特開 2024-38199 細菌由来ミニ細胞を含む組成物およびそれを使用する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024038199

(43)【公開日】2024-03-19

(54)【発明の名称】細菌由来ミニ細胞を含む組成物およびそれを使用する方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/704 20060101AFI20240312BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 31/7032 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240312BHJP

   A61K 47/69 20170101ALI20240312BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 47/46 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 31/7034 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 31/685 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 31/164 20060101ALI20240312BHJP

【ＦＩ】

A61K31/704

A61P43/00 121

A61P35/00

A61K31/7032

A61P35/02

A61P35/04

A61K39/395 C

A61K39/395 L

A61K47/68

A61K47/69

A61K9/51

A61K47/46

A61K31/7034

A61K31/685

A61K31/164

【審査請求】有

【請求項の数】19

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023222336

(22)【出願日】2023-12-28

(62)【分割の表示】P 2021503095の分割

【原出願日】2019-07-22

(31)【優先権主張番号】62/702,172

(32)【優先日】2018-07-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/788,265

(32)【優先日】2019-01-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】504146523

【氏名又は名称】エンジーンアイシー モレキュラー デリバリー ピーティーワイ リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100123788

【弁理士】

【氏名又は名称】宮崎 昭夫

(74)【代理人】

【識別番号】100127454

【弁理士】

【氏名又は名称】緒方 雅昭

(72)【発明者】

【氏名】ブランバット、 ヒマンシュ

(72)【発明者】

【氏名】マックディアミド、 ジェニファー

(57)【要約】      （修正有）

【課題】がんを治療するための医薬組成物を提供する。
【解決手段】(a)少なくとも1つの抗腫瘍剤であって、抗腫瘍剤がモルホリニルアントラサイクリンを含み、精製された無傷の細菌由来ミニ細胞の治療有効量、および(b)Ｃ－グリコシド型のα－ガラクトシルセラミド（α－Ｃ－ＧａｌＣｅｒ）、β－Ｄ－グルコピラノシルセラミド（β－ＧｌｃＣｅｒ）、１，２－ジアシル－３－ガラクトシル－sn－グリセロール（ＢｂＧＬ－ＩＩ）、糖脂質を含むジアシルグリセロール（Ｇｌｃ－ＤＡＧ－ｓ２）、ガングリオキシド(ＧＤ３)等より選択されるインターフェロンII型アゴニスト、を含む抗癌剤組成物とする。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

(a)少なくとも1つの抗腫瘍剤を含む、精製された無傷の細菌由来ミニ細胞の治療有効量、
および
(b)インターフェロンI型アゴニスト、インターフェロンII型アゴニスト、またはインター
フェロンI型アゴニストおよびインターフェロンII型アゴニストの組合せ、
を含む組成物。

【請求項2】

前記組成物の要素（b）が、
(i)インターフェロンI型アゴニストを含む、精製された無傷の細菌由来ミニ細胞の治療有
効量、または
(ii)インターフェロンII型アゴニストを含む、精製された無傷の細菌由来ミニ細胞の治療
有効量、または
(iii)以下の組合せ：
(1)インターフェロンI型アゴニストを含む精製された無傷の細菌由来ミニ細胞の治療有
効量、および
(2)インターフェロンII型アゴニストを含む精製された無傷の細菌由来ミニ細胞の治療
有効量、
を含む、請求項1に記載の組成物。

【請求項3】

(a)前記抗腫瘍剤、およびインターフェロンI型アゴニスト、インターフェロンII型アゴニ
スト、またはインターフェロンI型アゴニストおよびインターフェロンII型アゴニストの
組合せは、２つ以上の精製された無傷の細菌由来ミニ細胞内にパッケージ化され、または
(b)前記抗腫瘍剤、およびインターフェロンI型アゴニスト、インターフェロンII型アゴニ
スト、またはインターフェロンI型アゴニストおよびインターフェロンII型アゴニストの
組合わせは、精製された無傷の細菌由来ミニ細胞の３つの別々の集団内にパッケージ化さ
れる、
請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

前記抗腫瘍剤、インターフェロンI型アゴニスト、およびインターフェロンII型アゴニス
トを含み、ここで、
(a)前記抗腫瘍剤、インターフェロンI型アゴニスト、およびインターフェロンII型アゴニ
ストは、同じミニ細胞内に含まれ、
(b)前記抗腫瘍剤およびインターフェロンI型アゴニストは第１のミニ細胞内に含まれ、イ
ンターフェロンII型アゴニストは第２のミニ細胞内に含まれ、
(c)前記抗腫瘍剤およびインターフェロンII型アゴニストは第１のミニ細胞内に含まれ、
インターフェロンI型アゴニストは第２のミニ細胞内に含まれ、
(d)前記抗腫瘍剤は第１のミニ細胞内に含まれ、インターフェロンI型アゴニストおよびイ
ンターフェロンII型アゴニストは第２のミニ細胞内に含まれ、または
(e)前記抗腫瘍剤は第１のミニ細胞内に含まれ、インターフェロンI型アゴニストは第２の
ミニ細胞内に含まれ、およびインターフェロンII型アゴニストは第３のミニ細胞内に含ま
れる、
請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項5】

前記組成物が、インターフェロンI型アゴニストを含まない、請求項１～４のいずれか１
項に記載の組成物。

【請求項6】

(a)前記抗腫瘍剤は、放射性核種、化学療法薬、機能性核酸、および機能性核酸を転写す
ることができるポリヌクレオチドからなる群から選択され、および／または
(b)前記抗腫瘍剤は、超毒性化学療法剤であり、および／または
(c)前記抗腫瘍剤は、モルホリニルアントラサイクリン、メイタンシノイド、デュカルマ
イシン、アウリスタチン、カリケアマイシン（ＤＮＡ損傷剤）、α－アマニチン（RNAポ
リメラーゼII阻害剤）、センタマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ストレプトニグチン
、窒素マスタード、ニトロソルエア、アルカンスルホネート、ピリミジン類似体、プリン
類似体、代謝拮抗剤、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、ビンカアルカロイド
、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン剤、およびこれらの組合せからなる群より選択され
る超毒性化学療法剤であり、および／または
(d)前記抗腫瘍剤は、ネモルビシン、ＰＮＵ-１５９６８２、イダルビシン、ダウノルビシ
ン、カミノマイシン、およびオキソルビシンからなる群より選択されるモルホリニルアン
トラサイクリンである超毒性化学療法剤であり、および／または
(e)前記抗腫瘍剤は、ＰＮＵ-１５９６８２である超毒性化学療法剤であり、および／また
は
(f)前記抗腫瘍剤は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、アンチセ
ンスＲＮＡ、およびリボザイムからなる群より選択される機能性核酸であり、および／ま
たは
(g)前記抗腫瘍剤は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、アンチセ
ンスＲＮＡ、およびリボザイムからなる群より選択される機能性核酸であり、ここで、機
能性核酸は腫瘍細胞増殖、血管新生または化学療法に対する抵抗性を促進し、および／ま
たはアポトーシスまたは細胞周期停止を阻害する遺伝子を阻害し、そして任意に、（i）
ｓｉＲＮＡは、リボヌクレオチドレダクターゼＭ１（ＲＲＭ１）発現を阻害し、（ii）ｓ
ｉＲＮＡがポロ様キナーゼ1（Ｐｌｋ１）発現を阻害し、または（iii）ｍｉＲＮＡがｍｉ
ＲＮＡ１６ａである、
請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項7】

(a)インターフェロンI型アゴニスト、インターフェロンII型アゴニスト、またはインター
フェロンI型アゴニストとインターフェロンII型アゴニストの組合せはオリゴヌクレオチ
ドであり、および／または
(b)インターフェロンI型アゴニスト、インターフェロンII型アゴニスト、またはインター
フェロンアI型ゴニストとインターフェロンII型アゴニストとの組み合わせはオリゴヌク
レオチドであり、オリゴヌクレオチドは少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５
０ヌクレオチド、または少なくとも約６０ヌクレオチドの配列を含み、および／または
(c)インターフェロンＩ型アゴニスト、インターフェロンII型アゴニスト、またはインタ
ーフェロンI型アゴニストとインターフェロンII型アゴニストの組み合わせはオリゴヌク
レオチドであり、オリゴヌクレオチドはＰＮＰａｓｅ１、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ポリ－ＩＣＬ
Ｃ、イミキモド、イミダゾキノリンエスキモド、ｃＧＡＭＰまたはＣｐＧ－オリゴデオキ
シヌクレオチドのポリヌクレオチド産物である、
請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項8】

インターフェロンI型アゴニストが、二本鎖ＲＮＡ(dsＲＮＡ)、ポリ(ｄＡ：ｄＴ)ＤＮＡ
、二本鎖Z－ＤＮＡおよびB－ＤＮＡ、３６ｂｐおよびＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドよりも
長いＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、細菌セカンドメッセンジャーサイクリックジ－ＧＭＰ、ＴＬ
Ｒ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９アゴニスト、ＳＴＩＮＧアゴニスト
、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される請求項１～７のいずれか一項記
載の組成物。

【請求項9】

(a)インターフェロンII型アゴニストが、Ｃ－グリコシド型のα－ガラクトシルセラミド
（α－Ｃ－ＧａｌＣｅｒ）、α－ガラクトシルセラミド（α－ＧａｌＣｅｒ)、１２炭素
アシル型ガラクトシルセラミド（β－ＧａｌＣｅｒ）、β－Ｄ－グルコピラノシルセラミ
ド（β－ＧｌｃＣｅｒ）、１，２－ジアシル－３－ガラクトシル－sn－グリセロール（Ｂ
ｂＧＬ－ＩＩ）、糖脂質を含むジアシルグリセロール（Ｇｌｃ－ＤＡＧ－ｓ２）、ガング
リオキシド(ＧＤ３)、ガングリオトリアセラミド（Ｇｇ３Ｃｅｒ）、グリコシルホスファ
チジルイノシトール（ＧＰＩ）、α－グルクロノシルセラミド（ＧＳＬ－１またはＧＳＬ
－４）、イソグロボトリヘキソシルセラミド（ｉＧｂ３）、リポホスホグリカン（ＬＰＧ
）、ホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、α－ガラクトシルセラミド類似体（ＯＣＨ）、ス
レイトールセラミドおよびそれらの組合わせからなる群より選択され、および／または
(b)インターフェロンII型作動薬はα－ガラクトシルセラミド（α－GalCer）である、
請求項１～８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項10】

(a)抗腫瘍剤を含むミニ細胞に結合した二重特異性リガンド、および／または
(b)インターフェロンI型アゴニストを含むミニ細胞に結合した二重特異性リガンド、およ
び／または
(c)インターフェロンII型アゴニストを含むミニ細胞に結合した二重特異性リガンド、を
更に含む請求項１～９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項11】

前記二重特異性リガンドが、
(a) ミニ細胞表面構造に対する特異性を有する第１のアームと、非食作用性哺乳動物細胞
表面受容体に対する特異性を有する第２のアームを含み、および／または
(b)ミニ細胞表面構造に対する特異性を有する第１のアームと、非食作用性哺乳動物細胞
表面受容体に対する特異性を有し、ミニ細胞表面構造がミニ細胞表面上のリポ多糖のO－
多糖成分である第２のアームとを含み、および／または
(c)ミニ細胞表面構造に対する特異性を有する第1のアームおよび非食作用性哺乳動物細胞
表面受容体に対する特異性を有する第２のアームを含み、ここで、非貪食性哺乳動物細胞
表面受容体は、ミニ細胞の受容体媒介エンドサイトーシスを活性化することができ、およ
び／または
(d)二重特異性抗体または抗体断片を含み、および／または
(e)ここで、抗体または抗体断片は、細菌由来のミニ細胞表面構造に対する特異性を有す
る第１の多価アームと、癌細胞表面受容体に対する特異性を有する第２の多価アームとを
含み、癌細胞表面受容体は、ミニ細胞の受容体媒介エンドサイトーシスを活性化すること
ができる、
請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記組成物が、１０⁷ミニ細胞当たり約１未満の汚染親細菌細胞、１０⁸ミニ細胞当たり約
１未満の汚染親細菌細胞、１０⁹ミニ細胞当たり約１未満の汚染親細菌細胞、１０¹⁰ミニ
細胞当たり約１未満の汚染親細菌細胞、または１０¹¹ミニ細胞当たり約１未満の汚染親細
菌細胞を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項13】

薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成
物。

【請求項14】

前記ミニ細胞が、直径約４００nmである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組成物
。

【請求項15】

前記組成物が２００nm濾過によって除去可能な親細菌細胞汚染を含まない、請求項１～１
４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項16】

前記組成物が、
(a)少なくとも約１０⁹、
(b)少なくとも約１×１０⁹、
(c)少なくとも約２×１０⁹、
(d)少なくとも約５×１０⁹、
(e)少なくとも８×１０⁹、
(f)約１０¹¹以下、
(g)約１×１０¹¹以下、
(h)約９×１０¹⁰以下、または
(i)約８×１０¹⁰以下
のミニ細胞または死滅した細菌細胞を含む、請求項１～１５のいずれか1項に記載の組成
物。

【請求項17】

有効量の前記組成物を被験体に投与することを含む、必要とする被験体を治療する方法に
おいて使用するための、請求項１～１６のいずれか1項に記載の組成物。

【請求項18】

前記被検体が、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ウサギ、マウス
、またはラットである請求項１７に記載の組成物。

【請求項19】

(a)前記被検体は癌に罹患しており、および／または
(b)前記被験体が癌に罹患しており、該癌が肺癌、乳癌、脳癌、肝臓癌、結腸癌、膵臓癌
、および膀胱癌からなる群より選択され、および／または
(c)前記被験体が癌に罹患しており、該癌が急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病
、副腎皮質がん、エイズ関連がん、エイズ関連リンパ腫、虫垂がん、星状細胞腫、非定型
奇形腫／ラブドイド腫瘍、基底細胞がん、膀胱がん、脳幹グリオーマ、脳腫瘍、乳がん、
気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、原発部位不明がん、カルチノイド腫瘍、主要サイト不
明がん、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、子宮頸がん、
小児がん、脊索腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、大腸
がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞腫瘍、子宮体が
ん、上衣芽細胞腫、上衣芽腫、上衣腫、食道がん、感覚神経肉腫、ユーイング肉腫、頭蓋
外胚細胞腫瘍、性腺外生殖細胞腫瘍、肝外胆管がん、胆がん、胃（胃）がん、胃腸カルチ
ノイド腫瘍、消化管間質細胞腫瘍、消化管間質腫瘍（GIST）、妊娠性絨毛腫瘍 、神経膠
腫、有毛細胞白血病、 心臓腫瘍、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒
色腫、小島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓ガン、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭ガン、
唇ガン、肝臓がん、悪性繊維性組織サイト骨ガン、脂肪肉腫、髄芽腫、黒色腫、メルケル
細胞がん、メルケル細胞がん、中皮腫、原発不明の転移性扁平上皮首がん、口腔がん、多
発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、
鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚がん、非小細胞肺
がん、口腔がん、口腔癌、中咽頭がん、骨肉腫、その他の脳および脊髄腫瘍、卵巣胚細胞
腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵がん、乳頭腫症、副鼻腔がん、副甲状腺がん、骨盤がん、ペ
ニスのがん、咽頭がん、中間的な分化を示す松果体実質細胞腫瘍、松果体芽腫、下垂体腫
瘍、形質細胞新生物/多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、 原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫、
原発性肝細胞腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性肝細胞がん、前立腺がん、腎細胞がん、腎細胞が
ん、腎細胞がん、網膜芽細胞腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、セザリー症候群、唾液腺が
ん、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮がん、頸部がん、胃（胃）がん、
テント上原始神経外胚葉性腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、咽頭がん、胸腺がん、胸腺
腫、甲状腺がん、移行上皮がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、絨毛腫瘍、尿管がん、
尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブ
リン血症、およびウィルムス腫瘍および／または
(d)前記被験体は、脳幹グリオーマ、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢
神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮腫、中間的
分化の松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫からなる群より
選択される脳腫瘍または脳腫瘍を罹患している、
請求項１７または１８に記載の組成物。

【請求項20】

前記組成物が、
(a)少なくとも週に１回、数週間にわたり、および／または
(b)１週間に少なくとも１回、数週間から数ヶ月にわたり、および／または
(c)１週間に少なくとも１回、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１
０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９または
約２０週間またはそれ以上、および／またはおよび／または
(d)毎週約２回、および／または
(e)約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１
３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９または約２０週間、またはそれ以
上にわたり、週に約２回、
投与される、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【関連出願の参照】

【0001】

本出願は２０１８年７月２３日に出願された米国仮出願62／702,172及び２０１９年１月４日に出願された米国仮出願62／788,265に対し、35USC§119に基づく優先権利益を主張し、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

現在、がんの治療に用いられるほとんどの薬物は全身投与される。細胞傷害性抗がん剤の全身デリバリーはがん治療において極めて重要な役割を果たすが、それはまた深刻な問題を引き起こす。例えば、投与された薬物に対する正常な組織／器官の全身曝露は、重篤な毒性を引き起こし得る。このことは、全身投与されるがん化学療法薬が薬剤の生物学的利用能の低さおよび患者内の分布容積の大さを克服するために、しばしば非常に高い用量で送達されなければならないという事実によって悪化する。また、全身的な薬剤投与は、しばしば主要な血管内での安全なカテーテルの使用を必要とするので、侵襲的であり得る。薬物の全身投与は末梢または中枢のいずれかの静脈の使用を必要とすることが多いため、静脈炎などの局所合併症を引き起こす可能性がある。薬物の血管外遊出はまた、ビンカアルカロイドおよびアントラサイクリンの投与時に一般に見られるような、局所投与部位での水泡／組織損傷をもたらし得る。

【0003】

がん治療における別の課題は、化学療法に対する内因性または獲得性の臨床的腫瘍耐性である。一次化学療法に反応しない腫瘍では、診断時に内因性耐性が存在する。後天性耐性は初回治療によく反応する可能性があるが、再発時に耐性表現型を示す腫瘍で生じる。このような腫瘍は、以前に使用された薬と、構造や作用機序が異なる薬を含む新しい薬の両方に耐性を獲得する。ＭＤＲ (多剤耐性）という用語は１種類の薬にさらされた後に、腫瘍細胞が構造的に無関係ないくつかの薬に対して交差耐性を示すようになる現象をいう。多剤耐性の機序は複雑で多因子性であるが、これは主としてがん細胞におけるゲノム不安定性および突然変異のレベルが高いためである。例示的な機構は、薬物不活性化、細胞膜ポンプによる薬物の排出、薬物流入の減少、薬物標的の突然変異およびアポトーシスの開始不全である。Bredel、2001；Chenら、2001; Sunら、2001; and White & McCubrey、2001。

【0004】

免疫系と悪性細胞の相互作用も腫瘍形成に重要な役割を果たしている。免疫系が形質転換した細胞を検出し、拒絶することができないと、がんの発生につながる可能性がある。腫瘍は、免疫介在性拒絶反応から逃れるために複数の機構を用いる。これらのメカニズムの多くは、現在、細胞レベルおよび分子レベルで知られている。このような知見にもかかわらず、がん免疫療法は臨床において未だ確立された治療法ではない。

【0005】

したがって、薬物耐性を低下させ、アポトーシスを促進し、免疫応答を誘導することができ、同時にこれらの薬物を全身的に送達することに関連する問題を回避することができる、薬物の標的送達を提供することができる送達システムに対する大きな必要性が依然として存在する。本発明はこれらの必要性をみたすものである。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の１つの実施形態は、（a）抗腫瘍剤を含む、精製された無傷の細菌由来ミニ細胞の治療有効量、および（b）インターフェロンＩ型アゴニスト、インターフェロンII型アゴニスト、またはインターフェロンＩ型アゴニストとインターフェロンII型アゴニストとの組み合わせを含む組成物に関する。インターフェロンＩ型アゴニストおよび／またはインターフェロンII型アゴニストは任意に、無傷の細菌由来ミニ細胞内に存在し得る。

【0007】

一実施形態では、組成物が（a）抗腫瘍剤を含む精製された無傷の細菌由来ミニ細胞の治療有効用量、および（b）インターフェロンＩ型アゴニストを含む精製された無傷の細菌由来ミニ細胞の治療有効用量を含む。別の実施形態では、組成物が（a）抗腫瘍剤を含む精製された無傷の細菌由来ミニ細胞の治療有効量、および（b）インターフェロンII型アゴニストを含む精製された無傷の細菌由来ミニ細胞の治療有効量を含む。なおさらなる実施形態において、組成物は、(a）抗腫瘍剤を含む、精製された無傷の細菌由来ミニ細胞の治療有効用量;(b)インターフェロンＩ型アゴニストを含む、精製された無傷の細菌由来ミニ細胞の治療有効用量；および（c）インターフェロンII型アゴニストを含む、精製された無傷の細菌由来ミニ細胞の治療有効用量を含む。

【0008】

一実施形態では抗腫瘍剤およびインターフェロンＩ型アゴニスト、インターフェロンII型アゴニスト、またはインターフェロンＩ型アゴニストおよびインターフェロンII型アゴニストの組み合わせは２つ以上の精製された無傷の細菌由来ミニ細胞内にパッケージされる。一実施形態では抗腫瘍剤およびインターフェロンＩ型アゴニスト、インターフェロンII型アゴニスト、またはインターフェロンＩ型アゴニストおよびインターフェロンII型アゴニストの組み合わせは精製された無傷の細菌由来ミニ細胞の３つの別個の集団内にパッケージ化される。

【0009】

一実施形態では組成物が抗腫瘍剤、インターフェロンＩ型アゴニスト、およびインターフェロンII型アゴニストを含み、（a）抗腫瘍剤、インターフェロンＩ型アゴニスト、およびインターフェロンII型アゴニストは同じミニ細胞内に含まれ、（b）抗腫瘍剤およびインターフェロンII型アゴニストは第２のミニ細胞内に含まれ、（c）抗腫瘍剤およびインターフェロンII型アゴニストは第２のミニ細胞内に含まれ、（d）抗腫瘍剤は第1のミニ細胞内に含まれ、または（e）抗腫瘍剤は第２のミニ細胞内に含まれる。II型インターフェロンアゴニストが第３のミニ細胞内に含まれる。

【0010】

一実施形態では、組成物はインターフェロンＩ型アゴニストを含まない。

【0011】

一実施形態では、抗腫瘍剤が放射性核種、化学療法薬、機能性核酸、および機能性核酸を転写することができるポリヌクレオチドからなる群から選択される。一実施形態では、抗腫瘍剤が超毒性化学療法薬である。一実施形態では、超毒性化学療法薬がモルホリニルアントラサイクリン、メイタンシノイド、デュカルマイシン、アウリスタチン、カリケアマイシン（ＤＮＡ損傷剤）、α－アマニチン（ＲＮＡポリメラーゼII阻害剤）、センタマイシン(ＬｉＮＫ)、ピロロベンゾジアゼピン(ＬｉＮＫ)、ストレプトニグチン、窒素マスタード、ニトロソルエア、アルカンスルホネート、ピリミジン類似体、プリン類似体、代謝拮抗剤、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、ビンカアルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン剤、およびそれらの組合せからなる群より選択される。一実施形態では、モルホリニルアントラサイクリンがネモルビシン、ＰＮＵ１５９６８２、イダルビシン、ダウノルビシン、カミノマイシン、およびオキソルビシンからなる群より選択される。一実施形態では、超毒性化学療法薬はＰＮＵ１５９６８２である。

【0012】

一実施形態では、機能性核酸がｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、lｉｎｃＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、およびリボザイムからなる群より選択される。一実施形態では、機能性核酸が腫瘍細胞増殖、血管新生、または化学療法に対する抵抗性を促進する、および／またはアポトーシスもしくは細胞周期停止を阻害する遺伝子を阻害する。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、リボヌクレオチドレダクターゼＭ１（ＲＲＭ１）発現を阻害する。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ポロ様キナーゼ１（Ｐｌｋ１）発現を阻害する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡはｍｉＲＮＡ１６ａである。

【0013】

一実施形態ではインターフェロンＩ型アゴニスト、インターフェロンII型アゴニスト、またはインターフェロンＩ型アゴニストとインターフェロンII型アゴニストの組み合わせはオリゴヌクレオチドである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドが少なくとも約４０のヌクレオチド、少なくとも約５０のヌクレオチド、または少なくとも約６０のヌクレオチドの配列を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドがＰＮＰａｓｅ１、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ポリＩＣＬＣ、イミキモド、イミダゾキオリネレスキモド、ｃＧＡＭＰまたはＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドのポリヌクレオチド産物である。

【0014】

一実施形態では、インターフェロンＩ型アゴニストが二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ)、ポリ(ｄＡ：ｄＴ）ＤＮＡ、二本鎖ＺＤＮＡおよびＢＤＮＡ、３６ｂｐおよびＤＮＡＲＮＡハイブリッドよりも長いＤＮＡ（dsＤＮＡ）、細菌セカンドメッセンジャーサイクリックジＧＭＰ、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９アゴニスト、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される。

【0015】

一実施形態では、インターフェロンII型アゴニストがＣ－グリコシド型のα－ガラクトシルセラミド（α－Ｃ－ＧａｌＣｅｒ）、α－ガラクトシルセラミド(α－ＧａｌＣｅｒ)、１２炭素アシル型ガラクトシルセラミド（β－ＧａｌＣｅｒ）、β－Ｄ－グルコピラノシルセラミド（β－ＧｌｃＣｅｒ）、１，２－ジアシル－３－ガラクトシル－ｓｎ－グリセロール（ＢｂＧＬ-ＩＩ）、糖脂質を含むジアシルグリセロール（Ｇｌｃ－ＤＡＧ－ｓ２）、ガングリオキシド(ＧＤ３)、ガングリオトリアセラミド（Ｇｇ３Ｃｅｒ）、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）、α－グルクロノシルセラミド（ＧＳＬ－１またはＧＳＬ－４）、イソグロボトリヘキソシルセラミド（ｉＧｂ３）、リポホスホグリカン（ＬＰＧ）、ホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、α－ラクトシルセラミド類似体（ＯＣＨ）、スレイトールセラミドおよびそれらの組合わせからなる群より選択される。一実施形態では、インターフェロンII型アゴニストがα－ガラクトシルセラミド（α－ＧａｌＣｅｒ）である。

【0016】

一実施形態では、組成物が抗新生物剤を含むミニ細胞に結合した二重特異性リガンドをさらに含む。一実施形態では、組成物がI型インターフェロンアゴニストを含むミニ細胞に結合した二重特異性リガンドをさらに含む。一実施形態では、組成物がII型インターフェロンアゴニストを含むミニ細胞に結合した二重特異性リガンドをさらに含む。

【0017】

一実施形態では、二重特異性リガンドがミニ細胞表面構造に対する特異性を有する第１のアームと、非食作用性(non-phagocytotic)哺乳動物細胞表面受容体に対する特異性を有する第２のアームとを含む。一実施形態では、ミニ細胞表面構造がミニ細胞表面上のリポ多糖のＯ多糖成分である。１つの実施形態において、非貪食哺乳動物細胞表面受容体は、ミニ細胞の受容体媒介エンドサイトーシスを活性化することができる。

【0018】

一実施形態では、二重特異性リガンドが二重特異性抗体または抗体断片を含む。一実施形態では抗体または抗体断片が細菌由来のミニ細胞表面構造に対する特異性を有する第１の多価アームと、がん細胞表面受容体に対する特異性を有する第２の多価アームとを含み、がん細胞表面受容体はミニ細胞の受容体媒介エンドサイトーシスを活性化することができる。

【0019】

一実施形態において、該組成物は、１０⁷ミニ細胞当たり約１未満の汚染親細菌細胞、１０⁸ミニ細胞当たり約１未満の汚染親細菌細胞、１０⁹ミニ細胞当たり約１未満の汚染親細菌細胞、１０¹⁰ミニ細胞当たり約１未満の汚染親細菌細胞、または１０¹¹ミニ細胞当たり約１未満の汚染親細菌細胞を含む。

【0020】

一実施形態では、組成物が薬学的に許容される担体をさらに含む。一実施形態では、ミニ細胞が直径が約４００nmである。一実施形態では、組成物が２００nm濾過によって除去可能な親細菌細胞汚染を含まない。

【0021】

一実施形態において、該組成物は、以下の量のミニ細胞または死滅した細菌細胞を含む：（a）少なくとも約１０⁹；（b）少なくとも約１×１０⁹；（c）少なくとも約２×１０⁹；（d）少なくとも約５×１０⁹；（e）少なくとも８×１０⁹；（f）約１０¹¹以下;(g)約１×１０¹¹以下;(h)約９×１０¹⁰以下；または（i）約８×１０¹⁰以下。
本発明の一実施形態は必要とする被験体を治療する方法に関し、この方法は、有効量の本明細書に開示される組成物を被験体に投与することを含む。一実施形態では、対象がヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ウサギ、マウス、またはラットである。
一実施形態では、対象はヒトである。
一実施形態では、対象はがんに罹患している。１つの実施形態において、がんは、肺がん、乳がん、脳がん、肝臓がん、結腸がん、肛門がん、膵臓がん、および膀胱がんからなる群より選択される。一実施態様では、がんは急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質がん、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、基底細胞がん、膀胱がん、脳幹グリオーマ、脳腫瘍、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、原発部位不明がん、カルチノイド腫瘍、主要サイト不明がん、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、子宮頸
がん、小児がん、脊索腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、大腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞腫瘍、子宮体がん、上衣芽細胞腫、上衣芽腫、上衣腫、食道がん、感覚神経肉腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外生殖細胞腫瘍、肝外胆管がん、胆がん、胃（胃）がん、胃腸カルチノイド腫瘍、消化管間質細胞腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛腫瘍 、神経膠腫、有毛細胞白血病、 心臓腫瘍、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、小島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓ガン、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭ガン、唇ガン、肝臓がん、悪性繊維性組織サイト骨ガン、脂肪肉腫、髄芽腫、黒色腫、メルケル細胞がん、メルケル細胞がん、中皮腫、原発不明の転移性扁平上皮首がん、口腔がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚がん、非小細胞肺がん、口腔がん、口腔癌、中咽頭がん、骨肉腫、その他の脳および脊髄腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵がん、乳頭腫症、副鼻腔がん、副甲状腺がん、骨盤がん、ペニスのがん、咽頭がん、中間的な分化を示す松果体実質細胞腫瘍、松果体芽腫、下垂体腫瘍、形質細胞新生物/多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、 原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、原発性肝細胞腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性肝細胞がん、前立腺がん、腎細胞がん、腎細胞がん、腎細胞がん、網膜芽細胞腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、セザリー症候群、唾液腺がん、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮がん、頸部がん、胃（胃）がん、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、咽頭がん、胸腺がん、胸腺腫、甲状腺がん、移行上皮がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、絨毛腫瘍、
尿管がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍からなる群より選択される。
一実施形態において、脳がんまたは脳腫瘍は、脳幹グリオーマ、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮腫、中間的分化の松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫からなる群より選択される。
一実施形態では、組成物が数週間にわたって少なくとも1週間に1回投与される。一実施形態において、組成物は、数週間～数ヶ月にわたって週に少なくとも1回投与される。
一実施形態では、組成物が週に少なくとも１回、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９または約２０週間以上投与される。一実施形態では、組成物が毎週約２回投与される。1つの実施形態において、組成物は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９または約２０週間以上、週2回投与される。
上記の概要および図面の以下の説明ならびに詳細な説明は、例示的かつ説明的なものである。それらは本発明のさらなる詳細を提供することを意図しているが、限定として解釈されるべきではない。他の目的、利点、および新規な特徴は、本発明の以下の詳細な説明から当業者には容易に明らかになるのであろう。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】Ｏ－多糖類およびヒト上皮増殖因子受容体抗原に対する二重特異性抗体を含み、抗がん剤ＰＮＵ１５９６８２（アントラサイクリン類似体）を負荷されたＥｎＧｅｎｅＩＣドリームビヒクル(ＥＤＶ)(例えば、細菌ミニ細胞）のグラフ描写である。

【図2】表面上にＯ－多糖を含み、免疫調節性６０mer二本鎖ＤＮＡを負荷されたＥｎＧｅｎｅＩＣドリームビヒクル（ＥＤＶ）のグラフ描写である。

【図3】表面にＯ－多糖類を含み、免疫調節性α－ガラクトシルセラミド（αＧＣ）を負荷したＥｎＧｅｎｅＩＣドリームビヒクル（ＥＤＶ）のグラフ描写である。

【図4】中皮腫患者を治療するために、ＥＧＦＲ標的およびｍｉＲＮＡ１６a負荷ＥＤＶを評価した臨床試験のグラフ概要図である。

【図5】Ａ５４９肺がん細胞株に対する示された化学療法薬の細胞毒性効果を示す図である。図４Ａは、示された化学療法薬物の効果を、超毒性薬物ＰＮＵ１５９６８２と比較する。図４Ｂは、ドキソルビシンおよびＰＮＵ１５９６８２の効果を比較する。

【図6】副腎皮質がん細胞株ＡＣＣ０１（図６Ａ）およびＡＣＣ０７（図６Ｂ）に対する示された化学療法薬の効果を示す図である。

【図7】ＭＤＡＭＢ４６８乳がん細胞株に対する示された化学療法薬の効果を示す図である。

【図8】ヒト結腸直腸がん細胞株Ｃａｃｏ２（図８Ａ）およびＨＣＴ１１６（図８Ｂ）に対する示された化学療法薬の効果を示す図である。

【図9】神経膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧに対する、示された化学療法薬の効果を示す図である。

【図10】ヒト膵臓細胞株ＭｉａＰａｃａ２（図１０Ａ）およびゲミシタビン耐性ＭｉａＰａｃａ２ ＧｅｍＲ細胞（図１０Ｂ）に対する示された化学療法薬の効果を示す図である。

【図11】ＥＧＦＲを標的とし、ＰＮＵ-１５９６８２（^EGFRＥＤＶ₆₈₂ ^TM）またはアドリアマイシン（^EGFRＥＤＶ_Dox ^TM）を用いてロードされたＥＤＶが、マウスにおけるＡ５４９異種移植片腫瘍の成長に及ぼす影響を示す図である。陰性対照は生理食塩水のみ、またはＰＮＵ－１５９６８２（ＥＤＶ₆₈₂ ^TM）を装填した非標的ＥＤＶである。矢印は、マウスが示された生理食塩水またはＥＤＶ組成物で処置された場合を示す。アスタリスクは、最初に生理食塩水で処理されたマウスが^EGFRＥＤＶ₆₈₂ ^TM構成をいつ管理されたかを示す。

【図12】示されたＮＳＣＬＣ細胞株におけるＧＡＰＤＨ発現と比較した、ＧＡＰＤＨ(グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ)（Ｇ)、ＫＳＰ(キネシンスピンドルタンパク質）、Ｐｌｋ１（ポロ様キナーゼ１）(Ｐ)、およびＲＲＭ１（リボヌクレオチドレダクターゼ酵素１)(Ｒ)の発現を示す図である。

【図13】中皮腫細胞株（ＭＳＴＯ、図１３Ａ）または副腎皮質がん細胞株（Ｈ２９５Ｒ、図１３Ｂ）にＥＧＦＲ標的化ｓｉＲＲＭ１パッケージ化ＥＤＶを送達する効果を示す図である。

【図14】Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおける中皮腫異種移植片腫瘍増殖に対する、ＥＧＦＲ標的化ｍｉＲＮＡ１６ａ（^EGFRＥＤＶ_miRNA16a ^TM）またはＥＧＦＲ標的化ｓｉＲＲＭ１パッケージ化ＥＤＶ（^EGFRＥＤＶ_siRRM1 ^TM）の送達の影響を示す図である。陰性対照は、スクランブルｓｉＲＮＡを負荷した生理食塩水またはＥＧＦＲ標的ＥＤＶであった。

【図15】ＥＧＦＲ標的化ｍｉＲＮＡ１６ａ（^EGFRＥＤＶ_miRNA16a ^TM）またはＥＧＦＲ標的化ｓｉＲＲＭ１パッケージ化ＥＤＶ（^EGFRＥＤＶ_siRRM1 ^TM）で処置した中皮腫異種移植片Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスから単離した腫瘍を、スクランブルｓｉＲＮＡを負荷した生理食塩水処置ＥＤＶまたはＥＧＦＲ標的化ＥＤＶと比較して示す図である。

【図16】ポロ様キナーゼ１（^EGFRＥＤＶ^TM _siPLK ^TM）およびリボヌクレオチドレダクターゼ酵素１(^EGFRＥＤＶ_siRRM1 ^TM）を標的とするｓｉＲＮＡを負荷したＥＧＦＲ標的ＥＤＶによって、アドレノ皮質がん細胞（ＡＣＣ０１）において誘導されたアポトーシスを示す図であり、細胞残屑の数（図１６Ａ）およびプロピジウムヨウ化物（ＰＩ）陽性細胞に対するアネキシン５の比率（図１６Ｂ）を測定することに基づく。無関係なｓｉＲＮＡ(^EGFRＥＤＶ^TM _siluciferase ^TM）を負荷したＥＤＶで処理したＡＣＣ０１細胞における未処理ＡＣＣ０１細胞におけるアポトーシス、および無負荷ＥＤＶ（^EGFRＥＤＶ^TM）を陰性対照として含む。

【図17】細胞破片の数およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陽性細胞に対するアネキシン５の比率を測定することに基づいて、ポロ様キナーゼ１（^EGFRＥＤＶ^TM _siPLK ^TM）（図１７Ｄ）およびリボヌクレオチドレダクターゼ酵素１(^EGFRＥＤＶ_siRRM1 ^TM）を標的とするｓｉＲＮＡを負荷したＥＧＦＲ標的ＥＤＶによってアドレノ皮質がん細胞（ＡＣＣ０１）において誘導されるサブＧ１停止（図１７Ｄ）を示す図である。未処理のＡＣＣ０１セル（図１７Ａ）のアポトーシス、無関係なｓｉＲＮＡ(^EGFRＥＤＶ^TM _siluciferase ^TM）でロードされたＥＤＶで処理されたＡＣＣ０１セル（図１７Ｃ）、およびアンロードされたＥＤＶ（^EGFRＥＤＶ^TM）（図１７Ｂ）は、ネガティブコントロールとして含まれる。

【図18】（i）黒三角＝^EGFRＥＤＶ_PNU-159682 ^TM + ＥＤＶ40mer^TM、（ii）黒丸＝^EGFRＥＤＶ_PNU-159682 ^TM、（iii）白四角＝^EGFRＥＤＶ_PNU-159682 ^TM＋ＥＤＶ、（iv）白三角＝^EGFRＥＤＶ_PNU-159682 ^TM + ＥＤＶ_50mer ^TM、および（v）黒四角＝生理食塩水で処置したＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおけるＡ５４９（肺がん）異種移植片腫瘍増殖の影響を示す図である。上向き矢印で示すように、異種移植片移植後２４、２７、２９、３１、３４、３６、および３８日目に、マウスをこれらのＥＤＶの組み合わせで処置した。３６日目と３８日目に、約６５０mm3の腫瘍容積を有する生理食塩水群マウスを、下矢印で示すように^EGFRＥＤＶ_PNU-159682 ^TM + ＥＤＶ_50mer ^TMで処理した。

【図19】４０merを含むＥＤＶ（ＰＮＵ１５９６８２（^EGFRＥＤＶ_PNU ^TM）を含むＥＤＶと組合せた^EGFRＥＤＶ_40mers ^TM )）で処置したＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおけるＡ５４９（肺がん）異種移植片腫瘍増殖に対する影響を示す図である。三角は治療日数を示す。

【図20】生理食塩水（陰性対照）、ＩＦＮ－γ（１回当たり０．５×１０４ＩＵ）、ドキソルビシン（^EGFRＥＤＶ_Dox ^TM）を負荷したＥＧＦＲ標的ＥＤＶ、および^EGFRＥＤＶ_Dox ^TM + ＩＦＮ－γで処理したＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおけるＡ５４９（肺がん）異種移植片腫瘍増殖に対する影響を示す図である。三角は治療日数を示す。

【図21】食塩水（陰性対照）、ＩＦＮ－γ（１用量当たり０．５×１０４ＩＵ）、ドキソルビシン（^EGFRＥＤＶ_Dox ^TM）を負荷したＥＧＦＲ標的ＥＤＶ、および^EGFRＥＤＶ_Dox ^TM + ＩＦＮ－γで処理したＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおけるＭＤＡ－ＭＢ４６８（乳がん）異種移植片腫瘍増殖に対する影響を示す。三角は治療日数を示す。

【図22】生理食塩水（陰性対照）、ＩＦＮ－γ（１用量当たり０．５×１０４ＩＵ）、ドキソルビシン（^EGFRＥＤＶ_Dox ^TM）を負荷したＥＧＦＲ標的ＥＤＶ、および^EGFRＥＤＶ_Dox ^TM +ＩＦＮ－γで処理したＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおけるＭＤＡ－ＭＢ４６８（乳がん）異種移植片腫瘍増殖に対する作用を示す別の試験を示す。三角は治療日数を示す。

【図23】生理食塩水（陰性対照、グループ１）、ドキソルビシンを負荷したＥＧＦＲ標的ＥＤＶ（^EGFRＥＤＶ_Dox ^TM 、グループ２）、^EGFRＥＤＶ_Dox ^TMＩＦＮγ(１用量当たり０．７５×１０4 ＩＵ）（グループ３）、および^EGFRＥＤＶ_Dox ^TM + ＩＦＮγ(１用量当たり０．５×１０4ＩＵ）（グループ４）で処置したＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおけるドキソルビシン耐性Ａ５４９異種移植片腫瘍増殖に対する影響を示す。グループ１～３のマウスには、黒三角で示すように、週に２回処置を行った。グループ４のマウスを、白三角で示すように、週に３回処置した。

【図24-1】パクリタキセルを負荷した種々の用量の^EGFRＥＤＶ^TMを投与した、ヒト初回投与試験からの患者のサイトカインプロファイルを示す図である。（図２４Ａ)＝５用量の各々について測定されたＩＬ６のpg／mL；（図２４Ｃ)＝５用量の各々について測定されたＩＬ１０のpg／mL；（図２４Ｄ)＝５用量の各々について測定されたＴＮＦαのpg／mL；（図２４Ｆ)＝５用量の各々について測定されたＩＦＮγのpg／mL；（図２４Ｇ)＝５用量の各々について測定されたＩＬ－1βのpg／mL；（図２４Ｈ)＝５用量の各々について測定されたＩＬ２のpg／mL；（図２４Ｉ)＝５用量の各々について測定されたＩＬ４のpg／mL；（図２４Ｊ)＝５用量のそれぞれについて測定したＩＬ１２のpg/mL。最後に、（図２４Ｋ）は、試験した５つの用量を示す。

【図24-2】パクリタキセルを負荷した種々の用量の^EGFRＥＤＶ^TMを投与した、ヒト初回投与試験からの患者のサイトカインプロファイルを示す図である。（図２４Ａ)＝５用量の各々について測定されたＩＬ６のpg／mL；（図２４Ｃ)＝５用量の各々について測定されたＩＬ１０のpg／mL；（図２４Ｄ)＝５用量の各々について測定されたＴＮＦαのpg／mL；（図２４Ｆ)＝５用量の各々について測定されたＩＦＮγのpg／mL；（図２４Ｇ)＝５用量の各々について測定されたＩＬ－1βのpg／mL；（図２４Ｈ)＝５用量の各々について測定されたＩＬ２のpg／mL；（図２４Ｉ)＝５用量の各々について測定されたＩＬ４のpg／mL；（図２４Ｊ)＝５用量のそれぞれについて測定したＩＬ１２のpg/mL。最後に、（図２４Ｋ）は、試験した５つの用量を示す。

【図24-3】パクリタキセルを負荷した種々の用量の^EGFRＥＤＶ^TMを投与した、ヒト初回投与試験からの患者のサイトカインプロファイルを示す図である。（図２４Ａ)＝５用量の各々について測定されたＩＬ６のpg／mL；（図２４Ｃ)＝５用量の各々について測定されたＩＬ１０のpg／mL；（図２４Ｄ)＝５用量の各々について測定されたＴＮＦαのpg／mL；（図２４Ｆ)＝５用量の各々について測定されたＩＦＮγのpg／mL；（図２４Ｇ)＝５用量の各々について測定されたＩＬ－1βのpg／mL；（図２４Ｈ)＝５用量の各々について測定されたＩＬ２のpg／mL；（図２４Ｉ)＝５用量の各々について測定されたＩＬ４のpg／mL；（図２４Ｊ)＝５用量のそれぞれについて測定したＩＬ１２のpg/mL。最後に、（図２４Ｋ）は、試験した５つの用量を示す。

【図24-4】パクリタキセルを負荷した種々の用量の^EGFRＥＤＶ^TMを投与した、ヒト初回投与試験からの患者のサイトカインプロファイルを示す図である。（図２４Ａ)＝５用量の各々について測定されたＩＬ６のpg／mL；（図２４Ｃ)＝５用量の各々について測定されたＩＬ１０のpg／mL；（図２４Ｄ)＝５用量の各々について測定されたＴＮＦαのpg／mL；（図２４Ｆ)＝５用量の各々について測定されたＩＦＮγのpg／mL；（図２４Ｇ)＝５用量の各々について測定されたＩＬ－1βのpg／mL；（図２４Ｈ)＝５用量の各々について測定されたＩＬ２のpg／mL；（図２４Ｉ)＝５用量の各々について測定されたＩＬ４のpg／mL；（図２４Ｊ)＝５用量のそれぞれについて測定したＩＬ１２のpg/mL。最後に、（図２４Ｋ）は、試験した５つの用量を示す。

【図25-1】ドキソルビシンを負荷した種々の用量のEGFRＥＤＶTMを投与した、ヒト初回投与試験からの患者のサイトカインプロファイルを示す図である。（図２５Ａ)＝８用量の各々について測定されたＩＬ６のpg／mL；（図２５Ｃ）＝８用量の各々について測定されたＩＬ１０のpg／mL；（図２５Ｄ)＝８用量の各々について測定されたＴＮＦαのpg／mL；（図２５Ｆ)＝８用量の各々について測定されたＩＦＮγのpg／mL；（図２５Ｇ)＝８用量の各々について測定されたＩＬ－1βのpg／mL；（図２５Ｈ)＝８用量の各々について測定されたＩＬ２のpg／mL；（図２５Ｉ)＝８用量の各々について測定されたＩＬ４のpg／mL。（図２５Ｊ)＝８用量の各々について測定されたＩＬ１２のpg/mL。最後に、（図２５Ｋ）は試験した追加の３つの用量を示し、最初の５つの用量は、（図２４Ｋ）に示したものと同じである。

【図25-2】ドキソルビシンを負荷した種々の用量のEGFRＥＤＶTMを投与した、ヒト初回投与試験からの患者のサイトカインプロファイルを示す図である。（図２５Ａ)＝８用量の各々について測定されたＩＬ６のpg／mL；（図２５Ｃ）＝８用量の各々について測定されたＩＬ１０のpg／mL；（図２５Ｄ)＝８用量の各々について測定されたＴＮＦαのpg／mL；（図２５Ｆ)＝８用量の各々について測定されたＩＦＮγのpg／mL；（図２５Ｇ)＝８用量の各々について測定されたＩＬ－1βのpg／mL；（図２５Ｈ)＝８用量の各々について測定されたＩＬ２のpg／mL；（図２５Ｉ)＝８用量の各々について測定されたＩＬ４のpg／mL。（図２５Ｊ)＝８用量の各々について測定されたＩＬ１２のpg/mL。最後に、（図２５Ｋ）は試験した追加の３つの用量を示し、最初の５つの用量は、（図２４Ｋ）に示したものと同じである。

【図25-3】ドキソルビシンを負荷した種々の用量のEGFRＥＤＶTMを投与した、ヒト初回投与試験からの患者のサイトカインプロファイルを示す図である。（図２５Ａ)＝８用量の各々について測定されたＩＬ６のpg／mL；（図２５Ｃ）＝８用量の各々について測定されたＩＬ１０のpg／mL；（図２５Ｄ)＝８用量の各々について測定されたＴＮＦαのpg／mL；（図２５Ｆ)＝８用量の各々について測定されたＩＦＮγのpg／mL；（図２５Ｇ)＝８用量の各々について測定されたＩＬ－1βのpg／mL；（図２５Ｈ)＝８用量の各々について測定されたＩＬ２のpg／mL；（図２５Ｉ)＝８用量の各々について測定されたＩＬ４のpg／mL。（図２５Ｊ)＝８用量の各々について測定されたＩＬ１２のpg/mL。最後に、（図２５Ｋ）は試験した追加の３つの用量を示し、最初の５つの用量は、（図２４Ｋ）に示したものと同じである。

【図25-4】ドキソルビシンを負荷した種々の用量のEGFRＥＤＶTMを投与した、ヒト初回投与試験からの患者のサイトカインプロファイルを示す図である。（図２５Ａ)＝８用量の各々について測定されたＩＬ６のpg／mL；（図２５Ｃ）＝８用量の各々について測定されたＩＬ１０のpg／mL；（図２５Ｄ)＝８用量の各々について測定されたＴＮＦαのpg／mL；（図２５Ｆ)＝８用量の各々について測定されたＩＦＮγのpg／mL；（図２５Ｇ)＝８用量の各々について測定されたＩＬ－1βのpg／mL；（図２５Ｈ)＝８用量の各々について測定されたＩＬ２のpg／mL；（図２５Ｉ)＝８用量の各々について測定されたＩＬ４のpg／mL。（図２５Ｊ)＝８用量の各々について測定されたＩＬ１２のpg/mL。最後に、（図２５Ｋ）は試験した追加の３つの用量を示し、最初の５つの用量は、（図２４Ｋ）に示したものと同じである。

【図26】ＤＮＡチャレンジを伴う細胞質ゾルＤＮＡセンサーのシグナル伝達経路を示す図である。これまで、細胞内二本鎖ＤＮＡを検出するために、多くのサイトゾルＤＮＡセンサーが定義されてきた。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩはＡＴに富むＤＮＡをＲＮＡセンサーＲＩＧ－Ｉによって認識されるＲＮＡに転写し、続いてＳＴＩＮＧとＩＲＦ３の活性化が起こる。ＤＮＡセンサーＤＡＩ、ＩＦＩ１６、ＤＤＸ４１およびＬＳｍ１４Ａは、dsＤＮＡを直接感知して、I型ＩＦＮ産生のためにＳＴＩＮＧを活性化する。dsＤＮＡの存在下では、ｃＧＡＳはＳＴＩＮＧの強力な活性化因子であるｃＧＡＭＰの合成を触媒する。dsＤＮＡと共に、ＬＲＲＦＩＰ１はＳＴＩＮＧ依存的にβ－カテニンとＩＲＦ３活性化を開始する。他のＤＮＡセンサーはＳＴＩＮＧとは無関係に免疫応答をプライミングする。ｄｓＤＮＡの認識後、Ｓｏｘ２は好中球におけるＴａｂ２／ＴＡＫ１複合体の活性化を誘発する。ｄｓＤＮＡによって検出されると、ＤＨＸ９／３６はＭｙＤ８８を介してＮＦκＢおよびＩＲＦ７を活性化する。ＤＮＡセンサーＫｕ７０はＩＲＦ１およびＩＲＦ７の活性化を誘発する。ＡＩＭ２はＤＮＡ結合を伴うＡＳＣを介してインフラマソームの活性化を開始する。

【図27-1】ＥＤＶ処置に応答したＲＡＷ２６４．７細胞および骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）活性化を示す図である。（図２７Ａ）１μg／mlのＬＰＳ、Ｅｐ－ＥＤＶ、Ｅｐ－ＥＤＶ６８２、または６８２と共に直接インキュベートされたＲＡＷ細胞におけるＣＤ８６発現。（図２７Ｂ）ＥｐＥＤＶ、ＥｐＥＤＶ６８２または６８２で処理した４Ｔ１またはＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞と共培養したＲＡＷ細胞におけるＣＤ８６発現。Ｅｐ－ＥＤＶ６８２治療がん細胞と共同培養したＲＡＷ細胞は、ＣＤ８６表現の著しい増加をもたらした。（図２７Ｃ）ＥＤＶ処理腫瘍細胞と共にインキュベートした原料細胞によるＴＮＦα産生の有意な増加を示す原料細胞／腫瘍細胞共培養物におけるＴＮＦα産生。(図２７Ｄ）原料細胞／腫瘍細胞共培養におけるＩＬ－６産生は、ＥＤＶ処理腫瘍細胞と共にインキュベートされた原料細胞によるＩＬ－６産生の有意な増加を示す。（図２７Ｅ）ＢＭＤＣ／４Ｔ１共培養物におけるＩＦＮαおよびＩＦＮβ出現の定量。（図２７Ｆ）ＢＭＤＣ／ＣＴ２６Ｅｐ１２．１共培養物におけるＩＦＮαおよびＩＦＮβ出現のＰＣＲ定量。（図２７Ｇ）ＢＭＤＣ／腫瘍細胞共培養物におけるＣＤ８６^HiおよびＭＨＣクラスII^Hi発現および（図２７Ｈ)ＣＤ８０^Hi発現の定量。（図２７Ｉ）ＥＤＶおよび薬物処理ＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞とのＢＭＤＣ共培養におけるＭＨＣクラスＩＩ対ＣＤ８６発現の流量サイトメトリー密度プロット。（図２７Ｊ）ＢＭＤＣ／腫瘍細胞共培養物の上清からのＴＮＦα(図２７ Ｋ）ＩＬ１２ｐ４０および（図２７Ｌ）ＩＬ６のＥＬＩＳＡ分析。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表し、一元配置分散分析およびＴｕｋｅｙの多重比較検定により分析した。

【図27-2】ＥＤＶ処置に応答したＲＡＷ２６４．７細胞および骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）活性化を示す図である。（図２７Ａ）１μg／mlのＬＰＳ、Ｅｐ－ＥＤＶ、Ｅｐ－ＥＤＶ６８２、または６８２と共に直接インキュベートされたＲＡＷ細胞におけるＣＤ８６発現。（図２７Ｂ）ＥｐＥＤＶ、ＥｐＥＤＶ６８２または６８２で処理した４Ｔ１またはＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞と共培養したＲＡＷ細胞におけるＣＤ８６発現。Ｅｐ－ＥＤＶ６８２治療がん細胞と共同培養したＲＡＷ細胞は、ＣＤ８６表現の著しい増加をもたらした。（図２７Ｃ）ＥＤＶ処理腫瘍細胞と共にインキュベートした原料細胞によるＴＮＦα産生の有意な増加を示す原料細胞／腫瘍細胞共培養物におけるＴＮＦα産生。(図２７Ｄ）原料細胞／腫瘍細胞共培養におけるＩＬ－６産生は、ＥＤＶ処理腫瘍細胞と共にインキュベートされた原料細胞によるＩＬ－６産生の有意な増加を示す。（図２７Ｅ）ＢＭＤＣ／４Ｔ１共培養物におけるＩＦＮαおよびＩＦＮβ出現の定量。（図２７Ｆ）ＢＭＤＣ／ＣＴ２６Ｅｐ１２．１共培養物におけるＩＦＮαおよびＩＦＮβ出現のＰＣＲ定量。（図２７Ｇ）ＢＭＤＣ／腫瘍細胞共培養物におけるＣＤ８６^HiおよびＭＨＣクラスII^Hi発現および（図２７Ｈ)ＣＤ８０^Hi発現の定量。（図２７Ｉ）ＥＤＶおよび薬物処理ＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞とのＢＭＤＣ共培養におけるＭＨＣクラスＩＩ対ＣＤ８６発現の流量サイトメトリー密度プロット。（図２７Ｊ）ＢＭＤＣ／腫瘍細胞共培養物の上清からのＴＮＦα(図２７ Ｋ）ＩＬ１２ｐ４０および（図２７Ｌ）ＩＬ６のＥＬＩＳＡ分析。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表し、一元配置分散分析およびＴｕｋｅｙの多重比較検定により分析した。

【図27-3】ＥＤＶ処置に応答したＲＡＷ２６４．７細胞および骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）活性化を示す図である。（図２７Ａ）１μg／mlのＬＰＳ、Ｅｐ－ＥＤＶ、Ｅｐ－ＥＤＶ６８２、または６８２と共に直接インキュベートされたＲＡＷ細胞におけるＣＤ８６発現。（図２７Ｂ）ＥｐＥＤＶ、ＥｐＥＤＶ６８２または６８２で処理した４Ｔ１またはＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞と共培養したＲＡＷ細胞におけるＣＤ８６発現。Ｅｐ－ＥＤＶ６８２治療がん細胞と共同培養したＲＡＷ細胞は、ＣＤ８６表現の著しい増加をもたらした。（図２７Ｃ）ＥＤＶ処理腫瘍細胞と共にインキュベートした原料細胞によるＴＮＦα産生の有意な増加を示す原料細胞／腫瘍細胞共培養物におけるＴＮＦα産生。(図２７Ｄ）原料細胞／腫瘍細胞共培養におけるＩＬ－６産生は、ＥＤＶ処理腫瘍細胞と共にインキュベートされた原料細胞によるＩＬ－６産生の有意な増加を示す。（図２７Ｅ）ＢＭＤＣ／４Ｔ１共培養物におけるＩＦＮαおよびＩＦＮβ出現の定量。（図２７Ｆ）ＢＭＤＣ／ＣＴ２６Ｅｐ１２．１共培養物におけるＩＦＮαおよびＩＦＮβ出現のＰＣＲ定量。（図２７Ｇ）ＢＭＤＣ／腫瘍細胞共培養物におけるＣＤ８６^HiおよびＭＨＣクラスII^Hi発現および（図２７Ｈ)ＣＤ８０^Hi発現の定量。（図２７Ｉ）ＥＤＶおよび薬物処理ＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞とのＢＭＤＣ共培養におけるＭＨＣクラスＩＩ対ＣＤ８６発現の流量サイトメトリー密度プロット。（図２７Ｊ）ＢＭＤＣ／腫瘍細胞共培養物の上清からのＴＮＦα(図２７ Ｋ）ＩＬ１２ｐ４０および（図２７Ｌ）ＩＬ６のＥＬＩＳＡ分析。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表し、一元配置分散分析およびＴｕｋｅｙの多重比較検定により分析した。

【図27-4】ＥＤＶ処置に応答したＲＡＷ２６４．７細胞および骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）活性化を示す図である。（図２７Ａ）１μg／mlのＬＰＳ、Ｅｐ－ＥＤＶ、Ｅｐ－ＥＤＶ６８２、または６８２と共に直接インキュベートされたＲＡＷ細胞におけるＣＤ８６発現。（図２７Ｂ）ＥｐＥＤＶ、ＥｐＥＤＶ６８２または６８２で処理した４Ｔ１またはＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞と共培養したＲＡＷ細胞におけるＣＤ８６発現。Ｅｐ－ＥＤＶ６８２治療がん細胞と共同培養したＲＡＷ細胞は、ＣＤ８６表現の著しい増加をもたらした。（図２７Ｃ）ＥＤＶ処理腫瘍細胞と共にインキュベートした原料細胞によるＴＮＦα産生の有意な増加を示す原料細胞／腫瘍細胞共培養物におけるＴＮＦα産生。(図２７Ｄ）原料細胞／腫瘍細胞共培養におけるＩＬ－６産生は、ＥＤＶ処理腫瘍細胞と共にインキュベートされた原料細胞によるＩＬ－６産生の有意な増加を示す。（図２７Ｅ）ＢＭＤＣ／４Ｔ１共培養物におけるＩＦＮαおよびＩＦＮβ出現の定量。（図２７Ｆ）ＢＭＤＣ／ＣＴ２６Ｅｐ１２．１共培養物におけるＩＦＮαおよびＩＦＮβ出現のＰＣＲ定量。（図２７Ｇ）ＢＭＤＣ／腫瘍細胞共培養物におけるＣＤ８６^HiおよびＭＨＣクラスII^Hi発現および（図２７Ｈ)ＣＤ８０^Hi発現の定量。（図２７Ｉ）ＥＤＶおよび薬物処理ＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞とのＢＭＤＣ共培養におけるＭＨＣクラスＩＩ対ＣＤ８６発現の流量サイトメトリー密度プロット。（図２７Ｊ）ＢＭＤＣ／腫瘍細胞共培養物の上清からのＴＮＦα(図２７ Ｋ）ＩＬ１２ｐ４０および（図２７Ｌ）ＩＬ６のＥＬＩＳＡ分析。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表し、一元配置分散分析およびＴｕｋｅｙの多重比較検定により分析した。

【図27-5】ＥＤＶ処置に応答したＲＡＷ２６４．７細胞および骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）活性化を示す図である。（図２７Ａ）１μg／mlのＬＰＳ、Ｅｐ－ＥＤＶ、Ｅｐ－ＥＤＶ６８２、または６８２と共に直接インキュベートされたＲＡＷ細胞におけるＣＤ８６発現。（図２７Ｂ）ＥｐＥＤＶ、ＥｐＥＤＶ６８２または６８２で処理した４Ｔ１またはＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞と共培養したＲＡＷ細胞におけるＣＤ８６発現。Ｅｐ－ＥＤＶ６８２治療がん細胞と共同培養したＲＡＷ細胞は、ＣＤ８６表現の著しい増加をもたらした。（図２７Ｃ）ＥＤＶ処理腫瘍細胞と共にインキュベートした原料細胞によるＴＮＦα産生の有意な増加を示す原料細胞／腫瘍細胞共培養物におけるＴＮＦα産生。(図２７Ｄ）原料細胞／腫瘍細胞共培養におけるＩＬ－６産生は、ＥＤＶ処理腫瘍細胞と共にインキュベートされた原料細胞によるＩＬ－６産生の有意な増加を示す。（図２７Ｅ）ＢＭＤＣ／４Ｔ１共培養物におけるＩＦＮαおよびＩＦＮβ出現の定量。（図２７Ｆ）ＢＭＤＣ／ＣＴ２６Ｅｐ１２．１共培養物におけるＩＦＮαおよびＩＦＮβ出現のＰＣＲ定量。（図２７Ｇ）ＢＭＤＣ／腫瘍細胞共培養物におけるＣＤ８６^HiおよびＭＨＣクラスII^Hi発現および（図２７Ｈ)ＣＤ８０^Hi発現の定量。（図２７Ｉ）ＥＤＶおよび薬物処理ＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞とのＢＭＤＣ共培養におけるＭＨＣクラスＩＩ対ＣＤ８６発現の流量サイトメトリー密度プロット。（図２７Ｊ）ＢＭＤＣ／腫瘍細胞共培養物の上清からのＴＮＦα(図２７ Ｋ）ＩＬ１２ｐ４０および（図２７Ｌ）ＩＬ６のＥＬＩＳＡ分析。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表し、一元配置分散分析およびＴｕｋｅｙの多重比較検定により分析した。

【図28-1】ＥＤＶ処理に応答した腫瘍応答およびマクロファージ活性化を示す図である。（図２８Ａ）４Ｔ１または（図２８Ｂ)ＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＥｐＥＤＶおよびＥｐＥＤＶ６８２処置に応答した腫瘍増殖。（図２８Ｃ）ＢＡＬＢ／ＣヌードマウスＴ８４異種移植片におけるＥＤＶ－６８２およびＥＤＶ－ＥＧＦＲ６８２、ならびに（図２８Ｄ）Ａ５４９／ＭＤＲ異種移植片を有するＢＡＬＢ／ＣヌードマウスにおけるＥＤＶ－６８２、ＥＤＶ－ＥＧＦＲＤoxおよびＥＤＶ－ＥＧＦＲ６８２に応答する腫瘍増殖。緑色の矢印は、正式に生理食塩水で処置したマウスのＥＤＶＥＧＦＲ６８２処置を開始した場所を示す。データー（図２８Ａ～Ｄ）は平均±s．e．m．を表し、そして４Ｔ１腫瘍から単離され、５：１（Ｅ：Ｔ）の比率で４Ｔ１細胞と共培養されたＣＤ１１ｂ+の二元配置ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較試験（図２８E）ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡによって分析される。プロットは、細胞接着および増殖／死対時間に相関する正規化細胞指数を表す。４Ｔ１腫瘍由来のＣＤ１１ｂ+ 細胞は細胞指数の増大によって示されるように、最初の接着および沈降相を経験し、続いて、細胞指数の増大または減少によって表される増殖または死滅を経験する。（図２８Ｆ）処置マウスの４Ｔ１腫瘍におけるＭ１（ＣＤ８６+）：Ｍ２（ＣＤ２０６+）マクロファージの比率。（図２８Ｇ）CT２６Ｅｐ１２．１腫瘍から単離し、ＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞と５：１（Ｅ：Ｔ）の比率で共培養したＣＤ１１ｂ+のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ。（図２８Ｈ）処置マウスのＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍におけるＭ１（ＣＤ８６+）：Ｍ２（ＣＤ２０６+）マクロファージの比率。データ（図２８Ｆおよび２８Ｈ）は平均±s．e．m．を表し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較検定によって分析した。

【図28-2】ＥＤＶ処理に応答した腫瘍応答およびマクロファージ活性化を示す図である。（図２８Ａ）４Ｔ１または（図２８Ｂ)ＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＥｐＥＤＶおよびＥｐＥＤＶ６８２処置に応答した腫瘍増殖。（図２８Ｃ）ＢＡＬＢ／ＣヌードマウスＴ８４異種移植片におけるＥＤＶ－６８２およびＥＤＶ－ＥＧＦＲ６８２、ならびに（図２８Ｄ）Ａ５４９／ＭＤＲ異種移植片を有するＢＡＬＢ／ＣヌードマウスにおけるＥＤＶ－６８２、ＥＤＶ－ＥＧＦＲＤoxおよびＥＤＶ－ＥＧＦＲ６８２に応答する腫瘍増殖。緑色の矢印は、正式に生理食塩水で処置したマウスのＥＤＶＥＧＦＲ６８２処置を開始した場所を示す。データー（図２８Ａ～Ｄ）は平均±s．e．m．を表し、そして４Ｔ１腫瘍から単離され、５：１（Ｅ：Ｔ）の比率で４Ｔ１細胞と共培養されたＣＤ１１ｂ+の二元配置ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較試験（図２８E）ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡによって分析される。プロットは、細胞接着および増殖／死対時間に相関する正規化細胞指数を表す。４Ｔ１腫瘍由来のＣＤ１１ｂ+ 細胞は細胞指数の増大によって示されるように、最初の接着および沈降相を経験し、続いて、細胞指数の増大または減少によって表される増殖または死滅を経験する。（図２８Ｆ）処置マウスの４Ｔ１腫瘍におけるＭ１（ＣＤ８６+）：Ｍ２（ＣＤ２０６+）マクロファージの比率。（図２８Ｇ）CT２６Ｅｐ１２．１腫瘍から単離し、ＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞と５：１（Ｅ：Ｔ）の比率で共培養したＣＤ１１ｂ+のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ。（図２８Ｈ）処置マウスのＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍におけるＭ１（ＣＤ８６+）：Ｍ２（ＣＤ２０６+）マクロファージの比率。データ（図２８Ｆおよび２８Ｈ）は平均±s．e．m．を表し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較検定によって分析した。

【図28-3】ＥＤＶ処理に応答した腫瘍応答およびマクロファージ活性化を示す図である。（図２８Ａ）４Ｔ１または（図２８Ｂ)ＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＥｐＥＤＶおよびＥｐＥＤＶ６８２処置に応答した腫瘍増殖。（図２８Ｃ）ＢＡＬＢ／ＣヌードマウスＴ８４異種移植片におけるＥＤＶ－６８２およびＥＤＶ－ＥＧＦＲ６８２、ならびに（図２８Ｄ）Ａ５４９／ＭＤＲ異種移植片を有するＢＡＬＢ／ＣヌードマウスにおけるＥＤＶ－６８２、ＥＤＶ－ＥＧＦＲＤoxおよびＥＤＶ－ＥＧＦＲ６８２に応答する腫瘍増殖。緑色の矢印は、正式に生理食塩水で処置したマウスのＥＤＶＥＧＦＲ６８２処置を開始した場所を示す。データー（図２８Ａ～Ｄ）は平均±s．e．m．を表し、そして４Ｔ１腫瘍から単離され、５：１（Ｅ：Ｔ）の比率で４Ｔ１細胞と共培養されたＣＤ１１ｂ+の二元配置ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較試験（図２８E）ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡによって分析される。プロットは、細胞接着および増殖／死対時間に相関する正規化細胞指数を表す。４Ｔ１腫瘍由来のＣＤ１１ｂ+ 細胞は細胞指数の増大によって示されるように、最初の接着および沈降相を経験し、続いて、細胞指数の増大または減少によって表される増殖または死滅を経験する。（図２８Ｆ）処置マウスの４Ｔ１腫瘍におけるＭ１（ＣＤ８６+）：Ｍ２（ＣＤ２０６+）マクロファージの比率。（図２８Ｇ）CT２６Ｅｐ１２．１腫瘍から単離し、ＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞と５：１（Ｅ：Ｔ）の比率で共培養したＣＤ１１ｂ+のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ。（図２８Ｈ）処置マウスのＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍におけるＭ１（ＣＤ８６+）：Ｍ２（ＣＤ２０６+）マクロファージの比率。データ（図２８Ｆおよび２８Ｈ）は平均±s．e．m．を表し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較検定によって分析した。

【図28-4】ＥＤＶ処理に応答した腫瘍応答およびマクロファージ活性化を示す図である。（図２８Ａ）４Ｔ１または（図２８Ｂ)ＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＥｐＥＤＶおよびＥｐＥＤＶ６８２処置に応答した腫瘍増殖。（図２８Ｃ）ＢＡＬＢ／ＣヌードマウスＴ８４異種移植片におけるＥＤＶ－６８２およびＥＤＶ－ＥＧＦＲ６８２、ならびに（図２８Ｄ）Ａ５４９／ＭＤＲ異種移植片を有するＢＡＬＢ／ＣヌードマウスにおけるＥＤＶ－６８２、ＥＤＶ－ＥＧＦＲＤoxおよびＥＤＶ－ＥＧＦＲ６８２に応答する腫瘍増殖。緑色の矢印は、正式に生理食塩水で処置したマウスのＥＤＶＥＧＦＲ６８２処置を開始した場所を示す。データー（図２８Ａ～Ｄ）は平均±s．e．m．を表し、そして４Ｔ１腫瘍から単離され、５：１（Ｅ：Ｔ）の比率で４Ｔ１細胞と共培養されたＣＤ１１ｂ+の二元配置ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較試験（図２８E）ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡによって分析される。プロットは、細胞接着および増殖／死対時間に相関する正規化細胞指数を表す。４Ｔ１腫瘍由来のＣＤ１１ｂ+ 細胞は細胞指数の増大によって示されるように、最初の接着および沈降相を経験し、続いて、細胞指数の増大または減少によって表される増殖または死滅を経験する。（図２８Ｆ）処置マウスの４Ｔ１腫瘍におけるＭ１（ＣＤ８６+）：Ｍ２（ＣＤ２０６+）マクロファージの比率。（図２８Ｇ）CT２６Ｅｐ１２．１腫瘍から単離し、ＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞と５：１（Ｅ：Ｔ）の比率で共培養したＣＤ１１ｂ+のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ。（図２８Ｈ）処置マウスのＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍におけるＭ１（ＣＤ８６+）：Ｍ２（ＣＤ２０６+）マクロファージの比率。データ（図２８Ｆおよび２８Ｈ）は平均±s．e．m．を表し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較検定によって分析した。

【図29-1】ＥＤＶ処置に対するＮＫ細胞応答を示す図である。（図２９ Ａ）２０：１（Ｅ：Ｔ）の比で４Ｔ１細胞と共培養された４Ｔ１腫瘍を有するマウスの脾臓から単離されたＮＫ細胞のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ。プロットは、時間正規化細胞指数から計算された細胞生存率を表す。（図２９Ｂ）生理食塩水、ＥｐＥＤＶ、またはＥｐＥＤＶ６８２由来のＮＫ細胞と共培養された４Ｔ１細胞の生存率％は、ＮＫの添加の７０時間後にマウスを処置した（図２９Ｃ）ＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞と２０：１（Ｅ：Ｔ）比で共培養されたＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍を有するマウスの脾臓から単離されたＮＫ細胞のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ。（図２９Ｄ）生理食塩水、ＥｐＥＤＶ、またはＥｐＥＤＶ６８２処置マウス由来のＮＫ細胞と共培養されたＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞の生存率％はＮＫ細胞の添加の５０時間後に（図２９Ｅ）、４Ｔ１腫瘍内のＮＫ細胞（ＣＤ４５＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＤＸ５＋）におけるＮＫＧ２Ｄの発現を示し、ＥｐＥＤＶ６８２処置マウスにおけるＮＫＧ２Ｄ発現の増加を示す。（図２９Ｆ)ＲＡＮＴＥＳおよび（図２９Ｇ)ＴＮＦαの産生は、４Ｔ１腫瘍を有するＥＤＶ処理マウスの脾臓から単離されたＮＫ細胞と４Ｔ１細胞との共培養において行われる。（図２９Ｈ）４つの異なるマウス腫瘍細胞株の表面上のＮＫＧ２Ｄリガンドrae１、Ｈ６０ａ、およびＭＵＬＴ１の定量。（図２９Ｉ）ＲＡＥ１および／またはＨ６０ａ阻害抗体の存在下で２０：１（Ｅ：Ｔ）比で４Ｔ１細胞と共培養された４Ｔ１腫瘍を有すルＥｐＥＤＶ６８２処置マウスの脾臓から単離されたＮＫ細胞のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡは、両方がＮＫ腫瘍細胞溶解において重要であることを実証する。（図２９Ｊ）ＮＫ細胞添加の８０時間後のＮＫ細胞溶解の定量は、ＲＡＥ阻害抗体と組み合わせたＨ６０ａ抗体単独でのＮＫ細胞溶解の有意な阻害を 示す。データ（図２９Ｂ、２９Ｄ、２９ＥＧ、および２９Ｊ）は平均±s．e．m．を表し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較検定によって分析した。

【図29-2】ＥＤＶ処置に対するＮＫ細胞応答を示す図である。（図２９ Ａ）２０：１（Ｅ：Ｔ）の比で４Ｔ１細胞と共培養された４Ｔ１腫瘍を有するマウスの脾臓から単離されたＮＫ細胞のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ。プロットは、時間正規化細胞指数から計算された細胞生存率を表す。（図２９Ｂ）生理食塩水、ＥｐＥＤＶ、またはＥｐＥＤＶ６８２由来のＮＫ細胞と共培養された４Ｔ１細胞の生存率％は、ＮＫの添加の７０時間後にマウスを処置した（図２９Ｃ）ＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞と２０：１（Ｅ：Ｔ）比で共培養されたＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍を有するマウスの脾臓から単離されたＮＫ細胞のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ。（図２９Ｄ）生理食塩水、ＥｐＥＤＶ、またはＥｐＥＤＶ６８２処置マウス由来のＮＫ細胞と共培養されたＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞の生存率％はＮＫ細胞の添加の５０時間後に（図２９Ｅ）、４Ｔ１腫瘍内のＮＫ細胞（ＣＤ４５＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＤＸ５＋）におけるＮＫＧ２Ｄの発現を示し、ＥｐＥＤＶ６８２処置マウスにおけるＮＫＧ２Ｄ発現の増加を示す。（図２９Ｆ)ＲＡＮＴＥＳおよび（図２９Ｇ)ＴＮＦαの産生は、４Ｔ１腫瘍を有するＥＤＶ処理マウスの脾臓から単離されたＮＫ細胞と４Ｔ１細胞との共培養において行われる。（図２９Ｈ）４つの異なるマウス腫瘍細胞株の表面上のＮＫＧ２Ｄリガンドrae１、Ｈ６０ａ、およびＭＵＬＴ１の定量。（図２９Ｉ）ＲＡＥ１および／またはＨ６０ａ阻害抗体の存在下で２０：１（Ｅ：Ｔ）比で４Ｔ１細胞と共培養された４Ｔ１腫瘍を有すルＥｐＥＤＶ６８２処置マウスの脾臓から単離されたＮＫ細胞のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡは、両方がＮＫ腫瘍細胞溶解において重要であることを実証する。（図２９Ｊ）ＮＫ細胞添加の８０時間後のＮＫ細胞溶解の定量は、ＲＡＥ阻害抗体と組み合わせたＨ６０ａ抗体単独でのＮＫ細胞溶解の有意な阻害を 示す。データ（図２９Ｂ、２９Ｄ、２９ＥＧ、および２９Ｊ）は平均±s．e．m．を表し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較検定によって分析した。

【図29-3】ＥＤＶ処置に対するＮＫ細胞応答を示す図である。（図２９ Ａ）２０：１（Ｅ：Ｔ）の比で４Ｔ１細胞と共培養された４Ｔ１腫瘍を有するマウスの脾臓から単離されたＮＫ細胞のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ。プロットは、時間正規化細胞指数から計算された細胞生存率を表す。（図２９Ｂ）生理食塩水、ＥｐＥＤＶ、またはＥｐＥＤＶ６８２由来のＮＫ細胞と共培養された４Ｔ１細胞の生存率％は、ＮＫの添加の７０時間後にマウスを処置した（図２９Ｃ）ＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞と２０：１（Ｅ：Ｔ）比で共培養されたＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍を有するマウスの脾臓から単離されたＮＫ細胞のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ。（図２９Ｄ）生理食塩水、ＥｐＥＤＶ、またはＥｐＥＤＶ６８２処置マウス由来のＮＫ細胞と共培養されたＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞の生存率％はＮＫ細胞の添加の５０時間後に（図２９Ｅ）、４Ｔ１腫瘍内のＮＫ細胞（ＣＤ４５＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＤＸ５＋）におけるＮＫＧ２Ｄの発現を示し、ＥｐＥＤＶ６８２処置マウスにおけるＮＫＧ２Ｄ発現の増加を示す。（図２９Ｆ)ＲＡＮＴＥＳおよび（図２９Ｇ)ＴＮＦαの産生は、４Ｔ１腫瘍を有するＥＤＶ処理マウスの脾臓から単離されたＮＫ細胞と４Ｔ１細胞との共培養において行われる。（図２９Ｈ）４つの異なるマウス腫瘍細胞株の表面上のＮＫＧ２Ｄリガンドrae１、Ｈ６０ａ、およびＭＵＬＴ１の定量。（図２９Ｉ）ＲＡＥ１および／またはＨ６０ａ阻害抗体の存在下で２０：１（Ｅ：Ｔ）比で４Ｔ１細胞と共培養された４Ｔ１腫瘍を有すルＥｐＥＤＶ６８２処置マウスの脾臓から単離されたＮＫ細胞のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡは、両方がＮＫ腫瘍細胞溶解において重要であることを実証する。（図２９Ｊ）ＮＫ細胞添加の８０時間後のＮＫ細胞溶解の定量は、ＲＡＥ阻害抗体と組み合わせたＨ６０ａ抗体単独でのＮＫ細胞溶解の有意な阻害を 示す。データ（図２９Ｂ、２９Ｄ、２９ＥＧ、および２９Ｊ）は平均±s．e．m．を表し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較検定によって分析した。

【図29-4】ＥＤＶ処置に対するＮＫ細胞応答を示す図である。（図２９ Ａ）２０：１（Ｅ：Ｔ）の比で４Ｔ１細胞と共培養された４Ｔ１腫瘍を有するマウスの脾臓から単離されたＮＫ細胞のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ。プロットは、時間正規化細胞指数から計算された細胞生存率を表す。（図２９Ｂ）生理食塩水、ＥｐＥＤＶ、またはＥｐＥＤＶ６８２由来のＮＫ細胞と共培養された４Ｔ１細胞の生存率％は、ＮＫの添加の７０時間後にマウスを処置した（図２９Ｃ）ＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞と２０：１（Ｅ：Ｔ）比で共培養されたＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍を有するマウスの脾臓から単離されたＮＫ細胞のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ。（図２９Ｄ）生理食塩水、ＥｐＥＤＶ、またはＥｐＥＤＶ６８２処置マウス由来のＮＫ細胞と共培養されたＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞の生存率％はＮＫ細胞の添加の５０時間後に（図２９Ｅ）、４Ｔ１腫瘍内のＮＫ細胞（ＣＤ４５＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＤＸ５＋）におけるＮＫＧ２Ｄの発現を示し、ＥｐＥＤＶ６８２処置マウスにおけるＮＫＧ２Ｄ発現の増加を示す。（図２９Ｆ)ＲＡＮＴＥＳおよび（図２９Ｇ)ＴＮＦαの産生は、４Ｔ１腫瘍を有するＥＤＶ処理マウスの脾臓から単離されたＮＫ細胞と４Ｔ１細胞との共培養において行われる。（図２９Ｈ）４つの異なるマウス腫瘍細胞株の表面上のＮＫＧ２Ｄリガンドrae１、Ｈ６０ａ、およびＭＵＬＴ１の定量。（図２９Ｉ）ＲＡＥ１および／またはＨ６０ａ阻害抗体の存在下で２０：１（Ｅ：Ｔ）比で４Ｔ１細胞と共培養された４Ｔ１腫瘍を有すルＥｐＥＤＶ６８２処置マウスの脾臓から単離されたＮＫ細胞のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡは、両方がＮＫ腫瘍細胞溶解において重要であることを実証する。（図２９Ｊ）ＮＫ細胞添加の８０時間後のＮＫ細胞溶解の定量は、ＲＡＥ阻害抗体と組み合わせたＨ６０ａ抗体単独でのＮＫ細胞溶解の有意な阻害を 示す。データ（図２９Ｂ、２９Ｄ、２９ＥＧ、および２９Ｊ）は平均±s．e．m．を表し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較検定によって分析した。

【図30-1】ＥＤＶ処置に応答した脾細胞／腫瘍細胞共培養物による間質腫瘍サイトカイン／ケモカイン産生およびサイトカイン産生を示す図である。（図３０Ａ）４Ｔ１または（図３０Ｂ）ＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＥｐＥＤＶおよびＥｐＥＤＶ６８２処置に応答して産生された間質性サイトカインおよびケモカインのＥＬＩＳＡ分析。Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２ 治療により、主にＴｈ１サイトカインが増加する。データは平均±標準偏差を表す。一方向ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較検定により分析した個々のサイトカインデータ。（図３０Ｃ）ＴＮＦアルファ （図３０Ｄ）ＩＬ－２（図３０Ｅ）ＩＬ－１β（図３０Ｆ）ＩＦＮガンマおよび（図３０Ｇ）ＩＬ－１０のＥＬＩＳＡ分析は、生理食塩水、Ｅｐ－ＥＤＶ、および４Ｔ１およびＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍を有するＥｐ－ＥＤＶ－６８２処理マウスから単離した脾細胞と、それらに対応する腫瘍細胞との共培養物の上清から得た。データは平均±標準偏差を表す。一元配置分散分析およびＴｕｋｅｙの多重比較を用いて、グループ＋または－腫瘍細胞を比較した。腫瘍細胞を用いた場合と用いない場合の個々の治療法を比較するために用いられるＴ試験。

【図30-2】ＥＤＶ処置に応答した脾細胞／腫瘍細胞共培養物による間質腫瘍サイトカイン／ケモカイン産生およびサイトカイン産生を示す図である。（図３０Ａ）４Ｔ１または（図３０Ｂ）ＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＥｐＥＤＶおよびＥｐＥＤＶ６８２処置に応答して産生された間質性サイトカインおよびケモカインのＥＬＩＳＡ分析。Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２ 治療により、主にＴｈ１サイトカインが増加する。データは平均±標準偏差を表す。一方向ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較検定により分析した個々のサイトカインデータ。（図３０Ｃ）ＴＮＦアルファ （図３０Ｄ）ＩＬ－２（図３０Ｅ）ＩＬ－１β（図３０Ｆ）ＩＦＮガンマおよび（図３０Ｇ）ＩＬ－１０のＥＬＩＳＡ分析は、生理食塩水、Ｅｐ－ＥＤＶ、および４Ｔ１およびＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍を有するＥｐ－ＥＤＶ－６８２処理マウスから単離した脾細胞と、それらに対応する腫瘍細胞との共培養物の上清から得た。データは平均±標準偏差を表す。一元配置分散分析およびＴｕｋｅｙの多重比較を用いて、グループ＋または－腫瘍細胞を比較した。腫瘍細胞を用いた場合と用いない場合の個々の治療法を比較するために用いられるＴ試験。

【図30-3】ＥＤＶ処置に応答した脾細胞／腫瘍細胞共培養物による間質腫瘍サイトカイン／ケモカイン産生およびサイトカイン産生を示す図である。（図３０Ａ）４Ｔ１または（図３０Ｂ）ＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＥｐＥＤＶおよびＥｐＥＤＶ６８２処置に応答して産生された間質性サイトカインおよびケモカインのＥＬＩＳＡ分析。Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２ 治療により、主にＴｈ１サイトカインが増加する。データは平均±標準偏差を表す。一方向ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較検定により分析した個々のサイトカインデータ。（図３０Ｃ）ＴＮＦアルファ （図３０Ｄ）ＩＬ－２（図３０Ｅ）ＩＬ－１β（図３０Ｆ）ＩＦＮガンマおよび（図３０Ｇ）ＩＬ－１０のＥＬＩＳＡ分析は、生理食塩水、Ｅｐ－ＥＤＶ、および４Ｔ１およびＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍を有するＥｐ－ＥＤＶ－６８２処理マウスから単離した脾細胞と、それらに対応する腫瘍細胞との共培養物の上清から得た。データは平均±標準偏差を表す。一元配置分散分析およびＴｕｋｅｙの多重比較を用いて、グループ＋または－腫瘍細胞を比較した。腫瘍細胞を用いた場合と用いない場合の個々の治療法を比較するために用いられるＴ試験。

【図30-4】ＥＤＶ処置に応答した脾細胞／腫瘍細胞共培養物による間質腫瘍サイトカイン／ケモカイン産生およびサイトカイン産生を示す図である。（図３０Ａ）４Ｔ１または（図３０Ｂ）ＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＥｐＥＤＶおよびＥｐＥＤＶ６８２処置に応答して産生された間質性サイトカインおよびケモカインのＥＬＩＳＡ分析。Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２ 治療により、主にＴｈ１サイトカインが増加する。データは平均±標準偏差を表す。一方向ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較検定により分析した個々のサイトカインデータ。（図３０Ｃ）ＴＮＦアルファ （図３０Ｄ）ＩＬ－２（図３０Ｅ）ＩＬ－１β（図３０Ｆ）ＩＦＮガンマおよび（図３０Ｇ）ＩＬ－１０のＥＬＩＳＡ分析は、生理食塩水、Ｅｐ－ＥＤＶ、および４Ｔ１およびＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍を有するＥｐ－ＥＤＶ－６８２処理マウスから単離した脾細胞と、それらに対応する腫瘍細胞との共培養物の上清から得た。データは平均±標準偏差を表す。一元配置分散分析およびＴｕｋｅｙの多重比較を用いて、グループ＋または－腫瘍細胞を比較した。腫瘍細胞を用いた場合と用いない場合の個々の治療法を比較するために用いられるＴ試験。

【図31-1】ＥＤＶ処置に応答したＴ細胞機能および表現型を示す図である。（図３１Ａ）３０：１（Ｅ：Ｔ）の比率で４Ｔ１細胞と共培養された４Ｔ１腫瘍を有するマウスの脾臓から単離されたＣＤ８+ Ｔ細胞のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ。プロットは、細胞接着および増殖／死対時間に相関する正規化細胞指数を表す。（図３１Ｂ）ＣＤ８+ Ｔ細胞の添加30時間後に、生理食塩水、Ｅｐ－ＥＤＶ、またはＥｐ－ＥＤＶ－６８２処理マウス由来のＣＤ８+ Ｔ細胞と共培養した４Ｔ１細胞の生存率％。（図３１Ｃ）ＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍を有するマウスの脾臓から単離されたＣＤ８+ Ｔ細胞のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡを、ＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞と３０：１（Ｅ：Ｔ）の比率で共培養した。プロットは、細胞接着および増殖／死対時間に相関する正規化細胞指数を表す。（図３１Ｄ）生理食塩水、ＥｐＥＤＶ、またはＥｐＥＤＶ６８２処置マウス由来のＣＤ８+ Ｔ細胞と共培養されたＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞の生存率％は、ＣＤ８+ Ｔ細胞の追加の２０時間後に処置された。（図３１Ｅ）ＣＤ８+ T－セル（ＣＤ４５+、ＣＤ３+、ＣＤ８+として定義される）の割合が、４Ｔ１の形態で検出された。（図３１Ｆ）Ｔ－ｒｅｇｓ（ＣＤ４５+、ＣＤ３+、ＣＤ４、ＣＤ２５+として定義される）のパーセンテージは、４Ｔ１の形態で検出された。（図３１Ｇ）４Ｔ１腫瘍を有するマウスの腫瘍排出リンパ節におけるＴ細胞の数を、全細胞の％で示す。（図３１Ｈ）４Ｔ１腫瘍を有するマウスの腫瘍排出リンパ節における樹状細胞における％ＣＤ８０／ＭＨＣクラスII発現。（図３１Ｉ）４Ｔ１細胞で処置したＥｐ－ＥＤＶ－６８２マウスから単離されたＣＤ８+ Ｔ細胞間の相互作用の共焦点像。赤色－アクチン、緑色－パーフォリン、青色（暗色）－ＤＡＰＩ；スケールバー１０μｍ。データ（図３１Ｂ、３１Ｄ、および３１ＥＨ）は平均±s．e．m．を表し、一方向ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較試験（図３１Ｂ、３１Ｄ、および３１ＥＧ）またはｔ試験（図３１Ｈ）によって分析した。

【図31-2】ＥＤＶ処置に応答したＴ細胞機能および表現型を示す図である。（図３１Ａ）３０：１（Ｅ：Ｔ）の比率で４Ｔ１細胞と共培養された４Ｔ１腫瘍を有するマウスの脾臓から単離されたＣＤ８+ Ｔ細胞のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ。プロットは、細胞接着および増殖／死対時間に相関する正規化細胞指数を表す。（図３１Ｂ）ＣＤ８+ Ｔ細胞の添加30時間後に、生理食塩水、Ｅｐ－ＥＤＶ、またはＥｐ－ＥＤＶ－６８２処理マウス由来のＣＤ８+ Ｔ細胞と共培養した４Ｔ１細胞の生存率％。（図３１Ｃ）ＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍を有するマウスの脾臓から単離されたＣＤ８+ Ｔ細胞のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡを、ＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞と３０：１（Ｅ：Ｔ）の比率で共培養した。プロットは、細胞接着および増殖／死対時間に相関する正規化細胞指数を表す。（図３１Ｄ）生理食塩水、ＥｐＥＤＶ、またはＥｐＥＤＶ６８２処置マウス由来のＣＤ８+ Ｔ細胞と共培養されたＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞の生存率％は、ＣＤ８+ Ｔ細胞の追加の２０時間後に処置された。（図３１Ｅ）ＣＤ８+ T－セル（ＣＤ４５+、ＣＤ３+、ＣＤ８+として定義される）の割合が、４Ｔ１の形態で検出された。（図３１Ｆ）Ｔ－ｒｅｇｓ（ＣＤ４５+、ＣＤ３+、ＣＤ４、ＣＤ２５+として定義される）のパーセンテージは、４Ｔ１の形態で検出された。（図３１Ｇ）４Ｔ１腫瘍を有するマウスの腫瘍排出リンパ節におけるＴ細胞の数を、全細胞の％で示す。（図３１Ｈ）４Ｔ１腫瘍を有するマウスの腫瘍排出リンパ節における樹状細胞における％ＣＤ８０／ＭＨＣクラスII発現。（図３１Ｉ）４Ｔ１細胞で処置したＥｐ－ＥＤＶ－６８２マウスから単離されたＣＤ８+ Ｔ細胞間の相互作用の共焦点像。赤色－アクチン、緑色－パーフォリン、青色（暗色）－ＤＡＰＩ；スケールバー１０μｍ。データ（図３１Ｂ、３１Ｄ、および３１ＥＨ）は平均±s．e．m．を表し、一方向ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較試験（図３１Ｂ、３１Ｄ、および３１ＥＧ）またはｔ試験（図３１Ｈ）によって分析した。

【図31-3】ＥＤＶ処置に応答したＴ細胞機能および表現型を示す図である。（図３１Ａ）３０：１（Ｅ：Ｔ）の比率で４Ｔ１細胞と共培養された４Ｔ１腫瘍を有するマウスの脾臓から単離されたＣＤ８+ Ｔ細胞のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ。プロットは、細胞接着および増殖／死対時間に相関する正規化細胞指数を表す。（図３１Ｂ）ＣＤ８+ Ｔ細胞の添加30時間後に、生理食塩水、Ｅｐ－ＥＤＶ、またはＥｐ－ＥＤＶ－６８２処理マウス由来のＣＤ８+ Ｔ細胞と共培養した４Ｔ１細胞の生存率％。（図３１Ｃ）ＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍を有するマウスの脾臓から単離されたＣＤ８+ Ｔ細胞のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡを、ＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞と３０：１（Ｅ：Ｔ）の比率で共培養した。プロットは、細胞接着および増殖／死対時間に相関する正規化細胞指数を表す。（図３１Ｄ）生理食塩水、ＥｐＥＤＶ、またはＥｐＥＤＶ６８２処置マウス由来のＣＤ８+ Ｔ細胞と共培養されたＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞の生存率％は、ＣＤ８+ Ｔ細胞の追加の２０時間後に処置された。（図３１Ｅ）ＣＤ８+ T－セル（ＣＤ４５+、ＣＤ３+、ＣＤ８+として定義される）の割合が、４Ｔ１の形態で検出された。（図３１Ｆ）Ｔ－ｒｅｇｓ（ＣＤ４５+、ＣＤ３+、ＣＤ４、ＣＤ２５+として定義される）のパーセンテージは、４Ｔ１の形態で検出された。（図３１Ｇ）４Ｔ１腫瘍を有するマウスの腫瘍排出リンパ節におけるＴ細胞の数を、全細胞の％で示す。（図３１Ｈ）４Ｔ１腫瘍を有するマウスの腫瘍排出リンパ節における樹状細胞における％ＣＤ８０／ＭＨＣクラスII発現。（図３１Ｉ）４Ｔ１細胞で処置したＥｐ－ＥＤＶ－６８２マウスから単離されたＣＤ８+ Ｔ細胞間の相互作用の共焦点像。赤色－アクチン、緑色－パーフォリン、青色（暗色）－ＤＡＰＩ；スケールバー１０μｍ。データ（図３１Ｂ、３１Ｄ、および３１ＥＨ）は平均±s．e．m．を表し、一方向ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較試験（図３１Ｂ、３１Ｄ、および３１ＥＧ）またはｔ試験（図３１Ｈ）によって分析した。

【図31-4】ＥＤＶ処置に応答したＴ細胞機能および表現型を示す図である。（図３１Ａ）３０：１（Ｅ：Ｔ）の比率で４Ｔ１細胞と共培養された４Ｔ１腫瘍を有するマウスの脾臓から単離されたＣＤ８+ Ｔ細胞のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ。プロットは、細胞接着および増殖／死対時間に相関する正規化細胞指数を表す。（図３１Ｂ）ＣＤ８+ Ｔ細胞の添加30時間後に、生理食塩水、Ｅｐ－ＥＤＶ、またはＥｐ－ＥＤＶ－６８２処理マウス由来のＣＤ８+ Ｔ細胞と共培養した４Ｔ１細胞の生存率％。（図３１Ｃ）ＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍を有するマウスの脾臓から単離されたＣＤ８+ Ｔ細胞のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡを、ＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞と３０：１（Ｅ：Ｔ）の比率で共培養した。プロットは、細胞接着および増殖／死対時間に相関する正規化細胞指数を表す。（図３１Ｄ）生理食塩水、ＥｐＥＤＶ、またはＥｐＥＤＶ６８２処置マウス由来のＣＤ８+ Ｔ細胞と共培養されたＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞の生存率％は、ＣＤ８+ Ｔ細胞の追加の２０時間後に処置された。（図３１Ｅ）ＣＤ８+ T－セル（ＣＤ４５+、ＣＤ３+、ＣＤ８+として定義される）の割合が、４Ｔ１の形態で検出された。（図３１Ｆ）Ｔ－ｒｅｇｓ（ＣＤ４５+、ＣＤ３+、ＣＤ４、ＣＤ２５+として定義される）のパーセンテージは、４Ｔ１の形態で検出された。（図３１Ｇ）４Ｔ１腫瘍を有するマウスの腫瘍排出リンパ節におけるＴ細胞の数を、全細胞の％で示す。（図３１Ｈ）４Ｔ１腫瘍を有するマウスの腫瘍排出リンパ節における樹状細胞における％ＣＤ８０／ＭＨＣクラスII発現。（図３１Ｉ）４Ｔ１細胞で処置したＥｐ－ＥＤＶ－６８２マウスから単離されたＣＤ８+ Ｔ細胞間の相互作用の共焦点像。赤色－アクチン、緑色－パーフォリン、青色（暗色）－ＤＡＰＩ；スケールバー１０μｍ。データ（図３１Ｂ、３１Ｄ、および３１ＥＨ）は平均±s．e．m．を表し、一方向ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較試験（図３１Ｂ、３１Ｄ、および３１ＥＧ）またはｔ試験（図３１Ｈ）によって分析した。

【図32-1】患者末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の予後指標および免疫表現型検査を示す図であり、用量１２での樹状細胞および単球による抗原提示の増強および細胞傷害性ＣＤ８+ Ｔ細胞含量の上昇の証拠を明らかにする。予後指標（図３２Ａ)ＣＡ１９９および（図３２Ｂ)Ｃ反応性タンパク質血清レベル。（図３２Ｃ）単球および（図３２Ｄ）中間体（ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋＋）抗原提示単球サブタイプについてのＤｕｒａｃｌｏｎｅ免疫表現型決定パネルを用いたＰＢＭＣの分析。％白血球として表した。ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞応答を御する（図３２Ｅ）骨髄性樹状（Ｃｌｅｃ９Ａ＋）細胞（ｍＤＣ）および（図３２Ｆ）形質細胞様樹状および骨髄性樹状（プロフェッショナル抗原提示ＤＣ）を含む樹状細胞サブタイプ。示されるように％ＤＣまたは％ｍＤＣで表す。（図３２Ｇ)ＣＤ８+Ｔ細胞サブタイプ。細胞傷害性ＣＤ８+Ｔ細胞には、エフェクターおよび消耗した（ＰＤ１＋）サブタイプが含まれる。

【図32-2】患者末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の予後指標および免疫表現型検査を示す図であり、用量１２での樹状細胞および単球による抗原提示の増強および細胞傷害性ＣＤ８+ Ｔ細胞含量の上昇の証拠を明らかにする。予後指標（図３２Ａ)ＣＡ１９９および（図３２Ｂ)Ｃ反応性タンパク質血清レベル。（図３２Ｃ）単球および（図３２Ｄ）中間体（ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋＋）抗原提示単球サブタイプについてのＤｕｒａｃｌｏｎｅ免疫表現型決定パネルを用いたＰＢＭＣの分析。％白血球として表した。ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞応答を御する（図３２Ｅ）骨髄性樹状（Ｃｌｅｃ９Ａ＋）細胞（ｍＤＣ）および（図３２Ｆ）形質細胞様樹状および骨髄性樹状（プロフェッショナル抗原提示ＤＣ）を含む樹状細胞サブタイプ。示されるように％ＤＣまたは％ｍＤＣで表す。（図３２Ｇ)ＣＤ８+Ｔ細胞サブタイプ。細胞傷害性ＣＤ８+Ｔ細胞には、エフェクターおよび消耗した（ＰＤ１＋）サブタイプが含まれる。

【図32-3】患者末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の予後指標および免疫表現型検査を示す図であり、用量１２での樹状細胞および単球による抗原提示の増強および細胞傷害性ＣＤ８+ Ｔ細胞含量の上昇の証拠を明らかにする。予後指標（図３２Ａ)ＣＡ１９９および（図３２Ｂ)Ｃ反応性タンパク質血清レベル。（図３２Ｃ）単球および（図３２Ｄ）中間体（ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋＋）抗原提示単球サブタイプについてのＤｕｒａｃｌｏｎｅ免疫表現型決定パネルを用いたＰＢＭＣの分析。％白血球として表した。ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞応答を御する（図３２Ｅ）骨髄性樹状（Ｃｌｅｃ９Ａ＋）細胞（ｍＤＣ）および（図３２Ｆ）形質細胞様樹状および骨髄性樹状（プロフェッショナル抗原提示ＤＣ）を含む樹状細胞サブタイプ。示されるように％ＤＣまたは％ｍＤＣで表す。（図３２Ｇ)ＣＤ８+Ｔ細胞サブタイプ。細胞傷害性ＣＤ８+Ｔ細胞には、エフェクターおよび消耗した（ＰＤ１＋）サブタイプが含まれる。

【図33】ＥＤＶがどのようにして最初に腫瘍への細胞傷害性物質の送達を介して免疫原性腫瘍微小環境を作り出し、次に抗腫瘍表現型に向けて直接的または間接的に自然免疫系を刺激し、最後に腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞が生じる適応応答を生じるかの概略を示す図である。（図３３Ａ）ＥｐＥＤＶ６８２は漏出性血管系を介して腫瘍微小環境に入り、腫瘍細胞アポトーシスおよび免疫活性化ＤＡＭＰの放出を生じる。アポトーシス細胞またはＥＤＶさえも直接飲み込むことによる腫瘍微小環境内のマクロファージの相互作用はＭ１マクロファージ分極および炎症性サイトカインＴＮＦアルファおよびＩＬ６の放出をもたらす（図３３Ｃ)Ｍ１マクロファージが腫瘍細胞をさらに溶解し、さらなる免疫細胞を動員することができるＭＩＰ-１αを放出することができる。（図３３Ｄ）未成熟樹状細胞はアポトーシス細胞体を飲み込み、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処理および成熟放出1型インターフェロン、ＴＮＦα、ＩＬ－１２ｐ４０およびＩＬ－６に応答して生じる腫瘍抗原を放出した。（図３３Ｅ）次いで、成熟ＤＣは、Ｔ細胞への抗原提示のためにリンパ節に移動する。（図３３Ｆ)ＮＫ細胞活性化はまた、さらなる免疫細胞を誘引するためのＩＦＮがγおよびＴＮＦαならびにＲＡＮＴＥＳの放出を生じる腫瘍微小環境において生じる。さらに、活性化されたＮＫ細胞は腫瘍細胞を効果的に溶解する。（図３３Ｇ）ＲＡＮＴＥＳ及びＭＩＰ－１αの放出はさらなるＴ細胞、ＮＫ細胞、およびマクロファージを腫瘍に補充し、そこで（図３３Ｈ）腫瘍特異的ＣＤ８+ Ｔ細胞は、次いで、腫瘍細胞溶解を介して反応に寄与する。（図３３Ｉ）これらの工程の全てが組み合わさって、効果的な抗腫瘍免疫応答を作り出す。

【図34-1】ＥＤＶ処置に応答したＲＡＷ２６４．７およびＪＡＷＳＩＩ細胞活性化を示す図である。（図３４Ａ）ＥＤＶ製剤と直接インキュベートしたＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦα産生。（図３４Ｂ）ＥＤＶ製剤と直接インキュベートしたＲＡＷ２６４．７細胞によるＩＬ６産生。（図３４Ｃ）未処理ＣＴ２６Ｅｐ１２．１および４Ｔ１細胞またはＥｐＥＤＶ、ＥｐＥＤＶ６８２、または６８２単独で処理した細胞とのＪＡＷＳII細胞共培養におけるＣＤ８６およびＭＨＣクラスＩＩ発現のフローサイトメトリーヒストグラムオーバーレイ。（図３４Ｄ）処理された腫瘍細胞と共培養されたＪＡＷＳＩＩ細胞上でフローサイトメトリーを介して決定されるようなＣＤ８６発現の定量。（図３４Ｅ）処理された腫瘍細胞と共培養されたＪＡＷＳＩＩ細胞上のフローサイトメトリーによって決定されたＭＨＣクラスＩＩ発現の定量。データは平均±s．e．m．を表し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較検定によって分析する。

【図34-2】ＥＤＶ処置に応答したＲＡＷ２６４．７およびＪＡＷＳＩＩ細胞活性化を示す図である。（図３４Ａ）ＥＤＶ製剤と直接インキュベートしたＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦα産生。（図３４Ｂ）ＥＤＶ製剤と直接インキュベートしたＲＡＷ２６４．７細胞によるＩＬ６産生。（図３４Ｃ）未処理ＣＴ２６Ｅｐ１２．１および４Ｔ１細胞またはＥｐＥＤＶ、ＥｐＥＤＶ６８２、または６８２単独で処理した細胞とのＪＡＷＳII細胞共培養におけるＣＤ８６およびＭＨＣクラスＩＩ発現のフローサイトメトリーヒストグラムオーバーレイ。（図３４Ｄ）処理された腫瘍細胞と共培養されたＪＡＷＳＩＩ細胞上でフローサイトメトリーを介して決定されるようなＣＤ８６発現の定量。（図３４Ｅ）処理された腫瘍細胞と共培養されたＪＡＷＳＩＩ細胞上のフローサイトメトリーによって決定されたＭＨＣクラスＩＩ発現の定量。データは平均±s．e．m．を表し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較検定によって分析する。

【図34-3】ＥＤＶ処置に応答したＲＡＷ２６４．７およびＪＡＷＳＩＩ細胞活性化を示す図である。（図３４Ａ）ＥＤＶ製剤と直接インキュベートしたＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦα産生。（図３４Ｂ）ＥＤＶ製剤と直接インキュベートしたＲＡＷ２６４．７細胞によるＩＬ６産生。（図３４Ｃ）未処理ＣＴ２６Ｅｐ１２．１および４Ｔ１細胞またはＥｐＥＤＶ、ＥｐＥＤＶ６８２、または６８２単独で処理した細胞とのＪＡＷＳII細胞共培養におけるＣＤ８６およびＭＨＣクラスＩＩ発現のフローサイトメトリーヒストグラムオーバーレイ。（図３４Ｄ）処理された腫瘍細胞と共培養されたＪＡＷＳＩＩ細胞上でフローサイトメトリーを介して決定されるようなＣＤ８６発現の定量。（図３４Ｅ）処理された腫瘍細胞と共培養されたＪＡＷＳＩＩ細胞上のフローサイトメトリーによって決定されたＭＨＣクラスＩＩ発現の定量。データは平均±s．e．m．を表し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較検定によって分析する。

【図35-1】Ｂａｌｂ／ｃおよびＢａｌｂ／ｃヌード異種移植片におけるＥＤＶ処置に応答した体重変化およびマクロファージ活性化を示す。（図３５Ａ)ＣＴ２６Ｅｐ１２．１（図３５Ｂ）４Ｔ１（図３５Ｃ)T８４および（図３５Ｄ)Ａ５４９／ＭＤＲ腫瘍を有するマウスの体重の変化％。最初の投与では５％以下の体重減少しか見られず、その後、体重は回復し、その後の投与で安定する。データは平均±標準偏差を表す。ＥＤＶ処置マウスの（図３５Ｅ)Ａ５４９／ＭＤＲおよび（図３５Ｆ)Ｔ８４腫瘍におけるマクロファージのＭ１／Ｍ２（ＣＤ８６：ＣＤ２０６）比。（図３５Ｇ）Ａ５４９／ＭＤＲ腫瘍から単離され、Ａ５４９／ＭＤＲ細胞と５：１（Ｅ：Ｔ）の比率で共培養されたＣＤ１１ｂ+のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ。プロットは、細胞接着および増殖／死対時間に相関する正規化細胞指数を表す。（図３５Ｈ）生理食塩水またはＥＧＦＲＥＤＶ６８２処置マウスの腫瘍由来のＣＤ１１ｂ+細胞と共培養したＡ５４９／ＭＤＲ細胞の細胞溶解％は、ＣＤ１１ｂ+細胞を加えた６．５時間後に処置した。（図３５Ｉ）４Ｔ１細胞で処理した４Ｔ１腫瘍から単離したＣＤ１１ｂ+細胞の共培養におけるＭＩＰ１αの産生。データ（図３５Ｅ、３５Ｆ、３５Ｈ、および３５Ｉ）は平均±s．e．m．を表し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較試験（図３５Ｅ、３５Ｈ、３５Ｉ）またはｔ試験（図３５Ｆ）によって分析した。

【図35-2】Ｂａｌｂ／ｃおよびＢａｌｂ／ｃヌード異種移植片におけるＥＤＶ処置に応答した体重変化およびマクロファージ活性化を示す。（図３５Ａ)ＣＴ２６Ｅｐ１２．１（図３５Ｂ）４Ｔ１（図３５Ｃ)T８４および（図３５Ｄ)Ａ５４９／ＭＤＲ腫瘍を有するマウスの体重の変化％。最初の投与では５％以下の体重減少しか見られず、その後、体重は回復し、その後の投与で安定する。データは平均±標準偏差を表す。ＥＤＶ処置マウスの（図３５Ｅ)Ａ５４９／ＭＤＲおよび（図３５Ｆ)Ｔ８４腫瘍におけるマクロファージのＭ１／Ｍ２（ＣＤ８６：ＣＤ２０６）比。（図３５Ｇ）Ａ５４９／ＭＤＲ腫瘍から単離され、Ａ５４９／ＭＤＲ細胞と５：１（Ｅ：Ｔ）の比率で共培養されたＣＤ１１ｂ+のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ。プロットは、細胞接着および増殖／死対時間に相関する正規化細胞指数を表す。（図３５Ｈ）生理食塩水またはＥＧＦＲＥＤＶ６８２処置マウスの腫瘍由来のＣＤ１１ｂ+細胞と共培養したＡ５４９／ＭＤＲ細胞の細胞溶解％は、ＣＤ１１ｂ+細胞を加えた６．５時間後に処置した。（図３５Ｉ）４Ｔ１細胞で処理した４Ｔ１腫瘍から単離したＣＤ１１ｂ+細胞の共培養におけるＭＩＰ１αの産生。データ（図３５Ｅ、３５Ｆ、３５Ｈ、および３５Ｉ）は平均±s．e．m．を表し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較試験（図３５Ｅ、３５Ｈ、３５Ｉ）またはｔ試験（図３５Ｆ）によって分析した。

【図35-3】Ｂａｌｂ／ｃおよびＢａｌｂ／ｃヌード異種移植片におけるＥＤＶ処置に応答した体重変化およびマクロファージ活性化を示す。（図３５Ａ)ＣＴ２６Ｅｐ１２．１（図３５Ｂ）４Ｔ１（図３５Ｃ)T８４および（図３５Ｄ)Ａ５４９／ＭＤＲ腫瘍を有するマウスの体重の変化％。最初の投与では５％以下の体重減少しか見られず、その後、体重は回復し、その後の投与で安定する。データは平均±標準偏差を表す。ＥＤＶ処置マウスの（図３５Ｅ)Ａ５４９／ＭＤＲおよび（図３５Ｆ)Ｔ８４腫瘍におけるマクロファージのＭ１／Ｍ２（ＣＤ８６：ＣＤ２０６）比。（図３５Ｇ）Ａ５４９／ＭＤＲ腫瘍から単離され、Ａ５４９／ＭＤＲ細胞と５：１（Ｅ：Ｔ）の比率で共培養されたＣＤ１１ｂ+のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ。プロットは、細胞接着および増殖／死対時間に相関する正規化細胞指数を表す。（図３５Ｈ）生理食塩水またはＥＧＦＲＥＤＶ６８２処置マウスの腫瘍由来のＣＤ１１ｂ+細胞と共培養したＡ５４９／ＭＤＲ細胞の細胞溶解％は、ＣＤ１１ｂ+細胞を加えた６．５時間後に処置した。（図３５Ｉ）４Ｔ１細胞で処理した４Ｔ１腫瘍から単離したＣＤ１１ｂ+細胞の共培養におけるＭＩＰ１αの産生。データ（図３５Ｅ、３５Ｆ、３５Ｈ、および３５Ｉ）は平均±s．e．m．を表し、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの多重比較試験（図３５Ｅ、３５Ｈ、３５Ｉ）またはｔ試験（図３５Ｆ）によって分析した。

【図36】ＥＤＶ処置に対するＮＫ細胞応答を示す図である。（図３６Ａ）１０：１（Ｅ：Ｔ）比でＴ８４細胞と共培養されたＴ８４腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃヌードマウスの脾臓から単離されたＮＫ細胞のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ。プロットは、時間正規化細胞指数から計算された細胞生存率を表す。（図３６Ｂ）生理食塩水およびＥＧＦＲＥＤＶ６８２処置マウスおよびＴ８４細胞の脾臓から単離されたＮＫ細胞の共培養物におけるグランザイムＢ産生。データは平均±s．e．m．を表し、ｔ検定により分析した。（図３６Ｃ）Ａ５４９／MDR腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃヌードマウスの脾臓から単離されたＮＫ細胞のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡを、Ａ５４９／ＭＤＲ細胞と１０：１（Ｅ：Ｔ）の比で共培養した。プロットは、時間（生理食塩水ｎ＝５; ＥＧＦＲＥＤＶ６８２ｎ＝４）にわたる、正規化された細胞指数から計算された細胞生存率を表す。

【図37】患者由来膵管腺がん細胞の受容体発現および薬物感受性スクリーニングを示す図である。（図３７Ａ）腫瘍のヘッド由来の細胞のＥＧＦＲ表面受容体定量。（図３７Ｂ）腫瘍のテールからの細胞のＥＧＦＲ表面受容体定量。（図３７Ｃ）６８２感度と比較した、第１および第２のラインの化学療法薬物／薬物の組み合わせの薬物感度およびＩＣ５０。

【図38】全ＰＢＭＣプール(ＦＳＣ v ＳＳＣ)からの単一細胞を、前方散乱幅（ＦＳＣＷ）対前方散乱面積（ＦＳＣＡ）に基づいてゲートし、次いでＣＤ４５染色について分析した(ＦＳＣ v ＣＳ４５＋上のＣＤ４５＋ゲート）ことを示す図である。細胞生存率は９６％であり(Count and viability kit #C00162、Beckman Coulter、データは示さず）、死細胞は８０のＦＳＣ閾値識別器に基づいて排除された。全樹状細胞（ＤＣ）をレウコイト（ＣＤ４５＋）上にゲートし、ＨＬＡ－ＤＲ＋およびＬｉｎｅａｇｅ（＃353351、Beckman Coulter)と定義した。系統陰性マーカーは、それぞれ、Ｔ細胞、単球、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞について陰性選択するために使用される、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ５６に対して作製された同じフルオロフォア（ＰＥ）とコンジュゲートした抗体のプールから構成された。ＨＬＡ－ＤＲ＋であった残りの細胞は樹状細胞としてゲート化され、形質細胞様ＤＣ（ＣＤ１１ｃ－ＣＤ１２３＋）または抗原提示骨髄性ＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１２３－）に細分された。骨髄性ＤＣ（ｍＤＣ）は３つの主要サブセット、ＣＤ１ｃ＋ｍＤＣ１、ＣＤ１４１＋ｍＤＣ２（ここに示すＣｌｅｃ９Ａ＋）およびＣＤ１６＋ｍＤＣに分けられた。ＣＤ１４＋発現は白血球上でゲート制御された単球（＃Ｂ93604、Beckman Coulter)を定義し、その後、古典的（ＣＤ１４＋ＣＤ１６－）、中間的（ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋）および非古典的（ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋）に細分された。Ｔ細胞（＃Ｂ53328、Beckman Coulter)はＣＤ３＋で、リンパ球上でゲート制御されていた（ＣＤ４５＋ＳＳＣ低値）。次いで、CＤ３＋Ｔ細胞サブセット、Ｔヘルパー（ＣＤ４＋）および細胞傷害性Ｔ（ＣＤ８＋）を定義した。ＰＤ１＋ ＣＤ８＋ 細胞傷害性Ｔ細胞ゲートをＳＳＣに対してプロットし、ＣＤ８+ Ｔ細胞上でゲートした。全てのＦＳＣおよびＳＳＣ軸は直線であり、一方、蛍光チャネル軸（全てのＣＤマーカー）は対数または双指数関数である（「logicle」、Kaluzaソフトウェア、Beckman Coulter)。

【図39】ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ実験に使用した細胞単離物の純度を示すフローサイトメトリー分析を示す。（図３９Ａ）マウス腫瘍からのＣＤ１１ｂ+細胞の単離。イソタイプ対照vs.ＦＳＣおよびＣＤ１１ｂvs.ＦＳＣを示す密度プロット。試料は、約８０％の純度のＣＤ１１ｂ+細胞を有していた。（図３９Ｂ）マウス脾臓からのＮＫ細胞の単離。密度プロットは、ＦＳＣに対してアイソタイプ対照、ＦＳＣに対してＮＫｐ４６およびＦＳＣに対してＣＤ１１ｂを示す。試料は～９０％の純度のＮＫ細胞を有していた。（図３９Ｃ）マウススプリーンからのＣＤ８+ Tセル分離。密度プロットは、ＦＳＣに対してアイソタイプ対照、ＦＳＣに対してＣＤ３ｅ、およびＦＳＣに対してＣＤ８を示す。試料は約９０％の純度のＴ細胞（ＣＤ３ｅ+）を有し、それらのＴ細胞の９８％以上がＣＤ８+であった。

【図40】同系マウスモデル（Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける^EpＣＴ２６大腸腫瘍）における^Epミニ細胞_Doxおよびミニ細胞_α-GCを使用する組合せ処置を示す図である。

【図41】ＣＴ２６同種移植片を有するＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、^Epミニ細胞_Doxおよびミニ細胞_α-GCの併用処置が大きな腫瘍を減少させるのに効果的であることを示す図である。

【図42】ＣＴ２６同種移植片を有するＢａｌｂ／ｃマウスにおける腫瘍退縮に対する^Ｅｐミニ細胞_Doxおよびミニ細胞_α-GCの影響を示す。

【図43】（図４３Ａおよび４３Ｂ）^Ｅｐミニ細胞_Doxおよびミニ細胞_α-GC（図４３Ｄおよび４３Ｅ）ミニ細胞_α-GCのみ（図４３Ｆ）^Epミニ細胞_Dox のみ、および（図４３Ｃ）生理食塩水で処理した種々のサイズのＣＴ２６イソグラフトを示す図である。

【図44】 ^Epミニ細胞_Doxおよびミニ細胞_α-GCで処理した種々のサイズのＣＴ２６イソグラフトを示す図である。

【図45】種々の時点でのミニ細胞_α-GC処置後のＪＡＷＳＩＩ細胞のαＧＣ－ＣＤ１Ｄ提示を示す図である（図４５Ａ～Ｅ）。

【発明を実施するための形態】

【0023】

Ｉ． 概要
本発明は、（i）抗腫瘍剤およびI型インターフェロンアゴニスト;(ii)抗腫瘍剤およびII型インターフェロンアゴニスト；または（iii）抗腫瘍剤、Ｉ型インターフェロンアゴニスト、およびII型インターフェロンアゴニストの組み合わせを含む組成物であって、少なくとも抗腫瘍剤が無傷の細菌由来ミニ細胞内にパッケージされている組成物が、がん治療戦略を相乗的に改善することができるという発見に基づく。

【0024】

少なくとも抗腫瘍剤、および任意にI型および／またはII型インターフェロンアゴニストが無傷の細菌由来ミニ細胞内にパッケージされる、活性剤と免疫調節剤との組み合わせは、がん性細胞に対する劇的な効力、ならびに対象における薬物耐性発達の驚くべき欠如を生じる。記載された組成物は、I型および／またはII型インターフェロンアゴニストのような免疫調節薬と組み合わせた抗腫瘍薬の全身送達に関連する毒性を回避して、相乗的に改善されたがん治療戦略を提供する。

【0025】

がん免疫療法における最近の進歩は特定のがんにおいて、前例のない耐久性のある臨床応答をもたらした（Emensら、2017; Farkonaら、2016; OisethおよびAziz、2017; Sharmaら、2017; Ventola、2017）。しかし、現在の免疫療法戦略は様々な腫瘍型にわたって限定された成功率をもたらし、最初に時間腫瘍退縮再発を促進することを実証する患者のかなりの割合をもたらした（Emensら、2017; Mellmanら、2011; OisethおよびAziz、2017; Sharmaら、2017; Ventola、2017）。

【0026】

以下の実施例１６に記載されるデータは、腫瘍標的ナノ細胞治療の細胞－免疫療法機能の機構を解明し、ここでは、免疫系の複数のアームの係合と組み合わせた超細胞毒素の送達を介して腫瘍に対する二重攻撃を開始する。このアプローチは免疫原性腫瘍微小環境を作り出し、それにより患者に生じるかもしれない一次耐性および／または適応耐性を回避する複数の免疫細胞サブセットにも作用することにより、免疫療法による現在の落とし穴のいくつかを回避する。

【0027】

さらに、患者のサブセットは腫瘍細胞抗原の欠如または免疫細胞浸潤の欠如から生じる腫瘍免疫原性を欠き、したがって、利用可能な現在の戦略に対して初期応答を示さない（Emensら、2017; OisethおよびAziz、2017; Sharmaら、2017）。このように、新規で頑健な免疫療法アプローチの同定は、臨床転帰の有意な改善をもたらす可能性があり、依然として優先権の高い領域である。

【0028】

有効な抗腫瘍免疫応答を開始するために、特定の工程は、自発的または治療的のいずれかで達成されなければならない。第１に、腫瘍細胞死を介してインサイチュで誘導され得るか、または外因的に送達され得る腫瘍細胞抗原は樹状細胞（ＤＣ）によって取り込まれなければならない（Anguilleら、2015; Emensら、2017; Jungら、2018; Mellmanら、2011）。抗原取り込みと併せて、ＤＣは抗原の分化および増強されたプロセシングおよび提示を促す適切な成熟シグナルを受け取る必要があり、その結果、耐性とは反対の抗腫瘍機能が促進される（Anguilleら、2015; Emensら、2017; Jungら、2018; Mellmanら、2011; Simmonsら、2012）。これらの成熟した腫瘍抗原負荷ＤＣはその後、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞の産生、ＮＫおよび／またはＮＫＴ細胞応答のトリガー、およびＴ－ヘルパー１型応答の増強を介して起こり得る抗腫瘍Ｔ細胞応答を効果的に生成しなければならない（Emensら、2017; Fangら、2017; Mellmanら、2011; Sharmaら、2017; Zitvogelら、2015）。抗腫瘍Ｔ細胞は免疫抑制シグナルが存在し得る腫瘍微小環境に最終的に入らなければならず、それらの抗腫瘍機能を有効に実施しなければならない（Emensら、2017; Mellmanら、2011）。これらの工程のいずれかで生じる問題は、免疫療法の有効性を妨げ、治療の全失敗をもたらし得る(Emensら、2017; Mellmanら、2011; Sharmaら、2017)。

【0029】

現在、臨床的に最も注目されている免疫療法戦略には、免疫学的チェックポイントインヒビターおよびキメラ抗原受容体Ｔ細胞療法（CAR）が含まれる（Emensら、2017; Mellmanら、2011; OisethおよびAziz、2017; Sharmaら、2017; Ventola、2017）。細胞傷害性Tリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）およびプログラム細胞死１／プログラム細胞死１リガンド（ＰＤ／ＰＤＬ）などのチェックポイント阻害剤は免疫抑制シグナルの伝達を遮断し、腫瘍微小環境内で細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化するように刺激することによって機能する（Dineら、2017; Jenkinsら、2018; Sharpe、2017）。これらの経路の阻害剤は特定のがんにおいて劇的な臨床結果を示しているが、異なるがんにわたる全体的な応答率は依然として低く（～15－25％）、これらの治療に関連する免疫関連毒性は高い可能性がある(Dineら、2017; Emens ら、2017; Jenkins ら、2018; Sharpe、2017; Ventola、2017）。新たなチェックポイントが潜在的免疫ターゲットとして継続的に発見されていることにより、免疫抑制経路の精巧で多様なセットを利用することが可能であることは明らかである（Dineら、2017; Emensら、2017; Farkonaら、2016; Jenkinsら、2018; Sharpe、2017）。したがって、チェックポイント阻害剤に対する耐性の開発はハードルであり続けており、これらの問題を克服するために複数のチェックポイント阻害剤の組み合わせを利用する試みがなされているが、これはしばしば関連する毒性を悪化させる(Dineら、2017; Jenkinsら、2018; Sharmaら、2017;Ventola、2017）。

【0030】

広く注目されている第２の治療は定義された腫瘍抗原特異性を有し、標的腫瘍細胞の殺傷を開始するために強力なＴ細胞活性化を誘発することができる膜融合受容体を発現するための患者のＴ細胞の遺伝子操作を伴うＣＡＲＴ細胞治療である（D’Aloiaら、2018’; Farkonaら、2016; Mellmanら、2011; Sharmaら、2017）。この治療アプローチは「液体」血液がんの治療において、前例のない臨床結果をもたらしたが、現在まで、良好な特異的抗原標的の欠如、腫瘍へのホーミング不良、腫瘍への溢出不良、および敵対的腫瘍微小環境内での持続性の欠如に関連する限界に起因して、固形悪性腫瘍を標的とする際に同等の応答をもたらさなかった（D’Aloiaら、2018’; Sharmaら、2017）。重度に前処置された患者からのリンパ球の利用可能性および長い製造時間に関連する実用的な限界も存在し、急速に進行する疾患を有する患者にとって実行可能な治療選択肢ではない（OisethおよびAziz、2017; Rezvaniら、2017）。

【0031】

EnGeneIC Dream Vector (ＥＤＶ)は細菌における細胞分裂の極性部位を再活性化することによって生成される、直径４００±２０nmの非生存ナノ細胞からなる細菌由来の送達系である（MacDiarmidら、2007b）。これらのナノ細胞は細胞傷害性薬物、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡでパッケージ化され得、ナノ細胞の表面多糖への二重特異性抗体の付着を介して腫瘍細胞表面受容体に特異的に標的化され得ることが実証されている（MacDiarmidら、2009; MacDiarmidら、2007b; Reidら、2013）。マウスおよびイヌの研究における静脈内投与後はそれらのサイズのために血管系に保持されているが、その後、腫瘍関連漏出
性血管系を介して腫瘍に急速に溢出していることが実証されている（MacDiarmidら、2007b; Sagnellaら、2018）。関連する二重特異性抗体を介する腫瘍細胞表面受容体の結合はエンドソームへのマクロピノサイトーシス、およびリソソームにおける細胞内の変性赤血球を介するペイロードの放出をもたらす（MacDiarmidら、2009; MacDiarmidら、2007b; Sagnellaら、2018）。これらのナノ細胞治療の安全性は３つの第I相臨床試験で実証されており、様々な末期がん患者には１０００回を超える用量が投与され、６８２の負荷ＥＤＶが現在第I相試験で患者に送達されており、これまでに有望な安全性プロフィールが示されている（2017; Kaoら、2015; Solomonら、2015; van Zandwijkら、2017; Whittleら、2015）。
Ａ． 細菌のミニ細胞デリバリー法の概要
がん細胞に化学療法剤を送達するための細菌ミニ細胞の使用は、以前に記載されている。がんを治療するためのこの送達方法は、毒性化学療法剤もしくは薬物、または機能性核酸を、典型的には直径約４００nmである細菌由来ミニ細胞にパッケージ化する。典型的には、ミニ細胞が特異的がん細胞を標的とする抗体を有する。この抗体はがん細胞の表面に結合し、ミニ細胞はがん細胞によって細胞内に取り込まれる。このようにして、毒性化学療法剤は全身に広く分布せず、したがって、毒性薬物または化合物ががん細胞内に送達されるにつれて、副作用および不耐性の機会を減少させる。毒性化学療法剤の送達ビヒクルとして抗体標的化ミニ細胞を用いると、がん細胞を死滅させるのに必要な薬物がはるかに少なくなり、したがって治療指数が改善される。

【0032】

実際に、本発明者らは、ミニ細胞（またはEnGeneICドリームビヒクル、ＥＤＶ）がマウス（実施例１）、イヌ（実施例２）、およびサル（実施例３）における異種移植腫瘍に、パクリタキセルまたはドキソルビシンなどの化学療法薬を送達し得ることを示した。標的送達はがん細胞が化学療法剤の大部分を受け取り、低レベルの毒性を生じることを確実にする。実施例１～３を参照されたい; MacDiarmidら、2007b；MacDiarmidら、2007a; MacDiarmidら、2009；およびMacDiarmidら、2016も参照されたい。さらに、ミニ細胞は、異種移植モデルにおいて有意な免疫応答を誘導せず、ミニ細胞は忍容性が良好である（実施例４）。したがって、無傷の細菌由来ミニ細胞は、進行固形腫瘍を標的としたドキソルビシン（実施例５）、膠芽腫を標的としたドキソルビシン（実施例６）、および中皮腫を標的としたＭｉｃｒｏＲＮＡ－１６ａ（実施例７）を含む例を有する、患者に抗がん剤を送達するための十分に許容されるビヒクルである。

【0033】

しかしながら、これらの治療戦略は、全ての患者において、全てのがんの完全寛解または治癒をもたらさなかった。したがって、がん治療療法の改善が必要とされている。本発明者らは、３つの異なるタイプのペイロードを有するミニ細胞の組み合わせを使用すると、驚くほど劇的かつ有効な臨床効果が得られることを発見した。

【0034】

具体的には本発明者らがインターフェロンＩ型アゴニストおよび／またはインターフェロンII型アゴニストを含むミニ細胞と組み合わせた化学療法剤（例えば、以下の実施例において、薬剤はＰＮＵ１５９６８２、超毒性化学療法剤である）を含むミニ細胞が相乗的な抗腫瘍効果をもたらし、後期膵臓がんに罹患している患者によって十分に耐えられることを発見した。実施例１２を参照されたい。実際、後期膵臓がん患者はこの治療後に著しく改善された生活の質を示し、これは、その段階の患者にとって顕著である。このトリプル・オブ・デュル・コンビネーション戦略は、がんの治療を相乗的に改善するものである。本発明者らはまた、インターフェロンII型アゴニストを含むミニ細胞と組み合わせた化学療法剤を含むミニ細胞が、相乗的な抗腫瘍効果を生じることを発見した。

【0035】

また驚くべきことに、II型インターフェロンアゴニストとの併用、およびＩ型インターフェロンアゴニストがない場合に、ミニ細胞パッケージ化抗腫瘍薬の２剤併用により、大きなサイズの腫瘍に対して劇的な有効性もたらされることが発見された。このような結果は、以前には記載されていない。一部の患者では、Ｉ型インターフェロンアゴニストとII型インターフェロンアゴニストを併用すると、２種類のインターフェロンアゴニストが相乗的に作用するのではなく競合的に作用する可能性があるため、逆効果となる可能性があると仮定されている。このデータについては、以下で詳しく説明する。

【0036】

以下の説明はこれらの発見に関連する本発明を概説するが、本発明を、記載される特定の実施形態、方法論、プロトコル、または試薬に限定するものではない。同様に、ここで使用される用語は特定の実施形態のみを記載し、本発明の範囲を限定するものではない。

【0037】

Ｂ． 実験結果のまとめ
(i) ミニ細胞中にパッケージ化化された抗悪性腫瘍剤とミニ細胞パッケージ化Ｉ型インターフェロンアゴニストとの併用
第１の実施形態では、細菌ミニ細胞にパッケージされたＩ型インターフェロンアゴニストと組み合わせた細菌ミニ細胞パッケージされた抗腫瘍剤の組み合わせに関する組成物および方法が記載される。

【0038】

実施例１１および図１８は以下の表に要約されるように、種々のミニ細胞（ＥＤＶ）組成物で処置されたマウスにおける肺がん異種移植片モデルにおける結果を示すデータを記載する。グループ１および５の動物に、無傷の細菌由来ミニ細胞中にパッケージされた化学療法剤（ＰＮＵ１５９６８２）と、無傷の細菌由来ミニ細胞中にパッケージされたI型インターフェロンアゴニスト（４０mer二本鎖ＤＮＡまたは５０mer二本鎖ＤＮＡ）との組み合わせを投与した。全てのミニ細胞組成物は、腫瘍増殖の安定化をもたらした。しかしながら、最も劇的な結果は、実験のパート１における生理食塩水処理から生じた大きな腫瘍サイズを処理した後に得られた。その後、生理食塩水処理対照群を、ミニ細胞パッケージ化抗腫瘍剤とミニ細胞パッケージ化I型インターフェロンアゴニストとの組み合わせを含む組成物で実験の第２部において処理した場合、腫瘍サイズは、５日間にわたって６２％減少した。

【0039】

【表1】

実施例１１の追跡調査ではミニ細胞にパッケージされたＩ型インターフェロンアゴニストの追加が劇的な腫瘍サイズ減少をもたらし、これはミニ細胞にパッケージされた抗腫瘍剤をＩ型インターフェロンアゴニスト免疫賦活剤の非存在下で使用した場合には見られなかった。結果を以下の表にまとめる。これらの結果は、ミニ細胞パッケージ化Ｉ型インターフェロンアゴニストの添加によるミニ細胞パッケージ化抗腫瘍剤に対する免疫賦活剤効果を明らかに実証する。

【0040】

【表2】

(ii) ミニ細胞パッケージされたI型インターフェロンアゴニストおよび任意選択でII型インターフェロン作動薬（ミニ細胞パッケージではない）とミニ細胞パッケージ化抗悪性腫瘍剤との併用
第２の実施形態は、ミニ細胞パッケージ化Ｉ型インターフェロンアゴニストまたはミニ細胞パッケージ化抗悪性腫瘍剤と、ミニ細胞パッケージ化Ｉ型インターフェロンアゴニストおよびII型インターフェロンアゴニスト（細菌ミニ細胞を含まない）とを組み合わせたミニ細胞パッケージ化防新生物剤を使用する方法および組成物を対象とする。

【0041】

本発明の組成物の劇的かつ驚くべき有効性のさらなる証拠は、実施例１２に示される臨床結果に反映される。具体的には、実施例１２が（1）ミニ細胞パッケージ化抗腫瘍剤とミニ細胞パッケージ化Ｉ型インターフェロンアゴニストとの組み合わせ；および（2）ミニ細胞パッケージ化抗腫瘍剤、ミニ細胞パッケージ化Ｉ型インターフェロンアゴニスト、およびII型インターフェロンアゴニストの組み合わせを含む組成物で進行固形腫瘍を患う患者を処置した場合に起こったことに関する。

【0042】

特に、実施例１２に詳述されるヒト臨床データは、ヒト患者におけるミニ細胞パッケージ化抗腫瘍剤の免疫賦活剤として使用されるI型およびII型ＩＦＮアゴニストの安全性プロフィールを実証する。無傷の細菌由来ミニ細胞にパッケージ化されたI型インターフェロンアゴニストが４０mer二本鎖ＤＮＡ（ＥＤＶ_40mer）または６０mer二本鎖ＤＮＡ（ＥＤＶ_60mer）であった以下の表３のデータを参照されたい。
さらに、他のすべての治療選択肢を使い果たしたステージ４の膵臓がん患者で得られた結果は顕著であった。患者の腫瘍マーカー（ＣＡ １９－９）の量は最初の３回の投与後に９０％以上低下し、これはわずか１０日間の治療に相当した。１０回投与後、これはさらに低下し、腫瘍マーカー値はほぼ９５％低下した。この患者はまた、ＩＶ期膵がんを呈するほとんどの患者が経験する悪液質状態とは対照的に、有意な体重増加を示し、生活の質の顕著な改善を報告した。これらの結果は、特に進行膵がんに伴う予後不良を考えると劇的である。
要約すると、５例が^EGFR(5)ＥＤＶ_PNU/Doxまたは^EGFR(V)ＥＤＶ_PNU+ＥＤＶ_40mer/60mer(I型ＩＦＮアゴニスト）±Imukin（II型ＩＦＮアゴニスト）の計６９回を受けた。治療は忍容性が良好であり、免疫調節免疫賦活剤の添加は、単剤負荷ＥＤＶおよび標的ＥＤＶの安全性プロファイルを変化させないようであった。

【0043】

【表3】

(iii)ミニ細胞パッケージ化抗悪性腫瘍剤のII型インターフェロンアゴニストとの併用
実施例１３は、ミニ細胞にパッケージされた抗新生物剤をII型インターフェロンアゴニスト、例えばＩＦＮ－γと組み合わせることの有効性を評価するために実施された種々の研究の結果を記載している。結果は、II型インターフェロンアゴニストの追加が肺がんおよび乳がんを含む種々のがんの異種移植モデルにおいてミニ細胞にパッケージされた抗新生物剤の抗がん効果を増強または増強することを示す。さらに、実施例１３に記載され、以下の表４に抜粋されるデータは、抗腫瘍剤単独に通常耐性である腫瘍の処置において、ミニ細胞中にパッケージされた抗腫瘍剤を含む組成物へのII型インターフェロンアゴニストの添加が腫瘍安定化を達成するために必須であることを実証する。したがって、ミニ細胞パッケージ化抗腫瘍剤をII型インターフェロンアゴニストと組み合わせることにより、薬物耐性を克服することができる。

【0044】

【表4】

(iv) ミニ細胞パッケージ化抗腫瘍剤、ミニ細胞パッケージ化I型インターフェロンおよびII型インターフェロンアゴニスト(単独またはミニ細胞パッケージ化のいずれか)の三剤併用
本発明者らはまた、ミニ細胞パッケージ化抗腫瘍剤、ミニ細胞パッケージ化I型インターフェロンアゴニスト、およびII型インターフェロンアゴニスト（単独またはミニ細胞パッケージ化のいずれか）の三重組み合わせが、劇的な抗がん効果を生じ得ることを発見した。具体的には、実施例１４が後期内因性腫瘍（脳がん、肉腫、またはメラノーマ）を有するイヌの処置を、ミニ細胞パッケージ化抗腫瘍剤、ミニ細胞パッケージ化I型インターフェロンアゴニスト、およびII型インターフェロンアゴニストの組合せで詳述する。結果は、組み合わせ組成物が十分に耐性であったことを示す。さらに、７匹の評価可能な動物のうち６匹（８５．７％）では疾患は安定化したが、１匹のイヌはほぼ部分奏効（腫瘍サイズの２９．８％の縮小）を達成した。

【0045】

(v) Ｉ型インターフェロン不存在下の、ミニ細胞パッケージ化抗腫瘍剤およびミニ細胞パッケージ化II型インターフェロンアゴニストの二剤併用
別の実施形態では、本発明がミニ細胞パッケージ化抗腫瘍薬と、ミニ細胞パッケージ化II型インターフェロンアゴニスト、例えばα－ガラクトシルセラミド（α－ＧＣ）との組み合わせを含み、Ｉ型インターフェロンアゴニストの非存在下で、驚くべき抗がん効果を示す発見に基づく組成物に関する。

【0046】

特に、実施例２３は、腫瘍に対するミニ細胞含有治療薬およびミニ細胞含有インターフェロンII型アゴニストの二重組合せの効力を示すデータを記載する。この結果は、インターフェロンＩ型アゴニストを欠く組成物が腫瘍を効果的に処置するために使用され得ることを実証する。図４０および図４２も参照されたい。実験結果は、生理食塩水および^Epミニ細胞_Dox処置と比較して、^Ｅｐミニ細胞_Dox＋ミニ細胞_α-GC（インターフェロンII型アゴニスト）を受けた併用処置群について、腫瘍進行の顕著な停止を示した。この結果は^Epミニ細胞_Doxに、ミニ細胞_α-GC処理を追加することにより、免疫賦活剤効果の理論を支持する。

【0047】

さらなるデータは、生理食塩水処置対照腫瘍が薬物およびα－ＧＣＥＤＶ媒介二重併用療法（図４１）；例えば、ミニ細胞パッケージ化抗腫瘍剤とミニ細胞パッケージ化II型インターフェロンアゴニストとの組み合わせへの処置変更後に劇的な腫瘍退行を実証したことを示した。特に、８００mm³に達した腫瘍は３日間で６００³mm未満のに低下し、短期間で顕著な腫瘍径の縮小（～２５％）が認められた。二重組合せ組成物が短期間で大きな腫瘍を劇的に減少させる能力は、本発明以前には知られていなかった。

【0048】

本発明の１つの実施形態において、二重組み合わせ組成物（例えば、ミニ細胞パッケージ化抗腫瘍剤をミニ細胞パッケージ化インターフェロンII型アゴニストと組み合わせたもの）は、腫瘍のサイズ（大きな腫瘍のサイズを含む）を、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％減少させ得る。約３日、約５日、約１週間、約２週間、約３週間、約１
、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２カ月、約１．５年、約２年以上のような、任意の適切な時間にわたって、細胞サイズの減少を測定することができる。

【0049】

Ｃ． 免疫療法のデータ
実施例１６は、腫瘍細胞表面受容体に標的化されたミニ細胞パッケージ化抗腫瘍剤が、がん免疫療法、例えば、細胞－免疫療法として機能することを実証するデータを詳細に記載する。特に、実施例は、マクロファージ、ＮＫ細胞および樹状細胞を含む自然免疫系の細胞を活性化する細菌ミニ細胞の能力を例示する。これに続いて樹状細胞の成熟と抗原提示が起こり、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞が産生され、さらなる免疫細胞の腫瘍微小環境への動員をもたらす適応Ｔ細胞応答が起こる。このアプローチは免疫原性腫瘍微小環境を作り出し、複数の免疫細胞サブセットにも作用することで、患者に生じる可能性のある原発性および／または適応抵抗性を回避することによって、免疫療法による現在の落とし穴の一部を回避するものである。

【0050】

したがって、この例は細菌ミニ細胞が腫瘍細胞内に細胞傷害性薬物を送達し、同時に、腫瘍を特異的に標的とする自然免疫応答および適応免疫応答を誘発する能力を示す。

【0051】

さらなる免疫療法データを実施例１８に示し、これは、ＮＫ細胞が抗新生物剤を含む標的ミニ細胞での処置に続いてインビボで抗腫瘍表現型を採用することを示すデータを記載する。これは、ＮＫ細胞が先天性免疫系の主要なエフェクター細胞であり、活性化シグナルと阻害シグナルとのバランスによって厳密に調節されるので、有意である(Morvan and Lanier、2016; Wallace and Smyth、2005）。ＮＫ細胞機能の障害は腫瘍発生、増殖、および転移の増加と関連しており、したがって、抗腫瘍免疫応答に寄与することにおけるその重要性は十分に実証されている（Fangら、2017; MorvanおよびLanier、2016; Rezvaniら、2017; WallaceおよびSmyth、2005）。

【0052】

興味深いことに、実施例１９は、腫瘍微小環境内の主にＴｈ１サイトカイン応答がミニ細胞カプセル化抗腫瘍剤（例えば、ＰＮＵ１５９６８２）での処置後に示されることを示すデータを詳細に示す。腫瘍微小環境内のサイトカインおよびケモカイン産生は、免疫細胞が相互に効果的に連絡して、腫瘍促進または抑制のいずれかであり得る協調応答を生成することを可能にするBelardelliおよびFerrantini、2002; LeeおよびMargolin、2011）。個々のサイトカインの免疫応答への影響は、局所濃度、サイトカイン受容体発現パターン、周囲の細胞の活性化状態など、様々な因子に依存している(Lee and Margolin、2011）。従って、多くのサイトカインは腫瘍増殖に対する反対の効果を引き出すことができることが示されている（Dredgeら、2002; Landskronら、2014; LeeおよびMargolin、2011）。

【0053】

さらに、実施例２０はミニ細胞カプセル化抗腫瘍剤（例えば、ＰＮＵ１５９６８２）での処置が腫瘍特異的ＣＤ８+ Ｔ細胞の産生を生じることを示すデータを詳述する。最初のインビトロ実験は、ＥＤＶ処理が効果的な化学療法剤を負荷された標的化ＥＤＶに応答して、直接的相互作用または細胞死の結果のいずれかを介して樹状細胞成熟をもたらし得ることを示した。従って、この試験は、この結果がインビボでのＤＣ成熟および抗原提示に翻訳され得、腫瘍特異的ＣＤ８⁺ 細胞傷害性Ｔ細胞の産生を生じるかどうかを試験することを目的とした。結果として得られたデーターは、ミニ細胞処理が腫瘍特異的ＣＤ８⁺ Ｔ細胞の産生を首尾よく誘発したことを実証した。さらに、全Ｔ細胞数（ＣＤ３＋）の有意な増加、ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８+ Ｔ細胞数の両方の有意な増加がミニ細胞カプセル化抗腫瘍剤（例えば、ＰＮＵ１５９６８２）で処置されたマウスのリンパ節において見られた（図３１Ｇ）。処理されたマウスのリンパ節における成熟樹状細胞の有意な増加も検出され（図３１Ｈ）、４Ｔ１細胞で処理されたマウスから単離されたＣＤ８⁺ Ｔ細胞間の相互作用の可視化は、これらのＴ細胞が腫瘍細胞にペルフォリン（緑色）を付着させ、そこに排出することができることを示している（図３１Ｉ）。

【0054】

実施例２１は抗腫瘍剤（例えば、スーパー細胞毒素ＰＮＵ１５９６８２）を負荷した標的化細菌ミニ細胞が、この薬物を腫瘍部位に効果的に送達するだけでなく、多数の免疫細胞サブセットを刺激することによって免疫療法剤として挙動する能力を実証する。実施例は、マクロファージ、ＮＫ細胞およびＣＤ８⁺Ｔ細胞を含む免疫細胞サブセットを、腫瘍細胞を効果的に排除することができる抗腫瘍表現型に向かって押すための、ミニ細胞カプセル化抗腫瘍剤処理の能力を実証する。抗腫瘍薬の有効性と組み合わせると、腫瘍に対する二重の攻撃をもたらす。

【0055】

がん免疫療法の概念は数十年前後であったが、その可能性が多くの免疫療法の承認によって実現され始めたのは最近のことである（Farkonaら、2016; Ventola、2017）。細菌性ミニ細胞は腫瘍への直接的な細胞毒性剤の送達を介して最初に免疫原性腫瘍微小環境を作り出し、そこで抗腫瘍表現型に向けて直接的または間接的に自然免疫系を刺激する、独特の複合細胞免疫療法である。次いで、この先天性免疫活性化は、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞が生じる適応応答を誘発する（図３３）。

【0056】

静脈内投与後、ミニ細胞は腫瘍の漏出性血管系を介して腫瘍に溢出し、ここで、それらの毒性ペイロードを有する標的化ミニ細胞の投与用量の３０％以上が２時間以内に腫瘍微小環境に直接沈着する（MacDiarmidら、2007b）。標的細菌ミニ細胞は、腫瘍細胞上の受容体に結合し（実施例２１の場合、４Ｔ１およびＣＴ２６Ｅｐ１２．１）、次いで、それらの負荷（抗腫瘍剤）を腫瘍細胞内に直接的に効果的に送達する。ＰＮＵ１５９６８２は、腫瘍細胞に送達されてから２４時間以内に迅速なアポトーシスを生じる非常に強力な超細胞毒である（図３３Ａ）。次いで、細菌ミニ細胞（例えば、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２）処理によって産生されるアポトーシス細胞およびＤＡＭＰシグナルは腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）などの自然免疫細胞と相互作用し、ＣＤ８６のアップレギュレーションおよびＴＮＦαおよびＩＬ-６などのＴｈ１炎症誘発性サイトカインの産生を刺激することができる（図３３Ｂ）。これらの変化は腫瘍細胞を溶解し、サイトカインを放出して他の免疫細胞サブセットの活性化をシグナル伝達することができるマクロファージのＭ１分極の典型であり、したがって抗腫瘍特性を有することが示されている（Sawa－WejkszaおよびKandefer－Szerszen、2018; Yuan ら、2015）。

【0057】

さらに、細菌ミニ細胞自体も、同様のＭ１分極を産生するＴＡＭと直接相互作用することができるが、これは現在の系において非常に低いレベルで起こることが予想される。ＴＡＭは一般に、腫瘍微小環境において最も豊富な免疫細胞であり、ＴＡＭの数の増加は、予後不良および腫瘍増殖の増加と関連することが実証されている（Sawa－WejkszaおよびKandefer－Szerszen、2018）。これはＴＡＭの大部分が腫瘍促進特性を有することが示されている抗炎症性Ｍ２マクロファージからなるが、炎症性Ｍ１マクロファージは抗腫瘍特性を示すという事実によるものである（Sawa－WejkszaおよびKandefer－Szerszen、2018; Yuan ら、2015）。実施例２１は、４つの異なる腫瘍モデルにおいて、細菌ミニ細胞処理が腫瘍微小環境内のＭ１：Ｍ２バランスをシフトさせる能力を示す。異なる腫瘍モデルにおけるこのシフトの程度の差にもかかわらず、Ｍ１極性化の増加は、細菌ミニ細胞で処理されたマウスの腫瘍から単離されたＴＡＭによる腫瘍細胞溶解の増加に翻訳されることが示された。Ｍ１への表現型シフトに加えて、細菌ミニ細胞処置マウスの腫瘍からのＴＡＭはまた、免疫細胞動員、特にＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞による腫瘍浸潤を促進するのに関与することが確立されているケモカインであるＭＩＰ－１αの増加量を分泌した（図３３Ｃ）（Allenら、2018）。

【0058】

ＴＡＭ活性化に加えて、未成熟樹状細胞（ＤＣ）は細菌ミニ細胞と直接相互作用するか、より可能性が高いが、細菌ミニ細胞処理腫瘍によって産生されたアポトーシス細胞およびＤＡＭＰシグナルと相互作用し、樹状細胞の成熟および抗原提示のためのリンパ節への移動をもたらす。ＤＣは最も効果的な抗原提示細胞であることが知られており、自然免疫系と適応免疫系の橋渡しを構成するため、がん免疫療法における潜在的標的として探求されている（Allenら、2018）。

【0059】

ＤＣに基づく免疫療法のための最新の戦略はＤＣまたはＤＣ前駆体のエクスビボ操作およびプライミングを含むが、この戦略の成功は免疫寛容の発生、不十分な数のＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の誘導、または不十分な抗腫瘍効力を有するもの、および腫瘍微小環境の抑制性質を含む様々な因子のために限定されている（Anguilleら、2015; Jungら、2018; Landskronら、2014; OisethおよびAziz、2017）。細菌ミニ細胞処理は死にかけている腫瘍細胞（図３３Ｄ）に応答して、腫瘍微小環境内のＤＣのインビボでのプライミングおよび成熟を可能にし、未成熟ＤＣは、標的化され、薬物負荷された細菌ミニ細胞に応答して産生されるＤＡＭＰおよび／またはアポトーシス性腫瘍細胞体を取り込むことができる。次に、これらのＤＡＭＰおよび死につつある腫瘍細胞は、ＭＨＣクラスＩおよびII分子を介してＤＣ表面上の抗原提示のために処理され、同時にＤＣ成熟が起こる。ＤＣ成熟プロセスのマーカーとして同定された共刺激分子ＣＤ８６、ＣＤ８０およびＭＨＣクラスIIのアップレギュレーションは細菌ミニ細胞処置マウスの腫瘍排液リンパ節において検出される成熟ＤＣのパーセンテージの増加と共に、細菌ミニ細胞処置腫瘍細胞と共培養されたＤＣにおいて生じることが示された（Anguilleら、2015; Cauwelsら、2018; Simmonsら、2012）。成熟過程の間、ＤＣはＴ細胞への抗原提示のために腫瘍排出リンパ節に移動し、それによって、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞および腫瘍に対する適応免疫反応を開始する腫瘍特異的ＣＤ８⁺ＣＴＬの産生を増加させる（図３３Ｅ）。続いて、細菌ミニ細胞処理腫瘍細胞と共培養したＤＣによるＩＦＮα／β、ＴＮＦα、ＩＬ－１２ｐ４０、およびＩＬ－６の産生の増加が検出され、さらに４Ｔ１及びＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍モデルの両方で観察された腫瘍微小環境におけるＩＦＮα濃度の有意な増加が認められた（実施例２１）。腫瘍微小環境内の１型ＩＦＮ（ＩＦＮα／βおよびＩＦＮ刺激遺伝子の発現レベルは良好な疾患転帰と相関することが示されており、実際には、免疫療法を含むがん治療の成功に必要である可能性さえある（Cauwelsら、2018年; Fitzgerald-BocarslyおよびFeng、2007年; Zitvogelら、2015年）。1型ＩＦＮの抗腫瘍活性はＤＣ、ＴおよびＢリンパ球、ＮＫ細胞、およびマクロファージの免疫細胞活性化を介して間接的に生じる（Cauwelsら、2018; Fitzgerald-BocarslyおよびFeng、2007; Showalterら、2017; Zitvogelら、2015）。

【0060】

マクロファージおよびＤＣ抗腫瘍機能を増強することと併せて、抗腫瘍剤を含む細菌ミニ細胞での処置は、ＮＫ細胞活性化を誘発し得、増加した細胞毒性をもたらす（図３３Ｆ）。ＮＫ細胞は抗原非方法悪性細胞を溶解する固有の能力を有するため、宿主への有害な影響の可能性を避けるために、その活性化および機能状態を厳密に制御しなければならない。ＮＫ細胞を誘引し、腫瘍微小環境内でＮＫ細胞を活性化する能力は、その抗腫瘍機能を発揮する能力に不可欠である。Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処理腫瘍の微小環境において有意に増加するＩＬ－２、ＩＦＮγ、およびＩＦＮαを含むサイトカインはサイトカイン産生の増加および細胞溶解機能の増強の両方に向かってＮＫ細胞を活性化することが知られている（Fangら、2017年; FerlazzoおよびMunz，2004年; LeeおよびMargolin，2011年; MorvanおよびLanier，2016年; Rezvaniら、2017年）。実際、証拠は１型ＩＦＮがＮＫ細胞毒性の活性化に必要であることを示す（FerlazzoおよびMunz、2004; Mullerら、2017）。さらに、１型ＩＦＮは細胞老化を誘導し、続いて腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンド発現のアップレギュレーションを誘導し、それによってＮＫ細胞によるそれらの排除を促進することができる（Mullerら、2017）。ＮＫＧ２Ｄ受容体のアップレギュレーションはＥｐ－ＥＤＶ－６８２で処理したマウスの腫瘍内のＮＫ細胞で観察され、この受容体はＥｐ－ＥＤＶ－６８２処理マウスから単離したＮＫ細胞の細胞溶解能力に有意に寄与することが実証された。さらに、未成熟、中間および成熟マウスのＮＫ細胞はケモカインＭＩＰ１αおよびＲＡＮＴＥＳに結合できるＣＣＲ１およびＣＣＲ５ケモカイン受容体の両方を発現しており、いずれもＥｐ－ＥＤＶ－６８２を投与した腫瘍のほか、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２を投与したマウスのマクロファージおよびＮＫ細胞によってアップレギュレートされている（BeＲＮＡrdiniら、2016年）。

【0061】

ＭＩＰ１αおよびＲＡＮＴＥＳなどのケモカインは腫瘍微小環境へのＮＫ細胞、マクロファージ、およびＴ細胞を含むヘルパーおよびエフェクター免疫細胞のさらなる動員に関与する（図３３Ｇ)(Allenら、2018; Bernardiniら、2016; Zibertら、2004）。マクロァージ、ＮＫ細胞、およびＤＣを包含するＥＤＶ処理による最 初の先天性免疫応答に続いて、適応免疫応答がマウントされ、そこでは腫瘍特異的CTLおよびＴ－ヘルパー細胞が産生され、次いで腫瘍部位に動員される（図３３Ｈ）。腫瘍特異的CTLは次に、標的化された、薬物負荷ＥＤＶと組み合わせて他の免疫細胞サブセットによって作り出された、優先抗腫瘍環境にさらに寄与して、腫瘍細胞を標的化し、溶解する。標的化された薬物負荷ＥＤＶ治療は腫瘍微小環境内のＴｈ１サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、およびＩＬ－６）の増加によって証明されるように、主にＴｈ１反応を誘発する。前述したように、先天性免疫細胞サブセットは、活性化されると、これらの特定のサイトカインの１つ以上の主要な供給源となる。Ｔ細胞は同様に、前述のサイトカインの全てを産生し得る（BelardelliおよびFerrantini，2002; LeeおよびMargolin，2011）。これらのサイトカインの先天性免疫細胞またはＴ細胞のいずれかによる放出はさらなる免疫細胞の同時刺激、活性化、増殖、および増加した抗原提示に関与し、免疫系の抗腫瘍活性をさらに増強するフィードバックループを作り出す（図３３Ｉ)(LeeおよびMargolin，2011）。

【0062】

細菌ミニ細胞治療は腫瘍部位に直接従来のおよび新規の薬物療法を送達し、続いて抗腫瘍免疫応答を誘発することが可能な独特のがん治療戦略を表す。腫瘍に対する二重の攻撃が起こり、まず、送達された治療に応答して細胞死を経て、続いて適応免疫応答を導く自然免疫細胞活性化が起こる。この種の治療法には、免疫細胞の活性化がインビボでも主に腫瘍部位で起こるという点で、現在の免疫療法戦略よりも一定の利点があり、これは急速に変化する動的環境である。さらに、免疫原性腫瘍環境を作り出し、それらの腫瘍に対する免疫応答または単一の免疫細胞サブセットのみを標的とする治療への適応をほとんど示さない患者に関連する問題を回避して、複数の免疫細胞サブセットに対する効果を誘発する。実施例２１に記載の研究は新規のがん免疫治療薬としての細菌ミニ細胞の可能性を強調し、将来の細菌ミニ細胞製剤はペイロードおよび標的化能力の両方に関してこの技術の汎用性を考慮して、その固有の免疫原性をさらに活用することができる（MacDiarmidら、2007a）。

【0063】

Ｄ． 超毒性抗悪性腫瘍剤
実施例１７は化合物に関連する重篤な毒性のために従来の手段を使用して送達することができない、超毒性抗腫瘍剤、例えばＰＮＵ１５９６８２の有効な送達を実証するデータを詳述する。具体的には実施例１７がｐＭ範囲の薬物耐性がん細胞であっても、ＰＮＵ１５９６８２がＩＣ５０を有する超細胞毒素である方法を詳述し（Quintieriら、2005）、これは重篤な全身毒性のために化合物を臨床的に使用することができないことを意味する（StaudacherおよびBrown、2017）。しかし、細菌ミニ細胞中にカプセル化される場合、ＰＮＵ１５９６８２のようなスーパー細胞毒素は、ほとんど副作用を伴わずに腫瘍に効果的に送達され得る。

【0064】

ＩＩ．構成要素
上記のように、本発明の組成物は、少なくとも２つの異なる活性剤、抗腫瘍剤およびＩ型インターフェロンアゴニスト、II型インターフェロンアゴニスト、またはＩ型インターフェロンアゴニストおよびII型インターフェロンアゴニストと抗腫瘍剤との両方を含む。３つの異なる活性剤は、１つ、２つ、または３つの異なるミニ細胞にパッケージ化することができる。II型インターフェロンアゴニストはまた、ミニ細胞にパッケージされることなく、本発明の方法および組成物に含まれ得る。

【0065】

Ａ．がんの治療に有用な抗腫瘍活性剤または細胞傷害活性剤
「抗悪性腫瘍剤」とは、化学的、生物学的なものであるかにかかわらず、腫瘍細胞の増殖、発生、成熟又は拡散を阻止又は阻害する医薬品をいう。「抗悪性腫瘍剤」とは「抗悪性腫瘍剤」及び「化学療法剤」と互換的に使用されるものである。
本開示の文脈において、所定の脳腫瘍患者を治療するための抗腫瘍剤を選択することは、従来の医療行為と一致して、いくつかの因子に依存する。これらの因子には患者の年齢、カルノフスキー・スコア、および患者が受けた可能性のあるあらゆる治療歴が含まれるが、これらに限定されない。一般に、神経腫瘍学の原則と実践、M.Mehta(Demos Medical Publishing 2011）、および神経腫瘍学の原則、DSchiffおよびPO’Neill, edsを参照のこと。（McGraw－Hill 2005）。

【0066】

組成物は、多くとも約１mgの抗腫瘍薬または化学療法薬を含むことができる。あるいは、化学療法薬の量が多くとも約７５０μg、約５００μg、約２５０μg、約１００μg、約５０μｇ、約１０μｇ、約５μｇ、約１μｇ、約０．５μｇ、または約０．１μｇであり得る。別の態様では、組成物がミニ細胞にパッケージ化されずに使用される場合、薬物の治療有効量の約1／1,000未満、あるいは約1／2,000、1／5,000、1／10,000、1／20,000、1／50,000、1／100,000、1／200,000または1／500,000未満の量を有する化学療法薬物を含む。本開示のさらに別の態様によれば、組成物は、少なくとも約１nmolの化学療法薬を含むことができる。したがって、本開示はまた、化学療法薬の量が、それぞれ、少なくとも約２nmol、約３nmol、約４nmol、約５nmol、約１０nmol、約２０nmol、約５０nmol、約１００nmol、または約８００nmolである実施形態を包含する。

【0067】

本開示の文脈において、所与の腫瘍を処置するための抗腫瘍剤の選択は、いくつかの因子に依存する。これらの因子には患者の年齢、腫瘍の病期、および何であれ患者が受けた可能性のある過去の治療法が含まれるが、これらに限定されない。

【0068】

本開示によれば、薬物は無傷の細菌由来ミニ細胞にパッケージ化するために、以下に詳述されるクラスのうちの１つから選択され得る。これらの薬物はまた、薬物設計および発明努力から設計された合成類似物でもあり得る。任意の公知の化学療法剤が、本発明の組成物において利用され得る。公知の化学療法剤の例にはこれらに限定されないが、以下のものが含まれる：(1) マスタードガス誘導体（メクロレタミン、シクロホスファミド（シトキサン）、クロラムブシル（ロイケラン）、メルファラン、イホスファミドなど）、エチレンイミン（チオテパ（チオプレックス）およびヘキサメチルメラミン）、アルキルスルホネート（ブスルファン（ミレラン））、ヒドラジンおよびトリアジン（アルトレタミン（ヘキサレン）、プロカルバジン（マチュラン）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）およびテモゾロミド）、ニトロソ尿素（カルムスチン、ロムスチンおよびストレプトゾシン）、金属塩（カルボプラチン、シスプラチン（プラチノール）およびオキサリプラチン）、メクロレタミン、メルファラン（アルケラン）などのアルキル化剤；(2) 植物アルカロイド、テルペノイドおよびトポイソメラーゼ阻害薬、例えばビンカアルカロイド（ビンクリスチン（オンコビン）、ビンブラスチン（ヴェルバン）、ビンデシン、およびビノレルビン）、タキサン（パクリタキセル（タキソール）およびドセタキセル（タキソテール））、ポドフィロトキシン（エトポシドおよびテニソピド）、およびカンプトテカン類似体（イリノテカンおよびトポテカン）；(3) アントラサイクリン系（ドキソルビシン（アドリアマイシン、ルベックス、ドキシル）、ダウノルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、デュオカルマイシンおよびダクチノマイシン（コスメゲン））、クロモマイシン（ダクチノマイシンおよびプリカマイシン（ミトラマイシン））、およびその他（ミトマイシンおよびブレオマイシン（ブレノキサン））などの抗腫瘍薬；(4) 葉酸拮抗薬（メトトレキサート）、ピリミジン拮抗薬（メトトレキサート）、ピリミジン拮抗薬（５－フルオロウラシル、フォクスウリジン、シタラビン、フルロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビンおよびゲムシタビン）、プリン拮抗薬（６－メルカプトプリン（プリンエトール）および６－チオグアニン）、６－チオプリン、およびアデノシンデアミナーゼ阻害薬（クラドリビン（ロイスタチン）、フルダラビン、ネララビンおよびペントスタチン）、アザシチジン、チオグアニン、およびシタラビン（ａｒａ－Ｃ）などの代謝拮抗薬；(5) トポイソメラーゼI阻害薬（イロノテカン、トポテカン）、トポイソメラーゼII阻害薬（アムサクリン、エトポシド、エトポシドリン酸、テニポシド）などのトポイソメラーゼ阻害薬；(6)エストロゲンおよびアンドロゲン阻害薬（タモキシフェンおよびフルタミド）、ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト（リュープロリドおよびゴセレリン（ゾラデックス））、アロマターゼ阻害薬（アミノグルテチミドおよびアナストロゾール（アリミデックス））によって例示されるホルモン剤；(7) ＤＮＡ低メチル化剤、例えばアザシチジン、デシタビン；(8) イニパリブ、オラパリブ、ベリパリブなどのポリ（アデノシン二リン酸［ＡＤＰ］－リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）経路阻害薬；(9) ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路阻害薬、例：エベロリムス；(10) ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害薬、例えば、ボリノスタット、エンチノスタット（Ｓｎｄｘ－２７５）、モセチノスタット（ＭＧＣＤ１０３）、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）、ロミデプシン、バルプロ酸[0049]、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤、例えば、フラボピリドール、オロモウシン、ロスコビチン、ケンパウロン、ＡＧ－０２４３２２（ファイザー）、ファスカプリシン、リウビジン、プルバラノールＡ、ＮＵ２０５８、ＢＭＬ－２５９、ＳＵ ９５１６、ＰＤ－０３３２９９１、Ｐ２７６‐００[0050]、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ９０）阻害剤、例えば、ゲルダナマイシン、タネスピマイシン、アルベスピマイシン、ラジシコール、デグリン、およびＢＩＩＢ０２１；(11) マウス二重微小染色体２（ＭＤＭ２）阻害剤、例えば、Cis－イミダゾリン、ベンゾジアゼピンジオン、スピロ－オキシインドール、イソキノリノン、チオフェン、５－デアザフラビン、トリプタミン；(12) 未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害薬、例えば、アミノピリジン、ジアミノピリミジン、ピリドイソキノリン、ピロロピラゾール、インドロカルバゾール、ピロロピリミジン、ジアニリノピリミジン；(13) ベンズアミド、フタラジノン、トリサイクリックインドール、ベンズイミダゾール、インダゾール、ピロロカルバゾール、フタラジノン、イソインドリノンによって例示されるポリ［ＡＤＰリボース］ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害薬；および(14) アンサクリン、アスパラギナーゼ（Ｅｌ－ｓｐａｒ）、ヒドロキシ尿素、ミトキサントロン（ノバントロン）、ミトタン（ライタントロン）、メイタンシノイド、レチノイン酸誘導体、骨髄増殖因子（サルグラモスチムおよびフィルグラスチム）、アミホスチン、葉酸代謝を破壊する薬剤、例えばペメトレキセド、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤（ヒドロキシ尿素）、副腎皮質ステロイド阻害剤（ミトタン）、酵素（アスパラギナーゼおよびペグアスパラガーゼ）、抗微小管剤（エストラムスチン）、およびレチノイド（ベキサロテン、イソトレチノイン、トレチノイン（ＡＴＲＡ））によって例示されるその他の抗がん剤。

【0069】

低分子薬物サブカテゴリーの例示である化学療法薬は、アクチノマイシン－Ｄ、アルケラン、Ａｒａ-Ｃ、 アナストロゾール、 ＢｉＣＮＵ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、カペシタビン、カルボムスチン、ＣＣＮＵ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、ＣＰＴ-１１、シクロホスファミド、シタラビン、シトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、エピルビシン、エトポシド、フロウリジン、フルダラビン、フルタミド、ホテムスチン、ゲムシタビン、ヘキサメチルアミン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレサミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタクセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、ステロイド、ストレプトゾシン、ＳＴＩ―５７１、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テトラジン、チオグアニン、チオテバ、チオグアニン、トムデックス、トポテカン、トレオスルファン、トリメトレキサート、ビンバラスティン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ＶＰ-１６、ゼローダがある。

【0070】

メイタンシノイド（分子量： ～７３８ダルトン）はメイタンシンの化学誘導体の一群であり、強力な細胞毒性を有する。ヒト患者の使用には安全でないと考えられるが、毒性の懸念のために、メイタンシノイドは本発明に従って、ミニ細胞を介した脳腫瘍患者への送達に適している。

【0071】

デュオカルマイシン（分子量： ～５８８ダルトン）は、ストレプトマイシス細菌から最初に単離された一連の関連する天然産物である。それらはまた、強力な細胞毒性を有するが、ヒトでの使用には安全でないと考えられる。メイタンシノイドと同様に、デュオカルマイシンは、本発明における使用のための適切な化学療法薬である。

【0072】

生物学的化学療法薬のサブカテゴリーには、限定されるものではないが、アスパラギナーゼ、ＡＩＮ―４５７、バピネオズマブ、べリムナブ、ブレンツキシマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダロツズマブ、デンソスマブ、エプラツズマブ、エスタフェナトクス、ファルレツズマブ、フィギツムマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ（ＷＸ－Ｇ２５０）、ハーセプチン、イブリツモマブ、イノツズマブ、イポリズマブ、メポリズマブ、ムロモナブ－ＣＤ３、ナプツモマブ、ネシツツムマブ、ニモツムマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オテリキシズマブ、オゾガマイシン、パギマクシブマブ、パニツムマブ、ラムシルマブ、ペルツズマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、ＲＥＧＮ８８、ソラネズマブ、テプリズマブ、チウキセタン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレメリムマブ、ベドリズマブ、ザルツムマブおよびザノリムマブがある。

【0073】

いくつかの実施形態において、抗悪性腫瘍薬は、アクチノマイシン－Ｄ、アルケラン、ａｒａ-Ｃ、アナストロゾール、ＢｉＣＮＵ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルボプラチン、カルムスチン、ＣＣＮＵ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、ＣＰＴ－１１、シクロホスファミド、シタラビン、シトキシンアラビノシド、シトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デキソラゾキサン、ドセタクセル、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、エピルビシン、エチレンイミン、エトポシド、フロクスウリジン、フルオロウラシル、フルタミド、ホテムスチン、ゲムシタビン、ヘキサメチルアミン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタクセル、パミドタミン、ペントシタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、ステロイド、ストレプトゾシン、ＳＴＩ-５７１、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシデ、テトラジン、チオグアニン、チオテパ、トムデックス、トモテカン、トレオスルファン、トリメトレキサート、ビンブラスチン、ビンクリスティン、ビンデシン、ビノレルビン、ＶＰ-１６、キセロダ、アスパラギナーゼ、ＡＩＮ-４５７、バピニュウツマブ、ベリムマブ、ブレンツキシマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダロツズマブ、デノスマブ 、エプラツズマブ、エスタフェナトクス、ファレツツマブ、フィギツムマブ、ガリキシマブ,ゲムツツマブ、ギレンツキシマブ(ＷＸ―Ｇ２５０)、ヘルセプチン、イブリツモマブ、イントツツマブ、イプリズマブ、メポリズマブ、ムロモナブ－ＣＤ３、ナプツモマブ、ネシツモマブ、ニモツツマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オテリズマブ、オゾガミシン、パジバキシマブ、パニツムマブ、パーツツマブ、ラムシルマブ、レスリツマブ、リツキシマブ、ＲＥＧＮ８８、ソラネズマブ、タネツマブ、テプリズマブ、ティウクセタン、トラスツツマブ、トシツモマブ、トレメリムマブ、ベドリズマブ、ザルツムマブ、ザノリムパブ、５ＦＣ 、アキュータンホフマンラロッシェ、ＡＥＥ７８８ノバルティス、ＡＭＧ-１０２、アンチネオプラストン、ＡＱ４Ｎ（バノキサントロン）、ＡＶＡＮＤＩＡ（ロシグリタゾンマレイン酸塩）、アバスチン（ベバシズマブ）ジェネテック、ＢＣＮＵ、ｂｉＣＮＵカルムスチン、ＣＣＩ－７７９、ＣＣＮＵ、ＣＣＮＵロムスチン、セレコキシブ（システミック）、クロロキン、シレンギチド（ＥＭＤ１２１９７４）、ＣＰＴ－１１（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ、イリノテカン）、ダサチニブ（ＢＭＳ－３５４８２５、スプリセル）、樹状細胞療法、エトポシド（エポシン、エトポホス、ベペシド）、ＧＤＣ－０４４９、グレベック（メシル酸イマチニブ）、グリアデルウエファー、ヒドロキシクロロキン、ＩＬ－１３、ＩＭＣ－３Ｇ３、免疫療法 、イレッサ(ＺＤ-１８３９）、ラバチニブ（ＧＷ５７２０１６）、がん用メトトレキサート(システミック )、ノボキュア、ＯＳＩ-７７４、 ＰＣＶ、ＲＡＤ００１ ノバ―ティス (ｍＴＯＲ阻害剤）、ラパマイシン（ラパムネ、、シロリムス）、ＲＭＰ－７、シンバスタチン、シロリムス、ソラフェニブ、ＳＵ－１０１、ＳＵ５４１６ スゲン、スルファサラジン（アズルフィデン）、スーテント（ファイザー）、ＴＡＲＣＥＶＡ(エロトニブＨＣｌ)、タキソール、ＴＥＭＯＤＡＲ schering-plough、ＴＧＦ-Ｂアンチセンス、サロミド(サリドマイド)、トポテカン（システィミック）、ＶＥＧＦトラップ、ＶＥＧＦ－trap、ボリノスタット（SAHA）、ＸＬ７６５、ＸＬ１８４、ＸＬ７６５、 ザルネストラ（tipifarnib）、ＺＯＣＯＲ（シムバスチン)、シクロホスファミド(シトキサン)、（Alkeran）、クロラムブシル(リュ
ーケラン)、チオペタ（チオプレックス）、ブスルファン（ミレラン）、プロカルバジン（マツラン）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、アルトレタミン（ヘキサレン）、クロラムブシル、シスプラチン（プラチノール）、イホスファミド、メトトレキサート（ＭＴＸ）、６-チオプリンス(メルカトプリン[６-ＭＰ］、チオグアニン［６-ＴＧ])、メルカプトプリン（プリンネトール）、リン酸フルダラシン、(ルイスタチン)、フルロラシル（５-ＦＵ）、シタラビン（ａｒａ－Ｃ）、アザシチジン、ビンブラスチン（Velban）、ビンクリスチン（オンコビン）、ポドフィロトキシン（エトポシド｛ＶＭ－１６｝およびテニポシドＶＭ｛ＶＭ－２６｝）、カンプトテシン(トポテカンおよびイリノテカン（タキソール）、パクリタクセル(タクソール)およびドセタクセル(タクソテレ)のようなタキサン、（アドリアマイシン、ルベックス、ドキシル）、ダクチノマイシン（コスメゲン）、プリカマイシン(ミズラマイシン)、マイトマイシン（ムタマイシン）、ブレオマイシン（ブレノキサン）、エストロゲンおよびアンドロゲン阻害薬（タモキシフェン）、ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト（リュープロリドおよびゴセレリン（ゾラデックス）、アナストロマターゼ阻害薬（アミノグルテチミドおよびアナストロゾール（アリミデックス））、アムサクリン、アスパラギナーゼ（Ｅｌ-ｓｐａｒ）、ミトキサントロン(ノバントロン)、ミトタン（ロイソドレン）、レチノイン酸誘導体、骨髄増殖因子（サーグラモスチムおよびフィルグラスチム）、アミホスチン、デシタビン、イニパリブ、オラパリブ、ベリパリブ、エベロリムス、ボリノスタット、エンチノスタット（ＳＮＤＸ－２７５）、モセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９)、ロミデプシン、バルプロ酸、フラボピリドール、オロモウシン、ロスコビチン、ケンパウロン、ＡＧ－０２４３２２（ファイザー）、ファスカプリジン、リュービディン、プルバラノールＡ、ＮＵ２０５８、ＢＭＬ－２５９、ＳＵ９５１６、ＰＤ－０３３２９９１、Ｐ２７６-００、ゲルダナマイシン、タネスピマイシン、アルベスピマイシン、ラディシコール、デグエリン、ＢＩＩＢ０２１、cis－イミダゾリン、ベンゾジアゼピンジオン、スピロ－オキシインドール、イソキノリノン、チオフェン、５－デアザフラビン、トリプタミン、アミノピリミジン、ジアミノピリミジン、ピリドイソキノリン、ピロロビラゾール、インドロカルバゾール、ピロロピリミジン、ジアニリノピリミジン、ベンズアミド、フタラジノン、トリサイクリックインドール、ベンズイミダゾール、インダゾール、ピロロカルバゾール、イソインドリノン モルホリニルアントラサイクリン、マイタンシノイド、デュサルマイシン、カリケアマイシン（ＤＮＡ損傷剤）、α－アマニチン（ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤）、センタナマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ニトロゲンムスタード、ストレプトニグチン、ニトロソウアート、アルカンスルホネート、ピリミジン類似体、プリン類似体、代謝拮抗剤、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、ビンカアルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン剤、およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される化合物を含む。
本開示に従って使用可能な活性薬剤は、上記に列挙した薬物種類または特定の薬剤に限定されない。異なる発見舞台は、がん細胞のユニークな分子特徴に向けられる新しい薬剤を産生し続ける；実際、数千のそのような化学的および生物学的薬剤が発見されており、そのうちのいくつかのみをここに列挙する。しかし、親水性または疎水性の多様な活性薬剤のパッケージ化に適応する、無傷の細菌由来ミニ細胞および死滅細菌細胞の驚くべき能力は本開示の発見に従って、ミニ細胞にパッケージ化場合に、本質的に任意のそのような薬剤ががんを治療する可能性を有することを意味する。

【0074】

抗腫瘍剤の種類の例は、放射性核種、化学療法薬、および調節ＲＮＡを含むがこれらに限定されない機能性核酸である。種類の構成員は、以下でさらに議論される。

【0075】

ｉ．放射性核種
「放射性核種」とは、不安定な核をもつ原子、すなわち、核内で新たに生成された放射線粒子または原子電子のいずれかに付与されるのに利用可能な過剰なエネルギーを特徴とする原子である。本明細書では放射性核種を「放射性同位元素」、「放射性イメージング剤」、または「放射性標識」と呼ぶこともある。放射性核種はイメージングおよび／または治療目的で使用することができる。それらは、ミニ細胞内に含有され得るか、またはミニ細胞外表面上のリガンド、ペプチド、または糖脂質に付着され得る。結合は、直接またはリンカーを介して、メルカプトアセチルトリグリシン（ＭＡＧ３）、ＤＯＴＡ、ＥＤＴＡ、ＨＹＮＩＣ、ＤＴＰＡ、またはクラウンエーテルなどのキレート剤を含むキレート化部分を含有するリンカーを使用することができる。キレート剤は、ミニ細胞表面成分に直接付着させるか、またはリンカーを介してミニ細胞に付着させることができる。多くの放射性核種が当技術分野で知られており、イットリウム－９０、テクネチウム－９９ｍ、ヨウ素－１２３、ヨウ素－１２４、ヨウ素－１２５、ヨウ素－１３１、ルビジウム－８２、タリウム－２０１、ガリウム－６７、フッ素－１８、キセノン－１３３、およびインジウム－１１１など、多くの放射性核種が医療用途に適していることが知られている。

【0076】

したがって、いくつかの実施形態では、放射性同位体がイットリウム９０、イットリウム８６、テルビウム１５２、テルビウム１５５、テルビウム１４９、テルビウム１６１、テクネチウム９９ｍ、ヨウ素１２３、ヨウ素１３１、ルビジウム８２、タリウム２０１、ガリウム６７、フッ素１８、銅６４、ガリウム６８、キセノン１３３、インジウム１１１、ルテチウム１７７、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される放射性同位体を含む。

【0077】

イメージングおよび治療の両方の目的でミニ細胞に付着させるのに有用な放射性同位元素には、例えば、ガンマおよびベータ放射体であるヨウ素-１３１およびルテチウム-１７７が含まれる。従って、これらの薬剤は、画像化および治療の両方のために使用され得る。

【0078】

同じ元素の異なる同位体、例えば、ヨウ素１２３（ガンマ放射体）およびヨウ素１３１（ガンマおよびベータ放射体）もまた、画像化および治療目的の両方のために使用され得る（GerardおよびCavalieri、2002; Alzahraniら、2012）。

【0079】

新しい例は、イットリウム－８６／イットリウム－９０またはテルビウム同位体（Ｔｂ）：¹⁵²Ｔｂ(ベータプラス放射体)、¹⁵⁵Ｔｂ(ガンマ放射体)、¹⁴⁹Ｔｂ(アルファ放射体)、および¹⁶¹Ｔｂ(beta-particle)(Mullerら、2012; Walrandら、2015）である。

【0080】

核イメージングは、ガンマおよび陽電子エミッター（β＋）を利用する。テクネチウム－９９ｍ（^99mＴｃ）またはヨウ素－１２３（¹²³Ｉ）などのガンマエミッタは、ガンマカメラ（平面イメージング）またはＳＰＥＣＴ(単一光子放出コンピュータ断層撮影)(Holman and Tumeh、1990）を用いて配置することができる。

【0081】

これら粒子の組織浸透は放射同位体のエネルギーに比例する(Kramer-MarekおよびCapala、2012）。β粒子は潜在的な殺細胞効果を有するが、ほんの数ミリメートルの組織浸透を有するため、周囲の健康な組織を残す。日常的な核腫瘍学の実施において一般に使用されるβエミッターはルテチウム１７７（¹⁷⁷Ｌｕ、組織浸透：０．５～０．６mm、最大：２mm、４９７keV、半減期：６．７日）およびイットリウム９０（⁹⁰Ｙ、組織浸透：平均２．５mm、最大：１１mm、９３５keV、半減期：６４時間）を含む（Teunissenら、2005；Kwekkeboomら、2008；Ahmadzadehfarら、2010；Pillaiら、2013；Ahmadzadehfarら、2016）。

【0082】

放射性核種は、核医学において、特に腫瘍細胞を損傷するためのベータ線エミッターとして、広範な使用を見出している。いくつかの実施形態において、放射性核種は、抗腫瘍剤として適切に使用される。

【0083】

放射性核種は、任意の公知の技術によって、無傷の、細菌由来のミニ細胞と会合され得る。したがって、タンパク質または他のミニ細胞表面部分（下記参照）は、Pierce Biotechnology Inc（Rockford、Ill．）から市販され、Rice ら、Semin. Nucl. Med.,41,265（2011）に詳述されている、Ｐｉｅｒｃｅヨウ素標識試薬の使用などの市販の標識手段を使用して、放射性核種で標識することができる。あるいは、放射性核種をミニ細胞内のタンパク質に組み込むことができる。

【0084】

後者の状況では、ミニ細胞をつくる細菌株を外来タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡで形質転換する。非対称的な細胞分裂の際にミニ細胞が形成されると、プラスミドＤＮＡのいくつかのコピーがミニ細胞の細胞質に分離する。得られた組換えミニ細胞を、プラスミドＤＮＡからミニ細胞内で発現された外来タンパク質が放射性核種運搬アミノ酸に組み込まれるような条件下で、放射性標識アミノ酸の存在下でインキュベートする。例えば、Clark-Curtiss anＤＣurtiss、Methods Enzymol、101：347－362（1983）のプロトコールに従って、組換えミニ細胞を、^35Sメチオニンを含む最小増殖培地中でインキュベートし、それにより、新たに発現されたプラスミドコードタンパク質が^35Sメチオニンを組み込む。同様の手法を用いて、組換えミニ細胞を所望に応じて他の放射性標識でパッケージ化することができる。

【0085】

ミニ細胞表面上のオリゴ糖はまた、例えば、Fukuda、Curr Protocols Molec. Biol. (Suppl. 26), 17.5.1-17.5.8 (1994)に記載された十分に確立されたプロトコールを使用して放射性標識され得る。ミニ細胞に固有のこのようなオリゴ糖の例として、グラム陰性菌由来のミニ細胞の表面に見られるリポ多糖（ＬＰＳ）のＯ－多糖成分が挙げられる（後述）。

【0086】

この点に関する好ましい方法は、ミニ細胞を特定の腫瘍に標的化するために使用される腫瘍標的化リガンドとして使用される二重特異性抗体を放射性標識することである。米国特許公開2007／0237744を参照されたく、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。すなわち、ミニ細胞上に「コーティングされた」二重特異性抗体は、放射性標識のためにかなりの量のさらなる表面タンパク質を暴露する。したがって、抗体でコーティングされたミニ細胞に関連する放射標識のより高い比活性を達成することが可能である。対照的に、コーティングされていないミニ細胞の放射性標識、すなわち、放射性核種が風土病非のみを標識する場合、より弱い標識（より低い比活性）を生じ得る。一実施形態では、このより弱い標識がグラム陰性細菌に由来するミニ細胞の外膜関連タンパク質が以下でさらに論じるように、ミニ細胞表面を覆うＯ-多糖の長鎖を含むＬＰＳによってマスクされるために起こると考えられる。

【0087】

腫瘍を処置するために、本開示の組成物は、腫瘍を完全に排除しないとしても、腫瘍塊を少なくとも減少させるのに十分な腫瘍内照射のレベルを与える用量または複数の用量で送達される。治療の進行は、この線に沿って、ケースバイケースで監視することができる。しかしながら、一般的には組成物中にパッケージ化される放射能の量が典型的には約３０～約５０Gyのオーダーであるが、本発明はまた、約３０Gy～約２００Gyの全範囲を与える、例えば約５０～約２００Gyのような、より多量の放射能を意図する。

【0088】

場合によってはミニ細胞ボーン放射性核種の腫瘍への非常に効率的かつ特異的な送達を考慮すると、組成物中にパッケージされる放射能の量は上記よりもさらに低くてもよい。したがって、一態様では、組成物が約２０～約４０Gy、または約１０～約３０Gy、または約１～約２０Gy、または約１０Gy未満を含む。

【0089】

いくつかの腫瘍ターゲティングリガンドは、リガンドが腫瘍細胞に結合する間に腫瘍に放射線を送達する機能を有する放射性同位元素を含み得る。いくつかの実施形態において、リガンドは、Ａｒｇ-Ｇｌｙ―Ａｓｐ(ＲＧＤ)ペプチド、ボンベシン（ＢＢＮ）／ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、コレシストキニン（ＣＣＫ）／ガストリンペプチド、α－メラノサイト刺激ホルモン（α－ＭＳＨ）、ニューロペプチド（ＮＴ）、［⁶⁸Ｇａ］Ｇａ－ＰＳＭＡ－ＨＢＥＤＣＣ（［⁶⁸Ｇａ］Ｇａ－ＰＳＭＡ－１１［ＰＥＴ］）、［¹⁷⁷Ｌｕ］Ｙ－Ｊ５９１、［¹²³Ｉ］Ｉ－ＭＩＰ－１０７２、［¹³¹Ｉ］Ｉ－ＭＩＰ－１０９５、⁶⁸Ｇａまたは¹⁷⁷Ｌｕ標識ＰＳＭＡ－Ｉ＆Ｔ、⁶⁸ＧａまたはＬｕ標識ＤＫＦＺ－ＰＳＭＡ－６１７（ＰＳＭＡ－６１７）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）ペプチド、サブスタンスＰ、Ｔ１４０を含む腫瘍分子標的ペプチド１（ＴＭＴＰ１）、血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）、またはそれらの任意の組合せ。

【0090】

いくつかの実施形態において、放射性同位体は、腫瘍標的化リガンドに結合される。いくつかの実施形態では、結合はリンカーを介する。いくつかの実施形態では、腫瘍標的化リガンドが放射性同位体または放射性同位体をキレート化するキレート剤部分の結合のための官能基を含むペプチドを含む。結合に利用可能なペプチドの官能基にはリジン側鎖上のε－アミノ基、アルギニン側鎖上のグアニジニウム基、アスパラギン酸またはグルタミン酸上のカルボキシル基、システインチオール、およびチロシン上のフェノールが含まれるが、これらに限定されない。最も一般的な共役反応は、カルボジイミド／Ｎヒドロキシスクシンイミジル（ＥＤＣ／ＮＨＳ）媒介カルボキシルおよびアミンカップリング、チオール基へのマレイミド共役、およびチロシン上のフェノールのジアゾニウム修飾である。ペプチドを画像化部分と結合させるための代表的な化学は多くの総説において見出すことができる（ErathodiyilおよびYing，2011; Takahashiら、2008）。

【0091】

いくつかの実施形態では、放射性同位元素が放射性造影剤として機能する。いくつかの放射性同位元素はＳＰＥＣＴ画像化のための^99mＴｃ、¹²³Ｉ、および¹¹¹Ｉｎ、ならびにＰＥＴ画像化のための¹⁸Ｆ、⁶⁴Ｃｕ、および⁶⁸Ｇａを含むペプチド標識のために使用されている（Chatalicら、2015）。一般に、これらの放射性同位体は、キレート剤を介してペプチドに結合される。いくつかの広く使用されているキレート剤は、(Sunら、2017）に記載されている。ほとんどの治療用放射性医薬品は、β放出同位体（β－）標識されている。

【0092】

腫瘍細胞を標的とする本発明のミニ細胞はまた、ミニ細胞が結合している腫瘍細胞に放射性同位元素から標的放射線を送達する。いくつかの実施形態では放射性同位元素が治療用放射線放出剤として機能し、放射性同位元素によって提供される放射線の量は腫瘍に対する治療効果を提供するのに十分である。いくつかの実施形態において、治療効果は、腫瘍サイズの減少である。腫瘍は、約１００％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、または約５％だけサイズが縮小され得る。

【0093】

放射性標識ホスホネートは高い骨親和性を有し、疼痛性骨転移の画像化および緩和のために使用され得る。骨代謝の程度に応じて、トレーサーは、骨、好ましくは骨芽細胞性骨転移への接着を介して蓄積する。治療計画には、テクネチウム－９９m－ヒドロキシエチリデンジホスホネート（ＨＥＤＰ）による骨シンチグラフィーを行い、代謝および転移病変の範囲を推定する必要がある。ビスホスホネートＨＥＤＰは、レニウム１８６（βエミッター、半減期：８９時間、１．１MeV最大エネルギー、最大範囲：４．６mm）またはレニウム１８８（βエミッター［８５％、２．１MeV］およびγエミッター［１５％、１５５ keV］、半減期：１６．８時間、軟組織における最大範囲：１０mm）のいずれかでの治療のために標識することができる（Palmedo、2007）。骨緩和療法のための新しい有望な放射性医薬品には、ゾレドロン酸の放射性標識複合体がある。ゾレドロン酸は環状側鎖をもつ新しい、最も強力なビスホスホネートの世代に属する。スカンジウム－４６またはルテチウム－１７７で標識したゾレドロン酸の骨親和性は優れた吸収（［１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ゾレドロン酸に対して９８％、［４６Ｓｃ］Ｓｃ－ゾレドロン酸に対して８２％）を示し、これは、サマリウム－１５３で標識したビスホスホネートよりもはるかに高い（最大：６７％)(Majkowskaら、2009）。これらのビスホスホネートは骨転移の診断または治療として使用するために、無傷のミニ細胞に結合させることができる。

【0094】

IＩ．化学療法薬
本開示において使用される抗腫瘍剤はまた、化学療法薬であり得る。本明細書において、「化学療法剤」、「化学療法剤」、および「化学療法剤」は、腫瘍細胞を殺すかまたは破壊する能力を有する薬剤を意味するために互換的に使用される。化学療法剤は以下にさらに詳述されるように、小分子薬物または生物学的薬物であり得る。

【0095】

「小分子薬物」サブカテゴリーは（i）生物学的プロセスに対する効果、および（ii）タンパク質またはポリマー高分子と比較して低分子量を有することを特徴とする化合物を包含する。小分子薬物は典型的には約８００ダルトン以下であり、Temodar（登録商標）（テモゾロミド）によって例示されるように、約１９４ダルトンで、約１５０ダルトンの下限を有し、これは神経膠芽腫および他のタイプの脳がんを処置するために使用される。この文脈において、「約」は、適格な分子量値が測定精度の変動および数ダルトンまたは数十ダルトンのオーダーの実験誤差を受けることを示す。したがって、小分子薬物は、約９００ダルトン以下、約８００ダルトン以下、約７００ダルトン以下、約６００ダルトン以下、約５００ダルトン以下、または約４００ダルトン以下、例えば約１５０～約４００ダルトンの範囲の分子量を有することができる。より具体的には、小分子薬物が約４００ダルトン以上、約４５０ダルトン以上、約５００ダルトン以上、約５５０ダルトン以上、約６００ダルトン以上、約６５０ダルトン以上、約７００ダルトン以上、または約７５０ダルトン以上の分子量を有することができる。別の実施形態では、ミニ細胞にパッケージされた小分子薬物が約４００～約９００ダルトン、約４５０～約９００ダルトン、約４５０～約８５０ダルトン、約４５０～約８００ダルトン、約５００～約８００ダルトン、または約５５０～約７５０ダルトンの分子量を有する。

【0096】

具体的には適切な小分子薬物には特に、窒素マスタード、ニトロソルエア、エチレンイミン、アルカンスルホネート、テトラジン、白金化合物、ピリミジン類似体、プリン類似体、代謝拮抗物質、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、ビンカアルカロイド、およびトポイソメラーゼ阻害剤などの上記に列挙したものが含まれるが、これらに限定されない。従って、本発明において使用するための小分子薬物は特に、以下のいずれかの中から選択され得る：エネジイン（例えば、ダインマイシンＡ、ユニラマイシン、カリケアマイシンγ１およびカリケアマイシンθ1）；メアマイシン、FR901464の合成類似体；ベンゾスベレン誘導体（例えば、Tanpureら、Bioorg Med. Chem., 21： 8019－32 （2013）に記載される）；オーリスタチン（例えば、オーリスタチンE、モノメチルオーリスタチンＥ(ＭＭＡＥ))およびオーリスタチンF（これらは、ドラスタチンの合成類似体である）；デュオカルマイシン(例えばデュオカルマイシンＳＡおよびＣＣ－１０６５）；メイタンシンおよびその誘導体（メイタンシノイド）（例えば、ＤＭ1およびＤＭ４）；イリノテカン（Camptosar（登録商標））ならびに他のトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、トポテカン、エトポシド、ミトキサントロンおよびテニポシド）；ならびにヤタケマイシン（その合成はOkanoら、2006によって詳述される）。

【0097】

より詳細には、本明細書に詳述される特異的小分子薬物のいずれか１つまたは複数が本発明での使用に適したもの例証である：アクチノマイシンＤ、アルケラン、アラビアＣ、アナストロゾール、ＢｉＣＮＵ、ビカルタミド、ビサントレン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、カルボプラチン、カルボプラチナム、カルムスチン、ＣＣＮＵ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、ＣＰＴ１１、シクロホスファミド、シタラビン、シトシンアラビノシド、シトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダクノルビシン、デキサラゾキサン、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、エピルビシン、エチレンイミン、エトポシド、フロキシウルジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、ホテムスチン、ゲムシタビン、ヘキサメチルアミン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミドイリノテカン、イリノテカン、ロムスチン、メクロルエタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトテレキサエート、ミトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、ＳＴＩ－５７１、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テトラジン、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トムデックス、トレオスルファン、トリメトレキサート、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンオレルビンおよびＶＰ-１６。

【0098】

本明細書の目的のために、「生物学的薬物」とは、対照的に、以下に論じる「機能的核酸」を除く生物学的プロセスによって作製することができる任意の生物学的に活性な高分子を意味すると定義され、サイズによってそのポリペプチドは上記に定義されるように小分子薬物として適格である。したがって、「生物学的薬物」サブカテゴリーは、小分子薬物および機能的核酸サブカテゴリーを除外し、それらと重複しない。生物学的薬物の例は、例えば、医薬化学および薬物設計のツールを使用して、天然であろうと組換えであろうと合成であろうと、治療用タンパク質および抗体である。

【0099】

ｉｉｉ．超毒性化学療法薬
化学療法を目的として設計されたある種の分子は、許容できない毒性のために前臨床または臨床試験中に失敗する。本発明者らは高毒性または「超毒性」の化学療法薬をミニ細胞にパッケージ化し、続いて腫瘍患者に全身的に送達すると、薬剤が腫瘍細胞に送達されることを示した。さらに、腫瘍細胞が破壊され、薬剤含有細胞質が近傍の正常組織に放出された後でも、結果は正常組織に対する毒性ではない。これは薬剤が既にＤＮＡなどの腫瘍細胞構造に結合しており、もはや正常細胞を攻撃できないためである。したがって、本発明はがん患者への高毒性（「超毒性」）化学療法薬の送達に特に有用である。

【0100】

がん患者が全ての治療選択肢を使い果たした場合、腫瘍は従来の細胞毒性薬に対する高度の耐性を伴うかなりの不均一性の段階に達した可能性が高い。本記述の「毒性の強い化学療法剤」または「超毒性の化学療法剤」とは、がん細胞に対する有効用量と比較して、正常細胞に対する致死量が比較的低いため、従来の薬剤に対する耐性を克服できる化学療法剤を指す。

【0101】

したがって、一態様では、高毒性化学療法薬が標的がんに対する有効用量中央値（ＥＤ₅₀）よりも低い致死量中央値（ＬＤ₅₀）を有する。例えば、高毒性または超毒性化学療法薬は、標的がんに対する薬物のED₅₀の約５００％、４００％、３００％、２５０％、２００％、１５０％、１２０％、または１００％未満のＬＤ₅₀を有することができる。別の態様では、高毒性または超毒性化学療法薬がその最小有効用量、例えば、最小有効用量の約５００％、約４００％、約３００％、約２５０％、約２００％、約１５０％、約１２０％、約１００％，約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、または約５０％より低い最大亜致死量（すなわち、重篤または不可逆的毒性を引き起こさない最高用量）を有する。一実施形態において、標的がんは例えば、（1）薬物が設計されるがん型、（2）その薬物について前臨床または臨床試験が行われる最初のがん型、または（3）薬物が試験された全てのがんの中で最も高い有効性を示すがん型であり得る。

【0102】

超毒性化学療法薬物の例示的な非限定的な例には、メイタンシノイド、デュオカルミシン、モルホリニルアントラサイクリン、およびそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。メイタンシノイド（分子量：約７３８ダルトン）はメイタンシンの化学誘導体の群であり、強力な細胞毒性を有する。ヒト患者の使用には安全ではないと考えられるが、毒性の懸念のために、メイタンシノイドは本発明に従って、ミニ細胞を介した腫瘍患者への送達に適している。デュオカルマイシン（分子量：約５８８ダルトン）は、ストレプトマイセス細菌から最初に単離された一連の関連する天然産物である。それらはまた、
強力な細胞毒性を有するが、ヒトでの使用には安全でないと考えられる。メイタンシノイドと同様に、デュオカルマイシンは、本発明における使用のための適切な化学療法薬である。

【0103】

同様に、国際特許出願ＷＯ1998/002446に記載されているモルホリニルアントラサイクリン誘導体のクラスの化合物が例示されている。そのような誘導体の中には、ネモルビシン（３’－デアミノ－３’－［２（Ｓ）－メトキシ－４－モルホリニル］ドキソルビシン)(ＭＭＤＸ)、およびその主要代謝産物であるＰＮＵ－１５９６８２（３’－デアミノ－３’－アンヒドロ－［２’’（Ｓ）－メトキシ－３’’（Ｒ）－ヒドロキシ－４’’－モルホリニル］ドキソルビシン）、ならびに米国特許第8,470,948号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている他のそのような４つの誘導体がある：３’－デアミノ－３’’－４’－アンヒドロ－［２’’（Ｓ）－メトキシ－３’’（Ｒ）－ヒドロキシ－４’’－モルホリニル］－イダルビシン；３’－デアミノ－３’’－４’－アンヒドロ－［２’’（Ｓ）－メトキシ－３’’（Ｒ）－ヒドロキシ－４’’－モルホリニル］－ダウリルビシン；３’－デアミノ－３’’－４’ －アンヒドロ－２’’ （Ｓ）－メトキシ－３’’（Ｒ）－ヒドロキシ－４’’－モルホリニル］－カミノマイシン；および３’－デアミノ－３’’－４’－アンヒドロ－［２’’（Ｓ）－エトキシ－３’’（Ｒ）－ヒドロキシ－４’’－モルホリニル］d－オキソルビシン。

【0104】

本開示の例示的な実施形態では、ミニ細胞が超毒性化学療法薬３’デアミノ３’’，４’アンヒドロ［２’’（Ｓ）メトキシ３’’（Ｒ）オキシ４’’モルホリニル］ドキソルビシン（ＰＮＵ１５９６８２）を含む。本発明者らは、ＰＮＵ－１５９６８２が多くの異なる腫瘍細胞株における薬物耐性を克服すると思われる強力な薬物であり、多くの異なる腫瘍細胞株に対する細胞毒性分析において、ある範囲の従来の化学療法薬よりもはるかに強力であることを発見した。実施例８および９を参照されたい。さらに、ドキソルビシンに耐性のヒト腫瘍異種移植片が、ＥＧＦＲ標的およびＰＮＵ－１５９６８２負荷ＥＤＶのIＶ投与によって効果的に治療され得ることが、インビボマウス異種移植実験において示された。実施例１１を参照。注目すべきことに、ＰＮＵ－１５９６８２負荷ＥＤＶとI型インターフェロンアゴニストを併用すると、忍容性が良好であり、後期膵がん患者において相乗的かつ抗がん効果の改善が得られることがわかった。実施例１２を参照されたい。したがって、本発明の一実施形態では、組成物が活性抗がん剤としてＰＮＵ１５９６８２を含むＥＧＦＲ標的ミニ細胞を含む。

【0105】

超毒性化学療法特性を示す可能性のある他の適切ながん化学療法薬には、オーリスタチン、カリケアマイシン（ＤＮＡ損傷剤）、α－アマニチン（ＲＮＡポリメラーゼII阻害剤）、センタナマイシン、ゲルダナマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ストレプトニグチン、窒素マスタード、ニトロソルエース、エチレンイミン、アルカンスルホネート、テトラジン、白金化合物、ピリミジン類似体、プリン類似体、代謝拮抗剤、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、ビンカアルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、およびホルモン剤が含まれる。

【0106】

ｉｖ 生物学的化学療法薬
別の局面において、ミニ細胞は、生物学的化学療法薬を含み得る。このような薬物の実施例としては、アスパラギナーゼ、ＡＩＮ―４５７、バピネオズマブ、ベリムマブ、ブレンツキシマブ、ブリアキンマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダロツズマブ、デノスマブ、エプラツズマブ、エストラフェナトクス、ファレツヅマブ、フィギツムマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ（ＷＸ-Ｇ２５０）、イプリツモマブ、イノツズマブ、イピリズマブ、メポリズマブ、ムロモナブ－ＣＤ３、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツムマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オテリズマブ、オゾガミシン、パジバキシマブ、パニツムマブ、ペルツヅマブ、ラムシルマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、ＲＥＧＮ８８、ソラネズマブテプリズマブ、タネズマブ、チウキセタン、トシツモマブ、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、トレメリムマブ、ベドリズマブ、ザルツムマブ、およびザノリムマブが挙げられるが、これらに限定されない。

【0107】

ｖ．機能性核酸
「機能性核酸」とは、宿主細胞への導入の際に、タンパク質の発現を特異的に妨害する核酸分子をいい、がんの治療に関して、本開示によれば、無傷の細菌由来ミニ細胞を介してがん細胞に送達される機能性核酸ペイロードは腫瘍細胞増殖、血管新生または化学療法に対する抵抗性を促進する、および／またはアポトーシスまたは細胞周期停止を阻害する遺伝子、すなわち「がん促進遺伝子」を阻害することが好ましい。

【0108】

一般に、本開示で使用される機能性核酸分子は、タンパク質の転写物と相互作用することによってタンパク質の発現を減少させる能力を有する。本開示のためのミニ細胞ペイロードのこのカテゴリーには、とりわけ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ショートＲＮＡ（典型的には４００塩基長未満）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイムおよびデコイＲＮＡ、アンチセンス核酸、およびLincＲＮＡなどの調節ＲＮＡが含まれる。「リボザイム」とは他のＲＮＡ分子を塩基配列特異的に繰り返し切断できる酵素活性を有するＲＮＡ分子をいい、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、特定の遺伝子転写産物の一部に相補的な核酸分子であって、転写産物とハイブリダイズして翻訳を阻害することができるものをいい、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＲＮＡまたはＤＮＡを含むことができ、「ＬｉｎｃＲＮＡ」または「長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ」とは、２００ヌクレオチドより長い非タンパク質コード転写産物を包含する。Khalilら、2009によって論じられているように、ＬｉｎｃＲＮＡは遺伝子の転写、スプライシング、および／または翻訳を調節することができる。

【0109】

調節ＲＮＡのタイプのそれぞれは、上記のように腫瘍促進遺伝子を阻害し、したがって、本開示による使用に適した機能的核酸分子の供給源であり得る。したがって、本開示の一実施形態では、無傷のミニ細胞が腫瘍促進遺伝子を標的とするために利用され得る転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ干渉（ＲＮＡi）機構を媒介するｓｉＲＮＡ分子を保有する。例えば、MacDiarmidら、2009（抗体提示ミニ細胞は、化学療法薬、薬剤に対する耐性を発現するのに対抗するｓｉＲＮＡ）、およびOhおよびPark、Advanced Drug Delivery Rev., 61：850－62（2009）（それぞれ、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、肝臓がん、肺がん、および前立腺がんを治療する治療的なｓｉＲＮＡｓの配達）を参照されたい。

【0110】

「ｓｉＲＮＡ」は一般に、タンパク質発現を特異的に妨害するそれらの能力のために命名された約１０～約３０ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子を指す。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は約１２～約２８ヌクレオチド長であり、より好ましくは約１５～約２５ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは約１９～約２３ヌクレオチド長であり、最も好ましくは約２１～約２３ヌクレオチド長である。したがって、ｓｉＲＮＡ分子は例えば、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、または約２９ヌクレオチドの長さであり得る。

【0111】

1つの鎖の長さは、ｓｉＲＮＡ分子の長さを示す。例えば、２１リボヌクレオチド長（２１量体）とよばれるｓｉＲＮＡは、１９個の連続した塩基対合のためにアニーリングする２本の対向するＲＮＡ鎖を含むことができる。各鎖上の残りの２つのリボヌクレオチドは「オーバーハング」を形成し、ｓｉＲＮＡが異なる長さの２本の鎖を含む場合、鎖の長い方がｓｉＲＮＡの長さを示す。たとえば、２１ヌクレオチド長の１本鎖と２０ヌクレオチド長の２本鎖をもつｄｓＲＮＡは２１量体を構成する。

【0112】

ｓｉＲＮＡ特異的および調節ＲＮＡの設計を補助するためのツールは一般に、容易に入手可能である。例えば、コンピュータベースのｓｉＲＮＡ設計ツールは、www.dharmacon.comのインターネット上で利用可能である。

【0113】

別の好ましい実施形態では、本開示の無傷のミニ細胞がｓｉＲＮＡと同様に、転写後の遺伝子サイレンシングＲＮＡ干渉（ＲＮＡi）機構を媒介することができるｍｉＲＮＡを保有する。また、ｓｉＲＮＡと同様に、ｍｉＲＮＡによって媒介される遺伝子サイレンシング効果を利用して、腫瘍促進遺伝子を標的とすることができる。例えば、Kotaら、2009（トランスフェクションを介するｍｉＲＮＡの送達はマウス肝臓がんモデルにおいて、がん細胞増殖の阻害、腫瘍特異的アポトーシスおよび疾患進行からの劇的な防御をもたらす）、およびTakeshitaら、2010（一過性トランスフェクションを介する合成ｍｉＲＮＡの送達は、骨組織上の転移性前立腺腫瘍細胞の増殖を阻害した）を参照のこと。

【0114】

どちらもＲＮＡ干渉を媒介するが、ｍｉＲＮＡとｓｉＲＮＡには差がある。この点において、「ｍｉＲＮＡ」は一般に、（ｓｉＲＮＡの場合のように二本鎖ではなく）約１７～約２７ヌクレオチド一本鎖ＲＮＡ分子のクラスを意味する。したがって、ｍｉＲＮＡ分子は例えば、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、または約２７ヌクレオチドの長さであり得る。好ましくは、ｍｉＲＮＡ分子が約２１～約２５ヌクレオチド長である。

【0115】

ｍｉＲＮＡとｓｉＲＮＡのもう一つの違いは、前者は一般にｍＲＮＡの標的を完全には補完しないことである。対照的に、ｓｉＲＮＡはｍＲＮＡ標的に対して完全に相補的でなければならない。したがって、ｓｉＲＮＡは一般的に単一の、特異的な標的のサイレンシングをもたらすが、ｍｉＲＮＡは乱雑である。

【0116】

さらに、両方がＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）に集合するが、ｓｉＲＮＡとｍｉＲＮＡはＲＩＳＣ集合前のそれぞれの初期工程が異なる。これらの違いは、Chuら、2006；およびGregoryら、2006に詳細に記載されている。多数のデータベースがｍｉＲＮＡ保管場所として働く。たとえば、ｍｉＲＢａｓｅ(www.mirbase.org)およびtphttp://diana.cslab.ece.ntua.gr/DianaToolsNew/index.php?r=tarbase/index)） を参照されたい。従来の用法ではｍｉＲＮＡは通常、接頭辞「－mir」を連続番号と組み合わせて命名される。例えば、マウスmir－３５２の後に発見された新しいｍｉＲＮＡはマウス「ｍｉｒ－３５３」と命名される再び、ｍｉＲＮＡを含む調節ＲＮＡの設計を補助するためのツールは、容易に入手可能である。この点に関して、コンピュータベースのｍｉＲＮＡ設計ツールは、wmd2.Weigelworld.org／cgi／mirnatoolｓ.plでインターネット上で利用可能である。

【0117】

ｍｉＲＮＡ１６ａが、中皮腫および副腎皮質がん細胞への標的化されたミニ細胞媒介送達によって投与され得ることが、本発明者らの発見である。実施例７を参照。がん細胞によって一旦細胞内に取り込まれると、ｍｉＲＮＡ１６ａはがん細胞増殖を強力に阻害することがわかった。従って、いくつかの実施形態において、本開示のミニ細胞は、ｍｉＲＮＡ１６ａを含む。腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有用な他のマイクロＲＮＡにはmir３４ファミリーおよびlet７ファミリーが含まれる。

【0118】

上記のように、本発明の組成物に用いられる機能性核酸は、腫瘍細胞の増殖、血管新生または化学療法に対する抵抗性を促進する遺伝子を阻害することができる。阻害された遺伝子自身も、アポトーシスや細胞周期停止を阻害することができる。機能的核酸によって標的化され得る遺伝子の例は、以下に提供される。

【0119】

本開示の機能性核酸は好ましくは薬物耐性を促進し、アポトーシスを阻害し、または腫瘍表現型を促進するタンパク質の遺伝子または転写物を標的とする。これらの文脈における機能性核酸戦略の成功裏の適用は当該技術分野において達成されているが、ミニ細胞ベクターの利点はない。例えば、Sioud, Trends Pharmacol. Sci., 2004；、Caplen、Expert Opin.Biol.Ther., 2003; Nieth ら、2003; Caplen and Mousses、2003; Duxburyら、2004; Yagueら、2004；およびDuanら、2004を参照のこと。

【0120】

薬剤耐性に寄与するタンパク質は、機能的核酸の好ましい標的を構成する。これらの蛋白質は、獲得薬物耐性または内因性薬物耐性に寄与する可能性がある。腫瘍細胞などの罹患細胞が、最初は薬物に反応するが、その後の治療サイクルで不応性となると、耐性表現型が獲得される。獲得薬物耐性に関与する有用な標的には、Ｐ－糖タンパク質（Ｐ－ｇｐ、Ｐ－１７０、ＰＧＹ１、ＭＤＲ１、ＡＢＣＢ１、ＭＤＲ関連タンパク質、多剤耐性タンパク質１）、ＭＤＲ－２およびＭＤＲ－３などのＡＴＰ結合カセットトランスポーターが含まれる。ＭＲＰ２（多剤耐性関連タンパク質）、ＢＣＲ－ＡＢＬ（切断点クラスター領域）Ａｂｅｌｓｏｎプロトオンコジーン）、ＳＴＩ－５７１耐性関連タンパク質、肺耐性関連タンパク質、シクロオキシゲナーゼ－２、核因子κ、ＸＲＣＣ１（Ｘ線交差相補性グループ１）、ＥＲＣＣ１（切り出し交差相補性遺伝子）、ＧＳＴＰ１（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ）、変異β－チューブリン、およびＩＬ－６などの増殖因子は、獲得薬物耐性に関与するさらなる標的である。

【0121】

薬剤耐性に寄与する特に有用な標的には、P－糖タンパク質、ＭＤＲ-２、ＭＤＲ-３、ＢＣＲＰ、ＡＰＴ１１ａ、およびＬＲＰなどのＡＴＰ結合カセットトランスポーターが含まれる。有用な標的には、アポトーシス抵抗性を促進するタンパク質も含まれる。これらには、Ｂｃｌ２（Ｂ細胞白血病／リンパ腫）、Ｂｃｌ-ＸＬ、Ａ１／Ｂｆｌ１、局所接着キナーゼ、ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、およびｐ５３変異蛋白質が含まれる。

【0122】

有用な標的には、さらに、発がん性および変異性腫瘍抑制タンパク質が含まれる。これらの例示は、β－カテニン、ＰＫＣ－α（タンパク質キナーゼＣ）、Ｃ－ＲＡＦ、ＤＰ９７ Dead box ＲＮＡヘリカーゼ１、ＦＬＩＰ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１）、Ｃ－Ｓｆｃ、５３ＢＰＩ、Ｐｏｌｙｃｏｍｂ群タンパク質ＥＺＨ２（ｚｅｓｔｅ相同体のエンハンサー）、ＥｒｂＢ１、ＨＰＶ-１６ Ｅ５およびＥ７（ヒト乳頭腫ウイルス初期５および初期７）、ＦｏｒｔｉＬｉｎ＆ ＭＣＩ１Ｐ（骨髄性細胞白血病１タンパク質）、ＤＩＰ１３α（ＤＤＣ相互作用タンパク質１３ａ）、ＭＢＤ２（メチルＣｐＧ結合ドメイン）、ｐ２１、ＫＬＦ４（Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子４）、ｔｐｔ/ＴＣＴＰ(翻訳制御腫瘍タンパク質）、ＳＰＫ１およびＳＰＫ２（スフィンゴシンキナーゼ）、Ｐ３００、ＰＬＫ１（ポロ様キナーゼ－１）、Ｔｒｐ５３、ＥｒｂＢ１である。ＶＥＧＦ(Vascular endothelial growth factor)、ＢＡＧ－１（ＢＣＬ２-associated athanogene 1）、ＭＲＰ２、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＳＴＩ－５７1 resistance-associated protein、シクロオキシゲナーゼ－２、核因子κ、ＸＲＣＣ１、ＥＲＣＣ１、ＧＳＴＰ１、突然変異体－β－チューブリン、および増殖因子。

【0123】

また、標的として有用なのは、細胞質ポリアデニル化エレメント結合タンパク質（ＣＥＰＢ）によって例示されるグローバル調節エレメントである。例えば、ＣＥＰＢ４は膠芽腫および膵臓がんにおいて過剰発現され、そこでは、このタンパク質が腫瘍増殖に関連する数百の遺伝子を活性化し、健康な細胞においては検出されない（Oritz－Zapaterら、2011年）。したがって、本明細書に従って、神経膠芽腫の処置はＣＥＰＢ４の過剰発現に対抗する薬剤（例えば、ｓｉＲＮＡまたは腫瘍細胞によるＣＥＰＢ４発現を破壊する他の機能的核酸分子）を含む、無傷の、細菌由来のミニ細胞を含む組成物の投与を介して達成され得る。

【0124】

機能的核酸の有用な標的のさらなる例には、複製タンパク質A(RPA)、７０ｋＤａ（ＲＰＡ１）、３２ｋＤａ（ＲＰＡ２）、および１４ｋＤａ（ＲＰＡ３）サブユニットから構成される三量体複合体が含まれ、これはすべての生物におけるＤＮＡ複製に必須である。Iftodeら、1999。

【0125】

他の有用な標的は、有糸分裂およびゲノム安定性の維持に重要なものである。例としては、ポロ様キナーゼ（ＰＬＫ１）があり、広範囲のがん細胞で過剰発現していることがわかった。実施例３、図１２を参照されたい。本開示の発明者らはまた、Ｐｌｋ１（ｓｉＰｌｋ１）発現を阻害するｓｉＲＮＡが、中皮腫および副腎皮質がん細胞の増殖を阻害することを見出した。実施例１０を参照。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のミニ細胞はＰｌｋ１を含む。

【0126】

他の有用な標的は、ＤＮＡ複製および修復に関与するものである。たとえば、リボヌクレオシド５’－二リン酸から、ＤＮＡの複製や修復に必要な対応する２’－デオキシリボヌクレオシド５’－三リン酸への転化を触媒するので、がんの治療標的となりうるリボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）などがある。D’Angiolellaら、2012を参照のこと。ヒトＲＲは２つのサブユニット、ＲＲＭ１およびＲＲＭ２を含み、両方のサブユニットを標的とする機能的核酸は、本発明において有用である。本開示の発明者らは、ＲＲＭ１（ｓｉＲＲＭ１）を標的とするｓｉＲＮＡがミニ細胞を送達すると、中皮腫および副腎皮質がん細胞増殖を強力に阻害することを示した。実施例１０を参照。したがって、いくつかの実施形態では、ミニ細胞がリボヌクレオチドレダクターゼＭ１（ＲＲＭ１）発現を阻害するｓｉＲＮＡを含む。

【0127】

Ｂ． Ｉ型インターフェロンアゴニスト
本発明の組成物はI型インターフェロンアゴニスト、すなわち、Ｉ型インターフェロンのレベル（例えば、活性または発現レベル）を増加させる薬剤を含み得る。ヒトI型インターフェロン（ＩＦＮ）は、免疫系の活性の調節を助けるインターフェロンタンパク質の大きなサブグループである。インターフェロンはインターフェロン受容体に結合する。I型ＩＦＮはすべて、ＩＦＮＡＲ１鎖とＩＦＮＡＲ２鎖からなるＩＦＮ－α（ＩＦＮＡＲ）として知られる特異的な細胞表面受容体複合体に結合する。ＩＦＮＡＲはＩＦＮ－α（アルファ）、ＩＦＮ－β（ベータ）、ＩＦＮ－κ（カッパー）、ＩＦＮ－δ（デルタ）、ＩＦＮ－ε（イプシロン）、ＩＦＮ－τ（タウ）、ＩＦＮ－ω（オメガ）、ＩＦＮ－ζ（ゼータ、リミチンとしても知られる）と呼ばれる哺乳類のＩ型ＩＦＮである。

【0128】

ｉ． オリゴヌクレオチド
図２は、免疫調節性の６０mer二本鎖ＤＮＡを含むミニ細胞の例示的な実施形態のグラフ描写を示す。本発明者らは、ＥＧＦＲ標的ミニ細胞を有する二本鎖ＤＮＡなどのI型インターフェロンアゴニストの送達が細胞傷害性薬物を負荷されたミニ細胞の免疫賦活剤（すなわち、抗腫瘍効果を増強する）として作用することを発見した。実施例１１を参照されたい。したがって、超毒性薬剤ＰＮＵ－１５９６８２とパッケージされたミニ細胞を組み合わせることにより、抗腫瘍効果が増強され、この治療は後期膵臓がん患者によって十分に忍容性であった。実施例１２を参照されたい。

【0129】

I型インターフェロン（ＩＦＮ）の発現は、標的細胞に二本鎖ＤＮＡを送達することによって誘導することができる。具体的には、微生物病原体由来のサイトゾルＤＮＡによる自然免疫活性化がI型ＩＦＮおよびcＧＡＭＰ、サイクリックＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（cＧＡＳ）およびＩＦＮγ誘導因子１６（ＩＦＩ１６）などのサイトゾルＤＮＡセンサーによって媒介される炎症誘発性サイトカインの強力な誘因である。例えば、Hansenら、2014；およびUnterholznerら、2013を参照のこと。cＧＡＳは二本鎖ＤＮＡへのポスト結合、cＧＡＳはＩＦＮ遺伝子の小胞体結合タンパク質刺激因子（ＳＴＩＮＧ）上にドッキングするセカンドメッセンジャーサイクリックＧＭＰ－ＡＭＰを産生する酵素能力を有する。Barberら、2011。これにより、ＳＴＩＮＧがホモ二量体化し、ＥＲから遊走し(Dobbsら、2015）、ＳＴＩＮＧをリン酸化するＴＡＮＫ結合キナーゼ１を動員することで、ＩＦＮの発現を開始させる転写因子ＩＦＮ調節因子３が生じる。Dobbsら、2015; Wangら、2014；およびLiuら、2015を参照のこと。したがって、Ｉ型ＩＦＮの発現は上記および引用された参考文献に記載されるように、細胞質ＤＮＡセンサーによって認識され得る標的細胞に二本鎖ＤＮＡを送達することによって誘導され得る。

【0130】

いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される組成物は、Ｉ型ＩＦＮアゴニストを含む無傷のミニ細胞を含む。いくつかの実施形態において、Ｉ型ＩＦＮアゴニストは本明細書中に記載されるように、Ｉ型ＩＦＮのＤＮＡセンサ媒介誘導に適切なオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、または少なくとも約２００ヌクレオチドの配列を含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドが約１０から約２００までのヌクレオチドの配列、またはこれらの２つの値の間の任意の量を含む。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、または少なくとも約６０ヌクレオチドの配列を含む。

【0131】

他の実施形態において、酵素ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（ＰＮＰａｓｅ１）のポリヌクレオチド産物は、ＩＦＮ活性の合成誘導物質として使用され得る。Fieldら、1967。同様に、ｄｓＲＮＡ模倣ポリイノシン：ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））は、ＴＬＲ３およびＭＤＡ５の両方に対するアゴニストとして機能することが示された。Alexopoulouら、2001；およびGitlinら、2006。したがって、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドがＰＮＰａｓｅ１、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ポリＩＣＬＣ、イミキモド、イミダゾキオリンレスキモド、またはＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドのポリヌクレオチド産物である。

【0132】

合成オリゴヌクレオチドはまた、核酸センサーのアゴニストとして設計され、使用され得る。たとえば、ＴＬＲ９活性化合成ＣｐＧオリゴデオキシ核酸（ＣｐＧ－ＯＤＮ）は、ヒトＤＮＡとは対照的に非メタル化ＣｐＧモチフに富んでいるという、菌ＤＮＡの免疫刺激特性に基づいて設計された。Kriegら、1995。配列特徴および骨格修飾の最適化は、Ｂ細胞またはｐＤＣのいずれかを優先的に活性化するＣｐＧＯＤＮサブタイプをもたらした。したがって、本明細書では、ＣｐＧ－ＯＤＮはメチル化されていてもメチル化されていなくてもよく、または両方の組み合わせであってもよいと考えられる。

【0133】

Ｉ型ＩＦＮ分泌の刺激因子であることが知られている多くの分子が存在し、これらの分子はそれらのアゴニストと共に、ミニ細胞を介して送達してＩ型ＩＦＮ分泌を誘発するのに適している。これらの分子には限定されるわけではないが、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)、ポリ(ｄＡ：ｄＴ)ＤＮＡ、二本鎖Ｚ－ＤＮＡおよびＢ－ＤＮＡ、３６ｂｐおよびＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドより長いＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、細菌のセカンドメッセンジャーであるサイクリックジＧＭＰ、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９アゴニスト、ならびに以下により十分に説明されるＳＴＩＮＧアゴニストが含まれる。

【0134】

ii． 二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）
二本鎖ＲＮＡはI型ＩＦＮの誘導因子である。ＲＮＡヘリカーゼであるレチノイン酸誘導遺伝子Ｉ（ＲＩＧ―Ｉ）とメラノーマ分化関連遺伝子５（ＭＤＡ５）は、I型ＩＦＮ分泌を誘発する細胞質受容体である。これらの受容体（ＲＩＧ－Ｉ様受容体）はミトコンドリア局在アダプター分子ＩＰＳ－１あるいはＭＡＶＳとキナーゼＴＢＫ１、ＩＫＫｉを介してシグナルを伝達し、ＩＲＦ３を活性化し、I型ＩＦＮ易伝子の転写を誘導する（河合・秋良、2010）。ＲＩＧ－ＩおよびＭＤＡ５は、それらの５’末端でトリリン酸化されたウイルスＲＮＡに応答する（LeungおよびAmarasinghe、2016; Lu ら、2010; Marq ら、2011; Wang ら、2010）。

【0135】

iii． ポリ（ｄＡ：ｄＴ）ＤＮＡ
ＲＮＡポリメラーゼIIIは、ポリ(ｄＡ：ｄＴ)ＤＮＡのための細胞質ゾルＤＮＡセンサーである(Ablasser ら、2009）。細胞質ゾルでは、ＲＮＡポリメラーゼIIIがポリ（ｄＡ：ｄＴ）を５’トリリン酸化を伴うＲＮＡに変換する。変換された５’-ｐｐｐＲＮＡは、次にＲＩＧ－Ｉ－ＭＡＶＳ経路とＮＦκＢ活性化を開始させて、Ｉ型ＩＦＮ分泌を誘発する。

【0136】

iv． 二本鎖Ｚ-ＤＮＡとＢ-ＤＮＡ
サイトゾルＤＮＡセンサー、ＩＲＦのＤＮＡ依存性アクチベーター（ＤＡＩ）またはＺ-ＤＮＡ結合タンパク質１は、ＴＢＫ１及びＩＲＦ３を介する機構において、右巻きのｄｓＤＮＡ高次構造（Ｂ-ＤＮＡ）に応答してI型ＩＦＮを誘導することが知られている(Kawai and Akira、2010）。ＲＮＡポリメラーゼIIIもＢ－ＤＮＡを５’－ｐｐｐＲＮＡに転写し、その後ＲＩＧ－Iを介してＩ型ＩＦＮ転写を活性化する（Chiuら、2009）。これらの転写因子がリン酸化されると、Ｉ型ＩＦＮファミリーのすべての遺伝子の発現を促すのに役立ち、それによってＩ型ＩＦＮ産生が増幅される。多くのサイトゾルＤＮＡセンサーが細胞内病原性ＤＮＡを認識することが報告されている。例えば、Xiaら、"DNA sensor cGAS-mediated immune recognition"、Protein Cell、7（11）： 777－791 （2016）から抜粋された図２６を参照されたい。

【0137】

例えば、ＤＤＸ４１（Zhangら、2011b）、ＩＦＩ１６（Orzalliら、2012; Unterholznerら、2010）およびＤＡI(Takaokaら、2007）は二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を検出し、ＳＴＩＮＧＴＢＫ１ＩＲＦ３経路を活性化する。ＬＲＲＦＩＰ１はｄｓＤＮＡと結合し、β－カテニンを介してＩＲＦ３の活性化を引き起こす（Yangら、2010）。ＤＨＸ９およびＤＨＸ３６はｄｓＤＮＡと会合し、ＭｙＤ８８を介してＮＦκＢ活性化をもたらす（Kimら、2010）。Ｋｕ７０はｄｓＤＮＡと結合して、ＩＲＦ１およびＡＳＣＲＦ７の活性化を介してI型インターフェロン（ＩＦＮ）を誘導する（Zhangら、2011a）。ＡＩＭ２はＡＳＣおよびプロ－カスパーゼ－1を動員することにより、ｄｓＤＮＡと相互作用し、インフラマソームを活性化する（Burckstummerら、2009年; Fernandes-Alnemriら、2009年; Hornungら、2009年）。注目すべきことに、Ｓｏｘ２は好中球のサイトゾルで発現し、dsＤＮＡに結合するとＴａｂ２／ＴＡＫ１複合体を配列依存的に活性化する(Xiaら、2015）。

【0138】

ｖ． ３６ｂｐより長いＤＮＡ（dsＤＮＡ）とＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド
ｃＧＡＳは、細胞質ＤＮＡを認識するＤＮＡセンサーである(Ablasserら、2013a; Ablasserら、2013b; Gaoら、2013a; Liら、2013b; Schogginsら、2014; Sunら、2013; Wuら、2013）。３６ｂｐより長い二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）がｃＧＡＳ活性化に最適である（Gaoら、2013b）。ポストＤＮＡ結合、ｃＧＡＳはＡＴＰおよびＧＴＰが触媒ポケットに入ることを可能にする立体配座変化を受け、ＳＴＩＮＧ－ＴＢＫ１軸の強い活性剤であるＣＧＡＭＰの合成をもたらす（Civrilら、2013; Gaoら、2013b; Kranzuschら、2013; Wuら、2013; Zhangら、2014）。cＧＡＳはｄｓＤＮＡおよびＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドによって活性化され得る（Mankanら、2014）。

【0139】

vｉ． 最近のセカンドメッセンジャーであるｃｙｃｌｉｃ-ｄｉ-ＧＭＰ
細菌のセカンドメッセンジャーであるｃｙｃｌｉｃ-ｄｉ-ＧＭＰはＤＡＩまたは他の既知の細胞質受容体とは無関係であるが、ＴＢＫ１及びＩＲＦ３を必要とする機構を介して、Ｉ型ＩＦＮを強力に誘導する（McWhirterら、2009）。

【0140】

ｖii． ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９アゴニスト
一部の細胞種、例えばマクロファージやＤＣでは、Ｉ型ＩＦＮがそれぞれｄｓＲＮＡやリポ多糖による膜貫通受容体トル様受容体３（ＴＬＲ３）やＴＬＲ４のトリガーに応答して産生される。ＴＬＲ３とＴＬＲ４はアダプター分子ＴＲＩＦを介してシグナルを伝達し、ＴＢＫ１と会合してＩＲＦ３を活性化する（川井・秋良、2010）。

【0141】

天然型ＩＦＮ産生細胞である形質細胞様ＤＣ(ｐＤＣ)(Colonnaら、2004）は、細胞内エンドソーム受容体であるＴＬＲ７とＴＬＲ９を優先的に発現し、アダプタータンパク質ＭｙＤ８８を介したシグナル伝達を引き起こすことで、それぞれ一本鎖ＲＮＡとＤＮＡウイルスに応答できるようにしている(Colonnaら、2004）。これらの受容体はこれらの細胞がＩＲＦ７とＩＲＦ８を恒常的に発現し、ＭｙＤ８８－ＩＲＦ７複合体はエンドソームコンパートメントに保持されるようにTLR連結時に時空間的調節を受け、そこでＩ型ＩＦＮ産生を誘発するため、ｐＤＣのみでI型ＩＦＮを誘発する効率が高い(Colonnaら、2004）。

【0142】

ＴＬＲ４アゴニストグルコピラノシル脂質免疫賦活剤（ＧＬＡ）は、単独で、または抗ＰＤｍＡｂと組み合わせて試験されている[Immune Design 2016](J.MeulenおよびS.Brady、「Immune Design」、Hum．Vaccin．Immunother.,13（1)：15（2017））。ＴＬＲ３アゴニストPolyiltonol(商標）およびＴＬＲ７／８アゴニストＭＥＤＩ９１９７もまた、進行した到達可能な固形腫瘍を有する患者において試験されている（MedImmune 2016；Oncovir 201）。("自然宿主防御を起動させること; Hiltonol（ポリＩＣＬＣ）および悪性腫瘍、ASalzar、Oncovir、Inc．、www．oncovir．com／id2(accessed July 11、2018); およびGuptaら、"Abstract ＣＴ０９１: ＭＥＤＩ９１９７の安全性と薬力学的活動、 ＴＬＲ ７／８ アゴニストは固形腫瘍と共に被検体内で管理される " Cancer Research、AACR Annual Meeting 2017; April 1-5、2017(published July 2017））。低線量放射線療法とともにＣｐＧ富化オリゴデオキシヌクレオチド(ＣｐＧＯＤＮ、ＰＦ－３５１２６７６）などのＴＬＲアゴニストの腫瘍内注射は、第Ｉ／ＩＩ相臨床試験で進行期非ホジキンリンパ腫患者において臨床反応を示している［Dynavax 2016］（Adamusら、2018）。

【0143】

viii． ＳＴＩＮＧアゴニスト
環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）［サイクリックジ（グアノシン５’一りん酸）、環状ジ（アデノシン５’一りん酸）、及び環状ＧＭＰは、インターフェロン遺伝子の細胞質パターン認識受容体刺激剤（ＳＴＩＮＧ）を介してＴＢＫ１／ＩＲＦ３／１型インターフェロンシグナル伝達軸を活性化する病原体関連分子パターン分子（ＰＡＭＰ）のクラスである。

【0144】

Ｉ型インターフェロン応答を誘発するための新しいＳＴＩＮＧアゴニストが開発されている。１つの主要なアプローチは効率を改善するためのＣＤＮの合理的な修飾を含み、これは、合成ジチオ混合結合ＣＤＮの開発につながる（Corralesら、2015）。１つの化合物(ＭＬ ＲＲＳ２ＣＤＡまたはＡＤＵＳ１００）はヒトおよびマウスＳＴＩＮＧの両方に結合し、複数の動物モデルにおいて強力な抗腫瘍効果を示した（Corralesら、2015）。皮膚アクセス可能な固形腫瘍およびリンパ腫を有する患者におけるＡＤＵＳ１００の第１相臨床試験が進行中である(Aduro Biotech 2016）。

【0145】

１０００ゲノムプロジェクトデータベース（http://www.1000genomes.org/）の解析から、ＷＴアレル、レファレンス（ＲＥＦ）アレル（Ｒ２３２Ｈ）、ＨＡＱアレル（Ｒ７１Ｈ、Ｇ２３０Ａ、Ｒ２９３Ｑ）、ＡＱアレル（Ｇ２３０Ａ、Ｒ２９３Ｑ）およびＱアレル（Ｒ２９３Ｑ）を含む５つのヒトＳＴＩＮＧ変種を識別した（Yiら、2013）。

【0146】

合理的に設計された合成ＣＤＮアゴニストＭＬ ＲＲＳ２ ＣＤＡが開発され、細菌または宿主細胞ｃＧＡＳによって産生される天然ＳＴＩＮＧリガンドと比較して、増強された安定性、ヒトＳＴＩＮＧ活性化、細胞取り込み、および抗腫瘍効力、ならびに低い反応原性を示す（Corralesら、2015; Fuら、2015）。

【0147】

Ｒｐ、Ｒｐ（Ｒ, Ｒ）ジチオ置換ジアステレオマーＣＤＮはホスホジエステラーゼによる消化に抵抗性であり、培養ヒト細胞においてＩＦＮ－βのより高い発現を刺激し、ジチオ修飾を含まないＣＤＮと比較してより強力な抗腫瘍免疫を誘導した（Corralesら、2015; Fuら、2015）。ヒトＳＴＩＮＧに対する親和性を増加させるために、ＭＬＲＲＳ２ ＣＤＡは、１つの２’５’および１つの３’５’混合ホスホジエステル結合（２’，３’ＣＤＮ）を有するリン酸架橋によって規定される非正準構造を含む。２’，３’混合結合構造は増大したＳＴＩＮＧ結合親和性を付与し（Gaoら、2013b）、真核生物cＧＡＳによって産生される内因性ｃＧＡＭＰにおいても見出される。ＭＬＲＲ―Ｓ２ＣＤＡは菌体３’，３’ＣＤＮ(Corralesら、2015; Fuら、2015）によって誘導されたシグナル伝達に耐性であることが知られているＲＥＦアレルに対するドナーホモジゴースを含む、異なるＳＴＩＮＧ型を有する複数のドナーから単離されたヒト周辺血球（ＰＢＭＣ）中のＩＦＮ－βのＨＥＫ２９３Ｔ細胞ＳＴＩＮＧシグナリングアッセイおよび誘導されたＩＦＮ－βの誘導ドーズ依存性発現において、広範囲に既知のヒトＳＴＩＮＧアレルを活性化することが示された。

【0148】

Ｃ． ＩＩ型インターフェロンアゴニスト
本発明の組成物および方法はII型ＩＦＮアゴニスト、すなわち、II型インターフェロンのレベル（例えば、活性または発現レベル）を増加させる薬剤を含み得る。型IIインターフェロン（ＩＦＮ）のクラスは、現在、ＩＦＮ－γ(ガンマ）と呼ばれるメンバーを含む。成熟ＩＦＮ－γは抗平行ホモ二量体であり、ＩＦＮ－γ受容体（ＩＦＮＧＲ）複合体に結合して標的細胞内でシグナルを誘発する。ＩＦＮＧＲはＩＦＮＧＲ１とＩＦＮＧＲ２と名づけられた各分子の２つのサブユニットからできている。ＩＦＮ－γは、免疫応答および炎症応答の調節に関与している；ヒトではインターフェロン－γは１種類のみである。活性化Ｔ細胞やナチュラルキラー細胞で産生される。ＩＦＮ－γはＩ型ＩＦＮの作用を増強する。Ｔｈ１細胞から放出されたＩＦＮ－γは感染部位に白血球を動員し、炎症を亢進させる。また、マクロファージを刺激して、飲み込まれた細菌を殺す。Ｔｈ１細胞から放出されるＩＦＮ－γは、Ｔｈ２応答の調節にも重要である。ＩＦＮ－γは免疫応答の調節に重要な役割を果たしており、その産生は自己免疫疾患を引き起こす可能性がある。

【0149】

したがって、本発明の一実施形態は、II型ＩＦＮアゴニストを含むミニ細胞を含む組成物を包含する。ミニ細胞は細菌に由来するが、ミニ細胞自体はヒト患者においてII型インターフェロン応答を活性化しない。実施例１５を参照。本発明者らは、ＩＦＮγの添加がドキソルビシンを負荷したＥＧＦＲ標的ＥＤＶの抗腫瘍効力を増大させ、異種移植モデルにおいて腫瘍退縮を引き起こすことを発見した。実施例１３を参照されたい。さらに、（i）超毒性化学療法薬ＰＮＵ１５９６８２を負荷したＥＦＧＲ標的化ミニ細胞、（ii）２０ヌクレオチドを含む二本鎖ＤＮＡを負荷した非標的化ミニ細胞、および（iii）ＩＦＮγ生成物Ｉｍｕｋｉｎを含むミニ細胞を含む組成物は後期内因性腫瘍に罹患しているイヌにおいて十分に耐性があり、抗がん効果を誘導した。実施例１４を参照。

【0150】

II型ＩＦＮは細胞傷害性Ｔ細胞を活性化することにより抗腫瘍免疫に重要な役割を果たす。例えば、Chikumaら、2017を参照のこと。ＩＦＮγサイトカインは自然抗原の結合によりナチュラルキラー細胞から放出されるが、スフィンゴ糖脂質化合物は自然免疫応答と獲得免疫応答の両方の強力な活性化因子として機能することができる。本発明者らは、スフィンゴ糖脂質への曝露がII型インターフェロン、ＩＦＮ－γ、および多数のインターロイキン（Ｔｈ１－、Ｔｈ２－、および／またはＴｈ１７－型サイトカイン）を含む自然ナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞による強力なサイトカイン応答を誘導することを発見した。例えば、Carrenoら、2016を参照のこと。次いで、iＮＫＴ細胞はＤＣ成熟を誘導し、細胞傷害性Ｔ細胞応答の発生をもたらすＴ細胞ヘルパー様機能を示す。

【0151】

ＩＦＮタイプII応答を誘導するのに有用なグリコスフィンゴリプの例は本明細書に記載されており、Ｃ－グリコシド形態のα－ガラクトシルセラミド（α－Ｃ－ＧａｌＣｅr)、αガラクタトシルセラミド (α－ＧａｌＣｅｒ)、１２炭素アシル形態のガラクトシルセラミド（β－ＧａｌＣｅｒ）、β－Ｄ－グルコピラノシルセラミド（β－GlcCer）、１，２－ジアシル－３－０－ガラクトシル－ｓｎ－グリセロール（ＢｂＧＬ－II）、ジアシルグリセロール含有糖脂質（Ｇｌｃ－ＤＡＧ－ｓ２）、ガングリオシド(ＧＤ３)、ガングリオトリアセラミド（Ｇｇ３Ｃｅr）、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）、α－グルクロノシルセラミド（ＧＳＬ－１またはＧＳＬ－４）、イソグロボトリヘキシルセラミド（iＧｂ３）、リポホスホグリカン（ＬＰＧ）、α－ガラクトシルセラミド類似体（ＯＣＨ）、およびトレイトルセラミド。特定の実施形態において、本明細書中に開示されるミニ細胞は、II型ＩＦＮアゴニストとしてα－ガラクトシルセラミド（α－ＧalCer）を含む。

【0152】

ＩＮＦＩI型アゴニストであるα－ＧＣは、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）として知られる白血球の一種の活性化を介して免疫系を刺激することが知られている（Birkholzら、2015）。ミニ細胞が標的細胞に対するα－ＧＣの提示を容易にすることができることを知り、実施例１７でさらに論じるように、出願人はミニ細胞_α-GCを用いたミニ細胞促進免疫活性化の研究へ移行し、化学療法薬のミニ細胞促進送達からなる治療を補完することができた。

【0153】

実施例１８に示すように、出願人は化学療法ドキソルビシン（^Epミニ細胞_Dox）を含有するミニ細胞を投与した腫瘍含有マウスと、α－ＧＣを含有するミニ細胞（ミニ細胞_α-GC）とが、^Epミニ細胞_Doxのみを投与したマウスよりも、腫瘍進行の顕著な停止を示すことを発見した。これらの観察はＩＮＦＩ型アゴニストを除き、代わりにＩＮＦＩＩ型アゴニストを組み込んだミニ細胞組成物が、マウスにおける腫瘍の治療に効果的であることを示した。

【0154】

ミニ細胞はｉＮＫＴ細胞活性化およびII型インターフェロンＩＦＮ－γ産生in vivoで増強する観点から、II型ＩＦＮアゴニストを免疫系の細胞に直接送達することができる。あるいは、標的でないＥＤＶは免疫系の貪食細胞に取り込まれ、そこでエンドソームで分解され、αＧＣは免疫活性化のためにiＮＫＴ細胞に提示される。したがって、いくつかの実施形態では、ミニ細胞がII型インターフェロンアゴニストの標的送達を提供する。他の実施形態では、本明細書に開示される組成物がII型インターフェロンアゴニストを含む非標的ミニ細胞を含む。

【0155】

ＩＦＮ－γ産生は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって分泌されるサイトカインによって制御され、最も顕著なのはインターロイキン（ＩＬ）－１２およびＩＬ－１８である。これらのサイトカインは、自然免疫応答におけるＩＦＮ－γ産生と感染を結びつける橋渡しとして働く。多くの病原体のマクロファージ認識はＩＬ－１２とケモカインの分泌を誘導する。これらのケモカインはＮＫ細胞を炎症部位に引き寄せ、ＩＬ－１２はこれらの細胞のＩＦＮ－γ合成を促進する。マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞では、ＩＬ－１２とＩＬ－１８の刺激が組み合わさるとＩＦＮ－γ産生がさらに増加する。従って、これらのタンパク質のいずれかまたはそれらの組み合わせは、本開示の目的のための適切な薬剤である。

【0156】

ＩＦＮ－γ産生の負の調節因子には、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、形質転換増殖因子βおよびグルココルチコイドがある。これらの因子を阻害するタンパク質や核酸は、ＩＦＮ－γの産生を刺激することができる。

【0157】

また、ＩＦＮ－γをコードするポリヌクレオチド、またはＩＦＮ－γの産生および／または分泌を活性化する遺伝子もこの文脈での使用に適している。

【0158】

ＩＦＮ－γのレベルを増加させる薬剤もまた、ウイルスワクチンであり得る。感染や他の種類の有害作用を引き起こすことなくＩＦＮ－緕Y生を誘導できる多くのウイルスワクチンが利用可能である。この種のウイルスワクチンの代表的なものは、インフルエンザ（インフルエンザ）ワクチンである。

【0159】

データは、腫瘍細胞に対する宿主免疫応答を効果的に活性化するために必要なＩＦＮ－γの血清濃度が患者が薬物負荷、二重特異的抗体標的化ミニ細胞または死滅細菌細胞の投与も受けた場合に低いことを示す。従って、1つの局面において、本発明の方法は、約３０，０００pg／mL以下の血清ＩＦＮγ濃度の増加を生じる。別の局面において、血清ＩＦＮ－γ濃度は、約５０００pg／mL、１０００pg／mL、９００pg／mL、８００pg／mL、７００pg／mL、６００pg／mL、５００pg／mL、４００pg／mL、３００pg／mL、２００pg／mL、または１００pg／mLより高くないまで増加する。さらなる局面において、得られる血清ＩＦＮγ濃度は、少なくとも約１０pg／mL、または少なくとも約２０pg／mL、３０pg／mL、４０pg／mL、５０pg／mL、６０pg／mL、７０pg／mL、８０pg／mL、９０pg／mL、１００pg／mL、１５０pg／mL、２００pg／mL、３００pg／mL、４００pg／mLまたは５００pg／mLである。

【0160】

いくつかの態様によれば、薬剤は、ＩＦＮγタンパク質、または操作されたタンパク質もしくはアナログである。いくつかの局面において、投与は、宿主血液のml当たり約０．０２ｎｇ～１マイクログラムのＩＦＮ－γを達成する。一態様では、宿主血液中で達成されるＩＦＮγ濃度が約０．１ng／ml～約５００ng／ml、約０．２ng／ml～約２００ng／ml、約０．５ng／ml～約１００ng／ml、約１ng／ml～約５０ng／ml、または約２ng／ml～約２０ng／mlである。

【0161】

III．無傷の細菌由来ミニ細胞
「ミニ細胞」という用語はここでは染色体を欠き（「無染色体」）、二分裂の際に、細胞分裂とＤＮＡ分離との協調の乱れによって生じた細菌細胞の誘導体を意味するために用いられる。ミニ細胞はいわゆる「膜ブレブ」（大きさが約０．２μｍ以下）のような他の小さな小胞とは異なっている。この小胞が特定の状況下で自然に生成・放出されるが、特定の遺伝子再編成やエピソーム遺伝子発現によるものではない。同じトークンによって、無傷のミニ細胞は同様ゴーストとは区別される。同様ゴーストは特異的な遺伝子再編成やエピソーム遺伝子発現のために生成されない。本開示で使用される細菌由来のミニ細胞は完全に無傷であり、したがって、破壊または分解され、除去さえされる外膜または画定膜によって特徴付けられる、他の無染色体形態の細菌細胞誘導体とは区別される。米国特許を参照されたい。第7,183,105号、第111欄、第54行以降。本開示のミニ細胞を特徴付ける無傷の膜は、腫瘍発明内で、取り込み後にペイロードが放出されるまで、ミニ細胞内での治療用ペイロードの保持を可能にする。

【0162】

ミニ細胞またはＥＤＶは、正常な細菌細胞分裂を制御する遺伝子を不活性化し、それによって細胞の極性部位を脱抑制する結果として産生される無核の非生存ナノ粒子である。Maら、2004。抑制解除は細菌が中心および極で分裂することを意味し、本開示の発明者らが示したミニ細胞をもたらす極性分裂は、様々な化学療法薬の効率的なパッケージ化を可能にする漏出耐性のマイクロリザーバ担体として機能することができる。さらに、例えば、粒子当たり約14,000分子しかパッケージ化できない現在のステルスリポソーム薬物キャリア（リポソームドキソルビシン）とは対照的に(Parkら、Breast Cancer Res、4(3)：95－99（2002））、または５個未満の薬物分子を運ぶことができる「武装抗体」、ＥＤＶは、100万個までの薬物分子のペイロードを容易に収容することができる。さらに、ＥＤＶは二重特異性抗体を使用してがん細胞の表面上の過剰発現受容体を標的とすることができ（下記の部Dを参照）、これはインビトロおよびインビボの両方で、非常に有意な腫瘍増殖阻害および／または退行を可能にする。

【0163】

本発明で使用されるミニ細胞は、ＥｃｏｌｉおよびＳｔｙｐｈｙｍｕｒｉｕｍなどの細菌細胞から調製することができる。原核生物の染色体複製は、中細胞隔形成を含む、正常な二分裂に連結されている。たとえば大腸菌では、ｍｉｎＣＤのようなｍｉｎ遺伝子の変異によって、細胞分裂の際に細胞極での隔壁形成の阻害を取り除くことができ、その結果、正常な娘細胞と染色体のないミニ細胞が産生される。de Boer ら、J.Bacteriol.,174：63－70 (1992)；Raskin & de Boer、J.Bacteriol.,181：6419－s24 (1999); Hu & Lutkenhaus、Mol.Microbio.,34：82－90（1999); Harry, Mol. Microbiol.,40：795（2001）を参照されたい。

【0164】

ｍｉｎオペロン突然変異に加えて、例えば枯草菌のｄｉｖＩＶＢ１において、隔壁形成に影響を及ぼす一連の他の遺伝子再編成または突然変異に続いて、染色体のないミニ細胞も生成される。ReeveおよびCornett、JVirol., 15：1308（1975）を参照のこと。ミニ細胞はまた、細胞分裂／染色体分離に関与するタンパク質の遺伝子発現レベルの撹乱に続いて形成され得る。例えば、ｍｉｎＥの過剰発現は、極性分裂およびミニ細胞の産生を導く。同様に、染色体のないミニ細胞は染色体分離における欠損、例えば、Bacilus subtilisにおけるｓｍｃ突然変異（Brittonら、Genes Dev.,12： 1254（1998））、BsubtilisにおけるspoOJ欠失（Iretonら、JBacteriol., 176： 532029（1994））、ＥｃｏｌｉにおけるｍｕｋＢ突然変異（Hiragaら、JBacteriol., 171：1496（1989））、およびＥｃｏｌｉにおけるｐａｒＣ突然変異（StewartおよびD’Ari、JBacteriol., 174：4513（1992））に起因し得る。さらに、ＣａｆＡは細胞分裂の速度を増強し得、そして／または複製後の染色体分配を阻害し得（Okadaら、JBacteriol., 176：917（1994））、連鎖細胞および染色体不含ミニ細胞の形成を生じる。

【0165】

したがって、ミニ細胞は任意の細菌細胞からの本開示のために調製することができ、これは、これらの細菌における細菌細胞分裂の保存された性質によるグラム陽性またはグラム陰性起源である。さらに、本開示において使用されるミニ細胞は上記のように、無傷の細胞壁（すなわち、「無傷のミニ細胞」）を有するべきであり、そして特定の遺伝的再配置またはエピソーム遺伝子発現に起因しない、他の小胞（例えば、膜ブレブ）と区別され、そしてそれらから分離されるべきである。

【0166】

所与の実施形態において、ミニ細胞の親（供給源）細菌は、グラム陽性であり得るか、またはグラム陰性であり得る。一態様では、親細菌がTerra-/Glidobacteria(BV1）、Proteobacteria(ＢＶ２）、Spirochaetes、Sphingobacteria、およびPlanctobacteriaを含むＢＶ４から1つ以上選択される。別の局面に追及すると、細菌は、Bacilli、ClostridiaまたはTenericutes／MollicutesなどのFirmicutes(ＢＶ３）、またはActinomycetalesまたはBifidobacterialesなどのActinobacteria(ＢＶ５）から選択される1つ以上である。

【0167】

本発明によれば、死滅細菌細胞は、Bergey’s Manual Of Systematic Biologyの第２版に定義されているような、細菌、シアノバテリア、真正細菌および古細菌の非生存原核細胞である。このような細胞はそれらが無傷の細胞壁および／または細胞膜を有し、細菌種に内因性である遺伝物質（核酸）を含む場合、「無傷」であると見なされる。死滅した細菌細胞を調製する方法は例えば、米国特許出願公開第2008／0038296号に記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0168】

さらに別の局面において、該細菌は、エオバクテリア（クロロフレキシ、デイノコッカス－サームス）、シアノバクテリア、サーモフルバクテリア、好熱菌（アキフィカ、サーモトガエ）、アルファ、ベータ、ガンマ（腸内細菌科）デルタまたはエプシロンプロテオバクテリア、スピロバクテリア、スピロヘータ、フィブロバクター、クロロビ／バクテロイデス、クラミジア／ベルコメクロビア、プラントミケス、アシドバクテリア、クリシオゲネス、デフェリバクテリア、フソバクテリア、ゲムアチモナデテス、ニトロスピラ、シネルギステス、ディクチオグロムス、レンティスファエラバシラス、バシラス、リステリア科、ブドウ球菌、腸球菌科、エンテロコッカス、ラクトバシラセエ、ロイコノストック、クロストリジウム、サーモアナエロバクター、マイコプラズマ目、アナエロプラズマ目、アコレプラズマ目、アクチオマイシネ、アクチノマイセス、コリネバクテリウム、コリネバクテリウム、フランキナーゼ、ミクロコッシネ、ブレビバクテリウム、およびビフィズス菌から１種以上が選択される。

【0169】

薬学的使用のために、本開示の組成物は、免疫原性成分および他の毒性汚染物質から可能な限り完全に単離されたミニ細胞または死滅した細菌細胞を含むべきである。遊離エンドトキシンおよび親細菌細胞を除去するために細菌由来のミニ細胞を精製するための方法論は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるWO 2004／113507に記載されている。簡単には、（a）一般に０．２μｍより小さい膜ブレブなどのより小さい小胞、（b）細胞膜から放出される遊離エンドトキシン、および（c）生きているか死んでいるかにかかわらず親細菌、およびそれらの破片（これも遊離エンドトキシンの供給源である）の除去を達成する。このような除去は、とりわけ、より小さい小胞および細胞残屑を除去するための０．２μｍ濾過、親細胞を誘導してフィラメントを形成した後に親細胞を除去するための０．４５μｍ濾過、生きた細菌細胞を殺すための抗生物質、および遊離エンドトキシンに対する抗体を用いて実施することができる。

【0170】

精製手順の基礎はそれらの細菌供給源の差異にもかかわらず、全ての無傷のミニ細胞は約４００nmのサイズであり、すなわち、膜小胞および他のより小さい小胞より大きく、そして親細菌より小さいという本発明者らによる発見である。ミニ細胞のサイズ決定は、電子顕微鏡法などの固体状態を使用することによって、または液体ベースの技術、例えば動的光散乱によって達成することができる。そのような各技法によってもたらされるサイズ値は誤差範囲を有する可能性があり、その値は、技法間でいくらか異なる可能性がある。したがって、乾燥状態のミニ細胞のサイズは、電子顕微鏡法によって約４００nm±５０nmと測定することができる。動的光散乱は、同じミニ細胞を約５００nm±５０nmのサイズであると測定することができる。また、薬物パッケージ化リガンド標的ミニ細胞は、やはり動的光散乱を使用して、約４００nm～６００nm±５０nmであると測定することができる。

【0171】

サイズ値のこの散乱は、例えば上記のように、免疫原性成分および他の毒性汚染物質からミニ細胞を単離する目的のために、実際に容易に適応される。すなわち、無傷の細菌由来ミニ細胞は、ミニ細胞に堅い球状構造を与える堅い膜によって囲まれた細胞質を特徴とする。この構造は透過型電子顕微鏡写真で明らかであり、ミニ細胞の直径は硬い膜の外側の境界の間でミニ細胞を横切って測定される。この測定により、上述した４００nm±５０nmのサイズ値が得られた。

【0172】

死滅した細菌細胞またはグラム陰性細菌に由来するミニ細胞のもう一つの構造要素はリポ多糖（ＬＰＳ）のＯ-多糖成分であり、これはリピドＡアンカーを介して外膜に埋め込まれている。この成分は、鎖の反復単位当たり４～５個の糖の７０～１００個もの反復単位を有する反復炭水化物残基単位の鎖である。これらの鎖はin vivoのように液体環境では剛性ではないので、サンゴ海環境で海藻の一般的な外観を与える波状の柔軟な構造をとることができる；すなわち、鎖は、ミニ細胞膜に固定されたままで液体と共に移動する。

【0173】

Ｏ-多糖成分の影響を受けて、動的光散乱は上記のように、約５００nm～約６００nmのミニ細胞サイズの値を提供することができる。それにもかかわらず、グラム陰性菌およびグラム陽性菌のミニ細胞は同様に０．４５μｍ濾過を容易に通過し、４００nm±５０nmの有効ミニ細胞サイズを実証する。上記の大きさのばらつきは、本発明に包含され、特に、「約４００nmの大きさ」などの語句における修飾語句「およそ」によって示される。

【0174】

毒性汚染物質に関して、本開示の組成物は、好ましくは約３５０EU未満の遊離エンドトキシンを含む。これに関して、約２５０EU以下、約２００EU以下、約１５０EU以下、約１００EU以下、約９０EU以下、約８０EU以下、約７０EU以下、約６０EU以下、約５０EU以下、約４０EU以下、約３０EU以下、約２０EU以下、約１５EU以下、約１０EU以下、約９EU以下、約８EU以下、約７EU以下、約６EU以下、約５EU以下、約４EU以下、約３EU以下、約２EU以下、約１EU以下、約０．９EU以下、約０．８EU以下、約０．７EU以下、約０．６EU以下、約０．５EU以下、約０．４EU以下、約０．４EU以下、約０.３EU以下、約０．２EU以下、約０．１EU以下、約０．０５EU以下、または約０．０１EU以下。

【0175】

本発明の組成物はまた、少なくとも約１０⁹のミニ細胞または死滅した細菌細胞、例えば、少なくとも約１×１０⁹、少なくとも約２×１０⁹、少なくとも約５×１０⁹、または少なくとも８×１０⁹含むことができる。いくつかの実施形態において、組成物は約１０¹¹個以下のミニ細胞または死滅したバクテリアセル、例えば約１×１０¹¹以下、または約９×１０¹⁰以下、または約８×１０¹⁰以下を含む。

【0176】

ＩV．ミニ細胞または殺菌された細菌細胞への活性物質のロード
活性剤または抗腫瘍剤（例えば、小分子薬物、タンパク質および機能性核酸）は、複数の無傷のミニ細胞を活性剤と一緒に緩衝液中で共インキュベートすることによって、ミニ細胞中に直接パッケージ化され得る。緩衝液の組成は、この分野でよく知られている条件に応じて変化させ、無傷のミニ細胞における活性剤の負荷を最適化することができる。緩衝液はまた、薬剤に依存して（例えば、核酸ペイロードの場合、ヌクレオチド配列またはミニ細胞にロードされる核酸の長さに依存して）変化され得る。ローディングに適した例示的な緩衝液にはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれるが、これに限定されない。一旦パッケージ化されると、活性剤はミニ細胞内に残り、分解から保護される。無菌生理食塩水中でインキュベートしたｓｉＲＮＡパッケージ化ミニ細胞を用いた長期インキュベーション研究は例えば、ｓｉＲＮＡの漏出がないことを示した。

【0177】

核酸によってコードされ得る機能性核酸またはタンパク質のような活性剤は、活性剤をコードするプラスミドのようなベクターを親細菌細胞に形質転換することによって、ミニ細胞に導入され得る。ミニ細胞が親細菌細胞から形成される場合、ミニ細胞は、プラスミドおよび／または発現産物、抗腫瘍剤の特定のコピーを保持する。ミニ細胞へのパッケージ化および発現産物のさらなる詳細は国際公開第03／033519号パンフレットにより提供され、その内容は参照によりその全体が本発明に組み込まれる。

【0178】

WO 03／033519に提示されるデータは、例えば、哺乳動物遺伝子発現プラスミドを保有する組換えミニ細胞が、食細胞および非食細胞に送達され得ることを実証した。国際公開第03／033519号パンフレットはまた、エピソーム複製プラスミドＤＮＡ上に担持された異種核酸を用いたミニ細胞産生親細菌株の遺伝的形質転換を記載した。親生物とミニ細胞を分離すると、エピソームＤＮＡの一部はミニ細胞に分離される。得られた組換えミニ細胞は哺乳類食細胞に容易に飲み込まれ、細胞内ファゴリソソーム内で分解されるようになった。さらに、組換えＤＮＡの一部はファゴリソソーム膜を逃れ、哺乳類細胞核に輸送され、そこで組換え遺伝子が発現した。

【0179】

他の実施形態では、異なるmＲＮＡ標的に向けられた複数の核酸を、同じミニ細胞にパッケージ化することができる。このようなアプローチは、薬物耐性およびアポトーシス耐性と戦うために使用され得る。例えば、がん患者は日常的に化学療法薬に対する耐性を示す。このような耐性は、とりわけ、多剤耐性（ＭＤＲ）ポンプおよび抗アポトーシス遺伝子のような遺伝子の過剰発現によって媒介され得る。この耐性に対抗するために、ミニ細胞は、ＭＤＲ席連遺伝子に対する治療的に有意な濃度の機能性核酸と共にパッケージされ得、そして化学療法の前に患者に投与され得る。さらに、異なるｍＲＮＡ標的に向けられた同じミニ細胞複数の機能性核酸へのパッケージ化は、ほとんどの分子標的が突然変異を受け、複数の対立遺伝子を有するため、治療成功を高めることができる。ミニ細胞への核酸の直接パッケージ化のさらなる詳細は国際公開第2009／027830号パンフレットに提供されており、その内容は、参照によりその全体が本願に組み込まれる。

【0180】

小分子薬物は、親水性であろうと疎水性であろうと、ミニ細胞を含む細胞外培地とミニ細胞細胞質との間に薬物の濃度勾配を作り出すことによってミニ細胞中にパッケージ化することができる。細胞外培地がミニ細胞の細胞質よりも高い薬物濃度を含む場合、薬物は、この濃度勾配を下ってミニ細胞の細胞質に自然に移動する。しかし、濃度勾配が逆になると、薬物はミニ細胞から外に移動しない。例えば、米国特許出願公開第2008／0051469号（その内容は参照により特に組み込まれる）に、薬物ローディングプロセスおよびその驚くべき性質のさらなる詳細が見出される。

【0181】

ミニ細胞に、通常は水溶性ではない薬物を装填するために、薬物は最初に、適切な溶媒に溶解され得る。例えば、パクリタキセルはエタノールとクレモフォアＥＬ(ポリエトキシル化ヒマシ油）との１：1ブレンドに溶解し、続いてＰＢＳ中で希釈して、水性媒体中で部分的に希釈され、薬物が溶液中に残ることを確実にするために最小量の有機溶媒を担持するパクリタキセルの溶液を達成することができる。ミニ細胞は、薬物負荷のためにこの最終培地中でインキュベートすることができる。従って、本発明者らは疎水性薬物でさえ、ミニ細胞の細胞質または膜中に拡散して、高い、そして治療的に有意な細胞質薬物負荷を達成し得ることを発見した。これは、ミニ細胞膜が疎水性リン脂質二重層から構成されており、疎水性分子の細胞質への拡散を防止することが期待されるため、予想外である。代表的な低分子薬物の多様性のミニ細胞へのローディングが示されており、様々なサイズおよび化学的特性が示されている：ドキソルビシン、パクリタキセル、フルオロ－パクリタキセル、シスプラチン、ビンブラスチン、モンサトロール、チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）阻害剤ＯＳＩ－７９０４、イリノテカン、5－フルオロウラシル、ゲムシタビン、およびカルボプラチン。さらに、ボードを横切って、得られた小分子薬物パッケージ化ミニ細胞は、インビトロおよびインビボで、有意な抗腫瘍効力を示す。

【0182】

Ｖ． ミニ細胞を特定の哺乳類細胞および腫瘍の標的化する
本発明者らは腫瘍細胞周囲の血管が完全性の喪失を示すことを発見した。すなわち、血管は血液脳関門（ＢＢＢ）環境においても、大きな開窓を有し、「漏れやすい」状態である。がん細胞が定着すると、新たな血管の形成を促進する物質－血管新生と呼ばれるプロセス－を分泌する。これらの血管は速やかに成長し、正常な血管とは異なり、５０nmから１．２μｍ（透過性亢進血管系）の「穴」（開窓部）で漏れやすい。リポソームなどの薬物送達粒子は、現在、腫瘍微小環境を支持する漏出性血管系からの血管外遊出を含む受動的方法によって腫瘍標的化をもたらすと考えられている。Hobbsら、1998。異常な腫瘍微小環境は間質性高血圧を特徴とし、この現象が抗がん抗体治療薬のアクセスを制限し得ることが示されているが、これは免疫リポソーム（Nielsenら、2002）およびQuantum Dotsに結合体化された抗体（Gaoら、2004）によって例示されるように、絶対的な障壁であるとは思われない。この現象は、特異的に指向された腫瘍抗体を保有するという追加の利点を有するＥＤＶにも当てはまる。静注後、ＥＤＶは腫瘍の微小環境に漏出し、その後、がん細胞表面受容体との結合およびエンドサイトーシスを介して能動的なターゲティングが行われる。したがって、従来の理解とは対照的に、ミニ細胞と同じ大きさ、すなわち、ＢＢＢの上記のコンセンサス孔径限界よりもはるかに大きい粒子は、それにもかかわらず、漏出性血管壁の開窓よりも小さく、したがって、これらの開窓を通って腫瘍微小環境に受動的に溢出することができる。

【0183】

腫瘍微小環境に入ると、ミニ細胞は宿主腫瘍細胞による受容体媒介性の内在化を誘発し、それらに取り込まれることができる。したがって、抗腫瘍剤でパッケージ化されたミニ細胞は腫瘍細胞の細胞質中に薬剤を放出し、それを殺す。

【0184】

本開示のさらなる態様によれば、上記の組成物のミニ細胞または殺された細菌細胞は、リガンドを介して標的哺乳動物腫瘍細胞に向けられる。いくつかの実施形態では、リガンドは「二重特異性」ですなわち、リガンドはミニ細胞および哺乳動物（腫瘍）細胞成分の両方に対して特異性を示し、その結果、所与の小胞を標的細胞に結合させ、それによって、後者が前者を飲み込む。ミニ細胞を腫瘍細胞に標的化するための二重特異性リガンドの使用は国際公開第05／056749号パンフレットおよび国際公開第05／079854号パンフレットにさらに記載されており、死滅した細菌細胞を腫瘍細胞に標的化するための二重特異性リガンドの使用は、米国特許第8,591,862号にさらに記載されており、これらの記載内容は、その全部を参照してここに盛り込んでいる。このようなリガンドが小胞に付着すると、リガンドの非占有特異性（「単一特異性」）は、それが標的（腫瘍）哺乳動物細胞と相互作用するまで関係する。多数の腫瘍標的化リガンドが当該分野で公知である（Hongら、2011; Hoelderら、2012; Galluzziら、2013）。ソマトスタチン（ＳＳＴ）ペプチド、血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）、Ａｒｇ（ＲＧＤ）ペプチド、およびボンベシン／ガストリン放出ペプチド（ＢＢＮ／ＧＲＰ）などのいくつかのペプチドは腫瘍受容体イメージングについて首尾よく特徴付けられている(De Jongら、2009; Tweedle、2009; SchotteliusおよびWester、2009; Igarashiら、2011; Lavermanら、2012）。

【0185】

腫瘍標的化ペプチド配列は主に３つの異なる方法で選択され得る：（1）天然タンパク質からの誘導体化（Nagpalら、2011)；(2）化学合成および構造に基づく合理的工学（Anderssonら、2000; Merrifield、2006）；ならびに（3）ペプチドライブラリーのスクリーニング（GrayおよびBrown 2013）。これらの方法の中で、ファージディスプレイ技術は従来の方法であるが、最も広く使用されている方法であり、多くの利点（例えば、取り扱いの容易さ、および多数の異なるペプチドが効果的にスクリーニングされ得る（Deutscher，2010））。
正常細胞ではなく腫瘍細胞に過剰発現している受容体は、in vivo腫瘍イメージングの優れた候補である。今日まで、多くの腫瘍標的化ペプチドおよびそれらのアナログが、以下に記載されるように同定されている。

【0186】

Arg－Gly-Asp（ＲＧＤ）ペプチドＲＧＤは、インテグリン受容体に特異的に結合す(Ruoslahti、1996）。インテグリンは２つのサブユニット（αとβサブユニット）を構成する。インテグリンファミリー、特にαｖβ３は、腫瘍の血管新生および転移と関連している。これらは血管新生時に内皮細胞上に過剰発現するが、ほとんどの正常器官ではほとんど検出できない。そのため、画像診断に広く用いられている。

【0187】

ボンベシン（ＢＢＮ）／消化性放出ペプチド（ＧＲＰ）－両生類ＢＮおよびその関連ペプチドは、エキソクリン、内分裂、サーモレギュレーション、スクロース規制、ならびに細胞成長などの種々の生理的効果を示すニューロペプチドファミリーから成る（Ohki－Hamazaki他、2005）。ボンベシン様ペプチド受容体には、ニューロメジンＢ受容体、ボンベシン３受容体、ＧＲＰ受容体、ボンベシン４受容体の４つのサブタイプがある。これらの受容体は、乳がん、卵巣がんおよび消化管間質腫瘍などの多くの腫瘍において過剰発現される。

【0188】

コレシストキニン（ＣＣＫ）／ガストリンペプチドＣＣＫおよびガストリンは構造的および機能的に類似したペプチドであり、胃腸管ならびに中枢神経系において様々な生理学的作用を発揮する（Matsunoら、1997）。ＣＣＫに対する３種類の受容体（ＣＣＫ１、ＣＣＫ２、ＣＣＫ２ｉ４ｓｖ）が同定されており、いずれもＧＰＣＲのスーパーファミリーに属している。中でもＣＣＫ２／ガストリン受容体は、間質性卵巣がんおよび星状細胞腫などのヒトがんにおいて頻繁に見出されている。

【0189】

α－Melanocyte-stimulating hormone （α-ＭＳＨ）－α－ＭＳＨは直鎖状トリデカペプチドであり、主に皮膚色素沈着調節を担っている(Singh and Mukhopadhyay、2014）。α－ＭＳＨとその類似体はヒトメラノーマ転移の８０％以上に発現するメラノコルチン－１受容体（ＭＣ―１ｒ）に結合親和性を示し、メラノーマ標的イメージングと放射線療法の媒体として広く使用されている。

【0190】

ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）ＮＰＹは３６アミノ酸ペプチドであり、膵臓ポリペプチドファミリーに属する（Tatemoto，2004）。ＮＰＹ受容体は、神経芽細胞腫、肉腫、および乳がんを含む様々な腫瘍において過剰発現される。

【0191】

Neutrotensin (ＮＴ)－ＮＴは１３アミノ酸ペプチドで、膵管腺がん、小細胞肺がん、甲状腺髄様がんなど様々な腫瘍で同定されているＮＴ受容体を標的としている(Tyler-McMahonら、2000）。したがって、それはがんイメージングのための魅力的な候補である。

【0192】

前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）前立腺がん細胞は、細胞表面上でＰＳＭＡを過剰発現する(Silverら、2007; Ghosh and Heston、2004; Mhawech-Faucegliaら、2007; Santoni ら、2014）。［⁶⁸Ｇａ］ＧａＰＳＭＡ－ＨＰＥＤＣＣ（［⁶⁸Ｇａ］ＧａＰＳＭＡ－１１［ＰＥＴ］としても知られる）、モノクローナル抗体(ｍＡｂ)[¹⁷⁷ Ｌｕ］Ｌｕ／［⁹⁰ Ｙ］ｙ－Ｊ５９１（療法）、［¹²³Ｉ］Ｉ－ＭＩＰ－１０７２（平面／ＳＰＥＣＴ）、［¹³¹Ｉ］Ｉ－ＭＩＰ－１０９５（療法）、およびＰＥＴのための⁶⁸Ｇａまたは治療のための¹⁷⁷Ｌｕで標識されたセラノスティック剤ＰＳＭＡ－Ｉ＆ＴおよびＤＫＦＺ－ＰＳＭＡ－６１７（ＰＳＭＡ－６１７）を含む、ＰＳＭＡを標的とするいくつかの利用可能な放射性医薬品がある。

【0193】

ソマトスタチン（ＳＳＴ）ペプチドＳＳＴは１４または２８アミノ酸のいずれかを有する天然に存在するシクロペプチドホルモンである（Weckbeckerら、2003）。インスリン、グルカゴン、その他のホルモンの分泌を阻害することができる。ソマトスタチン受容体（ＳＳＴＲ；５つのサブタイプＳＳＴＲ１～ＳＳＴＲ５）は、神経膠腫、神経内分泌腫瘍および乳房腫瘍を含む多くの腫瘍において過剰発現される。ＧＥＰ系の神経内分泌腫瘍（ＮＥＮ）は、膵臓、空腸、回腸、盲腸、直腸、虫垂、結腸に由来することが最も多い。すべてのＧＥＰ－ＮＥＮに共通する特徴は、内分泌細胞と神経細胞の複合的な特徴である。高分化型ＮＥＮはソマトスタチン受容体（ＳＳＴＲ）、特にＳＳＴＲ―２サブタイプを過剰発現する。

【0194】

サブスタンスＰ－サブスタンスＰは、タキキニン（Strand、1999）として知られる神経ペプチドファミリーに属するウンデカペプチドである。サブスタンスＰはニューロキニン１受容体（ＮＫ１Ｒ）に知られる特異的な内因性リガンドであり、様々ながん細胞に発現していることがわかっている。

【0195】

Ｔ１４０Ｔ１４０は１つのジスルフィド架橋を有する１４アミノ酸ペプチドであり、ケモカイン受容体４型（ＣＸＣＲ４）の逆アゴニストである（Burgerら、2005）。その誘導体はＣＸＣＲ４造影剤として広く使用されている。

【0196】

腫瘍分子標的ペプチド１（ＴＭＴＰ１）ＴＭＴＰ１は高転移性がん細胞、特に典型的な肝微小転移由来のがん細胞に特異的に結合することが見出されている５アミノ酸ペプチドである（Yangら、2008）。

【0197】

血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）ＶＩＰは２８アミノ酸を有する神経ペプチドである（Igarashiら、2011）。血管拡張、細胞増殖を促進する。その作用は主に２つの受容体サブタイプ（ＶＰＡＣ１とＶＰＡＣ２）によって制御されている。ＶＩＰ受容体はすい臓の腺がんや神経内分泌腫瘍を含む多くの腫瘍に大量に発現している。

【0198】

リガンドは、リガンドと、多糖類、糖タンパク質、またはポリペプチドなどの細胞膜上の成分との間の相互作用によって小胞の細胞膜に付着させることができる。発現されたリガンドは、リガンドの腫瘍表面成分結合部分が露出されるように小胞の表面上に固定され、その結果、小胞と哺乳動物腫瘍細胞とが接触すると、その部分が標的哺乳動物細胞表面受容体に結合することができる。

【0199】

あるいは、リガンドが細菌由来の小胞の生きた対応物、例えばミニ細胞の親細胞によって、あるいは殺された細胞になる前に細菌細胞によって発現され、提示される。この場合、このリガンドは、小胞に対する特異性を必要とせず、哺乳動物細胞に特徴的な成分に対してのみ特異性を提示する。すなわち、このような成分は腫瘍細胞がその表面に存在する限り、腫瘍細胞自体に、または治療中の特定の種類の腫瘍細胞にさえも特異的である必要
はない。

【0200】

静脈内投与すると、小胞は腫瘍微小環境に急速に蓄積する。上記の漏出性腫瘍血管系の関数として生じるこの蓄積は小胞パッケージ化治療ペイロードの腫瘍細胞への送達をもたらし、次いで、これはパッケージ化小胞を内在化する。

【0201】

本発明者らは、この送達アプローチが通常、ミニ細胞の特異的接着およびエンドサイトーシスに対して抵抗性である細胞を含む、一連の哺乳動物腫瘍細胞に適用可能であることを見出した。例えば、抗ＨＥＲ２レセプターまたは抗ＥＧＦレセプターに向けられる抗体を含むリガンドは、肺、卵巣、脳、乳房、前立腺、および皮膚がん細胞のような一連の標的非貪食細胞上のそれぞれのレセプターにミニ細胞を結合することができる。

【0202】

こうして達成された結合は、それぞれのタイプの非貪食細胞による小胞の取り込みに先行する。すなわち、本発明の文脈において、適切な標的細胞は細胞表面受容体を提示し、その結合は、小胞上のリガンドによって、その小胞のエンドサイトーシスを誘発する。

【0203】

より具体的には、本発明者らが（a）ミニ細胞または死滅細菌細胞上のリガンドと（b）哺乳動物細胞表面受容体との間の相互作用がここでは「受容体媒介エンドサイトーシス」（ｒＭＥ）経路と呼ばれる取り込み経路を、腫瘍細胞などの標的宿主細胞の後期エンドソーム／リソソームコンパートメントに活性化することができることを発見した。このｒＭＥ経路によって、本発明者らは、細菌由来の小胞が初期エンドソーム、後期エンドソームおよびリソソームを通してプロセシングされ、哺乳動物宿主細胞の細胞質へのそれらのペイロードの放出を生じることを見出した。さらに、核酸であるペイロードは、後期エンドソーム／リソソームコンパートメントにおいて完全な分解を逃れるだけでなく、宿主細胞によっても発現される。

【0204】

この送達アプローチのための腫瘍標的リガンドはペイロード運搬小胞上の表面成分および標的細胞上の表面成分にそれぞれ結合し、後者の成分とのその相互作用がｒＭＥ経路への小胞の取り込みを導くので、上記のように「二重特異性」であり得る。いずれにしても、本発明によれば、成分との相互作用が標的細胞表面からの細胞質内在化を伴うエンドサイトーシス経路に実質的にアクセスする場合、所与の標的細胞表面レセプターは、リガンドによる結合の候補であり得る。このような候補は候補成分をその表面上に提示する細胞型が候補を結合するリガンドを担持するミニ細胞とインビトロで共インキュベートされ、そしてまた、例えば、共焦点顕微鏡を介して視覚的に、検出に従う蛍光色素または他のマーカーに結合されるアッセイを介して、本発明における適合性について容易に評価される。この種のインビトロアッセイはMacDiarmid ら、2007bにより、図３の４３６頁の凡例に記載されている）したがって、観察されたマーカーの内部移行は、試験された標的細胞表面受容体が本発明に適しているというようなアッセイによる陽性指標を構成する。

【0205】

本発明によれば、リガンドは、所望の特異性または特異性を示す任意のポリペプチドまたは多糖であり得る。好ましいリガンドは抗体である。本使用において、用語「抗体」は免疫原性応答のインビトロまたはインビボ生成によって得られる免疫グロブリン分子を包含し、従って、「抗体」カテゴリーはモノクローナル抗体およびヒト化抗体（例えば、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体など）を包含する。Caravella and Lugovskoy(Curr. Opin. Chem.Biol., 14：520－28 （2010）)の総説(ここではその全体を参照として組み込む)によって証明されるように、多数の異なる二重特異性タンパク質および抗体ベースのリガンドが知られている。本開示に従って有用な抗体は、公知の組換えＤＮＡ技術によって得ることができる。

【0206】

したがって、非限定的な例として、腫瘍抗原などの表面成分に対する特異性を有する抗体を使用して、治療される腫瘍中の細胞にミニ細胞を標的化することができる。この点における例示的な細胞表面受容体にはＲＴＫである上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、血管内皮成長因子受容体（VＥＧＦＲ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）およびインスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）のいずれかが含まれ、これらのそれぞれは脳腫瘍を含むいくつかの固形腫瘍において高度に発現され、葉酸受容体はいくつかの下垂体腺腫において過剰発現される。このような二重特異性リガンドは突然変異受容体または改変受容体（例えば、ヒト神経膠芽腫多形腫瘍の５０％～８０％において発現されるＩＬ１３Ｒα２受容体）に標的化され得る（Wykoskyら、2008; Jarboeら、2007；Debinskiら、2000；およびOkadaら、1994を参照のこと）が、正常組織において発現されるその生理学的対応物ＩＬ４Ｒ／ＩＬ１３Ｒとは異なる。Hershey、2003を参照されたい。したがって、ＩＬ１３Ｒα２は正常な脳細胞には実質的に存在しない。Debinski and Gibo、2000を参照。さらに、脳に転移する腫瘍はある種の受容体を過剰発現する可能性があり、これもまた適切な標的となり得る。例えば、Da Silvaら、2010は、乳がんの脳転移がＲＴＫのＨＥＲファミリーの全てのメンバーを発現することを示した。脳転移巣の２０％でＨＥＲ２が増幅・過剰発現、脳転移巣の２１％でＥＧＦＲが過剰発現、脳転移巣の６０％でＨＥＲ３が過剰発現、脳転移巣の２２％でＨＥＲ４が過剰発現していた。興味深いことに、ＨＥＲ３発現は脳に存在する乳がん細胞で増加していた。

【0207】

標的細胞表面レセプター候補の例示はレセプター型チロシンキナーゼまたは”ＲＫＴ”のメンバーである。ＲＫＴは膜貫通タンパク質のファミリーであり、他の膜内在性タンパク質と同様の速度で構成的内部移行（エンドサイトーシス）を行う。Goh and Sorkin、2013を参照のこと。ＲＫＴのファミリーは、Lemmon and Schlessingerが、Cell, 141（7）：1117－134 （2010）に記載さしている。例示的なＲＴＫは、ＥｒｂＢ ＥＧＦＲ、 ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４ Ｉｎｓ ＩｎｓＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩｎｓＲＲ ＰＤＧＦ ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＣＳＦ１Ｒ／Ｆｍｓ、Ｋｉｔ/ＳＣＦＲ、Ｆｉｔ３/Ｆｌｋ２ ＶＥＧＦ ＶＥＧＦＲ１/Ｆｉｔ１、ＶＥＧＦＲ２/ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ３／Ｆｉｔ４ ＦＧＦ ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４ ＰＴＫ７ ＰＴＫ７／Ｃｃｋ４ Ｔｒｋ ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ Ｒｏｒ Ｒｏｒ１、Ｒｏｒ２ ＭｕＳＫ ＭＥＴ、Ｒｏｎ ＡＸＬ、Ｍｅｒ、Ｔｙｒｏ３ Ｔｉｅ Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２ Ｅｐｈ ＥｐｈＡ１‐８、ＥＰＨＡ１０、ＥｐｈＢ１‐４、ＥｐｈＢ６ Ｒｅｔ Ｒｙｋ ＤＤＲ ＤＤＲ１、 ＤＤＲ２ Ｒｏｓ ＬＭＲ ＬＭＲ1、ＬＭＲ２、ＬＭＲ３ ＡＬＫ、ＬＴＫ ＳＴＹＫ１ ＳｕＲＴＫ１０６/ＳＴＹＫ１である。

【0208】

適切な標的細胞表面受容体に適した別の候補は、膜関連の高親和性葉酸結合タンパク質（葉酸受容体）のファミリーであり、これは葉酸および還元型葉酸誘導体と結合し、テトラヒドロ葉酸の細胞内部への送達を媒介する；ＩＬ１３などの同族サイトカインの内部移行に役割を果たす膜結合サイトカイン受容体のファミリー；特定のがん細胞上に発現し、同族モノクローナル抗体、例えばＣＤ２０の例でリツキシマブの内部移行を媒介するＣＤ２０、ＣＤ３３、メソテリンおよびＨＭ１．２４などの表面抗原；およびエンドソーム経路を通って輸送され、がん細胞接着の主要橋渡し役である接着受容体ファミリー（インテグリン）である。本発明の１つの実施形態において、腫瘍細胞表面受容体は、インテグリン、ニューロメジンＢ受容体、ボンベシン３受容体、ＧＲＰ受容体、ボンベシン４受容体、ＣＣＫ２／ガストリン、メラノコルチン－１受容体（ＭＣ－１ｒ）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ)受容体、ニューロテンシン（ＮＴ）受容体、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）受容体、ニューロキニン1受容体（ＮＫ１Ｒ）、ケモカイン受容体型４（ＣＸＣＲ４）、血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）、上皮成長因子受容体（
ＥＧＦＲ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、インスリンのような成長因子受容体(ＩＧＦＲ)およびこれらの組み合わせがある。

【0209】

本発明の別の実施形態によれば、細胞表面レセプターは疾患状態において標的細胞上で独特に発現されるが、発現されないままであるか、低いレベルで発現されるか、または健康な状態において接近非ないかのいずれかである抗原である。本発明の標的化リガンドによって特異的に結合され得るそのような標的抗原の例は、有利にはＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ－２ｎｅｕ、ＨＥＲ－３、ＨＥＲ－４、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ－１（ムチン）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＭＵＣ５、ＭＵＣ７、ＢｈｃＧ、Ｌｅｗｉｓ－Ｙから選択され得る。ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ガングリオシドＧＤ３、９-Ｏ-アセチルＧＤ３、ＧＭ１、フコシルＳＡ、ＧＤ２、カルボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ/ＣＡ ＩＸ）、ＣＤ４４ｖ６、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ-１、形質細胞抗原、（膜結合)ＩｇＥ、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ-α前駆体、ＳＴＥＡＰ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ-６、デスモグレイン４、Ｅ－カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＡ１９-９マーカーおよびミュラー管阻害物質（ＭＩＳ）受容体タイプＩＩｓＴｎ（シアリル化Ｔｎ抗原; ＴＡＧ-７２）、ＦＡＰ(線維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン、ＥＧＦＲＶＩＩＩＬＧ、ＳＡＳおよびＣＤ６３。

【0210】

VI． 製剤
本発明はその範囲内に、（1）抗腫瘍剤、（2）Ｉ型ＩＦＮアゴニスト、および／または（3）II型ＩＦＮアゴニストの１つ以上の組み合わせをペイロードとして有するミニ細胞を含む組成物または製剤を含む。３つの成分すべてを含む組成物において、抗腫瘍剤、Ｉ型ＩＦＮアゴニスト、およびII型ＩＦＮアゴニストは、１つ以上のミニ細胞に含まれ得る。例えば:(a)抗腫瘍剤、Ｉ型ＩＦＮアゴニスト、およびII型ＩＦＮアゴニストは同じミニ細胞内に含まれ得る;(b)抗腫瘍剤およびI型ＩＦＮアゴニストが第１のミニ細胞内に含まれ得、そしてII型ＩＦＮアゴニストは第２のミニ細胞内に含まれ得る;(c)抗腫瘍剤およびII型ＩＦＮアゴニストが第１のミニ細胞内に含まれ得、そしてＩ型ＩＦＮアゴニストは第２のミニ細胞内に含まれ得る；または（d）抗腫瘍剤が第１のミニ細胞内に含まれ得、そしてII型ＩＦＮアゴニストは第２のミニ細胞内に含まれ得、そしてII型ＩＦＮアゴニストは第２のミニ細胞内に含まれ得る；または（e）抗腫瘍剤が第１のミニ細胞内に含まれ得、Ｉ型ＩＦＮアゴニストは第２のミニ細胞内に含まれ得、そしてII型ＩＦＮアゴニストは第３のミニ細胞内に含まれ得る。

【0211】

本発明はその範囲内に、（1）抗腫瘍剤および（2）Ｉ型ＩＦＮアゴニストまたはII型ＩＦＮアゴニストの組み合わせをペイロードとして有するミニ細胞を含む組成物または製剤を含む。いくつかの実施形態では、抗腫瘍剤およびＩ型ＩＦＮアゴニストまたはＩＮＦIIアゴニストが１つ以上のミニ細胞に含まれ得る。例えば、(a)抗腫瘍剤およびＩ型ＩＦＮアゴニストは同じミニ細胞内に含まれ得る;(b)抗腫瘍剤が第１のミニ細胞内に含まれ得、Ｉ型ＩＦＮアゴニストは第２のミニ細胞内に含まれ得る;(c)抗腫瘍剤およびII型ＩＦＮアゴニストが同じミニ細胞内に含まれ得る；または（d）抗腫瘍剤が第１のミニ細胞内に含まれ得、II型ＩＦＮアゴニストは第２のミニ細胞内に含まれ得る。

【0212】

例示的な実施形態において、本明細書中に開示される組成物は抗腫瘍剤ｓｉＰｌｋ１、インターフェロンＩ型アゴニスト６０mer二本鎖ＤＮＡ、および／またはインターフェロンII型アゴニストα－ガラクトシルセラミドを含み、ここで、ｓｉＰｌｋ１、６０mer二本鎖ＤＮＡ、およびα－ガラクトシルセラミドは、１つ以上のミニ細胞内に含まれる。

【0213】

別の例示的な実施形態では、本明細書に開示される組成物が抗腫瘍剤siRRM1、インターフェロンＩ型アゴニスト６０mer二本鎖ＤＮＡ、および／またはインターフェロンII型アゴニストα－ガラクトシルセラミドを含み、ｓｉＲＲＭ１、６０mer二本鎖ＤＮＡ、およびα－ガラクトシルセラミドは１つ以上のミニ細胞内に含まれる。

【0214】

別の例示的実施形態では本明細書に開示される組成物が抗腫瘍剤ＰＮＵ１５９６８２、インターフェロンＩ型アゴニスト６０mer二本鎖ＤＮＡ、および／またはインターフェロンII型アゴニストαガラクトシルセラミドを含み、ＰＮＵ１５９６８２、６０mer二本鎖ＤＮＡ、および／またはαガラクトシルセラミドは１つ以上のミニ細胞内に含まれる。

【0215】

製剤はまた、ミニ細胞を標的細胞に標的化するための二重特異性リガンドを任意に含む。ミニ細胞およびリガンドは、本明細書に記載されるものいずれであってもよい。したがって、本発明の二重特異性リガンドは、ミニ細胞の表面成分および標的哺乳動物細胞の表面成分に結合することができる。

【0216】

本発明のミニ細胞、薬物、および任意選択で二重特異性リガンドを含む製剤（すなわち、組成物の薬物または薬物送達品質を過度に妨害しない他の成分を有するそのようなミニ細胞、薬物、およびリガンドを含む製剤）は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体または賦形剤を使用して、従来の様式で製剤化することができる。

【0217】

本開示の製剤または組成物は単位投薬形態で、例えば、アンプルまたはバイアルで、または複数用量容器で、添加された防腐剤の有無にかかわらず、提示することができる。処方物は油性または水性ビヒクル中の溶液、懸濁液、またはエマルジョンであり得、そして処方剤（例えば、懸濁剤、安定剤および／または分散剤）を含み得る。適切な溶液はレシピエントの血液と等張であり、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液によって例示される。あるいは、製剤が適切なビヒクル、例えば、無菌の発熱物質を含まない水または生理食塩水で再構成するために、凍結乾燥粉末形態であり得る。製剤はまた、デポー製剤の形態であってもよい。このような長時間作用性処方物は移植（例えば、皮下または筋肉内）によって、または筋肉内注射によって投与され得る。いくつかの実施形態では、投与することは経腸または非経口投与を含む。いくつかの実施形態では、投与することは経口、頬側、舌下、鼻腔内、直腸、膣、静脈内、筋肉内、および皮下注射から選択される投与を含む。

【0218】

いくつかの態様では、治療有効量の抗腫瘍剤を含むミニ細胞含有組成物が提供される。抗腫瘍剤の「治療有効」量は、本開示に従って、対象に投与された場合に薬理学的応答を引き起こす、問題の薬剤、例えばｓｉＲＮＡまたは超細胞傷害性薬剤の投薬量である。

【0219】

従って、本開示の文脈において、治療有効量は以下にさらに記載されるように、治療ペイロードを保有するミニ細胞が投与される場合、動物モデルまたはヒト被験体のいずれかにおいて、腫瘍または腫瘍の症状の予防または改善を参照することによって測定され得る。所定の例（例えば、特定の被験体）における「治療有効量」を証明する量は、そのような投薬量が熟練した実施者によって「治療有効量」と見なされるとしても、腫瘍について同様に処置される被験体の１００％に対して有効ではないかもしれない。この点に関する適切な用量はまた、例えば、腫瘍の型、段階、および重症度の関数として変化する。

【0220】

「治療的に有効である」が医薬組成物中のミニ細胞の数を指すために使用される場合、その数は、どの抗腫瘍剤がミニ細胞中にパッケージ化されるか、および腫瘍を処置する際のその薬剤の効力に基づいて確認され得る。この点において、治療効果は、腫瘍塊などの臨床的または病理学的パラメーターを用いて測定することができる。従って、腫瘍質量の減少または減少した増加は、治療効果を測定するために使用され得る。

【0221】

Ａ．投与ルート
本発明の製剤は局所的または全身的のいずれかで、所望の治療効果を達成するために、種々の経路を介して、および哺乳動物体内の種々の部位に投与され得る。送達は例えば、経口投与によって、体腔への製剤の適用によって、吸入または通気によって、または非経口、筋肉内、静脈内、門脈内、肝臓内、腹腔内、皮下、腫瘍内、または皮内投与によって達成され得る。投与の様式および部位は、標的細胞の位置に依存する。例えば、腫瘍転移は、標的ミニ細胞の静脈内送達を介してより効率的に処置され得る。原発性卵巣がんは、標的ミニ細胞の腹腔内送達を介して治療され得る。経路の組み合わせもまた、使用され得る。例えば、転移性膀胱がんにおいて、細胞傷害性薬物負荷および受容標的化ミニ細胞は膀胱内および静脈内に投与され得、免疫賦活剤パッケージ化（受容体標的化または非標的化）ミニ細胞は標的化薬物パッケージ化ミニ細胞と共に静脈内に投与され得る。標的化された、薬物パッケージ化ミニ細胞のin situ投与は膀胱表面露出腫瘍を標的とし得るが、静脈内投与されたミニ細胞の完全な組合せは組織局在腫瘍を標的とし得、また抗腫瘍免疫応答を誘発し得る。

【0222】

Ｂ．純度
本発明のミニ細胞は、汚染親細菌細胞を実質的に含まない。したがって、ミニ細胞含有製剤は、好ましくは１０⁷ミニ細胞当たり約１未満の汚染親細菌細胞、１０⁸ミニ細胞当たり約１未満の汚染親細菌細胞、１０⁹ミニ細胞当たり約１未満の汚染親細菌細胞、１０¹⁰ミニ細胞当たり約1未満の汚染親細菌細胞、または１０¹¹ミニ細胞当たり約１未満の汚染親細菌細胞を含む。

【0223】

ミニ細胞を精製する方法は当該分野で公知であり、そしてPCT／IB02／04632に記載される。１つのこのような方法は、クロスフロー濾過（供給流量は膜表面に平行である; Forbes,1987）およびデッドエンド濾過（供給流量は膜表面に垂直である）を組み合わせる。必要に応じて、濾過の組み合わせの前に、細菌細胞のいくらかの部分を除去し、それによってミニ細胞について上清を濃縮するために、低遠心力での差動遠心分離を行うことができる。

【0224】

別の精製方法は、生物学的に適合性の媒体中で密度勾配遠心分離を用いる。遠心分離後、ミニ細胞バンドを勾配から収集し、任意に、ミニ細胞をさらなるラウンドの密度勾配遠心分離に供して、純度を最大にする。本方法は、ミニ細胞含有試料に対して分画遠心分離を実施する予備工程をさらに含むことができる。低遠心力で実施される場合、示差遠心分離は親細菌細胞のいくらかの部分を除去し、それによって、ミニ細胞について上清を濃縮する。

【0225】

特に有効な精製方法は、ミニ細胞純度を増加させるために細菌フィラメント化を利用する。従って、ミニ細胞精製方法は、（a）ミニ細胞を含有する試料を、親細菌細胞が糸状形態をとるように誘導する条件に供する工程、続いて（b）試料を濾過して精製ミニ細胞調製物を得る工程を包含し得る。

【0226】

公知のミニ細胞精製方法を組み合わせることもできる。１つの非常に効果的な方法の組み合わせは、以下の通りである：
工程Ａ：ミニ細胞産生細菌細胞培養物の分化遠心分離。この工程は２，０００gで約２０分間行うことができ、上清中にミニ細胞を残しながら、ほとんどの親細菌細胞を除去する；
工程Ｂ：等張および非毒性密度勾配媒体を使用する密度勾配遠心分離。この工程はミニ細胞の損失を最小限に抑えながら、親細菌細胞を含む多くの汚染物質からミニ細胞を分離する。好ましくは、この工程は精製方法内で繰り返される；
工程Ｃ：親細菌細胞汚染をさらに減少させるために、０．４５μｍフィルターを通したクロスフロー濾過；
工程Ｄ：残存親細菌細胞のストレス誘導性フィラメント形成。これは、ミニ細胞懸濁液をいくつかのストレス誘導環境条件のいずれかに曝すことによって達成され得る；
工程Ｅ：親細菌細胞を死滅させるための抗生物質処理；
工程Ｆ：膜ブレブ、膜断片、細菌残屑、核酸、培地成分などの小さな汚染物質を除去し、ミニ細胞を濃縮するためのクロスフロー濾過。ミニ細胞を小さな汚染物質から分離するために、０．２μｍ濾過を使用することができ、ミニ細胞を濃縮するために、０．１μｍ濾過を使用することができる；
工程Ｇ：糸状の死んだ細菌細胞を除去するためのデッドエンド濾過。この
工程のために０．４５μｍ濾過を使用することができる；
工程Ｈ：ミニ細胞調製物からのエンドトキシンの除去。抗脂質Ａ被覆磁性ビーズをこの工程に用いることができる。

【0227】

一般に、本明細書に開示される製剤は、任意の潜在的な毒性を最小限にしながら、最適な生理学的効果を得るために、日常的なテストによって規定される適切な用量で使用され得る。投与法は、患者の年齢、体重、性別、医学的状態；治療される状態の重症度、投与経路、および患者の腎機能および肝機能を含む様々な因子に応じて選択され得る。

【0228】

最小の副作用で最大の効力を生じる範囲内のミニ細胞および薬物の濃度を達成する際の最適な精度は、ミニ細胞の動力学および標的部位および標的細胞に対する薬物の利用可能性に基づくレジメンを必要とし得る。治療レジメンの至適濃度を決定する際には、ミニ細胞または薬物の分布、平衡、および排泄を考慮してもよい。ミニ細胞および薬物の用量は、組み合わせて使用される場合、所望の効果を達成するために調節され得る。

【0229】

さらに、製剤の用量投与は、薬物動態学的／薬力学的モデリングシステムを用いて最適化することができる。例えば、１つ以上の投薬レジメンが選択され得、そして薬物動態学的／薬力学的モデルが、１つ以上の投薬レジメンの薬物動態学的／薬力学的プロフィールを決定するために使用され得る。次に、特定の薬物動態学的／薬力学的プロフィールに基づいて所望の薬物動態学的／薬力学的応答を達成する投与のための投薬レジメンの１つが選択され得る。例えば、WO 00／67776を参照のこと。

【0230】

具体的には、製剤が数週間にわたって少なくとも１週間に１回投与することができる。一実施形態では、製剤が数週間～数ヶ月にわたって週に少なくとも１回投与される。

【0231】

より具体的には、製剤が少なくとも１日１回、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、または約３１日間投与することができる。あるいは、製剤が約一日に約１回、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０または約３１日またはそれ以上毎に投与され得る。

【0232】

あるいは、製剤が約１週間に約１回、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９または約２０週間またはそれ以上毎に約１回投与されてもよい。あるいは、製剤が約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９または約２０週間以上、少なくとも週１回投与され得る。

【0233】

あるいは、製剤は、毎週約２回、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９または約２０週間またはそれ以上毎約２回投与され得る。あるいは、製剤が約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９または約２０週間以上、少なくとも週１回投与され得る。

【0234】

あるいは、製剤が約１カ月に１回、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１または約１２カ月またはそれ以上ごとに約１回投与することができる。

【0235】

なお、１日１回投与とするか、１日の総投与量を１日２回、３回または４回に分けて投与する。

【0236】

薬物の前にミニ細胞を投与する方法では、薬物の投与がミニ細胞の投与の数分から数時間後の任意の時点で起こり得る。あるいは、薬物が数時間～数日、おそらく数週間～数ヶ月後の任意の時点で、ミニ細胞の後に投与され得る。

【0237】

より具体的には、ミニ細胞が薬物の少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３または約２４時間前に投与され得る。さらに、ミニ細胞は、薬物の投与の少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０または約３１日前に投与され得る。さらに別の実施形態において、ミニ細胞は、薬物の少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９または約２０週間以上前に投与され得る。さらなる実施形態において、ミニ細胞は、薬物の少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１または約１２ヶ月前に投与され得る。

【0238】

別の実施形態において、ミニ細胞は、薬物の後に投与される。ミニ細胞の投与は、薬物の投与後、数分から数時間の任意の時点で起こり得る。あるいは、ミニ細胞が薬物の数時間～数日、おそらく数週間～数ヶ月後の任意の時点で投与され得る。

【0239】

ＶＩＩ． 癌を処置する方法
本明細書中に記載される組成物は、癌に罹患している対象を処置するために使用され得る。本明細書に開示される方法は、少なくとも１つの抗腫瘍剤、インターフェロンＩ型アゴニスト、インターフェロンII型アゴニスト、またはインターフェロンＩ型アゴニストとインターフェロンII型アゴニストとの組み合わせを含む、本発明による組成物の有効量を対象に投与することを含む。抗新生物剤、インターフェロンＩ型アゴニスト、インターフェロンII型アゴニスト、またはインターフェロンＩ型アゴニストとインターフェロンII型アゴニストの組合せは、１つ以上のミニ細胞で構成される。

【0240】

別の局面において、癌に罹患している被験体を処置するために使用される組成物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む。

【0241】

別の局面において、本明細書中に開示される方法は癌に罹患している被験体を処置するために有用であり、ここで、被験体は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ウサギ、マウス、またはラットである。

【0242】

別の局面において、本明細書中に開示される方法は、癌疾患を処置するために有用である。いくつかの実施形態では癌は肺癌、乳癌、脳癌、肝臓癌、結腸癌、膵臓癌、または膀胱癌を含む。

【0243】

いくつかの実施形態において、がんには、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質がん、 エイズ関連のガン、エイズ関連リンパ腫、肛門がん、虫垂ガン;星細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、膀胱がん、脳幹神経膠腫、脳腫瘍（脳幹グリオーマ、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮腫、松果体実質腫瘍、テント上の原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、原発部位不明の癌、カルチノイド腫瘍;未知の主要なサイトのがん、中枢神経系非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、子宮頸癌、小児がん、脊索腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性脊髄増殖性障害、大腸がん、結腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣芽腫、上衣腫、食道癌、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫;頭蓋外胚、性腺外生殖細胞腫瘍、 肝外胚細胞腫瘍、胃（胃）がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、グリオーマ、有毛細胞白血病、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、小島細胞腫瘍;カポジ肉腫、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭ガン;唇のガン、肝臓がん、悪性線維性組織球腫骨がん、髄芽腫、髄上皮腫;黒色腫、メルケル細胞がん、メルケル細胞がん、中皮腫、原発不明の転移性扁平上皮性頸部がん、口ガン、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、脊髄増殖性新生物;、鼻腔がん、鼻咽頭ガン、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚がん、非小細胞肺がん、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫、その他の脳腫瘍および脊髄腫瘍、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞 卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、乳頭腫症;副鼻腔ガン;副甲状腺癌、骨盤部癌、陰茎がん、咽頭がん、松果体腫瘍、松果体芽腫、下垂体性腫瘍、形質細胞新生物/多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、一次性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、原発性肝細胞癌、前立腺癌、直腸ガン、腎細胞（腎臓）癌、腎細胞癌、気道癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、セザリー症候群、小さな細胞肺がん、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮細胞癌、扁平上皮首ガン、胃（胃）癌、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、Ｔ細胞癌、精巣癌、咽頭癌、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺癌、移行性細胞ガン、腎盂と尿管の移行上皮がん、栄養芽層の腫瘍、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、またはウィルムス腫瘍が含まれる。

【0244】

いくつかの実施形態において、脳癌または脳腫瘍は、脳幹グリオーマ、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮腫、中間的分化の松果体実質腫瘍、テント上未分化原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫からなる群より選択される。

【0245】

ＶＩＩＩ．定義
本明細書で使用される技術用語および科学用語は別段の定義がない限り、本発明が関係する当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の説明および実施例において参照される材料、試薬などは、特に断らない限り、商業的供給源から入手可能である。

【0246】

便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語および語句の意味は、以下に提供される。他の用語および語句は、本明細書全体を通して定義される。

【0247】

単数形「a」、「an」、および「the」は文脈が明らかにそわないと指示しない限り、複数の引用を含む。

【0248】

用語「約」は、理解される数が本明細書に記載される厳密な数に限定されず、本発明の範囲から逸脱せずに、列挙された数の実質的に周囲の数を指すことが意図されることを意味する。本明細書で使用される場合、「約」は当業者によって理解され、それが使用される文脈である程度変化するのであろう。それが使用される文脈で与えられる当業者に明らかでない用語の使用がある場合、「約」は特定の用語の±１０％までを意味するであろう。

【0249】

本明細書中で互換的に使用される「個体」、「対象」、「宿主」および「患者」は、診断、処置または治療が所望される任意の哺乳動物対象をいう。１つの好ましい実施形態において、個体、対象、宿主、または患者はヒトである。他の対象としてはウシ、ウマ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、霊長類、およびマウスが挙げられるが、これらに限定されない。

【0250】

本明細書中で互換的に使用される「癌」、「新生物」、「腫瘍」、「悪性腫瘍」および「癌腫」は、細胞増殖の制御の有意な喪失によって特徴付けられる異常な成長表現型を示す細胞または組織を指す。がんには主にいくつかの種類がある。がんとは、皮膚内または内臓を覆っている組織から発生するがんのことである。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、その他の結合組織や支持組織から発生するがんである。白血病は、骨髄などの造血組織から発生するがんで、異常な血液細胞が大量に産生されて血液中に入るようになる。リンパ腫と多発性骨髄腫は、免疫系の細胞から発生するがんである。中枢神経系がんは、脳と脊髄の組織から発生するがんである。本発明の方法および組成物は特に、前癌性、悪性、前転移性、転移性、および非転移性細胞に適用される。

【0251】

用語「治療」、「治療する」、「治療する」などは、腫瘍患者において所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。この効果は、腫瘍またはその症状を完全にまたは部分的に予防するという点で予防的であり得、および／または腫瘍および／または腫瘍に起因する有害な効果について部分的または完全な安定化または治癒という点で治療的であり得る。治療は、哺乳動物、特にヒトにおける腫瘍の任意の治療を包含する。所望の効果は特に、腫瘍塊の減少または腫瘍塊増加の阻害として測定され得る腫瘍応答である。腫瘍応答に加えて、全生存の増加、無増悪生存、または腫瘍再発までの時間、または
有害作用の減少もまた、所望の処置効果として臨床的に使用され得る。

【0252】

本明細書中で使用される場合、用語「投与する」は、別のものに直接投与すること、自己投与すること、および本明細書中に開示されるような薬剤の投与を処方または指示することを含む。

【0253】

本明細書中で使用される場合、語句「有効量」および「治療有効量」は、それぞれ、そのような処置を必要とする被験体において、活性剤が投与される特定の薬理学的効果を提供する、被験体における活性剤投薬量または血漿濃度を意味する。有効量の活性剤は、たとえそのような投薬量が当業者によって有効量であると見なされるとしても、本明細書中に記載される状態／疾患を処置する際に常に有効であるとは限らないことが強調される。

【0254】

本明細書中で使用される場合、用語「活性剤」は、被験体を処置するために有用で機能性核酸をコードする任意の小分子薬物、タンパク質、機能性核酸、または多核酸である。活性剤は、本明細書に記載される抗腫瘍薬、機能性酸、インターフェロンＩ型アゴニストまたはII型アゴニストのいずれかであり得る。

【0255】

「薬学的に許容される」という語句は、本明細書では適切なベネフィット／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題または合併症を伴わずにインビボで使用するのに適した、健全な医学的判断の範囲内にある化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。

【0256】

「エンドサイトーシス」という用語は（1）食作用および（2）ピノサイトーシス自体、（2a）受容体結合を必要としないマクロピノサイトーシス、ならびに（2b）クラスリン介在性エンドサイトーシス、（2c）カベオラ介在性エンドサイトーシスおよび（2d）クラスリン／カベオラ非依存性エンドサイトーシスを含むカテゴリーを包含し、これらは全て後期エンドソーム／リソソーム経路にアクセスする傾向がある。本発明者らはミニ細胞上のリガンドと哺乳類細胞表面受容体との相互作用により、特定のエンドサイトーシス経路が活性化され、後期エンドソーム／リソソームコンパートメントへの受容体媒介エンドサイトーシス（ｒＭＥ）が関与することを発見した。このようなエンドサイトーシス経路のおかげで、本発明者らはさらに、ミニ細胞が標的哺乳動物細胞の細胞質中にそれらのペイロードを放出することができることを発見した。ペイロードがコード核酸である場合、核酸は、後期エンドソーム／リソソーム区画において完全に分解されるだけでなく、標的哺乳動物細胞においても発現される。

【0257】

以下の実施例は限定するものではなく、単に例示的なものであり、本発明のより完全な理解を提供するものである。実施例は、薬剤耐性腫瘍細胞が（1）薬剤耐性をコードする遺伝子の発現を減少または排除するように設計されたＲＮＡｉ配列を担持する標的組換えミニ細胞の投与、および（2）癌細胞が感受性にされる薬剤を担持する標的化された、薬剤パッケージ化ミニ細胞の投与によって、インビボで効果的に治療され得ることを実証する。

【0258】

以下の実施例は、本発明を例示するために提供される。しかし、本発明は、これらの実施例に記載された特定の条件または詳細に限定されるべきではないことを理解されたい。明細書全体を通して、米国特許を含む、公に利用可能な文書へのあらゆる参照は、参照により特に援用される。

【実施例0259】

実施例１：マウスを用いた前臨床試験
この実施例はミニ細胞（ＥＤＶ）が化学療法薬の効率的な送達を提供し、マウス異種移植モデルにおいて腫瘍増殖を阻害することを示した。ＥＤＶ標的化技術は、結腸癌、乳癌、卵巣癌、白血病、肺癌、中皮腫、および子宮癌を含む様々な癌のマウス異種移植モデルで試験されている。さらに、ＥＤＶがＥＧＦＲ、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、およびＣＤ３３を含む腫瘍細胞表面受容体に標的化されたので、種々の標的化部分が利用された。最後に、試験した標的ＥＤＶは、ドキソルビシン、パクリタキセル、モナストロール、イリノテカン、ＰＮＵ１５９６８２のような超細胞傷害性薬剤、および新規チミジル酸シンターゼ阻害剤（ＯＳＩ）を含む多種多様な細胞傷害性薬剤を含んでいた。ＰＮＵ－１５９６８２は、ドキソルビシンよりも数千時間細胞傷害性であるアントラサイクリン類似体である。ＯＳＩ７９０４は抗腫瘍活性を有するベンゾキナゾリン葉酸類似体である。チミジル酸シンターゼ阻害薬として、ＯＳＩ－７９０４はチミジル酸シンターゼに非競合的に結合し、その結果、チミンヌクレオチド合成およびＤＮＡ複製が阻害される。

【0260】

全ての場合において、腫瘍の安定化または退行は、特異的に標的化されたＥＤＶおよび薬物パッケージされたＥＤＶを使用した場合、大きな（＞１０００ mm³）腫瘍についても観察された（表５を参照のこと）。遊離薬物（ＥＤＶに詰め込まれていない）で処理した対照マウスは静脈炎の予想毒性を示し、最終的に体重が減少し、死亡した。これらの毒性はＥＤＶ包装薬剤の反復投与では認められなかった。

【0261】

驚くべきことに、ＥＤＶを介して送達された細胞傷害性薬物の濃度は全身送達より８，０００倍も低かったが、ＥＤＶによって送達された細胞傷害性薬物濃度は抗腫瘍効力を最大にするのに十分であった。

【0262】

【表5-1】

【0263】

【表5-2】

実施例２： イヌを用いた前臨床試験
この実施例は、薬物を負荷したミニ細胞（ＥＤＶ）がイヌに安全に投与され得ることを示した。

【0264】

一連の内因性腫瘍を有するイヌ（ｎ＝４１）を用いたイヌの毒性試験では、標的ＥＤＶおよび薬剤包装ＥＤＶを最大９８回まで、２年以上の経過で１匹の動物に安全に投与できることが示された。一部のイヌでは投与後にインターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－１０（ＩＬ-１０）および腫瘍壊死因子α(ＴＮＦ－α)の上昇を伴う軽度の温度上昇（最大１の上昇）が認められたが、重大な有害事象との関連は認められなかった。

【0265】

さらに、イヌを用いた前臨床試験では、ＣＤ３を標的としたドキソルビシン負荷ＥＤＶが腫瘍増殖を阻害できることが示された。進行した非ホジキンリンパ腫の２匹のイヌを、ＣＤ３標的、ドキソルビシンパッケージ化ＥＤＶで処理し、両者はリンパ節サイズの非常に有意な減少により明らかなように、顕著な腫瘍退縮を示した。MacDiarmid ら、2007b。血管肉腫のイヌの６０％以上が、ＣＤ３３標的ＥＤＶおよびドキソルビシンパッケージ化ＥＤＶで治療した場合、腫瘍の安定化または退縮を示した。

【0266】

後期脳腫瘍のイヌ(ｎ＝１７）を対象とした別の研究では、ドキソルビシンを負荷したＥＧＦＲ標的ＥＤＶで動物を治療した。MacDiarmid ら、2016。１匹のイヌ（２０回を超える用量を投与された１１匹のイヌ）に９８回までの反復用量を１×１０¹⁰の^EGFRミニ細胞_Doxで投与したが、毒性の徴候は観察されなかった。客観的奏効率は２３．５３％（イヌ１７匹中４匹；９５％信頼区間、６．８－４９．８％）であった。腫瘍反応を評価した１５匹のイヌのうち、２匹は治療に対して完全反応（ＣＲ）を示し、２匹は治療に対して部分反応（ＰＲ）を示し（腫瘍容積の９０～９８．９５％の減少）、１０匹は安定疾患（ＳＤ）、１匹は進行性疾患（ＰＤ）を示した。

【0267】

脳がんの２頭のイヌにおける¹²³ヨウ素放射標識ＥＧＦＲ標的ＥＤＶを用いた生体内分布試験では、標的ＥＤＶが脳腫瘍に局在することが示され、ＥＤＶが血液脳関門を回避して腫瘍周辺に入ることができることが示唆された。消化管に局在することから、糞便を介した排泄が示唆される。

【0268】

実施例３：サルを用いた前臨床試験
この実施例は、ミニ細胞（ＥＤＶ）技術がサルによって十分に許容されることを示した。３件のアカゲザル試験を実施し、空のＥＤＶ（１用量あたり２×１０¹⁰まで）、ＥＧＦＲ標的ドキソルビシン負荷ＥＤＶ（１用量あたり２×１０¹⁰まで）、およびＥＧＦＲ標的パクリタキセル負荷ＥＤＶ（１用量あたり１×１０¹¹まで）の毒性を評価した。サルにＥＤＶを週１回、５週間投与した（３５日間反復投与試験）。

【0269】

イヌで見られたように、温度の一過性のスパイク（１までの上昇）があり、同時に投与後のＩＬ－６の上昇が認められた。炎症マーカーＣ反応性蛋白もこれらの時期に増加したが、有意な毒性や有害事象は観察されなかった。ＥＧＦＲを標的としたドキソルビシンを負荷したＥＤＶのみによる治療経過中に、ＴＮＦ－αの軽度の上昇が認められた。合計７２匹のサルにＥＤＶ技術を安全に投与した。

【0270】

実施例４：前臨床試験における炎症反応と免疫反応
この実施例から、前臨床マウス試験（実施例１）、前臨床イヌ試験（実施例２）および前臨床サル試験（実施例３）では、わずかな炎症反応しか観察されなかったことが示された。これらの反応は、投与４時間後と同様に速やかに消失した。その他、血液学的及び生化学的パラメータに有意な変化は認められなかった。投与期間中、外観および行動は健康なままであった。

【0271】

抗産物抗体の形成は、イヌ試験およびサル試験で評価した。標的ＥＤＶの投与に関して考慮された免疫応答は以下のとおりであった：
・ ＥＤＶ表面露出免疫優性抗原に対する血清抗体反応は、ＬＰＳのＯ－多糖成分（ＩｇＧまたはＩｇＭ反応）である。抗Ｏ-多糖抗体応答はＴ細胞非依存性であり、記憶応答を示さない。
・ 腫瘍細胞表面受容体（例えば、ＥＧＦＲ）にＥＤＶを標的化するためのＢｓＡｂの構築に使用されるマウスＩｇＧモノクローナル抗体に対する血清抗体応答。

【0272】

血管肉腫または脳腫瘍のイヌにおいて、血清抗ＬＰＳ ＩｇＧ力価は、標的ＥＤＶおよびドキソルビシンパッケージ化ＥＤＶの投与３－４までに平均約１０，０００まで上昇した。その後の投与では、それ以上の力価の上昇はみられなかった。サルを用いた３試験（健常動物）における抗ＬＰＳ ＩｇＧ力価は、プラトーに達する前の最初の２～３回の投与で概して軽度の上昇を示した。グラム陰性菌に対するワクチンで予想される抗Ｏ－多糖抗体力価は一般に数百万であるため、反応は主に用量依存的であり、最高用量レベルの^EGFRＥＤＶ_Dox では１００を丁度超える最高力価まで上昇した。

【0273】

サル試験における抗ＬＰＳＩｇＭ力価応答も軽度であり、^EGFRＥＤＶ_Doxでの処置ではわずかに１００を超えるまで上昇し、非標的ＥＤＶでの処置では１，０００まで上昇した。用量３～４の後、力価はそれ以上増加しなかった。

【0274】

ＢｓＡｂの構築に用いたモノクローナル抗体に対する免疫原性応答はサルを用いた試験でも測定されており、ＥＧＦＲ標的ＥＤＶ（マウスＩｇＧ）を投与したサルでは、ＥＧＦＲ抗体に応答して軽度の力価上昇が観察された。これらの結果から、ＢｓＡｂを標的とした薬物パッケージ化ＥＤＶの投与は、その後の投与の有効性を妨げうる有意な抗ＬＰＳ免疫応答を誘発しない可能性があることが示唆される。これは、反復投与が実行可能な治療選択肢である可能性が高いことを示唆しているため、免疫系が損なわれている可能性が高い癌患者に特に関連がある。

【0275】

実施例５：進行固形癌におけるアービタックス標的、パクリタキセルパッケージＥＤＶ（^EGFR(Erb)ＥＤＶ_Pac）を評価する第1相臨床試験
本実施例は、進行固形腫瘍にパクリタキセル（Taxol(登録商標)）を送達するためにミニ細胞（ＥＤＶ）を使用する有望な結果を示した。

【0276】

この試験ではエルビタックス（セツキシマブ）を標的としたパクリタキセルパッケージ化ＥＤＶのヒト患者における忍容性は良好であることが示されたが、治験において有害事象または用量制限毒性が認められたため、かなりの数の患者が試験を終了しなければならなかった。さらに、この治療戦略は疾患の安定化を達成したが、この研究の患者のいずれも治療に対して部分的または完全奏効を示さなかった。この試験データの結果はSolomonら、2015年に公表されている。

【0277】

ヒト初回投与試験は、ＥＧＦＲ標的パクリタキセル負荷ＥＤＶ（^EGFR(Erb)ＥＤＶ_Pac）の安全性、忍容性および最高耐量または推奨第２相用量を決定するための用量漸増試験としてデザインされた。ＥＤＶをＥＧＦＲに標的化するために使用される抗体は、Erbitux配列に基づくことに留意されたい。他の目的は、静脈内投与された^EGFR(Erb)ＥＤＶ_Pacに対する免疫応答および炎症応答を評価すること、およびＲＥＣＩＳＴ基準に従って治療に対する応答を評価することであった。

【0278】

本試験はオーストラリア・メルボルンの３カ所の腫瘍診療所で実施され、オーストラリアニュージーランド臨床試験登録(番号ACTRN12609000672257）に登録され、最終的な試験報告書が入手可能であり、本試験は2015年のSolomonらに発表されている。

【0279】

患者は、標準的な治癒的治療が利用できない１８歳以上の進行性上皮性悪性腫瘍の成人であった。

【0280】

^EGFR(Erb)ＥＤＶ_Pacを、５週間の処置からなるサイクルにおいて、２０分間の静脈内注入として毎週投与した。その後、患者がＭＲＩ、ＣＴ、またはＦＤＧ－ＰＥＴによる腫瘍の放射線学的評価を受けた無治療週が設けられた。腫瘍が安定しているか、治療に反応している場合、または治療から臨床的利益を得ている場合は患者はさらなるサイクルの治療を継続することができ、用量制限毒性（ＤＬＴ）または治療の中止を必要とする他の有害事象（ＡＥ）は経験しなかった。

【0281】

パクリタキセルを含む１回当たりの投与量が１×１０⁸、１×１０⁹、３×１０⁹、１×１０¹⁰、１．５×１０¹⁰、２×１０¹⁰、および５×１０¹⁰のＥＧＦＲ（Ｅｒｂ）ターゲットＥＤＶの７段階で計２３６回の投与が提供された。２８例中２２例が少なくとも１サイクルの治療（週５回投与）を完了し、１例は９サイクル（約１４カ月）にわたり４５回の投与を受けた。投与に関連した死亡は認められなかった。最高耐量は１×１０^{10 EGFR(Erb)}ＥＤＶ_Pacと同定され、特に長時間の発熱および肝機能検査（ＬＦＴ）の一過性上昇の形態で、この用量以上で有意な毒性が観察された。本治療の忍容性は概して良好であり、示さた集団において許容可能な安全性所見が認められた。

【0282】

臨床試験及び所見の概要を以下の表６に示す。

【0283】

【表6】

少なくとも治験薬との因果関係が「おそらく関連あり」とされた主な有害事象は微熱（発熱）および悪寒（悪寒）であり、患者の最大６０％で認められた（グレード１～２の重症度）。ほとんどの患者で、投与４時間後にサイトカインＩＬ-６、ＩＬ-８およびＩＬ－１０の軽度の一過性の上昇が認められた。投与後２４時間以内に投与前のレベルに回復した。これは、治療に対する軽微な炎症反応と一致する。

【0284】

５例に重篤と考えられる治療関連有害事象が認められ、８例に用量制限毒性または減量を必要とする有害事象が認められた。これらの事象を表７に要約し、以下の説明に記載する。

【0285】

【表7】

１×１０⁸投与集団では、ＬＦＴの上昇が認められ、ＤＬＴ基準を満たしていた。この事象は重篤ではないと判断され、その後の用量段階についてＤＬＴの定義が修正された。ＭＴＤを上回る用量レベルの患者４例で、修正ＤＬＴ基準を満たさないＬＦＴ値上昇が認められたが、これらの患者は治療に関連した重篤な臨床症状（発熱、悪寒、悪心、嘔吐）も発現し、安全性委員会は減量を決定した。

【0286】

１×１０^{8 EGFR(Erb)}ＥＤＶ_Pacの初回投与量には３例が組み入れられ、１例は５回の投与量のうち３回後に、グレード３のリン酸塩濃度の低下が認められた。いずれの場合も投与後２４時間までに正常値に回復し、臨床症状も認められなかった。別の１例では投与３の４時間後に肝酵素アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）の無症候性のグレード３の上昇が認められたが、次の投与までにベースラインに戻った。これらの事象は治験実施計画書の本来の用量制限毒性（ＤＬＴ）の規定を満たし、進行中の患者の用量は５×１０^{7 EGFR(Erb)}ＥＤＶ_Pacに減少し、１例は試験期間中に計４５回の用量を投与された。さらに３人の患者が１×１０^{8 EGFR(Erb)}ＥＤＶ_Pacを受けるように募集され、これら３人の個体では薬物関連有害事象は報告されなかった。治験実施計画書のＤＬＴの定義を修正し、投与７日以内に消失した生化学的異常を除外した。

【0287】

２回目の投与から２日後に１×１０^{9 EGFR(Erb)}ＥＤＶ_Pacに増量したが、１例は重度の関節痛を経験した。これに伴い、サイトカインであるインターフェロンαが有意に上昇し、ウイルス感染が示唆された。患者は観察のために入院し、後に反応性関節炎と診断され、これは重篤な有害事象（ＳＡＥ）として分類された。安全委員会は何らかの検討を行った後、慎重に進めることを決定し、この事象をＤＬＴと定義した。したがって、この集団は６例にも拡大された。この試験では、他に同様の事象を経験した患者はいなかった。第１サイクルの完了時に、安全性データは用量をさらに増量することを支持した。

【0288】

３人の患者の集団を次の用量に集め、３×１０^{9 EGFR(Erb)}ＥＤＶ_Pac１人の患者は、急速に進行する疾患のために１回の用量のみを受けた後に中止され、その後、疾患の結果として死亡した。４例目は同用量レベルで募集された。患者全員がこの用量に大きな懸念なく忍容性を示し、安全性データから用量をさらに増量することが裏付けられた。この集団の１人の患者は最初のサイクルの後に疾患の安定化を達成し、計１０回の投与で２サイクルを完了した。１例は、骨髄への疾患浸潤のため、５回中４回のみ投与された。

【0289】

３人の患者の集団を、次回の用量レベル、１×１０^{10 EGFR(Erb)}ＥＤＶ_Pac に補充した：患者はいかなる重大な懸念もなしにこの用量レベルに耐え、周期１の完了時に、安全データーは、用量をさらに増加させることを支持した。３例中２例は病勢安定を達成し、それぞれ１５回投与と２５回投与の３サイクルと５サイクルを完了した。

【0290】

２人の患者は、次の用量レベルに動員され、５×１０^{10 EGFR(Erb)}ＥＤＶ_Pac 、このレベルで１回の用量を受け、両方とも、肝臓酵素ＡＬＴおよびＡＳＴの等級３～４の上昇を経験した。これらの変化は一過性であり、治験実施計画書の改訂されたＤＬＴの規定を満たしていなかったが、患者が発熱、厳しさ、悪心などの他の有害事象を経験したため（１例では重篤な有害事象のため入院に至った）、これらの患者は１×１０^{10 EGFR(Erb)}ＥＤＶ_Pac に投与量を減らすこととした。これらの患者もまた、炎症マーカーＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、およびＴＮＦ－αのかなりの上昇を経験した。この２人の患者のうち１人は病勢安定を達成するために治療を継続し、減量後に２サイクルのフルサイクルを完了した。

【0291】

最大耐量（ＭＴＤ）を同定するために、１人の患者を２×１０^{10 EGFR(Erb)}ＥＤＶ_Pacの中間用量レベルに補充し、この患者はこのレベルで１回の用量を受け、同様に、発熱、過酷さ、悪心および嘔吐、ならびに炎症マーカーの上昇を伴う、ＡＬＴおよびＡＳＴにおけるグレード３～４の一過性の上昇を経験した。乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）およびγグルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）の臨床的に有意な上昇も認められた。再度、これらのパラメーターは治験実施計画書の改訂されたＤＬＴの規定を満たしていなかったが、肝酵素の上昇は重篤な有害事象であると考えられ、１×１０^{10 EGFR(Erb)}ＥＤＶ_Pacに減量することが臨床的に適切であると判断された。この被験者は安定した疾病を達成し、１９回の投与を受けた４サイクルを完了した。

【0292】

ＭＴＤを同定するためのさらなる試みにおいて、３人の患者を１．５×１０^{10 EGFR(Erb)}ＥＤＶ_Pacの中間用量に補充したが、これらの患者のうちの１人はいかなる有害反応も伴わずに最初の用量を受けたが、急速に進行する疾病のために治療を継続しなかった。別の患者はグレード３の低血圧を発現し、これは重篤な有害事象の用量制限と考えられたため、用量を５×１０^{9 EGFR(Erb)}ＥＤＶ_Pac に減量した。この集団の最終患者は初回投与後に、治療に伴う症状（発熱、硬直、嘔吐）および炎症マーカーの上昇を伴うＡＳＴのグレード３の上昇を経験し、その後の用量は１×１０^{10 EGFR(Erb)}ＥＤＶ_Pacに減量した。

【0293】

従って、^EGFR(Erb)ＥＤＶ_Pacに対するＭＴＤは１×１０¹⁰の用量レベルであり、さらに３人の患者がこの用量レベルに動員されたと結論された。１例は、サイトカイン放出症候群と推測されたため、１回投与後に試験を中止した。患者は既存の咳嗽があり、腕頭静脈を圧迫する鎖骨上腫瘤による失神のエピソードを時折経験した。投与後２～４時間の間に患者は発熱し、咳を始め、スタッフが目撃した失神のエピソードを３～４回経験した。患者は観察のため入院し、ＩＦＮγの増加は検出されなかったが、サイトカイン放出症候群と診断された。患者はＩＬ－６、ＩＬ－８およびＩＬ－１０の上昇を経験し、この用量レベル以上で他の患者で観察されたのと同様であったが、これは典型的なサイトカイン放出症候群ではなく製剤の細菌成分に対する炎症反応を表している可能性が高い。この事象は重篤な有害事象ではなかったが、安全性委員会は既存の疾患が関与しているため、ＤＬＴ基準を満たさないと判断した。残りの２例は、大きな懸念なく第１クールの治療を終了した。

【0294】

試験治療下で発現した有害事象による死亡は認められなかった。全体として、この治療の忍容性は良好であり、意図した対象集団に対する安全性に特段の懸念はない。

【0295】

スクリーニング時のサルモネラ菌 typhimurium(抗ＬＰＳ）およびErbituxに対する抗体は、全例で陰性であった。１例を除くすべての患者は、^EGFR(Erb)ＥＤＶ_Pacによる治療後に陽性のサルモネラ菌抗体価を発現した（２７／２８＝９６％）。抗ＬＰＳ抗体価は投与３（Day １５）までにピークに達し、反復投与にもかかわらずそのレベルに維持された。アービタックス抗体価陽性を示した患者はいなかった。

【0296】

サイクル１を完了した２２人の患者を、腫瘍反応について評価した。観察された最良の反応は、病勢安定（ＳＤ）であった（ＲＥＣＩＳＴ規準に従って部分奏効または完全奏効を達成した患者はいなかった）。第１サイクル終了時には２２例中１０例（４５．５％）に安定が認められ、２２例中１２例（５５．５％）に病勢進行（ＰＤ）が確認された。用量レベル1の患者１例は９サイクルの完全な治療を完了し、４サイクル目の終了時から疾患は安定し、進行した状態が交互に認められた。彼女は１９７日というＰＤの発症までの最も長い時間であった。

【0297】

結論として、男性を対象とした最初の試験では、パクリタキセルをパッケージ化したＥＤＶの忍容性は良好であり、患者の４５．５％が疾患の安定化を示すことが実証された。この実施例はまた、生存および疾患応答を改善するために癌治療戦略を改善することが望ましいことを実証する。

【0298】

実施例６：再発神経膠芽腫におけるＥＧＦＲ標的ドキソルビシンパッケージＥＤＶ（^EGFR(V)ＥＤＶ_Dox）を評価する第１相臨床試験
この実施例は、ＥＧＦＲを標的としたドキソルビシンパッケージ化ミニ細胞（ＥＤＶ）による治療が再発性膠芽腫に罹患した患者において忍容性が良好であったことを示している。患者の５０％が疾患の安定化を示したが、部分奏効または完全奏効を経験した患者はいなかった。Whittle ら、J. Clin. Neurosci., 22（12）：1889－1894（2015）。

【0299】

再発神経膠芽腫試験は、ＥＧＦＲ標的ドキソルビシン負荷ＥＤＶ（^VＥＤＶ_Dox）の安全性、忍容性および最高耐量または推奨第２相用量を決定するための用量漸増試験としてデザインされた。ＥＤＶをＥＧＦＲに標的化するために使用される抗体は、現在のプロトコールのための抗体（ベクチビックスベースの配列）と同じであることに留意されたい。他の目的は、静脈内投与された^VＥＤＶ_Doxに対する免疫応答および炎症応答を評価すること、および神経腫瘍学（ＲＡＮＯ）基準における応答評価に従って治療に対する応答を評価することであった。

【0300】

本研究は２０１３年２月５日に開始し、２０１４年６月２６日に終了した。オーストラリア、シドニーおよびメルボルンの４カ所の腫瘍クリニックで実施され、オーストラリアニュージーランド臨床試験登録 (番号ACTRN12613000297729）に登録されており、最終臨床試験報告書が入手可能である。この研究は、Whittleら、JClinのリスト草案に基づいて発表されている。Neurosci.,22(12)：1889－1894(2015）。

【0301】

患者は１８歳以上の成人で、病理学的に確認され、再発世界保健機構（ＷＨＯ）グレードＩＶの膠芽腫と確定診断され、標準治療（最大限の安全な外科的切除、標準補助放射線／テモゾロミド、維持テモゾロミド治療を含む）を受けた後に疾患の再発または進行を経験した患者であった。

【0302】

^VＥＤＶ_Doxを、８週間の処置からなるサイクルにおいて、２０分間の静脈内注入として毎週投与した。各サイクルの終わりに、患者は磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）で腫瘍の放射線学的評価を受けた。腫瘍が安定しているか、または治療に反応している場合、または治療から臨床的利益が得られている場合には、患者はさらなるサイクルの治療を継続することができ、ＤＬＴまたは治療の中止を必要とするその他のＡＥを経験しなかった。

【0303】

１回当たり２×１０⁹、５×１０⁹、８×１０^{9 V}ＥＤＶ_Doxの３段階の用量で、計1９７回の用量を加えた。１４例中８例が少なくとも１サイクルの治療を完了し（１週間ごとに８回）、１例は４７回の投与をほぼ６サイクル（約１２カ月）にわたって受けた。投与に関連した死亡は認められず、用量制限毒性を発現した患者や、投与中止を必要とするその他の有害事象を発現した患者は認められなかった。臨床試験及び所見の概要を以下の表８に示す。

【0304】

【表8】

少なくとも治験薬との因果関係が「おそらく関連あり」とされた主な有害事象は、５０％までの患者で認められた軽度の発熱（発熱）、悪心および硬直（悪寒）であった（一般的にグレード１～２の重症度）。ほとんどの患者で、投与３時間後にサイトカインＩＬ-６、ＩＬ-８、ＩＬ-１０、ＴＮＦ－痰フ軽度の一過性の上昇が認められた。投与後２４時間以内に投与前のレベルに回復した。これは、治療に対する軽微な炎症反応と一致する。

【0305】

米国国立癌研究所の有害事象共通用語規準（ＮＣＩ-ＣＴＣＡＥ）によるグレード３以上の治療関連有害事象を５例に認めた。これらの事象は、以下の表９に要約され、以下の説明に記載される。

【0306】

【表9】

２例でグレード３以上の有害事象が発現し、重篤と判断された。５×１０⁹投与量の１例はグレード１の発熱を伴うグレード３の体力低下の重篤な有害事象のために、サイクル１の投与２の後の夕方に入院した。患者は試験登録時に抗産物抗体（ＥＤＶのサルモネラ菌ＬＰＳ成分に対する抗体）が陽性であったため、これは用量制限毒性とは考えられなかった。この患者はさらに２回の治療を受けたが、事象の再発は認められなかった。

【0307】

８×１０⁹投与群の別の１例では、１サイクル目の投与４時間後にグレード３の症候性低血圧の重篤な有害事象が発現し、静脈内水分補給入院となった。これは、患者が治療を受けたＥＣｏｌｉ尿路感染症に起因する可能性が高いため、ＤＬＴとはみなされなかった。その後、治験薬を３回追加投与された。

【0308】

３例でグレード３以上の有害事象が発現したが、重篤とは判断されなかった。１例では、一部の投与後にグレード ３の肝酵素上昇が認められた。これらは、無症候性で一過性であり、用量間でベースラインに戻ったため、用量制限毒性または重篤な有害事象とはみなされなかった。２例でグレード３の低リン酸血症が認められ、１例ではグレード４のリンパ球減少症が認められた。これらはまた、一過性であり、治療的介入を必要としなかったため、用量制限毒性や重篤な有害事象とも考えられなかった。

【0309】

全体として、この治療の忍容性は良好であり、意図した対象集団に対する安全性に特段の懸念はない。

【0310】

ＥＤＶ治療に対する免疫応答を評価するため、スクリーニング時にサルモネラ菌に対する抗体を評価した。スクリーニング時に１４例中１３例（９３％）がサルモネラ菌抗体陰性であった。用量レベル２に割り付けられた１例はスクリーニング時に陽性であった。３回目の投与までに、全例で最初に抗体価の上昇が認められた。計４７回の投与を受けた患者が１例いたにもかかわらず、その後の投与量を超えて増強することなく力価が維持された。ベクチビックスに対する抗体を発現した患者はいなかった。

【0311】

有効性を評価するため、第１サイクルを完了した８例について腫瘍縮小効果を評価した。完全寛解または部分寛解を経験した患者はいなかったが、５０％が疾患の安定を示し、疾患の進行を経験した患者はいなかった。１例の患者は試験の全期間にわたって疾患が安定しており、ほぼ６サイクル（約１２ヵ月）の治療を受けていたと報告された。

【0312】

少なくとも１サイクルの治療を完了した８人の患者を、生存について追跡調査した。８例全例が背景生存期間中央値５～７カ月を超えて生存し、ＯＳ中央値は１５．１カ月（範囲９．１～＞１８．４）であった。４人の被験者は最後の接触時に生存しており、この時点で打ち切られた。少なくとも1サイクルの治療を完了したこれらのうちの２人（１４．３％）は、＞１８ヶ月間生存した。

【0313】

結論として、ＥＧＦＲ標的ドキソルビシン包装ＥＤＶによる再発膠芽腫の治療は、有害事象がほとんどなく、患者の５０％が疾患の安定化を経験した有望な結果を示した。しかしながら、改善された治療戦略が必要とされている。

【0314】

実施例７：中皮腫におけるＭｉｃｒｏＲＮＡ-１６ミミック（^EGFR(V)ＥＤＶ_miRNA16a）をパッケージ化したＥＧＦＲ標的ＥＤＶを評価する第１相臨床試験
この実施例では、マイクロＲＮＡ-１６でパッケージされたＥＧＦＲ標的ＥＤＶが有効性を検査した１６人の患者のうち１人の中皮腫患者で部分奏効を示したのに対し、患者の６２．５％は疾患が安定化し、患者の３１．３％は疾患が進行したことが示された。試験データは、van Zandwijkら、Lancet Oncol., 18（10）:1386－1396(2017）およびKaoら、Am.J. Respir. Crit. Care Med.,191(12): 1467-1469 (2015) に公開されている。この治療戦略は概して良好であった。

【0315】

再発悪性胸膜中皮腫患者を対象とした非盲検多施設共同探索的第１相試験で^VＥＤＶ_miRNA16aを評価した。試験の主要エンドポイントは^VＥＤＶ_miRNA16aの最高耐量およびＤＬＴを確立し、反復投与の影響を評価し、^VＥＤＶ_miRNA16aによる有効性の早期徴候を検出することであった。ＥＤＶをＥＧＦＲに標的化するために使用した抗体は、現在のプロトコール（ベクチビックスベースの配列）の抗体と同じであったことに留意されたい。試験の第２のエンドポイントは^VＥＤＶ_miRNA16aを投与された患者のＱＯＬを評価し、治療中の東部協力腫瘍学グループ（ＥＣＯＧ）の全身状態および肺機能パラメータの変化をモニタリングすることであった。探索的評価項目は、治療中の免疫マーカーおよびサイトカインマーカーの変化を評価した。

【0316】

適格であるためには、患者が腫瘍組織におけるＥＧＦＲ発現の証拠を伴うＭＰＭの組織学的または細胞学的記録を受けていなければならない。患者は、ＥＣＯＧのパーフォーマンスステータスが０または１で、平均余命が３カ月以上の１８歳以上の男女を対象とした。患者は、標準的な１または２番目のライン治療レジメンの投与中または投与後に疾病の進行を示さなければならず、十分な骨髄、肝臓および腎機能を有することが必要であった。

【0317】

^VＥＤＶ_miRNA16aを、８週間の処置からなるサイクルで、２０分間の静脈内注入として週１回または週2回投与した。各サイクルの終わりに、患者は腫瘍の放射線学的評価を受けた。腫瘍縮小効果の判定は、ＲＥＣＩＳＴ(固形腫瘍の改訂反応評価基準)基準に準じて行った。肺活量測定、ＦＤＧ-ＰＥＴスキャンおよびCTスキャンを用いて、疾患の進展度を評価した。

【0318】

この試験は2014年10月2日にオーストラリアのシドニーの３つの腫瘍クリニックで開始され、2016年11月24日に終了した。本試験は、オーストラリアニュージーランド臨床試験登録（番号ACTRN 12614001248651）および臨床試験gov(番号NCT02369198）に登録された。合計２７人の患者が５つの集団を超えて動員され、２６人の患者が合計３１６用量の^VＥＤＶ_miRNA16aを受けた（１人の被験者はいずれかの治療を受ける前に死亡し、さらなる解析から除外された）。この研究は、Kao ら、2015およびvan Zandwijk ら、2017により発表されている。

【0319】

評価した投与量は、５×１０⁹を週１回または２回、２．５×１０⁹を週２回投与した。サイトカイン反応の増加を避けるために、用量を１×１０⁹からフェーズ１当量用量に漸増させる用量適応も評価した。デキサメタゾン（ｄｅｘ）適応も評価し、その後の用量の前投薬のためにｄｅｘを徐々に減少させた。ＭＴＤは週１回５×１０^{9 V}ＥＤＶ_miR16aと同定された。本治療は概して良好であり、示された集団において許容可能な安全性所見が認められた。

【0320】

臨床試験及び所見の概要を以下の表１０に示す。

【0321】

【表10】

２４例中１６例が少なくとも１サイクルの治療を完了し、２例は合計で４０回以上の投与を受けた（治療のフルサイクルが５回以上）。観察された最良効果は１例の部分奏効であった。この症例は以下に記載するように、^VＥＤＶ_miR16aによる治療に反応してほぼ完全な寛解を示した。１０人の患者（６２．５％）は疾患の安定化を示し、５人の患者（３１．３％）は疾患の進行を示した。生存期間中央値は３６．５週、すなわち８．４か月（範囲９．３～＞１１９．６週）であり、９例（６０．０％）が６か月間生存し、このうち５例は治療開始から１２か月以上経過した時点で良好に生存していた。図４を参照されたい。

【0322】

特に注目すべきことに、１人の患者（集団１からの患者＃５）は第１サイクルの終わりに劇的な臨床応答を示した（Kaoら、Am. J. Respir. Crit. Care Med., 191（12）：467－1469（2015）を参照のこと）。８週間の期間の終了時、ＰＥＴ-ＣＴスキャンで「完全である」代謝反応が明らかになり、胸部ＣＴスキャンで部分奏効が認められ、４週間後に確認された。客観的画像反応は呼吸機能検査パラメータの顕著な改善を伴っていた。

【0323】

投与に関連した有害事象で最も多かったのは、悪寒、硬直、発熱、頻脈または高血圧（盗汗もこのカテゴリーに含まれる）などの注入に伴う反応（９６．２％）であった。これらの大部分の重症度は軽度から中等度であった。腫瘍部位の非心臓性胸痛も、注入後に１４例の患者（５３．８％）が経験した。これらの反応は治験実施計画書の改訂により対処された。治験実施計画書の改訂版では、第１サイクルでは全被験者に用量漸増スケジュールの修正を行ったため、注入に伴う反応が少なく、重症度も低かった。臨床検査では、炎症性サイトカインおよび好中球の一過性の上昇、ならびに大多数の患者における^VＥＤＶ_miRNA16a注入直後のリンパ球の一過性の低下が明らかにされ、軽度の炎症反応と一致した。

【0324】

８例に９件の重篤な有害事象が認められ、これらは少なくとも治療との関連性があるかもしれないとされた。非心臓性胸痛及び注入に伴う反応は、いずれも２例に発現した。３例で用量制限毒性が発現し、さらに２例で用量制限毒性と考えられる毒性が発現したが、用量制限毒性の枠外で発現したため、用量制限毒性の基準には適合しなかった。投与に関連した死亡は認められなかった。これらの事象は、以下の表１１に要約され、以下の説明に記載される。

【0325】

【表11】

３人の患者を集団１に補充した（週に５×１０⁹）。このうち１例では、腫瘍部位周辺の非心臓性胸痛の用量制限毒性が認められた。この被験者は減量された用量に進み、その後、完全な強度に段階的に戻った。この集団を拡大して計６例の被験者を登録したが、それ以上のＤＬＴはなかった。

【0326】

集団２の被験者２例中２例（週２回５×１０⁹）に減量又は治験中止に至る毒性が認められた。第１は、用量制限毒性として分類された注入関連反応であった。この被験者は減量された用量に進み、その後、完全な強度に段階的に戻った。２番目の事象は冠動脈虚血を併発した持続的な心電図変化であり、第４週の投与で起こったため、用量制限毒性として分類されなかった（以下でさらに考察する）。この被験者は試験から除外され、この集団（最大投与量）にそれ以上の被験者は組み入れられなかった。

【0327】

６人の被験者を追加の集団（集団３、週１回５×１０⁹＋用量漸増）に登録し、そこでは、すべての被験者が減量を開始し、その後、治験薬に対する注入反応を最小限に抑えるために、十分な強さまで漸増した。この集団で用量制限毒性を経験した被験者はいなかった。

【0328】

２人の被験者を集団４に登録し（２．５×１０⁹、週２回＋用量漸増）、用量制限毒性は経験されなかった。しかし、週２回投与に伴う臨床的負担が大きいため、この集団への募集を中止することとした。

【0329】

９例の被験者を追加の集団（集団５、週５×１０⁹＋用量漸増＋ｄｅｘ適応）に登録し、用量漸増およびデキサメタゾン前投薬の漸減を含む投薬計画を評価した。図４を参照されたい。この集団では、１例の被験者に何ら治療を施さなかった。残りの８例のうち、２例で減量又は治験中止に至った毒性が認められた。第１はタコツボ（ストレス関連）心筋症であり、これは、用量制限毒性として分類された（以下にさらに議論される）。この被験者は試験を中止した。２つ目はアナフィラキシー様反応であり、第７週の投与で起こったため、用量制限毒性として分類されなかった。しかしながら、この被験者は試験から除外され、この集団への募集は中止された。最長許容量は、週１回５×１０^{9 V}ＥＤＶ_miRNA16aと決定された。

【0330】

この試験では多くの心イベントが認められたが、他の適応症に対する異なるＥＤＶ生成物の試験ではこれまで観察されていなかった。２例で重篤な有害事象として、減量又は中止に至った心イベント（虚血及びたこつぼ型心筋症）が認められた。当該事象は投与７日後に発現し、冠動脈疾患の既往歴があったことから、虚血は治験薬投与に起因する可能性は低いと判断された。この被験者では、より早期の投与中に心電図変化が認められた。心筋症事象に先立って急性輸液反応が発現したが、これはおそらくｄｅｘ漸減の結果であると考えられた。この被験者には冠動脈疾患の既往もあった。さらに３例で投与後に一過性の心電図変化（Ｔ波異常）が認められたが、重篤とは分類されなかった。これらは、トロポニンの上昇、虚血または駆出率の変化とは関連していなかった。すべての事象が消失し、被験者は追加投与を受けたが、それ以上の心電図異常は認められなかった。それにもかかわらず、悪性胸膜中皮腫患者の高齢、および本疾患に関連する罹病率を考慮すると、これらの観察結果から、安全性委員会は、より厳格な心臓除外基準と、残りの試験および今後のあらゆる試験のための追加的な心臓モニタリングを推奨するに至った。

【0331】

^VＥＤＶ_miRNA16aによる総合的な治療は一般に、５×１０⁹のＥＤＶの最高耐容用量まで十分に耐容され、この特定の患者集団では十分な監視および適応された漸増用量計画が与えられたが、有意な懸念はなかった。

【0332】

このように、この例は、癌細胞にｍｉＲＮＡ１６ａを送達するためにＥＧＦＲを標的とするＥＤＶを用いることによって、中皮腫を治療する上で有望な結果を示した。しかしながら、実施例の結果はまた、中皮腫のための改善された治療戦略の必要性を実証する。

【0333】

実施例８：インビトロ細胞毒性アッセイは、超毒性薬物PNU－１５９６８２が他の化学療法剤よりも大きく腫瘍細胞系の増殖を阻害することを明らかにした
この実施例は、超毒性細胞傷害性化学療法剤であるPNU－１５９６８２が広範囲の他の化学療法薬よりも強力な癌細胞増殖阻害剤であることを示した。

【0334】

ＰＮＵ１５９６８２はアントラサイクリン系ネモルビシン（ＭＭＤＸ）の強力な代謝産物であり、その親化合物（ＭＭＤＸとドキソルビシン）の３，０００倍以上の細胞毒性を有することから、ＰＮＵ―１５９６８２は、“超毒性”化学療法薬と考えられる。このような薬物の使用は、超毒性薬物の毒性レベルが死亡を含む重度の有害事象をもたらすため、一般的に典型的な化学療法治療では不可能である。

【0335】

ＰＮＵ－１５９６８２および他の示される化学療法剤を、図５～１０に示される濃度で腫瘍細胞株に添加した。

【0336】

全ての細胞をさらに７２時間インキュベートし、続いて、CellTiter 96 AQu_eousOne Solution Cell Proliferation Assay(Promega Corp、Madison、W ＩＵSA）を、製造者の指示に従って使用して、比色ＭＴＳ細胞増殖分析（Coryら、Cancer Commun.,3（7)：207－12 (1991））を行った。比色測定値を４９０nmで読み取った。

【0337】

より大きな細胞毒性：これらのin vitro細胞毒性分析の結果は、ＰＮＵ－１５９６８２が図５Ａに示されるような一連の既知の化学療法剤によって観察される細胞毒性と比較して、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９に対してより大きな細胞毒性を示すことを示した。特に、ＰＮＵ１５９６８２はＡ５４９細胞をドキソルビシンよりもはるかに大きく阻害した。図５Ｂ。

【0338】

従来の化学療法剤に対する耐性を示すことが知られている癌細胞に対する有効性：さらに、図６は、ＰＮＵ－１５９６８２およびデュオカルマイシンがドキソルビシン、ミトタン、パクリタキセル、オキサリプラチン、およびミトキサントロンに対して高度に耐性であったステージＩＶ患者に由来する２つのAdreno－cortical癌細胞株に対して強力な細胞毒性効果を示したことを示す。さらに、図７は、ＰＮＵ－１５９６８２がドキソルビシン、パクリタキセルおよびドセタキセルに耐性であったヒト乳癌細胞株ＭＤＡ-ＭＢ-４６８の増殖を阻害したことを示す。図８は、ＰＮＵ－１５９６８２がドキソルビシン、シスプラチンに耐性であるヒト結腸直腸癌細胞株Ｃａｃｏ-２（図８Ａ）およびＨＣＴ１１６（図８Ｂ）の増殖を阻害したことを示す。図９は、ＰＮＵ－１５９６８２がドキソルビシンおよびパクリタキセルＩＶＡＸに耐性であった神経膠芽腫細胞株Ｕ８７－ＭＧの増殖を阻害し得ることを示す。図１０Ａは、これらの細胞がドキソルビシン、ゲムザール、マトルトキサート、オキサリプラチン、イリノテカン、および５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）に耐性であるにもかかわらず、ＰＮＵ－１５９６８２がゲミシタビン感受性であるヒト膵臓細胞株（ＭｉａＰａｃａ-２細胞、図１０Ａ）の増殖を阻害することができることを示す。図１０Ｂは、ＰＮＵ－１５９６８２がゲミシタビン耐性細胞（ＭｉａＰａｃａ－２ ＧｅｍＲ細胞、図１０Ｂ）であるヒト膵臓細胞株の増殖を、これらの細胞がｇｅｍｚａｒに耐性であったとしても阻害し得ることを示す。

【0339】

これらのデータはＰＮＵ－１５９６８２などの超毒性化学療法剤を癌治療に使用することが非常に望ましいことを示しており、それは、薬剤が従来の非超毒性化学療法剤に対する耐性を示す癌の治療に有用であり得るからである。

【0340】

実施例９： ＥＧＦＲ標的ＥＤＶとともに送達されたPNU１５９６８２は、マウス異種移植モデルにおいてヒト肺癌細胞の薬剤耐性を克服することができる
この実施例はＰＮＵ－１５９６８２などの超毒性化学療法剤を送達するためにミニ細胞（ＥＤＶ）を使用することが、肺癌異種移植モデルにおける腫瘍増殖を効果的に阻害することを示した。

【0341】

Ａ５４９（肺癌）細胞をドキソルビシン（Ｄｏｘ）存在下で連続培養し、Ｄｏｘ耐性クローンを選択することによりドキソルビシン耐性とした。次に、これらの細胞を異種移植片としてＢａｌｂ/ｃ ｎｕ/ｎｕマウスに移植した。腫瘍体積が～１５０mm³に達したとき、（１群あたりｎ＝７）マウスの４つの異なった群を、（i）生理食塩水、（ii）ドキソルビシン（^EGFRＥＤＶ^TM _Dox）を負荷したＥＤＶを標的とする上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、（iii）ＰＮＵ－１５９６８２（^EGFRＥＤＶ^TM ₆₈₂）を負荷したＥＤＶを標的とするＥＧＦＲ、および（iv）図１１に実線矢印で示す時点でＰＮＵ－１５９６８２（ＥＤＶ^TM ₆₈₂）を負荷した非標的ＥＤＶで静脈内（ＩＶ）処置した。ＥＧＦＲを標的とし、ＰＮＵ－１５９６８２を負荷したＥＤＶの組成を図１にグラフで示す。

【0342】

図１１に示された結果は、^EGFRＤＶ^TM _Doxが抗腫瘍効果を有さず、したがって、腫瘍はドックス耐性を示したことを示す。対照的に、^EGFRＥＤＶ^TM ₆₈₂で処理したマウスは、完全な回復を示した。生理食塩水で処理した腫瘍が５００mm³～７００mm³の腫瘍体積に達したとき、図１１に星印（＊）で示した時点で処理を^EGFRＥＤＶ^TM ₆₈₂に変更した。驚くべきことに、結果は、５００mm³～７００mm³の体積に達した腫瘍においてさえ、非常に有意な抗腫瘍効力を示した。

【0343】

実施例１０： 機能性ＤＮＡ剤をＥＧＦＲ標的化ＥＤＶで送達することは、中皮腫（ＭＳＴＯ）およびアドレノ皮質癌（ＡＣＣ）癌細胞増殖を効果的に阻害する
この実施例はポロ様キナーゼ1（Ｐｌｋ１）、リボヌクレオチドレダクターゼ酵素1（ＲＲＭ１）を標的とするｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ１６ａを標的とするｓｉＲＮＡを送達するためにミニ細胞（ＥＤＶ）を使用することが、癌細胞の増殖を効果的に阻害し得ることを示した。

【0344】

キナーゼ1（Ｐｌｋ１）およびリボヌクレオチドリダクションザイム1（ＲＭ１）は、Ａ５４９、Ａ５４９ＭＤＲ（ドックス耐性Ａ５４９セルライン、多薬剤耐性膜ポンプ、ＭＤＲを過剰表現する）、Ｈ２１２２、Ｈ３５８およびＨ４４１を含むいくつかの非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）セルラインにおいて過剰に表されることが示された。図１２はＧＡＰＤＨ（ｇ）、ＫＳＰ（Ｋ）、Ｐｌｋ１（Ｐ）、およびＲＲＭ１（Ｒ）の発現を示し、この発現は、示されたＮＳＣＬＣ細胞株におけるＧＡＰＤＨ発現と比較して示される。

【0345】

Ｐｌｋ１またはＲＲＭ１が癌治療のための有用な標的であるかどうかを試験するために、ＲＲＭ１（ｓｉＲＲＭ１）およびＰｌｋ１（ｓｉＰｌｋ１）を標的とする阻害非コード低分子干渉ＲＮＡ「ｓｉＲＮＡ」を合成し、がん細胞株への送達のためにＥＤＶ中にパッケージ化した。

【0346】

ＲＲＭ１を標的とするｓｉＲＮＡは、中皮腫および副腎皮質癌細胞の増殖を阻害することがわかった。ＥＧＦＲ標的、ｓｉＲＲＭ１パッケージＥＤＶをＭＳＴＯ(メソヘリオマ細胞系）またはＨ２９５Ｒ（アドレノ皮質細胞系）にトランスフェクトした。トランスフェクションの５日後、細胞増殖を測定し、その結果を図１３に示し、非標的化ｓｉＲＲＭ１パッケージ化ＥＤＶまたはＥＧＦＲ標的化ｓｉＮｏｎｓｅｎｓｅパッケージ化ＥＤＶを用いた対照トランスフェクションと比較して、細胞増殖の非常に有意な阻害を示した。

【0347】

Ｂａｌｂ/ｃ ｎｕ/ｎｕマウスにおける中皮腫（ＭＳＴＯ）異種移植片研究において、ＥＧＦＲ導的化ｓｉＲＲＭ１パッケージ化ＥＤＶでの静脈内（ＩＶ）処置は図１４に示されるように、生理食塩水またはＥＧＦＲ標的化ｓｉＳｃｒａｍｂｌｅｄパッケージ化ＥＤＶと比較して、非常に有意な抗腫瘍効力を示した。ｓｉＲＲＭ１パッケージ化ＥＤＶを受けたマウスから単離された腫瘍は、陰性対照を受けたマウスからの腫瘍よりも有意に小さかった。図１５。

【0348】

ｍｉｒｎａ16ａは中皮腫癌細胞の増殖を阻害することが分かった。Balb/c nu/nuマウスにおける中皮腫（ＭＳＴＯ）異種移植片研究において、ＥＧＦＲ標的化ｍｉＲＮＡ１６ａパッケージ化ＥＤＶでの静脈内（IV）処置は図１４に示されるように、生理食塩水またはＥＧＦＲ標的化siスクランブルパッケージ化ＥＤＶと比較して、非常に有意な抗腫瘍効力を示した。ｍｉＲＮＡ１６ａパッケージ化ＥＤＶを受けたマウスから単離された腫瘍は、陰性対照を受けたマウスからの腫瘍よりも有意に小さかった。図１５。

【0349】

ＥＧＦＲ（^EGFRＥＤＶ^TM _siPLK）を標的としたｓｉＰＬＫ負荷ＥＤＶは図１６に示すように、癌患者由来腫瘍スフェロイド（ＡＣＣ００１）においてアポトーシスを誘発し、ペイロード（^EGFRＥＤＶ^TM）を全く含まないＥＤＶ、または無関係なルシフェラーゼ配列（^EGFRＥＤＶ^TM _luciferase）を標的とするＲＮＡ干渉分子を有するＥＤＶを陰性対照として用いた。これらのネガティブコントロールと比較して、^EGFRＥＤＶ^TM _siPLKは細胞残屑の測定（図１６Ａ）およびアネキシン／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）比率の測定（図１６Ｂ）によって決定されるように、ＡＣＣ１スフェロイドにおけるアポトーシスを誘導した。^EGFRＥＤＶ^TM _siPLK処理はまた、図１７に示されるように、陰性対照と比較して、サブＧ１細胞サイクラー停止において有意な数の細胞をもたらした。このように、siＲＮＡでＰｌｋ１発現を阻害することは、ＡＣＣ００１副腎皮質癌細胞においてアポトーシスと細胞周期停止を誘導するための有効な戦略である。

【0350】

実施例１１：ＥＧＦＲ標的ＥＤＶによるインターフェロンＩ型アゴニストの送達は、異種移植モデルにおいて細胞毒性薬を負荷したＥＤＶの抗腫瘍効果を増大させる
この実施例は、インターフェロンＩ型アゴニストと併用される化学療法剤を送達するためにミニ細胞（ＥＤＶ）を使用することが、肺癌異種移植片などの癌を治療するための有効な戦略であることを示した。インターフェロンＩ型アゴニストは、化学療法剤と同じまたは異なるミニ細胞中に存在同様。本実施例において、化学療法剤は超毒性薬物ＰＮＵ－１５９６８２であり、インターフェロンＩ型アゴニストは、４０mer二本鎖ＤＮＡである。

【0351】

Ｂａｌｂ/Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおけるＡ５４９（肺癌）異種移植片を、図１８に描写されるように、尾静脈における静脈内注射によって種々のＥＤＶ組み合わせで処置した。マウスは、（i）黒三角＝^EGFRＥＤＶ_PNU-159682 + ＥＤＶ_40mer、（ii）黒丸^EGFRＥＤＶ_PNU-159682（iii）白四角＝^EGFRＥＤＶ_PNU-159682＋ＥＤＶ、(iv）白三角＝^EGFRＥＤＶ_PNU-159682+ＥＤＶ_50mer、および（v）黒四角＝サラインで処理した。Ｉ型インターフェロン作動薬である。

【0352】

図１８に上向き矢印で示すように、異種移植片移植後２４、２７、２９、３１、３４、３６、および３８日目に、マウスをこれらのＥＤＶの組み合わせで処置した。図１８に示すように、試験したＥＤＶの全ての組み合わせは、腫瘍増殖の安定化をもたらした。対照的に、生理食塩水処理対照群は～６５０mm³の体積まで主要増殖を示した。第３６日と３８日では、腫瘍体積が～６５０mm³の食塩水群マウスが、図１８の下矢印で示されるように^EGFRＥＤＶ_PNU-159682 ＋ＥＤＶ_50merで処理された。

【0353】

ＰＮＵ―１５９６８２とＥＧＦＲターゲティング（^EGFRＥＤＶ_PNU-159682）を含むミニ細胞（ＥＤＶ）と４０merダブルストランドＤＮＡ（ＥＤＶ_40mer）を含むＥＤＶを組み合わせて、～６５０mm³の大量のを持つマウスを処理すると、その結果、大きく後退する結果となった。具体的には、わずか５日で、腫瘍容積は～６５０mm³から～２５０mm³に減少し、５日で６２％減少した。結果を以下の表にまとめる。

【0354】

【表12】

さらに、図１９に示されるように、ＰＮＵ－１５９６８２およびＥＧＦＲ標的化（^EGFRＥＤＶ_PNU-159682）を含むミニ細胞（ＥＤＶ）と組合せて４０mer二本鎖ＤＮＡ（ＥＤＶ_40mer）を含むＥＤＶは、肺癌のマウス異種移植片モデルにおいて^EGFRＥＤＶ_PNU-159682単独で処置された腫瘍細胞と比較して、腫瘍のより有意な退縮を誘導した。図１９において、Ｂａｌｂ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスを、（i）黒丸＝^EGFRＥＤＶ_PNU-159682、（ii）黒三角＝^EGFRＥＤＶ_PNU-159682+ＥＤＶ_40mer、または（iii）黒四角＝生理食塩水で処置した。結果を以下の表にまとめる。

【0355】

【表13】

結論として、ミニ細胞にパッケージされたＩ型ＩＦＮアゴニストは、^EGFRＥＤＶ_PNU-159682 治療の抗腫瘍効果を増大させる。

【0356】

実施例１２： Ｉ型ＩＦＮアゴニスト（ＥＤＶ_40merまたはＥＤＶ_60mer）およびII型ＩＦ
Ｎアゴニスト（ イムキン）を用いたＥＤＶ_PNU-159682 の臨床的評価
本実施例は、Ｉ型およびII型ＩＦＮアゴニストが進行固形腫瘍に罹患しているヒト患者における^EGFRＥＤＶ_PNU-159682の抗癌作用を増大させることを示した。著しいことに、進行期膵臓癌患者においてさえ、この治療は、わずか３回の投与後に腫瘍マーカーレベルの９０％の低下を生じ、患者は著しく改善された生活の質を示した。

【0357】

薬物、Ｉ型ＩＦＮアゴニスト、およびII型ＩＦＮアゴニストを含むミニ細胞による処置：本発明者らは、対象が１型ＩＦＮアゴニスト４０mer二本鎖ＤＮＡ（ＥＤＶ_40mer）（１型ＩＦＮアゴニスト）または６０mer二本鎖ＤＮＡ（ＥＤＶ_60mer）（１型ＩＦＮアゴニスト）を負荷したミニ細胞と組合せて標的化および負荷ＥＤＶを受けた臨床事例研究を行った。

【0358】

進行固形腫瘍の３例に、デザイナーＥＤＶ試験（メルボルン、オーストラリア）の一環として、^EGFR(V)ＥＤＶ_PNU-159682と補助ＥＤＶ_40mer（１型ＩＦＮアゴニスト）の併用療法を行った。２人の追加の患者は、緊急使用法のもとで、ＥＤＶ_60mer（１型ＩＦＮアゴニスト）と併用して負荷および標的ＥＤＶを受けた。ＩＶ期膵がんと診断された１人の緊急使用患者は^EGFR(V)ＥＤＶ_PNU-159682およびＥＤＶ_40mer(１型ＩＦＮアゴニスト）またはＥＤＶ_60mer（１型ＩＦＮアゴニスト）による治療を受け、再発副腎皮質がんと診断された２人目の緊急使用患者は^EGFR(V)ＥＤＶ_PNUおよびＥＤＶ_60mer＋イムキン（２型ＩＦＮ）を受けた。

【0359】

臨床試験
薬剤および１型ＩＦＮアゴニストを含むミニ細胞：補助ＥＤＶ_40merを伴う^EGFR(V)ＥＤＶ_PNU（１型ＩＦＮアゴニスト）を、進行固形腫瘍を有する被験者を対象とした非盲検単一施設探索的第1相試験（デザイナーＥＤＶ試験）において、３人の患者で評価した。適格とするために、標的化を容易にするために、患者は、腫瘍組織におけるＥＧＦＲ発現のエビデンスを有する進行固形腫瘍の組織学的または細胞学的記録を得ることとした。患者は、標準的な１次、２次または３次治療レジメンの投与中または投与後に疾患の進行を示していなければならない。試験の主要なエンドポイントは、型ＥＤＶ_40mer（第１種ＩＦＮアゴニスト）との^EGFR(V)ＥＤＶ_PNU-159682の安全性と耐性を確立することであった。

【0360】

この試験は、オーストラリア、メルボルンの単一センターで開始され、オーストラリアニュージーランド臨床試験登録（番号ACTRN 12617000037303）に登録された。

【0361】

試験の３被験者は、５×１０⁸のＥＤＶ (１型ＩＦＮアゴニスト)を用いて、２．５×１０⁹で計１３回の^EGFR(V)ＥＤＶ_PNU-159682を受けた。治療は、８週間の治療からなるサイクルにおいて、２０分間のＩＶ注入として週１回投与した。各サイクルの終了時に、患者は腫瘍の放射線学的評価を受けた。

【0362】

入手可能な安全性データは限られているが、ＩＰに対する予期せぬ副作用はなく、治療は概して良好であった。他のＥＤＶ生成物の投与でみられるように、患者は一般的に炎症性サイトカインであるＩＬ－６、ＩＬ－８およびＴＮＦ－αの一時的な増加を経験し、これは治療用量間でベースラインに戻った。観察された血液学的パラメータの変化はＥＤＶ治療薬を用いた過去の試験でみられた変化を大きく反映しており、白血球（ＷＢＣ）の軽度の自己限定性上昇、投与３時間後の好中球の上昇、およびそれに伴うリンパ球および単球の減少などであった。パラメータは、次の投与前の次の時点で正常に戻った。一部の被験者で血清リン酸塩濃度の軽度低下が認められたが、介入を必要とせず、用量間でベースライン値に回復した。

【0363】

２例で注入に伴う反応に関連する有害事象が発現し、投与から約１時間後に硬直および発熱が認められた。これらの患者は観察のために一晩入院し、事象は翌日までに消失した。１例が用量制限毒性のため試験を中止した。２人目の患者は試験を継続し、追加投与を受けた。

【0364】

思いやりのある使用研究
シドニーのローヤルノースショア病院で最初の思いやりのある使用ケース研究が行われた。患者は６８歳の女性で、ステージＩＶの膵癌と診断された。Ｗｈｉｐｐｌｅ手術（膵頭十二指腸切除術）を受け、第一選択治療としてゲムシタビンが投与された。ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ治療レジメンも受けたが、転移性肝疾患を発症した。彼女の腫瘍細胞をin vitroで試験し、ＰＮＵ－１５９６８２に感受性であることが見出された。

【0365】

患者は、異なる免疫調節アジュバントと組み合わせて、ＰＮＵ負荷ＥＤＶおよびＥＧＦＲ標的ＥＤＶを含むＥＤＶ生成物の２週間毎の用量を受けた。これらを、２０mLの注入としてＩＶ送達した。患者は本プロトコールでの使用を意図したように、ＥＧＦＲ（Ｖ）標的ＥＤＶおよびＰＮＵを含むＩＴＧ（６０９）標的ＥＤＶの両方、ならびにＥＤＶ_40mer（１型ＩＦＮアゴニスト）またはＥＤＶ_60mer（１型ＩＦＮアゴニスト）を受けた。全部で４５回の^EGFR(V)ＥＤＶ_PNU-159682+ＥＤＶ_40mer（または関連する商品ＥＤＶ_60mer）を受けた。^EGFR(V)ＥＤＶ_PNU-159682と^ITG(609)ＥＤＶ_PNU-159682の量はそれぞれ２×１０⁹と４×１０⁹まで増量し、ＥＤＶ_40mer/60mer は５×１０⁸の一連の量で与えた。

【0366】

患者の治療に対する忍容性は非常に良好であり、ＩＰ関連の重篤な有害事象は認められなかった。予備的な結果は炎症性サイトカインであるＩＬ-６、ＩＬ-８およびＴＮＦ－αの投与後の一過性の増加を示しており、他のＥＤＶ生成物の投与で見られたものと同様である。これらの反応は一般に、その後の投与量にわたって低下した。抗炎症性サイトカインＩＬ－１０も投与後に一過性に増加した。興味深いことに、ＩＦＮ－αは研究全体を通して様々な時点で同様に増加し、これは、ＥＤＶ_{40mer／60mer}による刺激の結果である可能性が高い。投与２時間後にＩＦＮ－γの上昇は検出されなかった。

【0367】

注目すべきことに、患者の腫瘍マーカー（ＣＡ１９－９）の量は、治療のわずか１０日間に相当する最初の３回の投与後に９０％以上低下した。１０回投与後、これはさらに低下し、腫瘍マーカー値がほぼ９５％低下した。また、ＩＶ期膵がん患者のほとんどが経験する悪液質状態とは対照的に、有意な体重増加を示し、生活の質の著しい改善を報告した。このように、本症例研究の予備的な安全性および有効性の結果は、特に進行膵癌に伴う予後不良を考慮すると、極めて有望である。

【0368】

薬剤、I型ＩＦＮアゴニスト、およびＩI型アゴニストから成るミニ細胞：腫瘍量が非常に重い末期副腎皮質癌患者を対象とした２回目のコンパッショネートユースケーススタディは、Royal North Shore Hospital(シドニー）で治療された。

【0369】

^EGFR(V)ＥＤＶ_PNU-159682（抗腫瘍剤を含むミニ細胞、１×１０⁹～４×１０⁹［ＥＤＶ］、ＥＤＶ_60mer（Ｉ型ＩＦＮアゴニストを含むミニ細胞、１型ＩＦＮアゴニストの用量は５×１０⁸～２×１０⁹［ＥＤＶ］の範囲）、およびイムキン（ＩI型ＩＦＮの用量は５μg（１×１０⁵ＩＵ）～３０μg（６×１０⁵ ＩＵ）の範囲）の抗腫瘍剤を含むミニ細胞を週２当たり１０回投与した。

【0370】

患者は治療に非常によく耐え、投与後60分まで軽度の体温上昇を経験したのみであった。これは、ＥＤＶ製品の投与で予想される。残念ながら、患者は重篤な免疫系抑制因子であることが知られている高レベルのコルチゾールを含む非常に高い疾患負荷を有し、第７週のＣＴスキャンは進行性疾患を示したため、患者は試験から脱落した。

【0371】

要約すると、５例が^EGFR(V)ＥＤＶ_PNU/Doxまたは^EGFR(V)ＥＤＶ_PNU/PNU＋ＥＤＶ_40mer/
60mer(Ｉ型ＩＦＮアゴニスト）±イムキン（II型ＩＦＮ）の計６９回を受けた。治療は十分に寛容であり、免疫調節アジュバントの添加は、単剤負荷ＥＤＶおよび標的ＥＤＶの安全性プロフィールを変化させないようであった。

【0372】

実施例１３：ＩＦＮ－γ(II型ＩＦＮアゴニスト）の添加はドキソルビシンを負荷した上皮成長因子受容体標的ＥＤＶの抗腫瘍効果を増強し、様々な癌の異種移植モデルにおいて腫瘍退縮を引き起こす
この実施例はドキソルビシンをＩＦＮ－γと組み合わせて送達するためにミニ細胞（ＥＤＶ）を使用することが、マウス異種移植モデルにおいて改善された抗腫瘍効果を提供することを示した。

【0373】

肺癌：肺癌モデルにおいて^EGFRＥＤＶ_DoxとＩＦＮγ(II型ＩＦＮ）の併用の抗腫瘍効果を研究するために、Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおけるＡ５４９（肺癌）異種移植片を確立し、静脈内尾静脈注射による種々の治療併用を受けた４グループに分けた。グループ１は、無菌の生理食塩水を受けた（図２０、白菱形）。グループ２には、投与量当たりＩＦＮ－γ(０．５×１０⁴ＩＵ）を与えた（図２０、黒三角）。グループ３は^EGFRＥＤＶ_Doxを受信した（図２０、黒四角）グループ４は投与量当たり^EGFRＥＤＶ_DoxおよびＩＦＮ－γ（０．５×１０⁴ＩＵ）を投与した（図２０、固体）。^EGFRＥＤＶ_Doxで処置したマウスは、Ａ５４９肺癌異種移植片の腫瘍安定化を達成した（図２０、黒四角）。対照的に、^EGFRＥＤＶ_DoxおよびＩＦＮ－γで処置したマウスは、全６回の投与後４３日目までに非常に有意な腫瘍退縮を示した（図２０、黒丸）。ＩＦＮ－γのみで処理したマウスは、抗腫瘍効果を示さず（図２０、黒三角）、腫瘍は生理食塩水処理グループと同様に成長した（図２０、白菱形）。従って、^EGFRＥＤＶ_DoxとＩＦＮγ(II型ＩＦＮ）とを組み合わせると、以下の表１４に要約されるように、肺癌のマウス異種移植片モデルにおいて腫瘍退縮が生じた。

【0374】

【表14】

乳がん：乳がんモデルにおいて、^EGFRＥＤＶ_DoxとＩＦＮ－γを結合させた抗がん効果を研究するために、Ｂａｌｂ／ｎｕ／ｎｕマウスにおけるＭＤＡ-ＭＢ４６８異種移植を確立し、静脈注射により異なる治療組み合わせを受ける４つのグループに分けた。グループ１は、無菌生理食塩水を受けた（図２１、白菱形）。グループ２には、投与量当たりＩＦＮ－γ(０．５×１０⁴ＩＵ）を与えた（図２１、黒三角）。グループ３には（図２１、黒四角）を投与し、グループ４には^EGFRＥＤＶ_DoxおよびＩＦＮ－γ(０．５×１０⁴ＩＵ）を投与した（図２１、黒丸）。

【0375】

^EGFRＥＤＶ_Doxで治療されたマウスはＭＤＡ－ＭＢ４６８乳癌異種移植片の腫瘍安定化を達成したが、約２５日目までに、ドキソルビシン耐性の発現により腫瘍が再増殖し始めた可能性が高い（図２１、黒四角）。対照的に、^EGFRＥＤＶ_DoxおよびＩＦＮ－γで処置したマウスは非常に有意な腫瘍退縮を示し、３０日目までに、全６用量の後、これらの腫瘍は、瘢痕組織により類似していた（図２１、円）。ＩＦＮ－γのみで処理したマウスは、抗腫瘍効果を示さず（図２１、黒三角）、生理食塩水処理群と同様に腫瘍が増殖した（図２１、白菱形）。図２２に示される追加の試験において、^EGFRＥＤＶ_Dox で処置されたマウスはＭＤＡ-ＭＢ４６８乳癌異種移植片の腫瘍退縮を再度達成したが、～２３日までにはドキソルビシンに対する耐性の発現により、腫瘍は再び成長し始めた（図２２、黒四角）。対照的に、^EGFRＥＤＶ_DoxおよびＩＦＮ－γで処置したマウスは非常に有意な腫瘍退縮を示し、２８日目までに、全３回の投与後、これらの腫瘍は瘢痕組織により類似していた（図２２、黒丸）。ＩＦＮ－γのみで処理したマウスは、抗腫瘍効果を示さず（図２２、黒三角）、生理食塩水処理群（図２２、白菱形）と同様に腫瘍が成長した。従って、^EGFRＥＤＶ_DoxとＩＦＮ－γ(II型ＩＦＮ）とを組み合わせると、以下の表１５に要約されるように、乳癌のマウス異種移植片モデルにおいて腫瘍退縮が生じた。

【0376】

【表15】

肺癌：ドキソルビシン耐性肺癌モデルにおいて^EGFRＥＤＶ_DoxとＩＦＮ－γ(II型ＩＦＮ）を組み合わせることの抗腫瘍効果を研究するために、Ａ５４９肺癌細胞系を、最初にドキソルビシン（Ｄｏｘ）の存在下で培養して増殖させ、Ｄｏｘ耐性誘導体細胞系を確立した。次に、Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおけるＤｏｘ耐性Ａ５４９異種移植片を樹立し、尾静脈注射による異なる治療組合せを受ける４グループに分けた。グループ１は、１週間に２回、無菌生理食塩水を受けた（図２３、白菱形）。グループ２は^EGFRＥＤＶ_Dox（図２３、黒三角）を投与され、グループ３は^ＥＧＦＲＥＤＶ_ＤｏｘおよびＩＦＮ－γ(０．７５×１０⁴ＩＵ）を投与された（図２３、黒四角）。グループ４は、投与量当たり^EGFRＥＤＶ_DoxおよびＩＦＮ－γ(０．５×１０⁴ＩＵ）を投与された（図２３、実線）。図２３に示すように、グループ１、２、および３は１週間あたり２回、示された投薬量であり（図２３のｘ軸上の黒三角によって示される）；一方、グループ４のマウスは１週間あたり３回、示された投薬量を投与された（図２３のｘ軸上の白三角によって示される）。^EGFRＥＤＶ_DoxおよびＩＦＮ－γ(０．５または０．７５×１０⁴ＩＵ）で週２回または週３回処置したマウスは、耐性Ａ５４９肺癌異種移植片の腫瘍安定化を達成した（図２３）。対照的に、^EGFRＥＤＶ_Doxで処置したマウスは抗腫瘍効力を示さず、腫瘍は生理食塩水で処置したグループと同様に増殖した。この結果はＩＦＮ－γ(０．５または０．７５×１０⁴ＩＵ）を、通常は腫瘍単独に抵抗性である腫瘍の処置における^EGFRＥＤＶ_Doxと共に含めることが、腫瘍安定化を達成するために必須であることを示唆する。したがって、^EGFRＥＤＶ_DoxとＩＦＮ－γを組み合わせることにより、肺癌異種移植モデルにおける薬剤耐性を克服することができる（以下の表１６に要約）。

【0377】

【表16】

実施例１４：^EGFRＥＤＶ_PNUまたは^ITGＥＤＶ_PNU-159682+ＥＤＶ_40mer（Ｉ型ＩＦＮアゴニスト）＋イムキン(II型ＩＦＮ)を用いた遅延ステージの内生腫瘍を伴うイヌの処置
この実施例は、イヌの研究において、ミニ細胞技術および追加的にインターフェロンγ(イムキン)（II型ＩＦＮ）を有する超毒性薬物ＰＮＵ-１５９６８２およびＩ型ＩＦＮアゴニスト（４０mer二本鎖ＤＮＡ）を送達することが、良好な忍容性を示すことを示した。

【0378】

内因性後期癌のイヌを用いて毒性学的研究を行った。イヌは後期腫瘍を呈するコンパニオン動物であった。各ペットの飼い主からインフォームドコンセントを得た。

【0379】

脳がん、肉腫、または黒色腫のイヌ１３匹を、免疫調節アジュバント（ＥＤＶ_60mer/50merおよび／またはイムキン）と併用して、ＥＧＦＲまたはＩＴＧ(インテグリン）を標的とするＰＮＵ負荷ＥＤＶで治療した。脳腫瘍または肉腫のイヌをＥＧＦＲ標的ＥＤＶで治療し（ｎ＝９）、黒色腫のイヌをＩＴＧ導的ＥＤＶで治療した（ｎ＝４）。合計１８５週１回または隔週１回の用量を、アジュバントの有無にかかわらず、異なる組み合わせで投与し、最大７３回の用量を単一のイヌに与えた。最大５×１０⁹のＰＮＵロードＥＤＶおよび標的ＥＤＶ、最大２×１０⁹ＥＤＶ_40mer/50mer、イムキン、２５μg／m²／用量を用いた。いずれの併用も全般的に忍容性は良好であり、最も多く認められた有害事象は他のＥＤＶ生成物の投与時に認められた有害事象（軽度の嗜眠、発熱、悪心、嘔吐）と同様であった。免疫調節アジュバントの添加はＥＤＶ投与で見られる一般スペクトルを変化させたり、有害事象の頻度を増加させたりしないようであった。

【0380】

血液学的パラメータに対する注目すべき影響として、投与３時間後の白血球サブセット（ＷＢＣ、好中球、リンパ球、単球および好酸球）の軽度の一過性の減少が認められた。同様の変化が、免疫調節アジュバントの添加の有無にかかわらず見られた。注目すべきは、他のイヌおよびヒトの臨床試験では好中球は一般に投与後３時間で減少するのではなく増加したことである。この軽度の好中球減少は、ＰＮＵ負荷ＥＤＶによるイヌの治療に特異的であると思われる。

【0381】

イヌでは、投与３時間後にＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ４０及びＴＮＦ－αの一過性の上昇が認められた。一般に、免疫調節アジュバントを含む用量は、ＰＮＵ負荷ＥＤＶ単独を含む用量よりも、これらのサイトカインのわずかに高い誘導をもたらした。また、投与後のＩＬ－２量が低下した。これらのデータは、抗腫瘍負荷ＥＤＶおよび標的ＥＤＶと組み合わせて使用される免疫調節ＥＤＶアジュバントの安全性および忍容性を支持する。

【0382】

観察された最良効果は評価可能な７匹中６匹（８５．７％）で疾患の安定化が認められたが、１匹のイヌではほぼ部分奏効（腫瘍サイズの２９．８％の縮小）が得られた。１匹のイヌは、１１ヵ月以上の治療期間にわたって７３回の投与を受け、試験期間中安定した疾患を示した。このイヌは視神経を圧迫する腫瘍塊による視力喪失を示した。しかし、治療の過程で視力は回復し、臨床症状の改善が示された。

【0383】

実施例１５：標的ＥＤＶと負荷ＥＤＶはヒト臨床試験でＩＦＮ－γを活性化しない
この実施例から、パクリタキセルまたはドキソルビシンをパッケージ化したＥＤＶはトル様受容体活性化と一致するサイトカイン反応をヒトで誘導するが、このＥＤＶ処理はインターフェロンII型反応を誘導しないことが示された。

【0384】

標的ＥＤＶおよび負荷ＥＤＶの投与によって活性化される経路に関する洞察を得るために、サイトカインのパネルを、ヒト初回投与試験 (上記実施例５）および再発性膠芽腫ヒト臨床試験（上記実施例６）において評価した。

【0385】

図２４はヒト初回投与試験 （実施例５）における^EGFR(Erb)ＥＤＶ_Pac治療に対するサイトカイン応答を示し、図２５は、反復グリオブラストマ試験における^EGFR(V)ＥＤＶ_Doxに対するサイトカイン応答を示す。図２４および２５に示すように、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０およびより程度の低いＴＮＦ－ヘ投与３～４時間後に一過性に上昇し、いずれの治療についても２４時間後または次の投与前までにベースラインに戻った。パクリタキセルまたはドキソルビシンを負荷したＥＤＶに対するサイトカイン反応は、トル様受容体経路、特に細菌ＬＰＳによって刺激されることが知られているＴＬＲ４の活性化と一致している。ヒト初回投与試験のみの患者2例でＩＬ－１２が無作為に上昇したが（図２４）、上昇は投与と一致しなかった。

【0386】

興味深いことに、I型インターフェロンＩＦＮ－αは、ヒト初回投与研究（図２４参照）の患者３／２２例、および再発性膠芽腫研究（図２５参照）の患者１／１４例において、研究期間を通じてランダムな段階で上昇した。ＩＦＮ－αの誘導は投与と一致しなかった。インターフェロン経路は一般に、ＴＬＲ経路のような細菌刺激よりもむしろウイルス刺激によって活性化されるため、これらの選択された患者は試験中にウイルス感染が同時に報告されていなかった可能性がある（例えば、風邪）。しかし、ＩＦＮ－γを含む試験された他のすべてのサイトカインは、標的ＥＤＶおよび負荷ＥＤＶの投与によって影響されなかった。このことから、II型ＩＦＮ－αの活性化（イムキンの添加を介して）は、異なる抗腫瘍経路を刺激することによって標的ＥＤＶおよび負荷ＥＤＶの有効性を高めるための実行可能なアプローチである可能性が示唆される。

【0387】

実施例１６：がんに対する細胞免疫療法：腫瘍を標的とした、超毒性薬物パッケージ化された細菌由来ナノ細胞によって誘発される新規経路
この実施例は、腫瘍細胞表面受容体を標的としたＥＤＶナノ細胞が自然免疫系および適応免疫系の活性化と併せて、スーパーサイトトキシンＰＮＵ－１５９６８２（６８２）を送達することによって、腫瘍に対する二重攻撃が可能な癌免疫療法として機能することを実証する。

【0388】

この実施例は、主にＴｈ１サイトカイン応答を伴う微小環境内で腫瘍細胞を死滅させることができる６８２活性化Ｍ１マクロファージおよびＮＫ細胞を送達する標的ＥＤＶナノ細胞を示す。これに続いて、樹状細胞の成熟が起こり、抗原提示および腫瘍特異的ＣＤ８⁺ Ｔ細胞の生成が生じる。スーパーサイトトキシン送達と、先天性および適応性抗腫瘍免疫応答の両方の活性化の組み合わせは、臨床腫瘍学において可能性を有する強力な癌細胞免疫療法をもたらす。

【0389】

この実施例はＥＤＶナノ細胞の新規な細胞－免疫療法機能について初めて示し、そこでは、腫瘍細胞内で細胞傷害性薬物を送達することができるだけでなく、同時に腫瘍を特異的に標的とする自然免疫応答および適応免疫応答を誘発することができる。臨床的に、思いやりのある使用症例患者では、６８２の負荷ＥＤＶが適応免疫を刺激しながら薬剤耐性を克服することが示されている。前臨床試験は、ＥＤＶ治療に起因する免疫療法経路が免疫系による効果的な抗腫瘍応答を開始するのに必要な全ての工程に対処するアプローチを包含することを実証した。この例は、マクロファージ、ＮＫ細胞および樹状細胞を含む自然免疫系の細胞を活性化するＥＤＶの能力を例示している。これに続いて樹状細胞の成熟と抗原提示が起こり、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞が産生され、さらなる免疫細胞の腫瘍微小環境への動員をもたらす適応Ｔ細胞応答が起こる。このアプローチは免疫原性腫瘍微小環境を作り出し、それにより患者に生じるかもしれない一次耐性および／または適応耐性を回避する複数の免疫細胞サブセットにも作用することにより、免疫療法による現在のピットフォールのいくつかを回避する。

【0390】

結果：ＥＤＶ処理に応答したＭ１マクロファージ極性化と樹状細胞成熟：ＥＤＶがサルモネラタイフィムリウム菌 に由来する事実のため、ＥＤＶ外膜は実質的なリポ多糖（ＬＰＳ）含有量を含む（MacDiarmidら、2007b）。高用量のＬＰＳとマクロファージとの相互作用は、マクロファージの活性化およびＭ１の極性化をもたらすことがよく知られている。ＥＤＶが同様の表現型反応を誘発することができるかどうかを決定するために、ＲＡＷ２６４．７細胞をＥｐ－ＥＤＶ－６８２およびＥｐ－ＥＤＶとインキュベートし、マクロファージ表現型およびサイトカイン産生の変化について調べた。共刺激性ＣＤ８６発現の発現はマクロファージ極性化の表現型指標であるとともに、抗腫瘍Ｍ１腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の特徴であることが知られている（Dongら、2016）。

【0391】

Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２およびＥｐ－ＥＤＶの両方はおそらくＥＤＶ表面上のＬＰＳの存在に応答して、ＣＤ８６発現量の有意な増加を誘発することができたが、６８２単独では同じ応答を誘発しなかった（図２７Ａ）。さらに、ＥＤＶ処理ＲＡＷ細胞はＴｈ１マクロファージ分極の原因であると同定されている炎症誘発性サイトカインＴＮＦ－αおよびＩＬ－６の有意な増加を示した（Yuanら、2015）（図３５Ａおよび３５Ｂ）。興味深いことに、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２で処理し、続いてＲＡＷ２６４．７細胞と共培養したマウス腫瘍細胞（４Ｔ１およびＣＴ２６Ｅｐ１２．１）はまた、ＲＡＷ２６４．７細胞上でのＣＤ８６発現の有意な増加（図２７Ｂ）ならびに炎症誘発性サイトカインＴＮＦ－αおよびＩＬ－６の産生の有意な増加を生じさせることができた。（図２７Ｃ－２７Ｄ）。しかし、Ｅｐ－ＥＤＶまたは６８２処理のみではＣＤ８６発現に有意な変化を生じることはできず、６８２処理ではＴｈ１サイトカインの産生の増加は認められなかったことから、ＥＤＶ負荷６８２に応答した細胞死がその後のＭ１マクロファージの極性化を完全に誘導するために必要であることが示された。

【0392】

樹状細胞成熟に対するＥｐ－ＥＤＶ、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２、および６８２処置に応答した腫瘍細胞死の効果も試験した（図２７Ｅ～２７Ｉ）。骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を処理した腫瘍細胞（４Ｔ１及びＣＴ２６Ｅｐ１２．１）と４８時間共インキュベートした後、１型インターフェロンＩＦＮαおよびＩＦＮβの産生を評価した。樹状細胞による１型インターフェロン産生の増加は樹状細胞の成熟および抗原提示の増強の機序として十分に確立されており、ＮＫ細胞およびＴ細胞を含む他の免疫細胞サブセットとの相互作用に不可欠である(Fitzgerald-Bocarsly and Feng、2007; Simmons ら、 2012）。Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処理４Ｔ１細胞とのＢＭＤＣ共培養は、ＩＦＮα ｍＲＮＡ産生の約１００倍の増加およびＩＦＮβｍＲＮＡ産生の約７０倍の増加を伴う１型インターフェロンの両方の有意な増加を示した（図２７Ｅ）。同様に、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処理ＣＴ２６Ｅｐ１２．１とのＢＭＤＣ共培養は、ＩＦＮαｍＲＮＡ産生の約３００倍の増加およびＩＦＮβｍＲＮＡ産生の約６０倍の増加を示した（図２７Ｆ）。

【0393】

さらに、ＥＤＶに負荷された薬物の差異が１型インターフェロン産生に何らかの影響を及ぼしたかどうかを評価するために、ＣＴ２６Ｅｐ１２．１をＥｐ－ＥＤＶ－Ｄｏｘで処理したところ、ＩＦＮβｍＲＮＡ産生の有意な～２０倍の増加が認められたが、ＩＦＮαｍＲＮＡ産生のわずかで有意ではない増加が認められたのみであった。Ｅｐ－ＥＤＶおよび６８２処理は、いずれの細胞株との共培養においても、１型インターフェロンｍＲＮＡ産生の増加を誘発することができなかった。しかしながら、ＣＴ２６Ｅｐ１２．１のドキソルビシン（Ｄｏｘ）処理は、実際、ＩＦＮβｍＲＮＡ産生の有意な～５倍の増加を示した（図２７Ｆ）。腫瘍細胞のドキソルビシン処理は免疫原性細胞死をもたらすことが知られており、したがって、樹状細胞の成熟を促すことができる。しかしながら、ＩＣ５０をはるかに超える薬物用量は一般に、薬物単独でこのタイプの死が生じるために必要である（Showalterら、2017）。ＢＭＤＣをＥＤＶと薬物で処理した４Ｔ１およびＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞と共インキュベートすると、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩＩ、およびＣＤ８０が２４時間以内にアップレギュレーションされ（図２７Ｇ～２７Ｉ）、マウスＪＡＷＳＩＩ細胞で見られる同様の結果が得られた（図３５Ｃ～３５Ｅ）ＥＤＶで処理した腫瘍細胞
と共培養したＢＭＤＣも、ＴＮＦアルファ、ＩＬ－１２ｐ４０、およびＩＬ－６の産生の顕著かつ有意な増加を示した（図２７Ｊ～２７Ｌ）。これらの結果は６８２を負荷したＥＤＶがマクロファージをＭ１抗腫瘍表現型に偏向させ、樹状細胞成熟を促進することができ、６８２単独では同様の応答を誘発することができないことを示す。

【0394】

実施例１７：スーパー細胞毒ＰＮＵ－１５９６８２の効果的な送達は、殺腫瘍性ＣＤ１１ｂ⁺先天性免疫細胞を生成する
６８２はｐＭ範囲の薬物耐性癌細胞でさえＩＣ５０を有する超細胞毒素であるため（Quintieriら、2005）、このような化合物に関連する重篤な全身毒性のために、臨床的に使用することができない（StaudacherおよびBrown、2017）。しかし、ＥＤＶに封入した場合、６８２のようなスーパーサイトトキシンを、最小限の体重減少（％）、被毛の波打ちがほとんどないかまたは全くないこと、および様々な治療的ペイロードを担うＥＤＶで処理されたマウスを含む以前の研究と相関するＥｐ－ＥＤＶ－６８２処理マウスにおける嗜眠または円背姿勢の出現がないことから明らかなように、副作用がほとんどなく腫瘍に効果的に送達することができる（MacDiarmidら、2009; MacDiarmidら、2007a; MacDiarmidら、2007b; Sagnellaら、2018）（図３５Ａ－３５Ｄ）。

【0395】

ここでは、乳房脂肪パッドに４Ｔ１腫瘍または皮下ＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍のいずれかを有するＥｐ－ＥＤＶ－６８２処置ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、有意な腫瘍退縮が見られた（図２８Ａ～２８Ｂ）。Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２はまた、Ｔ８４ヒト異種移植片および薬物耐性Ａ５４９／ＭＤＲ異種移植片を有する無胸腺ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて有意な腫瘍還元を促進することができ、ならびに大きな（～６００mm³）Ａ５４９／ＭＤＲ腫瘍において有意な腫瘍還元を誘発することができた（図２８Ｃ～２８Ｄ）。

【0396】

ＥＤＶが腫瘍に化学療法剤を効果的に送達することができることは十分に確立されているが、最初のインビトロ実験はＥＤＶがＭ１マクロファージ分極を駆動することを含むが、これに限定されない多くの方法で免疫療法剤として挙動することもできることを示した。これらの結果が腫瘍微小環境内の先天性免疫系のインビボ刺激にまで拡張されたかどうかを確立するために、ＣＤ１１ｂ⁺免疫細胞を、生理食塩水、Ｅｐ－ＥＤＶ、またはＥｐ－ＥＤＶ－６８２で処理した４Ｔ１またはＣＴ２６Ｅｐ１２．１マウス腫瘍から単離し、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅリアルタイムセルアナライザー（ＲＴＣＡ）において、それらの対応する腫瘍細胞と５：１（エフェクター：標的）の比率でエクスビボで共培養した（図２８Ｅ～２８Ｇ）。接着性４Ｔ１細胞と共培養したＣＤ１１ｂ⁺細胞は最初の接着および沈降相を示し、その結果細胞指数が増加し、続いて活性相を示し、ＣＤ１１ｂ⁺ 細胞が接着性腫瘍細胞を殺すのに効果的である場合には細胞指数が着実に減少し、腫瘍細胞が効果的に溶解されず増殖し続けた場合には細胞指数が増加した。

【0397】

実証されたように、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２で処置したマウスの腫瘍から単離したＣＤ１１ｂ^＋細胞は４Ｔ１細胞を殺すのに非常に効果的であったが、Ｅｐ－ＥＤＶまたは生理食塩水で処置した腫瘍から単離したものは４Ｔ１腫瘍細胞を殺さなかった（図２８Ｅ）。４Ｔ１腫瘍内のマクロファージの表現型決定（ＣＤ４５⁺ ＣＤ１１ｂ⁺ Ｌｙ６Ｇ^- Ｌｙ６Ｃ^＋）がＣＤ８６：ＣＤ２０６発現マクロファージの比の増加によって証明されるように、Ｍ１／Ｍ２比の増加を示した（図２８Ｆ）。更に、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２ ４Ｔ１系細胞担持マウスからのＣＤ１ｂ⁺は４Ｔ１細胞（図３６Ｉ）とex vivo共培養した場合、マクロファージ炎症蛋白質１α（ＣＣＬ３／ＭＩＰα)の産生において、塩水およびＥｐＥＤＶ処理マウスと比較して２倍の増加を示した。ＭＩＰ－１αの局所的産生は免疫エフェクター細胞浸透物を細胞微小環境中に誘引し、エフェクター細胞媒介抗菌反応を潜在化する主要因子として意味されていた（Allenら、2018; Zibertら、2004）。

【0398】

接着性ＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞と共培養されたＣＤ１１ｂ⁺細胞は同様に、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２で処置されたマウスの腫瘍から単離されたＣＤ１１ｂ⁺細胞の増強された細胞溶解活性を示した（図２８Ｇ）。全般的に、ＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍由来のＣＤ１１ｂ⁺細胞は４Ｔ１腫瘍由来のものよりも活性が高かったが、これは３つの処置群すべてについてのｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡにおける細胞指数の着実な低下によって示される。しかしながら、細胞溶解はより顕著であり、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処置群におけるＣＤ１１ｂ⁺ 細胞添加後１時間以内に始まり、ＣＤ１１ｂ⁺ 細胞添加後１０時間で４２％の生存率に低下した。対照的に、Ｅｐ－ＥＤＶ処理サンプルでのサイトリズムの開始には５時間近くを要し、サリン処理群では７時間、ＣＤ１１ｂ⁺ 細胞追加後１０時間での生存率はそれぞれ７６％および８６％であった。ＣＴ２６Ｅｐ１２．１種瘍から単離されたＣＤ１１ｂ⁺細胞のフローサイトメトリー解析は、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処置腫瘍においてＣＤ８６：ＣＤ２０６比（Ｍ１／Ｍ２比）の有意な増大を示した（図２８Ｈ）。

【0399】

免疫コンピテントマウス株と同様に、マクロファージ分極のシフトは、無胸腺ヌードマウスにおける薬物耐性ヒト肺癌異種移植片（Ａ５４９／ＭＤＲ）においても見られ、ＥＧＦＲ－ＥＤＶ－６８２処置マウスの脾臓におけるＭ１／Ｍ２比の約２～３倍の増加が生理食塩水処置マウスまたは腫瘍増殖の減少に効果のないＥＤＶで処置したマウスと比較して観察された（図３５Ｅ）。さらに、ＥＧＦＲ－ＥＤＶ－６８２処置Ｔ８４腫瘍において、Ｍ１／Ｍ２比のわずかであるが有意な増加も検出された（図３５Ｆ）。両方の免疫コンピテントマウス癌モデルと同様に、ＥＧＦＲ－ＥＤＶ－６８２で処置されたＡ５４９／ＭＤＲ腫瘍を有するヌードマウスの腫瘍から単離されたＣＤ１１ｂ⁺細胞は生理食塩水で処置されたものと比較して、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡによって決定されるように、Ａ５４９／ＭＤＲ腫瘍細胞へのＣＤ１１ｂ⁺ 細胞付加の６．５時間後に２８％の細胞溶解を伴う優れた腫瘍細胞溶解を示した（図３５Ｇおよび３５Ｈ）。

【0400】

実施例１８： ＮＫ細胞は、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処理後にインビボで抗腫瘍表現型をとる
本実施例の目的は、抗腫瘍剤を含む細菌ミニ細胞のＮＫ細胞機能に対する影響を決定することであった。

【0401】

ＮＫ細胞機能に対する６８２を有するＥＤＶの効果を探るために、ＥＤＶ処理および４Ｔ１またはＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍を有する対照ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓からＥｐ－ＥＤＶ－６８２、ＥｐＥＤＶまたは生理食塩水による２週間処理後にＮＫ細胞を単離した。脾臓ＮＫ細胞を、それらの対応する腫瘍細胞と２０：１のＥ：Ｔ比でｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅＲＴＣＡ中で共培養し、腫瘍細胞死を３～４日間にわたって分析した（図２９Ａ～２９Ｄ）。

【0402】

両腫瘍モデルのＥｐ－ＥＤＶ－６８２処理マウスのＮＫ細胞は標的腫瘍細胞の有意かつ強力な細胞溶解を介して抗腫瘍特性を示したが、生理食塩水またはＥｐ－ＥＤＶで処理したマウスはその標的腫瘍細胞に対してほとんどまたは全く細胞溶解能を示さなかった。ＣＴ２６Ｅｐ１２．１を有するマウス由来のＮＫ細胞は標的ＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞の迅速な細胞溶解を示し、同時培養の最初の数時間以内にほぼ６０％の標的細胞生存率に低下し、５０時間後にわずか１８％の標的細胞生存率を維持した。Ｅｐ－ＥＤＶ処理ＣＴ２６Ｅｐ１２．１同様のＮＫ細胞は５０時間後に７０～８０％の標的細胞生存率を有する低レベルの細胞溶解能力を有し、一方、生理食塩水処理マウス同様のＮＫ細胞は、同じ期間に～８２％の標的細胞生存率を示した（図２９Ｄ）。４Ｔ１腫瘍を有するＥｐ－ＥＤＶ－６８２処理マウス由来のＮＫ細胞は依然として高度に活性であるが、７０時間後に～３６％の標的細胞生存率まで低下する、より緩やかな細胞溶解プロファイルを示し、一方、生理食塩水またはＥｐ－ＥＤＶ処理マウス由来のＮＫ細胞は９０％の標的細胞生存率を維持した（図２９Ａおよび２９Ｂ）。さらに、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２で処理したマウスから単離したＮＫ細胞とのＮＫ／４Ｔ１共培養は、生理食塩水で処理したマウスからのものと比較して、ＴＮＦαおよびＲＡＮＴＥＳの両方の産生の２倍以上の増加を示した（図２９Ｆおよび２９Ｇ）。

【0403】

Ａ５４９／ＭＤＲまたはＴ８４腫瘍を有する無胸腺マウスの脾臓から単離したＮＫ細胞は、免疫応答性マウス腫瘍モデル（図３６Ａおよび３６Ｃ）と同様の細胞溶解プロファイルを示した。ＥＧＦＲ－ＥＤＶ－６８２処理マウスのＮＫ細胞はその標的腫瘍細胞と共培養すると、Ａ５４９／ＭＤＲおよびＴ８４腫瘍のいずれにおいても標的細胞の生存率が４０％未満となったが、生理食塩水対照ではいずれも標的細胞の生存率が７０％を維持した。Ｔ８４／ＮＫ細胞共培養物中のグランザイムＢ産生の試験は、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処置マウス由来のＮＫ細胞を含む共培養物中のグランザイムＢの有意に高いレベルを明らかにした（図３６Ｂ）。

【0404】

フローサイトメトリーを介して４Ｔ１腫瘍内のＮＫ細胞を検査した結果、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処理腫瘍のＮＫ細胞（ＣＤ４５＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＤＸ５＋）は、腫瘍免疫監視において重要であることが知られているＮＫ活性化受容体であるＮＫＧ２Ｄ発現を有意に増加させた（図２９Ｅ）。腫瘍細胞表面上のＮＫＧ２ＤリガンドのアップレギュレーションはＮＫ阻害シグナルを無効にするのに十分であり、したがって腫瘍細胞の細胞溶解を可能にする(Morvan and Lanier、2016）。ＮＫＧ２Ｄ結合ＮＫリガンドＲＡＥ-１、Ｈ６０ａ、およびＭＵＬＴ－１についてのマウス腫瘍細胞株（ＣＴ２６Ｅｐ１２．１および４Ｔ１を含む）のスクリーニングにより、４Ｔ１およびＣＴ２６Ｅｐ１２．１のいずれもスクリーニングした４つの細胞株の６０ａの発現レベルが最も高く、これがこれら２つの細胞株において最も高い全体的発現を有するリガンドであることが示された。さらに、マウス乳癌細胞系４Ｔ１およびＥＭＴ-６細胞はスクリーニングした全ての細胞系においてＲＡＥ-１の最高の発現を示したが、Ｈ６０ａよりはるかに低いレベルであり、一方、ＣＴ２６Ｅｐ１２．１はこのリガンドのレベルが非常に低かっただけであった。最後に、４Ｔ１細胞を除いて、全ての他の細胞系はＭＵＬＴ－１の発現を示さなかった（図２９Ｈ）。

【0405】

単離したＮＫ細胞の細胞溶解活性におけるこれらのリガンドとＮＫＧ２Ｄ受容体の役割をさらに調べるために、ＮＫ細胞を４Ｔ１腫瘍を有するＥｐ－ＥＤＶ－６８２処理マウスの脾臓から単離した。ＮＫ細胞を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡシステムにおいて４Ｔ１細胞と共培養する前に、ＮＫＧ２Ｄ受容体のその特定のリガンドへの結合をブロックするように設計された抗体と共にインキュベートした（図２９Ｉ）。ＲＡＥ－１に対する抗体は４Ｔ１細胞のＮＫ細胞溶解の～１３％阻害をもたらしたが、Ｈ６０ａに対する抗体は～２１％阻害をもたらし、２つの抗体の組み合わせはＮＫ細胞の細胞溶解能力の～２５％を阻害した（図２９Ｊ）。

【0406】

実施例１９：腫瘍微小環境内の主にＴｈ１サイトカイン応答は、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処理後に示される 本実施例の目的は、ＥＤＶ処置後の腫瘍微小環境内のサイトカイン環境を調査することであった。

【0407】

４Ｔ１およびＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍を、最終処置の２４時間後に採取し、そして非酵素的方法で穏やかに解離させて、細胞の溶解がないことを確実にし、その結果、間質性腫瘍サイトカインレベルを評価し得た（図３０Ａ～３０Ｂ）。腫瘍サイズがかなり違うために、腫瘍を秤量し、測定し、そしてサイトカインレベルを、これらのサイズ差を説明するために、組織１グラムあたりに計算した。いずれの腫瘍も、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処理に反応して腫瘍微小環境内のＴＮＦαの有意な増加を示したが、この増加は生理食塩水処理と比較して、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処理後に１０倍の増加を伴うＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍においてより顕著であった。同様に、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処理は、４Ｔ１腫瘍におけるＩＦＮαレベルの約２倍の増加、およびＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍における１５倍の増加を伴う、両腫瘍における間質ＩＦＮα濃度の有意な増加をもたらした。

【0408】

Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処理によるサイトカインレベルの最も顕著な変化はＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍で見られ、そこではＩＦＮγレベルの５百倍の増加が起こったが、４Ｔ１腫瘍ではＩＦＮγレベルのわずかではあるが有意な２倍の増加が起こった。Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処理の結果としてのＩＬ－１βレべルは４Ｔ１腫瘍で有意に減少したが、ＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍では有意ではないが増加を示した。ＩＬ２（～４倍）およびＩＬ４（～３倍）の有意な増加が４Ｔ１腫瘍で生じたが、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処理後のＩＬ６レベルに有意な変化はなかった。Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処理マウスのＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍ではＩＬ－２量は１５０倍以上有意に増加したが、ＩＬ－６量は有意に３倍増加し、ＩＬ－４は２倍有意ではない増加が観察された。抗原提示細胞、ＮＫ細胞、およびＴ細胞などの免疫細胞による浸潤の主要な決定因子であることが示されているＭＩＰ－1α(ＣＣＬ３）およびＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）も試験した（Allenら、2018）。４Ｔ１およびＣＴ２６Ｅｐ１２．１の両方はＥｐ－ＥＤＶ－６８２処理腫瘍における２つのケモカインのレベルの増加を示し、ＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍におけるＭＩＰ－１αレベルおよびＥｐ－ＥＤＶ－６８２で処理された４Ｔ１腫瘍におけるＲＡＮＴＥＳレベルの約３倍の有意な増
加を示した。さらに、ＲＡＮＴＥＳとＭＩＰ－１αレベルの２～２．５倍の増加は有意ではなかったが、それぞれＣＴ２６Ｅｐ１２．１と４Ｔ１ Ｅｐ－ＥＤＶ処理の両方で起こった。一般に、Ｅｐ－ＥＤＶ処置は、生理食塩水処置群と同様の間質腫瘍サイトカインおよびケモカインレベルをもたらした。

【0409】

間質性腫瘍サイトカインの検査に加えて、処置動物由来の脾細胞によるサイトカイン産生（ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、およびＩＬ－１０）を評価した。脾細胞を単独で培養するか、またはそれらの対応するマウス由来の分散した腫瘍細胞と共培養した。生理食塩水、Ｅｐ－ＥＤＶ、およびＥｐ－ＥＤＶ－６８２での全身処置は、４Ｔ１またはＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍モデルのいずれかからの脾細胞によるサイトカイン産生に対して有意な効果を有さなかった（図３０Ｃ～３０Ｇ）。しかし、脾細胞を対応する処理腫瘍とともに培養すると、これもはやそうではなかった。TNF瘤Y生は、脾細胞のみと比較して、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２で処理したマウスからの共培養、ならびに両腫瘍モデルからの生理食塩水およびＥｐ－ＥＤＶで処理したマウスからの共培養において有意に増加した（図３０Ｃ）。４Ｔ１モデルにおいて、ＩＬ－２産生は、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処置マウスからの共培養物において、生理食塩水処置マウスと比較して有意に増加した（図３０Ｄ）。さらに、生理食塩水処理マウスの脾細胞を対応する腫瘍細胞と共培養した場合、ＩＬ－２産生の有意な減少が認められた。ＩＬ－２ ＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍を有するマウスから単離した脾細胞単独と比較して、全ての共培養において産生が有意に増加した。ＩＬ－１β産生における唯一の有意な変化は、生理食塩水処置マウスからの試料がＥｐ－ＥＤＶ－６８２処置マウスと比較して、インビボで見られる差に対応する有意な増加を示した４Ｔ１モデルからの共培養物において生じた（図３０Ｅ）。ＩＦＮγ産生は脾細胞単独と、４Ｔ１腫瘍を有する生理食塩水処理マウスから分離した共培養の間で有意に減少し、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処理脾細胞／腫瘍細胞共培養の方が、生理食塩水またはＥｐ－ＥＤＶ処理４Ｔ１腫瘍担癌マウスから分離した共培養よりも有意に大きかった（図３０Ｆ）。ＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍モデルにおいて、ＩＦＮγ産生は生理食塩水およびＥｐ－ＥＤＶ共培養と比較して、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処理脾細胞／腫瘍細胞共培養で減少したが、これはＥｐ－ＥＤＶに対してのみ有意であった。最後に、ＩＬ－１０産生は、ＣＴ２６Ｅｐ１２．１処置マウスからの生理食塩水処置脾細胞／腫瘍細胞共培養物において、脾細胞単独およびＥＤＶ処置群と比較して有意に増加した（図３０Ｇ）。

【0410】

実施例２０： Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処理は腫瘍特異的ＣＤ８+ Ｔ細胞の産生を導く
最初のin vitro実験では、ＥＤＶ処理が効果的な化学療法薬を負荷した標的ＥＤＶに応答して、直接的相互作用または細胞死の結果のいずれかを介して樹状細胞の成熟をもたらしうることが示された。従って、この試験は、この結果がインビボでのＤＣ成熟および抗原提示に翻訳され得、腫瘍特異的ＣＤ８⁺ 細胞傷害性Ｔ細胞の産生を生じるかどうかを試験することを目的とした。

【0411】

２週間の処置後、生理食塩水、Ｅｐ－ＥＤＶ、またはＥｐ－ＥＤＶ－６８２で処置した４Ｔ１またはＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍を有するマウスから脾臓を取り出し、ＣＤ８⁺ Ｔ細胞を単離した。次いで、ＣＤ８⁺ Ｔ細胞を対応する腫瘍細胞に添加し、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡを用いてこれらの細胞を特異的に認識し、殺すそれらの能について試験した（図３１Ａおよび３１Ｃ）。４Ｔ１を保有するマウスから単離され、生理食塩水またはＥｐ－ＥＤＶで処理されたＣＤ８⁺ Ｔ細胞は４Ｔ１細胞に対して細胞毒性を示さなかったが、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２で処理されたマウスから単離されたＣＤ８⁺ Ｔ細胞は３０時間後に標的細胞の５０％の細胞溶解を誘導した（図３１Ｂ）。

【0412】

ＣＴ２６Ｅｐ１２．１を有し、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２で処理されたマウスから単離されたＣＤ８⁺ Ｔ細胞は標的ＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞を殺すのに非常に効果的であり、エフェクタ細胞を標的細胞に加えた２０時間後に８１％の細胞毒性が見られた（図３１Ｄ）。興味深いことに、Ｅｐ－ＥＤＶ処置でさえ、ＣＴ２６Ｅｐ１２．１モデルにおいて腫瘍特異的ＣＤ８⁺ Ｔ細胞の産生を誘発することができ、２０時間後に４０％の細胞毒性が明らかであったが、生理食塩水処置マウス由来のＣＤ８⁺ Ｔ細胞はＣＴ２６Ｅｐ１２．１細胞に対して特異性を示さなかった。４Ｔ１腫瘍内のＣＤ８+ Ｔ細胞の流動解析は、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処置マウスの腫瘍内のＣＤ８⁺ Ｔ細胞（ＣＤ４５⁺、ＣＤ３⁺、ＣＤ８⁺）の割合のわずかながら有意な増大を示した（図３１Ｅ）。さらに、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処置マウスの腫瘍内の調節性Ｔ細胞（ＣＤ４５⁺、ＣＤ３⁺、ＣＤ４、ＣＤ２５⁺）の割合が有意に２倍低下した（図３１Ｆ）。４Ｔ１腫瘍担癌マウスの腫瘍流量リンパ節におけるＴ細胞数も流れを介して調べた。生理食塩水およびＥｐ－ＥＤＶ処理マウスの両方と比較して、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処理マウスのリンパ節において、全体的なＴ細胞数（ＣＤ３⁺）の有意な増加、ならびにＣＤ4^＋およびＣＤ８⁺ Ｔ細胞数の両方の有意な増加が見られた（図３１Ｇ）。４Ｔ１腫瘍を有するＥｐ－ＥＤＶ－６８２処置マウスのリンパ節における成熟樹状細胞の有意な増大も検出された（図３１Ｈ）。４Ｔ１細胞で処置したＥｐ－ＥＤＶ－６８２マウス由来の単離されたＣＤ８⁺ Ｔ細胞間の相互作用の可視化はこれらのＴ細胞が腫瘍細胞に付着し、パーフォリン（緑色）を腫瘍細胞に放出することができることを示す（図３１Ｉ）。

【0413】

実施例２１：ステージＩＶの膵管腺癌の1ケースにおけるＥＧＦＲ－ＥＤＶ－６８２に対する患者の患者の反応
この実験は、ステージＩＶの膵管腺癌（ＰＤＡＣ）患者（ＣＥＢ）におけるＥＧＦＲＥＤＶ６８２治療の使用の思いやりのある症例の臨床観察に関連する。

【0414】

ＣＥＢの診断的評価は腹部のコンピュータ体軸断層撮影（ＣＴ）（２０１７年５月）を含み、多発性低密度肝病変を明らかにした。腫瘍は陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）では活発ではなかった。標準的な生化学検査および血液学的検査は、概して特記すべきものはなかった。血清ＣＡ１９―９およびＣ反応性蛋白質（ＣＲＰ）も評価した。一部の消化器悪性腫瘍、特に膵癌に発現する糖鎖抗原であるＣＡ １９－９の血清中低濃度は、全生存率および治療に対する反応の予後指標となることが示されている。同様に、上昇したＣＲＰレベルもまた、不良な臨床転帰と有意に関連することが示されている（Szkanderaら、2014）。ゲムシタビンとＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸの後でさえ、ＣＥＢはＣＡ１９－９量が120,000ｋＵ／Ｌを超え、通常の３,０００倍であり、かなり上昇したＣＲＰ量が６４mg／Lであった。

【0415】

すい頭部と尾部の両方から切除した腫瘍組織から得たＰＤＡＣ細胞について、薬剤感受性を調べた。頭部および尾部ＰＤＡＣ細胞の両方は低感度を示し、第１および第２の系統の薬物に対して部分的に応答しなかった（図３７Ａ）。対照的に、両者は６８２に対して極端な感度を示し、ＩＣ５０はｐＭ温度範囲であった（図３７Ａ）。さらに、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は、フローサイトメトリー（図３７）によって、細胞あたり＞200,000コピーで過剰発現されることが見出され、したがって、治療のために６８２を負荷したＥＤＶを標的化するための理想的な受容体であることが見出された。

【0416】

ＣＥＢは６８２を保有するＥＤＶに耐性があり、ＥＧＦＲ(Ｅ－ＥＤＶ－Ｄ６８２）を非常に良好に標的とし、サイクル全体にわたる健康の劇的な増加を報告した。その間にＥＣＯＧのパフォーマンス状態は２から０に低下した。投与３時間後にＴＮＦαおよびＩＬ－６の一過性の上昇が認められたが、これは投与１日後が最も高く、その後の投与ではるかに低く、おそらく耐性の増強を示していると考えられる。血液学的パラメータに変化はなく、白血球数（ＷＣＣ）はサイクルを通して正常のままであった。生化学検査の結果は、１４回投与後でも特記すべきものはなかった。注目すべきは、ＣＡ１９－９マーカーが120,000 kU／lを超えて5,310 kU／mlに着実に低下し、ＣＲＰレベルが投与１３回で６４mg／Lから７mg／Lに低下したことであった（図３２Ａおよび３２Ｂ）。

【0417】

１２回投与後、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来の主要な免疫細胞サブセットの免疫表現型検査により、好ましい抗腫瘍反応を裏付ける可能性のある複数の細胞型内の変化が明らかになった（Gating戦略－図３８）。マクロファージおよび樹状細胞の前駆体である全ＣＤ１４＋単球は、中間体（ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋＋）単球サブセット（６９％増加；図３２Ｄ）を含むスクリーニング用量（Ｄ1）（図３２Ｃ）と比較した場合、Ｄ１２で１５．２８％から３１．３９％に増加した（１０５％増加）。中間の単球はＴ細胞に抗原を提示する能力が最も高く、ＩＬ－１２およびＩＦＮ－繧フ抗原特異的誘導が優れている(Zie
gler-Heitbrock and Hofer、2013）。

【0418】

骨髄性樹状細胞（ｍＤＣ）の２８％の増加および形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ)の６０％の減少も観察され（図３２Ｆ）、ＣＤ８＋エフェクターT応答を駆動する原因であるＣｌｅｃ９Ａ＋骨髄性樹状細胞（ｍＤＣ）もまた増加した（Ｄ１２で９８％）（図３２Ｅ）。この増加は、Ｄ１２におけるエフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞（５０％増加）を含む全細胞傷害性ＣＤ８+ Ｔ細胞（６０％）の増加と一致していた（図３２Ｇ）。エフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞プールは単球、マクロファージまたは樹状細胞によって提示された抗原と最近相互作用し、腫瘍および／またはＥＤＶ抗原特異的Ｔ細胞を含むＣＤ８+ Ｔ細胞である。消耗したプログラム死－１（ＰＤ－１＋）表現型を発現する細胞傷害性ＣＤ８+ Ｔ細胞は、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞による長期の細胞活性化とＰＤ連結への感受性を示す、Ｄ１と比較してＤ１２で１７％減少した。この方法は腫瘍および腫瘍排出リンパ節内でよく起こる。このケーススタディで観察された結果は、前臨床マウスモデルで観察された結果と同様の傾向をたどる。

【0419】

考察：このデータは、スーパーサイトトキシン６８２を負荷した標的ＥＤＶが本剤を腫瘍部位に効果的に送達するだけでなく、複数の免疫細胞サブセットを刺激することによって免疫療法として挙動する能力を示している。Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処理が、マクロファージ、ＮＫ細胞およびＣＤ８⁺ Ｔ細胞を含む免疫細胞サブセットを、腫瘍細胞を効果的に排除することができる抗腫瘍表現型に向かって押すことができることが実証されている。この薬物の有効性と組み合わせると、腫瘍に二重の攻撃をもたらす。

【0420】

静脈内投与後、ＥＤＶはその漏出性血管系を介して腫瘍に溢出し、ここで、それらの毒性ペイロードを有する標的ＥＤＶの投与用量の３０％以上が２時間以内に腫瘍微小環境に直接沈着する（MacDiarmidら、2007b）。ＥｐＣＡＭ標的化ＥＤＶは腫瘍細胞上の表面発現ＥｐＣＡＭ（この場合、４Ｔ１およびＣＴ２６Ｅｐ１２．１）に結合し、次いで、それらのペイロード（６８２）を腫瘍細胞内に直接的に有効に送達する。６８２は、腫瘍細胞に送達されてから２４時間以内に迅速なアポトーシスを生じる非常に強力な超細胞毒である（図３３Ａ）。次に、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処理によって産生されたアポトーシス細胞
およびＤＡＭＰシグナルは腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）などの自然免疫細胞と相互作用し、ＣＤ８６のアップレギュレーションおよびＴＮＦアルファおよびＩＬ－６などのＴｈ１炎症誘発性サイトカインの産生を刺激することができる（図３３Ｂ）。

【0421】

さらに、ＥＤＶ自体も、ＴＡＭと直接相互作用して、同様のＭ１分極を生成することができるが、これは現在のシステムにおいて非常に低いレベルで起こることが予想される。ここでは、４つの異なる腫瘍モデルにおいて、腫瘍微小環境内のＭ１：Ｍ２バランスをシフトさせるＥｐ－ＥＤＶ－６８２処理の能力が実証されている。異なる腫瘍モデルにおけるこのシフトの程度の差にもかかわらず、Ｍ１極性化の増加は、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２で処理されたマウスの腫瘍から単離されたＴＡＭによる腫瘍細胞溶解の増加に翻訳されることが示された。Ｍ１への表現型シフトに加えて、Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２処置マウスの腫瘍からのＴＡＭは免疫細胞動員、特にＮＫ細胞、ＣＤ４⁺ Ｔ細胞およびＣＤ８⁺ Ｔ細胞による腫瘍浸潤を促進する役割を果たすことが確立されているケモカインであるＭＩＰ－１α(図３３Ｃ）も分泌した（Allenら、2018）。

【0422】

ＥＤＶ処置は、死んでいる腫瘍細胞に応答して、腫瘍微小環境内のＤＣのインビボプライミングおよび成熟を可能にする（図３３Ｄ）。成熟過程の間、ＤＣはＴ細胞への抗原提示のために腫瘍排出リンパ節に移動し、それによって、ＣＤ４⁺ Ｔヘルパー細胞および腫瘍に対する適応免疫反応を開始する腫瘍特異的ＣＤ８⁺ ＣＴＬの産生を増加させる（図３３Ｅ）。

【0423】

マクロファージおよびＤＣ抗腫瘍機能を増強することと併せて、ＥＤＶ処置は、ＮＫ細胞活性化を誘発し得、増加した細胞毒性を導く（図３３Ｆ）。ＮＫＧ２Ｄ受容体のアップレギュレーションはＥｐ－ＥＤＶ－６８２で処理したマウスの腫瘍内のＮＫ細胞上で観察され、この受容体はＥｐ－ＥＤＶ－６８２処理マウスから単離したＮＫ細胞の細胞溶解能に有意に寄与することが実証された。さらに、未成熟、中間および成熟マウスＮＫ細胞はケモカインＭＩＰ１αおよびＲＡＮＴＥＳに結合することができるＣＣＲ１およびＣＣＲ５ケモカイン受容体の両方を発現し、それらの両方はＥｐ－ＥＤＶ－６８２処理腫瘍ならびにＥｐ－ＥＤＶ－６８２処理マウス由来のマクロファージおよびＮＫ細胞によって増加される（Bernardiniら、2016年）。

【0424】

ＭＩＰ１αおよびＲＡＮＴＥＳなどのケモカインは腫瘍微小環境へのＮＫ細胞、マクロファージ、およびＴ細胞を含むヘルパーおよびエフェクター免疫細胞のさらなる動員に関与する（図３３Ｇ)(Allenら、2018; Bernardiniら、2016; Zibertら、2004）。マクロファージ、ＮＫ細胞、およびＤＣを包含するＥＤＶ処理による最初の先天性免疫応答に続いて、適応免疫応答がマウントされ、そこでは腫瘍特異的ＣＴＬおよびＴ－ヘルパー細胞が産生され、次いで腫瘍部位に動員される（図３３Ｈ）。次いで、腫瘍特異的CTLは標的化された薬物負荷ＥＤＶと組み合わせて他の免疫細胞サブセットによって作り出された優先抗腫瘍環境にさらに寄与する腫瘍細胞を標的化し、溶解する。標的化された薬物負荷ＥＤＶ治療は腫瘍微小環境内のＴｈ１サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、およびＩＬ－６）の増加によって証明されるように、主にＴｈ１反応を誘発する。先に述べたように、自然免疫細胞サブセットは、活性化されると、これらの特定のサイトカインの１つ以上の主要な供給源となる。Ｔ細胞は同様に、前述のサイトカインの全てを産生し得る（BelardelliおよびFerrantini，2002; LeeおよびMargolin，2011）。先天性免疫細胞またはＴ細胞のいずれかによるこれらのサイトカインの放出はさらなる免疫細胞の同時刺激、活性化、増殖、および増加した抗原提示に関与し、免疫系の抗腫瘍活性をさらに増強するフィードバックループを作製する（図３３Ｉ)(LeeおよびMargolin、2011)。

【0425】

方法及び材料
EnGeneIC Dream Vector (ＥＤＶ)：ＥＤＶは先に記載したように Salmonella enterica serovar Typhimurium(STyphimurium)minCDE-strainから産生され、精製された(MacDiarmidら、2007b)。薬物負荷、抗体標的化、凍結乾燥、および用量調製は以前に記載されている（MacＤiarmidら、2007b; Sagnellaら、2018）。ＥＤＶ調製物は、Zetasizer NanoシリーズおよびNanoSight LM20(Malvern Instrument)を用いた動的光散乱を用いてＥＤＶサイズおよび数を評価する厳密な品質管理の対象とした。エンドトキシンレベルを、Endosafeポータブル試験システム(Charles River)を用いて評価した。薬物をＥＤＶ^TM調製物から抽出し、先に記載したように高速液体クロマトグラフィーによって定量した（MacDiarmidら、2007b）。

【0426】

流量サイトメトリー：全ての流量サイトメトリーをBeckman Coulter Gallios ６Ｃで行い、Kaluzaソフトウェア(Beckman Coulter)を用いて分析した。

【0427】

細胞培養： ＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ ＦＣＳを含有するダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)(Sigma)中で約７０％コンフルエンスまで増殖させ、細胞スクレーパーを用いて継代培養した。モウスがん細胞系（４Ｔ１およびＣＴ２６）は１０％ ＦＣＳを含んでいるＲＰＭＩ－１６４０培地（Sigma）の単層で成長させ、リン酸塩緩衝塩素(ＰＢＳ)/Trypsin ＥＤＴＡを用いて週２～３回継代培養した。全ての細胞を、５％ ＣＯ₂を含む加湿大気中で３７の培養物中で維持し、そして日常的にスクリーニングし、そしてマイコプラズマを含まないことを確認した。マウス細胞株におけるＥｐＣＡＭ発現および受容体数を、Quantum Simply Cellular anti－Rat IgGミクロスフェア(Bangs Laboratory)を使用して、ＡＰＣ抗マウスＣＤ３２６（Biolegend）を用いたフローサイトメトリーを使用して定量した。ＣＴ２６はＥｐＣＡＭについて陰性であることが示されたので、細胞をLipofectamine 2000(Thermo Fisher)を用いてマウスＥｐＣＡＭ ＯＲＦクローン（NM_008532．2)(Genescript)を含むＤＹＫｐＣＤＮＡ３．１＋Ｃで形質移入した。Ｇ４１８選択を使用して、ＣＴ２６クローンを発現するＥｐＣＡＭの純粋な集団を得、そして細胞をＥｐＣＡＭ発現について上記のようにスクリーニングした。クローンについて、増殖速度、薬剤感受性およびin vivo腫瘍原性を調べ、上記３つのパラメータが親ＣＴ２６細胞株と類似している高いＥｐＣＡＭ発現を有するものを、その後のすべての研究（ＣＴ２６Ｅｐ１２．１）のために選択した。

【0428】

骨髄由来ＤＣ(ＢＭＤＣ)：Ｂａｌｂ／ｃマウスの大腿骨および脛骨から骨髄を分離した。赤血球溶解および洗浄後、細胞をＡＩＭＶ + ５％ＦＢＳ＋２－メルカプトエタノール＋ペニシリン／ストレプトマイシン＋２０ng/ml ＧＭ－ＣＳＦ(MＩＬtenyi Biotec)に再懸濁し、７日間増殖させた。

【0429】

ＲＡＷ２６４．７細胞のＥＤＶでの処理: ＲＡＷ２６４．７細胞を、１ウェルあたり３×１０⁵細胞で６ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした。次いで、培地を、以下の１μg/mL ＬＰＳ(Sigma);１００ｐｍｏｌ ＰＮＵ－１５９６８２(Najing Levena);Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２（５００：１および１０００：１-ＥＤＶ：細胞）、Ｅｐ－ＥＤＶ（５０００：１-ＥＤＶ：細胞）のうちの１つを含む新鮮な培地で置き換えるか、または未処理のままにした。細胞を、処理の６時間後および２４時間後に、細胞スクレーパーを使用して回収し、そして試料を、ＤＡＰＩ(Sigma)、抗ＣＤ４５ Brilliant Violet 510（BioLegend）、抗ＣＤ８６ ＡＰＣ－Ｃｙ７（BioLegend）、および抗ＣＤ２０６ ＡＦ４８８(R&D Systems)で染色し、そしてフローサイトメトリーによって評価した。

【0430】

マクロファージおよびＤＣ／腫瘍細胞共培養: ＣＴ２６Ｅｐ１２．１および４Ｔ１細胞をVersene(Gibco)で回収し、細胞を１mLのエッペンドルフ管に回収した。細胞を、Ｅｐ－ＥＤＶ（１０００：１および５０００：１－ＥＤＶ：細胞）；Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２（５００：１および１０００：１－ＥＤＶ：細胞）；Ｅｐ－ＥＤＶ－Ｄｏｘ（１０，０００：１－ＥＤＶ：細胞）、１００pmol ＰＮＵ－１５９６８２、５μＭドキソルビシン、または培地単独を含む1０％ＦＢＳ(Bovogen)を補充した１mLのＤＭＥＭ(Sigma)に再懸濁した。薬物およびＥＤＶ量は選択された濃度が処置後最初の２４時間以内に細胞死の開始を生じるように、ＭＴＳおよびＸＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅリアルタイム実験を介して確立した。次いで、細胞をＰＢＳで十分に洗浄して、任意の非接着性ＥＤＶまたは過剰の薬物を除去した。処理した腫瘍細胞を、ＲＡＷ２６４．７またはＢＭＤＣのいずれかで、腫瘍細胞: ＲＡＷ２６４．７/ＢＭＤＣ/ＪＵＴ IIの１：１の比率で一夜培養した。上清をＥＬＩＳＡ分析のために回収した。ＲＡＷ２６４．７／腫瘍細胞共培養物を、細胞スクレーパーを使用して収集し、そして試料を、ＤＡＰＩ(Sigma)、抗ＣＤ４５ Brilliant Violet 510（BioLegend）、抗ＣＤ８６ ＡＰＣ－Ｃｙ７、および抗ＣＤ２０６ ＡＦ４８８で染色し、そしてフローサイトメトリーによって評価した。ＪＡＷＳＩＩ/腫瘍細胞およびＢＭＤＣ／腫瘍細胞共培養物をバーゼンで収集し、ＤＡＰＩ（Sigma)、ＣＤ１１ｂＡＦ４８８（Abcam）、ＣＤ１１ｃ ＰＥ(Molecular Probes)、抗ＣＤ４５Brilliant Violet ５１０またはＰＥＣｙ５（BioLegend）、anti-ＣＤ８６ ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＭＨＣクラスＩＩ ＰＥＣｙ５（Thermo Fisher)、ＭＨＣクラスII Brilliant Violet４２１（BioLegend）、７－ＡＡＤ（BioLegend）、および／またはＣＤ８０ＰＥ(Thermo Fisher)で染色し、フローサイトメトリーによって評価した。ＲＮＡｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ (Qiagen)を製造者のプロトコールに従って使用して、ＢＭＤＣ／腫瘍細胞共培養物からＲＮＡを抽出した。簡単に述べると、細胞を溶解し、ＲＬＴ緩衝液中でホモジナイズし、ｇＤＮＡエリミ
ネータースピンカラムに通した。７０％エタノールをフロースルーに添加し、次いで試料をＲＮｅａｓｙスピンカラムに通し、洗浄し、ＲＮａｓｅを含まない水中で溶出した。ＲＮＡ濃度はエッペンドルフ生物光度計プラスで測定した。ＲＮＡを使用して、製造者のプロトコールに従ってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ^TMＶＩＬＯ^TMＣＤＮＡシンセシスキット（サーモフィッシャー）を使用してＣＤＮＡを逆転写した。転写されたＣＤＮＡをｑＰＣＲのために１：２に希釈した。各ｑＰＣＲ反応は、５μL TaqMan fast advancedmaster mix(Thermo Fisher),０．５μL ２０Ｘ Taqmanプライマー／プローブ混合物（ＩＦＮα Mm03030145_gH、ＩＦＮb1 Mm00439552_s1、GAPDH Mm99999915_g1; Thermo Fisher)および２．５μLの水を含んでいた。８μLの混合物および２μLのＣＤＮＡを９６ウェルプレートに添加した。ｑＰＣＲは、Applied Biosystems Real-TimEp CR Systemを用いて行った。データをエクセルにエクスポートし、ΔΔＣｔから相対定量を計算した。

【0431】

インビボ腫瘍モデル：すべての動物実験は、ＥｎＧｅｎｅＩＣ動物倫理ガイドラインに従って、ＡＥＣ １／２０１６、ＡＥＣ １４／２０１６、ＡＥＣ １５／２０１１、およびＡＥＣ １１／２０１７の下で実施した。４Ｔ１およびＣＴ２６Ｅｐ１２．１モデルについては、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスをAnimal Resources Centreから得た。Ｔ８４およびＡ５４９／ＭＤＲモデルについては、５～７週齢のＢＡＬＢ/ｃ Ｆｏｘ１^nu／ＡＲＣを動物資源センターから入手した。少なくとも１週間の観察後に、５０μLのＰＢＳ当たり５×１０⁴の４Ｔ１細胞を右側の第３の乳房脂肪パッドに、または１００μLのＰＢＳ当たり２×１０⁵のＣＴ２６Ｅｐ１２．１をＢＡＬＢ／ｃマウスの右側腹部に皮下注射した。ヒト異種移植片については、１００μLのＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ(シグマ）あたり５×１０⁶ Ａ５４９／ＭＤＲまたは１×１０⁷Ｔ８４を右側腹部に河下注射した。４Ｔ１モデルに対する腫瘍誘発後７日目、平均腫瘍径が約９０mm³であった場合には治療を開始し、ＣＴ２６Ｅｐ１２．１モデルについては９日目に、平均腫瘍径が約１２５mm³ のマウスを、生理食塩水、１×１０⁹ ＥｐＣＡＭ標的ＥＤＶ（Ｅｐ－ＥＤＶ）、またはＰＮＵ－１５９６８２（Ｅｐ－ＥＤＶ－６８２）を負荷した１×１０⁹ ＥｐＣＡＭ標的ＥＤＶのうちの１つを用いて、週３回、２週間、腹腔内静脈注射により治療した。腫瘍を週３回測定し、腫瘍体積をπ／６（長さ×幅×高さ）として計算した。２週間の期間の終わりに、マウスを人道的に安楽死させ、ex vivo分析のために腫瘍および脾臓を採取した。Ａ５４９／ＭＤＲおよびＴ８４腫瘍の治療は、腫瘍がそれぞれ１００～１２０mm³および１２０～１５０mm³に達したときに開始した。マウスを、生理食塩水、ドキソルビシン（ＥＧＦＲ－ＥＤＶ－Ｄｏｘ）を負荷した１×１０⁹ ＥＧＦＲ標的ＥＤＶ、ＰＮＵ－１５９６８２（ＥＧＦＲ－ＥＤＶ－６８２）を負荷した１ｘ１０⁹ ＥＧＦＲ標的ＥＤＶ、またはＰＮＵ－１５９６８２（ＥＤＶ－６８２）を負荷した１×１０⁹ 非標的ＥＤＶで処理した。

【0432】

４Ｔ１およびＣＴ２６Ｅｐ１２．１腫瘍からのＣＤ１１ｂ⁺細胞の単離：腫瘍を解剖し、秤量し、そしてgentleMACS（商標）Dissociatorを使用して、製造業者の指示に従って３７で組織解離キット(Miltenyi Biotec)を使用して酵素的に消化した。解離後、赤血球溶解緩衝液（Sigma）を用いて赤血球を除去した。洗浄後、細胞を７０μｍ細胞ストレーナーに通して、凝集塊を除去した。ＣＤ１１ｂ⁺細胞を、ＭＡＣＳ分離器(Miltenyi Biotec)上のＬＳカラム上のＣＤ１１ｂ ＭＡＣＳビーズ(Miltenyi Biotec)を使用する陽性選択によって精製した。単離されたＣＤ１１ｂ⁺細胞集団の純度を、ＡＰＣ抗マウスＣＤ１１ｂ(Biolegend)を用いたフローサイトメトリーによって評価し、約８０％純粋であることが示された（図３９Ａ）。

【0433】

脾臓からのＮＫおよびＣＤ８の単離：脾臓を、Dounceホモジナイザーを使用してホモジナイズし、７０μｍメッシュストレーナーを通して濾過して、単細胞懸濁液を得、続いて、ＲＢＣ溶解緩衝液を使用して赤血球溶解した。次いで、脾細胞を洗浄し、細胞数を実施してから、ＮＫまたはＣＤ８+ Ｔ細胞単離に進行した。ＮＫ細胞およびＣＤ８+ Ｔ細胞を、ＮＫ細胞単離IIキット(Miltenyi Biotec)またはＣＤ８ａ+ Ｔ細胞単離キット(Miltenyi Biotec)のいずれかを使用して、製造業者の説明書に従って、ネガティブ選択によって解離脾臓細胞から単離した。ＭＡＣＳセパレーター(Miltenyi Biotec)上のＬＳカラムを用いて細胞を分離した。ＮＫ細胞およびＣＤ８+ Ｔ細胞調製物をフローサイトメトリーによって評価し、ＮＫ細胞純度は一貫して９０％よりも高かったが（図３９Ｂ）、ＣＤ８+ Ｔ細胞純度は一貫して８６％よりも高かった（図３９Ｃ）。ＮＫ細胞を、ＮＫ細胞媒介細胞溶解アッセイの前に、３７℃で１０％ ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ－１６４０倍地中で一晩休止させた。ＣＤ８+ Ｔ細胞を、単離直後に腫瘍細胞に加え、ＣＤ８+ Ｔ細胞溶解を評価した。

【0434】

ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅは、腫瘍細胞のＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ８＋、およびＮＫ細胞細胞溶解を監視した：細胞増殖特性および腫瘍細胞死を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＤＰシステムによりリアルタイムで監視した。そうするために、組織培養ウェルの基部を覆う円形電極は電気インピーダンスの変化を検出し、インピーダンス値を細胞指数（ＣＩ）に変換する。細胞指数測定値は、細胞接着の強度および細胞数に直接対応する。標的細胞（４Ｔ１、ＣＴ２６Ｅｐ１２．１、Ａ５４９／ＭＤＲ、またはＴ８４）をＥプレート１６に播種した。細胞を付着させ、それらが対数増殖期に達するまで増殖させた。エフェクター細胞（ＣＤ１１ｂ＋細胞、ＮＫ細胞又はＣＤ８+ Ｔ細胞）は、５：１（ＣＤ１１ｂ＋：腫瘍細胞）、２０：１（ＮＫ細胞：マウス腫瘍細胞）、１０：１（ＮＫ：ヒト腫瘍細胞）及び３０：１（ＣＤ８+ Ｔ細胞：腫瘍細胞）のエフェクター／標的細胞比で標的細胞に添加された。エフェクター細胞を加えた後、このシステムは３～４日間、定期的に測定し（５分または１５分毎）、免疫細胞が仲介する腫瘍細胞の殺傷をモニターした。

【0435】

ＮＫ細胞媒介細胞溶解阻害：マウス腫瘍細胞株を、最初にanti-Ｒａｅ―１α／β／γ－ＰＥ（Miltenyi Biotec)、anti-Ｈ６０ａ―ＰＥ(Miltenyi Biotec)、およびanti-ＭＵＬＴ―１ ＰＥ（R&D Systems)によるフローサイトメトリーを介してＮＫ細胞リガンド発現についてスクリーニングした。これらのリガンド発現レベルに基づくＮＫ細胞媒介細胞溶解阻害のために、エフェクターＮＫ細胞を、以下のＮＫ細胞リガンド：anti-ＲＡＥ－１αβγ(R&D Systems)またはanti-Ｈ６０(R&D Systems)に対する３μg／mlのブロッキン
グｍＡｂの存在下で、別々におよび混合物として標的細胞に添加した。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅデータをＥｘｃｅｌで変換し、グラフ化および統計解析のためにPrism(GraphPad Software)にエクスポートした。

【0436】

腫瘍／脾臓フローサイトメトリー：腫瘍および脾臓を上記のように解離させた。赤血球溶解後、細胞をMACS緩衝液(Miltenyi Biotec)中で１：１０のＦｃブロックと共に１０分間インキュベートした。１０分間インキュベートした後、細胞を１回洗浄し、ＭＡＣＳ緩衝液中の一次抗体パネルと共に、暗所で氷上で１５分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、次いでフローサイトメトリー分析のために緩衝液に再懸濁した。Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびマクロファージ染色パネルでは以下の抗体が用いられた。：anti-ＣＤ４５ ＰＥＣｙ７ (BioLegend)、anti-ＣＤ４５ ＢＶ５１０ (Biolegend)、anti-ＣＤ３ｅ ＡＰＣ－ｅFluor７８０ (eBioscience)、 anti-ＣＤ３ ＡＰＣ (Molecular Probes)、anti-ＣＤ４ ＰＥ―ＴＲ (Abcam)、anti-ＣＤ８ａ ＦＩＴＣ (eBioscience)、anti-ＣＤ８ ＢＶ５１０ (BioLegend)、anti-ＣＤ２５ ＰＥ (Abcam)、anti-ＣＤ３１４(NKG2D)、ＰＥ－ｅＦｌｕｏｒ６１０ (eBioscience)、anti-ＣＤ３３５ (NKp46)ＰＥＣｙ７ (BioLegend)、anti-ＣＤ２７ ＢＶ４２１ (BioLegend)、ant-CＤ１８３ (CXCR3) ＢＶ５１０ (BioLegend)、anti－ＮＫＧ２Ａ/Ｃ/Ｅ ＦＩＴＣ (eBioscience)、anti-ＣＤ１１ｂ ＡＰＣ (BD Pharmingen)、anti-Ｌｙ６Ｃ ＦＩＴＣ（BioLegend)、 anti-Ｌｙ６Ｇ ＢＶ５１０ (BioLegend)、anti-Ｆ４/８０ ＰＥ Ｄａｚｚｌｅ５９４ (BioLegend)、anti-ＣＤ２０６ ＰＥＣｙ７ (BioLegend)およびanti-ＣＤ８６ ＡＰＣ―Ｃｙ７ (BioLegend)。単一染色対照および／またはversacomp(Beckman Coulter)ビーズを蛍光補償のために使用した。ＤＡＰＩ (
Sigma)、ヨウ化プロピジウム（Sigma）、ＤＲＡＱ５(Thermo Fisher)、またはｌｉｖｅ/Ｄｅａｄ Ｙｅｌｌｏｗ(Thermo Fisher)を生細胞検出に使用した。未染色およびアイソタイプ対照を用いて、自己蛍光量を決定し、抗体特異性を確認した。

【0437】

サイトカインおよびケモカイン検出（腫瘍および脾細胞）：マウス腫瘍における間質サイトカインおよびケモカインレベルを測定するために、腫瘍を全ての皮膚を除去して注意深く解剖し、無血清培地に入れ、重量を測定した。次いで、腫瘍を、エッペンドルフ micropestles(Sigma)を使用して穏やかに破壊し、大きな断片が見えないことを確実にした。細胞懸濁液を遠心分離し、上清を収集し、分析まで－８０で保存した。脾細胞／腫瘍細胞共培養のために、脾臓を解離させ、腫瘍を以前に記載されたように酵素的に消化した。次いで、同じマウス同様の脾細胞および腫瘍を、１０：１の比率で組織培養プレートに入れ（脾細胞：腫瘍細胞）、７２時間まで培養した。上清を２４、４８および７２時間で回収し、分析まで－８０で保存した。マウスＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ－１αについて、製造業者の指示に従って腫瘍および脾細胞上清を分析した。ＩＦＮαキットはPBL Assay Scienceから入手し、ＩＬ－β、ＡＴＮＦ－α、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＦＮγ、ＡＲＡＮＴＥＳ(ＣＣＬ５）およびＭＩＰ－1α（ＣＣＬ３）デュオセットキットはR＆Dシステムから入手した。各ＥＬＩＳＡは、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン(Sigma）基質を用いて開発した。マイクロウェルプレートを、Biotek uQuantプレートリーダーにおいて、参照波長として５４０nmを用いて４５０nmで読み取った。ＫＣジュニアソフトウェアを使用して、４つのパラメータロジスティック曲線を標準に適合させ、試料を補間した。各アッセイの最小検出可能濃度（ＭＤＣ）は、応答のｓ．ｄ．に１０を掛け、変曲点における標準曲線の勾配で割ることによって計算した。

【0438】

共焦点顕微鏡法： ４Ｔ１細胞をＬａｂ－Ｔｅｋチャンバースライド（Sigma）上に播種し、２４時間付着および増殖させた。単離したＣＤ８⁺ Ｔ細胞を４Ｔ１細胞に添加し、８時間放置し、その時点で細胞を４％パラホルムアルデヒド中で固定した。細胞を洗浄し、ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中の０．５％トリトン-ｘ-１００で透過処理した。細胞を３％ＢＳＡで３０分間ブロックし、続いてＰＢＳＴで希釈した一次抗パーフォリン抗体（Abcam）とインキュベートした。洗浄後、細胞を二次ヤギ抗ラットＩｇＧ Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ４８８（Abcam）とインキュベートし、続いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５６８ Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ(Thermo Fisher)とインキュベートした。細胞を、ＤＡＰＩ(Thermo Fisher)を含むProlong Diamond Antifadeでマウントし、そして画像化の前にマニキュア液で密封した。画像をＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０で取得し、画像は合併して、画像Ｊで処理した。

【0439】

ステージＩＶの膵管腺癌の症例提示：６７歳の白人女性、初発症状が黄疸であったＣＥＢは、以前に膵管腺癌（ＰＤＡＣ）に対して膵臓、胆、十二指腸、脾臓および胃の一部と周囲リンパ節を除去するための完全なWhipple法を受けていた。膵頭部と膵尾部に腫瘍を認め、ステージ IVと診断した。他の施設でゲムシタビンとその後のＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸによる治療を受けたが、治療中に肝臓に広範な転移性疾患を発症していた。彼女の化学療法の終了時に、ホイップル処置の１６ヶ月後に、彼女は全ての治療選択肢を使い果たし、彼女の体重は６２kgから４５ｋgに減少し、彼女はオーストラリア治療薬局（ＴＧＡ）コンパシオン酸塩使用スキームの下で投与することができる実験的ＥＤＶ治療を求め、中皮腫(van Zandwijkら、2017）および再発性神経膠芽腫（Whittleら、2015）についての第Ｉ相試験において以前に試験されていた。シドニーのRoyal North Shore Hospitalの腫瘍科病棟で、ＣＥＢを第１サイクルとして週２回、７週間投与した。しかしながら、彼女の弱体化した状態のために、そしてＥＤＶに固有のリポ多糖に対する耐性を潜在的に構築するために、用量は、サイクル内でゆっくりと増加した（以下の表１７）。

【0440】

【表17】

投薬は２０mlのnikiポンプを介して２０分間にわたり投与され、前のように投薬の前に前投薬が与えられた(van Zandwijkら、2017）。血清生化学的検査、血液学的検査およびサイトカイン発現を、各投与の前と３時間後に評価した。ＣＡ１９－９およびＣ反応性タンパク質量を少なくとも週２回モニターした。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、抗腫瘍免疫細胞数の変化について、投与前およびサイクル終了時にフローサイトメトリーにより調べた。最初の外科的切除から腫瘍組織を得て、ＰＤＡＣ細胞を培養し、薬物感受性および表面受容体発現について試験した。

【0441】

統計：全ての統計分析を、GraphPad Prismソフトウェアパッケージを使用して行った。データは、平均±標準偏差（ＳＤ）または平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表され。２群間の統計的有意性は、スチューデントのｔ検定によって決定した。３群以上の群間の統計学的有意差は、一元配置分散分析、続いてTukeyの多重比較検定により判定した。腫瘍退縮研究の意義は、二元配置ＡＮＯＶＡに続いてＴｕｋｅｙの多重比較検定により決定した。すべての検定について、ｐ値は以下のとおりであった：* ｐ０．０５、** ｐ０．０１、*** ｐ０．００１、および**** ｐ０．０００１。

【0442】

実施例２２：ＪＡＷＳＩＩ細胞のＥＤＶ_α－GC処理およびその後のＣＤ１ｄリガンドを介するαＧＣの表層提示
この実施例は、癌細胞に対するαＧＣおよび遊離αＧＣのＥＤＶ送達を対比する。

【0443】

使用セル：マウス未成熟単球ＪＡＷＳＩＩ（ＡＴＣＣ(登録商標)ＣＲＬ－１１９０４^TM）。

【0444】

Perfecta３Ｄ９６－Well Hanging Drop Plate調製：３Ｄ懸滴プレートの上側および下側トレイリザーバを、Ｐ１０００ピペットを使用して溶融１％アガロースで満たした（１gのアガロースを１００mlの水に溶解し、マイクロ波で溶解し、～５０に冷却させた）。プレートを乾燥させ、室温で少なくとも３０分間沈降させた。次いで、懸滴プレートの外側ウェルを、５０μLの無菌細胞培養培地（細胞なし）／ウェルで満たした。

【0445】

ＪＡＷＳＩＩスフェロイドのＥＤＶ_α－GC処理：ＪＡＷＳＩＩ細胞を１０００ng／mlのαＧＣ(陽性対照）；未処理細胞と比較した空のミニ細胞およびミニ細胞_αGCで処理し、処理後８時間、１６時間、２４時間および４８時間で収集した（図４６Ａ～４６Ｄ）。

【0446】

ＪＡＷＳＩＩ細胞の単細胞懸濁液への解離：ＪＡＷＳＩＩ細胞を半懸濁培養物としてＴ２５またはＴ７５フラスコ中で増殖させた。ピペット助剤を用いてピペッティングすることにより、培養培地を滅菌５０ml管に注意深く収集し、フラスコの培養表面を５mlの滅菌PBSで２回洗浄し、各洗浄後に同じ滅菌５０ml管に収集した。接着細胞を、５mlの０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡの添加によって収集し、そして３７で３分間、または全ての細胞がフラスコの表面から持ち上げられるまでインキュベートした。持ち上げた細胞を、ピペット補助を用いて穏やかにピペッティングすることによって、注意深く単一細胞に分け、前の工程で使用した試料無菌５０ml管に移した。次いで、細胞懸濁液を３００gで７分間遠心分離し、上清を注意深くデカントした。細胞ペレットを、チューブの底を指でフリックすることによって解離させ、５mlの予め温めたＪＡＷＳＩＩ培養培地に再懸濁した。細胞懸濁液を、ピペット補助を用いて注意深くピペッティングすることによって、単一細胞にさらに解離させた。細胞数を決定するために、１０μLの細胞懸濁液を１０μLのトリパンブルー溶液と混合し、ＥＶＥ自動細胞カウンターを用いて分析した。

【0447】

最初の処理調製：６つの懸滴懸濁液サンプルを、各処理群について、時点ごとに使用した。５×１０⁴ＪＡＷＳＩＩ細胞および５×１０⁸ミニ細胞（ミニ細胞対細胞の比率１：１０００）をそれぞれの処理試料に使用し、ＪＡＷＳＩＩ細胞培養培地中で総量５０μLで培養した。アイソタイプ対照のために、余分な未処理試料を調製した。適量のミニ細胞を７分で1２,０００gで遠心法によりペレット化し、ピペットで上清を注意深く除去した。適切な量の生きたＪＡＷＳ細胞（前のセクションからの細胞数に基づく）を、ペレット化されたミニ細胞に添加した。次いで、穏やかなピペッティングによって、ミニ細胞をシングルミニ細胞－細胞懸濁液に解離させた。次いで、滅菌培養培地を添加することによって、各サンプルの最終容量を作製した。未処理試料およびαＧＣ処理試料については、５×１０⁴のＪＡＷＳＩＩ細胞を各サンプル使用し、総体積５０μLのＪＡＷＳＩＩ細胞培養培地中で培養した。適切な量の生きたＪＡＷＳＩＩ細胞をエッペンドルフチューブに移した。次いで、滅菌培養培地を添加することによって、各サンプルの最終容量を作製した。１０００ng／mLのαＧＣを、１０００ng／mLのαＧＣ(陽性対照）処理群で処理したＪＡＷＳＩＩ細胞のための細胞懸濁液に直接添加した。次いで、試料を、５０μLの処理懸濁液／ウェルで懸滴プレートの各々のウェルに注意深く播種し、そして収集まで５％ ＣＯ_２で３７℃でインキュベートした。

【0448】

処理したＪＡＷＳＩＩ細胞を抗αＧａｌＣｅｒ：mＣＤ１ｄ複合体モノクローナル抗体で染色する：各懸滴ウェルの全内容物を、Ｐ２００ピペットを用いて注意深く収集し、エッペンドルフチューブに移した。合計6個のサンプルを、各処置群について１つのチューブに収集した。１：１０００ＰＥ結合抗マウスαＧalCer：ｍＣＤ１ｄ複合体モノクローナル抗体および１：１０００ＰＥ結合マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロールを適切なサンプルに添加し、穏やかにボルテックスすることによって混合した。ＧａｌＣｅｒ：ｍＣＤ１ｄモノクローナル抗体は、ＧａｌＣｅｒ：ＣＤ１ｄ複合体の細胞表面露出部分に結合する。次に、試料を暗所で室温で２０分間インキュベートした。次いで、試料を３５０gで５分間遠心分離することによってペレット化した。注意深くピペッティングすることによって上清を除去し、ペレットを再懸濁し、５００μLのＦＡＣＳ緩衝液中で１回洗浄した。次いで、細胞を３５０gで５分間の遠心分離によって収集し、２５０μLのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳ管に移した。1μLのＤＡＰＩを各サンプルに添加し、チューブを穏やかに旋回させることによって混合した。次いで、試料を、Ｇａｌｌｉｏｓフローサイトメーターを使用して分析した。

【0449】

結果：フローサイトメトリーデータ（図４５）はミニ細胞_α-GCで処理したＪＡＷＳＩＩ細胞および遊離α－ＧＣで処理したＪＡＷＳＩＩ細胞について、抗ＧａｌＣｅｒ：ｍＣＤ１ｄで染色した後に、ミニ細胞単独で処理したＪＡＷＳＩＩ細胞および未処理のＪＡＷＳＩＩ細胞と比較して、明らかな変化を示した。この陽性染色は、ミニ細胞によるα－ＧＣのＪＡＷＳＩＩ細胞への送達およびその後の細胞表面上に糖脂質を提示するＣＤ１ｄ分子による細胞表面上の抗原提示の成功を確認する。α－ＧＣの提示は、抗腫瘍活性に不可欠なII型ＩＦＮカスケードを引き起こすインバリアントＮＫＴ細胞による受容体認識を導く重要な工程である。

【0450】

実施例２３：同種マウスモデル（Ｂａｌｂ／ｃマウスの^EpＣＴ２６マウス結腸癌)での^Epミニ細胞_Doxとミニ細胞_α-GCの組合せ処理を使用したインビボ検討
この実施例は、腫瘍に対するミニ細胞含有治療薬およびミニ細胞含有インターフェロンII型アゴニストの効力を例示する。この結果は、インターフェロンＩ型アゴニストを欠く組成物が腫瘍を効果的に処置するために使用され得ることを実証する。

【0451】

マウスおよび処置（実験１～３）：Ｂａｌｂ／Ｃマウス、雌、６～７週齢を、Animal Resources Company(西オーストラリア）から入手した。実験を開始する前に、マウスを１週間順応させた。ＣＴ２６細胞（マウス結腸癌）をＥｐＣＡＭ抗原を発現するプラスミドで安定に形質転換し、安定なクローン（Ｅｐclone１２．１）を樹立した。このクローンは、細胞の表面上にＥｐＣＡＭを発現した。すべての動物実験は、全米保健医療研究審議会、実験動物の飼養および使用に関するオーストラリアのガイドライン、およびＥｎＧｅｎｅＩＣ動物倫理委員会の承認を受けて実施した。

【0452】

ＣＴ２６（Ｅｐクローン１２．１）同種移植片を、それぞれのマウスの左側腹部に１００μLのＰＢＳ当たり２×１０⁵細胞を皮下注射することによって確立した。腫瘍は移植後８日以内に約１２５mm³の開始体積まで増殖した。マウスを各投与群につき８匹のマウスで無作為に群分けした。^Epミニ細胞_Dox、ミニ細胞_α-GC、および^Epミニ細胞＋ミニ細胞_α-GC組合せ）を用いて、生理食塩水処理のみと比較した。

【0453】

投与は週３回、２週間行った。^Epミニ細胞_Dox は、一回および組合せ処理で一回当たり１×１０⁹ミニ細胞で与えた。ミニ細胞_α-GC を実験１（図４０）および３（図４２）では１×１０⁷ で、実験２（図４０）では１×１０⁸で投与した；ここで、生理食塩水群はまた、腫瘍体積が８００mm³に達したときにチャレンジした。

【0454】

結果：３つの実験はすべて、^Epミニ細胞_Dox＋ミニ細胞_α-GCを受けた併用治療群について、生理食塩水および^Epミニ細胞_Dox 治療と比較して、腫瘍進行の顕著な停止を示した。この結果は、ミニ細胞_α-GC処理に^Epミニ細胞_Dox処理を追加することにより、非補助的効果の理論を支持する。また、ミニ細胞_α-GC単独での治療も、実験２で最も良かったように、併用治療の程度ではないもの、３つの実験すべてにおいて、がんの進行に歯止めがかかっていることが示された。

【0455】

実験２では、生理食塩水で処置した対照腫瘍が薬物およびα－ＧＣＥＤＶ媒介併用療法への処置変更後に劇的な腫瘍退縮を示した（図４１）。８００mm³に達した腫瘍は、試験終了の３日前に６００mm³未満に低下した。

【0456】

マウスおよび処置（実験４）：６～７週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの左側腹部に２×１０⁵細胞／１００μLのＰＢＳを皮下注射することにより、ＣＴ２６（Ｅｐクローン１２．１）同種移植片を確立した。腫瘍をおよそ２００～２５０mm³ または６００～８００mm³まで増殖させた後、治療を開始した。マウスを６群、各群３匹に無作為に割り付けた。マウスには１回のみ投与した。処置群には、生理食塩水（図４３Ｃ）、^Epミニ細胞_Dox （１x１０⁹）（図４３Ｆ）、ミニ細胞_α－GC(１x１０⁶）（図４３Ｅ）、ミニ細胞_α－GC(１x１０⁷）（図４３Ｄ）、^Epミニ細胞_Dox１x１０⁹ ＋ミニ細胞_α－GC（１x１０⁶）（図４３Ｂ）、 ^Epミニ細胞_Dox（１x１０⁹）＋ミニ細胞_α－GC (１x１０⁷）（図４３Ａ）が含まれる。

【0457】

マウスを、２００～２５０mm³（図４３）腫瘍については処置の２４時間後に、６００～８００mm³腫瘍については１６時間および２４時間後に屠殺した（図４４）。

【0458】

結果：ＣＴ２６同系腫瘍担持Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるミニ細胞_α－GC投与の単独および併用の影響を、上記のような単回投与で種々のサイズの腫瘍を処置することによってさらに調査した。興味深いことに、２００～２５０mm³および４００～６００mm³の腫瘍を有する両方のマウスにおいて、腫瘍は、投与の２４時間以内に顕著な壊死（黒色）を発症することが見出された。この影響は腫瘍が大きいほど顕著であり、対照群では認められなかった。

【0459】

まとめると、このデータは、ミニ細胞含有治療薬とインターフェロンII型アゴニストの組み合わせが腫瘍に対する有効性を実証することを示している。この結果は、インターフェロンＩ型アゴニストを欠く組成物が、腫瘍を効果的に処置するために使用され得ることを実証する。

【0460】

当業者には、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、本発明の方法および組成物に様々な修正および変形を行うことができることが明らかであろう。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲およびその均等の範囲内に入る限り、本発明の修正および変形を包含することが意図される。

【0461】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24-1】

【図24-2】

【図24-3】

【図24-4】

【図25-1】

【図25-2】

【図25-3】

【図25-4】

【図26】

【図27-1】

【図27-2】

【図27-3】

【図27-4】

【図27-5】

【図28-1】

【図28-2】

【図28-3】

【図28-4】

【図29-1】

【図29-2】

【図29-3】

【図29-4】

【図30-1】

【図30-2】

【図30-3】

【図30-4】

【図31-1】

【図31-2】

【図31-3】

【図31-4】

【図32-1】

【図32-2】

【図32-3】

【図33】

【図34-1】

【図34-2】

【図34-3】

【図35-1】

【図35-2】

【図35-3】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【手続補正書】

【提出日】2023-12-28

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

(a)少なくとも1つの抗腫瘍剤であって、抗腫瘍剤がモルホリニルアントラサイクリンを含み、精製された無傷の細菌由来ミニ細胞の治療有効量、
および
(b)Ｃ－グリコシド型のα－ガラクトシルセラミド（α－Ｃ－ＧａｌＣｅｒ）、α－ガラクトシルセラミド（α－ＧａｌＣｅｒ)、１２炭素アシル型ガラクトシルセラミド（β－ＧａｌＣｅｒ）、β－Ｄ－グルコピラノシルセラミド（β－ＧｌｃＣｅｒ）、１，２－ジアシル－３－ガラクトシル－sn－グリセロール（ＢｂＧＬ－ＩＩ）、糖脂質を含むジアシルグリセロール（Ｇｌｃ－ＤＡＧ－ｓ２）、ガングリオキシド(ＧＤ３)、ガングリオトリアセラミド（Ｇｇ３Ｃｅｒ）、グリコシルホスファジルイノシトール（ＧＰＩ）、α－グルクロノシルセラミド（ＧＳＬ－１またはＧＳＬ－４）、イソグロボトリヘキソシルセラミド（ｉＧｂ３）、リポホスホグリカン（ＬＰＧ）、ホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、α－ガラクトシルセラミド類似体（ＯＣＨ）、スレイトールセラミドおよびそれらの組合わせからなる群より選択されるインターフェロンII型アゴニスト、を含む抗癌剤組成物。

【請求項2】

前記組成物の要素（b）が、
インターフェロンII型アゴニストを含む精製された無傷の細菌由来ミニ細胞の治療有効量、を含む、請求項１に記載の抗癌剤組成物。

【請求項3】

(a)前記抗腫瘍剤、および、インターフェロンII型アゴニストが、２つ以上の精製された無傷の細菌由来ミニ細胞内にパッケージ化された、請求項１または２に記載の抗癌剤組成物。

【請求項4】

前記抗腫瘍剤、およびインターフェロンII型アゴニストを含み、ここで、
(a)前記抗腫瘍剤、インターフェロンI型アゴニスト、およびインターフェロンII型アゴニストは、同じミニ細胞内に含まれ、または
(b)前記抗腫瘍剤は第１のミニ細胞内に含まれ、インターフェロンII型アゴニストは第２のミニ細胞内に含まれる
請求項１～３のいずれか１項に記載の抗癌剤組成物。

【請求項5】

前記組成物が、インターフェロンI型アゴニストを含まない、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗癌剤組成物。

【請求項6】

モルホリニルアントラサイクリンが、ネモルビシン、ＰＮＵ-１５９６８２、イダルビシン、ダウノルビシン、カミノマイシン、およびオキソルビシンからなる群より選択される請求項１～５のいずれか１項に記載の抗癌剤組成物。

【請求項7】

モルホリニルアントラサイクリンがＰＮＵ－１５９６８２である、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗癌剤組成物。

【請求項8】

インターフェロンII型アゴニストが、α－ガラクトシルセラミド（α－GalCer）である、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗癌剤組成物。

【請求項9】

(a)抗腫瘍剤を含むミニ細胞に結合した二重特異性リガンド、および／または
(b)インターフェロンI型アゴニストを含むミニ細胞に結合した二重特異性リガンド、および／または
(c)インターフェロンII型アゴニストを含むミニ細胞に結合した二重特異性リガンド、を更に含む請求項１～８のいずれか１項に記載の抗癌剤組成物。

【請求項10】

前記二重特異性リガンドが、
(a)ミニ細胞表面構造に対する特異性を有する第１のアームと、非食作用性哺乳動物細胞表面受容体に対する特異性を有する第２のアームを含み、および／または
(b)ミニ細胞表面構造に対する特異性を有する第１のアームと、非食作用性哺乳動物細胞表面受容体に対する特異性を有し、ミニ細胞表面構造がミニ細胞表面上のリポ多糖のO－多糖成分である第２のアームとを含み、および／または
(c)ミニ細胞表面構造に対する特異性を有する第1のアームおよび非食作用性哺乳動物細胞表面受容体に対する特異性を有する第２のアームを含み、ここで、非貪食性哺乳動物細胞表面受容体は、ミニ細胞の受容体媒介エンドサイトーシスを活性化することができ、および／または
(d)二重特異性抗体または抗体断片を含み、および／または
(e)ここで、抗体または抗体断片は、細菌由来のミニ細胞表面構造に対する特異性を有する第１の多価アームと、癌細胞表面受容体に対する特異性を有する第２の多価アームとを含み、癌細胞表面受容体は、ミニ細胞の受容体媒介エンドサイトーシスを活性化することができる、請求項９に記載の抗癌剤組成物。

【請求項11】

前記組成物が、１０^７ミニ細胞当たり約１未満の汚染親細菌細胞、１０^８ミニ細胞当たり約１未満の汚染親細菌細胞、１０^９ミニ細胞当たり約１未満の汚染親細菌細胞、１０^１０ミニ細胞当たり約１未満の汚染親細菌細胞、または１０^１１ミニ細胞当たり約１未満の汚染親細菌細胞を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗癌剤組成物。

【請求項12】

薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗癌剤組成物。

【請求項13】

前記ミニ細胞が、直径約４００nmである、請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗癌剤組成物。

【請求項14】

前記組成物が２００nm濾過によって除去可能な親細菌細胞汚染を含まない、請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗癌剤組成物。

【請求項15】

前記組成物が、
(a)少なくとも１０ ^９ 、
(b)少なくとも１×１０ ^９ 、
(c)少なくとも２×１０ ^９ 、
(d)少なくとも５×１０ ^９ 、
(e)少なくとも８×１０ ^９ 、
(f)１０ ^１１ 以下、
(g)１×１０ ^１１ 以下、
(h)９×１０ ^１０ 以下、または
(i)８×１０ ^１０ 以下のミニ細胞または死滅した細菌細胞を含む、請求項１～１４のいずれか1項に記載の抗癌剤組成物。

【請求項16】

有効量の前記組成物を被験体に投与することを含む、必要とする被験体を治療する方法において使用するための、請求項１～１５のいずれか1項に記載の抗癌剤組成物。

【請求項17】

前記被検体が、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ウサギ、マウス、またはラットである請求項１６に記載の抗癌剤組成物。

【請求項18】

(a)前記被検体は癌に罹患しており、および／または
(b)前記被験体が癌に罹患しており、該癌が肺癌、乳癌、脳癌、肝臓癌、結腸癌、膵臓癌、および膀胱癌からなる群より選択され、および／または
(c)前記被験体が癌に罹患しており、該癌が急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質がん、エイズ関連がん、エイズ関連リンパ腫、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、基底細胞がん、膀胱がん、脳幹グリオーマ、脳腫瘍、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、原発部位不明がん、カルチノイド腫瘍、主要サイト不明がん、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、子宮頸がん、小児がん、脊索腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、大腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞腫瘍、子宮体がん、上衣芽細胞腫、上衣芽腫、上衣腫、食道がん、感覚神経肉腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外生殖細胞腫瘍、肝外胆管がん、胆がん、胃（胃）がん、胃腸カルチノイド腫瘍、消化管間質細胞腫瘍、消化管間質腫瘍（GIST）、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫、有毛細胞白血病、心臓腫瘍、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、小島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓ガン、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭ガン、唇ガン、肝臓がん、悪性繊維性組織サイト骨ガン、脂肪肉腫、髄芽腫、黒色腫、メルケル細胞がん、メルケル細胞がん、中皮腫、原発不明の転移性扁平上皮首がん、口腔がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚がん、非小細胞肺がん、口腔がん、口腔癌、中咽頭がん、骨肉腫、その他の脳および脊髄腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵がん、乳頭腫症、副鼻腔がん、副甲状腺がん、骨盤がん、ペニスのがん、咽頭がん、中間的な分化を示す松果体実質細胞腫瘍、松果体芽腫、下垂体腫瘍、形質細胞新生物/多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、 原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫、原発性肝細胞腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性肝細胞がん、前立腺がん、腎細胞がん、腎細胞がん、腎細胞がん、網膜芽細胞腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、セザリー症候群、唾液腺がん、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮がん、頸部がん、胃（胃）がん、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、咽頭がん、胸腺がん、胸腺腫、甲状腺がん、移行上皮がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、絨毛腫瘍、尿管がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍および／または
(d)前記被験体は、脳幹グリオーマ、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮腫、中間的分化の松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫からなる群より選択される脳腫瘍または脳腫瘍を罹患している、請求項１６または１７に記載の抗癌剤組成物。

【請求項19】

前記組成物が、
(a)少なくとも週に１回、数週間にわたり、および／または
(b)１週間に少なくとも１回、数週間から数ヶ月にわたり、および／または
(c)１週間に少なくとも１回、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０週間またはそれ以上、および／または
(d)毎週２回、および／または
(e)２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０週間、またはそれ以上にわたり、週に２回、投与される、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の抗癌剤組成物。