ＦＯＳＬ２、ＧＡＴＡ６及びＭＥＩＳ１の任意の１つ以上であり；
（ｌ）前記標的細胞が星状細胞であり、前記転写因子がＩＲＦ１、ＳＯＸ９、ＡＲＮＴ２、ＰＡＸ６、ＳＮＡＩ２、ＲＵＮＸ２及びＳＯＸ５の任意の１つ以上であり；
（ｍ）前記標的細胞が内皮細胞であり、前記転写因子がＳＯＸ１７、ＳＭＡＤ１、ＴＡＬ１、ＨＯＸＢ７、ＪＵＮＢ、ＮＦＫＢ１及びＩＲＦ１の任意の１つ以上であり；
（ｎ）前記標的細胞が上皮細胞であり、前記転写因子がＭＹＣ、ＩＬ１Ｂ、ＦＯＳ、ＮＦＫＢ１、ＥＳＲＲＡ、ＦＯＸＱ１、ＩＲＦ１及びＰＡＸ６の任意の１つ以上であり；又は（ｏ）前記標的細胞が角化細胞であり、前記転写因子がＳＯＸ９、ＮＦＫＢ１、ＭＹＣ、ＮＲ２Ｆ２、ＦＯＳＬ２、ＦＯＳＬ１及びＡＨＲである、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記ソース細胞が単球細胞であり、
（ａ）前記標的細胞がＨＳＣであり、前記転写因子がＭＹＢ、ＩＬ１Ｂ、ＧＡＴＡ１、ＧＦＩ１及びＧＦＩ１Ｂの任意の１つ以上である、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記ソース細胞が心臓線維芽細胞であり、前記標的細胞が胎児心筋細胞であり、前記転写因子がＢＭＰ１０、ＧＡＴＡ６、ＴＢＸ５、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２－５及びＧＡＴＡ４の任意の１つ以上である、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記ソース細胞が間葉系幹細胞であり、前記標的細胞が星状細胞であり、前記転写因子がＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＡＲＮＴ２、ＭＹＢＬ２、ＰＯＵ３Ｆ２、Ｅ２Ｆ１及びＨＭＧＢ２の任意の１つ以上である、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記ソース細胞が多能性幹細胞であり、
（ａ）前記標的細胞が星状細胞であり、前記転写因子がＰＡＸ６、ＰＯＵ３Ｆ２、ＳＮＡＩ２、ＲＵＮＸ２、ＳＯＸ５、Ｅ２Ｆ５及びＨＭＧＢ２の任意の１つ以上であり；
（ｂ）前記標的細胞が角化細胞であり、前記転写因子がＴＰ６３、ＴＦＡＰ２Ａ、ＭＹＣ、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＯＸ９及びＮＦＫＢ１の任意の１つ以上であり；又は
（ｃ）前記標的細胞が内皮細胞であり、前記転写因子がＳＯＸ１７、ＴＡＬ１、ＨＯＸＢ７、ＮＦＫＢ１、ＩＲＦ１、ＳＭＡＤ１及びＪＵＮＢの任意の１つ以上である、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記標的細胞の前記少なくとも１つの特徴が、任意の１つ以上の標的細胞マーカーの上方調節、及び／又は細胞形態における変化である、請求項１２～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

以下の標的細胞に関する前記マーカーが：
－軟骨細胞：ＣＤ４９、ＣＤ１０、ＣＤ９、ＣＤ９５、インテグリンα１０β１，１０５、及び硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の産生；
－毛包：ＣＤ２００、ＰＨＬＤＡ１及びフォリスタチン；
－ＣＤ４＋Ｔ－細胞：ＣＤ３、ＣＤ４；
－ＣＤ８＋Ｔ－細胞：ＣＤ３、ＣＤ８；
－ＮＫ－細胞：ＣＤ５６、ＣＤ２；
－ＨＳＣ：ＣＤ４５、ＣＤ１９／２０、ＣＤ１４／１５、ＣＤ３４、ＣＤ９０；
－脂肪のＭＳＣ：ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０、ＣＤ４５、及びインビトロでの骨芽細胞、脂肪細胞及び軟骨細胞に向かった分化；
－骨髄のＭＳＣ：ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０、及びインビトロでの骨芽細胞、脂肪細胞及び軟骨細胞に向かった分化；
－オリゴデンドロサイト及びオリゴデンドロサイト前駆体；ＮＧ２及びＰＤＧＦＲα Ｏｌｉｇ２及びＮｋｘ２．２に関するＱＰＣＲ；
－骨格筋細胞：ＭｙｏＤ、ミオゲニン及びデスミン；
－平滑筋細胞：ミオカルディン、平滑筋αアクチン及び平滑筋ミオシン重鎖；
－胎児心筋細胞：ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＨ６、ＡＣＴＮ１、ＣＤＨ２及びＧＪＡ１；
－内皮細胞：ＰｅＣＡＭ（ＣＤ３１）、ＶＥ－カドヘリン及びＶＥＧＦＲ２；
－角化細胞：ケラチン１、ケラチン１４、パンケラチン及びインボルクリン；
－星状細胞：ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ及びＡＬＤＨ１Ｌ１；並びに
－上皮細胞：サイトケラチン１５（ＣＫ１５）、サイトケラチン３（ＣＫ３）、インボルクリン及びコネキシン４を含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

標的細胞に分化させるのに十分な時間及び条件下で前記ソース細胞を培養させることが、表９に示される関連する培地中で前記細胞を少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間培養することを含む、請
求項１２～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

更に、前記標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を有する細胞を個人に投与するステップを含む、請求項１２～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

請求項１２～２６のいずれか一項に記載の方法により生成された、標的細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞。

【請求項28】

細胞の少なくとも５％が前記標的細胞の少なくとも１つの特徴を有し、請求項１２～２６のいずれか一項に記載の方法により生成される、細胞集団。

【請求項29】

前記集団中の前記細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が、前記標的細胞の少なくとも１つの特徴を有する、請求項２８に記載の細胞集団。

【請求項30】

標的細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を製造するための、請求項１２～２６のいずれか一項に記載の方法における使用のためのキットであって、本明細書に記載した転写因子又はその変異体をコードする１つ以上の核酸配列を有する１つ以上の核酸を含み、場合により更に、ソース細胞を標的細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞にリプログラミングするための指示書を含む、キット。

【請求項31】

前記標的細胞タイプへのソース細胞タイプの転換を促進するのに有用な剤を特定する方法であって：
－本明細書に記載した任意の方法により、標的細胞タイプへのソース細胞タイプの転換に必要な１つ以上の転写因子を決定するステップと；
－標的細胞タイプへのソース細胞タイプの転換に必要な前記１つ以上の転写因子の量を増大させる能力に関して１つ以上の候補剤をスクリーニングするステップと；
を含み、
前記１つ以上の転写因子の前記量を増大させる剤は、前記標的細胞タイプへのソース細胞タイプの前記転換を促進するのに有用な剤である、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、その開示全体が本明細書に完全に組み込まれるオーストラリア仮特許出願第２０１５９０５３４９号明細書による優先権を主張する。

【0002】

本発明は、１つの細胞タイプから他の細胞タイプに転換する方法及び組成物に関する。詳細には、本発明は、異なる細胞タイプへの細胞の分化転換に関する。

【背景技術】

【0003】

細胞ベースの再生療法は、傷害、疾病又は年齢により損傷した組織を補充するために特定の細胞タイプの生成を必要とする。胚性幹細胞（ＥＳＣ）は（ヒト）身体から全細胞タイプに分化する可能性を有し、従って補充療法のソースとして広範に研究されている。しかしながら、ＥＳＣは培養した胚盤胞から樹立されるため、患者特異的に誘導することができない。従って、免疫拒絶及び倫理的な問題が、ＥＳＣ技術、特にヒトＥＳＣ技術の臨床適用への移行を阻止する主な障壁となっている。

【0004】

細胞補充療法は、自身の容易にアクセス可能な組織、例えば皮膚又は血液から直接、治療的に重要な様々な細胞タイプを迅速に生成する可能性を有する。そのような免疫学的に一致した細胞は、移植後の拒絶の危険性も低いであろう。更に、これらの細胞は高分化しているため、より低い腫瘍形成能が現れるであろう。

【0005】

多能性状態を経ない、１つの細胞タイプから他の細胞タイプへの転換プロセスである分化転換は、再生医療において非常に有望であり得るが、未だに高い信頼性のもとで適用されていない。１つの体細胞タイプの表現型を他の表現型に変えることは可能であり得るが、転換に必要な要素は、特定が困難であり、殆どの場合未知である。細胞タイプの独自性を直接リプログラミングする因子の特定は、現在、中でも特に、不十分かつ極めることのできない手法である、妥当な因子のセットの包括的な実験的試験の費用により制限されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

１つの細胞タイプから他の細胞タイプに転換するのに必要な因子を特定する新しい及び／又は改善された方法が必要とされている。治療的用途に使用される細胞及び細胞集団も必要とされている。

【0007】

明細書における任意の先行技術に対する参照は、この先行技術が任意の管轄権内の通常の一般的知識の一部を形成し、又は、この先行技術が当業者によって他の先行技術の一部として理解され、関連するものとして見なされ、及び／又は組み合わされ得ることを合理的に予測し得ることの承認又は示唆ではない。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、遺伝子発現データを調節ネットワーク情報と組み合わせて、細胞転換（即ち、ソース細胞を、標的細胞タイプの特徴を示す細胞に転換する）を誘導するのに必要なリプログラミング因子を予測する予測的フレームワークに関する。このフレームワークは、既知の分化転換に使用される転写因子、及び実験的に検証された以前未知であった分化転換に関する転写因子を正確に予測する。本発明はまた、標的細胞タイプの特徴を有する細胞へのソース細胞の直接リプログラミング（即ち、分化転換又は細胞リプログラミング）のための方法及び組成物に関する。

【0009】

本発明は、ソース細胞を標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を有する細胞に転換するのに必要な転写因子を決定する方法を提供し、該方法は：
－ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプ中の遺伝子の差次的発現を決定するステップと；－差次的遺伝子発現に基づいて、少なくとも１つのネットワークに亘って、ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプの各々における各転写因子（ＴＦ）に関するネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、遺伝子発現に影響する相互作用の情報を含む、ステップと；
－ネットワークスコアと差次的遺伝子発現との情報の組み合わせに基づいてＴＦをランク付けし、それによりソース細胞から標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を有する細胞への転換のための転写因子のセットを特定するステップと、を含む。

【0010】

本発明は、ソース細胞を標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を有する細胞に転換させるのに必要な転写因子を決定する方法を提供し、該方法は：
－ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプ中の各差次的発現遺伝子に関する遺伝子スコアを決定するステップと；
－少なくとも１つのネットワークに亘って、各遺伝子スコアの加重和を実行することにより、ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプの各々における各転写因子（ＴＦ）に関するネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、遺伝子発現に影響する相互作用の情報を含む、ステップと；
－遺伝子スコアとネットワークスコアとの組み合わせに基づいてＴＦをランク付けするステップと；
－各細胞タイプに関するランク付けリストの比較に基づいて、ソース細胞から標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を有する細胞への転換のための転写因子のセットを特定するステップと、を含む。

【0011】

好ましくは、遺伝子スコアは、差次的発現のｌｏｇ倍数変化と調整Ｐ値との組み合わせである。遺伝子スコアは、ツリーベースの方法又はＢａｙｅｓｉａｎクラスタリングに基づいて計算することができる。

【0012】

好ましくは、ネットワークは、タンパク質－ＤＮＡ相互作用、タンパク質－ＤＮＡ、タンパク質－ＲＮＡ相互作用の情報を含む。典型的には、ネットワークは、遺伝子の転写因子及び調節領域の間の相互作用の情報を含む。典型的には、調節領域は、遺伝子のプロモーター領域である。

【0013】

好ましくは、本方法は更に、遺伝子スコアを決定する前に、各遺伝子に関する発現データを収集するステップを含む。

【0014】

好ましくは、本方法は更に、各細胞タイプからのランク付けリストから、転写的に重複性のＴＦを除去するステップを含む。

【0015】

本発明は、ソース細胞を標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を有する細胞に転換するのに必要な転写因子を決定する方法を提供し、該方法は：
－ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプ中の各遺伝子に関する発現データを収集するステップと；
－各サンプル中の各遺伝子に関するツリーベースの背景に対する差次的発現を計算した後、ｌｏｇ倍数変化及び調整Ｐ値を遺伝子スコアと組み合わせるステップと；
－各ＴＦ上に中心を置く少なくとも１つのサブネットワークに亘って、遺伝子スコアの加重和を実行することにより、各ＴＦに関するネットワークスコアを計算するステップと；－遺伝子スコアとネットワークスコアとの組み合わせに基づいてＴＦをランク付けするス
テップと；
－各細胞タイプからのランク付けリストの比較に基づいて、任意の２つの細胞タイプ間の転換のための転写因子のセットを計算するステップと；場合により
－リストから転写的に重複性のＴＦを除去するステップと、を含み、
それにより、標的細胞タイプへのソース細胞タイプの転換に必要な転写因子を決定する。

【0016】

本発明は、ソース細胞を標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を有する細胞に転換するのに必要な転写因子を決定する方法を提供し、該方法は：
－各サンプル（ｓ）における各遺伝子（ｘ）に関する発現データを収集するステップと；－各サンプルにおける各遺伝子に関するツリーベースの背景に対する差次的発現を計算した後、ｌｏｇ倍数変化

【数1】

及び調整Ｐ値

【数2】

を遺伝子スコア

【数3】

と組み合わせるステップと、
－各ＴＦ上に中心を置く２つの異なるサブネットワークに亘って、遺伝子スコアの加重和を実行することにより、各ＴＦ（ｘ）に関するネットワークスコア

【数4】

を計算するステップと；
－

【数5】

スコアの組み合わせに基づいてＴＦをランク付けするステップと；
－各細胞タイプからのランク付けリストの比較に基づいて、任意の２つの細胞タイプ間の転換のための転写因子のセットを計算するステップと、
－リストから転写的に重複性のＴＦを除去するステップと、を含み、
それにより、標的細胞タイプへのソース細胞タイプの転換に必要な転写因子を決定する。

【0017】

好ましくは、特定された転写因子のセットは、標的細胞タイプにおいて発現された遺伝子の少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の発現に影響を与えるものである。

【0018】

ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプは、ＦＡＮＴＯＭ５データセットに記載されている任意の細胞タイプ、又は表４を含む本明細書に記載されている任意の細胞タイプであり
得る。

【0019】

典型的には、サブネットワークは、ＭＡＲＡが適用された遺伝子発現データ、又はＳＴＲＩＮＧデータベース（本明細書で

【数6】

と称される）であるが、遺伝子発現に影響する転写因子の相互作用に関する情報を含む、本明細書に言及する任意のサブネットワークを使用することができる。

【0020】

好ましくは、本方法は更に、それらの必要なＴＦに基づいて２Ｄ面上に細胞タイプを配置し、選択されたＴＦにより直接調節される必要な遺伝子の平均適用範囲に基づいて高さを加えることにより、細胞転換景観を形成するステップを含む。

【0021】

好ましくは、本明細書に記載した任意の方法は、更に、それらの必要なＴＦに基づいて２Ｄ面上に細胞タイプを配置し、選択されたＴＦにより直接調節される必要な遺伝子の平均適用範囲に基づいて高さを加えることにより、細胞転換景観を形成するステップを含む。

【0022】

上述した本発明の任意の方法において、方法は更に、ソース細胞タイプにおいて、標的細胞タイプへのソース細胞タイプの転換に必要であると決定された転写因子の量を増大させるステップを含む。

【0023】

本発明は、標的細胞タイプへのソース細胞タイプの転換を促進するのに有用な剤を特定する方法を提供し、該方法は：
－本明細書に記載した任意の方法により、標的細胞タイプへのソース細胞タイプの転換に必要な１つ以上の転写因子を決定するステップと；
－標的細胞タイプへのソース細胞タイプの転換に必要な１つ以上の転写因子の量を増大させる能力に関して１つ以上の候補剤をスクリーニングするステップと；
を含み、
１つ以上の転写因子の量を増大させる剤は、標的細胞タイプへのソース細胞タイプの転換を促進するのに有用な剤である。

【0024】

好ましくは、候補剤は、非限定に、タンパク質（抗体又はその断片又は抗体模倣物等）、ペプチド、核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸を含む）、炭水化物、有機化合物、小分子、天然物、ライブラリー抽出物、体液を含む、試験を望まれる任意の化合物であり得る。候補化合物は、ライブラリー、例えば変更物又は修飾物を含む化合物の収集物の一部であってもよい。

【0025】

本発明は、ソース細胞をリプログラミングする方法を提供し、該方法は、ソース細胞における１つ又は転写因子、又はその変異体のタンパク質発現を増大させることを含み、ソース細胞は、標的細胞の少なくとも１つの特徴を有するようにリプログラミングされ：
－ソース細胞は、皮膚線維芽細胞、上皮角化細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、単球又は心臓線維芽細胞からなる群から選択され；
－標的細胞は、軟骨細胞、毛包、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ－細胞、造血性（ｈａｅｍｏｐｏｅｉｔｉｃ）幹細胞（ＨＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、脂肪のＭＳＣ、骨髄のＭＳＣ、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆体、骨格筋細胞、平滑筋細胞、胎児心筋細胞、上皮細胞、内皮細胞、角化細胞及び星状細胞からなる群から選択され；
－転写因子は、表４に列挙したものの１つ以上である。

【0026】

本発明は、標的細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞をソース細胞から生成する方法を提供し、該方法は：
－ソース細胞において１つ以上の転写因子、又はその変異体の量を増大させることと；
－標的細胞に分化させるのに十分な時間及び条件下で、ソース細胞を培養し；それにより標的細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞をソース細胞から生成することと、を含み：
－ソース細胞は、皮膚線維芽細胞、上皮角化細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、単球又は心臓線維芽細胞からなる群から選択され；
－標的細胞は、軟骨細胞、毛包、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ（ナチュラルキラー）－細胞、造血性（ｈａｅｍｏｐｏｅｉｔｉｃ）幹細胞（ＨＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、脂肪のＭＳＣ、骨髄のＭＳＣ、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆体、骨格筋細胞、平滑筋細胞、胎児心筋細胞、上皮細胞、内皮細胞、角化細胞及び星状細胞からなる群から選択され；
－転写因子は、表４に列挙したものの１つ以上である。

【0027】

本発明はまた、表４に列挙したソース細胞をリプログラミングする方法を提供し、該方法は、ソース細胞において表４の転写因子又はその変異体のタンパク質発現を増大させることを含み、ソースは、標的細胞の少なくとも１つの特徴を有するようにリプログラミングされる。

【0028】

本発明は、ソース細胞を、標的細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞にリプログラミングする方法を提供し、該方法は：ｉ）ソース細胞、又はソース細胞を含む細胞集団を提供することと；ｉｉ）前記ソース細胞に、１つ以上の転写因子をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸をトランスフェクトすることと；ｉｉｉ）前記細胞又は細胞集団を培養し、場合により細胞又は細胞集団を標的細胞の少なくとも１つの特徴に関して監視することと、を含み：
－ソース細胞は、皮膚線維芽細胞、上皮角化細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、単球又は心臓線維芽細胞からなる群から選択され；
－標的細胞は、軟骨細胞、毛包、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ－細胞、造血性（ｈａｅｍｏｐｏｅｉｔｉｃ）幹細胞（ＨＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、脂肪のＭＳＣ、骨髄のＭＳＣ、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆体、骨格筋細胞、平滑筋細胞 胎児心筋細胞、上皮細胞、内皮細胞、角化細胞及び星状細胞からなる群から選択され；
－転写因子は、表４に列挙したものの１つ以上である。

【0029】

本明細書に記載した本発明の任意の方法において、ソース細胞は線維芽細胞であり、
（ａ）標的細胞は軟骨細胞であり、転写因子はＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２及びＡＨＲの任意の１つ以上であり；
（ｂ）標的細胞は毛包であり、転写因子はＺＩＣ１、ＰＲＲＸ２、ＲＡＲＢ、ＶＤＲ、ＦＯＸＤ１及びＣＲＥＢ３の任意の１つ以上であり；
（ｃ）標的細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞であり、転写因子はＲＯＲＡ、ＬＥＦ１、ＪＵＮ、ＦＯＳ及びＢＡＣＨ２の任意の１つ以上であり；
（ｄ）標的細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であり、転写因子はＲＯＲＡ、ＦＯＳ、ＳＭＡＤ７、ＪＵＮ及びＲＵＮＸ３の任意の１つ以上であり；
（ｅ）標的細胞はＮＫ細胞であり、転写因子はＲＯＲＡ、ＳＭＡＤ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ及びＮＦＡＴＣ２の任意の１つ以上であり；
（ｆ）標的細胞はＨＳＣであり、転写因子はＭＹＢ、ＧＡＴＡ１、ＧＦＩ１及びＧＦＩ１Ｂの任意の１つ以上であり；
（ｇ）標的細胞は脂肪のＭＳＣであり、転写因子はＮＯＴＣＨ３、ＨＩＣ１、ＩＤ１、ＥＳＲＲＡ、ＩＲ１、ＳＩＸ５、ＳＲＥＢＦ１及びＳＮＡＩ２の任意の１つ以上であり；
（ｈ）標的細胞は骨髄のＭＳＣであり、転写因子はＳＩＸ１、ＩＤ１、ＨＯＸＡ７、ＦＯＸＣ２、ＨＯＸＡ９、ＭＡＦＢ及びＩＲＸ５の任意の１つ以上であり；
（ｉ）標的細胞はオリゴデンドロサイト前駆体であり、転写因子はＮＫＸ２－１、ＡＮＫＲＤ１、ＦＯＸＡ２、ＣＤＨ１、ＺＦＰ４２、ＩＧＦ１、ＩＣＡＭ１及びＦＯＳの任意の１つ以上であり；
（ｊ）標的細胞は骨格筋細胞であり、転写因子はＭＹＯＧ、ＨＩＣ１ ＭＹＯＤ１、ＦＯＸＤ１、ＰＩＴＸ３、ＳＩＸ２、ＨＯＸＡ７及びＪＵＮＢであり；
（ｋ）標的細胞は平滑筋細胞であり、転写因子はＧＡＴＡ６、ＬＩＦ、ＪＵＮＢ、ＣＲＥＢ３、ＭＥＩＳ１及びＰＢＸ１の任意の１つ以上であり；
（ｌ）標的細胞は胎児心筋細胞であり、転写因子はＢＭＰ１０、ＧＡＴＡ６、ＴＢＸ５、ＦＨＬ２、ＮＫＸ２－５、ＨＡＮＤ２、ＧＡＴＡ４及びＰＰＡＲＧＣ１Ａの任意の１つ以上であり；
（ｍ）標的細胞は星状細胞であり、転写因子はＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＡＲＮＴ２、Ｅ２Ｆ５、ＰＢＸ１、ＳＭＡＤ１、及びＲＵＮＸ２の任意の１つ以上であり、
（ｎ）標的細胞は上皮細胞であり、転写因子はＦＯＳ、ＤＢＰ、ＨＥＳ１、ＦＯＸＡ２、ＥＳＲＲＡ、ＣＤＨ１、ＦＯＸＱ１及びＰＡＸ６の任意の１つ以上であり；
（ｏ）標的細胞は内皮細胞であり、転写因子はＳＯＸ１７、ＳＭＡＤ１、ＴＡＬ１、ＩＲＦ１、ＴＣＦ７Ｌ１、ＭＸＤ４及びＪＵＮＢの任意の１つ以上であり；又は
（ｐ）標的細胞は角化細胞であり、転写因子はＦＯＸＱ１、ＳＯＸ９、ＭＡＦＢ、ＣＤＨ１、ＦＯＳ、及びＲＥＬの任意の１つ以上である。

【0030】

すぐ上の（ａ）～（ｐ）において、転写因子の全部を使用することができる。好ましくは、線維芽細胞は皮膚線維芽細胞である。

【0031】

本明細書に記載した本発明の任意の方法において、ソース細胞は角化細胞であり、
（ａ）標的細胞は軟骨細胞であり、転写因子はＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＴＧＦＢ３、ＦＯＸＣ１及びＳＩＸ２の任意の１つ以上であり；
（ｂ）標的細胞は毛包であり、転写因子はＲＵＮＸ１Ｔ１、ＺＩＣ１、ＰＲＲＸ１、ＭＳＸ１、ＥＢＦ１、ＦＯＸＤ１及びＲＵＮＸ２の任意の１つ以上であり；
（ｃ）標的細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞であり、転写因子はＲＯＲＡ、ＬＥＦ１、ＪＵＮ、ＦＯＳ及びＮＲ３Ｃ１の任意の１つ以上であり；
（ｄ）標的細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であり、転写因子はＲＯＲＡ、ＦＯＳ、ＳＭＡＤ７、ＪＵＮ及びＲＵＮＸ３の任意の１つ以上であり；
（ｅ）標的細胞はＮＫ細胞であり、転写因子はＲＯＲＡ、ＳＭＡＤ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＮＦＡＴＣ２及びＲＵＮＸ３の任意の１つ以上であり；
（ｆ）標的細胞はＨＳＣであり、転写因子はＭＹＢ、ＧＡＴＡ１、ＧＦＩ１及びＧＦＩ１Ｂの任意の１つ以上であり；
（ｇ）標的細胞は脂肪のＭＳＣであり、転写因子はＴＷＩＳＴ１、ＨＩＣ１、ＩＤ１、ＭＳＸ１、ＩＲＦ１、ＨＯＸＢ７、ＳＮＡＩ２及びＥ２Ｆ１の任意の１つ以上であり；
（ｈ）標的細胞は骨髄のＭＳＣであり、転写因子はＳＩＸ１、ＴＷＳＩＴ１、ＩＤ１、ＨＭＯＸ１、ＦＯＸＣ２及びＨＯＸＡ７の任意の１つ以上であり；
（ｉ）標的細胞はオリゴデンドロサイト前駆体細胞であり、転写因子はＮＫＸ２－１、ＡＮＫＲＤ１、ＺＦＰ４２、ＦＯＳ、ＩＧＦ１、ＩＣＡＭ１、ＦＯＸＡ２及びＣＤＨ１の任意の１つ以上であり；
（ｊ）標的細胞は骨格筋細胞であり、転写因子はＭＹＯＧ、ＭＹＯＤ１、ＲＦ１、ＰＩＴＸ３、ＨＯＸＡ７、ＦＯＸＤ１及びＳＯＸ８の任意の１つ以上であり；
（ｋ）標的細胞は平滑筋細胞であり、転写因子はＩＲＦ１、ＧＡＴＡ６、ＬＩＦ及びＭＥＩＳ１の任意の１つ以上であり；
（ｌ）標的細胞は内皮細胞であり、転写因子はＳＯＸ１７、ＴＡＬ１、ＳＭＡＤ１、ＩＲＦ１及びＴＣＦ７Ｌ１の任意の１つ以上であり、又は
（ｍ）標的細胞は上皮細胞であり、転写因子はＮＯＴＣＨ１、ＨＲ、ＤＢＰ、ＯＴＸ１、ＥＳＲＲＡ、ＦＯＸＱ１、ＰＡＸ６、及びＩＲＸ５の任意の１つ以上である。

【0032】

すぐ上の（ａ）～（ｍ）において、転写因子の全部を使用することができる。好ましくは、角化細胞は上皮角化細胞である。より好ましくは、角化細胞は口腔粘膜角化細胞である。より好ましくは、ソース細胞が粘膜角化細胞の場合、標的細胞は角膜上皮細胞である。

【0033】

本明細書に記載した本発明の任意の方法において、ソース細胞は胚性幹細胞であり、
（ａ）標的細胞は軟骨細胞であり、転写因子はＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６及びＮＦＫＢ１の任意の１つ以上であり；
（ｂ）標的細胞は毛包であり、転写因子はＴＷＩＳＴ１、ＺＩＣ１、ＮＲ２Ｆ２、ＰＲＲＸ１、ＮＦＫＢ１及びＡＨＲの任意の１つ以上であり；
（ｃ）標的細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞であり、転写因子はＲＯＲＡ、ＬＥＦ１、ＪＵＮ、ＦＯＳ及びＢＡＣＨ２の任意の１つ以上であり；
（ｄ）標的細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であり、転写因子はＲＯＲＡ、ＦＯＳ、ＳＭＡＤ７及びＪＵＮの任意の１つ以上であり；
（ｅ）標的細胞はＮＫ細胞であり、転写因子はＲＯＲＡ、ＳＭＡＤ７、ＦＯＳ、ＪＵＮ及びＮＦＡＴＣ２の任意の１つ以上であり；
（ｆ）標的細胞はＨＳＣであり、転写因子はＭＹＢ、ＩＬ１Ｂ、ＫＬＦ１、ＧＡＴＡ１、ＧＦＩ１、ＧＦＩ１Ｂ及びＮＦＥ２の任意の１つ以上であり；
（ｇ）標的細胞は脂肪のＭＳＣであり、転写因子はＴＷＩＳＴ１、ＳＮＡＩ２、ＩＲＦ１、ＭＸＤ４、ＮＦＫＢ１、ＭＳＸ１、ＨＯＸＢ７及びＥＳＲＲＡの任意の１つ以上であり；
（ｈ）標的細胞は骨髄のＭＳＣであり、転写因子はＩＲＦ１、ＲＵＮＸ１、ＣＥＢＰＢ、ＡＨＲ、ＦＯＸＣ２及びＨＯＸＡ９の任意の１つ以上であり；
（ｉ）標的細胞はオリゴデンドロサイト前駆体細胞であり、転写因子はＮＫＸ２－１、ＡＮＫＲＤ１、ＦＯＸＡ２、ＬＭＯ３、ＦＯＳ、ＩＧＦ１、ＩＣＡＭ１及びＣＤＨ１の任意の１つ以上であり；
（ｊ）標的細胞は骨格筋細胞であり、転写因子はＭＹＯＧ、ＩＲＦ１、ＭＹＯＤ１、ＦＯＸＤ１、ＮＦＫＢ１、ＪＵＮＢ及びＨＯＸＡ７の任意の１つ以上であり；
（ｋ）標的細胞は平滑筋細胞であり、転写因子はＩＲＦ１、ＮＦＫＢ１、ＪＵＮＢ、ＦＯＳＬ２、ＧＡＴＡ６及びＭＥＩＳ１の任意の１つ以上であり；
（ｌ）標的細胞は内皮細胞であり、転写因子はＳＯＸ１７、ＴＡＬ１、ＳＭＡＤ１、ＨＯＸＢ７、ＪＵＮＢ．ＩＲＦ１及びＮＦＫＢ１の任意の１つ以上であり；
（ｍ）標的細胞は星状細胞であり、転写因子はＩＲＦ１、ＳＯＸ９、ＡＲＮＴ２、ＰＡＸ６、ＳＮＡＩ２、ＳＯＸ５、及びＲＵＮＸ２の任意の１つ以上であり；
（ｎ）標的細胞は角化細胞であり、転写因子はＳＯＸ９、ＮＦＫＢ１、ＭＹＣ、ＮＲ２Ｆ２、ＡＨＲ、ＦＯＳＬ１及びＦＯＳＬ２の任意の１つ以上であり、又は
（ｏ）標的細胞は上皮細胞であり、転写因子はＭＹＣ、ＩＬ１Ｂ、ＦＯＳ、ＮＦＫＢ１、ＥＳＲＲＡ、ＦＯＸＱ１、ＩＲＦ１及びＰＡＸ６の任意の１つ以上である。

【0034】

すぐ上の（ａ）～（ｏ）において、列挙された転写因子の全部を使用することができる。好ましくは、胚性幹細胞はヒト胚性幹細胞である。

【0035】

本明細書に記載した本発明の任意の方法において、ソース細胞は単球細胞であり、標的細胞はＨＳＣであり、転写因子はＭＹＢ、ＩＬ１Ｂ、ＧＡＴＡ１、ＧＦＩ１及びＧＦＩ１Ｂの任意の１つ以上である。好ましくは、列挙された転写因子の全部を使用することがで
きる。

【0036】

本明細書に記載した本発明の任意の方法において、ソース細胞は心臓線維芽細胞であり、標的細胞は胎児心筋細胞であり、転写因子はＢＭＰ１０、ＧＡＴＡ６、ＴＢＸ５、ＡＮＫＲＤ１、ＨＡＮＤ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＮＫＸ２－５及びＧＡＴＡ４の任意の１つ以上である。好ましくは、列挙された転写因子の全部を使用することができる。

【0037】

本明細書に記載した本発明の任意の方法において、ソース細胞は多能性細胞であり、標的細胞は内皮細胞であり、転写因子はＳＯＸ１７、ＴＡＬ１、ＨＯＸＢ７、ＮＦＫＢ１、ＩＲＦ１、ＪＵＮＢ、及びＳＭＡＤ１の任意の１つ以上である。好ましくは、列挙された転写因子の全部を使用することができる。好ましくは、多能性細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。

【0038】

本明細書に記載した本発明の任意の方法において、ソース細胞は多能性細胞であり、標的細胞は星状細胞であり、転写因子はＰＡＸ６、ＰＯＵ３Ｆ２、ＳＮＡＩ２、ＲＵＮＸ２、ＳＯＸ５、Ｅ２Ｆ５、及びＨＭＧＢ２の任意の１つ以上である。好ましくは、列挙された転写因子の全部を使用することができる。好ましくは、多能性細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。

【0039】

本明細書に記載した本発明の任意の方法において、ソース細胞は多能性細胞であり、標的細胞は角化細胞であり、転写因子はＴＰ６３、ＴＦＡＰ２Ａ、ＭＹＣ、ＮＦＫＢＩＡ、ＳＯＸ９、及びＮＦＫＢ１の任意の１つ以上である。好ましくは、列挙された転写因子の全部を使用することができる。好ましくは、多能性細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。

【0040】

本明細書に記載した本発明の任意の方法において、ソース細胞は骨髄幹細胞であり、標的細胞は星状細胞であり、転写因子はＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＡＲＮＴ２、ＭＹＢＬ２、ＰＯＵ３Ｆ２、Ｅ２Ｆ１及びＨＭＧＢ２の任意の１つ以上である。好ましくは、列挙された転写因子の全部を使用することができる。

【0041】

好ましくは、標的細胞の少なくとも１つの特徴は、任意の１つ以上の標的細胞マーカーの上方調節、及び／又は細胞形態における変化である。関連するマーカーは、本明細書に記載され及び当技術分野で既知である。以下の標的細胞の例示的なマーカーは：
－軟骨細胞：ＣＤ４９、ＣＤ１０、ＣＤ９、ＣＤ９５、インテグリンα１０β１，１０５、及び硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の産生；
－毛包：ＣＤ２００、ＰＨＬＤＡ１及びフォリスタチン；
－ＣＤ４＋Ｔ－細胞：ＣＤ３、ＣＤ４；
－ＣＤ８＋Ｔ－細胞：ＣＤ３、ＣＤ８；
－ＮＫ－細胞：ＣＤ５６、ＣＤ２；
－ＨＳＣ：ＣＤ４５、ＣＤ１９／２０、ＣＤ１４／１５、ＣＤ３４、ＣＤ９０；
－脂肪のＭＳＣ：ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０、ＣＤ４５、及びインビトロでの骨芽細胞、脂肪細胞及び軟骨細胞に向かった分化；
－骨髄のＭＳＣ：ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０、及びインビトロでの骨芽細胞、脂肪細胞及び軟骨細胞に向かった分化；
－オリゴデンドロサイト及びオリゴデンドロサイト前駆体；ＮＧ２及びＰＤＧＦＲα、Ｏｌｉｇ２及びＮｋｘ２．２に関するＱＰＣＲ；
－骨格筋細胞：ＭｙｏＤ、ミオゲニン及びデスミン；
－平滑筋細胞：ミオカルディン、平滑筋αアクチン及び平滑筋ミオシン重鎖；－胎児心筋細胞：ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＨ６、ＡＣＴＮ１、ＣＤＨ２及びＧＪＡ１；
－内皮細胞：ＰｅＣＡＭ（ＣＤ３１）、ＶＥ－カドヘリン及びＶＥＧＦＲ２；
－角化細胞：ケラチン１、ケラチン１４、パンケラチン及びインボルクリン；
－星状細胞：ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ及びＡＬＤＨ１Ｌ１；並びに
－上皮細胞：サイトケラチン１５（ＣＫ１５）、サイトケラチン３（ＣＫ３）、インボルクリン及びコネキシン４
を含む。

【0042】

典型的には、標的細胞分化に好適な条件は、細胞を十分な時間、好適な培地中で培養することを含む。培養の十分な時間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間であり得る。好適な培地は、表９に示したものであり得る。

【0043】

本発明はまた、本明細書に記載される方法により生成された、標的細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を提供する。

【0044】

本明細書に記載した任意の方法において、方法は更に、標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を有する細胞を増やして、標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を有する細胞の集団中での割合を増加させるステップを含むことができる。細胞を増やすステップは、下に記載する細胞の集団を生成するのに十分な時間及び条件下で培地中で行われてもよい。

【0045】

本明細書に記載した任意の方法において、方法は更に、標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を有する細胞、又は細胞を含む細胞集団を個人に投与するステップを含み得る。

【0046】

本発明はまた、細胞の少なくとも５％が標的細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞集団を提供し、それらの細胞は、本明細書に記載した方法により生成される。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が、標的細胞の少なくとも１つの特徴を有する。

【0047】

本発明はまた、本明細書に開示した標的細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を製造するためのキットに関する。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載した転写因子又はその変異体をコードする１つ以上の核酸配列を有する１つ以上の核酸を含む。好ましくは、キットは、表４に引用した、標的細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞の製造に使用することができる。好ましくは、キットは、表４に引用したソース細胞と共に使用することができる。いくつかの実施形態では、キットは更に、本明細書に開示した方法による、ソース細胞を標的細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞にリプログラミングするための指示書を含む。好ましくは、本発明は、本明細書に記載した本発明の方法において使用される際のキットを提供する。

【0048】

本発明は、少なくとも１つの標的細胞と、標的細胞内の１つ以上の転写因子のタンパク質発現を増大させる少なくとも１つの剤とを含む組成物に関する。好ましくは、標的細胞は、本明細書に記載したものの１つである。更に、転写因子は、本明細書に記載した任意の１つである。好ましくは、標的細胞及び転写因子は、表４に記載されているものである。

【0049】

本発明は、線維芽細胞のリプログラミング方法を提供し、該方法は、線維芽細胞におけるＦＯＸＱ１、ＳＯＸ９、ＭＡＦＢ、ＣＤＨ１、ＦＯＳ及びＲＥＬ、又はその変異体の任意の１つ以上のタンパク質発現を増大させることを含み、線維芽細胞は、角化細胞の少な
くとも１つの特徴を有するようにリプログラミングされている。

【0050】

本発明は、線維芽細胞から角化細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を生成する方法を提供し、該方法は：
－線維芽細胞におけるＦＯＸＱ１、ＳＯＸ９、ＭＡＦＢ、ＣＤＨ１、ＦＯＳ及びＲＥＬ、又はその変異体の任意の１つ以上の量を増大させることと；
－線維芽細胞を角化細胞分化に十分な時間及び条件下で培養し；それにより線維芽細胞から角化細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を生成することと、を含む。

【0051】

本発明は、線維芽細胞を角化細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞にリプログラミングする方法を提供し、該方法は：ｉ）線維芽細胞、又は線維芽細胞を含む細胞集団を提供することと；ｉｉ）ポリペプチドＦＯＸＱ１、ＳＯＸ９、ＭＡＦＢ、ＣＤＨ１、ＦＯＳ及びＲＥＬをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を前記線維芽細胞にトランスフェクトすることと；ｉｉｉ）前記細胞又は細胞集団を培養し、場合により細胞又は細胞集団を、角化細胞の少なくとも１つの特徴に関して監視することと、を含む。

【0052】

好ましくは、角化細胞の少なくとも１つの特徴は、任意の１つ以上の角化細胞マーカーの上方調節、及び／又は細胞形態における変化である。角化細胞マーカーは、ケラチン１、ケラチン１４及びインボルクリンを含み、細胞形態は、玉石の外観である。

【0053】

典型的には、角化細胞分化に好適な条件は、細胞を十分な時間、好適な培地中で培養することを含む。培養の十分な時間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間であってもよい。好適な培地は、表９に示すものであってもよい。

【0054】

本発明はまた、本明細書に記載される方法により生成された、角化細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を提供する。

【0055】

本明細書に記載した任意の方法において、方法は更に、標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を有する細胞を増やして、標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を有する細胞の集団中での割合を増加させるステップを含むことができる。細胞を増やすステップは、下に記載する細胞の集団を生成するのに十分な時間及び条件下で培地中で行われてもよい。

【0056】

本明細書に記載した任意の方法において、方法は更に、角化細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞、又は細胞を含む細胞集団を個人に投与するステップを含み得る。

【0057】

本発明はまた、細胞の少なくとも５％が角化細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞集団を提供し、それらの細胞は、本明細書に記載した方法により生成される。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が、角化細胞の少なくとも１つの特徴を有する。

【0058】

本発明はまた、本明細書に開示した、角化細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を製造するためのキットに関する。いくつかの実施形態では、キットは、（ｉ）ＦＯＸＱ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；及び（ｉｉ）ＳＯＸ９ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；及び（ｉｉｉ）ＭＡＦＢポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、及び（ｉｖ）ＣＤＨ１ポリペプチド又はその変異体をコード
する核酸配列、及び（ｖ）ＦＯＳポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、及び（ｖｉ）ＲＥＬポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列の任意の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、キットは更に、本明細書に開示した方法による、線維芽細胞を角化細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞にリプログラミングするための指示書を含む。好ましくは、本発明は、本明細書に記載した本発明の方法において使用される際のキットを提供する。

【0059】

本発明は、少なくとも１つの線維芽細胞と、線維芽細胞におけるＦＯＸＱ１、ＳＯＸ９、ＭＡＦＢ、ＣＤＨ１、ＦＯＳ及びＲＥＬの任意の１つ以上のタンパク質発現を増大させる少なくとも１つの剤とを含む組成物に関する。

【0060】

本発明は、線維芽細胞のリプログラミングのための方法を提供し、該方法は、線維芽細胞におけるＳＯＸ１７、ＳＭＡＤ１、ＴＡＬ１、ＩＲＦ１、ＴＣＦ７Ｌ１、ＭＸＤ４及びＪＵＮＢ、又はその変異体の任意の１つ以上のタンパク質発現を増大させることを含み、線維芽細胞は、内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有するようにリプログラミングされる。

【0061】

本発明は、線維芽細胞から内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を生成する方法を提供し、該方法は：
－線維芽細胞におけるＳＯＸ１７、ＳＭＡＤ１、ＴＡＬ１、ＩＲＦ１、ＴＣＦ７Ｌ１、ＭＸＤ４及びＪＵＮＢ、又はその変異体の任意の１つ以上の量を増大させることと；
－線維芽細胞を内皮分化に十分な時間及び条件下で培養し；それにより線維芽細胞から内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を生成することと、を含む。

【0062】

本発明は、線維芽細胞を内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞にリプログラミングするための方法を提供し、該方法は：ｉ）線維芽細胞、又は線維芽細胞を含む細胞集団を提供することと；ｉｉ）ポリペプチドＳＯＸ１７、ＳＭＡＤ１、ＴＡＬ１、ＩＲＦ１、ＴＣＦ７Ｌ１、ＭＸＤ４及びＪＵＮＢをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を前記線維芽細胞にトランスフェクトすることと；ｉｉｉ）前記細胞又は細胞集団を培養し、場合により細胞又は細胞集団を、内皮細胞の少なくとも１つの特徴に関して監視することと、を含む。

【0063】

好ましくは、内皮細胞の少なくとも１つの特徴は、任意の１つ以上の内皮マーカーの上方調節、及び／又は細胞形態における変化である。内皮マーカーは、ＣＤ３１（Ｐｅ－ＣＡＭ）、ＶＥ－カドヘリン及びＶＥＧＦＲ２を含み、細胞形態は、毛細管様構造であってもよい。

【0064】

典型的には、内皮分化に好適な条件は、細胞を十分な時間、好適な培地中で培養することを含む。培養の十分な時間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間であってもよい。好適な培地は、表９に示すものであってもよい。

【0065】

本発明はまた、本明細書に記載される方法により生成された、内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を提供する。

【0066】

本明細書に記載した任意の方法において、方法は更に、内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞、又は細胞を含む細胞集団を個人に投与するステップを含み得る。

【0067】

本発明はまた、細胞の少なくとも５％が内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞
集団を提供し、それらの細胞は、本明細書に記載した方法により生成される。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が、内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する。

【0068】

本発明はまた、本明細書に開示した、内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を製造するためのキットに関する。いくつかの実施形態では、キットは、（ｉ）ＳＯＸ１７ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；及び（ｉｉ）ＳＭＡＤ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；及び（ｉｉｉ）ＩＲＦ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、（ｉｖ）ＴＣＦ７Ｌ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、（ｖ）ＭＸＤ４ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、（ｖｉ）ＴＡＬ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；及び（ｖｉｉ）ＪＵＮＢポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列の任意の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、キットは更に、本明細書に開示した方法による、線維芽細胞を内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞にリプログラミングするための指示書を含む。好ましくは、本発明は、本明細書に記載した本発明の方法において使用される際のキットを提供する。

【0069】

本発明は、少なくとも１つの線維芽細胞と、線維芽細胞におけるＳＯＸ１７、ＳＭＡＤ１、ＴＡＬ１、ＩＲＦ１、ＴＣＦ７Ｌ１、ＭＸＤ４及びＪＵＮＢの任意の１つ以上のタンパク質発現を増大させる少なくとも１つの剤とを含む組成物に関する。

【0070】

本発明は、線維芽細胞のリプログラミングのための方法を提供し、該方法は、線維芽細胞におけるＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＡＲＮＴ２、Ｅ２Ｆ５、ＰＸＢ１、ＳＭＡＤ１、及びＲＵＮＸ２、又はその変異体の任意の１つ以上のタンパク質発現を増大させることを含み、線維芽細胞は、星状細胞の少なくとも１つの特徴を有するようにリプログラミングされる。

【0071】

本発明は、線維芽細胞から星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を生成する方法を提供し、該方法は：
－線維芽細胞におけるＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＡＲＮＴ２、Ｅ２Ｆ５、ＰＸＢ１、ＳＭＡＤ１、及びＲＵＮＸ２又はその変異体の任意の１つ以上の量を増大させることと；
－線維芽細胞を星状細胞分化に十分な時間及び条件下で培養し；それにより線維芽細胞から星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を生成することと、を含む。

【0072】

本発明は、線維芽細胞を星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞にリプログラミングするための方法を提供し、該方法は：ｉ）線維芽細胞、又は線維芽細胞を含む細胞集団を提供することと；ｉｉ）ポリペプチドＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＡＲＮＴ２、Ｅ２Ｆ５、ＰＸＢ１、ＳＭＡＤ１、及びＲＵＮＸ２をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を前記線維芽細胞にトランスフェクトすることと；ｉｉｉ）前記細胞又は細胞集団を培養し、場合により細胞又は細胞集団を、星状細胞の少なくとも１つの特徴に関して監視することと、を含む。

【0073】

好ましくは、星状細胞の少なくとも１つの特徴は、任意の１つ以上の星状細胞マーカーの上方調節、及び／又は細胞形態における変化である。星状細胞マーカーは、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、及びＡＬＤＨ１Ｌ１を含む。好ましくは、使用されるマーカーは、ＧＦＡＰである。好ましくは観察される形態は、星状突出物の存在である。典型的には、星状細胞分化に好適な条件は、細胞を十分な時間、好適な培地中で培養することを含む。培養の十分な時間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３
、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間であってもよい。好適な培地は、表９に示すものであってもよい。

【0074】

本発明はまた、本明細書に記載される方法により生成された、星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を提供する。

【0075】

本明細書に記載した任意の方法において、方法は更に、星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞、又は細胞を含む細胞集団を、個人に投与するステップを含み得る。

【0076】

本発明はまた、細胞の少なくとも５％が星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞集団を提供し、それらの細胞は、本明細書に記載した方法により生成される。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する。

【0077】

本発明はまた、本明細書に開示した、星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を製造するためのキットに関する。いくつかの実施形態では、キットは、（ｉ）ＳＯＸ２ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；及び（ｉｉ）ＳＯＸ９ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｉｉｉ）ＡＲＮＴ２ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、（ｉｖ）Ｅ２Ｆ５ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、（ｖ）ＰＸＢ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｖｉ）ＳＭＡＤ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、及び（ｖｉｉ）ＲＵＮＸ２ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列の任意の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、キットは更に、本明細書に開示した方法による、線維芽細胞を星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞にリプログラミングするための指示書を含む。好ましくは、本発明は、本明細書に記載した本発明の方法において使用される際のキットを提供する。

【0078】

本発明は、少なくとも１つの線維芽細胞と、線維芽細胞におけるＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＡＲＮＴ２、Ｅ２Ｆ５、ＰＸＢ１、ＳＭＡＤ１、及びＲＵＮＸ２の任意の１つ以上のタンパク質発現を増大させる少なくとも１つの剤とを含む組成物に関する。

【0079】

本発明は、線維芽細胞のリプログラミングのための方法を提供し、該方法は、線維芽細胞におけるＦＯＳ、ＤＢＰ、ＨＥＳ１、ＦＯＸＡ２、ＥＳＲＲＡ、ＣＤＨ１、ＦＯＸＱ１及びＰＡＸ６又はその変異体の任意の１つ以上のタンパク質発現を増大させることを含み、線維芽細胞は、上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有するようにリプログラミングされる。

【0080】

本発明は、線維芽細胞から上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を生成する方法を提供し、該方法は：
－線維芽細胞におけるＦＯＳ、ＤＢＰ、ＨＥＳ１、ＦＯＸＡ２、ＥＳＲＲＡ、ＣＤＨ１、ＦＯＸＱ１及びＰＡＸ６又はその変異体の任意の１つ以上の量を増大させることと；
－線維芽細胞を上皮分化に十分な時間及び条件下で培養し；それにより線維芽細胞から上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を生成することと、を含む。

【0081】

本発明は、線維芽細胞を上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞にリプログラミングするための方法を提供し、該方法は：ｉ）線維芽細胞、又は線維芽細胞を含む細胞集団を提供することと；ｉｉ）ポリペプチドＦＯＳ、ＤＢＰ、ＨＥＳ１、ＦＯＸＡ２、ＥＳ
ＲＲＡ、ＣＤＨ１、ＦＯＸＱ１及びＰＡＸ６をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を前記線維芽細胞にトランスフェクトすることと；ｉｉｉ）前記細胞又は細胞集団を培養し、場合により細胞又は細胞集団を、上皮細胞の少なくとも１つの特徴に関して監視することと、を含む。

【0082】

好ましくは、上皮細胞の少なくとも１つの特徴は、任意の１つ以上の上皮マーカーの上方調節、及び／又は細胞形態における変化である。上皮マーカーは、サイトケラチン１５（ＣＫ１５）、サイトケラチン３（ＣＫ３）、インボルクリン及びコネキシン４を含む。好ましくは観察される形態は、玉石の外観である。

【0083】

典型的には、上皮分化に好適な条件は、細胞を十分な時間、好適な培地中で培養することを含む。培養の十分な時間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間であってもよい。好適な培地は、表９に示すものであってもよい。

【0084】

本発明はまた、本明細書に記載される方法により生成された、上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を提供する。

【0085】

本明細書に記載した任意の方法において、方法は更に、上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞、又は細胞を含む細胞集団を個人に投与するステップを含み得る。

【0086】

本発明はまた、細胞の少なくとも５％が上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞集団を提供し、それらの細胞は、本明細書に記載した方法により生成される。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が、上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する。

【0087】

本発明はまた、本明細書に開示した、上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を製造するためのキットに関する。いくつかの実施形態では、キットは、（ｉ）ＦＯＳポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；及び（ｉｉ）ＤＢＰポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｉｉｉ）核ＦＯＸＡ２ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、（ｉｖ）ＥＳＲＲＡポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、（ｖ）ＣＤＨ１ポリペプチド又はその変異をコードする核酸配列体；（ｖｉ）ＦＯＸＱ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、及び（ｖｉｉ）ＰＡＸ６ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列の任意の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、キットは更に、本明細書に開示した方法による、線維芽細胞を上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞にリプログラミングするための指示書を含む。好ましくは、本発明は、本明細書に記載した本発明の方法において使用される際のキットを提供する。

【0088】

本発明は、少なくとも１つの線維芽細胞と、線維芽細胞におけるＦＯＳ、ＤＢＰ、ＨＥＳ１、ＦＯＸＡ２、ＥＳＲＲＡ、ＣＤＨ１、ＦＯＸＱ１及びＰＡＸ６の任意の１つ以上のタンパク質発現を増大させる少なくとも１つの剤とを含む組成物に関する。

【0089】

本発明は、角化細胞のリプログラミングのための方法を提供し、該方法は、角化細胞におけるＳＯＸ１７、ＴＡＬ１、ＳＭＡＤ１、ＩＲＦ１、ＨＯＸＢ７及びＴＣＦ７Ｌ１の任意の１つ以上のタンパク質発現を増大させることを含み、角化細胞は、内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有するようにリプログラミングされる。

【0090】

本発明は、角化細胞から内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を生成する方法を提供し、該方法は：
角化細胞におけるＳＯＸ１７、ＴＡＬ１、ＳＭＡＤ１、ＩＲＦ１、ＨＯＸＢ７及びＴＣＦ７Ｌ１、又はその変異体の任意の１つ以上の量を増大させることと；
角化細胞を内皮分化に十分な時間及び条件下で培養し；それにより内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を角化細胞から生成することと、を含む。

【0091】

本発明は、角化細胞を内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞にリプログラミングするための方法を提供し、該方法は：ｉ）角化細胞、又は角化細胞を含む細胞集団を提供することと；ｉｉ）ポリペプチドＳＯＸ１７、ＴＡＬ１、ＳＭＡＤ１、ＩＲＦ１、ＨＯＸＢ７及びＴＣＦ７Ｌ１をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を前記角化細胞にトランスフェクトすることと；ｉｉｉ）前記細胞又は細胞集団を培養し、場合により細胞又は細胞集団を、内皮細胞の少なくとも１つの特徴に関して監視することと、を含む。

【0092】

好ましくは、本発明の任意の態様において、内皮細胞は、微小血管内皮細胞である。

【0093】

好ましくは、内皮細胞の少なくとも１つの特徴は、任意の１つ以上の内皮マーカーの上方調節、及び／又は細胞形態における変化である。内皮マーカーは、ＣＤ３１、ＶＥ－カドヘリン及びＶＥＧＦＲ２を含む。

【0094】

典型的には、内皮分化に好適な条件は、細胞を十分な時間、好適な培地中で培養することを含む。培養の十分な時間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間であってもよい。好適な培地は、表９に示すものであってもよい。

【0095】

本発明はまた、本明細書に記載される方法により生成された、微小血管内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を提供する。

【0096】

本発明はまた、細胞の少なくとも５％が内皮細胞、好ましくは微小血管内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞集団を提供し、それらの細胞は、本明細書に記載した方法により生成される。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が、内皮細胞、好ましくは微小血管内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する。

【0097】

本発明はまた、本明細書に開示した、内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を製造するためのキットに関する。いくつかの実施形態では、キットは、（ｉ）ＳＯＸ１７ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；及び（ｉｉ）核ＴＡＬ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；及び（ｉｉｉ）ＳＭＡＤ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、及び（ｉｖ）ＩＲＦ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、（ｖ）ＴＣＦ７Ｌ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；及び（ｖｉ）ＨＯＸＢ７ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列の任意の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、キットは更に、本明細書に開示した方法による、角化細胞を内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞にリプログラミングするための指示書を含む。好ましくは、本発明は、本明細書に記載した本発明の方法において使用される際のキットを提供する。

【0098】

本発明は、少なくとも１つの角化細胞と、角化細胞におけるＳＯＸ１７、ＴＡＬ１、ＳＭＡＤ１、ＩＲＦ１、ＨＯＸＢ７及びＴＣＦ７Ｌ１の任意の１つ以上のタンパク質発現を増大させる少なくとも１つの剤とを含む組成物に関する。

【0099】

本発明は、角化細胞のリプログラミングのための方法を提供し、該方法は、角化細胞におけるＮＯＴＣＨ１、ＨＲ、ＤＢＰ、ＯＴＸ１、ＥＳＲＲＡ、ＦＯＸＱ１、ＰＡＸ６及びＩＲＸ５の任意の１つ以上のタンパク質発現を増大させることを含み、角化細胞は、上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有するようにリプログラミングされる。

【0100】

本発明は、角化細胞から上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を生成する方法を提供し、該方法は：
角化細胞におけるＮＯＴＣＨ１、ＨＲ、ＤＢＰ、ＯＴＸ１、ＥＳＲＲＡ、ＦＯＸＱ１、ＰＡＸ６及びＩＲＸ５又はその変異体の任意の１つ以上の量を増大させることと；
角化細胞を上皮分化に十分な時間及び条件下で培養し；それにより上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を角化細胞から生成することと、を含む。

【0101】

本発明は、角化細胞を上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞にリプログラミングするための方法を提供し、該方法は：ｉ）角化細胞、又は角化細胞を含む細胞集団を提供することと；ｉｉ）ポリペプチドＮＯＴＣＨ１、ＨＲ、ＤＢＰ、ＯＴＸ１、ＥＳＲＲＡ、ＦＯＸＱ１、ＰＡＸ６及びＩＲＸ５をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を前記角化細胞にトランスフェクトすることと；ｉｉｉ）前記細胞又は細胞集団を培養し、場合により細胞又は細胞集団を、上皮細胞の少なくとも１つの特徴に関して監視することと、を含む。

【0102】

好ましくは、本発明の任意の態様において、上皮細胞は、角膜上皮細胞である。

【0103】

好ましくは、上皮細胞の少なくとも１つの特徴は、任意の１つ以上の上皮マーカーの上方調節、及び／又は細胞形態における変化である。上皮マーカーは、サイトケラチン１５（ＣＫ１５）、サイトケラチン３（ＣＫ３）、インボルクリン及びコネキシン４を含む。

【0104】

典型的には、内皮分化に好適な条件は、細胞を十分な時間、好適な培地中で培養することを含む。培養の十分な時間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間であってもよい。好適な培地は、表９に示すものであってもよい。

【0105】

本発明はまた、本明細書に記載される方法により生成された、上皮細胞、好ましくは角膜上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を提供する。

【0106】

本発明はまた、細胞の少なくとも５％が上皮細胞、好ましくは角膜上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞集団を提供し、それらの細胞は、本明細書に記載した方法により生成される。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が、上皮細胞、好ましくは角膜上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する。

【0107】

本発明はまた、本明細書に開示した、上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を製造するためのキットに関する。いくつかの実施形態では、キットは、（ｉ）ＮＯＴＣＨ
１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列をコードする核酸配列；及び（ｉｉ）ＨＲポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；及び（ｉｉｉ）ＤＢＰポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、及び（ｉｖ）ＯＴＸ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、（ｖ）ＥＳＲＲＡポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｖｉ）ＦＯＸＱ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｖｉｉ）ＰＡＸ６ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；及び（ｖｉｉｉ）ＩＲＸ５ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列の任意の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、キットは更に、本明細書に開示した方法による、上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞への角化細胞のリプログラミングのための指示書を含む。好ましくは、本発明は、本明細書に記載した本発明の方法において使用される際のキットを提供する。

【0108】

本発明は、少なくとも１つの角化細胞と、角化細胞におけるＮＯＴＣＨ１、ＨＲ、ＤＢＰ、ＯＴＸ１、ＥＳＲＲＡ、ＦＯＸＱ１、ＰＡＸ６及びＩＲＸ５の任意の１つ以上のタンパク質発現を増大させる少なくとも１つの剤とを含む組成物に関する。

【0109】

本発明は、胚性幹細胞を分化させるための方法を提供し、該方法は、胚性幹細胞におけるＳＯＸ１７、ＴＡＬ１、ＳＭＡＤ１、ＨＯＸＢ７、ＪＵＮＢ、ＩＲＦ１及びＮＦＫＢ１の任意の１つ以上のタンパク質発現を増大させることを含み、胚性幹細胞は、内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有するように分化する。

【0110】

本発明は、胚性幹細胞から内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を生成する方法を提供し、該方法は：
胚性幹細胞におけるＳＯＸ１７、ＴＡＬ１、ＳＭＡＤ１、ＨＯＸＢ７、ＪＵＮＢ、ＩＲＦ１及びＮＦＫＢ１又はその変異体の任意の１つ以上の量を増大させることと；
胚性幹細胞を内皮分化に十分な時間及び条件下で培養し；それにより内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を胚性幹細胞から生成することと、を含む。

【0111】

本発明は、胚性幹細胞を内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞に分化させるための方法を提供し、該方法は：ｉ）胚性幹細胞、又は胚性幹細胞を含む細胞集団を提供することと；ｉｉ）ポリペプチドＳＯＸ１７、ＴＡＬ１、ＳＭＡＤ１、ＨＯＸＢ７、ＪＵＮＢ、ＩＲＦ１及びＮＦＫＢ１の任意の１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を前記胚性幹細胞にトランスフェクトすることと；ｉｉｉ）前記細胞又は細胞集団を培養し、場合により細胞又は細胞集団を、内皮細胞の少なくとも１つの特徴に関して監視することと、を含む。

【0112】

好ましくは、本発明の任意の態様において、内皮細胞は、微小血管内皮細胞である。

【0113】

好ましくは、内皮細胞の少なくとも１つの特徴は、任意の１つ以上の内皮マーカーの上方調節、及び／又は細胞形態における変化である。内皮マーカーは、ＣＤ３１、ＶＥ－カドヘリン及びＶＥＧＦＲ２を含む。

【0114】

典型的には、内皮分化に好適な条件は、細胞を十分な時間、好適な培地中で培養することを含む。培養の十分な時間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間であってもよい。好適な培地は、表９に示すものであってもよい。

【0115】

本発明はまた、本明細書に記載される方法により生成された、微小血管内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を提供する。

【0116】

本発明はまた、細胞の少なくとも５％が内皮細胞、好ましくは微小血管内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞集団を提供し、それらの細胞は、本明細書に記載した方法により生成される。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が、内皮細胞、好ましくは微小血管内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する。

【0117】

本発明はまた、本明細書に開示した、内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を製造するためのキットに関する。いくつかの実施形態では、キットは、（ｉ）ＳＯＸ１７ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｉｉ）ＴＡＬ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｉｉｉ）ＳＭＡＤ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、（ｉｖ）ＩＲＦ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、（ｖ）ＮＦＫＢ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｖｉ）ＨＯＸＢ７ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；及び（ｖｉｉ）ＪＵＮＢポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列の任意の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、キットは更に、本明細書に開示した方法による、内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞への胚性幹細胞の分化のための指示書を含む。好ましくは、本発明は、本明細書に記載した本発明の方法において使用される際のキットを提供する。

【0118】

本発明は、少なくとも１つの胚性幹細胞と、胚性幹細胞におけるＳＯＸ１７、ＴＡＬ１、ＳＭＡＤ１、ＨＯＸＢ７、ＪＵＮＢ、ＩＲＦ１及びＮＦＫＢ１の任意の１つ以上のタンパク質発現を増大させる少なくとも１つの剤とを含む組成物に関する。

【0119】

本発明は、胚性幹細胞を分化させるための方法を提供し、該方法は、胚性幹細胞におけるＩＲＦ１、ＳＯＸ９、ＡＲＮＴ２、ＰＡＸ６、ＳＮＡＩ２、ＳＯＸ５及びＲＵＮＸ２のタンパク質発現を増大させることを含み、胚性幹細胞は、星状細胞の少なくとも１つの特徴を有するように分化する。

【0120】

本発明は、胚性幹細胞から星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を製造又は生成する方法を提供し、該方法は：
胚性幹細胞におけるＩＲＦ１、ＳＯＸ９、ＡＲＮＴ２、ＰＡＸ６、ＳＮＡＩ２、ＳＯＸ５及びＲＵＮＸ２、又はその変異体の任意の１つ以上の量を増大させることと；
胚性幹細胞を星状細胞分化に十分な時間及び条件下で培養し；それにより星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を胚性幹細胞から生成することと、を含む。

【0121】

本発明は、胚性幹細胞を星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞に分化させるための方法を提供し、該方法は：ｉ）胚性幹細胞、又は胚性幹細胞を含む細胞集団を提供することと；ｉｉ）前記胚性幹細胞に、ＩＲＦ１、ＳＯＸ９、ＡＲＮＴ２、ＰＡＸ６、ＳＮＡＩ２、ＳＯＸ５及びＲＵＮＸ２のポリペプチドの任意の１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸をトランスフェクトすることと；ｉｉｉ）前記細胞又は細胞集団を培養し、場合により細胞又は細胞集団を、星状細胞の少なくとも１つの特徴に関して監視することと、を含む。

【0122】

好ましくは、星状細胞の少なくとも１つの特徴は、任意の１つ以上の星状細胞マーカーの上方調節、及び／又は細胞形態における変化である。星状細胞マーカーは、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、及びＡＬＤＨ１Ｌ１を含む。好ましくは、使用されるマーカーは、ＧＦＡＰである。好ましくは、観察される形態は、星状突出物の存在である。

【0123】

典型的には、星状細胞分化に好適な条件は、細胞を十分な時間、好適な培地中で培養することを含む。培養の十分な時間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間であってもよい。好適な培地は、表９に示すものであってもよい。

【0124】

本発明はまた、本明細書に記載される方法により生成された、星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を提供する。

【0125】

本発明はまた、細胞の少なくとも５％が星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞集団を提供し、それらの細胞は、本明細書に記載した方法により生成される。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が、星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する。

【0126】

本発明はまた、本明細書に開示した、星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を製造するためのキットに関する。いくつかの実施形態では、キットは、（ｉ）ＩＲＦ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｉｉ）ＳＯＸ９ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｉｉｉ）ＡＲＮＴ２ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、（ｉｖ）ＰＡＸ６ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、（ｖ）ＳＮＡＩ２ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、（ｖｉ）ＲＵＮＸ２ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；及び（ｖｉｉ）ＳＯＸ５ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列の任意の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、キットは更に、本明細書に開示した方法による、星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞への胚性幹細胞の分化のための指示書を含む。好ましくは、本発明は、本明細書に記載した本発明の方法において使用される際のキットを提供する。

【0127】

本発明は、少なくとも１つの胚性幹細胞と、胚性幹細胞におけるＩＲＦ１、ＳＯＸ９、ＡＲＮＴ２、ＰＡＸ６、ＳＮＡＩ２、ＳＯＸ５及びＲＵＮＸ２のタンパク質発現を増大させる少なくとも１つの剤とを含む組成物に関する。

【0128】

本発明は、胚性幹細胞の分化のための方法を提供し、方法は、胚性幹細胞におけるＳＯＸ９、ＮＦＫＢ１、ＭＹＣ、ＮＲ２Ｆ２、ＦＯＳＬ１、ＡＨＲ及びＦＯＳＬ２の任意の１つ以上のタンパク質発現を増大させることを含み、胚性幹細胞は、角化細胞の少なくとも１つの特徴を有するように分化する。

【0129】

本発明は、胚性幹細胞から角化細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を生成する方法を提供し、該方法は：
胚性幹細胞におけるＳＯＸ９、ＮＦＫＢ１、ＭＹＣ、ＮＲ２Ｆ２、ＦＯＳＬ１、ＡＨＲ及びＦＯＳＬ２、又はその変異体の任意の１つ以上の量を増大させることと、
胚性幹細胞を角化細胞分化に十分な時間及び条件下で培養し；それにより胚性幹細胞から角化細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を生成することと、を含む。

【0130】

本発明は、胚性幹細胞を角化細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞に分化させる方法を提供し、該方法は：ｉ）胚性幹細胞、又は胚性幹細胞を含む細胞集団を提供することと；ｉｉ）前記胚性幹細胞に、ＳＯＸ９、ＮＦＫＢ１、ＭＹＣ、ＮＲ２Ｆ２、ＦＯＳＬ１、ＡＨＲ及びＦＯＳＬ２のポリペプチドの任意の１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸をトランスフェクトすることと；ｉｉｉ）前記細胞又は細胞集団を培養し、場合により細胞又は細胞集団を、角化細胞の少なくとも１つの特徴に関して監視
することと、を含む。

【0131】

好ましくは、角化細胞の少なくとも１つの特徴は、任意の１つ以上の角化細胞マーカーの上方調節、及び／又は、細胞形態における変化である。角化細胞マーカーは、パンケラチン、ケラチン１、ケラチン１４及びインボルクリンを含み、細胞形態は、玉石の外観である。

【0132】

典型的には、角化細胞分化に好適な条件は、細胞を十分な時間、好適な培地中で培養することを含む。培養の十分な時間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間であってもよい。好適な培地は、表９に示したものであってもよい。

【0133】

本発明はまた、本明細書に記載される方法により生成された、角化細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を提供する。

【0134】

本発明はまた、細胞の少なくとも５％が角化細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞集団を提供し、それらの細胞は、本明細書に記載した方法により生成される。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が、角化細胞の少なくとも１つの特徴を有する。

【0135】

本発明はまた、本明細書に開示した、角化細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を製造するためのキットに関する。いくつかの実施形態では、キットは、（ｉ）ＳＯＸ９ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｉｉ）ＮＦＫＢ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｉｉｉ）ＭＹＣポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、（ｉｖ）ＦＯＳＬ２ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｖ）ＮＲ２Ｆ２ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｖｉ）ＦＯＳＬ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；及び（ｖｉｉ）核ＡＨＲポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列の任意の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、キットは更に、本明細書に開示した方法による、角化細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞への胚性幹細胞の分化のための指示書を含む。好ましくは、本発明は、本明細書に記載した本発明の方法において使用される際のキットを提供する。

【0136】

本発明は、少なくとも１つの胚性幹細胞と、胚性幹細胞におけるＳＯＸ９、ＮＦＫＢ１、ＭＹＣ、ＮＲ２Ｆ２、ＦＯＳＬ１、ＡＨＲ及びＦＯＳＬ２のタンパク質発現を増大させる少なくとも１つの剤とを含む組成物に関する。

【0137】

本発明は、胚性幹細胞を分化させるための方法を提供し、該方法は、胚性幹細胞におけるＭＹＣ、ＩＬ１Ｂ、ＦＯＳ、ＮＦＫＢ１、ＥＳＲＲＡ、ＦＯＸＱ１、ＩＲＦ１及びＰＡＸ６の任意の１つ以上のタンパク質発現を増大させることを含み、胚性幹細胞は、上皮細胞、好ましくは角膜上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有するように分化する。

【0138】

本発明は、胚性幹細胞から上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を生成する方法を提供し、該方法は：
胚性幹細胞におけるＭＹＣ、ＩＬ１Ｂ、ＦＯＳ、ＮＦＫＢ１、ＥＳＲＲＡ、ＦＯＸＱ１、ＩＲＦ１及びＰＡＸ６、又はその変異体の任意の１つ以上の量を増大させることと；
胚性幹細胞を上皮分化に十分な時間及び条件下で培養し；それにより上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を胚性幹細胞から生成することと、を含む。

【0139】

本発明は、胚性幹細胞を上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞に分化させる方法を提供し、該方法は：ｉ）胚性幹細胞、又は胚性幹細胞を含む細胞集団を提供することと；ｉｉ）ＭＹＣ、ＩＬ１Ｂ、ＦＯＳ、ＮＦＫＢ１、ＥＳＲＲＡ、ＦＯＸＱ１、ＩＲＦ１及びＰＡＸ６のポリペプチドの任意の１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を前記胚性幹細胞にトランスフェクトすることと；ｉｉｉ）前記細胞又は細胞集団を培養し、場合により細胞又は細胞集団を上皮細胞の少なくとも１つの特徴に関して監視することと、を含む。

【0140】

好ましくは、上皮細胞の少なくとも１つの特徴は、任意の１つ以上の上皮マーカーの上方調節、及び／又は、細胞形態における変化である。上皮マーカーは、サイトケラチン１５（ＣＫ１５）、サイトケラチン３（ＣＫ３）、インボルクリン及びコネキシン４を含み、細胞形態は、玉石の外観であってもよい。

【0141】

典型的には、上皮分化に好適な条件は、細胞を十分な時間、好適な培地中で培養することを含む。培養の十分な時間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間であってもよい。好適な培地は、表９に示すものであってもよい。

【0142】

本発明はまた、本明細書に記載される方法により生成された、上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を提供する。

【0143】

本発明はまた、細胞の少なくとも５％が上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞集団を提供し、それらの細胞は、本明細書に記載した方法により生成される。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が、上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する。

【0144】

本発明はまた、本明細書に開示した、上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を製造するためのキットに関する。いくつかの実施形態では、キットは、（ｉ）ＭＹＣポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｉｉ）ＩＬ１Ｂポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｉｉｉ）ＦＯＳポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、（ｉｖ）ＮＦＫＢ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｖ）ＥＳＲＲＡポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｖｉ）ＦＯＸＱ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｖｉｉ）ＩＲＦ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；及び（ｖｉｉｉ）ＰＡＸ６ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列の任意の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、キットは更に、本明細書に開示した方法による、上皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞への胚性幹細胞の分化のための指示書を含む。好ましくは、本発明は、本明細書に記載した本発明の方法において使用される際のキットを提供する。

【0145】

本発明は、少なくとも１つの胚性幹細胞と、胚性幹細胞におけるＭＹＣ、ＩＬ１Ｂ、ＦＯＳ、ＮＦＫＢ１、ＥＳＲＲＡ、ＦＯＸＱ１、ＩＲＦ１及びＰＡＸ６の任意の１つ以上のタンパク質発現を増大させる少なくとも１つの剤とを含む組成物に関する。

【0146】

本発明は、多能性幹細胞を分化させることを含む、多能性幹細胞から内皮細胞を生成する方法を提供し、該方法は、多能性幹細胞におけるＳＯＸ１７、ＴＡＬ１、ＮＦＫＢ１、ＩＲＦ１、ＨＯＸＢ７、ＪＵＮＢ及びＳＭＡＤ１の任意の１つ以上のタンパク質発現を増
大させることを含み、多能性幹細胞は、内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有するように分化する。

【0147】

本発明の任意の態様において（任意の方法又は組成物を含む）、多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってもよい。

【0148】

本発明は、多能性幹細胞から内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を生成する方法を提供し、該方法は：
多能性幹細胞におけるＳＯＸ１７、ＴＡＬ１、ＮＦＫＢ１、ＨＯＸＢ７、ＪＵＮＢ、ＩＲＦ１及びＳＭＡＤ１、又はその変異体の任意の１つ以上の量を増大させることと；
多能性幹細胞を内皮分化に十分な時間及び条件下で培養し；それにより多能性幹細胞から内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を生成することと、を含む。

【0149】

本発明は、多能性幹細胞を内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞に分化させるための方法を提供し、該方法は：ｉ）多能性幹細胞、又は多能性幹細胞を含む細胞集団を提供することと；ｉｉ）前記多能性幹細胞に、ポリペプチドＳＯＸ１７、ＴＡＬ１、ＮＦＫＢ１、ＨＯＸＢ７、ＪＵＮＢ、ＩＲＦ１及びＳＭＡＤ１の任意の１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸をトランスフェクトすることと、ｉｉｉ）前記細胞又は細胞集団を培養し、場合により細胞又は細胞集団を、内皮細胞の少なくとも１つの特徴に関して監視することと、を含む。

【0150】

好ましくは、内皮細胞の少なくとも１つの特徴は、任意の１つ以上の内皮マーカーの上方調節、及び／又は細胞形態における変化である。内皮マーカーは、パンＣＤ３１、ＶＥ－カドヘリン及びＶＥＧＦＲ２を含む。

【0151】

典型的には、内皮分化に好適な条件は、細胞を十分な時間、好適な培地中で培養することを含む。培養の十分な時間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間であってもよい。好適な培地は、表９に示すものであってもよい。

【0152】

本発明はまた、本明細書に記載される方法により生成された、内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を提供する。

【0153】

本発明はまた、細胞の少なくとも５％が内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞集団を提供し、それらの細胞は、本明細書に記載した方法により生成される。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が、内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する。

【0154】

本発明はまた、本明細書に開示した、内皮細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を製造するためのキットに関する。いくつかの実施形態では、キットは、（ｉ）ＳＯＸ１７ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｉｉ）ＴＡＬ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｉｉｉ）ＮＦＫＢ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、（ｉｖ）ＩＲＦ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、（ｖ）ＳＭＡＤ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｖｉ）ＨＯＸＢ７ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；及び（ｖｉｉ）ＪＵＮＢポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列の任意の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、キットは更に、本明細書に開示した方法による、内皮細胞の少なくとも１つの
特徴を有する細胞への多能性幹細胞の分化のための指示書を含む。好ましくは、本発明は、本明細書に記載した本発明の方法において使用される際のキットを提供する。

【0155】

本発明は、少なくとも１つの多能性幹細胞と、多能性幹細胞におけるＳＯＸ１７、ＴＡＬ１、ＮＦＫＢ１、ＩＲＦ１、ＨＯＸＢ７、ＪＵＮＢ及びＳＭＡＤ１の任意の１つ以上のタンパク質発現を増大させる少なくとも１つの剤とを含む組成物に関する。

【0156】

本発明は、多能性幹細胞を分化させることを含む、多能性幹細胞から星状細胞を生成する方法を提供し、該方法は、多能性幹細胞におけるＰＡＸ６、ＳＮＡＩ２、ＰＯＵ３Ｆ２、ＳＯＸ５、Ｅ２Ｆ５、ＲＵＮＸ２、及びＨＭＧＢ２の任意の１つ以上のタンパク質発現を増大させることを含み、多能性幹細胞は、星状細胞の少なくとも１つの特徴を有するように分化する。

【0157】

本発明は、多能性幹細胞から星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を生成する方法を提供し、該方法は：
多能性幹細胞におけるＰＡＸ６、ＳＮＡＩ２、ＰＯＵ３Ｆ２、ＳＯＸ５、Ｅ２Ｆ５、ＲＵＮＸ２、及びＨＭＧＢ２、又はその変異体の任意の１つ以上の量を増大させることと；
多能性幹細胞を星状細胞分化に十分な時間及び条件下で培養し；それにより星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を多能性幹細胞から生成することと、を含む。

【0158】

本発明は、多能性幹細胞を星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞に分化させるための方法を提供し、該方法は：ｉ）多能性幹細胞、又は多能性幹細胞を含む細胞集団を提供することと；ｉｉ）ポリペプチドＰＡＸ６、ＳＮＡＩ２、ＰＯＵ３Ｆ２、ＳＯＸ５、Ｅ２Ｆ５、ＲＵＮＸ２、及びＨＭＧＢ２の任意の１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を前記多能性幹細胞にトランスフェクトすることと、ｉｉｉ）前記細胞又は細胞集団を培養し、場合により細胞又は細胞集団を、星状細胞の少なくとも１つの特徴に関して監視することと、を含む。

【0159】

好ましくは、星状細胞の少なくとも１つの特徴は、任意の１つ以上の星状細胞マーカーの上方調節、及び／又は細胞形態における変化である。星状細胞マーカーは、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、及びＡＬＤＨ１Ｌ１を含む。好ましくは、使用されるマーカーは、ＧＦＡＰである。好ましくは、観察される形態は、星状突出物の存在である。

【0160】

典型的には、星状細胞分化に好適な条件は、細胞を十分な時間、好適な培地中で培養することを含む。培養の十分な時間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間であってもよい。好適な培地は、表９に示すものであってもよい。

【0161】

本発明はまた、本明細書に記載される方法により生成された、星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を提供する。

【0162】

本発明はまた、細胞の少なくとも５％が星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞集団を提供し、それらの細胞は、本明細書に記載した方法により生成される。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する。

【0163】

本発明はまた、本明細書に開示した、星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を
製造するためのキットに関する。いくつかの実施形態では、キットは、（ｉ）ＰＡＸ６ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｉｉ）ＳＮＡＩ２ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｉｉｉ）ＲＵＮＸ２ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、（ｉｖ）ＨＭＧＢ２ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｖ）ＰＯＵ３Ｆ２ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｖｉ）ＳＯＸ５ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；及び（ｖｉｉ）Ｅ２Ｆ５ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列の任意の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、キットは更に、本明細書に開示した方法による、星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞への多能性幹細胞の分化のための指示書を含む。好ましくは、本発明は、本明細書に記載した本発明の方法において使用される際のキットを提供する。

【0164】

本発明は、少なくとも１つの多能性幹細胞と、多能性幹細胞におけるＰＡＸ６、ＳＮＡＩ２、ＰＯＵ３Ｆ２、ＳＯＸ５、Ｅ２Ｆ５、ＲＵＮＸ２、及びＨＭＧＢ２の任意の１つ以上のタンパク質発現を増大させる少なくとも１つの剤とを含む組成物に関する。

【0165】

本発明は、多能性幹細胞を分化させることを含む、多能性幹細胞から角化細胞を生成する方法を提供し、該方法は、多能性幹細胞におけるＴＦＡＰ２Ａ、ＭＹＣ、ＳＯＸ９、ＴＰ６３、ＮＦＫＢＩＡ及びＮＦＫＢ１の任意の１つ以上のタンパク質発現を増大させることを含み、多能性幹細胞は、角化細胞の少なくとも１つの特徴を有するように分化する。

【0166】

本発明は、多能性幹細胞から角化細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を生成する方法を提供し、該方法は：
多能性幹細胞におけるＴＦＡＰ２Ａ、ＭＹＣ、ＳＯＸ９、ＴＰ６３、ＮＦＫＢＩＡ及びＮＦＫＢ１又はその変異体の任意の１つ以上の量を増大させることと；
多能性幹細胞を角化細胞分化に十分な時間及び条件下で培養し；それにより多能性幹細胞から角化細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を生成すること、を含む。

【0167】

本発明は、多能性幹細胞を角化細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞に分化させるための方法を提供し、該方法は：ｉ）多能性幹細胞、又は多能性幹細胞を含む細胞集団を提供することと；ｉｉ）ポリペプチドＴＦＡＰ２Ａ、ＭＹＣ、ＳＯＸ９、ＴＰ６３、ＮＦＫＢＩＡ及びＮＦＫＢ１の任意の１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を前記多能性幹細胞にトランスフェクトすることと、ｉｉｉ）前記細胞又は細胞集団を培養し、場合により細胞又は細胞集団を、角化細胞の少なくとも１つの特徴に関して監視することと、を含む。

【0168】

好ましくは、角化細胞の少なくとも１つの特徴は、任意の１つ以上の角化細胞マーカーの上方調節、及び／又は細胞形態における変化である。角化細胞マーカーは、ケラチン１、ケラチン１４及びインボルクリンを含み、細胞形態は、玉石の外観である。

【0169】

典型的には、角化細胞分化に好適な条件は、細胞を十分な時間、好適な培地中で培養することを含む。培養の十分な時間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間であってもよい。好適な培地は、表９に示すものであってもよい。

【0170】

本発明はまた、本明細書に記載される方法により生成された、角化細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を提供する。

【0171】

本発明はまた、細胞の少なくとも５％が角化細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞集団を提供し、それらの細胞は、本明細書に記載した方法により生成される。好ましくは
、集団中の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が、角化細胞の少なくとも１つの特徴を有する。

【0172】

本発明はまた、本明細書に開示した、角化細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を製造するためのキットに関する。いくつかの実施形態では、キットは、（ｉ）ＴＦＡＰ２Ａポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｉｉ）ＭＹＣポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｉｉｉ）ＳＯＸ９ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、（ｉｖ）ＮＦＫＢ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｖ）ＴＰ６３ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｖｉ）ＮＦＫＢＩＡポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列の任意の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、キットは更に、本明細書に開示した方法による、角化細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞への多能性幹細胞の分化のための指示書を含む。好ましくは、本発明は、本明細書に記載した本発明の方法において使用される際のキットを提供する。

【0173】

本発明は、少なくとも１つの多能性幹細胞と、多能性幹細胞におけるＴＦＡＰ２Ａ、ＭＹＣ、ＳＯＸ９、ＴＰ６３、ＮＦＫＢＩＡ及びＮＦＫＢ１の任意の１つ以上のタンパク質発現を増大させる少なくとも１つの剤とを含む組成物に関する。

【0174】

本発明は、骨髄幹細胞を分化させることを含む、骨髄幹細胞から星状細胞を生成する方法を提供し、該方法は、骨髄幹細胞におけるＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＡＲＮＴ２、ＭＹＢＬ２、ＰＯＵ３Ｆ２、Ｅ２Ｆ１及びＨＭＧＢ２の任意の１つ以上のタンパク質発現を増大させることを含み、骨髄幹細胞は、星状細胞の少なくとも１つの特徴を有するように分化する。

【0175】

本発明は、骨髄幹細胞から星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を生成する方法を提供し、該方法は：
骨髄幹細胞におけるＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＡＲＮＴ２、ＭＹＢＬ２、ＰＯＵ３Ｆ２、Ｅ２Ｆ１及びＨＭＧＢ２又はその変異体の任意の１つ以上の量を増大させることと；
骨髄幹細胞を星状細胞分化に十分な時間及び条件下で培養し；それにより骨髄幹細胞から星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を生成することと、を含む。

【0176】

本発明は、骨髄幹細胞を星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞に分化させるための方法を提供し、該方法は：ｉ）骨髄幹細胞、又は骨髄幹細胞を含む細胞集団を提供することと；ｉｉ）ポリペプチドＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＡＲＮＴ２、ＭＹＢＬ２、ＰＯＵ３Ｆ２、Ｅ２Ｆ１及びＨＭＧＢ２の任意の１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を前記骨髄幹細胞にトランスフェクトすることと；ｉｉｉ）前記細胞又は細胞集団を培養し、場合により細胞又は細胞集団を、星状細胞の少なくとも１つの特徴に関して監視することと、を含む。

【0177】

好ましくは、星状細胞の少なくとも１つの特徴は、任意の１つ以上の星状細胞マーカーの上方調節、及び／又は細胞形態における変化である。星状細胞マーカーは、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、及びＡＬＤＨ１Ｌ１を含む。好ましくは、使用されるマーカーは、ＧＦＡＰである。好ましくは、観察される形態は、星状突出物の存在である。

【0178】

典型的には、星状細胞分化に好適な条件は、細胞を十分な時間、好適な培地中で培養することを含む。培養の十分な時間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２
３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間であってもよい。好適な培地は、表９に示すものであってもよい。

【0179】

本発明はまた、本明細書に記載される方法により生成された、星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を提供する。

【0180】

本発明はまた、細胞の少なくとも５％が星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞集団を提供し、それらの細胞は、本明細書に記載した方法により生成される。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が、星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する。

【0181】

本発明はまた、本明細書に開示した、星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞を製造するためのキットに関する。いくつかの実施形態では、キットは、（ｉ）ＳＯＸ２ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｉｉ）ＳＯＸ９ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｉｉｉ）ＡＲＮＴ２ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列、（ｉｖ）Ｅ２Ｆ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｖ）ＨＭＧＢ２ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列；（ｖｉ）ＰＯＵ３Ｆ２ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸配列の任意の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、キットは更に、本明細書に開示した方法による、骨髄幹細胞を星状細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞に分化させるための指示書を含む。好ましくは、本発明は、本明細書に記載した本発明の方法において使用される際のキットを提供する。

【0182】

本発明は、少なくとも１つの骨髄幹細胞と、骨髄幹細胞におけるＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＡＲＮＴ２、ＭＹＢＬ２、Ｅ２Ｆ１、ＰＯＵ３Ｆ２及びＨＭＧＢ２の任意の１つ以上のタンパク質発現を増大させる少なくとも１つの剤とを含む組成物に関する。

【0183】

典型的には、本明細書に記載した転写因子のタンパク質発現又は量は、細胞を転写因子の発現を増大させる剤と接触させることにより増大される。好ましくは、剤は：ヌクレオチド配列、タンパク質、アプタマー及び小分子、リボソーム、ＲＮＡｉ剤及びペプチド－核酸（ＰＮＡ）並びにその類似体又は変異体からなる群から選択される。好ましくは、剤は外来性である。

【0184】

典型的には、本明細書に記載した転写因子のタンパク質発現又は量は、転写因子をコードする、又は転写因子の機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸を細胞内に導入することにより増大される。好ましくは、転写因子をコードするヌクレオチド配列は、表３に列挙した受入番号を有する配列と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である。

【0185】

好ましくは、核酸は更に、異種プロモーターを含む。好ましくは、核酸は、例えばウイルスベクター又は非ウイルスベクター等のベクター内にある。好ましくは、ベクターは、宿主細胞ゲノムに一体化されないゲノムを含むウイルスベクターである。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターであってもよい。

【0186】

本明細書に記載した任意の方法は、インビトロ、エクスビボ又はインビボで行われる１つ以上の、又は全部の、ステップを有し得る。

【0187】

本明細書で使用するとき、文脈が別様に必要とする場合を除いて、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び該用語の変更物、例えば「含んでいる」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「から構成される」は、更なる付加物、成分、整数又はステップを排除することを意図しない。

【0188】

本発明の更なる態様及び前述の段落に記載された態様の更なる実施形態は、例として提供される以下の記載から、また添付の図面を参照して明らかとなるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0189】

【図1-1】細胞転換のためのＴＦを予測するＭｏｇｒｉｆｙアルゴリズム。これは以下のように行われる：（Ａ）Ｍｏｇｒｉｆｙは、差次的に発現したのみでなく、所定の細胞タイプ中の多数の差次的発現遺伝子の調節に関与するように思われるＴＦを見出すことを目指している。（Ｂ）本発明者らは、ＤＥＳｅｑに適切な背景を選択するために（Ａｎｄｅｒｓ，Ｓ．＆ Ｈｕｂｅｒ，Ｗ．（２０１０））Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２０１０；１１（１０）：Ｒ１０６）、ＦＡＮＴＯＭ５コンソーシアム（Ｆｏｒｒｅｓｔ，Ａ．Ｒ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５０７，４６２－４７０（２０１４））の一部として作製された細胞タイプオントロジーツリーを使用して、サンプル中の遺伝子に関する調整ｐ値及びｌｏｇ倍数変化を計算する。

【図1-2】（Ｃ）各ＴＦに関して、本発明者らは、遺伝子の接続距離及び親のｏｕｔ－ｄｅｇｒｅｅによって、遺伝子に対する下流効果に重みを加えて、影響の局所ネットワーク近隣を構築する。（Ｄ）本発明者らは、他の因子と比較してその影響が重複しているＴＦを除去することにより、調節適用範囲を最大化する。

【図2】いくつかの既知の分化転換に関するＭｏｇｒｉｆｙ予測は、文献に公表されている。Ｍｏｇｒｉｆｙが公表リストから正確に特定するＴＦが強調されている。サンプルは、ＦＡＮＴＯＭ細胞オントロジーを使用して分類される（Ｆｏｒｒｅｓｔ，Ａ．Ｒ．Ｒ．ｅｔ ａｌ、上記の通り）。各公表に関して、初期最大適用範囲セットにある転写因子が緑色で示され、予測されるＭｏｇｒｉｆｙセットの全体が橙色で示される。例えば線維芽細胞と筋芽細胞との間の分化転換は（Ｌａｔｔａｎｚｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１，２１１９－２８（１９９８））ＭＹＯＤのみ必要とし、これはＭｏｇｒｉｆｙにより特定された。

【図3-1】Ｍｏｇｒｉｆｙにより予測される新規な転換の実験検証：皮膚線維芽細胞からの角化細胞の誘導。（Ａ）皮膚線維芽細胞からの角化細胞分化転換に関与するとしてＭｏｇｒｉｆｙにより予測される転写因子ネットワーク。

【図3-2】（Ｂ）分化転換アッセイに使用された方法の概略。（Ｃ）分化転換の間の１２～１６日目に回収された細胞内の示されるマーカーのｑＰＣＲ分析。全ての値は、実験的反復であり、皮膚線維芽細胞における遺伝子発現に関するものである（ｎ＝３、エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍを示す）。（Ｄ）２４日目の明視野及びＧＦＰ画像は、分化転換細胞の玉石形態（上部パネル）及びＧＦＰ＋対照細胞（下部パネル）を示す。

【図4-1】Ｍｏｇｒｉｆｙにより予測される新規な転換の実験検証：角化細胞からの微小血管内皮細胞の誘導。（Ａ）角化細胞からの微小血管内皮細胞分化転換に関与するとしてＭｏｇｒｉｆｙにより予測される転写因子ネットワークの概略図。（Ｂ）分化転換アッセイに使用された方法の概略。（Ｃ）分化転換の０、１４及び１８日目のＣＤ３１発現のフローサイトメトリー分析。

【図4-2】（Ｄ）分化転換の１８日目に回収されたＣＤ３１＋細胞内の示される発現マーカーのｑＰＣＲ分析。全ての値は、実験的反復であり、角化細胞における遺伝子発現に関するものである（ｎ＝３、エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍを示す）。（Ｅ）ベクターフリーの対照細胞（ａ）及び分化転換細胞（ｂ～ｆ）に関する１８日目の内皮マーカーＣＤ３１及びＶＥ－カドヘリンの免疫蛍光分析。スケールバー＝５０μｍ。

【図5】公表された転換に対する比較。更なる転写因子がリストに追加されたときの、各転換に関する追加の適用範囲値は、適用範囲が８つ以内の転写因子で常に１００％付近に達することを示す。

【図6】既存の細胞転換ＴＦ技術に対するベンチマーキング。細胞転換のためのＴＦのセットを引き出すことに関して、Ｍｏｇｒｉｆｙの性能がどれほど他の公表された方法に匹敵するかを示すために、２つの統計を報告する。第１に（上部パネル）、各技術の回収率；１００％の回収率は、その技術も、公表された転換に使用されるＴＦのセットの全てを見出したことを意味する。その結果、その技術が実験の構成に使用されていた場合、既知の転換セットは最初の繰り返し（ｉｔｅｒａｔｉｏｎ）にて発見されていた筈である。Ｍｏｇｒｉｆｙの場合、これは公表された転換の６／１０にあたり、ＣｅｌｌＮｅｔ及びＤ’Ａｌｌｅｓｓｉｏ ｅｔ ａｌの場合、これは公表された転換の１／１０のみで当てはまる。第２に（下部パネル）、回収されたＴＦの平均ランクがプロットされている。各技術により取りそこなったＴＦを無視して、この試験は各技術が必要なＴＦの優先順位を何とか決める点でいかに優れているかを示す。線維芽細胞及び心臓（心筋細胞）の間の転換を除いて、Ｍｏｇｒｉｆｙは全ての場合で最高に機能した。正確なＴＦのいずれも予測されなかった場合、平均ランクは示されない。これは、ＣｅｌｌＮｅｔでの４つの転換、及びＤ’Ａｌｅｓｓｉｏ ｅｔ ａｌ．での１つの転換に該当する。

【図7】ヒト細胞タイプのリプログラミング景観。サンプルを：上記のＦｏｒｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．により提供された細胞オントロジータームを用いて分類する。反復を含むオントロジータームの発現プロファイルは、多次元スケーリングを用いてＸ－Ｙ面内に配置され、細胞タイプを提供し、類似した発現プロファイルを有する細胞タイプが互いにすぐ近くに存在する。次いで、上位の８ＴＦの正規化累積適用範囲に従って、Ｍｏｇｒｉｆｙにより景観上の高さを計算し、従って上位にランク付けされたＴＦが必要な遺伝子の全部を調節する転換では、高さは１であり、その反対では、高さは０となる。

【図8】Ｍｏｇｒｉｆｙにより予測される新規な転換の実験検証：皮膚線維芽細胞からの内皮細胞の誘導。Ａ：分化転換の１８日目の内皮マーカーＰｅＣＡＭ及びＶＥ－カドヘリン（ｃａｄｅｈｒｉｎ）の免疫蛍光分析。スケールバー、２５μｍ。Ｂ：分化転換の１８日目の内皮関連の遺伝子ＶＥＧＦＲ２及びＶＥ－カドヘリンの発現レベルを示すｑＰＣＲ分析。

【図9】Ｍｏｇｒｉｆｙにより予測される新規な転換の実験検証：ｈＥＳＣからの内皮細胞の誘導。Ａ：分化転換の１８日目の内皮マーカーＰｅＣＡＭ及びＶＥ－カドヘリン（ｃａｄｅｈｒｉｎ）の免疫蛍光分析。スケールバー、２５μｍ。Ｂ：分化転換の１８日目の内皮関連の遺伝子ＶＥＧＦＲ２及びＶＥ－カドヘリンの発現レベルを示すｑＰＣＲ分析。

【図10】ｈＥＳＣからの内皮細胞の誘導。Ａ：分化転換の１２及び１８日目のＰｅＣＡＭ発現のフローサイトメトリー分析。ＦＳＣ、フォワードスキャッター。Ｂ：分化転換の１８日目のＰｅＣＡＭ陽性細胞の定量化。Ｎ＝３。

【図11】Ｍｏｇｒｉｆｙにより予測される新規な転換の実験検証：ｈｉＰＳＣからの内皮細胞の誘導。Ａ：分化転換の１８日目の内皮マーカーＰｅＣＡＭ及びＶＥ－カドヘリン（ｃａｄｅｈｒｉｎ）の免疫蛍光分析。スケールバー、２５μｍ。Ｂ：分化転換の１８日目の内皮関連の遺伝子ＶＥＧＦＲ２及びＶＥ－カドヘリンの発現レベルを示すｑＰＣＲ分析。

【図12】ｈｉＰＳＣからの内皮細胞の誘導。Ａ：分化転換の１２及び１８日目のＰｅＣＡＭ発現のフローサイトメトリー分析。ＦＳＣ、フォワードスキャッター。Ｂ：分化転換の１８日目のＰｅＣＡＭ陽性細胞の定量化。Ｎ＝３。

【図13】Ｍｏｇｒｉｆｙにより予測される新規な転換の実験検証：線維芽細胞からの星状細胞の誘導。分化転換の２１日目の星状細胞マーカーＧＦＡＰの免疫蛍光分析。スケールバー、２５μｍ。

【図14】Ｍｏｇｒｉｆｙにより予測される新規な転換の実験検証：ｈＥＳＣからの星状細胞の誘導。分化転換の２１日目の星状細胞マーカーＧＦＡＰの免疫蛍光分析。スケールバー、２５μｍ。

【図15】Ｍｏｇｒｉｆｙにより予測される新規な転換の実験検証：ｈｉＰＳＣからの星状細胞の誘導。分化転換の２１日目の星状細胞マーカーＧＦＡＰの免疫蛍光分析。２５μｍ。

【図16】Ｍｏｇｒｉｆｙにより予測される新規な転換の実験検証：ＢＭ－ＭＳＣからの星状細胞の誘導。分化転換の２１日目の星状細胞マーカーＧＦＡＰの免疫蛍光分析。スケールバー、２５μｍ。

【図17】Ｍｏｇｒｉｆｙにより予測される新規な転換の実験検証：ｈＥＳＣからの角化細胞の誘導。分化転換の２１日目の角化細胞マーカーパンケラチンの免疫蛍光分析。スケールバー、２５μｍ。

【図18】Ｍｏｇｒｉｆｙにより予測される新規な転換の実験検証：ｈｉＰＳＣからの角化細胞の誘導。Ａ：分化転換の２１日目の角化細胞マーカーケラチン１４（ＫＲＴ１４）の免疫蛍光分析。スケールバー、２５μｍ。Ｂ及びＣ：分化転換の２１日目の角化細胞関連の遺伝子ケラチン１４（Ｂ）及びケラチン１（Ｃ）の発現レベルを示すｑＰＣＲ分析。

【発明を実施するための形態】

【0190】

本明細書に開示及び定義した本発明は、文章若しくは図面に言及され又は文章若しくは図面から明らかな個々の特徴の２つ以上の全ての代替的な組み合わせに及ぶことが理解されるであろう。これらの異なる組み合わせの全ては、本発明の様々な代替的態様を構成する。

【0191】

以下、本発明の所定の実施形態を詳細に参照する。本発明は実施形態との関連で記載されるが、その意図は本発明をこれらの実施形態に限定することではないことが理解されるであろう。対照的に、本発明は、特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内に含まれ得る、全ての代替物、修飾物、及び等価物を包含することが意図される。

【0192】

当業者は、本明細書に記載したものと同様の又は等価な、本発明の実践に使用できる多数の方法及び材料を認識するであろう。本発明は、記載された方法及び材料に如何様にも限定されない。本明細書に開示及び定義された本発明は、文章若しくは図面に言及され又は文章若しくは図面から明らかな個々の特徴の２つ以上の代替的な組み合わせの全てに拡大されることが理解されるであろう。これらの異なる組み合わせの全ては、本発明の様々な代替的態様を構成する。

【0193】

本明細書の解釈を目的として、単数で使用される用語は複数も含み、その逆も同様である。

【0194】

本発明は、細胞転換を体系的に実行するための実際的かつ効率的な機構を提供し、ヒト細胞のリプログラミングの一般化を促進する。本発明は、遺伝子発現データを調節ネットワーク情報と組み合わせて、それらのいずれも単独で行うには十分ではない、即ち、ソース細胞タイプを標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を有する細胞に転換するのに必要な転写因子を確実かつ正確に特定するには十分ではないものを達成する。更に、いくつかの実施形態では、本発明は、全転写因子のランク付けリストではなく、転換のための転写因子のセットを提供する。

【0195】

サンプルにおける各遺伝子に関する発現データは、本明細書に記載したものを含む、任意の既知の方法により決定することができる。データは、新規に生成され又は既存のデータベースに由来することができる。

【0196】

差次的発現は、ＤＥＳｅｑ、ｅｄｇｅＲ、ｂａｙＳｅｑ２３、ＢＢＳｅｑ２４、ＮＯＩＳｅｑ２５又はＱｕａｓｉＳｅｑプロトコル又は１つ以上のサンプルにおける背景に対する差次的発現を決定する、当業者に既知の任意の他のプロセス、又はペアワイズ比較を用
いて計算することができる。

【0197】

本発明の様々な方法にて引用されるツリーベースの背景アプローチは、そのオントロジーが非常に近い細胞タイプを除外すると共に、ツリーにおいて背景に近い他の細胞タイプを含めるという原理に基づいている。これは、限界点として機能するツリーの頂点に近いポイントを選び出すことにより達成され得る。分析された細胞タイプとして同じクレードにあるサンプルを除去してもよく、同じクレードにはないが、尚このポイントの下方にあるサンプルを含めてもよい。この結果は、確かな結果を与えるのに十分広いが、統計的検出力が管理できるレベルを保つのに十分狭い、サンプルのセットである。

【0198】

ツリーベースのアプローチの代替物は、Ｂａｙｅｓｉａｎクラスタリング、詳細にはＶａｖｏｕｌｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１５、１６：３９に記載されているＤＧＥｃｌｕｓｔアプローチである。

【0199】

転写因子のネットワークベースの影響範囲を計算するために、遺伝子発現に影響する転写因子の相互作用に関するネットワーク情報のソースを含む任意のネットワーク又はサブネットワークを使用することができる。典型的には、これは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質等の他の生物学的分子との転写因子の相互作用に関する情報である。例えば、転写因子と遺伝子のプロモーター又は調節領域における既知の結合部位との間のタンパク質－ＤＮＡ相互作用に関する任意のネットワーク情報である。そのようなネットワーク情報のソースの例は、Ｍｏｔｉｆ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＭＡＲＡ）（ＦＡＮＴＯＭ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４１：５５３－５６２０）である。ネットワーク情報のソースの更なる例は、タンパク質－タンパク質、タンパク質－ＤＮＡ、タンパク質－ＲＮＡ及び／又は生物学的経路相互作用のデータベースである。そのようなネットワーク情報のソースの例は、ＳＴＲＩＮＧ（Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ／Ｐｒｏｔｅｉｎ）データベースである。データベースの例と、転写因子のネットワークベースの影響範囲の計算方法は、実施例に記載されている。好ましくは、ＭＡＲＡ由来ネットワークがネットワークスコアの生成に使用された場合、キャップ分析遺伝子発現（ＣＡＧＥ：ｃａｐ ａｎａｌｙｓｉｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）等の転写出発部位を特定する任意の技術を使用して、遺伝子スコアを生成する。

【0200】

遺伝子影響の加重和を１つ以上のネットワークに亘って計算して、１つ以上の影響リストを生成することができる。好ましくは、本明細書に記載したもの等の少なくとも２つの影響リストが生成される。適用され得る重み付けは、直接調節からますます遠い遺伝子が、ネットワークスコアに比較的影響を与えないようにする重みづけ（本明細書で距離重み付けと称される）、及び大きく偏在する転写因子を補償し、多数のかろうじて差次的に発現した遺伝子の調節により人為的に高いスコアを受けることを防ぐ重み付け（本明細書でエッジ重み付けと称される）を含む。

【0201】

本明細書で使用するとき「Ｍｏｇｒｉｆｙ」は、標的細胞の少なくとも１つの特徴を有する細胞へのソース細胞の転換に必要な転写因子を決定するための、本明細書に記載した方法を指す。本発明の任意の実施形態において、Ｍｏｇｒｉｆｙ方法は、様々なコンピューター処理システム、例えば、ラップトップコンピューター、ネットブックコンピューター、タブレットコンピューター、スマートフォン、デスクトップコンピューター、サーバーコンピューターにて実施することができる。一実施形態では、コンピューターシステムはプロセッサー及びデータ格納デバイスを含み、前記データ格納デバイスは、一連のコンピューター読み取り可能な媒体を格納している。一態様では、コンピューターシステムは、更に、ソース及び／又は標的細胞の間の発現プロファイルを比較するためのアルゴリズ
ムを含み得る。一実施形態では、コンピューター読み取り可能な媒体は、異なる細胞タイプからの発現プロファイル又は一連の発現プロファイルを格納している。更なる実施形態では、コンピューター読み取り可能な媒体は、遺伝子のネットワークの調節に関与する転写因子の詳細を格納している。特定のタイプのコンピューター処理システムは、使用される適切なハードウェア及びアーキテクチャーを決定することが認識されるであろう。

【0202】

遺伝子及びネットワークスコアの決定は、実施例を含む、本明細書に記載した任意の方法によるものであってもよい。

【0203】

転写因子のランク付けは、本明細書に記載した遺伝子のスコア及びネットワークスコア、又は本明細書に記載した影響リスト等を考慮に入れて、本明細書に記載した任意の方法によるものであってもよい。好ましくは、差次的発現分析及び／若しくはスコアに基づくスコア若しくは影響リスト、又は、遺伝子発現に直接及び／若しくは間接的に影響する転写因子の相互作用に基づく影響リストが、転写因子のランク付けに使用される。

【0204】

所定の転換のためのＴＦのセットを特定するために、ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプのランク付けリストを比較する。標的細胞タイプのＴＦリストがソース標的内で既に発現されている場合、これをリストから除去してもよい。

【0205】

各細胞タイプのランク付けリストからの転写的に重複性のＴＦの除去は、本明細書に記載した任意の方法によるものであってもよく、ＴＦの各々が直接調節する遺伝子のリストの比較によるものを含む。所定のＴＦの場合において、ＴＦが調節する遺伝子の９８％を超えて調節する、より高くランク付けされたＴＦが存在する場合、これは除去されてもよい。従って、得られた予測は、調節影響範囲において多様なＴＦを含む。

【0206】

細胞のリプログラミングのプロセスは、細胞が生じ得る後代のタイプを変更し、フォワードプログラミング及び分化転換の異なるプロセスを含む。いくつかの実施形態では、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞又は多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）細胞のフォワードプログラミングは、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞又は多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）細胞よりも分化した表現型を有する細胞タイプの少なくとも１つの特徴を有する細胞を提供する。別の実施形態では、１つの体細胞の分化転換は、別の体細胞タイプの少なくとも１つの特徴を有する細胞を提供する。

【0207】

本発明は、ソース細胞が標的細胞になる前に、中間において人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）になることなく、ソース細胞から標的細胞に直接リプログラミング又は分化転換する組成物及び方法を提供する。ｉＰＳ細胞技術と比較して、分化転換は非常に効率的であり、下流用途におけるテラトーマ形成の危険性が非常に低い。更に、分化転換はインビボで１つの細胞タイプから別の細胞タイプへの直接転換に用いることができるが、ｉＰＳ細胞技術はできない。

【0208】

ソース細胞は、体細胞又は疾病細胞を含む、本明細書に記載した任意の細胞タイプであり得る。体細胞は、成人細胞、又は成人の１つ以上の検出可能な特徴を示す成人に由来する細胞、又は非胚細胞であり得る。疾病細胞は、疾病又は病状の１つ以上の検出可能な特徴を示す細胞であってもよく、例えば疾病細胞は、癌の１つ以上の臨床的又は生化学的マーカーを示す癌細胞であってもよい。ソース細胞の例には、造血性細胞、例えばリンパ球、骨髄性細胞；頬粘膜細胞、上皮細胞、間葉系細胞、角化細胞、肝細胞が挙げられる。ソース細胞の例は、表４に示される。

【0209】

本明細書で使用するとき、用語「体細胞」は、生殖細胞とは対照的に、生命体の身体を形成する任意の細胞を指す。哺乳動物では、生殖細胞（「配偶子」としても既知）は精子
（ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ）及び卵子であり、これらは受精中に融合して接合体と呼ばれる細胞を生じ、該細胞から哺乳動物胚全体が発達する。哺乳動物の身体内の他の細胞タイプはどれも、－そこからそれらが作製された細胞（生殖母細胞）である精子（ｓｐｅｒｍ）及び卵子、並びに未分化幹細胞を除いて、－体細胞である：内臓、皮膚、骨、血液及び結合組織は、全て体細胞から構成されている。いくつかの実施形態では、体細胞は「非胚性体細胞」であり、これは、胚に存在せず、又は胚から得られるものではなく、インビトロでのそのような細胞の増殖から生じるものではない体細胞を意味する。いくつかの実施形態では、体細胞は「成人体細胞」であり、これは、胚若しくは胎児以外の生命体に存在し、又は胚若しくは胎児以外の生命体から得られ、又はインビトロでのそのような細胞の増殖から生じるものである細胞を意味する。体細胞は、例えばテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のレベルを増大させることにより、不死化して細胞の無限の供給を提供することができる。例えば、ＴＥＲＴのレベルは、内在性遺伝子からのＴＥＲＴ転写を増大させることにより、又は、任意の遺伝子送達方法若しくは系を介して導入遺伝子を導入することにより、増大させることができる。

【0210】

特に示さない限り、体細胞のリプログラミングのための方法は、インビボ及びインビトロの両方で行うことができる（ここで、インビボは体細胞が対象内に存在する場合に実施され、インビトロは、培養液中に維持された単離された体細胞を使用して実施される）。

【0211】

胚性幹細胞等の胚細胞は、胚細胞株に由来する細胞であってもよく、胚又は胎児に直接由来するものではない。代替的に、胚細胞は、胚又は胎児に由来する細胞であり得るが、細胞は、胚若しくは胎児の発達の破壊、又は胚若しくは胎児の発達に任意の負の影響を有することなく得られ又は単離される。

【0212】

ヒト、個人を含む胎児、新生児、若年性又は成人霊長類からの細胞を含む、分化した体細胞は、本発明の方法において好適なソース細胞である。好適な体細胞は、非限定的に、骨髄細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、造血性細胞、角化細胞、肝臓細胞、腸細胞、間葉系細胞、骨髄性前駆体細胞及び脾臓細胞を含む。代替的に、体細胞は、それ自体で増殖し、他のタイプの細胞に分化することができる細胞であり得、血液幹細胞、筋肉／骨幹細胞、脳幹細胞及び肝臓幹細胞を含む。好適な体細胞は、転写因子をコードする遺伝子材料を含む転写因子を取り込むように受容性であり、又は科学文献にて一般に既知の方法を用いて受容性とされ得る。取り込みの向上方法は、細胞タイプ及び発現システムに応じて様々であり得る。好適な形質導入効率を有する受容性体細胞の調製に使用される例示的な条件は、当業者に周知である。出発体細胞は、約２４時間の倍加時間を有し得る。

【0213】

本明細書で使用するとき、用語「単離された細胞」は、そこで細胞が元々見出された生命体から除去された細胞、又はそのような細胞の子孫を指す。場合により、細胞は、例えば他の細胞の存在下、インビトロで培養されている。場合により、細胞は後に第２の生命体に導入され、又はそこから細胞が単離された（又は細胞がその子孫である）生命体に再導入される。

【0214】

本明細書で使用するとき、単離された細胞集団に関連した用語「単離された集団」は、細胞の混合された又は異種集団から除去及び分離された細胞の集団を指す。いくつかの実施形態では、単離された集団は、そこから細胞が単離され又は豊富化された異種集団と比較して、実質的に純粋な細胞の集団である。

【0215】

特定の細胞集団に関連した用語「実質的に純粋」は、全細胞集団を構成する細胞に関連して、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％純粋な細胞の集団を指す。言い換えれば、標的細胞の集団に関する用語「実質的に純粋」又は「本質的に精製された」は、細胞の約
２０％未満、より好ましくは約１５％、１０％、８％、７％未満、最も好ましくは約５％、４％、３％、２％、１％未満、又は１％未満が、本明細書で用語により定義される標的細胞又はそれらの子孫ではない細胞集団を指す。

【0216】

本明細書で使用するとき、用語「癌」は、自律的成長の能力を有する、即ち急速に増殖する細胞成長により特徴付けられる異常な状態又は病状を有する細胞を指す。この用語は、病理組織タイプ又は侵襲性の段階に関わらず、全タイプの癌性成長又は発癌性プロセス、転移性組織又は悪性に癌化した細胞、組織、又は器官を含むことが意図される。用語「癌」は、様々な器官系の悪性腫瘍、例えば、例えば肺、乳房、甲状腺、リンパ系、胃腸及び尿生殖器に発症するもの、並びに殆どの結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌及び／又は精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸癌及び食道の癌等の悪性腫瘍を含む腺癌を含む。用語「癌腫」は、当技術分野では、上皮又は内分泌組織の悪性腫瘍と認識され及びそれらを指し、呼吸器系癌腫、胃腸系癌腫、尿生殖器系癌腫、精巣癌腫、乳房癌腫、前立腺癌腫、内分泌系癌腫及び黒色腫を含む。例示的な癌腫には、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭部及び頸部、結腸及び卵巣の組織から形成されるものが挙げられる。用語「癌腫」は、例えば、癌性及び肉腫組織から構成される悪性腫瘍を含む癌肉腫も含む。「腺癌」は、腺組織に由来し又は腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成する癌腫を指す。用語「肉腫」は、当技術分野では、間葉系誘導の悪性腫瘍と認識され及びそれを指す。

【0217】

本明細書で使用するとき、「標的細胞」に対する参照は、表４の一番上の行のもの等、本明細書に標的細胞又は標的細胞タイプとして引用される細胞の任意の１つ以上に対する参照であり得る。

【0218】

ソース細胞は、該ソース細胞が標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を示す場合、本発明の方法により標的細胞に転換され、又は標的様細胞となったことが決定される。例えばヒト線維芽細胞は、該細胞が標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を示す場合、角化細胞様細胞に転換されたことを確認されるであろう。典型的には、細胞は、標的細胞タイプの１、２、３、４、５、６、７、８又はそれを超える特徴を示すであろう。例えば、標的細胞が角化細胞である場合、細胞は、任意の１つ以上の角化細胞マーカーの上方調節、及び／又は細胞形態における変化が検出可能な場合、角化細胞様細胞であることが確認又は決定され、好ましくは、角化細胞マーカーは、ケラチン１、ケラチン１４及びインボルクリンを含み、細胞形態は、玉石の外観である。本発明の任意の態様において、標的細胞の特徴は、細胞形態、遺伝子発現プロファイル、活性アッセイ、タンパク質発現プロファイル、表面マーカープロファイル、又は分化能の分析により決定され得る。特徴又はマーカーの例には、本明細書に記載したもの及び当業者に既知のものが挙げられる。関連するマーカーの他の例には、例えば造血性幹細胞（ＨＳＣ）への角化細胞の転換の場合：ＣＤ４５（パン造血性（ｐａｎ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ）マーカー）、ＣＤ１９／２０（Ｂ細胞マーカー）、ＣＤ１４／１５（骨髄性）、ＣＤ３４（前駆体／ＳＣマーカー）、ＣＤ９０（ＳＣ）及びα－インテグリン（ＨＳＣにより発現されない角化細胞マーカー）が挙げられ；造血性幹細胞へのヒト胚性幹細胞の転換の場合：Ｒｕｎｘ１（ＧＦＰ）、ＣＤ４５（パン造血性マーカー）、ＣＤ１９／２０（Ｂ細胞マーカー）、ＣＤ１４／１５（骨髄性）、ＣＤ３４（前駆体／ＳＣマーカー）、ＣＤ９０（ＳＣ）、Ｔｒａ－１－１６０（ＨＳＣ内で発現されないＥＳＣマーカー）が挙げられ；高齢又は成人ＨＳＣの幼若化の場合：若年及び高齢ヒトＨＳＣの転写シグネチャー間の比較（例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑを用いて）、及び幼若化細胞を動物に移植した後、１、３及び６カ月後に評価して、骨髄バイアスを決定することによる「幼若化ＨＳＣ」の機能的特徴付け（ここで骨髄バイアスの消失は、「幼若化」ＨＳＣを示す）が挙げられる。本明細書に記載した転換の多数に関するマーカーの例を、下の表１に示す。

【0219】

【表1】

【0220】

本明細書に引用した転写因子は、ＨＵＧＯ Ｇｅｎｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＨＧＮＣ）Ｓｙｍｂｏｌにより引用される。各転写因子に関する例示的なヌクレオチド配列を下の表２及び３に示す。ヌクレオチド配列は、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベース（Ｆｌｉｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌｕｍｅ ４２，Ｉｓｓｕｅ Ｄ１．Ｐｐ．Ｄ７４９－Ｄ７５５）バージョン８３に由来する。本明細書に引用した転写因子の任意のホモログ、オルソログ又はパラログも本発明での使用に想定される。

【0221】

下の表２ａ及びｂ：本明細書に記載した方法に従って使用し得るＥｎｓｅｍｂｌ遺伝子受入番号（ヌクレオチド配列；ＮＴ ｓｅｑ）及び例示的な転写因子（ＴＦ）。ソース細胞タイプは一番左の列に示し、標的細胞タイプは一番上の行に示す。ソース細胞タイプを標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を有する細胞に転換するのに使用され得る転写因子を示す。

【0222】

【表2】

【0223】

【表3】

【0224】

【表4】

【0225】

【表5】

【0226】

【表6】

【0227】

用語「変異体」は、完全長ポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチドを指す。本発明は、表２ａ及びｂに列挙した配列を含む、本明細書に記載した転写因子の変異体の使用を想定している。変異体は、完全長ポリペプチドの断片、又は天然に存在するスプライス変異体であり得る。
変異体は、ポリペプチドの断片と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一のポリペプチドであってもよく、ここで断片は、野生型ポリペプチドの完全長の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の長さを有し、又はそのドメインは、標的細胞タイプへのソース細胞タイプの転換を促進する能力等の、関心対象の機能的活性を有する。いくつかの実施形態では、ドメインは、配列の任意のアミノ酸位置から開始して、Ｃ－末端に向かって延びる少なくとも１００、２００、３００、又は４００アミノ酸長である。タンパク質の活性を排除又は実質的に低減する、当技術分野で既知の変更物は避けることが好ましい。いくつかの実施形態では、変異体は完全長ポリペプチドのＮ－及び／又はＣ－末端部分が欠如し、例えば、いずれかの末端からの１０、２０、又は５０までのアミノ酸が欠如している。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、成熟（完全長）ポリペプチドの配列を有し、これは正常な細胞内タンパク質分解プロセシング中（例えば、共翻訳又は翻訳後プロセシング中）に除去されたシグナルペプチド等の１つ以上の部分を有していたポリペプチドを意味する。タンパク質が、該タンパク質を自然に発現する細胞から該タンパク質を精製することによる以外の方法で生成された、いくつかの実施形態では、タンパク質はキメラポリペプチドであり、これはタンパク質が２つ以上の異なる種に由来する部分を含むことを意味する。タンパク質が該タンパク質を自然に発現する細胞から該タンパク質を精製することによる以外の方法で生成された、いくつかの実施形態では、タンパク質は誘導体であり、これは、タンパク質が、配列が実質的にタンパク質の生物学的活性を実質的に低減しない配列である限り、タンパク質に関連しない更なる配列を含むことを意味する。当業者は、当技術分野で既知のアッセイを使用して、特定のポリペプチド変異体、断片、又は誘導体が機能的であるか否かを分かり、又は容易に確かめることができるであろう。例えば、転写因子の変異体がソース細胞を標的細胞タイプに転換する能力は、本明細書の実施例に開示されるアッセイを使用して評価することができる。他の便利なアッセイは、ルシフェラーゼ等の検出可能なマーカーをコードする核酸配列に作動可能に結合した転写因子結合部位を含むレポーター構築物の転写を活性化する能力を測定することを含む。本発明の所定の実施形態では、機能的変異体又は断片は、完全長野生型ポリペプチドの活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれを超える活性を有する。

【0228】

転写因子の量の増大に関連した用語「の量を増大させる」は、関心対象の細胞（例えば、線維芽細胞又は角化細胞等のソース細胞）における転写因子の量を増大させることを指す。いくつかの実施形態では、転写因子の量は、転写因子の量が対象（例えば、後記の発現カセットのいずれも導入されていない線維芽細胞又は角化細胞内）よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又はそれを超えて多い場合、関心対象の細胞（例えば、１つ以上の転写因子をコードするポリヌクレオチドの発現を案内する発現カセットが導入されている細胞）内で「増大されている」。しかしながら、転写、翻訳の量、速度又は効率、転写因子（又は、それをコードするプレ－ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ）の安定性又は活性を増大させる任意の方法を含む、転写因子の量を増大させる任意の方法が想定される。加えて、転写発現の負のレギュレーターを下方調節又は妨害して、既存の転写の効率を増大させる（例えば、ＳＩＮＥＵＰ）ことも考えられる。

【0229】

用語「剤」は、本明細書で使用するとき、非限定に、小分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド、薬物、イオン等の任意の化合物又は物質を意味する。「剤」は、非限定的に、合成及び天然に存在するタンパク質性及び非タンパク質性の実体を含む任意の化学物質、実体又は部分であり得る。いくつかの実施形態では、剤は、核酸、核酸類似体、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー、核酸のオリゴマー、アミノ酸、又は炭水化物であり、非限定的にタンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡザイム、糖タンパク質、ｓｉＲＮＡ、リポタンパク質、アプタマー、及びそれらの修飾物及び組み合わせ等を含む
。所定の実施形態では、剤は化学部分を有する小分子である。例えば、化学部分は、非置換又は置換アルキル、芳香族、又はヘテロシクリル部分を含み、マクロライド、レプトマイシン及びその関連する天然物又は類似体を含む。化合物は、所望の活性及び／若しくは特性を有することが既知であってもよく、又は多様な化合物のライブラリーから選択されてもよい。

【0230】

用語「外来性」は、細胞又は生命体内のタンパク質、遺伝子、核酸、又はポリヌクレオチドに関連して使用される場合、人工又は天然手段により細胞又は生命体内に導入されたタンパク質、遺伝子、核酸、又はポリヌクレオチドを指し；又は細胞に関連して使用される場合、単離された後、人工又は天然手段により他の細胞又は生命体内に導入された細胞を指す。外来性核酸は、異なる生命体又は細胞に由来してもよく、又は、生命体又は細胞内で自然に生じる核酸の１つ以上の更なる複製であってもよい。外来性細胞は異なる生命体に由来してもよく、又は同じ生命体に由来してもよい。非限定的な例として、外来性核酸は、天然の細胞のものとは異なる染色体上の位置内にあるもの、又は自然に見出されるものとは異なる核酸配列が隣接しているものである。外来性核酸はまた、エピソーマルベクター等の染色体外のものであってもよい。

【0231】

標的細胞タイプへのソース細胞タイプの転換に必要な１つ以上の転写因子の量を増大させる能力に関する、１つ以上の候補剤のスクリーニングは、転写因子の産生又は発現を可能にするシステムを候補剤と接触させ、転写因子の量が増大しているか否かを決定するステップを含み得る。システムは、インビボ、例えば生命体内の組織若しくは細胞、又はインビトロ、生命体から単離された細胞、又はインビトロ転写アッセイ、又は細胞若しくは組織内のエクスビボであってもよい。転写因子の量は、直接又は間接的に、タンパク質又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ又はプレ－ｍＲＮＡ）の量を決定することにより測定することができる。候補剤は、転写因子をコードする遺伝子の転写における任意のステップを増大させることにより、又は対応するｍＲＮＡの翻訳を増大させることにより転写因子の量を増大させるように機能する。代替的に、候補剤は、転写因子をコードする遺伝子の転写のリプレッサーの阻害活性、又は転写因子をコードするｍＲＮＡ、若しくは転写因子のタンパク質自体の分解をもたらす分子の活性を低減し得る。

【0232】

好適な検出手段は、放射性ヌクレオチド、酵素、補酵素、蛍光体、化学発光体（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、色素原、酵素基質又は補因子、酵素阻害剤、補欠分子族複合体、遊離基、粒子、染料等の標識の使用を含む。そのような標識試薬は、多様な周知のアッセイ、例えば放射免疫測定法、酵素免疫測定法、例えばＥＬＩＳＡ、蛍光免疫測定法等に使用され得る。例えば、米国特許第３，７６６，１６２号明細書；同第３，７９１，９３２号明細書；同第３，８１７，８３７号明細書；及び同第４，２３３，４０２号明細書を参照されたい。

【0233】

本発明の方法は、ハイスループットスクリーニング適用を含む。例えば、本発明によるアッセイの任意のものを含むハイスループットスクリーニングアッセイを使用することができ、ここで、転写因子の産生又は発現を可能にするシステムのアリコートを、多ウェルプレートの異なるウェル内の複数の候補剤に暴露する。更に、本開示によるハイスループットスクリーニングアッセイは、任意の種類の小型化アッセイシステムにおいて、多ウェルプレートの異なるウェル内の複数の候補剤に暴露される、転写因子の産生又は発現を可能にするシステムのアリコートを含む。

【0234】

開示の方法は、小型化の任意の容認可能な方法によって、アッセイシステムにおいて「小型化」されてもよく、これは非限定に２４、４８、９６又は３８４－ウェル／プレート等の多ウェルプレート、マイクロチップ又はスライドを含む。アッセイは、有利には、より少量の試薬及び他の材料を含むマイクロチップ支持体上で行われるように、サイズが縮
小されてもよい。ハイスループットスクリーニングの助けとなる、プロセスの任意の小型化は、本発明の範囲内である。

【0235】

本発明の任意の方法において、標的細胞は、ソース細胞が得られた哺乳動物と同じ哺乳動物に移動され得る。換言すれば本発明の方法で使用されるソース細胞は、自己細胞であってもよく、即ち標的細胞が投与されるのと同じ個人から得られてもよい。代替的に、標的細胞は、別の個人に同種間移動されてもよい。好ましくは、細胞は、個人の医学的状態の処置又は予防の方法における対象に対して自家性である。

【0236】

本明細書で引用される用語「細胞培養培地」（本明細書で「培養培地」又は「培地」とも称される）は、細胞生存能を維持し、増殖を支持する栄養素を含む、細胞を培養するための培地である。細胞培養培地は、以下の任意のものを適切な組み合わせで含み得る：塩、緩衝液、アミノ酸、ブドウ糖又は他の糖、抗生物質、血清又は血清交換物、及びペプチド成長因子等の他の構成成分等。特定の細胞タイプに通常使用される細胞培養培地は、当業者に既知である。本発明の方法で使用するための例示的な細胞培養培地は、表９に示される。

【0237】

【表7】

【0238】

【表8】

【0239】

【表9】

【0240】

本明細書に記載した核酸、又は核酸を含むベクターは、上の表３にて引用した１つ以上の配列、又は表３にて列挙したアミノ酸配列の任意の１つ以上をコードする配列を含み得る。

【0241】

用語「発現」は、ＲＮＡ及びタンパク質の生成、並びに適宜、タンパク質の分泌に関与する細胞プロセスを指し、適用可能な場合、非限定に、例えば転写、翻訳、折りたたみ、修飾及びプロセシングを含む。

【0242】

用語「単離された」又は「部分的に精製された」は、本明細書で使用するとき、核酸又はポリペプチドの場合、その天然源に見出された状態で、核酸又はポリペプチドと共に存在する、及び／又は、細胞により発現された際に、若しくは分泌されたポリペプチドの場合、分泌された際に、核酸若しくはポリペプチドと共に存在するであろう少なくとも１つの他の構成成分（例えば、核酸又はポリペプチド）から分離された核酸又はポリペプチドを指す。化学合成された核酸若しくはポリペプチド、又はインビトロ転写／翻訳を用いて合成されたものは、「単離された」と見なされる。

【0243】

用語「ベクター」は、宿主又はソース細胞内への導入のためにＤＮＡ配列が挿入され得る担体ＤＮＡ分子を指す。好ましいベクターは、自律増殖が可能であり、及び／又はそれらが結合する核酸の発現が可能なものである。作動可能に結合した遺伝子の発現を案内することが可能なベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。従って、「発現ベクター」は、宿主細胞内での関心対象の遺伝子の発現に必要な、必要な調節領域を含む特化したベクターである。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子は、ベクター内の他の配列に作動可能に結合している。ベクターは、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターが使用されるときは、ウイルスベクターは複製欠損であることが好ましく、複製欠損は、複製のためにコードされた全ウイルス核酸を除去することにより達成され得る。複製欠損ウイルスベクターは、感染性の状態に留まり、複製アデノウイルスベクターと同様の方法で細胞に進入するが、細胞に入った後、複製又は増殖しない。ベクターは、リポソーム及びナノ粒子、及びＤＮＡ分子を細胞に送達する他の手段も包含する。

【0244】

用語「作動可能に結合した」は、コード配列に対して適切な位置にてＤＮＡ分子内に配置されてコード配列の発現をもたらす、コード配列の発現に必要な調節配列を意味する。この同じ定義が、時折、発現ベクター内のコード配列及び転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、及び終止エレメント）の配置に適用される。用語「作動可能に結合した」は、発現されるべきポリヌクレオチド配列の前方に適切な開始シグナル（例えば、ＡＴＧ）を有し、発現制御配列の制御下でポリヌクレオチド配列の発現、及びポリヌクレオチド配列によりコードされた所望のポリペプチドの産生を可能にするように正確な読み枠を維持することを含む。

【0245】

用語「ウイルスベクター」は、細胞内への核酸構築物の担体としてのウイルス、又はウイルス関連ベクターの使用を指す。構築物は、細胞内への感染又は形質導入のために、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、又はヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ）、又はレトロウイルス及びレンチウイルスベクターを含むその他のような非複製、欠損ウイルスゲノムに一体化及びパッケージされてもよい。ベクターは、細胞のゲノムに組み込まれても、又は組み込まれなくてもよい。構築物は、所望であれば、トランスフェクションのためのウイルス配列を含んでもよい。代替的に、構築物は、エピソーマル複製が可能なベクター、例えばＥＰＶ及びＥＢＶベクターに組み込まれてもよい。

【0246】

本明細書で使用するとき、用語「アデノウイルス」は、アデノウイルス科のウイルスを指す。アデノウイルスは、ヌクレオカプシド及び二本鎖線状ＤＮＡゲノムから構成される中型（９０～１００ｎｍ）の、無エンベロープ（裸）の正二十面体ウイルスである。

【0247】

本明細書で使用するとき、用語「非一体化ウイルスベクター」は、宿主ゲノムに一体化されないウイルスベクターを指す；ウイルスベクターにより送達される遺伝子の発現は、一時的である。宿主ゲノムへの一体化が殆ど～全く存在しないため、非一体化ウイルスベクターは、ゲノムの無作為の場所における挿入によるＤＮＡ変異を生じない利点を有する。例えば、非一体化ウイルスベクターは、染色体外に留まり、その遺伝子を宿主ゲノムに挿入せず、該挿入は、内在性遺伝子の発現を攪乱する可能性がある。非一体化ウイルスベクターは、非限定的に以下を含み得る：アデノウイルス、アルファウイルス、ピコルナウイルス及びワクシニアウイルス。これらのウイルスベクターは、それらの任意のものが、ある稀な状況で、ウイルス核酸を宿主細胞のゲノムに一体化し得る可能性があるにも関わらず、本明細書で使用される用語として「非一体化」ウイルスベクターである。重要なことは、本明細書に記載した方法に使用されるウイルスベクターが、概して、又は使用される条件下におけるライフサイクルの主な部分として、それらの核酸を宿主細胞のゲノムに一体化しないことである。

【0248】

本明細書に記載したベクターは、科学文献で一般に既知の方法を用いて、治療法での使用のためにそれらの安全性を高め、所望であれば選択及びエンリッチメントマーカーを含み、及び、含まれるヌクレオチド配列の発現を最適化するように構築及び操作することができる。ベクターは、該ベクターがソース細胞タイプ内で自己複製することを可能にする構造的な構成要素を含む必要がある。例えば、既知のＥｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ ｏｒｉＰ／Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ－１（ＥＢＮＡ－Ｉ）組み合わせ（例えば、その全体が本明細書に示されるが如く参照により組み込まれるＬｉｎｄｎｅｒ，Ｓ．Ｅ．ａｎｄ
Ｂ．Ｓｕｇｄｅｎ，Ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｒｅｐｌｉｃｏｎ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｌｉｃｅｎｓｅｄ，ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ，Ｐｌａｓｍｉｄ ５８：１（２００７）参照）は、ベクターの自己複製を支持するのに十分であり、また哺乳動物、特に霊長類の細胞内で機能することが既知の他の組み合わせも使用することができる。本発明での使用
に好適な発現ベクターの構築のための標準的な技術は、当業者に周知であり、その全体が本明細書に示されるが如く参照により組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，”（３ｒｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２００１）等の出版物に見出すことができる。

【0249】

本発明の方法では、転換に必要な関連転写因子をコードする遺伝子材料は、１つ以上のリプログラミングベクターによりソース細胞内に送達される。各転写因子は、ソース細胞内でポリヌクレオチドの発現を駆動することができる異種プロモーターに作動可能に結合した転写因子をコードするポリヌクレオチド導入遺伝子として、ソース細胞内に導入され得る。

【0250】

好適なリプログラミングベクターは、本明細書に記載した任意のものであり、感染性又は複製コンピテントウイルスを生じさせるのに十分なウイルスゲノムの全部又は一部をコードしない、プラスミド等のエピソーマルベクターを含むが、ベクターは、１つ以上のウイルスから得られる構造的エレメントを含んでもよい。１つ又は複数のリプログラミングベクターが単一のソース細胞内に導入され得る。１つ以上の導入遺伝子が単一のリプログラミングベクター上に提供され得る。１つの強い構成的転写プロモーターは、複数の導入遺伝子の転写制御を提供することができ、これは発現カセットとして提供され得る。ベクター上の別個の発現カセットが、別個の強い構成的プロモーターの転写制御下にあってもよく、該構成的プロモーターは、同じプロモーターの複製であってもよく又は異なるプロモーターであってもよい。様々な異種プロモーターが当技術分野で既知であり、転写因子の所望の発現レベル等の因子に応じて使用され得る。下に例示するように、ソース細胞内で異なる強度を有する異なるプロモーターを使用して、別個の発現カセットの転写を制御することが有利であり得る。転写プロモーターの選択における別の考慮事項は、プロモーターが発現停止される率である。当業者は、遺伝子の産物がリプログラミング方法におけるその役割を完了し又は実質的に完了した後、１つ以上の導入遺伝子又は導入遺伝子発現カセットの発現を低減することが有利であり得ることを認識するであろう。例示的なプロモーターは、ヒトＥＦ１α伸長因子プロモーター、ＣＭＶサイトメガロウイルス即時型（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）プロモーター及びＣＡＧニワトリアルブミンプロモーター、並びに他の種からの対応する相同プロモーターである。ヒト体細胞内では、ＥＦ１α及びＣＭＶの両方が強いプロモーターであるが、ＣＭＶプロモーターはＥＦ１αプロモーターよりも効率的に発現停止され、従って前者の制御下にある導入遺伝子の発現が後者の制御下にある導入遺伝子よりも早く停止される。転写因子は、ソース細胞内で、リプログラミング効率を調節するように変化し得る相対的な比率で発現され得る。好ましくは、複数の導入遺伝子が単一の転写産物上にコードされる場合、内部リボソーム進入部位が、転写プロモーターの先端方向において導入遺伝子の上流に提供される。因子の相対的な比率は、送達される因子に応じて変動し得るが、本開示を所有する当業者は、因子の最適な比率を決定することができる。

【0251】

当業者は、複数のベクターよりも単一のベクターを介して全因子を導入する有利な効率性は、全ベクターサイズが増大するにつれて、ベクターの導入が困難になることを認識するであろう。当業者はまた、ベクター上の転写因子の位置が、その一時的発現、及び結果としてのリプログラミング効率に影響し得ることも認識するであろう。従って、本出願者らは、ベクターと組み合わせた、因子の様々な組み合わせを用いた。数個のそのような組み合わせは、本明細書で、リプログラミングを支持することが示される。

【0252】

リプログラミングベクターの導入後、及びソース細胞がリプログラミングされている間、ベクターは、導入された導入遺伝子が転写及び翻訳されている間、標的細胞内に存続し得る。導入遺伝子発現は、有利には、標的細胞タイプにリプログラミングされた細胞内で
下方調節又は停止され得る。リプログラミングベクターは染色体外に留まり得る。効率性が極めて低い場合、ベクターは細胞のゲノムに一体化され得る。以下の実施例は、説明を意図し、本発明を決して限定しない。

【0253】

本発明で使用される、細胞、組織又は生命体の形質転換のための核酸送達に好適な方法は、本明細書に記載した又は当業者に既知の、核酸（例えば、ＤＮＡ）を細胞、組織又は生命体に導入し得る事実上任意の方法を含むと考えられる（例えば、Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ
ａｎｄ Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６（５）：３２９－３３０（２００９）；Ｙｕｓａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６：３６３－３６９（２００９）；Ｗｏｌｔｊｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５８，７６６－７７０（９ Ａｐｒ．２００９））。そのような方法には、非限定的に、場合によりＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）又はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等の脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いた、エクスビボトランスフェクションによる等のＤＮＡの直接送達（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１３４４－１３４６，１９８９、Ｎａｂｅｌ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ ３２６：７１１－７１３，１９８７）、微量注入法（参照により本明細書に組み込まれるＨａｒｌａｎｄ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０１：１０９４－１０９９，１９８５；米国特許第５，７８９，２１５号明細書）を含む注射によって（米国特許第５，９９４，６２４号明細書、同第５，９８１，２７４号明細書、同第５，９４５，１００号明細書、同第５，７８０，４４８号明細書、同第５，７３６，５２４号明細書、同第５，７０２，９３２号明細書、同第５，６５６，６１０号明細書、同第５，５８９，４６６号明細書及び同第５，５８０，８５９号明細書、各々参照により本明細書に組み込まれる）；電気穿孔法によって（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３８４，２５３号明細書；Ｔｕｒ－Ｋａｓｐａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６：７１６－７１８，１９８６；Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：７１６１－７１６５，１９８４）；リン酸カルシウム沈降法によって（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６－４６７，１９７３；Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７（８）：２７４５－２７５２，１９８７；Ｒｉｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０：６８９－６９５，１９９０）；ＤＥＡＥ－デキストランと、その後のポリエチレングリコールの使用によって（Ｇｏｐａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，５：１１８８－１１９０，１９８５）；直接音波負荷（ｄｉｒｅｃｔ ｓｏｎｉｃ ｌｏａｄｉｎｇ）によって（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：８４６３－８４６７，１９８７）；リポソーム媒介トランスフェクション（Ｎｉｃｏｌａｕ ａｎｄ Ｓｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５－１９０，１９８２；Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：３３４８－３３５２，１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９：１５７－１７６，１９８７；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０：８７－９４，１９８０；Ｋａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：３７５－３７８，１９８９；Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：３３６１－３３６４，１９９１）及び受容体媒介トランスフェクション（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：８８７－８９２，１９８８；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：４４２９－４４３２，１９８７）によって；並びにそれらの方法の任意の組み合わせが挙げられ、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。

【0254】

関連分子を細胞内に導入することを仲介できる多数のポリペプチドが以前記載されており、本発明に適用することができる。例えば、Ｌａｎｇｅｌ（２００２）Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓを参照されたい。膜を横切る輸送を向上させるポリペプチド配列の例には、非限定的に、ショウジョウバエホメオタンパク質アンテナペディア転写タンパク質（ＡｎｔＨＤ）（Ｊｏｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．３：１１２１－３４，１９９１；Ｊｏｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１８６４－８，１９９１；Ｌｅ Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：９１２０－４，１９９３）、ヘルペスシンプレックスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２（Ｅｌｌｉｏｔｔ ａｎｄ Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ ８８：２２３－３３，１９９７）；ＨＩＶ－１転写活性化因子ＴＡＴタンパク質（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｃｅｌｌ ５５：１１７９－１１８８，１９８８；Ｆｒａｎｋｅｌ ａｎｄ Ｐａｂｏ，Ｃｅｌｌ ５５：１ ２８９－１１９３，１９８８）；Ｋａｐｏｓｉ ＦＧＦシグナル配列（ｋＦＧＦ）；タンパク質形質導入ドメイン－４（ＰＴＤ４）；ペネトラチン、Ｍ９１８、トランスポータン－１０；核局在化配列、ＰＥＰ－Ｉペプチド；両親媒性ペプチド（例えば、ＭＰＧペプチド）；米国特許第６，７３０，２９３号明細書に記載されているような送達増強輸送体（非限定に、少なくとも５～２５若しくはそれを超える連続アルギニン又は３０、４０若しくは５０アミノ酸の連続セットにおける５～２５若しくはそれを超えるアルギニンを含むペプチド配列を含む；非限定に、十分な、例えば少なくとも５つのグアニジノ又はアミジノ部分を有するペプチドを含む）；及び市販のペネトラチン（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）（商標）１ペプチド、及びフランス、パリのＤａｉｔｏｓ Ｓ．Ａ．から入手可能なＶｅｃｔｏｃｅｌｌ（登録商標）プラットフォームのＤｉａｔｏｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｖｅｃｔｏｒ（「ＤＰＶｓ」）が挙げられる。国際公開第２００５／０８４１５８号パンフレット及び同第２００７／１２３６６７号パンフレット並びにそこに記載される更なる輸送体も参照されたい。これらのタンパク質は形質膜を通過できるのみでなく、本明細書に記載した転写因子等の他のタンパク質の結合は、これらの複合体の細胞取り込みを刺激するのに十分である。

【0255】

表４ａ．本発明の例示的な転換。ソース細胞タイプは一番左の列に示し、標的細胞タイプは一番上の行に示す。ソース細胞タイプから標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を有する細胞への転換に必要な転写因子を示す。

【0256】

【表10】

【0257】

【表11】

【0258】

表４ｂ．本発明の更なる例示的な転換。ソース細胞タイプは一番左の列に示し、標的細胞タイプは一番上の行に示す。ソース細胞タイプから標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を有する細胞への転換に必要な転写因子を示す。

【0259】

【表12】

【0260】

本発明は、以下の非限定的な実施例を含む。

【実施例0261】

実施例１
各細胞転換に必要なＴＦのセットを予測するために、本発明者らは、細胞タイプ間で差次的に発現されるのみでなく、局所ネットワークにおいて他の差次的発現遺伝子に対する調節影響も及ぼすＴＦを特定する（図１ａ参照）。全細胞における全遺伝子に関する差次的発現を捕捉する単一のスコアは、ｌｏｇ倍数変化及び調整ｐ値を組み合わせることにより規定される。各細胞における各ＴＦの調節影響を、既知のインタラクトーム（ＳＴＲＩＮＧ及びＭＡＲＡにより規定される、図１ｃ参照）に亘る差次的発現スコアの加重和を行うことにより計算する。この和は、２つの因子：（１）調節の直接さ、即ち、ＴＦと下流遺伝子との間の中間がいくつあるか、及び（２）特異性、即ち、同様に上流ＴＦが調節する他の遺伝子の数、により重みづけされる。この加重和により、ＴＦはそれらの影響に従って、各細胞タイプ内でランク付けされる。最終ステップは、ソースと比較して、標的細胞タイプ内で差次的発現遺伝子に亘って、組み合わされた最大の影響を有するＴＦの最適セットを選択することである。これは、組み合わされた影響が、セットの影響を増大させないものを省いて、発現された標的細胞遺伝子の９８％に到達するまで、差次的影響によるランク付けの順序でＴＦをセットに加えることにより行われる（図１ｄ及び下記の方法体系を参照）。生物学的に言えば、Ｍｏｇｒｉｆｙは、標的細胞タイプの独自性の最大の原因となる調節ネットワークの部分を制御するＴＦを特定する。

【0262】

Ｍｏｇｒｉｆｙは、１つ以上のステップを含んでもよく、これは下に概略され、以下のセクションでより詳しく記載される。

【0263】

１．各サンプル（ｓ）内の各遺伝子（ｘ）に関する発現データを収集する。
２．各サンプル内の各遺伝子のツリーベースの背景に対する差次的発現を計算した後、ｌｏｇ倍数変化

【数7】

及び調整Ｐ値

【数8】

を遺伝子スコア

【数9】

と組み合わせる。
３．各サンプル内の各ＴＦ（ｘ）に関して、各ＴＦ上に中心を置く２つの異なるサブネットワーク

【数10】

に亘って、遺伝子スコアの加重和を実行することにより、ネットワークスコア（Ｎ^Ｓ）を計算する。
４．

【数11】

スコアの組み合わせに基づいてＴＦをランク付けする。
５．各細胞タイプからのランク付けリストの比較に基づいて、任意の２つの細胞タイプ間の転換のための転写因子のセットを計算する。
６．リストから転写的に重複性のＴＦを除去する。
７．細胞タイプをそれらの必要なＴＦに基づいて２Ｄ面上に配置し、選択されたＴＦにより直接調節される必要な遺伝子の平均適用範囲に基づいた高さを加えることにより、細胞転換景観を形成する。

【0264】

ステップ１：ＦＡＮＴＯＭ５データセットから得た発現データ
Ｍｏｇｒｉｆｙは、クラスター化ＣＡＧＥタグの７００ライブラリーを使用し、これはＴＳＳ位置を提供する。これらは、それらの対応する遺伝子（ＦＡＮＴＯＭ５コンソーシアムにより提供（Ｆｏｒｒｅｓｔ，Ａ．Ｒ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５０７，４６２－４７０（２０１４））にマッピングされる。このデータを使用して、各ライブラリーにおける各遺伝子に関するタグ数を作製する。合計で、少なくとも１つのサンプル中、少なくとも２０ ＴＰＭ（タグパーミリオン（ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ））で発現する１
５，８７８の異なる遺伝子（そのうち１４０８はＴＦ）が存在する。

【0265】

ステップ２：ツリーベースの差次的発現
差次的発現の計算は、生物学的データを分析する際の一般的な問題であり、これを行うためにいくつかの技術が存在する。本発明者らは、ベンチマーク評価において良好に機能することから、この作業にＤＥＳｅｑの使用を選択し、ＤＥＳｅｑは、いくつかの非反復データセットの分析を可能にし、また短い実行時間を有する。差次的発現を計算するために、２つのグループ：差次的発現を特定したいサンプルのセット及び比較する背景を特定する必要がある。正確な背景を選択する問題は重要である。多すぎる非関連サンプルは、試験の統計的検出力を低減し得る。背景中の狭すぎる又は少なすぎるサンプルは、どの遺伝子が実際に差次的発現しているか区別することを不可能にする。１つの解決法は、細胞タイプの各々の間のペアワイズ検定の網羅的計算を行うことである。このアプローチは２つの問題を有する：第１に、これは非常に計算的に高価であり、第２に、サンプルと平均背景との間で差次的発現遺伝子を明らかにせず、どちらかと言えば２つのサンプル間で詳細に明らかにする。Ｍｏｇｒｉｆｙの場合、本発明者らは全ての状況での所定の細胞タイプに重要な遺伝子に興味があり、従ってサンプルの収集には反対である。これを行うために、本発明者らは、ＦＡＮＴＯＭ５細胞オントロジーに基づくツリーベースの背景選択方法を実行した（図１Ｂ）。このアプローチの原理は、そのオントロジーが非常に近い細胞タイプを除外すると共に、ツリーにおいて背景に近い他の細胞タイプを含めることである。これは、限界点として機能するツリーの頂点に近いポイントを選び出すことにより達成された。分析された細胞タイプとして同じクレードにあるサンプルを除去し、同じクレードにはないが、尚このポイントの下方にあるサンプルを含めた。この結果は、確かな結果を与えるのに十分広いが、統計的検出力が管理できるレベルを保つのに十分狭い、サンプルのセットである。

【0266】

ＤＥｓｅｑのためのこのツリーベースの背景選択は、各サンプル内の各遺伝子に関するｌｏｇ倍数変化及びＦＤＲ調整ｐ値を形成する全ＦＡＮＴＯＭ５ライブラリー（反復により分類）上で行われる。非均一背景が存在するため、各差次的発現計算の結果は、直接比較することができず、従って残りのステップでは、これらの数字は各サンプル内の遺伝子のランク付けに使用され、比較されるのはランク付けである。

【0267】

本発明者らは高いレベルの影響を有するＴＦの特定のみに興味があるため、以下の等式を使用して、ｌｏｇ倍数変化及びＦＤＲ調整ｐ値を単一の正のスコア

【数12】

に変換する：

【数13】

式中、

【数14】

は、サンプルｓ内の遺伝子ｘのｌｏｇ倍数変化である。

【数15】

は、サンプルｓ内の遺伝子ｘの調整ｐ値である。

【0268】

この式は、高いｌｏｇ倍数変化及び低い調整ｐ値スコアを有する遺伝子を非常に高く保証し、逆も同様である。これは各サンプル内の全遺伝子に適用され、差次的発現の１５８７８遺伝子マトリクスにより７００サンプルを形成する。

【0269】

ステップ３：ＴＦのネットワークベースの影響範囲の計算
各ＴＦの重要性を評価するために、ＴＦの局所近隣に対するその効果を、ネットワーク情報の２つのソースを使用して計算する：ＳＴＲＩＮＧデータベース及びモチーフ活性の応答解析（ＭＡＲＡ：Ｍｏｔｉｆ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）。下に記載するこれら２つの技術は、異なるタイプの相互作用を含む。ＭＡＲＡは、遺伝子のプロモーター領域内の既知の結合部位とのタンパク質－ＤＮＡ相互作用を提供する。これは、相互作用の低レベルの指向された調節ネットワークを表す。ＳＴＲＩＮＧは、タンパク質－タンパク質、タンパク質－ＤＮＡ、タンパク質－ＲＮＡを含む様々なタイプの相互作用、及び生物学的経路を含む相互作用のメタデータベースである。これは、遺伝子発現に直接又は間接的の両方で影響するように行われる相互作用の概要を提供する。

【0270】

影響を計算するために、遺伝子影響の加重和（ステップ２より）を転写因子の局所ネットワーク近隣に亘って行う。この局所ネットワークは、最大３エッジに制約され、各ノードの効果は、それが位置するシードＴＦから離れるにつれ減少し、その親からのｏｕｔ ｄｅｇｒｅｅに依存する（図１Ｃ）。直接調節からますます遠い遺伝子が、スコアに比較的影響を与えないようにする距離重み付けを使用する。エッジ重み付けは、大きく偏在する転写因子を補償し、多数のかろうじて差次的に発現した遺伝子の調節により人為的に高いスコアを受けることを防ぐのに使用される。本発明者らは、

【数16】

を有する１０遺伝子を調節するＴＦは、

【数17】

を有する１０００遺伝子を調節するＴＦよりも重要であると考える。

【0271】

この加重和を行う等式は：

【数18】

式中：
Ｘ∈Ｖ_ｘは、ＴＦｘの局所サブネットワークを構成するノード（Ｖ_ｘ）のセットにおける各遺伝子（ｒ）である。
Ｌ_ｒ，ｎは、ネットワークｎにおけるｘから離れるレベル（又はステップの数）ｒである
。
Ｏ_ｒ，ｎは、ネットワークｎにおけるｒの親の程度である。

【0272】

これをＭＡＲＡ及びＳＴＲＩＮＧネットワークの両方に亘り行い、２つのＴＦ－影響リスト

【数19】

を得る。

【0273】

ステップ４：ステップ２及び３の結果に基づきＴＦをランク付けする
ステップ３及び４の結果は、

【数20】

に基づく各サンプルに関する３つのランク付けＴＦリストである。各サンプル内の各ＴＦの最終的なランク付けを得るために、３つのリストの各々におけるそのランク付けを足し合わせる。本発明者らは上位の１００ＴＦの後、残りの調節影響は非常に小さいことを見出したため、ランクは最大１００に制限する。ＴＦが特定のリストに現れない場合、スコア１００を与えられる。この結果は各細胞タイプに関するＴＦの単一のランク付けリストであり；最小スコア／ランクを有するものは、細胞転換を促進すると予測されるものである。

【0274】

ステップ５：全ペアワイズ実験比較を算出して、予測を形成する
所定の転換に関するＴＦのセットを予測するために、ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプからのランク付けリストを比較する。標的細胞タイプリストからのＴＦがソース標的内に既に発現されている場合（２０ＴＰＭ超）、これをリストから除去する。

【0275】

ステップ６：転写的に重複性のＴＦの除去
最終的なランク付けが完了した後、調節重複性を除去する。これは、ＴＦの各々が直接調節する遺伝子のリストを比較することにより達成される。所定のＴＦの場合、ＴＦが調節する遺伝子の９８％を超えて調節する、より高くランク付けされたＴＦが存在する場合、これを除去する。これは、得られた予測が、調節の影響範囲において多様なＴＦを含むことを意味する。このカットオフは経験的に選択されて、予測される因子の数を最小限にすると共に、ネットワーク適用範囲を最大限にした（図５）。

【0276】

ステップ７：ステップ１～６に基づいて細胞リプログラミング景観を形成する
リプログラミング景観を形成するために、本発明者らはＺ座標とは独立してＸ及びＹ座標を計算した。景観の複雑さを低減するために、本発明者らは、ＦＡＮＴＯＭ５により提供される細胞オントロジーにより分類された個人サンプルの遺伝子発現プロファイルを平均する。この結果は、少なくとも３つのサンプルを含む３１４のオントロジーのセットであり、そこから本発明者らは平均遺伝子発現を有する。Ｘ及びＹ座標は、これらのプロファイルの多次元尺度構成法（ＭＤＳ）を行うことにより計算する。ＭＤＳの結果は、地点間の距離が多次元現実からの２次元削減にて維持されるデータの投影である。結果として、景観のＸ－Ｙ面で互いに接近した２点は、類似した発現プロファイルを有し、従って類似した細胞タイプを表す。景観のＺ－軸は、上位８のＭｏｇｒｉｆｙ予測ＴＦの調節適用範囲を考慮することにより計算する。全転換に関して、本発明者らはオントロジーにて発現される遺伝子のセットに注目し、これらのいくつかは、各ＴＦにより直接調節される。
本発明者らは、可能な最大ＡＵＣにより正規化した、上位の８ＴＦに関する累積適用範囲の曲線下面積を計算して、各オントロジーに関する０～１の間の値を高さとして回収する。従って、高さ１は、必要な遺伝子の全部が上位にランク付けされたＴＦにより直接調節されるオントロジーを表し、高さ０は、上位８ＴＦのいずれも、必要な遺伝子のいずれも直接調節しないことを表す。次いでＸ、Ｙ及びＺ値をＲ ｐａｃｋａｇｅ ｐｌｏｔ３Ｄに使用して、ｉｍａｇｅ２Ｄ及びｐｅｒｓｐ３Ｄパッケージを使用して景観を生成する。最も高い位置の異なる幹細胞は、遺伝子セットエンリッチメントスコア０．４１、ｐ－値０．０１１で見出された。

【0277】

実施例２
Ｍｏｇｒｉｆｙの予測力を評価するために、本発明者らは、最初に、ヒト細胞に関与するものに焦点を当て、周知の、以前に公表された直接細胞転換に対してＭｏｇｒｉｆｙがどのように実行されるかを決定した。これらは絶対的な、完全な組み合わせとしてではないが、比較に有用な正の例の基準点と見なすべきである。図２に示すように、殆ど全ての場合、Ｍｏｇｒｉｆｙは、以前に機能することが示されたＴＦの完全セットを予測するが、公表された因子の代わりに上流ＴＦを含む場合がある。例えば、ヒト線維芽細胞は、ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１としても既知）、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＭＹＣ又はＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８を導入することによりｉＰＳ細胞に転換され得ることが既知である。Ｍｏｇｒｉｆｙは、この転換に関してＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２を上位の３ＴＦとして予測し、これらは実験的に確認されている組み合わせである。以前の作業では、マクロファージ様細胞へのＢ細胞及び線維芽細胞の転換は、ＣＥＢＰａ及びＰＵ．１（ＳＰＩ１としても既知）の発現により可能であったことが示されており（Ｘｉｅ，Ｈ．，Ｙｅ，Ｍ．，Ｆｅｎｇ，Ｒ．＆Ｇｒａｆ，Ｔ．Ｃｅｌｌ １１７，６６３－６７６（２００４）．；Ｒａｐｉｎｏ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．３，１１５３－６３（２０１３）、これはＭｏｇｒｉｆｙが完全に予測している。ヒト皮膚線維芽細胞を心筋細胞に転換するために、本発明者らは、ＦＡＮＴＯＭ５セットのデータを使用しないことを選択し、これは、該データが多くの重要な心筋細胞遺伝子を欠くためである（サンプルの起源における不足を示している）。細胞が異種の組織であり、理想的ではない心臓サンプルを使用しているにも関わらず、Ｍｏｇｒｉｆｙの予測リストは、ヒト転換に使用される５つのＴＦのうちの４つ（又は密接に関係する因子）を含む（Ｆｕ，Ｊ．－Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ １，２３５-４７（２０１３））。
マウス及びヒトの両方における様々な細胞タイプからニューロンへの分化転換の多数の報告が文献に存在する（表５）。

【0278】

【表13】

【0279】

使用されるＴＦのセットは、おそらくニューロンの異種性及び複雑性に起因して様々であるが、全実験に共通する因子は、Ｍｏｇｒｉｆｙにより予測される（表６）。

【0280】

【表14】

【0281】

最終的に、ヒト線維芽細胞と肝細胞との間で、Ｍｏｇｒｉｆｙは転換及び成熟に必要なものと非常に類似したＴＦの組み合わせを予測する（図２）。図２に示す転換を用いて、本発明者らはＭｏｇｒｉｆｙ、ＣｅｌｌＮｅｔ及びＤ’Ａｌｅｓｓｉｏ ｅｔ ａｌからのエントロピーベースのアプローチ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ５，Ｉｓｓｕｅ ５，１０ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１５，Ｐａｇｅｓ ７６３－７７５）の、これらの既知の因子を回収する能力を評価した。Ｍｏｇｒｉｆｙに関する公表された転写因子の平均回収率は８４％、ＣｅｌｌＮｅｔでは３１％及びＤ’Ａｌｅｓｓｉｏ ｅｔ ａｌでは５１％であった（図６）。図２の１０個の転換のうち６つにおいて、Ｍｏｇｒｉｆｙは必要なＴＦの１００％を回収し、これは、Ｍｏｇｒｉｆｙがこれらの転換のためのＴＦセットを提供するのに使用されていた場合、実験は最初から成功していた
可能性があることを意味する。一方、ＣｅｌｌＮｅｔ及びＤ’Ａｌｌｅｓｉｏ ｅｔ ａｌは、１０個の転換のうち１つのみに関して全因子を回収した。

【0282】

Ｍｏｇｒｉｆｙの主な目標は、細胞転換のためのＴＦを予測することであるけれども、天然に存在する状態及びそれらの間の遷移の観点からヒト細胞タイプの景観をマッピングして、個々の細胞タイプを記述するＴＦのコアコントロールセットを捕捉する。これ自体が、研究者達の得意な細胞タイプ中の異なるＴＦの役割を明らかにする、該研究者達の助けとなり得ると考えられる。実際に、Ｍｏｇｒｉｆｙは現在研究室で適用されている細胞リプログラミングのための戦略を超える有意な利点を提供し、その過剰発現が、指向された細胞転換を誘導するであろうＴＦの予測を助ける。Ｍｏｇｒｉｆｙは３０７ ＦＡＮＴＯＭ５組織／細胞タイプの全ての可能な組み合わせ間の転換に関して予め計算され、９３，９４２の指向された転換をもたらしている。Ｍｏｇｒｉｆｙは、発現シグネチャー（例えば、ＲＮＡｓｅｑ又はＣＡＧＥ）が既知であれば、ＦＡＮＴＯＭ５に含まれていない多数の他の細胞タイプに適用することができる。Ｍｏｇｒｉｆｙは出発点及び体系的手段を提供して、ヒトにおける新たな転換を探索する。ＭｏｇｒｉｆｙはＴＦ重複性ステップを組み込んでいるため、細胞転換のための予測としてのＴＦの有限のセットを与えることが可能であり、これは全ＴＦの単なるランク付けよりも有用である。

【0283】

Ｍｏｇｒｉｆｙの性能を他の方法と比較するために、ベンチマーキング実験を行った。最初に、ＭＡＲＡ、ＳＴＲＩＮＧ及び差次的発現構成要素のみの使用との比較における、完全Ｍｏｇｒｉｆｙアルゴリズムの使用の性能に関する効果を評価する。次に、ＣｅｌｌＮｅｔ及びＤ’Ａｌｌｅｓｉｏ ｅｔ ａｌ．との比較を行った。これらは、現在、非常に様々な細胞タイプに関する転写因子セットを計算する手段を提供する唯一の他の技術である。比較を行うために、図２に示す公表された転換からの転写因子のセットを真陽性として使用した。ベンチマークは、以下のステップを使用する、これらのＴＦの回収における各技術の性能の評価からなっていた。

【0284】

１）各転換に関して、考慮される転写因子の数を特定する：Ｍｏｇｒｉｆｙは全ＴＦのランク付けリストではなく、ＴＦのセットを提供する唯一の方法であり、目的は他の方法をＭｏｇｒｉｆｙと比較することであるため、使用される因子の数に関してＭｏｇｒｉｆｙにより生成された情報は、他の方法と共有された。即ち、他の方法よりも多くの因子を使用できる方法は存在しない。例えばＢ細胞とマクロファージとの間の転換の場合、Ｍｏｇｒｉｆｙは８ＴＦが十分である筈と予測し、従って全方法で上位の８ＴＦが比較に使用される。

【0285】

２）各方法に関して、正確な転写因子が予測されるか否か確認する：転写因子の公表された各セットに関して、各方法による予測を比較し、２つの統計を抽出する。最初に、公表された転写因子の回収率（即ち、全因子が予測セットに含まれていた場合、１００％）、次に、公表された因子の平均ランク（即ち、正確に特定された各ＴＦについて、ランクを合計し、正確に特定されたＴＦの総数で割る）。

【0286】

これらの２つのステップによる結果は、表７及び８に見出すことができ、ＭｏｇｒｉｆｙのＣｅｌｌＮｅｔ及びＤ’Ａｌｌｅｓｉｏ ｅｔ ａｌ．に対する比較の概要は、図６に見出すことができる。

【0287】

ＣｅｌｌＮｅｔに関する結果を抽出するために、本発明者らは、出発点としての線維芽細胞（ＧＳＥ１４８９７）及びＢ細胞（ＧＳＥ６５１３６）に関する公的に入手可能なデータセットを使用し、ＣｅｌｌＮｅｔ（ｃｅｌｌｎｅｔ．ｈｍｓ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ）へのウェブインターフェースを使用して、図２の各転換に関する予測を提供した。Ｄ’Ａｌｌｅｓｓｉｏ ｅｔ ａｌ．は、多数の細胞タイプに関するＴＦのランク付けセッ
トを提供し、これらのランク付けリストを比較に使用した。

【0288】

表７：Ｍｏｇｒｉｆｙ、ＣｅｌｌＮｅｔ及びＤ’Ａｌｅｓｓｉｏ ｅｔ ａｌ．の性能を比較するベンチマーキング結果。図２の各転換に関して、各技術の予測を示す。ＣｅｌｌＮｅｔ及びＤ’Ａｌｅｓｓｉｏ ｅｔ ａｌのランク付けリストは、Ｍｏｇｒｉｆｙのセットのサイズでカットオフされている。これらのセットを比較するために、平均ランク及び公表されたセットからの総回収効率を抽出する。これらの統計は、各技術がこれらの転換に関して達成したであろう性能を示す案内となる。公表された転写因子の特定の失敗は、各技術からの予測された転写因子が、必ずしも細胞を転換できないことを意味するものではなく、このベンチマークは、入手可能なデータのみに基づく性能を評価するよう設計されている。ＣｅｌｌＮｅｔに関するＭｙｏｂｌａｓｔの予測には、骨格筋ＧＲＮを使用した。

【0289】

【表15】

【0290】

【表16】

【0291】

表８：Ｍｏｇｒｉｆｙ及びその個々の構成要素（ＭＡＲＡ、ＳＴＲＩＮＧ及び差次的発現）の性能を比較するベンチマーキング結果。図２の各転換に関して、Ｍｏｇｒｉｆｙ及びＭｏｇｒｉｆｙの個々の構成要素の各々に関する予測を示す。ＭＡＲＡ、ＳＴＲＩＮＧ及び差次的発現構成要素のランク付けリストは、Ｍｏｇｒｉｆｙにより予測されるセットのサイズでカットオフされている。これらのセットを比較するために、平均ランク及び公表セットからの総回収効率を抽出する。これらの統計は、各技術がこれらの転換に関して達成したであろう性能を示す案内となる。公表された転写因子の特定の失敗は、各技術からの予測された転写因子が、必ずしも細胞を転換できないことを意味するものではなく、
このベンチマークは、入手可能なデータのみに基づく性能を評価するよう設計されている。

【0292】

【表17】

【0293】

【表18】

【0294】

実施例３
Ｍｏｇｒｉｆｙの予測能力を実験で証明するために、本発明者らはヒト細胞を使用して１１の新規な細胞転換を行った：
・線維芽細胞から角化細胞（結果は実施例４）；
・角化細胞から内皮細胞（結果は実施例５）；
・線維芽細胞から内皮細胞（結果は実施例６）；
・胚性幹細胞から内皮細胞（結果は実施例７）；
・人工多能性幹細胞から内皮細胞（結果は実施例８）；
・線維芽細胞から星状細胞（結果は実施例９）；
・胚性幹細胞から星状細胞（結果は実施例１０）；
・人工多能性幹細胞から星状細胞（結果は実施例１１）；
・骨間葉系幹細胞から星状細胞（結果は実施例１２）；
・胚性幹細胞から角化細胞（結果は実施例１３）；及び
・人工多能性幹細胞から角化細胞（結果は実施例１４）。

【0295】

この実施例に、材料及び方法を記載する。

【0296】

レンチウイルス生成
レンチウイルス生成のために、２９３Ｔヒト胚腎臓（ＨＥＫ；Ｓｉｇｍａ）細胞をＴ－７５フラスコ内で培養した。細胞が９０～９５％コンフルエンスに達した後、ＬＴＸリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）遺伝子導入剤を使用して、ＥＦ１αプロモーター及びＩＲＥＳ２－ｅＧＦＰ（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ）から関連転写因子（例えばＣＤＨ１、ＦＯＳ、ＦＯＸＱ１、ＨＯＸＢ６、ＩＲＦ１、ＭＡＦＢ、ＲＥＬ、ＳＭＡＤ１、ＳＯＸ９、ＳＯＸ１７、ＴＡＬ１、ＴＣＦ７Ｌ１、ＭＸＤ４、ＮＦＫＢ１、ＳＯＸ２、ＡＲＮＴ２、ＲＵＮＸ２、ＰＡＸ６、ＳＮＡＩ２、ＨＭＧＢ２、Ｅ２Ｆ１、ＭＹＣ、ＦＯＳＬ２、又はＴＦＡＰ２Ａ）を発現している－ｌｖ１６５ベクターを、第２世代Ｔｒｏｎｏ ｌａｂパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２及びｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ）と共に、細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間及び３６時間後にウイルス上清を収集し、超遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。次いで、ウイルス濃縮物を－８０℃で保存した。滴定は、フローサイトメトリーにより測定されるｅＧＦＰ発現に基づくものであった。これらの実験に使用した細胞株は、マイコプラズマ汚染に関して陰性であった。

【0297】

細胞培養
実験で使用する前に、ヒト成人上皮角化細胞（ＨＥＫａ；ＧＩＢＣＯ）及びヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦｓ；ＧＩＢＣＯ）を２．５×１０^３細胞／ｃｍ^２に増やし、少なくとも３回継代した。１０％ ＨＫＧＳ（ＧＩＢＣＯ）及び１％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（ＧＩＢＣＯ）を含む角化細胞血清フリー培地（ＫＳＦＭ；ＧＩＢＣＯ）中でＨＥＫａ細胞を培養した。一方、ＨＤＦｓは、１０％ ＬＳＧＳ（ＧＩＢＣＯ）及び１％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含む培地１０６（ＧＩＢＣＯ）中で培養した。次いで、細胞を後の使用のために液体窒素中で凍結させた。角化細胞からの内皮細胞分化転換のために、細胞を解凍し、９０％コンフルエンスに達するまで、２．５×１０^３細胞／ｃｍ^２で播種した。次いで、それらをＫＳＦＭ培地中に５．０×１０^３細胞／ｃｍ^２で２日間再び播種し、その後、ポリブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の存在下、ＫＳＦＭ培地中でＨＯＸＢ６、ＩＲＦ１、ＳＭＡＤ１、ＳＯＸ１７、ＴＡＬ１、及びＴＣＦ７Ｌ１の濃縮レンチウイルス粒子で感染させた。ウイルスの添加後（１２～２４時間）、培地を新鮮なＫＳＦＭ培地と交換した。４日目、培地を、ヒトＶＥＧＦ（５０ｎｇ／μｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、ヒトＢＭＰ４（２０ｎｇ／μｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）及びヒトＦＧＦ２（２０ｎｇ／μｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を含む１％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを有するヒト内皮血清フリー培地（ＧＩＢＣＯ）と交換した。線維芽細胞からの角化細胞分化転換のために、細胞を９０％コンフルエンスに達するまで、２．５×１０^３細胞／ｃｍ^２で播種した。次いで、それらをマウス線維芽細胞培地（ＭＥＦＭ）中に２．５×１０^３細胞／ｃｍ^２で２４時間再び播種し、その後、ポリブレンの存在下、ＭＥＦＭ中でＣＤＨ１、ＦＯＳ、ＦＯＸＱ１、ＭＡＦＢ、ＲＥＬ、及びＳＯＸ９のレンチウイルス粒子を２４時間形質導入した。４日目、培地を、１％ Ｐｅ
ｎ／Ｓｔｒｅｐ、レチノイン酸及びヒトＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ）を含むＫＳＦＭ培地と交換した。全実験を通して、新鮮な培地を少なくとも２日に１回加えた。これらの実験の各々を３～４回繰り返した。

【0298】

【表19】

【0299】

フローサイトメトリー
様々な時点で、分化転換細胞を、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ）を用いて３７℃で３分間分離した。次いで、細胞をフローサイトメトリー分析又は選別のために調製した。細胞を抗－ヒトＣＤ３１－ＡＰＣ（１７－０３１９－４１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共に４℃で１５分間インキュベートし、ＤＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ）で洗浄し、１０００ｒｐｍで７分間遠心分離した後、ヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）含有培地中に再懸濁した。ＬＳＲ－ＩＩ分析器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＩｎｆｌｕｘ細胞選別機（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、各々、データ分析及び選別に使用した。

【0300】

ｑＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造業者の指示書に従って全ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。リアルタイム定量ＰＣＲ反応を、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＱＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して３重で設定した後、７５００リアルタイムＰＣＲシステム上で行った。ｑＰＣＲのプライマー配列は：
Ｆ－ＣＤ３１：ＣＣＴＴＣＴＧＣＴＣＴＧＴＴＣＡＡＧＣＣ
Ｒ－ＣＤ３１：ＧＧＧＴＣＡＧＧＴＴＣＴＴＣＣＣＡＴＴＴ
Ｆ－ＶＥ：ＡＴＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＡＴＧＣＣＣＣＧ
Ｒ－ＶＥ：ＴＧＴＣＴＡＴＴＧＣＧＧＡＧＡＴＣＴＧＣＡＧ
Ｆ－ＶＥＧＦＲ２：ＧＧＣＣＣＡＡＴＡＡＴＣＡＧＡＧＴＧＧＣＡ
Ｒ－ＶＥＧＦＲ２：ＣＣＡＧＴＧＴＣＡＴＴＴＣＣＧＡＴＣＡＣＴＴＴ
Ｆ－ケラチン１：ＡＧＡＧＴＧＧＡＣＣＡＡＣＴＧＡＡＧＡＧＴ
Ｒ－ケラチン１：ＡＴＴＣＴＣＴＧＣＡＴＴＴＧＴＣＣＧＣＴＴ
Ｆ－ケラチン１４：ＡＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＴＡＣＴＧＣ
Ｒ－ケラチン１４：ＡＧＧＡＧＡＡＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧ
Ｆ－インボルクリン：ＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＴＡＣＴＧＴＧＡ
Ｒ－インボルクリン：ＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＣＡＧＴＣＴＴＧＡＧＧ
Ｆ－β－ＡＣＴＩＮ：ＣＡＴＧＴＡＣＧＴＴＧＣＴＡＴＣＣＡＧＧＣ
Ｒ－β－ＡＣＴＩＮ：ＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴ
である。

【0301】

免疫蛍光法
細胞をＤＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間固定した。関心対象のマーカーが細胞表面上に発現していたため、細胞を透過処理する必要はなかった。細胞をＤＰＢＳ中の５％ロバ血清で３０分間ブロックした後、一次抗体（ヤギポリクローナル抗ＣＤ３１、ｓｃ－１５０６；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ；及びウサギポリクローナル抗ＶＥ－カドヘリン、ａｂ３３１６８；ａｂｃａｍ）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を二次抗体（ロバ抗ヤギＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ－５５５；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、及びロバ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ－６４７；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に室温で２時間インキュベートした。最終的に、細胞を４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１分間覆った。Ｎｉｋｏｎ Ｄｉｇｉｔａｌ ｓｉｇｈｔ ＤＳ－Ｕ２カメラを有する倒立Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ落射蛍光顕微鏡を使用して全画像を撮影し、ＦＩＪＩソフトウエアを使用して処理及び分析した。

【0302】

実施例４－ヒト線維芽細胞から角化細胞（ｉＫｅｒ）への転換
この転換のために、Ｍｏｇｒｉｆｙにより予測されたＦＯＸＱ１、ＳＯＸ９、ＭＡＦＢ、ＣＤＨ１、ＦＯＳ及びＲＥＬを細胞に形質導入した（図３Ａ及び表１０）。

【0303】

【表20】

【0304】

形質導入後の１６日目までに、角化細胞関連のマーカー、ケラチン１、ケラチン１４及びインボルクリンは、分化転換細胞内で顕著に上方調節された（図３Ｃ）。更に、３週目までに、形質導入された細胞の大部分は、角化細胞により示される典型的な特徴である玉石形態を示した。隣接する非形質導入ＧＦＰネガティブ細胞、又は、ＧＦＰのみのウイルスを形質導入された対照細胞は、それらの線維芽細胞形態を維持した（図３Ｄの矢印）。このリプログラミングされた細胞の形態及び分子特性は、Ｍｏｇｒｉｆｙがヒト線維芽細胞から角化細胞様細胞への転換を誘導するのに必要なＴＦを首尾よく予測することを示す。

【0305】

実施例５－成人ヒト角化細胞（ＨＥＫａ）から微小血管内皮細胞（ｉＥＣｓ）へ
この転換のために、本発明者らはＭｏｇｒｉｆｙにより提案された６つのＴＦからＳＯＸ１７、ＴＡＬ１、ＳＭＡＤ１、ＩＲＦ１及びＴＣＦ７Ｌ１を使用することを選択した（図４及び表１１）。

【0306】

【表21】

【0307】

これらの５つのＴＦは、ｉＥＣｓに必要な遺伝子の９２％までを調節することが予測される。これらのＴＦがＨＥＫａ細胞内で過剰発現された後、本発明者らは、細胞をそれらの培地中に４日目まで保つ必要があることを見出した（図４Ｂ）。本発明者らはＦＡＣＳを使用して、安定している内皮マーカーＣＤ３１を使用して細胞リプログラミングの動態を調べ（図４Ｃ）、形質導入後の１４日目までに、本発明者らは感染細胞の２％超が上方調節されたＣＤ３１を有し、１８日目までにほぼ１０％が上方調節されたＣＤ３１を有することを認めた。この時点で、本発明者らは、これらのＣＤ３１細胞を単離し、ｑＰＣＲにより内皮関連遺伝子（ＣＤ３１、ＶＥ－カドヘリン及びＶＥＧＦＲ２）の発現を評価し、評価された全遺伝子の明らかな再活性化が示された（図４Ｄ）。最終的に、本発明者らは、免疫蛍光法（ＩＦ）を行って分化転換細胞の形態及び発現を検証した。図４Ｅに示すように、予測されたＴＦを形質導入された細胞のみ－対象細胞ではない－が、正しい形態を提示し、表面上にＣＤ３１及びＶＥ－カドヘリンを発現した。このリプログラミングされた細胞の形態及び分子特性は、ヒト内皮様細胞へのヒト角化細胞の遷移の成功を示す。

【0308】

実施例６－線維芽細胞から内皮細胞へ
使用した転写因子：ＳＯＸ１７、ＳＭＡＤ１、ＴＡＬ１、ＩＲＦ１、ＴＣＦ７Ｌ１及びＭＸＤ４。（Ｍｏｇｒｉｆｙは因子ＪＵＮＢも特定したが、これは使用しなかった）。

【0309】

分化転換戦略：転写因子のウイルス形質導入の２４時間前に、ＬＳＧＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有する培地１０６中で、ヒト皮膚線維芽細胞をウェルプレート上に５ｋ細胞／ｃｍ^２で播種した。翌日、転写因子をコードするレンチウイルス粒子を、ポリブレン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を有する培地１０６中で細胞に形質導入した。次いで、形質導入の直後、ウェルプレートを１９００ｒｐｍで６０分間遠心分離した。５日目に、培地をＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、及びＢＭＰ４（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で補充した内皮培地（培地１３１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と交換した。培地は実験全体を通して２日毎に交換した。

【0310】

免疫蛍光分析は、分化転換の１８日目に内皮マーカーＰｅＣＡＭ及びＶＥ－カドヘリン（ｃａｄｅｈｒｉｎ）の発現の証拠を示した（図８Ａ）。

【0311】

ｑＰＣＲ分析も、分化転換の１８日目に、内皮関連の遺伝子ＶＥＧＦＲ２及びＶＥ－カドヘリンの発現レベルを示した（図８Ｂ）。

【0312】

実施例７－胚性幹細胞から内皮細胞へ
使用した転写因子：ＳＯＸ１７、ＳＭＡＤ１、ＴＡＬ１、ＮＦＫＢ１及びＩＲＦ１。（Ｍｏｇｒｉｆｙは因子ＨＯＸＢ７及びＪＵＮＢも特定したが、これらは使用しなかった）。

【0313】

分化転換戦略：転写因子のウイルス形質導入の２４時間前に、ヒト胚性幹細胞（Ｈ９）をＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、マトリゲル被覆（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）ウェルプレート上に５ｋ細胞／ｃｍ^２で播種した。翌日、転写因子をコードするレンチウイルス粒子を、ポリブレン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を有するＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地中で細胞に形質導入した。次いで、形質導入の直後、ウェルプレートを１９００ｒｐｍで６０分間遠心分離した。５日目に、培地をＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、及びＢＭＰ４（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で補充した内皮培地（培地１３１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と交換した。培地は実験全体を通して２日毎に交換した。

【0314】

免疫蛍光分析は、分化転換の１８日目に内皮マーカーＰｅＣＡＭ及びＶＥ－カドヘリン（ｃａｄｅｈｒｉｎ）の発現の証拠を示した（図９Ａ）。

【0315】

ｑＰＣＲ分析は、分化転換の１８日目に、内皮関連の遺伝子ＶＥＧＦＲ２及びＶＥ－カドヘリンの発現レベルを示した（図９Ｂ）。

【0316】

図１０は、分化転換の１２及び１８日目のＰｅＣＡＭ発現のフローサイトメトリー分析と、分化転換の１８日目のＰｅＣＡＭ陽性細胞の定量化の結果を示す。

【0317】

実施例８－多能性幹細胞から内皮細胞へ
使用した転写因子：ＳＯＸ１７、ＴＡＬ１、ＮＦＫＢ１、ＩＲＦ１、及びＳＭＡＤ１。（Ｍｏｇｒｉｆｙは因子ＨＯＸＢ７及びＪＵＮＢも特定したが、これらは使用しなかった）。

【0318】

分化転換戦略：転写因子のウイルス形質導入の２４時間前に、ヒト誘導多能性幹細胞（３２Ｆドナー）をＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
中で、マトリゲル被覆（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）ウェルプレート上に５ｋ細胞／ｃｍ^２で播種した。翌日、転写因子をコードするレンチウイルス粒子を、ポリブレン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を有するＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地中で細胞に形質導入した。次いで、形質導入の直後、ウェルプレートを１９００ｒｐｍで６０分間遠心分離した。５日目に、培地をＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、及びＢＭＰ４（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で補充した内皮培地（培地１３１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と交換した。培地は実験全体を通して２日毎に交換した。

【0319】

免疫蛍光分析は、分化転換の１８日目に内皮マーカーＰｅＣＡＭ及びＶＥ－カドヘリン（ｃａｄｅｈｒｉｎ）の発現を示す（図１１Ａ）。

【0320】

ｑＰＣＲ分析は、分化転換の１８日目に、内皮関連の遺伝子ＶＥＧＦＲ２及びＶＥ－カドヘリンの発現レベルを示す（図１１Ｂ）。

【0321】

図１２は、分化転換の１２及び１８日目のＰｅＣＡＭ発現のフローサイトメトリー分析を示す。分化転換の１８日目のＰｅＣＡＭ陽性細胞のＦＳＣ、フォワードスキャッター及び定量化。

【0322】

実施例９－線維芽細胞から星状細胞へ
使用した転写因子：ＳＯＸ２、ＳＯＸ９ ＡＲＮＴ２、ＳＭＡＤ１及びＲＵＮＸ２。（Ｍｏｇｒｉｆｙは因子Ｅ２Ｆ５及びＰＢＸ１も特定したが、これらは使用しなかった）。

【0323】

分化転換戦略：転写因子のウイルス形質導入の２４時間前に、ＬＳＧＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有する培地１０６中で、ヒト皮膚線維芽細胞をウェルプレート上に５ｋ細胞／ｃｍ^２で播種した。翌日、転写因子をコードするレンチウイルス粒子を、ポリブレン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を有する培地中で細胞に形質導入した。次いで、形質導入の直後、ウェルプレートを１９００ｒｐｍで６０分間遠心分離した。５日目に、培地をＩＬ１β（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で補充した星状細胞培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と交換した。７日目に、培地を星状細胞培地と交換した。培地は実験全体を通して２日毎に交換した。

【0324】

免疫蛍光分析は、分化転換の２１日目に星状細胞マーカーＧＦＡＰの発現を示す（図１３）。

【0325】

実施例１０－胚性（Ｅｍｂｙｒｏｎｉｃ）幹細胞（Ｈ９）から星状細胞へ
使用した転写因子：ＩＲＦ１、ＳＯＸ９、ＡＲＮＴ２、ＰＡＸ６、ＳＮＡＩ２、ＲＵＮＸ２。（Ｍｏｇｒｉｆｙは因子ＳＯＸ５も予測したが、これは使用しなかった）。

【0326】

分化転換戦略：転写因子のウイルス形質導入の２４時間前に、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、ヒト胚性幹細胞（Ｈ９）をマトリゲル被覆（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）ウェルプレート上に５ｋ細胞／ｃｍ^２で播種した。翌日、転写因子をコードするレンチウイルス粒子を、ポリブレン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を有するＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地中で細胞に形質導入した。次いで、形質導入の直後、ウェルプレートを１９００ｒｐｍで６０分間遠心分離した。２日目に、培地をＢ２７サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び０．６μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を有するＮ２培地と交換した。６日目に、培地をＩＬ１β（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で補充した星状細胞培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と交換した。８日目に、培地を星状細胞培地と交換した。培地は実験全体を通して２日毎に交換した。

【0327】

免疫蛍光分析は、分化転換の２１日目に星状細胞マーカーＧＦＡＰの発現を示す（図１４）。

【0328】

実施例１１－多能性幹細胞から星状細胞へ
使用した転写因子：ＰＡＸ６、ＳＮＡＩ２、ＲＵＮＸ２、ＨＭＧＢ２。（Ｍｏｇｒｉｆｙは因子ＰＯＵ３Ｆ２．Ｅ２Ｆ５及びＳＯＸ５も予測したが、これらは使用しなかった）。

【0329】

分化転換戦略：転写因子のウイルス形質導入の２４時間前に、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、ヒト誘導多能性幹細胞（３２Ｆドナー）をマトリゲル被覆（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）ウェルプレート上に５ｋ細胞／ｃｍ^２で播種した。翌日、転写因子をコードするレンチウイルス粒子を、ポリブレン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を有するＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地中で細胞に形質導入した。次いで、形質導入の直後、ウェルプレートを１９００ｒｐｍで６０分間遠心分離した。２日目に、培地をＢ２７サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び０．６μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を有するＮ２培地と交換した。６日目に、培地をＩＬ１β（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で補充した星状細胞培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と交換した。８日目に、培地を星状細胞培地と交換した。培地は実験全体を通して２日毎に交換した。

【0330】

免疫蛍光分析は、分化転換の２１日目に星状細胞マーカーＧＦＡＰの発現を示した（図１５）。

【0331】

実施例１２－間葉系幹細胞から星状細胞へ
転写因子：ＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＡＲＮＴ２、ＭＹＢＬ２、Ｅ２Ｆ１、ＨＭＧＢ２。（Ｍｏｇｒｉｆｙは因子ＨＯＸＢ７及びＪＵＮＢも特定したが、これらは使用しなかった）。

【0332】

分化転換戦略：転写因子のウイルス形質導入の２４時間前に、ＭＳＣ培地（１５％ ＦＢＳ、グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを有するα－ＭＥＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、骨髄間葉系幹細胞（７０８１ドナー）をウェルプレート上に５ｋ細胞／ｃｍ^２で播種した。翌日、転写因子をコードするレンチウイルス粒子を、ポリブレン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を有するＭＳＣ培地中で細胞に形質導入した。次いで、形質導入の直後、ウェルプレートを１９００ｒｐｍで６０分間遠心分離した。５日目に、培地をＩＬ１β（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で補充した星状細胞培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と交換した。７日目に、培地を星状細胞培地と交換した。培地は実験全体を通して２日毎に交換した。

【0333】

免疫蛍光分析は、分化転換の２１日目に星状細胞マーカーＧＦＡＰの発現を示した（図１６）。

【0334】

実施例１３－胚性幹細胞から角化細胞へ
使用した転写因子：ＳＯＸ９、ＮＦＫＢ１、ＭＹＣ、ＦＯＳＬ２。（Ｍｏｇｒｉｆｙは因子ＮＲ２Ｆ２、ＦＯＳＬ１及びＡＨＲも予測したが、これらは使用しなかった）。

【0335】

分化転換戦略：転写因子のウイルス形質導入の２４時間前に、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、ヒト胚性幹細胞（Ｈ９）をマトリゲル被覆（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）ウェルプレート上に５ｋ細胞／ｃｍ^２で播種した。翌日、転写因子をコードするレンチウイルス粒子を、ポリブレン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ）を有するＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地中で細胞に形質導入した。次いで、形質導入の直後、ウェルプレートを１９００ｒｐｍで６０分間遠心分離した。２日目に、培地を３μＭのレチノイン酸を有するＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地と交換した。６日目に、培地をＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及びＥＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で補充したＥｐｉＬｉｆｅ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と交換した。培地は実験全体を通して２日毎に交換した。

【0336】

免疫蛍光分析は、分化転換の２１日目に角化細胞マーカーパンケラチンの発現を示した（図１７）。

【0337】

実施例１４－多能性幹細胞から角化細胞へ
転写因子：ＴＦＡＰ２Ａ、ＭＹＣ、ＳＯＸ９、ＮＦＫＢ１。（Ｍｏｇｒｉｆｙは因子ＴＰ６３及びＮＦＫＢＩＡも予測したが、これらは使用しなかった）。

【0338】

分化転換戦略：転写因子のウイルス形質導入の２４時間前に、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、ヒト誘導多能性幹細胞（３２Ｆドナー）をマトリゲル被覆（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）ウェルプレート上に５ｋ細胞／ｃｍ^２で播種した。翌日、転写因子をコードするレンチウイルス粒子を、ポリブレン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を有するＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地中で細胞に形質導入した。次いで、形質導入の直後、ウェルプレートを１９００ｒｐｍで６０分間遠心分離した。２日目に、培地を３μＭのレチノイン酸を有するＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地と交換した。６日目に、培地をＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及びＥＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で補充したＥｐｉＬｉｆｅ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と交換した。培地は実験全体を通して２日毎に交換した。

【0339】

免疫蛍光分析は、分化転換の２１日目に角化細胞マーカーケラチン１４（ＫＲＴ１４）の発現を示す（図１８Ａ）。

【0340】

ｑＰＣＲ分析は、分化転換の２１日目に角化細胞関連の遺伝子ケラチン１４及びケラチン１の発現レベルを示す（図１８Ｂ及び１８Ｃ）。

【0341】

実施例１５
代表的な細胞景観を生成するためにいくつかの試みを行ったが、１つ又は２つの細胞タイプに焦点を当て、経路積分準ポテンシャル、機構的モデリング又は確率景観に基づくものである。本発明者らは、Ｍｏｇｒｉｆｙにより決定された、全部－対－全部のＴＦネットワーク差異の組み合わせの転写プロファイルとの比較により、ヒト細胞タイプを表す３Ｄ景観の形成が可能になるとの仮説を立てた（図７）。景観は、分子的に類似した細胞タイプを、ｘ－ｙ面にて互いに接近して配置し、細胞タイプがどのくらい、良好な出発細胞ソースの可能性があるかに従って高さ（ｚ方向）を調整する（オンラインの材料及び方法にて詳細を参照）。興味深いことに、本発明者らは、異なる幹細胞が最高位置に配置されることを認める。このことは、景観において最高地点にある細胞の転写ネットワークは、より少数のＴＦによって制御され、細胞が分化するにつれて（谷部内）、細胞はより多くのＴＦが転写ネットワークを微調整するのに必要となることを示唆し得る。

【図1-1】

【図1-2】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-01-16

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

ソース細胞を標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を有する細胞に転換するのに必要な転写因子を決定する方法であって：
－前記ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプ中の遺伝子の差次的発現を決定するステップと；
－前記差次的遺伝子発現に基づいて、少なくとも１つのネットワークに亘って、前記ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプの各々における各転写因子に関するネットワークスコアを決定するステップであって、前記ネットワークは、遺伝子発現に影響する相互作用の情報を含む、ステップであって、転写因子に中心を置く少なくとも１つのサブネットワークに亘って、遺伝子スコアの加重和を実行することにより、各転写因子に関するネットワークスコアを計算するステップと；
－ネットワークスコアと差次的遺伝子発現との情報の組み合わせに基づいて前記転写因子をランク付けし、それによりソース細胞から標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を有する細胞への転換のための転写因子のセットを特定するステップと、を含む、方法。

【請求項2】

前記ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプ中の各差次的発現遺伝子に関する遺伝子スコアを決定するステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記遺伝子スコアが、前記差次的発現のｌｏｇ倍数変化と調整Ｐ値との組み合わせである、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記遺伝子スコアが、下記等式１を用いたｌｏｇ倍数変化と調整Ｐ値との組み合わせである、請求項３に記載の方法：

（式中、L ^S _X はサンプルｓ内の遺伝子ｘのｌｏｇ倍数変化であり、P ^S _X はサンプルｓ内の遺伝子ｘの調整ｐ値である）。

【請求項5】

前記遺伝子スコアが、好ましくは背景に対する、ツリーベースの方法を使用して計算される、又はＢａｙｅｓｉａｎクラスタリングを使用して計算される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記ネットワークが、タンパク質－ＤＮＡ相互作用、タンパク質－タンパク質相互作用及び／又はタンパク質－ＲＮＡ相互作用の情報を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

ネットワークが、Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ／Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＳＴＲＩＮＧ）データベースを含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ネットワークが、遺伝子の転写因子及び調節領域の間の相互作用の情報を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

前記調節領域が、遺伝子のプロモーター領域である及び／又はネットワークが、Ｍｏｔｉｆ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＭＡＲＡ）由来の相互作用を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

更に、各細胞タイプからの前記ランク付けリストから、転写的に重複性のＴＦを除去するステップを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプにおける遺伝子の差次的発現の決定が、発現データの差次的発現分析を使用した遺伝子スコアを決定することを含み、発現データが、それぞれの遺伝子の転写開始部位を特定し、及び／又は発現データは、キャップ分析遺伝子発現で得られた発現データ及び／又は発現データがＦＡＮＴＯＭ５データセットから得られた発現データを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

細胞タイプSにおける転写因子xへのネットワークスコア（N ^S _X,n ）が、下記等式２を使用してネットワークｎにわたって計算される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法：

（式中、 _Ｘ∈ Ｖ _ｘ は、転写因子xの局所サブネットワークを構成するノード（Ｖｘ）のセットにおける各遺伝子（ｒ）であり、
Ｌ _ｒ，ｎ は、ネットワークｎにおけるxから離れるステップの数ｒであり、
G ^s _r は、遺伝子ｒへの遺伝子スコアであり、及び
Ｏ _ｒ，ｎ は、ネットワークｎにおけるｒの親の程度である。）

【請求項13】

ソース細胞タイプから、標的細胞タイプの少なくとも１つの特徴を示す細胞に転換するための転写因子のセットを特定することが、標的細胞タイプのランク付けリストとソース細胞タイプにおける発現された特定された遺伝子のセットを比較することを含み、
標的細胞タイプリストからの転写因子がすでにソース細胞タイプで発現されているときは、その後ランク付けリストから除去される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

少なくとも１つのネットワークに亘って差次的遺伝子発現に基づく、ソース及び標的細胞タイプのそれぞれにおける、それぞれの転写因子へのネットワークスコアを決定することが、第２のネットワークにわたる各転写因子への第１のネットワーク及び第２のネットワークスコアにわたる各転写因子への第１のネットワークスコアを決定することを含み、第１のネットワークが、遺伝子のプロモーター領域内の既知の結合部位を有する転写因子間のタンパク質－ＤＮＡ相互作用を含み、第２のネットワークが、タンパク質－タンパク質、タンパク質－ＤＮＡ及びタンパク質－ＲＮＡ相互作用を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法であって、
－前記ソース細胞は、皮膚線維芽細胞、上皮角化細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞、単球又は心臓線維芽細胞からなる群から選択され；及び／又は
－前記標的細胞タイプは、軟骨細胞、毛包、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ－細胞、造血性（ｈａｅｍｏｐｏｅｉｔｉｃ）幹細胞（ＨＳＣ）、脂肪の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、骨髄の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆体、骨格筋細胞、平滑筋細胞、胎児心筋細胞、内皮細胞、星状細胞、角化細胞及び上皮細胞からなる群から選択され；及び／又は
ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプがそれぞれ、ＦＡＮＴＯＭ５データセットに記載された細胞タイプのいずれかから選択される、方法。

【請求項16】

標的細胞の少なくとも１つの特徴が、任意の１つ以上の標的細胞マーカーの上方調節及び／又は細胞形態における変化である、請求項１～１５のいずれかに記載の方法。

【請求項17】

請求項１～１６のいずれかに記載の方法であって、該方法がさらに：
－ソース細胞において、ソース細胞タイプから標的細胞タイプへの転換に必要であると決定された１つ以上の転写因子の量を増大させること
を含む、方法。

【請求項18】

プロセッサー、及びプロセッサーによって実行されると、プロセッサーが請求項１～１７のいずれかに記載の方法を実行する指示を格納するコンピューター読み取り可能な媒体を含む、コンピューターシステム。

【請求項19】

前記標的細胞タイプの少なくとも一つの特徴を示す細胞へのソース細胞タイプの転換を促進するのに有用な剤を特定する方法であって：
－請求項１～１７に記載の方法を使用して、標的細胞タイプの少なくとも一つの特徴を示す細胞へのソース細胞タイプの転換に必要な１つ以上の転写因子を決定するステップと；
－標的細胞タイプの少なくとも一つの特徴を示す細胞へのソース細胞タイプの転換に必要な前記１つ以上の転写因子の量を増大させる能力に関して１つ以上の候補剤をスクリーニングするステップと；
を含み、
前記１つ以上の転写因子の前記量を増大させる剤は、前記標的細胞タイプの少なくとも一つの特徴を示す細胞へのソース細胞タイプの前記転換を促進するのに有用な剤である、方法。