(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024038496
(43)【公開日】2024-03-19
(54)【発明の名称】ペプチド
(51)【国際特許分類】
C07K 14/81 20060101AFI20240312BHJP
C07K 7/00 20060101ALI20240312BHJP
C40B 40/10 20060101ALI20240312BHJP
C12N 15/15 20060101ALN20240312BHJP
【ＦＩ】
C07K14/81
C07K7/00
C40B40/10
C12N15/15 ZNA
【審査請求】有
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024010633
(22)【出願日】2024-01-29
(62)【分割の表示】P 2022209538の分割
【原出願日】2013-08-07
(31)【優先権主張番号】P 2012176208
(32)【優先日】2012-08-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】307010166
【氏名又は名称】第一三共株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100146581
【弁理士】
【氏名又は名称】石橋 公樹
(74)【代理人】
【識別番号】100113583
【弁理士】
【氏名又は名称】北野 範子
(74)【代理人】
【識別番号】100161160
【弁理士】
【氏名又は名称】竹元 利泰
(74)【代理人】
【識別番号】100167678
【弁理士】
【氏名又は名称】西田 直浩
(72)【発明者】
【氏名】西宮 大祐
(72)【発明者】
【氏名】橋本 隆二
(57)【要約】
【課題】標的結合ペプチドを提供する。
【解決手段】 ペプチド・ライブラリーに含まれるペプチドと標的分子とを接触させる工
程、標的分子に結合したペプチドを回収する工程、及び、回収されたペプチドを遺伝子組
換えにより調製する工程を含む方法により得られる、標的結合ペプチド。
【選択図】なし
【解決手段】 ペプチド・ライブラリーに含まれるペプチドと標的分子とを接触させる工
程、標的分子に結合したペプチドを回収する工程、及び、回収されたペプチドを遺伝子組
換えにより調製する工程を含む方法により得られる、標的結合ペプチド。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記（ｉ）に記載のアミノ酸配列において、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２乃至８及び１０乃至１４以外の、１個以上５個以下のアミノ酸がアミノ酸置換、欠失、付加および／または挿入してなるアミノ酸配列を有するペプチド：
（ｉ）配列表の配列番号１４において第４３番塩基チミン乃至第９３番チミンからなる塩基配列が配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列で置き換えられてなる塩基配列によりコードされるアミノ酸配列であって、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列においてＸ１乃至Ｘ１２がシステイン以外の天然界に存在するアミノ酸であるアミノ酸配列。
（ｉ）配列表の配列番号１４において第４３番塩基チミン乃至第９３番チミンからなる塩基配列が配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列で置き換えられてなる塩基配列によりコードされるアミノ酸配列であって、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列においてＸ１乃至Ｘ１２がシステイン以外の天然界に存在するアミノ酸であるアミノ酸配列。
【請求項2】
配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列においてＸ１乃至Ｘ１２がシステイン以外の天然界に存在するアミノ酸であるアミノ酸配列が、配列表の配列番号２乃至９（図１２のペプチド番号１、２、６、７、１２乃至１４および１７）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項3】
ヒト由来のＣｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ、ヒト由来のＫａｌｌｉｋｒｅｉｎ、ヒト由来のＥＧＦＲ又はヒト由来のＨＥＲ２の内、少なくともいずれか一つの予め決定された標的分子に結合する、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項4】
予め決定された標的分子がヒト由来のＣｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎであることを特徴とする、請求項３に記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ペプチド、該ペプチドの誘導体、該ペプチドまたは該誘導体に含まれるペプ
チドに対応するヌクレオチド、ヌクレオチドを含むベクター、該ベクターおよび／または
ヌクレオチドが導入された細胞、該細胞を培養する工程を含んでなるペプチドおよび／ま
たはその誘導体の製造方法、該ペプチドおよび／またはその誘導体を含んでなるペプチド
・ライブラリー、標的分子に結合するペプチドおよび／またはその誘導体の同定方法、標
的分子に結合するペプチドおよび／またはその誘導体の製造方法、被検ペプチドおよび／
またはその誘導体が標的分子に結合するか否かを判定する方法、該ヌクレオチドを含んで
なるヌクレオチド・ライブラリー、該ペプチドもしくはその誘導体、該ヌクレオチド、該
ベクターまたは該細胞を含むことからなる組成物、該ペプチドもしくはその誘導体、該ヌ
クレオチド、該ベクターまたは該細胞を含むことからなる試薬等に関する。
チドに対応するヌクレオチド、ヌクレオチドを含むベクター、該ベクターおよび／または
ヌクレオチドが導入された細胞、該細胞を培養する工程を含んでなるペプチドおよび／ま
たはその誘導体の製造方法、該ペプチドおよび／またはその誘導体を含んでなるペプチド
・ライブラリー、標的分子に結合するペプチドおよび／またはその誘導体の同定方法、標
的分子に結合するペプチドおよび／またはその誘導体の製造方法、被検ペプチドおよび／
またはその誘導体が標的分子に結合するか否かを判定する方法、該ヌクレオチドを含んで
なるヌクレオチド・ライブラリー、該ペプチドもしくはその誘導体、該ヌクレオチド、該
ベクターまたは該細胞を含むことからなる組成物、該ペプチドもしくはその誘導体、該ヌ
クレオチド、該ベクターまたは該細胞を含むことからなる試薬等に関する。
【背景技術】
【0002】
ＳＰＩＮＫ２（Ｓｅｒｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｋａｚａｌ－
ｔｙｐｅ ２）は、３つのｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄを有するＫａｚａｌ－ｔｙｐｅ
ｄｏｍａｉｎから成る７ｋＤａのタンパク質である。ヒト生体内では精巣や精嚢で発現
しており、ｔｒｙｐｓｉｎ／ａｃｒｏｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとして機能している（
非特許文献１）。
ｔｙｐｅ ２）は、３つのｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄを有するＫａｚａｌ－ｔｙｐｅ
ｄｏｍａｉｎから成る７ｋＤａのタンパク質である。ヒト生体内では精巣や精嚢で発現
しており、ｔｒｙｐｓｉｎ／ａｃｒｏｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとして機能している（
非特許文献１）。
【0003】
１９９１年、Ｗｉｎｔｅｒらがｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙを用いた抗体のスクリーニ
ングを報告したことにより、ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙは完全ヒト型抗体の創製法とし
て、抗体医薬開発に大きな影響を与えた（非特許文献２）。近年ではタンパク質工学の進
歩により、ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙやｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙなどのディ
スプレイ技術を用いて、ｎｏｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｃａｆｆｏｌｄの開発が盛んにな
りつつある。Ｎｏｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｃａｆｆｏｌｄは、ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
ｂｉｎｄｉｎｇ（ａｆｆｉｎｉｔｙ） ｐｒｏｔｅｉｎなどとも呼ばれ、抗体の可変領
域（ＣＤＲ）様の結合領域を付与した人工タンパク質のことである。標的となるタンパク
質Ｘに対する結合性を有し、タンパク質間相互作用が可能な点に加え、生産性や免疫原性
、組織浸潤性などの観点に特長を持っている。Ｋｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ ｌｉｂｒａ
ｒｙ（Ｄｙａｘ）（特許文献１）やａｎｔｉｃａｌｉｎ（Ｐｉｅｒｉｓ）などに代表され
るように、科学上または産業上の台頭が望まれているが、その種類は未だ少なく、疾患関
連分子に対する新規なｎｏｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｃａｆｆｏｌｄの創出が期待されて
いる（非特許文献３）。
ングを報告したことにより、ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙは完全ヒト型抗体の創製法とし
て、抗体医薬開発に大きな影響を与えた（非特許文献２）。近年ではタンパク質工学の進
歩により、ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙやｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙなどのディ
スプレイ技術を用いて、ｎｏｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｃａｆｆｏｌｄの開発が盛んにな
りつつある。Ｎｏｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｃａｆｆｏｌｄは、ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
ｂｉｎｄｉｎｇ（ａｆｆｉｎｉｔｙ） ｐｒｏｔｅｉｎなどとも呼ばれ、抗体の可変領
域（ＣＤＲ）様の結合領域を付与した人工タンパク質のことである。標的となるタンパク
質Ｘに対する結合性を有し、タンパク質間相互作用が可能な点に加え、生産性や免疫原性
、組織浸潤性などの観点に特長を持っている。Ｋｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ ｌｉｂｒａ
ｒｙ（Ｄｙａｘ）（特許文献１）やａｎｔｉｃａｌｉｎ（Ｐｉｅｒｉｓ）などに代表され
るように、科学上または産業上の台頭が望まれているが、その種類は未だ少なく、疾患関
連分子に対する新規なｎｏｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｃａｆｆｏｌｄの創出が期待されて
いる（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】米国特許出願公開 ＵＳ２００８／００２０３９４ Ａ１（または日本出願公表 特表２００７－５２４３４８）
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｃｈｅｎ Ｔ， Ｌｅｅ ＴＲ， Ｌｉａｎｇ ＷＧ， Ｃｈａｎｇ ＷＳ， Ｌｙｕ ＰＣ． （２００９） Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｙｐｓｉｎ－ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｓｉｔｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＳＰＩＮＫ２ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ. Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． ７７（１）：２０９－１９．
【非特許文献2】Ｊａｍｅｓ Ｄ． Ｍａｒｋｓ， Ｈｅｎｎｉｅ Ｒ． Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ， Ｔｉｍｏｔｈｙ Ｐ． Ｂｏｎｎｅｒｔ， Ｊｏｈｎ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ， Ａｎｄｒｅｗ Ｄ． Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， Ｇｒｅｇ Ｗｉｎｔｅｒ （１９９１） Ｂｙ－ｐａｓｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ： Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｖ－ｇｅｎｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ ｐｈａｇｅ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２２２（３）：５８１－９７．
【非特許文献3】Ｓｋｅｒｒａ Ａ． （２００７） Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｎｏｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １８：２９５－３０４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
発明者らは、ＳＰＩＮＫ２およびその改変体について鋭意検討した結果、ＳＰＩＮＫ２
の内在性の標的以外の分子に対して高い結合活性を示すペプチドを含むライブラリーを作
製し、当該ライブラリーから内在性の標的以外の標的分子に対して高い結合活性を示すペ
プチドを単離すること等により、本発明を完成した。
の内在性の標的以外の分子に対して高い結合活性を示すペプチドを含むライブラリーを作
製し、当該ライブラリーから内在性の標的以外の標的分子に対して高い結合活性を示すペ
プチドを単離すること等により、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、例えば、
（１）
下記（ｉ）または（ｉｉ）から選択されるペプチド：
（ｉ）配列表の配列番号１４において第４３番塩基チミン乃至第９３番チミンからなる塩
基配列が配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列で置き換えら
れてなる塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むペプチド；および、
（ｉｉ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２乃至８及び１０乃
至１４以外の、１個以上５個以下のアミノ酸がアミノ酸置換、欠失、付加および／または
挿入してなるアミノ酸配列を有する（ｉ）記載のペプチド、
（２）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１番目乃至５番目、７番目、９番目および
１０番目のＸａａが、それぞれ、システインおよびプロリンを除く任意のアミノ酸である
、（１）記載のペプチド、
（３）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて６番目および８番目のＸａａが、それぞれ
、システインを除く任意のアミノ酸である、（１）または（２）記載のペプチド、
（４）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１１番目のＸａａが、チロシン、セリン、
フェニルアラニン、ロイシンおよびスレオニンからなる群より選択されるアミノ酸である
、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載のペプチド、
（５）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１２番目のＸａａが、アスパラギン、アス
パラギン酸、ロイシン、リジン、グルタミン、アラニンおよびグルタミン酸からなる群よ
り選択されるアミノ酸である、（１）乃至（４）のいずれか一つに記載のペプチド、
（６）
保存的アミノ酸置換が、疎水性アミノ酸グループ、中性親水性アミノ酸グループ、酸性
アミノ酸グループ、塩基性アミノ酸グループ、主鎖の方角に影響を与えるアミノ酸のグル
ープ、および、芳香族アミノ酸グループから選択されるいずれかのグループ内において行
われることを特徴とする、（１）乃至（５）のいずれか一つに記載のペプチド、
（７）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１番目のＸａａが、アルギニン、メチオニ
ン、ロイシン、トリプトファンおよびセリンからなる群より選択されるアミノ酸である、
（１）乃至（６）のいずれか一つに記載のペプチド、
（８）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて２番目のＸａａが、スレオニン、アルギニ
ン、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸である、
（１）乃至（７）のいずれか一つに記載のペプチド、
（９）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて３番目のＸａａが、アルギニン、ヒスチジ
ン、トリプトファン、セリンおよびフェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸
である、（１）乃至（８）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１０）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて４番目のＸａａが、トリプトファン、アル
ギニンおよびロイシンからなる群より選択されるアミノ酸である、（１）乃至（９）のい
ずれか一つに記載のペプチド、
（１）
下記（ｉ）または（ｉｉ）から選択されるペプチド：
（ｉ）配列表の配列番号１４において第４３番塩基チミン乃至第９３番チミンからなる塩
基配列が配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列で置き換えら
れてなる塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むペプチド；および、
（ｉｉ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２乃至８及び１０乃
至１４以外の、１個以上５個以下のアミノ酸がアミノ酸置換、欠失、付加および／または
挿入してなるアミノ酸配列を有する（ｉ）記載のペプチド、
（２）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１番目乃至５番目、７番目、９番目および
１０番目のＸａａが、それぞれ、システインおよびプロリンを除く任意のアミノ酸である
、（１）記載のペプチド、
（３）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて６番目および８番目のＸａａが、それぞれ
、システインを除く任意のアミノ酸である、（１）または（２）記載のペプチド、
（４）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１１番目のＸａａが、チロシン、セリン、
フェニルアラニン、ロイシンおよびスレオニンからなる群より選択されるアミノ酸である
、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載のペプチド、
（５）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１２番目のＸａａが、アスパラギン、アス
パラギン酸、ロイシン、リジン、グルタミン、アラニンおよびグルタミン酸からなる群よ
り選択されるアミノ酸である、（１）乃至（４）のいずれか一つに記載のペプチド、
（６）
保存的アミノ酸置換が、疎水性アミノ酸グループ、中性親水性アミノ酸グループ、酸性
アミノ酸グループ、塩基性アミノ酸グループ、主鎖の方角に影響を与えるアミノ酸のグル
ープ、および、芳香族アミノ酸グループから選択されるいずれかのグループ内において行
われることを特徴とする、（１）乃至（５）のいずれか一つに記載のペプチド、
（７）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１番目のＸａａが、アルギニン、メチオニ
ン、ロイシン、トリプトファンおよびセリンからなる群より選択されるアミノ酸である、
（１）乃至（６）のいずれか一つに記載のペプチド、
（８）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて２番目のＸａａが、スレオニン、アルギニ
ン、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸である、
（１）乃至（７）のいずれか一つに記載のペプチド、
（９）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて３番目のＸａａが、アルギニン、ヒスチジ
ン、トリプトファン、セリンおよびフェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸
である、（１）乃至（８）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１０）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて４番目のＸａａが、トリプトファン、アル
ギニンおよびロイシンからなる群より選択されるアミノ酸である、（１）乃至（９）のい
ずれか一つに記載のペプチド、
【0008】
（１１）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて５番目のＸａａが、グリシン、アルギニン
、ロイシン、ヒスチジン、トリプトファン、メチオニンおよびチロシンからなる群から選
択されるアミノ酸である、（１）乃至（１０）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１２）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて６番目のＸａａが、アスパラギン、ヒスチ
ジン、プロリン、リジン、トリプトファン、アルギニンおよびアスパラギン酸からなる群
から選択されるアミノ酸である、（１）乃至（１１）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１３）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて７番目のＸａａが、アルギニン、フェニル
アラニン、トリプトファン、ロイシン、アラニンおよびグリシンからなる群から選択され
るアミノ酸である、（１）乃至（１２）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１４）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて８番目のＸａａが、スレオニン、プロリン
、アスパラギンおよびセリンからなる群から選択されるアミノ酸である、（１）乃至（１
３）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１５）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて９番目のＸａａが、トリプトファン、メチ
オニン、チロシンおよびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸である、（
１）乃至（１４）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１６）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１０番目のＸａａが、グルタミン、バリン
、リジン、メチオニン、アラニン、ロイシンおよびアスパラギンからなる群から選択され
るアミノ酸である、（１）乃至（１５）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１７）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１１番目のＸａａが、チロシン、フェニル
アラニンおよびロイシンからなる群から選択されるアミノ酸である、（１）乃至（１６）
のいずれか一つに記載のペプチド、
（１８）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１２番目のＸａａがリジンである、（１）
乃至（１７）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１９）
配列表の配列番号２乃至９（図１２のペプチド番号１、２、６、７、１２乃至１４およ
び１７）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含む、（１）乃至（１８）のいずれか
一つに記載のペプチド、
（２０）
（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載のペプチドに化学的修飾および／または生物
学的修飾が施されてなる該ペプチドの誘導体、
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて５番目のＸａａが、グリシン、アルギニン
、ロイシン、ヒスチジン、トリプトファン、メチオニンおよびチロシンからなる群から選
択されるアミノ酸である、（１）乃至（１０）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１２）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて６番目のＸａａが、アスパラギン、ヒスチ
ジン、プロリン、リジン、トリプトファン、アルギニンおよびアスパラギン酸からなる群
から選択されるアミノ酸である、（１）乃至（１１）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１３）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて７番目のＸａａが、アルギニン、フェニル
アラニン、トリプトファン、ロイシン、アラニンおよびグリシンからなる群から選択され
るアミノ酸である、（１）乃至（１２）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１４）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて８番目のＸａａが、スレオニン、プロリン
、アスパラギンおよびセリンからなる群から選択されるアミノ酸である、（１）乃至（１
３）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１５）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて９番目のＸａａが、トリプトファン、メチ
オニン、チロシンおよびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸である、（
１）乃至（１４）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１６）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１０番目のＸａａが、グルタミン、バリン
、リジン、メチオニン、アラニン、ロイシンおよびアスパラギンからなる群から選択され
るアミノ酸である、（１）乃至（１５）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１７）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１１番目のＸａａが、チロシン、フェニル
アラニンおよびロイシンからなる群から選択されるアミノ酸である、（１）乃至（１６）
のいずれか一つに記載のペプチド、
（１８）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１２番目のＸａａがリジンである、（１）
乃至（１７）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１９）
配列表の配列番号２乃至９（図１２のペプチド番号１、２、６、７、１２乃至１４およ
び１７）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含む、（１）乃至（１８）のいずれか
一つに記載のペプチド、
（２０）
（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載のペプチドに化学的修飾および／または生物
学的修飾が施されてなる該ペプチドの誘導体、
【0009】
（２１）
下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド：
（ｉ）（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載のペプチドの有するアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列からなるヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド；
（ｉｉ）（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載のペプチドの有するアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列を含んでなるヌクレオチド；および、
（ｉｉｉ）（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載のペプチドの有するアミノ酸配列を
コードする塩基配列からなるヌクレオチド、
（２２）
（２１）記載のヌクレオチドを含んでなるベクター、
（２３）
（２１）記載のヌクレオチドまたは（２２）記載のベクターが導入された細胞、
（２４）
下記工程（ｉ）および（ｉｉ）を含んでなる（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載
のペプチドの製造方法：
（ｉ）（２３）記載の細胞を培養する工程；および、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた培養物から該ペプチドを回収する工程、
（２５）
（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載のペプチドおよび／または（２０）記載のペ
プチドの誘導体を含んでなるペプチド・ライブラリー、
（２６）
ペプチドおよび／またはペプチドの誘導体が、（２４）記載の工程（ｉ）および（ｉｉ
）を含んでなる方法により調製されたものであることを特徴とする、（２５）記載のライ
ブラリー、
（２７）
ライブラリーにおいて、表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）である該ペプチド又はペプチド
誘導体および該表現型に対応する遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）であるヌクレオチドが直接
的または間接的にリンクしていることを特徴とする、（２５）または（２６）記載のライ
ブラリー、
（２８）
ヌクレオチドが（２１）に記載のヌクレオチドである、（２７）に記載のライブラリー
、
（２９）
ファージ・ディスプレイ・ライブラリー、リボゾーム・ディスプレイ・ライブラリー若
しくは核酸ディスプレイ・ライブラリーである、（２５）乃至（２８）のいずれか一つに
記載のライブラリー、
（３０）
下記（ｉ）および（ｉｉ）の工程を含んでなる、標的分子に結合する、（１）乃至（１
９）のいずれか一つに記載のペプチドまたは（２０）記載のペプチド誘導体の同定方法：
（ｉ）（２５）乃至（２９）のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドま
たはペプチド誘導体と該標的分子とを接触させる工程；および、
（ｉｉ）該標的分子に結合するペプチドまたはペプチド誘導体を回収する工程、
下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド：
（ｉ）（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載のペプチドの有するアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列からなるヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド；
（ｉｉ）（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載のペプチドの有するアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列を含んでなるヌクレオチド；および、
（ｉｉｉ）（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載のペプチドの有するアミノ酸配列を
コードする塩基配列からなるヌクレオチド、
（２２）
（２１）記載のヌクレオチドを含んでなるベクター、
（２３）
（２１）記載のヌクレオチドまたは（２２）記載のベクターが導入された細胞、
（２４）
下記工程（ｉ）および（ｉｉ）を含んでなる（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載
のペプチドの製造方法：
（ｉ）（２３）記載の細胞を培養する工程；および、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた培養物から該ペプチドを回収する工程、
（２５）
（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載のペプチドおよび／または（２０）記載のペ
プチドの誘導体を含んでなるペプチド・ライブラリー、
（２６）
ペプチドおよび／またはペプチドの誘導体が、（２４）記載の工程（ｉ）および（ｉｉ
）を含んでなる方法により調製されたものであることを特徴とする、（２５）記載のライ
ブラリー、
（２７）
ライブラリーにおいて、表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）である該ペプチド又はペプチド
誘導体および該表現型に対応する遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）であるヌクレオチドが直接
的または間接的にリンクしていることを特徴とする、（２５）または（２６）記載のライ
ブラリー、
（２８）
ヌクレオチドが（２１）に記載のヌクレオチドである、（２７）に記載のライブラリー
、
（２９）
ファージ・ディスプレイ・ライブラリー、リボゾーム・ディスプレイ・ライブラリー若
しくは核酸ディスプレイ・ライブラリーである、（２５）乃至（２８）のいずれか一つに
記載のライブラリー、
（３０）
下記（ｉ）および（ｉｉ）の工程を含んでなる、標的分子に結合する、（１）乃至（１
９）のいずれか一つに記載のペプチドまたは（２０）記載のペプチド誘導体の同定方法：
（ｉ）（２５）乃至（２９）のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドま
たはペプチド誘導体と該標的分子とを接触させる工程；および、
（ｉｉ）該標的分子に結合するペプチドまたはペプチド誘導体を回収する工程、
【0010】
（３１）
下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）の工程を含んでなる、標的分子に結合する、（１）乃至（１
９）のいずれか一つに記載のペプチドまたは（２０）記載のペプチド誘導体の製造方法：
（ｉ）（２５）乃至（２９）のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドま
たはペプチド誘導体と該標的分子とを接触させる工程；および、
（ｉｉ）該標的分子に結合するペプチドまたはペプチド誘導体を回収する工程；および、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）において回収された該ペプチドまたはペプチド誘導体に含まれる
、該標的分子に結合するペプチドを化学合成、遺伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳によ
り調製する工程、
（３２）
下記（ｉ）および（ｉｉ）の工程を含んでなる、（１）乃至（１９）のいずれか一つに
記載のペプチドまたは（２０）記載のペプチドの誘導体が標的分子に結合するか否かを判
定する方法：
（ｉ）（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載の被検ペプチドまたは（２０）記載の被
検ペプチド誘導体と該標的分子とを接触させる工程；および、
（ｉｉ）被検ペプチドまたは被検ペプチド誘導体が該標的分子に結合する場合、該ペプチ
ドまたは被検ペプチド誘導体は陽性であると決定する工程、
（３３）
下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）の工程を含んでなる、標的分子に結合する、（１）乃至（１
９）のいずれか一つに記載のペプチドまたは（２０）記載のペプチドの誘導体の製造方法
：
（ｉ）（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載の被検ペプチドまたは（２０）記載の被
検ペプチド誘導体と該標的分子とを接触させる工程；
（ｉｉ）被検ペプチドまたは被検ペプチド誘導体が該標的分子に結合する場合、該ペプチ
ドまたは被検ペプチド誘導体は陽性であると決定する工程；および、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において被検ペプチドまたはペプチド誘導体が陽性と判定された
場合、該ペプチドまたはペプチド誘導体に含まれる、該標的分子に結合するペプチドを、
遺伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳により調製する工程、
（３４）
（２１）に記載のヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド・ライブラリー、
（３５）
ヌクレオチドがファージミド、コスミドもしくはプラスミドまたはその断片である、（
３４）記載のライブラリー、
（３６）
ヌクレオチドが原核もしくは真核細胞内、または、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ上もし
くはウイルス粒子中に存在する、（３４）または（３５）記載のヌクレオチド・ライブラ
リー、
（３７）
（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載のペプチド、（２０）記載のペプチドの誘導
体、（２１）記載のヌクレオチド、（２２）記載のベクターまたは（２３）記載の細胞を
含むことからなる組成物、
（３８）
（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載のペプチド、（２０）記載のペプチドの誘導
体、（２１）記載のヌクレオチド、（２２）記載のベクターまたは（２３）記載の細胞を
含むことからなる試薬、
（３９）
予め決定された標的分子に結合する、（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載のペプ
チド、または、（２０）記載のペプチドの誘導体、
（４０）
標的分子がＳＰＩＮＫ２の内在性の標的ではないことを特徴とする、（３９）記載のペ
プチドまたはペプチドの誘導体、
下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）の工程を含んでなる、標的分子に結合する、（１）乃至（１
９）のいずれか一つに記載のペプチドまたは（２０）記載のペプチド誘導体の製造方法：
（ｉ）（２５）乃至（２９）のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドま
たはペプチド誘導体と該標的分子とを接触させる工程；および、
（ｉｉ）該標的分子に結合するペプチドまたはペプチド誘導体を回収する工程；および、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）において回収された該ペプチドまたはペプチド誘導体に含まれる
、該標的分子に結合するペプチドを化学合成、遺伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳によ
り調製する工程、
（３２）
下記（ｉ）および（ｉｉ）の工程を含んでなる、（１）乃至（１９）のいずれか一つに
記載のペプチドまたは（２０）記載のペプチドの誘導体が標的分子に結合するか否かを判
定する方法：
（ｉ）（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載の被検ペプチドまたは（２０）記載の被
検ペプチド誘導体と該標的分子とを接触させる工程；および、
（ｉｉ）被検ペプチドまたは被検ペプチド誘導体が該標的分子に結合する場合、該ペプチ
ドまたは被検ペプチド誘導体は陽性であると決定する工程、
（３３）
下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）の工程を含んでなる、標的分子に結合する、（１）乃至（１
９）のいずれか一つに記載のペプチドまたは（２０）記載のペプチドの誘導体の製造方法
：
（ｉ）（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載の被検ペプチドまたは（２０）記載の被
検ペプチド誘導体と該標的分子とを接触させる工程；
（ｉｉ）被検ペプチドまたは被検ペプチド誘導体が該標的分子に結合する場合、該ペプチ
ドまたは被検ペプチド誘導体は陽性であると決定する工程；および、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において被検ペプチドまたはペプチド誘導体が陽性と判定された
場合、該ペプチドまたはペプチド誘導体に含まれる、該標的分子に結合するペプチドを、
遺伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳により調製する工程、
（３４）
（２１）に記載のヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド・ライブラリー、
（３５）
ヌクレオチドがファージミド、コスミドもしくはプラスミドまたはその断片である、（
３４）記載のライブラリー、
（３６）
ヌクレオチドが原核もしくは真核細胞内、または、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ上もし
くはウイルス粒子中に存在する、（３４）または（３５）記載のヌクレオチド・ライブラ
リー、
（３７）
（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載のペプチド、（２０）記載のペプチドの誘導
体、（２１）記載のヌクレオチド、（２２）記載のベクターまたは（２３）記載の細胞を
含むことからなる組成物、
（３８）
（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載のペプチド、（２０）記載のペプチドの誘導
体、（２１）記載のヌクレオチド、（２２）記載のベクターまたは（２３）記載の細胞を
含むことからなる試薬、
（３９）
予め決定された標的分子に結合する、（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載のペプ
チド、または、（２０）記載のペプチドの誘導体、
（４０）
標的分子がＳＰＩＮＫ２の内在性の標的ではないことを特徴とする、（３９）記載のペ
プチドまたはペプチドの誘導体、
【0011】
（４１）
標的分子がヒト由来であることを特徴とする、（３９）または（４０）記載のペプチド
またはペプチドの誘導体、
（４２）
内在性の標的がトリプシンおよび／またはアクロシンである、（３９）乃至（４１）の
いずれか一つに記載のペプチドまたはペプチドの誘導体、
（４３）
内在性の標的がトリプシンである、（３９）乃至（４２）のいずれか一つに記載のペプチ
ドまたはペプチドの誘導体、
（４４）
（３９）乃至（４３）のいずれか一つに記載のペプチドまたはペプチドの誘導体を含むこ
とからなる組成物または試薬、
（４５）
下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）の工程を含んでなる、トリプシンおよび／またはアクロシン
以外のセリンプロテアーゼに結合し且つ該セリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性（
ペプチド結合加水分解活性：以下同じ）を阻害する、（１）乃至（１９）のいずれか一つ
に記載のペプチドまたは（２０）記載のペプチド誘導体の同定方法：
（ｉ）（２５）乃至（２９）のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドま
たはペプチド誘導体と該セリンプロテアーゼとを接触させる工程；
（ｉｉ）該セリンプロテアーゼに結合するペプチドまたはペプチド誘導体を回収する工程
；、および、
（ｉｉｉ）該ペプチドまたはペプチド誘導体が該セリンプロテアーゼの有する蛋白質分解
活性を阻害する場合、該ペプチドまたはペプチド誘導体を陽性と判定する工程、
（４６）
下記（ｉ）乃至（ｉｖ）の工程を含んでなる、トリプシンおよび／またはアクロシン以
外のセリンプロテアーゼに結合し且つその蛋白質分解活性を阻害する、（１）乃至（１９
）のいずれか一つに記載のペプチドまたは（２０）記載のペプチド誘導体の製造方法：
（ｉ）（２５）乃至（２９）のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドま
たはペプチド誘導体と該セリンプロテアーゼとを接触させる工程；
（ｉｉ）該セリンプロテアーゼに結合するペプチドまたはペプチド誘導体を回収する工程
；および、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において回収されたペプチドまたはペプチド誘導体が該セリンプ
ロテアーゼの有する蛋白質分解活性を阻害する場合、該ペプチドまたはペプチド誘導体を
陽性と判定する工程；、および、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において陽性と判定されたペプチドまたはペプチド誘導体に含ま
れる、該セリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性を阻害するペプチドを化学合成、遺
伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳により調製する工程、
（４７）
下記（ｉ）および（ｉｉ）の工程を含んでなる、（１）乃至（１９）のいずれか一つに
記載のペプチドまたは（２０）記載のペプチドの誘導体がトリプシンおよび／またはアク
ロシン以外のセリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性（ペプチド結合加水分解活性：
以下同じ）を阻害するか否かを判定する方法：
（ｉ）（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載の被検ペプチドまたは（２０）記載の被
検ペプチド誘導体と該セリンプロテアーゼとを接触させる工程；および、
（ｉｉ）該ペプチドまたはペプチド誘導体が該セリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活
性を阻害する場合、該ペプチドまたはペプチド誘導体を陽性と判定する工程、
（４８）
下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）の工程を含んでなる、トリプシンおよび／またはアクロシン
以外のセリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性を阻害する、（１）乃至（１９）のい
ずれか一つに記載のペプチドまたは（２０）記載のペプチドの誘導体の製造方法：
（ｉ）（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載の被検ペプチドまたは（２０）記載の被
検ペプチド誘導体と該セリンプロテアーゼとを接触させる工程；
（ｉｉ）該ペプチドまたはペプチド誘導体が該セリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活
性を阻害する場合、該ペプチドまたはペプチド誘導体を陽性と判定する工程；および、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において陽性と判定されたペプチドまたはペプチド誘導体に含ま
れる、該セリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性を阻害するペプチドを、遺伝子組換
えまたはイン・ビトロ翻訳により調製する工程、および、
（４９）
下記（ｉ）または（ｉｉ）から選択されるペプチド：
（ｉ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を含み、且つ下記（ア）乃至（エ）で
あるペプチド；
（ア）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１番目乃至５番目、７番目、９番目および
１０番目のＸａａが、それぞれ、システインおよびプロリンを除く任意のアミノ酸である
、
（イ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて６番目および８番目のＸａａが、それぞれ
、システインを除く任意のアミノ酸である、
（ウ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１１番目のＸａａが、チロシン、セリン、
フェニルアラニン、ロイシンおよびスレオニンからなる群より選択されるアミノ酸である
、
（エ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１２番目のＸａａが、アスパラギン、アス
パラギン酸、ロイシン、リジン、グルタミン、アラニンおよびグルタミン酸からなる群よ
り選択されるアミノ酸である：
および、
（ｉｉ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列において、アミノ末端から数えて１
番目乃至１２番目のＸａａ以外の、１個以上５個以下のアミノ酸が保存的アミノ酸置換、
欠失、付加および／または挿入してなるアミノ酸配列を含むペプチド、
（５０）
保存的アミノ酸置換が、疎水性アミノ酸グループ、中性親水性アミノ酸グループ、酸性
アミノ酸グループ、塩基性アミノ酸グループ、主鎖の方角に影響を与えるアミノ酸のグル
ープ、および、芳香族アミノ酸グループから選択されるいずれかのグループ内において行
われることを特徴とする、（４９）記載のペプチド、
標的分子がヒト由来であることを特徴とする、（３９）または（４０）記載のペプチド
またはペプチドの誘導体、
（４２）
内在性の標的がトリプシンおよび／またはアクロシンである、（３９）乃至（４１）の
いずれか一つに記載のペプチドまたはペプチドの誘導体、
（４３）
内在性の標的がトリプシンである、（３９）乃至（４２）のいずれか一つに記載のペプチ
ドまたはペプチドの誘導体、
（４４）
（３９）乃至（４３）のいずれか一つに記載のペプチドまたはペプチドの誘導体を含むこ
とからなる組成物または試薬、
（４５）
下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）の工程を含んでなる、トリプシンおよび／またはアクロシン
以外のセリンプロテアーゼに結合し且つ該セリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性（
ペプチド結合加水分解活性：以下同じ）を阻害する、（１）乃至（１９）のいずれか一つ
に記載のペプチドまたは（２０）記載のペプチド誘導体の同定方法：
（ｉ）（２５）乃至（２９）のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドま
たはペプチド誘導体と該セリンプロテアーゼとを接触させる工程；
（ｉｉ）該セリンプロテアーゼに結合するペプチドまたはペプチド誘導体を回収する工程
；、および、
（ｉｉｉ）該ペプチドまたはペプチド誘導体が該セリンプロテアーゼの有する蛋白質分解
活性を阻害する場合、該ペプチドまたはペプチド誘導体を陽性と判定する工程、
（４６）
下記（ｉ）乃至（ｉｖ）の工程を含んでなる、トリプシンおよび／またはアクロシン以
外のセリンプロテアーゼに結合し且つその蛋白質分解活性を阻害する、（１）乃至（１９
）のいずれか一つに記載のペプチドまたは（２０）記載のペプチド誘導体の製造方法：
（ｉ）（２５）乃至（２９）のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドま
たはペプチド誘導体と該セリンプロテアーゼとを接触させる工程；
（ｉｉ）該セリンプロテアーゼに結合するペプチドまたはペプチド誘導体を回収する工程
；および、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において回収されたペプチドまたはペプチド誘導体が該セリンプ
ロテアーゼの有する蛋白質分解活性を阻害する場合、該ペプチドまたはペプチド誘導体を
陽性と判定する工程；、および、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において陽性と判定されたペプチドまたはペプチド誘導体に含ま
れる、該セリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性を阻害するペプチドを化学合成、遺
伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳により調製する工程、
（４７）
下記（ｉ）および（ｉｉ）の工程を含んでなる、（１）乃至（１９）のいずれか一つに
記載のペプチドまたは（２０）記載のペプチドの誘導体がトリプシンおよび／またはアク
ロシン以外のセリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性（ペプチド結合加水分解活性：
以下同じ）を阻害するか否かを判定する方法：
（ｉ）（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載の被検ペプチドまたは（２０）記載の被
検ペプチド誘導体と該セリンプロテアーゼとを接触させる工程；および、
（ｉｉ）該ペプチドまたはペプチド誘導体が該セリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活
性を阻害する場合、該ペプチドまたはペプチド誘導体を陽性と判定する工程、
（４８）
下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）の工程を含んでなる、トリプシンおよび／またはアクロシン
以外のセリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性を阻害する、（１）乃至（１９）のい
ずれか一つに記載のペプチドまたは（２０）記載のペプチドの誘導体の製造方法：
（ｉ）（１）乃至（１９）のいずれか一つに記載の被検ペプチドまたは（２０）記載の被
検ペプチド誘導体と該セリンプロテアーゼとを接触させる工程；
（ｉｉ）該ペプチドまたはペプチド誘導体が該セリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活
性を阻害する場合、該ペプチドまたはペプチド誘導体を陽性と判定する工程；および、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において陽性と判定されたペプチドまたはペプチド誘導体に含ま
れる、該セリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性を阻害するペプチドを、遺伝子組換
えまたはイン・ビトロ翻訳により調製する工程、および、
（４９）
下記（ｉ）または（ｉｉ）から選択されるペプチド：
（ｉ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を含み、且つ下記（ア）乃至（エ）で
あるペプチド；
（ア）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１番目乃至５番目、７番目、９番目および
１０番目のＸａａが、それぞれ、システインおよびプロリンを除く任意のアミノ酸である
、
（イ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて６番目および８番目のＸａａが、それぞれ
、システインを除く任意のアミノ酸である、
（ウ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１１番目のＸａａが、チロシン、セリン、
フェニルアラニン、ロイシンおよびスレオニンからなる群より選択されるアミノ酸である
、
（エ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１２番目のＸａａが、アスパラギン、アス
パラギン酸、ロイシン、リジン、グルタミン、アラニンおよびグルタミン酸からなる群よ
り選択されるアミノ酸である：
および、
（ｉｉ）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列において、アミノ末端から数えて１
番目乃至１２番目のＸａａ以外の、１個以上５個以下のアミノ酸が保存的アミノ酸置換、
欠失、付加および／または挿入してなるアミノ酸配列を含むペプチド、
（５０）
保存的アミノ酸置換が、疎水性アミノ酸グループ、中性親水性アミノ酸グループ、酸性
アミノ酸グループ、塩基性アミノ酸グループ、主鎖の方角に影響を与えるアミノ酸のグル
ープ、および、芳香族アミノ酸グループから選択されるいずれかのグループ内において行
われることを特徴とする、（４９）記載のペプチド、
【0012】
（５１）
下記（ア）乃至（シ）である、（４９）又は（５０）に記載のペプチド：
（ア）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１番目のＸａａが、アルギニン、メチオニ
ン、ロイシン、トリプトファンおよびセリンからなる群より選択されるアミノ酸である、
（イ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて２番目のＸａａが、スレオニン、アルギニ
ン、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸である、
（ウ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて３番目のＸａａが、アルギニン、ヒスチジ
ン、トリプトファン、セリンおよびフェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸
である、
（エ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて４番目のＸａａが、トリプトファン、アル
ギニンおよびロイシンからなる群より選択されるアミノ酸である、
（オ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて５番目のＸａａが、グリシン、アルギニン
、ロイシン、ヒスチジン、トリプトファン、メチオニンおよびチロシンからなる群から選
択されるアミノ酸である、
（カ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて６番目のＸａａが、アスパラギン、ヒスチ
ジン、プロリン、リジン、トリプトファン、アルギニンおよびアスパラギン酸からなる群
から選択されるアミノ酸である、
（キ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて７番目のＸａａが、アルギニン、フェニル
アラニン、トリプトファン、ロイシン、アラニンおよびグリシンからなる群から選択され
るアミノ酸である、
（ク）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて８番目のＸａａが、スレオニン、プロリン
、アスパラギンおよびセリンからなる群から選択されるアミノ酸である、
（ケ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて９番目のＸａａが、トリプトファン、メチ
オニン、チロシンおよびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸である、
（コ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１０番目のＸａａが、グルタミン、バリン
、リジン、メチオニン、アラニン、ロイシンおよびアスパラギンからなる群から選択され
るアミノ酸である、
（サ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１１番目のＸａａが、チロシン、フェニル
アラニンおよびロイシンからなる群から選択されるアミノ酸である、
（シ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１２番目のＸａａがリジンである、
（５２）
（４９）乃至（５１）のいずれか一つに記載のペプチドに化学的修飾および／または生
物学的修飾が施されてなる該ペプチドの誘導体、
（５３）
予め決定された標的分子に結合する、（４９）乃至（５１）のいずれか一つに記載のペ
プチド、または、（５２）記載のペプチドの誘導体、
および、
（５４）
標的分子がＳＰＩＮＫ２の内在性の標的ではないことを特徴とする、（５３）記載のペ
プチドまたはペプチドの誘導体、
等に関するがそれらに限定されるものではない。
下記（ア）乃至（シ）である、（４９）又は（５０）に記載のペプチド：
（ア）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１番目のＸａａが、アルギニン、メチオニ
ン、ロイシン、トリプトファンおよびセリンからなる群より選択されるアミノ酸である、
（イ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて２番目のＸａａが、スレオニン、アルギニ
ン、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸である、
（ウ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて３番目のＸａａが、アルギニン、ヒスチジ
ン、トリプトファン、セリンおよびフェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸
である、
（エ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて４番目のＸａａが、トリプトファン、アル
ギニンおよびロイシンからなる群より選択されるアミノ酸である、
（オ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて５番目のＸａａが、グリシン、アルギニン
、ロイシン、ヒスチジン、トリプトファン、メチオニンおよびチロシンからなる群から選
択されるアミノ酸である、
（カ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて６番目のＸａａが、アスパラギン、ヒスチ
ジン、プロリン、リジン、トリプトファン、アルギニンおよびアスパラギン酸からなる群
から選択されるアミノ酸である、
（キ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて７番目のＸａａが、アルギニン、フェニル
アラニン、トリプトファン、ロイシン、アラニンおよびグリシンからなる群から選択され
るアミノ酸である、
（ク）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて８番目のＸａａが、スレオニン、プロリン
、アスパラギンおよびセリンからなる群から選択されるアミノ酸である、
（ケ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて９番目のＸａａが、トリプトファン、メチ
オニン、チロシンおよびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸である、
（コ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１０番目のＸａａが、グルタミン、バリン
、リジン、メチオニン、アラニン、ロイシンおよびアスパラギンからなる群から選択され
るアミノ酸である、
（サ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１１番目のＸａａが、チロシン、フェニル
アラニンおよびロイシンからなる群から選択されるアミノ酸である、
（シ）
配列表の配列番号１のアミノ末端から数えて１２番目のＸａａがリジンである、
（５２）
（４９）乃至（５１）のいずれか一つに記載のペプチドに化学的修飾および／または生
物学的修飾が施されてなる該ペプチドの誘導体、
（５３）
予め決定された標的分子に結合する、（４９）乃至（５１）のいずれか一つに記載のペ
プチド、または、（５２）記載のペプチドの誘導体、
および、
（５４）
標的分子がＳＰＩＮＫ２の内在性の標的ではないことを特徴とする、（５３）記載のペ
プチドまたはペプチドの誘導体、
等に関するがそれらに限定されるものではない。
【発明の効果】
【0013】
本発明により、所望の標的分子に結合するペプチドを選抜するのに有用なペプチド・ラ
イブラリーを提供することが可能となる。
イブラリーを提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】標的分子であるα－ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎに対するパニングから得られたＳＰＩＮＫ２変異体（ポリクローン）をファージに提示し、該標的分子に結合することをＥＬＩＳＡ法により確認した図。陰性対象の分子としては、ＢＳＡを用いた。
【図2】標的分子であるｐｌａｓｍａ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎに対するパニングから得られたＳＰＩＮＫ２変異体（ポリクローン）をファージに提示し、該標的分子に結合することをＥＬＩＳＡ法により確認した図。陰性対象の分子としては、ＢＳＡを用いた。
【図3】標的分子であるｈＥＧＦＲ／Ｆｃに対するパニングから得られたＳＰＩＮＫ２変異体（ポリクローン）をファージに提示し、該標的分子に結合することをＥＬＩＳＡ法により確認した図。陰性対象の分子としては、ＢＳＡを用いた。
【図4】標的分子であるｈＨＥＲ２／Ｆｃに対するパニングから得られたＳＰＩＮＫ２変異体（ポリクローン）をファージに提示し、該標的分子に結合することをＥＬＩＳＡ法により確認した図。陰性対象の分子としては、ＢＳＡを用いた。
【図5】大腸菌で発現精製したα―ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ結合ペプチド（シングルクローン）の分子状態を還元状態下のＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した図。
【図6】大腸菌で発現精製したα―ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ結合ペプチド（シングルクローン）の分子状態を非還元状態下のＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した図。
【図7】大腸菌で発現精製したα－ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ結合ペプチド８種類の結合親和性をＥＬＩＳＡ法により定量的に測定した図。
【図8】大腸菌で発現精製したα－ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ結合ペプチド番号２および６（ｃｌｏｎｅ２および６）の結合親和性をＥＬＩＳＡ法により定量的に測定した図。
【図9】大腸菌で発現精製したα－ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ結合ペプチド番号２（ｃｌｏｎｅ２）の標的特異性をＥＬＩＳＡ法により確認した図。
【図10】大腸菌で発現精製したα－ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ結合ペプチド番号６（ｃｌｏｎｅ６）の標的特異性をＥＬＩＳＡ法により確認した図。
【図11】大腸菌で発現精製したα－ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ結合ペプチド番号２および６（ｃｌｏｎｅ２および６）のｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ阻害活性を定量的に測定した図。
【図12】ＳＰＩＮＫ２変異体８種類（α－ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ結合ペプチド番号１、２、６、７、１２乃至１４および１７）のランダム領域のアミノ酸配列（配列番号２乃至９）。
【図13】多様性を伴うペプチドのランダム領域のアミノ酸配列（配列番号１）。アミノ酸番号２乃至８及び１０乃至１４は任意のアミノ酸を示す。
【図14】断片１の塩基配列（配列番号１０）
【図15-4】ｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ の塩基配列
【図16】断片３の塩基配列（配列番号１２）
【図17】断片５の塩基配列（配列番号１３）
【図18】ＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号１４）
【図20-2】断片１～断片５を含むＰＣＲ用鋳型ＤＮＡの塩基配列（配列番号１６：続き）
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明は、ペプチド、ペプチド誘導体、ペプチド・ライブラリー、ヌクレオチド、ベク
ター、細胞、ペプチドおよび／またはその誘導体の製造方法、所望の性質を有するペプチ
ドおよび／またはその誘導体の同定方法、所望の性質を有するペプチドおよび／またはそ
の誘導体の製造方法、被検ペプチドまたはその誘導体が標的分子に結合するか否かを判定
する方法、ヌクレオチド・ライブラリー、組成物、試薬等を提供する。本発明の様々な態
様について以下に述べるが、本発明の態様はそれらに限定されるものではない。
ター、細胞、ペプチドおよび／またはその誘導体の製造方法、所望の性質を有するペプチ
ドおよび／またはその誘導体の同定方法、所望の性質を有するペプチドおよび／またはそ
の誘導体の製造方法、被検ペプチドまたはその誘導体が標的分子に結合するか否かを判定
する方法、ヌクレオチド・ライブラリー、組成物、試薬等を提供する。本発明の様々な態
様について以下に述べるが、本発明の態様はそれらに限定されるものではない。
【0016】
１．ペプチド
本発明はペプチドを提供する。
本発明はペプチドを提供する。
【0017】
本発明の「ペプチド」は、「ポリペプチド」、「蛋白質」をもその意味に包含する。ま
た、本発明において、かかる「ペプチド」は、「ペプチドの誘導体に含まれるペプチド」
をもその意味に包含する。
た、本発明において、かかる「ペプチド」は、「ペプチドの誘導体に含まれるペプチド」
をもその意味に包含する。
【0018】
本発明の一つの態様において、ペプチドは、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配
列を含む。かかるペプチドに含まれる配列番号１で示されるアミノ酸配列において アミ
ノ末端から数えて１番目乃至１２番目のＸａａは、それぞれ、任意のアミノ酸であるが、
好適にはシステインを除く任意のアミノ酸である。
列を含む。かかるペプチドに含まれる配列番号１で示されるアミノ酸配列において アミ
ノ末端から数えて１番目乃至１２番目のＸａａは、それぞれ、任意のアミノ酸であるが、
好適にはシステインを除く任意のアミノ酸である。
【0019】
本発明のより好適な態様において、本発明のペプチドの有するアミノ酸配列に含まれる
、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列中、アミノ末端から数えて１乃至５番目、
７番目、９番目および１０番目のＸａａ（配列番号１の２乃至６番目、８番目、１１番目
および１２番目のアミノ酸にそれぞれ相当する）は、システインおよびプロリンを除く任
意のアミノ酸である； アミノ末端から数えて６番目および８番目のＸａａ（配列番号１
の７番目および１０番目のアミノ酸にそれぞれ相当する）は、システインを除く任意のア
ミノ酸である； アミノ末端から数えて１１番目のＸａａ（配列番号１の１３番目のアミ
ノ酸に相当する）は、チロシン、セリン、フェニルアラニン、ロイシンおよびスレオニン
からなる群より選択されるアミノ酸である； アミノ末端から数えて１２番目のＸａａ（
配列番号１の１４番目のアミノ酸に相当する）は、アスパラギン、アスパラギン酸、ロイ
シン、リジン、グルタミン、アラニンおよびグルタミン酸からなる群より選択されるアミ
ノ酸である； また、アミノ末端から数えて１番目乃至１２番目のＸａａは、本段落に記
載された各群から選択されるアミノ酸が、保存的アミノ酸置換されたもの（本発明の他の
部分に詳述されている）であってもよい。
、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列中、アミノ末端から数えて１乃至５番目、
７番目、９番目および１０番目のＸａａ（配列番号１の２乃至６番目、８番目、１１番目
および１２番目のアミノ酸にそれぞれ相当する）は、システインおよびプロリンを除く任
意のアミノ酸である； アミノ末端から数えて６番目および８番目のＸａａ（配列番号１
の７番目および１０番目のアミノ酸にそれぞれ相当する）は、システインを除く任意のア
ミノ酸である； アミノ末端から数えて１１番目のＸａａ（配列番号１の１３番目のアミ
ノ酸に相当する）は、チロシン、セリン、フェニルアラニン、ロイシンおよびスレオニン
からなる群より選択されるアミノ酸である； アミノ末端から数えて１２番目のＸａａ（
配列番号１の１４番目のアミノ酸に相当する）は、アスパラギン、アスパラギン酸、ロイ
シン、リジン、グルタミン、アラニンおよびグルタミン酸からなる群より選択されるアミ
ノ酸である； また、アミノ末端から数えて１番目乃至１２番目のＸａａは、本段落に記
載された各群から選択されるアミノ酸が、保存的アミノ酸置換されたもの（本発明の他の
部分に詳述されている）であってもよい。
【0020】
本発明のより一層好適な態様において、本発明のペプチドの有するアミノ酸配列に含ま
れる、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列中、アミノ末端から数えて１番目のＸ
ａａ（配列番号１の２番目のアミノ酸に相当する）は、アルギニン、メチオニン、ロイシ
ン、トリプトファンおよびセリンからなる群より選択されるアミノ酸である； アミノ末
端から数えて２番目のＸａａ（配列番号１の３番目のアミノ酸に相当する）は、スレオニ
ン、アルギニン、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群より選択されるアミ
ノ酸である； アミノ末端から数えて３番目のＸａａ（配列番号１の４番目のアミノ酸に
相当する）は、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、セリンおよびファニルアラニ
ンからなる群より選択されるアミノ酸である； アミノ末端から数えて４番目のＸａａ（
配列番号１の５番目のアミノ酸に相当する）は、トリプトファン、アルギニンおよびロイ
シンからなる群より選択されるアミノ酸である； アミノ末端から数えて５番目のＸａａ
（配列番号１の６番目のアミノ酸に相当する）は、グルシン、アルギニン、ロイシン、ヒ
スチジン、トリプトファン、メチオニンおよびチロシンからなる群より選択されるアミノ
酸である； アミノ末端から数えて６番目のＸａａ（配列番号１の７番目のアミノ酸に相
当する）は、アスパラギン、ヒスチジン、プロリン、リジン、トリプトファン、アルギニ
ンおよびアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸である； アミノ末端から数
えて７番目のＸａａ（配列番号１の８番目のアミノ酸に相当する）は、アルギニン、フェ
ニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、アラニンおよびグリシンからなる群より選択
されるアミノ酸である； アミノ末端から数えて８番目のＸａａ（配列番号１の１０番目
のアミノ酸に相当する）は、スレオニン、プロリン、アスパラギンおよびセリンからなる
群より選択されるアミノ酸である； アミノ末端から数えて９番目のＸａａ（配列番号１
の１１番目のアミノ酸に相当する）は、トリプトファン、メチオニン、チロシンおよびフ
ェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸である； アミノ末端から数えて１０
番目のＸａａ（配列番号１の１２番目のアミノ酸に相当する）は、グルタミン、バリン、
リジン、メチオニン、アラニン、ロイシンおよびアスパラギンからなる群より選択される
アミノ酸である； アミノ末端から数えて１１番目のＸａａ（配列番号１の１３番目のア
ミノ酸に相当する）は、チロシン、フェニルアラニンおよびロイシンからなる群より選択
されるアミノ酸である； アミノ末端から数えて１２番目のＸａａ（配列番号１の１４番
目のアミノ酸に相当する）はリジンである； また、アミノ末端から数えて１番目乃至１
２番目のＸａａは、本段落に記載された各群から選択されるアミノ酸が、保存的アミノ酸
置換されたもの（本発明の他の部分に詳述されている）であってもよい。
れる、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列中、アミノ末端から数えて１番目のＸ
ａａ（配列番号１の２番目のアミノ酸に相当する）は、アルギニン、メチオニン、ロイシ
ン、トリプトファンおよびセリンからなる群より選択されるアミノ酸である； アミノ末
端から数えて２番目のＸａａ（配列番号１の３番目のアミノ酸に相当する）は、スレオニ
ン、アルギニン、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群より選択されるアミ
ノ酸である； アミノ末端から数えて３番目のＸａａ（配列番号１の４番目のアミノ酸に
相当する）は、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、セリンおよびファニルアラニ
ンからなる群より選択されるアミノ酸である； アミノ末端から数えて４番目のＸａａ（
配列番号１の５番目のアミノ酸に相当する）は、トリプトファン、アルギニンおよびロイ
シンからなる群より選択されるアミノ酸である； アミノ末端から数えて５番目のＸａａ
（配列番号１の６番目のアミノ酸に相当する）は、グルシン、アルギニン、ロイシン、ヒ
スチジン、トリプトファン、メチオニンおよびチロシンからなる群より選択されるアミノ
酸である； アミノ末端から数えて６番目のＸａａ（配列番号１の７番目のアミノ酸に相
当する）は、アスパラギン、ヒスチジン、プロリン、リジン、トリプトファン、アルギニ
ンおよびアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸である； アミノ末端から数
えて７番目のＸａａ（配列番号１の８番目のアミノ酸に相当する）は、アルギニン、フェ
ニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、アラニンおよびグリシンからなる群より選択
されるアミノ酸である； アミノ末端から数えて８番目のＸａａ（配列番号１の１０番目
のアミノ酸に相当する）は、スレオニン、プロリン、アスパラギンおよびセリンからなる
群より選択されるアミノ酸である； アミノ末端から数えて９番目のＸａａ（配列番号１
の１１番目のアミノ酸に相当する）は、トリプトファン、メチオニン、チロシンおよびフ
ェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸である； アミノ末端から数えて１０
番目のＸａａ（配列番号１の１２番目のアミノ酸に相当する）は、グルタミン、バリン、
リジン、メチオニン、アラニン、ロイシンおよびアスパラギンからなる群より選択される
アミノ酸である； アミノ末端から数えて１１番目のＸａａ（配列番号１の１３番目のア
ミノ酸に相当する）は、チロシン、フェニルアラニンおよびロイシンからなる群より選択
されるアミノ酸である； アミノ末端から数えて１２番目のＸａａ（配列番号１の１４番
目のアミノ酸に相当する）はリジンである； また、アミノ末端から数えて１番目乃至１
２番目のＸａａは、本段落に記載された各群から選択されるアミノ酸が、保存的アミノ酸
置換されたもの（本発明の他の部分に詳述されている）であってもよい。
【0021】
さらに、本発明のある好適な態様において、本発明のペプチドは、配列表の配列番号１
で示されるアミノ酸配列に加え、当該アミノ酸配列のアミノ末端側に、直接あるいは１又
は２個以上の任意のアミノ酸を挟んで、配列表の配列番号１４の第１番塩基グアニン又は
第４番目塩基シトシン乃至第４２番塩基チミンからなる塩基配列によりコードされるアミ
ノ酸配列を、カルボキシル末端側に、直接あるいは１又は２個以上の任意のアミノ酸を挟
んで、配列表の配列番号１４の第９４番塩基グアニン乃至１８９番塩基シトシンからなる
塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を、それぞれ含んでいてもよい。かかるペプチ
ドの有するアミノ酸配列においては、配列表の配列番号１４の第１番塩基グアニン乃至第
３番塩基チミンによりコードされるアスパラギン酸は、その対応する位置に含まれていな
くてもよい。また、かかるペプチドの有するアミノ酸配列には、さらに他の任意のアミノ
酸配列が含まれていてもよい。そのようなペプチドとしては、例えば、後述する実施例１
において調製されたランダム変異ＳＰＩＮＫ２ライブラリーに含まれるペプチド、該ライ
ブラリーから実施例３において選別され、ランダム領域のアミノ酸配列が決定されたペプ
チド等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
で示されるアミノ酸配列に加え、当該アミノ酸配列のアミノ末端側に、直接あるいは１又
は２個以上の任意のアミノ酸を挟んで、配列表の配列番号１４の第１番塩基グアニン又は
第４番目塩基シトシン乃至第４２番塩基チミンからなる塩基配列によりコードされるアミ
ノ酸配列を、カルボキシル末端側に、直接あるいは１又は２個以上の任意のアミノ酸を挟
んで、配列表の配列番号１４の第９４番塩基グアニン乃至１８９番塩基シトシンからなる
塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を、それぞれ含んでいてもよい。かかるペプチ
ドの有するアミノ酸配列においては、配列表の配列番号１４の第１番塩基グアニン乃至第
３番塩基チミンによりコードされるアスパラギン酸は、その対応する位置に含まれていな
くてもよい。また、かかるペプチドの有するアミノ酸配列には、さらに他の任意のアミノ
酸配列が含まれていてもよい。そのようなペプチドとしては、例えば、後述する実施例１
において調製されたランダム変異ＳＰＩＮＫ２ライブラリーに含まれるペプチド、該ライ
ブラリーから実施例３において選別され、ランダム領域のアミノ酸配列が決定されたペプ
チド等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
【0022】
また、本発明のある態様において、ペプチドの有するアミノ酸配列に含まれる、配列表
の配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ末端から数えて１番目乃至１２番目のＸａ
ａ以外のアミノ酸は置換、欠失、付加および／又は挿入されていてもよい。かかるアミノ
酸配列において、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列または該配列に対応するア
ミノ酸配列のアミノ末端から数えて１番目乃至１２番目のＸａａ以外の、置換、欠失、付
加および／又は挿入されたアミノ酸の数は、１個以上１０個以下であればよく、その下限
は１個である。その上限は１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個で
あり、最小１個である。かかるアミノ酸の置換は、好適には保存的アミノ酸置換である。
の配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ末端から数えて１番目乃至１２番目のＸａ
ａ以外のアミノ酸は置換、欠失、付加および／又は挿入されていてもよい。かかるアミノ
酸配列において、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列または該配列に対応するア
ミノ酸配列のアミノ末端から数えて１番目乃至１２番目のＸａａ以外の、置換、欠失、付
加および／又は挿入されたアミノ酸の数は、１個以上１０個以下であればよく、その下限
は１個である。その上限は１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個で
あり、最小１個である。かかるアミノ酸の置換は、好適には保存的アミノ酸置換である。
【0023】
かかるアミノ酸配列において、配列番号１で示されるアミノ酸配列または該配列に対応
するアミノ酸配列のアミノ末端から数えて１番目乃至１２番目のＸａａは、それぞれ、任
意のアミノ酸であるが、好適にはシステインを除く任意のアミノ酸であり、より好適には
、前記の各群から選択されるアミノ酸であるか、あるいは該アミノ酸が保存的アミノ酸置
換されたものである。
するアミノ酸配列のアミノ末端から数えて１番目乃至１２番目のＸａａは、それぞれ、任
意のアミノ酸であるが、好適にはシステインを除く任意のアミノ酸であり、より好適には
、前記の各群から選択されるアミノ酸であるか、あるいは該アミノ酸が保存的アミノ酸置
換されたものである。
【0024】
「保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓ
ｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、機能的に等価または類似のアミノ酸との置換を意味する。ペ
プチドにおける保存的アミノ酸置換は、該ペプチドのアミノ酸配列に静的変化をもたらす
。例えば、同様の極性を有する一つまたは二つ以上のアミノ酸は機能的に等価に作用し、
かかるペプチドのアミノ酸配列に静的変化をもたらす。一般に、あるグループ内の置換は
構造および機能について保存的であると考えることができる。しかしながら、当業者には
自明であるように、特定のアミノ酸残基が果たす役割は当該アミノ酸を含む分子の三次元
構造における意味合いにおいて決定され得る。例えば、システイン残基は、還元型の（チ
オール）フォームと比較してより極性の低い、酸化型の（ジスルフィド）フォームをとる
ことができる。アルギニン側鎖の長い脂肪族の部分は構造的および機能的に重要な特徴を
構成し得る。また、芳香環を含む側鎖（トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン）
はイオン－芳香族相互作用または陽イオン－ｐｉ相互作用に寄与し得る。かかる場合にお
いて、これらの側鎖を有するアミノ酸を、酸性または非極性グループに属するアミノ酸と
置換しても、構造的および機能的には保存的であり得る。プロリン、グリシン、システイ
ン（ジスルフィド・フォーム）等の残基は主鎖の立体構造に直接的な効果を与える可能性
があり、しばしば構造的ゆがみなしに置換することはできない。
ｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、機能的に等価または類似のアミノ酸との置換を意味する。ペ
プチドにおける保存的アミノ酸置換は、該ペプチドのアミノ酸配列に静的変化をもたらす
。例えば、同様の極性を有する一つまたは二つ以上のアミノ酸は機能的に等価に作用し、
かかるペプチドのアミノ酸配列に静的変化をもたらす。一般に、あるグループ内の置換は
構造および機能について保存的であると考えることができる。しかしながら、当業者には
自明であるように、特定のアミノ酸残基が果たす役割は当該アミノ酸を含む分子の三次元
構造における意味合いにおいて決定され得る。例えば、システイン残基は、還元型の（チ
オール）フォームと比較してより極性の低い、酸化型の（ジスルフィド）フォームをとる
ことができる。アルギニン側鎖の長い脂肪族の部分は構造的および機能的に重要な特徴を
構成し得る。また、芳香環を含む側鎖（トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン）
はイオン－芳香族相互作用または陽イオン－ｐｉ相互作用に寄与し得る。かかる場合にお
いて、これらの側鎖を有するアミノ酸を、酸性または非極性グループに属するアミノ酸と
置換しても、構造的および機能的には保存的であり得る。プロリン、グリシン、システイ
ン（ジスルフィド・フォーム）等の残基は主鎖の立体構造に直接的な効果を与える可能性
があり、しばしば構造的ゆがみなしに置換することはできない。
【0025】
保存的アミノ酸置換は、以下に示すとおり、側鎖の類似性に基づく特異的置換（レーニ
ンジャ、生化学、改訂第２版、１９７５年刊行、７３乃至７５頁：Ｌ． Ｌｅｈｎｉｎｇ
ｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ｐｐ７３－７５，
Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９７５））および典型的置
換を含む。
ンジャ、生化学、改訂第２版、１９７５年刊行、７３乃至７５頁：Ｌ． Ｌｅｈｎｉｎｇ
ｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ｐｐ７３－７５，
Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９７５））および典型的置
換を含む。
【0026】
（１）非極性アミノ酸グループ：アラニン（以下、「Ａｌａ」または単に「Ａ」と記す）
、バリン（以下、「Ｖａｌ」または単に「Ｖ」と記す）、ロイシン（以下、「Ｌｅｕ」ま
たは単に「Ｌ」と記す）、イソロイシン（以下、「Ｉｌｅ」または単に「Ｉ」と記す）、
プロリン（以下、「Ｐｒｏ」または単に「Ｐ」と記す）、フェニルアラニン（「Ｐｈｅ」
または単に「Ｆ」と記す）、トリプトファン（以下、「Ｔｒｐ」または単に「Ｗ」と記す
）、メチオニン（以下、「Ｍｅｔ」または単に「Ｍ」と記す）
（２）非荷電極性アミノ酸グループ：グリシン（以下、「Ｇｌｙ」または単に「Ｇ」と記
す）、セリン（以下、「Ｓｅｒ」または単に「Ｓ」と記す）、スレオニン（以下、「Ｔｈ
ｒ」または単に「Ｔ」と記す）、システイン（以下、「Ｃｙｓ」または単に「Ｃ」と記す
）、チロシン（以下、「Ｔｙｒ」または単に「Ｙ」と記す）、アスパラギン（以下、「Ａ
ｓｎ」または単に「Ｎ」と記す）、グルタミン（以下、「Ｇｌｎ」または単に「Ｑ」と記
す）
（３）酸性アミノ酸グループ：アスパラギン酸（以下、「Ａｓｐ」または単に「Ｄ」と記
す）、グルタミン酸（以下、「Ｇｌｕ」または単に「Ｅ」と記す）
（４）塩基性アミノ酸グループ：リジン（以下、「Ｌｙｓ」または単に「Ｋ」と記す）、
アルギニン（以下、「Ａｒｇ」または単に「Ｒ」と記す）、ヒスチジン（以下、「Ｈｉｓ
」または単に「Ｈ」と記す）
、バリン（以下、「Ｖａｌ」または単に「Ｖ」と記す）、ロイシン（以下、「Ｌｅｕ」ま
たは単に「Ｌ」と記す）、イソロイシン（以下、「Ｉｌｅ」または単に「Ｉ」と記す）、
プロリン（以下、「Ｐｒｏ」または単に「Ｐ」と記す）、フェニルアラニン（「Ｐｈｅ」
または単に「Ｆ」と記す）、トリプトファン（以下、「Ｔｒｐ」または単に「Ｗ」と記す
）、メチオニン（以下、「Ｍｅｔ」または単に「Ｍ」と記す）
（２）非荷電極性アミノ酸グループ：グリシン（以下、「Ｇｌｙ」または単に「Ｇ」と記
す）、セリン（以下、「Ｓｅｒ」または単に「Ｓ」と記す）、スレオニン（以下、「Ｔｈ
ｒ」または単に「Ｔ」と記す）、システイン（以下、「Ｃｙｓ」または単に「Ｃ」と記す
）、チロシン（以下、「Ｔｙｒ」または単に「Ｙ」と記す）、アスパラギン（以下、「Ａ
ｓｎ」または単に「Ｎ」と記す）、グルタミン（以下、「Ｇｌｎ」または単に「Ｑ」と記
す）
（３）酸性アミノ酸グループ：アスパラギン酸（以下、「Ａｓｐ」または単に「Ｄ」と記
す）、グルタミン酸（以下、「Ｇｌｕ」または単に「Ｅ」と記す）
（４）塩基性アミノ酸グループ：リジン（以下、「Ｌｙｓ」または単に「Ｋ」と記す）、
アルギニン（以下、「Ａｒｇ」または単に「Ｒ」と記す）、ヒスチジン（以下、「Ｈｉｓ
」または単に「Ｈ」と記す）
【0027】
また、天然界に存在するアミノ酸は、その共通する側鎖の性質に基づいて次のようなグ
ループに分けることができる。
（１）疎水性アミノ酸グループ：ノルロイシン（Ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）、Ｍｅｔ、Ａｌ
ａ、Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ
（２）中性親水性アミノ酸グループ：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性アミノ酸グループ：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性アミノ酸グループ：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）主鎖の方角に影響を与えるアミノ酸のグループ：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族アミノ酸グループ：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
以下に、保存的置換の例を示すが、本発明の保存的アミノ酸置換はこれらに限定される
ものではない。
ループに分けることができる。
（１）疎水性アミノ酸グループ：ノルロイシン（Ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）、Ｍｅｔ、Ａｌ
ａ、Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ
（２）中性親水性アミノ酸グループ：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性アミノ酸グループ：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性アミノ酸グループ：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）主鎖の方角に影響を与えるアミノ酸のグループ：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族アミノ酸グループ：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
以下に、保存的置換の例を示すが、本発明の保存的アミノ酸置換はこれらに限定される
ものではない。
【0028】
Ａｌａは、例えば、Ｖａｌ，Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、ノルロイシン、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ
、Ｔｒｐと置換し得る。
Ａｒｇは、例えば、Ｌｙｓ、Ｈｉｓと置換し得る。
Ａｓｎは、例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙと置換し得る。
Ａｓｐは、例えば、Ｇｌｕと置換し得る。
Ｃｙｓは、例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎと置換し得る。
Ｇｌｎは、例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎと置換し得る。
Ｇｌｕは、例えば、Ａｓｐと置換し得る。
Ｇｌｙは、例えば、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｓ
ｐ、Ｇｌｕと置換し得る。
Ｈｉｓは、例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇと置換し得る。
Ｉｌｅは、例えば、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、ノル
ロイシンと置換し得る。
Ｌｅｕは、例えば、ノルロイシン、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ
、Ｔｒｐ、Ｍｅｔと置換し得る
Ｌｙｓは、例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓと置換し得る。
Ｍｅｔは、例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、ノル
ロイシンと置換し得る。
ノルロイシンは、例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ
、Ｔｒｐと置換し得る。
Ｐｈｅは、例えば、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｍｅ
ｔと置換し得る。
Ｐｒｏは、例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｇｌ
ｙと置換し得る。
Ｓｅｒは、例えば、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒと置換し得る。
Ｔｈｒは、例えば、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎと置換
し得る。
Ｔｒｐは、例えば、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅ
ｔと置換し得る。
Ｔｙｒは、例えば、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｓｅ
ｒと置換し得る。
Ｖａｌは、例えば、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、ノルロイシン
、Ｐｒｏと置換し得る。
、Ｔｒｐと置換し得る。
Ａｒｇは、例えば、Ｌｙｓ、Ｈｉｓと置換し得る。
Ａｓｎは、例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙと置換し得る。
Ａｓｐは、例えば、Ｇｌｕと置換し得る。
Ｃｙｓは、例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎと置換し得る。
Ｇｌｎは、例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎと置換し得る。
Ｇｌｕは、例えば、Ａｓｐと置換し得る。
Ｇｌｙは、例えば、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｓ
ｐ、Ｇｌｕと置換し得る。
Ｈｉｓは、例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇと置換し得る。
Ｉｌｅは、例えば、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、ノル
ロイシンと置換し得る。
Ｌｅｕは、例えば、ノルロイシン、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ
、Ｔｒｐ、Ｍｅｔと置換し得る
Ｌｙｓは、例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓと置換し得る。
Ｍｅｔは、例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、ノル
ロイシンと置換し得る。
ノルロイシンは、例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ
、Ｔｒｐと置換し得る。
Ｐｈｅは、例えば、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｍｅ
ｔと置換し得る。
Ｐｒｏは、例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｇｌ
ｙと置換し得る。
Ｓｅｒは、例えば、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒと置換し得る。
Ｔｈｒは、例えば、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎと置換
し得る。
Ｔｒｐは、例えば、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅ
ｔと置換し得る。
Ｔｙｒは、例えば、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｓｅ
ｒと置換し得る。
Ｖａｌは、例えば、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、ノルロイシン
、Ｐｒｏと置換し得る。
【0029】
かかるアミノ酸から構成されるアミノ酸配列を有する、本発明のペプチドの有するアミ
ノ酸配列に含まれるアミノ酸配列（配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列に対応す
る：ランダム領域）の例としては、以下のものを挙げることができるが、本発明のペプチ
ドの有するアミノ酸配列はこれらに限定されるものではない。
ノ酸配列に含まれるアミノ酸配列（配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列に対応す
る：ランダム領域）の例としては、以下のものを挙げることができるが、本発明のペプチ
ドの有するアミノ酸配列はこれらに限定されるものではない。
【0030】
ＣＲＴＲＷ ＧＮＲＣＴ ＷＱＹＫＰ ＶＣ （配列表の配列番号２： 図１２のα－キ
モトリプシン結合ペプチド１番）
ＣＭＲＨＲ ＲＨＦＣＴ ＭＶＹＫＰ ＶＣ （配列表の配列番号３： 図１２のα－キ
モトリプシン結合ペプチド２番）
ＣＲＲＷＬ ＬＰＷＣＴ ＹＫＹＫＰ ＶＣ （配列表の配列番号４： 図１２のα－キ
モトリプシン結合ペプチド６番）
ＣＬＷＲＲ ＨＫＬＣＰ ＦＫＦＫＰ ＶＣ （配列表の配列番号５： 図１２のα－キ
モトリプシン結合ペプチド７番）
ＣＷＲＳＷ ＲＷＡＣＰ ＹＭＹＫＰ ＶＣ （配列表の配列番号６： 図１２のα－キ
モトリプシン結合ペプチド１２番）
ＣＷＦＦＲ ＷＲＷＣＮ ＷＡＬＫＰ ＶＣ （配列表の配列番号７： 図１２のα－キ
モトリプシン結合ペプチド１３番）
ＣＳＴＷＲ ＭＷＧＣＰ ＷＬＹＫＰ ＶＣ （配列表の配列番号８： 図１２のα－キ
モトリプシン結合ペプチド１４番）
ＣＷＲＲＷ ＹＤＲＣＳ ＦＮＬＫＰ ＶＣ （配列表の配列番号９： 図１２のα－キ
モトリプシン結合ペプチド１７番）
モトリプシン結合ペプチド１番）
ＣＭＲＨＲ ＲＨＦＣＴ ＭＶＹＫＰ ＶＣ （配列表の配列番号３： 図１２のα－キ
モトリプシン結合ペプチド２番）
ＣＲＲＷＬ ＬＰＷＣＴ ＹＫＹＫＰ ＶＣ （配列表の配列番号４： 図１２のα－キ
モトリプシン結合ペプチド６番）
ＣＬＷＲＲ ＨＫＬＣＰ ＦＫＦＫＰ ＶＣ （配列表の配列番号５： 図１２のα－キ
モトリプシン結合ペプチド７番）
ＣＷＲＳＷ ＲＷＡＣＰ ＹＭＹＫＰ ＶＣ （配列表の配列番号６： 図１２のα－キ
モトリプシン結合ペプチド１２番）
ＣＷＦＦＲ ＷＲＷＣＮ ＷＡＬＫＰ ＶＣ （配列表の配列番号７： 図１２のα－キ
モトリプシン結合ペプチド１３番）
ＣＳＴＷＲ ＭＷＧＣＰ ＷＬＹＫＰ ＶＣ （配列表の配列番号８： 図１２のα－キ
モトリプシン結合ペプチド１４番）
ＣＷＲＲＷ ＹＤＲＣＳ ＦＮＬＫＰ ＶＣ （配列表の配列番号９： 図１２のα－キ
モトリプシン結合ペプチド１７番）
【0031】
本発明において、アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、またはその混合物（ＤＬ
－アミノ酸）であるが、特に明記しない限りＬ－アミノ酸を意味する。
－アミノ酸）であるが、特に明記しない限りＬ－アミノ酸を意味する。
【0032】
また、本発明において、アミノ酸は、上記以外のアミノ酸（以下、便宜的に「異常アミ
ノ酸」と総称する。）であってよい。異常アミノ酸としては、例えば、天然のペプチドや
蛋白質において見出されるセレノシステイン、Ｎ－ホルミルメチオニン、ピロリジン、ピ
ログルタミン酸、シスチン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、チロキシン、Ｏ－
ホスホセリン、デスモシン、β－アラニン、サルコシン、オルニチン、クレアチン、γア
ミノ酪酸、オパイン、テアニン、トリコロミン酸、カイニン酸、ドウモイ酸、アクロメリ
ン酸等を挙げることができ、非天然アミノ酸としては、Ａｃ－アミノ酸、Ｂｏｃ－アミノ
酸、Ｆｍｏｃ－アミノ酸、Ｔｒｔ－アミノ酸、Ｚ－アミノ酸等のＮ末端保護アミノ酸、ア
ミノ酸ｔ－ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、フルオレニル
エステル等のＣ末端保護アミノ酸、ジアミン、ωアミノ酸、βアミノ酸、γアミノ酸、ア
ミノ酸のＴｉｃ誘導体、アミノフォスフォン酸を含むその他のアミノ酸等を挙げることが
できるが、それらに限定されるものではない。
ノ酸」と総称する。）であってよい。異常アミノ酸としては、例えば、天然のペプチドや
蛋白質において見出されるセレノシステイン、Ｎ－ホルミルメチオニン、ピロリジン、ピ
ログルタミン酸、シスチン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、チロキシン、Ｏ－
ホスホセリン、デスモシン、β－アラニン、サルコシン、オルニチン、クレアチン、γア
ミノ酪酸、オパイン、テアニン、トリコロミン酸、カイニン酸、ドウモイ酸、アクロメリ
ン酸等を挙げることができ、非天然アミノ酸としては、Ａｃ－アミノ酸、Ｂｏｃ－アミノ
酸、Ｆｍｏｃ－アミノ酸、Ｔｒｔ－アミノ酸、Ｚ－アミノ酸等のＮ末端保護アミノ酸、ア
ミノ酸ｔ－ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、フルオレニル
エステル等のＣ末端保護アミノ酸、ジアミン、ωアミノ酸、βアミノ酸、γアミノ酸、ア
ミノ酸のＴｉｃ誘導体、アミノフォスフォン酸を含むその他のアミノ酸等を挙げることが
できるが、それらに限定されるものではない。
【0033】
本発明のペプチドは、化学合成、遺伝子組換え、イン・ビトロ翻訳等、ペプチドや蛋白
質を製造する方法として当業者に周知の方法により調製することができる。また、本発明
のライブラリー等から同定または選抜されたペプチドも、それらの方法により調製するこ
とができる。
質を製造する方法として当業者に周知の方法により調製することができる。また、本発明
のライブラリー等から同定または選抜されたペプチドも、それらの方法により調製するこ
とができる。
【0034】
化学合成法としては、例えば、ｔ－ブトキシカルボニル（ｔ－Ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏ
ｎｙｌ：Ｂｏｃ）法、９－フルオレニルメトキシカルボニル（９－Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍ
ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ：Ｆｍｏｃ）法等をあげることができるが、それらに限定
されるものではない。Ｆｍｏｃ法は、脱保護条件が温和であり、樹脂からのペプチドの切
り出しが簡便であること等の特長を有している（Ｆｍｏｃ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐ
ｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，
ｅｄ． ｂｙ Ｗ． Ｃ． Ｃｈａｎ， Ｐ． Ｄ． Ｗｈｉｔｅ Ｅｄｓ．， Ｏｘｆ
ｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２０００．）。
ｎｙｌ：Ｂｏｃ）法、９－フルオレニルメトキシカルボニル（９－Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍ
ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ：Ｆｍｏｃ）法等をあげることができるが、それらに限定
されるものではない。Ｆｍｏｃ法は、脱保護条件が温和であり、樹脂からのペプチドの切
り出しが簡便であること等の特長を有している（Ｆｍｏｃ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐ
ｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，
ｅｄ． ｂｙ Ｗ． Ｃ． Ｃｈａｎ， Ｐ． Ｄ． Ｗｈｉｔｅ Ｅｄｓ．， Ｏｘｆ
ｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２０００．）。
【0035】
本発明において、「ペプチドの誘導体」および「ペプチド誘導体」とは、本発明のペプ
チドに化学的な修飾または生物学的な修飾が施されたものを意味する。化学的な修飾とは
、本発明のペプチド中またはペプチド上において、化学反応、すなわち原子－原子間の結
合の生成若しくは切断により、元のペプチドとは異なる物質に変化させることを意味する
。生物学的修飾とは、本発明のペプチド中またはペプチド上において、生物学的反応、す
なわち生物に由来する蛋白質（酵素、サイトカイン等）、核酸（リボザイム等）、細胞、
組織、器官若しくは非ヒト個体を利用して、またはそれらの直接的または間接的な作用に
より、元のペプチドとは異なる物質を生じさせることを意味する。
チドに化学的な修飾または生物学的な修飾が施されたものを意味する。化学的な修飾とは
、本発明のペプチド中またはペプチド上において、化学反応、すなわち原子－原子間の結
合の生成若しくは切断により、元のペプチドとは異なる物質に変化させることを意味する
。生物学的修飾とは、本発明のペプチド中またはペプチド上において、生物学的反応、す
なわち生物に由来する蛋白質（酵素、サイトカイン等）、核酸（リボザイム等）、細胞、
組織、器官若しくは非ヒト個体を利用して、またはそれらの直接的または間接的な作用に
より、元のペプチドとは異なる物質を生じさせることを意味する。
【0036】
かかる「誘導体」は、元のペプチドとは異なる物質であれば特に限定されるものではな
いが、例えば、天然に生じる糖鎖または人工的に創出された糖鎖を含むもの、ポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）等のポリマーを含むもの、合成化合物または天然化合物を含むも
の、標識されたもの、固相化に必要な部分を含むもの、アミノ末端側にシグナルペプチド
が連結しているもの、精製または単離を行う際に利用するタグを含むもの、ディスプレイ
、パニング、発現等に適したベクターに由来するアミノ酸やアミノ酸配列、フレームシフ
トを回避するため又は制限酵素サイトを導入するために該ペプチドをコードする塩基配列
が改変されることにより生じたアミノ酸やアミノ酸配列、および、表現型であるペプチド
および該表現型に対応する遺伝型が直接的または間接的にリンクしているもの、ならびに
、それらのうち二つ以上を組み合わせたもの等をあげることができる。
いが、例えば、天然に生じる糖鎖または人工的に創出された糖鎖を含むもの、ポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）等のポリマーを含むもの、合成化合物または天然化合物を含むも
の、標識されたもの、固相化に必要な部分を含むもの、アミノ末端側にシグナルペプチド
が連結しているもの、精製または単離を行う際に利用するタグを含むもの、ディスプレイ
、パニング、発現等に適したベクターに由来するアミノ酸やアミノ酸配列、フレームシフ
トを回避するため又は制限酵素サイトを導入するために該ペプチドをコードする塩基配列
が改変されることにより生じたアミノ酸やアミノ酸配列、および、表現型であるペプチド
および該表現型に対応する遺伝型が直接的または間接的にリンクしているもの、ならびに
、それらのうち二つ以上を組み合わせたもの等をあげることができる。
【0037】
本発明のペプチド誘導体は、本発明のペプチドを原料として、化学反応、生化学反応、
翻訳後修飾等、ペプチドや蛋白質を化学的または生物学的に修飾する方法として当業者に
周知の方法に供することにより、調製することができる。また、本発明のライブラリー等
から同定または選抜されたペプチドの誘導体も、それらの方法により調製することができ
る。また、所望の翻訳後修飾能を有する細胞を用いた遺伝子組換えによっても、かかる翻
訳後修飾が施された本発明のペプチド誘導体を調製することができる。さらに、イン・ビ
トロ翻訳系に修飾アミノ酸を添加することにより、該修飾アミノ酸を含む本発明のペプチ
ド誘導体を調製することができる。
翻訳後修飾等、ペプチドや蛋白質を化学的または生物学的に修飾する方法として当業者に
周知の方法に供することにより、調製することができる。また、本発明のライブラリー等
から同定または選抜されたペプチドの誘導体も、それらの方法により調製することができ
る。また、所望の翻訳後修飾能を有する細胞を用いた遺伝子組換えによっても、かかる翻
訳後修飾が施された本発明のペプチド誘導体を調製することができる。さらに、イン・ビ
トロ翻訳系に修飾アミノ酸を添加することにより、該修飾アミノ酸を含む本発明のペプチ
ド誘導体を調製することができる。
【0038】
ＰＥＧ化の方法としては、例えば、ペプチドまたは蛋白質とＮ－Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃ
ｃｉｍｉｄｅ Ｅｓｔｅｒ（ＮＨＳ）－ＰＥＧとを反応させる方法等をあげることができ
るが、それに限定されるものではない。
ｃｉｍｉｄｅ Ｅｓｔｅｒ（ＮＨＳ）－ＰＥＧとを反応させる方法等をあげることができ
るが、それに限定されるものではない。
【0039】
本発明のペプチドおよびその誘導体は、好適な態様において、標的分子（本発明の他の
箇所において詳細に記載されている）に結合する。予め決定された標的分子に結合する本
発明のペプチドは、当該標的分子がマーカーとなり得る各種疾患の検査用の試薬等として
有用である。前述のとおり、本発明には、ペプチドの有するアミノ酸配列に含まれる、配
列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ末端から数えて１番目乃至１２番目の
Ｘａａ以外１乃至数個（数個は１乃至１０個の任意に整数個）のアミノ酸が置換、欠失、
付加および／又は挿入されてなるアミノ酸配列を有するペプチドが含まれるが、かかるペ
プチドはその好適な態様において標的分子に結合し、かかる標的分子は予め決定されてい
ることが好ましい。
箇所において詳細に記載されている）に結合する。予め決定された標的分子に結合する本
発明のペプチドは、当該標的分子がマーカーとなり得る各種疾患の検査用の試薬等として
有用である。前述のとおり、本発明には、ペプチドの有するアミノ酸配列に含まれる、配
列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ末端から数えて１番目乃至１２番目の
Ｘａａ以外１乃至数個（数個は１乃至１０個の任意に整数個）のアミノ酸が置換、欠失、
付加および／又は挿入されてなるアミノ酸配列を有するペプチドが含まれるが、かかるペ
プチドはその好適な態様において標的分子に結合し、かかる標的分子は予め決定されてい
ることが好ましい。
【0040】
本発明のペプチドおよびその誘導体がとり得る形態としては、例えば、単離された形態
（凍結乾燥標品、溶液等）、他の分子に結合した形態（固相化された形態、融合蛋白質、
異分子との会合体、標的分子と結合した形態等）、他のペプチド等をも含む物理的集合（
本発明のペプチド・ライブラリーを含む）、細胞表面上（大腸菌や酵母の細胞表面上等）
に発現または提示（ディスプレイと同義）された形態（本発明の細胞を含む）、ウイルス
粒子上に発現または提示（ディスプレイと同義）された形態等をあげることができるが、
それらに限定されるものではなく、使用、保存等の目的に適合した形態を任意に選択する
ことができる。
（凍結乾燥標品、溶液等）、他の分子に結合した形態（固相化された形態、融合蛋白質、
異分子との会合体、標的分子と結合した形態等）、他のペプチド等をも含む物理的集合（
本発明のペプチド・ライブラリーを含む）、細胞表面上（大腸菌や酵母の細胞表面上等）
に発現または提示（ディスプレイと同義）された形態（本発明の細胞を含む）、ウイルス
粒子上に発現または提示（ディスプレイと同義）された形態等をあげることができるが、
それらに限定されるものではなく、使用、保存等の目的に適合した形態を任意に選択する
ことができる。
【0041】
２．ヌクレオチド
本発明はヌクレオチドを提供する。
本発明はヌクレオチドを提供する。
【0042】
本発明において、「ヌクレオチド」は、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたは
ポリヌクレオチドであり、「核酸」、「核酸分子」または「遺伝子」とも呼ばれる。本発
明のヌクレオチドとしては、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、
プローブ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プライマー、ベクター等をあげるこ
とができるが、それらに限定されるものではない。また、本発明のヌクレオチドは、一本
鎖ヌクレオチド、二本鎖ヌクレオチドおよび三本以上のヌクレオチドの会合体のいずれで
あってもよく、ＤＮＡおよびＲＮＡからなるハイブリッド一本鎖ヌクレオチド、該ヌクレ
オチドとその相補鎖からなる二本鎖、一本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＲＮＡからなるハイブリ
ッド二本鎖、二本鎖ＲＮＡ、分子内に二本鎖構造部分を有し得る一本鎖ヌクレオチド等を
も包含する。さらに、本発明のヌクレオチドは、天然に生じる塩基またはモノヌクレオチ
ド以外の（人工的に創出された）塩基もしくはモノヌクレオチドを一つまたは二つ以上含
んでいてもよい。
ポリヌクレオチドであり、「核酸」、「核酸分子」または「遺伝子」とも呼ばれる。本発
明のヌクレオチドとしては、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、
プローブ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プライマー、ベクター等をあげるこ
とができるが、それらに限定されるものではない。また、本発明のヌクレオチドは、一本
鎖ヌクレオチド、二本鎖ヌクレオチドおよび三本以上のヌクレオチドの会合体のいずれで
あってもよく、ＤＮＡおよびＲＮＡからなるハイブリッド一本鎖ヌクレオチド、該ヌクレ
オチドとその相補鎖からなる二本鎖、一本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＲＮＡからなるハイブリ
ッド二本鎖、二本鎖ＲＮＡ、分子内に二本鎖構造部分を有し得る一本鎖ヌクレオチド等を
も包含する。さらに、本発明のヌクレオチドは、天然に生じる塩基またはモノヌクレオチ
ド以外の（人工的に創出された）塩基もしくはモノヌクレオチドを一つまたは二つ以上含
んでいてもよい。
【0043】
本発明の好適なヌクレオチドとしては、本発明のペプチドの有するアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列からなるヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド、本発明のペプチドの有
するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでなるヌクレオチド等をあげることができ
る。かかる好適なヌクレオチドは、本発明のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする
塩基配列以外の塩基配列および／または非ヌクレオチド部分を含んでいてもよく、化学的
または生物学的な修飾（本発明の他の部分に記載されている）が施されていてもよい。そ
れらはいずれも「ヌクレオチド」に包含される。
ドする塩基配列からなるヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド、本発明のペプチドの有
するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでなるヌクレオチド等をあげることができ
る。かかる好適なヌクレオチドは、本発明のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする
塩基配列以外の塩基配列および／または非ヌクレオチド部分を含んでいてもよく、化学的
または生物学的な修飾（本発明の他の部分に記載されている）が施されていてもよい。そ
れらはいずれも「ヌクレオチド」に包含される。
【0044】
また、本発明のヌクレオチドは、本発明のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする
塩基配列からなるヌクレオチドをも包含する。
塩基配列からなるヌクレオチドをも包含する。
【0045】
本発明においては、本発明のペプチドの有するアミノ酸配列が、あるヌクレオチドの塩
基配列の一部または全部によりコードされている場合、かかるヌクレオチドを「（かかる
）ペプチドに対応するヌクレオチド」とよび、かかるペプチドを「（かかる）ヌクレオチ
ドに対応するペプチド」とよぶ。
基配列の一部または全部によりコードされている場合、かかるヌクレオチドを「（かかる
）ペプチドに対応するヌクレオチド」とよび、かかるペプチドを「（かかる）ヌクレオチ
ドに対応するペプチド」とよぶ。
【0046】
本発明のペプチドに対応するヌクレオチドとしては、例えば、本発明のペプチドの有す
るアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド、
本発明のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでなるヌクレオチド
、本発明のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌクレオチド等
をあげることができるが、これらに限定されるものではない。
るアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド、
本発明のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでなるヌクレオチド
、本発明のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌクレオチド等
をあげることができるが、これらに限定されるものではない。
【0047】
本発明のヌクレオチドに対応するペプチドとしては、本発明のヌクレオチドの塩基配列
の一部もしくは全部によりコードされるアミノ酸配列からなるペプチドを含んでなるペプ
チド、本発明のヌクレオチドの塩基配列の一部または全部によりコードされるアミノ酸配
列を含んでなるペプチド、本発明のヌクレオチドの塩基配列の一部または全部によりコー
ドされるアミノ酸配列からなるペプチド、それらのペプチドのいずれか一つの誘導体等を
あげることができるが、これらに限定されるものではない。
の一部もしくは全部によりコードされるアミノ酸配列からなるペプチドを含んでなるペプ
チド、本発明のヌクレオチドの塩基配列の一部または全部によりコードされるアミノ酸配
列を含んでなるペプチド、本発明のヌクレオチドの塩基配列の一部または全部によりコー
ドされるアミノ酸配列からなるペプチド、それらのペプチドのいずれか一つの誘導体等を
あげることができるが、これらに限定されるものではない。
【0048】
本発明においては、「表現型に対応する遺伝型」なる表現も「ペプチドに対応するヌク
レオチド」と同じ意味に用いられる。同様に、「遺伝型に対応する表現型」なる表現も「
ヌクレオチドに対応するペプチド」と同じ意味に用いられる。
レオチド」と同じ意味に用いられる。同様に、「遺伝型に対応する表現型」なる表現も「
ヌクレオチドに対応するペプチド」と同じ意味に用いられる。
【0049】
本発明のヌクレオチドの化学的または生物学的な修飾物が本発明のペプチドを含んでい
る場合、かかる修飾物は、前述の本発明の「ペプチドの誘導体」の意味に包含される。
る場合、かかる修飾物は、前述の本発明の「ペプチドの誘導体」の意味に包含される。
【0050】
本発明のより好適なヌクレオチドとしては、前述の好適なヌクレオチドのうち、標的分
子に結合する本発明のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌク
レオチドを含んでなるヌクレオチド、標的分子に結合する本発明のペプチドの有するアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を含んでなるヌクレオチド、標的分子に結合する本発明の
ペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌクレオチド等をあげるこ
とができる。
子に結合する本発明のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌク
レオチドを含んでなるヌクレオチド、標的分子に結合する本発明のペプチドの有するアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を含んでなるヌクレオチド、標的分子に結合する本発明の
ペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌクレオチド等をあげるこ
とができる。
【0051】
本発明において、アミノ酸配列をコードする塩基配列を設計するに際しては、各アミノ
酸に対応するコドンを一種または二種以上使用することができる。それゆえ、あるペプチ
ドまたは蛋白質が有する単一のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、複数のバリエーシ
ョンを有し得る。かかるコドンの選択に際しては、該ペプチドに対応する遺伝型、すなわ
ち該塩基配列を含むヌクレオチドが導入される細胞（宿主細胞）のコドン使用（ｃｏｄｏ
ｎ ｕｓａｇｅ）に応じて適宜コドンを選択したり、複数のコドンの使用の頻度もしくは
割合を適宜調節したりすることができる。例えば、大腸菌を細胞（宿主細胞）として用い
る場合は、大腸菌において使用頻度が高いコドンを使用して塩基配列を設計することがで
きる。
酸に対応するコドンを一種または二種以上使用することができる。それゆえ、あるペプチ
ドまたは蛋白質が有する単一のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、複数のバリエーシ
ョンを有し得る。かかるコドンの選択に際しては、該ペプチドに対応する遺伝型、すなわ
ち該塩基配列を含むヌクレオチドが導入される細胞（宿主細胞）のコドン使用（ｃｏｄｏ
ｎ ｕｓａｇｅ）に応じて適宜コドンを選択したり、複数のコドンの使用の頻度もしくは
割合を適宜調節したりすることができる。例えば、大腸菌を細胞（宿主細胞）として用い
る場合は、大腸菌において使用頻度が高いコドンを使用して塩基配列を設計することがで
きる。
【0052】
本発明のヌクレオチドは、化学合成、遺伝子組換え等、ヌクレオチドを製造する方法と
して当業者に周知の方法により調製することができる。また、本発明のライブラリー等か
ら本発明の同定方法により回収（選抜、濃縮、単離を含む）されたペプチドに対応するヌ
クレオチドも、それらの方法により調製することができる。
して当業者に周知の方法により調製することができる。また、本発明のライブラリー等か
ら本発明の同定方法により回収（選抜、濃縮、単離を含む）されたペプチドに対応するヌ
クレオチドも、それらの方法により調製することができる。
【0053】
本発明のヌクレオチドがとり得る形態としては、例えば、単離された形態（凍結乾燥標
品、溶液等）、他の分子に結合した形態（固相化された形態等）、該ヌクレオチドを含む
組換えベクター（本発明のベクター）、該ヌクレオチドまたは該ベクターが導入された細
胞（本発明の細胞）、ウイルスもしくはウイルス粒子に含まれる形態（本発明のベクター
として含まれる形態を含む）、他のヌクレオチド等をも含む物理的集合（本発明のヌクレ
オチド・ライブラリーを含む）等をあげることができるが、それらに限定されるものでは
なく、使用、保存等の目的に適合した形態を任意に選択することができる。
品、溶液等）、他の分子に結合した形態（固相化された形態等）、該ヌクレオチドを含む
組換えベクター（本発明のベクター）、該ヌクレオチドまたは該ベクターが導入された細
胞（本発明の細胞）、ウイルスもしくはウイルス粒子に含まれる形態（本発明のベクター
として含まれる形態を含む）、他のヌクレオチド等をも含む物理的集合（本発明のヌクレ
オチド・ライブラリーを含む）等をあげることができるが、それらに限定されるものでは
なく、使用、保存等の目的に適合した形態を任意に選択することができる。
【0054】
３．ベクター
本発明は組換えベクター（以下、単に「ベクター」ともよぶ）を提供する。
本発明は組換えベクター（以下、単に「ベクター」ともよぶ）を提供する。
【0055】
本発明のベクターは、本発明のヌクレオチドを含み、且つ本発明のヌクレオチドを細胞
、微生物または個体に導入するための手段であれば特に限定されないが、好適には、ファ
ージミド、コスミド、プラスミド等の核酸ベクターをあげることができる。
、微生物または個体に導入するための手段であれば特に限定されないが、好適には、ファ
ージミド、コスミド、プラスミド等の核酸ベクターをあげることができる。
【0056】
本発明のベクターは、原核細胞または真核細胞に感染するウイルスまたはウイルス性ベ
クターであってもよい。
クターであってもよい。
【0057】
本発明において、「ファージミド」とは、プラスミド複製起点の他に、一本鎖バクテリ
オファージから誘導された第二の複製起点を含む細菌プラスミドを意味する。かかるファ
ージミドを有する細胞は、Ｍ１３またはそれに類似のヘルパーバクテリオファージによる
重感染において、一本鎖複製モードを介してファージミドを複製することができる。すな
わち、バクテリオファージ被覆タンパク質により被覆された感染性粒子の中に、一本鎖フ
ァージミドＤＮＡがパッケージされる。このようにして、ファージミドＤＮＡを、感染細
菌中にクローン二本鎖ＤＮＡプラスミドとして、ファージミドを、重感染した細胞の培養
上清からバクテリオファージ状の粒子として、それぞれ形成することができる。バクテリ
オファージ状の該粒子を、Ｆ性線毛を有する細菌にかかるＤＮＡを感染させるために該細
菌中に注入することにより、粒子自体をプラスミドとして再形成することができる。
オファージから誘導された第二の複製起点を含む細菌プラスミドを意味する。かかるファ
ージミドを有する細胞は、Ｍ１３またはそれに類似のヘルパーバクテリオファージによる
重感染において、一本鎖複製モードを介してファージミドを複製することができる。すな
わち、バクテリオファージ被覆タンパク質により被覆された感染性粒子の中に、一本鎖フ
ァージミドＤＮＡがパッケージされる。このようにして、ファージミドＤＮＡを、感染細
菌中にクローン二本鎖ＤＮＡプラスミドとして、ファージミドを、重感染した細胞の培養
上清からバクテリオファージ状の粒子として、それぞれ形成することができる。バクテリ
オファージ状の該粒子を、Ｆ性線毛を有する細菌にかかるＤＮＡを感染させるために該細
菌中に注入することにより、粒子自体をプラスミドとして再形成することができる。
【0058】
本発明のペプチドに対応するヌクレオチドおよびバクテリオファージ被覆蛋白質（ｃｏ
ａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を含んで構成される融合遺伝子を該ファージミドに挿入し
て細菌に感染させ、該細胞を培養すれば、かかるペプチドを、該細菌上またはファージ様
粒子上に発現もしくは提示（ディスプレイと同義）させるか、または、該被覆蛋白質との
融合蛋白質としてファージ粒子中もしくは該細菌の培養上清中に産生することができる。
【0059】
例えば、本発明のペプチドに対応するヌクレオチドおよびバクテリオファージ被覆タン
パク質遺伝子ｇｐＩＩＩを含んで構成される融合遺伝子をファージミドに挿入し、Ｍ１３
またはそれに類似のヘルパーファージとともに大腸菌に重感染させれば、該ペプチドおよ
び該被覆蛋白質を含んで構成される融合蛋白質として、該大腸菌の培養上清中に産生させ
ることができる。かかる融合蛋白質は該ペプチドの誘導体として本発明に包含される。
パク質遺伝子ｇｐＩＩＩを含んで構成される融合遺伝子をファージミドに挿入し、Ｍ１３
またはそれに類似のヘルパーファージとともに大腸菌に重感染させれば、該ペプチドおよ
び該被覆蛋白質を含んで構成される融合蛋白質として、該大腸菌の培養上清中に産生させ
ることができる。かかる融合蛋白質は該ペプチドの誘導体として本発明に包含される。
【0060】
ファージミドの代わりに、環状または非環状の各種ベクター、好適にはウイルスベクタ
ーを用いても、当業者に周知の方法に従って、該ベクターに含まれる本発明のヌクレオチ
ドの塩基配列によりコードされるペプチドを、該ベクターが導入された細胞あるいはウイ
ルス様粒子上に発現もしくは提示（ディスプレイと同義）させるか、または該細胞の培養
上清中に産生することができる。
ーを用いても、当業者に周知の方法に従って、該ベクターに含まれる本発明のヌクレオチ
ドの塩基配列によりコードされるペプチドを、該ベクターが導入された細胞あるいはウイ
ルス様粒子上に発現もしくは提示（ディスプレイと同義）させるか、または該細胞の培養
上清中に産生することができる。
【0061】
本発明のベクター（組換えベクター）は、遺伝子組換え等当業者に周知の方法により調
製することができる。
製することができる。
【0062】
本発明のベクターがとり得る形態としては、例えば、単離された形態（凍結乾燥標品、
溶液等）、他の分子に結合した形態（固相化された形態等）、細胞に導入された形態（本
発明の組換え細胞を含む）、他のベクター等をも含む物理的集合（本発明のヌクレオチド
・ライブラリーの特定の態様を含む）等をあげることができるが、それらに限定されるも
のではなく、使用、保存等の目的に適合した形態を任意に選択することができる。
溶液等）、他の分子に結合した形態（固相化された形態等）、細胞に導入された形態（本
発明の組換え細胞を含む）、他のベクター等をも含む物理的集合（本発明のヌクレオチド
・ライブラリーの特定の態様を含む）等をあげることができるが、それらに限定されるも
のではなく、使用、保存等の目的に適合した形態を任意に選択することができる。
【0063】
４．細胞
本発明は、その一つの態様において、組換え細胞（以下、単に「細胞」ともよぶ）を提
供する。
本発明は、その一つの態様において、組換え細胞（以下、単に「細胞」ともよぶ）を提
供する。
【0064】
本発明の細胞は、本発明のペプチドに対応するヌクレオチドを含み且つ該ペプチドを発
現する細胞である。かかる細胞の宿主細胞としては、真核細胞（株化細胞、初代培養細胞
、継代培養細胞を含む）および原核細胞のいずれであっても特に限定されるものではない
。
現する細胞である。かかる細胞の宿主細胞としては、真核細胞（株化細胞、初代培養細胞
、継代培養細胞を含む）および原核細胞のいずれであっても特に限定されるものではない
。
【0065】
原核細胞としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等の細菌細胞をあげることができるが、これらに
限定されるものではない。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等の細菌細胞をあげることができるが、これらに
限定されるものではない。
【0066】
真核細胞としては、例えば、動物細胞、昆虫細胞、酵母、真菌等をあげることができ、
動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（グルツマン、セル、２３巻、
１９８１年刊行、１７５乃至１８２頁：Ｇｌｕｚｍａｎ， Ｙ．， Ｃｅｌｌ （１９８
１）， ｖｏｌ．２３， ｐｐ１７５－１８２：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション番号 ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５０）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション番号 ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５８）、チャイ
ニーズ・ハムスター卵巣細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌ
：ＣＨＯ細胞：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション番号 ＡＴＣＣ ＣＣＬ
－６１）、ＣＨＯ細胞のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（ウルラオプとチャシン、プロシー
ディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー、７７巻
、１９８０年刊行、４１２６乃至４２２０頁：Ｕｒｌａｕｂ， Ｇ． ａｎｄ Ｃｈａｓ
ｉｎ， Ｌ． Ａ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１
９８０）， ｖｏｌ．７７， ｐｐ４１２６－４２２０）等をあげることができるが、こ
れらに限定されるものではない。
動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（グルツマン、セル、２３巻、
１９８１年刊行、１７５乃至１８２頁：Ｇｌｕｚｍａｎ， Ｙ．， Ｃｅｌｌ （１９８
１）， ｖｏｌ．２３， ｐｐ１７５－１８２：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション番号 ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５０）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション番号 ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５８）、チャイ
ニーズ・ハムスター卵巣細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌ
：ＣＨＯ細胞：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション番号 ＡＴＣＣ ＣＣＬ
－６１）、ＣＨＯ細胞のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（ウルラオプとチャシン、プロシー
ディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー、７７巻
、１９８０年刊行、４１２６乃至４２２０頁：Ｕｒｌａｕｂ， Ｇ． ａｎｄ Ｃｈａｓ
ｉｎ， Ｌ． Ａ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１
９８０）， ｖｏｌ．７７， ｐｐ４１２６－４２２０）等をあげることができるが、こ
れらに限定されるものではない。
【0067】
本発明の細胞は、本発明のヌクレオチドまたはベクターを宿主細胞へ導入することによ
り調製することができるが、好適には、本発明のベクターをトランスフェクション、形質
転換、形質導入等で宿主細胞へ導入することにより調製することができる。
り調製することができるが、好適には、本発明のベクターをトランスフェクション、形質
転換、形質導入等で宿主細胞へ導入することにより調製することができる。
【0068】
本発明の細胞の調製に適用し得るベクターとしては、例えば、かかる原核細胞と適合し
得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列、転写開始点、（翻訳の）開始コ
ドンと終止コドン等から選択されるものの塩基配列を一つ以上含むプラスミド、コスミド
、ファージミド等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。また、か
かるヌクレオチドまたはベクターは、該ベクターまたはヌクレオチドが導入された細胞に
表現形質（表現型）の選択性を付与し得る塩基配列を含んでいてもよい。かかるベクター
またはヌクレオチドを宿主細胞に導入し、得られた細胞を培養することにより、本発明の
ペプチドを発現させることができる。
得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列、転写開始点、（翻訳の）開始コ
ドンと終止コドン等から選択されるものの塩基配列を一つ以上含むプラスミド、コスミド
、ファージミド等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。また、か
かるヌクレオチドまたはベクターは、該ベクターまたはヌクレオチドが導入された細胞に
表現形質（表現型）の選択性を付与し得る塩基配列を含んでいてもよい。かかるベクター
またはヌクレオチドを宿主細胞に導入し、得られた細胞を培養することにより、本発明の
ペプチドを発現させることができる。
【0069】
本発明のペプチドの翻訳後修飾に適した宿主細胞も、本発明の細胞として使用すること
ができる。かかる宿主細胞が適用された本発明の細胞は、例えば、本発明のペプチド誘導
体を調製する方法（のある態様）において使用することができる。
ができる。かかる宿主細胞が適用された本発明の細胞は、例えば、本発明のペプチド誘導
体を調製する方法（のある態様）において使用することができる。
【0070】
本発明の細胞がとり得る形態としては、例えば、単離された形態（冷凍標品、凍結乾燥
標品、溶液等）、他の分子に結合した形態（固相化された形態等）、本発明のヌクレオチ
ドまたはベクターが導入された細胞（本発明の細胞に含まれる）、本発明のペプチドが表
面に発現または提示（ディスプレイと同義）されている細胞（本発明の細胞に含まれる）
、他の細胞等をも含む物理的集合（本発明のヌクレオチド・ライブラリーおよびペプチド
・ライブラリーの特定の態様を含む）等をあげることができるが、それらに限定されるも
のではなく、使用、保存等の目的に適合した形態を任意に選択することができる。
標品、溶液等）、他の分子に結合した形態（固相化された形態等）、本発明のヌクレオチ
ドまたはベクターが導入された細胞（本発明の細胞に含まれる）、本発明のペプチドが表
面に発現または提示（ディスプレイと同義）されている細胞（本発明の細胞に含まれる）
、他の細胞等をも含む物理的集合（本発明のヌクレオチド・ライブラリーおよびペプチド
・ライブラリーの特定の態様を含む）等をあげることができるが、それらに限定されるも
のではなく、使用、保存等の目的に適合した形態を任意に選択することができる。
【0071】
５．ペプチドの製造方法
本発明は、また他の態様として、本発明のペプチドの製造方法を提供する。
本発明は、また他の態様として、本発明のペプチドの製造方法を提供する。
【0072】
本発明のペプチドは、前述のとおり、化学合成、遺伝子組換え、イン・ビトロ翻訳等、
ペプチドや蛋白質を製造する方法として当業者に周知の方法により調製することができる
。また、本発明のライブラリー等から本発明の同定方法により回収（選抜、濃縮、単離を
含む）されたペプチドも、それらの方法により調製することができる。
ペプチドや蛋白質を製造する方法として当業者に周知の方法により調製することができる
。また、本発明のライブラリー等から本発明の同定方法により回収（選抜、濃縮、単離を
含む）されたペプチドも、それらの方法により調製することができる。
【0073】
本発明のペプチドの製造方法は、ある態様において、次の工程（１－１）および（１－
２）を含んでなる：
（１－１）本発明のペプチドに対応するヌクレオチドを含み且つ該ペプチド等を発現する
細胞（本発明の細胞）を培養する工程；および、
（１－２）該培養物から該ペプチドを回収する工程。
２）を含んでなる：
（１－１）本発明のペプチドに対応するヌクレオチドを含み且つ該ペプチド等を発現する
細胞（本発明の細胞）を培養する工程；および、
（１－２）該培養物から該ペプチドを回収する工程。
【0074】
また、本発明のペプチドの製造方法は、他の態様において、次の工程（２－１）および
（２－２）を含んでなる：
（２－１）標的分子に結合する本発明のペプチドのアミノ酸配列を決定する工程；および
、
（２－２）該アミノ酸配列からなるペプチドを化学合成または遺伝子組換えにより調製す
る工程。
（２－２）を含んでなる：
（２－１）標的分子に結合する本発明のペプチドのアミノ酸配列を決定する工程；および
、
（２－２）該アミノ酸配列からなるペプチドを化学合成または遺伝子組換えにより調製す
る工程。
【0075】
さらに、本発明のペプチドの製造方法は、また他の態様において、次の工程（３－１）
および（３－２）を含んでなる：
（３－１）本発明のペプチドに対応する対応するｍＲＮＡを調製する工程；および、
（３－２）前記（３－１）で得られたｍＲＮＡを鋳型として、イン・ビトロ翻訳により、
該ペプチドを調製する工程。
および（３－２）を含んでなる：
（３－１）本発明のペプチドに対応する対応するｍＲＮＡを調製する工程；および、
（３－２）前記（３－１）で得られたｍＲＮＡを鋳型として、イン・ビトロ翻訳により、
該ペプチドを調製する工程。
【0076】
また、これらの製造方法には、事前の工程として、本発明の同定方法を適宜組合せるこ
とができる。すなわち、まず、本発明の同定方法に含まれる工程を実施し、次いで本発明
の製造方法に含まれる工程を実施することができる。本発明のペプチドの製造方法は、そ
のような、本発明の同定方法（の各工程）をさらに含むことからなる方法をも包含する。
とができる。すなわち、まず、本発明の同定方法に含まれる工程を実施し、次いで本発明
の製造方法に含まれる工程を実施することができる。本発明のペプチドの製造方法は、そ
のような、本発明の同定方法（の各工程）をさらに含むことからなる方法をも包含する。
【0077】
そのような本発明のペプチドの製造方法は、例えば、次の工程（４－１）乃至（４－３
）を含んでなる：
（４－１）本発明のペプチド・ライブラリーに含まれるペプチドと標的分子とを接触させ
る工程；
（４－２）該標的分子に結合するペプチドを回収する工程；および
（４－３）回収されたペプチドを、化学合成、遺伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳によ
り調製する工程。
）を含んでなる：
（４－１）本発明のペプチド・ライブラリーに含まれるペプチドと標的分子とを接触させ
る工程；
（４－２）該標的分子に結合するペプチドを回収する工程；および
（４－３）回収されたペプチドを、化学合成、遺伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳によ
り調製する工程。
【0078】
同様に、これらの製造方法には、事前の工程として、本発明の判定方法を適宜組合せる
ことができる。すなわち、まず、本発明の判定方法に含まれる工程を実施し、次いで本発
明の製造方法に含まれる工程を実施することができる。本発明のペプチド等の製造方法は
、そのような、本発明の判定方法（の各工程）をさらに含むことからなる方法をも包含す
る。
ことができる。すなわち、まず、本発明の判定方法に含まれる工程を実施し、次いで本発
明の製造方法に含まれる工程を実施することができる。本発明のペプチド等の製造方法は
、そのような、本発明の判定方法（の各工程）をさらに含むことからなる方法をも包含す
る。
【0079】
そのような本発明のペプチド等の製造方法は、例えば、次の工程（５－１）乃至（５－
３）を含んでなる：
（５－１）本発明の被検ペプチドと標的分子とを接触させる工程；
（５－２）被検ペプチドが該標的分子に結合する場合、該ペプチドは陽性であると決定す
る工程；および、
（５－３）前記（５－２）において被検ペプチドは陽性であると決定された場合、該ペプ
チドを化学合成、遺伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳により調製する工程。
３）を含んでなる：
（５－１）本発明の被検ペプチドと標的分子とを接触させる工程；
（５－２）被検ペプチドが該標的分子に結合する場合、該ペプチドは陽性であると決定す
る工程；および、
（５－３）前記（５－２）において被検ペプチドは陽性であると決定された場合、該ペプ
チドを化学合成、遺伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳により調製する工程。
【0080】
さらに、本発明のペプチドの製造方法は、他の態様において、ＳＰＩＮＫ２の内在性の
標的分子であるトリプシンおよび／またはアクロシン以外の、好適にはトリプシン以外の
標的分子に結合し且つ該標的分子の有する生物活性の一部または全部を活性化もしくは促
進、または、阻害、不活性化もしくは抑制するペプチドを同定する工程を含んでなる。か
かる製造方法は、例えば、次の（６－１）乃至（６－３）または（７－１）乃至（７－３
）の工程を含む：
（６－１）本発明のペプチド・ライブラリーに含まれるペプチドと該標的分子とを接触さ
せる工程；
（６－２）該標的分子に結合するペプチドを回収する工程；、および、
（６－３）該ペプチドが該標的分子の有する生物活性を活性化もしくは促進するか、また
は、該標的分子を刺激する（ａｇｏｎｉｚｅ）場合、該ペプチドを陽性と判定する工程。
（７－１）本発明のペプチド・ライブラリーに含まれるペプチドと該標的分子とを接触さ
せる工程；
（７－２）該標的分子に結合するペプチドを回収する工程；、および、
（７－３）該ペプチドが該標的分子の有する生物活性を阻害、不活性化もしくは抑制する
か、または、該標的分子に拮抗する（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）場合、該ペプチドを陽性と
判定する工程。
標的分子であるトリプシンおよび／またはアクロシン以外の、好適にはトリプシン以外の
標的分子に結合し且つ該標的分子の有する生物活性の一部または全部を活性化もしくは促
進、または、阻害、不活性化もしくは抑制するペプチドを同定する工程を含んでなる。か
かる製造方法は、例えば、次の（６－１）乃至（６－３）または（７－１）乃至（７－３
）の工程を含む：
（６－１）本発明のペプチド・ライブラリーに含まれるペプチドと該標的分子とを接触さ
せる工程；
（６－２）該標的分子に結合するペプチドを回収する工程；、および、
（６－３）該ペプチドが該標的分子の有する生物活性を活性化もしくは促進するか、また
は、該標的分子を刺激する（ａｇｏｎｉｚｅ）場合、該ペプチドを陽性と判定する工程。
（７－１）本発明のペプチド・ライブラリーに含まれるペプチドと該標的分子とを接触さ
せる工程；
（７－２）該標的分子に結合するペプチドを回収する工程；、および、
（７－３）該ペプチドが該標的分子の有する生物活性を阻害、不活性化もしくは抑制する
か、または、該標的分子に拮抗する（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）場合、該ペプチドを陽性と
判定する工程。
【0081】
また、本発明の製造方法は、別の態様において、（６－１）乃至（６－３）または（７
－１）乃至（７－３）の替わりに、例えば、次の（８－１）および（８－２）または（９
－１）または（９－２）を含んでなる：
（８－１）被検ペプチドとトリプシンおよび／またはアクロシン以外の、好適にはトリプ
シン以外の標的分子とを接触させる工程；および、
（８－２）該ペプチドが該標的分子の有する生物活性を活性化もしくは促進するか、また
は、該標的分子を刺激する（ａｇｏｎｉｚｅ）場合、該ペプチドを陽性と判定する工程。
（９－１）被検ペプチドとトリプシンおよび／またはアクロシン以外の、好適にはトリプ
シン以外の標的分子とを接触させる工程；および、
（９－２）該ペプチドが該標的分子の有する生物活性を阻害、不活性化もしくは抑制する
か、または、該標的分子に拮抗する（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）場合、該ペプチドを陽性と
判定する工程。
－１）乃至（７－３）の替わりに、例えば、次の（８－１）および（８－２）または（９
－１）または（９－２）を含んでなる：
（８－１）被検ペプチドとトリプシンおよび／またはアクロシン以外の、好適にはトリプ
シン以外の標的分子とを接触させる工程；および、
（８－２）該ペプチドが該標的分子の有する生物活性を活性化もしくは促進するか、また
は、該標的分子を刺激する（ａｇｏｎｉｚｅ）場合、該ペプチドを陽性と判定する工程。
（９－１）被検ペプチドとトリプシンおよび／またはアクロシン以外の、好適にはトリプ
シン以外の標的分子とを接触させる工程；および、
（９－２）該ペプチドが該標的分子の有する生物活性を阻害、不活性化もしくは抑制する
か、または、該標的分子に拮抗する（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）場合、該ペプチドを陽性と
判定する工程。
【0082】
（６－１）乃至（６－３）、または、（８－１）および（８－２）等の工程に、（４－
３）または（５－３）等に準じた工程を組み合わせることにより、標的分子の有する生物
活性を活性化もしくは促進するペプチド、または、標的分子を刺激するペプチド（ａｇｏ
ｎｉｓｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）を製造することができる。同様に、（７－１）乃至（７
－３）、または、（９－１）および（９－２）等の工程に、（４－３）または（５－３）
等に準じた工程を組み合わせることにより、標的分子の有する生物活性を阻害、不活性化
もしくは抑制するペプチド、または、標的分子に拮抗するペプチド（ａｎｔａｇｏｎｉｓ
ｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）を製造することができる。
３）または（５－３）等に準じた工程を組み合わせることにより、標的分子の有する生物
活性を活性化もしくは促進するペプチド、または、標的分子を刺激するペプチド（ａｇｏ
ｎｉｓｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）を製造することができる。同様に、（７－１）乃至（７
－３）、または、（９－１）および（９－２）等の工程に、（４－３）または（５－３）
等に準じた工程を組み合わせることにより、標的分子の有する生物活性を阻害、不活性化
もしくは抑制するペプチド、または、標的分子に拮抗するペプチド（ａｎｔａｇｏｎｉｓ
ｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）を製造することができる。
【0083】
また、本発明はペプチドの誘導体（ペプチド誘導体）の製造方法を提供する。本発明の
ペプチド誘導体は、例えば、該誘導体に含まれるペプチドを上記の方法（ペプチドの製造
方法）により調製した後、化学反応、生化学反応、翻訳後修飾等に供することにより、調
製することができるが、それらに限定されるものではない。
ペプチド誘導体は、例えば、該誘導体に含まれるペプチドを上記の方法（ペプチドの製造
方法）により調製した後、化学反応、生化学反応、翻訳後修飾等に供することにより、調
製することができるが、それらに限定されるものではない。
【0084】
上記（２－２）、（３－２）、（４－３）または（５－３）において調製されるペプチ
ドの代わりに、当該ペプチド（Ｘ）の有するアミノ酸配列から１もしくは２以上のアミノ
酸又は部分アミノ酸配列が欠失してなるアミノ酸配列を有するペプチド（Ｘ’）を調製す
ることもできる。ペプチド（Ｘ’）の製造方法も本発明に包含される。かかる方法により
調製されるペプチド（Ｘ’）は好適には標的分子に結合する。かかる好適なペプチド（Ｘ
’）のアミノ酸配列においては、元のペプチドの有するアミノ酸配列に含まれるが標的分
子との結合に必須ではない１又は２以上のアミノ酸又は部分アミノ酸配列が欠失してもよ
い。
ドの代わりに、当該ペプチド（Ｘ）の有するアミノ酸配列から１もしくは２以上のアミノ
酸又は部分アミノ酸配列が欠失してなるアミノ酸配列を有するペプチド（Ｘ’）を調製す
ることもできる。ペプチド（Ｘ’）の製造方法も本発明に包含される。かかる方法により
調製されるペプチド（Ｘ’）は好適には標的分子に結合する。かかる好適なペプチド（Ｘ
’）のアミノ酸配列においては、元のペプチドの有するアミノ酸配列に含まれるが標的分
子との結合に必須ではない１又は２以上のアミノ酸又は部分アミノ酸配列が欠失してもよ
い。
【0085】
本発明のペプチド誘導体の製造方法としては、例えば、上記の（１－１）および（１－
２）、（２－１）および（２－２）、（３－１）および（３－２）、（４－１）乃至（４
－３）、（５－１）乃至（５－３）、（６－１）乃至（６－３）、（７－１）乃至（７－
３）、（８－１）および（８－２）、または、（９－１）および（９－２）等の各工程に
加え、本発明のペプチドを原料として本発明のペプチド誘導体を調製する工程（以下、「
誘導体調製工程」という。）をも含んでなる方法、上記の（２－２）、（３－２）、（４
－３）および（５－３）においてペプチドの代わりにペプチドの誘導体を調製する工程を
含んでなる方法、予めペプチド・ライブラリーにペプチド誘導体を含有させておく方法、
被検ペプチドの替わりに被検ペプチド誘導体を用いる方法等をあげることができるが、そ
れらに限定されるものではない。
２）、（２－１）および（２－２）、（３－１）および（３－２）、（４－１）乃至（４
－３）、（５－１）乃至（５－３）、（６－１）乃至（６－３）、（７－１）乃至（７－
３）、（８－１）および（８－２）、または、（９－１）および（９－２）等の各工程に
加え、本発明のペプチドを原料として本発明のペプチド誘導体を調製する工程（以下、「
誘導体調製工程」という。）をも含んでなる方法、上記の（２－２）、（３－２）、（４
－３）および（５－３）においてペプチドの代わりにペプチドの誘導体を調製する工程を
含んでなる方法、予めペプチド・ライブラリーにペプチド誘導体を含有させておく方法、
被検ペプチドの替わりに被検ペプチド誘導体を用いる方法等をあげることができるが、そ
れらに限定されるものではない。
【0086】
本発明のペプチド誘導体の製造方法に含まれ得る上記（２－２）、（３－２）、（４－
３）または（５－３）において調製されるペプチド誘導体の代わりに、当該ペプチド誘導
体（Ｙ）の有するアミノ酸配列から１もしくは２以上のアミノ酸又は部分アミノ酸配列が
欠失してなるアミノ酸配列を有するペプチド誘導体（Ｙ’）を調製することもできる。ペ
プチド誘導体（Ｙ’）の製造方法も本発明に包含される。かかる方法により調製されるペ
プチド誘導体（Ｙ’）は好適には標的分子に結合する。かかる好適なペプチド誘導体（Ｙ
’）のアミノ酸配列においては、元のペプチド誘導体の有するアミノ酸配列に含まれるが
標的分子との結合に必須ではない１又は２以上のアミノ酸又は部分アミノ酸配列が欠失し
てもよい。 また、所望の翻訳後修飾能を有する細胞を本発明のペプチドの製造方法にお
いて用いることにより、所望の翻訳後修飾が施されたペプチドとして、本発明のペプチド
誘導体を調製することもできる。かかる場合、例えば、所望の翻訳後修飾能を有する細胞
を、上記工程の（１－１）および（１－２）における細胞として、または、（２－２）、
（４－３）および（５－３）における遺伝子組換えに適用される細胞（または宿主細胞）
として、それぞれ用いることにより、所望の翻訳後修飾が施されたペプチド誘導体を調製
することができるが、本発明の（ペプチド誘導体の製造方法の態様として）ペプチドの翻
訳後修飾体を調製する方法は、それらに限定されるものではない。
３）または（５－３）において調製されるペプチド誘導体の代わりに、当該ペプチド誘導
体（Ｙ）の有するアミノ酸配列から１もしくは２以上のアミノ酸又は部分アミノ酸配列が
欠失してなるアミノ酸配列を有するペプチド誘導体（Ｙ’）を調製することもできる。ペ
プチド誘導体（Ｙ’）の製造方法も本発明に包含される。かかる方法により調製されるペ
プチド誘導体（Ｙ’）は好適には標的分子に結合する。かかる好適なペプチド誘導体（Ｙ
’）のアミノ酸配列においては、元のペプチド誘導体の有するアミノ酸配列に含まれるが
標的分子との結合に必須ではない１又は２以上のアミノ酸又は部分アミノ酸配列が欠失し
てもよい。 また、所望の翻訳後修飾能を有する細胞を本発明のペプチドの製造方法にお
いて用いることにより、所望の翻訳後修飾が施されたペプチドとして、本発明のペプチド
誘導体を調製することもできる。かかる場合、例えば、所望の翻訳後修飾能を有する細胞
を、上記工程の（１－１）および（１－２）における細胞として、または、（２－２）、
（４－３）および（５－３）における遺伝子組換えに適用される細胞（または宿主細胞）
として、それぞれ用いることにより、所望の翻訳後修飾が施されたペプチド誘導体を調製
することができるが、本発明の（ペプチド誘導体の製造方法の態様として）ペプチドの翻
訳後修飾体を調製する方法は、それらに限定されるものではない。
【0087】
６．ライブラリー
本発明はライブラリーを提供する。
本発明はライブラリーを提供する。
【0088】
本発明において、「ライブラリー」とは、類似するが、同一ではない分子の物理的集合
（コレクション）を意味する。かかる集合は、例えば、一つの容器中に共存し得るが、異
なる容器あるいは固相支持体上の異なる場所に、グループとしてまたは個々の分子として
、物理的に分離されて存在してもよい。複数のライブラリーが同一の集合に含まれていて
もよい。
（コレクション）を意味する。かかる集合は、例えば、一つの容器中に共存し得るが、異
なる容器あるいは固相支持体上の異なる場所に、グループとしてまたは個々の分子として
、物理的に分離されて存在してもよい。複数のライブラリーが同一の集合に含まれていて
もよい。
【0089】
本発明のライブラリーは、同一ではない本発明のペプチドおよび／またはヌクレオチド
の物理的集合であれば何ら限定されるものではないが、例えば、ファージ・ディスプレイ
・ライブラリー、リボゾーム・ディスプレイ・ライブラリー、核酸ディスプレイ・ライブ
ラリー等をあげることができる。
の物理的集合であれば何ら限定されるものではないが、例えば、ファージ・ディスプレイ
・ライブラリー、リボゾーム・ディスプレイ・ライブラリー、核酸ディスプレイ・ライブ
ラリー等をあげることができる。
【0090】
「ファージ・ディスプレイ」とは、繊維状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａ
ｇｅ）等の被覆蛋白質（ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）に外来のペプチドまたは蛋白質を連
結し、融合蛋白質としてファージ様粒子上に発現または提示（ディスプレイと同義）させ
る技術（方法およびそのための手段）を意味する。また、かかる技術を利用した、該ペプ
チドまたは蛋白質に対応するヌクレオチドの回収（選抜、濃縮、単離を含む）も「ファー
ジ・ディスプレイ」の意味に包含される。ファージ・ディスプレイ・ライブラリーは、か
かる技術において使用される、本発明のライブラリーの一態様である。
ｇｅ）等の被覆蛋白質（ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）に外来のペプチドまたは蛋白質を連
結し、融合蛋白質としてファージ様粒子上に発現または提示（ディスプレイと同義）させ
る技術（方法およびそのための手段）を意味する。また、かかる技術を利用した、該ペプ
チドまたは蛋白質に対応するヌクレオチドの回収（選抜、濃縮、単離を含む）も「ファー
ジ・ディスプレイ」の意味に包含される。ファージ・ディスプレイ・ライブラリーは、か
かる技術において使用される、本発明のライブラリーの一態様である。
【0091】
「リボゾーム・ディスプレイ」とは、イン・ビトロ翻訳において、翻訳反応中に形成さ
れる、ｍＲＮＡ－リボソーム－ペプチドまたは蛋白質、の三者を含んでなる複合体として
の形態で、ペプチドまたは蛋白質を発現または提示（ディスプレイと同義）させる技術（
方法およびそのための手段）を意味する。ここで、ペプチドまたは蛋白質は、該ｍＲＮＡ
の翻訳産物である。また、かかる技術による、該ペプチドまたは蛋白質に対応するヌクレ
オチドの回収（選抜、濃縮、単離を含む）も「リボゾーム・ディスプレイ」の意味に包含
される。リボゾーム・ディスプレイ・ライブラリーは、かかる技術において使用される、
本発明のライブラリーの他の一態様である。
れる、ｍＲＮＡ－リボソーム－ペプチドまたは蛋白質、の三者を含んでなる複合体として
の形態で、ペプチドまたは蛋白質を発現または提示（ディスプレイと同義）させる技術（
方法およびそのための手段）を意味する。ここで、ペプチドまたは蛋白質は、該ｍＲＮＡ
の翻訳産物である。また、かかる技術による、該ペプチドまたは蛋白質に対応するヌクレ
オチドの回収（選抜、濃縮、単離を含む）も「リボゾーム・ディスプレイ」の意味に包含
される。リボゾーム・ディスプレイ・ライブラリーは、かかる技術において使用される、
本発明のライブラリーの他の一態様である。
【0092】
「核酸ディスプレイ」とは、ヌクレオチド（核酸と同義）と、該ヌクレオチドに対応す
るペプチドまたは蛋白質を含んでなる複合体としての形態で、ペプチドもしくは蛋白質を
発現または提示（ディスプレイと同義）させる技術（方法およびそのための手段）を意味
する（キーフェとスゾスタク、ネイチャー、４１０巻、７１５乃至７１８頁、２００１年
刊行：Ｋｅｅｆｅ， Ａ．Ｄ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ， Ｊ．Ｗ．， Ｎａｔｕｒｅ，
ｖｏｌ．４１０ （２００１）， ｐｐ７１５－７１８）。また、かかる技術による、
該ペプチドまたは蛋白質に対応するヌクレオチドの回収（選抜、濃縮、単離を含む）も「
核酸ディスプレイ」の意味にされ包含する。核酸ディスプレイ・ライブラリーは、かかる
技術において使用される、本発明のライブラリーのまた他の一態様である。
るペプチドまたは蛋白質を含んでなる複合体としての形態で、ペプチドもしくは蛋白質を
発現または提示（ディスプレイと同義）させる技術（方法およびそのための手段）を意味
する（キーフェとスゾスタク、ネイチャー、４１０巻、７１５乃至７１８頁、２００１年
刊行：Ｋｅｅｆｅ， Ａ．Ｄ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ， Ｊ．Ｗ．， Ｎａｔｕｒｅ，
ｖｏｌ．４１０ （２００１）， ｐｐ７１５－７１８）。また、かかる技術による、
該ペプチドまたは蛋白質に対応するヌクレオチドの回収（選抜、濃縮、単離を含む）も「
核酸ディスプレイ」の意味にされ包含する。核酸ディスプレイ・ライブラリーは、かかる
技術において使用される、本発明のライブラリーのまた他の一態様である。
【0093】
核酸ディスプレイとしては、例えば、ｍＲＮＡディスプレイをあげることができるが、
それに限定されるものではない。（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ．３７， Ｎｏ．１６ ｅ１０８
， ｐｐ１－１３ （２００９））
ｍＲＮＡディスプレイは、ｍＲＮＡとその翻訳産物であるペプチドまたは蛋白質が介在
部分を挟んで連結してなる複合体としての形態で、ペプチドまたは蛋白質を提示（ディス
プレイと同義）させる技術である（キーフェとスゾスタク、ネイチャー、４１０巻、７１
５乃至７１８頁、２００１年刊行：Ｋｅｅｆｅ， Ａ．Ｄ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，
Ｊ．Ｗ．， Ｎａｔｕｒｅ， ｖｏｌ．４１０ （２００１）， ｐｐ７１５－７１８）
。
それに限定されるものではない。（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ．３７， Ｎｏ．１６ ｅ１０８
， ｐｐ１－１３ （２００９））
ｍＲＮＡディスプレイは、ｍＲＮＡとその翻訳産物であるペプチドまたは蛋白質が介在
部分を挟んで連結してなる複合体としての形態で、ペプチドまたは蛋白質を提示（ディス
プレイと同義）させる技術である（キーフェとスゾスタク、ネイチャー、４１０巻、７１
５乃至７１８頁、２００１年刊行：Ｋｅｅｆｅ， Ａ．Ｄ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，
Ｊ．Ｗ．， Ｎａｔｕｒｅ， ｖｏｌ．４１０ （２００１）， ｐｐ７１５－７１８）
。
【0094】
本発明においては、同一ではない本発明のペプチドおよび／またはヌクレオチドの物理
的集合を含む細胞の物理的集合、微生物（ウイルス、ファージ、ファージ様分子、それら
のいずれかの粒子等を含む）の物理的集合、および、天然に生じるかまたは人工的に創出
されたベクター（ファージミド、コスミド、プラスミド等を含む）の物理的集合、ならび
に、それらの断片の物理的集集合、および、科学的および／または生物学的な修飾物の物
理的集合も、「ライブラリー」の意味に包含される。
的集合を含む細胞の物理的集合、微生物（ウイルス、ファージ、ファージ様分子、それら
のいずれかの粒子等を含む）の物理的集合、および、天然に生じるかまたは人工的に創出
されたベクター（ファージミド、コスミド、プラスミド等を含む）の物理的集合、ならび
に、それらの断片の物理的集集合、および、科学的および／または生物学的な修飾物の物
理的集合も、「ライブラリー」の意味に包含される。
【0095】
前述のとおり、本発明において、アミノ酸配列コードする塩基配列を設計するに際して
は、各アミノ酸に対応するコドンを一種または二種以上使用することができる。それゆえ
、あるペプチドまたは蛋白質が有する単一のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、複数
のバリエーションを有し得る。かかるコドンの選択に際しては、該ペプチドに対応する遺
伝型、すなわち該塩基配列を含むヌクレオチドが導入される細胞（宿主細胞）のコドン使
用（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）に応じて適宜コドンを選択したり、複数のコドンの使用の
頻度もしくは割合を適宜調節したりすることができる。よって、本発明のヌクレオチド・
ライブラリーには、単一のアミノ酸配列をコードする塩基配列のヌクレオチドは、複数の
バリエーションを有し得る。すなわち、本発明のヌクレオチド・ライブラリーには、ある
ペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むヌクレオチドの物理的集合が
含まれていてもよい。かかる特定のペプチドに対応するヌクレオチドの物理的集合は、そ
れら自体で一つのヌクレオチド・ライブラリーを形成し得る。
は、各アミノ酸に対応するコドンを一種または二種以上使用することができる。それゆえ
、あるペプチドまたは蛋白質が有する単一のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、複数
のバリエーションを有し得る。かかるコドンの選択に際しては、該ペプチドに対応する遺
伝型、すなわち該塩基配列を含むヌクレオチドが導入される細胞（宿主細胞）のコドン使
用（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）に応じて適宜コドンを選択したり、複数のコドンの使用の
頻度もしくは割合を適宜調節したりすることができる。よって、本発明のヌクレオチド・
ライブラリーには、単一のアミノ酸配列をコードする塩基配列のヌクレオチドは、複数の
バリエーションを有し得る。すなわち、本発明のヌクレオチド・ライブラリーには、ある
ペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むヌクレオチドの物理的集合が
含まれていてもよい。かかる特定のペプチドに対応するヌクレオチドの物理的集合は、そ
れら自体で一つのヌクレオチド・ライブラリーを形成し得る。
【0096】
本発明のライブラリーには、類似するが、同一ではない分子が複数含まれる。ライブラ
リーに含まれる類似分子の種類（の数）のことを「ライブラリーの多様性」という。例え
ば、１００種の類似分子からなるライブラリーの多様性は１０２である。本発明において
、ライブラリーの多様性は、特に限定されるものではないが、その数値が高いほど好まし
い。
リーに含まれる類似分子の種類（の数）のことを「ライブラリーの多様性」という。例え
ば、１００種の類似分子からなるライブラリーの多様性は１０２である。本発明において
、ライブラリーの多様性は、特に限定されるものではないが、その数値が高いほど好まし
い。
【0097】
本発明の同定方法および該同定方法の工程を含むペプチドの製造方法において使用され
るペプチド・ライブラリーの多様性は、１×１０５以上、２×１０５以上、５×１０５以
上、１×１０６以上、２×１０６以上、５×１０６以上、１×１０７以上、２×１０７以
上、５×１０７以上、１×１０８以上、２×１０８以上、５×１０８以上、１×１０９以
上、２×１０９以上、５×１０９以上、１×１０１０以上、２×１０１０以上、５×１０
１０以上、１×１０１１以上、２×１０１１以上、５×１０１１以上、１×１０１２以上
、２×１０１２以上、５×１０１２以上、１×１０１３以上、２×１０１３以上、５×１
０１３以上、１×１０１４以上、２×１０１４以上、５×１０１４以上、１×１０１５以
上、２×１０１５以上、５×１０１５以上、１×１０１６以上、２×１０１６以上、５×
１０１６以上、または、１×１０１７以上である。かかるライブラリーの多様性は、実測
値に限定されるものではなく、理論値であってもよい。
るペプチド・ライブラリーの多様性は、１×１０５以上、２×１０５以上、５×１０５以
上、１×１０６以上、２×１０６以上、５×１０６以上、１×１０７以上、２×１０７以
上、５×１０７以上、１×１０８以上、２×１０８以上、５×１０８以上、１×１０９以
上、２×１０９以上、５×１０９以上、１×１０１０以上、２×１０１０以上、５×１０
１０以上、１×１０１１以上、２×１０１１以上、５×１０１１以上、１×１０１２以上
、２×１０１２以上、５×１０１２以上、１×１０１３以上、２×１０１３以上、５×１
０１３以上、１×１０１４以上、２×１０１４以上、５×１０１４以上、１×１０１５以
上、２×１０１５以上、５×１０１５以上、１×１０１６以上、２×１０１６以上、５×
１０１６以上、または、１×１０１７以上である。かかるライブラリーの多様性は、実測
値に限定されるものではなく、理論値であってもよい。
【0098】
７．同定方法
本発明は、標的分子に結合するペプチドおよび／またはペプチド誘導体の同定方法を提
供する。本発明の同定方法は、例えば、前記の工程（４－１）および（４－２）、（６－
１）および（６－２）、（７－１）および（７－２）等を含んでいてもよいが、それらに
限定されない。
本発明は、標的分子に結合するペプチドおよび／またはペプチド誘導体の同定方法を提
供する。本発明の同定方法は、例えば、前記の工程（４－１）および（４－２）、（６－
１）および（６－２）、（７－１）および（７－２）等を含んでいてもよいが、それらに
限定されない。
【0099】
（１）標的分子
本発明において「標的分子」とは、本発明のペプチドが結合する、ヒトもしくは非ヒト
動物の個体に内在する物質または生体内に取り込まれ得る外因性の物質を意味する。本発
明の標的分子は、好適にはＳＰＩＮＫ２の内在性の標的であるトリプシンおよび／または
アクロシン以外の、より好適にはトリプシン以外の分子であり、より一層好適にはヒト由
来のトリプシン以外のヒト由来の分子である。さらにより一層好適には、かかるヒト個体
が罹患し得る疾患の発症もしくは増悪に直接または間接的に関与し得るか、または、かか
る疾患と相関もしくは逆相関を示す、内在するかあるいは外因性の酵素、受容体、該受容
体のリガンド、サイトカイン等の液性因子、その他の生体高分子、シグナル伝達物質、細
胞、病原体、毒素、または、それらのいずれか一つもしくはそれ以上に由来する物質、例
えば、その断片、分解物、代謝産物、加工物等である（以下、「疾患関連標的分子」とい
う）。また、本発明の標的分子は、鉱物、ポリマー、プラスチック、合成低分子化合物等
の非天然物質であってもよい。
本発明において「標的分子」とは、本発明のペプチドが結合する、ヒトもしくは非ヒト
動物の個体に内在する物質または生体内に取り込まれ得る外因性の物質を意味する。本発
明の標的分子は、好適にはＳＰＩＮＫ２の内在性の標的であるトリプシンおよび／または
アクロシン以外の、より好適にはトリプシン以外の分子であり、より一層好適にはヒト由
来のトリプシン以外のヒト由来の分子である。さらにより一層好適には、かかるヒト個体
が罹患し得る疾患の発症もしくは増悪に直接または間接的に関与し得るか、または、かか
る疾患と相関もしくは逆相関を示す、内在するかあるいは外因性の酵素、受容体、該受容
体のリガンド、サイトカイン等の液性因子、その他の生体高分子、シグナル伝達物質、細
胞、病原体、毒素、または、それらのいずれか一つもしくはそれ以上に由来する物質、例
えば、その断片、分解物、代謝産物、加工物等である（以下、「疾患関連標的分子」とい
う）。また、本発明の標的分子は、鉱物、ポリマー、プラスチック、合成低分子化合物等
の非天然物質であってもよい。
【0100】
本発明のある態様として好適な標的分子はトリプシンおよび／またはアクロシン以外の
、より好適にはトリプシン以外のプロテアーゼであり、より一層好適にはセリンプロテア
ーゼである。さらにより一層好適にはエンド型のセリンプロテアーゼであり、エンド型セ
リンプロテアーゼの例としては、キモトリプシンをあげることができる。組織、体液、細
胞等から特定の蛋白質成分を精製、単離する際、かかる成分を含有する画分にそれらのプ
ロテアーゼ阻害剤を添加すれば、かかる成分の分解を低減することができ、それらのプロ
テアーゼ阻害剤は組換型および非組換型の各種蛋白質の製造に有用である。
また、それらのプロテアーゼは好適には疾患関連標的分子である。
、より好適にはトリプシン以外のプロテアーゼであり、より一層好適にはセリンプロテア
ーゼである。さらにより一層好適にはエンド型のセリンプロテアーゼであり、エンド型セ
リンプロテアーゼの例としては、キモトリプシンをあげることができる。組織、体液、細
胞等から特定の蛋白質成分を精製、単離する際、かかる成分を含有する画分にそれらのプ
ロテアーゼ阻害剤を添加すれば、かかる成分の分解を低減することができ、それらのプロ
テアーゼ阻害剤は組換型および非組換型の各種蛋白質の製造に有用である。
また、それらのプロテアーゼは好適には疾患関連標的分子である。
【0101】
本発明の標的分子は、本発明のペプチド・ライブラリーから該標的分子に結合するペプ
チド、該標的分子を刺激するペプチドまたは該標的分子に拮抗するペプチドを選抜する際
、被検ペプチドと標的分子に対する結合性または刺激活性もしくは拮抗活性を判定する際
等に使用される。かかる標的分子は、全長分子若しくはその断片、または任意のアミノ酸
、ペプチド、蛋白質、糖鎖、ポリマー、担体等が付加された誘導体であってもよい。また
、かかる標的分子は固相化されていてもよい。
チド、該標的分子を刺激するペプチドまたは該標的分子に拮抗するペプチドを選抜する際
、被検ペプチドと標的分子に対する結合性または刺激活性もしくは拮抗活性を判定する際
等に使用される。かかる標的分子は、全長分子若しくはその断片、または任意のアミノ酸
、ペプチド、蛋白質、糖鎖、ポリマー、担体等が付加された誘導体であってもよい。また
、かかる標的分子は固相化されていてもよい。
【0102】
（２）標的分子の調製
本発明の標的分子は、疾患に罹患した組織、細胞から単離、精製して、あるいは組織、
細胞等にその全部又は一部が結合又は含まれた形態で、使用することができる。また、本
発明の標的分子は、化学合成、遺伝子組換え、イン・ビトロ翻訳等、ペプチドまたは蛋白
質の製造方法として当業者に周知の方法により調製することができる。このようにして得
られた標的分子から、必要に応じて、前述のような誘導体を調製してもよい。
本発明の標的分子は、疾患に罹患した組織、細胞から単離、精製して、あるいは組織、
細胞等にその全部又は一部が結合又は含まれた形態で、使用することができる。また、本
発明の標的分子は、化学合成、遺伝子組換え、イン・ビトロ翻訳等、ペプチドまたは蛋白
質の製造方法として当業者に周知の方法により調製することができる。このようにして得
られた標的分子から、必要に応じて、前述のような誘導体を調製してもよい。
【0103】
本発明において、ペプチドまたは蛋白質は、イン・ビトロ翻訳、すなわち、かかるペプ
チドまたは蛋白質に対応するＤＮＡ、ｃＤＮＡ等のヌクレオチドもしくは該ヌクレオチド
を含むベクターを、転写および翻訳に必要な酵素、基質、エネルギー物質等を含む溶液中
で保温することによりイン・ビトロで所望のペプチドまたは蛋白質を合成する方法、遺伝
子組換え、すなわち、該ヌクレオチド若しくはベクターを原核もしくは真核の細胞（宿主
細胞）へ導入し、得られた組換え細胞を培養した後、該培養物から所望のペプチドまたは
蛋白質を回収する方法、化学合成等により調製することができる。
チドまたは蛋白質に対応するＤＮＡ、ｃＤＮＡ等のヌクレオチドもしくは該ヌクレオチド
を含むベクターを、転写および翻訳に必要な酵素、基質、エネルギー物質等を含む溶液中
で保温することによりイン・ビトロで所望のペプチドまたは蛋白質を合成する方法、遺伝
子組換え、すなわち、該ヌクレオチド若しくはベクターを原核もしくは真核の細胞（宿主
細胞）へ導入し、得られた組換え細胞を培養した後、該培養物から所望のペプチドまたは
蛋白質を回収する方法、化学合成等により調製することができる。
【0104】
標的分子が細胞膜に存在する蛋白質またはそのドメインである場合、かかる蛋白質また
はドメインの細胞外領域と免疫グロブリン（Ｉｇ）の定常領域とが連結してなる融合蛋白
質を適切な宿主－ベクター系において発現させることにより、分泌蛋白質として当該分子
を調製することもできる。
はドメインの細胞外領域と免疫グロブリン（Ｉｇ）の定常領域とが連結してなる融合蛋白
質を適切な宿主－ベクター系において発現させることにより、分泌蛋白質として当該分子
を調製することもできる。
【0105】
標的分子に対応するヌクレオチドは、例えば、発現クローニング法により取得すること
ができるが、これに限定されるものではない。発現クローニング法は、ペプチドまたは蛋
白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むｃＤＮＡの発現ライブラリーを構築し、
かかるｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、該ｃＤＮＡの全長または一部を特異的に増幅す
るプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という：サイキ他、サイ
エンス、２３９巻、４８７乃至４８９頁、１９８８年刊行：Ｓａｉｋｉ， Ｒ． Ｋ．，
ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８８）， ｖｏｌ．２３９， ｐｐ４８７－
４８９）を行うことにより、ペプチドまたは蛋白質に対応するｃＤＮＡをクローニングす
る方法である。
ができるが、これに限定されるものではない。発現クローニング法は、ペプチドまたは蛋
白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むｃＤＮＡの発現ライブラリーを構築し、
かかるｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、該ｃＤＮＡの全長または一部を特異的に増幅す
るプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という：サイキ他、サイ
エンス、２３９巻、４８７乃至４８９頁、１９８８年刊行：Ｓａｉｋｉ， Ｒ． Ｋ．，
ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８８）， ｖｏｌ．２３９， ｐｐ４８７－
４８９）を行うことにより、ペプチドまたは蛋白質に対応するｃＤＮＡをクローニングす
る方法である。
【0106】
イン・ビトロ翻訳に適用し得るキットや試薬としては、例えば、ロシュ・ダイアグノス
ティックス社製のラピッドトランスレーションシステム（ＲＴＳ）等を挙げることができ
る。
ティックス社製のラピッドトランスレーションシステム（ＲＴＳ）等を挙げることができ
る。
【0107】
遺伝子組換えの宿主細胞としては、本発明の細胞を調製するための宿主細胞として適用
可能な原核または真核の細胞を適宜選択することができる。
可能な原核または真核の細胞を適宜選択することができる。
【0108】
遺伝子組換えにおいて得られた組換え細胞（ヌクレオチドまたはベクターが導入された
細胞）は、当業者に周知の方法に従って培養することができ、該培養物中またはかかる細
胞内に所望のペプチドまたは蛋白質を産生させることができる。
細胞）は、当業者に周知の方法に従って培養することができ、該培養物中またはかかる細
胞内に所望のペプチドまたは蛋白質を産生させることができる。
【0109】
かかる培養に用いられる培地は、宿主細胞に応じて慣用されるものから適宜選択するこ
とができる。宿主細胞が大腸菌の場合、例えば、ＬＢ培地に必要に応じて、アンピシリン
等の抗生物質やＩＰＴＧを添加して培養に供することができる。
とができる。宿主細胞が大腸菌の場合、例えば、ＬＢ培地に必要に応じて、アンピシリン
等の抗生物質やＩＰＴＧを添加して培養に供することができる。
【0110】
かかる培養により、組換え細胞の内外に産生された所望のペプチドまたは蛋白質は、そ
の物理的、化学的および／または生物学的性質等を利用した公知の分画手法を適宜組み合
わせることにより、精製および単離することができる。
の物理的、化学的および／または生物学的性質等を利用した公知の分画手法を適宜組み合
わせることにより、精製および単離することができる。
【0111】
かかる分画手法としては、例えば、塩析、蛋白質沈殿剤による処理、透析、限外濾過、
分子ふるい（ゲル濾過）クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、疎水
クロマトグラフィー等をあげることができるが、これらに限定されるものではない。
分子ふるい（ゲル濾過）クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、疎水
クロマトグラフィー等をあげることができるが、これらに限定されるものではない。
【0112】
また、ペプチドまたは蛋白質に、予め、精製するために有用な部分を連結または付加さ
せることにより、効率よく所望のペプチドまたは蛋白質を精製することができる。例えば
、予め６残基からなるヒスチジンタグを連結しておくことにより、ニッケル・アフィニテ
ィー・クロマトグラフィーにより効率よく所望のペプチドまたは蛋白質を精製することが
できる。また、予めＩｇＧのＦｃ領域を連結しておくことにより、プロテインＡ・アフィ
ニティー・クロマトグラフィーにより効率よく所望のペプチドまたは蛋白質を精製するこ
とができる
せることにより、効率よく所望のペプチドまたは蛋白質を精製することができる。例えば
、予め６残基からなるヒスチジンタグを連結しておくことにより、ニッケル・アフィニテ
ィー・クロマトグラフィーにより効率よく所望のペプチドまたは蛋白質を精製することが
できる。また、予めＩｇＧのＦｃ領域を連結しておくことにより、プロテインＡ・アフィ
ニティー・クロマトグラフィーにより効率よく所望のペプチドまたは蛋白質を精製するこ
とができる
【0113】
（３）標的分子とペプチドおよび／またはペプチド誘導体との接触
本発明の同定方法は、ペプチドおよび／またはその誘導体と標的分子とを接触させる工
程を含む。ここで、該ペプチドおよび／またはその誘導体は、ペプチド・ライブラリーに
含まれていてもよい。すなわち、本発明の同定方法は、ペプチド・ライブラリーに含まれ
るペプチドおよび／またはその誘導体と標的分子とを接触させる工程を含んでもよい。
本発明の同定方法は、ペプチドおよび／またはその誘導体と標的分子とを接触させる工
程を含む。ここで、該ペプチドおよび／またはその誘導体は、ペプチド・ライブラリーに
含まれていてもよい。すなわち、本発明の同定方法は、ペプチド・ライブラリーに含まれ
るペプチドおよび／またはその誘導体と標的分子とを接触させる工程を含んでもよい。
【0114】
本発明において「接触させる」とは、二つまたはそれ以上の物質を、当該物質のうち二
つ以上の間で相互作用可能な距離まで接近させることを意味する。かかる相互作用として
は、例えば、共有結合、配位結合、金属－金属間結合、イオン結合、金属結合、水素結合
、ファンデルワールス結合等（以下、「化学結合」という。）、クーロン力による結合、
イオン間相互作用、水素結合、双極子相互作用、ファンデルワールス力等の静電的相互作
用に基づく相互作用（以下、「分子間力」という。）、その他の相互作用、電荷移動相互
作用、渡環相互作用、疎水相互作用、ペプチドと生体分子との会合等を挙げることができ
るが、それらに限定されるものではない。本発明において「二つまたはそれ以上の物質」
とは、標的分子および被検物質を含んでいれば、特に限定されるものではない。被検物質
としては、標的分子に結合する物質であれば特に限定されるものではないが、例えば、本
発明のペプチド、該ペプチドの誘導体、それらのいずれかが固相化された担体、それらの
いずれかが発現もしくは提示（ディスプレイと同義）された細胞、ウイルス粒子またはウ
イルス様粒子（ファージ、ファージミドを含む）等をあげることができる。かかる被検物
質は、ファージ・ディスプレイ、リボゾーム・ディスプレイ、核酸ディスプレイ等により
、真核または原核の細胞表面上に、ウイルス粒子またはウイルス様粒子上に、あるいはリ
ボゾームまたは核酸にリンクした形で、発現または提示（ディスプレイと同義）されてい
てもよい。
つ以上の間で相互作用可能な距離まで接近させることを意味する。かかる相互作用として
は、例えば、共有結合、配位結合、金属－金属間結合、イオン結合、金属結合、水素結合
、ファンデルワールス結合等（以下、「化学結合」という。）、クーロン力による結合、
イオン間相互作用、水素結合、双極子相互作用、ファンデルワールス力等の静電的相互作
用に基づく相互作用（以下、「分子間力」という。）、その他の相互作用、電荷移動相互
作用、渡環相互作用、疎水相互作用、ペプチドと生体分子との会合等を挙げることができ
るが、それらに限定されるものではない。本発明において「二つまたはそれ以上の物質」
とは、標的分子および被検物質を含んでいれば、特に限定されるものではない。被検物質
としては、標的分子に結合する物質であれば特に限定されるものではないが、例えば、本
発明のペプチド、該ペプチドの誘導体、それらのいずれかが固相化された担体、それらの
いずれかが発現もしくは提示（ディスプレイと同義）された細胞、ウイルス粒子またはウ
イルス様粒子（ファージ、ファージミドを含む）等をあげることができる。かかる被検物
質は、ファージ・ディスプレイ、リボゾーム・ディスプレイ、核酸ディスプレイ等により
、真核または原核の細胞表面上に、ウイルス粒子またはウイルス様粒子上に、あるいはリ
ボゾームまたは核酸にリンクした形で、発現または提示（ディスプレイと同義）されてい
てもよい。
【0115】
（４）選抜
本発明の同定方法は所望の性質を有するペプチドおよび／またはペプチド誘導体、好適
には標的分子に結合するペプチドおよび／またはペプチド誘導体を選抜する工程を含む。
本発明の同定方法は所望の性質を有するペプチドおよび／またはペプチド誘導体、好適
には標的分子に結合するペプチドおよび／またはペプチド誘導体を選抜する工程を含む。
【0116】
本発明において「結合」とは、ある条件の下において、二つまたはそれ以上の物質が、
それらの間で相互作用（本発明の他の部分に記載されている）が生じ得る程度に、互いに
近接しているか、あるいは会合した状態になることを意味する。
それらの間で相互作用（本発明の他の部分に記載されている）が生じ得る程度に、互いに
近接しているか、あるいは会合した状態になることを意味する。
【0117】
本発明においては、ある条件の下で、標的分子と被検物質とを接触させ、次いで該標的
分子に非特異的に吸着した被検物質および該標的分子に結合又は吸着しなかった被検物質
を、被検物質を含む画分から除去した後も、該画分中に被検物質が存在していれば、かか
る被検物質は該標的分子に「結合」すると解することができる。
分子に非特異的に吸着した被検物質および該標的分子に結合又は吸着しなかった被検物質
を、被検物質を含む画分から除去した後も、該画分中に被検物質が存在していれば、かか
る被検物質は該標的分子に「結合」すると解することができる。
【0118】
二つまたはそれ以上の物質の間に単なる非特異的な吸着しか生じていない場合、それら
の物質の間に「結合」は生じていないと解することができる。また、二つまたはそれ以上
の物質を接触させても、それらの間で相互作用（本発明の他の部分に記載されている）が
生じ得る程度に、互いに近接しないか、あるいは会合した状態にならない場合、それらの
物質の間に「結合」は生じていないと解することができる。
の物質の間に「結合」は生じていないと解することができる。また、二つまたはそれ以上
の物質を接触させても、それらの間で相互作用（本発明の他の部分に記載されている）が
生じ得る程度に、互いに近接しないか、あるいは会合した状態にならない場合、それらの
物質の間に「結合」は生じていないと解することができる。
【0119】
抗体と抗原の「結合」を測定する方法としては、フローサイトメトリー等により測定を
行う蛍光抗体法（直接法、間接法）、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ
（均一法、不均一法）、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ等が広く使用されている。これらの
方法において、被検抗体および抗原を本発明のペプチドまたはその誘導体および標的分子
に置き換えれば、抗体と抗原の「結合」の測定と同様に、ペプチドまたはその誘導体と標
的分子の「結合」の有無を測定することができる。
行う蛍光抗体法（直接法、間接法）、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ
（均一法、不均一法）、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ等が広く使用されている。これらの
方法において、被検抗体および抗原を本発明のペプチドまたはその誘導体および標的分子
に置き換えれば、抗体と抗原の「結合」の測定と同様に、ペプチドまたはその誘導体と標
的分子の「結合」の有無を測定することができる。
【0120】
また、「結合」の有無は、結合活性または親和性の指標を測定することにより、決定す
ることができる。結合親和性の指標としては、解離定数、結合定数等をあげることができ
る。
ることができる。結合親和性の指標としては、解離定数、結合定数等をあげることができ
る。
【0121】
以下で表される化学平衡状態にある分子ＡおよびＡに結合する物質Ｂの化学的解離につ
いて、
いて、
【0122】
【化1】
【0123】
解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ：Ｋｄ）は次の式により算出す
ることができる：
Ｋｄ＝［Ａ］［Ｂ］／［ＡＢ］
ここで［Ａ］、［Ｂ］および［ＡＢ］は、Ａ、ＢおよびＡＢ（会合体）の濃度をそれぞれ
意味する。Ｋｄは解離したＡおよびＢと解離していないＡＢとの比を意味するものであり
、Ｋｄの逆数は結合定数（Ｋａ）である。
ることができる：
Ｋｄ＝［Ａ］［Ｂ］／［ＡＢ］
ここで［Ａ］、［Ｂ］および［ＡＢ］は、Ａ、ＢおよびＡＢ（会合体）の濃度をそれぞれ
意味する。Ｋｄは解離したＡおよびＢと解離していないＡＢとの比を意味するものであり
、Ｋｄの逆数は結合定数（Ｋａ）である。
【0124】
本発明において用いられる「解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ
）」は、主に、ある標的分子に結合するためのペプチドおよび／またはペプチド誘導体の
平衡（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）解離定数を意味する。
）」は、主に、ある標的分子に結合するためのペプチドおよび／またはペプチド誘導体の
平衡（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）解離定数を意味する。
【0125】
本発明において、解離定数は、解離した物質（ペプチド、ペプチド誘導体、標的分子等
）および解離していない物質（ペプチドおよび／またはペプチド誘導体－標的分子会合体
等）の濃度を測定することにより、算出することができる。解離定数の測定－算出方法と
しては、当業者に周知の方法であれば特に限定されるものではないが、例えば、表面プラ
ズモン共鳴を用いた方法、等温滴定カロリメトリー法等をあげることができる。
）および解離していない物質（ペプチドおよび／またはペプチド誘導体－標的分子会合体
等）の濃度を測定することにより、算出することができる。解離定数の測定－算出方法と
しては、当業者に周知の方法であれば特に限定されるものではないが、例えば、表面プラ
ズモン共鳴を用いた方法、等温滴定カロリメトリー法等をあげることができる。
【0126】
表面プラズモン共鳴を用いた方法においては、標的分子とそれに結合するペプチドおよ
び／またはその誘導体の相互作用を、次のとおり測定－算出することができる：複数のペ
プチド濃度において、表面プラズモン共鳴により、一連の結合・解離反応を検出する；得
られた一連の結合・解離反応を解析する；得られた各種速度定数から解離定数を算出する
。
び／またはその誘導体の相互作用を、次のとおり測定－算出することができる：複数のペ
プチド濃度において、表面プラズモン共鳴により、一連の結合・解離反応を検出する；得
られた一連の結合・解離反応を解析する；得られた各種速度定数から解離定数を算出する
。
【0127】
表面プラズモン共鳴の測定－算出システムとしては、例えば、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒ
ｅ）・システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）等をあげることができるが、これに限
定されるものではない。ビアコア・システムを用いた場合の手順は次の通りである：ビア
コア・システムのセンサーチップ上に標的分子をアミンカップリングで固定化する；複数
のペプチド濃度において、該標的分子とペプチドとを接触させる；両者の相互作用を表面
プラズモン共鳴により検出する；一連の結合・解離反応を、横軸を時間とし、縦軸を結合
量（ＲＵ）とする、センサーグラムとして描き出す；複数のペプチド濃度で描き出された
センサーグラムから、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃ
ａｒｅ社製）を用いて、１：１ ラングミュアーモデルにフィッティングさせ、各種速度
パラメーターを算出する；各種速度パラメーターから解離定数を算出する。
ｅ）・システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）等をあげることができるが、これに限
定されるものではない。ビアコア・システムを用いた場合の手順は次の通りである：ビア
コア・システムのセンサーチップ上に標的分子をアミンカップリングで固定化する；複数
のペプチド濃度において、該標的分子とペプチドとを接触させる；両者の相互作用を表面
プラズモン共鳴により検出する；一連の結合・解離反応を、横軸を時間とし、縦軸を結合
量（ＲＵ）とする、センサーグラムとして描き出す；複数のペプチド濃度で描き出された
センサーグラムから、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃ
ａｒｅ社製）を用いて、１：１ ラングミュアーモデルにフィッティングさせ、各種速度
パラメーターを算出する；各種速度パラメーターから解離定数を算出する。
【0128】
等温滴定カロリメトリー法においては、標的分子とそれに結合するペプチドおよび／ま
たはその誘導体の相互作用を、次のとおり測定－算出することができる：標的分子を含む
溶液にペプチド溶液を滴下する（逆でも可）；相互作用により発生した熱量を測定し、結
合等温線を描く；結合等温線から解離定数（ＫＤ）、反応の結合比（Ｎ）、エンタルピー
変化（ΔＨ）、エントロピー変化（ΔＳ）が得られる。
たはその誘導体の相互作用を、次のとおり測定－算出することができる：標的分子を含む
溶液にペプチド溶液を滴下する（逆でも可）；相互作用により発生した熱量を測定し、結
合等温線を描く；結合等温線から解離定数（ＫＤ）、反応の結合比（Ｎ）、エンタルピー
変化（ΔＨ）、エントロピー変化（ΔＳ）が得られる。
【0129】
分子間相互作用に伴う微小な熱変化（発熱変化もしくは吸熱変化）をダイレクトに測定
するシステムとしては、例えば、ＭｉｃｒｏＣａｌ・システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａ
ｒｅ社）等をあげることができるが、これに限定されるものではない。ＭｉｃｒｏＣａｌ
・システムを用いた場合の手順は次の通りである：一定温度に保たれたサンプルセルにリ
ガンド溶液を滴定し攪拌する；分子間相互作用により結合量に正比例した熱の発生または
吸収が起こり、サンプルセル中の溶液温度が変化する；セルフィードバックネットワーク
（ＣＦＢ）がリファレンスセルとの温度差（ΔＴ）を感知する；ΔＴが０になるようにリ
ファレンスセルまたはサンプルセルを加熱する；ΔＴ＝０を保持するために要したフィー
ドバック電力を測定することで、相互作用による発熱量または吸熱量を得る；発生熱量を
縦軸に、標的分子とペプチドのモル比を横軸にとり、結合等温線から解離定数を算出する
。
するシステムとしては、例えば、ＭｉｃｒｏＣａｌ・システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａ
ｒｅ社）等をあげることができるが、これに限定されるものではない。ＭｉｃｒｏＣａｌ
・システムを用いた場合の手順は次の通りである：一定温度に保たれたサンプルセルにリ
ガンド溶液を滴定し攪拌する；分子間相互作用により結合量に正比例した熱の発生または
吸収が起こり、サンプルセル中の溶液温度が変化する；セルフィードバックネットワーク
（ＣＦＢ）がリファレンスセルとの温度差（ΔＴ）を感知する；ΔＴが０になるようにリ
ファレンスセルまたはサンプルセルを加熱する；ΔＴ＝０を保持するために要したフィー
ドバック電力を測定することで、相互作用による発熱量または吸熱量を得る；発生熱量を
縦軸に、標的分子とペプチドのモル比を横軸にとり、結合等温線から解離定数を算出する
。
【0130】
本発明の同定方法および／または判定方法（後述）においては、例えば、標的分子に対
して１００μＭ以下、５０μＭ以下、２０μＭ以下、１０μＭ以下、５μＭ以下、２μＭ
以下、１μＭ以下、５００ｎＭ（０．５μＭ）以下、２００ｎＭ以下、１００ｎｍ以下、
５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、５
００ｐＭ（０．５ｎＭ）以下、２００ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、２０ｐ
Ｍ以下、１０ｐＭ以下、５ｐＭ以下、２ｐＭ以下、または、１ｐＭ以下、の解離定数を示
す被検物質を、標的分子に結合する、すなわち陽性と決定することができるが、解離定数
の基準値、および「結合」の有無を決定する基準はこれらに限定されるものではない。
して１００μＭ以下、５０μＭ以下、２０μＭ以下、１０μＭ以下、５μＭ以下、２μＭ
以下、１μＭ以下、５００ｎＭ（０．５μＭ）以下、２００ｎＭ以下、１００ｎｍ以下、
５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、５
００ｐＭ（０．５ｎＭ）以下、２００ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、２０ｐ
Ｍ以下、１０ｐＭ以下、５ｐＭ以下、２ｐＭ以下、または、１ｐＭ以下、の解離定数を示
す被検物質を、標的分子に結合する、すなわち陽性と決定することができるが、解離定数
の基準値、および「結合」の有無を決定する基準はこれらに限定されるものではない。
【0131】
本発明の同定方法において、「選抜」の工程は、標的分子に結合する被検物質を回収す
る工程でもあり、その産物中に標的分子に結合する被検物質が含有されているかまたは濃
縮されていれば、かかる産物は、該標的分子に結合する物質のみからなるもの、および、
該標的分子には結合しない物質が混在しているもののいずれであってもよい。また、かか
る産物中に含有または濃縮された、標的分子に結合する被検物質は、単一のものであって
も、２種以上の混合物であってもよい。
る工程でもあり、その産物中に標的分子に結合する被検物質が含有されているかまたは濃
縮されていれば、かかる産物は、該標的分子に結合する物質のみからなるもの、および、
該標的分子には結合しない物質が混在しているもののいずれであってもよい。また、かか
る産物中に含有または濃縮された、標的分子に結合する被検物質は、単一のものであって
も、２種以上の混合物であってもよい。
【0132】
本発明の同定方法における選抜工程、すなわち回収工程とは、標的分子に結合する物質
が含まれるかまたは濃縮された画分を回収する工程を意味する。かかる工程は、本発明の
技術分野において当業者に周知の分画－精製方法であれば特に限定されるものではないが
、標的分子に結合した物質と、標的分子には結合しなかった物質および標的分子に非特異
的に吸着した物質とを標的分子（を含む画分）から分離する工程、標的分子に結合した物
質を溶出する（標的分子から分離する）工程等を含んでいてもよい。かかる工程において
は、結合の有無につき解離定数等の判定基準を設けなくてもよい。
が含まれるかまたは濃縮された画分を回収する工程を意味する。かかる工程は、本発明の
技術分野において当業者に周知の分画－精製方法であれば特に限定されるものではないが
、標的分子に結合した物質と、標的分子には結合しなかった物質および標的分子に非特異
的に吸着した物質とを標的分子（を含む画分）から分離する工程、標的分子に結合した物
質を溶出する（標的分子から分離する）工程等を含んでいてもよい。かかる工程において
は、結合の有無につき解離定数等の判定基準を設けなくてもよい。
【0133】
本発明においては、本発明の同定方法に含まれる「選抜」を「パニング」と呼ぶことが
ある。本発明において、「パニング」とは、本発明のペプチドおよび／またはペプチド誘
導体と標的分子とを接触させ、該標的分子に結合するペプチドおよび／またはペプチド誘
導体を回収（選抜、濃縮、単離を含む）することを意味する。
ある。本発明において、「パニング」とは、本発明のペプチドおよび／またはペプチド誘
導体と標的分子とを接触させ、該標的分子に結合するペプチドおよび／またはペプチド誘
導体を回収（選抜、濃縮、単離を含む）することを意味する。
【0134】
パニングには当業者に周知の方法を適用することができ、例えば、固相パニング法、液
相パニング法をあげることができるが、これに限定されるものではない。固相パニング法
では、例えば、標的分子を固相化し、次いで液相に含まれるペプチドと該標的分子とを接
触させ、次いで標的分子に結合しなかったペプチドおよび非特異的に結合したペプチドを
除去した後、該標的分子に結合したペプチドを選択的に固相（に結合した該標的分子）か
ら分離させることにより、所望の結合活性を有するペプチドを選抜することができるが、
固相パニング法の操作はこれに限定されるものではない。液相パニング法では、例えば、
溶液中でペプチドと該標的分子とを接触させ、次いで標的分子に結合しなかったペプチド
および非特異的に結合したペプチドを除去した後、該標的分子に結合したペプチドを選択
的に該標的から分離させることにより、所望の結合活性を有するペプチドを選抜すること
ができるが、液相パニング法の操作はこれに限定されるものではない。
相パニング法をあげることができるが、これに限定されるものではない。固相パニング法
では、例えば、標的分子を固相化し、次いで液相に含まれるペプチドと該標的分子とを接
触させ、次いで標的分子に結合しなかったペプチドおよび非特異的に結合したペプチドを
除去した後、該標的分子に結合したペプチドを選択的に固相（に結合した該標的分子）か
ら分離させることにより、所望の結合活性を有するペプチドを選抜することができるが、
固相パニング法の操作はこれに限定されるものではない。液相パニング法では、例えば、
溶液中でペプチドと該標的分子とを接触させ、次いで標的分子に結合しなかったペプチド
および非特異的に結合したペプチドを除去した後、該標的分子に結合したペプチドを選択
的に該標的から分離させることにより、所望の結合活性を有するペプチドを選抜すること
ができるが、液相パニング法の操作はこれに限定されるものではない。
【0135】
本発明の同定方法において、表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ：表現形質と同義）に対応す
る遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）：遺伝形質と同義）がリンクしたライブラリーを用いるこ
とにより、標的分子に結合するペプチド（「ペプチド誘導体に含まれるペプチド」をも含
む）に対応するヌクレオチドを効率よく選抜し、それゆえ該ペプチドを効率よく調製する
ことが可能になる。表現型とそれに対応する遺伝型（以下、単に「表現型と遺伝型」とい
う）のリンクは、直接的および間接的のいずれであってもよい。
る遺伝型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）：遺伝形質と同義）がリンクしたライブラリーを用いるこ
とにより、標的分子に結合するペプチド（「ペプチド誘導体に含まれるペプチド」をも含
む）に対応するヌクレオチドを効率よく選抜し、それゆえ該ペプチドを効率よく調製する
ことが可能になる。表現型とそれに対応する遺伝型（以下、単に「表現型と遺伝型」とい
う）のリンクは、直接的および間接的のいずれであってもよい。
【0136】
表現型と遺伝型が「直接的にリンクした」とは、表現型と遺伝型の挙動が一致している
ことを意味する。表現型と遺伝型の間に、他の部分が介在している等、一定の距離があっ
ても、両者の挙動が一致していれば「直接的にリンクした」の意味に包含される。すなわ
ち、両者が物理的に隣接していることは必須ではない。
ことを意味する。表現型と遺伝型の間に、他の部分が介在している等、一定の距離があっ
ても、両者の挙動が一致していれば「直接的にリンクした」の意味に包含される。すなわ
ち、両者が物理的に隣接していることは必須ではない。
【0137】
本発明において、表現型と遺伝型の「挙動が一致している」とは、本発明のペプチド、
ヌクレオチド、ベクター、細胞、製造方法、同定方法、判定方法、ペプチド・ライブラリ
ー、ヌクレオチド・ライブラリー、組成物、試薬等の態様おいて、両者の挙動が一致して
いることを意味する。それらの態様において、経時的に、一時的に、ある時点まで、もし
くは、ある時点以降、内的要因、外的要因、それらの組合せもしくはその他の要因により
、「挙動の一致」が全体的または部分的に失われても、「挙動が一致している」の意味に
包含される。
ヌクレオチド、ベクター、細胞、製造方法、同定方法、判定方法、ペプチド・ライブラリ
ー、ヌクレオチド・ライブラリー、組成物、試薬等の態様おいて、両者の挙動が一致して
いることを意味する。それらの態様において、経時的に、一時的に、ある時点まで、もし
くは、ある時点以降、内的要因、外的要因、それらの組合せもしくはその他の要因により
、「挙動の一致」が全体的または部分的に失われても、「挙動が一致している」の意味に
包含される。
【0138】
表現型と遺伝型が直接的にリンクしたものとしては、例えば、リボゾーム・ディスプレ
イ・ライブラリー、核酸ディスプレイ・ライブラリー、本発明のペプチドに対応するヌク
レオチドが直接的または間接的にリンクしていることを特徴とするペプチドおよび／また
はその誘導体、かかるペプチドおよび／またはその誘導体を含んでなるペプチド・ライブ
ラリー等をあげることができる。
イ・ライブラリー、核酸ディスプレイ・ライブラリー、本発明のペプチドに対応するヌク
レオチドが直接的または間接的にリンクしていることを特徴とするペプチドおよび／また
はその誘導体、かかるペプチドおよび／またはその誘導体を含んでなるペプチド・ライブ
ラリー等をあげることができる。
【0139】
表現型と遺伝型が「間接的にリンクした」とは、両者の挙動は必ずしも一致していない
か、または、両者は必ずしも「直接的にリンクし」ていないが、特定の表現型から該表現
型に対応する遺伝型へアクセスできることを意味する。表現型と遺伝型が間接的にリンク
したものとしては、例えば、ファージ・ディスプレイ・ライブラリー、発現クローニング
に用いられるｃＤＮＡライブラリー等をあげることができるが、これらに限定されるもの
ではない。
か、または、両者は必ずしも「直接的にリンクし」ていないが、特定の表現型から該表現
型に対応する遺伝型へアクセスできることを意味する。表現型と遺伝型が間接的にリンク
したものとしては、例えば、ファージ・ディスプレイ・ライブラリー、発現クローニング
に用いられるｃＤＮＡライブラリー等をあげることができるが、これらに限定されるもの
ではない。
【0140】
ファージ・ディスプレイ・ライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーに含まれる各クロー
ンにおいて、表現型としてのペプチドまたはその誘導体と、それに対応する遺伝型として
のヌクレオチドの挙動は、必ずしも一致していないが、該ライブラリーに含まれるペプチ
ドおよび／またはその誘導体と標的分子とを接触させ、標的分子に結合しなかったか、ま
たは標的分子に非特異的に吸着したファージ様粒子を除去した後、標的分子に結合したフ
ァージ様粒子を選択的に溶出させること等の工程を経ることにより、標的分子に結合する
ペプチドおよび／またはその誘導体（ファージ様粒子上に発現または提示された）を選抜
することができるとともに、対応する遺伝型、すなわち、かかるペプチドまたはその誘導
体（に含まれるペプチド）に対応するヌクレオチドを精製、単離し、その塩基配列を決定
することができる。このような表現型からそれに対応する遺伝型へのアクセス上のメリッ
トは、ファージ・ディスプレイ等の、表現型と遺伝型が「間接的にリンクした」場合に限
定されるものではなく、「直接的にリンクした」場合にも享受できる。
ンにおいて、表現型としてのペプチドまたはその誘導体と、それに対応する遺伝型として
のヌクレオチドの挙動は、必ずしも一致していないが、該ライブラリーに含まれるペプチ
ドおよび／またはその誘導体と標的分子とを接触させ、標的分子に結合しなかったか、ま
たは標的分子に非特異的に吸着したファージ様粒子を除去した後、標的分子に結合したフ
ァージ様粒子を選択的に溶出させること等の工程を経ることにより、標的分子に結合する
ペプチドおよび／またはその誘導体（ファージ様粒子上に発現または提示された）を選抜
することができるとともに、対応する遺伝型、すなわち、かかるペプチドまたはその誘導
体（に含まれるペプチド）に対応するヌクレオチドを精製、単離し、その塩基配列を決定
することができる。このような表現型からそれに対応する遺伝型へのアクセス上のメリッ
トは、ファージ・ディスプレイ等の、表現型と遺伝型が「間接的にリンクした」場合に限
定されるものではなく、「直接的にリンクした」場合にも享受できる。
【0141】
本発明の同定方法に含まれる工程は、２回以上繰り返して行うことができる。とりわけ
、選抜の工程で回収されたペプチドおよび／またはペプチド誘導体から、あらためてペプ
チド・ライブラリーを構築して、接触および選抜の工程を行うことにより、標的分子に結
合するペプチドおよび／またはその誘導体を、より高度に濃縮することが可能となる。そ
れらの操作をさらに繰り返すことにより、標的分子に結合するペプチドおよび／またはそ
の誘導体はより一層高度に濃縮され、最終的にそれらを単離する効率を上げることできる
。さらに、標的分子に結合するペプチドおよび／またはその誘導体がより一層高度に濃縮
されることで、よりアフィニティーの高いバインダーの単離が可能となる。
、選抜の工程で回収されたペプチドおよび／またはペプチド誘導体から、あらためてペプ
チド・ライブラリーを構築して、接触および選抜の工程を行うことにより、標的分子に結
合するペプチドおよび／またはその誘導体を、より高度に濃縮することが可能となる。そ
れらの操作をさらに繰り返すことにより、標的分子に結合するペプチドおよび／またはそ
の誘導体はより一層高度に濃縮され、最終的にそれらを単離する効率を上げることできる
。さらに、標的分子に結合するペプチドおよび／またはその誘導体がより一層高度に濃縮
されることで、よりアフィニティーの高いバインダーの単離が可能となる。
【0142】
また、標的分子に結合するペプチドおよび／またはその誘導体の高度な濃縮は、本発明
の同定方法に含まれる工程において、標的に結合したペプチドおよび／またはその誘導体
と非特異的に結合したものとをより強力に分離することによっても可能となる。そのよう
な分離方法としては、例えば、非特異的に結合したペプチド等を除去する工程の回数を増
やすことや、非特異的に結合したペプチドの除去に用いる試薬（界面活性剤等）をより強
力なものに変更すること等が挙げられる。
の同定方法に含まれる工程において、標的に結合したペプチドおよび／またはその誘導体
と非特異的に結合したものとをより強力に分離することによっても可能となる。そのよう
な分離方法としては、例えば、非特異的に結合したペプチド等を除去する工程の回数を増
やすことや、非特異的に結合したペプチドの除去に用いる試薬（界面活性剤等）をより強
力なものに変更すること等が挙げられる。
【0143】
本発明のペプチドまたはその誘導体は、単量体、ホモもしくはヘテロの二量体、三量体
、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、または、九個以上の単量体から構成される
多量体、のいずれの形態をもとり得る。
、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、または、九個以上の単量体から構成される
多量体、のいずれの形態をもとり得る。
【0144】
標的分子一分子または標的部位一箇所に結合する本発明のペプチドまたはその誘導体の
分子数は、１、２、３、４、５、６、７、８、または９以上のいずれでもよく、かかるぺ
プチドまたはその誘導体は、単量体、ホモもしくはヘテロの二量体、三量体、四量体、五
量体、六量体、七量体、八量体、または、九個以上の単量体から構成される多量体のいず
れの形態で標的分子に結合してもよい。
分子数は、１、２、３、４、５、６、７、８、または９以上のいずれでもよく、かかるぺ
プチドまたはその誘導体は、単量体、ホモもしくはヘテロの二量体、三量体、四量体、五
量体、六量体、七量体、八量体、または、九個以上の単量体から構成される多量体のいず
れの形態で標的分子に結合してもよい。
【0145】
本発明のペプチドまたはその誘導体一分子あたりが結合する標的分子の分子数または標
的部位数は、１、２、３、４、５、６、７、８、または９以上のいずれでもよい。
的部位数は、１、２、３、４、５、６、７、８、または９以上のいずれでもよい。
【0146】
また、本発明は標的分子の有する生物活性の一部又は全部を活性化もしくは促進するか
、または、阻害、不活性化もしくは抑制するペプチドまたはペプチド誘導体を同定する方
法、ならびに、標的分子を刺激するかもしくは拮抗するペプチドまたはペプチド誘導体を
同定する方法を提供する。すなわち、本発明は標的分子の活性化剤、促進剤もしくは刺激
剤（ａｇｏｎｉｓｔ）、または、阻害剤、不活性化剤、抑制剤もしくは拮抗剤（ａｎｔａ
ｇｏｎｉｓｔ）を同定する方法を提供する。それらの同定方法には、例えば、前記の工程
（６－１）乃至（６－３）、（７－１）乃至（７－３）等を含んでもよいが、それらの工
程を含むものに限定されない。
、または、阻害、不活性化もしくは抑制するペプチドまたはペプチド誘導体を同定する方
法、ならびに、標的分子を刺激するかもしくは拮抗するペプチドまたはペプチド誘導体を
同定する方法を提供する。すなわち、本発明は標的分子の活性化剤、促進剤もしくは刺激
剤（ａｇｏｎｉｓｔ）、または、阻害剤、不活性化剤、抑制剤もしくは拮抗剤（ａｎｔａ
ｇｏｎｉｓｔ）を同定する方法を提供する。それらの同定方法には、例えば、前記の工程
（６－１）乃至（６－３）、（７－１）乃至（７－３）等を含んでもよいが、それらの工
程を含むものに限定されない。
【0147】
８．組成物
本発明は組成物を提供する。
本発明は組成物を提供する。
【0148】
本発明の組成物は、本発明のペプチド、ペプチドの誘導体、ヌクレオチド、ベクターま
たは細胞を含むことからなる。
たは細胞を含むことからなる。
【0149】
本発明のペプチドまたはその誘導体（本発明の細胞表面上に提示されたものを含む）を
含むことからなる組成物は、該ペプチドまたはその誘導体が結合する標的分子を検出する
ために使用することができる。
含むことからなる組成物は、該ペプチドまたはその誘導体が結合する標的分子を検出する
ために使用することができる。
【0150】
本発明のヌクレオチド、ベクターまたは細胞を含むことからなる組成物は、該ヌクレオ
チド、該ベクターまたは該細胞に含まれる本発明のヌクレオチドの有する塩基配列により
コードされるアミノ酸配列を有するペプチドを調製するために使用することができる。ま
た、かかる組成物は、該ヌクレオチドを含むヌクレオチド、ベクター、細胞等を検出する
ためにも使用することができる。
チド、該ベクターまたは該細胞に含まれる本発明のヌクレオチドの有する塩基配列により
コードされるアミノ酸配列を有するペプチドを調製するために使用することができる。ま
た、かかる組成物は、該ヌクレオチドを含むヌクレオチド、ベクター、細胞等を検出する
ためにも使用することができる。
【0151】
かかる組成物には、必要に応じて、緩衝剤、塩類、金属、防腐剤、界面活性剤、凍結ま
たは凍結乾燥等の調製方法により本発明のペプチド、ペプチドの誘導体、ヌクレオチド、
ベクターまたは細胞が蒙るダメージを軽減または防止するための物質等を含有せしめるこ
とができる。
たは凍結乾燥等の調製方法により本発明のペプチド、ペプチドの誘導体、ヌクレオチド、
ベクターまたは細胞が蒙るダメージを軽減または防止するための物質等を含有せしめるこ
とができる。
【0152】
９．試薬
本発明は試薬を提供する。
本発明は試薬を提供する。
【0153】
本発明の試薬は、本発明のペプチド、ペプチドの誘導体、ヌクレオチド、ベクターまた
は細胞を含むことからなる。
は細胞を含むことからなる。
【0154】
本発明のペプチドまたはその誘導体を含むことからなる試薬は、該ペプチドまたはその
誘導体が結合する標的分子を検出するために使用することができる。
誘導体が結合する標的分子を検出するために使用することができる。
【0155】
本発明のヌクレオチド、ベクターまたは細胞を含むことからなる試薬は、該ヌクレオチ
ドを含むヌクレオチド、ベクター、細胞等を検出するために使用することができる。
ドを含むヌクレオチド、ベクター、細胞等を検出するために使用することができる。
【0156】
本発明の試薬は組成物であってもよい。
かかる試薬を含むキットも、本発明の試薬に包含される。
かかる試薬を含むキットも、本発明の試薬に包含される。
【0157】
また、本発明のペプチド、ペプチド誘導体、それらが提示された細胞等は、標的分子等
の物質を認識する素子として、かかる物質に対するバイオセンサーに利用することができ
る。
の物質を認識する素子として、かかる物質に対するバイオセンサーに利用することができ
る。
【0158】
１０．判定方法
本発明は、被検物質が、標的分子に結合するか否かを判定する方法をも提供する。本発
明の判定方法は、例えば、前記の工程（５－１）および（５－２）等を含んでいてもよい
が、それらに限定されない。
本発明は、被検物質が、標的分子に結合するか否かを判定する方法をも提供する。本発
明の判定方法は、例えば、前記の工程（５－１）および（５－２）等を含んでいてもよい
が、それらに限定されない。
【0159】
本発明の判定方法には、本発明の同定方法に含まれる工程と同一または適宜改変した工
程を使用することができる。ただし、かかる判定方法に供する被検物質は、ライブラリー
等の集合に含まれていなくてもよい。例えば、判定方法に供する被検ペプチドまたは被検
ペプチド誘導体は、ペプチド・ライブラリーに含まれるペプチドまたはペプチド誘導体に
限定されるものではなく、他のペプチドから分離された単一のペプチドまたはペプチド誘
導体、それらを含む混合物等であってもよい。すなわち、本発明の同定方法は、主として
、被検物質の物理的集合から所望の性質を有するものを選抜する方法として適しているの
に対して、本発明の判定方法は、特定の被検物質が所望の性質を有しているか否かを調べ
るための検定方法としても適している。
程を使用することができる。ただし、かかる判定方法に供する被検物質は、ライブラリー
等の集合に含まれていなくてもよい。例えば、判定方法に供する被検ペプチドまたは被検
ペプチド誘導体は、ペプチド・ライブラリーに含まれるペプチドまたはペプチド誘導体に
限定されるものではなく、他のペプチドから分離された単一のペプチドまたはペプチド誘
導体、それらを含む混合物等であってもよい。すなわち、本発明の同定方法は、主として
、被検物質の物理的集合から所望の性質を有するものを選抜する方法として適しているの
に対して、本発明の判定方法は、特定の被検物質が所望の性質を有しているか否かを調べ
るための検定方法としても適している。
【0160】
本発明の判定方法において、例えば、被検物質が標的分子に結合するか否かを決定する
工程においては、解離定数等親和性の指標に関する条件を充たしているか否かを判定の基
準とすることができる。また、本発明の同定方法と同じ選抜工程において被検物質が標的
分子に結合する物質として回収されれば、該被検物質を陽性と判定することができる。
工程においては、解離定数等親和性の指標に関する条件を充たしているか否かを判定の基
準とすることができる。また、本発明の同定方法と同じ選抜工程において被検物質が標的
分子に結合する物質として回収されれば、該被検物質を陽性と判定することができる。
【0161】
また、本発明は、被検物質が標的分子の有する生物活性の一部又は全部を活性化もしく
は促進、または、阻害、不活性化もしくは抑制するか否かを判定する方法、ならびに、被
検物質が標的分子を刺激する（ａｇｏｎｉｚｅ）か否かまたは標的分子と拮抗する（ａｎ
ｔａｇｏｎｉｚｅ）か否かを判定する方法をも提供する。そのような本発明の判定方法は
、例えば、前記の工程（８－１）および（８－２）、（９－１）および（９－２）等を含
んでいてもよいが、それらに限定されない。
は促進、または、阻害、不活性化もしくは抑制するか否かを判定する方法、ならびに、被
検物質が標的分子を刺激する（ａｇｏｎｉｚｅ）か否かまたは標的分子と拮抗する（ａｎ
ｔａｇｏｎｉｚｅ）か否かを判定する方法をも提供する。そのような本発明の判定方法は
、例えば、前記の工程（８－１）および（８－２）、（９－１）および（９－２）等を含
んでいてもよいが、それらに限定されない。
【実施例0162】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし、これらの実施例は本発明の技
術的範囲をなんら限定するものではない。本発明の実施例で用いるプラスミド、制限酵素
、ＤＮＡ修飾酵素等は市販のものであり、常法に従って使用することができる。また、Ｄ
ＮＡのクローニング、ポリヌクレオチド配列の決定、宿主細胞の形質転換、形質転換細胞
の培養、得られる培養物からの酵素の採取、精製等に用いた操作についても当業者によく
知られているものであるか、文献等により容易に知ることのできるものである。
術的範囲をなんら限定するものではない。本発明の実施例で用いるプラスミド、制限酵素
、ＤＮＡ修飾酵素等は市販のものであり、常法に従って使用することができる。また、Ｄ
ＮＡのクローニング、ポリヌクレオチド配列の決定、宿主細胞の形質転換、形質転換細胞
の培養、得られる培養物からの酵素の採取、精製等に用いた操作についても当業者によく
知られているものであるか、文献等により容易に知ることのできるものである。
【0163】
[実施例１]
（１－１）ランダム変異ＳＰＩＮＫ２ライブラリーの作製
ランダム変異ＳＰＩＮＫ２ライブラリーをファージに提示するため、ファージミドベク
ターを構築した。まず、ｔＴＨ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを含む領域を合成して「断片１（
配列番号１０）」とし、ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒを含むｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ（ＧＥ
ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の２０９７から２２３２までの領域（配列番号１１）を合成して
「断片２」とした。ＳＤ配列およびｐｈｏＡシグナルペプチドを含む配列（配列番号１２
）を「断片３」として、ファージコート蛋白質（ｇｅｎｅ ＩＩＩ）はｐＣＡＮＴＡＢ
５Ｅ由来の配列を「断片４」として、さらに、Ｉｐｐ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを含む領域
は「断片５（配列番号１３）」として合成した。「断片１」～「断片５」を鋳型として、
下記プライマー１および２、ならびにＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ：ＤＮＡポリメ
ラーゼ、緩衝液、基質等から構成される）を用いたオーバーラップエクステンションＰＣ
Ｒ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ １６０秒）×３０ｃｙｃｌｅ）を行
った。
プライマー１：５’－ＡＡＡＡＡＡＣＧＣＧＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＡＧＧＧＴＡＧ
ＣＧＡＡＡＡＣＣＴ－３’
プライマー２：５’－ＡＡＡＡＡＧＧＣＧＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＧ
ＣＡＡＣＴＧＴＴＧＧ－３’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗ
ｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ）によりＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡ断片およびｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅを
制限酵素ＡｆｌＩＩＩ（ＮＥＢ）およびＮａｒＩ（ＮＥＢ）で３７℃で１時間以上処理し
、アガロースゲル電気泳動後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇ
ｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍにより精製した。精製した断片
を、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）を用いて、１６℃で一晩反応させることで、
ｌｉｇａｔｉｏｎ反応を実施した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ溶液は、大腸菌ＪＭ１０９（ＴＯＹ
ＯＢＯ）に添加し、氷上で３０分間静置した後、４２℃で４５秒の熱処理後、さらに氷上
で５分間静置し、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含む２－ＹＴプレートに播種後、３７
℃で一晩静置培養することで、大腸菌の形質転換を実施した。翌日、形質転換した大腸菌
を、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）に植菌し、３７℃で一晩培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ ９６ Ｔｕｒｂｏ Ｍ
ｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドＤＮＡを回収し（以下、「
ｍｉｎｉｐｒｅｐ処理」という）、配列解析を実施することで目的のベクターが構築され
たことを確認し、「ファージミドベクターｐＰＲ３」と命名した。
ファージミドベクターｐＰＲ３は（１－２）で構築したファージミドベクターｐＰＲ３
＿ＳＰＩＮＫ２（ＷＴ）の代わりに、（１－３）以降の実施例において使用することがで
きる。
（１－１）ランダム変異ＳＰＩＮＫ２ライブラリーの作製
ランダム変異ＳＰＩＮＫ２ライブラリーをファージに提示するため、ファージミドベク
ターを構築した。まず、ｔＴＨ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを含む領域を合成して「断片１（
配列番号１０）」とし、ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒを含むｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ（ＧＥ
ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の２０９７から２２３２までの領域（配列番号１１）を合成して
「断片２」とした。ＳＤ配列およびｐｈｏＡシグナルペプチドを含む配列（配列番号１２
）を「断片３」として、ファージコート蛋白質（ｇｅｎｅ ＩＩＩ）はｐＣＡＮＴＡＢ
５Ｅ由来の配列を「断片４」として、さらに、Ｉｐｐ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを含む領域
は「断片５（配列番号１３）」として合成した。「断片１」～「断片５」を鋳型として、
下記プライマー１および２、ならびにＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ：ＤＮＡポリメ
ラーゼ、緩衝液、基質等から構成される）を用いたオーバーラップエクステンションＰＣ
Ｒ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ １６０秒）×３０ｃｙｃｌｅ）を行
った。
プライマー１：５’－ＡＡＡＡＡＡＣＧＣＧＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＡＧＧＧＴＡＧ
ＣＧＡＡＡＡＣＣＴ－３’
プライマー２：５’－ＡＡＡＡＡＧＧＣＧＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＧ
ＣＡＡＣＴＧＴＴＧＧ－３’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗ
ｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ）によりＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡ断片およびｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅを
制限酵素ＡｆｌＩＩＩ（ＮＥＢ）およびＮａｒＩ（ＮＥＢ）で３７℃で１時間以上処理し
、アガロースゲル電気泳動後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇ
ｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍにより精製した。精製した断片
を、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）を用いて、１６℃で一晩反応させることで、
ｌｉｇａｔｉｏｎ反応を実施した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ溶液は、大腸菌ＪＭ１０９（ＴＯＹ
ＯＢＯ）に添加し、氷上で３０分間静置した後、４２℃で４５秒の熱処理後、さらに氷上
で５分間静置し、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含む２－ＹＴプレートに播種後、３７
℃で一晩静置培養することで、大腸菌の形質転換を実施した。翌日、形質転換した大腸菌
を、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）に植菌し、３７℃で一晩培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ ９６ Ｔｕｒｂｏ Ｍ
ｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドＤＮＡを回収し（以下、「
ｍｉｎｉｐｒｅｐ処理」という）、配列解析を実施することで目的のベクターが構築され
たことを確認し、「ファージミドベクターｐＰＲ３」と命名した。
ファージミドベクターｐＰＲ３は（１－２）で構築したファージミドベクターｐＰＲ３
＿ＳＰＩＮＫ２（ＷＴ）の代わりに、（１－３）以降の実施例において使用することがで
きる。
【0164】
（１－２）ファージミドベクターｐＰＲ３＿ＳＰＩＮＫ２（ＷＴ）の構築
ランダム変異ＳＰＩＮＫ２ライブラリーをファージに提示するため、ファージミドベク
ターを構築した。まず、ｔＴＨ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを含む領域を「断片１（配列番号
１０）」とし、ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒを含むｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ（ＧＥ ｈｅａｌ
ｔｈｃａｒｅ）の２０９９から２２３２までの領域（配列番号１１のヌクレオチド番号３
から１３６まで）を「断片２」とした。ＳＤ配列ならびにｐｈｏＡシグナルペプチドおよ
び野生型ＳＰＩＮＫ２、すなわちＳＰＩＮＫ２（ＷＴ）のアミノ酸配列をコードする塩基
配列を含む配列（配列番号１２）を「断片３」、ｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅに基くファージコ
ート蛋白質（ｇｅｎｅ ＩＩＩ）を含む配列（配列番号１６のヌクレオチド番号６００か
ら１８４８まで）を「断片４」として、さらに、Ｉｐｐ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを含む領
域は「断片５（配列番号１３）」とした。「断片１」～「断片５」を含む塩基配列（配列
番号１６）を有するＤＮＡを鋳型として、下記プライマー１および２、ならびにＫＯＤ－
ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ：ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、基質等から構成される）を用
いたオーバーラップエクステンションＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６
８℃ １６０秒）×３０ｃｙｃｌｅ）を行った。
プライマー１’：５’－ＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＣＧＣＣＣＡＡＴＡＣＧＣＡＡＡＣＣＧＣ
ＣＴＣＴＣＣ－３’
プライマー２’：５’－ＡＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＴＧＴＣＧＣ－３’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗ
ｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ）によりＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡ断片およびｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅを
制限酵素ＳａｐＩ（ＮＥＢ）およびＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）で３７℃で１時間以上処理し、
アガロースゲル電気泳動後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅ
ｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍにより精製した。精製した断片を
、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）を用いて、１６℃で一晩反応させることで、ｌ
ｉｇａｔｉｏｎ反応を実施した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ溶液は、大腸菌ＪＭ１０９（ＴＯＹＯ
ＢＯ）に添加し、氷上で３０分間静置した後、４２℃で４５秒の熱処理後、さらに氷上で
５分間静置し、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含む２－ＹＴプレートに播種後、３７℃
で一晩静置培養することで、大腸菌の形質転換を実施した。翌日、形質転換した大腸菌を
、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）に植菌し、３７℃で一晩培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ ９６ Ｔｕｒｂｏ Ｍｉ
ｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドＤＮＡを回収し（以下、「ｍ
ｉｎｉｐｒｅｐ処理」という）、配列解析を実施することで目的のベクターが構築された
ことを確認した。さらに、構築したベクターは制限酵素ＥｃｏＲＩを用いて３７℃で１時
間以上処理し、Ｋｌｅｎｏｗ処理後にＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）を用いて、
１６℃で１時間ｌｉｇａｔｉｏｎ反応させ、大腸菌ＪＭ１０９へ形質転換した。形質転換
された大腸菌を培養した後に、ｍｉｎｉｐｒｅｐ処理し、得られたＤＮＡの配列解析を実
施することで構築したベクターを、「ファージミドベクターｐＰＲ３＿ＳＰＩＮＫ２（Ｗ
Ｔ）」と命名し、以下の実施例に供した。
ランダム変異ＳＰＩＮＫ２ライブラリーをファージに提示するため、ファージミドベク
ターを構築した。まず、ｔＴＨ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを含む領域を「断片１（配列番号
１０）」とし、ｌａｃ ｏｐｅｒａｔｏｒを含むｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ（ＧＥ ｈｅａｌ
ｔｈｃａｒｅ）の２０９９から２２３２までの領域（配列番号１１のヌクレオチド番号３
から１３６まで）を「断片２」とした。ＳＤ配列ならびにｐｈｏＡシグナルペプチドおよ
び野生型ＳＰＩＮＫ２、すなわちＳＰＩＮＫ２（ＷＴ）のアミノ酸配列をコードする塩基
配列を含む配列（配列番号１２）を「断片３」、ｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅに基くファージコ
ート蛋白質（ｇｅｎｅ ＩＩＩ）を含む配列（配列番号１６のヌクレオチド番号６００か
ら１８４８まで）を「断片４」として、さらに、Ｉｐｐ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを含む領
域は「断片５（配列番号１３）」とした。「断片１」～「断片５」を含む塩基配列（配列
番号１６）を有するＤＮＡを鋳型として、下記プライマー１および２、ならびにＫＯＤ－
ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ：ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、基質等から構成される）を用
いたオーバーラップエクステンションＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６
８℃ １６０秒）×３０ｃｙｃｌｅ）を行った。
プライマー１’：５’－ＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＣＧＣＣＣＡＡＴＡＣＧＣＡＡＡＣＣＧＣ
ＣＴＣＴＣＣ－３’
プライマー２’：５’－ＡＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＴＧＴＣＧＣ－３’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗ
ｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ）によりＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡ断片およびｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅを
制限酵素ＳａｐＩ（ＮＥＢ）およびＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）で３７℃で１時間以上処理し、
アガロースゲル電気泳動後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅ
ｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍにより精製した。精製した断片を
、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）を用いて、１６℃で一晩反応させることで、ｌ
ｉｇａｔｉｏｎ反応を実施した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ溶液は、大腸菌ＪＭ１０９（ＴＯＹＯ
ＢＯ）に添加し、氷上で３０分間静置した後、４２℃で４５秒の熱処理後、さらに氷上で
５分間静置し、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含む２－ＹＴプレートに播種後、３７℃
で一晩静置培養することで、大腸菌の形質転換を実施した。翌日、形質転換した大腸菌を
、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）に植菌し、３７℃で一晩培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ ９６ Ｔｕｒｂｏ Ｍｉ
ｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドＤＮＡを回収し（以下、「ｍ
ｉｎｉｐｒｅｐ処理」という）、配列解析を実施することで目的のベクターが構築された
ことを確認した。さらに、構築したベクターは制限酵素ＥｃｏＲＩを用いて３７℃で１時
間以上処理し、Ｋｌｅｎｏｗ処理後にＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）を用いて、
１６℃で１時間ｌｉｇａｔｉｏｎ反応させ、大腸菌ＪＭ１０９へ形質転換した。形質転換
された大腸菌を培養した後に、ｍｉｎｉｐｒｅｐ処理し、得られたＤＮＡの配列解析を実
施することで構築したベクターを、「ファージミドベクターｐＰＲ３＿ＳＰＩＮＫ２（Ｗ
Ｔ）」と命名し、以下の実施例に供した。
【0165】
（１－３）ファージミドベクターｐＰＲ３＿ｓｔｕｆｆｅｒ＿ＴＥＶの構築
次に、ファージミドベクターｐＰＲ３＿ＳＰＩＮＫ２（ＷＴ）に、ＴＥＶ ｐｒｏｔｅ
ａｓｅ切断配列およびｓｔｕｆｆｅｒを挿入した。ＴＥＶ ｐｒｏｔｅａｓｅ切断配列を
作製するため、下記プライマー３および４、ならびにＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いたオーバ
ーラップエクステンションＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ １０
秒）×３０ｃｙｃｌｅ）を行った。
プライマー３：５’－ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＡＧＧＧＴＡＧＣＧＡＡＡＡＣＣＴＧＴＡＴ
ＴＴＴＣＡＧＡＧ－３’
プライマー４：５’－ＧＣＴＡＡＡＣＡＡＣＴＴＴＣＡＡＣＧＧＴｇｃｔａｃｃＧＣＴＣ
ＴＧＡＡＡＡＴＡＣＡＧＧ－３’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗ
ｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ ＳｙｓｔｅｍによりＤ
ＮＡを調製し、「断片６」とした。（１－２）で構築したｐＰＲ３＿ＳＰＩＮＫ２（ＷＴ
）を鋳型として、下記プライマー５および６、ならびにＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いたＰＣ
Ｒ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ３０秒）×３０ｃｙｃｌｅ）を実施
することで、ファージコート蛋白質（ｇｅｎｅ ＩＩＩ）を増幅した。
プライマー５：５’－ＡＣＣＧＴＴＧＡＡＡＧＴＴＧＴＴＴＡＧＣＡＡＡＡＣＣＣ－３’
プライマー６：５’－ＣＡＴＴＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＧＣＧＣＡＧＴＣ－３
’
さらに、増幅したＤＮＡ断片を鋳型として、下記プライマーαおよびβならびにＫＯＤ
－ｐｌｕｓ－を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ４５秒）
×３０ｃｙｃｌｅ）を行った。
プライマーα ：５’－ＡＡＣＡＣＧＣＧＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＡＧＧＧＴＡＧＣ
－３’
プライマーβ ：５’－ＡＡＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＴＧＧＡＡ
ＡＧ－３’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗ
ｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ ＳｙｓｔｅｍによりＤ
ＮＡを調製した。調製したＤＮＡ断片および（１－２）で構築したｐＰＲ３＿ＳＰＩＮＫ
２（ＷＴ）を制限酵素ＭｌｕＩ（ＮＥＢ）およびＢａｍＨＩ（ＮＥＢ）で３７℃で１時間
以上処理し、アガロースゲル電気泳動後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗｉｚａｒｄ
ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍにより精製した。精
製した断片を、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅを用いて、１６℃で一晩反応させることで、
ｌｉｇａｔｉｏｎ反応を実施し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換された大腸
菌を培養した後に、ｍｉｎｉｐｒｅｐ処理し、得られたＤＮＡの配列解析を実施した。構
築したベクターを、「ファージミドベクターｐＰＲ３＿ＴＥＶ」と命名した。尚、操作は
（１－１）に記載の方法に準じて行った。
構築したファージミドベクターｐＰＲ３＿ＴＥＶおよびｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）およびＭｌｕＩ（ＮＥＢ）で３７℃
で１時間以上処理し、アガロースゲル電気泳動後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗｉ
ｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍにより精製
した。精製した断片を、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅを用いて、１６℃で一晩反応させる
ことで、ｌｉｇａｔｉｏｎ反応を実施し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換さ
れた大腸菌を培養した後に、ｍｉｎｉｐｒｅｐ処理し、得られたＤＮＡの配列解析を実施
して「ファージミドベクターｐＰＲ３＿ｓｔｕｆｆｅｒ＿ＴＥＶ」と命名した。尚、操作
は（１－２）に記載の方法に準じて行った。
次に、ファージミドベクターｐＰＲ３＿ＳＰＩＮＫ２（ＷＴ）に、ＴＥＶ ｐｒｏｔｅ
ａｓｅ切断配列およびｓｔｕｆｆｅｒを挿入した。ＴＥＶ ｐｒｏｔｅａｓｅ切断配列を
作製するため、下記プライマー３および４、ならびにＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いたオーバ
ーラップエクステンションＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ １０
秒）×３０ｃｙｃｌｅ）を行った。
プライマー３：５’－ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＡＧＧＧＴＡＧＣＧＡＡＡＡＣＣＴＧＴＡＴ
ＴＴＴＣＡＧＡＧ－３’
プライマー４：５’－ＧＣＴＡＡＡＣＡＡＣＴＴＴＣＡＡＣＧＧＴｇｃｔａｃｃＧＣＴＣ
ＴＧＡＡＡＡＴＡＣＡＧＧ－３’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗ
ｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ ＳｙｓｔｅｍによりＤ
ＮＡを調製し、「断片６」とした。（１－２）で構築したｐＰＲ３＿ＳＰＩＮＫ２（ＷＴ
）を鋳型として、下記プライマー５および６、ならびにＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いたＰＣ
Ｒ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ３０秒）×３０ｃｙｃｌｅ）を実施
することで、ファージコート蛋白質（ｇｅｎｅ ＩＩＩ）を増幅した。
プライマー５：５’－ＡＣＣＧＴＴＧＡＡＡＧＴＴＧＴＴＴＡＧＣＡＡＡＡＣＣＣ－３’
プライマー６：５’－ＣＡＴＴＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＧＣＧＣＡＧＴＣ－３
’
さらに、増幅したＤＮＡ断片を鋳型として、下記プライマーαおよびβならびにＫＯＤ
－ｐｌｕｓ－を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ４５秒）
×３０ｃｙｃｌｅ）を行った。
プライマーα ：５’－ＡＡＣＡＣＧＣＧＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＡＧＧＧＴＡＧＣ
－３’
プライマーβ ：５’－ＡＡＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＴＧＧＡＡ
ＡＧ－３’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗ
ｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ ＳｙｓｔｅｍによりＤ
ＮＡを調製した。調製したＤＮＡ断片および（１－２）で構築したｐＰＲ３＿ＳＰＩＮＫ
２（ＷＴ）を制限酵素ＭｌｕＩ（ＮＥＢ）およびＢａｍＨＩ（ＮＥＢ）で３７℃で１時間
以上処理し、アガロースゲル電気泳動後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗｉｚａｒｄ
ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍにより精製した。精
製した断片を、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅを用いて、１６℃で一晩反応させることで、
ｌｉｇａｔｉｏｎ反応を実施し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換された大腸
菌を培養した後に、ｍｉｎｉｐｒｅｐ処理し、得られたＤＮＡの配列解析を実施した。構
築したベクターを、「ファージミドベクターｐＰＲ３＿ＴＥＶ」と命名した。尚、操作は
（１－１）に記載の方法に準じて行った。
構築したファージミドベクターｐＰＲ３＿ＴＥＶおよびｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）およびＭｌｕＩ（ＮＥＢ）で３７℃
で１時間以上処理し、アガロースゲル電気泳動後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗｉ
ｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍにより精製
した。精製した断片を、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅを用いて、１６℃で一晩反応させる
ことで、ｌｉｇａｔｉｏｎ反応を実施し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換さ
れた大腸菌を培養した後に、ｍｉｎｉｐｒｅｐ処理し、得られたＤＮＡの配列解析を実施
して「ファージミドベクターｐＰＲ３＿ｓｔｕｆｆｅｒ＿ＴＥＶ」と命名した。尚、操作
は（１－２）に記載の方法に準じて行った。
【0166】
（１－４）ランダム変異ＳＰＩＮＫ２ファージミドベクターの作製
変異を導入しないＳＰＩＮＫ２領域を増幅するため、ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列
をコードする塩基配列（配列番号１４）を鋳型として、下記プライマー７および８、なら
びにＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃
１０秒）×３０ｃｙｃｌｅ）を行った。
プライマー７：５’－ＧＧＴＡＧＣＧＡＴＡＴＧＡＧＣＡＣＣＴＡＴＧＣ－３’
プライマー８：５’－ＧＣＡＣＧＧＡＣＣＡＴＴＧＣＧＡＡＴＡ－３’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗ
ｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ ＳｙｓｔｅｍによりＤ
ＮＡを調製した。調製したＤＮＡ断片をＩｎｓｅｒｔ Ａとした。
次に、ランダム領域（配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列に対応する領域）を
含むＳＰＩＮＫ２オリゴヌクレオチドを合成した。
５’－ＧＣ ＡＡＡ ＴＡＴ ＣＧＴ ＡＣＣ ＣＣＧ ＡＡＴ ＴＧＴ ＵＵＵ ＵＵ
Ｕ ＵＵＵ ＵＵＵ ＵＵＵ ＶＶＶ ＵＵＵ ＴＧＴ ＶＶＶ ＵＵＵ ＵＵＵ ＷＷ
Ｗ ＸＸＸ ＣＣＧ ＧＴＴ ＧＧＴ ＡＧＣ ＧＡＴ ＡＴＧ－３’
ＵＵＵ、ＶＶＶ、ＷＷＷおよびＸＸＸはＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択される任意の塩基
を表す。
ＵＵＵには、Ｃｙｓ、Ｐｒｏを除く１８種のアミノ酸（Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓ
ｐ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙ
ｒ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ）をコードするコドンが含まれている。
ＶＶＶには、Ｃｙｓを除く１９種のアミノ酸（Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓ
ｎ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅ
ｒ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ）をコードするコドンが含まれている。
ＷＷＷには、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒをコードするコドンが含まれて
いる。
ＸＸＸには、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕをコードする
コドンが含まれている。
Ｉｎｓｅｒｔ ＡおよびＳＰＩＮＫ２オリゴヌクレオチドを鋳型として、下記プライマ
ー９および１０、ならびにＰｆｕＵｌｔｒａ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いたＰＣＲ法（（９５℃ ２０秒、５５℃ ２
０秒、７２℃ ３０秒）×１０ｃｙｃｌｅ）を行った。
プライマー９：５’－ＧＴＴＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＡＧＣＡＡＡＴＡＴＣＧＴＡＣＣＣＣ
ＧＡＡＴＴＧＴ－３’
プライマー１０：５’－ＧＣＡＣＧＧＡＣＣＡＴＴＧＣＧＡＡＴＡ－３’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗ
ｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ ＳｙｓｔｅｍによりＤ
ＮＡを調製した。調製したＤＮＡ断片をＩｎｓｅｒｙ Ｂとした。さらに、Ｉｎｓｅｒｔ
Ｂを鋳型として、下記プライマー１１および１２、ならびにＰｆｕＵｌｔｒａ ＩＩ
Ｆｕｓｉｏｎ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲ法（（９５℃ ２０
秒、５５℃ ２０秒、７２℃ ３０秒）×１０ｃｙｃｌｅ）を行った。
プライマー１１：５’－ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＣＣＧＣＡＧＴＴＴＧＧＴＣＴＧＴ
ＴＴＡＧＣＡＡＡＴＡＡＴＣＧＴ－３’
プライマー１２：５’－ＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣＧＧＡＣＣＡＴＴＧＣＧＡＡＴ
ＡＡＴＴＴＴＡＡＴ－３’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗ
ｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ ＳｙｓｔｅｍによりＤ
ＮＡを調製した。調製したＤＮＡ断片をＩｎｓｅｒｔ Ｃとした。Ｉｎｓｅｒｔ Ｃを制
限酵素ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）およびＡｓｃＩ（ＮＥＢ）で、ファージミドベクターｐＰＲ
３＿ｓｔｕｆｆｅｒ＿ＴＥＶをＥｃｏＲＩ（ＴＡＫＡＲＡ）およびＭｌｕＩ（ＴＡＫＡＲ
Ａ）を用いて、それぞれ３７℃で５時間以上処理し、Ｉｎｓｅｒｔ ＣをＷｉｚａｒｄ
ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍを用いることで精製し
、ｐｈａｇｅｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒをアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のＤＮ
Ａ断片を切り出し、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ
Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により精製した。精製した断片を、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉ
ｇａｓｅ（ＮＥＢ）を用いて、１６℃で一晩反応させることで、ｌｉｇａｔｉｏｎ反応を
実施した。翌日、６５℃で１０分熱処理を行い、Ａｍｉｃｏｎ－Ｕｌｔｒａ（３０ｋ：Ｍ
ｉｌｌｉｐｏｒｅ）により、ＤＮＡの脱塩を実施した。
変異を導入しないＳＰＩＮＫ２領域を増幅するため、ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列
をコードする塩基配列（配列番号１４）を鋳型として、下記プライマー７および８、なら
びにＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃
１０秒）×３０ｃｙｃｌｅ）を行った。
プライマー７：５’－ＧＧＴＡＧＣＧＡＴＡＴＧＡＧＣＡＣＣＴＡＴＧＣ－３’
プライマー８：５’－ＧＣＡＣＧＧＡＣＣＡＴＴＧＣＧＡＡＴＡ－３’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗ
ｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ ＳｙｓｔｅｍによりＤ
ＮＡを調製した。調製したＤＮＡ断片をＩｎｓｅｒｔ Ａとした。
次に、ランダム領域（配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列に対応する領域）を
含むＳＰＩＮＫ２オリゴヌクレオチドを合成した。
５’－ＧＣ ＡＡＡ ＴＡＴ ＣＧＴ ＡＣＣ ＣＣＧ ＡＡＴ ＴＧＴ ＵＵＵ ＵＵ
Ｕ ＵＵＵ ＵＵＵ ＵＵＵ ＶＶＶ ＵＵＵ ＴＧＴ ＶＶＶ ＵＵＵ ＵＵＵ ＷＷ
Ｗ ＸＸＸ ＣＣＧ ＧＴＴ ＧＧＴ ＡＧＣ ＧＡＴ ＡＴＧ－３’
ＵＵＵ、ＶＶＶ、ＷＷＷおよびＸＸＸはＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択される任意の塩基
を表す。
ＵＵＵには、Ｃｙｓ、Ｐｒｏを除く１８種のアミノ酸（Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓ
ｐ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙ
ｒ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ）をコードするコドンが含まれている。
ＶＶＶには、Ｃｙｓを除く１９種のアミノ酸（Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓ
ｎ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅ
ｒ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ）をコードするコドンが含まれている。
ＷＷＷには、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒをコードするコドンが含まれて
いる。
ＸＸＸには、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕをコードする
コドンが含まれている。
Ｉｎｓｅｒｔ ＡおよびＳＰＩＮＫ２オリゴヌクレオチドを鋳型として、下記プライマ
ー９および１０、ならびにＰｆｕＵｌｔｒａ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いたＰＣＲ法（（９５℃ ２０秒、５５℃ ２
０秒、７２℃ ３０秒）×１０ｃｙｃｌｅ）を行った。
プライマー９：５’－ＧＴＴＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＡＧＣＡＡＡＴＡＴＣＧＴＡＣＣＣＣ
ＧＡＡＴＴＧＴ－３’
プライマー１０：５’－ＧＣＡＣＧＧＡＣＣＡＴＴＧＣＧＡＡＴＡ－３’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗ
ｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ ＳｙｓｔｅｍによりＤ
ＮＡを調製した。調製したＤＮＡ断片をＩｎｓｅｒｙ Ｂとした。さらに、Ｉｎｓｅｒｔ
Ｂを鋳型として、下記プライマー１１および１２、ならびにＰｆｕＵｌｔｒａ ＩＩ
Ｆｕｓｉｏｎ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲ法（（９５℃ ２０
秒、５５℃ ２０秒、７２℃ ３０秒）×１０ｃｙｃｌｅ）を行った。
プライマー１１：５’－ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＣＣＧＣＡＧＴＴＴＧＧＴＣＴＧＴ
ＴＴＡＧＣＡＡＡＴＡＡＴＣＧＴ－３’
プライマー１２：５’－ＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣＧＧＡＣＣＡＴＴＧＣＧＡＡＴ
ＡＡＴＴＴＴＡＡＴ－３’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗ
ｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ ＳｙｓｔｅｍによりＤ
ＮＡを調製した。調製したＤＮＡ断片をＩｎｓｅｒｔ Ｃとした。Ｉｎｓｅｒｔ Ｃを制
限酵素ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）およびＡｓｃＩ（ＮＥＢ）で、ファージミドベクターｐＰＲ
３＿ｓｔｕｆｆｅｒ＿ＴＥＶをＥｃｏＲＩ（ＴＡＫＡＲＡ）およびＭｌｕＩ（ＴＡＫＡＲ
Ａ）を用いて、それぞれ３７℃で５時間以上処理し、Ｉｎｓｅｒｔ ＣをＷｉｚａｒｄ
ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍを用いることで精製し
、ｐｈａｇｅｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒをアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のＤＮ
Ａ断片を切り出し、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ
Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により精製した。精製した断片を、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉ
ｇａｓｅ（ＮＥＢ）を用いて、１６℃で一晩反応させることで、ｌｉｇａｔｉｏｎ反応を
実施した。翌日、６５℃で１０分熱処理を行い、Ａｍｉｃｏｎ－Ｕｌｔｒａ（３０ｋ：Ｍ
ｉｌｌｉｐｏｒｅ）により、ＤＮＡの脱塩を実施した。
【0167】
（１－５）ランダム変異ＳＰＩＮＫ２ファージミドベクターを有する大腸菌ＸＬ１－Ｂｌ
ｕｅの作製
次に、形質転換に用いるコンピテントセルを調製した。前日に３７℃で一晩、２－ＹＴ
培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて培養したＸＬ１－Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）を２－ＹＴ培地に植菌し、３７℃で数時間培養した。氷冷後、遠心分離（３，０００
ｇ、１０分、４℃）によりペレットを回収し、滅菌水で懸濁した後、遠心を行った。さら
に、１０％グリセロールでペレットを懸濁した後遠心分離し、再度、１０％グリセロール
による懸濁した後遠心分離を行った。最後に、ペレットを１０％グリセロールで懸濁して
、コンピテントセルとした。
（１－４）で調製したＤＮＡとコンピテントセルを用いて、エレクトロポレーション（
１．９７ｋＶ、１８６μＦ）により、形質転換を実施した。その後、ＳＯＣ培地を用いて
、３７℃で１時間、振とう培養を行い、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリン（和光純薬工業）
および２％グルコース（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を含む２－ＹＴプレートにプレ
ーティングし、３０℃で静置培養した。翌日、１％グルコースおよび１５％グリセロール
（和光純薬工業）を含む２－ＹＴ溶液を用いてコロニーを回収し、－８０℃で保存した。
また、エレクトロポレーション後の培養液の一部は採取し、段階希釈後にプレーティング
し、静置培養した。翌日、コロニー数を測定することで、ライブラリーサイズを見積もり
、構築されたライブラリーのサイズは１．２×１０１０程度であることを確認した。
ｕｅの作製
次に、形質転換に用いるコンピテントセルを調製した。前日に３７℃で一晩、２－ＹＴ
培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて培養したＸＬ１－Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）を２－ＹＴ培地に植菌し、３７℃で数時間培養した。氷冷後、遠心分離（３，０００
ｇ、１０分、４℃）によりペレットを回収し、滅菌水で懸濁した後、遠心を行った。さら
に、１０％グリセロールでペレットを懸濁した後遠心分離し、再度、１０％グリセロール
による懸濁した後遠心分離を行った。最後に、ペレットを１０％グリセロールで懸濁して
、コンピテントセルとした。
（１－４）で調製したＤＮＡとコンピテントセルを用いて、エレクトロポレーション（
１．９７ｋＶ、１８６μＦ）により、形質転換を実施した。その後、ＳＯＣ培地を用いて
、３７℃で１時間、振とう培養を行い、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリン（和光純薬工業）
および２％グルコース（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を含む２－ＹＴプレートにプレ
ーティングし、３０℃で静置培養した。翌日、１％グルコースおよび１５％グリセロール
（和光純薬工業）を含む２－ＹＴ溶液を用いてコロニーを回収し、－８０℃で保存した。
また、エレクトロポレーション後の培養液の一部は採取し、段階希釈後にプレーティング
し、静置培養した。翌日、コロニー数を測定することで、ライブラリーサイズを見積もり
、構築されたライブラリーのサイズは１．２×１０１０程度であることを確認した。
【0168】
（１－６）ランダム変異ＳＰＩＮＫ２ファージライブラリーの構築
（１－５）で構築した大腸菌コロニー群を、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンおよび１％
グルコースを含む２－ＹＴ培地に植菌し、ＯＤ６００ｎｍ＝０．３の大腸菌懸濁液を調製
した。３７℃で振とう培養を行うことで、ＯＤ６００ｎｍ＝０．５になるまで培養し、充
分量のｈｅｌｐｅｒｐｈａｇｅ ＶＣＳＭ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を加えて、３７
℃で３０分間静置し、さらに、３７℃で３０分間振とう培養を実施した。その後、氷上で
３０分間静置し、遠心分離（３，０００ｇ、２０分、４℃）により、ペレットを回収し、
０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリン、３０μｇ／ｍｌカナマイシン（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓ
ｑｕｅ）、０．２５ｍＭ ＩＰＴＧ（和光純薬工業）を含む２－ＹＴ培地で懸濁し、２２
℃で一晩、振とう培養を実施した。
翌日、遠心分離（９，０００ｇ、２０分、４℃）により培養上清を回収し、２０％ Ｐ
ｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ６０００（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）お
よび２．５Ｍ ＮａＣｌ（和光純薬工業）溶液を１／４量添加し、４℃で３０分間静置す
ることで、ファージ粒子を沈殿させた（以下、「ＰＥＧ沈殿」と呼ぶ）。ＰＥＧ沈殿およ
び遠心分離（９，０００ｇ、３０分、４℃）を２回繰り返し、沈殿したファージをＰＢＳ
に懸濁することで、ランダム変異ＳＰＩＮＫ２ファージライブラリーを調製した。
作製したファージ溶液を大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅに感染させ、０．１ｍｇ／ｍｌアンピ
シリンおよび１％グルコースを含む２－ＹＴプレートに播種し、形成したコロニー数を測
定した。ファージライブラリーの力価は、１．８×１０１３ ｐｈａｇｅ／ｍｌであった
。
（１－５）で構築した大腸菌コロニー群を、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンおよび１％
グルコースを含む２－ＹＴ培地に植菌し、ＯＤ６００ｎｍ＝０．３の大腸菌懸濁液を調製
した。３７℃で振とう培養を行うことで、ＯＤ６００ｎｍ＝０．５になるまで培養し、充
分量のｈｅｌｐｅｒｐｈａｇｅ ＶＣＳＭ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を加えて、３７
℃で３０分間静置し、さらに、３７℃で３０分間振とう培養を実施した。その後、氷上で
３０分間静置し、遠心分離（３，０００ｇ、２０分、４℃）により、ペレットを回収し、
０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリン、３０μｇ／ｍｌカナマイシン（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓ
ｑｕｅ）、０．２５ｍＭ ＩＰＴＧ（和光純薬工業）を含む２－ＹＴ培地で懸濁し、２２
℃で一晩、振とう培養を実施した。
翌日、遠心分離（９，０００ｇ、２０分、４℃）により培養上清を回収し、２０％ Ｐ
ｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ６０００（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）お
よび２．５Ｍ ＮａＣｌ（和光純薬工業）溶液を１／４量添加し、４℃で３０分間静置す
ることで、ファージ粒子を沈殿させた（以下、「ＰＥＧ沈殿」と呼ぶ）。ＰＥＧ沈殿およ
び遠心分離（９，０００ｇ、３０分、４℃）を２回繰り返し、沈殿したファージをＰＢＳ
に懸濁することで、ランダム変異ＳＰＩＮＫ２ファージライブラリーを調製した。
作製したファージ溶液を大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅに感染させ、０．１ｍｇ／ｍｌアンピ
シリンおよび１％グルコースを含む２－ＹＴプレートに播種し、形成したコロニー数を測
定した。ファージライブラリーの力価は、１．８×１０１３ ｐｈａｇｅ／ｍｌであった
。
【0169】
[実施例２]
標的分子に結合するＳＰＩＮＫ２変異体の選別
（２－１）液相パニング法
ＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ｂｉｏｔｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（
Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて、付属の説明書に従い、（２－４）に記載の標的蛋白質をビオチ
ン化した。
ビオチン化標的蛋白質は、ＳＰＩＮＫ２変異体提示ファージと混合して１～１２時間反
応させた。反応後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ）（以下、単に「ビーズ」と呼ぶ）を加えることでビオチン化標的蛋白
質をビーズに結合させ、０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ（以下、「ＰＢＳ－Ｔ」と呼
ぶ）で所定の回数洗浄した後、ＡｃＴＥＶＴＭ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）で３０分間反応させることで、ビーズ表面のビオチン化標的蛋白質に結合したＳＰＩ
ＮＫ２変異体提示ファージを回収した。回収したファージは、大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅに
感染させ、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンおよび１％グルコースを含む２－ＹＴプレート
に播種し、３０℃で一晩培養した。尚、液相パニングの第一ラウンドには、ランダム変異
ＳＰＩＮＫ２ファージライブラリーを、第二ラウンド以降には、前ラウンドで得られた大
腸菌コロニー群から調製したファージを使用した。
標的分子に結合するＳＰＩＮＫ２変異体の選別
（２－１）液相パニング法
ＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ｂｉｏｔｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（
Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて、付属の説明書に従い、（２－４）に記載の標的蛋白質をビオチ
ン化した。
ビオチン化標的蛋白質は、ＳＰＩＮＫ２変異体提示ファージと混合して１～１２時間反
応させた。反応後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ）（以下、単に「ビーズ」と呼ぶ）を加えることでビオチン化標的蛋白
質をビーズに結合させ、０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ（以下、「ＰＢＳ－Ｔ」と呼
ぶ）で所定の回数洗浄した後、ＡｃＴＥＶＴＭ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）で３０分間反応させることで、ビーズ表面のビオチン化標的蛋白質に結合したＳＰＩ
ＮＫ２変異体提示ファージを回収した。回収したファージは、大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅに
感染させ、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンおよび１％グルコースを含む２－ＹＴプレート
に播種し、３０℃で一晩培養した。尚、液相パニングの第一ラウンドには、ランダム変異
ＳＰＩＮＫ２ファージライブラリーを、第二ラウンド以降には、前ラウンドで得られた大
腸菌コロニー群から調製したファージを使用した。
【0170】
（２－２）固相パニング法
Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍ ９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ
（Ｎｕｎｃ）に一定量の標的蛋白質を添加し、４℃で一晩静置することで、プレートへの
固定化を実施した。また、Ｐｉｅｒｃｅ ＮＨＳ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ａｇａｒｏｓｅ
Ｄｒｙ Ｒｅｓｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ）に一定量の標的蛋白質を添加し、付属の説明書に
従い、アガロースへの固定化を実施した。
標的蛋白質を固定化したプレートまたはアガロースは、ＳＰＩＮＫ２変異体提示ファー
ジと混合して１～１２時間反応させた。反応後、ビーズを加えることでビオチン化標的蛋
白質をビーズに結合させ、ＰＢＳ－Ｔで所定の回数洗浄した後、ＡｃＴＥＶＴＭ Ｐｒｏ
ｔｅａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３０分間反応させることで、ビーズ表面のビオチ
ン化標的蛋白質に結合したＳＰＩＮＫ２変異体提示ファージを回収した。回収したファー
ジは、大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅに感染させ、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンおよび１％グ
ルコースを含む２－ＹＴプレートに播種し、３０℃で一晩培養した。尚、固相パニングの
第一ラウンドには、ランダム変異ＳＰＩＮＫ２ファージライブラリーを、第二ラウンド以
降には、前ラウンドで得られた大腸菌コロニー群から調製したファージを使用した。
Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍ ９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ
（Ｎｕｎｃ）に一定量の標的蛋白質を添加し、４℃で一晩静置することで、プレートへの
固定化を実施した。また、Ｐｉｅｒｃｅ ＮＨＳ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ａｇａｒｏｓｅ
Ｄｒｙ Ｒｅｓｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ）に一定量の標的蛋白質を添加し、付属の説明書に
従い、アガロースへの固定化を実施した。
標的蛋白質を固定化したプレートまたはアガロースは、ＳＰＩＮＫ２変異体提示ファー
ジと混合して１～１２時間反応させた。反応後、ビーズを加えることでビオチン化標的蛋
白質をビーズに結合させ、ＰＢＳ－Ｔで所定の回数洗浄した後、ＡｃＴＥＶＴＭ Ｐｒｏ
ｔｅａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３０分間反応させることで、ビーズ表面のビオチ
ン化標的蛋白質に結合したＳＰＩＮＫ２変異体提示ファージを回収した。回収したファー
ジは、大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅに感染させ、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンおよび１％グ
ルコースを含む２－ＹＴプレートに播種し、３０℃で一晩培養した。尚、固相パニングの
第一ラウンドには、ランダム変異ＳＰＩＮＫ２ファージライブラリーを、第二ラウンド以
降には、前ラウンドで得られた大腸菌コロニー群から調製したファージを使用した。
【0171】
（２－３）ファージの調製
パニング後に得られた大腸菌コロニー群を、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンおよび１％
グルコースを含む２－ＹＴ培地に植菌し、ＯＤ６００ｎｍ＝０．３の大腸菌懸濁液を調製
した。３７℃で振とう培養を行うことで、ＯＤ６００ｎｍ＝０．５になるまで培養し、充
分量のｈｅｌｐｅｒｐｈａｇｅ ＶＣＳＭ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を加えて、３７
℃で３０分間静置し、さらに、３７℃で３０分間振とう培養を実施した。その後、氷上で
３０分間静置し、遠心分離（３，０００ｇ、２０分、４℃）により、ペレットを回収し、
０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリン、３０μｇ／ｍｌカナマイシン（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓ
ｑｕｅ）、０．２５ｍＭ ＩＰＴＧ（和光純薬工業）を含む２－ＹＴ培地で懸濁し、２２
℃で一晩、振とう培養を実施した。翌日、遠心分離により培養上清を回収し、ＰＥＧ沈殿
および遠心分離を２回繰り返すことで、次ラウンドで使用するファージ溶液を調製した。
パニング後に得られた大腸菌コロニー群を、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンおよび１％
グルコースを含む２－ＹＴ培地に植菌し、ＯＤ６００ｎｍ＝０．３の大腸菌懸濁液を調製
した。３７℃で振とう培養を行うことで、ＯＤ６００ｎｍ＝０．５になるまで培養し、充
分量のｈｅｌｐｅｒｐｈａｇｅ ＶＣＳＭ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を加えて、３７
℃で３０分間静置し、さらに、３７℃で３０分間振とう培養を実施した。その後、氷上で
３０分間静置し、遠心分離（３，０００ｇ、２０分、４℃）により、ペレットを回収し、
０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリン、３０μｇ／ｍｌカナマイシン（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓ
ｑｕｅ）、０．２５ｍＭ ＩＰＴＧ（和光純薬工業）を含む２－ＹＴ培地で懸濁し、２２
℃で一晩、振とう培養を実施した。翌日、遠心分離により培養上清を回収し、ＰＥＧ沈殿
および遠心分離を２回繰り返すことで、次ラウンドで使用するファージ溶液を調製した。
【0172】
（２－４）標的分子に結合するＳＰＩＮＫ２変異体の選別
下記４種類のいずれか一つを標的蛋白質として、液相または固相パニングを３～５ラウ
ンド実施した。
・Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）
・Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ（Ｒ＆Ｄ
ｓｙｓｔｅｍｓ）
・Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＥＧＦＲ／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ：以
下、「ＥＧＦＲ／Ｆｃ」と呼ぶ）
・Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＥｒｂＢ２／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ：
以下、「ＨＥＲ２／Ｆｃ」と呼ぶ）
下記４種類のいずれか一つを標的蛋白質として、液相または固相パニングを３～５ラウ
ンド実施した。
・Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）
・Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ（Ｒ＆Ｄ
ｓｙｓｔｅｍｓ）
・Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＥＧＦＲ／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ：以
下、「ＥＧＦＲ／Ｆｃ」と呼ぶ）
・Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＥｒｂＢ２／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ：
以下、「ＨＥＲ２／Ｆｃ」と呼ぶ）
【0173】
（２－５）ＳＰＩＮＫ２変異体（ポリクローン）の標的蛋白質への結合性評価
（２－３）に記載の方法に従い、パニング後の大腸菌群からＳＰＩＮＫ２変異体提示フ
ァージを調製した。
Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍ ９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ
（Ｎｕｎｃ）に、（２－４）に記載の標的蛋白質、および、ネガティブコントロールとし
てＩｇＧ－Ｆｒｅｅ，Ｐｒｏｔｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｕ
ｂｍｉｎ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
：以下、「ＢＳＡ」と呼ぶ）を添加し、４℃で一晩静置することで、９６ ｗｅｌｌ ｐ
ｌａｔｅのコーティングを行った。次に、パニング後の大腸菌群から調製したＳＰＩＮＫ
２変異体提示ファージをサンプルとして添加し、室温で１時間静置した。その後、サンプ
ルを除き、ＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、ＨＲＰ／Ａｎｔｉ－Ｍ１３ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を添加し、室温で１時間静置した
。その後、ＨＲＰ／Ａｎｔｉ－Ｍ１３ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅを除
き、ＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、ＰＯＤ基質Ａ．Ｂ．Ｔ．Ｓ．キット（ｎａｃａｌａｉ）を
用いて発色させ、測定波長４０５ｎｍの吸光度を測定した。サンプルおよびＨＲＰ／Ａｎ
ｔｉ－Ｍ１３ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅの希釈にはＰＢＳ－Ｔを用い
た。
結果を図１～図４に示す。各標的蛋白質に対するパニングにより、ランダム変異ＳＰＩ
ＮＫ２ライブラリーから標的特異的な結合性を示すＳＰＩＮＫ２変異体（ポリクローン）
が濃縮されたことが、ＥＬＩＳＡ法により確認された。
（２－３）に記載の方法に従い、パニング後の大腸菌群からＳＰＩＮＫ２変異体提示フ
ァージを調製した。
Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍ ９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ
（Ｎｕｎｃ）に、（２－４）に記載の標的蛋白質、および、ネガティブコントロールとし
てＩｇＧ－Ｆｒｅｅ，Ｐｒｏｔｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｕ
ｂｍｉｎ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
：以下、「ＢＳＡ」と呼ぶ）を添加し、４℃で一晩静置することで、９６ ｗｅｌｌ ｐ
ｌａｔｅのコーティングを行った。次に、パニング後の大腸菌群から調製したＳＰＩＮＫ
２変異体提示ファージをサンプルとして添加し、室温で１時間静置した。その後、サンプ
ルを除き、ＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、ＨＲＰ／Ａｎｔｉ－Ｍ１３ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を添加し、室温で１時間静置した
。その後、ＨＲＰ／Ａｎｔｉ－Ｍ１３ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅを除
き、ＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、ＰＯＤ基質Ａ．Ｂ．Ｔ．Ｓ．キット（ｎａｃａｌａｉ）を
用いて発色させ、測定波長４０５ｎｍの吸光度を測定した。サンプルおよびＨＲＰ／Ａｎ
ｔｉ－Ｍ１３ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅの希釈にはＰＢＳ－Ｔを用い
た。
結果を図１～図４に示す。各標的蛋白質に対するパニングにより、ランダム変異ＳＰＩ
ＮＫ２ライブラリーから標的特異的な結合性を示すＳＰＩＮＫ２変異体（ポリクローン）
が濃縮されたことが、ＥＬＩＳＡ法により確認された。
【0174】
[実施例３]
α－ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ結合ペプチド（シングルクローン）の評価
（３－１）ｐＥＴ ３２ａ（改変）の構築
ｐＩＲＥＳ Ｐｕｒｏ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として、下記プライマー１３およ
び１４、ならびにＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １
５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ３０秒）×３０ｃｙｃｌｅ）を行った。
５’－ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＣＣＧＡＧＴＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣ
－３’
５’－ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＧＣＡＣＣＧＧＧＣＴＴＧ
ＣＧＧ－３’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗ
ｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ）によりＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡ断片およびｐＥＴ ３２ａ（＋）（
Ｎｏｖａｇｅｎ）をそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩ（ＴＡＫＡＲＡ）およびＸｈｏＩ（ＴＡ
ＫＡＲＡ）を用いて、３７℃で１時間以上処理し、アガロースゲル電気泳動後に、所望の
ＤＮＡ断片を切り出し、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕ
ｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により精製した。精製した断片を、Ｔ４ ＤＮＡ
Ｌｉｇａｓｅを用いて、１６℃で一晩反応させることで、ｌｉｇａｔｉｏｎ反応を実施し
、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換された大腸菌を培養した後に、ｍｉｎｉｐ
ｒｅｐおよび配列解析を実施することで、「ｐＥＴ ３２ａ（改変）」を構築した。尚、
操作は（１－２）に記載の方法に準じて行った。
α－ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ結合ペプチド（シングルクローン）の評価
（３－１）ｐＥＴ ３２ａ（改変）の構築
ｐＩＲＥＳ Ｐｕｒｏ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として、下記プライマー１３およ
び１４、ならびにＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １
５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ３０秒）×３０ｃｙｃｌｅ）を行った。
５’－ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＣＣＧＡＧＴＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣ
－３’
５’－ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＧＣＡＣＣＧＧＧＣＴＴＧ
ＣＧＧ－３’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗ
ｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ）によりＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡ断片およびｐＥＴ ３２ａ（＋）（
Ｎｏｖａｇｅｎ）をそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩ（ＴＡＫＡＲＡ）およびＸｈｏＩ（ＴＡ
ＫＡＲＡ）を用いて、３７℃で１時間以上処理し、アガロースゲル電気泳動後に、所望の
ＤＮＡ断片を切り出し、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕ
ｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により精製した。精製した断片を、Ｔ４ ＤＮＡ
Ｌｉｇａｓｅを用いて、１６℃で一晩反応させることで、ｌｉｇａｔｉｏｎ反応を実施し
、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換された大腸菌を培養した後に、ｍｉｎｉｐ
ｒｅｐおよび配列解析を実施することで、「ｐＥＴ ３２ａ（改変）」を構築した。尚、
操作は（１－２）に記載の方法に準じて行った。
【0175】
（３－２）α－ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ結合ペプチドの大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ（Ｄ
Ｅ３）での発現精製
ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属の
説明書に従い、パニング後の大腸菌群からｐｈａｇｅｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒを回収した。
回収したベクターおよびｐＥＴ ３２ａ（改変）を、制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＴＡＫＡＲＡ
）およびＮｏｔＩ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、３７℃で１時間以上処理し、アガロースゲ
ル電気泳動後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ
ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により精製した。精製した
断片を、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）を用いて、１６℃で一晩反応させること
で、ｌｉｇａｔｉｏｎ反応を行い、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を実施した。尚、操作は
（１－２）に記載の方法に準じて行った。Ｍｉｎｉｐｒｅｐにより回収したプラスミドで
、大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換し、０．１ｍｇ／
ｍｌアンピシリンを含む２－ＹＴプレートに播種した。
次に、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含む２－ＹＴ培地にコロニーを植菌し、３７℃
で一晩培養後、その一部を再度０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含む２－ＹＴ培地に植菌
し、ＯＤ６００ｎｍ＝１ぐらいまで培養した。その後、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を加
え、１６℃で一晩培養することで、発現誘導を実施した。翌日、遠心分離（３，０００ｇ
、２０分、４℃）により集菌後、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｏｖａ
ｇｅｎ）を添加し、室温で２０分攪拌した。遠心分離（１０，０００ｇ、２０分、４℃）
により回収した上清に、ＴＡＬＯＮ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（ＴＡ
ＫＡＲＡ）を加え、４℃で１時間以上攪拌することで、当該ＲｅｓｉｎにＨｉｓ ｔａｇ
融合目的蛋白質を吸着させた。リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）でＲｅｓｉｎを数回洗浄した後、
溶出液（５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１５０
ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌ、ｐＨ７．４）を添加することでＨｉｓ ｔａｇ融合蛋白質を回
収した。さらに、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｃａｐｔｕｒｅ ｋｉｔ（Ｎｏ
ｖａｇｅｎ）を用いてＴｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｔａｇを切断し、ＴＡＬＯＮに添加する
ことでＴｈｉｏｒｅｄｏｉｎ ｔａｇを除去した。最後に、Ａｍｉｃｏｎ－Ｕｌｔｒａ（
３ｋ）を用いて、目的蛋白質の濃縮およびＰＢＳへの置換を実施した。調製した目的蛋白
質（ＳＰＩＮＫ２変異体）を、還元および非還元状態でＳＤＳ－ＰＡＧＥに供することで
、分子状態の解析を試みた。
結果を図５および６に示す。全てのクローンは、還元および非還元状態で単一バンドを
示したことから、発現精製した目的蛋白質の分子状態は、モノマー体が主成分であること
が確認された。
Ｅ３）での発現精製
ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属の
説明書に従い、パニング後の大腸菌群からｐｈａｇｅｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒを回収した。
回収したベクターおよびｐＥＴ ３２ａ（改変）を、制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＴＡＫＡＲＡ
）およびＮｏｔＩ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、３７℃で１時間以上処理し、アガロースゲ
ル電気泳動後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ
ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により精製した。精製した
断片を、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）を用いて、１６℃で一晩反応させること
で、ｌｉｇａｔｉｏｎ反応を行い、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を実施した。尚、操作は
（１－２）に記載の方法に準じて行った。Ｍｉｎｉｐｒｅｐにより回収したプラスミドで
、大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換し、０．１ｍｇ／
ｍｌアンピシリンを含む２－ＹＴプレートに播種した。
次に、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含む２－ＹＴ培地にコロニーを植菌し、３７℃
で一晩培養後、その一部を再度０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含む２－ＹＴ培地に植菌
し、ＯＤ６００ｎｍ＝１ぐらいまで培養した。その後、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を加
え、１６℃で一晩培養することで、発現誘導を実施した。翌日、遠心分離（３，０００ｇ
、２０分、４℃）により集菌後、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｏｖａ
ｇｅｎ）を添加し、室温で２０分攪拌した。遠心分離（１０，０００ｇ、２０分、４℃）
により回収した上清に、ＴＡＬＯＮ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（ＴＡ
ＫＡＲＡ）を加え、４℃で１時間以上攪拌することで、当該ＲｅｓｉｎにＨｉｓ ｔａｇ
融合目的蛋白質を吸着させた。リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）でＲｅｓｉｎを数回洗浄した後、
溶出液（５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１５０
ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌ、ｐＨ７．４）を添加することでＨｉｓ ｔａｇ融合蛋白質を回
収した。さらに、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｃａｐｔｕｒｅ ｋｉｔ（Ｎｏ
ｖａｇｅｎ）を用いてＴｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｔａｇを切断し、ＴＡＬＯＮに添加する
ことでＴｈｉｏｒｅｄｏｉｎ ｔａｇを除去した。最後に、Ａｍｉｃｏｎ－Ｕｌｔｒａ（
３ｋ）を用いて、目的蛋白質の濃縮およびＰＢＳへの置換を実施した。調製した目的蛋白
質（ＳＰＩＮＫ２変異体）を、還元および非還元状態でＳＤＳ－ＰＡＧＥに供することで
、分子状態の解析を試みた。
結果を図５および６に示す。全てのクローンは、還元および非還元状態で単一バンドを
示したことから、発現精製した目的蛋白質の分子状態は、モノマー体が主成分であること
が確認された。
【0176】
（３－３）大腸菌で発現精製したα－ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ結合ペプチドの標的結合
親和性の評価
（３－２）で調製したＳＰＩＮＫ２変異体（α－ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ ｂｉｎｄ
ｅｒ）の標的結合特異性を確認するため、ＥＬＩＳＡ法による評価を実施した。Ｎｕｎｃ
Ｍａｘｉｓｏｒｐ ｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍ ９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに、標的蛋
白質ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｏｎを添加し、４℃で一晩静置することで、９６ ｗｅｌｌ
ｐｌａｔｅのコーティングを行った。次に、（３－２）で調製したＳＰＩＮＫ２変異体を
サンプルとして添加し、室温で１時間静置した。その後、サンプルを除き、ＰＢＳ－Ｔで
洗浄した後、Ｓ－Ｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｈ
ＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＢＥＴＨＹＬ）を添加し、室温で１時間静置した。その後
、検出抗体溶液を除き、ＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、ＰＯＤ基質Ａ．Ｂ．Ｔ．Ｓ．キットを
用いて発色させ、測定波長４０５ｎｍの吸光度を測定した。サンプルおよびＳ－Ｔａｇ
Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ
ｄの希釈にはＰＢＳ－Ｔを用いた。
結果を図７および８に示す。大腸菌で調製したＳＰＩＮＫ２変異体は、全てが標的に対
して結合性を有していた。また、ＥＬＩＳＡはｓｉｇｍｏｉｄ曲線を示したことから、Ｅ
ＬＩＳＡで検出されたシグナル強度の最低値および最大反応より、最大反応の５０％を示
す濃度、すなわちＥＣ５０を算出し、ペプチド番号２（ｃｌｏｎｅ２）の結合活性値ＥＣ
５０は１８．３ｎＭ、ペプチド番号６（ｃｌｏｎｅ６）のＥＣ５０は１７．８ｎＭである
ことが確認された。
親和性の評価
（３－２）で調製したＳＰＩＮＫ２変異体（α－ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ ｂｉｎｄ
ｅｒ）の標的結合特異性を確認するため、ＥＬＩＳＡ法による評価を実施した。Ｎｕｎｃ
Ｍａｘｉｓｏｒｐ ｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍ ９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに、標的蛋
白質ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｏｎを添加し、４℃で一晩静置することで、９６ ｗｅｌｌ
ｐｌａｔｅのコーティングを行った。次に、（３－２）で調製したＳＰＩＮＫ２変異体を
サンプルとして添加し、室温で１時間静置した。その後、サンプルを除き、ＰＢＳ－Ｔで
洗浄した後、Ｓ－Ｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｈ
ＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＢＥＴＨＹＬ）を添加し、室温で１時間静置した。その後
、検出抗体溶液を除き、ＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、ＰＯＤ基質Ａ．Ｂ．Ｔ．Ｓ．キットを
用いて発色させ、測定波長４０５ｎｍの吸光度を測定した。サンプルおよびＳ－Ｔａｇ
Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ
ｄの希釈にはＰＢＳ－Ｔを用いた。
結果を図７および８に示す。大腸菌で調製したＳＰＩＮＫ２変異体は、全てが標的に対
して結合性を有していた。また、ＥＬＩＳＡはｓｉｇｍｏｉｄ曲線を示したことから、Ｅ
ＬＩＳＡで検出されたシグナル強度の最低値および最大反応より、最大反応の５０％を示
す濃度、すなわちＥＣ５０を算出し、ペプチド番号２（ｃｌｏｎｅ２）の結合活性値ＥＣ
５０は１８．３ｎＭ、ペプチド番号６（ｃｌｏｎｅ６）のＥＣ５０は１７．８ｎＭである
ことが確認された。
【0177】
（３－４）大腸菌で発現精製したα－ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ結合ペプチドの標的特異
性の評価
Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍ ９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ
に、標的蛋白質ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎおよびネガティブコントロールｔｒｙｐｓｉｎ
（ＰＩＥＲＣＥ）を添加し、４℃で一晩静置することで、９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅの
コーティングを行った。次に、（３－２）で調製したＳＰＩＮＫ２変異体をサンプルとし
て添加し、室温で１時間静置した。その後、サンプルを除き、ＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、
Ｓ－Ｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＨＲＰ ｃｏｎ
ｊｕｇａｔｅｄを添加し、室温で１時間静置した。その後、検出抗体溶液を除き、ＰＢＳ
－Ｔで洗浄した後、ＰＯＤ基質Ａ．Ｂ．Ｔ．Ｓ．キットを用いて発色させ、測定波長４０
５ｎｍの吸光度を測定した。サンプルおよびＳ－Ｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｆｆｉｎ
ｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄの希釈にはＰＢＳ－Ｔを用い
た。
結果を図９および１０に示す。ペプチド番号２および６（ｃｌｏｎｅ２および６）は、
ｔｒｙｐｓｉｎに対しては全く反応性を示さなかったが、標的蛋白質であるｃｈｙｍｏｔ
ｒｙｐｓｉｎには強い反応を示したことから、標的特異的な結合を有することが見出され
た。
性の評価
Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍ ９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ
に、標的蛋白質ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎおよびネガティブコントロールｔｒｙｐｓｉｎ
（ＰＩＥＲＣＥ）を添加し、４℃で一晩静置することで、９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅの
コーティングを行った。次に、（３－２）で調製したＳＰＩＮＫ２変異体をサンプルとし
て添加し、室温で１時間静置した。その後、サンプルを除き、ＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、
Ｓ－Ｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＨＲＰ ｃｏｎ
ｊｕｇａｔｅｄを添加し、室温で１時間静置した。その後、検出抗体溶液を除き、ＰＢＳ
－Ｔで洗浄した後、ＰＯＤ基質Ａ．Ｂ．Ｔ．Ｓ．キットを用いて発色させ、測定波長４０
５ｎｍの吸光度を測定した。サンプルおよびＳ－Ｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｆｆｉｎ
ｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄの希釈にはＰＢＳ－Ｔを用い
た。
結果を図９および１０に示す。ペプチド番号２および６（ｃｌｏｎｅ２および６）は、
ｔｒｙｐｓｉｎに対しては全く反応性を示さなかったが、標的蛋白質であるｃｈｙｍｏｔ
ｒｙｐｓｉｎには強い反応を示したことから、標的特異的な結合を有することが見出され
た。
【0178】
（３－５）大腸菌で発現精製したα－ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ結合ペプチドのｃｈｙｍ
ｏｔｒｙｐｓｉｎ阻害活性評価
標的蛋白質ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎに関して、（３－２）で調製したＳＰＩＮＫ２変
異体およびＰｉｅｒｃｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙ
Ｋｉｔを用いて、阻害活性を定量した。操作は、付属の説明書に従い、実施した。
結果を図１１に示す。ペプチド番号２および６（ｃｌｏｎｅ２および６）はともに阻害
活性を示し、それぞれのＩＣ５０は、８１５ｎＭ、３７４ｎＭであった。
ｏｔｒｙｐｓｉｎ阻害活性評価
標的蛋白質ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎに関して、（３－２）で調製したＳＰＩＮＫ２変
異体およびＰｉｅｒｃｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙ
Ｋｉｔを用いて、阻害活性を定量した。操作は、付属の説明書に従い、実施した。
結果を図１１に示す。ペプチド番号２および６（ｃｌｏｎｅ２および６）はともに阻害
活性を示し、それぞれのＩＣ５０は、８１５ｎＭ、３７４ｎＭであった。
【0179】
（３－６）α－ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ結合ペプチドの配列解析
（３－３）でｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎに対して結合性を示したＳＰＩＮＫ２変異体（
α－ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ結合ペプチド）の配列解析を実施した。各ＳＰＩＮＫ２変
異体で形質転換された大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）を、０．１ｍｇ／ｍｌアンピ
シリンを含む２－ＹＴ培地を用いて３７℃で一晩培養し、翌日、ＱＩＡｐｒｅｐ ９６
Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いて培養物からプラスミドＤＮＡを回収した
。該プラスミドＤＮＡを鋳型とし、次の塩基配列を有するプライマー１５：
５’－ＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＣＡＴＡＴＧＣＡＣＣＡＴＣ－３’
を用いて、塩基配列を解析した。
ランダム化領域（ランダム領域）の解析結果を図１２に示す。全てのＳＰＩＮＫ２変異
体のランダム化領域は、異なる塩基配列を有していた。
（３－３）でｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎに対して結合性を示したＳＰＩＮＫ２変異体（
α－ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ結合ペプチド）の配列解析を実施した。各ＳＰＩＮＫ２変
異体で形質転換された大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）を、０．１ｍｇ／ｍｌアンピ
シリンを含む２－ＹＴ培地を用いて３７℃で一晩培養し、翌日、ＱＩＡｐｒｅｐ ９６
Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いて培養物からプラスミドＤＮＡを回収した
。該プラスミドＤＮＡを鋳型とし、次の塩基配列を有するプライマー１５：
５’－ＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＣＡＴＡＴＧＣＡＣＣＡＴＣ－３’
を用いて、塩基配列を解析した。
ランダム化領域（ランダム領域）の解析結果を図１２に示す。全てのＳＰＩＮＫ２変異
体のランダム化領域は、異なる塩基配列を有していた。
【産業上の利用可能性】
【0180】
本発明のペプチド・ライブラリーは、各種標的分子に結合するペプチドの探索に使用す
ることができ、検査薬、診断薬等の研究に有用である。また、予め決定された標的分子に
結合するペプチドは検査薬、診断薬等として有用である。
ることができ、検査薬、診断薬等の研究に有用である。また、予め決定された標的分子に
結合するペプチドは検査薬、診断薬等として有用である。
【配列表フリーテキスト】
【0181】
配列表の配列番号１ － 多様性を伴うペプチドのランダム領域（図１３）
配列表の配列番号２ － キモトリプシン結合ペプチドのランダム領域（図１２：ペプチ
ド番号１）
配列表の配列番号３ － キモトリプシン結合ペプチドのランダム領域（図１２：ペプチ
ド番号２）
配列表の配列番号４ － キモトリプシン結合ペプチドのランダム領域（（図１２：ペプ
チド番号６）
配列表の配列番号５ － キモトリプシン結合ペプチドのランダム領域（（図１２：ペプ
チド番号７）
配列表の配列番号６ － キモトリプシン結合ペプチドのランダム領域（（図１２：ペプ
チド番号１２）
配列表の配列番号７ － キモトリプシン結合ペプチドのランダム領域（（図１２：ペプ
チド番号１３）
配列表の配列番号８ － キモトリプシン結合ペプチドのランダム領域（（図１２：ペプ
チド番号１４）
配列表の配列番号９ － キモトリプシン結合ペプチドのランダム領域（（図１２：ペプ
チド番号１７）
配列表の配列番号１０ － 断片１（図１４）
配列表の配列番号１１ － 断片２（図１５中の下線部）
配列表の配列番号１２ － 断片３（図１６）
配列表の配列番号１３ － 断片５（図１７）
配列表の配列番号１４ － ＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列をコードする塩基配列（図１８
）
配列表の配列番号１５ － 配列表の配列番号１４で示される塩基配列がコードするアミ
ノ酸配列
配列表の配列番号１６ － 断片１～断片５を含むＰＣＲ用鋳型ＤＮＡの塩基配列
配列表の配列番号２ － キモトリプシン結合ペプチドのランダム領域（図１２：ペプチ
ド番号１）
配列表の配列番号３ － キモトリプシン結合ペプチドのランダム領域（図１２：ペプチ
ド番号２）
配列表の配列番号４ － キモトリプシン結合ペプチドのランダム領域（（図１２：ペプ
チド番号６）
配列表の配列番号５ － キモトリプシン結合ペプチドのランダム領域（（図１２：ペプ
チド番号７）
配列表の配列番号６ － キモトリプシン結合ペプチドのランダム領域（（図１２：ペプ
チド番号１２）
配列表の配列番号７ － キモトリプシン結合ペプチドのランダム領域（（図１２：ペプ
チド番号１３）
配列表の配列番号８ － キモトリプシン結合ペプチドのランダム領域（（図１２：ペプ
チド番号１４）
配列表の配列番号９ － キモトリプシン結合ペプチドのランダム領域（（図１２：ペプ
チド番号１７）
配列表の配列番号１０ － 断片１（図１４）
配列表の配列番号１１ － 断片２（図１５中の下線部）
配列表の配列番号１２ － 断片３（図１６）
配列表の配列番号１３ － 断片５（図１７）
配列表の配列番号１４ － ＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列をコードする塩基配列（図１８
）
配列表の配列番号１５ － 配列表の配列番号１４で示される塩基配列がコードするアミ
ノ酸配列
配列表の配列番号１６ － 断片１～断片５を含むＰＣＲ用鋳型ＤＮＡの塩基配列
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15-1】
【図15-2】
【図15-3】
【図15-4】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20-1】
【図20-2】
【配列表】