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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024039787
(43)【公開日】2024-03-25
(54)【発明の名称】悪性腫瘍治療剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/522 20060101AFI20240315BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240315BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240315BHJP
【ＦＩ】
A61K31/522
A61P35/00
A61P43/00 111
【審査請求】未請求
【請求項の数】2
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022144405
(22)【出願日】2022-09-12
(71)【出願人】
【識別番号】502285457
【氏名又は名称】学校法人順天堂
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】砂田 成章
(72)【発明者】
【氏名】三木 義男
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086CB07
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZC20
(57)【要約】 （修正有）
【課題】トポイソメラーゼＩＩαを特異的に阻害する悪性腫瘍治療剤を提供する。
【解決手段】次の一般式（１）
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なって、水素原子又はハロゲン原子を示し、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を示す）
で表されるプリン誘導体又はその塩を含有する悪性腫瘍治療剤。
【選択図】図１
【解決手段】次の一般式（１）
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なって、水素原子又はハロゲン原子を示し、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を示す）
で表されるプリン誘導体又はその塩を含有する悪性腫瘍治療剤。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
次の一般式（１）
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なって、水素原子又はハロゲン原子を示し、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を示す）
で表されるプリン誘導体又はその塩を含有する悪性腫瘍治療剤。
【化1】
で表されるプリン誘導体又はその塩を含有する悪性腫瘍治療剤。
【請求項2】
次の一般式（１）
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なって、水素原子又はハロゲン原子を示し、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を示す）
で表されるプリン誘導体又はその塩を含有するトポイソメラーゼＩＩα阻害剤。
【化2】
で表されるプリン誘導体又はその塩を含有するトポイソメラーゼＩＩα阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、悪性腫瘍治療剤に関する。
【背景技術】
【0002】
がん細胞は無秩序な増殖を繰り返し、正常な細胞を障害し組織を壊したり、転移を行うことで本来がんのかたまりがない組織でも増殖を行う。細胞の増殖には遺伝情報が刻まれたＤＮＡの複製が必要となり、複製時にはＤＮＡが持つらせん構造のねじれやひずみを一度解消させる必要がある。このらせん構造を変化させる酵素にトポイソメラーゼがあり、Ｉ型とＩＩ型のタイプが存在する。トポイソメラーゼＩはＤＮＡの２重らせん構造のうち１本を切断し再結合に関与する。トポイソメラーゼＩＩは２重らせん構造の両方を切断し再結合に関与する。このトポイソメラーゼＩＩを阻害することによる悪性腫瘍治療剤としては、エトポシドが知られている（非特許文献１）。また、ドキソルビシンなどのアントラサイクリン系悪性腫瘍治療剤も、トポイソメラーゼＩＩ阻害作用を有することが知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，８，１０３４４（２０１８）
【非特許文献2】Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１８，１６３９－１６４２（２０１２）
【非特許文献3】Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８８，５９１－５９４（２０１７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
トポイソメラーゼＩＩには、α型とβ型の二つのタイプがあり、エトポシドやドキソルビシンが阻害するのは、トポイソメラーゼＩＩα及びＩＩβの両方であることがわかってきた。そして、ドキソルビシンによる心毒性は、心筋細胞におけるトポイソメラーゼＩＩβの機能障害を介して起こることもわかってきた（非特許文献２）。
従って、本発明の課題は、トポイソメラーゼＩＩαを特異的に阻害する悪性腫瘍治療剤を提供することにある。
従って、本発明の課題は、トポイソメラーゼＩＩαを特異的に阻害する悪性腫瘍治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0005】
そこで本発明者は、ＤＮＡ２本鎖切断（ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ：ＤＳＢ）定量システム（非特許文献３）を用いて、種々の癌細胞におけるＤＳＢ形成を生じさせる化合物をスクリーニングした。その結果、特定のプリン誘導体が多様な癌細胞株でＤＳＢ形成作用を示し、そのプリン誘導体は、細胞増殖抑制及びＤＮＡ損傷応答として特異的に起こるＧ２／Ｍ細胞周期アレストを引き起こすことも見出した。次に、多種の癌細胞株に対する細胞毒性作用を検討し、得られたフィンガープリントを用いて、既知の２５０化合物のデータベースをもとに類似性についてドライ解析した結果、そのプリン誘導体はトポイソメラーゼ阻害作用により抗がん効果を示していると予測された。そこで、そのプリン誘導体のトポイソメラーゼ阻害剤との競合作用を検討したところ、そのプリン誘導体はトポイソメラーゼ阻害剤との競合阻害を示し、さらに機能欠失実験により、その作用はトポイソメラーゼＩＩα特異的阻害剤であることが判明した。さらに、そのプリン誘導体は、ｉｎ ｖｉｖｏでも優れた抗癌効果を有すること確認し、本発明を完成した。
【0006】
すなわち、本発明は、次の発明［１］～［８］を提供するものである。
［１］次の一般式（１）
［１］次の一般式（１）
【0007】
【化1】
【0008】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なって、水素原子又はハロゲン原子を示し、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を示す）
で表されるプリン誘導体又はその塩を含有する悪性腫瘍治療剤。
［２］次の一般式（１）
で表されるプリン誘導体又はその塩を含有する悪性腫瘍治療剤。
［２］次の一般式（１）
【0009】
【化2】
【0010】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なって、水素原子又はハロゲン原子を示し、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を示す）
で表されるプリン誘導体又はその塩を含有するトポイソメラーゼＩＩα阻害剤。
［３］悪性腫瘍治療剤製造のための、次の一般式（１）
で表されるプリン誘導体又はその塩を含有するトポイソメラーゼＩＩα阻害剤。
［３］悪性腫瘍治療剤製造のための、次の一般式（１）
【0011】
【化3】
【0012】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なって、水素原子又はハロゲン原子を示し、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を示す）
で表されるプリン誘導体又はその塩の使用。
［４］トポイソメラーゼＩＩα阻害剤製造のための、次の一般式（１）
で表されるプリン誘導体又はその塩の使用。
［４］トポイソメラーゼＩＩα阻害剤製造のための、次の一般式（１）
【0013】
【化4】
【0014】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なって、水素原子又はハロゲン原子を示し、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を示す）
で表されるプリン誘導体又はその塩の使用。
［５］悪性腫瘍を治療するための次の一般式（１）
で表されるプリン誘導体又はその塩の使用。
［５］悪性腫瘍を治療するための次の一般式（１）
【0015】
【化5】
【0016】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なって、水素原子又はハロゲン原子を示し、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を示す）
で表されるプリン誘導体又はその塩。
［６］トポイソメラーゼＩＩαを阻害するための次の一般式（１）
で表されるプリン誘導体又はその塩。
［６］トポイソメラーゼＩＩαを阻害するための次の一般式（１）
【0017】
【化6】
【0018】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なって、水素原子又はハロゲン原子を示し、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を示す）
で表されるプリン誘導体又はその塩。
［７］次の一般式（１）
で表されるプリン誘導体又はその塩。
［７］次の一般式（１）
【0019】
【化7】
【0020】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なって、水素原子又はハロゲン原子を示し、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を示す）
で表されるプリン誘導体又はその塩を投与することを特徴とする悪性腫瘍の治療方法。
［８］次の一般式（１）
で表されるプリン誘導体又はその塩を投与することを特徴とする悪性腫瘍の治療方法。
［８］次の一般式（１）
【0021】
【化8】
【0022】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なって、水素原子又はハロゲン原子を示し、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を示す）
で表されるプリン誘導体又はその塩を投与することを特徴とするトポイソメラーゼＩＩαの阻害方法。
で表されるプリン誘導体又はその塩を投与することを特徴とするトポイソメラーゼＩＩαの阻害方法。
【発明の効果】
【0023】
本発明のプリン誘導体又はその塩を含有する医薬組成物を用いれば、癌患者のトポイソメラーゼＩＩαが特異的に阻害され、安全かつ確実に悪性腫瘍を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】化合物Ａの癌細胞株のＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）形成作用を示す図である。
【図2】化合物Ａの癌細胞に対する増殖抑制効果を示す図である。
【図3】化合物Ａの細胞周期に対する作用を示す図である。
【図4】化合物Ａの細胞パネル試験によるフィンガープリントを示す図である。
【図5】ＣＯＭＰＡＲＥ解析による化合物Ａの類似化合物のランキングを示す図である。
【図6】化合物Ａ及びエトポシド（ＥＴＰ）とトポイソメラーゼＩＩ阻害剤（ＩＣＲＦ１９３）のＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）形成作用における競合阻害を示す図である。
【図7】ｓｉＲＮＡによるトポイソメラーゼＩＩα及びＩＩβのノックダウン効率を示す図である。
【図8】トポイソメラーゼＩＩの機能欠失実験における化合物ＡのＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）形成作用を示す図である。
【図9】化合物Ａ及び化合物Ｂの癌細胞株のＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）形成作用を示す図である。
【図10】体重の推移に対する化合物Ａ及びエトポシド（ＥＴＰ）の影響を示す図である。
【図11】腫瘍体積の推移に対する化合物Ａ及びエトポシド（ＥＴＰ）の影響を示す図である。
【図12】腫瘍重量の推移に対する化合物Ａ及びエトポシド（ＥＴＰ）の影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0025】
本発明は、プリン誘導体又はその塩を含有する悪性腫瘍治療剤又はトポイソメラーゼＩＩα阻害剤であり、本発明の一態様は、次の一般式（１）
【0026】
【化9】
【0027】
（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なって、水素原子又はハロゲン原子を示し、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を示す）
で表されるプリン誘導体又はその塩を含有する悪性腫瘍治療剤又はトポイソメラーゼＩＩα阻害剤である。
で表されるプリン誘導体又はその塩を含有する悪性腫瘍治療剤又はトポイソメラーゼＩＩα阻害剤である。
【0028】
式（１）中のＸ１及びＸ２は、同一又は異なって、水素原子又はハロゲン原子を示す。ここで、ハロゲン原子としては、塩素原子、臭素原子、フッ素原子、ヨウ素原子が挙げられるが、塩素原子、臭素原子又はフッ素原子が好ましく、塩素原子又はフッ素原子がより好ましく、塩素原子がさらに好ましい。
Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なって、水素原子又はハロゲン原子を示すが、Ｘ１がハロゲン原子、Ｘ２が水素原子又はハロゲン原子であるのが好ましい。より好ましくは、Ｘ１が塩素原子又はフッ素原子であり、Ｘ２水素原子、塩素原子又はフッ素原子である場合であり、さらに好ましくは、Ｘ１が塩素原子であり、Ｘ２水素原子又は塩素原子である場合である。
Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なって、水素原子又はハロゲン原子を示すが、Ｘ１がハロゲン原子、Ｘ２が水素原子又はハロゲン原子であるのが好ましい。より好ましくは、Ｘ１が塩素原子又はフッ素原子であり、Ｘ２水素原子、塩素原子又はフッ素原子である場合であり、さらに好ましくは、Ｘ１が塩素原子であり、Ｘ２水素原子又は塩素原子である場合である。
【0029】
式（１）中のＲ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を示す。ここで、炭素数１～６のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｔ－ブチル基、イソブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基などが挙げられる。このうち、炭素数１～４のアルキル基が好ましく、炭素数１～３のアルキル基がより好ましく、メチル基、エチル基がさらに好ましい。
Ｒ１とＲ２の組み合わせとしては、Ｒ１及びＲ２が水素原子の場合、Ｒ１及びＲ２が炭素数１～６のアルキル基の場合がより好ましい。Ｒ１及びＲ２が水素原子の場合、Ｒ１及びＲ２が炭素数１～４のアルキル基の場合がさらに好ましい。Ｒ１及びＲ２が水素原子の場合、Ｒ１及びＲ２が炭素数１～３のアルキル基の場合がよりさらに好ましい。Ｒ１及びＲ２が水素原子の場合、Ｒ１及びＲ２が炭素数１～２のアルキル基の場合がよりさらに好ましい。
Ｒ１とＲ２の組み合わせとしては、Ｒ１及びＲ２が水素原子の場合、Ｒ１及びＲ２が炭素数１～６のアルキル基の場合がより好ましい。Ｒ１及びＲ２が水素原子の場合、Ｒ１及びＲ２が炭素数１～４のアルキル基の場合がさらに好ましい。Ｒ１及びＲ２が水素原子の場合、Ｒ１及びＲ２が炭素数１～３のアルキル基の場合がよりさらに好ましい。Ｒ１及びＲ２が水素原子の場合、Ｒ１及びＲ２が炭素数１～２のアルキル基の場合がよりさらに好ましい。
【0030】
式（１）で表される化合物の塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩などの有機酸塩が挙げられる。また、式（１）で表される化合物には、種々の異性体が存在する場合があり、それらの異性体、異性体の混合物が含まれる。さらに、式（１）で表される化合物又はその塩の水和物も含まれる。
【0031】
式（１）の化合物又はその塩は、既に知られている化合物であり、それ自体公知の方法により製造することもできるし、市販品を購入することもできる。
【0032】
式（１）の化合物は、後記実施例に示すように、トポイソメラーゼＩＩα特異的阻害剤である。従って、多様な癌細胞に対してＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を形成し、広範囲の癌に対して優れた抗癌作用を示す。また、トポイソメラーゼＩＩα特異的阻害剤であるから、ドキソルビシンのような心毒性を示さず、安全性も高いものと考えられる。さらに、多くの抗癌剤に対して耐性を誘発する、薬剤排出Ｐ糖タンパク陽性癌細胞株に対して増殖抑制効果を示すことから、薬剤耐性の癌に対しても有効である。
【0033】
本発明の悪性腫瘍治療剤の対象癌としては、例えば頭頚部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、胆道癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、子宮体癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣腫瘍、骨・軟部肉腫、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、皮膚癌、脳腫瘍、中皮腫等が挙げられる。
【0034】
式（１）の化合物又はその塩を医薬として用いるにあたっては、必要に応じて薬学的担体と配合し、治療目的に応じて各種の投与形態（医薬組成物）を採用可能であり、該形態としては、例えば、経口剤、注射剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤等のいずれでもよい。これらの投与形態は、各々当業者に公知慣用の製剤方法により製造できる。
【0035】
薬学的担体としては、製剤素材として慣用の各種有機或いは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等として配合される。また、必要に応じて防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、安定化剤等の製剤添加物を用いることもできる。
経口用固形製剤を調製する場合は、式（１）の化合物に賦形剤、必要に応じて賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。
注射剤を調製する場合は、式（１）の化合物にｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤を製造することができる。
上記の各投与単位形態中に配合されるべき式（１）化合物の量は、これを適用すべき患者の症状により、或いはその剤形等により一定ではないが、一般に投与単位形態あたり、経口剤では約０．０５～１０００ｍｇ、注射剤では約０．０１～５００ｍｇ、坐剤では約１～１０００ｍｇとするのが望ましい。
また、上記投与形態を有する薬剤の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概には決定できないが、通常成人（体重５０ｋｇ）１日あたり約０．０５～５０００ｍｇ、好ましくは０．１～１０００ｍｇとすればよく、これを１日１回又は２～３回程度に分けて投与するのが好ましい。
経口用固形製剤を調製する場合は、式（１）の化合物に賦形剤、必要に応じて賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。
注射剤を調製する場合は、式（１）の化合物にｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤を製造することができる。
上記の各投与単位形態中に配合されるべき式（１）化合物の量は、これを適用すべき患者の症状により、或いはその剤形等により一定ではないが、一般に投与単位形態あたり、経口剤では約０．０５～１０００ｍｇ、注射剤では約０．０１～５００ｍｇ、坐剤では約１～１０００ｍｇとするのが望ましい。
また、上記投与形態を有する薬剤の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概には決定できないが、通常成人（体重５０ｋｇ）１日あたり約０．０５～５０００ｍｇ、好ましくは０．１～１０００ｍｇとすればよく、これを１日１回又は２～３回程度に分けて投与するのが好ましい。
【実施例0036】
次に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【0037】
実施例１
（方法）
ＤＳＢの検出には、ＤＳＢが形成された際に、損傷周辺箇所で起こるヒストンＨ２ＡＸのＳｅｒ１３９のリン酸化であるγＨ２ＡＸをフローサイトメトリー法により検出した。すなわち、接着細胞に化合物Ａを２４時間処理後、細胞をトリプシンにより剥離、洗浄後、γＨ２ＡＸ抗体混合の染色バッファーにより４℃条件でオーバーナイト染色した。フローサイトメーターにより細胞内のγＨ２ＡＸ量を測定、解析した。
（方法）
ＤＳＢの検出には、ＤＳＢが形成された際に、損傷周辺箇所で起こるヒストンＨ２ＡＸのＳｅｒ１３９のリン酸化であるγＨ２ＡＸをフローサイトメトリー法により検出した。すなわち、接着細胞に化合物Ａを２４時間処理後、細胞をトリプシンにより剥離、洗浄後、γＨ２ＡＸ抗体混合の染色バッファーにより４℃条件でオーバーナイト染色した。フローサイトメーターにより細胞内のγＨ２ＡＸ量を測定、解析した。
【0038】
（結果）
化合物Ａ（式（１）中、Ｘ１，Ｘ２＝Ｃｌ、Ｒ１，Ｒ２＝Ｈ）のＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）形成作用を図１に示す。
図１より、化合物Ａは、ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞及びＤＬＤ－１細胞のいずれの癌細胞に対して濃度依存的にＤＳＢ形成作用を有することがわかる。
化合物Ａ（式（１）中、Ｘ１，Ｘ２＝Ｃｌ、Ｒ１，Ｒ２＝Ｈ）のＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）形成作用を図１に示す。
図１より、化合物Ａは、ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞及びＤＬＤ－１細胞のいずれの癌細胞に対して濃度依存的にＤＳＢ形成作用を有することがわかる。
【0039】
実施例２
（方法）
細胞増殖解析には、代謝活性の指標であるＡＴＰを測定するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイを用いた。９６ウェルプレートに播種した細胞に化合物Ａを５日間処理した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ ２．０溶液を細胞に混合、プレートリーダーにより発光を検出、用量反応曲線を解析した。
細胞周期解析は、以下の方法により実施した。細胞に化合物Ａを２４時間処理、トリプシンにより細胞を剥離、洗浄後、７０％エタノールで細胞固定した。さらに洗浄後、ＲＮＡｓｅを処理、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ；ヨウ化プロピジウム）により染色した。フローサイトメーターにより細胞内のＰＩ量の測定、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍ細胞周期分布を解析した。
（方法）
細胞増殖解析には、代謝活性の指標であるＡＴＰを測定するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイを用いた。９６ウェルプレートに播種した細胞に化合物Ａを５日間処理した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ ２．０溶液を細胞に混合、プレートリーダーにより発光を検出、用量反応曲線を解析した。
細胞周期解析は、以下の方法により実施した。細胞に化合物Ａを２４時間処理、トリプシンにより細胞を剥離、洗浄後、７０％エタノールで細胞固定した。さらに洗浄後、ＲＮＡｓｅを処理、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ；ヨウ化プロピジウム）により染色した。フローサイトメーターにより細胞内のＰＩ量の測定、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍ細胞周期分布を解析した。
【0040】
（結果）
化合物Ａの癌細胞増殖抑制作用を図２に示す。図２より、化合物Ａは、ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞及びＤＬＤ－１細胞のいずれの癌細胞に対しても強い増殖抑制作用を有することがわかる。
化合物Ａの細胞周期に対する分布状態を示す。図３より、化合物Ａは、ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞及びＤＬＤ－１細胞においてＤＳＢの応答として起こるＧ２／Ｍ細胞周期アレストを引き起こすことがわかる。
化合物Ａの癌細胞増殖抑制作用を図２に示す。図２より、化合物Ａは、ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞及びＤＬＤ－１細胞のいずれの癌細胞に対しても強い増殖抑制作用を有することがわかる。
化合物Ａの細胞周期に対する分布状態を示す。図３より、化合物Ａは、ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞及びＤＬＤ－１細胞においてＤＳＢの応答として起こるＧ２／Ｍ細胞周期アレストを引き起こすことがわかる。
【0041】
実施例３
ＪＦＣＲ３９細胞パネル試験
（方法）
３９種類のがん細胞株から構成される細胞パネルＪＦＣＲ３９に対する化合物Ａの５０％細胞増殖阻害濃度（ＧＩ５０）を解析、細胞増殖阻害のスペクトル（フィンガープリント）を解析した。その後、化合物Ａのフィンガープリントを、２５０種類の標準物質のフィンガープリントデータベースと比較解析（ＣＯＭＰＡＲＥ解析）することで、作用機序の予測評価を実施した。
ＪＦＣＲ３９細胞パネル試験
（方法）
３９種類のがん細胞株から構成される細胞パネルＪＦＣＲ３９に対する化合物Ａの５０％細胞増殖阻害濃度（ＧＩ５０）を解析、細胞増殖阻害のスペクトル（フィンガープリント）を解析した。その後、化合物Ａのフィンガープリントを、２５０種類の標準物質のフィンガープリントデータベースと比較解析（ＣＯＭＰＡＲＥ解析）することで、作用機序の予測評価を実施した。
【0042】
ＪＦＣＲ３９細胞パネル試験は、以下の文献に従った。
Ｙａｍｏｒｉ Ｔ． Ｐａｎｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｖａｌｕａｂｌｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２００３；５２ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ７４－９．
ｈｔｔｐｓ：／／ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２８０－００３－０６４９－１
ＣＯＭＰＡＲＥ解析は、以下の文献に従った。
Ｐａｕｌｌ ＫＤ， Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ ＲＨ， Ｈｏｄｅｓ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓｐｌａｙ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｄｒｕｇｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ： ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅａｎ ｇｒａｐｈ ａｎｄ ＣＯＭＰＡＲＥ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ． Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ １９８９；８１：１０８８－９２．
ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｊｎｃｉ／８１．１４．１０８８
Ｙａｍｏｒｉ Ｔ． Ｐａｎｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｖａｌｕａｂｌｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２００３；５２ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ７４－９．
ｈｔｔｐｓ：／／ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２８０－００３－０６４９－１
ＣＯＭＰＡＲＥ解析は、以下の文献に従った。
Ｐａｕｌｌ ＫＤ， Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ ＲＨ， Ｈｏｄｅｓ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓｐｌａｙ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｄｒｕｇｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ： ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅａｎ ｇｒａｐｈ ａｎｄ ＣＯＭＰＡＲＥ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ． Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ １９８９；８１：１０８８－９２．
ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｊｎｃｉ／８１．１４．１０８８
【0043】
（結果）
各癌細胞株に対する化合物Ａのフィンガープリント（ＧＩ５０）を図４に示す。
図４中、Ｂｒｅｓｔは、乳癌細胞株に対する感受性を示す。ＣＮＳは、中枢神経系癌細胞株に対する感受性を示す。Ｃｏｌｏｎは、大腸癌細胞株に対する感受性を示す。Ｌｕｎｇは、肺癌細胞株に対する感受性を示す。Ｍｅｌａｎｏｍａは、メラノーマ細胞株に対する感受性を示す。Ｏｖａｒｉａｎは、卵巣癌細胞株に対する感受性を示す。Ｒｅｎａｌは、腎臓癌細胞株に対する感受性を示す。Ｓｔｏｍａｃｈは、胃癌細胞株に対する感受性を示す。Ｐｒｏｓｔａｔｅは、前立腺癌細胞株に対する感受性を示す。ＭＧ－ＭＩＤは、ＬｏｇＧＩ５０の平均値を示す。ＤｅｌｔａはＭＧ－ＭＩＤと最も感受性の高い細胞株のＬｏｇＧＩ５０の差を示す。Ｒａｎｇｅは、最も感受性の低い細胞株と感受性の高い細胞株のＬｏｇＧＩ５０の差を示す。
図４から、化合物Ａは、ほとんどすべての癌細胞に対して類似した濃度領域で細胞毒性を引き起こすことがわかる。また、化合物Ａは、薬剤排出Ｐ糖タンパク陽性株ＨＣＴ－１５（基質薬物：エトポシド、ドキソルビシン等）に対しても他の細胞株と同等の毒性作用を示し、薬剤耐性癌に対しても有効であることが示唆された。
化合物Ａに対する標準化合物とのＣＯＭＰＡＲＥ解析の結果を図５に示す。
図５から、化合物Ａは、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤である可能性が示唆された。
各癌細胞株に対する化合物Ａのフィンガープリント（ＧＩ５０）を図４に示す。
図４中、Ｂｒｅｓｔは、乳癌細胞株に対する感受性を示す。ＣＮＳは、中枢神経系癌細胞株に対する感受性を示す。Ｃｏｌｏｎは、大腸癌細胞株に対する感受性を示す。Ｌｕｎｇは、肺癌細胞株に対する感受性を示す。Ｍｅｌａｎｏｍａは、メラノーマ細胞株に対する感受性を示す。Ｏｖａｒｉａｎは、卵巣癌細胞株に対する感受性を示す。Ｒｅｎａｌは、腎臓癌細胞株に対する感受性を示す。Ｓｔｏｍａｃｈは、胃癌細胞株に対する感受性を示す。Ｐｒｏｓｔａｔｅは、前立腺癌細胞株に対する感受性を示す。ＭＧ－ＭＩＤは、ＬｏｇＧＩ５０の平均値を示す。ＤｅｌｔａはＭＧ－ＭＩＤと最も感受性の高い細胞株のＬｏｇＧＩ５０の差を示す。Ｒａｎｇｅは、最も感受性の低い細胞株と感受性の高い細胞株のＬｏｇＧＩ５０の差を示す。
図４から、化合物Ａは、ほとんどすべての癌細胞に対して類似した濃度領域で細胞毒性を引き起こすことがわかる。また、化合物Ａは、薬剤排出Ｐ糖タンパク陽性株ＨＣＴ－１５（基質薬物：エトポシド、ドキソルビシン等）に対しても他の細胞株と同等の毒性作用を示し、薬剤耐性癌に対しても有効であることが示唆された。
化合物Ａに対する標準化合物とのＣＯＭＰＡＲＥ解析の結果を図５に示す。
図５から、化合物Ａは、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤である可能性が示唆された。
【0044】
実施例４
（方法）
化合物ＡがトポイソメラーゼＩＩ阻害剤である可能性を検証するため、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤との競合阻害実験とトポイソメラーゼＩＩの機能欠失実験による機能解析を実施した。
競合阻害実験は、以下の方法により実施した。エトポシドと作用機序の異なるトポイソメラーゼＩＩ阻害剤のＩＣＲＦ－１９３処理１時間後、１０μＭのエトポシドもしくは化合物Ａを添加し、さらに２４時間処理した。その後、ＤＳＢを実施例１と同様の方法により検出した。
機能欠失実験は、はじめにＴｏｐ２α（ＴＯＰ２Ａの遺伝子産物）及びＴｏｐ２β（ＴＯＰ２Ｂの遺伝子産物）を標的としたｓｉＲＮＡによる遺伝子ノックダウン効率をウエスタンブロッティングにより解析した。その後、ノックダウン下において、１０μＭの化合物ＡによるＤＳＢ形成を解析した。
（方法）
化合物ＡがトポイソメラーゼＩＩ阻害剤である可能性を検証するため、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤との競合阻害実験とトポイソメラーゼＩＩの機能欠失実験による機能解析を実施した。
競合阻害実験は、以下の方法により実施した。エトポシドと作用機序の異なるトポイソメラーゼＩＩ阻害剤のＩＣＲＦ－１９３処理１時間後、１０μＭのエトポシドもしくは化合物Ａを添加し、さらに２４時間処理した。その後、ＤＳＢを実施例１と同様の方法により検出した。
機能欠失実験は、はじめにＴｏｐ２α（ＴＯＰ２Ａの遺伝子産物）及びＴｏｐ２β（ＴＯＰ２Ｂの遺伝子産物）を標的としたｓｉＲＮＡによる遺伝子ノックダウン効率をウエスタンブロッティングにより解析した。その後、ノックダウン下において、１０μＭの化合物ＡによるＤＳＢ形成を解析した。
【0045】
（結果）
化合物ＡとトポイソメラーゼＩＩ阻害剤（ＩＣＲＦ－１９３）の競合阻害実験の結果を図６に示す。単剤処理と比べ、ＩＣＲＦ－１９３との併用時では、化合物Ａにより形成されるＤＳＢ量は低下することを示した。この効果はエトポシドと同様であった。つまり、化合物ＡはトポイソメラーゼＩＩを標的としていることが示唆された。
図７に、ｓｉＲＮＡによるノックダウン効率の結果を示す。ｓｉＲＮＡにより、Ｔｏｐ２α及びＴｏｐ２βの発現量は有意に低下していることが示された。
図８に、トポイソメラーゼＩＩに対する機能欠失実験の結果を示す。Ｔｏｐ２α及びＴｏｐ２βのノックダウン下における化合物ＡのＤＳＢ形成作用を調べたところ、Ｔｏｐ２αのノックダウン下で、顕著に当該作用が抑制されることを示した。一方で、Ｔｏｐ２βに対してはそのような作用は見られなかった。したがって、化合物Ａは、Ｔｏｐ２αの特異的な阻害剤であることが示唆された。
化合物ＡとトポイソメラーゼＩＩ阻害剤（ＩＣＲＦ－１９３）の競合阻害実験の結果を図６に示す。単剤処理と比べ、ＩＣＲＦ－１９３との併用時では、化合物Ａにより形成されるＤＳＢ量は低下することを示した。この効果はエトポシドと同様であった。つまり、化合物ＡはトポイソメラーゼＩＩを標的としていることが示唆された。
図７に、ｓｉＲＮＡによるノックダウン効率の結果を示す。ｓｉＲＮＡにより、Ｔｏｐ２α及びＴｏｐ２βの発現量は有意に低下していることが示された。
図８に、トポイソメラーゼＩＩに対する機能欠失実験の結果を示す。Ｔｏｐ２α及びＴｏｐ２βのノックダウン下における化合物ＡのＤＳＢ形成作用を調べたところ、Ｔｏｐ２αのノックダウン下で、顕著に当該作用が抑制されることを示した。一方で、Ｔｏｐ２βに対してはそのような作用は見られなかった。したがって、化合物Ａは、Ｔｏｐ２αの特異的な阻害剤であることが示唆された。
【0046】
実施例５
実施例１と同様にして、化合物Ａと類似の化合物について、ＤＳＢ形成作用を検討した。
その結果を、図９に示す。図９より、化合物Ａと類似の化合物Ｂ（式（１）中、Ｘ１，Ｘ２＝Ｃｌ、Ｒ１，Ｒ２＝Ｃ２Ｈ５）も、強力なＤＳＢ形成作用を示した。なお、化合物Ｃ（式（１）中、Ｘ１＝Ｃｌ、Ｘ２＝Ｈ、Ｒ１，Ｒ２＝Ｃ２Ｈ５）も、ＤＳＢ形成作用を示した。
実施例１と同様にして、化合物Ａと類似の化合物について、ＤＳＢ形成作用を検討した。
その結果を、図９に示す。図９より、化合物Ａと類似の化合物Ｂ（式（１）中、Ｘ１，Ｘ２＝Ｃｌ、Ｒ１，Ｒ２＝Ｃ２Ｈ５）も、強力なＤＳＢ形成作用を示した。なお、化合物Ｃ（式（１）中、Ｘ１＝Ｃｌ、Ｘ２＝Ｈ、Ｒ１，Ｒ２＝Ｃ２Ｈ５）も、ＤＳＢ形成作用を示した。
【0047】
実施例６
Ｉｎ ｖｉｖｏ
（方法）
腫瘍移植モデルとして、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの下肢部皮下に、ＤＬＤ－１細胞を移植した。腫瘍体積が約３００ｍｍ３に達した個体に対し、平日の週５日間連続で、化合物Ａ（５０ｍｇ／ｋｇ）もしくはエトポシド（２０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。マウスの体重及び腫瘍体積は、週３回（１日もしくは２日おき）、測定した。観察終了後、処死したマウスから腫瘍を摘出し、腫瘍重量を測定した。
Ｉｎ ｖｉｖｏ
（方法）
腫瘍移植モデルとして、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの下肢部皮下に、ＤＬＤ－１細胞を移植した。腫瘍体積が約３００ｍｍ３に達した個体に対し、平日の週５日間連続で、化合物Ａ（５０ｍｇ／ｋｇ）もしくはエトポシド（２０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。マウスの体重及び腫瘍体積は、週３回（１日もしくは２日おき）、測定した。観察終了後、処死したマウスから腫瘍を摘出し、腫瘍重量を測定した。
【0048】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
