特開 2024-38030 腫瘍崩壊性腫瘍ウイルスおよび使用の方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024038030

(43)【公開日】2024-03-19

(54)【発明の名称】腫瘍崩壊性腫瘍ウイルスおよび使用の方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/01 20060101AFI20240312BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240312BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240312BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20240312BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 31/436 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240312BHJP

【ＦＩ】

C12N7/01 ZNA

C12N15/09 Z

C12N15/113 Z

A61K35/761

A61P35/00

A61P43/00 121

A61K31/436

A61K45/00

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023216375

(22)【出願日】2023-12-22

(62)【分割の表示】P 2020153724の分割

【原出願日】2015-09-23

(31)【優先権主張番号】62/054,724

(32)【優先日】2014-09-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】513037649

【氏名又は名称】ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】クロダーグ オーシア

(72)【発明者】

【氏名】シゲキ ミヤケ－ストナー

(57)【要約】

【課題】腫瘍崩壊性腫瘍ウイルスおよび使用の方法の提供。
【解決手段】Ｅ２Ｆ脱調節腫瘍細胞で選択的に複製する組換えアデノウイルスが、記載される。組換えアデノウイルスは、改変されたＥ１Ａタンパク質、改変されたか欠失させたＥ４ｏｒｆ１タンパク質、改変されたか欠失させたＥ４ｏｒｆ６／７タンパク質またはその任意の組合せをコードするゲノムを有し、そのため組換えアデノウイルスは、腫瘍細胞と比較して正常細胞で複製欠陥を示す。いくつかの例では、組換えアデノウイルスゲノムは、特異的細胞型を組換えアデノウイルスの標的にし、肝臓をウイルスの脱標的化し、肝臓でのウイルス複製を阻害し、および／または既存の中和抗体を回避する、追加の改変をコードする。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

図面に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０１４年９月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／０５４，７２４号の利益を主張し、当該出願は、その全体が本明細書において参考として援用される。

【0002】

この開示は、腫瘍細胞における溶解複製を選択的に起こす、Ｅ１Ａ、Ｅ４ｏｒｆ１および／またはＥ４ｏｒｆ６／７の１つまたは複数の改変を含む組換えアデノウイルスに関する。組換えアデノウイルスは、全身送達および腫瘍細胞での取込みを可能にするために、繊維、ヘキソンまたはカプシドタンパク質の１つまたは複数の改変を任意選択で有する。
政府援助の謝辞

【0003】

本発明は、米国国立衛生研究所から授与された助成金番号５Ｔ３２ＧＭ００７２４０－３５の下の政府援助によって作られた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

【背景技術】

【0004】

がんは、毎年５０万人超の死亡の原因である、複合的な衰弱性の疾患である。がんのためのより効果的かつ選択的で安全な治療への重大な必要性がある。この拡散的な生命をおびやかす疾患のための既存の治療、例えば化学療法および手術は、全ての悪性細胞を排除することが稀であり、治療の有益性を上回ることがある有害な副作用をしばしば示す。

【0005】

現行のがん治療の欠点の多くに対処する可能性を有する１つのアプローチは、腫瘍崩壊性のアデノウイルス療法である（Pesonenら、Molecular Pharmaceutics８巻（１号）：
１２～２８頁、２０１０年）。アデノウイルス（Ａｄ）は、自己複製する生物機械である。アデノウイルスは、タンパク質外皮に包まれた線状の二本鎖３６ｋｂ ＤＮＡゲノムからなる。アデノウイルスは細胞複製機構を侵略し、乗っ取って、増殖し、アセンブリー後、溶解細胞死を誘導して、周辺細胞に拡散する。これらの全く同じ細胞制御装置が、がんの突然変異の標的である。この知識を活用することにより、腫瘍細胞に特異的に感染して複製し、細胞を溶解させて、可能な抵抗に打ち勝ちつつ遠隔転移を探し出して破壊することができる何千ものウイルス子孫を放出する、誘導ミサイルのように働く合成ウイルスを作製することができる。したがって、腫瘍崩壊性ウイルスの設計の目標は、がん細胞で特異的に複製するが正常細胞には無害であるウイルスを生産することである。しかし、がん細胞において選択的に複製することができるウイルスを設計することにおいては、かなりの難題があった。したがって、がん細胞において選択的に複製するさらなるウイルスの必要性がまだある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Pesonenら、Molecular Pharmaceutics８巻（１号）：１２～２８頁、２０１０年

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

Ｅ２Ｆ脱調節腫瘍細胞において選択的に複製する組換えアデノウイルスが開示される。組換えアデノウイルスは、改変Ｅ１Ａタンパク質、改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質またはその任意の組合せをコードするゲノムを有し、そのため組換えアデノウイルスは、腫瘍細胞と比較して正常細胞において複製欠陥を示す。組換えアデノウイルスのゲノムは、特異的細胞型を組換えアデノウイルスの標的にし、肝臓からウイルスを脱標的化し、肝臓でのウイルス複製を阻害し、および／または既存の中和抗体を回避する、追加の改変を任意選択でさらにコードする。

【0008】

組換えアデノウイルスのゲノムが、改変Ｅ１Ａタンパク質、改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質またはその任意の組合せをコードし、組換えアデノウイルスは、腫瘍細胞と比較して正常細胞において複製欠陥を示す、組換えアデノウイルスが本明細書で提供される。

【0009】

一部の実施形態では、組換えアデノウイルスゲノムは、誘導可能な再標的化のための改変をさらにコードする。例えば、ゲノムは、ＦＫ５０６結合性タンパク質（ＦＫＢＰ）に融合した標的化リガンド、および野生型ＦＫＢＰ－ラパマイシン結合性（ＦＲＢ）タンパク質またはＴ２０９８Ｌ置換を含む突然変異体ＦＲＢタンパク質に融合したアデノウイルス繊維タンパク質を任意選択でコードする。

【0010】

一部の実施形態では、組換えアデノウイルスゲノムは、肝臓からアデノウイルスを脱標的化する改変をさらにコードする。一部の例では、ゲノムは、ヘキソンタンパク質の改変をコードし、および／または肝臓特異的マイクロＲＮＡのための１つまたは複数の結合部位を含む。

【0011】

一部の実施形態では、ウイルスを代替の細胞受容体にリダイレクトするために、組換えアデノウイルスゲノムは、キメラ繊維タンパク質をコードする。

【0012】

一部の実施形態では、組換えアデノウイルスゲノムは、既存の中和抗体を回避するために、カプシド交換アデノウイルスをコードする。一部の例では、ゲノムのＥ１、Ｅ３およびＥ４領域は第１のアデノウイルス血清型に由来し、ゲノムのＥ２Ｂ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｅ２ＡおよびＬ４領域は第２のアデノウイルス血清型に由来する。

【0013】

さらに、組換えアデノウイルスのゲノムが、Ｅ１の欠失を含み、ＥＦ１αプロモーターによって駆動するＧＦＰ－ルシフェラーゼ融合タンパク質をコードする、組換えリポーターアデノウイルス遺伝子発現ベクターが提供される。一部の実施形態では、アデノウイルス発現ベクターは、３’－ＵＴＲに肝臓特異的マイクロＲＮＡ結合部位をさらに含む。

【0014】

開示される組換えアデノウイルスを含む組成物も、本明細書で提供される。さらに、組換えアデノウイルスゲノムの配列を含む組換え核酸分子およびベクターが提供される。

【0015】

本明細書に開示される組換えアデノウイルス（またはその組成物）を投与することによって、腫瘍細胞生存性を阻害し、腫瘍進行を阻害し、腫瘍体積を低減し、がんの対象を治療する方法が、本開示によってさらに提供される。

【0016】

本開示の上のおよび他の目的および特徴は、添付の図面を参照して進行する以下の詳細な説明からより明白になる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１Ａ～１Ｂは、組換えアデノウイルス感染細胞からのアデノウイルスＥ１Ａの発現を示す細胞溶解物のイムノブロットである。細胞は、模擬感染させたか、またはＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２（野生型）、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１（Ｅ１ＡΔＬＸＣＸＥ／ΔＥ４ｏｒｆ６／７）、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８９（Ｅ１ＡΔＬＸＣＸＥ）またはＯＮＹＸ－８３８（Ｅ１ＡΔＣＲ２）に感染させた。図１Ａについては、静止期のヒト一次小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）をＭＯＩ １０で感染させ、溶解物をＥ１Ａ発現について分析した。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２感染細胞では、感染の後期にＥ１Ａレベルの低下があった。同様に、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８９またはＯＮＹＸ－８３８感染細胞では、感染の後期にＥ１Ａレベルの低下があった。しかし、初期の時点では、Ｅ１Ａの発現は、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２感染細胞でのＥ１Ａの発現より大きい。対照的に、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１感染細胞は感染全期間でＥ１Ａのより強く連続した発現を示し、そのことはアデノウイルス生活環を通した進行の失敗を指し示す。図１Ｂについては、コンフルエント肺腺癌細胞（Ａ５４９）をＭＯＩ ３０で感染させ、溶解物をＥ１Ａ発現について分析した。全ての感染は、感染の後期にＥ１Ａレベルの低下につながり、典型的なアデノウイルス生活環進行を指し示す。

【0018】

【図2】図２Ａ～２Ｂは、感染した一次および腫瘍細胞での細胞サイクリンおよびアデノウイルス後期タンパク質の発現を示す細胞溶解物のイムノブロットである。細胞は、模擬感染させたか、またはＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２（野生型）、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１（Ｅ１ＡΔＬＸＣＸＥ／ΔＥ４ｏｒｆ６／７）、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８９（Ｅ１ＡΔＬＸＣＸＥ）、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２１０（ΔＥ４ｏｒｆ６／７）またはＯＮＹＸ－８３８（Ｅ１ＡΔＣＲ２）に感染させた。図２Ａについては、ＳＡＥＣをＭＯＩ １０で感染させた。野生型ウイルスおよびＥ１Ａ突然変異だけを有するウイルスと対照的に、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１は、Ｅ２Ｆ依存性細胞周期標的、Ｓ相サイクリン、サイクリンＡおよびサイクリンＢを活性化することができなかった。さらに、Ｅ４ｏｒｆ６／７突然変異を有するＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１およびＡｄＳｙｎ－ＣＯ２１０は、後期タンパク質の発現および複製に欠陥があった。これらの欠陥の両方とも、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２１０においてはより低い程度で明らかだった。図２Ｂについては、Ａ５４９細胞を、ＭＯＩ ３０で感染させた。感染一次細胞と対照的に、後期構造タンパク質の発現で明らかな欠陥はなく、サイクリンＡおよびサイクリンＢは全ての感染Ａ５４９試料にまだ存在していた。

【0019】

【図3】図３Ａ～３Ｂは、それぞれ感染ＳＡＥＣおよびＡ５４９細胞での細胞性ＤＮＡを数量化するＦＡＣＳヒストグラムである。細胞は、模擬感染させたか、またはＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２（野生型）、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１（Ｅ１ＡΔＬＸＣＸＥ／ΔＥ４ｏｒｆ６／７）、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８９（Ｅ１ＡΔＬＸＣＸＥ）またはＡｄＳｙｎ－ＣＯ２１０（ΔＥ４ｏｒｆ６／７）に感染させて、感染から４８時間後に収集した。非感染細胞のＤＮＡ含有量を、バックグラウンドプロファイルに示す。Ｙ軸は細胞の相対的な存在度であり、Ｘ軸は細胞中のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）からの蛍光であり、それはＤＮＡの量に比例する。図３Ａについては、静止期のＳＡＥＣを、ＭＯＩ １０で感染させた。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１感染はＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２と比較してＳＡＥＣで大きなＤＮＡ複製欠陥を示し、それはウイルス複製の減少と関連している。この時点で、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２１０感染ＳＡＥＣでも軽度の欠陥が明らかだった。図３Ｂについては、Ａ５４９細胞を、ＭＯＩ ３０で感染させた。これらの細胞では、いかなる突然変異体ウイルス感染でもＤＮＡ複製欠陥は明らかでなかった。

【0020】

【図4】図４Ａ～４Ｂは、それぞれ感染ＳＡＥＣおよびＡ５４９細胞からのアデノウイルスバーストを示すグラフである。細胞は、模擬感染させたか、またはＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２（野生型）、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１（Ｅ１ＡΔＬＸＣＸＥ／ΔＥ４ｏｒｆ６／７）、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８９（Ｅ１ＡΔＬＸＣＸＥ）、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２１０（ΔＥ４ｏｒｆ６／７）またはＯＮＹＸ－８３８（Ｅ１ＡΔＣＲ２）に感染させ、感染から４８および７２時間後に培地を収集した。培地中の感染性ウイルス粒子を、ＥＬＩＳＡによって数量化した。図４Ａについては、静止期のＳＡＥＣを、ＭＯＩ １０で感染させた。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１およびＡｄＳｙｎ－ＣＯ２１０感染は両方とも、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２と比較してＳＡＥＣで大きな複製欠陥を明らかにした。図４Ｂについては、Ａ５４９細胞を、ＭＯＩ ３０で感染させた。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２１０を除いては、これらの細胞でウイルス複製の欠陥は観察されなかった。

【0021】

【図5】図５Ａ～５Ｂは、感染から７日後の感染ＳＡＥＣおよびＡ５４９細胞の細胞生存性をそれぞれ示すグラフである。細胞は、模擬感染させたか、またはＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２（野生型）、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１（Ｅ１ＡΔＬＸＣＸＥ／ΔＥ４ｏｒｆ６／７）、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８９（Ｅ１ＡΔＬＸＣＸＥ）、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２１０（ΔＥ４ｏｒｆ６／７）またはＯＮＹＸ－８３８（Ｅ１ＡΔＣＲ２）の系列希釈に感染させ、細胞代謝活性をＷＳＴ－１アッセイによって数量化した。図５Ａに示すように、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２と比較して、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１はＳＡＥＣで細胞殺滅能力の低下を示した。図５Ｂに示すように、試験した突然変異体ウイルスの中では、野生型ウイルスと比較して細胞殺滅の欠陥はなかった。

【0022】

【図6AB】図６Ａは、細胞溶解物のイムノブロットである。アデノウイルス後期構造タンパク質発現および細胞性サイクリン誘導を検出するために、ＭＯＩ １０で感染させた正常ヒト星状神経膠細胞（ＮＨＡ）をイムノブロットにかけた。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１はサイクリンＡを誘導せず、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２と比較して遅く、減少した後期ウイルスタンパク質発現を実証し、そのことは複製欠陥を指し示す。図６Ｂ～６Ｃは、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１がＮＨＡで減弱された感染を示すことを示すグラフである。図６Ｂについては、ＮＨＡをウイルス群に感染させ、感染から４８および７２時間後に培地中の感染性粒子の数を数量化した。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１およびＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８９は、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２と比較してＮＨＡで複製欠陥を実証した。図６Ｃについては、ＭＯＩ １０で感染させたＮＨＡで、感染から４８時間後に、ＰＩ ＦＡＣＳによりＤＮＡ複製を数量化した。非感染細胞のＤＮＡ含有量を、ヒストグラムのバックグラウンドプロファイルに示す。Ｙ軸は細胞の相対的な存在度であり、Ｘ軸は細胞中のＰＩからの蛍光であり、それは核酸の量に比例する。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１はＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２と比較して低下したＤＮＡ複製誘導を示し、それはウイルス複製の減少とリンクしている。

【0023】

【図6C】図６Ｂ～６Ｃは、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１がＮＨＡで減弱された感染を示すことを示すグラフである。図６Ｂについては、ＮＨＡをウイルス群に感染させ、感染から４８および７２時間後に培地中の感染性粒子の数を数量化した。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１およびＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８９は、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２と比較してＮＨＡで複製欠陥を実証した。図６Ｃについては、ＭＯＩ １０で感染させたＮＨＡで、感染から４８時間後に、ＰＩ ＦＡＣＳによりＤＮＡ複製を数量化した。非感染細胞のＤＮＡ含有量を、ヒストグラムのバックグラウンドプロファイルに示す。Ｙ軸は細胞の相対的な存在度であり、Ｘ軸は細胞中のＰＩからの蛍光であり、それは核酸の量に比例する。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１はＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２と比較して低下したＤＮＡ複製誘導を示し、それはウイルス複製の減少とリンクしている。

【0024】

【図7AB】図７Ａは、感染神経膠芽腫Ｕ８７細胞からの細胞溶解物のイムノブロットである。アデノウイルス後期構造タンパク質発現および細胞性サイクリン誘導を検出するために、ＭＯＩ ２０で感染させたＵ８７細胞をイムノブロットにかけた。図７Ｂ～７Ｃは、組換えアデノウイルスが神経膠芽腫Ｕ８７細胞で複製欠陥を有しないことを示すグラフである。図７Ｂについては、Ｕ８７細胞をウイルス群に感染させ、感染から４８および７２時間後に培地中の感染性粒子の数を数量化した。図７Ｃについては、ＭＯＩ ２０で感染させたＵ８７細胞で、感染から４８時間後に、ＰＩ ＦＡＣＳによりＤＮＡ複製を数量化した。非感染細胞のＤＮＡ含有量を、ヒストグラムのバックグラウンドプロファイルに示す。Ｙ軸は細胞の相対的な存在度であり、Ｘ軸は細胞中のＰＩからの蛍光であり、それは核酸の量に比例する。

【0025】

【図7C】図７Ｂ～７Ｃは、組換えアデノウイルスが神経膠芽腫Ｕ８７細胞で複製欠陥を有しないことを示すグラフである。図７Ｂについては、Ｕ８７細胞をウイルス群に感染させ、感染から４８および７２時間後に培地中の感染性粒子の数を数量化した。図７Ｃについては、ＭＯＩ ２０で感染させたＵ８７細胞で、感染から４８時間後に、ＰＩ ＦＡＣＳによりＤＮＡ複製を数量化した。非感染細胞のＤＮＡ含有量を、ヒストグラムのバックグラウンドプロファイルに示す。Ｙ軸は細胞の相対的な存在度であり、Ｘ軸は細胞中のＰＩからの蛍光であり、それは核酸の量に比例する。

【0026】

【図8AB】図８Ａは、感染神経膠芽腫Ｕ１１８細胞からの細胞溶解物のイムノブロットである。アデノウイルス後期構造タンパク質発現および細胞性サイクリン誘導を検出するために、ＭＯＩ ２０で感染させたＵ１１８細胞をイムノブロットにかけた。図８Ｂ～８Ｃは、組換えアデノウイルスが神経膠芽腫Ｕ１１８細胞で複製欠陥を有しないことを示すグラフである。図８Ｂについては、Ｕ１１８細胞をウイルス群に感染させ、感染から４８および７２時間後に培地中の感染性粒子の数を数量化した。図８Ｃについては、ＭＯＩ ２０で感染させたＵ１１８細胞で、感染から４８時間後に、ＰＩ ＦＡＣＳによりＤＮＡ複製を数量化した。非感染細胞のＤＮＡ含有量を、ヒストグラムのバックグラウンドプロファイルに示す。Ｙ軸は細胞の相対的な存在度であり、Ｘ軸は細胞中のＰＩからの蛍光であり、それは核酸の量に比例する。

【0027】

【図8C】図８Ｂ～８Ｃは、組換えアデノウイルスが神経膠芽腫Ｕ１１８細胞で複製欠陥を有しないことを示すグラフである。図８Ｂについては、Ｕ１１８細胞をウイルス群に感染させ、感染から４８および７２時間後に培地中の感染性粒子の数を数量化した。図８Ｃについては、ＭＯＩ ２０で感染させたＵ１１８細胞で、感染から４８時間後に、ＰＩ ＦＡＣＳによりＤＮＡ複製を数量化した。非感染細胞のＤＮＡ含有量を、ヒストグラムのバックグラウンドプロファイルに示す。Ｙ軸は細胞の相対的な存在度であり、Ｘ軸は細胞中のＰＩからの蛍光であり、それは核酸の量に比例する。

【0028】

【図9AB】図９Ａは、感染ヒト線維芽細胞（ＩＭＲ９０細胞）からの細胞溶解物のイムノブロットである。後期構造タンパク質発現を検出するために、ＭＯＩ １０で感染させた線維芽細胞をイムノブロットにかけた。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１はＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２と比較して遅く、減少した後期ウイルスタンパク質発現を示し、そのことは複製欠陥を指し示す。図９Ｂ～９Ｃは、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１がＩＭＲ９０細胞で軽度の複製欠陥を有することを示すグラフである。図９Ｂについては、線維芽細胞をウイルス群に感染させ、感染から４８および７２時間後に培地中の感染性粒子の数を数量化した。これらの時点におけるこのアッセイで、改変アデノウイルスの複製能力に明白な差がなかった。図９Ｃについては、ＭＯＩ ２０で感染させた線維芽細胞で、感染から４８時間後に、ＰＩ ＦＡＣＳによりＤＮＡ複製を数量化した。非感染細胞のＤＮＡ含有量を、ヒストグラムのバックグラウンドプロファイルに示す。Ｙ軸は細胞の相対的な存在度であり、Ｘ軸は細胞中のＰＩからの蛍光であり、それは核酸の量に比例する。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１はＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２と比較して低下したＤＮＡ複製誘導を示し、それはウイルス複製の減少とリンクしている。

【0029】

【図9C】図９Ｂ～９Ｃは、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１がＩＭＲ９０細胞で軽度の複製欠陥を有することを示すグラフである。図９Ｂについては、線維芽細胞をウイルス群に感染させ、感染から４８および７２時間後に培地中の感染性粒子の数を数量化した。これらの時点におけるこのアッセイで、改変アデノウイルスの複製能力に明白な差がなかった。図９Ｃについては、ＭＯＩ ２０で感染させた線維芽細胞で、感染から４８時間後に、ＰＩ ＦＡＣＳによりＤＮＡ複製を数量化した。非感染細胞のＤＮＡ含有量を、ヒストグラムのバックグラウンドプロファイルに示す。Ｙ軸は細胞の相対的な存在度であり、Ｘ軸は細胞中のＰＩからの蛍光であり、それは核酸の量に比例する。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１はＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２と比較して低下したＤＮＡ複製誘導を示し、それはウイルス複製の減少とリンクしている。

【0030】

【図10】図１０は、感染から１０日後の感染一次ＮＨＡ細胞の細胞生存性を示すグラフである。細胞を、野生型または突然変異体ウイルスの系列希釈に感染させた。代謝活性は、ＷＳＴ－１アッセイによって数量化した。１細胞につき３つおよび１０個の感染性粒子では２つの群のウイルスが明らかであり、グラフでは「より少ない殺滅」および「より多い殺滅」と表示した。より少ない細胞殺滅を誘導したウイルスは、Ｒｂ結合性突然変異を有するＥ１ＡおよびＥ４ｏｒｆ６／７の欠失の両方を有する。より多い殺滅を誘導したウイルスは、野生型Ｅ１または野生型Ｅ４のいずれかを有する。

【0031】

【図11】図１１は、感染から９日後の感染した静止期のＳＡＥＣ－ｈＴＥＲＴ細胞の細胞生存性を示すグラフである。細胞を、野生型または突然変異体ウイルスの系列希釈に感染させた。代謝活性は、ＷＳＴ－１アッセイによって数量化した。１細胞につき３つおよび１０個の感染性粒子では２つの群のウイルスが明らかであり、グラフでは「より少ない殺滅」および「より多い殺滅」と表示した。より少ない細胞殺滅を誘導したウイルスは、Ｒｂ結合性突然変異を有するＥ１ＡおよびＥ４ｏｒｆ６／７の欠失の両方を有する。より多い細胞殺滅を誘導したウイルスは、野生型Ｅ１または野生型Ｅ４のいずれかを有する。

【0032】

【図12】図１２は、感染から９日後の感染した増殖期のＳＡＥＣ－ｈＴＥＲＴ細胞の細胞生存性を示すグラフである。細胞を、野生型または突然変異体ウイルスの系列希釈に感染させた。代謝活性は、ＷＳＴ－１アッセイによって数量化した。１細胞につき３つおよび１０個の感染性粒子では２つの群のウイルスが明らかであり、グラフでは「より少ない殺滅」および「より多い殺滅」と表示した。より少ない細胞殺滅を誘導したウイルスは、Ｒｂ結合性突然変異を有するＥ１ＡおよびＥ４ｏｒｆ６／７の欠失の両方を有する。より多い細胞殺滅を誘導したウイルスは、野生型Ｅ１または野生型Ｅ４のいずれかを有する。

【0033】

【図13】図１３は、感染から７日後の感染Ａ５４９細胞の細胞生存性を示すグラフである。細胞を、野生型または改変ウイルスの系列希釈に感染させた。代謝活性は、ＷＳＴ－１アッセイによって数量化した。

【0034】

【図14】図１４は、感染から７日後の感染ヒト乳がん細胞（ＭＤＡ ＭＢ２３１）の細胞生存性を示すグラフである。細胞を、野生型または改変ウイルスの系列希釈に感染させた。代謝活性は、ＷＳＴ－１アッセイによって数量化した。

【0035】

【図15】図１５は、感染から７日後の感染神経膠芽腫細胞（Ｕ８７）の細胞生存性を示すグラフである。細胞を、野生型または改変ウイルスの系列希釈に感染させた。代謝活性は、ＷＳＴ－１アッセイによって数量化した。

【0036】

【図16】図１６は、図１０～１５に示す、感染一次ＮＨＡ、ＳＡＥＣ－ｈＴＥＲＴ（静止期）、ＳＡＥＣ－ｈＴＥＲＴ（増殖期）、Ａ５４９、ＭＤＡ ＭＢ２３１およびＵ８７細胞のための細胞生存性アッセイの定量化を示す表である。

【0037】

【図17】図１７は、感染Ｕ２ＯＳ細胞（機能的ｐ５３およびＲｂを有する）およびＳａＯＳ２細胞（非機能的ｐ５３およびＲｂを有する）のための細胞生存性アッセイの定量化を示す表である。細胞を、野生型または改変ウイルスの系列希釈に感染させた。代謝活性は、ＷＳＴ－１アッセイによって数量化した。

【0038】

【図18AB】図１８Ａは、ＦＲＢドメインとラパマイシンおよびＦＫＢＰ１２との結合界面を示す図である。突然変異体ＦＲＢドメイン（ＦＲＢ^＊；ｍＴＯＲ残基Ｔ２０９８Ｌ）は、ラパマイシンまたはラパマイシン相同体ＡＰ２１９６７のいずれかとＦＲＢ／ＦＫＢＰ１２ヘテロダイマーを形成するように誘導される。図１８Ｂは、ＡＰ２１９６７でなくラパマイシンの存在下で、ＦＲＢ－繊維を有するＥＧＦＲ標的化ウイルス（ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０５；配列番号８８）が、ＭＤＡ ＭＢ４５３乳がん細胞の改善された形質導入を有することを示すグラフである。ラパマイシンまたはＡＰ２１９６７のいずれかの存在下で、ＦＲＢ^＊－繊維を有するＥＧＦＲ標的化ウイルス（ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２２０；配列番号９８）は、ＭＤＡ ＭＢ４５３細胞の改善された形質導入を有する。図１８Ｃは、その標的ｐ７０ Ｓ６Ｋのリン酸化をブロックするｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンの活性を示すイムノブロットである。ラパマイシン相同体ＡＰ２１９６７は、標的化濃度でｍＴＯＲを阻害しない。図１８Ｄは、感染から９日後の感染ＨＳ５７８Ｔ転移性乳がん細胞の細胞生存性を示すグラフである。細胞を、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１２の系列希釈に感染させた。感染から２４、４８、７２および９６時間後に、新鮮なラパマイシンまたはＡＰ２１９６７を５０ｎＭまで追加した。代謝活性をＷＳＴ－１アッセイによって数量化し、マッチさせた薬物治療の非感染細胞に正規化させた。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１２はＥ１ＡΔＬＸＣＸＥ、ΔＥ４ｏｒｆ６／７、ΔＥ３－ＲＩＤα／β、ΔＥ３－１４．７ｋの腫瘍崩壊性突然変異を有し、ラパマイシン依存性またはＡＰ２１９６７依存性のＥＧＦＲ標的化遺伝子ＥＧＦＲＶＨＨ－ＦＫＢＰおよびＦＲＢ^＊－繊維を発現する。標的化なしに対してラパマイシンまたはＡＰ２１９６７を受けるＥＧＦＲ標的化腫瘍崩壊性ウイルスに感染した細胞で、殺滅の増大がある。図１８Ｅは、感染から９日後の感染ＨＳ５７８Ｔ転移性乳がん細胞の細胞生存性を示すグラフである。細胞を、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１３の系列希釈に感染させた。感染から２４、４８、７２および９６時間後に、新鮮なラパマイシンを５０ｎＭまで追加した。代謝活性をＷＳＴ－１アッセイによって数量化し、マッチさせた薬物治療の非感染細胞に正規化させた。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１３はＥ１ＡΔＬＸＣＸＥ、ΔＥ４ｏｒｆ６／７、ΔＥ３－ＲＩＤα／β、ΔＥ３－１４．７ｋの腫瘍崩壊性突然変異を有し、ラパマイシン依存性のＥＧＦＲ標的化遺伝子ＥＧＦＲＶＨＨ－ＦＫＢＰおよびＦＲＢ－繊維を発現する。標的化なしでラパマイシンを受けるＥＧＦＲ標的化腫瘍崩壊性ウイルスに感染した細胞で、殺滅の増大がある。

【図18CD】図１８Ａは、ＦＲＢドメインとラパマイシンおよびＦＫＢＰ１２との結合界面を示す図である。突然変異体ＦＲＢドメイン（ＦＲＢ^＊；ｍＴＯＲ残基Ｔ２０９８Ｌ）は、ラパマイシンまたはラパマイシン相同体ＡＰ２１９６７のいずれかとＦＲＢ／ＦＫＢＰ１２ヘテロダイマーを形成するように誘導される。図１８Ｂは、ＡＰ２１９６７でなくラパマイシンの存在下で、ＦＲＢ－繊維を有するＥＧＦＲ標的化ウイルス（ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０５；配列番号８８）が、ＭＤＡ ＭＢ４５３乳がん細胞の改善された形質導入を有することを示すグラフである。ラパマイシンまたはＡＰ２１９６７のいずれかの存在下で、ＦＲＢ^＊－繊維を有するＥＧＦＲ標的化ウイルス（ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２２０；配列番号９８）は、ＭＤＡ ＭＢ４５３細胞の改善された形質導入を有する。図１８Ｃは、その標的ｐ７０ Ｓ６Ｋのリン酸化をブロックするｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンの活性を示すイムノブロットである。ラパマイシン相同体ＡＰ２１９６７は、標的化濃度でｍＴＯＲを阻害しない。図１８Ｄは、感染から９日後の感染ＨＳ５７８Ｔ転移性乳がん細胞の細胞生存性を示すグラフである。細胞を、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１２の系列希釈に感染させた。感染から２４、４８、７２および９６時間後に、新鮮なラパマイシンまたはＡＰ２１９６７を５０ｎＭまで追加した。代謝活性をＷＳＴ－１アッセイによって数量化し、マッチさせた薬物治療の非感染細胞に正規化させた。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１２はＥ１ＡΔＬＸＣＸＥ、ΔＥ４ｏｒｆ６／７、ΔＥ３－ＲＩＤα／β、ΔＥ３－１４．７ｋの腫瘍崩壊性突然変異を有し、ラパマイシン依存性またはＡＰ２１９６７依存性のＥＧＦＲ標的化遺伝子ＥＧＦＲＶＨＨ－ＦＫＢＰおよびＦＲＢ^＊－繊維を発現する。標的化なしに対してラパマイシンまたはＡＰ２１９６７を受けるＥＧＦＲ標的化腫瘍崩壊性ウイルスに感染した細胞で、殺滅の増大がある。図１８Ｅは、感染から９日後の感染ＨＳ５７８Ｔ転移性乳がん細胞の細胞生存性を示すグラフである。細胞を、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１３の系列希釈に感染させた。感染から２４、４８、７２および９６時間後に、新鮮なラパマイシンを５０ｎＭまで追加した。代謝活性をＷＳＴ－１アッセイによって数量化し、マッチさせた薬物治療の非感染細胞に正規化させた。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１３はＥ１ＡΔＬＸＣＸＥ、ΔＥ４ｏｒｆ６／７、ΔＥ３－ＲＩＤα／β、ΔＥ３－１４．７ｋの腫瘍崩壊性突然変異を有し、ラパマイシン依存性のＥＧＦＲ標的化遺伝子ＥＧＦＲＶＨＨ－ＦＫＢＰおよびＦＲＢ－繊維を発現する。標的化なしでラパマイシンを受けるＥＧＦＲ標的化腫瘍崩壊性ウイルスに感染した細胞で、殺滅の増大がある。

【図18E】図１８Ａは、ＦＲＢドメインとラパマイシンおよびＦＫＢＰ１２との結合界面を示す図である。突然変異体ＦＲＢドメイン（ＦＲＢ^＊；ｍＴＯＲ残基Ｔ２０９８Ｌ）は、ラパマイシンまたはラパマイシン相同体ＡＰ２１９６７のいずれかとＦＲＢ／ＦＫＢＰ１２ヘテロダイマーを形成するように誘導される。図１８Ｂは、ＡＰ２１９６７でなくラパマイシンの存在下で、ＦＲＢ－繊維を有するＥＧＦＲ標的化ウイルス（ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０５；配列番号８８）が、ＭＤＡ ＭＢ４５３乳がん細胞の改善された形質導入を有することを示すグラフである。ラパマイシンまたはＡＰ２１９６７のいずれかの存在下で、ＦＲＢ^＊－繊維を有するＥＧＦＲ標的化ウイルス（ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２２０；配列番号９８）は、ＭＤＡ ＭＢ４５３細胞の改善された形質導入を有する。図１８Ｃは、その標的ｐ７０ Ｓ６Ｋのリン酸化をブロックするｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンの活性を示すイムノブロットである。ラパマイシン相同体ＡＰ２１９６７は、標的化濃度でｍＴＯＲを阻害しない。図１８Ｄは、感染から９日後の感染ＨＳ５７８Ｔ転移性乳がん細胞の細胞生存性を示すグラフである。細胞を、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１２の系列希釈に感染させた。感染から２４、４８、７２および９６時間後に、新鮮なラパマイシンまたはＡＰ２１９６７を５０ｎＭまで追加した。代謝活性をＷＳＴ－１アッセイによって数量化し、マッチさせた薬物治療の非感染細胞に正規化させた。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１２はＥ１ＡΔＬＸＣＸＥ、ΔＥ４ｏｒｆ６／７、ΔＥ３－ＲＩＤα／β、ΔＥ３－１４．７ｋの腫瘍崩壊性突然変異を有し、ラパマイシン依存性またはＡＰ２１９６７依存性のＥＧＦＲ標的化遺伝子ＥＧＦＲＶＨＨ－ＦＫＢＰおよびＦＲＢ^＊－繊維を発現する。標的化なしに対してラパマイシンまたはＡＰ２１９６７を受けるＥＧＦＲ標的化腫瘍崩壊性ウイルスに感染した細胞で、殺滅の増大がある。図１８Ｅは、感染から９日後の感染ＨＳ５７８Ｔ転移性乳がん細胞の細胞生存性を示すグラフである。細胞を、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１３の系列希釈に感染させた。感染から２４、４８、７２および９６時間後に、新鮮なラパマイシンを５０ｎＭまで追加した。代謝活性をＷＳＴ－１アッセイによって数量化し、マッチさせた薬物治療の非感染細胞に正規化させた。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１３はＥ１ＡΔＬＸＣＸＥ、ΔＥ４ｏｒｆ６／７、ΔＥ３－ＲＩＤα／β、ΔＥ３－１４．７ｋの腫瘍崩壊性突然変異を有し、ラパマイシン依存性のＥＧＦＲ標的化遺伝子ＥＧＦＲＶＨＨ－ＦＫＢＰおよびＦＲＢ－繊維を発現する。標的化なしでラパマイシンを受けるＥＧＦＲ標的化腫瘍崩壊性ウイルスに感染した細胞で、殺滅の増大がある。

【0039】

【図19】図１９は、治療されたマウスにおけるＨＳ５７８Ｔ皮下異種移植の平均腫瘍体積を示すグラフである。確立された腫瘍を有するマウスはＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１３の腫瘍内注射を受け、その後、定期的な腹腔内８ｍｇ／ｋｇラパマイシン注射（ｎ＝５）もしくはビヒクル対照（ｎ＝４）を受けたか、または、それらは腫瘍内ビヒクル対照を受け、その後、定期的な腹腔内８ｍｇ／ｋｇラパマイシン注射（ｎ＝５）もしくはビヒクル対照（ｎ＝４）を受けた。最初の感染の１９日後に開始して、４日ごとにさらに３回、同じ群で感染を繰り返した。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１３はＥ１ＡΔＬＸＣＸＥ、ΔＥ４ｏｒｆ６／７、ΔＥ３－ＲＩＤα／β、ΔＥ３－１４．７ｋの腫瘍崩壊性突然変異を有し、ラパマイシン依存性のＥＧＦＲ標的化遺伝子ＥＧＦＲＶＨＨ－ＦＫＢＰおよびＦＲＢ－繊維を発現する。ラパマイシンとＥＧＦＲ標的化腫瘍崩壊性ウイルスを受けたマウスでの腫瘍は、最良の応答を示した。

【0040】

【図20】図２０は、感染から９日後の感染ＨＳ５７８Ｔ転移性乳がん細胞の細胞生存性を示すグラフである。細胞を、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５の系列希釈に感染させた。感染から２４、４８、７２および９６時間後に、新鮮なラパマイシンまたはＡＰ２１９６７を５０ｎＭまで追加した。代謝活性をＷＳＴ－１アッセイによって数量化し、マッチさせた薬物治療の非感染細胞に正規化させた。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５は、Ｅ１ＡΔＬＸＣＸＥ、ΔＥ４ｏｒｆ６／７、ΔＥ３－ＲＩＤα／β、ΔＥ３－１４．７ｋの腫瘍崩壊性突然変異；肝臓脱標的化ヘキソン突然変異Ｅ４５１Ｑを有し；ラパマイシン依存性またはＡＰ２１９６７依存性のＥＧＦＲ標的化遺伝子ＥＧＦＲＶＨＨ－ＦＫＢＰおよびＦＲＢ^＊－繊維を発現する。標的化なしに対してラパマイシンまたはＡＰ２１９６７を受けるＥＧＦＲ標的化腫瘍崩壊性ウイルスに感染した細胞で、殺滅の増大がある。

【0041】

【図21AB】図２１Ａ～２１Ｂは、治療されたマウスにおけるＨＳ５７８Ｔ皮下異種移植の平均体積を示すグラフである。図２１Ｃ～２１Ｄは、治療されたマウスにおけるＨＳ５７８Ｔ皮下異種移植の体積の変化倍率を示すグラフである。確立された腫瘍を有するマウスは、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５の３回の腫瘍内注射を４日ごとに受け、その後、腹腔内２もしくは８ｍｇ／ｋｇラパマイシン注射（それぞれｎ＝８およびｎ＝８）を隔日に、またはビヒクル対照を（ｎ＝６）隔日に受け；または、それらはＡｄＳｙｎ－ＣＯ４４２の３回の腫瘍内注射を４日ごとに受け、その後腹腔内２もしくは８ｍｇ／ｋｇラパマイシン注射（それぞれｎ＝６およびｎ＝６）を隔日に受け；または、それらはビヒクル対照の３回の腫瘍内注射を４日ごとに受け、その後腹腔内２もしくは８ｍｇ／ｋｇラパマイシン注射（それぞれｎ＝６およびｎ＝６）を隔日に受けた。８ｍｇ／ｋｇラパマイシンとＥＧＦＲ標的化腫瘍崩壊性ウイルスを受けたマウスでの腫瘍は、最良の応答を示す。

【図21C】図２１Ａ～２１Ｂは、治療されたマウスにおけるＨＳ５７８Ｔ皮下異種移植の平均体積を示すグラフである。図２１Ｃ～２１Ｄは、治療されたマウスにおけるＨＳ５７８Ｔ皮下異種移植の体積の変化倍率を示すグラフである。確立された腫瘍を有するマウスは、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５の３回の腫瘍内注射を４日ごとに受け、その後、腹腔内２もしくは８ｍｇ／ｋｇラパマイシン注射（それぞれｎ＝８およびｎ＝８）を隔日に、またはビヒクル対照を（ｎ＝６）隔日に受け；または、それらはＡｄＳｙｎ－ＣＯ４４２の３回の腫瘍内注射を４日ごとに受け、その後腹腔内２もしくは８ｍｇ／ｋｇラパマイシン注射（それぞれｎ＝６およびｎ＝６）を隔日に受け；または、それらはビヒクル対照の３回の腫瘍内注射を４日ごとに受け、その後腹腔内２もしくは８ｍｇ／ｋｇラパマイシン注射（それぞれｎ＝６およびｎ＝６）を隔日に受けた。８ｍｇ／ｋｇラパマイシンとＥＧＦＲ標的化腫瘍崩壊性ウイルスを受けたマウスでの腫瘍は、最良の応答を示す。

【図21D】図２１Ａ～２１Ｂは、治療されたマウスにおけるＨＳ５７８Ｔ皮下異種移植の平均体積を示すグラフである。図２１Ｃ～２１Ｄは、治療されたマウスにおけるＨＳ５７８Ｔ皮下異種移植の体積の変化倍率を示すグラフである。確立された腫瘍を有するマウスは、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５の３回の腫瘍内注射を４日ごとに受け、その後、腹腔内２もしくは８ｍｇ／ｋｇラパマイシン注射（それぞれｎ＝８およびｎ＝８）を隔日に、またはビヒクル対照を（ｎ＝６）隔日に受け；または、それらはＡｄＳｙｎ－ＣＯ４４２の３回の腫瘍内注射を４日ごとに受け、その後腹腔内２もしくは８ｍｇ／ｋｇラパマイシン注射（それぞれｎ＝６およびｎ＝６）を隔日に受け；または、それらはビヒクル対照の３回の腫瘍内注射を４日ごとに受け、その後腹腔内２もしくは８ｍｇ／ｋｇラパマイシン注射（それぞれｎ＝６およびｎ＝６）を隔日に受けた。８ｍｇ／ｋｇラパマイシンとＥＧＦＲ標的化腫瘍崩壊性ウイルスを受けたマウスでの腫瘍は、最良の応答を示す。

【0042】

【図22】図２２Ａ～２２Ｃは、肝臓でのアデノウイルス媒介遺伝子発現の排除および肝臓へのアデノウイルス感染の脱標的化を示す。図２２Ａに示すように、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１９９、Ｅ１領域を欠くアデノウイルスベクターは、全身感染の後、肝臓でルシフェラーゼを排他的に高レベルで発現する。図２２Ｂに示すように、肝臓特異的マイクロＲＮＡ ｍｉＲ１２２がルシフェラーゼ発現を排除することを除いて、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１９９に対応するウイルス、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２００にマウスが全身感染するときに、ルシフェラーゼシグナルは失われる。図２２Ｃに示すように、アデノウイルスヘキソンタンパク質が、それを肝臓から脱標的化する突然変異Ｅ４５１Ｑを有することを除いて、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２００に対応するウイルス、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１７１にマウスが全身感染するとき、ルシフェラーゼの発現は脾臓で検出することができる。

【0043】

【図23ABC】図２３Ａ～２３Ｅは、繊維タンパク質構造の例示、ならびに様々な細胞型をより良好に形質導入するキメラ繊維タンパク質を有するウイルスを作製するために、２つのアデノウイルス血清型からのモジュールを組み合わせることによって生産された組換えアデノウイルスを特徴付ける一連のグラフおよび画像を含む。

【図23D】図２３Ａ～２３Ｅは、繊維タンパク質構造の例示、ならびに様々な細胞型をより良好に形質導入するキメラ繊維タンパク質を有するウイルスを作製するために、２つのアデノウイルス血清型からのモジュールを組み合わせることによって生産された組換えアデノウイルスを特徴付ける一連のグラフおよび画像を含む。

【図23E】図２３Ａ～２３Ｅは、繊維タンパク質構造の例示、ならびに様々な細胞型をより良好に形質導入するキメラ繊維タンパク質を有するウイルスを作製するために、２つのアデノウイルス血清型からのモジュールを組み合わせることによって生産された組換えアデノウイルスを特徴付ける一連のグラフおよび画像を含む。

【0044】

【図24A】図２４Ａは、カプシド交換キメラウイルスを作製するためのモジュール改変を表す例示である。図２４Ｂは、特異的突然変異体ウイルスならびにそれらのＥ１、コア、Ｅ３およびＥ４モジュール改変を掲載する表である。

【図24B】図２４Ａは、カプシド交換キメラウイルスを作製するためのモジュール改変を表す例示である。図２４Ｂは、特異的突然変異体ウイルスならびにそれらのＥ１、コア、Ｅ３およびＥ４モジュール改変を掲載する表である。

【0045】

【図25A】図２５Ａ～２５Ｅは、タンパク質含有量およびカプシド交換ウイルスからの発現を示す一連のイムノブロットである。

【図25BC】図２５Ａ～２５Ｅは、タンパク質含有量およびカプシド交換ウイルスからの発現を示す一連のイムノブロットである。

【図25DE】図２５Ａ～２５Ｅは、タンパク質含有量およびカプシド交換ウイルスからの発現を示す一連のイムノブロットである。

【0046】

【図26】図２６Ａ～２６Ｃは、カプシド交換ウイルスが抗Ａｄ５抗体を含有するヒト血清によって中和されないことを示す一連のグラフである。

【0047】

【図27】図２７は、種Ａ（Ａｄ１２；配列番号４７）、種Ｂ（Ａｄ７；配列番号４８）、種Ｃ（Ａｄ２およびＡｄ５；それぞれ配列番号４９および配列番号５０）、種Ｄ（Ａｄ９；配列番号５１）、種Ｅ（Ａｄ４；配列番号５２）、種Ｆ（Ａｄ４０；配列番号５３）および種Ｇ（Ａｄ５２；配列番号５４）を含むヒトアデノウイルス種からのＥ１Ａ配列のアラインメントを示す。本明細書に開示される腫瘍崩壊性アデノウイルス組成物で見出される突然変異部位であるＹ４７の概要を示す。強力なＥ１Ａ－Ｒｂ相互作用のために必要であるＣ１２４を含有するＬＸＣＸＥモチーフが、灰色のボックスで強調されている。

【0048】

【図28】図２８は、種Ａ（Ａｄ１２；配列番号５５）、種Ｂ（Ａｄ７；配列番号５６）、種Ｃ（Ａｄ２およびＡｄ５；それぞれ配列番号５７および配列番号５８）、種Ｄ（Ａｄ９；配列番号５９）、種Ｅ（Ａｄ４；配列番号６０）および種Ｇ（Ａｄ５２；配列番号６１）を含むヒトアデノウイルス種からのＥ４ｏｒｆ１配列のアラインメントを示す。それを通してＥ４ｏｒｆ１がＰＩ３Ｋを上方調節し、細胞増殖の負の調節を阻止する、ＰＤＺ結合性モチーフが灰色のボックスで強調されている。

【0049】

【図29】図２９は、ラパマイシン依存性のＥＧＦＲ標的化構成成分を有する合成アデノウイルスに感染した２９３－Ｅ４細胞からのタンパク質発現のイムノブロットを示す。２９３－Ｅ４細胞は、Ａｄｓｅｍｂｌｙ野生型Ａｄ（ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１７０）、標的化改変ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０５または対照ウイルスＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０６もしくはＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０７のいずれかに、１０の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。ラパマイシン制御ＥＧＦＲ標的化ウイルスＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０５については、感染のマーカーとしてＧＦＰリポーターをＥ１Ａに融合させた。Ｅ３Ｂ転写物は、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋを欠失させることによって改変し、ＥＧＦＲＶＨＨ－ＦＫＢＰを発現させるために使用した。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０６はＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０５の全ての改変を含有するが野生型繊維を保持し、したがって、ＦＲＢドメインを有しない。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０７はＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０６の全ての改変を含有するが野生型Ｅ３領域を保持し、したがって、ＦＫＢＰ融合遺伝子を有しない。繊維の移動の変化は、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０７およびＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０５での９０アミノ酸ＦＲＢドメイン挿入を示す。ＥＧＦＲＶＨＨ－ＦＫＢＰ融合タンパク質の発現は、ＦＫＢＰ１２のプローブすることによって検出された。後期タンパク質発現の時間経過は、Ａｄｓｅｍｂｌｙ野生型Ａｄと比較して、カプシド突然変異体またはＧＦＰ－Ｅ１Ａリポーターを有するＥＧＦＲＶＨＨ－ＦＫＢＰ発現ウイルスの複製で顕著な欠陥がないことを示す。

【0050】

【図30】図３０は、ビヒクル（非感染）、対照ウイルス（ＡｄＳｙｎ－ＣＯ４４２）または腫瘍崩壊性アデノウイルス（ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５）の３回の腫瘍内注射、およびラパマイシン（０、２または８ｍｇ／ｋｇ）の３週間の１日おきの腹腔内同時投与の２８日後のＨＳ５７８Ｔ異種移植腫瘍応答を示すウォーターフォールプロットである。左から右に、（ａ）非感染、ラパマイシンなし；（ｂ）非感染、２ｍｇ／ｋｇラパマイシン；（ｃ）非感染、８ｍｇ／ｋｇラパマイシン；（ｄ）ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５、ラパマイシンなし；（ｅ）ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５、２ｍｇ／ｋｇラパマイシン；（ｆ）ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５、８ｍｇ／ｋｇラパマイシン；（ｇ）ＡｄＳｙｎ－ＣＯ４４２、２ｍｇ／ｋｇラパマイシン；および（ｈ）ＡｄＳｙｎ－ＣＯ４４２、８ｍｇ／ｋｇラパマイシンを示す。Ｎ＝各群での腫瘍数。各カラムは個々の腫瘍を表し、データはその治療前の腫瘍体積と比較して表される。

【0051】

【図31】図３１は、ＨＳ５７８Ｔ異種移植組織の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を示す。皮下ＨＳ５７８Ｔ異種移植腫瘍を有するマウスを、１００μＬのビヒクル、２ｍｇ／ｋｇのラパマイシンまたは８ｍｇ／ｋｇのラパマイシンの腹腔内注射によって治療した。注射から１時間後、異種移植組織を収集し、１０％ホルマリンで固定し、Ｐ７０Ｓ６ＫのホスホＴ３７８の形態を認識する抗体によるＩＨＣ染色のために切断した。トレオニン３８９でリン酸化したＰ７０Ｓ６Ｋ（Ｐ７０Ｓ６Ｋ ｐ－Ｔ３８９）のために染色したＨＳ５７８Ｔ異種移植組織切片のマイクロピクトグラフを示す。Ｔ３８９でのＰ７０Ｓ６Ｋのリン酸化は、ｍＴＯＲ活性の特質である。無治療かまたは低いアデノウイルスＥＧＦＲ標的化有効用量（２ｍｇ／ｋｇ）の組織では、Ｐ７０Ｓ６Ｋ ｐ－Ｔ３８９の染色によって明白なように、ｍＴＯＲ活性は阻害されない。より高いアデノウイルスＥＧＦＲ標的化有効用量（８ｍｇ／ｋｇ）では、Ｐ７０Ｓ６Ｋ ｐ－Ｔ３８９染色の喪失によって明らかなように、ｍＴＯＲ活性は阻害される。

【発明を実施するための形態】

【0052】

配列表
米国特許法施行規則１．８２２に規定されるように、添付の配列表に掲載される核酸およびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基のための標準の略字およびアミノ酸のための３文字コードを使用して示される。各核酸配列の１本の鎖だけが示されるが、提示される鎖へのいかなる参照にも相補鎖が含まれると理解される。配列表は、２０１５年９月２３日に作られた２．９１ＭＢのＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出され、それは本明細書に参照により組み込まれる。添付の配列表では：

【0053】

配列番号１～３１および６８～９８は、組換えアデノウイルスのヌクレオチド配列である（表１～５；実施例６；および実施例７を参照）。

【0054】

配列番号３２は、Ａｄ５ Ｅ１Ａのアミノ酸配列である。

【0055】

配列番号３３は、Ａｄ５ Ｅ１ＡΔＬＸＣＸＥのアミノ酸配列である。

【0056】

配列番号３４は、Ａｄ５ Ｅ１Ａ Ｃ１２４Ｇのアミノ酸配列である。

【0057】

配列番号３５は、Ａｄ５ Ｅ１Ａ Δ２－１１のアミノ酸配列である。

【0058】

配列番号３６は、Ａｄ５ Ｅ１Ａ Ｙ４７Ｈ Ｃ１２４Ｇのアミノ酸配列である。

【0059】

配列番号３７は、Ａｄ５ Ｅ１Ａ Δ２－１１ Ｙ４７Ｈ Ｃ１２４Ｇのアミノ酸配列である。

【0060】

配列番号３８は、Ａｄ５ Ｅ４ｏｒｆ１のアミノ酸配列である。

【0061】

配列番号３９は、Ａｄ５ Ｅ４ｏｒｆ１ ΔＰＤＺｂのアミノ酸配列である。

【0062】

配列番号４０は、Ａｄ５ Ｅ４ｏｒｆ６／７のアミノ酸配列である。

【0063】

配列番号４１は、Ａｄ５繊維のアミノ酸配列である。

【0064】

配列番号４２は、Ａｄ５ ＦＲＢ繊維のアミノ酸配列である。

【0065】

配列番号４３は、Ａｄ５ ＦＲＢ^＊繊維のアミノ酸配列である。

【0066】

配列番号４４は、ＥＧＦＲＶＨＨ－ＧＳ－ＦＫＢＰのアミノ酸配列である。

【0067】

配列番号４５は、Ａｄ５ヘキソンのアミノ酸配列である。

【0068】

配列番号４６は、Ａｄ５ヘキソンＥ４５１Ｑのアミノ酸配列である。

【0069】

配列番号４７は、種Ａ（Ａｄ１２）Ｅ１Ａのアミノ酸配列である。

【0070】

配列番号４８は、種Ｂ（Ａｄ７）Ｅ１Ａのアミノ酸配列である。

【0071】

配列番号４９は、種Ｃ（Ａｄ２）Ｅ１Ａのアミノ酸配列である。

【0072】

配列番号５０は、種Ｃ（Ａｄ５）Ｅ１Ａのアミノ酸配列である。

【0073】

配列番号５１は、種Ｄ（Ａｄ９）Ｅ１Ａのアミノ酸配列である。

【0074】

配列番号５２は、種Ｅ（Ａｄ４）Ｅ１Ａのアミノ酸配列である。

【0075】

配列番号５３は、種Ｆ（Ａｄ４０）Ｅ１Ａのアミノ酸配列である。

【0076】

配列番号５４は、種Ｇ（Ａｄ５２）Ｅ１Ａのアミノ酸配列である。

【0077】

配列番号５５は、種Ａ（Ａｄ１２）Ｅ４ｏｒｆ１のアミノ酸配列である。

【0078】

配列番号５６は、種Ｂ（Ａｄ７）Ｅ４ｏｒｆ１のアミノ酸配列である。

【0079】

配列番号５７は、種Ｃ（Ａｄ２）Ｅ４ｏｒｆ１のアミノ酸配列である。

【0080】

配列番号５８は、種Ｃ（Ａｄ５）Ｅ４ｏｒｆ１のアミノ酸配列である。

【0081】

配列番号５９は、種Ｄ（Ａｄ９）Ｅ４ｏｒｆ１のアミノ酸配列である。

【0082】

配列番号６０は、種Ｅ（Ａｄ４）Ｅ４ｏｒｆ１のアミノ酸配列である。

【0083】

配列番号６１は、種Ｇ（Ａｄ５２）Ｅ４ｏｒｆ１のアミノ酸配列である。

【0084】

配列番号６２は、Ａｄ２のヌクレオチド配列である。

【0085】

配列番号６３は、Ａｄ５のヌクレオチド配列である。

【0086】

配列番号６４は、Ａｄ２ Ｅ４ｏｒｆ６／７のアミノ酸配列である。

【0087】

配列番号６５は、Ａｄ５ Ｅ３－ＲＩＤαのアミノ酸配列である。

【0088】

配列番号６６は、Ａｄ５ Ｅ３－ＲＩＤβのアミノ酸配列である。

【0089】

配列番号６７は、Ａｄ５ Ｅ３－１４．７Ｋのアミノ酸配列である。

【0090】

詳細な説明
Ｉ．略記号
Ａｄ アデノウイルス
ＣＡＲ コクサッキーアデノウイルス受容体
ＣＰＥ 細胞変性効果
ＥＧＦＲ 上皮増殖因子受容体
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着アッセイ
ＦＡＣＳ 蛍光活性化細胞分取
ＦＫＢＰ ＦＫ５０６結合性タンパク質
ＦＲＢ ＦＫＢＰ－ラパマイシン結合性
ｈＴＥＲＴ ヒトテロメラーゼ逆転写酵素
ＨｕＶＥＣ ヒト血管内皮細胞
ＭＡＶ－１ マウスアデノウイルス１
ｍｉＲ マイクロＲＮＡ
ＭＯＩ 感染多重度
ｍＴＯＲ ラパマイシンの哺乳動物標的
ＮＨＡ 正常ヒト星状神経膠細胞
ＰＥＴ 陽電子放射断層撮影（positron emission topography）
ＰＩ ヨウ化プロピジウム
ＰＲＰ ＰＥＴリポータープローブ
Ｒｂ 網膜芽細胞腫
ＳＡＥＣ 小気道上皮細胞
ＷＴ 野生型
ＩＩ．用語および方法

【0091】

特に明記しない限り、技術用語は従来の用法に従って用いられる。分子生物学での一般用語の定義は、Oxford University Pressによって出版されたBenjamin Lewin、Genes
V、１９９４年（ＩＳＢＮ ０－１９－８５４２８７－９）；Blackwell Science Ltd.によって出版されたKendrewら（編）、The Encyclopedia of Molecular Biology、
１９９４年（ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）；およびVCH Publishers, Inc.によって出版されたRobert A. Meyers（編）、Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、１９９５年（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）に見出すことができる。

【0092】

本開示の様々な実施形態のレビューを容易にするために、具体的な用語の以下の説明が提供される：

【0093】

アデノウイルス：線状の二本鎖ＤＮＡゲノムおよび二十面体カプシドを有する非外膜ウイルス。ヒトアデノウイルスの６８個の公知の血清型が現在あり、それらは７つの種類（種Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ）に分けられる。アデノウイルスの異なる血清型は、疾患の異なるタイプと関連し、一部の血清型は呼吸器疾患（主に種ＢおよびＣ）、結膜炎（種ＢおよびＤ）および／または胃腸炎（種ＦおよびＧ）を引き起こす。

【0094】

投与：任意の有効な経路によって対象に薬剤、例えば治療剤（例えば組換えウイルス）を提供するか、与えること。例示的な投与経路には、注射（例えば皮下、筋肉内、皮内、腹腔内および静脈内）、経口、管内、舌下、直腸、経皮、鼻腔内、膣および吸入経路が限定されずに含まれる。

【0095】

抗体：抗原のエピトープを認識して結合する（例えば特異的に認識し、特異的に結合する）軽鎖および／または重鎖免疫グロブリン可変領域を少なくとも含むポリペプチドリガンド。免疫グロブリン分子は重鎖および軽鎖で構成され、それぞれは、可変重鎖（Ｖ_Ｈ）領域および可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）領域と呼ばれる可変領域を有する。一緒に、Ｖ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域は、抗体によって認識される抗原に結合する役割を担う。

【0096】

抗体は、当技術分野で周知である抗体、例えば単一ドメイン抗体（例えばＶＨドメイン抗体、またはＶＨＨ抗体）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’_２断片、単一鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）およびジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）のインタクトな免疫グロブリンならびに変異体および一部（断片）を含む。ｓｃＦｖタンパク質は免疫グロブリンの軽鎖可変領域および免疫グロブリンの重鎖可変領域がリンカーによって結合している融合タンパク質であり、ｄｓＦｖでは、鎖の結合を安定させるためにジスルフィド結合を導入するように鎖が突然変異されている。用語「抗体」は、遺伝子操作された形態、例えばキメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）およびヘテロコンジュゲート抗体（二重特異性抗体など）も含む。Pierce Catalog and Handbook、１９９４～１９９５年（Pierce Chemical Co.、Rockford、IL）；Kuby, J.、Immunology、３版、W. H. Freeman & Co.、New York、１９９７年も参照。

【0097】

化学療法剤：異常な細胞成長を特徴とする疾患の治療で治療的有用性を有するあらゆる化学薬剤。そのような疾患には、腫瘍、新生物およびがん、ならびに過形成成長を特徴とする乾癬などの疾患が含まれる。一実施形態では、化学療法剤は放射性化合物である。当業者は、有用な化学療法剤を容易に特定することができる（例えば、Harrison's Principles of Internal Medicine、１４版中のSlapakおよびKufe、Principles of Cancer
Therapy、８６章；Abeloff、Clinical Oncology２版、（著作権）２０００年、Churchill Livingstone, Incの中のPerryら、Chemotherapy、１７章；Baltzer, L.、Berkery, R.（編）：Oncology Pocket Guide to Chemotherapy、２版、St. Louis、Mosby-Year Book、１９９５年；Fischer, D.S.、Knobf, M.F.、Durivage, H.J.（編）：The
Cancer Chemotherapy Handbook、４版、St. Louis、Mosby-Year Book、１９９３年を参照）。併用化学療法は、がんを治療するための１つを超える薬剤の投与である。

【0098】

キメラ：異なる起源を有する少なくとも２つの部分で構成される。本開示との関連で、「キメラアデノウイルス」は、少なくとも２つの異なる血清型に由来する（例えばＡｄ５およびアデノウイルスの第２の血清型に由来する）遺伝物質および／またはタンパク質を有するアデノウイルスである。この文脈において、「カプシド交換」アデノウイルスは、カプシドタンパク質がアデノウイルスの１つの血清型に由来し、残りのタンパク質が別のアデノウイルス血清型に由来する、キメラアデノウイルスを指す。同様に、「キメラ繊維」は、アデノウイルスの少なくとも２つの異なる血清型に由来するアミノ酸配列を有する繊維タンパク質である。例えば、キメラ繊維は、Ａｄ５からの繊維シャフトおよびアデノウイルスの第２の血清型からの繊維ノブで構成されてもよい（図２３Ａを参照）。

【0099】

接触させる：直接的な物理的関係に置くこと；固体および液体の両形態を含む。

【0100】

変性変異体：本開示との関連で、「変性変異体」は、遺伝子コードの結果として変性した配列を含むペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。２０個の天然アミノ酸があり、そのほとんどは１つを超えるコドンによって指定される。したがって、ヌクレオチド配列によってコードされるペプチドのアミノ酸配列が変更されない限り、ペプチドをコードする全ての変性ヌクレオチド配列が含まれる。

【0101】

欠失：「欠失」Ｅ４ｏｒｆ１またはＥ４ｏｒｆ６／７のタンパク質をコードするアデノウイルスゲノムは、Ｅ４ｏｒｆ１またはＥ４ｏｒｆ６／７タンパク質発現の不在をもたらすＥ４ｏｒｆ１またはＥ４ｏｒｆ６／７コード配列の完全な欠失または部分的欠失を有するアデノウイルスを指す。

【0102】

Ｅ２Ｆの脱調節：Ｅ２Ｆ転写因子および下流標的遺伝子の活性の増加を指し、ほとんど全てのタイプのヒトがんで起こる。Ｅ２Ｆ経路活性および転写の脱調節は、Ｒｂ、ｐ１０７およびｐ１３０腫瘍抑制遺伝子における機能突然変異および欠失の喪失などの、経路の任意の上流構成要素での様々な異なる突然変異から生じることができる。Ｒｂは同定された最初の腫瘍抑制遺伝子であり、ヒト腫瘍の少なくとも３分の１で不在であるかまたは突然変異している。さらに、ｐ１６突然変異および／または後成的サイレンシングが、腫瘍細胞でＥ２Ｆを活性化することができる。サイクリンＤおよびＣＤＫ４突然変異、遺伝子増幅または過剰発現も、ヒト腫瘍で脱調節されたＥ２Ｆ活性をもたらすことができる。さらに、Ｅ２Ｆは、ＥＧＦＲ、ＲＴＫ、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＰＩ－３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＲＡＦ、ＭＹＣを含む増殖因子受容体経路の突然変異によって活性化される。ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}－サイクリンＤ：ｃｄｋ４／６－ＲＢ－Ｅ２Ｆ経路での突然変異は一般的に排他的に起こり、したがって、１つの「ヒット」（例えば、ｐ１６）は、他のもの（例えば、Ｒｂ突然変異またはサイクリンＤ：ｃｄｋ過剰発現）を伴わない。しかし、ほとんどの現行の化学療法は、Ｅ２Ｆ転写標的を阻害するが正常細胞にも毒性であり、しばしば深刻な医原性合併症を有する増殖性毒である。本明細書に開示されるように、代替の治療的アプローチは、ｐ１６－サイクリンＤ：ｃｄｋ４－ＲＢ－Ｅ２Ｆ経路を脱調節したがん細胞病巣において選択的溶解複製を起こすウイルスを使用することである。

【0103】

Ｅ１Ａ：アデノウイルス初期領域１Ａ（Ｅ１Ａ）遺伝子およびその遺伝子から発現されるポリペプチド。Ｅ１Ａタンパク質は、細胞を細胞周期に駆動することによって、ウイルスのゲノム複製で役割を果たす。本明細書で用いるように、用語「Ｅ１Ａタンパク質」はＥ１Ａ遺伝子から発現されるタンパク質を指し、この用語は任意のアデノウイルス血清型によって生成されるＥ１Ａタンパク質を含む。例として、野生型Ａｄ５ Ｅ１Ａタンパク質のアミノ酸配列は配列番号３２として本明細書で示し、改変Ａｄ５ Ｅ１Ａ配列は配列番号３３～３７として本明細書で提供する。さらに、様々な異なるアデノウイルス血清型からの野生型Ｅ１Ａタンパク質配列は、配列番号４７～５４として本明細書で示す。一部の実施形態では、改変Ｅ１Ａタンパク質は、配列番号３２～３７または配列番号４７～５４のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む。本明細書で企図される改変Ｅ１Ａタンパク質は、腫瘍細胞と比較して正常細胞において組換えアデノウイルスの複製欠陥に寄与するものである。本明細書に開示される改変Ｅ１Ａタンパク質は、Ａｄ５ Ｅ１Ａタンパク質である。しかし、任意の所望の血清型で対応する改変を加えることができ、したがって本開示に包含される。例えば、ヒトアデノウイルスの全ての種はＬＸＣＸＥモチーフを含有し、それは、Ａｄ５ではＬＴＣＨＥ（配列番号３２の残基１２２～１２６）に対応する。同様に、残基２～１１の欠失およびＹ４７ＨおよびＣ１２４Ｇ置換は、Ａｄ５に関して番号付けされるが、任意の他の血清型に導入することができる（全てのヒトアデノウイルス種からのＥ１Ａのアラインメントを提供する、図２７を参照）。

【0104】

Ｅ３－ＲＩＤα／ＲＩＤβおよびＥ３－１４．７ｋ：Ｅ３遺伝子から生成した初期発現タンパク質。Ｅ３－ＲＩＤα、Ｅ３－ＲＩＤβおよびＥ３－１４．７ｋタンパク質は受容体内在化および分解複合体（ＲＩＤ）を構成し、それは核膜に局在化し、感染した細胞を宿主の抗ウイルス応答から保護するために、ＣＤ９５（ＦａｓＬ受容体）ならびにＴＮＦＲ１および２（ＴＮＦ／ＴＲＡＩＬ受容体）を含む様々な受容体のエンドサイトーシスおよび分解を引き起こす。Ｅ３－ＲＩＤα、Ｅ３－ＲＩＤβおよびＥ３－１４．７ｋコード配列は、この順序で互いの隣にある。本開示の一部の実施形態では、Ｅ３－ＲＩＤαの開始コドンからＥ３－１４．７ｋの終止コドンまでが削除され、ＦＫＢＰ融合タンパク質のコード配列で置き換えられた（例えば、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１２、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１３、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５およびＡｄＳｙｎ－ＣＯ４４０を参照）。Ａｄ５ Ｅ３－ＲＩＤα、Ｅ３－ＲＩＤβおよびＥ３－１４．７ｋのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号６５～６７で示す。

【0105】

Ｅ４ｏｒｆ１：Ｅ４遺伝子から生成したアデノウイルスタンパク質。用語「Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質」は、任意のアデノウイルス血清型からのＥ４遺伝子によって生成されるＥ４ｏｒｆ１タンパク質を含む。例として、野生型Ａｄ５ Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質のアミノ酸配列は配列番号３８として本明細書で示し、ＰＤＺ結合性モチーフの欠失を有する改変Ａｄ５ Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質は、配列番号３９として本明細書で提供する。さらに、様々な異なるアデノウイルス血清型からの野生型Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質配列は、配列番号５５～６１として本明細書で示す。一部の実施形態では、改変Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質は、配列番号３８、３９および５５～６１のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む。本明細書で企図される改変Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質は、腫瘍細胞と比較して正常細胞において組換えアデノウイルスの複製欠陥に寄与するものである。本明細書に開示される改変Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質は、Ａｄ５ Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質である。しかし、任意の所望の血清型で対応する改変を加えることができ、したがって本開示に包含される。図２８に示すＥ４ｏｒｆ１アラインメントで示すように、アデノウイルス種Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＧではＥ４ｏｒｆ１のＣ末端の３つの残基がＰＤＺ結合性モチーフを構成する。本明細書の一部の実施形態では、組換えアデノウイルスは、完全な欠失Ｅ４ｏｒｆ１をコードする。

【0106】

Ｅ４ｏｒｆ６／７：アデノウイルスＥ４遺伝子によってコードされたタンパク質。用語「Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質」は、任意のアデノウイルス血清型からのＥ４遺伝子によって生成されるＥ４ｏｒｆ６／７タンパク質を含む。例として、野生型Ａｄ５ Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質のアミノ酸配列は配列番号４０として本明細書で示し、野生型Ａｄ２
Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質のアミノ酸配列は配列番号６４として本明細書で示す。一部の実施形態では、Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質は、配列番号４０または配列番号６４のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む。本明細書で企図される改変Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質は、腫瘍細胞と比較して正常細胞において組換えアデノウイルスの複製欠陥に寄与するものである。一部の実施形態では、改変Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質は、そのＥ２Ｆ結合部位を消滅させるかもしくは害し、および／またはＥ２Ｆ相互作用を害する突然変異（欠失など）を含む。他の実施形態では、改変Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質は、Ｅ２Ｆ４の効率的な転位のために必要とされる核局在化シグナルを削除するかまたは害する改変を含む。Ｅ４ｏｒｆ６／７の例示的な改変は、下のセクションでさらに議論される。

【0107】

上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）：細胞外タンパク質リガンドのＥＧＦファミリーのメンバーのための細胞表面受容体。ＥＧＦＲは、ＥｒｂＢ－１およびＨＥＲ１としても知られる。多くの種類のがんが、ＥＧＦＲの過剰発現につながる突然変異を含有する。

【0108】

繊維：アデノウイルス繊維タンパク質は、細胞表面受容体への結合を媒介する三量体タンパク質である。繊維タンパク質は、長いＮ末端シャフトおよび球状のＣ末端ノブで構成される（図２３Ａを参照）。

【0109】

ＦＫ５０６結合性タンパク質（ＦＫＢＰ）：タンパク質フォールディングシャペロンとして機能する、真核細胞で発現されるタンパク質のファミリー。ＦＫＢＰは、ラパマイシンに結合するその能力で知られている。例示的なＦＫＢＰ配列を、配列番号４４の残基１３２～２３８として本明細書で示す。

【0110】

ＦＫＢＰ－ラパマイシン結合性（ＦＲＢ）：ラパマイシンに結合するラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）のドメイン。ＦＲＢの例示的な配列を、配列番号４２の残基５４７～６３６として本明細書で示す。ラパマイシンおよびラパログ（ＡＰ２１９６７としても知られる）の両方に結合することが可能であるＦＲＢの突然変異形態（「ＦＲＢ^＊」と本明細書で呼ぶ）は、配列番号４３の残基５４７～６３６として本明細書で示す。ＦＲＢ^＊はヒトｍＴＯＲの２０９８位にトレオニンからロイシンへの置換（Ｔ２０９８Ｌ）を含有し、それは配列番号４３の残基６２０に対応する。

【0111】

融合タンパク質：少なくとも２つの異なる（異種）タンパク質またはペプチドからのアミノ酸配列を含有するタンパク質。融合タンパク質は、例えば、２つの異なる（異種）タンパク質の少なくとも一部をコードする核酸配列から工学的に操作された核酸配列の発現によって生産することができる。融合タンパク質を作製するために、核酸配列は同じリーディングフレームの中にいなければならず、内部終止コドンを含有してはならない。融合タンパク質、特に短い融合タンパク質は、化学合成によって生産することもできる。

【0112】

異種：異種タンパク質またはポリペプチドは、異なる供与源または種に由来するタンパク質またはポリペプチドを指す。

【0113】

ヘキソン：主要なアデノウイルスカプシドタンパク質。Ａｄ５からの例示的なヘキソン配列を、配列番号４５として本明細書で示す。Ｅ４５１Ｑ置換を含む突然変異体ヘキソン配列を、配列番号４６として本明細書で示す。

【0114】

単離された：「単離された」生体構成成分（核酸分子、タンパク質、ウイルスまたは細胞など）は、他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質および細胞などの、その構成成分が天然に存在する生物体の細胞もしくは組織中の他の生体構成成分、または生物体自体から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸分子およびタンパク質には、標準の精製方法によって精製されたものが含まれる。本用語は、宿主細胞での組換え発現によって調製される核酸分子およびタンパク質、ならびに化学的に合成される核酸分子およびタンパク質も包含する。

【0115】

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）：植物、動物およびウイルスで遺伝子発現を調節する一本鎖ＲＮＡ分子。マイクロＲＮＡをコードする遺伝子は、転写されて一次転写物マイクロＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）を形成し、それはプロセシングされて、前駆体マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる短いステムループ分子を形成し、次にエンドヌクレアーゼ的開裂が続いて成熟マイクロＲＮＡが形成される。成熟マイクロＲＮＡは長さが概ね２１～２３ヌクレオチドであり、１つまたは複数の標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲに部分的に相補的である。標的ｍＲＮＡの開裂を促進することによって、または細胞転写物の翻訳をブロックすることによって、マイクロＲＮＡは遺伝子発現をモジュレートする。本開示との関連で、「肝臓特異的マイクロＲＮＡ」は、肝臓で優先的に発現されるマイクロＲＮＡ、例えば、肝臓だけで発現されるマイクロＲＮＡ、または他の器官または組織のタイプと比較して肝臓で有意により多く発現されるマイクロＲＮＡである。

【0116】

改変：核酸配列またはタンパク質配列の変化。例えば、アミノ酸配列改変には、例えば、置換、挿入および欠失またはその組合せが含まれる。挿入には、単一のまたは複数のアミノ酸残基のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合ならびに配列内挿入が含まれる。欠失は、タンパク質配列からの１つまたは複数のアミノ酸残基の除去によって特徴付けられる。本明細書の一部の実施形態では、改変（置換、挿入または欠失など）は、機能の変化、例えばタンパク質の特定の活性の低減または増強をもたらす。本明細書で用いるように、「Δ」または「デルタ」は、欠失を指す。例えば、Ｅ１ＡΔＬＸＣＸＥは、ＬＸＣＸＥモチーフの欠失を有するＥ１Ａポリペプチドを指す。置換型改変は、少なくとも１つの残基が除去されて、異なる残基がその代わりに挿入されたものである。アミノ酸置換は一般的に単一の残基のものであるが、いくつかの異なる位置で同時に存在することができる。置換、欠失、挿入またはその任意の組合せを組み合わせて、最終突然変異体配列に到達することができる。これらの改変は、タンパク質をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの改変によって調製することができ、それによって改変をコードするＤＮＡが生成される。既知の配列を有するＤＮＡの所定部位で挿入、欠失および置換突然変異を起こさせる技術は、当技術分野で周知である。「改変」タンパク質、核酸またはウイルスは、上で概説した１つまたは複数の改変を有するものである。

【0117】

新生物、悪性腫瘍、がんおよび腫瘍：新生物は、過剰な細胞分裂からもたらされる、組織または細胞の異常成長である。新生物成長は、腫瘍を生成することができる。個体における腫瘍の量は、腫瘍の数、体積または重量で測定することができる「腫瘍負荷」である。転移しない腫瘍は、「良性」と呼ばれる。周囲の組織に侵入し、および／または転移することができる腫瘍は、「悪性」と呼ばれる。悪性腫瘍は、「がん」とも呼ばれる。

【0118】

血液がんは、血液または骨髄のがんである。血液学的（または血液原性）がんの例には、白血病、例えば急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球白血病、急性骨髄性白血病ならびに骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単核球性および赤白血病）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄球（顆粒球）白血病、慢性骨髄性白血病および慢性リンパ球性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（緩慢性および高悪性度型）、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、毛様細胞性白血病および脊髄形成異常が含まれる。一部の場合には、リンパ腫は固形腫瘍と考えられている。

【0119】

固形腫瘍は、嚢胞、液体領域を通常含有しない、組織の異常な塊である。固形腫瘍は良性であるか、または悪性であることがある。異なるタイプの固形腫瘍は、それらを形成する細胞のタイプについて命名される（肉腫、癌腫およびリンパ腫など）。肉腫および癌種などの固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ系悪性腫瘍、膵がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、髄様甲状腺癌、乳頭状甲状腺癌、褐色細胞腫脂腺癌、乳頭状癌、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）感染新生物、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌、黒色腫およびＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫（例えば、脳幹神経膠腫および混合性神経膠腫）、神経膠芽腫（多形性神経膠芽腫としても知られる）、星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、未分化胚細胞腫、髄芽細胞腫、神経線維腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴覚神経腫、希突起膠細胞腫、髄膜腫（menangioma）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫および脳転移）が含まれる。

【0120】

腫瘍崩壊性ウイルス：増殖性障害の細胞、例えば、がん／腫瘍細胞を選択的に殺滅するウイルス。がん細胞の殺滅は、当技術分野で確立された任意の方法によって、例えば、生細胞数を判定すること、または細胞変性効果、アポトーシスもしくはがん細胞でのウイルスタンパク質の合成（例えば、複製のために必要なウイルス遺伝子の代謝標識、イムノブロットまたはＲＴ－ＰＣＲによる）もしくは腫瘍サイズの低減を検出することによって検出することができる。

【0121】

作動可能に連結した：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係に置かれるとき、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、そのプロモーターはそのコード配列に作動可能に連結している。一般的に、作動可能に連結したＤＮＡ配列は連続しており、２つのタンパク質コード領域を連結するために必要な場合には、同じリーディングフレームの中にある。

【0122】

薬学的に許容される担体：この開示で有益な薬学的に許容される担体（ビヒクル）は、従来通りである。E. W. MartinによるRemington's Pharmaceutical Sciences、Mack
Publishing Co.、Easton、PA、１５版（１９７５年）は、１つまたは複数の治療的化
合物、分子または薬剤（例えば本明細書に開示される組換えウイルス）の医薬送達に適する組成物および製剤を記載する。

【0123】

一般に、担体の性質は、採用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、ビヒクルとして薬学的および生理的に許容される流体、例えば水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどを含む、注射可能な流体を通常含む。固体組成物（例えば、散剤、ピル剤、錠剤またはカプセル剤の形態）については、従来の無毒の固体担体には、例えば医薬用グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムを含めることができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、少量の無毒の補助物質、例えば湿潤または乳化剤、保存剤およびｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有することができる。

【0124】

ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質：モノマーがアミド結合を通して連結されるアミノ酸残基であるポリマー。アミノ酸がアルファ－アミノ酸であるとき、Ｌ光学異性体またはＤ光学異性体を使用することができる。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書で互換的に使用される。これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。用語「残基」または「アミノ酸残基」は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに組み込まれるアミノ酸への言及を含む。

【0125】

ポリペプチドでの保存的置換は、タンパク質配列中の１つのアミノ酸残基の、類似の生化学的特質を有する異なるアミノ酸残基への置換である。一般的に、保存的置換は、結果として生じるポリペプチドの活性にほとんど影響しない。例えば、１つまたは複数の保存的置換（例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ以下の置換）を含むタンパク質またはペプチドは、野生型タンパク質またはペプチドの構造および機能を保持する。ポリペプチドは、例えば部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲなどの標準の手法を使用して、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を操作することによって、１つまたは複数の保存的置換を含有するように生成することができる。一例では、そのような変異体は、抗体の交差反応性または免疫応答を誘導するその能力を試験することによって、容易に選択することができる。保存的置換の例を、下に示す。

【化1】

【0126】

保存的置換は、（ａ）例えばシートもしくはヘリカル立体構造としての、置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクを一般的に維持する。

【0127】

タンパク質の特質に最大の変化を起こすことが一般的に予想される置換は、非保存的、例えば、（ａ）親水性残基、例えばセリルもしくはスレオニルが、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルもしくはアラニルに（もしくは、によって）置換される；（ｂ）システインもしくはプロリンが任意の他の残基に（もしくは、によって）置換される；（ｃ）電気陽性の側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニルもしくはヒスチジル（histadyl）が、電気陰性の残基、例えば、グルタミルもしくはアスパルチルに（もしくは、によって）置換される；または（ｄ）かさ高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を有していないもの、例えばグリシンに（もしくは、によって）置換される変化である。

【0128】

疾患を防止、治療または改善する：疾患を「防止する」は、疾患の完全な発達を阻害することを指す。「治療する」は、それが発達し始めた後の、疾患または病態の徴候または症状を改善する治療的介入を指す。「改善する」は、疾患の徴候または症状の数または重症度の低減を指す。

【0129】

プロモーター：核酸（例えば遺伝子）の転写を指示／開始するＤＮＡの領域。プロモーターは、必要な核酸配列を転写の開始部位の近くに含む。一般的に、プロモーターは、それらが転写する遺伝子の近くに位置する。プロモーターは、転写の開始部位から数千塩基対に位置することができる、遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントも任意選択で含む。「構成的プロモーター」は、連続的に活性であり、外部のシグナルまたは分子による調節を受けないプロモーターである。対照的に、「誘導可能なプロモーター」の活性は、外部のシグナルまたは分子（例えば、転写因子またはテトラサイクリン）によって調節される。

【0130】

タンパク質ＩＸ（ｐＩＸ）：ヘキソンタンパク質と関連しているアデノウイルスカプシドのマイナー構成成分。

【0131】

精製された：用語「精製された」は、絶対純度を必要としない。むしろ、それは相対的な用語を意図する。したがって、例えば、精製されたペプチド、タンパク質、ウイルスまたは他の活性化合物は、天然に関連しているタンパク質および他の混在物質から完全にまたは一部単離されるものである。ある特定の実施形態では、用語「実質的に精製された」は、細胞、細胞培養培地または他の粗製の調製物から単離され、最初の調製物の様々な構成成分、例えばタンパク質、細胞性デブリおよび他の構成成分を除去するために分別にかけられたペプチド、タンパク質、ウイルスまたは他の活性化合物を指す。

【0132】

ラパマイシン：公知の免疫抑制および増殖抑制の特質を有する小分子。シロリムスとしても知られるラパマイシンは、細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓの生成物として最初に発見されたマクロライドである。ラパマイシンは、ｍＴＯＲに結合して、その活性を阻害する。

【0133】

Ｒｂ欠損細胞：腫瘍抑制遺伝子Ｒｂのレベルが正常または対照細胞でのＲｂのレベルと比較して低減される細胞（腫瘍細胞など）、またはＲｂ経路が破壊されるか不活性である細胞。用語「Ｒｂ経路」または「Ｒｂシグナル伝達経路」は、ｐＲｂ／ｐ１０７、Ｅ２Ｆ－１／－２／－３およびＧ１サイクリン／ｃｄｋ複合体を含むｐＲｂ活性に影響する分子を少なくとも一部指す。現在知られていない分子がこの定義の中に入ることもできることが理解される。

【0134】

Ｒｂ／ｐ１６／サイクリンＤ：ｃｄｋ４／Ｅ２Ｆ複製に障害または欠損があるアデノウイルス：Ｒｂ／ｐ１０７／ｐ１３０／ｐ１６／Ｅ２Ｆ／ＣＤＫ－サイクリンチェックポイントを含む機能的細胞性Ｒｂ／ｐ１０７／ｐ１３０／ｐ１６／サイクリン：ＣＤＫ／Ｅ２Ｆ経路タンパク質の正常レベルの存在下で、細胞の感染後に部分的または完全に減衰した複製を示すアデノウイルス（改変／組換えアデノウイルスなど）。例えば、感染した細胞がＲｂ／ｐ１６経路に障害または欠損がある（すなわち、感染した細胞が完全に機能的なＲｂまたはＲｂ／ｐ１６経路の他のタンパク質の正常なレベルを発現しない）場合は、Ｒｂ／ｐ１６／Ｅ２Ｆ経路複製に障害のあるアデノウイルスの複製は正常に進行する。反対に、細胞が機能的Ｒｂ（例えば、本明細書において「Ｒｂ発現細胞」とも呼ぶ正常な活性を有するＲｂ）の正常なレベルを発現する場合は、Ｒｂ複製に障害または欠損を起こしているアデノウイルスの複製は減衰または阻止される。Ｒｂの正常なレベルを発現することができない（例えばＲｂ遺伝子の調節領域への突然変異）ことによって、または正常未満のＲｂ活性を有する突然変異したＲｂを発現することによって、細胞はＲｂに障害または欠損を起こすことができる。Ｒｂの正常なレベルおよび正常なＲｂ活性レベルは、同じ種類の健康で非疾患細胞で見出される。したがって、Ｒｂに障害のある細胞は、突然変異したＲｂ遺伝子を含む。任意選択で、Ｒｂに障害のある細胞は、Ｒｂ遺伝子が完全にまたは部分的に欠失しているゲノムを含む。Ｒｂに障害のある細胞は、がん／腫瘍細胞であってよい。正常なＲｂ機能の喪失をもたらすことができる他のゲノム病変には、ＣＤＫ突然変異、サイクリン突然変異および増幅、ｐ１６突然変異および／または後成的遺伝子発現抑制、ｐ１０７突然変異、ｐ１３０突然変異および増殖因子受容体経路突然変異が限定されずに含まれる。

【0135】

Ｒｂ／ｐ１６腫瘍抑制遺伝子経路またはＲｂ／ｐ１６経路：網膜芽細胞腫（Ｒｂ）タンパク質ならびにＣｄｋ、Ｅ２Ｆ、非定型的プロテインキナーゼＣおよびＳｋｐ２を非限定的に含む経路中の他のタンパク質／タンパク質ファミリーを含む、シグナル伝達経路全体を指す。用語「Ｒｂ／ｐ１６腫瘍抑制遺伝子経路に障害または欠損がある」は、例えば、タンパク質の正常なレベルを発現することができないかまたは正常未満の活性を有する突然変異したタンパク質を発現し、したがってその経路が異常に機能することによって、シグナル伝達経路の１つまたは複数の分子に障害または欠損があることを意味する。そのような欠陥は、遊離のＥ２Ｆの高い発現レベルおよびＥ２Ｆプロモーターの高い活性をもたらす。したがって、細胞は、Ｒｂ／ｐ１６腫瘍抑制遺伝子経路でタンパク質の正常なレベルを発現することができないかまたは正常未満の活性を有する突然変異したタンパク質を発現することによって、Ｒｂ／ｐ１６経路に障害または欠損があることができる。

【0136】

組換え：組換え核酸分子、タンパク質またはウイルスは、天然に存在しない配列を有するか、または配列の２つのそうでなければ分離したセグメントの人工的組合せによって作製される配列を有するものである。この人工的組合せは、化学的合成によって、または、核酸分子の単離されたセグメントの人工操作、例えば遺伝子操作技術によって達成することができる。用語「組換え」は、天然の核酸分子、タンパク質またはウイルスの一部の付加、置換または欠失だけによって変更された核酸、タンパク質およびウイルスも含む。

【0137】

複製欠陥：非腫瘍細胞（腫瘍細胞と比較して）で「複製欠陥」を示すアデノウイルスは、腫瘍細胞と比較して正常細胞においてウイルス複製の低減を示すアデノウイルスを指す。複製欠陥は、例えば、腫瘍細胞と比較した正常細胞における、ウイルス後期タンパク質発現の欠如、ウイルスＤＮＡ合成の低減、Ｅ２Ｆ標的遺伝子（例えばサイクリンＡおよびＢ）を誘導する能力の低下、Ｓ相侵入を導き出す能力の低下および／または細胞殺滅を誘導する能力の低下によって明白に示される。

【0138】

複製欠損ウイルス：所与の表現型を有する所定の細胞集団（例えば、脱調節されたＥ２Ｆ経路を有する腫瘍細胞）において、細胞増殖を優先的に阻害するか、細胞溶解を引き起こすか、またはアポトーシスを誘導する（総合的に殺滅と考えられる）ウイルス。そのようなウイルスは、細胞増殖を低減または阻害すること、細胞溶解を引き起こすこと、アポトーシスを誘導すること、そうでなければ所定の細胞表現型を有しない細胞（例えば正常非腫瘍細胞）で複製することができないか、その能力が限定的である。

【0139】

配列同一性：２つまたはそれ超の核酸配列または２つまたはそれ超のアミノ酸配列間の同一性または類似性は、配列の間の同一性または類似性で表される。配列同一性は、同一性百分率で測定することができる；百分率が高いほど、配列はより同一である。配列類似性は、類似性百分率（保存的アミノ酸置換を考慮する）で測定することができる；百分率が高いほど、配列はより類似している。標準の方法を使用して整列させたとき、核酸またはアミノ酸配列の相同体またはオルソログは比較的高い程度の配列同一性／類似性を有する。オルソログのタンパク質またはｃＤＮＡが、関係のより遠い種（ヒトおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓの配列など）と比較してより緊密に関係した種（ヒトおよびマウスの配列など）に由来するとき、この相同性はより有意である。

【0140】

比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野で周知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、以下に記載される：Smith & Waterman、Adv. Appl. Math.２巻：４８２頁、１９８１年；Needleman & Wunsch、J. Mol. Biol.４８巻：４４３頁、１９７０年；Pearson & Lipman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA８５巻：２４４４頁、１９８８年；Higgins & Sharp、Gene、７３巻：２３７～４４頁、１９８８年；Higgins & Sharp、CABIOS５巻：１５１～３頁、１９８９年；Corpetら
、Nuc. Acids Res.１６巻：１０８８１～９０頁、１９８８年；Huangら、Computer Appls.、Biosciences８巻、１５５～６５頁、１９９２年；およびPearsonら、Meth. Mol.
Bio.２４巻：３０７～３１頁、１９９４年。Altschulら、J. Mol. Biol.２１５巻：
４０３～１０頁、１９９０年は、配列アラインメント方法および相同性計算の詳細な考察を提供する。

【0141】

配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと共に使用するために、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＣＢＩ）およびインターネット上を含むいくつかの情報源から、ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ
Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Altschulら、J. Mol. Biol.２１５巻：４０３～１０頁、１９９０年）が利用できる。追加の情
報は、ＮＣＢＩウェブサイトで見出すことができる。

【0142】

血清型：抗原の特徴的なセットによって区別される緊密に関係した微生物（ウイルスなど）の群。

【0143】

対象：生きている多細胞性脊椎動物の生物体、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含むカテゴリー。

【0144】

合成の：研究室で人工手段によって生成される、例えば、合成核酸またはタンパク質は研究室で化学的に合成することができる。

【0145】

標的化リガンド：本開示との関連で、「標的化リガンド」は、標的化リガンドに特異的である受容体または結合性タンパク質を発現する特異的細胞型に組換えアデノウイルスを導くタンパク質である。一部の実施形態では、標的化リガンドは、腫瘍で過剰発現される細胞表面タンパク質（例えばＥＧＦＲ）に特異的である抗体である。

【0146】

治療剤：化学化合物、小分子、組換えウイルスまたは他の組成物、例えば、対象に適切に投与されるときに所望の治療的または予防的効果を誘導することが可能である、アンチセンス化合物、抗体、ペプチドまたは核酸分子。例えば、がんのための治療剤には、がんの発達または転移を阻止または阻害する薬剤が含まれる。

【0147】

治療有効量：その薬剤で治療される対象または細胞で所望の効果を達成するのに十分な特定の医薬または治療剤（例えば、組換えウイルス）の量。薬剤の有効量は、治療する対象または細胞、および治療組成物の投与方法を非限定的に含む、いくつかの因子に依存することができる。

【0148】

Ｕｅｘｏｎ：初期Ｅ３領域と繊維遺伝子の間のｌ鎖（左方向への転写）に位置するオープンリーディングフレーム（Tollefsonら、J Virol ８１巻（２３号）：１２９１８～
１２９２６頁）。

【0149】

ベクター：ベクターは、宿主細胞で複製および／または一体化するベクターの能力を破壊することなく、外来核酸の挿入を可能にする核酸分子である。ベクターは、複製起点などの、宿主細胞でのその複製を可能にする核酸配列を含むことができる。ベクターは、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子および他の遺伝子エレメントを含むこともできる。発現ベクターは、挿入された遺伝子または複数の遺伝子の転写および翻訳を可能にするために必要な調節配列を含有するベクターである。

【0150】

特に説明されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、この開示が属する分野の当業技術者が通常理解するのと同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別途指示しない限り、複数の指示語を含む。「ＡまたはＢを含む」は、ＡもしくはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドのために与えられる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値は概算であり、記載のために提供されることをさらに理解するべきである。本明細書に記載されるそれらに類似するか、または同等である方法および材料は、本開示の実施または試験で使用することができるが、適する方法および材料が以下に記載される。本明細書で指摘される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。相反する場合には、用語の説明を含めた本明細書が優先される。さらに、材料、方法および実施例は例示されるだけであり、限定することが目的ではない。
ＩＩＩ．組換えアデノウイルス

【0151】

Ｅ２Ｆ脱調節腫瘍細胞で選択的に複製することが可能である組換えアデノウイルスが、本開示によって提供される。本明細書に開示される組換えアデノウイルスは、改変Ｅ１Ａタンパク質、改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質またはその任意の組合せをコードするゲノムを有する。Ｅ１Ａ、Ｅ４ｏｒｆ１および／またはＥ４ｏｒｆ６／７突然変異の結果、組換えアデノウイルスは正常（すなわち、非腫瘍）細胞で複製欠陥を示す一方で、腫瘍細胞中で複製してそれらを溶解させる能力を保持する。一例では、例えば、感染した正常細胞および感染腫瘍細胞で感染性粒子の数を比較することによって判定したとき、組換えアデノウイルスは、同じ細胞型の腫瘍細胞と比較して正常（すなわち、非腫瘍）細胞（例えば、乳がん細胞対正常乳房細胞）において複製の低下、例えば、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の低下を有する。

【0152】

本明細書で提供される組換えアデノウイルスは、例えば特異的細胞型への標的化のために、肝臓への標的化および肝臓での複製を阻害するために、および一般的なアデノウイルス血清型に対する既存の中和抗体を回避するために、追加の改変を任意選択で含む。腫瘍崩壊性アデノウイルスをコードする組換え核酸分子も提供される。

【0153】

ＥＦ１αプロモーターの制御下でＧＦＰ－ルシフェラーゼを発現する組換えリポーターアデノウイルス遺伝子発現ベクターが、本明細書でさらに提供される。一部の場合には、開示されるリポーターアデノウイルスは、肝臓への標的化および肝臓での複製を阻害するために、１つまたは複数の改変を含む。組換えリポーターアデノウイルスをコードする組換え核酸分子も提供される。
Ａ．腫瘍崩壊性改変

【0154】

本明細書に開示される特異的腫瘍崩壊性改変は、アデノウイルス５（Ａｄ５）ゲノム配列に関して記載される。しかし、任意のヒトアデノウイルス血清型で同じ改変および欠失を生じることができよう。例示的な一実施形態では、組換えアデノウイルスは、Ａｄ３４である。他の具体的な実施形態では、組換えアデノウイルスは、Ａｄ１１またはＡｄ３７である。図２７および２８は、ヒトアデノウイルス種の間におけるＥ１ＡおよびＥ４ｏｒｆ１領域の配列類似性を例示する。

【0155】

Ｅ１ＡのＣＲ１領域は細胞性Ｅ２Ｆに配列および構造的な相同性を有し、Ｅ２Ｆ－Ｒｂ相互作用と競合する。保存されたＥ１Ａ疎水性残基Ｌ４３、Ｌ４６およびＹ４７は、Ｒｂとの相互作用のための疎水性アンカーとして働く。Ｄ、Ｅ、Ｈ、ＫまたはＲなどの極性アミノ酸へのＬ４３、Ｌ４６および／またはＹ４７の突然変異は、このＥ１Ａ－Ｒｂ相互作用を排除するだろう。本開示の一部の実施形態では、組換えアデノウイルスは、Ｅ１Ａ－Ｒｂ相互作用を破壊するために、Ｅ１ＡにＹ７４Ｈ突然変異を含む。

【0156】

Ｅ１Ａは、そのＬＸＣＸＥモチーフを通してＲｂと強く相互作用する。第１のロイシンおよび中央のシステインの側鎖はＲｂのＢボックスモチーフの小さい疎水性ポケットの中で結合するので、この残基の欠失または小さい（Ｇなど）もしくは極性アミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｈ、ＫまたはＲなど）への突然変異はこのＥ１Ａ－Ｒｂ相互作用を排除するだろう。したがって、本明細書の一部の実施形態では、組換えアデノウイルスはＬＸＣＸＥモチーフの欠失（ΔＬＸＣＸＥ）またはＣ１２４Ｇ置換をＥ１Ａに含む。

【0157】

Ｅ１Ａ残基Ｃ１２４およびＹ４７の両方とも、Ｒｂに結合して不活性化するために重要である。したがって、一部の実施形態では、組換えアデノウイルスは二重突然変異体Ｙ／Ｆ４７ＨおよびＣ１２４Ｇをコードするが、これらの残基または領域に起こさせたいかなる突然変異（上記のような）も、Ｅ１Ａ－Ｒｂ相互作用の減弱をもたらすと考えられている。したがって、Ｒｂ－Ｅ１Ａ相互作用を破壊するいかなる残基の突然変異または欠失も、本明細書で企図される。

【0158】

Ｅ１Ａの残基２～１１の欠失はｐ３００／ＣＢＰ相互作用を排除し、ＤＰ－１相互作用を破壊し、Ｅ２Ｆ標的を上方調節するＥ１Ａの能力をさらに低減する。Ｅ１Ａ残基２～１１の点突然変異、例えば、保存されたＲ２もしくはＨ３残基のグリシンもしくはアラニン突然変異、またはこの相互作用を排除する、異なるアデノウイルス血清型からの疎水性Ｉ／Ｌ／Ｖ４の極性残基突然変異（例えば、Ｄ、Ｅ、Ｈ、ＫまたはＲ）（図２７に示すＥ１Ａアラインメントを参照）も、本明細書で企図される。

【0159】

Ｅ４ｏｒｆ１は、そのＣ末端のＰＤＺ結合性モチーフを通して、ＰＤＺモチーフを含有する細胞性タンパク質と相互作用する。本明細書に開示される一部の実施形態では、Ｅ４ｏｒｆ１の最後の３アミノ酸は、そのＰＤＺ結合性モチーフを排除するために削除される。大きな疎水性残基、例えばＶ、ＬもしくはＩへのＡｄ５ Ｅ４ｏｒｆ１の高度に保存されたＳ１２６の点突然変異；または極性残基、例えばＤ、Ｅ、Ｈ、ＫもしくはＲへのＡｄ５ Ｅ４ｏｒｆ１のＶ１２８の点突然変異も、本明細書で企図される。これらの置換は、Ｅ４ｏｒｆ１のＰＤＺ結合性活性を排除し、Ｅ４ｏｒｆ１のこの形質転換機能を排除すると考えられている。Ｅ４ｏｒｆ１における同じ欠失および／または突然変異は、Ａｄ３４などの他のアデノウイルス血清型で起こさせることができる。Ｅ４ｏｒｆ１の完全な欠失を、導入することもできる。

【0160】

組換えアデノウイルスのゲノムが、改変Ｅ１Ａタンパク質、改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質またはその任意の組合せをコードし、組換えアデノウイルスは、腫瘍細胞と比較して正常細胞において複製欠陥を示す、組換えアデノウイルスが本明細書で提供される。

【0161】

一部の実施形態では、ゲノムは、改変Ｅ１Ａタンパク質および改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質をコードする。他の実施形態では、ゲノムは、改変Ｅ１Ａタンパク質および欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質をコードする。さらに他の実施形態では、ゲノムは、改変Ｅ１Ａタンパク質、改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質および欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質をコードする。

【0162】

一部の例では、組換えアデノウイルスの改変Ｅ１Ａタンパク質は、ＬＸＣＸＥモチーフの欠失；残基２～１１の欠失；Ｃ１２４Ｇ置換；Ｙ４７Ｈ置換；Ｙ４７Ｈ置換およびＣ１２４Ｇ置換；またはＹ４７Ｈ置換、Ｃ１２４Ｇ置換および残基２～１１の欠失を含む。これらの突然変異は配列番号３２のアミノ酸配列を有するＡｄ５ Ｅ１Ａに関して記載される；しかし、Ｅ１Ａ配列は高度に保存されているので、対応する突然変異を任意の他のヒトアデノウイルスで起こさせることができる（図２７を参照）。

【0163】

一部の例では、改変Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質は、ＰＤＺ結合性モチーフの欠失を含む。他の例では、Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質は、Ｃ末端の１０アミノ酸もしくは２０アミノ酸の欠失、またはＡ、Ｋ、Ｒ、Ｐ、Ｆ、ＧもしくはＬへのＤ６８の突然変異を含む。

【0164】

一部の例では、改変Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質は、そのＥ２Ｆ結合部位を消滅させるか、もしくは害し、および／またはＥ２Ｆ相互作用を害する突然変異（欠失など）を含む。他の実施形態では、改変Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質は、Ｅ２Ｆ４の効率的な転位のために必要とされる核局在化シグナルを削除するか、または害する改変を含む。

【0165】

特定の非限定例では、組換えアデノウイルスのゲノムは、ＬＸＣＸＥモチーフの欠失を含む改変Ｅ１Ａタンパク質および欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質（例えば、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１２、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１３、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ４４２を参照）；
ＬＸＣＸＥモチーフの欠失を含む改変Ｅ１Ａタンパク質、ＰＤＺ結合性モチーフの欠失を含む改変Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、および欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質（例えば、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２８５を参照）；
ＬＸＣＸＥモチーフの欠失を含む改変Ｅ１Ａタンパク質、欠失Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、および欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質（例えば、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２８６を参照）；
Ｃ１２４Ｇ置換を含む改変Ｅ１Ａタンパク質および欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質（例えば、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２８７を参照）；
Ｃ１２４Ｇ置換を含む改変Ｅ１Ａタンパク質、ＰＤＺ結合性モチーフの欠失を含む改変Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、および欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質（例えば、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２８８を参照）；
Ｃ１２４Ｇ置換を含む改変Ｅ１Ａタンパク質、欠失Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、および欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質（例えば、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２８９を参照）；
残基２～１１の欠失を含む改変Ｅ１Ａタンパク質および欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質（例えば、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２９０を参照）；
残基２～１１の欠失を含む改変Ｅ１Ａタンパク質、ＰＤＺ結合性モチーフの欠失を含む改変Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、および欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質（例えば、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２９１を参照）；
残基２～１１の欠失を含む改変Ｅ１Ａタンパク質、欠失Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、および欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質（例えば、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２９２を参照）；
Ｙ４７Ｈ置換およびＣ１２４Ｇ置換を含む改変Ｅ１Ａタンパク質、ならびに欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質（例えば、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２９３を参照）；
Ｙ４７Ｈ置換およびＣ１２４Ｇ置換を含む改変Ｅ１Ａタンパク質、ＰＤＺ結合性モチーフの欠失を含む改変Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、ならびに欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質（例えば、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２９４を参照）；
Ｙ４７Ｈ置換およびＣ１２４Ｇ置換を含む改変Ｅ１Ａタンパク質、欠失Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、ならびに欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質（例えば、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２９５を参照）；
Ｙ４７Ｈ置換、Ｃ１２４Ｇ置換および残基２～１１の欠失を含む改変Ｅ１Ａタンパク質、ならびに欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質（例えば、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２９６を参照）；
Ｙ４７Ｈ置換、Ｃ１２４Ｇ置換および残基２～１１の欠失を含む改変Ｅ１Ａタンパク質、ＰＤＺ結合性モチーフの欠失を含む改変Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、ならびに欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質（例えば、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２９７を参照）；または
Ｙ４７Ｈ置換、Ｃ１２４Ｇ置換および残基２～１１の欠失を含む改変Ｅ１Ａタンパク質、欠失Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、ならびに欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質（例えば、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２９８を参照）をコードする。

【0166】

具体例では、組換えアデノウイルスのゲノムは、配列番号６～８、１０～１２、１４、１５、１８～２０、２２～２６、３０、３１および８２～８７のいずれか１つと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるか、または組換えアデノウイルスのゲノムは、配列番号６～８、１０～１２、１４、１５、１８～２０、２２～２６、３０、３１、８２～８７および９２～９７のいずれか１つを含むか、またはそれからなり、例えば、正常細胞および腫瘍細胞で感染性粒子の数を比較することによって判定したときに、同じ細胞型の腫瘍細胞と比較して正常（すなわち、非腫瘍）細胞（例えば、乳がん細胞対正常乳房細胞）で、複製の低下、例えば、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の低下を有する。

【0167】

一部の実施形態では、組換えアデノウイルスのゲノムは、Ｅ３－ＲＩＤα／ＲＩＤβおよびＥ３－１４．７ｋコード配列の欠失を含む。
Ｂ．肝臓脱標的化改変

【0168】

本明細書に開示される組換えアデノウイルスは、肝臓からウイルスを脱標的化する改変をさらに含むことができる。Ａｄ５ヘキソンは血液中の第Ｘ因子に結合することができ、それは、全身性汎発を阻止して炎症を制限する、肝臓のクッパー細胞によるその吸収に導くことができる。これを克服するために、肝臓での取込みおよび発現を阻止する追加のゲノム改変をＥ１およびコアモジュールに含むように、組換えアデノウイルスを工学的に操作した。

【0169】

これらの追加の改変を含むゲノムモジュールを試験するために、ならびにｉｎ ｖｉｖｏ使用および遺伝子送達のためのＡｄ５発現ベクターを作製するために、Ｅ１Ａ／Ｅ１遺伝子を欠失させ、ＥＦ１α駆動ルシフェラーゼ－ＧＦＰ融合で置き換えた。静脈内注射したとき、ルシフェラーゼ生物発光によって明白に示されるように、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１９９は主に肝臓に蓄積した（図２２を参照）。

【0170】

肝臓での標的外発現を阻止するために、肝臓で特異的に発現されるマイクロＲＮＡのために、Ｅ１Ａの３’ＵＴＲに結合部位を含むようにウイルスを工学的に操作した。特定の実施形態では、その発現および結合部位がヒトおよびマウスの肝細胞の両方で保存されているので、ｍｉＲ１２２が肝臓特異的マイクロＲＮＡとして選択された。一部の例では、ウイルスの遺伝子発現および細胞性炎症性応答を誘導する肝臓でのいかなる残留ウイルスの取込みを阻止するために、肝臓特異的ｍｉＲ１２２のための２つのマイクロＲＮＡ結合部位をＥ１Ａの３’ＵＴＲに挿入した。Ａｄｓｙｎ－ＣＯ１９９と対照的に、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２００は（図２２および下の実施例２を参照）、肝臓でルシフェラーゼ発現を駆動しない。

【0171】

第Ｘ因子へのＡｄ５ヘキソンの結合を通して肝臓でウイルスの取込みおよび隔離を阻止するために、肝臓取込みを阻止する、ヘキソンでの追加の突然変異（Ｅ４５１Ｑ）でウイルスを工学的に操作した。ＡｄＳｙｎ１９９およびＡｄｓｙｎ２００と対照的に、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１７１は肝臓中に蓄積せず、代わりに、他の器官、この場合脾臓およびリンパ節を標的にすることができるが、それはこれらが非担癌動物であったからである（図２２）。

【0172】

Ｅ１Ａ、Ｅ４ｏｒｆ１および／またはＥ４ｏｒｆ６／７に１つまたは複数の突然変異を有するＥ２Ｆ選択的ウイルスの全身送達を可能にするために、ヘキソンに肝臓脱標的化Ｅ４５１Ｑ改変をさらに含むように、組換えアデノウイルスを工学的に操作した（例えば、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５およびＡｄＳｙｎ－ＣＯ４４２を参照；図２０および２１と実施例２を参照）。

【0173】

肝臓でアデノウイルス蓄積を阻止するために、アデノウイルスヘキソン遺伝子への他の突然変異が本明細書で企図される。例えば、ヘキソンの９つの超可変領域を異なる血清型からのもので置き換えることによって、組換えアデノウイルスを肝臓から脱標的化することができるだろう。

【0174】

組換えアデノウイルスのゲノムは、改変Ｅ１Ａタンパク質、改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質またはその任意の組合せをコードし、改変ヘキソンタンパク質をさらにコードし、組換えアデノウイルスは、腫瘍細胞と比較して正常細胞において複製欠陥を示す、組換えアデノウイルスが本明細書で提供される（例えば、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５を参照）。

【0175】

一部の実施形態では、改変ヘキソンタンパク質は、Ｅ４５１Ｑ置換を含む。具体例では、組換えアデノウイルスのゲノムは、配列番号３０、配列番号９２もしくは配列番号９７と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるか、またはゲノムは、配列番号３０、配列番号９２もしくは配列番号９７のヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。

【0176】

組換えアデノウイルスのゲノムが、改変Ｅ１Ａタンパク質、改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質またはその任意の組合せをコードし、肝臓特異的マイクロＲＮＡのための１つまたは複数の結合部位をさらに含み、組換えアデノウイルスは、腫瘍細胞と比較して正常細胞において複製欠陥を示す組換えアデノウイルスがさらに本明細書で提供される。

【0177】

一部の実施形態では、肝臓特異的マイクロＲＮＡのための１つまたは複数の結合部位は、Ｅ１Ａの３’－ＵＴＲに位置する。一部の例では、肝臓特異的マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－３０またはｍｉＲ－１９２である。
Ｃ．誘導可能な再標的化のための改変

【0178】

本明細書に開示される組換えアデノウイルスは、腫瘍細胞受容体への誘導可能なｉｎ ｖｉｖｏ再標的化のためにさらに改変することができる。遍在的に使用されるＡｄ２／５ベクターは、感染のために、上皮細胞の上に存在するがほとんどの転移性がんに存在しない、コクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）に依存する。「ＲａｐＡＤ」は、融合タンパク質を通して任意の腫瘍細胞受容体（または任意の細胞型）へのアデノウイルス感染のラパマイシン／ラパログ誘導性標的化を可能にする（参照により本明細書にその全体が組み込まれる、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１３／１３８５０５を参照）。柔軟なアダプター系の使用は、ウイルスカプシドのアセンブリーを妨害しない。理想的な再標的化融合タンパク質は、特異的がん細胞表面分子に強力な親和性を有する抗体である。ラクダ科の動物およびサメは、単一の１０ｋＤａの可変ＶＨＨドメインを通してそれらのエピトープを認識する、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）をコードする。合成生物学を使用して、肺がんで高度に上方調節される特異的分子、例えばＥＧＦＲおよびＣＥＡＣＡＭ５を認識するＶＨＨを作製することができる。ラパマイシンは、ＣＡＲが下方調節される転移腫瘍細胞上のＥＧＦＲに合成アデノウイルス感染を再標的化させることが実証された。

【0179】

工学的に操作したアデノウイルスは、生物学的に直交性のラパログＡＰ２１９６７で標的化させることもできる。ラパマイシンは腫瘍崩壊性のアデノウイルス療法との合理的な組合せであるが、ラパマイシンの細胞性および生物性の影響を回避することが望ましいであろう場合がある。したがって、アデノウイルス再標的化のための別のオプションとして、ラパマイシン構造相同体ＡＰ２１９６７を使用することができる。ＡＰ２１９６７は、ＦＫＢＰおよび突然変異体ＦＲＢ^＊ドメイン（ｍＴＯＲ突然変異Ｔ２０９８Ｌ）と安定したヘテロダイマーを形成することができるが、野生型ＦＲＢドメインではできない。ラパマイシンと対照的に、ＡＰ２１９６７は、ｐ７０Ｓ６キナーゼリン酸化、正規の下流基質によって明白なように、ｍＴＯＲシグナル伝達を不活性化しない。しかし、ＡＰ２１９６７は、ＦＫＢＰ－ＶＨＨ融合を通して腫瘍細胞へのＦＲＢ^＊－繊維（ＦＲＢ－繊維でなく）発現ウイルスの再標的化を誘導することがなおできる（図１８）。

【0180】

ＥＧＦＲ標的化アデノウイルスが突然変異体ＦＲＢドメイン（ＦＲＢ^＊）で改変されるとき、それは、ラパマイシンおよびＡＰ２１９６７によりＥＧＦＲを通して細胞に感染するように誘導することができる（図１８～２１および下の実施例２を参照）。

【0181】

組換えアデノウイルスのゲノムが、改変Ｅ１Ａタンパク質、改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質またはその任意の組合せをコードし、ＦＫＢＰタンパク質に融合した標的化リガンド、および野生型ＦＲＢタンパク質またはＴ２０９８Ｌ置換を含む突然変異体ＦＲＢタンパク質に融合したアデノウイルス繊維タンパク質をさらにコードする、組換えアデノウイルスが本明細書で提供される。

【0182】

一部の実施形態では、標的化リガンドは、ラクダ科の動物のＶＨＨ抗体などの、単一ドメイン抗体である。特定の例では、単一ドメイン抗体は、ＥＧＦＲまたは腫瘍細胞で上方調節される別の分子に特異的である。非限定例では、組換えアデノウイルスのゲノムは、配列番号２５、配列番号２６もしくは配列番号８８と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるか、または配列番号２５、配列番号２６もしくは配列番号８８のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる（例えば、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１２、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１３およびＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０５を参照）。

【0183】

一部の実施形態では、Ｅ３－ＲＩＤα／ＲＩＤβおよびＥ３－１４．７ｋコード配列を欠失させることによって、ＦＫＢＰ－標的化リガンド融合タンパク質がアデノウイルスゲノムに収容される。しかし、アデノウイルスゲノムの代替位置が企図される。例えば、標的化リガンド－ＦＫＢＰ融合タンパク質は、自己開裂Ｐ２Ａリンカー配列でＥ３－ＡＤＰにＮ末端融合として（例えば、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ４４０；配列番号６８を参照）、または自己開裂Ｐ２Ａ配列でＥ１Ｂ－５５ｋにＣ末端融合として挿入することもできる。

【0184】

組換えアデノウイルスのゲノムが、改変Ｅ１Ａタンパク質、改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質またはその任意の組合せをコードし、Ｔ２０９８Ｌ置換を含む突然変異体ＦＲＢタンパク質に融合したアデノウイルス繊維タンパク質をさらにコードする、組換えアデノウイルスがさらに提供される。一部の例では、ゲノムは、Ｅ４５１Ｑ置換を含む改変ヘキソンタンパク質をさらにコードする。具体例では、組換えアデノウイルスのゲノムは、配列番号３１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるか、または配列番号３１のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる（例えば、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３６を参照）。

【0185】

上記の誘導可能に再標的化された組換えアデノウイルスは、肝臓再標的化改変、例えば突然変異体ヘキソンタンパク質（例えばＥ４５１Ｑ置換）をさらに含むことができる。あるいは、または、さらに、組換えアデノウイルスのゲノムは、肝臓特異的マイクロＲＮＡのための１つまたは複数の結合部位を含むことができる（上記の通り）。
Ｄ．再標的化のためのキメラ繊維タンパク質

【0186】

Ａｄ５および多くの他の血清型の繊維タンパク質が細胞付着のためにコクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）に結合することが示されたが、他の血清型はＣＤ４６、デスモグレイン２、シアリン酸または他を使用することが示された。したがって、キメラ繊維タンパク質をコードするゲノムを有し、それによって異なる細胞受容体を組換えウイルスの標的にさせる組換えアデノウイルスが本明細書で提供される（図２３Ａ～２３Ｅおよび下の実施例３を参照）。

【0187】

組換えアデノウイルスのゲノムが、改変Ｅ１Ａタンパク質、改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質またはその任意の組合せをコードし、さらに、キメラ繊維タンパク質をコードする組換えアデノウイルスが本明細書で提供される。

【0188】

一部の実施形態では、キメラ繊維タンパク質は、第１のアデノウイルス血清型からの繊維シャフトおよび第２のアデノウイルス血清型からの繊維ノブを含む。一部の例では、第１のアデノウイルス血清型はＡｄ５であり、第２のアデノウイルス血清型はＡｄ３、Ａｄ９、Ａｄ１１、Ａｄ１２、Ａｄ３４またはＡｄ３７である。１つの非限定例では、第１のアデノウイルス血清型はＡｄ５であり、第２のアデノウイルス血清型はＡｄ３４である。

【0189】

特定の例では、組換えアデノウイルスのゲノムは、配列番号８２、配列番号８３または配列番号８４のヌクレオチド配列を含む。

【0190】

キメラ繊維を発現する組換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、上記のように誘導可能な標的化および／または肝臓再標的化改変をさらに含むことができる。
Ｅ．中和抗体を回避するためのカプシド交換

【0191】

本開示は、既存の中和抗体を回避することが可能なキメラウイルスを作製するために、天然のアデノウイルスモジュラリティーを活用することをさらに企図する。特に、それらを既存の抗体に「見えなく」させて反復接種を可能にする、完全な「カプシド」モジュール交換（ゲノムのほぼ６０％）を有するＡｄ５をベースとしたウイルスが本明細書で開示される。カプシド交換された組換えアデノウイルスが、実施例４でさらに記載される（図２４～２６も参照）。

【0192】

組換えアデノウイルスのゲノムが、改変Ｅ１Ａタンパク質、改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質またはその任意の組合せをコードし、組換えアデノウイルスのゲノムが、カプシド交換キメラアデノウイルスをコードする組換えアデノウイルスが本明細書で提供される。一部の実施形態では、ゲノムのＥ１、Ｅ３およびＥ４領域は第１のアデノウイルス血清型に由来し、ゲノムのＥ２Ｂ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｅ２ＡおよびＬ４領域は第２のアデノウイルス血清型に由来する。一部の例では、第１のアデノウイルス血清型のＥ１領域は、第２のアデノウイルス血清型からのｐＩＸタンパク質をコードするように改変され；および／または、第１のアデノウイルス血清型のＥ３領域は、第２のアデノウイルス血清型からのＵｅｘｏｎおよび繊維タンパク質をコードするように改変される。特定の例では、第１のアデノウイルス血清型はＡｄ５であり、第２のアデノウイルス血清型はＡｄ３、Ａｄ９、Ａｄ１１、Ａｄ３４またはＡｄ３７である。

【0193】

特定の例では、組換えアデノウイルスのゲノムは、配列番号８５、または配列番号９２～９７のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。

【0194】

組換え腫瘍崩壊性カプシド交換アデノウイルスは、上記のようにキメラ繊維、誘導可能な標的化および／または肝臓再標的化改変をさらに含むことができる。
Ｆ．他の改変

【0195】

本明細書に開示される組換えアデノウイルスは、例えば腫瘍を選択的に増強するために、特異的細胞型に感染を導くために、および既存の中和抗体を回避するために、追加の改変を含むこともできる。

【0196】

一実施形態では、組換えアデノウイルスは、ＲＧＥへのインテグリン結合性ＲＧＤモチーフの突然変異を有するカプシドタンパク質ペントンと一緒にＥ１、Ｅ３およびＥ４突然変異を有するＥＧＦＲ標的化腫瘍崩壊性アデノウイルスである（例えば、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ５１１；配列番号８６）。このペントン突然変異は脾臓でのウイルスの取込みを低減し、抗ウイルス性炎症性応答を弱めることが示されている。

【0197】

別の実施形態では、組換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、繊維タンパク質へのＲＧＤペプチドの挿入と一緒にＥ１およびＥ４突然変異を含む（例えば、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ５１２；配列番号８７）。繊維タンパク質でのＲＧＤ挿入は、血管内皮細胞を含むより広い種類の細胞型に感染を劇的に増加させることが示された。
Ｇ．組換えリポーターアデノウイルス

【0198】

組換えリポーターアデノウイルスが、本明細書でさらに提供される。一部の実施形態では、組換えアデノウイルスのゲノムは、Ｅ１Ａの欠失を含み、ＥＦ１α－ルシフェラーゼをコードする（例えば、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１９９、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２００およびＡｄＳｙｎ－ＣＯ１７１を参照）。

【0199】

一部の実施形態では、組換えアデノウイルスのゲノムは、肝臓特異的マイクロＲＮＡのための１つまたは複数の結合部位をさらに含み、および／または改変ヘキソンタンパク質をコードする。一部の例では、肝臓特異的マイクロＲＮＡのための１つまたは複数の結合部位は、Ｅ１Ａの３’－ＵＴＲに位置する。具体的な非限定例では、肝臓特異的マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－１２２である。一部の例では、改変ヘキソンタンパク質は、Ｅ４５１Ｑ置換を含む。

【0200】

具体的な非限定例では、組換えアデノウイルスのゲノムは、配列番号２７（ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１９９）、配列番号２８（ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２００）または配列番号２９（ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１７１）のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるか、またはそれを含むか、もしくはそれからなる。
ＩＶ．野生型および突然変異体ウイルス配列

【0201】

本明細書で開示される組換えアデノウイルスの組換えアデノウイルスゲノムが、本開示によってさらに提供される。特に、配列番号１～３１および６８～９８のいずれか１つと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子が提供される。具体例では、組換え核酸は、配列番号１～３１および６８～９８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。

【0202】

組換えアデノウイルスゲノムを含むベクターも提供される。一部の実施形態では、配列番号１～３１および６８～９８のいずれか１つと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸分子を含むベクターが提供される。一部の例では、配列番号１～３１および６８～９８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる核酸分子を含むベクターが提供される。

【0203】

本明細書で開示される組換えアデノウイルスによって発現される、野生型および突然変異体のアデノウイルスタンパク質配列が下で提供される。
Ｅ１Ａ突然変異体

【0204】

下のＥ１Ａ配列では、ＬＸＣＸＥモチーフは下線によって示される。このモチーフは、Ａｄ５ Ｅ１Ａ（配列番号３２）のアミノ酸１２２～１２６に存在する。Ｙ４７ＨおよびＣ１２４Ｇ置換は、太字で示す。

【化2-1】

【化2-2】

【化2-3】

Ａｄ５ Ｅ４ｏｒｆ１およびＥ４ｏｒｆ６／７
Ａｄ５ Ｅ４ｏｒｆ１のＣ末端のＰＤＺ結合性モチーフ（配列番号３８の残基１２６～１２８）には、下線が引かれている。

【化3】

【0205】

Ｅ２Ｆへの結合を排除するか、もしくは害する、または核局在化シグナルを欠失させるか、もしくは害する、改変Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質をコードするゲノムを有する組換えアデノウイルスが、本明細書で企図される。一部の例では、Ｅ２Ｆ結合部位を欠失させる／害するために、改変Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質は、約６０、約５０、約４０、約３０、約２０または約１０アミノ酸の欠失をＣ末端に含む。他の例では、Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質は、Ｃ末端の１０アミノ酸に欠失、フレームシフトもしくは挿入を、またはＥ２Ｆ結合を消滅させるか、または害する、タンパク質のＣ末端の第３からの３３アミノ酸の欠失を含む。一部の実施形態では、突然変異は、Ｅ２Ｆ相互作用を害するアミノ酸８１～９１を含む。

【0206】

他の例では、改変Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質は、Ｅ２Ｆ４の効率的な転位のために必要とされる核局在化配列を消滅させるために、Ｎ末端の５８アミノ酸の欠失を含む。Ａｄ２およびＡｄ５ Ｅ４ｏｒｆ６／７のアミノ酸１３と３８の間に位置する８つのアルギニン残基があり、それはこの領域での２５％を超えるアルギニン含有量に等しい。Ｅ４ｏｒｆ６のＮ末端でのアルギニン残基の全体的クラスタリングは、他のアデノウイルス血清型で維持されている。アルギニン残基１６、１８、２１、２２、２７および／または２９をアラニン（または、この領域を通して核局在化を消滅させる他の適当な残基）に置換する突然変異が、企図される。

【0207】

他の例では、改変Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質は、Ｅ２Ｆ二重部位占有を誘導するＥ４ｏｒｆ６／７の能力を排除または阻害するために、１つまたは複数の改変を含む。具体的な非限定例には、プロリン、アラニン、リシン、アスパラギン酸またはグルタミン酸へのＦ１２５の突然変異；またはＰ、Ａ、Ｋ、Ｒ、Ｇ、ＦへのＤ１２１の突然変異が含まれる。

【0208】

他のＥ４ｏｒｆ６／７突然変異には、以下のものが含まれる：Ｅ２Ｆ単一部位占有を阻止する、Ｔ１３３Ａ、Ｒ１０１Ａ、Ｑ１０５Ｐまたは任意の突然変異；アルファヘリックスを破壊してＥ２Ｆ結合を阻止する、Ｍ８４ＮもしくはＰ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｈおよび／またはＥ９３Ａ、もしくはＫ、Ｐ、Ｇ、Ｒ、Ｌ、Ｍ。他の企図される突然変異には、Ｔ１３３ＱもしくはＡ、Ｋ、Ｇ、Ｐ、Ｌ、Ｈ；Ｇ１４１Ｌ、Ｐ、Ｋ Ｈ、Ｆ、Ａ；またはＶ１４９Ｎ、Ｋ、Ｐ、Ｈ、Ｇ、Ｅ、Ｄが含まれる。
繊維配列

【0209】

下の組換え繊維配列では、ＦＲＢ配列には下線が引かれている。ＦＲＢ^＊に存在する突然変異は、太字で示す。

【化4-1】

【化4-2】

標的化リガンド配列

【化5】

ヘキソン配列

【化6-1】

【化6-2】

Ｅ３配列

【化7】

Ｖ．医薬組成物

【0210】

組換えアデノウイルス（または組換えアデノウイルスをコードする１つまたは複数の核酸もしくはベクター）を含む組成物が、本明細書で提供される。組成物は、任意選択で、製剤化およびｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ投与に適する。任意選択で、組成物は、提供される薬剤の１つまたは複数および薬学的に許容される担体を含む。適する担体およびそれらの製剤は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、２
２版、Loyd V. Allenら編、Pharmaceutical Press（２０１２年）に記載される。薬学的に許容される担体には、生物学的にまたは他の形で望ましくなくはない材料が含まれ、すなわち、その材料は、望ましくない生物学的作用も引き起こさずに、またはそれが含有される医薬組成物の他の構成成分と有害な方法で相互作用することなく対象に投与される。対象に投与される場合、担体は、任意選択で、有効成分の分解を最小にし、対象において有害な副作用を最小にするように選択される。

【0211】

組換えウイルス（または、組換えアデノウイルスをコードする１つまたは複数の核酸もしくはベクター）は、公知の方法に従って、例えば静脈内投与、例えばボーラスとして、もしくはある期間の連続的注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、関節滑液嚢内、クモ膜下腔内、経口、局所、腫瘍内または吸入の経路によって投与される。投与は局所であってもまたは全身性であってもよい。組成物は、局所、経口、非経口、静脈内、関節内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、経皮、肝臓内、頭蓋内、噴霧／吸入、または気管支鏡検査法による導入を含むいくつかの投与経路のいずれかを通して投与することができる。したがって、組成物は、局所または全身の治療が所望であるかどうかによって、および治療される領域によっていくつかの方法で投与される。

【0212】

一部の実施形態では、投与のための組成物は、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体に溶解させた本明細書に記載の組換えアデノウイルス（または組換えゲノム）を含む。様々な水性担体、例えば、緩衝食塩水などを使用することができる。これらの溶液は無菌であり、望ましくない物質を一般に含まない。これらの組成物は、従来の、周知の滅菌技術によって滅菌することができる。組成物は、生理条件に近づけるのに必要とされる薬学的に許容される補助物質、例えばｐＨ調整および緩衝剤、毒性調整剤など、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含むことができる。これらの製剤中の活性薬剤の濃度は、大きく異なることができ、選択される投与の特定の様式および対象の必要性に従って、液量、粘度、体重などに主に基づいて選択される。

【0213】

特に組換えウイルスの医薬製剤は、所望の程度の純度を有する組換えアデノウイルス（または、組換えアデノウイルスをコードする１つまたは複数の核酸）を、任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することによって調製することができる。そのような製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液であってよい。

【0214】

許容される担体、賦形剤または安定剤は、用いられる投与量および濃度においてレシピエントに無毒である。許容される担体、賦形剤または安定剤は、酢酸、リン酸、クエン酸および他の有機酸；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）保存剤、低分子量ポリペプチド；血清アルブミンもしくはゼラチンなどのタンパク質、またはポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；ならびにアミノ酸、単糖、二糖およびグルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート化剤；ならびにイオン性および非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート）；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属錯体（例えばＺｎ－タンパク質複合体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤であってもよい。組換えアデノウイルス（または組換えアデノウイルスをコードする１つまたは複数の核酸）は、感染単位の任意の適当な濃度で製剤化することができる。

【0215】

経口投与に適する製剤は、（ａ）液体溶液、例えば、水、食塩水またはＰＥＧ４００などの希釈剤に懸濁させた組換えアデノウイルスの有効量；（ｂ）有効成分の所定量を液体、固体、顆粒またはゼラチンとして各々含有するカプセル剤、サシェ剤または錠剤；（ｃ）適当な液体での懸濁液；および（ｄ）適する乳剤からなる。錠剤の形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、微結晶性セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸および他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、着香剤、色素、崩壊剤および薬学的に適合する担体の１つまたは複数を含むことができる。ロゼンジの形態は、有効成分をフレーバー、例えばスクロースに、ならびに、有効成分に加えて当技術分野で公知の担体を含有する、有効成分を不活性の基剤、例えばゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴム乳濁液、ゲルなどに含むパステル剤に含むことができる。

【0216】

組換えアデノウイルス（または組換えアデノウイルスをコードする１つまたは複数の核酸）は、単独で、または他の適する構成成分と組み合わせて、吸入により投与されるエアゾール製剤（すなわち、それらは「霧状にする」ことができる）にすることができる。エアゾール製剤は、加圧した許容される噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などに入れることができる。

【0217】

例えば関節内（関節の中）、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮内、腹腔内および皮下経路による非経口投与に適する製剤には、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、および予定レシピエントの血液と製剤を等張性にする溶質を含有することができる、水性および非水性の等張性の無菌注射溶液、ならびに、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および保存剤を含むことができる、水性および非水性の無菌懸濁液が含まれる。提供される方法では、組成物は、例えば、静脈内注入、経口的、局所的、腹腔内、膀胱内、腫瘍内またはクモ膜下腔内に投与することができる。非経口投与、腫瘍内投与および静脈内投与が、好ましい投与方法である。化合物の製剤は、単位用量または多回用量密封容器、例えばアンプルおよびバイアルで提供することができる。

【0218】

注射溶液および懸濁液は、前に記載の種類の無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。ｅｘ ｖｉｖｏ療法のためにアデノウイルスによって形質導入もしくは感染させたか、または核酸でトランスフェクトさせた細胞を、上記のように静脈内または非経口的に投与することもできる。

【0219】

医薬調製物は、好ましくは単位剤形である。そのような形態では、調製物は、活性成分の適当な量を含有する単位用量に細分化される。したがって、医薬組成物は、投与方法によって様々な単位剤形で投与することができる。例えば、経口投与に適する単位剤形には、散剤、錠剤、ピル剤、カプセル剤およびロゼンジ剤が限定されずに含まれる。

【0220】

一部の実施形態では、組成物は、異なる細胞受容体に結合する組換えアデノウイルスなどの、少なくとも２つの異なる組換えアデノウイルスを含む。例えば、組成物中の組換えアデノウイルスの少なくとも１つは、キメラ繊維タンパク質を発現することができる。あるいは、組換えアデノウイルスは、標的化リガンドが組成物中のウイルスを区別する標的化リガンド－ＦＫＢＰ融合タンパク質をコードすることによって異なる細胞受容体を標的にすることができる。一部の例では、組成物は、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの異なる組換えアデノウイルスを含む。
ＶＩ．治療方法

【0221】

本明細書で開示される組換えアデノウイルス組成物は、治療的または予防的処置のために投与することができる。特に、対象において腫瘍細胞生存性を阻害し、対象において腫瘍進行を阻害し、対象において腫瘍体積を低減し、および／または対象においてがんを治療する方法が提供される。本方法は、対象に組換えアデノウイルス（またはその組成物）の治療有効量を投与することを含む。全体で記載されるように、アデノウイルスまたは医薬組成物は、静脈内、血管内、クモ膜下腔内、筋肉内、皮下、腹腔内または経口的を限定されずに含む任意の数の方法で投与される。任意選択で、本方法は、対象に１つまたは複数の追加の治療剤を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、治療剤は化学療法剤である。他の実施形態では、治療剤は、免疫モジュレータである。さらに他の実施形態では、治療剤は、ＣＤＫ４阻害剤などのＣＤＫ阻害剤である。

【0222】

一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、肺、前立腺、結腸直腸、乳房、甲状腺、腎臓または肝臓のがんまたは腫瘍であるか、または白血病型である。一部の場合には、がんは転移性である。一部の例では、腫瘍は、乳房、下垂体、甲状腺または前立腺の腫瘍；脳、肝臓、髄膜、骨、卵巣、子宮または子宮頸の腫瘍；単核球性もしくは骨髄性白血病；腺癌、アデノーマ、星状細胞腫、膀胱腫瘍、脳腫瘍、バーキットリンパ腫、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、軟骨肉腫、絨毛癌、線維腫、線維肉腫、神経膠芽腫、神経膠腫、肝癌、組織球腫、上皮様平滑筋腫、平滑筋肉腫、リンパ腫、脂肪肉腫細胞、乳房腫瘍、髄芽細胞腫、骨髄腫、プラズマ細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、骨原性肉腫、膵臓腫瘍、下垂体腫瘍、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、精巣腫瘍、胸腺腫またはウィルムス腫瘍である。腫瘍には、乳房、結腸、直腸、肺、口部、下咽頭、食道、胃、膵臓、肝臓、胆嚢および胆管、小腸、尿路（腎臓、膀胱および尿路上皮を含む）、女性の生殖器官（子宮頸、子宮および卵巣ならびに絨毛癌および妊娠期絨毛性疾患を含む）、男性の生殖器官（前立腺、精嚢、精巣および胚細胞腫瘍を含む）、内分泌腺（甲状腺、副腎および下垂体を含む）および皮膚の癌腫、ならびに血管腫、黒色腫、肉腫（骨および軟部組織から生じるものならびにカポジ肉腫を含む）、および脳、神経、目および髄膜の腫瘍（星状細胞腫、神経膠腫、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽細胞腫、神経線維腫および髄膜腫を含む）を含む、原発性および転移性の固形腫瘍が含まれる。一部の態様では、リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫）の治療でだけでなく、造血悪性腫瘍、例えば白血病（すなわち、緑色腫、プラズマ細胞腫ならびに菌状息肉腫および皮膚Ｔ細胞リンパ腫／白血病のプラークおよび腫瘍）から生じる固形腫瘍を、治療することができる。さらに、本明細書に記載される腫瘍からの転移の防止で、処置が役立ち得る。

【0223】

治療的適用では、組換えアデノウイルスまたはその組成物は、対象に治療的に有効な量または用量で投与される。この使用のために有効な量は、疾患の重症度および患者の健康の全身状態による。患者によって必要とされ、耐容される投与量および頻度に従い、組成物の単回または多回投与を投与することができる。「患者」または「対象」には、ヒトおよび他の動物の両方、特に哺乳動物が含まれる。したがって、本方法は、ヒトの療法および獣医学の両方への応用に適用可能である。

【0224】

改変配列を有するアデノウイルスの有効量は個体ベースで決定され、また、少なくとも一部、使用される特定の組換えアデノウイルス；個体のサイズ、年齢、性；ならびに増殖細胞のサイズおよび他の特徴に基づく。例えば、ヒトの治療のために、組換えウイルスの少なくとも１０^３プラーク形成単位（ＰＦＵ）が使用され、例えば、存在する増殖細胞または新生物のタイプ、サイズおよび数によって、組換えウイルスの少なくとも１０^４、少なくとも１０^５、少なくとも１０^６、少なくとも１０^７、少なくとも１０^８、少なくとも１０^９、少なくとも１０^１０、少なくとも１０^１１または少なくとも１０^１２ＰＦＵ、例えば概ね１０^３～１０^１２ＰＦＵが使用される。有効量は、体重１ｋｇ当たり約１．０ｐｆｕから体重１ｋｇ当たり約１０^１５ｐｆｕであってよい（例えば、体重１ｋｇ当たり約１０^２ｐｆｕから体重１ｋｇ当たり約１０^１３ｐｆｕ）。組換えアデノウイルスは、単回用量または多回用量（例えば、２、３、４、６またはそれ超の用量）で投与される。多回用量は、同時並行的に、または連続して（例えば、数日または数週間にわたって）投与することができる。

【0225】

一部の実施形態では、提供される方法は、対象に、１つまたは複数の追加の治療剤、例えば抗がん剤または他の治療処置（腫瘍の外科切除など）を投与することを含む。例示的な抗がん剤には、化学療法剤、例えば、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、挿入抗生物質、増殖因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存剤、生体応答調節剤、抗ホルモン剤（例えば抗アンドロゲン）、抗血管形成剤およびＣＤＫ阻害剤が限定されずに含まれる。他の抗がん治療には、放射線療法およびがん細胞を特異的に標的にする他の抗体が含まれる。

【0226】

アルキル化剤の非限定例には、ナイトロジェンマスタード（メクロルエタミン、シクロホスファミド、メルファラン、ウラシルマスタードまたはクロラムブシルなど）、スルホン酸アルキル（ブスルファンなど）、ニトロソ尿素（カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシンまたはダカルバジンなど）が含まれる。

【0227】

代謝拮抗物質の非限定例には、葉酸類似体（メトトレキセートなど）、ピリミジン類似体（５－ＦＵまたはシタラビンなど）およびプリン類似体、例えばメルカプトプリンまたはチオグアニンが含まれる。

【0228】

天然生成物の非限定例には、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチンまたはビンデシンなど）、エピポドフィロトキシン（エトポシドまたはテニポシドなど）、抗生物質（ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシンまたはマイトマイシンＣなど）および酵素（Ｌ－アスパラギナーゼなど）が含まれる。

【0229】

その他の薬剤の非限定例には、白金配位錯体（シスプラチンとしても知られるシス－ジアミン－ジクロロ白金ＩＩなど）、置換型尿素（ヒドロキシ尿素など）、メチルヒドラジン誘導体（プロカルバジンなど）および副腎皮質（adrenocrotical）抑制剤（ミトタンおよびアミノグルテチミドなど）が含まれる。

【0230】

ホルモンおよびアンタゴニストの非限定例には、副腎皮質ステロイド（プレドニゾンなど）、プロゲスチン（カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロンおよび酢酸メゲストロール（magestrol）など）、エストロゲン（ジエチルスチルベ
ストロールおよびエチニルエストラジオールなど）、抗エストロゲン（タモキシフェンなど）およびアンドロゲン（プロピオン酸テストステロン（testerone）およびフルオキシ
メステロンなど）が含まれる。

【0231】

最も一般的に使用される化学療法薬の例には、アドリアマイシン、アルケラン、Ａｒａ－Ｃ、ＢｉＣＮＵ、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチナム、シスプラチン、シトキサン、ダウノルビシン、ＤＴＩＣ、５－ＦＵ、フルダラビン、Ｈｙｄｒｅａ、イダルビシン、イホスファミド、メトトレキセート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、タキソール（または、ドセタキセルなどの他のタキサン）、Ｖｅｌｂａｎ、ビンクリスチン、ＶＰ－１６が含まれ、一部のより新しい薬物には、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ－１１）、Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ、Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ、Ｒｉｔｕｘａｎ ＳＴＩ－５７１、タキソテール、トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）、Ｘｅｌｏｄａ（カペシタビン）、Ｚｅｖｅｌｉｎおよびカルシトリオールが含まれる。

【0232】

使用することができる免疫調節物質の非限定例には、ＡＳ－１０１（Ｗｙｅｔｈ－Ａｙｅｒｓｔ Ｌａｂｓ．）、ブロピリミン（Ｕｐｊｏｈｎ）、ガンマインターフェロン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＩＬ－２（ＣｅｔｕｓまたはＨｏｆｆｍａｎ－ＬａＲｏｃｈｅ）、ヒト免疫グロブリン（Ｃｕｔｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＩＭＲＥＧ（Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ、Ｌａ．のＩｍｒｅｇから）、ＳＫ＆Ｆ １０６５２８およびＴＮＦ（腫瘍壊死因子；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が含まれる。

【0233】

一部のタイプのがんのための別の一般的な治療は、外科処置、例えばがんまたはその一部の外科切除である。治療の別の例は、腫瘍を根絶するか、または外科切除の前にそれを縮小するのを助けるための、腫瘍部位への放射線療法、例えば放射性物質またはエネルギーの投与（外部ビーム療法など）である。

【0234】

ＣＤＫ（サイクリン依存性キナーゼ）阻害剤は、ＣＤＫの機能を阻害する薬剤である。提供される方法で使用するためのＣＤＫ阻害剤の非限定例には、ＡＧ－０２４３２２、ＡＴ７５１９、ＡＺＤ５４３８、フラボピリドール、インジスラム、Ｐ１４４６Ａ－０５、ＰＤ－０３３２９９１およびＰ２７６－００が含まれる（例えば、Lapennaら、Nature Reviews、８巻：５４７～５６６頁、２００９年を参照）。他のＣＤＫ阻害剤には、ＬＹ２８３５２１９、パルボシクリブ、ＬＥＥ０１１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ｐａｎ－ＣＤＫ阻害剤ＡＴ７５１９、セリシクリブ、ＣＹＣ０６５、ブチロラクトンＩ、ヒメニアルジシン、ＳＵ９５１６、ＣＩＮＫ４、ＰＤ０１８３８１２またはファスカプリシンが含まれる。

【0235】

一部の例では、ＣＤＫ阻害剤は、広範囲阻害剤（フラボピリドール、オロモウシン、ロスコビチン、ケンパウロン、ＳＮＳ－０３２、ＡＴ７５１９、ＡＧ－０２４３２２、（Ｓ）－ロスコビチンまたはＲ５４７など）である。他の例では、ＣＤＫ阻害剤は、特異的阻害剤（ファスカプリシン、リュービジン、プルバラノールＡ、ＮＵ２０５８、ＢＭＬ－２５９、ＳＵ ９５１６、ＰＤ０３３２９９１またはＰ－２７６－００など）である。

【0236】

薬剤および投与量の選択は、治療される所与の疾患に基づいて当業者が容易に決定することができる。薬剤または組成物の組合せは、併存して（例えば、混合物として）、別々であるが同時に（例えば、別個の静脈内系統によって）または逐次的に（例えば、１つの薬剤が先ず投与され、その後第２の薬剤の投与が続く）投与することができる。したがって、用語、組合せは、２つまたはそれ超の薬剤または組成物の、併存、同時または逐次的な投与を指すために使用される。

【0237】

本明細書に開示される方法により、対象は本明細書で提供される薬剤の１つまたは複数の有効量を投与される。有効量は、所望の生理的応答（例えば、がん細胞の殺滅）をもたらすのに必要な任意の量と規定される。治療剤は、１日に約０．００１ｍｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇの初期投与量で一般的に投与される。約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇから約２００ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの用量範囲を使用することができる。しかし、対象の必要量、治療される状態の重症度および採用される化合物によって、投与量は変更されてもよい。例えば、投与量は、特定の対象において診断されるがんのタイプおよびステージを考慮して経験的に決定することができる。対象に投与される用量は、提供される方法との関連で、患者で有益な治療応答に経時的に影響するのに十分であるべきである。特定の状況のための適切な投与量の決定は、開業医の技術の範囲内である。したがって、薬剤を投与するための有効量およびスケジュールは、当業者が経験的に決定することができる。投与量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などのかなりの有害な副作用を引き起こすほど大きくあるべきでない。何らかの禁忌症が生じた場合、投与量は個々の医師が調整することができる。所与のクラスの医薬品のための適当な投与量について、指針を文献で見出すことができる。

【0238】

腫瘍細胞を、本明細書に開示される組換えアデノウイルスまたはその組成物と接触させることによって、腫瘍細胞生存性を阻害する方法が、本明細書で提供される。一部の実施態様では、本方法はｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。他の実施形態では、本方法はｉｎ ｖｉｖｏの方法であり、腫瘍細胞を接触させることは腫瘍を有する対象に組換えアデノウイルスまたは組成物を投与することを含む。

【0239】

対象に本明細書で開示される組換えアデノウイルス（またはその組成物）の治療有効量を投与することによって、対象において腫瘍進行を阻害するか、または腫瘍体積を低減する方法がさらに提供される。

【0240】

対象に本明細書で開示される組換えアデノウイルス（またはその組成物）の治療有効量を投与することによって、対象においてがんを治療する方法も提供される。

【0241】

対象に（ｉ）ラパマイシン／ラパログ誘導性の再標的化組換えアデノウイルスの治療有効量；および（ｉｉ）ラパマイシンまたはその類似体を投与することによって、対象において腫瘍体積を低減する方法がさらに提供される。対象に（ｉ）ラパマイシン／ラパログ誘導性の再標的化組換えアデノウイルスの治療有効量；および（ｉｉ）ラパマイシンまたはその類似体を投与することによって、対象においてがんを治療する方法も提供される。

【0242】

一部の実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、約０．１ｍｇ／ｋｇから約２．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。他の実施形態では、ラパマイシンは、約０．１ｍｇ／ｋｇから約０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の例では、ラパマイシンは、約０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇまたは２．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。

【0243】

一部の実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、約１から１５ｍｇ／ｍ^２、例えば約３から１２ｍｇ／ｍ^２または約５から１０ｍｇ／ｍ^２の用量で投与される。一部の例では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４または約１５ｍｇ／ｍ^２の用量で投与される。

【0244】

一部の実施形態では、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体は、対象において実質的な免疫抑制を引き起こさない用量で投与される。「実質的な免疫抑制を引き起こさない用量で」のラパマイシンまたはその類似体の投与は、特定の対象のための有効濃度２５（ＥＣ_２５）またはそれ未満である用量を指す。当業者は、対象において実質的な免疫抑制を引き起こさないラパマイシンまたはその類似体の用量を決定することが可能である（例えば、Schubertら、Am J Transplant４巻：７６７～７７３頁、２００４年を参照）。一
部の例では、ＥＣ_２５は、約１ｎｇ／ｍＬから約１５ｎｇ／ｍＬ、例えば約３ｎｇ／ｍＬから約１０ｎｇ／ｍＬである。非限定例では、ＥＣ_２５は、約１ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１１ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ、約１３ｎｇ／ｍＬ、約１４ｎｇ／ｍＬまたは約１５ｎｇ／ｍＬである。

【0245】

一部の実施形態では、再標的化アデノウイルスのゲノムは、ＦＫＢＰに融合した標的化リガンド、および野生型ＦＫＢＰ－ラパマイシン結合性（ＦＲＢ）タンパク質またはＴ２０９８Ｌ置換を含む突然変異体ＦＲＢタンパク質に融合したアデノウイルス繊維タンパク質をコードする。一部の例では、標的化リガンドは、ＥＧＦＲに特異的な単一ドメイン抗体などの、単一ドメイン抗体である。特定の非限定例では、組換えアデノウイルスのゲノムは、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５（配列番号３０）、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５Ｂ－Ｋ（配列番号９２）またはＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５Ｂ－ＴＫ（配列番号９７）のヌクレオチド配列を含む。

【0246】

本方法の一部の実施形態では、腫瘍またはがんは、Ｅ２Ｆ経路の脱調節によって特徴付けられる。一部の実施形態では、腫瘍またはがんは、肺、前立腺、結腸直腸、乳房、甲状腺、腎臓または肝臓の腫瘍またはがんであるか、または白血病である。

【0247】

一部の実施形態では、本方法は、対象を追加の治療剤、例えば、化学療法剤、免疫モジュレータまたはＣＤＫ阻害剤、例えばＣＤＫ４阻害剤で治療することをさらに含む。

【0248】

以下の実施例は、ある特定の特徴および／または実施形態を例示するために提供される。これらの実施例は、本開示を記載される特定の特徴または実施形態に限定するものと解釈するべきでない。

【実施例0249】

（実施例１）
脱調節されたＥ２Ｆ活性を有する腫瘍細胞で選択的に複製する腫瘍崩壊性アデノウイルス

【0250】

参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／０２４３５１に記載される方法に従って、改変アデノウイルスを下で参照する構成成分で作製した。ゲートウェイｐＤＯＮＲベクターを採用した。ヒトＡｄ５ ＤＮＡから、ＰＣＲによってＥ１モジュールを得、ＳＬＩＣを使用してベクターｐＤＯＮＲ Ｐ１Ｐ４に挿入した。ａｔｔＬ１およびａｔｔＬ４組換え部位を含むｐＤＯＮＲ Ｐ１Ｐ４ベクター骨格を、ＰＣＲを使用して増幅させ、ＳＬＩＣによってＡｄ５ Ｅ１モジュールと組み合わせた。ａｔｔＢ５およびａｔｔＢ３ｒ組換え部位に隣接する生成物を生産するために、Ｅ３モジュールをＰＣＲによって得た。ゲートウェイＢＰ反応によって、生成物をｐＤＯＮＲ Ｐ５Ｐ３ｒベクターに挿入した。ａｔｔＢ３およびａｔｔＢ２組換え部位に隣接する生成物を生産するために、Ｅ４モジュールをＰＣＲによって得た。ゲートウェイＢＰ反応によって、生成物をｐＤＯＮＲ Ｐ３Ｐ２ベクターに挿入した。ｐＤＯＮＲ Ｐ５Ｐ２ベクターからのａｔｔＲ５－ｃｃｄＢ－Ｃｍ（ｒ）－ａｔｔＲ２断片をＰＣＲによって増幅させ、Ａｄｓｅｍｂｌｙ ＤＥＳＴベクターに挿入した（「ＭｕｌｔｉＳｉｔｅ Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ」、Ｃａｔ＃１２５３７－１００；およびSoneら、J Biotechnol１
３６巻（３～４号）：１１３～１２１頁、２００８年を参照）。Ａｄｓｅｍｂｌｙ方法は、参照により本明細書にその全体が組み込まれる、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／０２４３５１に記載される。

【0251】

Ａｄｓｅｍｂｌｙ ＤＥＳＴベクターのためのベクター骨格は、３つの異なる供与源からのパーツで構成される。Ａｍｐ（ｒ）カセットおよびｌａｃＺ遺伝子を、プラスミドｐＵＣ１９から増幅させた。これを、プラスミドｐＳＢ３Ｋ５－Ｉ５２００２、ＢｉｏＢｒｉｃｋｓｉＧＥＭ ２００７パーツ配布の一部から得た、ｐ１５Ａ複製起点と組み合わせた。プラスミドをより低い（１０～１２）コピー数に維持するｐ１５Ａ複製起点は、Ｅ１毒性を低減するのに必要である。最後に、自己切除ウイルスを作製するために、酵素ＩＳｃｅＩのための哺乳動物の発現カセットをプラスミドｐＡｄＺ５－ＣＶ５－Ｅ３＋からＰＣＲ増幅させた。ｐ１５Ａ－ＳｃｅＩと呼ばれるベクターを作製するために、このカセットをベクター骨格にクローニングした。これは、ゲノムアセンブリーを開始するために使用されるベクターである。遺伝子モジュールは、野生型Ａｄ５ウイルスから精製されたＤＮＡまたはプラスミドｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から全て得た。

【0252】

ヒトＡｄ５のためのＤＥＳＴベクターに関しては、Ｅ２およびＬ３モジュールを３断片ＳＬＩＣによってプラスミドｐ１５Ａ－ＳｃｅＩに挿入した。ａｔｔＲ５およびａｔｔＲ２部位に隣接するｃｃｄＢおよびＣｈｌｏｒ（ｒ）を発現する対抗選択マーカーを、ＰＣＲによってプラスミドｐＤＯＮＲ Ｐ５Ｐ２から得た。第２の対抗選択マーカーを、ＰＣＲによってベクターｐＤＯＮＲ Ｐ１Ｐ４から得た。ＤＥＳＴベクターを作製するためにＥ２およびＬ４モジュールの末端に工学的に操作した特異な制限酵素で切断の後に、２つの対抗選択マーカーをＳＬＩＣによってｐ１５Ａ－ＳｃｅＩＥ２－Ｌ４の右側と左側に挿入した。

【0253】

Ａｍｐ（ｒ）カセットに関して：プラスミドｐＵＣ１９に関しては、ｐ１５Ａ複製起点：プラスミドｐＳＢ３Ｋ５－Ｉ５２００２は、ＢｉｏＢｒｉｃｋｓｉＧＥＭ ２００７パーツ配布の一部であった。アデノウイルス遺伝子モジュールに関しては、ＤＮＡはＡｄ５粒子またはプラスミドｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から精製した。ＤＯＮＲベクターｐＤＯＮＲ Ｐ１Ｐ４、Ｐ５Ｐ２、Ｐ５Ｐ３Ｒ、Ｐ３Ｐ２は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た。

【0254】

全てのＰＣＲアッセイは、Ｐｈｕｓｉｏｎ酵素（ＮＥＢ）を使用して実行した。Ａｄ５からアデノウイルス遺伝子モジュールを得るためのＰＣＲアッセイは、１×ＨＦ緩衝液、各々２００μＭのｄＮＴＰ、各々０．５μＭのプライマーおよび１０ｎｇの鋳型で実行した。Ｅ２－Ｌ２モジュールについては、３％ＤＭＳＯも追加した。鋳型は、プラスミドｐＡｄ／ＰＬ－ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｅ２－Ｌ２、Ｌ３－Ｌ４およびＥ４モジュールの場合）またはＡｄ５ゲノムＤＮＡ（Ｅ１およびＥ３モジュールの場合）であった。ＰＣＲ条件は以下の通りだった：

【0255】

Ｅ２－Ｌ２およびＬ３－Ｌ４：９８℃で３０秒間－９８℃で１０秒間、６５℃で３０秒間を１０サイクル（温度を２サイクルおきに１℃下げる）、７２℃で７分間－９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で８分間を２９サイクル－７２℃で１０分間－４℃を保持。

【0256】

Ｅ３：９８℃で３０秒間－９８℃で１０秒間、７０℃で３０秒間を１０サイクル（温度を１サイクルおきに０．５℃下げる）、７２℃で２分３０秒間－９８℃で１０秒間、６８℃で３０秒間、７２℃で２分３０秒間を２５サイクル－７２℃で１０分間－４℃を保持。

【0257】

Ｅ４：９８℃で３０秒間－９８℃で１０秒間、６３℃で３０秒間を６サイクル（温度を１サイクルおきに０．５℃下げる）、７２℃で２分間－９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間を２９サイクル－７２℃で５分間－４℃を保持。

【0258】

精製されたウイルスからウイルスのゲノムＤＮＡを得るために、１０ｍＭのトリスｐＨ８、５ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＮａＣｌおよび０．２％のＳＤＳを含有する３００μｌの溶解緩衝液に、精製されたウイルスの１００μｌまでを追加した。混合物を６０℃で５分間インキュベートし、その後、５μｌのプロテイナーゼＫストック（約２０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、６０℃で１時間さらにインキュベートした。次に試料を５分間、氷上に置き、続いて１５Ｋ×ｇで１５分間遠心回転させた。上清を取り出し、等量のイソプロパノールに加え、よく混合し、４℃および１５Ｋ×ｇで１５分間遠心回転させた。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、４℃で１５分間再度遠心回転させた。ペレットを乾燥させ、使用のために再懸濁した。

【0259】

ＳＬＩＣに関しては、以下の２０μｌの反応において、線状の断片を室温で２０分間、エキソヌクレアーゼで処理した：５０ｍＭのトリスｐＨ８、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μｇ／ｍＬのＢＳＡ、２００ｍＭの尿素、５ｍＭのＤＴＴおよび０．５μｌのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ。反応を１μｌの０．５ＭのＥＤＴＡの添加によって停止させ、続いて７５℃で２０分間インキュベートした。次に、新しいチューブで、等量のＴ４処理ＤＮＡをおよそ２０μｌの量まで混合した。２つの断片を合わせたＳＬＩＣについては、各反応物１０μｌを使用した。３つの断片を合わせたＳＬＩＣについては、各反応物７μｌを使用した。６５℃に１０分間加熱することによって断片をアニールし、続いて、５秒おきに０．５℃ずつ徐々に冷却して温度を２５℃まで下げた。アニーリングの後、反応物５μｌを形質転換させ、クローンをスクリーニングした。

【0260】

ＡｄＳｌｉｃＲに関しては、１００ｎｇのＴ４処理ｐ１５Ａ－ＳｃｅＩ（ＰＣＲによって線状化）ならびにＥ２およびＬ３モジュール（それらのそれぞれの侵入ベクターからＰＣＲによって得た）の各々の３００ｎｇを使用して、３断片ＳＬＩＣ反応を実行した。これで、ベクターｐ１５Ａ－ＳｃｅＩ Ｅ２－Ｌ４を作製した。ｐ１５Ａ－ＳｃｅＩ Ｅ２－Ｌ４の５μｇをＳｗａＩで切断し、Ｑｉａｇｅｎ ＱｉａｅｘＩＩを使用してゲル精製した。Ｅ３およびＥ４モジュールは、それらのそれぞれの侵入ベクターからＰＣＲによって得た。線状化ベクター（４５０ｎｇ）およびＰＣＲ生成物（２００ｎｇ）の各々をＴ４
ＤＮＡポリメラーゼで処理し、１５０～２００ｎｇのベクターおよび約１００ｎｇの各モジュールＰＣＲを使用してＳＬＩＣを通常通り実行した。陽性クローンの単離の後、新しいベクターの５μｇをＰａｃＩで切断してゲル精製し、次に、新しいＳＬＩＣ反応でＥ１ ＰＣＲ生成物（Ｔ４処理したものの１００ｎｇ）と合わせた。これでゲノムアセンブリーが完成され、プラスミドはウイルスを再構成するトランスフェクションの準備ができた。

【0261】

Ｅ１およびＥ４突然変異体領域を構築するために、個々のモジュール侵入ベクターで操作を実行した。ＬＴＣＨＥ配列（配列番号３２の残基１２２～１２６）が欠如している生成物を生産するために、ベクター骨格を有するＥ１モジュールをプライマーでＰＣＲ増幅し、次に、ｐＥＮＴＲ－Ｅ１－Ｅ１Ａ－ΔＬＸＣＸＥを生産するためにＳＬＩＣを使用して環化した。

【0262】

あるいは、Ｙ４７をＨに、Ｃ１２４をＧに突然変異させるＥ１Ａコドン変化を有する生成物を生産するために、またはｐＥＮＴＲ－Ｅ１－Ｅ１Ａ－Ｙ４７Ｈ、ｐＥＮＴＲ－Ｅ１－Ｅ１Ａ－Ｃ１２４ＧまたはｐＥＮＴＲ－Ｅ１－Ｅ１Ａ－Δ２－１１をそれぞれ生産するために残基２～１１を欠失させるために、ベクター骨格を有するＥ１モジュールをプライマーでＰＣＲ増幅した。これらの生成物は、これらの突然変異の組合せ：ｐＥＮＴＲ－Ｅ１－Ｅ１Ａ－Ｙ４７Ｈ－Ｃ１２４ＧおよびｐＥＮＴＲ－Ｅ１－Ｅ１Ａ－Ｙ４７Ｈ－Ｃ１２４Ｇ－Δ２－１１を生産するさらなるＰＣＲ突然変異のための鋳型として使用された。ｐＥＮＴＲ－Ｅ４－ΔＥ４ｏｒｆ６／７を生産するために、Ｅ４ｏｒｆ６終止コドンの下流のＥ４ｏｒｆ６／７特異的エクソン配列（２９７ｂｐ）が欠如している生成物を生産するために、ベクター骨格を有するＥ４モジュールをプライマーでＰＣＲ増幅した。この生成物は、Ｅ４ｏｒｆ１のＰＤＺ結合性モチーフまたはＥ４ｏｒｆ１配列全体が欠如している生成物（それぞれ、ｐＥＮＴＲ－Ｅ４－ΔＥ４ｏｒｆ６／７－Ｅ４ｏｒｆ１ΔＰＤＺｂおよびｐＥＮＴＲ－Ｅ４－ΔＥ４ｏｒｆ６／７－ΔＥ４ｏｒｆ１）を生産するために、プライマーと一緒にＰＣＲのための鋳型としても使用された。

【0263】

突然変異を有する完全なウイルスゲノムを生産するために、野生型Ｅ３モジュールおよび野生型Ｅ４または突然変異体Ｅ４モジュールと組み合わせて、次に野生型Ｅ１または突然変異体Ｅ１と組み合わせて、ｐ１５Ａ－ＳｃｅＩＥ２－Ｌ４を使用してＡｄＳｌｉｃＲを実行した。野生型ＡｄＳｌｉｃＲアデノウイルスは、下に示す表１で指定される。

【表1-1】

【表1-2】

【0264】

ウイルスの生成、濃度および精製に関しては、２９３ Ｅ４細胞を感染性粒子に感染させ、ＣＰＥが明白であった感染から概ね４８時間後に、細胞を収集し、５００×ｇで５分間の遠心分離によって単離した。３回の凍結融解を通してＴＭＮ緩衝液（１０ｍＭのトリスＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で細胞を溶解させ、３，０００×ｇおよび３，５００×ｇで１５分間の２回の遠心分離によって細胞デブリを除去した。塩化セシウム勾配（０．５ｇ／ｍＬ）を使用して、３７，０００×ｇで１８～２４時間の超遠心を通してウイルス粒子をバンド形成させた。バンドを収集し、１０％グリセロールを含むＴＭＮ中の１０，０００ ＭＷＣＯ Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（登録商標）透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、４℃で一晩（１２～１８時間）透析し、次に、－８０℃で保存した。精製したウイルスの力価は、抗アデノウイルス５型一次抗体（ａｂ６９８２、Ａｂｃａｍ）およびＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ抗ウサギアルカリ性ホスファターゼ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による細胞ベースの系列希釈感染ＥＬＩＳＡによって、滴定された野生型標準に対して判定した。

【0265】

一次ヒト小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）の感染の間のアデノウイルスタンパク質の発現を評価するために、１２ウェルプレート中の静止期ＳＡＥＣをＭＯＩ ３０のアデノウイルスに感染させ、感染の４時間後に細胞の上の培地を交換した。感染の２４、３６および４８時間後に、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、５００μＬの冷ＰＢＳに回収し、５分間の４℃での５，０００ｒｐｍでペレット化し、急速冷凍し、－８０℃で保存した。ＲＩＰＡ緩衝液（１００ｍＭのトリスｐＨ７．４、３００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ、２％のデオキシコール酸、２ｍＭのＮａＦ、０．２ｍＭのＮａＶＯ_４、２ｍＭのＤＴＴ）で、細胞ペレットを４℃で１時間溶解し、カップ超音波処理器での超音波処理（２×６０ｓパルス、４℃で６０振幅）が含まれた。４℃で２０分間の１３，０００ｒｐｍでの遠心分離によって、細胞デブリをペレット化した。Ｂｉｏ－ＲａｄのＤＣ（商標）タンパク質アッセイを使用してタンパク質濃度を判定し、試料のタンパク質濃度を正規化した。製造業者のプロトコールに従って、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを使用して、ゲル電気泳動を実行した。タンパク質は、ウェスタンブロットによって検出した。タンパク質を検出するために使用された一次抗体は、以下の通りだった：Ｅ１Ａ（ａｂ２８３０５、Ａｂｃａｍ）、β－アクチン（Ａ５４４１、Ｓｉｇｍａ）、Ａｄ５後期タンパク質（ａｂ６９８２、Ａｂｃａｍ）、サイクリンＡ（Ａｂ－６ ６Ｅ６、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ）、サイクリンＢ（Ａｂ－３ ＧＮＳ１、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ）。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を二次抗体として使用し、シグナルはＬＩ－ＣＯＲ ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標）装置を使用して検出した。肺腺癌Ａ５４９細胞および正常ヒト星状神経膠細胞（ＮＨＡ）の感染の間のアデノウイルスタンパク質発現を評価するために、１２ウェルプレートのコンフルエント細胞をＭＯＩ １０のアデノウイルスに感染させ、ＳＡＥＣについて記載したのと同様に処理した。神経膠芽腫Ｕ８７細胞、神経膠芽腫Ｕ１１８細胞、ヒト血管内皮細胞（ＨｕＶＥＣ）またはヒト線維芽細胞の感染の間のアデノウイルスタンパク質発現を評価するために、１２ウェルプレートのコンフルエント細胞をＭＯＩ ２０のアデノウイルスに感染させ、ＳＡＥＣについて記載したのと同様に処理した。

【0266】

細胞周期分析を実行するために、細胞をタンパク質発現についてのと同じＭＯＩに感染させた。感染の４８時間後に、細胞をトリプシン処理によってプレートからはがし、冷ＰＢＳで洗浄した。細胞を５００μＬの冷ＰＢＳに再懸濁させ、３ｍＬの冷７０％ＥｔＯＨ／１５ｍＭグリシン、ｐＨ２．８で固定した。試料を４℃に保ち、ＦＡＣＳの前に、細胞をペレット化し、冷ＰＢＳで洗浄し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）／ＲＮアーゼＡ溶液に再懸濁させ、次に３７℃で１時間インキュベートした。各試料のために、少なくとも１０，０００件の事象をＦＡＣＳによって収集した。

【0267】

感染からのアデノウイルスバーストを評価するために、１２ウェルプレートの静止期細胞をＭＯＩ １またはＭＯＩ １０のアデノウイルスに感染させ、感染から４時間後に細胞の上の培地を交換した。ウェルからの培地を感染の４８および７２時間後に収集し、瞬間冷凍して一度解凍し、４℃で５分間７，０００ｒｐｍで遠心分離して、細胞性デブリをペレット化した。培地の量を測定し、瞬間冷凍して－８０℃で保存した。培地中のウイルスの力価は、抗アデノウイルス５型一次抗体（ａｂ６９８２、Ａｂｃａｍ）およびＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ抗ウサギアルカリ性ホスファターゼ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による細胞ベースの系列希釈感染ＥＬＩＳＡによって、滴定された野生型標準に対して判定した。

【0268】

細胞生存アッセイに関しては、細胞を９６ウェルプレートに播種し、ＭＯＩ ３０の系列希釈で、３連で感染させた。ＭＯＩ １０感染ウェルで完全なＣＰＥがあった、感染から７～１０日目に、製造業者の仕様書に従って細胞増殖試薬ＷＳＴ－１（Ｒｏｃｈｅ）を使用して代謝活性を測定した。

【0269】

上記のように、がんは、さらなる治療処置を必要とする問題の疾患であり続ける。そのような治療の１つは、腫瘍崩壊性ウイルスを含む。アデノウイルスは、腫瘍崩壊性ウイルス用として探求されているウイルスの１つである。網膜芽細胞腫（Ｒｂ）腫瘍抑制遺伝子経路機能は、Ｒｂの直接突然変異によって、ＣＤＫ阻害剤ｐ１６機能の喪失（例えば、突然変異／メチル化による）によって、またはＣＤＫ／サイクリンの増幅によって、ほとんど全てのヒトがんで失われる。正常な非分裂細胞では、Ｒｂは低リン酸化されたままであり、その標的プロモーターの位置で転写因子Ｅ２Ｆに結合し、Ｅ２Ｆトランス活性化ドメインをマスキングすることによって、ならびにクロマチン－リモデリング複合体およびヒストン改変活性を動員することによって転写を抑制する。細胞周期のＧ１～Ｓ移行の間、ＣＤＫは、Ｅ２Ｆ抑制を軽減するＲｂをリン酸化する。アデノウイルスは、Ｒｂ腫瘍抑制遺伝子経路を不活性化して、細胞を強制的に複製させ、ウイルスのゲノムを併存して再生させる、初期ウイルス腫瘍性タンパク質を発現する。アデノウイルスＥ１Ａは、一部ＬＸＣＸＥモチーフを通してＲｂに結合し、その腫瘍抑制遺伝子活性を脱調節する。したがって、Ｅ１ＡでＬＸＣＸＥモチーフを欠失させることはＲｂ不活性化を排除し、選択的に複製するウイルス（ＯＮＹＸ－８３８）を作製するだろうと提案された。しかし、Johnson
ら（Cancer Cell、１巻（４号）：３２５～３３７頁、２００２年）は、Ａｄ Ｅ１Ａ ＬＸＣＸＥ突然変異が、Ｓ期侵入、ウイルスＤＮＡ複製および後期タンパク質発現を阻止するのに十分でなかったという証拠を提供し、本明細書に記載される実験からの結果と一貫した。Ｅ１Ａ突然変異体のＲｂ選択性が論争の的であるとしても、この突然変異は、悪性の脳腫瘍のための第ＩＩ相臨床治験に進んでいる腫瘍崩壊性ウイルス（ＤＮＸ－２４０１）のための根拠として提案されている。より高いＲｂ選択性を達成しようとして、アデノウイルスＥ１およびＥ４領域のためのプロモーターをＥ２Ｆプロモーターと置き換え、ＯＮＹＸ－４１１を生産するためにそれをＥ１ＡΔＬＸＣＸＥモチーフと組み合わせたアデノウイルスを生産した（Johnsonら、Cancer Cell、１巻（４号）：３２５～３３７頁
、２００２年；およびDubenskyら、Cancer Cell、１巻（４号）：３０７～３０９頁、２００２年）。これらのウイルスを試験するために、腫瘍および一次ヒト細胞を野生型ウイルス、ＯＮＹＸ－８３８（Ｅ１ＡΔＬＸＣＸＥ）またはＯＮＹＸ－４１１に感染させ、感染後の様々な時点で回収した。ＯＮＹＸ－８３８は、腫瘍および一次肺上皮細胞で無差別に複製した。Ｅ１ＡΔＬＸＣＸＥをアデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１ＢおよびＥ４領域の細胞性Ｅ２Ｆコントロールと組み合わせたＯＮＹＸ－４１１は、正常細胞に対して腫瘍細胞で選択的複製を実証した（Johnsonら、Cancer Cell１巻（４号）：３２５～３３７頁、２
００２年）。しかし、Ｅ２Ｆプロモーターは組換えをもたらし、さらに腫瘍細胞において複製を野生型ウイルスレベルに制限した。

【0270】

本明細書に記載されるように、Ｅ１ＡによるＲｂ抑制からのＥ２Ｆ放出と独立して、細胞性およびＡｄプロモーターでＥ２Ｆタンパク質をさらに安定させる、別のＡｄタンパク質、Ｅ４ｏｒｆ６／７がある。一緒に、Ｅ１ＡおよびＥ４ｏｒｆ６／７はＥ２Ｆ媒介転写を駆動し、Ｓ期開始を引き起こし、ウイルスＤＮＡゲノムを併存して増殖させる。したがって、機能的Ｒｂが欠如している腫瘍細胞のための選択的腫瘍崩壊性ウイルス療法である、Ｅ１Ａ改変、Ｅ４ｏｒｆ１改変および／またはＥ４ｏｒｆ６／７改変を有する組換えアデノウイルスが、本明細書で提供される。具体的には、それらが一次細胞でなく腫瘍細胞で選択的に複製するかどうか判定するために、Ｅ１Ａ／Ｅ４ｏｒｆ１／Ｅ４ｏｒｆ６／７での化合物突然変異を工学的に操作した。これらの突然変異の組合せは、がんのための有効で自己増幅性の療法をもたらすと提案されている。

【0271】

正常の（非腫瘍）細胞および腫瘍細胞でこれらのウイルスを試験するために、細胞を、模擬感染させたか、またはＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２（野生型）、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１（Ｅ１ＡΔＬＸＣＸＥ／ΔＥ４ｏｒｆ６／７）、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８９（Ｅ１ＡΔＬＸＣＸＥ）またはＯＮＹＸ－８３８（Ｅ１ＡΔＣＲ２）に感染させた。ＯＮＹＸ－８３８は、Ｅ１ＡのＣＲ２ドメインにあるΔＬＸＣＸＥも欠如している。静止期のヒト一次小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）（非腫瘍細胞）を、ＭＯＩ １０で感染させた。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２は、感染の後期にＥ１Ａレベルの予想された低下を示した（図１Ａ）。同様に、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８９またはＯＮＹＸ－８３８感染細胞では、感染の後期にＥ１Ａレベルの低下がある。しかし、初期の時点では、Ｅ１Ａの発現は、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２感染細胞でのＥ１Ａの発現より大きい。対照的に、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１は感染全期間でＥ１Ａのより強く連続した発現を示し、そのことはアデノウイルス生活環を通した進行の失敗を指し示す。コンフルエント肺腺癌（Ａ５４９）細胞（腫瘍細胞）を、ＭＯＩ ３０で感染させた。全ての感染は、感染の後期にＥ１Ａレベルの予想された低下をもたらし、典型的なアデノウイルス生活環進行を指し示す（図１Ｂ）。

【0272】

突然変異体アデノウイルスによるＳＡＥＣまたはＡ５４９細胞の感染後の後期アデノウイルスタンパク質および細胞サイクリンタンパク質発現を、図２Ａ（ＳＡＥＣ）および図２Ｂ（Ａ５４９細胞）に示す。野生型ウイルスおよびＥ１Ａ突然変異だけを有するウイルスと対照的に、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１は、ＳＡＥＣでＥ２Ｆ依存性細胞周期標的、Ｓ相のサイクリンＡおよびサイクリンＢを活性化することができなかった。さらに、Ｅ４ｏｒｆ６／７突然変異を有するＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１およびＡｄＳｙｎ－ＣＯ２１０は、ＳＡＥＣでの後期タンパク質の発現および複製に欠陥があった。これらの欠陥の両方とも、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２１０においてはより低い程度で明らかだった。感染一次細胞と対照的に、Ａ５４９細胞で後期構造タンパク質の発現に明らかな欠陥はなく、サイクリンＡおよびサイクリンＢは全ての感染Ａ５４９試料にまだ存在していた。

【0273】

感染したＳＡＥＣおよびＡ５４９細胞のＤＮＡ複製を、図３Ａおよび３Ｂに示す。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１感染はＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２と比較してＳＡＥＣで大きなＤＮＡ複製欠陥を示し、それはウイルス複製の減少とリンクしている。この時点で、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２１０感染ＳＡＥＣでも軽度の欠陥が明らかだった。Ａ５４９細胞では、いかなる突然変異体ウイルス感染でもＤＮＡ複製欠陥は明らかでなかった。

【0274】

図４Ａ～４Ｂは、感染したＳＡＥＣおよびＡ５４９細胞からのアデノウイルスバーストを示す。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１およびＡｄＳｙｎ－ＣＯ２１０感染は両方とも、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２と比較してＳＡＥＣで大きな複製欠陥を明らかにした（図４Ａ）。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２１０を除いては、Ａ５４９細胞でウイルス複製の欠陥はなかった（図４Ｂ）。

【0275】

図５Ａ～５Ｂは、感染から７日後の感染したＳＡＥＣおよびＡ５４９の細胞生存性を示す。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２と比較して、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１はＳＡＥＣで細胞殺滅能力の低下を示した。図５Ｂに示すように、試験した突然変異体ウイルスの中では、Ａ５４９細胞において野生型ウイルスと比較して細胞殺滅の欠陥はなかった。

【0276】

正常ヒト星状神経膠細胞（ＮＨＡ）（図６Ａ～６Ｃ）、神経膠芽腫Ｕ８７細胞（図７Ａ～７Ｃ）、神経膠芽腫Ｕ８７細胞（図８Ａ～８Ｃ）およびＩＭＲ９０細胞（図９Ａ～９Ｃ）でも、組換えウイルスを試験した。ＮＨＡでは、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１はサイクリンＡを誘導せず、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２と比較して遅く、減少した後期ウイルスタンパク質発現を実証し、そのことは複製欠損を指し示す（図６Ａ）。さらに、感染性粒子の数（図６Ｂ）およびＤＮＡ含有量（図６Ｃ）によって測定されるように、野生型ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１０２と比較して、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１はＮＨＡで減弱した感染を示した。ＮＨＡ細胞と対照的に、突然変異体アデノウイルスは、神経膠芽腫Ｕ８７細胞（図７Ａ～７Ｃ）でも神経膠芽腫Ｕ１１８細胞（図８Ａ～８Ｃ）でも複製欠陥を実証しなかった。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１は、ＩＭＲ９０細胞で軽度の複製欠陥を示した（図９Ａ～９Ｃ）。

【0277】

したがって、上記のデータは、カプシドタンパク質発現の欠如、Ｅ２Ｆ標的遺伝子（サイクリンＡおよびＢ）の誘導失敗、Ｓ相侵入およびウイルス複製誘発の失敗によって証明されるように、野生型およびＥ１ＡΔＣＲ２ウイルスと対照的に、Ｅ１ＡΔＣＲ２／ΔＥ４ｏｒｆ６／７ならびにΔＥ４ｏｒｆ６／７ウイルスも、一次細胞で不十分に複製することを示す。対照的に、これらのウイルスは、Ａ５４９細胞および一群の腫瘍細胞系で野生型ウイルスレベルまで複製する。したがって、本明細書に開示される組換えアデノウイルスは、選択的がん治療剤である。

【0278】

Ｅ４ｏｒｆ１に突然変異を含む突然変異体アデノウイルスのより大きなセットの複製特異性の結果（表１を参照）を図１０～１５に示し、図１６で要約する。図１０は、感染から１０日後の感染した一次正常ヒト星状神経膠細胞（ＮＨＡ）の細胞生存性を示すグラフである。図１１は、感染から９日後の感染した静止期の正常小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ－ｈＴＥＲＴ）の細胞生存性を示すグラフである。図１２は、感染から１０日後の感染した増殖期のＳＡＥＣ－ｈＴＥＲＴ細胞の細胞生存性を示すグラフである。図１３は、感染から７日後の感染したヒト肺腺癌細胞（Ａ５４９）の細胞生存性を示すグラフである。図１４は、感染から７日後の感染したヒト乳がん細胞（ＭＤＡ ＭＢ２３１）の細胞生存性を示すグラフである。図１５は、感染から７日後の感染神経膠芽腫（Ｕ８７）の細胞生存性を示すグラフである。図１６は、感染から７日後の、感染した一次ＮＨＡ、ＳＡＥＣ－ｈＴＥＲＴ（静止期）、ＳＡＥＣ－ｈＴＥＲＴ（増殖期）、Ａ５４９、ＭＤＡ ＭＢ２３１およびＵ８７細胞の細胞生存性アッセイの定量化を示すヒートマップ表である。さらに、図１７は、感染したＵ２ＯＳおよびＳａＯＳ２細胞の細胞生存性アッセイの定量化を示す表を提供する。Ｕ２ＯＳおよびＳａＯＳ２細胞は両方とも、骨癌細胞である。しかし、ｐ５３およびＲｂはＵ２ＯＳ細胞で機能的であり、ＳａＯＳ２細胞では突然変異している。突然変異体ウイルスがＲｂに欠陥のある腫瘍細胞で選択的に複製することを、この結果は実証する。

【0279】

これらのデータは、Ｅ１Ａ、Ｅ４ｏｒｆ１および／またはＥ４ｏｒｆ６／７の様々な改変の組合せが、欠陥のあるＲｂ腫瘍抑制遺伝子経路を有するがん細胞で特異的に複製する選択的腫瘍崩壊性アデノウイルスをもたらすことを示す。
（実施例２）
Ｅ１、Ｌ３、Ｅ３および／またはＥ４に改変を有する腫瘍崩壊性アデノウイルス

【0280】

この実施例は、腫瘍選択性を有する追加の組換えアデノウイルスを記載する。例示的な組換えウイルスは表２に掲載され、これらのウイルスのゲノム配列は配列番号２５～３１に示す。

【表2】

【0281】

ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１２、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１３およびＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５は、ラパマイシンおよび／またはラパログ（ＡＰ２１９６７）依存性のＥＦＧＲ標的化ウイルスである（この標的化方法の記載については、参照により本明細書にその全体が組み込まれる、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１３／１３８５０５を参照）。これらの組換えウイルスの各々は、Ｅ３－ＲＩＤα／βおよびＥ３－１４．７ｋコード配列の欠失、ならびにＥＧＦＲＶＨＨ－ＦＫＢＰ融合タンパク質およびＦＲＢ^＊－繊維（ラパマイシンまたはラパログに結合することができる突然変異体ＦＲＢに融合したＡｄ５繊維）またはＦＲＢ－繊維（ラパマイシンだけに結合することができる野生型ＦＲＢに融合したＡｄ５繊維）のいずれかの挿入を含む。ＦＫＢＰ融合タンパク質でなく、ラパマイシン／ラパログ依存性再標的化のために必要とされるだろうＦＲＢ^＊－繊維をそれが発現するので、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ４４２は実験的コントロールウイルスとして使用することができる。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５およびＡｄＳｙｎ－ＣＯ４４２は、ヘキソンタンパク質にＥ４５１Ｑ突然変異も含む。この突然変異は、肝臓から組換えウイルスを脱標的化する。

【0282】

図１８Ａは、ＦＲＢドメインとラパマイシンおよびＦＫＢＰ１２との結合界面を示す。図１８Ｂは、ＡＰ２１９６７でなくラパマイシンの存在下で、ＦＲＢ－繊維を有するＥＧＦＲ標的化ウイルス（ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０５；配列番号８８）が、ＭＤＡ ＭＢ４５３乳がん細胞の改善された形質導入を有し、一方、ラパマイシンまたはＡＰ２１９６７のいずれかの存在下で、ＦＲＢ^＊－繊維を有するＥＧＦＲ標的化ウイルス（ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２２０；配列番号９８）が、ＭＤＡ ＭＢ４５３細胞の改善された形質導入を有することを示すグラフである。図１８Ｃは、その標的ｐ７０ Ｓ６Ｋのリン酸化をブロックするｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンの活性を示すイムノブロットである。ラパマイシン相同体ＡＰ２１９６７は、標的化濃度でｍＴＯＲを阻害しない。

【0283】

ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１２は、ＨＳ５７８Ｔ転移性乳がん細胞で試験した。感染から２４、４８、７２および９６時間後に、新鮮なラパマイシンまたはＡＰ２１９６７を５０ｎＭまで追加した。代謝活性をＷＳＴ－１アッセイによって数量化し、マッチする薬物治療の非感染細胞に正規化させた。図１８Ｄに示すように、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１２による感染は、標的化のない場合と比較して、ラパマイシンかＡＰ２１９６７を受けるＥＧＦＲ標的化腫瘍崩壊性ウイルスに感染した細胞の細胞殺滅の増大をもたらした。感染から９日後のＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１３感染ＨＳ５７８Ｔ転移性乳がん細胞の細胞生存性を、図１８Ｅに示す。細胞を、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１３の系列希釈に感染させた。感染から２４、４８、７２および９６時間後に、新鮮なラパマイシンを５０ｎＭまで追加した。代謝活性をＷＳＴ－１アッセイによって数量化し、マッチさせた薬物治療の非感染細胞に正規化させた。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１３はＥ１ＡΔＬＸＣＸＥ、ΔＥ４ｏｒｆ６／７、ΔＥ３－ＲＩＤα／β、ΔＥ３－１４．７ｋの腫瘍崩壊性突然変異を有し、ラパマイシン依存性のＥＧＦＲ標的化遺伝子ＥＧＦＲＶＨＨ－ＦＫＢＰおよびＦＲＢ－繊維を発現する。標的化なしにラパマイシンを受けるＥＧＦＲ標的化腫瘍崩壊性ウイルスに感染した細胞で、殺滅の増大がある。

【0284】

ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１３は、ＨＳ５７８Ｔ皮下異種移植を有するマウスで評価した。確立された腫瘍を有するマウスはＡｄＳｙｎ－ＣＯ３１３の腫瘍内注射を受け、その後、定期的な腹腔内８ｍｇ／ｋｇラパマイシン注射（ｎ＝５）もしくはビヒクル対照（ｎ＝４）を受けたか、または、それらは腫瘍内ビヒクル対照を受け、その後、定期的な腹腔内８ｍｇ／ｋｇラパマイシン注射（ｎ＝５）もしくはビヒクル対照（ｎ＝４）を受けた。最初の感染の１９日後に開始して、４日ごとにさらに３回、同じ群で感染を繰り返した。図１９に示すように、ラパマイシンとＥＧＦＲ標的化腫瘍崩壊性ウイルスを受けたマウスでの腫瘍は、最良の応答を示した。

【0285】

ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５は、ヘキソンＥ４５１Ｑ突然変異によって肝臓取込みを回避するカプシドを特徴として有する腫瘍崩壊性ウイルスであり、ラパマイシンまたはラパログＡＰ２１９６７の存在下でＥＧＦＲを通して細胞に感染するように標的化することができる。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５の腫瘍崩壊活性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで試験した。ＨＳ５７８Ｔ細胞を、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５の系列希釈に感染させた。感染から２４、４８、７２および９６時間後に、新鮮なラパマイシンまたはＡＰ２１９６７を５０ｎＭまで追加した。代謝活性をＷＳＴ－１アッセイによって数量化し、マッチさせた薬物治療の非感染細胞に正規化させた。図２０に示すように、標的化なしの感染細胞と比較して、ラパマイシンまたはＡＰ２１９６７を受けるＥＧＦＲ標的化腫瘍崩壊性ウイルスに感染した細胞で、殺滅の増大がある。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５をｉｎ ｖｉｖｏで評価するために、ＨＳ５７８Ｔ皮下異種移植をマウスで確立した。確立された腫瘍を有するマウスは、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５の３回の腫瘍内注射を４日ごとに受け、その後、腹腔内の２もしくは８ｍｇ／ｋｇラパマイシン注射（それぞれｎ＝８およびｎ＝８）を隔日に、またはビヒクル対照を（ｎ＝６）隔日に受け；または、それらはＡｄＳｙｎ－ＣＯ４４２の３回の腫瘍内注射を４日ごとに受け、その後腹腔内の２もしくは８ｍｇ／ｋｇラパマイシン注射（それぞれｎ＝６およびｎ＝６）を隔日に受け；または、それらはビヒクル対照の３回の腫瘍内注射を４日ごとに受け、その後腹腔内の２もしくは８ｍｇ／ｋｇラパマイシン注射（それぞれｎ＝６およびｎ＝６）を隔日に受けた。図２１Ａ～２１Ｄに示すように、８ｍｇ／ｋｇラパマイシンとＥＧＦＲ標的化腫瘍崩壊性ウイルスを受けたマウスでの腫瘍は、最も有意な応答を示す。

【0286】

ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１９９、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２００およびＡｄＳｙｎ－ＣＯ１７１は、Ｅ１Ａの欠失を有し、またＥＦ１αプロモーター（ＥＦ１α－ルシフェラーゼ）によって駆動されるルシフェラーゼをコードする、組換えリポーターウイルスである。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２００およびＡｄＳｙｎ－ＣＯ１７１は、肝臓でウイルス遺伝子の発現を阻害するために、Ｅ１Ａの３’－ＵＴＲにｍｉＲ－１２２（肝臓特異的マイクロＲＮＡ）のための２つの結合部位も含む。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１７１は、ヘキソンタンパク質に肝臓脱標的化Ｅ４５１Ｑ突然変異をさらにコードする。

【0287】

図２２Ａ～２２Ｃは、肝臓でのアデノウイルス媒介遺伝子発現の排除および肝臓へのアデノウイルス感染の脱標的化を示す。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１９９は、全身感染の後、肝臓で排他的に高レベルのルシフェラーゼを発現した（図２２Ａ）。図２２Ｂに示すように、肝臓特異的マイクロＲＮＡ ｍｉＲ１２２がルシフェラーゼ発現を排除することを除いて、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１９９に対応するウイルス、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２００にマウスが全身感染するときに、ルシフェラーゼシグナルは失われる。図２２Ｃに示すように、アデノウイルスヘキソンタンパク質が、それを肝臓から脱標的化する突然変異Ｅ４５１Ｑを有することを除いて、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２００に対応するウイルス、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１７１にマウスが全身感染するとき、ルシフェラーゼの発現を脾臓で検出することができる。これらのデータは、ＡｄＥ１遺伝子の肝臓発現、および必然的に肝細胞での複製を阻止するための、このゲノムモジュール改変の使用を立証する。
（実施例３）
キメラ繊維タンパク質を発現する組換えアデノウイルス

【0288】

この実施例は、特異的細胞型に感染を導くキメラ繊維タンパク質を発現する組換えアデノウイルスを記載する。

【0289】

Ａｄ５および多くの他の血清型の繊維タンパク質が細胞付着のためにコクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）に結合することが示されたが、他の血清型はＣＤ４６、デスモグレイン２、シアリン酸または他を使用することが示された。Ａｄｓｅｍｂｌｙ／ＡｄＳＬＩＣ（参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／０２４３５１を参照）はキメラウイルスの迅速な作製を可能にするので、様々な血清型の代わりの細胞標的化能力を検討するために、６つの繊維キメラウイルスの最初の群を生産した。繊維タンパク質のＣ末端の球状ノブは一般的に受容体結合の役割を担うので、Ａｄ３、Ａｄ９、Ａｄ１１、Ａｄ１２またはＡｄ３４からの繊維ノブでＡｄ５繊維ノブを置き換えることによって、キメラを作製した（図２３Ａ～２３Ｃ；表３）。Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ欠失およびＥＦ１αプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼ－ＧＦＰ融合を含有する同じＥ１モジュールで、各ウイルスを作製した。１７個の異なる腫瘍細胞系、一次気道細胞およびＨ９幹細胞系を形質導入するためにこの群を使用し、ルシフェラーゼ発現を各細胞型で測定した（図２３Ｄ）。Ａｄ３、Ａｄ１１またはＡｄ３４を有するキメラを使用したとき、Ａｄ５繊維と比較して、有意により高いルシフェラーゼ－ＧＦＰ発現がほとんど全ての細胞で観察された（図２３Ｄおよび２３Ｅ）。反対に、Ａｄ９またはＡｄ１２繊維キメラで形質導入された細胞では、ルシフェラーゼ－ＧＦＰ発現はほとんど普遍的により低かった。これらのデータは、Ａｄ５をベースとしたベクターを改善し、特異的細胞型への侵入のために組換えウイルスを最適化するために、他の血清型からの改変されたパーツを組み合わせることのできる能力の強力な使用を実証する。

【表3】

【0290】

（実施例４）
カプシド交換組換えアデノウイルス
この実施例は、カプシド交換キメラアデノウイルスを作製するためのモジュール改変を記載する。この実施例で記載される組換えアデノウイルスは、既存の中和抗体を回避するように設計されている。

【0291】

ヒト集団でそれらを既存の抗体に「見えなく」させて反復接種Ａｄｓｅｍｂｌｙ／ＡｄＳＬＩＣを可能にする、完全な「カプシド」モジュール交換（ゲノムのほぼ６０％）を有するＡｄ５をベースとしたウイルスを、アデノウイルスゲノムに存在するモジュラリティーを利用するように設計した。このモジュラリティーの最も確固とした試験は、１つの血清型の完全なモジュールを別の血清型の完全なモジュールと組み合わせることにあるだろう。この可能性は、Ａｄ５のＥ１、Ｅ３およびＥ４モジュールを他の血清型のコアモジュール（すなわち、Ｅ２Ｂ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｅ２ＡおよびＬ４；図２４Ａを参照）と組み合わせることによって検査した。これは、中和Ａｄ５抗体を回避することができるが、さらに腫瘍崩壊性ウイルスの作製で頻繁に突然変異するＡｄ５のよく特徴付けられた非構造的遺伝子を維持することができるウイルスを生産する。ＡｄＳＬＩＣは、Ａｄ３、Ａｄ９、Ａｄ１１、Ａｄ１２、Ａｄ３４またはマウスアデノウイルス１（ＭＡＶ－１）のコアモジュールをＡｄ５のＥ１、Ｅ３およびＥ４モジュールと含有したウイルスを生産するために使用された（図２４Ｂおよび表４）。さらに、Ａｄ５のｐＩＸコード領域を対応するコア血清型からのそれで置き換えるために、Ａｄ５ Ｅ１モジュールを変更し、Ｕｅｘｏｎおよび繊維コード領域を対応するコア血清型からのそれで置き換えるために、Ａｄ５ Ｅ３モジュールを変更した。したがって、カプシド構成成分の全ては１つの血清型からのものであり、ゲノムのＥ１、Ｅ３およびＥ４領域はＡｄ５からのものであった。作製された６つのキメラのうちの４つは、２９３－Ｅ４細胞で生存能力のあるウイルスを生成することができた。Ａｄ５とＡｄ３、Ａｄ９、Ａｄ１１またはＡｄ３４の間のキメラは全て複製したが、Ａｄ５／Ａｄ１２またはＡｄ５／ＭＡＶ－１キメラは、コア血清型のＩＴＲおよびパッケージング配列（Ψ）を含むようにさらに改変した後でさえ複製しなかった（図２４Ｂ）。したがって、これらの「カプシド交換」アデノウイルスキメラを生産する能力は、血清型によって異なる。

【表4-1】

【表4-2】

【0292】

生存能力のあるカプシド交換キメラウイルスの複製および遺伝子発現を、その後分析した。精製したカプシド交換粒子は、対応するコアモジュールを有する野生型アデノウイルス血清型と同じ総タンパク含有量を示した（図２５Ａ）。大多数の中和抗体の標的であるヘキソンタンパク質は、他の血清型でもカプシド交換ウイルスでも、Ａｄ５粒子に向けて生産されたポリクローナルウサギ抗血清によって認識されなかった（図２５Ａ）。ＶおよびＶＩなどのカプシドの内部に見出される他の構造タンパク質は、多少の交差反応性を実際、示した（図２５Ａ）。感染した細胞のウェスタンブロット分析は、Ａｄ５／Ａｄ３、Ａｄ５／Ａｄ１１およびＡｄ５／Ａｄ３４キメラについて、交差反応後期タンパク質および１００Ｋの発現が、Ａ５４９細胞では野生型Ａｄ３、Ａｄ１１およびＡｄ３４に等しく、一方Ｕ２ＯＳ細胞ではわずかにより高いことを示した（図２５Ｂ、２５Ｄおよび２５Ｅ）。全てのウイルスでＡｄ５に由来するＥ１Ａの発現は、これらの３つのキメラで野生型Ａｄ５より有意に高かったが、その理由は、おそらくＡｄ５より改善された細胞侵入のためである（図２５Ｂ、２５Ｄおよび２５Ｅおよび図２３Ｄ）。反対に、Ａｄ５／Ａｄ９カプシド交換キメラは、このＭＯＩで不良な遺伝子発現を示し、野生型Ａｄ９（後期タンパク質の場合）よりわずかに悪く、野生型Ａｄ５（Ｅ１Ａの場合）より悪かった（図２５Ｃ）。

【0293】

カプシド交換キメラウイルスが、Ａｄ５中和抗体を含有するヒト血清試料で抗体中和を回避することができるかどうかについて、次に調べた。ＷＳＴ－１細胞生存性アッセイを使用して測定したときに、Ａ５４９細胞のＡｄ５殺滅を中和することができたヒト血清試料を特定した。Ａｄ５またはカプシド交換キメラとのこれらの血清試料のインキュベーションの結果、Ａｄ５による細胞殺滅は阻害されたがカプシド交換ウイルスによる殺滅は影響されなかった（図２６Ａ～２６Ｃ）。これらのデータは、カプシド交換キメラウイルスがヒト試料で一般的に見出される既存のＡｄ５抗体を回避することが可能であること、およびＡｄ５非構造的構成成分および非Ａｄ５構造的構成成分の発現で複製が可能なことを実証する。したがって、有益な特質を有する新規ウイルスを作製するために、Ａｄｓｅｍｂｌｙ／ＡｄＳＬＩＣを使用して、アデノウイルスゲノムの中で観察される天然のモジュラリティーを活用することができる。

【0294】

上記のように、ヒト集団のかなりの百分率がＡｄ５および一部の他の一般的なアデノウイルス血清型に対して既存の抗体を有する。１６個のヒト血清試料の分析は、１６個の試料のうちの９つがＡｄ５に対する中和抗体を含有することを実証した。したがって、既存の中和抗体の回避を可能にするカプシド交換を有する腫瘍崩壊性ウイルスを開発した。Ｅ１Ａ（ΔＬＸＣＸＥ）およびＥ４（ΔＥ４ｏｒｆ６／７）に腫瘍崩壊性突然変異を含む、４つの組換えカプシド交換アデノウイルスを生産した。これらの突然変異は、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１８１に存在するのと同じ腫瘍崩壊性突然変異である。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１５９Ｘ（配列番号９３）、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ－１６７Ｘ（配列番号９４）、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０１Ｘ（配列番号９５）およびＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０２Ｘ（配列番号９６）は、それぞれＡｄ１１、Ａｄ９、Ａｄ３およびＡｄ３４からの構造タンパク質を含有する。
（実施例５）
改変されたまたはキメラの繊維タンパク質、またはカプシド突然変異または血清型交換を組み合わせた組換え腫瘍崩壊性アデノウイルス

【0295】

この実施例は、腫瘍選択性を有する、および／または特異的細胞型に感染を導く突然変異もしくはキメラの繊維タンパク質を発現する、追加の組換えアデノウイルス、および／または既存の中和抗体を回避するように設計されたカプシドが改変もしくは交換されたキメラアデノウイルスを記載する。例示的な組換えウイルスは表５に掲載され、これらのウイルスのゲノム配列は配列番号８２～８７に示す。

【表5】

【0296】

本明細書に開示される組換えアデノウイルス（表１～４を参照）は、特異的細胞型に感染を導くのに、および既存の中和抗体を回避するのに有利になることができる改変を各々有する。腫瘍崩壊性ウイルス療法の効能を増強するために、実施例１に記載されるＥ１およびＥ４突然変異を他のモジュールと組み合わせることができる。

【0297】

キメラ繊維と一緒にＥ１、コアおよびＥ４突然変異を有する組換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの例は、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ５０７、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ５０８およびＡｄＳｙｎ－ＣＯ５０９であり、それらは、それぞれＡｄ３４、Ａｄ１１およびＡｄ３７繊維タンパク質のノブドメインを使用する。

【0298】

Ａｄ３４カプシド交換と一緒にＥ１およびＥ４突然変異を有する組換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの１つの例は、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ５１０である。

【0299】

ＲＧＥへのインテグリン結合性ＲＧＤモチーフの突然変異を有するカプシドタンパク質ペントンと一緒にＥ１、Ｅ３およびＥ４突然変異を有する、ラパマイシン／ラパログ誘導ＥＧＦＲ標的化腫瘍崩壊性アデノウイルスの一例は、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ５１１である。このペントン突然変異は脾臓でのウイルスの取込みを低減し、抗ウイルス性炎症性応答を弱めることが示されている。

【0300】

繊維タンパク質へのＲＧＤペプチドの挿入と一緒にＥ１およびＥ４突然変異を有する組換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの一例は、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ５１２である。繊維タンパク質でのＲＧＤ挿入は、血管内皮細胞を含むより広い種類の細胞型への感染を劇的に増加させることが示された。
（実施例６）
Ａｄ５および他のアデノウイルス血清型に由来する腫瘍崩壊性アデノウイルス

【0301】

本明細書に開示される腫瘍崩壊性アデノウイルス（表１～５を参照）は、Ａｄ５ベクターを使用して開発された。しかし、アデノウイルス複製にとって重要であるいくつかのゲノム領域（およびこれらの領域によってコードされるタンパク質）は、アデノウイルス血清型の間で高度に保存されている。したがって、本明細書に開示される組換えアデノウイルスは、任意の所望のアデノウイルス血清型からのゲノム配列を使用して生産することができる。特に、Ｅ１ＡおよびＥ４ｏｒｆ６／７タンパク質は、全てのヒトアデノウイルス種の間で保存されている。図２７は、種Ａ（Ａｄ１２）、種Ｂ（Ａｄ７）、種Ｃ（Ａｄ２およびＡｄ５）、種Ｄ（Ａｄ９）、種Ｅ（Ａｄ４）、種Ｆ（Ａｄ４０）および種Ｇ（Ａｄ５２）のアデノウイルスからのＥ１Ａタンパク質のアラインメントを示す。同様に、図２８は、種Ａ（Ａｄ１２）、種Ｂ（Ａｄ７）、種Ｃ（Ａｄ２およびＡｄ５）、種Ｄ（Ａｄ９）、種Ｅ（Ａｄ４）および種Ｇ（Ａｄ５２）のアデノウイルスからのＥ４ｏｒｆ６／７タンパク質のアラインメントを示す。図２７および２８に示す配列、または公開データベースで利用できる任意の他のアデノウイルス配列を使用することによって、腫瘍崩壊性アデノウイルスの生産において任意のアデノウイルス血清型からのＥ１Ａおよび／またはＥ４ｏｒｆ６／７配列を容易に使用することができる。
（実施例７）
ＥＧＦＲ標的化構成成分を有する組換えアデノウイルスの特徴付け

【0302】

この実施例は、ＥＧＦＲを発現する細胞を標的にする合成アデノウイルスを記載し、組換えウイルスが改変の結果として２９３－Ｅ４細胞で複製が害されないことを確認する。以下の合成アデノウイルスを生産し、この研究で使用した：
ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１７０（配列番号９１）

【0303】

「Ａｄｓｅｍｂｌｙ」、アデノウイルスゲノムモジュールからの多部位Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ組換え反応を使用して構築された野生型アデノウイルス。ゲノムのアデノウイルスモジュールの間に３つの組換え部位が依然としてある－Ｅ１Ｂ－５５ＫとｐＩＸ遺伝子の間のａｔｔＢ４組換え部位；Ｌ４－３３ＫとｐＶＩＩＩ遺伝子の間のａｔｔＢ５部位；および繊維とＥ４遺伝子の間のａｔｔＢ３部位。この組換えアデノウイルスは、対照ウイルスとして働いた。
ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０５（配列番号８８）

【0304】

ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１７０に対応するＡｄｓｅｍｂｌｙにそれによって作製されたが、ＥＧＦＲを発現する細胞を感染させるラパマイシン依存性標的化を可能にする追加機能を有する組換えアデノウイルス。ｍＴＯＲからのＦＲＢドメインをコードする配列が、アデノウイルス繊維のノブドメイン中のＨＩループに挿入される。Ｅ３－ＲＩＤα、Ｅ３－ＲＩＤβおよびＥ３－１４．７Ｋの遺伝子が削除され、ＦＫＢＰ１２に融合したＥＧＦＲ結合性単一ドメイン抗体（ＥＧＦＲＶＨＨ）をコードする遺伝子で置き換えられた。ラパマイシンの存在下で、可溶性ＥＧＦＲＶＨＨ－ＦＫＢＰ融合タンパク質は、繊維中のＦＲＢドメインとヘテロダイマーを形成し、成熟アデノウイルス粒子が新しい細胞の上のＥＧＦＲに結合して、この新しい受容体を通して感染させることを可能にする。
ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０６（配列番号８９）

【0305】

この組換えアデノウイルスは、それが野生型繊維を有し、したがってＦＲＢドメインが欠如していること以外はＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０５と同一である。このウイルスは、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０５について記載したように、Ｅ３－ＲＩＤα、Ｅ３－ＲＩＤβおよびＥ３－１４．７Ｋの遺伝子の欠失、ならびにＦＫＢＰ１２に融合したＥＧＦＲ結合性単一ドメイン抗体（ＥＧＦＲＶＨＨ）をコードする遺伝子による置き換えを特徴とする。
ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０７（配列番号９０）

【0306】

この組換えアデノウイルスは、それが野生型Ｅ３領域を有し、したがってＥＧＦＲＶＨＨ－ＦＫＢＰ融合が欠如していること以外はＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０５と同一である。それは、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０５について記載したように、繊維へのＦＲＢ挿入を特徴とする。
ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２２０（配列番号９８）

【0307】

この組換えアデノウイルスは、それがＦＲＢドメインにＴ２０９８Ｌ突然変異を有する（ＦＲＢ^＊）こと以外はＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０５と同一であり、それは、ラパマイシンまたはＡＰ２１９６７によるＥＧＦＲ標的化を可能にする。

【0308】

ラパマイシン制御ＥＧＦＲ標的化ウイルスＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０５は、感染のマーカーとしてＥ１Ａに融合したＧＦＰリポーターを含有する。Ｅ３Ｂ転写物は、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋを削除することによって改変し、ＥＧＦＲＶＨＨ－ＦＫＢＰを発現させるために使用した。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０６はＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０５の全ての改変を有するが野生型繊維を保持し、したがって、ＦＲＢドメインを有しない。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０７はＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０６の全ての改変を含有するが野生型Ｅ３領域を保持し、したがって、ＦＫＢＰ融合遺伝子を有しない。

【0309】

組換えウイルスによるＡｄ５後期タンパク質発現を評価するために、２９３－Ｅ４細胞を、「野生型」対照ウイルスＡｄＳｙｎ－ＣＯ１７０、ラパマイシン依存性のＥＧＦＲ標的化改変ウイルスＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０５または対照ウイルスＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０６またはＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０７に、１０のＭＯＩで感染させた。図２９は、感染した２９３－Ｅ４細胞の溶解物からのタンパク質発現のイムノブロットを示す。繊維の移動の変化は、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０７およびＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０５での９０アミノ酸ＦＲＢドメインの挿入を示す。ＥＧＦＲＶＨＨ－ＦＫＢＰ融合タンパク質の発現は、ＦＫＢＰ１２のプローブすることによって検出された。後期タンパク質発現の時間経過は、Ａｄｓｅｍｂｌｙ野生型ＡｄＳｙｎ－ＣＯ１７０と比較して、カプシド突然変異体またはＧＦＰ－Ｅ１Ａリポーターを有するＥＧＦＲＶＨＨ－ＦＫＢＰ発現ウイルスの複製で顕著な欠陥がないことを示す。
（実施例８）
ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５のラパマイシン誘導ＥＧＦＲ標的化は、マウスでＨＳ５７８Ｔ異種移植の腫瘍崩壊性療法の効能を増加させる

【0310】

この実施例は、組換えアデノウイルスのラパマイシン依存性のＥＧＦＲ再標的化がＥＧＦＲ発現腫瘍異種移植の腫瘍体積を有意に低減するとの知見を記載する。
マウスおよび腫瘍

【0311】

ＨＳ５７８Ｔ（ＡＴＣＣ－ＨＴＢ－１２６；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＣＡ）乳がん細胞を、供給業者によって推奨される通りに培養した。雌の５週齢胸腺欠損マウス（Ｊ：ＮＵ ＃００７８５０；Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を、認可されたプロトコールの下で収容した。異種移植は、麻酔（イソフルラン）下で左右の側腹部へのＨＳ５７８Ｔ細胞（０．２ｍｌのＢＤマトリゲルマトリックスに懸濁させた５Ｅ６細胞；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）の皮下注射によって開始した。

【0312】

腫瘍進行を追跡するために、２つの直角の腫瘍直径（ｌおよびｗ）を毎週測定した。腫瘍体積は、体積＝１／２（ｌ^＊ｗ^２）である改変された楕円式を使用して計算した（Euhusら、J Surg Oncol３１巻（４号）：２２９～２３４頁、１９８６年；Tomaykoら、Cancer Chemother Pharmacol２４巻（３号）：１４８～１５４頁、１９８９年）。

【0313】

移植の２カ月後に、体積が２７０±１７ｍｍ^３（平均±ＳＥＭ）の８６個の腫瘍を有する４８匹のマウスが試験に含まれ、類似の平均サイズの腫瘍の処置群に無作為化した（ｎ＝６～８）。ＨＳ５７８Ｔの全ての注射が、腫瘍の確立に成功したわけではなかった。０、３および６日目に、マウスは、５０μｌのＰＢＳに希釈した２×１０^８ＰＦＵのアデノウイルスを腫瘍内に注射した。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５は、挿入されたＦＲＢ配列で繊維タンパク質を発現し、ＥＧＦＲを認識するナノボディ（ＥＧＦＲＶＨＨ）に融合したＦＫＢＰを発現する、腫瘍崩壊性アデノウイルスである。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ４４２はＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５の全ての特徴を有するが、ＥＧＦＲＶＨＨを発現しない。１００μＬの５％Ｔｗｅｅｎ８０／５％ＰＥＧ４００に希釈したラパマイシン（ロットＡＳＣ－１２７；ＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を、１、４、７日目およびその後１日おきに２または８ｍｇ／ｋｇの投与量で腹腔内注射により投与した。毒性のために体重を監視し、処置群に対して盲検化して腫瘍サイズを測定した。いかなる寸法で腫瘍が２０ｍｍを超えたか、または有意な腫瘍負荷の他の徴候を示したならば、マウスを屠殺した。
統計分析

【0314】

統計分析は、NIST/SEMATECH e-Handbook of Statistical Methodsの指針によりＲ
Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌソフトウェア３．２．０（Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して実行した。外れ値は、Ｑ－Ｑプロットによって視覚的に検証された正規分布を仮定して、９５％信頼区間による極端スチューデント化偏差手法を使用して識別した。データを収集した各時点で処置群の平均腫瘍体積の間の有意差について試験するために、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用した。
結果

【0315】

ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍を治療するために、ＥＧＦＲを通したアデノウイルス子孫の標的化送達の効能を試験するために、皮下ＨＳ５７８Ｔ異種移植をｎｕ／ｎｕマウスの両脇腹に確立した。腫瘍が２６４±１６ｍｍ^３（平均±ＳＥＭ）に到達したとき、類似の平均サイズの腫瘍の処置群にマウスを無作為化した。模擬腫瘍内注射（ビヒクルのみ）を受けたマウス、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５またはＡｄＳｙｎ－ＣＯ４４２。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ４４２は、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５の特徴を有するがＥＧＦＲＶＨＨ－ＦＫＢＰを発現しない対照ウイルスである。ウイルス子孫のＥＧＦＲ標的化を可能にするために、療法中にラパマイシン（ｒａｐ）を１日おきに同時投与した。結果を図３０に示す。

【0316】

模擬治療（ｎ＝８腫瘍）およびラパマイシンなしでは、腫瘍は妨げられずに成長し、模擬治療の開始から２８日後の平均腫瘍体積は１３００±４４８ｍｍ^３であり、その後、大きな腫瘍寸法のためにマウスは屠殺された。比較のために、下に記載されるデータは、療法のこの時点からである。

【0317】

アデノウイルス投与と組み合わせた１日おきの８ｍｇ／ｋｇラパマイシンの用量を先ず試験したが、高いラパマイシン濃度はウイルス感染の影響をマスキングした。８ｍｇ／ｋｇラパマイシンの単独投与（ウイルス感染なし）は、治療なしと比較して腫瘍成長を遅くするのに十分で（Ｐ＝４．５０×１０^－２）、２２９±４９ｍｍ^３の平均腫瘍体積をもたらした。２ｍｇ／ｋｇラパマイシンの単独投与（ｎ＝８）は、腫瘍の成長をブロックするのに十分でなかった（Ｐ＝０．１４４）。

【0318】

単独の腫瘍崩壊性ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５（ｎ＝１１）は、治療なしと比較して腫瘍成長速度に有意に影響せず、９４８±２０７ｍｍ^３の平均腫瘍体積をもたらした。これは、おそらく標的化されていないＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５子孫によるＨＳ５７８Ｔ感染の限界による。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５および２ｍｇ／ｋｇラパマイシンを同時投与したとき（ｎ＝１１）、ウイルス単独（Ｐ＝８．５４×１０^－４）または２ｍｇ／ｋｇラパマイシン単独（Ｐ＝１．４９×１０^－２）治療と比較したとき、腫瘍体積の劇的で有意な低減があり、１３３±２２ｍｍ^３の減少した平均腫瘍体積をもたらした。これらのデータは、腫瘍体積のこの低減がウイルス子孫のラパマイシン誘導ＥＧＦＲ標的化に依存することを示唆するが、その理由は、２ｍｇ／ｋｇラパマイシンおよび対照ウイルスＡｄＳｙｎ－ＣＯ４４２（ｎ＝９）による治療は、４０１±８９ｍｍ^３の平均腫瘍体積をもたらし、それは、２ｍｇ／ｋｇラパマイシン単独治療と比較して平均腫瘍体積の有意な（Ｐ＝０．４４９）差を有さず、また、２ｍｇ／ｋｇラパマイシンとＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５の同時投与より有意に（Ｐ＝４．９２×１０^－３）大きな腫瘍をもたらしたからである。

【0319】

２ｍｇ／ｋｇラパマイシン治療と２ｍｇ／ｋｇラパマイシンおよびＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５の同時投与の間の有意差は、治療の開始から１４日後という早い時期に測定された（Ｐ＝２．２５×１０^－２）。この時点で、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ４４２に感染したラパマイシン治療腫瘍は、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５感染腫瘍よりはっきりと大きくなっていた（Ｐ＝１．５４×１０^－２）。

【0320】

アデノウイルス再標的化に十分であるラパマイシンの用量が免疫抑制性でもあるかどうか評価するために、試験を実行した。皮下ＨＳ５７８Ｔ異種移植腫瘍を有するマウスを、１００μＬのビヒクル、２ｍｇ／ｋｇのラパマイシンまたは８ｍｇ／ｋｇのラパマイシンの腹腔内注射によって治療した。注射から１時間後、異種移植組織を収集し、１０％ホルマリンで固定し、Ｐ７０Ｓ６ＫのホスホＴ３７８の形態を認識する抗体によるＩＨＣ染色のために切断した。トレオニン３８９でリン酸化したＰ７０Ｓ６Ｋ（Ｐ７０Ｓ６Ｋ ｐ－Ｔ３８９）のために染色したＨＳ５７８Ｔ異種移植組織切片のマイクロピクトグラフを、図３１に示す。Ｔ３８９でのＰ７０Ｓ６Ｋのリン酸化は、ｍＴＯＲ活性の特質である。治療なしかまたは低いアデノウイルスＥＧＦＲ標的化有効用量（２ｍｇ／ｋｇ）の組織では、Ｐ７０Ｓ６Ｋ ｐ－Ｔ３８９の染色によって明白なように、ｍＴＯＲ活性は阻害されない。より高いアデノウイルスＥＧＦＲ標的化有効用量（８ｍｇ／ｋｇ）では、Ｐ７０Ｓ６Ｋ ｐ－Ｔ３８９染色のロスによって明らかなように、ｍＴＯＲ活性は阻害される。これらの結果は、ｉｎ ｖｉｖｏで組換えアデノウイルスのＥＧＦＲ標的化に十分であるラパマイシンの用量が、ｍＴＯＲを阻害しない（したがって、実質的に免疫抑制性でない）ことを実証する。
（実施例９）
Ａｄ３４カプシドを有する組換え腫瘍崩壊性アデノウイルス

【0321】

ＡｄＳＬＩＣによって構築されたアデノウイルスＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５Ｂ－Ｋ（配列番号９２）は、Ａｄ５の全ての構造タンパク質がＡｄ３４構造タンパク質で置き換えられていること以外は、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５（配列番号３０）と同一である。このウイルスは、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ２０２と同じカプシド交換を有する。これは、ウイルスがＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５の腫瘍崩壊選択性を保持するが、Ａｄ５中和抗体を回避することを可能にする。Ａｄ３４繊維ノブドメインはＡｄ５繊維ノブで置き換えられ、ノブドメインのＨＩループに挿入されたｍＴＯＲからのＦＲＢドメインをコードする配列を有する。Ｅ３－ＲＩＤα、Ｅ３－ＲＩＤβおよびＥ３－１４．７Ｋの遺伝子が削除され、ＦＫＢＰ１２に融合したＥＧＦＲ結合性単一ドメイン抗体（ＥＧＦＲＶＨＨ）をコードする遺伝子で置き換えられた。ラパマイシンの存在下で、可溶性ＥＧＦＲＶＨＨ－ＦＫＢＰ融合タンパク質は、繊維中のＦＲＢドメインとヘテロダイマーを形成し、成熟アデノウイルス粒子が新しい細胞の上のＥＧＦＲに結合して、この新しい受容体を通して感染させることを可能にする。ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５Ｂ－ＴＫ（配列番号９７）は、Ａｄ３４繊維のシャフトドメインがＡｄ５シャフトで置き換えられていること以外は、ＡｄＳｙｎ－ＣＯ３３５Ｂ－Ｋと同一の組換えアデノウイルスである。

【0322】

本開示の原理を適用することができる多くの可能な実施形態を考慮すると、例示される実施形態は本開示の単なる例であり、本開示の範囲を限定するものととるべきでないことを認識するべきである。むしろ、本開示の範囲は、以下の請求項によって規定される。したがって、我々は、これらの請求項の範囲および趣旨内の全てを請求する。
例えば、本発明の実施形態において、以下の項目が提供される。
（項目１）
組換えアデノウイルスであって、前記組換えアデノウイルスのゲノムが、改変Ｅ１Ａタンパク質、改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質またはその任意の組合せをコードし、前記組換えアデノウイルスが、腫瘍細胞と比較して正常細胞において複製欠陥を示す、組換えアデノウイルス。
（項目２）
前記ゲノムが、改変Ｅ１Ａタンパク質および改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質をコードする、項目１に記載の組換えアデノウイルス。
（項目３）
前記ゲノムが、改変Ｅ１Ａタンパク質および欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質をコードする、項目１に記載の組換えアデノウイルス。
（項目４）
前記ゲノムが、改変Ｅ１Ａタンパク質、改変または欠失Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質および欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質をコードする、項目１に記載の組換えアデノウイルス。（項目５）
前記改変Ｅ１Ａタンパク質が、
ＬＸＣＸＥモチーフの欠失；
残基２～１１の欠失；
Ｃ１２４Ｇ置換；
Ｙ４７Ｈ置換；
Ｙ４７Ｈ置換およびＣ１２４Ｇ置換；または
Ｙ４７Ｈ置換、Ｃ１２４Ｇ置換および残基２～１１の欠失
を含む、項目１～４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目６）
前記改変Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質が、ＰＤＺ結合性モチーフの欠失を含む、項目１、２、４および５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目７）
前記ゲノムが、
ＬＸＣＸＥモチーフの欠失を含む改変Ｅ１Ａタンパク質および欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質；
ＬＸＣＸＥモチーフの欠失を含む改変Ｅ１Ａタンパク質、ＰＤＺ結合性モチーフの欠失を含む改変Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、および欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質；
ＬＸＣＸＥモチーフの欠失を含む改変Ｅ１Ａタンパク質、欠失Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、および欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質；
Ｃ１２４Ｇ置換を含む改変Ｅ１Ａタンパク質および欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質；
Ｃ１２４Ｇ置換を含む改変Ｅ１Ａタンパク質、ＰＤＺ結合性モチーフの欠失を含む改変Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、および欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質；
Ｃ１２４Ｇ置換を含む改変Ｅ１Ａタンパク質、欠失Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、および欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質；
残基２～１１の欠失を含む改変Ｅ１Ａタンパク質および欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質；
残基２～１１の欠失を含む改変Ｅ１Ａタンパク質、ＰＤＺ結合性モチーフの欠失を含む改変Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、および欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質；
残基２～１１の欠失を含む改変Ｅ１Ａタンパク質、欠失Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、および欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質；
Ｙ４７Ｈ置換およびＣ１２４Ｇ置換を含む改変Ｅ１Ａタンパク質、ならびに欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質；
Ｙ４７Ｈ置換およびＣ１２４Ｇ置換を含む改変Ｅ１Ａタンパク質、ＰＤＺ結合性モチーフの欠失を含む改変Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、ならびに欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質；
Ｙ４７Ｈ置換およびＣ１２４Ｇ置換を含む改変Ｅ１Ａタンパク質、欠失Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、ならびに欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質；
Ｙ４７Ｈ置換、Ｃ１２４Ｇ置換および残基２～１１の欠失を含む改変Ｅ１Ａタンパク質、ならびに欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質；
Ｙ４７Ｈ置換、Ｃ１２４Ｇ置換および残基２～１１の欠失を含む改変Ｅ１Ａタンパク質、ＰＤＺ結合性モチーフの欠失を含む改変Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、ならびに欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質；または
Ｙ４７Ｈ置換、Ｃ１２４Ｇ置換および残基２～１１の欠失を含む改変Ｅ１Ａタンパク質、欠失Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、ならびに欠失Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質
をコードする、項目１に記載の組換えアデノウイルス。
（項目８）
前記ゲノムが、配列番号６～８、１０～１２、１４、１５、１８～２０および２２～２４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、項目７に記載の組換えアデノウイルス。
（項目９）
前記ゲノムが、ＦＫ５０６結合性タンパク質（ＦＫＢＰ）に融合した標的化リガンド、および野生型ＦＫＢＰ－ラパマイシン結合性（ＦＲＢ）タンパク質またはＴ２０９８Ｌ置換を含む突然変異体ＦＲＢタンパク質に融合したアデノウイルス繊維タンパク質をさらにコードする、項目１～７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目１０）
前記標的化リガンドが、単一ドメイン抗体である、項目９に記載の組換えアデノウイルス。
（項目１１）
前記単一ドメイン抗体がＥＧＦＲに特異的である、項目１０に記載の組換えアデノウイルス。
（項目１２）
前記ゲノムが、Ｅ３－ＲＩＤα／ＲＩＤβおよびＥ３－１４．７ｋコード配列の欠失を含む、項目１～７および９～１１のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目１３）
前記ゲノムが、配列番号２５または配列番号２６のヌクレオチド配列を含む、項目９～１２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目１４）
前記ゲノムが、改変ヘキソンタンパク質をさらにコードする、項目１～７および９～１２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目１５）
前記改変ヘキソンタンパク質が、Ｅ４５１Ｑ置換を含む、項目１４に記載の組換えアデノウイルス。
（項目１６）
前記ゲノムが、配列番号３０、配列番号９２または配列番号９７のヌクレオチド配列を含む、項目１４または項目１５に記載の組換えアデノウイルス。
（項目１７）
前記ゲノムが、Ｔ２０９８Ｌ置換を含む突然変異体ＦＲＢタンパク質に融合したアデノウイルス繊維タンパク質をさらにコードする、項目１～７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目１８）
前記ゲノムが、Ｅ４５１Ｑ置換を含む改変ヘキソンタンパク質をさらにコードする、項目１７に記載の組換えアデノウイルス。
（項目１９）
前記ゲノムが、配列番号３１のヌクレオチド配列を含む、項目１７または項目１８に記載の組換えアデノウイルス。
（項目２０）
前記ゲノムが、肝臓特異的マイクロＲＮＡのための１つまたは複数の結合部位をさらに含む、項目１～１９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目２１）
前記肝臓特異的マイクロＲＮＡのための前記１つまたは複数の結合部位が、Ｅ１Ａの３’－ＵＴＲに位置する、項目２０に記載の組換えアデノウイルス。
（項目２２）
前記肝臓特異的マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ－１２２である、項目２０または項目２１に記載の組換えアデノウイルス。
（項目２３）
前記ゲノムが、キメラ繊維タンパク質をコードする、項目１～２２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目２４）
前記キメラ繊維タンパク質が、第１のアデノウイルス血清型からの繊維シャフトおよび第２のアデノウイルス血清型からの繊維ノブを含む、項目２３に記載の組換えアデノウイルス。
（項目２５）
前記第１のアデノウイルス血清型がＡｄ５であり、前記第２のアデノウイルス血清型がＡｄ３、Ａｄ９、Ａｄ１１、Ａｄ１２、Ａｄ３４またはＡｄ３７である、項目２４に記載の組換えアデノウイルス。
（項目２６）
前記第１のアデノウイルス血清型がＡｄ５であり、前記第２のアデノウイルス血清型がＡｄ１１、Ａｄ３４またはＡｄ３７である、項目２５に記載の組換えアデノウイルス。
（項目２７）
前記ゲノムが、配列番号８２、配列番号８３または配列番号８４のヌクレオチド配列を含む、項目２６に記載の組換えアデノウイルス。
（項目２８）
前記ゲノムが、カプシド交換キメラアデノウイルスをコードする、項目１～２７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目２９）
前記ゲノムのＥ１、Ｅ３およびＥ４領域が第１のアデノウイルス血清型に由来し、前記ゲノムのＥ２Ｂ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｅ２ＡおよびＬ４領域が第２のアデノウイルス血清型に由来する、項目２８に記載の組換えアデノウイルス。
（項目３０）
前記第１のアデノウイルス血清型の前記Ｅ１領域が、前記第２のアデノウイルス血清型からのｐＩＸタンパク質をコードするように改変され；および／または
前記第１のアデノウイルス血清型の前記Ｅ３領域が、前記第２のアデノウイルス血清型からのＵｅｘｏｎおよび繊維タンパク質をコードするように改変される、項目２９に記載の組換えアデノウイルス。
（項目３１）
前記第１のアデノウイルス血清型がＡｄ５であり、前記第２のアデノウイルス血清型がＡｄ３、Ａｄ９、Ａｄ１１またはＡｄ３４である、項目２９または項目３０に記載の組換えアデノウイルス。
（項目３２）
前記ゲノムが、配列番号８５、配列番号９２、配列番号９７、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５または配列番号９６のヌクレオチド配列を含む、項目３１に記載の組換えアデノウイルス。
（項目３３）
前記ゲノムが、改変ペントンタンパク質をさらにコードする、項目１～３２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目３４）
前記改変ペントンタンパク質が、インテグリン結合性ＲＧＤモチーフの突然変異を含む、項目３３に記載の組換えアデノウイルス。
（項目３５）
前記ゲノムが、配列番号８６または配列番号８７のヌクレオチド配列を含む、項目３４に記載の組換えアデノウイルス。
（項目３６）
前記ゲノムが、ＲＧＤペプチドを含むように改変された繊維タンパク質をさらにコードする、項目１～３５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目３７）
前記ゲノムが、配列番号８７のヌクレオチド配列を含む、項目３６に記載の組換えアデノウイルス。
（項目３８）
項目１～３７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。
（項目３９）
腫瘍細胞生存性を阻害する方法であって、前記腫瘍細胞を、項目１～３７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスまたは項目３８に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
（項目４０）
ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記方法がｉｎ ｖｉｖｏの方法であり、前記腫瘍細胞を接触させることが、前記組換えアデノウイルスまたは前記組成物を、腫瘍を有する対象に投与することを含む、項目３９に記載の方法。
（項目４２）
対象において腫瘍進行を阻害するか、または腫瘍体積を低減する方法であって、前記対象に項目１～３７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスまたは項目３８に記載の組成物の治療有効量を投与し、それによって前記対象において腫瘍進行を阻害するか、または腫瘍体積を低減することを含む、方法。
（項目４３）
対象においてがんを治療する方法であって、前記対象に項目１～３７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスまたは項目３８に記載の組成物の治療有効量を投与し、それによって前記対象においてがんを治療することを含む、方法。
（項目４４）
対象において腫瘍体積を低減する方法であって、前記対象に
（ｉ）項目９～１６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスの治療有効量；および
（ｉｉ）ラパマイシンまたはその類似体
を投与することを含む方法。
（項目４５）
対象においてがんを治療する方法であって、前記対象に
（ｉ）項目９～１６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスの治療有効量；および
（ｉｉ）ラパマイシンまたはその類似体
を投与することを含む方法。
（項目４６）
前記ラパマイシンまたはラパマイシン類似体が、約０．１ｍｇ／ｋｇから約２．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、項目４４または項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記ラパマイシンまたはラパマイシン類似体が、約０．１ｍｇ／ｋｇから約０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、項目４４または項目４５に記載の方法。
（項目４８）
前記ラパマイシンまたはラパマイシン類似体が、約１から約１５ｍｇ／ｍ^２の用量で投与される、項目４４または項目４５に記載の方法。
（項目４９）
前記ラパマイシンまたはラパマイシン類似体が、約３から約１０ｎｇ／ｍＬの用量で投与される、項目４４または項目４５に記載の方法。
（項目５０）
前記ラパマイシンまたはラパマイシン類似体が、前記対象において実質的な免疫抑制を引き起こさない用量で投与される、項目４４～４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記腫瘍またはがんが、Ｅ２Ｆ経路の脱調節によって特徴付けられる、項目３９～５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記腫瘍またはがんが、肺、前立腺、結腸直腸、乳房、甲状腺、腎臓または肝臓の腫瘍またはがんであるか、または白血病である、項目３９～５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記対象を追加の治療剤で治療することをさらに含む、項目４１～５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記追加の治療剤が、免疫モジュレータを含む、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記追加の治療剤が、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤を含む、項目５３に記載の方法。
（項目５６）
組換えアデノウイルスのゲノムが、Ｅ１Ａの欠失を含み、ＥＦ１α－ルシフェラーゼをコードする、組換えアデノウイルス。
（項目５７）
前記ゲノムが、配列番号２７のヌクレオチド配列を含む、項目５６に記載の組換えアデノウイルス。
（項目５８）
前記ゲノムが、肝臓特異的マイクロＲＮＡのための１つまたは複数の結合部位をさらに含む、項目５６に記載の組換えアデノウイルス。
（項目５９）
前記肝臓特異的マイクロＲＮＡのための前記１つまたは複数の結合部位が、Ｅ１Ａの３’－ＵＴＲに位置する、項目５８に記載の組換えアデノウイルス。
（項目６０）
前記肝臓特異的マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ－１２２である、項目５８または項目５９に記載の組換えアデノウイルス。
（項目６１）
前記ゲノムが、配列番号２８のヌクレオチド配列を含む、項目５８～６０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目６２）
前記ゲノムが、改変ヘキソンタンパク質をコードする、項目５６および５８～６１のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目６３）
前記改変ヘキソンタンパク質が、Ｅ４５１Ｑ置換を含む、項目６２に記載の組換えアデノウイルス。
（項目６４）
前記ゲノムが、配列番号２９のヌクレオチド配列を含む、項目６２または項目６３に記載の組換えアデノウイルス。
（項目６５）
配列番号１～３１および６８～９８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、組換え核酸分子。
（項目６６）
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１～３１および６８～９８のいずれか１つからなる、項目６５に記載の組換え核酸分子。
（項目６７）
項目６５または項目６６に記載の核酸分子を含むベクター。
（項目６８）
項目６７に記載のベクターを含むトランスジェニック細胞。
（項目６９）
項目９～１６のいずれかに記載の組換えアデノウイルスおよびラパマイシンまたはその類似体を含むキット。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6AB】

【図6C】

【図7AB】

【図7C】

【図8AB】

【図8C】

【図9AB】

【図9C】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18AB】

【図18CD】

【図18E】

【図19】

【図20】

【図21AB】

【図21C】

【図21D】

【図22】

【図23ABC】

【図23D】

【図23E】

【図24A】

【図24B】

【図25A】

【図25BC】

【図25DE】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【配列表】

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