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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024039229
(43)【公開日】2024-03-22
(54)【発明の名称】Ｇａｌｅｃｔｉｎ－７阻害剤を用いた癌転移抑制剤
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20240314BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240314BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20240314BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240314BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20240314BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240314BHJP
C12Q 1/6813 20180101ALI20240314BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20240314BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240314BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240314BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240314BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
C12N15/113 Z ZNA
C07K16/18
C12Q1/02
C12Q1/6851 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6813 Z
A61P35/04
A61K48/00
A61K31/7088
A61K39/395 D
A61K39/395 N
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022143622
(22)【出願日】2022-09-09
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】504409543
【氏名又は名称】国立大学法人秋田大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000774
【氏名又は名称】弁理士法人 もえぎ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】久場 敬司
(72)【発明者】
【氏名】本山 悟
(72)【発明者】
【氏名】安 健博
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 穣
【テーマコード（参考）】
4B063
4C084
4C085
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QQ79
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR48
4B063QR55
4B063QR62
4B063QR72
4B063QR77
4B063QS25
4B063QS34
4B063QS36
4B063QX01
4C084AA13
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC411
4C084ZC412
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085EE01
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB26
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA75
4H045EA20
4H045EA50
(57)【要約】 （修正有）
【課題】癌転移におけるガレクチン-7の生理学的役割、特に、腫瘍微小環境における免疫抑制にガレクチン-7が果たす役割を明らかにすることにより、癌転移を抑制するための治療法及び治療薬を提供する。
【解決手段】ガレクチン-7阻害剤を有効成分とする癌転移抑制剤、好ましくは、ガレクチン-7阻害剤が、ガレクチン-7メッセンジャーRNA(mRNA)に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであり、好ましくは、ガレクチン-7阻害剤が、ガレクチン-7タンパク質に対する抗体である、癌転移抑制剤を提供する。
【選択図】図３
【解決手段】ガレクチン-7阻害剤を有効成分とする癌転移抑制剤、好ましくは、ガレクチン-7阻害剤が、ガレクチン-7メッセンジャーRNA(mRNA)に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであり、好ましくは、ガレクチン-7阻害剤が、ガレクチン-7タンパク質に対する抗体である、癌転移抑制剤を提供する。
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ガレクチン-7阻害剤を有効成分とする癌転移抑制剤。
【請求項2】
ガレクチン-7阻害剤が、ガレクチン-7メッセンジャーRNA(mRNA)に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の癌転移抑制剤。
【請求項3】
ガレクチン-7阻害剤が、ガレクチン-7タンパク質に対する抗体である、請求項1に記載の癌転移抑制剤。
【請求項4】
担癌患者由来試料中のガレクチン-7タンパク質濃度が、標準対照と比較して一定倍数以上高い場合に転移のリスクが高いと判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、癌免疫療法及びこれに使用する医薬に関するものである。
【背景技術】
【0002】
世界中で癌関連死亡の主因はがん転移である1,2。扁平上皮癌(SCC)は、皮膚、膀胱および上部気道消化管に発生する異なるタイプの腫瘍を含む。上部気道消化管癌のうち、頭頸部癌(口腔癌を含む)はほぼ全例、食道癌は80%以上がSCCである3,4。これらのSCCは、喫煙、飲酒、発癌性ウイルスなどの同じ危険因子により発症し、治療と同様に病理学的にも密接な類似性を共有している5。SCCは腺癌よりもリンパ節および遠隔臓器への転移を伴う頻度が高い。外科療法と化学療法/放射線療法を組み合わせた包括的治療戦略が継続的に進歩しているにもかかわらず、腫瘍はしばしば治療抵抗性で、患者の予後は不良である6,7。体細胞癌の重要な予後決定因子は転移の存在であり、死亡率と有意に相関する6,7。実際には、外科的治療後のリンパ節や遠隔臓器への転移による再発が問題となることが多い。このように、SCC細胞の転移の基本的機序を実験的に検討することは重要である。
【0003】
がん細胞は不均一な集団であり、転移能の高い細胞(転移性細胞)のごく一部がクローン選択されて転移に寄与している8,9。腫瘍微小環境は、線維芽細胞、内皮細胞、免疫/炎症細胞、および細胞外マトリックスから構成される。転移性細胞は、特異的な腫瘍微小環境において、周囲の細胞との相互作用、すなわち癌間質クロストークを介して、リンパ管および/または血管内で選択的に増殖し、侵入し、移動性を獲得する10,11。抗腫瘍免疫は腫瘍根絶に必須の役割を果たす。細胞傷害性リンパ球や樹状細胞(DC)などの抗腫瘍免疫細胞のアポトーシスや消耗、制御性T細胞や骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)の動員は、免疫抑制の微小環境を構成し、腫瘍細胞が播種の免疫監視から逃れることを可能にする12,13。さらに、免疫抑制/消耗は、低酸素環境の発達や血管新生と関連していた14,15。しかし、免疫抑制が腫瘍微小環境における転移をどのように形作るかの分子機構はほとんど未知のままであり、これは部分的には、in vivoでの腫瘍微小環境の遺伝子発現プロファイルを評価する方法論が限られているためである。
【0004】
ガレクチンは多様な生物学的機能を有するβ‐ガラクトシド結合レクチンのファミリーであり、全部で16の哺乳動物ガレクチンが同定されている16-18。ヒトの表皮で最初に同定されたガレクチンファミリーの原型であるガレクチン-7は、1つの糖鎖認識部位をもつ15kDaのタンパク質であり、ホモ二量体を形成する19,20。ガレクチン-7の発現は、主に皮膚、舌部、食道、胸腺などの重層上皮細胞に認められる21。ガレクチン-7の機能には、細胞遊走、細胞接着、アポトーシスおよび免疫の調節がある22,23。癌では、ガレクチン-7はもともとアポトーシスを起こした大腸癌細胞におけるp53誘導遺伝子として同定された。一方、ガレクチン-7の癌における役割は、腫瘍形成促進性と抗腫瘍性の両方が報告されており、SCCでも同様である25-27。例えば、ガレクチン-7の発現は、食道SCCおよび膀胱SCCにおける腫瘍細胞の高分化状態と正の相関を示した28,29。ガレクチン-7の発現は、子宮頸部SCC患者の予後に有益である30-32。一方、ガレクチン-7の高発現は口腔SCCの予後不良を予測する33-37。さらに、ガレクチン-7は、マウス異種移植モデルにおいて、ヒト頭頸部SCC (HNSCC)細胞及び乳癌細胞の腫瘍転移を促進することが報告された38,39。このように、癌転移におけるガレクチン-7の生理学的役割は未だ解明されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明が解決しようとする課題は、癌転移におけるガレクチン-7の生理学的役割、特に、腫瘍微小環境における免疫抑制にガレクチン-7が果たす役割を明らかにすることにより、癌転移を抑制するための治療法及び治療薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本研究では、同系マウスSCCモデルを利用することにより、転移性腫瘍微小環境の分子基盤を検討した。転移した腫瘍細胞の遺伝子発現プロファイルは、転移における免疫抑制の役割を示唆した。我々は、空間的トランスクリプトーム解析を行い、下方制御されたインターフェロン応答、抗原提示、ならびに自然免疫応答の特徴を共有する原発腫瘍の免疫抑制領域を遺伝的にマッピングした。免疫抑制領域内で、転移の決定的メディエータとして腫瘍細胞由来ガレクチン-7を同定した。ガレクチン-7の枯渇は、原発腫瘍の増殖に影響することなく、リンパ節および肺転移を有意に抑制した。従って、本発明は以下の構成を有する。
[実施態様1]
ガレクチン-7阻害剤を有効成分とする癌転移抑制剤。
[実施態様2]
ガレクチン-7阻害剤が、ガレクチン-7メッセンジャーRNA(mRNA)に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである、実施態様1に記載の癌転移抑制剤。
[実施態様3]
ガレクチン-7阻害剤が、ガレクチン-7タンパク質に対する抗体である、実施態様1に記載の癌転移抑制剤。
[実施態様4]
担癌患者由来試料中のガレクチン-7タンパク質濃度が、標準対照と比較して一定倍数以上高い場合に転移のリスクが高いと判定する方法。
[実施態様1]
ガレクチン-7阻害剤を有効成分とする癌転移抑制剤。
[実施態様2]
ガレクチン-7阻害剤が、ガレクチン-7メッセンジャーRNA(mRNA)に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである、実施態様1に記載の癌転移抑制剤。
[実施態様3]
ガレクチン-7阻害剤が、ガレクチン-7タンパク質に対する抗体である、実施態様1に記載の癌転移抑制剤。
[実施態様4]
担癌患者由来試料中のガレクチン-7タンパク質濃度が、標準対照と比較して一定倍数以上高い場合に転移のリスクが高いと判定する方法。
【発明の効果】
【0008】
本発明の医薬を用いることにより、癌又は腫瘍、特に、転移性腫瘍微小環境における免疫抑制が問題となる癌又は腫瘍の転移を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】インターフェロン遺伝子シグネチャーは転移性NR‐S1M細胞で下方制御される。C3H/HeN雌マウスにNRS1M細胞を皮下移植した。a、腫瘍増殖の経時変化を追跡し、腫瘍重量を測定してプロットする。b、移植2、4および5週後に、LN転移を有するマウスの割合を算出し、棒グラフとして示す。c、肺内の転移した腫瘍結節の数を数え、プロットする。d、転移性NR-S1M細胞を単離するための実験過程の図解。e、in vitroで培養した親および転移性NR-S1M細胞の増殖能をBrdU取り込みアッセイにより測定し、増殖細胞を表すO.D.値を棒グラフとしてプロットする。f、細胞死の程度はPI染色で評価し、PI陽性細胞の割合(比率、%)を算出する。C3H/HeN雌マウスに親NR-S1M細胞と転移性NR‐S1M細胞をそれぞれ移植した。g、移植後4週目の腫瘍重量を測定した。h、移植3週間後にLN転移を有するマウスの割合を算出する。データは平均値±標準誤差として示す。*p<0.05。***p<0.005。親細胞及び転移性NR-S1M細胞の網羅的遺伝子発現プロファイルは、RNA-Seqにより決定した。i、適用したカットオフ値(Q値<0.05、倍率変化>2)でDEGを提示する散布図である。j、転移性NR‐S1M細胞における下方制御されたDEGの遺伝子セット濃縮分析インターフェロン応答の遺伝子セットはトップヒットとして同定された。k、インターフェロン応答に含まれる遺伝子の発現レベル(TPM+1に調整)をヒートマッププロットとして示す。
【図2】悪性NR-S1M腫瘍は、限局性の免疫抑制領域を発達させる。a、CD45+ Gr-1-細胞上のCD3εおよびB220発現の代表的な細胞像指定されたT細胞とB細胞の割合を計算し、棒グラフとしてプロットする。b-c、転移性細胞に由来するNR-S1M腫瘍を、抗CD8または抗CD11c抗体を用いて免疫染色した。CD8陽性(b)およびCD11c陽性(c)細胞(茶色)を示す代表的な画像。青枠と赤枠の領域を強拡大すると、それぞれ免疫細胞に富む領域と乏しい領域が強調される。d-e、親細胞のNR-S1M腫瘍におけるCD8陽性(d)細胞およびCD11c陽性(e)細胞(茶色)の代表例。赤枠の領域を強拡大すると、免疫細胞の重度の欠損が強調される。
【図3】NR‐S1M腫瘍の空間的トランスクリプトーム(ST)解析。a、NR-S1M腫瘍組織のVisium結果の可視化(#3-2項)。H&E染色(左)と合計2812個のSTスポットを表す(右)。組織全体は、色の異なる偏りのないK-Meansクラスタリング(k = 9)を介して分類される。各クラスターのSTスポット数を列挙した。b、t-SNEアルゴリズムに従って、9つのクラスターすべてをプロットする。c-d、Loupe Browser Softwareを用いて、各クラスターの有意に上方制御された(c)および下方制御された(d)遺伝子を決定し、GO濃縮分析(Metascapeツール)に供した。各クラスターの上位5つのGO用語をP値付き棒グラフとして示した。
【図4】転移能を有する免疫抑制領域の同定。a-b、指定された免疫適格性(クラスター6)および免疫抑制性(クラスター4)領域のSTスポットは、それぞれ青色と赤色に着色される。これらの領域のうち、CD8陽性(a)およびCD11c陽性(b) STスポット(黄色)の割合を算出しプロットする。c、免疫適格性クラスターと免疫抑制性クラスターの間の有意に上方制御された遺伝子のマルチGO解析低酸素、アポトーシスシグナル伝達経路および血管新生の細胞応答のGO用語に対応する転移関連遺伝子の発現量(Median-Normalized Average)をdの棒グラフとしてプロットした。データは平均± SEMで示す。*p<0.05。**p<0.01。
【図5】潜在的転移促進因子としてのガレクチン-7の同定。a、転移性NR-S1M細胞における下方制御されたDEG(親株と比較して、赤丸、470遺伝子)および免疫抑制クラスター(免疫適格クラスターと比較して、青丸、86遺伝子)を合併して、21の共通遺伝子を得る。b、転移性NR-S1M細胞における上方制御されたDEG(親株と比較して、赤丸、393遺伝子)および免疫抑制クラスター(免疫適格クラスターと比較して、青丸、20遺伝子)を合併して、2つの共通遺伝子を得る。c-d、転移性NR-S1M細胞(c)および免疫抑制領域(d)におけるLgals7の上方制御された発現量を棒グラフとして示す。e、親および転移性NR-S1M細胞由来の細胞溶解物をウェスタンブロット法に付す。バンドはそれぞれガレクチン-7とGAPDH (内部対照)のレベルを示す。f、抗Gal-7抗体および抗CD8抗体を用いてNR-S1M腫瘍を免疫染色した。Gal-7がCD8に乏しい領域(赤い点線で囲まれた地域)で高発現していることを示す代表的な画像である。g、IFN‐γ(100ng/ml)またはTNF‐α(100ng/ml)の24時間処理の有無による転移性NR‐S1M細胞におけるLgals7発現の定量的RT‐PCR分析h、転移性NR-S1M細胞培養の上清およびNR-S1M移植マウス由来の血漿を採取し、ELISAに供した。ガレクチン-7の含有量を定量し、棒グラフとしてプロットする。データは平均± SEMで示す。*p<0.05。**p<0.01。****p<0.001。
【図6】NR‐S1M細胞におけるガレクチン-7の除去は転移を軽減する。C3H/HeN雌マウスに対照またはGal-7 KO NR-S1M細胞を6週間移植した。a、血漿ガレクチン-7の含有量はELISAにより定量した。b、腫瘍体積の経時変化を追跡し(左)、最終腫瘍重量を測定した(右)。c、6週間の移植後、LN転移を有するマウスの割合を計算する。d、各群のマウスのマクロ肺の代表的な画像を示す。棒は4mmを示す。e、肺内の転移性腫瘍結節の数を数え、プロットする。f、各群のマウスの肺重量を測定し、プロットする。データは平均± SEMで示す。*p<0.05。**p<0.01。
【図7】NR-S1M腫瘍におけるCD45+ Gr-1+細胞の比率。親および転移性NR‐S1M細胞に由来する腫瘍におけるCD45+ Gr‐1+細胞の割合に関するフローサイトメトリー解析
【図8】STクラスターのGlobal GO分析(切片#3-2)K‐Means分類クラスタ間の有意に上方制御された(左)および下方制御された(右)遺伝子のマルチGO解析
【図9】NR-S1M腫瘍のST解析(切片#3-1)。a、NR-S1M腫瘍組織(#3-1)のVisium結果の可視化H&E染色(左)と合計2258個のSTスポットを表す(右)。組織全体は、色の異なる偏りのないK-Meansクラスタリング(k = 9)を介して分類される。各クラスターのSTスポット数を列挙した。b、t-SNEアルゴリズムに従って、9つのクラスターすべてをプロットする。c-d、Loupe Browser Softwareを用いて、各クラスターの有意に上方制御された(c)および下方制御された(d)遺伝子を決定し、GO濃縮分析(Metascapeツール)に供した。各クラスターの上位5つのGO用語をP値付き棒グラフとして示した。
【図10】NR-S1M腫瘍のST解析(切片#4-3)。a、NR-S1M腫瘍組織(#4-3)のVisium結果の可視化H&E染色(左)と合計3774個のSTスポットを表す(右)。組織全体は、色の異なる偏りのないK-Meansクラスタリング(k = 9)を介して分類される。各クラスターのSTスポット数を列挙した。b、t-SNEアルゴリズムに従って、9つのクラスターすべてをプロットする。c-d、Loupe Browser Softwareを用いて、各クラスターの有意に上方制御された(c)および下方制御された(d)遺伝子を決定し、GO濃縮分析(Metascapeツール)に供した。各クラスターの上位5つのGO用語をP値付き棒グラフとして示した。
【図11】NR-S1M腫瘍のST解析(切片#4-4)。a、NR-S1M腫瘍組織(#4-4)のVisium結果の可視化H&E染色(左)と合計2446個のSTスポットを表す(右)。組織全体は、色の異なる偏りのないK平均クラスタリング(k = 9)を介して分類される。各クラスターのSTスポット数を列挙した。b、t-SNEアルゴリズムに従って、9つのクラスターすべてをプロットする。c-d、Loupe Browser Softwareを用いて、各クラスターの有意に上方制御された(c)および下方制御された(d)遺伝子を決定し、GO濃縮分析(Metascapeツール)に供した。各クラスターの上位5つのGO用語をP値付き棒グラフとして示した。
【図12】免疫抑制領域の比較GO解析(切片#3-1)。NR-S1M腫瘍組織#3-1では、指定された免疫適格性(クラスター2)および免疫抑制性(クラスター3)領域のSTスポットがそれぞれ青色および赤色に着色されている。免疫適格性クラスターと免疫抑制性クラスターの間の有意に上方制御された遺伝子のマルチGO解析を示す。
【図13】免疫抑制領域の比較GO解析(切片#4-3)。NR-S1M腫瘍組織#4-3では、指定された免疫適格性(クラスター3)および免疫抑制性(クラスター4)領域のSTスポットがそれぞれ青色および赤色に着色されている。免疫適格性クラスターと免疫抑制性クラスターの間の有意に上方制御された遺伝子のマルチGO解析を示す。
【図14】免疫抑制領域の比較GO解析(切片#4-4)。NR-S1M腫瘍組織#4-4では、指定された免疫適格性(クラスター2)および免疫抑制性(クラスター4)領域のSTスポットがそれぞれ青色および赤色に着色されている。免疫適格性クラスターと免疫抑制性クラスターの間の有意に上方制御された遺伝子のマルチGO解析を示す。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明者らは、転移性癌細胞がガレクチン-7タンパク質を細胞外に分泌し、腫瘍微小環境において免疫抑制を達成することにより自らの転移を促進することを見出した。従って、様々な段階においてガレクチン-7の機能を阻害する物質が本発明の癌転移抑制剤の有効成分となる。また、本発明の一態様において、担癌患者由来試料中のガレクチン-7タンパク質濃度が、標準対照と比較して一定倍数以上高い場合に転移のリスクが高いと判定することができる。当該一定倍数としては、例えば、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍、又は10倍が挙げられる。
【0011】
第1に、ガレクチン-7阻害剤として、ガレクチン-7遺伝子の発現を抑制する物質が挙げられる。より具体的には、ガレクチン-7メッセンジャーRNA(mRNA: 好ましくは、NCBI Reference Sequence: NM_002307.4)に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド(核酸医薬)が挙げられる。核酸医薬は、核酸医薬として一般的な長さであればよく、相補的な配列を有する部分は10～30、15～25、18～23、あるいは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30ヌクレオチド長である。当該相補的な配列は、好ましくはガレクチン-7 mRNAに対して完全に相補的な配列であるが、10%以下又は5%以下(例えば、相補的な配列を有する部分の長さが20ヌクレオチド長の場合には、それぞれ、2か所以下又は1か所以下)のミスマッチを有しても良い。核酸医薬は、相補的な配列を有する部分に加えて、他の機能的部分(修飾基、標識、薬剤等)を有しても良い。
【0012】
第2に、ガレクチン-7阻害剤として、ガレクチン-7タンパク質(好ましくは、NCBI Reference Sequence: NP_002298.1)の機能を阻害する物質が挙げられる。より具体的には、ガレクチン-7タンパク質に結合する抗体(抗体医薬)が挙げられる。抗体医薬は、好ましくは、モノクローナル抗体であり、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体である。
【0013】
第3に、ガレクチン-7阻害剤として、腫瘍微小環境の免疫細胞上の標的へのガレクチン-7の結合を阻害する物質が挙げられる。
【0014】
癌転移抑制は、一態様において、転移性腫瘍微小環境における免疫抑制の防止である。別の一態様において、癌転移抑制は、転移性腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫細胞のアポトーシスや消耗、あるいは、制御性T細胞や骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)の動員の抑制である。別の一態様において、癌転移抑制は、転移性腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫細胞の浸潤の低下の抑制である。ここで、抗腫瘍免疫細胞はCD8+ T細胞又はCD11c+ 樹状細胞(DC)である。
【0015】
原理的に、本発明のガレクチン-7阻害剤が有効な癌は、ガレクチン-7を発現し且つ転移能の高い細胞(転移性細胞)を含む癌である。具体的には、本発明のガレクチン-7阻害剤は口腔扁平上皮癌(SCC)に対して有効である。一方で、本発明のガレクチン-7阻害剤は食道SCC、膀胱SCC、及び子宮頸部SCCに対しては有効ではない。
【実施例0016】
1.材料及び方法
【0017】
1.1. 細胞培養・腫瘍転移モデル
マウス口腔扁平上皮癌細胞株NR-S1MはDr。Matsumotoから入手した58。親NR-S1M細胞を、5% CO2の存在下において37℃で10%ウシ胎児血清を添加したRPMI-1640培地を用いて培養した。Lgals7ノックアウト(Gal‐7 KO)NR‐S1M細胞を樹立するために、Lgals7の2つのsgRNA配列(Lgals7(AB)、CCTCGGGTTAAAGTGCAAGG; Lgals7(AC)、GCGATGAGGAGCACTTCAAA)をそれぞれpLentiCRISCRv2ベクターにクローニングした。pMD2.GおよびpsPax2プラズミドと組み合わせた合成したpLentiCRISPRv2‐sgRNAをPEI MAX試薬(Polysciences)で293FT細胞に共トランスフェクトし、レンチウィルスを得た。親NR‐S1M細胞をポリブレン(10μg/ml)で2種類の精製Lgals7レンチウイルスによりスピン感染させ、次いで1週間ピューロマイシンセレクチン(5μg/ml)にさらした。5週齢の雌C3H/HeNマウスをJapan SLCから購入した。マウスにNR-S1M細胞(DPBS 100μL中に5×106細胞/マウス)を皮下接種し、腫瘍体積が毎週測定され、安楽死後に腫瘍転移が評価された。マウスは秋田大学大学院医学研究科の動物施設で飼育した。すべての動物実験は、米国国立衛生研究所が公表している実験動物の飼育と使用の手引き(NIH Publication No.85-23、1996年改訂)に準拠し、秋田大学倫理審査委員会の承認を得た。転移性NR‐S1M細胞は、接種6週後にマウスの転移LNから採取し、プールし、親株と同様に培養した。
マウス口腔扁平上皮癌細胞株NR-S1MはDr。Matsumotoから入手した58。親NR-S1M細胞を、5% CO2の存在下において37℃で10%ウシ胎児血清を添加したRPMI-1640培地を用いて培養した。Lgals7ノックアウト(Gal‐7 KO)NR‐S1M細胞を樹立するために、Lgals7の2つのsgRNA配列(Lgals7(AB)、CCTCGGGTTAAAGTGCAAGG; Lgals7(AC)、GCGATGAGGAGCACTTCAAA)をそれぞれpLentiCRISCRv2ベクターにクローニングした。pMD2.GおよびpsPax2プラズミドと組み合わせた合成したpLentiCRISPRv2‐sgRNAをPEI MAX試薬(Polysciences)で293FT細胞に共トランスフェクトし、レンチウィルスを得た。親NR‐S1M細胞をポリブレン(10μg/ml)で2種類の精製Lgals7レンチウイルスによりスピン感染させ、次いで1週間ピューロマイシンセレクチン(5μg/ml)にさらした。5週齢の雌C3H/HeNマウスをJapan SLCから購入した。マウスにNR-S1M細胞(DPBS 100μL中に5×106細胞/マウス)を皮下接種し、腫瘍体積が毎週測定され、安楽死後に腫瘍転移が評価された。マウスは秋田大学大学院医学研究科の動物施設で飼育した。すべての動物実験は、米国国立衛生研究所が公表している実験動物の飼育と使用の手引き(NIH Publication No.85-23、1996年改訂)に準拠し、秋田大学倫理審査委員会の承認を得た。転移性NR‐S1M細胞は、接種6週後にマウスの転移LNから採取し、プールし、親株と同様に培養した。
【0018】
1.2. BrdU取込分析法
親および転移性NR‐S1M細胞の2×105細胞/mlを、それぞれ24ウェルプレートに播種した。翌日、培地にBrdUを6時間添加し、BrdU Cell Proliferation ELISA Kit (ab126556、abcam)を用いて増殖細胞を定量した。
親および転移性NR‐S1M細胞の2×105細胞/mlを、それぞれ24ウェルプレートに播種した。翌日、培地にBrdUを6時間添加し、BrdU Cell Proliferation ELISA Kit (ab126556、abcam)を用いて増殖細胞を定量した。
【0019】
1.3. 細胞死の測定
親および転移性NR‐S1M細胞の2×105細胞/mlを、それぞれ24ウェルプレートに播種した。翌日、剥離した細胞を、PI染色溶液(00-6990-50、eBioscience)を含有する1×DPBSに懸濁した。細胞死の程度(PI陽性細胞の比率)をBD FACSCalibur (BD Biosciences社)で評価した。
親および転移性NR‐S1M細胞の2×105細胞/mlを、それぞれ24ウェルプレートに播種した。翌日、剥離した細胞を、PI染色溶液(00-6990-50、eBioscience)を含有する1×DPBSに懸濁した。細胞死の程度(PI陽性細胞の比率)をBD FACSCalibur (BD Biosciences社)で評価した。
【0020】
1.4. RNA-Seq解析
三つ組みで、全RNAを、親または転移性NR‐S1M細胞からDirect‐zol RNA MicroPrep (Zymo Research)を用いて精製した。BGI Japanによりライブラリ構築とハイスループット配列決定を行った。DESeq2アルゴリズムを用いて、群間で差次的に発現する遺伝子(DEG)を選択した。遺伝子セット濃縮解析はDr.Tom Data Visualization Solution (BGI Japan)で行った。
三つ組みで、全RNAを、親または転移性NR‐S1M細胞からDirect‐zol RNA MicroPrep (Zymo Research)を用いて精製した。BGI Japanによりライブラリ構築とハイスループット配列決定を行った。DESeq2アルゴリズムを用いて、群間で差次的に発現する遺伝子(DEG)を選択した。遺伝子セット濃縮解析はDr.Tom Data Visualization Solution (BGI Japan)で行った。
【0021】
1.5. フローサイトメトリー
NR‐S1M腫瘍を切除し、細かく刻み、コラゲナーゼIV (2mg/ml、C5138、Sigma)とDNase I(100μg/ml、DN25、Sigma)を含むTESCA緩衝剤中で、振とうしながら37℃で30分間消化した。細胞懸濁液を細胞ストレーナーに通し、マウスBD Fcブロック精製ラット抗マウスCD16/CD32 mAb (BD Biosciences社)と氷上で15分間プレインキュベートした。次に、APC結合抗CD45(30-F11)、PE結合抗CD45R/B220(RA3-6B2)、PerCP/Cy5.5結合抗CD3ε(145-2C11)、およびPE/Cy7結合抗Gr-1(RB6-8C5)で細胞を染色した。抗体はすべてBioLegend社から購入した。フローサイトメトリー分析をBD FACSMelody (BD Biosciences社)で行い、データをFlowJo ver.10(Tree Star社)で分析した。
NR‐S1M腫瘍を切除し、細かく刻み、コラゲナーゼIV (2mg/ml、C5138、Sigma)とDNase I(100μg/ml、DN25、Sigma)を含むTESCA緩衝剤中で、振とうしながら37℃で30分間消化した。細胞懸濁液を細胞ストレーナーに通し、マウスBD Fcブロック精製ラット抗マウスCD16/CD32 mAb (BD Biosciences社)と氷上で15分間プレインキュベートした。次に、APC結合抗CD45(30-F11)、PE結合抗CD45R/B220(RA3-6B2)、PerCP/Cy5.5結合抗CD3ε(145-2C11)、およびPE/Cy7結合抗Gr-1(RB6-8C5)で細胞を染色した。抗体はすべてBioLegend社から購入した。フローサイトメトリー分析をBD FACSMelody (BD Biosciences社)で行い、データをFlowJo ver.10(Tree Star社)で分析した。
【0022】
1.6. 免疫組織化学
ホルマリン固定パラフィン包埋NR‐S1M腫瘍組織を切片化し、次にクエン酸緩衝液(pH 6.0)抗原回復と内因性ペルオキシダーゼ消光に供した。スライドをCD8α(4SM15,1:500、eBioscience)、CD11c (#97585,1:350、Cell Signaling Technology)、及びGal-7(A18059A,1:500、BioLegend)に対する一次抗体とインキュベートし、続いてSimple StainTM MAX PO (Nichirei Biosciences)を用いて検出した。核染色はMayer's Hematoxylin Solutionを用いて行った。
ホルマリン固定パラフィン包埋NR‐S1M腫瘍組織を切片化し、次にクエン酸緩衝液(pH 6.0)抗原回復と内因性ペルオキシダーゼ消光に供した。スライドをCD8α(4SM15,1:500、eBioscience)、CD11c (#97585,1:350、Cell Signaling Technology)、及びGal-7(A18059A,1:500、BioLegend)に対する一次抗体とインキュベートし、続いてSimple StainTM MAX PO (Nichirei Biosciences)を用いて検出した。核染色はMayer's Hematoxylin Solutionを用いて行った。
【0023】
1.7. 空間的トランスクリプトーム(ST)解析(Visium)
2匹のマウスに転移性NR‐S1M細胞を接種した。接種3週後の原発腫瘍を切除した。各腫瘍を2片に切断し、これにより計4個の腫瘍組織を採取し、ST解析に供した。新鮮組織は、Tissue-Tek O.C.T. Compound (Sakura Finetek)で直ちに凍結保存し、1週間以内に処理した。凍結組織ブロックを10μmの厚さで切片化した(CM1900、Leica)。切片組織のRNAの質は、ST分析の要件(RIN >7)を満たすことが確認された。Visium用ライブラリーは、Visium Spatial Gene Expression User Guide (CG000239 Rev C、10x Genomics)に従って厳密に作成した。組織を24分間透過させ、これをVisium Spatial Tissue Optimization Slide & Reagent Kit (10x Genomics社)を用いて測定した。NovaSeq S4試薬キット(Illumina)を用いて、NovaSeq 6000システム(Illumina)上で、試料あたり約3.5億～5億読取りの深さでライブラリーの配列を決定した。生のFASTQファイルとヒストロジー画像は、Space Ranger Software (10x Genomics)を用いて処理し、次にLoupe Browser Software (10x Genomics)59上で可視化した。代表的な組織切片(#3-2)を図3及び4に、他の3つの切片を図9～14に示す。各切片のすべてのSTスポットは、非階層的クラスタリングのためにK‐Means(k = 9)およびt‐SNEアルゴリズムを介して分類した。Loupe Browser Software (10x Genomics)により決定された各々のクラスターにおける有意に上方制御された遺伝子及び下方制御された遺伝子を、Metascape (https://metascape.org)を用いた遺伝子オントロジー(GO)解析に供した。
2匹のマウスに転移性NR‐S1M細胞を接種した。接種3週後の原発腫瘍を切除した。各腫瘍を2片に切断し、これにより計4個の腫瘍組織を採取し、ST解析に供した。新鮮組織は、Tissue-Tek O.C.T. Compound (Sakura Finetek)で直ちに凍結保存し、1週間以内に処理した。凍結組織ブロックを10μmの厚さで切片化した(CM1900、Leica)。切片組織のRNAの質は、ST分析の要件(RIN >7)を満たすことが確認された。Visium用ライブラリーは、Visium Spatial Gene Expression User Guide (CG000239 Rev C、10x Genomics)に従って厳密に作成した。組織を24分間透過させ、これをVisium Spatial Tissue Optimization Slide & Reagent Kit (10x Genomics社)を用いて測定した。NovaSeq S4試薬キット(Illumina)を用いて、NovaSeq 6000システム(Illumina)上で、試料あたり約3.5億～5億読取りの深さでライブラリーの配列を決定した。生のFASTQファイルとヒストロジー画像は、Space Ranger Software (10x Genomics)を用いて処理し、次にLoupe Browser Software (10x Genomics)59上で可視化した。代表的な組織切片(#3-2)を図3及び4に、他の3つの切片を図9～14に示す。各切片のすべてのSTスポットは、非階層的クラスタリングのためにK‐Means(k = 9)およびt‐SNEアルゴリズムを介して分類した。Loupe Browser Software (10x Genomics)により決定された各々のクラスターにおける有意に上方制御された遺伝子及び下方制御された遺伝子を、Metascape (https://metascape.org)を用いた遺伝子オントロジー(GO)解析に供した。
【0024】
1.8. ウエスタンブロット法
親および転移性NR‐S1M細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル(P8340、シグマ)を添加したRIPA緩衝液(50mM Tris‐Cl、pH 7.5、150mM NaCl、1% Triton、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム)中で溶解した。細胞溶解物を超音波処理し、LDS Sample Buffer (Invitrogen)およびβ-メルカプトエタノールで変性させた。試料をNuPAGE Bis-Tris Precast Gel (Invitrogen)にロードし、NuPAGE MES SDS Running Buffer (Invitrogen)を用いて分離し、ニトロセルロース膜(Invitrogen)に移した。メンブレンを5%スキムミルクでプレインキュベートし、次に抗Gal-7(1:1000,A18059A、BioLegend)または抗GAPDH (#5174,1:2000、Cell Signaling Technology)抗体で染色した。ブロットバンドは、ChemiDoc Touch Imaging System (Bio‐Rad)を用いてECL試薬(Bio‐Rad)で可視化した。
親および転移性NR‐S1M細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル(P8340、シグマ)を添加したRIPA緩衝液(50mM Tris‐Cl、pH 7.5、150mM NaCl、1% Triton、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム)中で溶解した。細胞溶解物を超音波処理し、LDS Sample Buffer (Invitrogen)およびβ-メルカプトエタノールで変性させた。試料をNuPAGE Bis-Tris Precast Gel (Invitrogen)にロードし、NuPAGE MES SDS Running Buffer (Invitrogen)を用いて分離し、ニトロセルロース膜(Invitrogen)に移した。メンブレンを5%スキムミルクでプレインキュベートし、次に抗Gal-7(1:1000,A18059A、BioLegend)または抗GAPDH (#5174,1:2000、Cell Signaling Technology)抗体で染色した。ブロットバンドは、ChemiDoc Touch Imaging System (Bio‐Rad)を用いてECL試薬(Bio‐Rad)で可視化した。
【0025】
1.9. 定量RT-PCR
抽出した全RNAをPrimeScript RT試薬キット(RR037、タカラバイオ)を用いてcDNA合成を行った。cDNA産物は、Thermal Cycler Dice Real Time System III(タカラバイオ)上で遺伝子特異的プライマーとTB Green Premix Ex Taq II (RR820、タカラバイオ)を用いて増幅した。以下のプライマーを合成し、この研究で使用した: Lgals7 Fw, AATTCGAGGCATGGTCCCTGAC; Lgals7 Rv, GGTGTTGAAGACAACCTCGGAAG; gapdh Fw, CTGCACCACCAACTGCTTAG; gapdh Rv, GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT。
抽出した全RNAをPrimeScript RT試薬キット(RR037、タカラバイオ)を用いてcDNA合成を行った。cDNA産物は、Thermal Cycler Dice Real Time System III(タカラバイオ)上で遺伝子特異的プライマーとTB Green Premix Ex Taq II (RR820、タカラバイオ)を用いて増幅した。以下のプライマーを合成し、この研究で使用した: Lgals7 Fw, AATTCGAGGCATGGTCCCTGAC; Lgals7 Rv, GGTGTTGAAGACAACCTCGGAAG; gapdh Fw, CTGCACCACCAACTGCTTAG; gapdh Rv, GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT。
【0026】
1.10. Gal-7 ELISA
NR-S1M細胞を接種したマウスの細胞培養上清および血漿を、製造業者のプロトコルに従ってマウスガレクチン-7 DuoSet ELISA (DY1304、R&D Systems社)に供した。
NR-S1M細胞を接種したマウスの細胞培養上清および血漿を、製造業者のプロトコルに従ってマウスガレクチン-7 DuoSet ELISA (DY1304、R&D Systems社)に供した。
【0027】
1.11. 統計
2つの実験群間の統計的有意性はスチューデントの両側t検定を用いて決定した。3群以上間のパラメータの比較は一元配置分散分析、続いてDunnettの多重比較試験を行った。P<0.05を有意とした。
2つの実験群間の統計的有意性はスチューデントの両側t検定を用いて決定した。3群以上間のパラメータの比較は一元配置分散分析、続いてDunnettの多重比較試験を行った。P<0.05を有意とした。
【0028】
2. 結果
【0029】
2.2. 同系マウスSCCモデルにおけるリンパ節転移からの転移性NR‐S1M腫瘍細胞の単離
NR-S1Mマウス口腔SCC細胞をC3H/HeNマウスの皮下に移植したところ、原発腫瘍の増殖が認められ、接種6週後までに腫瘍重量は最大値に達した(図1a)。腫瘍転移は、接種4週後には一定の割合のマウスで所属リンパ節(LN)および肺に認められるようになり、その後、腫瘍移植6週後にはすべてのマウスで腫瘍結節の肉眼的病理像を示す(図1b、c)。転移性細胞を解析するために、in vitro培養において、接着した腫瘍細胞を他の非接着性LN細胞(大部分はリンパ球)から解離させることにより、接種6週後の担癌マウスのリンパ節から転移した細胞を単離した(図1d)。この過程を3回繰り返すことにより、in vitro培養で転移性NR‐S1M細胞を樹立した。In vitro転移性NR‐S1M細胞では、増殖や細胞死に親細胞からの変化は認められなかった(図1e、f)。一方、転移性NR‐S1M細胞をマウスに接種すると、転移性NR‐S1M細胞の腫瘍は親細胞よりも腫瘍の増殖と転移が速く、転移性NR‐S1M細胞は移植後3週目に転移を示したが、6週目には親細胞の転移が確認された(図1g、h)。このように、単離された転移性NR‐S1M細胞は、in vivo腫瘍微小環境において転移能が増強された細胞について濃縮される。
NR-S1Mマウス口腔SCC細胞をC3H/HeNマウスの皮下に移植したところ、原発腫瘍の増殖が認められ、接種6週後までに腫瘍重量は最大値に達した(図1a)。腫瘍転移は、接種4週後には一定の割合のマウスで所属リンパ節(LN)および肺に認められるようになり、その後、腫瘍移植6週後にはすべてのマウスで腫瘍結節の肉眼的病理像を示す(図1b、c)。転移性細胞を解析するために、in vitro培養において、接着した腫瘍細胞を他の非接着性LN細胞(大部分はリンパ球)から解離させることにより、接種6週後の担癌マウスのリンパ節から転移した細胞を単離した(図1d)。この過程を3回繰り返すことにより、in vitro培養で転移性NR‐S1M細胞を樹立した。In vitro転移性NR‐S1M細胞では、増殖や細胞死に親細胞からの変化は認められなかった(図1e、f)。一方、転移性NR‐S1M細胞をマウスに接種すると、転移性NR‐S1M細胞の腫瘍は親細胞よりも腫瘍の増殖と転移が速く、転移性NR‐S1M細胞は移植後3週目に転移を示したが、6週目には親細胞の転移が確認された(図1g、h)。このように、単離された転移性NR‐S1M細胞は、in vivo腫瘍微小環境において転移能が増強された細胞について濃縮される。
【0030】
2.3. インターフェロン活性化遺伝子(ISG)の発現は転移性NR‐S1M細胞で下方制御される
転移性NR‐S1M細胞の網羅的遺伝子発現プロファイルを調べるために、RNA‐seq解析を行った。転移性NR-S1M細胞とその親細胞との比較において、合計863の差次的発現遺伝子(DEG)が同定され、そのうち393の遺伝子が上方制御され、470の遺伝子が下方制御された(図1i)。遺伝子セット濃縮分析は、下方制御されたDEGがほとんどインターフェロン応答の観点で濃縮されたが(図1j)、上方制御されたDEGは角化についてのみ検出されたことを実証した。変化したISGs発現量の代表的遺伝子を図1kに示す。
転移性NR‐S1M細胞の網羅的遺伝子発現プロファイルを調べるために、RNA‐seq解析を行った。転移性NR-S1M細胞とその親細胞との比較において、合計863の差次的発現遺伝子(DEG)が同定され、そのうち393の遺伝子が上方制御され、470の遺伝子が下方制御された(図1i)。遺伝子セット濃縮分析は、下方制御されたDEGがほとんどインターフェロン応答の観点で濃縮されたが(図1j)、上方制御されたDEGは角化についてのみ検出されたことを実証した。変化したISGs発現量の代表的遺伝子を図1kに示す。
【0031】
2.4. NR-S1M腫瘍の限局性免疫抑制領域
腫瘍細胞におけるISG発現の調節異常は腫瘍免疫に影響することが知られているため40,41、転移性NR‐S1M腫瘍では抗腫瘍免疫がダウンモジュレートされると推論した。腫瘍組織から酵素的に解離させた細胞のうちCD3陽性(CD3+)T細胞数をフローサイトメトリーで測定したところ、移植3週後の転移性NR-S1M細胞の腫瘍では、同じ時点の親細胞由来腫瘍に比べてCD3+ T細胞の割合が有意に減少していた(図2a)。対照的に、転移性細胞由来の腫瘍におけるB220+ B細胞の比率は変わらなかった(図2a)。さらに、Gr-1+細胞は転移性細胞の腫瘍の中へとより侵襲的に浸潤し、抗腫瘍免疫反応を抑制する未成熟骨髄好中球および単球のサブタイプであるMDSCの潜在的増加を意味することがわかった42(図7)。次にNR‐S1M腫瘍の組織切片における抗腫瘍免疫細胞の分布を調べた。移植4週後の転移性細胞の腫瘍の免疫組織化学では、CD8+ T細胞は腫瘍内に均等に分布するのではなく、むしろ不均一に局在している。腫瘍組織の一部の領域ではCD8+ T細胞が濃縮されている(青枠)が、他の領域ではまばらなCD8+ T細胞が認められる(赤枠)(図2b)。これと一貫して、CD11c+ DCもNR-S1M腫瘍に不均一に浸潤しており(図2c)、腫瘍免疫の不均一性が示された。興味深いことに、移植後6週目に親NR-S1M細胞の腫瘍が最大サイズに達し、転移を示した際に、親細胞由来腫瘍もCD8+ T細胞とCD11c+ DCの不均一な分布を示し(図2d、e)、悪性NR-S1M腫瘍では限局性の免疫抑制領域が発達していることが示唆された。
腫瘍細胞におけるISG発現の調節異常は腫瘍免疫に影響することが知られているため40,41、転移性NR‐S1M腫瘍では抗腫瘍免疫がダウンモジュレートされると推論した。腫瘍組織から酵素的に解離させた細胞のうちCD3陽性(CD3+)T細胞数をフローサイトメトリーで測定したところ、移植3週後の転移性NR-S1M細胞の腫瘍では、同じ時点の親細胞由来腫瘍に比べてCD3+ T細胞の割合が有意に減少していた(図2a)。対照的に、転移性細胞由来の腫瘍におけるB220+ B細胞の比率は変わらなかった(図2a)。さらに、Gr-1+細胞は転移性細胞の腫瘍の中へとより侵襲的に浸潤し、抗腫瘍免疫反応を抑制する未成熟骨髄好中球および単球のサブタイプであるMDSCの潜在的増加を意味することがわかった42(図7)。次にNR‐S1M腫瘍の組織切片における抗腫瘍免疫細胞の分布を調べた。移植4週後の転移性細胞の腫瘍の免疫組織化学では、CD8+ T細胞は腫瘍内に均等に分布するのではなく、むしろ不均一に局在している。腫瘍組織の一部の領域ではCD8+ T細胞が濃縮されている(青枠)が、他の領域ではまばらなCD8+ T細胞が認められる(赤枠)(図2b)。これと一貫して、CD11c+ DCもNR-S1M腫瘍に不均一に浸潤しており(図2c)、腫瘍免疫の不均一性が示された。興味深いことに、移植後6週目に親NR-S1M細胞の腫瘍が最大サイズに達し、転移を示した際に、親細胞由来腫瘍もCD8+ T細胞とCD11c+ DCの不均一な分布を示し(図2d、e)、悪性NR-S1M腫瘍では限局性の免疫抑制領域が発達していることが示唆された。
【0032】
2.5. NR-S1M腫瘍の空間的トランスクリプトーム解析
NR‐S1M腫瘍の不均一性領域における空間的遺伝子発現を調べるために、空間的トランスクリプトーム(ST)解析(Visium)を行った。接種3週後に転移性NR-S1M細胞の原発腫瘍4個について、切片あたり2200～3700個のバーコード化されたSTスポット(直径55μm)の遺伝子発現プロファイルが取得され、K-Means(k = 9)およびt-SNEアルゴリズム解析(図3a)により偏りのないクラスタリングが行われた。その結果、STスポットは遺伝子発現パターンから主に6クラスターに分類され、NR-S1M腫瘍における遺伝子発現の不均一性が示された(図3a、b)。各クラスターについて、有意に上方制御された遺伝子および下方制御された遺伝子を遺伝子オントロジー(GO)解析に供した(図8)。#3-2の切片では、上方制御された遺伝子のGO用語と下方制御された遺伝子のGO用語が、それぞれ、クラスター1、3-6並びにクラスター1、3および4で確認された(図3c、d)。重要なことに、抗原提示およびインターフェロン応答の遺伝子発現は、切片全体の他の領域と比較してクラスター4で顕著に下方制御されたが(図3d)、インターフェロン応答関連遺伝子はクラスター6で有意に上方制御された(図3c)。したがって、クラスター4および6はそれぞれ免疫抑制領域および免疫適格領域として遺伝的にマップされると解釈した。これと一貫して、著者らは、腫瘍の他の3つの切片において、免疫抑制領域および免疫適格領域に対応する同様の一対のクラスターを検出した(図9、10および11)。腫瘍の4切片のCd8aまたはItgax (Cd11c)陽性斑点を調べたところ、免疫適格領域と比較して免疫抑制領域ではCd8a+斑点とCd11c+斑点の両方が有意に減少しており(図4a、b)、免疫抑制領域における抗腫瘍免疫細胞の浸潤の低下が示された。#3-2の切片で免疫適格領域と免疫抑制領域との間でGO解析を行ったところ、免疫抑制はアポトーシス、低酸素応答、血管新生の上方制御と有意に関連していることが確認された(図4c)。他の3つの切片の免疫抑制領域でも同じ遺伝子セットが同定された(図12、13および14)。重要なことに、Vegfa、VimおよびMapk6などの転移に関連する遺伝子43-48は、免疫適格領域と比較して免疫抑制領域で有意に上方制御されていた(図4d)。これらの結果から、転移には免疫抑制領域が重要であることが示唆された。
NR‐S1M腫瘍の不均一性領域における空間的遺伝子発現を調べるために、空間的トランスクリプトーム(ST)解析(Visium)を行った。接種3週後に転移性NR-S1M細胞の原発腫瘍4個について、切片あたり2200～3700個のバーコード化されたSTスポット(直径55μm)の遺伝子発現プロファイルが取得され、K-Means(k = 9)およびt-SNEアルゴリズム解析(図3a)により偏りのないクラスタリングが行われた。その結果、STスポットは遺伝子発現パターンから主に6クラスターに分類され、NR-S1M腫瘍における遺伝子発現の不均一性が示された(図3a、b)。各クラスターについて、有意に上方制御された遺伝子および下方制御された遺伝子を遺伝子オントロジー(GO)解析に供した(図8)。#3-2の切片では、上方制御された遺伝子のGO用語と下方制御された遺伝子のGO用語が、それぞれ、クラスター1、3-6並びにクラスター1、3および4で確認された(図3c、d)。重要なことに、抗原提示およびインターフェロン応答の遺伝子発現は、切片全体の他の領域と比較してクラスター4で顕著に下方制御されたが(図3d)、インターフェロン応答関連遺伝子はクラスター6で有意に上方制御された(図3c)。したがって、クラスター4および6はそれぞれ免疫抑制領域および免疫適格領域として遺伝的にマップされると解釈した。これと一貫して、著者らは、腫瘍の他の3つの切片において、免疫抑制領域および免疫適格領域に対応する同様の一対のクラスターを検出した(図9、10および11)。腫瘍の4切片のCd8aまたはItgax (Cd11c)陽性斑点を調べたところ、免疫適格領域と比較して免疫抑制領域ではCd8a+斑点とCd11c+斑点の両方が有意に減少しており(図4a、b)、免疫抑制領域における抗腫瘍免疫細胞の浸潤の低下が示された。#3-2の切片で免疫適格領域と免疫抑制領域との間でGO解析を行ったところ、免疫抑制はアポトーシス、低酸素応答、血管新生の上方制御と有意に関連していることが確認された(図4c)。他の3つの切片の免疫抑制領域でも同じ遺伝子セットが同定された(図12、13および14)。重要なことに、Vegfa、VimおよびMapk6などの転移に関連する遺伝子43-48は、免疫適格領域と比較して免疫抑制領域で有意に上方制御されていた(図4d)。これらの結果から、転移には免疫抑制領域が重要であることが示唆された。
【0033】
2.6 ガレクチン-7は、腫瘍の免疫抑制領域で上方制御される潜在的な転移促進因子である。
NR‐S1M腫瘍の免疫抑制領域における重要な転移促進遺伝子を探索するために、NR‐S1M腫瘍の免疫抑制領域のDEGをin vitro培養転移性NR‐S1M細胞と比較した。下方制御されたコンパートメントについては、両DEGで21個の遺伝子が共通して下方制御され、そのほとんどがISGであった(図5a)。
NR‐S1M腫瘍の免疫抑制領域における重要な転移促進遺伝子を探索するために、NR‐S1M腫瘍の免疫抑制領域のDEGをin vitro培養転移性NR‐S1M細胞と比較した。下方制御されたコンパートメントについては、両DEGで21個の遺伝子が共通して下方制御され、そのほとんどがISGであった(図5a)。
【0034】
一方、Lgals7とKrt16の2つの遺伝子のみが両方のDEGで共通に上方制御されていた(図5b)。Keratin-16をコードするKrt16がOSCCの浸潤および転移を促進することが以前に報告されていることから49、我々はガレクチン-7をコードしSCCにおける役割については依然として解明されていないLgals7に焦点を当てた26,27。Lgals7はin vivoの免疫抑制腫瘍領域とin vitroの転移性NR-S1M細胞の両方で高発現していた(図5c、d)。ウエスタンブロット解析の結果、ガレクチン-7はin vitroで転移性NR-S1M細胞に発現していることが確認された(図5e)。ガレクチン-7の発現は親NR-S1M細胞には認められなかったが(図5c、e)、免疫組織化学的解析の結果、ガレクチン-7の発現は親NR-S1M細胞由来の生体内腫瘍、特にCD8+ T細胞に乏しい領域で誘導されることが明らかとなった(図5f)。また、転移性NR‐S1M細胞をIFN-γではなくTNF-αで処理すると、Lgals7の発現が有意に抑制されることがわかり(図5g)、ガレクチン-7の発現は炎症誘発性/免疫シグナル伝達によって負に調節されることが示唆された。さらに、in vitroで転移性NR-S1M細胞の細胞培養上清中にガレクチン-7は検出されなかったが(図5c、h)、NR-S1M担癌マウスでは腫瘍接種後5～6週目に血漿中ガレクチン-7レベルが有意に上方制御された(図5h)。このように、ガレクチン-7の発現は免疫抑制という微小環境下で誘導・強化され、腫瘍発生の後期段階においてin vivoで腫瘍細胞から細胞外に放出される。
【0035】
2.7. NR‐S1M細胞におけるガレクチン-7の除去は転移を抑制する
ガレクチン-7が腫瘍転移に関与するかどうかを検討するために、CRISPR‐Cas9システムを用いることによりLgals7ノックアウト(Gal‐7 KO)NR‐S1M細胞を作製した。免疫組織化学的検査では、Gal-7 KO細胞(示していない)の腫瘍ではガレクチン-7の誘導は確認されず、Gal-7 KO腫瘍を有するマウスでは血漿中ガレクチン-7レベルが大幅に低下していた(図6a)。原発腫瘍の増殖速度は変わらなかったが(図6b、c)、対照細胞を接種したマウスと比較してGal-7 KO細胞を接種したマウスでは、LN転移陽性マウスの数が有意に減少していた(図6d)。さらに、ガレクチン-7を枯渇させたNR-S1M細胞を移植したマウスでは、対照細胞を移植したマウスと比較して、肺の転移結節が顕著に減少しており(図6e、f)、Gal-7 KO細胞を移植したマウスでは一貫して肺重量も減少しており、腫瘍量の減少が示された(図6g)。このように、NR‐S1M細胞におけるガレクチン-7の枯渇はリンパ節および肺への転移を軽減する。
ガレクチン-7が腫瘍転移に関与するかどうかを検討するために、CRISPR‐Cas9システムを用いることによりLgals7ノックアウト(Gal‐7 KO)NR‐S1M細胞を作製した。免疫組織化学的検査では、Gal-7 KO細胞(示していない)の腫瘍ではガレクチン-7の誘導は確認されず、Gal-7 KO腫瘍を有するマウスでは血漿中ガレクチン-7レベルが大幅に低下していた(図6a)。原発腫瘍の増殖速度は変わらなかったが(図6b、c)、対照細胞を接種したマウスと比較してGal-7 KO細胞を接種したマウスでは、LN転移陽性マウスの数が有意に減少していた(図6d)。さらに、ガレクチン-7を枯渇させたNR-S1M細胞を移植したマウスでは、対照細胞を移植したマウスと比較して、肺の転移結節が顕著に減少しており(図6e、f)、Gal-7 KO細胞を移植したマウスでは一貫して肺重量も減少しており、腫瘍量の減少が示された(図6g)。このように、NR‐S1M細胞におけるガレクチン-7の枯渇はリンパ節および肺への転移を軽減する。
【0036】
3. 考察
【0037】
転移性細胞のRNA‐seqとin vivo腫瘍の空間的トランスクリプトミクスとの著者らの組み合わせ解析は、転移のメディエータとしてガレクチン-7を同定した。ガレクチン-7は免疫抑制の腫瘍微小環境において高度に誘導される。ガレクチン-7の欠失は、原発腫瘍の増殖に影響することなく、リンパ節および肺転移を特異的に抑制した。このように、ガレクチン-7は腫瘍転移の促進に特異的な役割を果たす。
【0038】
インビトロでの転移性NR‐S1M細胞は親細胞と比較して遺伝子発現の全体的な交代とISGの下方制御を示し、これは特異的な腫瘍微小環境によりインプリントされた遺伝的特性を示している可能性がある50。実際、腫瘍細胞固有のIFNシグナル伝達の下方制御40,41および腫瘍における抗腫瘍免疫細胞集団の劇的な減少12は、癌転移にとって極めて重要であることが示されている。我々のST解析は、悪性NR‐S1M腫瘍は非常に不均一であり、その中で同定された免疫抑制部位は転移性腫瘍細胞を増殖、維持するためのニッチ13,51である可能性を示した。転移性細胞のクローン選択に関する初期の研究は、転移性細胞におけるゲノムの不安定性を示唆していた52,53。免疫抑制領域における腫瘍細胞の遺伝的およびエピジェネティックな選択は、転移性細胞の選択およびその後の遠隔臓器における転移性結節の形成の原因となる可能性がある。正確な機構を解明するためには、単一細胞配列決定および/または単一細胞ATAC配列決定によるさらなる分析が必要であろう。
【0039】
in vitroでの転移性NR-S1M細胞におけるIFNならびにTNF-αに対する細胞応答の下方制御(図1j)は、炎症/免疫シグナル伝達がガレクチン-7発現の調節に関与しているかどうかを検討することを促した。重要なことに、TNF‐αによる処理はin vitroで転移性細胞におけるガレクチン-7発現を劇的に阻害し、ガレクチン-7はNR‐S1M腫瘍の免疫抑制領域で高度に発現した。このように、炎症/免疫シグナル伝達が損なわれた微小環境は、腫瘍進行中の腫瘍細胞におけるガレクチン-7の発現を強化するようである。一方、NR‐S1M腫瘍の免疫抑制領域は、アポトーシスと低酸素応答の遺伝子セットに富んでいる。ガレクチン-7発現はp53活性化により誘導される24ので、低酸素腫瘍微小環境は腫瘍細胞においてp53を活性化し、それによりガレクチン-7発現の誘発を導き、続いて細胞から放出される可能性がある。以前の研究では、核ガレクチン-7がMMP9発現を上方制御し、HNSCCの転移を誘発することを示した38。それにもかかわらず、HNSCC患者の血中に細胞外ガレクチン-7は検出されなかった。転移が血漿ガレクチン-7レベルの上昇と相関しているというエビデンスが今回の試験から得られたことから、細胞外ガレクチン-7が特異的な転移促進因子として機能している可能性が高い。組換えガレクチン-7は、試験管内でヒトJurkat T細胞のアポトーシスを誘導することが報告されているが55,56、これらの試験は非生理的に高濃度のガレクチン-7を用いて実施された。実際、ガレクチン-7による処置は、マウス脾臓DCにおけるISGの発現に影響を及ぼさないことが観察された(データは示さず)。このように、細胞外ガレクチン-7の転移特異的作用は非免疫細胞を介して発揮される可能性があり、さらなる解析が必要である。
【0040】
ガレクチン-7の発現は癌の不均一性と関連しており、転移形成を促進するが原発腫瘍の増殖は促進しない。詳細な機序はさらなる解析を待つが、その転移特異的作用は独特である。例えば、食道SCC患者の治療では、術前化学療法または放射線療法とそれに続く食道の治癒的切除が現在の標準治療法であるが、患者の特定の集団はリンパ節転移の再発に苦しんでいる57。ガレクチン-7発現の誘導は、著者らの腫瘍モデルにおける細胞アポトーシスならびに免疫抑制と関連するため、術前処置はガレクチン-7発現および分泌を誘導し、それによりSCC患者における腫瘍転移を逆に促進する可能性がある。
【産業上の利用可能性】
【0041】
したがって、ガレクチン-7および免疫抑制に関連する他の転移促進因子は、癌免疫療法の開発の潜在的標的である可能性がある。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】