▶ トランスレイト バイオ， インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024038143
(43)【公開日】2024-03-19
(54)【発明の名称】メッセンジャーＲＮＡ用乾燥粉末製剤
(51)【国際特許分類】
A61K 9/14 20060101AFI20240312BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240312BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20240312BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240312BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240312BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20240312BHJP
A61K 9/12 20060101ALI20240312BHJP
A61K 9/107 20060101ALI20240312BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20240312BHJP
A61K 47/32 20060101ALI20240312BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20240312BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20240312BHJP
A61K 47/14 20170101ALI20240312BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20240312BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20240312BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20240312BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20240312BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240312BHJP
【ＦＩ】
A61K9/14
A61K48/00 ZNA
A61P11/06
A61P11/00
A61P31/12
A61P31/16
A61K9/12
A61K9/107
A61K9/127
A61K47/32
A61K47/34
A61K47/18
A61K47/14
A61K47/36
A61K47/26
A61K47/24
A61K47/10
C12N15/12
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023220337
(22)【出願日】2023-12-27
(62)【分割の表示】P 2021503720の分割
【原出願日】2019-07-23
(31)【優先権主張番号】62/702,193
(32)【優先日】2018-07-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】517316797
【氏名又は名称】トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(74)【代理人】
【識別番号】100216105
【弁理士】
【氏名又は名称】守安 智
(72)【発明者】
【氏名】カーブ， シュリラング
(72)【発明者】
【氏名】デローサ， フランク
(72)【発明者】
【氏名】ハートレイン， マイケル
(72)【発明者】
【氏名】パテル， ザルナ
(72)【発明者】
【氏名】サロード， アシシュ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】治療的使用のための安定した乾燥粉末メッセンジャーＲＮＡ製剤、ならびにそれを作製および使用する方法を提供する。
【解決手段】嚢胞性線維症コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を送達するための乾燥粉末製剤であって、ＣＦＴＲタンパク質をコードするｍＲＮＡと、１つ以上の脂質と、１つ以上のポリマーと、を含む複数の噴霧乾燥粒子を含む、乾燥粉末製剤である。
【選択図】なし
【解決手段】嚢胞性線維症コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を送達するための乾燥粉末製剤であって、ＣＦＴＲタンパク質をコードするｍＲＮＡと、１つ以上の脂質と、１つ以上のポリマーと、を含む複数の噴霧乾燥粒子を含む、乾燥粉末製剤である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
嚢胞性線維症コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を送達するための乾燥粉末製剤であって、
ＣＦＴＲタンパク質をコードするｍＲＮＡと、
１つ以上の脂質と、
１つ以上のポリマーと、を含む複数の噴霧乾燥粒子を含む、乾燥粉末製剤。
ＣＦＴＲタンパク質をコードするｍＲＮＡと、
１つ以上の脂質と、
１つ以上のポリマーと、を含む複数の噴霧乾燥粒子を含む、乾燥粉末製剤。
【請求項2】
前記１つ以上の脂質が、前記ＣＦＴＲタンパク質をコードする前記ｍＲＮＡを封入する１つ以上の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に存在する、請求項１に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項3】
前記１つ以上の脂質および前記１つ以上のポリマーが、前記ＣＦＴＲタンパク質をコードする前記ｍＲＮＡを封入する１つ以上の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に存在する、請求項１に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項4】
前記ＣＦＴＲ ｍＲＮＡが、９０％以上の完全性を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項5】
前記ｍＲＮＡが、室温以下で６ヶ月以上保存したときに、９０％以上の完全性を維持する、請求項１～４のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項6】
前記複数の噴霧乾燥粒子の少なくとも２０％が、微粒子である、請求項１～５のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項7】
前記微粒子が、５μｍ未満の体積メジアン径を有する、請求項６に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項8】
前記乾燥粉末製剤が、吸入可能である、請求項１～７のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項9】
前記製剤が、再構成時に霧化可能である、請求項１～７のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項10】
前記１つ以上のポリマーが、前記脂質およびポリマーの合計重量の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％を構成する、請求項１～９のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項11】
前記１つ以上のポリマーが、前記脂質およびポリマーの合計重量の、約１０～９０％、１０～８０％、１０～７０％、１０～６０％、１０～５０％、１０～４０％、１０～３０％、１０～２０％、１５～２０％、１５～２５％、１５～３０％、１５～３５％、１５～４０％、１５～４５％、１５～５０％、１５～５５％、１５～６０％、１５～６５％、１５～７０％、１５～７５％、１５～８０％、または１５～９０％を構成する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項12】
前記１つ以上のポリマーが、前記脂質およびポリマーの合計重量の９０％、８０％、７０％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、または２０％以下を構成する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項13】
前記１つ以上のポリマー構成が、キトサン、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－コ
－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ｑ－カプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリアミドアミン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ（ヒドロキシアルキルＬ－アスパラギン）、ポリ（ヒドロキシアルキルＬ－グルタミン）、ポリ（２－アルキルオキサゾリン）アクリレート、修飾アクリレートおよびポリメタクリレート系ポリマー、ポリ－Ｎ－（２－ヒドロキシル－プロピル）メタアクリルアミド、ポリ－２－（メタクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン、ポリ（２－（メタクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン）、ならびにポリ（ジメチルアミノエチルメチルアクリレート）（ｐＤＭＡＥＭＡ）からなる群から選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ｑ－カプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリアミドアミン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ（ヒドロキシアルキルＬ－アスパラギン）、ポリ（ヒドロキシアルキルＬ－グルタミン）、ポリ（２－アルキルオキサゾリン）アクリレート、修飾アクリレートおよびポリメタクリレート系ポリマー、ポリ－Ｎ－（２－ヒドロキシル－プロピル）メタアクリルアミド、ポリ－２－（メタクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン、ポリ（２－（メタクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン）、ならびにポリ（ジメチルアミノエチルメチルアクリレート）（ｐＤＭＡＥＭＡ）からなる群から選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項14】
前記１つ以上のポリマーが、ポリメタクリレート系ポリマーを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項15】
前記１つ以上のポリマーが、Ｅｕｄｒａｇｉｔ ＥＰＯを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項16】
前記ｍＲＮＡを封入する１つ以上のＬＮＰが、１～２０、１～１５、１～１０、２～８、２～６、または２～４の範囲の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する、請求項２～１５のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項17】
前記ｍＲＮＡを封入する１つ以上のＬＮＰが、２または４の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する、請求項１６に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項18】
前記ＬＮＰが、８０％以上の封入効率を有する、請求項２～１７のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項19】
前記１つ以上の脂質が、カチオン性脂質を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項20】
前記カチオン性脂質が、Ｃ１２－２００、ＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレイル－３－トリメチタアンモニウムプロパン）、ＤＯＤＡＰ（１，２－ジオレイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＨＧＴ４００３、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＩＣＥ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１９に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項21】
前記カチオン性脂質が、ｃＫＫ－Ｅ１２である、請求項２０に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項22】
前記カチオン性脂質が、ＩＣＥである、請求項２０に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項23】
前記カチオン性脂質が、ＬＮＰ中の総脂質のモルで約２５～５０％を構成する、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項24】
前記１つ以上の脂質が、ＰＥＧ修飾脂質を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項25】
前記ＰＥＧ修飾脂質が、ＬＮＰ中の総脂質のモルで約１～１５％を構成する、請求項２４に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項26】
前記ＰＥＧ修飾脂質が、ＬＮＰ中の総脂質のモルで少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、８％、１０％、または１２％を構成する、請求項２４に記載の乾燥粉末製
剤。
剤。
【請求項27】
前記ＬＮＰが、２脂質成分ＬＮＰである、請求項２～２６のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項28】
前記１つ以上の脂質が、中性脂質またはコレステロール系脂質を含まない、請求項１～２７のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項29】
前記１つ以上の脂質が、中性脂質またはコレステロール系脂質をさらに含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項30】
前記１つ以上の脂質が、中性脂質をさらに含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項31】
前記ＬＮＰが、３脂質成分ＬＮＰである、請求項２９または３０に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項32】
単糖類、二糖類、多糖類、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ソルボース、ラクトース、スクロース、セロビオース、トレハロース、ラフィノース、デンプン、デキストラン、マルトデキストリン、シクロデキストリン、イヌリン、キシリトール、ソルビトール、ラクチトール、およびマンニトールからなる群から選択される少なくとも１つの糖をさらに含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項33】
前記糖が、マンニトールである、請求項３２に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項34】
エステル、ウレタン、ホスホエステル、ホスファゼン、アミノ酸、コラーゲン、キトサン、多糖類、アルブミン、界面活性剤、緩衝剤、塩、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項35】
前記界面活性剤が、ＣＨＡＰＳ（３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート）、リン脂質、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、トリトンＸ－１００、コカミドモノエタノールアミン、コカミドジエタノールアミン、モノステアリン酸グリセロール、モノラウリン酸グリセロール、ソルビタンモオノラウレエート（Ｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｏｎｏｌａｕｒｅａｔｅ）、モノステアリン酸ソルビタン、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｔｗｅｅｎ ８０、アルキルポリグルコシド、およびポロキサマーからなる群から選択される、請求項３４に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項36】
前記界面活性剤が、ポロキサマーである、請求項３５に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項37】
前記ＣＦＴＲ ｍＲＮＡが、前記噴霧乾燥粒子の合計重量の約１～２０％、１～１５％、１～１０％、１～８％、１～６％、１～５％、５～１５％、または５～１０％を構成する、請求項１～３６のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項38】
前記ＣＦＴＲ ｍＲＮＡが、前記噴霧乾燥粒子の合計重量の約１％、２％、３％、４％、５％、７．５％、１０％、１２．５％、または１５％を構成する、請求項１～３７のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項39】
インビボ発現のための嚢胞性線維症コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を送達する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１～３８のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤を投与する工程を含む、方法。
【請求項40】
前記乾燥粉末製剤が、肺送達によって投与される、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
前記乾燥粉末製剤が、吸入により投与される、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項42】
インビボ発現のための嚢胞性線維症コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を送達する方法であって、
請求項１～３８のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤を液体溶液に再構成することと、
それを必要とする対象に、前記再構成された液体溶液を投与することと、を含む、方法。
請求項１～３８のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤を液体溶液に再構成することと、
それを必要とする対象に、前記再構成された液体溶液を投与することと、を含む、方法。
【請求項43】
前記再構成された液体溶液が、霧化によって投与される、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記対象が、嚢胞性線維症に罹患している、請求項３９～４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を送達するための乾燥粉末製剤であって、
タンパク質またはペプチドをコードするｍＲＮＡと、
１つ以上の脂質と、
１つ以上のポリマーと、を含む複数の噴霧乾燥粒子を含む、乾燥粉末製剤。
タンパク質またはペプチドをコードするｍＲＮＡと、
１つ以上の脂質と、
１つ以上のポリマーと、を含む複数の噴霧乾燥粒子を含む、乾燥粉末製剤。
【請求項46】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を送達するための乾燥粉末製剤であって、
ａ．ペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡを封入する１つ以上の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と、
ｂ．１つ以上のポリマーと、を含む複数の噴霧乾燥粒子を含む、乾燥粉末製剤。
ａ．ペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡを封入する１つ以上の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と、
ｂ．１つ以上のポリマーと、を含む複数の噴霧乾燥粒子を含む、乾燥粉末製剤。
【請求項47】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の送達のための乾燥粉末製剤であって、ペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡを封入する１つ以上のナノ粒子を含む複数の噴霧乾燥粒子を含み、前記ナノ粒子が、
ａ．１つ以上の脂質と、
ｂ．１つ以上のポリマーと、を含む、乾燥粉末製剤。
ａ．１つ以上の脂質と、
ｂ．１つ以上のポリマーと、を含む、乾燥粉末製剤。
【請求項48】
前記ｍＲＮＡが、９０％以上の完全性を有する、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項49】
前記ｍＲＮＡが、室温以下で６ヶ月以上保存した後、９０％以上の完全性を維持する、請求項４５～４８のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項50】
前記ｍＲＮＡが、４℃以下で６ヶ月以上保存した後、９０％以上の完全性を維持する、請求項４５～４８のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項51】
前記複数の噴霧乾燥粒子の少なくとも２０％が、微粒子である、請求項４５～５０のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項52】
前記微粒子が、５μｍ未満の体積メジアン径を有する、請求項５１に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項53】
前記乾燥粉末製剤が、吸入可能である、請求項４５～５２のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項54】
前記製剤が、再構成時に霧化可能である、請求項４５～５２のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項55】
前記ｍＲＮＡを封入する１つ以上のＬＮＰが、１～２０、１～１５、１～１０、２～８、２～６、または２～４の範囲の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する、請求項４６～５４のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項56】
前記ｍＲＮＡを封入する１つ以上のＬＮＰが、２または４の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する、請求項５５に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項57】
ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子が、８０％以上の封入効率を有する、請求項４６～５６のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項58】
前記１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子が、１つ以上のカチオン性脂質を含む、請求項４６～５７のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項59】
前記１つ以上のカチオン性脂質が、Ｃ１２－２００、ＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレイル－３－トリメチタアンモニウムプロパン）、ＤＯＤＡＰ（１，２－ジオレイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＨＧＴ４００３、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＩＣＥ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５８に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項60】
前記１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子が、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む、請求項４６～５９のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項61】
前記ＬＮＰが、２脂質成分ＬＮＰである、請求項４６～６０のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項62】
前記１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子が、１つ以上の中性脂質または１つ以上のコレステロール系脂質をさらに含む、請求項４６～６０のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項63】
前記ＬＮＰが、３脂質成分ＬＮＰである、請求項６２に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項64】
前記１つ以上のポリマーが、合計重量の２０％、１５％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、または５％未満を構成する、請求項４５～６３のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項65】
前記１つ以上のポリマーが、前記脂質およびポリマーの合計重量の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％を構成する、請求項４５～６４のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項66】
前記１つ以上のポリマーが、前記脂質およびポリマーの合計重量の、約１０～９０％、１０～８０％、１０～７０％、１０～６０％、１０～５０％、１０～４０％、１０～３０
％、１０～２０％、１５～２０％、１５～２５％、１５～３０％、１５～３５％、１５～４０％、１５～４５％、１５～５０％、１５～５５％、１５～６０％、１５～６５％、１５～７０％、１５～７５％、１５～８０％、または１５～９０％を構成する、請求項４５～６５のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
％、１０～２０％、１５～２０％、１５～２５％、１５～３０％、１５～３５％、１５～４０％、１５～４５％、１５～５０％、１５～５５％、１５～６０％、１５～６５％、１５～７０％、１５～７５％、１５～８０％、または１５～９０％を構成する、請求項４５～６５のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項67】
前記１つ以上のポリマーが、前記脂質およびポリマーの合計重量の９０％、８０％、７０％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、または２０％以下を構成する、請求項４５～６６のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項68】
前記１つ以上のポリマー構成が、キトサン、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ｑ－カプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリアミドアミン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ（ヒドロキシアルキルＬ－アスパラギン）、ポリ（ヒドロキシアルキルＬ－グルタミン）、ポリ（２－アルキルオキサゾリン）アクリレート、修飾アクリレートおよびポリメタクリレート系ポリマー、ポリ－Ｎ－（２－ヒドロキシル－プロピル）メタアクリルアミド、ポリ－２－（メタクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン、ポリ（２－（メタクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン）、ならびにポリ（ジメチルアミノエチルメチルアクリレート）（ｐＤＭＡＥＭＡ）からなる群から選択される、請求項４５～６７のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項69】
前記１つ以上のポリマーが、ポリメタクリレート系ポリマーを含む、請求項４５～６８のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項70】
単糖類、二糖類、多糖類、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ソルボース、ラクトース、スクロース、セロビオース、トレハロース、ラフィノース、デンプン、デキストラン、マルトデキストリン、シクロデキストリン、イヌリン、キシリトール、ソルビトール、ラクチトール、およびマンニトールからなる群から選択される少なくとも１つの糖をさらに含む、請求項４５～６９のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項71】
前記糖が、マンニトールである、請求項７０に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項72】
エステル、ウレタン、ホスホエステル、ホスファゼン、アミノ酸、コラーゲン、キトサン、多糖類、アルブミン、界面活性剤、緩衝剤、塩、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項４５～７１のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項73】
前記界面活性剤が、ＣＨＡＰＳ（３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート）、リン脂質、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、トリトンＸ－１００、コカミドモノエタノールアミン、コカミドジエタノールアミン、モノステアリン酸グリセロール、モノラウリン酸グリセロール、ソルビタンモオノラウレエート（Ｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｏｎｏｌａｕｒｅａｔｅ）、モノステアリン酸ソルビタン、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｔｗｅｅｎ ８０、アルキルポリグルコシド、ポロキサマー、および任意にポロキサマー４０７からなる群から選択される、請求項７２に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項74】
前記界面活性剤が、ポロキサマーである、請求項７３に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項75】
前記ｍＲＮＡが、ペプチドをコードする、請求項４５～７４のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項76】
前記ｍＲＮＡが、治療用タンパク質をコードする、請求項４５～７４のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項77】
前記治療用タンパク質が、ＣＦＴＲである、請求項７６に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項78】
前記治療用タンパク質が、ＯＴＣである、請求項７６に記載の乾燥粉末製剤。
【請求項79】
インビボでｍＲＮＡを送達する方法であって、それを必要とする対象に、請求項４５～７８のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤を投与することを含む、方法。
【請求項80】
有効用量の、請求項４５～７８のいずれか一項に記載の乾燥粉末製剤中のｍＲＮＡを前記患者に投与することによって、患者における疾患または障害を治療する方法。
【請求項81】
前記乾燥粉末製剤が、吸入により投与される、請求項７９または８０に記載の方法。
【請求項82】
前記乾燥粉末製剤が、鼻腔内噴霧により投与される、請求項７９または８０に記載の方法。
【請求項83】
前記製剤が、定量吸入器によって投与される、請求項７９または８０に記載の方法。
【請求項84】
前記疾患または障害が、嚢胞性線維症；喘息；ＣＯＰＤ；肺気腫；内臓逆位を伴うもしくは伴わない原発性毛様体ジスキネジア（ＣＩＬＤ１）、またはカルタゲナー症候群；肺線維症；バート・ホッグ・デュベ症候；遺伝性出血性毛細血管拡張症；アルファ－１抗トリプシン欠損症；チトクロームｂ陽性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ、Ｘ線）；チトクロームｂ陽性肉芽腫性疾患、常染色体劣性；表面活性物質欠損症、肺表面活性物質代謝異常１、肺表面活性物質代謝異常２型、肺表面活性物質代謝異常３型；未熟児の呼吸窮迫症候群；結核、インフルエンザを含む肺ウイルス性疾患、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）から選択される、請求項８０～８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項85】
乾燥粉末製剤を製造する方法であって、
ｍＲＮＡ、１つ以上の脂質、およびポリマーを含む混合物を提供することと、
前記混合物を噴霧乾燥して、複数の粒子を形成することと、を含む、方法。
ｍＲＮＡ、１つ以上の脂質、およびポリマーを含む混合物を提供することと、
前記混合物を噴霧乾燥して、複数の粒子を形成することと、を含む、方法。
【請求項86】
前記ポリマーを添加する前に、前記１つ以上の脂質が、最初に前記ｍＲＮＡと混合されてｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を形成する、請求項８５に記載の方法。
【請求項87】
前記１つ以上の脂質が、単一工程で前記ｍＲＮＡおよび前記ポリマーと混合されて、ｍＲＮＡ担持脂質ポリマーナノ粒子を形成する、請求項８５に記載の方法。
【請求項88】
噴霧乾燥の前に前記混合物に１つ以上の賦形剤を添加することをさらに含む、請求項８５～８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項89】
前記複数の噴霧乾燥粒子が、以下：
ａ）１０％未満の水分含量、
ｂ）５μｍ未満の体積メジアン径を有する微粒子の画分、
ｃ）１０～３０００ｎｍのＺ平均サイズ範囲、
ｄ）１～２０のＮ／Ｐ比の範囲、
ｅ）８０％以上のｍＲＮＡ封入効率、
ｆ）９０％以上のｍＲＮＡ完全性のうちの１つ以上によって特徴付けられる、請求項８
５～８８のいずれか一項に記載の方法。
ａ）１０％未満の水分含量、
ｂ）５μｍ未満の体積メジアン径を有する微粒子の画分、
ｃ）１０～３０００ｎｍのＺ平均サイズ範囲、
ｄ）１～２０のＮ／Ｐ比の範囲、
ｅ）８０％以上のｍＲＮＡ封入効率、
ｆ）９０％以上のｍＲＮＡ完全性のうちの１つ以上によって特徴付けられる、請求項８
５～８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項90】
前記ｍＲＮＡが、タンパク質またはペプチドをコードする、請求項８５～８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項91】
前記ｍＲＮＡが、ペプチドをコードする、請求項８５～９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項92】
前記ｍＲＮＡが、治療用タンパク質をコードする、請求項８５～９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項93】
前記治療用タンパク質が、ＣＦＴＲである、請求項９２に記載の方法。
【請求項94】
前記治療用タンパク質が、ＯＴＣである、請求項９２に記載の方法。
【請求項95】
請求項８５～９４のいずれか一項に記載の方法に従って製造される乾燥粉末製剤。
【請求項96】
有効用量の、請求項９５に記載の乾燥粉末製剤中のｍＲＮＡを前記患者に投与することによって、患者における疾患または障害を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年７月２３日に出願された米国仮出願第６２／７０２，１９３号に対する優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１８年７月２３日に出願された米国仮出願第６２／７０２，１９３号に対する優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列一覧表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列一覧表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１９年７月１９日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、ＭＲＴ＿２００８ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称であり、サイズは１１３７バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列一覧表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１９年７月１９日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、ＭＲＴ＿２００８ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称であり、サイズは１１３７バイトである。
【背景技術】
【0003】
メッセンジャーＲＮＡ療法（ＭＲＴ）は、様々な疾患の治療にますます重要なアプローチとなっている。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物などの脂質封入ｍＲＮＡ製剤は、高度な細胞取り込みおよびタンパク質発現を示す。しかしながら、現在、これらの製剤は典型的には液体形態であり、通常、注射の形態で、または霧化器を介して投与される必要がある。これらの投与様式は、例えば、定量吸入器などのいくつかの低侵襲経路よりも患者によって望ましくない。凍結乾燥製剤は、時折、乾燥状態では信頼できる粒子均一性を提供しないか、または取り扱いおよび流通が容易ではない。凍結乾燥粉末は、患者に分注する前に適切な溶媒中に溶解されなければならず、数時間以内に分解され得る。ｍＲＮＡおよび／またはＬＮＰ不安定性の可能性から、ｍＲＮＡ調製物の凍結融解の繰り返しは推奨されない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
本発明は特に、より効率的なｍＲＮＡ送達およびより有効なｍＲＮＡ療法のために、脂質系ナノ粒子で封入されたｍＲＮＡの乾燥粉末（すなわち、噴霧乾燥）製剤を提供する。本発明に先立って、ｍＲＮＡおよび脂質ナノ粒子成分の両方が、適切な噴霧乾燥に必要な高温および／または高圧で構造的に不安定であるという事実から、噴霧乾燥脂質ナノ粒子で封入されたｍＲＮＡの課題のうちの１つが生じた。例えば、噴霧乾燥機の入口温度は、８０℃～９８℃の範囲である。脂質は、噴霧ノズルでまたはその近くで、高い入口温度で溶融および／または凝集する傾向がある。これは、ノズルを通した乾燥チャンバへの製剤の流れの妨げとなり、噴霧の均一な分散を破壊し、望ましくない粒子特性および乏しい収率を生じさせる。本発明は、混合物を噴霧乾燥プロセスに供する前に、ｍＲＮＡおよび脂質ナノ粒子混合物へのポリマーの添加により、この問題を予想外に解決した。本明細書に記載されるように、発明者らは、ポリマーをｍＲＮＡおよび脂質混合物に添加することにより、脂質ナノ粒子の凝集を効果的に防止し、吸入に好適なｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を含む微粒子の乾燥粉末形成が促進されることを観察した。
【0005】
より驚くべきことに、ｍＲＮＡの極めて不安定な性質にもかかわらず、本発明に従って調製された乾燥粉末製剤は、噴霧乾燥に関連する高温および／または高圧下であっても安定しており、様々な温度で長期間保存された後であっても高度なｍＲＮＡの完全性を維持することができる。さらに、本発明に従って調製された乾燥粉末製剤はまた、ｍＲＮＡのＬＮＰ封入効率が高く、結果としてｍＲＮＡの細胞送達が高いことを特徴とする。したがって、本発明は、安定した乾燥粉末形態のｍＲＮＡ療法剤に対するｍＲＮＡ療法分野での長年のニーズを満たし、これは容易に保存、移動、および分注することができる。さらに、本発明によるｍＲＮＡの乾燥粉末製剤は、液体の単回使用アリコートを凍結する必要な
しに、例えば、定量で、または計量されて単回使用量で再構成されて、患者に乾燥粉末として投与され得る。
しに、例えば、定量で、または計量されて単回使用量で再構成されて、患者に乾燥粉末として投与され得る。
【0006】
一態様では、本発明は、タンパク質またはペプチドをコードするｍＲＮＡ、１つ以上の脂質、および１つ以上のポリマーを含む複数の噴霧乾燥粒子を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の送達のための乾燥粉末製剤を提供する。
【0007】
別の態様では、本発明は、ペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡを封入する１つ以上の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、および１つ以上のポリマーを含む複数の噴霧乾燥粒子を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の送達のための乾燥粉末製剤を提供する。
【0008】
さらに別の態様では、本発明は、ペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡを封入する１つ以上のナノ粒子、１つ以上の脂質を含むナノ粒子、および１つ以上のポリマーを含む複数の噴霧乾燥粒子を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の送達のための乾燥粉末製剤を提供する。
【0009】
さらに別の態様では、本発明は、ＣＦＴＲタンパク質をコードするｍＲＮＡ、１つ以上の脂質、および１つ以上のポリマーを含む複数の噴霧乾燥粒子を含む、嚢胞性線維症コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の送達のための乾燥粉末製剤を提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上の脂質は、ＣＦＴＲタンパク質をコードするｍＲＮＡを封入する１つ以上のナノ粒子（ＬＮＰ）を形成する。いくつかの実施形態では、１つ以上の脂質および１つ以上のポリマーは、ＣＦＴＲタンパク質をコードするｍＲＮＡを封入する１つ以上のナノ粒子を形成する。
【0010】
本出願で使用されるように、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、脂質で形成されるナノ粒子、ならびに脂質およびポリマーの両方で形成されたナノ粒子を包含する。いくつかの実施形態では、脂質およびポリマーの両方で形成されたナノ粒子は、脂質ポリマーナノ粒子と呼ばれる。
【0011】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ）は、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の完全性を有する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ）は、９０％以上の完全性を有する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ）は、９５％以上の完全性を有する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ）は、９８％以上の完全性を有する。
【0012】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、室温以下で６ヶ月以上保存したときに９０％以上の完全性を維持する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、室温以下で６ヶ月以上保存したときに９５％以上の完全性を維持する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、室温以下で６ヶ月以上保存したときに９８％以上の完全性を維持する。
【0013】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、噴霧乾燥後、室温以下で３ヶ月以上保存した後に、９０％以上の完全性を維持する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、噴霧乾燥後、室温以下で６ヶ月以上保存した後に、９０％以上の完全性を維持する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、噴霧乾燥後、室温以下で９ヶ月以上保存した後に、９０％以上の完全性を維持する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、噴霧乾燥後、室温以下で１２ヶ月以上保存した後に、９０％以上の完全性を維持する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、噴霧乾燥後、４℃以下で３ヶ月以上保存した後に、９０％以上の完全性を維持する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、噴霧乾燥後、４℃以下で６ヶ月以上保存した後に、９０％以上の完全性を維持する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、噴霧乾燥
後、４℃以下で９ヶ月以上保存した後に、９０％以上の完全性を維持する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、噴霧乾燥後、４℃以下で１２ヶ月以上保存した後に、９０％以上の完全性を維持する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、室温以下で３ヶ月以上、６ヶ月以上、９ヶ月以上、または１２ヶ月以上保存した後、９５％以上の完全性を維持する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、４℃以下で３ヶ月以上、６ヶ月以上、９ヶ月以上、または１２ヶ月以上保存した後、９５％以上の完全性を維持する。
後、４℃以下で９ヶ月以上保存した後に、９０％以上の完全性を維持する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、噴霧乾燥後、４℃以下で１２ヶ月以上保存した後に、９０％以上の完全性を維持する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、室温以下で３ヶ月以上、６ヶ月以上、９ヶ月以上、または１２ヶ月以上保存した後、９５％以上の完全性を維持する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、４℃以下で３ヶ月以上、６ヶ月以上、９ヶ月以上、または１２ヶ月以上保存した後、９５％以上の完全性を維持する。
【0014】
いくつかの実施形態では、複数の噴霧乾燥粒子の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％は、微粒子の画分である。いくつかの実施形態では、複数の噴霧乾燥粒子の少なくとも２０％は、微粒子の画分である。
【0015】
いくつかの実施形態では、微粒子は、５マイクロメートル以下の体積メジアン径を有する。いくつかの実施形態では、微粒子は、４マイクロメートル以下の体積メジアン径を有する。いくつかの実施形態では、微粒子は、３マイクロメートル以下の体積メジアン径を有する。いくつかの実施形態では、微粒子は、２マイクロメートル以下の体積メジアン径を有する。いくつかの実施形態では、微粒子は、１マイクロメートル以下の体積メジアン径を有する。
【0016】
いくつかの実施形態では、複数の噴霧乾燥粒子は、０．６超、０．７超、０．８超、または０．９超の平均球形度を有する。いくつかの実施形態では、複数の噴霧乾燥粒子は、３，０００ｎｍ、２，５００ｎｍ、２，０００ｎｍ、１，５００ｎｍ、１，０００ｎｍ、または５００ｎｍ未満のＺ平均サイズを有する。
【0017】
いくつかの実施形態では、複数の噴霧乾燥粒子は、２０％未満、１８％未満、１６％未満、１４％未満、１２％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、または０．１％未満の残留水分含量を含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、乾燥粉末製剤は、吸入可能である。いくつかの実施形態では、乾燥粉末製剤は、定量吸入器で乾燥粉末として吸入される。いくつかの実施形態では、乾燥粉末製剤は、希釈剤で再構成され、霧化によって投与される。
【0019】
いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、脂質およびポリマーの合計重量の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％を構成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、脂質およびポリマーの合計重量の、約１０～９０％、１０～８０％、１０～７０％、１０～６０％、１０～５０％、１０～４０％、１０～３０％、１０～２０％、１５～２０％、１５～２５％、１５～３０％、１５～３５％、１５～４０％、１５～４５％、１５～５０％、１５～５５％、１５～６０％、１５～６５％、１５～７０％、１５～７５％、１５～８０％、または１５～９０％を構成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、脂質およびポリマーの合計重量の９０％、８０％、７０％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、または２０％以下を構成する。
【0020】
いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、乾燥粉末の総重量の少なくとも５０％を構成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、乾燥粉末の総重量の少なくとも４０％を構成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、乾燥粉末の総重量の少なくとも３０％を構成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマー
は、乾燥粉末の総重量の少なくとも２０％を構成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、乾燥粉末の総重量の少なくとも１５％を構成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、乾燥粉末の総重量の少なくとも１２％を構成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、乾燥粉末の総重量の少なくとも１０％を構成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、乾燥粉末の総重量の少なくとも９％を構成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、乾燥粉末の総重量の少なくとも８％を構成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、乾燥粉末の総重量の少なくとも７％を構成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、乾燥粉末の総重量の少なくとも６％を構成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、乾燥粉末の総重量の少なくとも５％を構成する。
は、乾燥粉末の総重量の少なくとも２０％を構成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、乾燥粉末の総重量の少なくとも１５％を構成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、乾燥粉末の総重量の少なくとも１２％を構成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、乾燥粉末の総重量の少なくとも１０％を構成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、乾燥粉末の総重量の少なくとも９％を構成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、乾燥粉末の総重量の少なくとも８％を構成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、乾燥粉末の総重量の少なくとも７％を構成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、乾燥粉末の総重量の少なくとも６％を構成する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、乾燥粉末の総重量の少なくとも５％を構成する。
【0021】
いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、キトサン、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ｑ－カプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリアミドアミン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ（ヒドロキシアルキルＬ－アスパラギン）、ポリ（ヒドロキシアルキルＬ－グルタミン）、ポリ（２－アルキルオキサゾリン）アクリレート、修飾アクリレートおよびポリメタクリレート系ポリマー、ポリ－Ｎ－（２－ヒドロキシル－プロピル）メタアクリルアミド、ポリ－２－（メタクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン、ポリ（２－（メタクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン）、ならびにポリ（ジメチルアミノエチルメチルアクリレート）（ｐＤＭＡＥＭＡ）からなる群から選択される。
【0022】
いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、ポリメタクリレート系ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、Ｅｕｄｒａｇｉｔ ＥＰＯを含む。
【0023】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを封入する１つ以上のＬＮＰ（ｍＲＮＡ担持ＬＮＰとも呼ばれる）は、１～２０、１～１５、１～１０、２～８、２～６、または２～４の範囲の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、１～２０の範囲の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、１～１８の範囲の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、１～１６の範囲の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、１～１４の範囲の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、１～１２の範囲の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、１～１０の範囲の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、１～８の範囲の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、１～６の範囲の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、２～２０の範囲の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、２～１６の範囲の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、２～１２の範囲の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、２～８の範囲の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、２～６の範囲の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、２～４の範囲の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、４～２０の範囲の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、４～１６の範囲の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ
）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、４～１４の範囲の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、４～１２の範囲の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、４～１０の範囲の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持ＬＮＰは、２または４の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持ＬＮＰは、２の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持ＬＮＰは、４の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。
）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、４～１４の範囲の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、４～１２の範囲の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、４～１０の範囲の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持ＬＮＰは、２または４の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持ＬＮＰは、２の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持ＬＮＰは、４の脂質：ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を有する。
【0024】
いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、７０％以上の封入効率を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、７５％以上の封入効率を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、８０％以上の封入効率を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、８５％以上の封入効率を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、９０％以上の封入効率を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、９２％以上の封入効率を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、９４％以上の封入効率を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、９５％以上の封入効率を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、９６％以上の封入効率を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、９７％以上の封入効率を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、９８％以上の封入効率を有する。
【0025】
いくつかの実施形態では、１つ以上の脂質は、カチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、Ｃ１２－２００、ＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレイル－３－トリメチタアンモニウムプロパン）、ＤＯＤＡＰ（１，２－ジオレイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＨＧＴ４００３、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＩＣＥ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0026】
いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、１つ以上のカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、イオン化可能なカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質Ｃ１２－２００を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質ＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレイル－３－トリメチタモニウムプロパン）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質ＤＯＤＡＰ（１，２－ジオレイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質ＤＯＴＭＡ（１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質ＤＬｉｎＤＭＡを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質ＨＧＴ－５０００を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質ＨＧＴ－５００１を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質ＨＧＴ－５００２を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質ｃＫＫ－Ｅ１２を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質ＯＦ－０２を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質標的２３を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質化合物１を含む。いくつかの実施形態では、
１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質化合物２を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質化合物３を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質ＨＧＴ４００１を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質ＨＧＴ４００２を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質ＨＧＴ４００３を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質ＨＧＴ４００４を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質ＨＧＴ４００５を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質１８：１カーボンテールリボース脂質を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質ＩＣＥを含む。
１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質化合物２を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質化合物３を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質ＨＧＴ４００１を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質ＨＧＴ４００２を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質ＨＧＴ４００３を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質ＨＧＴ４００４を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質ＨＧＴ４００５を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質１８：１カーボンテールリボース脂質を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、カチオン性脂質ＩＣＥを含む。
【0027】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中の総脂質のモルで約２５～５０％を構成する。
【0028】
いくつかの実施形態では、１つ以上の脂質は、ＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質は、Ｃ６～Ｃ２０長の１つ以上のアルキル鎖を含む脂質に共有結合された、長さが最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質は、ＬＮＰ中の総脂質のモルで最大２０％、１５％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％を構成する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＬＮＰ中の総脂質のモルで約１～１５％を構成する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＬＮＰ中の総脂質のモルで少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、８％、１０％、または１２％を構成する。
【0029】
いくつかの実施形態では、本発明による好適なＬＮＰは、２脂質成分ＬＮＰである。
【0030】
いくつかの実施形態では、１つ以上脂質は、中性脂質またはコレステロール系脂質を含まない。
【0031】
いくつかの実施形態では、１つ以上脂質は、中性脂質および／またはコレステロール系脂質をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の脂質は、中性脂質をさらに含む。
【0032】
いくつかの実施形態では、本発明による好適なＬＮＰは、３脂質成分ＬＮＰである。
【0033】
いくつかの実施形態では、本発明による乾燥粉末製剤は、少なくとも１つの糖をさらに含む。いくつかの実施形態では、糖は、単糖類、二糖類、多糖類、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ソルボース、ラクトース、スクロース、セロビオース、トレハロース、ラフィノース、デンプン、デキストラン、マルトデキストリン、シクロデキストリン、イヌリン、キシリトール、ソルビトール、ラクチトール、マンニトール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、糖は、マンニトールである。いくつかの実施形態では、糖は、総重量の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満を構成する。
【0034】
いくつかの実施形態では、本発明による乾燥粉末製剤は、エステル、ウレタン、ホスホエステル、ホスファゼン、アミノ酸、コラーゲン、キトサン、多糖類、アルブミン、界面活性剤、緩衝剤、塩、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
【0035】
いくつかの実施形態では、好適な界面活性剤は、ＣＨＡＰＳ（３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート）、リン脂質、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、トリトンＸ－１００、コカミドモノエタノールアミン、コカミドジエタノールアミン、モノステアリン酸グリセロール、モノラウリン酸グリセロール、ソルビタンモオノラウレエート（Ｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｏｎｏｌａｕｒｅａｔｅ）、モノステアリン酸ソルビタン、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｔｗｅｅｎ ８０、アルキルポリグルコシド、およびポロキサマー（例えば、ポロキサマー４０７）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、好適な界面活性剤は、ポロキサマーである。
【0036】
いくつかの実施形態では、本発明による乾燥粉末製剤は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、エステル、ウレタン、ホスホエステル、ホスファゼン、アミノ酸、コラーゲン、キトサン、多糖類、アルブミン、界面活性剤、緩衝剤、塩、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0037】
いくつかの実施形態では、本発明による乾燥粉末製剤は、界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ＣＨＡＰＳ（３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート）、リン脂質、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、トリトンＸ－１００、コカミドモノエタノールアミン、コカミドジエタノールアミン、モノステアリン酸グリセロール、モノラウリン酸グリセロール、ソルビタンモオノラウレエート（Ｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｏｎｏｌａｕｒｅａｔｅ）、モノステアリン酸ソルビタン、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｔｗｅｅｎ ８０、アルキルポリグルコシド、およびコポリマーからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポロキサマーである。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の２つの親水性ブロックに隣接したポリプロピレングリコールの中心疎水性ブロックからなるトリブロックコポリマーであるポロキサマーである。いくつか実施形態では、界面活性剤は、ポロキサマー４０７である。
【0038】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、乾燥粉末の合計重量の最大１０％を構成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、乾燥粉末の合計重量の最大９％を構成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、乾燥粉末の合計重量の最大８％を構成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、乾燥粉末の合計重量の最大７％を構成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、乾燥粉末の合計重量の最大６％を構成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、乾燥粉末の合計重量の最大５％を構成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、乾燥粉末の合計重量の最大４％を構成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、乾燥粉末の合計重量の最大３％を構成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、乾燥粉末の合計重量の最大２％を構成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、乾燥粉末の合計重量の１～１０％を構成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、乾燥粉末の合計重量の１～６％を構成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、乾燥粉末の合計重量の１～５％を構成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、乾燥粉末の合計重量の１～４％を構成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、乾燥粉末の合計重量の１～３％を構成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、乾燥粉末の合計重量の２～１０％を構成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、乾燥粉末の合計重量の２～９％を構成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、乾燥粉末の合計重量の２～８％を構成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、乾燥粉末の合計重量の２～７％を構成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、乾燥粉末の合計重量の２～６％
を構成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、乾燥粉末の合計重量の２～５％を構成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、修飾されていない。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。
を構成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、乾燥粉末の合計重量の２～５％を構成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、修飾されていない。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。
【0039】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、治療用タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、ＣＦＴＲである。
【0040】
いくつかの実施形態では、ＣＦＴＲ ｍＲＮＡは、噴霧乾燥粒子の合計重量の約１～２０％、１～１５％、１～１０％、１～８％、１～６％、１～５％、５～１５％、または５～１０％を構成する。いくつかの実施形態では、ＣＦＴＲ ｍＲＮＡは、噴霧乾燥粒子の合計重量の約１％、２％、３％、４％、５％、７．５％、１０％、１２．５％、または１５％を構成する。
【0041】
別の態様では、本発明は、インビボ発現のための嚢胞性線維症コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を送達する方法を提供し、それを必要とする対象に、本明細書に記載される乾燥粉末製剤を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される乾燥粉末製剤は、肺送達によって投与される。いくつかの実施形態では、乾燥粉末製剤は、吸入により投与される。
【0042】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載される乾燥粉末製剤を液体溶液に再構成する工程、およびそれを必要とする対象に再構成された液体溶液を投与する工程を含む、インビボ発現のための嚢胞性線維症コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を送達する方法を提供する。いくつかの実施形態では、再構成された液体溶液は、霧化によって投与される。いくつかの実施形態では、対象は、嚢胞性線維症に罹患している。
【0043】
別の態様では、本発明は、ｍＲＮＡ、１つ以上の脂質、およびポリマーを含む混合物を提供すること、ならびに混合物を噴霧乾燥して複数の粒子を形成することを含む、乾燥粉末製剤を製造する方法を提供する。
【0044】
いくつかの実施形態では、ポリマーを添加する前に、１つ以上の脂質は、最初にｍＲＮＡと混合されて、ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を形成する。
【0045】
いくつかの実施形態では、本発明による方法は、噴霧乾燥の前に、混合物に１つ以上の賦形剤を添加することをさらに含む。
【0046】
いくつかの実施形態では、複数の噴霧乾燥粒子は、以下：ａ）１０％未満の水分含量、ｂ）５マイクロメートル未満の体積メジアン径を有する微粒子の画分、ｃ）１０～３０００ｎｍのＺ平均サイズ範囲、ｄ）１～２０のＮ／Ｐ比の範囲、ｅ）８０％超のｍＲＮＡ封入効率、およびｆ）９５％超のｍＲＮＡ完全性のうちの１つ以上によって特徴付けられる。
【0047】
さらに別の態様では、本発明は、インビボでｍＲＮＡを送達する方法を提供し、それを必要とする対象に、本明細書に記載される乾燥粉末製剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、乾燥粉末製剤は、経口、鼻腔、気管、肺、または直腸経路を介して投与される。いくつかの実施形態では、乾燥粉末製剤は、吸入により投与される。いくつかの実施形態では、乾燥粉末製剤は、鼻腔内噴霧により投与される。いくつかの実施形態では、製剤は、定量吸入器によって投与される。いくつかの実施形態では、製剤は、霧化器によって投与される。
【0048】
さらに別の態様では、本発明は、インビボ発現のための嚢胞性線維症コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を送達する方法を提供し、それを必要とする対象に、本明細書に記載される乾燥粉末製剤を投与する工程を含む。
【0049】
さらに別の態様では、本発明は、有効用量の、本明細書に記載される乾燥粉末製剤中のｍＲＮＡを患者に投与することによって、患者における疾患または障害を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、嚢胞性線維症；喘息；ＣＯＰＤ；肺気腫；内臓逆位を伴うもしくは伴わない原発性毛様体ジスキネジア（ＣＩＬＤ１）、またはカルタゲナー症候群；肺線維症；バート・ホッグ・デュベ症候；遺伝性出血性毛細血管拡張症；アルファ－１抗トリプシン欠損症；チトクロームｂ陽性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ、Ｘ線）；チトクロームｂ陽性肉芽腫性疾患、常染色体劣性；表面活性物質欠損症、肺表面活性物質代謝異常１、肺表面活性物質代謝異常２型、肺表面活性物質代謝異常３型；未熟児の呼吸窮迫症候群；結核、インフルエンザを含む肺ウイルス性疾患、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）から選択される。
【0050】
本発明の追加の目的および利点は、以下の説明に部分的に記載され、部分的には、説明から明らかであるか、または本発明の実践によって学ぶことができる。本発明の目的および利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素および組み合わせによって実現され、達成される。
【0051】
前述の一般説明および以下の詳細な説明の両方は、例示的かつ説明的であり、特許請求の範囲にある本発明を限定するものではないことが理解されるべきである。
【0052】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付図面は、本発明のいくつかの実施形態を示し、説明と共に、本発明の原理を説明する役割を果たす。
【0053】
図面は、単に例示を目的とするものであり、制限するためのものではない。
【図面の簡単な説明】
【0054】
【図1】ｍＲＮＡ製剤の噴霧乾燥技術の例示的な図解を示す。
【図2】製剤中のポリマーなしまたはありの、噴霧乾燥後のＬＮＰ封入ｍＲＮＡ物質の回収パーセントを示す。
【図3】完全性評価のためのｍＲＮＡ参照の分光光度分析を示す。
【図4】脂質ナノ粒子からの抽出時のｍＲＮＡの完全性を示す例示的なデータを示す。
【図5】噴霧乾燥および４℃での保存後２週間でのポリマーを含む製剤中のＬＮＰに封入されたｍＲＮＡの完全性を示す例示的なデータを示す。
【図6】噴霧乾燥および－２０℃での保存後２週間でのポリマーを含む製剤中のＬＮＰに封入されたｍＲＮＡの完全性を示す例示的なデータを示す。
【図7】ポリマーを含む製剤中のＬＮＰに封入され、噴霧乾燥後２週間保存されたｍＲＮＡの完全性に保存温度の影響がないことを示す例示的なデータを示す。
【図8】噴霧乾燥および４℃での保存後４週間でのポリマーを含む製剤中のＬＮＰに封入されたｍＲＮＡの完全性を示す例示的なデータを示す。
【図9】噴霧乾燥および－２０℃での保存後４週間でのポリマーを含む製剤中のＬＮＰに封入されたｍＲＮＡの完全性を示す例示的なデータを示す。
【図10】４℃で保存された、噴霧乾燥後３週間でのポリマー（ＬＮＰなし）を含む製剤におけるｍＲＮＡの完全性を示す例示的なデータを示す。
【図11】－２０℃で保存された、噴霧乾燥後３週間でのポリマー（ＬＮＰなし）を含む製剤におけるｍＲＮＡの完全性を示す例示的なデータを示す。
【図12】ポリマー（ＬＮＰなし）で製剤化され、噴霧乾燥後３週間保存されたｍＲＮＡの完全性に保存温度の影響がないことを示す例示的なデータを示す。
【図13】４℃で保存された、噴霧乾燥後５週間でのポリマー（ＬＮＰなし）を含む製剤におけるｍＲＮＡの完全性を示す例示的なデータを示す。
【図14】－２０℃で保存された、噴霧乾燥後５週間でのポリマー（ＬＮＰなし）を含む製剤におけるｍＲＮＡの完全性を示す例示的なデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【0055】
定義
本発明がより容易に理解されるように、ある特定の用語が以下で最初に定義される。以下の用語および他の用語の追加の定義は、明細書全体を通して定められている。
本発明がより容易に理解されるように、ある特定の用語が以下で最初に定義される。以下の用語および他の用語の追加の定義は、明細書全体を通して定められている。
【0056】
動物：本明細書で使用される場合、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態では、「動物」とは、任意の発育段階のヒトを指す。いくつかの実施形態では、「動物」とは、任意の発育段階の非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、および／またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物には、哺乳動物、鳥、爬虫類、両生類、魚、昆虫、および／または寄生虫が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、および／またはクローンであり得る。
【0057】
およそまたは約：本明細書で使用される場合、目的とする１つ以上の値に適用される「およそ」または「約」という用語は、提示される参照値と同様の値を指す。特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、特に明記しない限り、または文脈からそうでないことが明らかでない限り（そのような数が可能値の１００％を超える場合を除く）、記述された参照値のいずれかの方向（より大きいかまたは小さい）で２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の値の範囲を指す。
【0058】
送達：本明細書で使用される際に、「送達」という用語は、局所送達および全身送達の両方を包含する。例えば、ｍＲＮＡの送達は、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、そのコードされたタンパク質が発現され、そしてその標的組織内で保持される状況（「局所分布」または「局所送達」とも称される）、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、そのコードされたタンパク質が発現され、そして患者の循環系（例えば、血清）内に分泌され、そして全身に分布され、他の組織によって取り込まれる状況（「全身分布」または「全身送達」とも称される）を包含する。
【0059】
封入：本明細書で使用される場合、「封入」という用語または文法的等価物は、ナノ粒子内に個々のｍＲＮＡ分子を閉じ込めるプロセスを指す。
【0060】
発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」とは、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳、複数のポリペプチドのインタクトなタンパク質（例えば、酵素）への集合、および／またはポリペプチドもしくは完全に集合したタンパク質（例えば、酵素）の翻訳後修飾を指す。本出願では、「発現」および「生成」という用語、ならびに文法的同義語は、互換的に使用される。
【0061】
改善する、増加させる、または減少させる：本明細書で使用される場合、「改善する」、「増加させる」、もしくは「減少させる」、または文法的同義語は、ベースライン測定、例えば、本明細書に記載の治療の開始前の同じ個体における測定、または本明細書に記載の治療の不在下での対照対象（または複数の対照対象）における測定と比較した値を示す。「対照対象」とは、治療されている対象と同じ疾患形態に罹患しており、治療されている対象とほぼ同じ年齢の対象である。
【0062】
インビトロ：本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、多細胞生物内ではなく、人工環境下で、例えば、試験管または反応容器内、細胞培養下等で生じる事象を指す。
【0063】
インビボ：本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物等の多細胞生物内で生じる事象を指す。細胞型系の文脈において、該用語は、生細胞内で生じる事象を意味するのに（例えば、インビトロ系の対語として）使用され得る。
【0064】
局所分布または局所送達：本明細書において使用される場合、「局所分布」、「局所送達」という用語、または文法的等価物は、組織特異的な送達または分布を指す。典型的には、局所分布または局所送達は、細胞内で翻訳および発現される、または分泌が限定的で、患者の循環系へ入ることを回避する、ｍＲＮＡにコードされるタンパク質（たとえば酵素）を必要とする。
【0065】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」という用語は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。本明細書で使用されるｍＲＮＡは、修飾および未修飾の両方のＲＮＡを包含する。ｍＲＮＡは１つ以上のコード領域および非コード領域を含み得る。ｍＲＮＡは、自然源から精製されてもよく、組換え発現系を用いて産生されてもよく、また任意選択的に精製、化学合成などをされてもよい。必要に応じて、例えば、化学合成された分子の場合、ｍＲＮＡは、化学修飾された塩基または糖類、骨格修飾などを有する類似体といった、ヌクレオシド類似体を含み得る。ｍＲＮＡ配列は、別途指示されない限り、５’から３’の方向に提示される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン）、化学修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）、介在塩基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ ｂａｓｅ）、修飾された糖類（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）、ならびに／または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホルアミダイト結合）であるか、またはそれを含む。
【0066】
Ｎ／Ｐ比：本明細書で使用される場合、「Ｎ／Ｐ比」という用語は、その脂質ナノ粒子
内に封入されたｍＲＮＡ中の負に荷電された分子単位に対する、脂質ナノ粒子中のカチオン性脂質中の正に荷電された分子単位のモル比を指す。このように、Ｎ／Ｐ比は、典型的には、脂質ナノ粒子内のカチオン性脂質中のアミン基のモルの、その脂質ナノ粒子内に封入されたｍＲＮＡ中のリン酸基のモルに対する比として計算される。
内に封入されたｍＲＮＡ中の負に荷電された分子単位に対する、脂質ナノ粒子中のカチオン性脂質中の正に荷電された分子単位のモル比を指す。このように、Ｎ／Ｐ比は、典型的には、脂質ナノ粒子内のカチオン性脂質中のアミン基のモルの、その脂質ナノ粒子内に封入されたｍＲＮＡ中のリン酸基のモルに対する比として計算される。
【0067】
患者：本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」という用語は、例えば、実験、診断、予防、美容、および／または治療目的のために、提供される組成物が投与され得る任意の生物を指す。典型的な患者には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、および／またはヒト等の哺乳動物）が含まれる。いくつかの実施形態では、患者は、ヒトである。ヒトには、出生前形態および出生後形態が含まれる。
【0068】
薬学的に許容される：本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、合理的な利益／リスクの比率に応じてヒトおよび動物の組織に接触させて使用するのに適した物質を指す。
【0069】
皮下投与：本明細書で使用される場合、「皮下投与」または「皮下注射」という用語は、皮膚および筋肉の間の組織層である皮下組織へのボーラス注射を指す。
【0070】
対象：本明細書で使用される際に、用語「対象」は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類）を指す。ヒトには、出生前形態および出生後形態が含まれる。多くの実施形態では、対象は、ヒトである。対象は、患者であり得る。疾患の診断または治療のために医療提供者に受診するヒトを指す。「対象」という用語は、本明細書では「個体」または「患者」と互換的に使用される。対象は、疾患または障害に罹患している場合があるか、またはそれに罹り易いが、疾患または障害の症状を呈する場合も呈さない場合もある。
【0071】
治療有効量：本明細書で使用される場合、治療薬の「治療有効量」という用語は、疾患、障害、および／または状態に罹患しているか、またはそれに罹り易い対象に投与されたときに、疾患、障害、および／または状態の症状（複数可）を治療する、診断する、予防する、および／またはその発症を遅延させるのに十分な量を意味する。当業者であれば、治療有効量が、典型的には、少なくとも１つの単位用量を含む投薬レジメンにより投与されることを理解する。
【0072】
治療すること：本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、または「治療すること」という用語は、特定の疾患、障害、および／または状態の１つ以上の症状または特徴を部分的にまたは完全に緩和する、改善する、軽減する、抑制する、予防、その発症を遅延させる、その重症度を低下させる、および／またはその発生率を低下させるために使用される任意の方法を指す。疾患の徴候を示していない対象、および／または疾患の初期の徴候のみを示している対象に対して、その疾患に関連する病態を発症させるリスクを減少させることを目的として、治療が行われる場合がある。
【0073】
本発明は、治療的使用のためのｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子（ｍＲＮＡ－ＬＮＰ）を含む安定した乾燥粉末製剤を提供する。特に、本発明は、各噴霧乾燥粒子が１つ以上のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子およびポリマーを含む、複数の噴霧乾燥粒子を含むｍＲＮＡを送達するための乾燥粉末製剤、ならびにそれらを作製および使用する方法を提供する。
【0074】
本発明の様々な態様が、以下のセクションで詳細に記載される。セクションの使用は、本発明を限定することを意味しない。各セクションは、本発明の任意の態様に適用することができる。本出願において、「または」の使用は、別段の記述がない限り、「および／
または」を意味する。
または」を意味する。
【0075】
噴霧乾燥プロセス
本発明を実施するために、様々な噴霧乾燥プロセスが使用され得る。プロセスは、概して、組成物の液体形態を装置に通すことによって組成物から水分を除去することを含み、図１として簡略化された図式描写が提供される。簡潔には、目的の組成物を含む液体製剤は、狭い入口噴霧の「アトマイザー」ノズルを通して、乾燥チャンバである第１のチャンバ内に通過される。通常、液体製剤は、定常流で通過される。液体製剤は、小さな液滴として乾燥チャンバ内に噴霧される。加熱された空気またはガスの流れはまた、乾燥チャンバ内に誘導されて、気流を形成する。この加熱された流れを通した製剤の通過は、入ってくる液滴を分散し、それらを固体粒子形態に乾燥する。この生成物は、コネクタまたはパイプを通して流れることによって第２のチャンバに誘導される。第２のチャンバは、サイクロン粉末収集器である。ここで、空気循環はサイクロンを生成し、粉末粒子は、渦流を介して出口端に取り付けられた収集容器に収集される。サイクロンチャンバは、排気ファンに取り付けられており、構成要素を冷却するのに役立つ。入口温度および出口温度は、オペレータで調整可能である。それぞれの入口温度および出口温度、チャンバ温度、液体供給流量（吸引器％）、圧力、加熱気流の性質、および最も重要なことに、液体供給の組成は、任意の粒子状物質の最適な乾燥のために好適に調整される。
本発明を実施するために、様々な噴霧乾燥プロセスが使用され得る。プロセスは、概して、組成物の液体形態を装置に通すことによって組成物から水分を除去することを含み、図１として簡略化された図式描写が提供される。簡潔には、目的の組成物を含む液体製剤は、狭い入口噴霧の「アトマイザー」ノズルを通して、乾燥チャンバである第１のチャンバ内に通過される。通常、液体製剤は、定常流で通過される。液体製剤は、小さな液滴として乾燥チャンバ内に噴霧される。加熱された空気またはガスの流れはまた、乾燥チャンバ内に誘導されて、気流を形成する。この加熱された流れを通した製剤の通過は、入ってくる液滴を分散し、それらを固体粒子形態に乾燥する。この生成物は、コネクタまたはパイプを通して流れることによって第２のチャンバに誘導される。第２のチャンバは、サイクロン粉末収集器である。ここで、空気循環はサイクロンを生成し、粉末粒子は、渦流を介して出口端に取り付けられた収集容器に収集される。サイクロンチャンバは、排気ファンに取り付けられており、構成要素を冷却するのに役立つ。入口温度および出口温度は、オペレータで調整可能である。それぞれの入口温度および出口温度、チャンバ温度、液体供給流量（吸引器％）、圧力、加熱気流の性質、および最も重要なことに、液体供給の組成は、任意の粒子状物質の最適な乾燥のために好適に調整される。
【0076】
いくつかの実施形態では、入口温度は、４０℃～２００℃の範囲内で調整可能である。いくつかの実施形態では、出口温度は、２０～７０℃の範囲である。ポンプおよび吸引器の相対圧力も、オペレータで調整可能である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子を噴霧乾燥するために、入口温度は、７０℃～２００℃で調整される。いくつかの実施形態では、入口温度は、８０℃～２００℃で調整される。いくつかの実施形態では、入口温度は、９０℃～２００℃で調整される。いくつかの実施形態では、入口温度は、９５℃～１８０℃で調整される。いくつかの実施形態では、入口温度は、９５℃～１６０℃で調整される。いくつかの実施形態では、入口温度は、９０℃～１５０℃で調整される。いくつかの実施形態では、入口温度は、９０℃～１２０℃で調整される。いくつかの実施形態では、入口温度は、９０℃～１００℃で調整される。いくつかの実施形態では、入口温度は、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、または１００℃である。
【0077】
乾燥チャンバへの吸引器の割合は、典型的には５０％～１００％で調整される。いくつかの実施形態では、乾燥チャンバへの吸引器の割合は、５０％～１００％で調整される。いくつかの実施形態では、乾燥チャンバへの吸引器の割合は、６０％～１００％で調整される。いくつかの実施形態では、乾燥チャンバへの吸引器の割合は、７０％～１００％で調整される。いくつかの実施形態では、乾燥チャンバへの吸引器の割合は、８０％～１００％で調整される。ある特定の実施形態では、吸引器の割合は、８０％～９０％で調整される。いくつかの実施形態では、吸引器の割合は、１００％未満であるか、または９５％未満であるか、または９０％未満であるか、または８５％未満であるか、または８０％未満である。
【0078】
いくつかの実施形態では、乾燥チャンバへの入口を通る液体流は、１０％～５０％の範囲に設定されるポンプによって調整される。いくつかの実施形態では、ポンプは、２０％～４０％の範囲に設定される。いくつかの実施形態では、ポンプは、１０％～３０％の範囲に設定される。いくつかの実施形態では、ポンプは、２０％～３０％の範囲に設定される。いくつかの実施形態では、ポンプは、３０％～５０％の範囲に設定される。いくつかの実施形態では、ポンプは、２５％に設定される。
【0079】
いくつかの実施形態では、出口温度は、２０℃～７０℃の範囲である。いくつかの実施形態では、出口温度は、３０℃～６０℃である。いくつかの実施形態では、出口温度は、
２０℃～５０℃である。いくつかの実施形態では、出口温度は、３０℃～５０℃である。いくつかの実施形態では、出口温度は、４０℃～５０℃である。いくつかの実施形態では、出口温度は、４５℃～５０℃である。
２０℃～５０℃である。いくつかの実施形態では、出口温度は、３０℃～５０℃である。いくつかの実施形態では、出口温度は、４０℃～５０℃である。いくつかの実施形態では、出口温度は、４５℃～５０℃である。
【0080】
ｍＲＮＡ－ＬＮＰの噴霧乾燥は、任意の好適な噴霧乾燥装置を使用して実施することができる。当業者に既知であるように、様々な噴霧乾燥装置が市販されており、本発明を実施するために使用することができる。本発明に好適な例示的な市販の装置には、以下が含まれるが、これらに限定されない。Ａｎｈｙｄｒｏ ＭｉｃｒａＳｐｒａｙ Ｄｒｙｅｒ
Ｂ－２９０；Ａｎｈｙｄｒｏ ＭｉｃｒａＳｐｒａｙ Ｄｒｙｅｒ Ｂ－９０（Ｂｕｃｈｉ製）、Ａｎｈｙｄｒｏ ＭｉｃｒａＳｐｒａｙ Ｄｒｙｅｒ ＧＭＰ；Ａｎｈｙｄｒｏ ＭｉｃｒａＳｐｒａｙ Ｄｒｙｅｒ Ａｓｅｐｔｉｃシリーズ（ＳＰＸ ＦＬＯＷ製）、ＭＤＬ－５０およびＭＤＬ－０１５（Ｆｕｊｉｓａｋｉ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ製）；Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｍｉｎｉ Ｓｐｒａｙｅｒ Ｄｒｙｅｒ ＧＡＳ４１０（Ｙａｍａｔｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａ製）；ＬＳＤ－１５００ Ｍｉｎｉ ｓｐｒａｙ ｄｒｙｅｒ、ＭＳＤ－８ Ｍｕｌｔｉ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｐｒａｙ ｄｒｙｅｒ；ＰＳＤ－１２ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｐｈａｒｍａｃｙ
ｓｐｒａｙ ｄｒｙｅｒ；（Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ Ｘｉａｎｄａｏ Ｄｒｙｉｎｇ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏ．Ｌｔｄ製）；ＴＡＬＬ ＦＯＲＭ ＤＲＹＥＲ（商標）；Ｍｕｌｔｉ－Ｓｔａｇｅ Ｄｒｙｅｒ；ＣＯＭＰＡＣＴ ＤＲＹＥＲ（商標）；ＦＩＬＴＥＲＭＡＴ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｅｒ；ＶＥＲＳＡＴＩＬＥ－ＳＤ（商標）；Ｆｌｕｉｄｉｚｅｄ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｅｒ；ＭＯＢＩＬＥ ＭＩＮＯＲ（商標）；ＳＤＭＩＣＲＯ（商標）；ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＭＩＮＯＲ（ＧＥＡ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ製）、ならびにその他多数。実験室スケールから工業製造スケールへの好都合なスケール拡大も、これらの製造業者のいくつかから入手可能である。
Ｂ－２９０；Ａｎｈｙｄｒｏ ＭｉｃｒａＳｐｒａｙ Ｄｒｙｅｒ Ｂ－９０（Ｂｕｃｈｉ製）、Ａｎｈｙｄｒｏ ＭｉｃｒａＳｐｒａｙ Ｄｒｙｅｒ ＧＭＰ；Ａｎｈｙｄｒｏ ＭｉｃｒａＳｐｒａｙ Ｄｒｙｅｒ Ａｓｅｐｔｉｃシリーズ（ＳＰＸ ＦＬＯＷ製）、ＭＤＬ－５０およびＭＤＬ－０１５（Ｆｕｊｉｓａｋｉ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ製）；Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｍｉｎｉ Ｓｐｒａｙｅｒ Ｄｒｙｅｒ ＧＡＳ４１０（Ｙａｍａｔｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａ製）；ＬＳＤ－１５００ Ｍｉｎｉ ｓｐｒａｙ ｄｒｙｅｒ、ＭＳＤ－８ Ｍｕｌｔｉ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｐｒａｙ ｄｒｙｅｒ；ＰＳＤ－１２ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｐｈａｒｍａｃｙ
ｓｐｒａｙ ｄｒｙｅｒ；（Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ Ｘｉａｎｄａｏ Ｄｒｙｉｎｇ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏ．Ｌｔｄ製）；ＴＡＬＬ ＦＯＲＭ ＤＲＹＥＲ（商標）；Ｍｕｌｔｉ－Ｓｔａｇｅ Ｄｒｙｅｒ；ＣＯＭＰＡＣＴ ＤＲＹＥＲ（商標）；ＦＩＬＴＥＲＭＡＴ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｅｒ；ＶＥＲＳＡＴＩＬＥ－ＳＤ（商標）；Ｆｌｕｉｄｉｚｅｄ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｅｒ；ＭＯＢＩＬＥ ＭＩＮＯＲ（商標）；ＳＤＭＩＣＲＯ（商標）；ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＭＩＮＯＲ（ＧＥＡ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ製）、ならびにその他多数。実験室スケールから工業製造スケールへの好都合なスケール拡大も、これらの製造業者のいくつかから入手可能である。
【0081】
噴霧乾燥ｍＲＮＡ担持ナノ粒子
本発明によれば、ｍＲＮＡ担持ナノ粒子を噴霧乾燥することは、ｍＲＮＡおよび脂質混合物にポリマーを添加することを含む。いくつかの実施形態では、ポリマーを添加する前に、脂質およびｍＲＮＡは、最初に混合されてｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を予め形成する。いくつかの実施形態では、脂質、ｍＲＮＡ、およびポリマーは、噴霧乾燥前に同時に混合される。いくつかの実施形態では、本発明による方法は、噴霧乾燥の前に、混合物に１つ以上の賦形剤を添加することをさらに含む。
本発明によれば、ｍＲＮＡ担持ナノ粒子を噴霧乾燥することは、ｍＲＮＡおよび脂質混合物にポリマーを添加することを含む。いくつかの実施形態では、ポリマーを添加する前に、脂質およびｍＲＮＡは、最初に混合されてｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を予め形成する。いくつかの実施形態では、脂質、ｍＲＮＡ、およびポリマーは、噴霧乾燥前に同時に混合される。いくつかの実施形態では、本発明による方法は、噴霧乾燥の前に、混合物に１つ以上の賦形剤を添加することをさらに含む。
【0082】
ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子
任意の所望の脂質は、ｍＲＮＡの封入に好適な任意の比で混合され得る。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および／またはＰＥＧ化脂質を含む。いくつかの実施形態では、好適な脂質混合物はまた、コレステロール系脂質を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、ポリマーまたは他の賦形剤と混合する前にｍＲＮＡおよび脂質を混合し、混合物を噴霧乾燥させることによって最初に形成される。
任意の所望の脂質は、ｍＲＮＡの封入に好適な任意の比で混合され得る。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および／またはＰＥＧ化脂質を含む。いくつかの実施形態では、好適な脂質混合物はまた、コレステロール系脂質を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、ポリマーまたは他の賦形剤と混合する前にｍＲＮＡおよび脂質を混合し、混合物を噴霧乾燥させることによって最初に形成される。
【0083】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、ｍＲＮＡ溶液を脂質溶液と混合することによって形成され、ｍＲＮＡ溶液および／または脂質溶液は、混合前に周囲温度よりも高い所定の温度に加熱される（“Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ”と題される米国特許第９，６６８，９８０号を参照されたく、その開示はその全体が本明細書に組み込まれる）。
【0084】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、予め形成された脂質ナノ粒子をｍＲＮＡと混合することによって形成される（米国特許出願公開第２０１８／０１５３８２２号を参照されたく、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
【0085】
いくつかの実施形態では、噴霧乾燥前の脂質ナノ粒子によるｍＲＮＡの封入効率は、７０％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥前の脂質ナノ粒子によるｍＲＮＡの封入効率は、７５％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥前の脂質ナノ粒子によるｍＲＮＡの封入効率は、８０％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥前の脂質ナノ粒子によるｍＲＮＡの封入効率は、８５％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥前の脂質ナノ粒子によるｍＲＮＡの封入効率は、８６％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥前の脂質ナノ粒子によるｍＲＮＡの封入効率は、８７％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥前の脂質ナノ粒子によるｍＲＮＡの封入効率は、８８％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥前の脂質ナノ粒子によるｍＲＮＡの封入効率は、８９％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥前の脂質ナノ粒子によるｍＲＮＡの封入効率は、９０％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥前の脂質ナノ粒子によるｍＲＮＡの封入効率は、９１％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥前の脂質ナノ粒子によるｍＲＮＡの封入効率は、９２％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥前の脂質ナノ粒子によるｍＲＮＡの封入効率は、９３％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥前の脂質ナノ粒子によるｍＲＮＡの封入効率は、９４％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥前の脂質ナノ粒子によるｍＲＮＡの封入効率は、９５％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥前の脂質ナノ粒子によるｍＲＮＡの封入効率は、９６％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥前の脂質ナノ粒子によるｍＲＮＡの封入効率は、９７％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥前の脂質ナノ粒子によるｍＲＮＡの封入効率は、９８％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥前の脂質ナノ粒子によるｍＲＮＡの封入効率は、９９％以上である。
【0086】
いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥した後のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、７０％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥した後のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、７５％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥した後のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、８０％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥した後のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、８５％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥した後のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、８６％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥した後のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、８７％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥した後のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、８８％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥した後のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、８９％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥した後のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、９０％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥した後のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、９１％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥した後のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、９２％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥した後のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、９３％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥した後のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、９４％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥した後のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、９５％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥した後のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、９６％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥した後のＬＮＰによるｍＲＮ
Ａの封入効率は、９７％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥した後のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、９８％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥した後のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、９９％以上である。
Ａの封入効率は、９７％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥した後のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、９８％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥した後のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、９９％以上である。
【0087】
いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥する前およびその後の両方のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、７０％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥する前およびその後の両方のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、７５％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥する前およびその後の両方のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、８０％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥する前およびその後の両方のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、８５％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥する前およびその後の両方のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、８６％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥する前およびその後の両方のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、８７％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥する前およびその後の両方のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、８８％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥する前およびその後の両方のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、８９％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥する前およびその後の両方のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、９０％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥する前およびその後の両方のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、９１％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥する前およびその後の両方のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、９２％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥する前およびその後の両方のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、９３％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥する前およびその後の両方のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、９４％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥する前およびその後の両方のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、９５％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥する前およびその後の両方のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、９６％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥する前およびその後の両方のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、９７％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥する前およびその後の両方のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、９８％以上である。いくつかの実施形態では、ポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤を噴霧乾燥する前およびその後の両方のＬＮＰによるｍＲＮＡの封入効率は、９９％以上である。
【0088】
いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の１０％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の１５％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の２０％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の２５％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の３０％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲ
ＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の３５％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の４０％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の４１％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の４２％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の４３％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の４４％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の４５％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の４６％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の４７％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の４８％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の４９％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の５０％以上である。
ＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の３５％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の４０％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の４１％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の４２％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の４３％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の４４％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の４５％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の４６％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の４７％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の４８％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の４９％以上である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥工程から回収されたポリマーおよびＬＮＰ封入ｍＲＮＡの製剤の質量は、噴霧乾燥工程前の製剤の質量の５０％以上である。
【0089】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡおよび脂質は、プロセス全体にわたって脂質／ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を一定に維持し、かつ量産化も容易にするポンプシステムを用いて混合される。いくつかの実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、１～２０の範囲である。いくつかの実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、２超、または３超、または４超、または５超、または６超、または７超、または８超、または９超、または１０超、または１１超、または１２超、または１３超、または１４超、または１５超である。いくつかの実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、１７、または１８、または１９、または２０である。
【0090】
好適なｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、様々なサイズで作製されてもよい。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥前のｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子のサイズは、脂質ナノ粒子の最大直径の長さによって決定される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、約２５０ｎｍ以下（例えば、約２２５ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、または５０ｎｍ以下）の噴霧乾燥前のサイズを有する。いくつかの実施形態では、好適なリポソームは、約１０～２５０ｎｍの範囲（例えば、約１０～２２５ｎｍ、１０～２００ｎｍ、１０～１７５ｎｍ、１０～１５０ｎｍ、１０～１２５ｎｍ、１０～１００ｎｍ、１０～７５ｎｍ、または１０～５０ｎｍの範囲）のサイズを有する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、約１００～２５０ｎｍの範囲（例えば、約１００～２２５ｎｍ、１００～２００ｎｍ、１００～１７５ｎｍ、１００～１５０ｎｍの範囲）の噴霧乾燥前のサイズを有する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、約１０～１００ｎｍの範囲（例えば、約１０～９０ｎｍ、１０～８０ｎｍ、１０～７０ｎｍ、１０～６０ｎｍ、または１０～５０ｎｍの範囲）の噴霧乾燥前のサイズを有する。特定の実施形態では、ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、約１００ｎｍ未満の噴霧乾燥前のサイズを有する。
【0091】
リポソーム集団の寸法決定に対して、当該技術分野において既知の様々な別の方法を利用することができる。こうした寸法決定方法の１つは、米国特許第４，７３７，３２３号に記載されており、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。バス超音波処理またはプローブ超音波処理のいずれかによるリポソーム懸濁液の超音波処理によって、直径
が約０．０５マイクロメートル未満の小さいＵＬＶまでサイズ漸減する。ホモジナイゼーションは別の方法であり、大きいリポソームをより小さいものに断片化するのに剪断エネルギーを利用する。典型的なホモジナイゼーション手順において、ＭＬＶは、選択されたリポソームの大きさ、典型的には約０．１～０．５マイクロメートルの大きさが観察されるまで、標準的なエマルジョンホモジナイザーを用いて再循環される。リポソームの大きさは、Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０：４２１－１５０（１９８１）（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載された準電気光散乱（ＱＥＬＳ）によって算出され得る。平均リポソーム直径を、形成されたリポソームを超音波処理することによって低減させることができる。断続的な超音波処理サイクルをＱＥＬＳ評価と交互に行って、効率的なリポソーム合成を導くことができる。
が約０．０５マイクロメートル未満の小さいＵＬＶまでサイズ漸減する。ホモジナイゼーションは別の方法であり、大きいリポソームをより小さいものに断片化するのに剪断エネルギーを利用する。典型的なホモジナイゼーション手順において、ＭＬＶは、選択されたリポソームの大きさ、典型的には約０．１～０．５マイクロメートルの大きさが観察されるまで、標準的なエマルジョンホモジナイザーを用いて再循環される。リポソームの大きさは、Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０：４２１－１５０（１９８１）（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載された準電気光散乱（ＱＥＬＳ）によって算出され得る。平均リポソーム直径を、形成されたリポソームを超音波処理することによって低減させることができる。断続的な超音波処理サイクルをＱＥＬＳ評価と交互に行って、効率的なリポソーム合成を導くことができる。
【0092】
好適なｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、ＰＥＧ化脂質、非カチオン性脂質、およびコレステロール系脂質のうちの１つ以上を含む。
【0093】
カチオン性脂質
本明細書において使用される場合、用語「カチオン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正電荷を有する多数の脂質種およびリピドイド種のいずれかを指す。いくつかのカチオン性脂質は文献に記載されており、その多くは市販されている。
本明細書において使用される場合、用語「カチオン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正電荷を有する多数の脂質種およびリピドイド種のいずれかを指す。いくつかのカチオン性脂質は文献に記載されており、その多くは市販されている。
【0094】
本発明の組成物および方法で使用するための好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１０／１４４７４０に記載されるカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、カチオン性脂質、以下の化合物構造を有する、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル ４－（ジメチルアミノ）ブタン酸塩：
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化1】
【0095】
本発明の組成物および方法で使用するためのその他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１３／１４９１４０に記載されるイオン化可能なカチオン性脂質が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のうちの一種のカチオン性脂質：
またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して水
素、任意で置換される、可変飽和または不飽和Ｃ１－Ｃ２０アルキル、および任意で置換される、可変飽和または不飽和Ｃ６－Ｃ２０アシルからなる群から選択され、式中、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して水素、任意で置換されるＣ１－Ｃ３０アルキル、任意で置換される可変不飽和Ｃ１－Ｃ３０アルケニル、および任意で置換されるＣ１－Ｃ３０アルキニルからなる群から選択され、式中、ｍおよびｏはそれぞれ独立して、ゼロおよび任意の正の整数（例えば、ｍは３）からなる群から選択され、および式中、ｎはゼロまたは任意の正の整数（例えば、ｎは１）である。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有する、カチオン性脂質（１５Ｚ、１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－ｌ－イル）テトラコサ－１５，１８－ジエン－１－アミン（「ＨＧＴ５０００」）：
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有する、カチオン性脂質（１５Ｚ、１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－４，１５，１８－トリエン－ｌ－アミン（「ＨＧＴ５００１」）：
およびその薬学的に許容される塩を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有する、カチオン性脂質および（１５Ｚ、１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－５，１５，１８－トリエン－１－アミン（「ＨＧＴ５００２」）：
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化2】
素、任意で置換される、可変飽和または不飽和Ｃ１－Ｃ２０アルキル、および任意で置換される、可変飽和または不飽和Ｃ６－Ｃ２０アシルからなる群から選択され、式中、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して水素、任意で置換されるＣ１－Ｃ３０アルキル、任意で置換される可変不飽和Ｃ１－Ｃ３０アルケニル、および任意で置換されるＣ１－Ｃ３０アルキニルからなる群から選択され、式中、ｍおよびｏはそれぞれ独立して、ゼロおよび任意の正の整数（例えば、ｍは３）からなる群から選択され、および式中、ｎはゼロまたは任意の正の整数（例えば、ｎは１）である。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有する、カチオン性脂質（１５Ｚ、１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－ｌ－イル）テトラコサ－１５，１８－ジエン－１－アミン（「ＨＧＴ５０００」）：
【化3】
【化4】
【化5】
【0096】
本発明の組成物および方法で使用するためのその他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１０／０５３５７２に、アミノアルコールリピドイドとして記載されるカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化6】
【0097】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１６／１１８７２５に記載されるカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化7】
【0098】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１６／１１８７２４に記載されるカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化8】
【0099】
本発明の組成物および方法において使用するための他の好適なカチオン性脂質は、１４，２５－ジトリデシル１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタンの式を有するカチオン性脂質、およびその薬学的に許容される塩を含む。
【0100】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１３／０６３４６８およびＷＯ２０１６／２０５６９１に記載されるカチオン性脂質が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、ＲＬの各々の事例は、独立して、任意で置換されるＣ６－Ｃ４０アルケニルである。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化9】
【化10】
【化11】
【化12】
【化13】
【0101】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１５／１８４２５６に記載されるカチオン性脂質が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、各Ｘは独立してＯまたはＳであり；各Ｙは独立してＯまたはＳであり；各ｍは独立して０～２０であり；各ｎは独立して１～６であり；各ＲＡは独立して水素、任意で置換されるＣ１－５０アルキル、任意で置換されるＣ２－５０アルケニル、任意で置換されるＣ２－５０アルキニル、任意で置換されるＣ３－１０カルボシクリル、任意で置換される３～１４員のヘテロシクリル、任意で置換されるＣ６－１４アリール、任意で置換される５～１４員のヘテロアリールまたはハロゲンであり、各ＲＢは独立して水素、任意で置換されるＣ１－５０アルキル、任意で置換されるＣ２－５０アルケニル、任意で置換されるＣ２－５０アルキニル、任意で置換されるＣ３－１０カルボシクリル、任意で置換される３～１４員のヘテロシクリル、任意で置換されるＣ６－１４アリール、任意で置換される５～１４員のヘテロアリールまたはハロゲンである。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「標的２３」：
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化14】
【化15】
【0102】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１６／００４２０２に記載されるカチオン性脂質が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
またはその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
またはその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【化16】
【化17】
【化18】
【0103】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、米国特許仮出願第６２／７５８，１７９号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
またはその薬学的に許容可能な塩を含み、式中、各Ｒ１およびＲ２は独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ６脂肪族であり、各ｍは独立して、１～４の値を有する整数であり、各Ａは独立して、共有結合またはアリーレンであり、各Ｌ１は独立して、エステル、チオエステル、ジスルフィド、または無水物基であり、各Ｌ２は独立して、Ｃ２－Ｃ１０脂肪族であり、各Ｘ１は独立して、ＨまたはＯＨであり、各Ｒ３は独立して、Ｃ６－Ｃ２０脂肪族である。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
またはその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
またはその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【化19】
【化20】
【化21】
【化22】
【0104】
本発明の組成物および方法で使用するためのその他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照により組み込まれる、Ｊ．ＭｃＣｌｅｌｌａｎ，Ｍ．Ｃ．Ｋｉｎｇ，Ｃｅｌｌ
２０１０，１４１，２１０－２１７およびＷｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２０１４）５：４２７７に記載されるカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法のカチオン性脂質は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。
２０１０，１４１，２１０－２１７およびＷｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２０１４）５：４２７７に記載されるカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法のカチオン性脂質は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
【化23】
【0105】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１５／１９９９５２に記載されるカチオン性脂質が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化24】
【化25】
【化26】
【化27】
【化28】
【化29】
【化30】
【化31】
【化32】
【化33】
【化34】
【化35】
【化36】
【0106】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１７／００４１４３に記載されるカチオン性脂質が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化37】
【化38】
【化39】
【化40】
【化41】
【化42】
【化43】
【化44】
【化45】
【化46】
【化47】
【化48】
【化49】
【化50】
【化51】
【化52】
【化53】
【0107】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１７／０７５５３１に記載されるカチオン性脂質が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｌ１またはＬ２のうちの１つは、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、または－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－で
あり；もう一つのＬ１またはＬ２は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－または－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－または直接結合であり；Ｇ１およびＧ２は、それぞれ独立して非置換Ｃ１－Ｃ１２アルキレンまたはＣ１－Ｃ１２アルケニレンであり；Ｇ３はＣ１－Ｃ２４アルキレン、Ｃ１－Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルケニレンであり；ＲａはＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立してＣ６－Ｃ２４アルキルまたはＣ６－Ｃ２４アルケニルであり；Ｒ３はＨ、ＯＲ５、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４または－ＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり、Ｒ４はＣ１－Ｃ１２アルキルであり；Ｒ５はＨまたはＣ１－Ｃ６アルキルであり；ｘは０、１または２である。
【化54】
あり；もう一つのＬ１またはＬ２は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－または－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－または直接結合であり；Ｇ１およびＧ２は、それぞれ独立して非置換Ｃ１－Ｃ１２アルキレンまたはＣ１－Ｃ１２アルケニレンであり；Ｇ３はＣ１－Ｃ２４アルキレン、Ｃ１－Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルケニレンであり；ＲａはＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立してＣ６－Ｃ２４アルキルまたはＣ６－Ｃ２４アルケニルであり；Ｒ３はＨ、ＯＲ５、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４または－ＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり、Ｒ４はＣ１－Ｃ１２アルキルであり；Ｒ５はＨまたはＣ１－Ｃ６アルキルであり；ｘは０、１または２である。
【0108】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開２０１７／１１７５２８に記載されるカチオン性脂質が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化55】
【化56】
【化57】
【0109】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１７／０４９２４５に記載されるカチオン性脂質が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法のカチオン性脂質は、以下の式のうちの１つの化合物：
およびその薬学的に許容される塩を含む。これら４つの式のうちのいずれか１つについて、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎＱおよび－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから独立して選択され、Ｑは、－ＯＲ、－ＯＨ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、および複素環からなる群から選択され、ｎは１、２または３である。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化58】
【化59】
【化60】
【化61】
【化62】
【0110】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、それぞれ本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１７／１７３０５４およびＷＯ２０１５／０９５３４０に記載されるカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化63】
【化64】
【化65】
【化66】
【0111】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質は、コレステロール系カチオン性脂質を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するイミダゾールコレステロールエステルまたは「ＩＣＥ」：
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化67】
【0112】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１２／１７０８８９に記載される切断可能カチオン性脂質が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
を含み、式中、Ｒ１は、イミダゾール、グアニジニウム、アミノ、イミン、エナミン、任意で置換されるアルキルアミノ（例えば、ジメチルアミノなどのアルキルアミノ）およびピリジルからなる群から選択され、式中、Ｒ２は、以下の２つの式のうちの１つからなる群から選択され：
式中、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、任意で置換される可変飽和または不飽和Ｃ６－Ｃ２０アルキルおよび任意で置換される可変飽和または不飽和Ｃ６－Ｃ２０アシルからなる群から選択され、式中、ｎは、０または任意の正の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上）である。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００１」：
およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００２」：
およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００３」：
およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００４」：
およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００５」：
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【化68】
【化69】
【化70】
【化71】
【化72】
【化73】
【化74】
【0113】
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、２０１８年５月１６日に出願された米国仮出願第６２／６７２，１９４号に記載される切断可能カチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、一般式のうちのいずれか、または米国仮出願第６２／６７２，１９４号に記載される構造（１ａ）～（２１ａ）および（１ｂ）～（２１ｂ）および（２２）～（２３７）のうちのいずれかであるカチオン性脂質を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、式（Ｉ’）による構造を有するカチオン性脂質を含み：
式中、
ＲＸは独立して、－Ｈ、－Ｌ１－Ｒ１、または－Ｌ５Ａ－Ｌ５Ｂ－Ｂ’であり、
Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３の各々は独立して、共有結合、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、または－Ｃ（Ｏ）ＮＲＬ－であり、
各Ｌ４ＡおよびＬ５Ａは独立して、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－Ｃ（Ｏ）ＮＲＬ－であり、
各Ｌ４ＢおよびＬ５Ｂは独立して、Ｃ１－Ｃ２０アルキレン、Ｃ２－Ｃ２０アルケニレン、またはＣ２－Ｃ２０アルキニレンであり、
各ＢおよびＢ’は、ＮＲ４Ｒ５または５～１０員の窒素含有ヘテロアリールであり、
各Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は独立して、Ｃ６－Ｃ３０アルキル、Ｃ６－Ｃ３０アルケニル、またはＣ６－Ｃ３０アルキニルであり、
各Ｒ４およびＲ５は独立して、水素、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、Ｃ２－Ｃ１０アルケニル、またはＣ２－Ｃ１０アルキニルであり、
各ＲＬは独立して、水素、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ２－Ｃ２０アルケニル、またはＣ２－Ｃ２０アルキニルである。
【化75】
ＲＸは独立して、－Ｈ、－Ｌ１－Ｒ１、または－Ｌ５Ａ－Ｌ５Ｂ－Ｂ’であり、
Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３の各々は独立して、共有結合、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、または－Ｃ（Ｏ）ＮＲＬ－であり、
各Ｌ４ＡおよびＬ５Ａは独立して、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－Ｃ（Ｏ）ＮＲＬ－であり、
各Ｌ４ＢおよびＬ５Ｂは独立して、Ｃ１－Ｃ２０アルキレン、Ｃ２－Ｃ２０アルケニレン、またはＣ２－Ｃ２０アルキニレンであり、
各ＢおよびＢ’は、ＮＲ４Ｒ５または５～１０員の窒素含有ヘテロアリールであり、
各Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は独立して、Ｃ６－Ｃ３０アルキル、Ｃ６－Ｃ３０アルケニル、またはＣ６－Ｃ３０アルキニルであり、
各Ｒ４およびＲ５は独立して、水素、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、Ｃ２－Ｃ１０アルケニル、またはＣ２－Ｃ１０アルキニルであり、
各ＲＬは独立して、水素、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ２－Ｃ２０アルケニル、またはＣ２－Ｃ２０アルキニルである。
【0114】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有する６
２／６７２，１９４の化合物（１３９）であるカチオン性脂質を含む：
。
２／６７２，１９４の化合物（１３９）であるカチオン性脂質を含む：
【化76】
【0115】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、カチオン性脂質、Ｎ－［ｌ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）を含む。（Ｆｅｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）；本明細書に参照によって組み込まれる、米国特許第４，８９７，３５５号）。本発明の組成物および方法のために好適な他のカチオン性脂質は、例えば、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（ｃａｒｂｏｘｙｓｐｅｒｍｙｌｇｌｙｃｉｎｅｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｄｅ）（「ＤＯＧＳ」）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパンアミニウム（「ＤＯＳＰＡ」）（Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）；米国特許第５，１７１，６７８号、米国特許第５，３３４，７６１号）、ｌ，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、ｌ，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）を含む。
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）；本明細書に参照によって組み込まれる、米国特許第４，８９７，３５５号）。本発明の組成物および方法のために好適な他のカチオン性脂質は、例えば、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（ｃａｒｂｏｘｙｓｐｅｒｍｙｌｇｌｙｃｉｎｅｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｄｅ）（「ＤＯＧＳ」）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパンアミニウム（「ＤＯＳＰＡ」）（Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）；米国特許第５，１７１，６７８号、米国特許第５，３３４，７６１号）、ｌ，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、ｌ，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）を含む。
【0116】
本発明の組成物および方法に好適な追加の例示的なカチオン性脂質はまた、ｌ，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＳＤＭＡ」）；１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＯＤＭＡ」）、１，２－ジリノレイロキシオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＬｉｎＤＭＡ」）、ｌ，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＬｅｎＤＭＡ」）、Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）、Ｎ－（ｌ，２－ジミリチルチルオキシプロップ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－ｌ－（シス，シス－９，１２－オクタデカジエンオキシ）プロパン（「ＣＬｉｎＤＭＡ」）；２－［５’－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－ジメチｌ－ｌ－（シス，シス－９’，ｌ－２’－オクタデカジエンオキシ）プロパン（「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」）；Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（「ＤＭＯＢＡ」）；１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」）；２，３－ジリノレオイロイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロピルアミン（「ＤＬｉｎＤＡＰ」）、ｌ，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」）；ｌ，２－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」）；２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［ｌ，３］－ジオキソラン（「ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ」）；２－（（８－［（３Ｐ）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－
Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ」）；（２Ｒ）－２－（（８－［（３ベータ）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）」）；（２Ｓ）－２－（（８－［（３Ｐ）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ、ｆｓｌ－ジメチ３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ）」）；２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［ｌ，３］－ジオキソラン（「ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ」）、および２－（２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，ｌ ２－ジエン－１－イル）－ｌ，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタンアミン（「ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ」）を含む（本明細書に参照によって援用される国際公開第２０１０／０４２８７７号参照；Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２－１７６（２０１０））。（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７：２７６－２８７（２００５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３－１００７（２００５）；国際特許公開第２００５／１２１３４８号）。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質のうちの１つ以上は、イミダゾール部分、ジアルキルアミノ部分、またはグアニジニウム部分のうちの少なくとも１つを含む。
Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ」）；（２Ｒ）－２－（（８－［（３ベータ）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）」）；（２Ｓ）－２－（（８－［（３Ｐ）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ、ｆｓｌ－ジメチ３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ）」）；２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［ｌ，３］－ジオキソラン（「ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ」）、および２－（２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，ｌ ２－ジエン－１－イル）－ｌ，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタンアミン（「ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ」）を含む（本明細書に参照によって援用される国際公開第２０１０／０４２８７７号参照；Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２－１７６（２０１０））。（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７：２７６－２８７（２００５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３－１００７（２００５）；国際特許公開第２００５／１２１３４８号）。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質のうちの１つ以上は、イミダゾール部分、ジアルキルアミノ部分、またはグアニジニウム部分のうちの少なくとも１つを含む。
【0117】
一部の実施形態では、本発明の組成物および方法に好適な一種以上のカチオン性脂質は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（「ＸＴＣ」）；（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン（「ＡＬＮＹ－１００」）および／または４，７，１３－トリス（３－オキソ－３－（ウンデシルアミノ）プロピル）－Ｎ１，Ｎ１６－ジウンデシル－４，７，１０，１３－テトラアザヘキサデカン－１，１６－ジアミド（「ＮＣ９８－５」）を含む。
【0118】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、組成物中の総脂質含有量、例えば、脂質ナノ粒子の重量で測定して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％を構成する１つ以上のカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、組成物中の総脂質含有量、例えば、脂質ナノ粒子のｍｏｌ％で測定して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または８０％を構成する１つ以上のカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、組成物中の総脂質含有量、例えば、脂質ナノ粒子の重量で測定して、約３０～７０％（例えば、約３０～６５％、約３０～６０％、約３０～５５％、約３０～５０％、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または約３５～４０％）を構成する１つ以上のカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、組成物中の総脂質含有量、例えば、脂質ナノ粒子のｍｏｌ％で測定して、約３０～７０％（例えば、約３０～６５％、約３０～６０％、約３０～５５％、約３０～５０％、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または約３５～４０％）を構成する１つ以上のカチオン性脂質を含む。
【0119】
いくつかの実施形態では、ステロール系カチオン性脂質は、本明細書に記載されるカチオン性脂質の代わりに、またはそれに加えて使用されてもよい。好適なステロール系カチオン性脂質は、ジアルキルアミノ含有ステロール系カチオン性脂質、イミダゾール含有ステロール系カチオン性脂質、およびグアニジニウム含有ステロール系カチオン性脂質である。例えば、ある特定の実施形態は、下記の構造（Ｉ）によって示されるように、イミダ
ゾール、例えば、イミダゾールコレステロールエステル、または「ＩＣＥ」脂質（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル ３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパノエートを含む一種以上のステロール系カチオン性脂質をふくむ組成物を対象とする。ある特定の実施形態では、機能的なタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の送達のための脂質ナノ粒子は、以下の構造によって示されるように、イミダゾール系カチオン性脂質、例えば、イミダゾールコレステロールエステル、または「ＩＣＥ」脂質（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル ３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパノエートの１つ以上を含んでもよい。
ゾール、例えば、イミダゾールコレステロールエステル、または「ＩＣＥ」脂質（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル ３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパノエートを含む一種以上のステロール系カチオン性脂質をふくむ組成物を対象とする。ある特定の実施形態では、機能的なタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の送達のための脂質ナノ粒子は、以下の構造によって示されるように、イミダゾール系カチオン性脂質、例えば、イミダゾールコレステロールエステル、または「ＩＣＥ」脂質（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル ３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパノエートの１つ以上を含んでもよい。
【化77】
【0120】
いくつかの実施形態では、リポソーム中のカチオン性脂質の割合は、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、または７０％超であり得る。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（複数可）は、リポソームの約３０～５０重量％（例えば、約３０～４５重量％、約３０～４０重量％、約３５～５０重量％、約３５～４５重量％、または約３５～４０重量％）を構成する。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ＩＣＥ脂質）は、モル比でリポソームの約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約６０％、約７０％、または約８０％を構成する。
【0121】
ＰＥＧ化脂質
いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、１つ以上のＰＥＧ化脂質を含む。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質およびＮ－オクタノイル－スフィンゴシン－ｌ－［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）－２０００］（Ｃ８ ＰＥＧ－２０００セラミド）を含めた誘導体化されたセラミド（ＰＥＧ－ＣＥＲ）などの誘導体化脂質の使用も、本発明により企図される。企図されるＰＥＧ修飾脂質は、長さがＣ６～Ｃ２０のアルキル鎖を有する脂質に共有結合された長さ最大５ｋＤａのポリエチレングリコール鎖を含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾またはＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ化コレステロールまたはＰＥＧ－２Ｋである。いくつかの実施形態では、特定の有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧセラミドである。
いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、１つ以上のＰＥＧ化脂質を含む。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質およびＮ－オクタノイル－スフィンゴシン－ｌ－［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）－２０００］（Ｃ８ ＰＥＧ－２０００セラミド）を含めた誘導体化されたセラミド（ＰＥＧ－ＣＥＲ）などの誘導体化脂質の使用も、本発明により企図される。企図されるＰＥＧ修飾脂質は、長さがＣ６～Ｃ２０のアルキル鎖を有する脂質に共有結合された長さ最大５ｋＤａのポリエチレングリコール鎖を含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾またはＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ化コレステロールまたはＰＥＧ－２Ｋである。いくつかの実施形態では、特定の有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧセラミドである。
【0122】
ＰＥＧ修飾リン脂質および誘導体化脂質は、リポソーム内の総脂質の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％を構成し得る。
【0123】
非カチオン性／ヘルパー脂質
本明細書で使用される場合、語句「非カチオン性脂質」は、任意の中性脂質、双性イオン性脂質、または陰イオン性脂質を意味する。本明細書で使用される場合、語句「カチオ
ン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の負電荷を運ぶ多数の脂質種のいずれかを指す。非カチオン性脂質として、以下に限定されないが、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－ｌ－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、ｌ－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはこれらの混合物が挙げられる。
本明細書で使用される場合、語句「非カチオン性脂質」は、任意の中性脂質、双性イオン性脂質、または陰イオン性脂質を意味する。本明細書で使用される場合、語句「カチオ
ン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の負電荷を運ぶ多数の脂質種のいずれかを指す。非カチオン性脂質として、以下に限定されないが、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－ｌ－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、ｌ－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはこれらの混合物が挙げられる。
【0124】
いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％を構成し得る。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質（複数可）は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の約２０～５０％（例えば、約２０～４５％、約２０～４０％、約２５～５０％、約２５～４５％、または約２５～４０％）を構成する。
【0125】
コレステロール系脂質
いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、１つ以上のコレステロール系脂質を含む。例えば、好適なコレステロール系カチオン性脂質には、例えば、ＤＣ－Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－エチルカルボキサミドコレステロール）、１，４－ビス（３－Ｎ－オレイルアミノ－プロピル）ピペラジン（Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）；Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３，１３９（１９９７）；米国特許第５，７４４，３３５号）、またはＩＣＥが挙げられる。いくつかの実施形態では、コレステロール系脂質（複数可）は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％を構成する。いくつかの実施形態では、コレステロール系脂質（複数可）は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の約２０～５０％（例えば、約２０～４５％、約２０～４０％、約２５～５０％、約２５～４５％、または約２５～４０％）を構成する。
いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、１つ以上のコレステロール系脂質を含む。例えば、好適なコレステロール系カチオン性脂質には、例えば、ＤＣ－Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－エチルカルボキサミドコレステロール）、１，４－ビス（３－Ｎ－オレイルアミノ－プロピル）ピペラジン（Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）；Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３，１３９（１９９７）；米国特許第５，７４４，３３５号）、またはＩＣＥが挙げられる。いくつかの実施形態では、コレステロール系脂質（複数可）は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％を構成する。いくつかの実施形態では、コレステロール系脂質（複数可）は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の約２０～５０％（例えば、約２０～４５％、約２０～４０％、約２５～５０％、約２５～４５％、または約２５～４０％）を構成する。
【0126】
カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール系脂質、およびＰＥＧ修飾脂質の例示的組み合わせは、実施例のセクションに記載されている。例えば、好適な脂質溶液は、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２－２００、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５０００、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ｃＫＫ－Ｅ１２、ＤＰＰＣ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２－２００、ＤＰＰＣ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５０００、ＤＰＰＣ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；またはＨＧＴ５００１、ＤＰＰＣ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを含み得る。脂質混合物を含むカチオン性脂質、非カチオン性脂質、および／またはＰＥＧ修飾脂質の選択、ならびにこれらの脂質の相互の相対的モル比は、選択される脂質の特徴、ならびに封入されるべきｍＲＮＡの性質および特徴に基づく。さらなる考慮すべき事項には、例えば、選択される脂質（複数可）のアルキル鎖の飽和度、ならびにサイズ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、融合性、および毒性が含まれる。したがって、モル比は、適宜に調整され得る。
【0127】
典型的には、ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥混合物の総固体含量の０．１％～３０％を占める。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥されるｍＲＮＡ担持ナノ粒子組成物の総固体含量は、０．５～２０％である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥されるｍＲＮＡ担持ナノ粒子組成物の総固体含量は、２～２０％である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥されるｍＲＮＡ担持ナノ粒子組成物の総固体含量は、２～１５％である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥されるｍＲＮＡ担持ナノ粒子組成物の総固体含量は、２～１０％である。
【0128】
ポリマー
様々なポリマーが、本発明による噴霧乾燥ｍＲＮＡ－ＬＮＰに使用され得る。典型的には、好適なポリマーは毒性が低く、広範囲の濃度にわたって十分な忍容性がある。いくつかの実施形態では、好適なポリマーは、正に荷電されている。例示的なポリマーとしては、これらに限定されないが、キトサン、ポリエステル、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ｑ－カプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリアミドアミン、ポリ（ヒドロキシアルキルＬ－アスパラギン）、ポリ（ヒドロキシアルキルＬ－グルタミン）、ポリ（２－アルキルオキサゾリン）アクリレート、修飾アクリレートおよびメタクリレート系ポリマー、ポリ－Ｎ－（２－ヒドロキシル－プロピル）メタアクリルアミド、ポリ－２－（メタクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン、ポリ（２－（メタクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン）、ならびにポリ（ジメチルアミノエチルメチルアクリレート）（ｐＤＭＡＥＭＡ）が挙げられる。
様々なポリマーが、本発明による噴霧乾燥ｍＲＮＡ－ＬＮＰに使用され得る。典型的には、好適なポリマーは毒性が低く、広範囲の濃度にわたって十分な忍容性がある。いくつかの実施形態では、好適なポリマーは、正に荷電されている。例示的なポリマーとしては、これらに限定されないが、キトサン、ポリエステル、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ｑ－カプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリアミドアミン、ポリ（ヒドロキシアルキルＬ－アスパラギン）、ポリ（ヒドロキシアルキルＬ－グルタミン）、ポリ（２－アルキルオキサゾリン）アクリレート、修飾アクリレートおよびメタクリレート系ポリマー、ポリ－Ｎ－（２－ヒドロキシル－プロピル）メタアクリルアミド、ポリ－２－（メタクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン、ポリ（２－（メタクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン）、ならびにポリ（ジメチルアミノエチルメチルアクリレート）（ｐＤＭＡＥＭＡ）が挙げられる。
【0129】
いくつかの実施形態では、好適なポリマーは、ポリメタクリレート誘導体であり、以下の構造のモノマーの繰り返し単位を含み、
式中、Ｒ１は独立して、Ｃ１－Ｃ６アルキルであり、Ｌ１は独立して、Ｃ２－Ｃ６アルキレンであり、Ｒ１ＡおよびＲ１Ｂの各々は独立して、Ｃ１－Ｃ６アルキルであり、ａは、１～５００の整数であり；Ｒ２は独立して、Ｃ１－Ｃ６アルキルであり、Ｒ２Ａは独立して、Ｃ１－Ｃ６アルキルであり、ｂは、１～５００の整数であり；Ｒ３は独立して、Ｃ１－Ｃ６アルキルであり、Ｒ３Ａは独立して、Ｃ１－Ｃ６アルキルであり、ｃは、１～５００の整数である。
【化78】
【0130】
いくつかの実施形態では、繰り返し単位は、以下によって表されてもよく、
式中、各Ｒ４は独立して、Ｒ２またはＲ３であり、各Ｒ４Ａは独立して、Ｒ２ＡまたはＲ３Ａであり、ｄは、１～５００の整数である。上記の構造では、Ｌ１は、－ＣＨ２ＣＨ２であってもよく、各Ｒ１ＡおよびＲ１Ｂは、メチルであり、かつ／または各Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、メチルであり、かつ／またはＲ２Ａは、ブチルであり、Ｒ３Ａは、メチルである。
【化79】
【0131】
いくつかの実施形態では、ポリマーの例示的なメンバーは、以下の式によって表される。
【化80】
【0132】
群の例示的なメンバーは、商品名Ｅｕｄｒａｇｉｔで知られている。本発明のいくつかの実施形態では、噴霧乾燥ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤に含まれるポリマーは、Ｅｕｄｒａｇｉｔポリマーである。Ｅｕｄｒａｇｉｔは、非結晶性ポリマーまたはコポリマーのクラスを形成し、その特性が官能基によって決定されるアクリル酸およびメタクリル酸のエステルに由来する。個々のＥｕｄｒａｇｉｔのグレードは、中性基、アルカリ基、または酸基の割合が異なり、したがって物理化学的特性が異なっている。いくつかの利用可能な形態の一部は、アニオン性であり、一部はカチオン性であり、一部は中性である。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥のためにｍＲＮＡ－ＬＮＰ複合体と使用されるこのタイプのポリマーは、三級アミン基を、メタクリル酸骨格で正に荷電した。それらはｍＲＮＡと複合体を形成し、それを封入してもよい。それらは、噴霧乾燥を支援するより高いＴｇおよび優れた熱可塑性特性を有する。これらのポリマーは、より高いｐＨでは不溶性であり、したがって界面活性剤中では、ｍＲＮＡを分解から保護するのに役立ち得る。Ｅｕｄｒａｇｉｔポリマーは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により経口使用のために承認されており、数十年間市販の経口製品に使用されている。これらのポリマーは毒性が低く、広範囲の濃度にわたって十分な忍容性がある。
【0133】
いくつかの実施形態では、使用されるポリマーは、ｐＨ５以上では不溶性であるＥｕｄｒａｇｉｔのクラスを含む。いくつかの実施形態では、ポリマーのこの特性は、ｍＲＮＡが唾液中に放出されないように、活性ｍＲＮＡ成分の経口送達に使用される。これらのポリマーの１つの利点は、機能性ポリマーが口の中で不溶性であるため、活性成分および他
の賦形剤の味覚および臭気を強力に遮蔽することである。
の賦形剤の味覚および臭気を強力に遮蔽することである。
【0134】
したがって、いくつかの実施形態では、上に記載されるこれらのメタクリル酸誘導体ポリマーは、安定した噴霧乾燥ｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末のための製剤を調製するために使用される。いくつかの実施形態では、これらのメタクリル酸誘導体ポリマーは、ｍＲＮＡの徐放に使用される。いくつかの実施形態では、ｐＨ≧５で不溶性のメタクリル酸誘導体ポリマーは、好適なｍＲＮＡの胃腸管（ＧＩ）への送達に使用される。いくつかの実施形態では、メタクリル酸誘導体ポリマーは、好適なｍＲＮＡの結腸への送達に使用される。
【0135】
いくつかの実施形態では、ポリマーは、乾燥粉末の総重量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、または５％未満を構成する。いくつかの実施形態では、ポリマーは、乾燥粉末の総重量の１％～６０％を構成する。いくつかの実施形態では、ポリマーは、乾燥粉末の総重量の約１～９０％、１０～９０％、２０～９０％、１０～５０％、１～２０％、２～１５％、３～１２％、１～１０％、２～９％、３～８％、１～７％、２～６％、または３～５％を構成する。
【0136】
他の賦形剤
いくつかの実施形態では、糖および他の賦形剤は、噴霧乾燥前に、ｍＲＮＡ担持ナノ粒子およびポリマー混合物に添加される。
いくつかの実施形態では、糖および他の賦形剤は、噴霧乾燥前に、ｍＲＮＡ担持ナノ粒子およびポリマー混合物に添加される。
【0137】
糖
様々な糖を、噴霧乾燥前に混合物に添加してもよい。糖は脱水中に安定化を提供することが企図される。製剤に好適である例示的な糖は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ソルボース、ラクトース、スクロース、セロビオース、トレハロース、ラフィノース、デンプン、デキストラン、マルトデキストリン、シクロデキストリン、インリン、キシリトール、ソルビトール、ラクチトール、およびマンニトールからなる群から選択される単糖類、二糖類、および多糖類である。
様々な糖を、噴霧乾燥前に混合物に添加してもよい。糖は脱水中に安定化を提供することが企図される。製剤に好適である例示的な糖は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ソルボース、ラクトース、スクロース、セロビオース、トレハロース、ラフィノース、デンプン、デキストラン、マルトデキストリン、シクロデキストリン、インリン、キシリトール、ソルビトール、ラクチトール、およびマンニトールからなる群から選択される単糖類、二糖類、および多糖類である。
【0138】
いくつかの実施形態では、好適な糖は、ラクトースおよび／またはマンニトールである。いくつかの実施形態では、好適な糖は、マンニトールである。いくつかの実施形態では、マンニトールは、約１～１０％の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、マンニトールは、約２～１０％の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、マンニトールは、約３～１０％の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、マンニトールは、約４～１０％の濃度で添加される。いくつかの実施形態では、マンニトールは、約５～１０％の濃度で添加される。
【0139】
いくつかの実施形態では、好適な糖は、トレハロースである。いくつかの実施形態では、マンニトールおよびトレハロースの両方が添加される。
【0140】
界面活性剤
いくつかの実施形態では、界面活性剤は、賦形剤として使用される。界面活性剤は、組成物の表面張力を増加させる。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥ｍＲＮＡ脂質組成物に使用される界面活性剤は、ＣＨＡＰＳ（３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート）、リン脂質、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、トリトンＸ－１００、コカミドモノエタノールアミン、コカミドジエタノールアミン、モノステアリン酸グリセロール、モノラウリン酸グリセロール、ソルビタンモオノラウレエート（Ｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｏｎｏｌａｕｒｅａｔｅ）、モノステアリン酸ソルビタン、Ｔｗ
ｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｔｗｅｅｎ ８０、アルキルポリグルコシド、およびポロキサマーからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポロキサマーである。
いくつかの実施形態では、界面活性剤は、賦形剤として使用される。界面活性剤は、組成物の表面張力を増加させる。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥ｍＲＮＡ脂質組成物に使用される界面活性剤は、ＣＨＡＰＳ（３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート）、リン脂質、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、トリトンＸ－１００、コカミドモノエタノールアミン、コカミドジエタノールアミン、モノステアリン酸グリセロール、モノラウリン酸グリセロール、ソルビタンモオノラウレエート（Ｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｏｎｏｌａｕｒｅａｔｅ）、モノステアリン酸ソルビタン、Ｔｗ
ｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ４０、Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｔｗｅｅｎ ８０、アルキルポリグルコシド、およびポロキサマーからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポロキサマーである。
【0141】
様々な他の賦形剤が、噴霧乾燥製剤に含まれてもよい。これらには、様々なポリエステル、ポリウレタン、ポリ（エステルアミド）、ポリ（オルトエステル）、ポリ無水物、ポリ（無水物－コ－イミド）、ポリホスホエステル、ポリホスファゼン、アミノ酸、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、多糖類、マルトデキストリン、アルブミン、様々な糖、界面活性剤、緩衝剤、および塩が含まれるが、これらに限定されない。
【0142】
乾燥粉末
本発明に従って調製された乾燥粉末は、複数の噴霧乾燥粒子を含む。残留水分含量、エアロゾル性能、および物理化学的安定性は、噴霧乾燥医薬品の重要なパラメータである。これは、以下の式を使用して、加熱および乾燥後の試料重量損失によって決定され、
水分含量％＝［（ＳＷｂ－ＳＷａ）／ＳＷｂ］×１００％
式中、ＳＷｂは加熱前の試料重量であり、ＳＷａは加熱後の試料重量である。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＴＧＡ ７（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）は、ナノ粒子中の残留水分を測定するための関連ソフトウェアを備えた、商業的に使用される機器の例である。
本発明に従って調製された乾燥粉末は、複数の噴霧乾燥粒子を含む。残留水分含量、エアロゾル性能、および物理化学的安定性は、噴霧乾燥医薬品の重要なパラメータである。これは、以下の式を使用して、加熱および乾燥後の試料重量損失によって決定され、
水分含量％＝［（ＳＷｂ－ＳＷａ）／ＳＷｂ］×１００％
式中、ＳＷｂは加熱前の試料重量であり、ＳＷａは加熱後の試料重量である。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＴＧＡ ７（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）は、ナノ粒子中の残留水分を測定するための関連ソフトウェアを備えた、商業的に使用される機器の例である。
【0143】
概して、製剤の活性薬学的成分の用量の均一性のために、許容される粒子サイズ分布の範囲が維持される。特に肺送達については、乾燥粉末製剤の粒子は、呼吸器系内のエアロゾルの分布および沈着に影響する。多くの場合、治療構成成分の効果的な吸収および分布のために、大きなコンダクティング気道への粒子沈着が好ましい。非常に微細な粒子のエアロゾル、例えば、１マイクロメートル未満の直径を有する粒子は、気管支拡張剤として機能する活性薬学的成分のための平滑筋などの肺の特定の細胞による効果的な吸収のために、末梢に沈着され得る。
【0144】
噴霧乾燥粒子の一次粒子サイズ分布は、Ｚ平均で表される動的光散乱によって測定される。Ｚ平均は、粒子直径の強度加重分布から計算される、また累積サイズとしても知られる平均であり、式、Ｄｚ＝ΣＳｉ／Σ（Ｓｉ／Ｄｉ）によって表され、Ｓｉは粒子「ｉ」からの散乱強度であり、Ｄｉは粒子の直径である。これらのパラメータに加えて、粒子の微細なコース画分が定義される。
【0145】
一方、多分散度指数（ＰＤＩ）は、所与の粒子試料の分子量の分布の尺度である。
【0146】
ゼータ電位は、粒子間の静電または電荷の反発／引力の大きさの尺度であり、安定性に影響を与えることが知られている基本的なパラメータのうちの１つである。その尺度は、分散、凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）、または凝集（ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ）の原因に関する詳細な洞察をもたらし、分散剤、エマルジョン、および懸濁液の製剤化を改善するために適用することができる。ＺＰは、分散体中の近接粒子および類似の荷電粒子の間の反発の程度を示す。高ＺＰは、高荷電粒子を示す。一般的に、高ＺＰ（負または正）は、電気反発による粒子の凝集を防止し、ナノ粒子分散を電気的に安定化する。一方で、ＺＰが低い場合、引力は反発力を超え、分散体は凝固または凝集する。ゼータ電位は、例えば、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）などの利用可能な装置システムを使用して、光子相関分光法によって測定することができる。
【0147】
ナノ粒子の球形度は、粒子が球をどれほど密接に再アセンブリするかの尺度である。これは、Ｗａｄｄｅｌｌの式によって測定することができ、以下のように決定されるΨによって示される。
噴霧乾燥ｍＲＮＡ脂質製剤のサイズ分布ならびに形状または球形度は、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）、透過電子顕微鏡、またはコールターカウンターによって流体中の粒子によって課される電気抵抗の変化によって測定可能である。
【化81】
【0148】
最後に、ｍＲＮＡの含量および／または完全性は、ＨＰＬＣまたはノーザンブロット分析によって評価される。いくつかの実施形態では、質量分析および他の関連する分光光化学分析は、ｍＲＮＡナノ粒子製剤の安定性、完全性、および品質評価のために実施される。
【0149】
本発明の噴霧乾燥ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、１０％未満の水分（ｗ／ｗ）を含む。いくつかの実施形態では、本発明の噴霧乾燥ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、約９％未満の水分を保持し得る。いくつかの実施形態では、本発明の噴霧乾燥ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、約８％未満の水分を保持し得る。いくつかの実施形態では、本発明の噴霧乾燥ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、約７％未満の水分を保持し得る。いくつかの実施形態では、本発明の噴霧乾燥ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、約６％未満の水分を保持し得る。いくつかの実施形態では、本発明の噴霧乾燥ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、約５％未満の水分を保持し得る。いくつかの実施形態では、本発明の噴霧乾燥ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、約４％未満の水分を保持し得る。いくつかの実施形態では、本発明の噴霧乾燥ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、約３％未満の水分を保持し得る。いくつかの実施形態では、本発明の噴霧乾燥ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、約２％未満の水分を保持し得る。いくつかの実施形態では、本発明の噴霧乾燥ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、約１％未満の水分を保持し得る。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤の水分含量は、５％未満である。
【0150】
噴霧乾燥ｍＲＮＡ ＬＮＰ製剤が本明細書に提供され、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、１０μｍ未満の微細画分（ｆｎｆｒ）を有する不均一なサイズである。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末粒子のｆｎｆｒは、１～１０μｍの範囲である。ｍＲＮＡ－ＬＮＰ噴霧乾燥試料に対する最適なＺ平均は、≦１０μｍであり得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ噴霧乾燥試料のＺ平均は、≦８μｍである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ噴霧乾燥試料のＺ平均は、≦５μｍである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ噴霧乾燥試料のＺ平均は、０．０１～１０μｍの範囲内であるべきである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ噴霧乾燥試料のＺ平均は、０．１～１０μｍの範囲内であるべきである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ噴霧乾燥試料のＺ平均は、０．１～５μｍの範囲内であるべきである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ噴霧乾燥試料のＺ平均は、０．１～３μｍの範囲内であるべきである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ噴霧乾燥試料のＺ平均は、０．１～５μｍの範囲内であるべきである。
【0151】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥前、２００ｎｍ未満のＺ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥前、１８０ｎｍ未満のＺ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥前、１５０ｎｍ未満のＺ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥前、１２０ｎｍ未満のＺ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥前、１００ｎｍ未満のＺ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥前、５０ｎｍ未満のＺ平均を含む。
【0152】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥後、５０００ｎｍ未満の
Ｚ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥後、４０００ｎｍ未満のＺ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥後、３０００ｎｍ未満のＺ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥後、２０００ｎｍ未満のＺ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥後、１０００ｎｍ未満のＺ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥後、５００ｎｍ未満のＺ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥後、５００ｎｍ未満のＺ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥後、３００ｎｍ未満のＺ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥後、２００ｎｍ未満のＺ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥後、１００ｎｍ未満のＺ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥後、５０ｎｍ未満のＺ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥後、１０ｎｍ未満のＺ平均を含む。
Ｚ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥後、４０００ｎｍ未満のＺ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥後、３０００ｎｍ未満のＺ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥後、２０００ｎｍ未満のＺ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥後、１０００ｎｍ未満のＺ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥後、５００ｎｍ未満のＺ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥後、５００ｎｍ未満のＺ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥後、３００ｎｍ未満のＺ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥後、２００ｎｍ未満のＺ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥後、１００ｎｍ未満のＺ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥後、５０ｎｍ未満のＺ平均を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子は、噴霧乾燥後、１０ｎｍ未満のＺ平均を含む。
【0153】
ｍＲＮＡ－ＬＮＰの乾燥粉末製剤が本明細書に提供され、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ粒子の平均球形度は、０．７～１の範囲である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の平均球形度は、０．７超、または０．８超、または０．９超である。
【0154】
いくつかの実施形態では、本出願のためのナノ粒子のゼータ電位値は、＋３０ｍＶ～－３０ｍＶである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子のゼータ電位値は、＋２０ｍＶ～－３０ｍＶである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子のゼータ電位値は、＋１０ｍＶ～－３０ｍＶである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子のゼータ電位値は、０ｍＶ～－３０ｍＶである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子のゼータ電位値は、－１０ｍＶ～－３０ｍＶである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子のゼータ電位値は、－２０ｍＶ～－３０ｍＶである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子のゼータ電位値は、＋２０ｍＶ～－３０ｍＶである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子のゼータ電位値は、－２０ｍＶ～－３０ｍＶである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子のゼータ電位値は、約－３０ｍＶであり、多分散指数は、約０．３未満である。
【0155】
いくつかの実施形態では、提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰの乾燥粉末製剤は、乾燥粉末の総重量の最大３０％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、または２％のｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、乾燥粉末の総重量の１～６％、１～５％、１～４％、１～３％、２～１０％、２～９％、２～８％、２～７％、２～６％、２～５％、２～１０％、２～１５％、２～２０％、２～３０％を構成する。
【0156】
安定性
様々な条件下で保存したときに安定である、噴霧乾燥ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤が提供される。本明細書で使用される場合、「安定」という用語は、保存後に７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超の完全性を保持するｍＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で１年超にわたって保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で１１ヶ月超にわたって保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で１０ヶ月超にわたって保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で９ヶ月超にわたって保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で８ヶ月超にわた
って保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で７ヶ月超にわたって保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で６ヶ月超にわたって保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で５ヶ月超にわたって保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で４ヶ月超にわたって保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で３ヶ月超にわたって保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で２ヶ月超にわたって保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で１ヶ月超にわたって保存されたとき、安定である。
様々な条件下で保存したときに安定である、噴霧乾燥ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤が提供される。本明細書で使用される場合、「安定」という用語は、保存後に７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超の完全性を保持するｍＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で１年超にわたって保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で１１ヶ月超にわたって保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で１０ヶ月超にわたって保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で９ヶ月超にわたって保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で８ヶ月超にわた
って保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で７ヶ月超にわたって保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で６ヶ月超にわたって保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で５ヶ月超にわたって保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で４ヶ月超にわたって保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で３ヶ月超にわたって保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で２ヶ月超にわたって保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で１ヶ月超にわたって保存されたとき、安定である。
【0157】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で８週間超にわたって保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で７週間超にわたって保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で６週間超にわたって保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で５週間超にわたって保存されたとき、安定である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤は、凍結状態（－２０℃）、４℃、または室温で４週間超にわたって保存されたとき、安定である。
【0158】
メッセンジャーＲＮＡ
本発明を使用して、任意のｍＲＮＡを製剤化することができる。本明細書で使用される場合、ｍＲＮＡは、コードされたタンパク質を翻訳するためにＤＮＡからリボソームに情報を伝えるタイプのＲＮＡである。ｍＲＮＡは様々な既知の方法のうちのいずれかにより合成され得る。例えば、本発明によるｍＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）を介して合成され得る。簡潔には、ＩＶＴは、典型的には、プロモーター、リボヌクレオチド三リン酸のプール、ＤＴＴおよびマグネシウムイオンを含み得る緩衝系、および適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）を含む線状または環状ＤＮＡ鋳型、ＤＮＡｓｅ Ｉ、ピロホスファターゼ、および／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を用いて行われる。正確な条件は、特定の用途により異なる。
本発明を使用して、任意のｍＲＮＡを製剤化することができる。本明細書で使用される場合、ｍＲＮＡは、コードされたタンパク質を翻訳するためにＤＮＡからリボソームに情報を伝えるタイプのＲＮＡである。ｍＲＮＡは様々な既知の方法のうちのいずれかにより合成され得る。例えば、本発明によるｍＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）を介して合成され得る。簡潔には、ＩＶＴは、典型的には、プロモーター、リボヌクレオチド三リン酸のプール、ＤＴＴおよびマグネシウムイオンを含み得る緩衝系、および適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）を含む線状または環状ＤＮＡ鋳型、ＤＮＡｓｅ Ｉ、ピロホスファターゼ、および／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を用いて行われる。正確な条件は、特定の用途により異なる。
【0159】
本発明を使用して、様々な長さのｍＲＮＡを製剤化することができる。いくつかの実施形態では、本発明を使用して、長さ約１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、または２０ｋｂ以上のインビトロで合成されたｍＲＮＡを送達することができる。いくつかの実施形態では、本発明を使用して、長さ約１～２０ｋｂ、約１～１５ｋｂ、約１～１０ｋｂ、約５～２０ｋｂ、約５～１５ｋｂ、約５～１２ｋｂ、約５～１０ｋｂ、約８～２０ｋｂ、または約８～１５ｋｂの範囲のインビトロで合成されたｍＲＮＡを送達することができる。
【0160】
本発明は、修飾されていないｍＲＮＡ、または一般的に安定性を強化する１つ以上の修飾を含むｍＲＮＡを製剤化するために使用され得る。いくつかの実施形態では、修飾は、
修飾ヌクレオチド、修飾糖リン酸骨格、ならびに５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）から選択される。
修飾ヌクレオチド、修飾糖リン酸骨格、ならびに５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）から選択される。
【0161】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの修飾は、ＲＮＡのヌクレオチドの修飾を含み得る。本発明による修飾ｍＲＮＡは、例えば、骨格修飾、糖修飾、または塩基修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、以下に限定されないが、プリン類（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））またはピリミジン類（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））をはじめとする天然ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体（修飾ヌクレオチド）から合成されてもよく、ならびに例えば１－メチル－アデニン、２－メチル－アデニン、２－メチルチオ－Ｎ－６－イソペンテニル－アデニン、Ｎ６－メチル－アデニン、Ｎ６－イソペンテニル－アデニン、２－チオ－シトシン、３－メチル－シトシン、４－アセチル－シトシン、５－メチル－シトシン、２，６－ジアミノプリン、１－メチル－グアニン、２－メチル－グアニン、２，２－ジメチル－グアニン、７－メチル－グアニン、イノシン、１－メチル－イノシン、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）（５－ウラシル）、ジヒドロウラシル、２－チオ－ウラシル、４－チオ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－ウラシル、５－フルオロ－ウラシル、５－ブロモ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウラシル、５－メチル－２－チオ－ウラシル、５－メチル－ウラシル、Ｎ－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、５－メチルアミノメチル－ウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５’－メトキシカルボニルメチル－ウラシル、５－メトキシ－ウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、１－メチル－シュードウラシル、キューオシン、ベータ－Ｄ－マンノシル－キューオシン、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、ならびにホスホロアミデート類、ホスホロチオエート類、ペプチドヌクレオチド類、メチルホスホネート類、７－デアザグアノシン、５－メチルシトシンおよびイノシンなどのプリン類ならびにピリミジン類の修飾ヌクレオチド類似体または誘導体として合成されてもよい。こうした類似体の調製は、例えば、米国特許第４，３７３，０７１号、米国特許第４，４０１，７９６号、米国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７号、米国特許第４，６６８，７７７号、米国特許第４，９７３，６７９号、米国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第５，１３２，４１８号、米国特許第５，１５３，３１９号、米国特許第５，２６２，５３０号、および米国特許第５，７００，６４２号（その開示は参照によりその全範囲において本明細書に含まれる）から当業者に既知である。
【0162】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ＲＮＡ骨格修飾を含み得る。典型的には、骨格修飾は、ＲＮＡに含まれるヌクレオチドの骨格のリン酸塩が化学的に修飾される修飾である。例示的な骨格修飾には、典型的には、メチルホスホネート、メチルホスホロアミダイト、ホスホロアミダイト、ホスホロチオエート（例えば、シチジン５’－Ｏ－（１－チオホスフェート））、ボラノホスフェート、正荷電グアニジウム基等からなる群からの修飾が含まれるが、これらに限定されず、これは、ホスホジエステル結合を他のアニオン性基、カチオン性基、または中性基で置き換えることを意味する。
【0163】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは糖修飾を含み得る。典型的な糖修飾は、ヌクレオチドの糖の化学修飾であり、糖修飾として、以下に限定されないが、２’－デオキシ－２’－フルオロ－オリゴリボヌクレオチド（２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン５’－三リン酸、２’－フルオロ－２’－デオキシウリジン５’－三リン酸）、２’－デオキシ－２’－デアミン－オリゴリボヌクレオチド（２’－アミノ－２’－デオキシシチジン５’－三リン酸、２’－アミノ－２’－デオキシウリジン５’－三リン酸）、２’－Ｏ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’－Ｏ－メチルシチジン５’－三リン酸、２’－メチルウリジン５’－三リ
ン酸）、２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、およびこれらの異性体（２’－アラシチジン５’－三リン酸、２’－アラウリジン５’－三リン酸）、またはアジド三リン酸（２’－アジド－２’－デオキシシチジン５’－三リン酸、２’－アジド－２’－デオキシウリジン５’－三リン酸）からなる群から選択される糖修飾が挙げられる。
ン酸）、２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、およびこれらの異性体（２’－アラシチジン５’－三リン酸、２’－アラウリジン５’－三リン酸）、またはアジド三リン酸（２’－アジド－２’－デオキシシチジン５’－三リン酸、２’－アジド－２’－デオキシウリジン５’－三リン酸）からなる群から選択される糖修飾が挙げられる。
【0164】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはヌクレオチドの塩基の修飾（塩基修飾）を含み得る。塩基修飾を含む修飾ヌクレオチドは、塩基修飾ヌクレオチドとも呼ばれる。こうした塩基修飾ヌクレオチドの例として、以下に限定されないが、２－アミノ－６－クロロプリンリボシド５’－三リン酸、２－アミノアデノシン５’－三リン酸、２－チオシチジン５’－三リン酸、２－チオウリジン５’－三リン酸、４－チオウリジン５’－三リン酸、５－アミノアリルシチジン５’－三リン酸、５－アミノアリルウリジン５’－三リン酸、５－ブロモシチジン５’－三リン酸、５－ブロモウリジン５’－三リン酸、５－ヨードシチジン５’－三リン酸、５－ヨードウリジン５’－三リン酸、５－メチルシチジン５’－三リン酸、５－メチルウリジン５’－三リン酸、６－アザシチジン５’－三リン酸、６－アザウリジン５’－三リン酸、６－クロロプリンリボシド５’－三リン酸、７－デアザアデノシン５’－三リン酸、７－デアザグアノシン５’－三リン酸、８－アザアデノシン５’－三リン酸、８－アジドアデノシン５’－三リン酸、ベンゾイミダゾールリボシド５’－三リン酸、Ｎ１－メチルアデノシン５’－三リン酸、Ｎ１－メチルグアノシン５’－三リン酸、Ｎ６－メチルアデノシン５’－三リン酸、Ｏ６－メチルグアノシン５’－三リン酸、シュードウリジン５’－三リン酸、ピューロマイシン５’－三リン酸、またはキサントシン５’－三リン酸が挙げられる。
【0165】
ｍＲＮＡ合成には、５’末端への「キャップ」および３’末端への「テール」の付加が含まれるのが典型的である。キャップの存在は、大半の真核生物細胞に見られるヌクレアーゼへの耐性を付与するのに重要である。「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護する役割を果たす。
【0166】
したがって、いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップ構造を含む。５’キャップは、典型的には次のように付加される：最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが５’ヌクレオチドから末端リン酸基のうちの１つを除去して２つの末端リン酸を残し、次に、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加されて５’－５’逆三リン酸結合を生成し、次いで、グアニンの７－窒素がメチルトランスフェラーゼによりメチル化される。２’－Ｏ－メチル化はまた、７－メチルグアノシン三リン酸塩残基の後の第１の塩基および／または第２の塩基で生じ得る。キャップ構造の例には、ｍ７ＧｐｐｐＮｐ－ＲＮＡ、ｍ７ＧｐｐｐＮｍｐ－ＲＮＡ、およびｍ７ＧｐｐｐＮｍｐＮｍｐ－ＲＮＡ（式中、ｍは２’－Ｏ－メチル残基を示す）が含まれるが、これに限定されない。
【0167】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは３’テール構造を含む。テール構造は典型的に、ポリ（Ａ）テールおよび／またはポリ（Ｃ）テールを含む。ｍＲＮＡの３’末端上のポリＡテールまたはポリＣテールは、典型的には、少なくとも５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも１５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも２００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも２５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも３００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも３５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも４００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも４５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも５００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも５５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも６００個のアデノシンヌクレオチ
ドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも６５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも７００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも７５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも８００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも８５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも９００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも９５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、または少なくとも１ｋｂのアデノシヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチドをそれぞれ含む。いくつかの実施形態では、ポリＡテールまたはポリＣテールはそれぞれ、約１０～８００個のアデノシンヌクレオチドまたはシトシンヌクレオチド（例えば、約１０～２００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～３００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～４００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～５００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～５５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約５０～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１００～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１５０～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約２００～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約２５０～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約３００～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約３５０～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約４００～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約４５０～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約５００～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～１５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～１００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約２０～７０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、または約２０～６０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド）であり得る。いくつかの実施形態では、テール構造は、本明細書に記載の様々な長さを有するポリ（Ａ）テールおよびポリ（Ｃ）テールの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、テール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアデノシンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、テール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のシトシンヌクレオチドを含む。
ドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも６５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも７００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも７５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも８００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも８５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも９００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも９５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、または少なくとも１ｋｂのアデノシヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチドをそれぞれ含む。いくつかの実施形態では、ポリＡテールまたはポリＣテールはそれぞれ、約１０～８００個のアデノシンヌクレオチドまたはシトシンヌクレオチド（例えば、約１０～２００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～３００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～４００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～５００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～５５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約５０～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１００～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１５０～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約２００～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約２５０～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約３００～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約３５０～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約４００～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約４５０～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約５００～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～１５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～１００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約２０～７０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、または約２０～６０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド）であり得る。いくつかの実施形態では、テール構造は、本明細書に記載の様々な長さを有するポリ（Ａ）テールおよびポリ（Ｃ）テールの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、テール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアデノシンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、テール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のシトシンヌクレオチドを含む。
【0168】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’および／または３’非翻訳領域を含む。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を及ぼす要素、例えば、鉄応答性要素を１つ以上含む。
【0169】
いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞におけるｍＲＮＡの位置安定性に影響を及ぼすタンパク質の結合部位、またはｍｉＲＮＡの１つ以上の結合部位のうちの１つ以上を含む。
【0170】
例示的な５’および／または３’非翻訳配列は、センスｍＲＮＡ分子の安定性を増加させるために、安定しているｍＲＮＡ分子（例えば、グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、またはクエン酸サイクル酵素）から得られ得る。例えば、５’非翻訳配列は、ヌクレアーゼ耐性を改善するおよび／またはポリヌクレオチドの半減期を改善するために、ＣＭＶ前初期１（ＩＥ１）遺伝子の部分配列またはその断片を含み得る。ポリヌクレオチドをさらに安定させるために、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする
配列またはその断片のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’末端または非翻訳領域への包含も企図される。概して、これらの修飾は、ポリヌクレオチドの安定性および／または薬物動態特性（例えば、半減期）を、それらの修飾されていない対応物と比較して改善し、例えば、かかるポリヌクレオチドのインビボヌクレアーゼ消化に対する耐性を改善するために行われる修飾を含む。
配列またはその断片のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’末端または非翻訳領域への包含も企図される。概して、これらの修飾は、ポリヌクレオチドの安定性および／または薬物動態特性（例えば、半減期）を、それらの修飾されていない対応物と比較して改善し、例えば、かかるポリヌクレオチドのインビボヌクレアーゼ消化に対する耐性を改善するために行われる修飾を含む。
【0171】
ｍＲＮＡ構築物設計は、Ｘ－コード配列－Ｙとして指定することができる。例示的なＸおよびＹヌクレオチド配列は、以下の通りである。
Ｘ（５’非翻訳配列）＝
ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧ （配列番号１）
Ｙ（３’非翻訳配列）＝
ＣＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＧＣＵ （配列番号２）
または
ＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＡＧＣＵ （配列番号３）
Ｘ（５’非翻訳配列）＝
ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧ （配列番号１）
Ｙ（３’非翻訳配列）＝
ＣＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＧＣＵ （配列番号２）
または
ＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＡＧＣＵ （配列番号３）
【0172】
インビトロ転写反応からもたらされたｍＲＮＡが、一部の実施形態で望ましい一方、細菌、真菌、植物、および／または動物から産生されたｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡの他の供給源が、本発明の範囲内であると意図される。
【0173】
いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ配列は、ヒト嚢胞性線維症膜貫通受容体である嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子ＣＦＴＲ（ｈＣＦＴＲ）タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ配列は、効率的な発現ヒト細胞のために最適化されたコドンである。治療的送達のためのＣＦＴＲ ｍＲＮＡの調製および最適化を具体化する詳細な説明は、２０１８年５月１６日に出願された米国特許出願第１５／９８１，７５７号に記載されており、その開示は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【0174】
薬学的製剤および治療的使用
本発明の乾燥粉末製剤の薬学的組成物は、様々な治療用途で使用され得る。インビボでの送達を容易にするために、本明細書に記載される乾燥粉末製剤は、１つ以上の追加の薬学的担体、標的化リガンド、または安定化試薬と組み合わされてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の薬学的担体は、噴霧乾燥の前に製剤に添加されてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の薬学的担体は、乾燥粉末製剤への挿入後技術を使用して（すなわち、噴霧乾燥後）に製剤に添加されてもよい。製剤化技法および薬物投与は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，（最新版）に見出され得る。
本発明の乾燥粉末製剤の薬学的組成物は、様々な治療用途で使用され得る。インビボでの送達を容易にするために、本明細書に記載される乾燥粉末製剤は、１つ以上の追加の薬学的担体、標的化リガンド、または安定化試薬と組み合わされてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の薬学的担体は、噴霧乾燥の前に製剤に添加されてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の薬学的担体は、乾燥粉末製剤への挿入後技術を使用して（すなわち、噴霧乾燥後）に製剤に添加されてもよい。製剤化技法および薬物投与は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，（最新版）に見出され得る。
【0175】
本明細書に記載される乾燥粉末製剤は、粉末形態で、または代替的に、再構成後にインビボで投与することができる。本明細書に記載される製剤のための好適な投与経路には、経口投与、直腸投与、膣投与、経粘膜投与、気管内投与もしくは吸入投与を含む肺投与、または腸投与、皮内注射、経皮（局所）注射、筋肉内注射、皮下注射、髄内注射を含む非経口送達、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、もしくは鼻腔内が含まれる。
特定の実施形態では、筋肉内投与は、骨格筋、平滑筋、および心筋からなる群から選択される筋肉に行われる。いくつかの実施形態では、この投与により、核酸の筋肉細胞への送達がもたらされる。いくつかの実施形態では、この投与により、核酸の肝細胞（すなわち、肝臓細胞）への送達がもたらされる。
特定の実施形態では、筋肉内投与は、骨格筋、平滑筋、および心筋からなる群から選択される筋肉に行われる。いくつかの実施形態では、この投与により、核酸の筋肉細胞への送達がもたらされる。いくつかの実施形態では、この投与により、核酸の肝細胞（すなわち、肝臓細胞）への送達がもたらされる。
【0176】
本発明の薬学的製剤は、全身様式ではなく局所様式で、例えば、薬学的製剤を標的とされる組織に直接注射することにより、好ましくは、徐放製剤で投与され得る。局所送達は、標的とされる組織に応じて様々な方式で達成され得る。送達されるｍＲＮＡが送達および／または発現され得る場所となる組織の例としては、限定されないが、肺、肝臓、腎臓、心臓、脾臓、血清、脳、骨格筋、リンパ節、皮膚、および／または脳脊髄液が挙げられる。複数の実施形態では、標的とされる組織は、肝臓である。例えば、本発明の組成物を含むエアロゾルは、吸入され得る（経鼻、気管、または気管支送達のために）。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、定量吸入器を使用して送達することができる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、送達のために再構成および霧化され得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、損傷、疾患の発現、または疼痛の部位に注射され得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、経口、気管、または食道適用のために、トローチ剤で提供され得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、胃または腸への投与のために、液体、錠剤、またはカプセル形態で供給され得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、直腸または膣適用のための座薬形態で供給され得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、クリーム、滴、またはさらに注射の使用によって眼に送達され得る。
【0177】
いくつかの実施形態では、本発明の乾燥粉末製剤は、液体溶液に再構成され、送達のために霧化される。霧化は、当該技術分野で既知の任意の霧化器によって達成され得る。霧化器は、液体をミストに変換し、それによって肺内により容易に吸入され得る。霧化器は、幼児、小児、および成人に効果的である。霧化器は、高用量の吸入薬剤を霧化することができる。典型的には、本発明で使用する霧化器は、取り外し可能であるマウスピースを含む。
【0178】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される乾燥粉末製剤を使用して、様々な疾患または障害の治療のための治療有効量のｍＲＮＡを送達してもよい。例えば、本発明による噴霧乾燥によって調製される乾燥粉末製剤は、経口、鼻腔、気管、または肺もしくは経路を介して、嚢胞性線維症などの肺関連障害の治療のために投与され得る。いくつかの実施形態では、乾燥粉末製剤は、吸入により投与される。いくつかの実施形態では、製剤は、定量吸入器によって投与される。いくつかの実施形態では、乾燥粉末製剤は、鼻腔内噴霧により投与される。いくつかの実施形態では、乾燥粉末製剤は、再水和され、静脈内注入、注射、経口点滴、鼻腔点滴、および当業者によって容易に考えられる任意の他の適用として投与される。
【0179】
本発明を使用して、様々な他の肺関連疾患、障害、および症状を治療することができる。いくつかの実施形態では、本発明の安定した乾燥粉末製剤は、疾患または障害は、喘息；ＣＯＰＤ；肺気腫；内臓逆位を伴うもしくは伴わない原発性毛様体ジスキネジア（ＣＩＬＤ１）、またはカルタゲナー症候群；肺線維症；バート・ホッグ・デュベ症候；遺伝性出血性毛細血管拡張症；アルファ－１抗トリプシン欠損症；チトクロームｂ陽性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ、Ｘ線）；チトクロームｂ陽性肉芽腫性疾患、常染色体劣性；表面活性物質欠損症、肺表面活性物質代謝異常１、肺表面活性物質代謝異常２型、肺表面活性物質代謝異常３型；未熟児の呼吸窮迫症候群；結核、インフルエンザを含む肺ウイルス性疾患、および呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のうちの１つ以上を治療するのに有用である。
【0180】
したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、対象の肺または肺細胞への送達また
はその治療で使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡを含む乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー３タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ダイニン軸糸中間鎖１タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ダイニン軸糸重鎖５（ＤＮＡＨ５）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルファ－１－アンチトリプシンタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、１つ以上のサーファクタントタンパク質、例えば、サーファクタントＡタンパク質、サーファクタントＢタンパク質、サーファクタントＣタンパク質、およびサーファクタントＤタンパク質のうちの１つ以上をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。
はその治療で使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡを含む乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー３タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ダイニン軸糸中間鎖１タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ダイニン軸糸重鎖５（ＤＮＡＨ５）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルファ－１－アンチトリプシンタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、１つ以上のサーファクタントタンパク質、例えば、サーファクタントＡタンパク質、サーファクタントＢタンパク質、サーファクタントＣタンパク質、およびサーファクタントＤタンパク質のうちの１つ以上をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。
【0181】
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の肝臓または肝臓細胞への送達またはその治療で使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。かかるペプチドおよびポリペプチドは、尿素サイクル障害に関連するもの、リソソーム貯蔵障害に関連するもの、グリコーゲン貯蔵障害に関連するもの、アミノ酸代謝障害に関連するもの、脂質代謝もしくは線維性障害に関連するもの、メチルマロン酸血症に関連するもの、または濃縮された全長ｍＲＮＡの肝臓または肝臓細胞への送達またはそれでの治療が乾燥粉末の利益を提供する任意の他の代謝性障害に関連するものを含み得る。
【0182】
ある特定の実施形態では、本発明は、尿素サイクル障害に関連するタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルギニノコハク酸シンテターゼ１タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、カルバモイルリン酸シンテターゼＩタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルギニノコハク酸リアーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルギナーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。
【0183】
ある特定の実施形態では、本発明は、リソソーム貯蔵障害に関連するタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルファ－ガラクトシダーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、グルコセレブロシダーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、イズロン酸－２－スルファターゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、イズロニダーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成する
ための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、Ｎ－アセチル－アルファ－Ｄ－グルコサミニダーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヘパランＮ－スルファターゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ガラクトサミン－６スルファターゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ベータ－ガラクトシダーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、リソソームリパーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アリールスルファターゼＢ（Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢ）をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。
ための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、Ｎ－アセチル－アルファ－Ｄ－グルコサミニダーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヘパランＮ－スルファターゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ガラクトサミン－６スルファターゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ベータ－ガラクトシダーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、リソソームリパーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アリールスルファターゼＢ（Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢ）をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。
【0184】
ある特定の実施形態では、本発明は、グリコーゲン貯蔵障害に関連するタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、酸アルファ－グルコシダーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、肝臓グリコーゲンホスホリラーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、筋ホスホグリセリン酸ムターゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、グリコーゲン脱分岐酵素をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。
【0185】
ある特定の実施形態では、本発明は、アミノ酸代謝に関連するタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、グルタリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、オキサラーゼ（ｏｘａｌａｓｅ）アラニン－グリオキシルアミノトランスフェラーゼ酵素をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。
【0186】
ある特定の実施形態では、本発明は、脂質代謝または線維性障害に関連するタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ｍＴＯＲ阻害剤をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＴＰａｓｅリン脂質輸送８Ｂ１（ＡＴＰ８Ｂ１）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、１つ以上のＮＦ－カッパＢ阻害剤、例えば、Ｉ－カッパＢアルファ、インターフェロン関連発生制御因子１（ＩＦＲＤ１）、およびサーチュイン１（ＳＩＲＴ１）のうちの１つ以上をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＰＰＡＲ－ガンマタンパク質または
活性バリアントをコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。
活性バリアントをコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。
【0187】
ある特定の実施形態では、本発明は、メチルマロン酸血症に関連するタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、メチルマロニルＣｏＡムターゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。
【0188】
ある特定の実施形態では、本発明は、肝臓への送達またはその治療が乾燥粉末の利益を提供することができる完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ウィルソン病タンパク質としても知られているＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ酵素をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、および第Ｘ因子などの１つまたは凝固酵素をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトヘモクロマトーシス（ＨＦＥ）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。
【0189】
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の心臓血管構造または心臓血管細胞への送達またはその治療で使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、血管内皮成長因子Ａタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、レラキシンタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、骨形成タンパク質－９タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、骨形成タンパク質－２受容体タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。
【0190】
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の筋肉または筋肉細胞への送達またはその治療で使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ジストロフィンタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、フラタキシンタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、対象の心筋または心筋細胞への送達またはその治療で使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、筋肉組織または筋肉細胞におけるカリウムチャネルおよびナトリウムチャネルの一方または両方を調節するタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、筋肉組織または筋肉細胞におけるＫｖ７．１チャネルを調節するタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、筋肉組織または筋肉細胞におけるＮａｖ１．５チャネルを調節するタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。
【0191】
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の神経系または神経系細胞への送達またはその治療で使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、生存運動ニューロン１タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、生存運動ニューロン２タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、フラタキシンタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＤメンバー１（ＡＢＣＤ１）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＣＬＮ３タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。
【0192】
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の血液もしくは骨髄または血液もしくは骨髄細胞への送達またはその治療で使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ベータグロビンタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ブルトンチロシンキナーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、および第Ｘ因子などの１つまたは凝固酵素をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。
【0193】
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の腎臓または腎臓細胞への送達またはその治療で使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＩＶ型コラーゲンアルファ５鎖（ＣＯＬ４Ａ５）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。
【0194】
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の眼または眼細胞への送達またはその治療で使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣＡ４）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、レチノスキシンタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａ（ＲＰＥ６５）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、２９０ｋＤａの中心体タンパク質（ＣＥＰ２９０）をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。
【0195】
ある特定の実施形態では、本発明は、対象または対象の細胞のためのワクチンの送達またはそれによる治療で使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、ウイルスなどの感染性因子由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、インフルエンザウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、呼吸器合胞体ウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成
するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、狂犬病ウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、サイトメガロウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ロタウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、またはＣ型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトパピローマウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、単純ヘルペスウイルス１型または単純ヘルペスウイルス２型などの単純ヘルペスウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス１型またはヒト免疫不全ウイルス２型などのヒト免疫不全ウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトメタニューモウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトパラインフルエンザウイルス１型、ヒトパラインフルエンザウイルス２型、またはヒトパラインフルエンザウイルス３型などのヒトパラインフルエンザウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、マラリアウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ジカウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、チクングニアウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。
するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、狂犬病ウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、サイトメガロウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ロタウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、またはＣ型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトパピローマウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、単純ヘルペスウイルス１型または単純ヘルペスウイルス２型などの単純ヘルペスウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス１型またはヒト免疫不全ウイルス２型などのヒト免疫不全ウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトメタニューモウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトパラインフルエンザウイルス１型、ヒトパラインフルエンザウイルス２型、またはヒトパラインフルエンザウイルス３型などのヒトパラインフルエンザウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、マラリアウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ジカウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、チクングニアウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。
【0196】
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の癌に関連する抗原または対象の癌細胞から特定された抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、対象自身の癌細胞から決定された抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための、すなわち、個別化癌ワクチンを提供するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、変異体ＫＲＡＳ遺伝子から発現した抗原をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。
【0197】
ある特定の実施形態では、本発明は、抗体をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、抗体は、二重特異性抗体であり得る。ある特定の実施形態では、抗体は、融合タンパク質の一部であり得る。ある特定の実施形態では、本発明は、ＯＸ４０に対する抗体をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦに対する抗体をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、組織壊死因子アルファに対する抗体をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＣＤ３に対する抗体をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＣＤ１９に対する抗体をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。
【0198】
ある特定の実施形態では、本発明は、免疫調節因子をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は
、インターロイキン１２をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、インターロイキン２３をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、インターロイキン３６ガンマをコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、１つ以上のインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）タンパク質の構成的に活性なバリアントをコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。
、インターロイキン１２をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、インターロイキン２３をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、インターロイキン３６ガンマをコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、１つ以上のインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）タンパク質の構成的に活性なバリアントをコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。
【0199】
ある特定の実施形態では、本発明は、エンドヌクレアーゼをコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、Ｃａｓ ９タンパク質などのＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、メガヌクレアーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡを有する乾燥粉末組成物を生成するための方法を提供する。
【0200】
本発明は、ｍＲＮＡ製剤の徐放が必要とされる様々な他の疾患、障害、および状態を治療するために使用され得る。これらの例は、胃腸管におけるｍＲＮＡ送達が有用である疾患を含む。かかる疾患には、これらに限定されないが、アポリポタンパク質Ｅ欠損症、炎症性腸疾患、またはクローン病；接着型Ｇタンパク質共役受容体ＶＩ欠損症；２型フォン・ヴィレブランド病；腎結石症、シュウ酸カルシウムＣＡＯＮ関連；若年発症成人型糖尿病８型が含まれる。
【0201】
本発明は、組織または器官へのｍＲＮＡ製剤の標的化された送達が有益であり得る様々な他の疾患、障害、または状態を治療するために使用され得る。これらは、目的に好適なポリマーの会合によって、特定の標的化部分の会合の有無を問わず、調整されてもよい。
【実施例0202】
本発明のある特定の化合物、組成物、および方法について、ある特定の実施形態に従って具体的に説明してきたが、以下の実施例は、本発明を単に説明するという役割を果たすものであり、それを制限することを意図するものではない。
【0203】
実施例１．噴霧乾燥から回収されたｍＲＮＡ－ＬＮＰ乾燥粉末製剤
この実施例では、ＬＮＰ封入ｍＲＮＡ製剤を、ポリマーで、およびポリマーなしで調製し、噴霧乾燥した。結果は、ポリマーを用いて調製されたＬＮＰ封入ｍＲＮＡ製剤が、ポリマーなしで調製された同じｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤と比較して、噴霧乾燥プロセスからの予想外の高回収率をもたらすことを示す。
この実施例では、ＬＮＰ封入ｍＲＮＡ製剤を、ポリマーで、およびポリマーなしで調製し、噴霧乾燥した。結果は、ポリマーを用いて調製されたＬＮＰ封入ｍＲＮＡ製剤が、ポリマーなしで調製された同じｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤と比較して、噴霧乾燥プロセスからの予想外の高回収率をもたらすことを示す。
【0204】
特に、ＬＮＰ封入ｍＲＮＡ製剤（ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）をコードするｍＲＮＡ、およびそれぞれＦＦＬ－Ｆ１、ＦＦＬ－Ｆ２と称される製剤）のうちの２つをそれぞれ、表１に記載されるそれぞれの個々の組成物を用いて、ポリマーなしでまたはポリマーを用いて調製した。これらの製剤を噴霧乾燥のために調製するために、ＦＦＬ ｍＲＮＡを、ｍＲＮＡをＬＮＰ内に封入するために最初にギアポンプを使用して脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と混合した。次いで、「ポリマーを用いる」試料について、次いでポリマー溶液を、ギアポンプを使用してｍＲＮＡ－ＬＮＰと混合した。次いで、図１の器具の図形表現に示されるように、溶液を噴霧乾燥させた。以下の条件を噴霧乾燥に使用した：入口温度９
０℃、吸引器パーセンテージ８５％、ポンプパーセンテージ２５％、および出口温度４６～５０℃。
０℃、吸引器パーセンテージ８５％、ポンプパーセンテージ２５％、および出口温度４６～５０℃。
【表1】
【0205】
結果
ポリマーなしの各ＬＮＰ－ｍＲＮＡ製剤上の噴霧乾燥工程は成功しなかった。いずれの場合も、表１（下部）に記載されるように、および図２に示されるように、物質が噴霧乾燥器に凝集し、噴霧乾燥器の様々な区画を詰まらせ、物質の回収がほとんどまたは全くなかった。しかしながら、ポリマーを用いて調製された同じ２つのＬＮＰ－ｍＲＮＡ製剤は、表１（下部）に記載されるように、および図２に示されるように、噴霧乾燥に成功し、噴霧乾燥工程から４０％を超える回収率の物質を得た。
ポリマーなしの各ＬＮＰ－ｍＲＮＡ製剤上の噴霧乾燥工程は成功しなかった。いずれの場合も、表１（下部）に記載されるように、および図２に示されるように、物質が噴霧乾燥器に凝集し、噴霧乾燥器の様々な区画を詰まらせ、物質の回収がほとんどまたは全くなかった。しかしながら、ポリマーを用いて調製された同じ２つのＬＮＰ－ｍＲＮＡ製剤は、表１（下部）に記載されるように、および図２に示されるように、噴霧乾燥に成功し、噴霧乾燥工程から４０％を超える回収率の物質を得た。
【0206】
封入効率およびナノ粒子サイズ（Ｚ平均）に対する噴霧乾燥の効果を、噴霧乾燥工程の前後に測定し、表１（下部）に値を示した。ポリマーを用いて調製されたＬＮＰ－ｍＲＮＡ製剤については、封入効率は、噴霧乾燥の前後で物質において顕著な変化はなく、ナノ粒子サイズは、噴霧乾燥の前から後までに増加することが見出された。ポリマーなしで調製されたＬＮＰ－ｍＲＮＡ製剤については、これらの測定は、任意の実質的な物質を生成するための噴霧乾燥工程の失敗により決定することができなかった。
【0207】
実施例２．ｍＲＮＡ乾燥粉末製剤の完全性および安定性
この実施例では、アルギニノコハク酸シンテターゼまたはＡＳＳ１ ｍＲＮＡをコードする２つのｍＲＮＡ製剤を調製し、長期安定性について評価した。特に、ＬＮＰを含まないがポリマー（ＡＳＳ１－Ｆ１）を含む１つのｍＲＮＡ製剤を調製した。ＬＮＰ封入ＬＮ
Ｐ＋ポリマー（ＡＳＳ－Ｆ２）を含んだ２つ目のｍＲＮＡ製剤を調製した。各製剤を、表２にさらに記載する。
この実施例では、アルギニノコハク酸シンテターゼまたはＡＳＳ１ ｍＲＮＡをコードする２つのｍＲＮＡ製剤を調製し、長期安定性について評価した。特に、ＬＮＰを含まないがポリマー（ＡＳＳ１－Ｆ１）を含む１つのｍＲＮＡ製剤を調製した。ＬＮＰ封入ＬＮ
Ｐ＋ポリマー（ＡＳＳ－Ｆ２）を含んだ２つ目のｍＲＮＡ製剤を調製した。各製剤を、表２にさらに記載する。
【0208】
ＡＳＳ１－Ｆ１製剤については、ｍＲＮＡをギアポンプを使用してポリマーと直接混合した。ＡＳＳ１－Ｆ２製剤については、ｍＲＮＡをＬＮＰ内に封入するために、ｍＲＮＡを最初にギアポンプを使用して脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と混合し、次いでポリマー溶液をギアポンプを使用してｍＲＮＡ－ＬＮＰと混合した。最終製剤を濃縮し、マンニトールを各製剤に添加した。次いで、図１の器具の図形表現に示されるように、溶液を噴霧乾燥させた。以下の条件を噴霧乾燥に使用した：入口温度９０℃、吸引器パーセンテージ８５％、ポンプパーセンテージ２５％、および出口温度４６～５０℃。
【表2】
【0209】
封入効率およびナノ粒子サイズ。封入効率に対する噴霧乾燥の効果を、乾燥の前後に測定した。この実施例では、ポリマーを含む製剤中のＬＮＰ封入ｍＲＮＡの封入効率は、工程前は７５．２８±１．４３であり、その後は８１．８５±０．４４であり、噴霧乾燥プロセスが封入効率に負に影響を与えなかったことを示す。噴霧乾燥の前後のナノ粒子の平均サイズは、それぞれ９９．４±１．３および４２６±１２であった。
【0210】
ｍＲＮＡ乾燥粉末の完全性および安定性。ポリマーを含む製剤中のＬＮＰ封入ｍＲＮＡ
は、たとえ冷蔵温度（４℃）で保存されていたか、または様々な時間にわたって－２０℃で凍結された場合でも、噴霧乾燥後のｍＲＮＡの予想外の高い完全性および安定性をもたらした。以下に記載されるｍＲＮＡの完全性および安定性を、分光光度分析、例えば、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、ならびにゲル電気泳動、例えば、ノーザンブロット分析によって評価した。
は、たとえ冷蔵温度（４℃）で保存されていたか、または様々な時間にわたって－２０℃で凍結された場合でも、噴霧乾燥後のｍＲＮＡの予想外の高い完全性および安定性をもたらした。以下に記載されるｍＲＮＡの完全性および安定性を、分光光度分析、例えば、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、ならびにゲル電気泳動、例えば、ノーザンブロット分析によって評価した。
【0211】
図３および図４は、ｍＲＮＡの完全性の分析のための例示的な対照としての役目を果たす。特に、図３は、ＣＥ（左側のパネル）およびゲル電気泳動（右側のパネル）によって評価されたインタクトなｍＲＮＡを示す。図の左側のパネルでは、インタクトなｍＲＮＡは単一の分光光度ピーク（影付き）として現れ、図の右側のパネルでは、インタクトなｍＲＮＡはｍＲＮＡの予期される分子サイズに対応する単一バンドとして現れ、その単一ピークおよび単一バンドはそれぞれ、インタクトなｍＲＮＡおよび分解生成物の不在を示す。同様に、図４は、噴霧乾燥前、およびＬＮＰから抽出された（すなわち、ｍＲＮＡ上のＣＥおよびゲル電気泳動分析を実施する目的で抽出される）ｍＲＮＡを示し、ＬＮＰからのｍＲＮＡの抽出が顕著なｍＲＮＡ分解生成物を生成しないことを確認する。図４のＣＥピークおよびゲルバンドと図３のＣＥピークおよびゲルバンドとの比較は、ＬＮＰからｍＲＮＡを抽出するために使用されるプロセスが、顕著なｍＲＮＡ分解生成物を生成しないことを示す。
【0212】
噴霧乾燥ＡＳＳ１－Ｆ１製剤または噴霧乾燥ＡＳＳ１－Ｆ２製剤のアリコートを、４℃または－２０℃のいずれかで保存し、様々な時点で試料を除去し、再構成し、ＣＥおよびゲル電気泳動によりｍＲＮＡの完全性を評価した。特に、ポリマー（ＡＳＳ１－Ｆ２）で製剤化された乾燥粉末ＡＳＳ１ ｍＲＮＡ－ＬＮＰのｍＲＮＡの完全性を、噴霧乾燥し、４℃または－２０℃のいずれかで保存した後、２週目および４週目で評価し、ポリマー（ＡＳＳ１－Ｆ１）で製剤化された乾燥粉末ＡＳＳ１ ｍＲＮＡ（ＬＮＰなし）のｍＲＮＡの完全性を、噴霧乾燥し、４℃または－２０℃のいずれかで保存した後、３週目および５週目で評価した。
【0213】
図５および図６は、ポリマー（ＡＳＳ１－Ｆ２）で製剤化され、それぞれ４℃または－２０℃で２週間保存された乾燥粉末ＡＳＳ１ ｍＲＮＡ－ＬＮＰのｍＲＮＡの完全性を示す。図５および図６の各々は、単一のＣＥピーク（左側のパネル）および単一のゲルバンド（右側のパネル）を示し、ＡＳＳ１ ｍＲＮＡが両方の温度条件で分解することなくインタクトなままであることを示す。図７はさらに、ＡＳＳ１ ｍＲＮＡの２つのピークの重ね合わせを示し（図５および図６から）、ｍＲＮＡが保存温度にかかわらずインタクトなままであることを示す。これらのデータは、ポリマーを含むｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の噴霧乾燥製剤が、例えば、約－２０℃もしくは最大約－２０℃で、または約４℃もしくは最大約４℃などの範囲の保存温度にわたって少なくとも２週間安定しているままであることを示す。
【0214】
図８および図９は、ポリマー（ＡＳＳ１－Ｆ２）で製剤化され、それぞれ４℃または－２０℃で４週間保存された乾燥粉末ＡＳＳ１ ｍＲＮＡ－ＬＮＰのｍＲＮＡの完全性を示す。図８および図９の両方は、単一のＣＥピーク（左側のパネル）および単一のゲルバンド（右側のパネル）を示し、ＡＳＳ１ ｍＲＮＡが両方の温度条件で分解することなくインタクトなままであることを示す。これらのデータは、ポリマーを含むｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の噴霧乾燥製剤が、例えば、約－２０℃もしくは最大約－２０℃で、または約４℃もしくは最大約４℃など、広範囲の保存温度にわたって少なくとも４週間安定しているままであることを示す。
【0215】
図１０および図１１は、ポリマー（ＡＳＳ１－Ｆ１）で製剤化され、それぞれ４℃または－２０℃で３週間保存された乾燥粉末ＡＳＳ１ ｍＲＮＡ（ＬＮＰなし）のｍＲＮＡの
完全性を示す。図１０および図１１に示されるように、ＡＳＳ１－Ｆ１ ｍＲＮＡは、両方の温度条件で、分解することなくインタクトなままであった。図１２は、ＡＳＳ１ ｍＲＮＡのＣＥピークの重ね合わせを示し（図１０および図１１からの）、ＣＥピークの完全な整列は、ｍＲＮＡの分解の不在を示す。これは、ポリマー（ＬＮＰ封入なし）を含むｍＲＮＡの噴霧乾燥製剤が、例えば、約－２０℃もしくは最大約－２０℃で、または約４℃もしくは最大約４℃など、広範囲の保存温度にわたって少なくとも３週間安定しているままであることを示す。
完全性を示す。図１０および図１１に示されるように、ＡＳＳ１－Ｆ１ ｍＲＮＡは、両方の温度条件で、分解することなくインタクトなままであった。図１２は、ＡＳＳ１ ｍＲＮＡのＣＥピークの重ね合わせを示し（図１０および図１１からの）、ＣＥピークの完全な整列は、ｍＲＮＡの分解の不在を示す。これは、ポリマー（ＬＮＰ封入なし）を含むｍＲＮＡの噴霧乾燥製剤が、例えば、約－２０℃もしくは最大約－２０℃で、または約４℃もしくは最大約４℃など、広範囲の保存温度にわたって少なくとも３週間安定しているままであることを示す。
【0216】
図１３および図１４は、ポリマー（ＡＳＳ１－Ｆ１）で製剤化され、それぞれ４℃または－２０℃で５週間保存された乾燥粉末ＡＳＳ１ ｍＲＮＡ（ＬＮＰなし）のｍＲＮＡの完全性を示す。図１３および図１４に示されるように、ＡＳＳ１－Ｆ１ ｍＲＮＡは、両方の温度条件で、分解することなくインタクトなままであった。これは、ポリマー（ＬＮＰ封入なし）を含むｍＲＮＡの噴霧乾燥製剤が、例えば、約－２０℃もしくは最大約－２０℃で、または約４℃もしくは最大約４℃など、広範囲の保存温度にわたって少なくとも５週間安定しているままであることを示す。
【0217】
驚くべきことに、ポリマー（ＡＳＳ１－Ｆ２）で製剤化された乾燥粉末ＡＳＳ１ ｍＲＮＡ－ＬＮＰの両方について、およびポリマー（ＡＳＳ１－Ｆ１）で製剤化された乾燥粉末ＡＳＳ１ ｍＲＮＡ（ＬＮＰなし）について、ｍＲＮＡの完全性は、例えば、冷蔵保存（約４℃）などの高い保存温度で長期間維持された。
【0218】
実施例３．脂質ポリマーナノ粒子におけるｍＲＮＡ封入の一工程方法
この実施例では、脂質、ｍＲＮＡ、およびポリマーを単一工程で調製して、脂質ポリマー封入ｍＲＮＡナノ粒子（ポリマーを含む製剤ＡＳＳ１－Ｆ３およびポリマーを含むＡＳＳ１－Ｆ４）を生成した。これは、ＬＮＰ封入ｍＲＮＡナノ粒子を最初に調製し、次いでポリマーを製剤に添加した実施例１および実施例２とは対照的である。さらに、参照製剤は、同じプロセスによって調製されたが、ナノ粒子または製剤にポリマーを含まない（ポリマーなしの製剤ＡＳＳ１－Ｆ３およびポリマーなしのＡＳＳ１－Ｆ４）。
この実施例では、脂質、ｍＲＮＡ、およびポリマーを単一工程で調製して、脂質ポリマー封入ｍＲＮＡナノ粒子（ポリマーを含む製剤ＡＳＳ１－Ｆ３およびポリマーを含むＡＳＳ１－Ｆ４）を生成した。これは、ＬＮＰ封入ｍＲＮＡナノ粒子を最初に調製し、次いでポリマーを製剤に添加した実施例１および実施例２とは対照的である。さらに、参照製剤は、同じプロセスによって調製されたが、ナノ粒子または製剤にポリマーを含まない（ポリマーなしの製剤ＡＳＳ１－Ｆ３およびポリマーなしのＡＳＳ１－Ｆ４）。
【0219】
特に、脂質およびポリマー（または対照製剤の単なる脂質）をエタノール中に溶解し、ギアポンプを使用してｍＲＮＡ溶液と一緒に混合した。４つの異なる製剤を調製した。第１および第２の製剤（ポリマーなしのＡＳＳ１－Ｆ３およびポリマーを含むＡＳＳ１－Ｆ３）を、ポリマーありまたはなしのいずれかで、カチオン性脂質としてｃＫＫ－Ｅ１２で調製した。第３および第４の製剤（ポリマーなしのＡＳＳ１－Ｆ４およびポリマーを含むＡＳＳ１－Ｆ４）は、ポリマーありまたはなしのいずれかで、カチオン性脂質としてＩＣＥ（イミダゾールコレステロールエステル）で調製した。ポリマーを含むＡＳＳ１－Ｆ３およびポリマーを含むＡＳＳ１－Ｆ４は、ポリマーとしてＥｕｄｒａｇｉｔを含んでいた。４つの製剤すべてが、ナノ粒子封入ｍＲＮＡとしてＡＳＳ１をコードするｍＲＮＡを含んでいた。各製剤を濃縮し、マンニトールを添加した。すべての製剤を、表３にさらに記載する。各製剤を、実施例１に記載される条件を使用して噴霧乾燥させた。
【表3】
【0220】
結果
ポリマーなしの製剤（ポリマーなしのＡＳＳ１－Ｆ３およびポリマーなしのＡＳＳ－Ｆ４）の噴霧乾燥工程は成功しなかった。いずれの場合も、ポリマーなしの各製剤について１±２％の回収を示す表３（下部）に記載されるように、物質が噴霧乾燥器に凝集し、噴霧乾燥器の様々な区画を詰まらせ、物質の回収がほとんどまたは全くなかった。しかしながら、ナノ粒子（ポリマーを含むＡＳＳ１－Ｆ３およびポリマーを含むＡＳＳ－Ｆ４）中のポリマーで調製されたこれら同じ２つの製剤はそれぞれ、表３に記載されるように、噴霧乾燥に成功し、噴霧乾燥工程から３５％超およびほぼ４０％の回収率の物質を得た。
ポリマーなしの製剤（ポリマーなしのＡＳＳ１－Ｆ３およびポリマーなしのＡＳＳ－Ｆ４）の噴霧乾燥工程は成功しなかった。いずれの場合も、ポリマーなしの各製剤について１±２％の回収を示す表３（下部）に記載されるように、物質が噴霧乾燥器に凝集し、噴霧乾燥器の様々な区画を詰まらせ、物質の回収がほとんどまたは全くなかった。しかしながら、ナノ粒子（ポリマーを含むＡＳＳ１－Ｆ３およびポリマーを含むＡＳＳ－Ｆ４）中のポリマーで調製されたこれら同じ２つの製剤はそれぞれ、表３に記載されるように、噴霧乾燥に成功し、噴霧乾燥工程から３５％超およびほぼ４０％の回収率の物質を得た。
【0221】
ナノ粒子中のポリマーで調製された製剤についての封入効率およびナノ粒子サイズ（Ｚ平均）に対する噴霧乾燥の効果を、噴霧乾燥工程の前後に測定し、表３（下部）に値を示
した。各脂質－ポリマー－ｍＲＮＡナノ粒子について、封入効率は、噴霧乾燥の前後で顕著な変化はなく、ナノ粒子サイズは、噴霧乾燥の前から後まで増加することが見出された。ポリマーなしで調製された製剤については、これらの測定は、任意の実質的な物質を生成するための噴霧乾燥工程の失敗により決定することができなかった。
した。各脂質－ポリマー－ｍＲＮＡナノ粒子について、封入効率は、噴霧乾燥の前後で顕著な変化はなく、ナノ粒子サイズは、噴霧乾燥の前から後まで増加することが見出された。ポリマーなしで調製された製剤については、これらの測定は、任意の実質的な物質を生成するための噴霧乾燥工程の失敗により決定することができなかった。
【0222】
これらの結果は、とりわけ、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子に添加されたポリマーにより、ｍＲＮＡ封入脂質ナノ粒子の噴霧乾燥が成功することを示す。これは、ｍＲＮＡを含まない同じ脂質ナノ粒子とは対照的であり、これは噴霧乾燥に成功しなかった。
【0223】
実施例４．脂質ポリマーナノ粒子におけるｍＲＮＡ封入の一工程方法
この実施例では、ポリマーであるＰＬＧＡを、脂質およびｍＲＮＡと単一工程で混合して、脂質－ＰＬＧＡで封入ｍＲＮＡナノ粒子を生成した。
この実施例では、ポリマーであるＰＬＧＡを、脂質およびｍＲＮＡと単一工程で混合して、脂質－ＰＬＧＡで封入ｍＲＮＡナノ粒子を生成した。
【0224】
特に、脂質およびＰＬＧＡ（または対照製剤の単なる脂質）を、エタノールおよびアセトニトリル（１：２）混合物中に溶解し、ギアポンプを使用してＡＳＳ１ ｍＲＮＡ溶液と混合した。最終製剤を５％マンニトール中で濃縮し、次いで噴霧乾燥した。以下の条件を噴霧乾燥に使用した：入口温度９０℃、吸引器パーセンテージ８５％、ポンプパーセンテージ２５％、および出口温度４６～５０℃。製剤を、表４にさらに記載する。
【表4】
【0225】
結果
ナノ粒子中のＰＬＧＡポリマーで調製された製剤の噴霧乾燥工程は、噴霧乾燥に成功し、噴霧乾燥工程からの物質の回収をもたらした。
ナノ粒子中のＰＬＧＡポリマーで調製された製剤の噴霧乾燥工程は、噴霧乾燥に成功し、噴霧乾燥工程からの物質の回収をもたらした。
【0226】
実施例５．噴霧乾燥ｍＲＮＡ製剤のインビボ送達
この実施例では、噴霧乾燥製剤である、ポリマーを含むＦＦＬ－Ｆ１（実施例１に記載される）を、乾燥粉末としておよび液体に溶解しての両方でマウスに投与し、投与された製剤中のｍＲＮＡの発現を両方のアプローチで検出した。
この実施例では、噴霧乾燥製剤である、ポリマーを含むＦＦＬ－Ｆ１（実施例１に記載される）を、乾燥粉末としておよび液体に溶解しての両方でマウスに投与し、投与された製剤中のｍＲＮＡの発現を両方のアプローチで検出した。
【0227】
特に、１つのアプローチでは、ポリマーを含むＦＦＬ－Ｆ１の乾燥粉末製剤を、乾燥粉末送気装置であるモデルＤＰ－４Ｍを使用して、１ｍｇの用量でマウスに投与した。乾燥粉末の投与後２４時間で、ＦＦＬ基質であるルシフェリンをマイクロスプレーを用いて投与し、インビボでのルシフェラーゼ発現を生体発光アッセイにより検出した。結果を図１５Ａに示す。
【0228】
第２のアプローチでは、ポリマーを含むＦＦＬ－Ｆ１を２０ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶解し、１ｍｇの用量に対し、マイクロスプレーによりマウスあたり５０マイクロリットルを投与した。投与後２４時間で、ＦＦＬ基質であるルシフェリンをマイクロスプレーを用いて投与し、インビボでのルシフェラーゼ発現を生体発光アッセイにより検出した。結果を図１５Ｂに示す。
【0229】
これらの結果は、ポリマーを含む製剤中でＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡが、噴霧乾燥後に活性を維持することを示す。これらの結果はまた、噴霧乾燥ＬＮＰ封入ｍＲＮＡが、乾燥粉末として直接投与されて、インビボでタンパク質の発現を提供することができることを示す。
【0230】
実施例６．ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ脂質ポリマーナノ粒子乾燥粉末製剤
この実施例では、嚢胞性線維症コンダクタンス調節因子タンパク質（ＣＦＴＲ）、またはＣＦＴＲ ｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡを、脂質ポリマーナノ粒子内に封入し、安定した乾燥粉末に噴霧乾燥することに成功した。
この実施例では、嚢胞性線維症コンダクタンス調節因子タンパク質（ＣＦＴＲ）、またはＣＦＴＲ ｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡを、脂質ポリマーナノ粒子内に封入し、安定した乾燥粉末に噴霧乾燥することに成功した。
【0231】
特に、ＣＦＴＲ－ｍＲＮＡを封入する脂質ポリマーナノ粒子を調製するために、以下の表５に記載されるＰＥＧ修飾脂質、カチオン性脂質、およびポリマーを、１５０ｍＬのエタノール中に溶解し、ギアポンプを使用してＣＦＴＲ－ｍＲＮＡ（６００ｍＬ、ｐＨ４．５、１ｍＭのクエン酸緩衝液、１５０ｍＭの塩化ナトリウム中０．０５ｇ）と混合した。次いで、３７．５ｇのマンニトールを５％重量／体積で溶解し、その結果得られた７５０ｍＬのＣＦＴＲ－ｍＲＮＡ溶液（２０％エタノール）を脂質ポリマーナノ粒子内に封入した。次いで、得られた混合物を、以下の噴霧乾燥条件を使用してＢｕｃｈｉ噴霧乾燥機で噴霧乾燥させた：９０℃の入口温度、９０％の吸引器の割合、２５％のポンプの割合、および４６～５０℃の出口温度。
【表5】
【0232】
噴霧乾燥後の脂質ポリマーナノ粒子中のＣＦＴＲ－ｍＲＮＡの完全性を定量的に決定するために、ＣＦＴＲ－ｍＲＮＡを、グアニジンチオシアネート、Ｎ－ラウロイルサルコシン、およびクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．５を含むＲＮＡ沈殿緩衝液とエタノール中のナノ粒子を混合および溶解することによってナノ粒子から沈殿させた。沈殿したｍＲＮＡをさらに分離し、ＲＮｅａｓｙシリカ膜（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、次いでＲＮＡｓｅ遊離水に再溶解した。精製されたｍＲＮＡを、製造業者が公開した指示に従い、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用したキャピラリー電気泳動により評価した。簡潔には、適切な体積のインターカレーティング染料およびＲＮＡ分離ゲルを混合し、機器に充填した。キャピラリー調整緩衝液を、必要な濃度に希釈し、調整流体ライン上に充填した。入口緩衝液、リンス緩衝液、および保存緩衝液をウェルプレート
に添加し、指定された場所に添加した。抽出されたｍＲＮＡおよび対照ｍＲＮＡを、ホルムアミド充填緩衝液を使用して１５０ｎｇ／μＬに希釈し、次いで７０℃で５分間加熱し、直ちに冷却することによって変性させた。試料を、製造業者の指示に従って希釈マーカーを使用してさらに希釈し、関連する分離方法によって断片分析器上で実行した。
に添加し、指定された場所に添加した。抽出されたｍＲＮＡおよび対照ｍＲＮＡを、ホルムアミド充填緩衝液を使用して１５０ｎｇ／μＬに希釈し、次いで７０℃で５分間加熱し、直ちに冷却することによって変性させた。試料を、製造業者の指示に従って希釈マーカーを使用してさらに希釈し、関連する分離方法によって断片分析器上で実行した。
【0233】
上の実施例に記載されるように、製剤中の追加のポリマーを含まないＬＮＰ－ｍＲＮＡ製剤は、噴霧乾燥に成功することができなかった。特に、ＬＮＰ－ｍＲＮＡ物質は、噴霧乾燥機に凝集され、噴霧乾燥器の様々な区画を詰まらせ、ＬＮＰ－ｍＲＮＡ材料の回収はほとんどまたは全くなかった。上の実施例が示すように、この噴霧乾燥に成功したＬＮＰ－ｍＲＮＡ物質の失敗は、ナノ粒子を作製しｍＲＮＡを封入する工程中にポリマーが存在するようにポリマーを脂質に含めることによって、または代替的には脂質ナノ粒子を作製しｍＲＮＡを封入する工程後にポリマーを製剤に添加することによってのいずれかで、ＬＮＰ製剤へのポリマーの添加により克服することができる。ここで、脂質ナノ粒子内に封入されたＣＦＴＲ－ｍＲＮＡは、ポリマー、特にＥｕｄｒａｇｉｔポリマーの添加により噴霧乾燥することに成功した。特に、脂質ポリマーナノ粒子で封入されたＣＦＴＲ－ｍＲＮＡが生成されるように、ナノ粒子を作製し、ｍＲＮＡを封入する工程の前に、Ｅｕｄｒａｇｉｔポリマーを脂質混合物に含めた。噴霧乾燥に成功したＣＦＴＲ－ｍＲＮＡ脂質ポリマーナノ粒子も、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）分析を使用して完全性について評価した。図１６Ａ１～Ａ６は、噴霧乾燥前後のＣＦＴＲ－ｍＲＮＡピークの完全性の例示的なＣＥクロマトグラフを示し、脂質ポリマー中での噴霧乾燥後のＣＦＴＲ－ｍＲＮＡの完全性がインタクトなままであることを示す。図１６Ａ１～Ａ３は、噴霧乾燥または封入もされなかった対照ＣＦＴＲ ｍＲＮＡを示し、一方、図１６Ａ４～Ａ６は、噴霧乾燥製剤から抽出されたＣＦＴＲ ｍＲＮＡを示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-12-27
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
本願明細書に記載の発明。