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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024039728
(43)【公開日】2024-03-25
(54)【発明の名称】抗腫瘍免疫応答増強剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/685 20060101AFI20240315BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240315BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240315BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240315BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240315BHJP
C12N 5/0784 20100101ALI20240315BHJP
A61K 39/39 20060101ALN20240315BHJP
【ＦＩ】
A61K31/685
A61P35/00
A61P37/04
A61P43/00 105
A61K45/00
A61P43/00 121
C12N5/0784
A61K39/39
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022144313
(22)【出願日】2022-09-12
(71)【出願人】
【識別番号】501190125
【氏名又は名称】蓮見 賢一郎
(71)【出願人】
【識別番号】510136312
【氏名又は名称】国立研究開発法人国立成育医療研究センター
(74)【代理人】
【識別番号】100107984
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
(74)【代理人】
【識別番号】100182305
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 鉄平
(74)【代理人】
【識別番号】100096482
【弁理士】
【氏名又は名称】東海 裕作
(74)【代理人】
【識別番号】100131093
【弁理士】
【氏名又は名称】堀内 真
(74)【代理人】
【識別番号】100150902
【弁理士】
【氏名又は名称】山内 正子
(74)【代理人】
【識別番号】100141391
【弁理士】
【氏名又は名称】園元 修一
(74)【代理人】
【識別番号】100221958
【弁理士】
【氏名又は名称】篠田 真希恵
(74)【代理人】
【識別番号】100192441
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 仁
(72)【発明者】
【氏名】蓮見 賢一郎
(72)【発明者】
【氏名】梨井 康
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AC20
4B065BA25
4B065BB10
4B065BB11
4B065CA44
4C084AA19
4C084NA05
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC751
4C085AA38
4C085FF12
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C086AA01
4C086AA02
4C086DA41
4C086MA03
4C086MA04
4C086MA55
4C086MA66
4C086NA05
4C086ZB09
4C086ZB21
4C086ZB26
4C086ZC75
(57)【要約】
【課題】腫瘍微小環境におけるＴＡＤＣの抗腫瘍活性を維持・増強する手段を提供すること。
【解決手段】３種類のリン脂質を含む組成物「ｃＰＬｓアジュバント」を投与すると、マウスに移植された腫瘍の成長の程度を顕著に抑制することを見いだし、また、未熟な樹状細胞をｃＰＬｓアジュバント存在下インビトロで培養すると、成熟した骨髄樹状細胞となり、サイトカインの産生を誘導することを確認した。
【選択図】なし
【解決手段】３種類のリン脂質を含む組成物「ｃＰＬｓアジュバント」を投与すると、マウスに移植された腫瘍の成長の程度を顕著に抑制することを見いだし、また、未熟な樹状細胞をｃＰＬｓアジュバント存在下インビトロで培養すると、成熟した骨髄樹状細胞となり、サイトカインの産生を誘導することを確認した。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジルセリンを含む抗腫瘍免疫応答増強剤。
【請求項2】
対象における腫瘍の成長抑制用に用いるための、請求項１記載の抗腫瘍免疫応答増強剤。
【請求項3】
未熟樹状細胞を成熟樹状細胞とするために用いるための、請求項１記載の抗腫瘍免疫応答増強剤。
【請求項4】
未熟樹状細胞を、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋生細胞とするために用いるための、請求項３記載の抗腫瘍免疫応答増強剤。
【請求項5】
未熟樹状細胞が、未熟標準型樹状細胞又は腫瘍関連樹状細胞であることを特徴とする、請求項４記載の抗腫瘍免疫応答増強剤。
【請求項6】
ホスファチジルコリンが５０～９０％、ホスファチジルエタノールアミンが５～２５％、及びホスファチジルセリンが５～２５％配合されていることを特徴とする、請求項１又は２記載の抗腫瘍免疫応答増強剤。
【請求項7】
１又は２以上の抗がん剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１又は２記載の抗腫瘍免疫応答増強剤。
【請求項8】
請求項１又は２記載の抗腫瘍免疫応答増強剤の存在下において、未熟樹状細胞をインビトロで培養することにより、成熟樹状細胞を調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗腫瘍免疫応答増強剤に関し、より詳細には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジルセリンを含む抗腫瘍免疫応答増強剤に関する。
【背景技術】
【0002】
樹状細胞(dendritic cells:ＤＣ）は、ナイーブＴ細胞及びメモリーＴ細胞の両方をプライミングでき、抗原特異的な抗腫瘍免疫を誘導する最も強力な抗原提示細胞として知られている（例えば、非特許文献１等参照）。しかし、腫瘍微小環境におけるＤＣ、すなわち腫瘍関連樹状細胞（以下、「tumor associated dendritic cellｓ：（ＴＡＤＣ）」ともいう）は、共刺激分子の発現が低く、未熟な表現型を示すこと（例えば、非特許文献２等参照）や、抑制的で機能不全な表現型を示し、宿主の免疫監視網からガン細胞を逃避させることに寄与する場合（例えば、非特許文献３等参照）があるなど、免疫抑制や免疫寛容化を起こす場合があることが知られている。さらに、ＴＡＤＣは、抗腫瘍タイプのＴ細胞の活性化を抑制し、腫瘍細胞の増殖を促進する様々な種類のサイトカインを分泌するという報告がある（例えば、非特許文献４等参照）。したがって、腫瘍微小環境において、ＤＣは抗腫瘍反応にプラスにもマイナスにも作用する諸刃の剣となりうることが知られており（例えば、非特許文献５等参照）、従来のがん免疫療法では、抗腫瘍活性が低減してしまう場合があるとされている。
【0003】
一方、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の活性化を必要とする対象に、共生微生物叢の培地での発酵を介して生成される発酵組成物を投与することを含む、ＴＩＬを活性化させる方法（例えば、特許文献１等参照）が提案されている。また、少なくとも１つのカチオン性脂質と少なくとも１つの抗原とを有する１つ以上の脂質を含むエクスビボでの樹状細胞活性化のための組成物（例えば、特許文献２等参照）や、腫瘍患者における異常な骨髄由来免疫抑制細胞の活性低下、骨髄由来免疫抑制細胞の分化誘導、腫瘍の増殖及び再発の抑制を可能とすることを特徴とするオールトランスレチノイン酸注射剤の使用等（例えば、特許文献３等参照）が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２０２１－５１７５８７号公報
【特許文献2】特開２０２２－３６９６１号公報
【特許文献3】特表２０１９－５２８３１５号公報
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Steinman RM, Banchereau J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 2007;449(7161):419-26
【非特許文献2】Oncotarget. 2016;7(39):63204-14
【非特許文献3】J Cancer. 2013;4(1):36-44
【非特許文献4】J Leukoc Biol. 2017;102(2):317-324
【非特許文献5】Frontiers in Oncology 2013 Volume 3 Article 90：1-12
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の課題は、腫瘍微小環境におけるＴＡＤＣの抗腫瘍活性を維持・増強する手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、マウスの腫瘍における微小環境に着目し、未成熟なＤＣであるとされているＴＡＤＣの抗腫瘍活性を維持・増強するため、様々な成分について検討を続けてきたが、マウスに移植した腫瘍が所定の大きさになった後に、ホスファチジルコリン（phosphatidylcholine：ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（phosphatidylethanolamine：ＰＥ）、ホスファチジルセリン（phosphatidylserine：ＰＳ）の３種類のリン脂質を含む組成物(Combined PhosphoLipids adjuvant：cPLs adjuvant）（以下、「ｃＰＬｓアジュバント」ともいう)を投与すると、マウスに移植された腫瘍の成長の程度を顕著に抑制することを見いだした。また、未熟なＤＣをｃＰＬｓアジュバント存在下インビトロで培養すると、かかる培養されたＤＣが成熟した骨髄樹状細胞（bone marrow-derived dendritic cells：ＢＭＤＣｓ）となり、炎症性サイトカインの産生を誘導することを確認した。さらに、ｃＰＬｓアジュバントを投与したがん細胞移植マウスより腫瘍組織を摘出し、腫瘍組織中の腫瘍浸潤白血球の形質について解析したところ、成熟したＤＣが発現するマーカーが発現し、Ｔ細胞の産生が促進されると共に、炎症性サイトカインの産生が促進されることを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【0008】
本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤を投与することにより、腫瘍の成長の程度を抑制することや、未熟な骨髄由来の樹状細胞やＴＡＤＣを成熟させることができ、また、未熟な樹状細胞を抗腫瘍免疫応答増強剤の存在下で培養することによりインビトロで成熟させることができる。
【0009】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジルセリンを含む抗腫瘍免疫応答増強剤。
［２］対象における腫瘍の成長抑制用に用いるための、上記［１］記載の抗腫瘍免疫応答増強剤。
［３］未熟樹状細胞を成熟樹状細胞とするために用いるための、上記［１］記載の抗腫瘍免疫応答増強剤。
［４］未熟樹状細胞を、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋生細胞とするために用いるための、上記［３］記載の抗腫瘍免疫応答増強剤。
［５］未熟樹状細胞が、未熟標準型樹状細胞又は腫瘍関連樹状細胞であることを特徴とする、上記［４］記載の抗腫瘍免疫応答増強剤。
［６］ホスファチジルコリンが５０～９０％、ホスファチジルエタノールアミンが５～２５％、及びホスファチジルセリンが５～２５％配合されていることを特徴とする、上記［１］又は［２］記載の抗腫瘍免疫応答増強剤。
［７］１又は２以上の抗がん剤をさらに含むことを特徴とする、上記［１］又は［２］記載の抗腫瘍免疫応答増強剤。
［８］上記［１］又は［２］記載の抗腫瘍免疫応答増強剤の存在下において、未熟樹状細胞をインビトロで培養することにより、成熟樹状細胞を調製する方法。
［１］ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジルセリンを含む抗腫瘍免疫応答増強剤。
［２］対象における腫瘍の成長抑制用に用いるための、上記［１］記載の抗腫瘍免疫応答増強剤。
［３］未熟樹状細胞を成熟樹状細胞とするために用いるための、上記［１］記載の抗腫瘍免疫応答増強剤。
［４］未熟樹状細胞を、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋生細胞とするために用いるための、上記［３］記載の抗腫瘍免疫応答増強剤。
［５］未熟樹状細胞が、未熟標準型樹状細胞又は腫瘍関連樹状細胞であることを特徴とする、上記［４］記載の抗腫瘍免疫応答増強剤。
［６］ホスファチジルコリンが５０～９０％、ホスファチジルエタノールアミンが５～２５％、及びホスファチジルセリンが５～２５％配合されていることを特徴とする、上記［１］又は［２］記載の抗腫瘍免疫応答増強剤。
［７］１又は２以上の抗がん剤をさらに含むことを特徴とする、上記［１］又は［２］記載の抗腫瘍免疫応答増強剤。
［８］上記［１］又は［２］記載の抗腫瘍免疫応答増強剤の存在下において、未熟樹状細胞をインビトロで培養することにより、成熟樹状細胞を調製する方法。
【0010】
また、本発明は、抗腫瘍免疫応答増強療法における使用のためのホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンを含む剤；ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンを含むサイトカイン産生促進剤；抗腫瘍免疫応答を増強するために使用されるホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジルセリンの組合せ；ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンを含む抗腫瘍免疫応答増強剤を、対象に投与することを含む、対象における抗腫瘍免疫応答を増強する方法；ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジルセリンを、抗腫瘍免疫応答を増強することを必要とする対象に投与する工程を含む、抗腫瘍免疫応答を増強する方法；腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答の増強を必要とする対象に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンを含む抗腫瘍免疫応答増強剤を投与する工程を含む、対象における腫瘍関連樹状細胞を活性化する方法や、対象における腫瘍の微小環境の免疫抑制性を低下させて臨床的有用性を増進させる剤を投与する方法や、抗腫瘍免疫応答増強剤により活性化された成熟樹状細胞や、抗腫瘍免疫応答増強剤により活性化された腫瘍関連樹状細胞や、抗腫瘍免疫応答増強剤により活性化された成熟樹状細胞を使用するがん免疫療法や、抗腫瘍免疫応答増強剤により活性化された腫瘍関連樹状細胞を使用するがん免疫療法を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】（ａ）は、ＭＯ４－Ｌｕｃ細胞の移植後に、４ｍｇ／ｋｇマウス体重又は１２ｍｇ／ｋｇマウス体重のｃＰＬｓアジュバントを脇腹に皮下注射したマウスと、ｃＰＬｓアジュバントを投与しないコントロールマウスのそれぞれにおける、移植後１６日経過時までの腫瘍の体積の推移を示すグラフである。横軸はマウス移植後の経過日数、縦軸はＭＯ４－Ｌｕｃ細胞移植マウスにおける腫瘍体積を示す。（ｂ）は、ｃＰＬｓアジュバントを４ｍｇ／ｋｇマウス体重又は１２ｍｇ／ｋｇマウス体重を皮下注射したマウスと、ｃＰＬｓアジュバントを投与しないコントロールマウスのそれぞれにおける移植後１６日目の腫瘍体積のヒストグラムである。（ｃ）は、Ｃ２６細胞の移植後に、１２ｍｇ／ｋｇマウス体重のｃＰＬｓアジュバントを脇腹に皮下注射したマウスと、ｃＰＬｓアジュバントを投与しないコントロールマウスのそれぞれにおける、移植後１６日経過時までの腫瘍の体積の推移を示すグラフである。（ｄ）は、ｃＰＬｓアジュバントを１２ｍｇ／ｋｇマウス体重を投与したマウスと、ｃＰＬｓアジュバントを投与しないコントロールマウスのそれぞれにおける移植後１６日目の腫瘍体積のヒストグラムである。（ｅ）は、ＭＯ４－Ｌｕｃ細胞移植マウスにｃＰＬｓアジュバント、ＰＣ、ＰＥ、及びＰＳがそれぞれ投与された場合の、移植後１６日経過時までの腫瘍の体積の推移を示すグラフである。
【図2】マウス標準型未熟な骨髄樹状細胞をｃＰＬｓアジュバント存在下で培養した後のフローサイトメトリー解析を示す。
【図3】マウス標準型未熟な骨髄樹状細胞をｃＰＬｓアジュバント存在下で培養した後の細胞の表面マーカーについて（ａ）ＩＡ／ＩＥ、（ｂ）ＣＤ８０、及び（ｃ）ＣＤ４０の発現を、それぞれ平均蛍光強度（mean fluorescence intensity：ＭＦＩ）のデルタ（Δ）値で表わしたグラフである。
【図4】ｃＰＬｓアジュバントの存在下で２日間培養されたｉｍＤＣについて（ａ）ＩＬ－１β、（ｂ）ＩＬ－１２、及び（ｃ）ＩＬ－６の発現をＭＦＩのデルタ値で表わしたグラフをそれぞれ示す。
【図5】（ａ）、（ｂ）ともｃＰＬｓアジュバント処理群のＴＩＬのフローサイトメトリー解析を示す。
【図6】ｃＰＬｓアジュバント処理群のＴＩＬｓについて（ａ）ＣＤ８６、及び（ｂ）ＩＡ／ＩＥの発現をＭＦＩのデルタ値で表わしたグラフをそれぞれ示す。
【図7】ｃＰＬｓアジュバント処理群のＴＩＬｓについて（ａ）ＩＬ－１β、（ｂ）ＩＬ－１２、及び（ｃ）ＩＦＮ－γの発現をＭＦＩのデルタ値で表わしたグラフである。
【図8】ＴＩＬｓに含まれるＣＤ４＋Ｔ細胞における（ａ）ＩＦＮ－γ、（ｃ）ＴＮＦ－α、及び（ｅ）ＩＬ－２の産生、並びにＣＤ８＋Ｔ細胞における（ｂ）ＩＦＮ－γ、（ｄ）ＴＮＦ－α、及び（ｆ）ＩＬ－２の産生をＭＦＩのデルタ値で表わしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤としては、ホスファチジルコリン（phosphatidylcholine：ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（phosphatidylethanolamine：ＰＥ）、及びホスファチジルセリン（phosphatidylserine：ＰＳ）を含む抗腫瘍免疫応答を増強することができる剤であれば特に限定されず、ＰＣ、ＰＥ、及びＰＳ以外のリン脂質を含まない剤や、ＰＣ、ＰＥ、及びＰＳ以外のリン脂質を必須成分として含まない剤を例示することができる。上記抗腫瘍免疫応答増強剤の投与対象としては、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、ヒト等の哺乳類を挙げることができる。
【0013】
本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤の作製方法としては、ＰＣ、ＰＥ、及びＰＳを順次、又は混合物として、溶媒に溶解・混合して抗腫瘍免疫応答増強剤を作製する方法を例示することができ、上記溶媒としては、本発明の効果を奏することができ、対象に対して侵襲的でない溶媒を挙げることができるが、エタノールを好適に挙げることができる。溶液の濃度としては、ＰＣ、ＰＥ、及びＰＳが０．５～２ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．８～１．５ｍｇ／ｍＬを挙げることができ、かかる溶液に含まれるＰＣ、ＰＥ、及びＰＳの配合割合としては、ＰＣが５０～９０％、ＰＥが５～２５％、ＰＳが５～２５％を挙げることができ、ＰＣが６０～８０％、ＰＥが１０～２０％、ＰＳが１０～２０％が好ましく、ＰＣが６５～７５％、ＰＥが１２．５～１７．５％、ＰＳが１２．５～１７．５％がより好ましい。
【0014】
上記ＰＣとしては、大豆由来ＰＣ、卵黄ＰＣ等の天然由来のＰＣや、炭素数７～２２の飽和又は不飽和カルボン酸を含む合成ＰＣを挙げることができる。合成ＰＣとして具体的には、ジラウロイルＰＣ、ジミリストイルＰＣ、ジオレオイルＰＣ、ジパルミトイルＰＣ、パルミトオレオイルＰＣ、ジステアロイルＰＣ等を挙げることができる。また、グリセリンの１位及び２位に結合する脂肪酸残基部分は、同一でも異なっていてもよい。
【0015】
上記ＰＥとしては、大豆由来ＰＥ、大豆由来水添ＰＥ等の天然由来のＰＥや、炭素数７～２２の飽和又は不飽和カルボン酸を含むＰＥ等の合成ＰＥを挙げることができる。具体的には、ジラウロイルＰＥ、ジミリストイルＰＥ、ジパルミトイルＰＥ、ジオレオイルＰＥ、パルミトオレオイルＰＥ、ジステアロイルＰＥ等を挙げることができる。また、グリセリンの１位及び２位に結合する脂肪酸残基部分は、同一でも異なっていてもよい。
【0016】
上記ＰＳとしては、大豆由来ＰＳ、大豆由来水添ＰＳ等の天然由来のＰＳや、炭素数７～２２の飽和又は不飽和カルボン酸を含むホＰＳ等の合成ＰＳを挙げることができる。具体的には、ジラウロイルＰＳ、ジミリストイルＰＳ、ジパルミトイルＰＳ、ジオレオイルＰＳ、パルミトオレオイルＰＳ、ジステアロイルＰＳ等を挙げることができる。また、グリセリンの１位及び２位に結合する脂肪酸残基部分は、同一でも異なっていてもよい。
【0017】
本発明における腫瘍としては、本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤を投与することにより、成長が抑制される腫瘍であれば特に制限されないが、悪性腫瘍が好ましく、悪性腫瘍としては、造血細胞悪性腫瘍、頭頚部がん、脳腫瘍、乳がん、子宮体がん、子宮頚がん、卵巣がん、食道がん、胃がん、虫垂がん、大腸がん、肝がん、胆嚢がん、胆管がん、膵がん、腎がん、副腎がん、消化管間質腫瘍、中皮腫、甲状腺がん、肺がん、骨肉腫、骨がん、前立腺がん、精巣腫瘍、膀胱がん、皮膚がん、肛門がんを例示することができる。
【0018】
本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤は、対象における腫瘍の成長抑制用に用いることができ、腫瘍の成長の抑制としては、本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤を投与した場合に、本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤を投与しない場合と比較して、腫瘍の体積の増加の程度を低下させることや、腫瘍の体積を減少させることや、腫瘍を消滅させることを挙げることができ、腫瘍の体積の増加の程度を低下させる場合としては特に限定はされないが、例えば、腫瘍体積（ｍｍ３）＝１／２（腫瘍の長さ×（腫瘍の幅）２）として算出する場合に、本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤を投与した場合の投与後所定時間経過後の腫瘍体積が、投与しない場合の腫瘍体積と比較して小さくなる場合を挙げることができ、具体的には、投与した場合の腫瘍の体積が、投与しない場合の腫瘍体積の４／５以下、好ましくは３／５以下、より好ましくは１／２以下となる場合を挙げることができる。
【0019】
本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤は、未熟樹状細胞を成熟樹状細胞とするために用いることができ、好ましくは、未熟樹状細胞をＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋生細胞にするために用いることができる。未熟樹状細胞としては、生体内に存在する未熟標準型骨髄樹状細胞、ＴＡＤＣ等を例示することができるが、これらの細胞をインビトロで調製することもできる。
【0020】
上記未熟標準型樹状細胞をインビトロで調製する方法としては、公知の方法であれば特に限定されないが、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、ヒト等の投与対象となる哺乳類の大腿骨及び／又は脛骨の骨髄細胞を採取し、採取した骨髄細胞を、ＦＢＳ、ペニシリン・ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、及び、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ、２－メルカプトエタノール、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦを含むＲＰＭＩ－１６４０培地において培養することにより、骨髄由来の未成熟の標準型樹状細胞を調製する方法を例示することができ、マウス細胞の場合には、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン・ストレプトマイシン、１％ピルビン酸ナトリウム、及び、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ、０．４％の５０μＭの２－メルカプトエタノール、１０ｎｇ／ｍＬのマウスＩＬ－４、１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦを含むＲＰＭＩ－１６４０培地において培養することにより、骨髄由来の未成熟の標準型樹状細胞を調製する方法を好適に挙げることができる。
【0021】
未熟樹状細胞を培養することにより、成熟樹状細胞をインビトロで調製する方法としては、本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤の存在下において、対象から採取した未熟樹状細胞をインビトロで培養する方法を例示することができ、例えば、０．１～１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．５～５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．８～１．６ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１．０～１．４ｍｇ／ｍＬの抗腫瘍免疫応答増強剤を添加した培地において、１２時間～７２時間、好ましくは２４時間～７２時間、より好ましくは３６時間～６０時間培養する方法を挙げることができる。
【0022】
上記抗腫瘍免疫応答増強剤は、対象から採取した未熟樹状細胞をインビトロで培養することにより、成熟樹状細胞を調製するために使用されることができ、インビトロで調製された成熟樹状細胞を対象の体内へ投与することもできる。
【0023】
上記ＴＡＤＣをインビトロで調製する方法としては、腫瘍微小環境に存在するＴＡＤＣを単離するための公知の方法であれば特に制限されないが、例えば、哺乳類の体内から摘出した腫瘍をＰＢＳで洗浄し、メスで細かく切断し、上記切断された腫瘍組織をさらに分散させて、単細胞懸濁液を調製し、単細胞懸濁液となった腫瘍をろ過し、ＰＢＳで洗浄し、パーコール勾配による遠心分離を行うことにより単核細胞を単離する方法を挙げることができ、このように調製されたＴＡＤＣは、腫瘍の成長の抑制の程度等について、インビトロで評価されることができる。
【0024】
上記腫瘍微小環境としては、悪性腫瘍（がん）の細胞以外の細胞が固形腫瘍に含まれる、又は固型腫瘍の周囲に共存する生体内環境であって、腫瘍細胞の成長を促進し、腫瘍の転移を促進し、及び／又は、宿主免疫を回避できる等の特性を有する、樹状細胞等の種々の細胞が存在し、腫瘍に対する免疫が抑制されている環境を挙げることができる。
【0025】
本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤が、未熟標準型樹状細胞、ＴＡＤＣ等の未熟な樹状細胞を成熟樹状細胞としたことを確認する方法としては、フローサイトメトリー等の個々の細胞の物理的及び化学的特性について複数のパラメーター分析を行うことができる手段によって、成熟樹状細胞が発現するマーカーや、活性化されたサイトカインを検出した場合に、被検細胞が成熟した樹状細胞になったと判定することにより確認する方法を例示することができる。
【0026】
本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤により、未熟標準型樹状細胞が成熟したことを確認する方法としては、上記パラメーター分析により、ＣＤ（Cluster of Differentiation）１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＩＡ／ＩＥ、ＣＤ８０、ＣＤ４０等の細胞表面マーカーの発現が、本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤を投与（添加）しない場合よりも有意に増加していると判定されること、及び／又は、標準型樹状細胞が成熟して活性化することにより、インターロイキン（ＩＬ）－１β、ＩＬ－１２、ＩＬ－６等のサイトカインの産生量が本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤を投与（添加）しない場合よりも有意に増加していると判定されることなどにより確認することを挙げることができる。
【0027】
本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤により、ＴＡＤＣが成熟したことを確認する方法としては、上記パラメーター分析により、ＣＤ４５生細胞において、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８６、ＩＡ／ＩＥ等の細胞表面マーカーの発現量が、本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤を投与（添加）しない場合よりも有意に増加していると判定されることを挙げることができる。また、標準型樹状細胞が成熟して活性化することにより、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－γ等のサイトカインの産生量が、本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤を投与（添加）しない場合よりも有意に増加していると判定されることなどにより確認することを挙げることができる。
【0028】
本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤により、ＴＡＤＣが成熟したことを確認する方法としては、ＣＤ４陽性を示すＴＡＤＣにおいて、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２の産生量が、本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤を投与（添加）しない場合よりも有意に増加することや、ＴＮＦ－αの産生量が、本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤を投与しない場合よりも有意に減少することを確認することをさらに含めることができる。
【0029】
また、本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤により、ＴＡＤＣが成熟したことを確認する方法としては、ＣＤ８陽性を示すＴＡＤＣにおいて、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及びＴＮＦ－αの産生量が、本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤を投与（添加）しない場合よりも有意に増加することを確認することをさらに含めることができる。
【0030】
本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤の投与対象としては、また、腫瘍を担持した対象であることが好ましいが、腫瘍を担持していない対象であっても、（悪性）腫瘍の発生を予防するための予防的措置として投与することができる。
【0031】
本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤の投与の態様としては、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、皮下注射、筋肉注射、静注等により投与する非経口的投与が好ましく、また、固型腫瘍の位置が特定できる場合は、固型腫瘍への投与、固型腫瘍の周辺、固型腫瘍の近傍への投与が好ましい。
【0032】
本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤の投与量としては、本発明の効果を奏する限りにおいて、また、重篤な副作用を起こさない限りにおいて、特に制限されないが、例えば、ヒトに対する本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤の投与量を決定する場合、当該技術分野において通常行われているとおり、マウス等の試験動物の体表面積から、ヒトにおいて同等の作用が発現する用量を推定するＨＥＤ換算方法や、最高血中濃度（Ｃｍａｘ）や時間曲線下面積（ＡＵＣ）のデータを検討する等の公知の方法により、実験データを蓄積したうえでヒトへの投与量を決定することができる。
【0033】
本発明の抗腫瘍免疫応答増強剤は、他の抗がん剤と併用することにより、抗がん剤の抗がん効果を高めることができる。他の抗がん剤としては、シクロホスファミド、ベンダムスチン、イオスファミド、ダカルバジン等のアルキル化剤；ペントスタチン、フルダラビン、クラドリビン、メソトレキセート、６－メルカプトプリン、エノシタビン等の代謝拮抗剤；リツキシマブ、セツキシマブ、トラスツズマブなどの分子標的剤；イマチニブ、ゲフェチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ダサチニブ、スニチニブ、トラメチニブ等のキナーゼ阻害剤；シクロスポリン、タクロリムス等のカルシニューリン阻害剤；イダルビジン、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ等の抗がん性抗生物質；イリノテカン、エトポシド等の植物アルカロイド；シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン等のプラチナ製剤；インターフェロン、ニボルマブ、ペンブロリズマブ等の免疫制御剤などを挙げることができる。
【0034】
本願明細書における、「増加した」、「増加する」、「増強する」、又は「活性化する」という用語は、ここでは全て、統計的に有意な量の増加を意味するために使用される。幾つかの実施態様では、「増加した」、「増加する」、「増強する」、又は「（増加することにより作用）が活性化する」という用語は、コントロールのレベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又はそれ以上で１００％の増加を含む増加、あるいは参照（コントロール）レベルと比較して１０～１００％の間の任意の増加、あるいは少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍の増加、あるいは２倍と１０倍以上の間の任意の増加を意味しうる。
【0035】
（統計解析方法）
本願明細書における、「統計的に有意」又は「有意に」という用語は、統計的有意性を指し、統計的有意性はｐ＜０．０５とすることもできる。
本願明細書における、「統計的に有意」又は「有意に」という用語は、統計的有意性を指し、統計的有意性はｐ＜０．０５とすることもできる。
【0036】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例0037】
［実施例１］
（脂質組成物の調製）
ホスファチジルコリン（ＰＣ）（Ｓｏｙ ＰＣ（９５％）、Avanti Polar Lipids社製）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）（Ｌｉｐｏｉｄ Ｓ ＰＥ、（大豆由来精製ホスファチジルエタノールアミン、９８％以上）Lipoid社製）、及び大豆由来ホスファチジルセリン（ＰＳ）（Ｌｉｐａｍｉｎｅ（登録商標）ＰＳ ９０ ＰＮ、ナガセケムテックス株式会社製）の３種類のリン脂質を、ＰＣ：ＰＥ：ＰＳを質量比で１４：３：３の割合でＥｔＯＨに溶解して作製した溶液を調製した。具体的には、０．８４ｍｇのＰＣ、０．１８ｍｇのＰＥ、及び０．１８ｍｇのＰＳを１ｍＬのエタノールに溶解し、１．２ｍｇ／ｍＬの脂質組成物ｃＰＬｓアジュバントを調製した。
（脂質組成物の調製）
ホスファチジルコリン（ＰＣ）（Ｓｏｙ ＰＣ（９５％）、Avanti Polar Lipids社製）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）（Ｌｉｐｏｉｄ Ｓ ＰＥ、（大豆由来精製ホスファチジルエタノールアミン、９８％以上）Lipoid社製）、及び大豆由来ホスファチジルセリン（ＰＳ）（Ｌｉｐａｍｉｎｅ（登録商標）ＰＳ ９０ ＰＮ、ナガセケムテックス株式会社製）の３種類のリン脂質を、ＰＣ：ＰＥ：ＰＳを質量比で１４：３：３の割合でＥｔＯＨに溶解して作製した溶液を調製した。具体的には、０．８４ｍｇのＰＣ、０．１８ｍｇのＰＥ、及び０．１８ｍｇのＰＳを１ｍＬのエタノールに溶解し、１．２ｍｇ／ｍＬの脂質組成物ｃＰＬｓアジュバントを調製した。
【0038】
（マウス）
８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒＳｌｃマウス（以下「Ｂ６マウス」という。）、及び、８週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスを日本ＳＬＣ株式会社から購入した。各マウスは、実験の１週間前から濾過水と餌を与えて飼育した。マウスの飼育方法は、国立成育医療研究センター（ＮＣＣＨＤ）の実験動物福祉に関するガイドラインに従った。
８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒＳｌｃマウス（以下「Ｂ６マウス」という。）、及び、８週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスを日本ＳＬＣ株式会社から購入した。各マウスは、実験の１週間前から濾過水と餌を与えて飼育した。マウスの飼育方法は、国立成育医療研究センター（ＮＣＣＨＤ）の実験動物福祉に関するガイドラインに従った。
【0039】
（がん細胞株の調製）
崇城大学薬学部、Ｊｕｎ Ｆａｎｇ博士より供与された、ホタルルシフェラーゼを発現するＯＶＡ発現マウスメラノーマ（以下「ＭＯ４－Ｌｕｃ細胞」という。）と、マウス結腸がん細胞株であるＣ２６細胞とを、１０％牛胎児血清及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（和光純薬株式会社製）において、５％のＣＯ２濃度下で３７℃にてそれぞれ培養した。
崇城大学薬学部、Ｊｕｎ Ｆａｎｇ博士より供与された、ホタルルシフェラーゼを発現するＯＶＡ発現マウスメラノーマ（以下「ＭＯ４－Ｌｕｃ細胞」という。）と、マウス結腸がん細胞株であるＣ２６細胞とを、１０％牛胎児血清及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（和光純薬株式会社製）において、５％のＣＯ２濃度下で３７℃にてそれぞれ培養した。
【0040】
（統計解析方法）
実施例に示す各結果は、平均値±標準偏差（ＳＤ）で解析を行った。データは、GraphPad Prismソフトウェア（バージョン7.0、GraphPad Software社製）を使用して解析した。２つのグループ（正規分布）の比較には、片側不対（独立標本において）、又は、対（３つの独立実験において）スチューデントのｔ－検定を用いた。２群の比較には片側Wilcoxon matched-pairs signed-rank testを用いた（異常分布）。複数群の比較には、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置分散分析（One-way ANOVA）を用いた。「有意に」なる文言は、統計学的有意性を指す。「顕著に」なる文言は、有意差が非常に大きい意である。統計学的有意性はp<0.05とした。
実施例に示す各結果は、平均値±標準偏差（ＳＤ）で解析を行った。データは、GraphPad Prismソフトウェア（バージョン7.0、GraphPad Software社製）を使用して解析した。２つのグループ（正規分布）の比較には、片側不対（独立標本において）、又は、対（３つの独立実験において）スチューデントのｔ－検定を用いた。２群の比較には片側Wilcoxon matched-pairs signed-rank testを用いた（異常分布）。複数群の比較には、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置分散分析（One-way ANOVA）を用いた。「有意に」なる文言は、統計学的有意性を指す。「顕著に」なる文言は、有意差が非常に大きい意である。統計学的有意性はp<0.05とした。
【0041】
（ＭＯ４－Ｌｕｃ細胞のマウスへの移植）
上記培養されたＭＯ４－Ｌｕｃ細胞はＰＢＳで２回洗浄され、３×１０６細胞／ｍＬの濃度となるようにＰＢＳにて再懸濁された。再懸濁されたＭＯ４－Ｌｕｃ細胞を、上記Ｂ６マウスの剃毛した右脇腹に皮下注射（３×１０５／１００μＬｓ．ｃ．）し、ＭＯ４－Ｌｕｃ細胞移植マウスとした（移植後０日）。
上記培養されたＭＯ４－Ｌｕｃ細胞はＰＢＳで２回洗浄され、３×１０６細胞／ｍＬの濃度となるようにＰＢＳにて再懸濁された。再懸濁されたＭＯ４－Ｌｕｃ細胞を、上記Ｂ６マウスの剃毛した右脇腹に皮下注射（３×１０５／１００μＬｓ．ｃ．）し、ＭＯ４－Ｌｕｃ細胞移植マウスとした（移植後０日）。
【0042】
上記ＭＯ４－Ｌｕｃ細胞移植マウスについて、ＭＯ４－Ｌｕｃ細胞移植後６日目から２日毎にノギスを用いて、腫瘍の長さ（ｌｅｎｇｔｈ）と、幅（ｗｉｄｔｈ）とを測定することにより腫瘍体積を算出した。腫瘍体積の算出式は、腫瘍体積（ｍｍ３）＝１／２（腫瘍の長さ×（腫瘍の幅）２）とした。ＭＯ４－Ｌｕｃ細胞移植後８日目において、１００ｍｍ３＞腫瘍体積＞１０ｍｍ３であるＭＯ４－Ｌｕｃ細胞移植マウスを選択して、ｃＰＬｓアジュバントを投与することとした。すなわち、ＭＯ４－Ｌｕｃ細胞移植後８日目と１１日目と１４日目とに、４ｍｇ／ｋｇマウス体重又は１２ｍｇ／ｋｇマウス体重のｃＰＬｓアジュバントを腹腔内に注入した。なお、ｃＰＬｓアジュバントを投与しなかったマウスをコントロールマウスとして同様に腫瘍体積の測定を行った。移植後１６日経過時までの腫瘍の体積の推移を示すグラフ（**p<0.01、****p<0.0001）を図１（ａ）に、ＭＯ４－Ｌｕｃメラノーマ移植後１６日目の腫瘍体積をＴｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置分散分析(one-way ＡＮＯＶＡ）により平均値±ＳＤで表したヒストグラム（**p<0.01、****p<0.0001）を図１（ｂ）に示す。
【0043】
（結果）
図１（ａ）から明らかなとおり、ＭＯ４－Ｌｕｃ細胞移植マウスにおいて、１２ｍｇ／ｋｇマウス体重のｃＰＬｓアジュバントを投与したマウス及び４ｍｇ／ｋｇマウス体重のｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスにおける腫瘍の体積の増加の程度は、無処置のコントロールマウスにおける腫瘍の体積の増加の程度と比較して明らかに小さかった。図１（ａ）において、ＭＯ４－Ｌｕｃ細胞移植後１６日目の、１２ｍｇ／ｋｇマウス体重のｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスの腫瘍の体積は、無処置のコントロールマウスの腫瘍の体積の約１／２であり、顕著に小さかった。１２ｍｇ／ｋｇマウス体重のｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスの腫瘍の体積は、４ｍｇ／ｋｇマウス体重のｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスの腫瘍の体積の約３／５であり有意に小さかった。
図１（ａ）から明らかなとおり、ＭＯ４－Ｌｕｃ細胞移植マウスにおいて、１２ｍｇ／ｋｇマウス体重のｃＰＬｓアジュバントを投与したマウス及び４ｍｇ／ｋｇマウス体重のｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスにおける腫瘍の体積の増加の程度は、無処置のコントロールマウスにおける腫瘍の体積の増加の程度と比較して明らかに小さかった。図１（ａ）において、ＭＯ４－Ｌｕｃ細胞移植後１６日目の、１２ｍｇ／ｋｇマウス体重のｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスの腫瘍の体積は、無処置のコントロールマウスの腫瘍の体積の約１／２であり、顕著に小さかった。１２ｍｇ／ｋｇマウス体重のｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスの腫瘍の体積は、４ｍｇ／ｋｇマウス体重のｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスの腫瘍の体積の約３／５であり有意に小さかった。
【0044】
図１（ｂ）から明らかなとおり、ＭＯ４－Ｌｕｃ細胞移植後１６日目の、１２ｍｇ／ｋｇマウス体重のｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスと無処置のコントロールマウスとにおける腫瘍の体積は、有意差が顕著にあることが示された。また、１２ｍｇ／ｋｇのｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスと４ｍｇ／ｋｇマウス体重のｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスとにおける腫瘍の体積についても有意差が認められた。
【0045】
以上の結果から、ＭＯ４－Ｌｕｃ細胞移植マウスにおいて、ｃＰＬｓアジュバントの投与により、優れた腫瘍の成長抑制作用がもたらされることが確認された。
【0046】
［実施例２］
（Ｃ２６細胞のマウスへの移植）
上記培養されたＣ２６細胞はＰＢＳで２回洗浄され、３×１０６細胞／ｍＬの濃度となるようにＰＢＳで再懸濁された。再懸濁されたＣ２６細胞を、上記Ｂａｌｂ／ｃマウスの剃毛した右脇腹に皮下注射（３×１０５／１００μＬｓ．ｃ．）し、Ｃ２６細胞移植マウスとした（移植後０日）。
（Ｃ２６細胞のマウスへの移植）
上記培養されたＣ２６細胞はＰＢＳで２回洗浄され、３×１０６細胞／ｍＬの濃度となるようにＰＢＳで再懸濁された。再懸濁されたＣ２６細胞を、上記Ｂａｌｂ／ｃマウスの剃毛した右脇腹に皮下注射（３×１０５／１００μＬｓ．ｃ．）し、Ｃ２６細胞移植マウスとした（移植後０日）。
【0047】
上記Ｃ２６細胞移植マウスについて、Ｃ２６細胞移植後６日目から２日毎にノギスを用いて、腫瘍の長さと幅とを測定し、上記ＭＯ４－Ｌｕｃ細胞移植マウス同様腫瘍体積を算出した。細胞移植後８日目において、１００ｍｍ３＞腫瘍体積＞１０ｍｍ３であるＣ２６細胞移植マウスを選択し、移植後８日目と１１日目と１４日目とに、４ｍｇ／ｋｇマウス体重又は１２ｍｇ／ｋｇマウス体重のｃＰＬｓアジュバントを腹腔内に注入した。ｃＰＬｓアジュバントを投与しなかったマウスをコントロールマウスとして同様に腫瘍体積の測定を行った。実施例１同様、腫瘍の体積の推移を示すグラフ(****p<0.0001)を図１（ｃ）に、ヒストグラム(****p<0.0001)を図１（ｄ）に示す。
【0048】
（結果）
図１（ｃ）から明らかなとおり、Ｃ２６細胞移植マウスにおいて、１２ｍｇ／ｋｇのｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスにおける腫瘍の体積の増加の程度は、無処置のコントロールマウスにおける腫瘍の体積の増加の程度と比較して明らかに小さかった。図１（ｃ）において、Ｃ２６細胞移植後１６日目の、１２ｍｇ／ｋｇマウス体重のｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスの腫瘍の体積は、無処置のコントロールマウスの腫瘍の体積の約１／４であり顕著に小さかった。また、図１（ｄ）から明らかなとおり、Ｃ２６細胞移植後１６日目の、１２ｍｇ／ｋｇのｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスと無処置のコントロールマウスとにおける腫瘍の体積を比較すると、ｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスにおいて、腫瘍の大きさが顕著に小さいことが示された。
図１（ｃ）から明らかなとおり、Ｃ２６細胞移植マウスにおいて、１２ｍｇ／ｋｇのｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスにおける腫瘍の体積の増加の程度は、無処置のコントロールマウスにおける腫瘍の体積の増加の程度と比較して明らかに小さかった。図１（ｃ）において、Ｃ２６細胞移植後１６日目の、１２ｍｇ／ｋｇマウス体重のｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスの腫瘍の体積は、無処置のコントロールマウスの腫瘍の体積の約１／４であり顕著に小さかった。また、図１（ｄ）から明らかなとおり、Ｃ２６細胞移植後１６日目の、１２ｍｇ／ｋｇのｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスと無処置のコントロールマウスとにおける腫瘍の体積を比較すると、ｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスにおいて、腫瘍の大きさが顕著に小さいことが示された。
【0049】
以上の結果から、Ｃ２６細胞移植マウスにおいても、ｃＰＬｓアジュバントの投与により、優れた腫瘍の成長抑制作用がもたらされることが確認された。
【0050】
［実施例３］
（ｃＰＬｓアジュバントの相乗効果）
０．８４ｍｇのＰＣを１ｍＬのエタノールに溶解することにより作製されたＰＣ溶液、０．１８ｍｇのＰＥを１ｍＬのエタノールに溶解することにより作製されたＰＥ溶液、及び０．１８ｍｇのＰＳを１ｍＬのエタノールに溶解することにより作製されたＰＳ溶液をそれぞれ作製し、上記１２ｍｇ／ｋｇマウス体重のｃＰＬｓアジュバントに代えて、上記実施例１の手順にて、８．４ｍｇ／ｋｇのＰＣ、１．８ｍｇ／ｋｇマウス体重のＰＥ、又は１．８ｍｇ／ｋｇマウス体重のＰＳがＭＯ４－Ｌｕｃ細胞移植マウスにそれぞれ投与された。それぞれのマウスにおける移植後１６日目までの腫瘍の体積の推移について図１（ｅ）のグラフ(*p<0.05、**p<0.01)に示す。
（ｃＰＬｓアジュバントの相乗効果）
０．８４ｍｇのＰＣを１ｍＬのエタノールに溶解することにより作製されたＰＣ溶液、０．１８ｍｇのＰＥを１ｍＬのエタノールに溶解することにより作製されたＰＥ溶液、及び０．１８ｍｇのＰＳを１ｍＬのエタノールに溶解することにより作製されたＰＳ溶液をそれぞれ作製し、上記１２ｍｇ／ｋｇマウス体重のｃＰＬｓアジュバントに代えて、上記実施例１の手順にて、８．４ｍｇ／ｋｇのＰＣ、１．８ｍｇ／ｋｇマウス体重のＰＥ、又は１．８ｍｇ／ｋｇマウス体重のＰＳがＭＯ４－Ｌｕｃ細胞移植マウスにそれぞれ投与された。それぞれのマウスにおける移植後１６日目までの腫瘍の体積の推移について図１（ｅ）のグラフ(*p<0.05、**p<0.01)に示す。
【0051】
ＭＯ４－Ｌｕｃ移植マウスにおける腫瘍の体積の推移を示す図１（ｅ）から明らかなとおり、ＭＯ４－Ｌｕｃ細胞移植マウスにおいて、１２ｍｇ／ｋｇマウス体重のｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスにおける腫瘍の体積の増加の程度は、無処置のコントロールマウスや、ＰＣ、ＰＥ、又はＰＳをそれぞれ単独で投与したマウスにおける腫瘍の体積の増加の程度と比較して小さかった。また、図１（ｅ）において、１２ｍｇ／ｋｇマウス体重のｃＰＬｓアジュバントを投与したＭＯ４－Ｌｕｃマウスの移植後１６日目の腫瘍の大きさは、無処置のコントロールマウスの腫瘍の体積の１／２未満であって顕著に小さく、またＰＥを投与したマウスの腫瘍の体積と比較して有意に小さく、ｃＰＬｓアジュバントの優れた抗腫瘍効果が示された。
【0052】
［実施例４］
［標準型樹状細胞の形質解析］
ＤＣに対するｃＰＬｓアジュバントの効果をより詳細に検討するため、まず骨髄由来の未成熟の標準型（conventional）の樹状細胞（ＤＣ）に対するｃＰＬｓアジュバントの効果を検討することとした。
［標準型樹状細胞の形質解析］
ＤＣに対するｃＰＬｓアジュバントの効果をより詳細に検討するため、まず骨髄由来の未成熟の標準型（conventional）の樹状細胞（ＤＣ）に対するｃＰＬｓアジュバントの効果を検討することとした。
【0053】
（未熟なマウス骨髄由来樹状細胞の調製）
大腿骨及び脛骨の骨髄細胞を、８～１２週齢のＢ６マウスから採取し、採取した骨髄細胞から、未熟な標準型のマウス骨髄樹状細胞（Immature mouse bone morrow dendritic cells（以下「ｉｍＤＣ」ともいう））を調製した。すなわちＢ６マウス由来の骨髄細胞を１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン・ストレプトマイシン（Gibco Thermo Fisher Scientific社製）、１％ピルビン酸ナトリウム（Gibco Thermo Fisher Scientific社製）、及び、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Gibco Thermo Fisher Scientific社製）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ（Gibco Thermo Fisher Scientific社製）、０．４％の５０μＭの２－メルカプトエタノール（和光純薬社製）、１０ｎｇ／ｍＬのマウスＩＬ－４（PeproTech社製）、１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（BioLegend社製）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地において５日間培養することにより、ｉｍＤＣが調製された。
大腿骨及び脛骨の骨髄細胞を、８～１２週齢のＢ６マウスから採取し、採取した骨髄細胞から、未熟な標準型のマウス骨髄樹状細胞（Immature mouse bone morrow dendritic cells（以下「ｉｍＤＣ」ともいう））を調製した。すなわちＢ６マウス由来の骨髄細胞を１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン・ストレプトマイシン（Gibco Thermo Fisher Scientific社製）、１％ピルビン酸ナトリウム（Gibco Thermo Fisher Scientific社製）、及び、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Gibco Thermo Fisher Scientific社製）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ（Gibco Thermo Fisher Scientific社製）、０．４％の５０μＭの２－メルカプトエタノール（和光純薬社製）、１０ｎｇ／ｍＬのマウスＩＬ－４（PeproTech社製）、１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（BioLegend社製）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地において５日間培養することにより、ｉｍＤＣが調製された。
【0054】
（マウス骨髄由来未熟樹状細胞へのｃＰＬｓアジュバントの添加）
上記ｉｍＤＣは、１．２ｍｇ／ｍＬのｃＰＬｓアジュバントをさらに添加した２４ウェルプレート上で、さらに２日間培養して、細胞が採取され、細胞数がカウントされた。細胞生存率は９０％以上であった。
上記ｉｍＤＣは、１．２ｍｇ／ｍＬのｃＰＬｓアジュバントをさらに添加した２４ウェルプレート上で、さらに２日間培養して、細胞が採取され、細胞数がカウントされた。細胞生存率は９０％以上であった。
【0055】
（ｃＰＬｓアジュバント添加後の樹状細胞のフローサイトメトリー解析）
上記ｃＰＬｓアジュバント存在下で２日間培養された細胞について、フローサイトメトリーによる解析を行うこととした。上記ｃＰＬｓアジュバント存在下で２日間培養された細胞は、洗浄後、ＰＢＳに最適濃度にて懸濁された。細胞内のサイトカイン染色のために、ブレフェルディンＡ（Brefeldin A）溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）の存在下、５０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ（Phorbor 12-myristate 13-acetate）と５００ｎｇ／ｍＬのイオノマイシン（ionomycin）（シグマアルドリッチ社製）とによって、３７℃にて４時間刺激された。その後、細胞内染色を容易にするために、細胞内固定化・透過化バッファー（cat#00-5523-00、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて透過化された。フローサイトメトリーによる解析結果を図２に示す。
上記ｃＰＬｓアジュバント存在下で２日間培養された細胞について、フローサイトメトリーによる解析を行うこととした。上記ｃＰＬｓアジュバント存在下で２日間培養された細胞は、洗浄後、ＰＢＳに最適濃度にて懸濁された。細胞内のサイトカイン染色のために、ブレフェルディンＡ（Brefeldin A）溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）の存在下、５０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ（Phorbor 12-myristate 13-acetate）と５００ｎｇ／ｍＬのイオノマイシン（ionomycin）（シグマアルドリッチ社製）とによって、３７℃にて４時間刺激された。その後、細胞内染色を容易にするために、細胞内固定化・透過化バッファー（cat#00-5523-00、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて透過化された。フローサイトメトリーによる解析結果を図２に示す。
【0056】
なお、これ以降フローサイトメトリー解析においては、セルアナライザーＬＥ－ＳＰ６８００ (ソニー株式会社製）、又はＢＤ ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙＴＭ (BDBiosciences社製)、及び ＦｌｏｗＪｏソフトウェア(バージョン10.5.0; BD Biosciences社製）を用いて解析を行った。
【0057】
（染色試薬）
これ以降、細胞内染色には以下の試薬を用いた。
LIVE/DEADTM Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405nm excitation（Ｌ３４９５７，サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、マウスＦｃブロッキング試薬（130-092-575，ミルテニー社製）、及び、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ６０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、ＡＰＣ／Ｃｙａｎｉｎｅ７、ＰＥ／Ｃｙａｎｉｎｅ７、ＰＥ／Ｄａｚｚｌｅ５９４、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５、ＡＰＣ、ＰＥ、ＦＩＴＣのいずれかに結合する、以下に示す抗マウスモノクローナル抗体（いずれもBioLegend社製）が染色に用いられた。
ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、
ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）、
ＣＤ４０（３／２３）、
ＣＤ８０（１６－１０Ａ１）、
ＣＤ８６（ＧＬ－１）、
ＩＡ／ＩＥ（Ｍ５／１１４．１５．２）、
ＣＤ８（５３－６．７）、
ＣＤ４（ＲＭ４－５）、
ＣＤ４５（３０－Ｆ１１）、
ＩＬ－１０（ＪＥＳ５－１６Ｅ３）、
ＩＬ－１２（Ｃ１５．６）、
ＩＬ－６（ＭＰ５－２０Ｆ３）、
ＩＬ－１β（ＮＪＴＥＮ３）、
ＴＮＦ－α（ＭＰ６－ＸＴ２２）、
ＩＦＮ－γ（ＸＭＧ１．２）。
これ以降、細胞内染色には以下の試薬を用いた。
LIVE/DEADTM Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405nm excitation（Ｌ３４９５７，サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、マウスＦｃブロッキング試薬（130-092-575，ミルテニー社製）、及び、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ６０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、ＡＰＣ／Ｃｙａｎｉｎｅ７、ＰＥ／Ｃｙａｎｉｎｅ７、ＰＥ／Ｄａｚｚｌｅ５９４、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５、ＡＰＣ、ＰＥ、ＦＩＴＣのいずれかに結合する、以下に示す抗マウスモノクローナル抗体（いずれもBioLegend社製）が染色に用いられた。
ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、
ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）、
ＣＤ４０（３／２３）、
ＣＤ８０（１６－１０Ａ１）、
ＣＤ８６（ＧＬ－１）、
ＩＡ／ＩＥ（Ｍ５／１１４．１５．２）、
ＣＤ８（５３－６．７）、
ＣＤ４（ＲＭ４－５）、
ＣＤ４５（３０－Ｆ１１）、
ＩＬ－１０（ＪＥＳ５－１６Ｅ３）、
ＩＬ－１２（Ｃ１５．６）、
ＩＬ－６（ＭＰ５－２０Ｆ３）、
ＩＬ－１β（ＮＪＴＥＮ３）、
ＴＮＦ－α（ＭＰ６－ＸＴ２２）、
ＩＦＮ－γ（ＸＭＧ１．２）。
【0058】
（結果）
図２から明らかなとおり、上記ｉｍＤＣは２日間ｃＰＬｓアジュバントの存在下で培養された後に、標準型樹状細胞（ｃＤＣ）において表出するＣＤ１１ｂ＋やＣＤ１１ｃ＋が発現していることが確認された。したがって、マウスの未熟なＤＣはｃＰＬｓアジュバントの存在下で培養されることにより、成熟したマウス骨髄樹状細胞（成熟ＢＭＤＣ）となり、ＣＤ１１ｂ＋やＣＤ１１ｃ＋を発現することが確認された。
図２から明らかなとおり、上記ｉｍＤＣは２日間ｃＰＬｓアジュバントの存在下で培養された後に、標準型樹状細胞（ｃＤＣ）において表出するＣＤ１１ｂ＋やＣＤ１１ｃ＋が発現していることが確認された。したがって、マウスの未熟なＤＣはｃＰＬｓアジュバントの存在下で培養されることにより、成熟したマウス骨髄樹状細胞（成熟ＢＭＤＣ）となり、ＣＤ１１ｂ＋やＣＤ１１ｃ＋を発現することが確認された。
【0059】
（マーカーの発現）
図３に、上記成熟ＢＭＤＣの表面マーカーについて、（ａ）ＩＡ／ＩＥ、（ｂ）ＣＤ８０、及び（ｃ）ＣＤ４０の発現をＭＦＩのデルタ値で表わしたグラフをそれぞれ示す。
図３に、上記成熟ＢＭＤＣの表面マーカーについて、（ａ）ＩＡ／ＩＥ、（ｂ）ＣＤ８０、及び（ｃ）ＣＤ４０の発現をＭＦＩのデルタ値で表わしたグラフをそれぞれ示す。
【0060】
（結果）
ｃＰＬｓアジュバントの存在下で２日間培養後の成熟ＢＭＤＣ（横軸：ｃＰＬｓアジュバント）は、ｃＰＬｓアジュバント無処理のｉｍＤＣ（横軸：ｉｍＤＣ）と比較して、ＩＡ／ＩＥ、ＣＤ８０、及びＣＤ４０の発現が有意に増加したことが確認された。また、ＣＤ８６についても、ｃＰＬｓアジュバントの存在下でｉｍＤＣを２日間培養した場合に発現が増加傾向にあることが確認された。
ｃＰＬｓアジュバントの存在下で２日間培養後の成熟ＢＭＤＣ（横軸：ｃＰＬｓアジュバント）は、ｃＰＬｓアジュバント無処理のｉｍＤＣ（横軸：ｉｍＤＣ）と比較して、ＩＡ／ＩＥ、ＣＤ８０、及びＣＤ４０の発現が有意に増加したことが確認された。また、ＣＤ８６についても、ｃＰＬｓアジュバントの存在下でｉｍＤＣを２日間培養した場合に発現が増加傾向にあることが確認された。
【0061】
以上の結果によりｃＰＬｓアジュバントの存在下でｉｍＤＣが十分に成熟して成熟ＢＭＤＣとなり、ＩＡ／ＩＥ抗原やＣＤ４０の発現が増加し、抗腫瘍免疫増強効果を奏することができることが示された。
【0062】
（サイトカイン産生）
図４に、上記ｃＰＬｓアジュバントの存在下で２日間培養されて成熟ＢＭＤＣとなったＤＣについて、（ａ）ＩＬ－１β、（ｂ）ＩＬ－１２、及び（ｃ）ＩＬ－６の産生をＭＦＩのデルタ値で表わしたグラフをそれぞれ示す。
図４に、上記ｃＰＬｓアジュバントの存在下で２日間培養されて成熟ＢＭＤＣとなったＤＣについて、（ａ）ＩＬ－１β、（ｂ）ＩＬ－１２、及び（ｃ）ＩＬ－６の産生をＭＦＩのデルタ値で表わしたグラフをそれぞれ示す。
【0063】
（結果）
ｃＰＬｓアジュバントの存在下で２日間培養されたｉｍＤＣ（横軸：ｃＰＬｓアジュバント）は、ｃＰＬｓアジュバント無処理のｉｍＤＣ（横軸：ｉｍＤＣ）と比較して、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２、及びＩＬ－６の産生が有意に増加したことが確認された。
ｃＰＬｓアジュバントの存在下で２日間培養されたｉｍＤＣ（横軸：ｃＰＬｓアジュバント）は、ｃＰＬｓアジュバント無処理のｉｍＤＣ（横軸：ｉｍＤＣ）と比較して、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２、及びＩＬ－６の産生が有意に増加したことが確認された。
【0064】
以上の結果により、Ｔ細胞を活性化し、抗原認識を促進するサイトカインであるＩＬ－１βの分泌が増加し、Ｔｈ１細胞を誘導し、炎症反応を調整するサイトカインであるＩＬ－１２の分泌が増加した。そしてまた、炎症性サイトカインであるＩＬ－６の分泌が増加した。これらの結果により、ｃＰＬｓアジュバントの存在下でｉｍＤＣが十分に成熟して成熟ＢＭＤＣとなり、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２、及びＩＬ－６の発現が増加し、抗腫瘍免疫増強効果を奏することができることが示された。
【0065】
［実施例５］
［腫瘍関連樹状細胞（ＴＡＤＣ）の形質解析］
ＴＩＬｓにおける腫瘍に常在するＴＡＤＣに対するｃＰＬｓアジュバントの効果について評価するため、腫瘍組織からＴＩＬｓを単離し、ＴＡＤＣに表出するマーカー等を解析した。
［腫瘍関連樹状細胞（ＴＡＤＣ）の形質解析］
ＴＩＬｓにおける腫瘍に常在するＴＡＤＣに対するｃＰＬｓアジュバントの効果について評価するため、腫瘍組織からＴＩＬｓを単離し、ＴＡＤＣに表出するマーカー等を解析した。
【0066】
（腫瘍浸潤白血球の調製）
実施例１において、ｃＰＬｓアジュバント（１２ｍｇ／ｋｇマウス体重）を投与した、又は投与しない無処理のＭＯ４－Ｌｕｃ細胞移植マウスについて、移植後１６日経過時に摘出された腫瘍から、腫瘍浸潤白血球をそれぞれ調製した。摘出腫瘍をＰＢＳで洗浄し、メスで細かく切断し、Miltenyi Tumor Dissociation Kit (Cat No.130-096-730、ミルテニーバイオテク社製)とGentleMACS Octo dissociator (Cat No.130-093-235、ミルテニーバイオテク社製)とを用いて、上記切断されたマウス腫瘍組織をさらに分散させて、単細胞懸濁液を調製した。単細胞懸濁液となった腫瘍を７０μＭプレセパレーションフィルター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）でろ過し、ＰＢＳで洗浄し、パーコール勾配（５５％及び７０％、ＧＥへルスケア社）による遠心分離（６００×ｇ）を、２０℃にて２０分間行うことにより単核細胞が単離され、各ＴＩＬｓが調製された。
実施例１において、ｃＰＬｓアジュバント（１２ｍｇ／ｋｇマウス体重）を投与した、又は投与しない無処理のＭＯ４－Ｌｕｃ細胞移植マウスについて、移植後１６日経過時に摘出された腫瘍から、腫瘍浸潤白血球をそれぞれ調製した。摘出腫瘍をＰＢＳで洗浄し、メスで細かく切断し、Miltenyi Tumor Dissociation Kit (Cat No.130-096-730、ミルテニーバイオテク社製)とGentleMACS Octo dissociator (Cat No.130-093-235、ミルテニーバイオテク社製)とを用いて、上記切断されたマウス腫瘍組織をさらに分散させて、単細胞懸濁液を調製した。単細胞懸濁液となった腫瘍を７０μＭプレセパレーションフィルター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）でろ過し、ＰＢＳで洗浄し、パーコール勾配（５５％及び７０％、ＧＥへルスケア社）による遠心分離（６００×ｇ）を、２０℃にて２０分間行うことにより単核細胞が単離され、各ＴＩＬｓが調製された。
【0067】
（ＴＩＬｓに含まれるＴＡＤＣの表面マーカーの解析）
ｃＰＬｓアジュバント（１２ｍｇ／ｋｇ）を投与したＭＯ４－Ｌｕｃ細胞移植マウスのＴＩＬｓにおいて発現しているマーカーを上記実施例４に記載の手順にてフローサイトメトリーにより解析した。結果を図５に示す。
ｃＰＬｓアジュバント（１２ｍｇ／ｋｇ）を投与したＭＯ４－Ｌｕｃ細胞移植マウスのＴＩＬｓにおいて発現しているマーカーを上記実施例４に記載の手順にてフローサイトメトリーにより解析した。結果を図５に示す。
【0068】
（結果）
図５のフローサイトメトリーによる解析から明らかなとおり、ｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスから摘出された腫瘍から調製されたＴＩＬｓにおいて、ＴＡＤＣは、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋生細胞として示された。したがって、上記実施例４で確認した成熟した標準型樹状細胞のマーカーと同様の、成熟した樹状細胞のマーカーを発現していることが確認された。
図５のフローサイトメトリーによる解析から明らかなとおり、ｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスから摘出された腫瘍から調製されたＴＩＬｓにおいて、ＴＡＤＣは、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋生細胞として示された。したがって、上記実施例４で確認した成熟した標準型樹状細胞のマーカーと同様の、成熟した樹状細胞のマーカーを発現していることが確認された。
【0069】
図６に、上記ＴＩＬｓにおけるＴＡＤＣについて（ａ）ＣＤ８６、及び（ｂ）ＩＡ／ＩＥの発現をＭＦＩのデルタ値で表わしたグラフをそれぞれ示す。
【0070】
上記ｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスから摘出された腫瘍から調製されたＴＩＬｓにおいて、樹状細胞の成熟マーカーであるＣＤ８６及びＩＡ／ＩＥの発現が有意に増加したことが確認された。したがって、ｃＰＬｓアジュバントが、ＴＩＬｓにおけるＴＡＤＣの成熟を促進し、抗腫瘍免疫増強効果を奏することができるようになったことを示すものであって、ｃＰＬｓアジュバントによって腫瘍微小環境においても樹状細胞が十分成熟し、抗腫瘍免疫増強効果を奏することができるようになったことが示唆された。
【0071】
（サイトカイン産生）
サイトカイン産生の観点からＴＩＬｓに含まれるＴ細胞の機能性を評価した。図７に、サイトカインである（ａ）ＩＬ－１β、（ｂ）ＩＬ－１２、及び（ｃ）ＩＦＮ－γの発現をＭＦＩのデルタ値で表わしたグラフをそれぞれ示す。
サイトカイン産生の観点からＴＩＬｓに含まれるＴ細胞の機能性を評価した。図７に、サイトカインである（ａ）ＩＬ－１β、（ｂ）ＩＬ－１２、及び（ｃ）ＩＦＮ－γの発現をＭＦＩのデルタ値で表わしたグラフをそれぞれ示す。
【0072】
（結果）
上記ｃＰＬｓアジュバント処理群のＴＩＬｓ（横軸：ｃＰＬｓアジュバント）においては、ｃＰＬｓアジュバント無処理対照群のＴＩＬｓ（横軸：control）と比較して、上記ｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスから摘出された腫瘍から調製されたＴＩＬにおいては、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２、及びＩＦＮ－γの産生が有意に増加したことが確認された。
上記ｃＰＬｓアジュバント処理群のＴＩＬｓ（横軸：ｃＰＬｓアジュバント）においては、ｃＰＬｓアジュバント無処理対照群のＴＩＬｓ（横軸：control）と比較して、上記ｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスから摘出された腫瘍から調製されたＴＩＬにおいては、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２、及びＩＦＮ－γの産生が有意に増加したことが確認された。
【0073】
上記ｃＰＬｓアジュバントを投与したマウスから摘出された腫瘍から調製されたＴＡＤＣにおいては、抗原認識、Ｔ細胞活性を促進するサイトカインであるＩＬ－１β、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－γの分泌が増加しており、ＴＩＬｓにおけるＴＡＤＣの成熟は、ｃＰＬｓアジュバントが促進していることが確認された。したがって、ｃＰＬｓアジュバントによって腫瘍微小環境においても樹状細胞が十分成熟し、抗腫瘍免疫増強効果を奏することができるようになったことが示唆された。
【0074】
ＴＩＬｓに含まれるＣＤ４＋Ｔ細胞における、（ａ）ＩＦＮ－γ、（ｃ）ＴＮＦ－α、及び（ｅ）ＩＬ－２の産生、並びにＣＤ８＋Ｔ細胞における（ｂ）ＩＦＮ－γ、（ｄ）ＴＮＦ－α、及び（ｆ）ＩＬ－２の産生をＭＦＩのデルタ値を算出した。結果を図９にそれぞれ示す。
【0075】
（結果）
図９から明らかなとおり、ｃＰＬｓアジュバント処理群のＣＤ４＋Ｔ細胞（横軸：ｃＰＬｓアジュバント）においては、ｃＰＬｓアジュバント無処理のＣＤ４＋Ｔ細胞（横軸：control）と比較して、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２の産生量が有意に高かった。一方、ＴＮＦ－αについては、ｃＰＬｓアジュバント処理群のＣＤ４＋Ｔ細胞における産生量は、ｃＰＬｓアジュバント無処理対照群のＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して有意に少なかった。
図９から明らかなとおり、ｃＰＬｓアジュバント処理群のＣＤ４＋Ｔ細胞（横軸：ｃＰＬｓアジュバント）においては、ｃＰＬｓアジュバント無処理のＣＤ４＋Ｔ細胞（横軸：control）と比較して、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２の産生量が有意に高かった。一方、ＴＮＦ－αについては、ｃＰＬｓアジュバント処理群のＣＤ４＋Ｔ細胞における産生量は、ｃＰＬｓアジュバント無処理対照群のＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して有意に少なかった。
【0076】
上記の結果により、活性化されたＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）は、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ等のサイトカインの産生を増加することや、ｃＰＬｓアジュバントの投与により腫瘍微小環境においてＣＤ４＋Ｔ細胞が活性化されたことが示された。
【0077】
ｃＰＬｓアジュバント処理群のＣＤ８＋Ｔ細胞においては、ｃＰＬｓアジュバント無処理のＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及びＴＮＦ－αの産生量が有意に多かった。
【0078】
ＣＤ８＋Ｔ細胞においては、ｃＰＬｓアジュバントは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及びＴＮＦ－αの発現を増強することが確認された。腫瘍微小環境においてｃＰＬｓアジュバントの投与により抗腫瘍免疫効果が増強されることが示唆された。
【0079】
（まとめ）
腫瘍微小環境における免疫寛容の解除のメカニズムの一つは、ｃＰＬｓアジュバント投与によって引き起こされるＴ細胞の活性化であることが示唆された。
腫瘍微小環境における免疫寛容の解除のメカニズムの一つは、ｃＰＬｓアジュバント投与によって引き起こされるＴ細胞の活性化であることが示唆された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
