(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024040374
(43)【公開日】2024-03-25
(54)【発明の名称】高純度ステビオールグリコシド
(51)【国際特許分類】
C12P 19/56 20060101AFI20240315BHJP
C12P 19/18 20060101ALN20240315BHJP
【ＦＩ】
C12P19/56
C12P19/18 ZNA
【審査請求】有
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024019488
(22)【出願日】2024-02-13
(62)【分割の表示】P 2022030027の分割
【原出願日】2013-03-12
(31)【優先権主張番号】61/649,978
(32)【優先日】2012-05-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】514297903
【氏名又は名称】ピュアサークル スンディリアン ブルハド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100108903
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 和広
(74)【代理人】
【識別番号】100142387
【弁理士】
【氏名又は名称】齋藤 都子
(74)【代理人】
【識別番号】100135895
【弁理士】
【氏名又は名称】三間 俊介
(74)【代理人】
【識別番号】100150810
【弁理士】
【氏名又は名称】武居 良太郎
(72)【発明者】
【氏名】マルコシャン、アヴェティク
(72)【発明者】
【氏名】プラカシュ、インドラ
(72)【発明者】
【氏名】プラカシュ チャチュールヴェデュラ、ヴァンカタ サイ
(72)【発明者】
【氏名】ジャリン、シリル
(72)【発明者】
【氏名】ローブ、パトリック
(72)【発明者】
【氏名】テル アル、ロブ
(57)【要約】
【課題】本発明は、高度に精製されたステビオールグリコシド、特にレバウジオシドＡ、Ｄ及びＸの調製方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明の方法は、ステビア・レバウディアナ・ベルトニ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ Ｂｅｒｔｏｎｉ）由来のＵＤＰ－グルコース転移酵素（ある種のステビオールグリコシドをレバウジオシドＡ、Ｄ及びＸに変換できる）の発現を含む。高度に精製されたレバウジオシドＡ、Ｄ及びＸは、任意の飲料、菓子類、パン類、クッキー及びチューインガムなどの食用及びかみ砕ける組成物におけるノンカロリー甘味料として有用である。
【選択図】なし
【解決手段】本発明の方法は、ステビア・レバウディアナ・ベルトニ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ Ｂｅｒｔｏｎｉ）由来のＵＤＰ－グルコース転移酵素（ある種のステビオールグリコシドをレバウジオシドＡ、Ｄ及びＸに変換できる）の発現を含む。高度に精製されたレバウジオシドＡ、Ｄ及びＸは、任意の飲料、菓子類、パン類、クッキー及びチューインガムなどの食用及びかみ砕ける組成物におけるノンカロリー甘味料として有用である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ステビオールグリコシド基質に少なくとも１つのグルコース単位を付加して、目標ステビオールグリコシドを提供する方法であって、ステビオールグリコシド基質を、ＵＧＴ７６Ｇ１を含む生体触媒タンパク質酵素と接触させることを含み、ステビオールグリコシド基質がレバウジオシドＤであり、目標ステビオールグリコシドがレバウジオシドＸである、方法。
【請求項2】
レバウジオシドＸを約８０重量％より高い純度に精製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
レバウジオシドＸを約９０重量％より高い純度に精製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
レバウジオシドＸを約９５重量％より高い純度に精製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
ＵＤＰ－グルコース転移酵素が宿主微生物において発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
宿主微生物が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母菌種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、アスペルギルス菌種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、及びピキア菌種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野
本発明は、高度に精製されたステビオールグリコシド組成物を含め、ステビオールグリコシドを含む組成物を調製するための生体触媒プロセスに関する
本発明は、高度に精製されたステビオールグリコシド組成物を含め、ステビオールグリコシドを含む組成物を調製するための生体触媒プロセスに関する
【0002】
配列表の参照による組み込み
２０１３年３月１２日に作成され、５ＫＢ（キロバイト）のデータを有し、本明細書と共に提出された「ＰｕｒｅＣｉｒｃｌｅ ２２ＰＣＴ ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題するテキストファイルは、その全体が参照により本出願に組み込まれる。
２０１３年３月１２日に作成され、５ＫＢ（キロバイト）のデータを有し、本明細書と共に提出された「ＰｕｒｅＣｉｒｃｌｅ ２２ＰＣＴ ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題するテキストファイルは、その全体が参照により本出願に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
高甘味度甘味料は、ショ糖の甘味レベルよりも何倍も高い甘味レベルを有する。それらは本質的にノンカロリーであり、食物及び飲料を含むダイエット製品及び低カロリー製品に一般的に使用されている。高甘味度甘味料は、血糖反応を誘発せず、それらを糖尿病患者及び炭水化物の摂取を制限することに関心がある人を対象とする製品における使用に適している。
【0004】
ステビオールグリコシドは、南アメリカの一定の地域を原産とするキク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）（コンポシタエ（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ））の多年生の低木ステビア・レバウディアナ・ベルトニ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ Ｂｅｒｔｏｎｉ）の葉において見出された化合物の一部類である。それらは、単一の基幹物質ステビオールによって構造的に特徴付けられ、位置Ｃ１３及びＣ１９の炭水化物残基の存在によって異なっている。それらは、ステビア属の葉に蓄積する（全乾燥重量のおよそ１０％～２０％含まれる）。乾燥重量を基に、ステビア属の葉に見出される４種の主なグリコシドは、典型的にはステビオシド（９．１％）、レバウジオシドＡ（３．８％）、レバウジオシドＣ（０．６～１．０％）及びズルコシド（ｄｕｌｃｏｓｉｄｅ）Ａ（０．３％）を含む。他の公知のステビオールグリコシドは、レバウジオシドＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＸ、ステビオールビオシド（ｓｔｅｖｉｏｌｂｉｏｓｉｄｅ）並びにルブソシド（ｒｕｂｕｓｏｓｉｄｅ）を含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
ステビア・レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）からステビオールグリコシドを調製するための方法は公知であるが、これらの方法の多くは商業的使用のために不適である。
【0006】
したがって、高度に精製されたステビオールグリコシド組成物を含む、ステビオールグリコシドを含む組成物を調製するための簡易で、効率的及び経済的な方法に対する必要性は残っている。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、ステビオールグリコシド基質を含む出発組成物をＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触させるステップ、それによりステビオールグリコシド基質よりも１つ又は複数の追加のグルコース単位を含む目標ステビオールグリコシドを含む組成物を産生するステップによって目標ステビオールグリコシドを含む組成物を調製するための生体触媒プロセスを提供する。
【0008】
出発組成物は、少なくとも１つのステビオールグリコシド基質を含む任意の組成物であってよい。一実施形態では、ステビオールグリコシド基質は、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、ズルコシドＢ、ズルコシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＧ、ステビオシド、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＨ、レバウジオシドＬ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＸ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ、合成ステビオールグリコシド又はこれらの組合せからなる群から選択される。出発組成物は、商業的に入手可能である又は調製される場合がある。出発組成物は、精製されたステビオールグリコシド基質又は部分精製されたステビオールグリコシド基質を含んでよい。
【0009】
一実施形態では、ステビオールグリコシド基質は、ルブソシドである。
【0010】
別の実施形態では、ステビオールグリコシド基質は、ステビオシドである。
【0011】
さらに別の実施形態では、ステビオールグリコシド基質は、レバウジオシドＡである。
【0012】
またさらに別の実施形態では、ステビオールグリコシド基質は、レバウジオシドＤである。
【0013】
目標ステビオールグリコシドは、任意の公知のステビオールグリコシドであってよい。一実施形態では、目標ステビオールグリコシドは、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、ズルコシドＢ、ズルコシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＧ、ステビオシド、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＨ、レバウジオシドＬ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＸ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ又は合成ステビオールグリコシドである。
【0014】
一実施形態では、目標ステビオールグリコシドは、ステビオシドである。
【0015】
別の実施形態では、目標ステビオールグリコシドは、レバウジオシドＡである。
【0016】
さらに別の実施形態では、目標ステビオールグリコシドは、レバウジオシドＤである。
【0017】
またさらに別の実施形態では、目標ステビオールグリコシドは、レバウジオシドＸである。
【0018】
ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、目標ステビオールグリコシドをもたらすように少なくとも１つのグルコース単位をステビオールグリコシド基質に付加できる任意のＵＤＰ－グルコース転移酵素であってよい。一実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、宿主において産生される。宿主は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母菌種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、アスペルギルス菌種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、ピキア菌種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）でもよい。別の実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素は合成される。
【0019】
ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、遊離、固定化又は全細胞系を含む任意の好適な形態で提供できる。ＵＤＰ－グルコース転移酵素の純度は、変化してもよい、例えば、未精製、半精製又は精製された酵素調製物（単数又は複数）として提供し得る。
【0020】
一実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素は遊離している。別の実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、例えば、無機又は有機支持体上に固定されている。さらに別の実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、全細胞系の形態で（例えば、微生物生細胞として）又は細胞可溶化物の形態で提供される。
【0021】
一実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、ステビオシドを形成するように少なくとも１つのグルコース単位をルブソシドに付加できる任意のＵＤＰ－グルコース転移酵素である。特定の実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素はＵＧＴ９１Ｄ２である。
【0022】
一実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、レバウジオシドＡを形成するように少なくとも１つのグルコース単位をステビオシドに付加できる任意のＵＤＰ－グルコース転移酵素である。特定の実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素はＵＧＴ７６Ｇ１である。
【0023】
別の実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、レバウジオシドＤを形成するように少なくとも１つのグルコース単位をレバウジオシドＡに付加できる任意のＵＤＰ－グルコース転移酵素である。特定の実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素はＵＧＴ９１Ｄ２である。
【0024】
さらに別の実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、レバウジオシドＸを形成するように少なくとも１つのグルコース単位をレバウジオシドＤに付加できる任意のＵＤＰ－グルコース転移酵素である。特定の実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素はＵＧＴ７６Ｇ１である。
【0025】
本発明の方法は、任意選択で、ＵＤＰを再利用して、ＵＤＰ－グルコースを得るステップをさらに含む。一実施形態では、該方法は、再利用触媒及び再利用基質を得ることにより、ＵＤＰを再利用するステップを含み、それにより、ステビオールグリコシド基質の目標ステビオールグリコシドへの生体内変換が触媒量のＵＤＰ－グルコース転移酵素及びＵＤＰ－グルコースを使用して実行される（図３）。
【0026】
一実施形態では、再利用触媒は、ショ糖合成酵素である。
【0027】
一実施形態では、再利用基質は、ショ糖である。
【0028】
本発明の方法は、任意選択で、出発組成物から目標ステビオールグリコシドを分離するステップをさらに含む。目標ステビオールグリコシドは、例えば、結晶化、膜による分離、遠心分離、抽出、クロマトグラフィー分離又はそのような方法の組合せなどの任意の好適な方法によって分離できる。
【0029】
一実施形態では、分離により、無水物として約８０重量％より多い目標ステビオールグ
リコシドを含む組成物、すなわち高度に精製されたステビオールグリコシド組成物が産生される。別の実施形態では、分離により、約９０重量％より多い目標ステビオールグリコシドを含む組成物が産生される。特定の実施形態では、組成物は、約９５重量％より多い目標ステビオールグリコシドを含む。
リコシドを含む組成物、すなわち高度に精製されたステビオールグリコシド組成物が産生される。別の実施形態では、分離により、約９０重量％より多い目標ステビオールグリコシドを含む組成物が産生される。特定の実施形態では、組成物は、約９５重量％より多い目標ステビオールグリコシドを含む。
【0030】
目標ステビオールグリコシドは、水和物、溶媒和物、無水物又はこれらの組合せを含め、任意の多形又はアモルファス形態でもよい。
【0031】
精製された目標ステビオールグリコシドは、消費製品において甘味料として使用できる。好適な消費製品は、これだけに限らないが、食物、飲料、医薬組成物、タバコ製品、栄養補助組成物、口腔衛生組成物及び化粧用組成物を含む。
【0032】
添付の図は、本発明の理解を深めるために含まれている。図は、本発明の実施形態を本発明の実施形態の原理を説明するための記載と共に例示する。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】ｒｅｂ Ｘの構造を示す図である。
【図2】ステビオシドからのｒｅｂ Ｘの生体触媒産生を示す図である。
【図3】酵素ＵＧＴ７６Ｇ１を使用するステビオシドからのｒｅｂ Ａの生体触媒産生と同時にショ糖合成酵素を介するＵＤＰグルコースへのＵＤＰの再利用を示す図である。
【図4】ｒｅｂ ＸのＩＲスペクトルを示す図である。
【図5】実施例１４に詳述する、ｒｅｂ Ｄからのｒｅｂ Ｘの生体触媒産生の生成物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。保持時間２４．１６５分のピークは未反応ｒｅｂ Ｄに対応する。保持時間３１．３２５分のピークはｒｅｂ Ｘに対応する。
【図6】ｒｅｂ Ｄから生体触媒作用によって産生された精製ｒｅｂ ＸのＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図7】ｒｅｂ Ｘ標準物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図8】ｒｅｂ Ｘ標準物と、ｒｅｂ Ｄからの生体内変換由来の精製されたｒｅｂ Ｘとの同時注入のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図9】ｒｅｂ Ｘ標準物及びｒｅｂ Ｄからの生合成後に精製されたｒｅｂ Ｘの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを重ねて示す図である。
【図10】ｒｅｂ Ｄからの生体触媒産生後に精製されたｒｅｂ ＸのＨＲＭＳスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0034】
本発明は、ステビオールグリコシド基質を含む出発組成物からの目標ステビオールグリコシドを含む組成物の調製のための生体触媒プロセスであって、目標ステビオールグリコシドがステビオールグリコシド基質よりも１つ又は複数の追加のグルコース単位を含むプロセスを提供する。
【0035】
本発明の１つの目的は、ステビオールグリコシド（特にステビオシド、ｒｅｂ Ａ、ｒｅｂ Ｄ及びｒｅｂ Ｘ）を他のステビオールグリコシド及び／又はこれらの組合せから調製するための効率的な生体触媒法を提供することである。
【0036】
本明細書において使用される「生体触媒作用」又は「生体触媒の」は、有機化合物に対する化学的転換を実施するためのタンパク質酵素などの天然触媒の使用を指す。生体触媒
作用は、代替的に生体内変換又は生合成としても公知である。単離された及び全細胞の両方の生体触媒作用法は、当技術分野において公知である。生体触媒タンパク質酵素は、天然に存在する又は組換えのタンパク質であってよい。
作用は、代替的に生体内変換又は生合成としても公知である。単離された及び全細胞の両方の生体触媒作用法は、当技術分野において公知である。生体触媒タンパク質酵素は、天然に存在する又は組換えのタンパク質であってよい。
【0037】
本明細書において使用される用語「ステビオールグリコシド（単数又は複数）」は、これだけに限らないが天然に存在するステビオールグリコシド（例えば、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、ズルコシドＢ、ズルコシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＧ、ステビオシド、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＨ、レバウジオシドＬ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＸ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ）、合成ステビオールグリコシド（例えば、酵素的にグリコシル化されたステビオールグリコシド）及びこれらの組合せを含むステビオールのグリコシドを指す。
【0038】
ステビオール及びそのグリコシドの化学構造
【0039】
【化1】
【0040】
【表1】
【0041】
出発組成物
本明細書において使用される「出発組成物」は、１つ又は複数のステビオールグリコシドを含有する任意の組成物（一般に水溶液）を指し、１つ又は複数のステビオールグリコシドは、生体内変換のための基質として作用する。
本明細書において使用される「出発組成物」は、１つ又は複数のステビオールグリコシドを含有する任意の組成物（一般に水溶液）を指し、１つ又は複数のステビオールグリコシドは、生体内変換のための基質として作用する。
【0042】
一実施形態では、出発組成物は、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、ズルコシドＢ、ズルコシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＧ、ステビオシド、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＨ、レバウジオシドＬ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＸ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ又は合成ステビオールグリコシドからなる群から選択される１つ又は複数のステビオールグリコシドを含む。特定の実施形態では、出発組成物は、２つ以上のステビオールグリコシドを含む。
【0043】
一実施形態では、出発組成物は、ステビオールグリコシド基質ルブソシドを含む。
【0044】
一実施形態では、出発組成物は、ステビオールグリコシド基質ステビオシドを含む。
【0045】
別の実施形態では、出発組成物は、ステビオールグリコシド基質レバウジオシドＡを含む。
【0046】
さらに別の実施形態では、出発組成物は、ステビオールグリコシド基質レバウジオシドＤを含む。
【0047】
出発組成物は、合成品又は精製（部分若しくは完全精製）、市販品又は調製品でもよい。本発明の方法において有用な出発組成物の一例は、ステビア・レバウディアナ植物材料（例えば、葉）の精製から得られる抽出物である。出発組成物の別の例は、溶媒で溶液にした市販のステビア抽出物である。出発組成物のさらに別の例は、溶媒で溶液にした市販のステビオールグリコシドの混合物である。他の好適な出発組成物は、ステビオールグリコシドを単離及び精製するためのプロセスの副産物を含む。
【0048】
一実施形態では、出発組成物は、精製されたステビオールグリコシド基質を含む。例えば、出発組成物は、乾物基準で約９９重量％より多い特定の基質ステビオールグリコシドを含む場合もある。
【0049】
別の実施形態では、出発組成物は、部分精製された基質ステビオールグリコシド組成物を含む。例えば、出発組成物は、乾物基準で約５０重量％、約６０重量％、約７０重量％、約８０重量％又は約９０重量％より多い特定の基質ステビオールグリコシドを含有する。
【0050】
一実施形態では、出発組成物は、精製されたルブソシドを含む。特定の実施形態では、出発組成物は、乾物基準で＞９９重量％ルブソシドを含有する。別の実施形態では、出発組成物は、部分精製されたルブソシドを含む。特定の実施形態では、出発組成物は、乾物基準で約５０重量％、約６０重量％、約７０重量％、約８０重量％又は約９０重量％より多いルブソシドを含有する。
【0051】
一実施形態では、出発組成物は、精製されたステビオシドを含む。特定の実施形態では、出発組成物は、乾物基準で＞９９重量％ステビオシドを含有する。別の実施形態では、出発組成物は、部分精製されたステビオシドを含む。特定の実施形態では、出発組成物は、乾物基準で約５０重量％、約６０重量％、約７０重量％、約８０重量％又は約９０重量％より多いステビオシドを含有する。
【0052】
別の実施形態では、出発組成物は、精製されたレバウジオシドＡを含む。特定の実施形態では、出発組成物は、乾物基準で約９９重量％より多いレバウジオシドＡを含有する。別の実施形態では、出発組成物は、部分精製されたレバウジオシドＡを含む。特定の実施形態では、出発組成物は、乾物基準で約５０重量％、約６０重量％、約７０重量％、約８０重量％又は約９０重量％より多いレバウジオシドＡを含有する。
【0053】
さらに別の実施形態では、出発組成物は、精製されたレバウジオシドＤを含む。特定の実施形態では、出発組成物は、乾物基準で約９９重量％より多いレバウジオシドＤを含有する。別の実施形態では、出発組成物は、部分精製されたレバウジオシドＤを含む。特定の実施形態では、出発組成物は、乾物基準で約５０重量％、約６０重量％、約７０重量％、約８０重量％又は約９０重量％より多いレバウジオシドＤを含有する。
【0054】
出発組成物のステビオールグリコシド構成成分（単数又は複数）は、本明細書に記載のとおり目標ステビオールグリコシド（単数又は複数）の産生のための基質（単数又は複数）の役割を果たす。目標ステビオールグリコシド標的（単数又は複数）は、１つ又は複数のグルコース単位の付加によってその対応するステビオールグリコシド基質（単数又は複数）とは化学的に異なる。
【0055】
目標ステビオールグリコシド
本方法の目標ステビオールグリコシドは、本明細書で開示するプロセスによって調製で
きる任意のステビオールグリコシドであってよい。一実施形態では、目標ステビオールグリコシドは、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、ズルコシドＢ、ズルコシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＧ、ステビオシド、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＨ、レバウジオシドＬ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＸ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＮ又はレバウジオシドＯからなる群から選択される。
本方法の目標ステビオールグリコシドは、本明細書で開示するプロセスによって調製で
きる任意のステビオールグリコシドであってよい。一実施形態では、目標ステビオールグリコシドは、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、ズルコシドＢ、ズルコシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＧ、ステビオシド、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＨ、レバウジオシドＬ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＸ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＮ又はレバウジオシドＯからなる群から選択される。
【0056】
一実施形態では、目標ステビオールグリコシドは、ステビオシドである。別の実施形態では、目標ステビオールグリコシドはｒｅｂ Ａである。さらに別の実施形態では、目標ステビオールグリコシドはｒｅｂ Ｄである。またさらに別の実施形態では、目標ステビオールグリコシドはｒｅｂ Ｘである。
【0057】
目標ステビオールグリコシドは、水和物、溶媒和物、無水物又はこれらの組合せを含む任意の多形性又はアモルファス形態であってよい。
【0058】
一実施形態では、本発明は、ルブソシドからのステビオシドの産生のための生体触媒プロセスであり、出発組成物はステビオールグリコシド基質ルブソシドを含む。特定の実施形態では、本発明は、ルブソシドからのステビオシドの産生のための生体触媒プロセスであり、出発組成物は部分精製されたルブソシドを含む。別の特定の実施形態では、本発明は、ルブソシドからのステビオシドの産生のための生体触媒プロセスであり、出発組成物は精製されたルブソシドを含む。
【0059】
一実施形態では、本発明は、ステビオシドからのｒｅｂ Ａの産生のための生体触媒プロセスであり、出発組成物はステビオールグリコシド基質ステビオシドを含む。特定の実施形態では、本発明は、ステビオシドからのｒｅｂ Ａの産生のための生体触媒プロセスであり、出発組成物は部分精製されたステビオシドを含む。別の特定の実施形態では、本発明は、ステビオシドからのｒｅｂ Ａの産生のための生体触媒プロセスであり、出発組成物は精製されたステビオシドを含む。
【0060】
別の実施形態では、本発明は、ｒｅｂ Ａからのｒｅｂ Ｄの産生のための生体触媒プロセスであり、出発組成物はステビオールグリコシド基質ｒｅｂ Ａを含む。特定の実施形態では、本発明は、ｒｅｂ Ａからのｒｅｂ Ｄの産生のための生体触媒プロセスであり、出発組成物は部分精製されたｒｅｂ Ａを含む。別の特定の実施形態では、本発明は、ｒｅｂ Ａからのｒｅｂ Ｄの産生のための生体触媒プロセスであり、出発組成物は精製されたｒｅｂ Ａを含む。
【0061】
さらに別の実施形態では、本発明は、ｒｅｂ Ｄからのｒｅｂ Ｘの産生のための生体触媒プロセスであり、出発組成物はステビオールグリコシド基質ｒｅｂ Ｄを含む。特定の実施形態では、本発明は、ｒｅｂ Ｄからのｒｅｂ Ｘの産生のための生体触媒プロセスであり、出発組成物は部分精製されたｒｅｂ Ｄを含む。別の特定の実施形態では、本発明は、ｒｅｂ Ｄからのｒｅｂ Ｘの産生のための生体触媒プロセスであり、出発組成物は精製されたｒｅｂ Ｄを含む。
【0062】
特定の実施形態では、目標ステビオールグリコシドは、混合物中に存在する。例えば、一実施形態では、目標ステビオールグリコシドは、混合物中に存在するｒｅｂ Ｘである。一実施形態では、目標ステビオールグリコシドの純度は、出発組成物中に存在する目標ステビオールグリコシドの純度と比較して高められている。例えば、出発組成物中に存在するｒｅｂ Ｘの純度は、本発明の方法を実行する結果として高められている。
【0063】
本発明の方法は、任意選択で、出発組成物から目標ステビオールグリコシドを分離するステップをさらに含む。目標ステビオールグリコシドは例えば、結晶化、膜による分離、遠心分離、抽出、クロマトグラフィー分離又はそのような方法の組合せなどの任意の好適な方法によって分離できる。
【0064】
特定の実施形態では、本明細書に記載のプロセスは、高度に精製された目標ステビオールグリコシド組成物を生じる。本明細書において使用される用語「高度に精製された」は、無水物として約８０重量％より多い目標ステビオールグリコシドを含む組成物を指す。一実施形態では、高度に精製された目標ステビオールグリコシド組成物は、例えば、乾物基準で９１％、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超又は約９９％超の目標ステビオールグリコシド含有量などの、無水物として約９０重量％より多い目標ステビオールグリコシドを含有する。
【0065】
さらに特定の実施形態では、目標ステビオールグリコシドがｒｅｂ Ｘである場合、本明細書に記載のプロセスは乾物基準で約９０重量％より多いｒｅｂ Ｘ含有量を有する組成物を提供する。別の特定の実施形態では、目標ステビオールグリコシドがｒｅｂ Ｘである場合、本明細書に記載のプロセスは乾物基準で約９５重量％より多いｒｅｂ Ｘ含有量を含む組成物を提供する。
【0066】
別の特定の実施形態では、目標ステビオールグリコシドがｒｅｂ Ｄである場合、本明細書に記載のプロセスは乾物基準で約９０重量％より多いｒｅｂ Ｄ含有量の組成物を提供する。別の特定の実施形態では、目標ステビオールグリコシドがｒｅｂ Ｄである場合、本明細書に記載のプロセスは乾物基準で約９５重量％より多いｒｅｂ Ｄ含有量を含む組成物を提供する。
【0067】
さらに別の特定の実施形態では、目標ステビオールグリコシドがｒｅｂ Ａである場合、本明細書に記載のプロセスは乾物基準で約９０重量％より多いｒｅｂ Ａ含有量を含む組成物を提供する。別の特定の実施形態では、目標ステビオールグリコシドがｒｅｂ Ａである場合、本明細書に記載のプロセスは乾物基準で約９５重量％より多いｒｅｂ Ａ含有量を含む組成物を提供する。
【0068】
またさらに別の特定の実施形態では、目標ステビオールグリコシドがステビオシドである場合、本明細書に記載のプロセスは乾物基準で約９０重量％より多いステビオシド含有量を含む組成物を提供する。別の特定の実施形態では、目標ステビオールグリコシドがステビオシドである場合、本明細書に記載のプロセスは乾物基準で約９５重量％より多いステビオシド含有量を含む組成物を提供する。
【0069】
一実施形態では、本発明の生体触媒法は、１回より多く実行され、第一の生体触媒プロセスによって産生される目標ステビオールグリコシドは、目標ステビオールグリコシドが産生される第二の生体触媒プロセスのためのステビオールグリコシド基質（中間目標ステビオールグリコシドであるとも考えられる）としての役割を果たす。
【0070】
特定の実施形態では、本発明は、ステビオールグリコシド基質を含む出発組成物をＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触させるステップ、それによりステビオールグリコシド基質よりも１つ又は複数の追加のグルコース単位を含む中間目標ステビオールグリコシドを含む組成物を産生するステップ；中間目標ステビオールグリコシドを含む組成物をＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触させるステップ、それにより中間目標ステビオールグリコシドよりも１つ又は複数の追加のグルコース単位を含む目標ステビオールグリコシドを産生するステップによって、目標ステビオールグリコシドを含む組成物を調製するための生体触媒プロセスを提供する。方法が実行される回数に応じて、目標ステビオールグリコシドの産生に関与する１つ又は複数の中間目標ステビオールグリコシド（例えば、第一の中間目標ステビオールグリコシド、第二の中間目標ステビオールグリコシド、第三の中間目標ステビオールグリコシド）がある場合がある。
【0071】
ＵＤＰ－グルコース転移酵素
本方法は生体触媒性である、すなわち生物学的触媒を利用する。一実施形態では、生体触媒は、タンパク質酵素である。特定の実施形態では、生体触媒は、ＵＤＰ－グルコース転移酵素である。ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、目標ステビオールグリコシドをもたらすように少なくとも１つのグルコース単位をステビオールグリコシド基質に付加できる任意のＵＤＰ－グルコース転移酵素でもよい。
本方法は生体触媒性である、すなわち生物学的触媒を利用する。一実施形態では、生体触媒は、タンパク質酵素である。特定の実施形態では、生体触媒は、ＵＤＰ－グルコース転移酵素である。ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、目標ステビオールグリコシドをもたらすように少なくとも１つのグルコース単位をステビオールグリコシド基質に付加できる任意のＵＤＰ－グルコース転移酵素でもよい。
【0072】
一実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、微生物などの宿主において産生される。例えば、ＵＤＰ－グルコース転移酵素をコードするＤＮＡ配列は、発現ベクターにクローニングされ、微生物（例えば、細菌）などの産生宿主に移入される。好適な宿主の非限定的例は、大腸菌、酵母菌種、アスペルギルス菌種、ピキア菌種を含む。過剰発現タンパク質は、その物理的及び化学的特性に基づいて当技術分野において公知の技術を使用して細胞抽出物から単離できる。宿主からＵＤＰ－グルコース転移酵素を単離するための代表的な非限定的技術は、遠心分離、電気泳動、液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー又は親和性クロマトグラフィーを含む。
【0073】
ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、未精製、半精製及び精製された酵素調製物（単数又は複数）として提供できる。
【0074】
一実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素は遊離している。別の実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素は固定されている。例えば、ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、無機又は有機材料から作られた固体支持体に固定されている場合がある。ＵＤＰ－グルコース転移酵素を固定するために好適な固体支持体の非限定的例は、誘導体化セルロース若しくはガラス、セラミックス、金属酸化物又は膜を含む。ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、例えば、共有結合、吸着、架橋結合、封入又はカプセル化によって固体支持体に固定される場合がある。
【0075】
変換のための反応媒体は、一般に水性（例えば、精製水、緩衝液又はこれらの組合せ）である。特定の実施形態では、反応媒体は緩衝液である。好適な緩衝液は、これだけに限らないがＰＩＰＥＳ緩衝液、酢酸緩衝液及びリン酸緩衝液を含む。特定の実施形態では、反応媒体はリン酸緩衝液である。反応媒体は、代替的に有機溶媒であってもよい。
【0076】
一実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、微生物生細胞などの全細胞系の形態で提供される。全細胞系は、任意選択で、酵素の固定化に関して上に特定した技術を利用して同様に固定されていてもよい。
【0077】
一実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、ルブソシドに少なくとも１つのグルコース単位を付加でき、それによりステビオシドを産生できる任意のＵＤＰ－グルコース転移酵素である。ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、例えば、ＵＧＴ９１Ｄ２であってもよい。
【0078】
別の実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、ステビオシドに少なくとも１つのグルコース単位を付加でき、それによりレバウジオシドＡを産生できる任意のＵＤＰ－グルコース転移酵素である。ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１であってもよい。
【0079】
さらに別の実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、レバウジオシドＡに少なくとも１つのグルコース単位を付加でき、それによりレバウジオシドＤを産生できる任意のＵＤＰ－グルコース転移酵素である。ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、例えば、ＵＧＴ９１Ｄ２であってもよい。
【0080】
またさらに別の実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、レバウジオシドＸを形成するようにレバウジオシドＤに少なくとも１つのグルコース単位を付加できる任意のＵＤＰ－グルコース転移酵素である。ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、例えば、ＵＧＴ７６Ｇ１であってもよい。
【0081】
本発明の方法は、任意選択で、ＵＤＰを再利用して、ＵＤＰ－グルコースを得るステップをさらに含む。一実施形態では、該方法は、再利用触媒（すなわちＵＤＰ－グルコース過剰産生できる生体触媒）及び再利用基質を得ることによってＵＤＰを再利用するステップを含み、それにより、基質ステビオールグリコシドの目標ステビオールグリコシドへの変換が触媒量のＵＤＰ－グルコース転移酵素及びＵＤＰ－グルコースを使用して実行される（図３）。
【0082】
一実施形態では、ＵＤＰ－グルコース再利用触媒は、ショ糖合成酵素である。
【0083】
一実施形態では、再利用基質は、ショ糖である。
【0084】
ルブソシドのステビオシドへの変換
一実施形態では、ルブソシドを含む出発組成物は、ステビオシドを産生するためにＵＤＰ－グルコースとステビオシドとの反応を触媒できるＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触される。一実施形態では、出発組成物は、部分精製されたルブソシドを含む。別の実施形態では、出発組成物は、精製されたルブソシドを含む。特定の実施形態では、出発組成物は、＞９９％のルブソシドを含む。特定の実施形態では、出発組成物は、約５０％、約６０％、約７０％約８０％又は約９０％より多いルブソシドを含む。
一実施形態では、ルブソシドを含む出発組成物は、ステビオシドを産生するためにＵＤＰ－グルコースとステビオシドとの反応を触媒できるＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触される。一実施形態では、出発組成物は、部分精製されたルブソシドを含む。別の実施形態では、出発組成物は、精製されたルブソシドを含む。特定の実施形態では、出発組成物は、＞９９％のルブソシドを含む。特定の実施形態では、出発組成物は、約５０％、約６０％、約７０％約８０％又は約９０％より多いルブソシドを含む。
【0085】
特定の実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、ＵＧＴ９１Ｄ２であり、Ｊｏｓｅｐｈらによって記載されている（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＣＥ８７８５５）。類似の配列が後に特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８９６７に記載され、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅと名付けられたことは記載されなければならない。ＵＧＴ９１Ｄ２ｅは、ＵＧＴ９１Ｄ１１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＲ０６９１８）と＞９５％同一性を、及びＪｏｓｅｐｈらのＵＧＴ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＣＥ８７８５５）と＞９９％同一性を共有している。
【0086】
いくつかの実施形態では、ＵＧＴ９１Ｄ２などのＵＤＰ－グルコース転移酵素は、宿主微生物における発現によって調製される。好適な宿主微生物は、これだけに限らないが大腸菌、酵母菌種、アスペルギルス菌種、ピキア菌種を含む。特定の実施形態では、ＵＧＴ９１Ｄ２は大腸菌において発現される。
【0087】
ＵＧＴ９１Ｄ２などのＵＤＰ－グルコース転移酵素は、遊離又は固定化形態で提供されてよい。酵素調製物は、未精製、半精製及び精製であってよい。一実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、全細胞系（例えば、微生物生細胞若しくは全微生物細胞）、細胞可溶化物及び／又は当技術分野において公知の任意の他の形態として提供される。
【0088】
変換のための反応媒体は、一般に水性であり、精製水、緩衝液又はこれらの組合せであってよい。特定の実施形態では、反応媒体は緩衝液である。好適な緩衝液は、これだけに限らないがＰＩＰＥＳ緩衝液、酢酸緩衝液及びリン酸緩衝液を含む。一実施形態では、反応媒体はリン酸緩衝液である。
【0089】
一実施形態では、ルブソシドのステビオシドへの変換は、ＵＤＰ－グルコース、ルブソシド及びＵＤＰ－グルコース転移酵素以外の化合物の添加をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、反応媒体は、ＭｇＣｌ２及び／又はＭｎＣｌ２を含む。
【0090】
反応は、例えば、約１０℃、約２０℃、約３０℃、約４０℃、約５０℃又は約６０℃などの約０℃から約６０℃の間の温度で実行できる。特定の実施形態では、反応は、約３０℃で実行される。
【0091】
反応は、例えば、約６時間、約１２時間、約２４時間、約４８時間、約７２時間、約１２０時間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間又は約７日間などの１時間から１週間の間の期間で進行できる。特定の実施形態では、反応は、約１２０時間実行される。
【0092】
グルコース供与体として使用されるＵＤＰ－グルコースは、任意選択で、酵素ショ糖合成酵素の使用によって再利用できる（図３）。ルブソシドは、ショ糖とＵＤＰとの間の反応によって再利用されるＵＤＰ－グルコースでステビオシドに転換される。結果としてルブソシド及びショ糖は化学量論量で使用されるが、ＵＤＰは触媒量で存在する。
【0093】
反応は、これだけに限らないが、ＨＰＬＣ、ＬＣＭＳ、ＴＬＣ、ＩＲ又はＮＭＲを含む好適な方法によってモニターできる。
【0094】
一実施形態では、ルブソシドのステビオシドへの変換は、上に述べた任意の方法によって決定されるとおり少なくとも約２％完了である。特定の実施形態では、ルブソシドのステビオシドへの変換は、少なくとも約１０％完了、少なくとも約２０％完了、少なくとも約３０％完了、少なくとも約４０％完了、少なくとも約５０％完了、少なくとも約６０％完了、少なくとも約７０％完了、少なくとも約８０％完了又は少なくとも約９０％完了である。特定の実施形態では、ルブソシドのステビオシドへの変換は、少なくとも約９５％完了である。
【0095】
ステビオシドのｒｅｂ Ａへの変換
一実施形態では、ステビオシドを含む出発組成物は、ｒｅｂ Ａを産生するためにＵＤＰ－グルコースとステビオシドとの反応を触媒できるＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触される。グルコース単位はｒｅｂ Ａをもたらすように、ステビオシドのＣ１３位で二糖に化学的に付加される。一実施形態では、出発組成物は、部分精製されたステビオシドを含む。別の実施形態では、出発組成物は、精製されたステビオシドを含む。特定の実施形態では、出発組成物は、＞９９％のステビオシドを含む。特定の実施形態では、出発組成物は、約５０％、約６０％、約７０％約８０％又は約９０％より多いステビオシドを含む。
一実施形態では、ステビオシドを含む出発組成物は、ｒｅｂ Ａを産生するためにＵＤＰ－グルコースとステビオシドとの反応を触媒できるＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触される。グルコース単位はｒｅｂ Ａをもたらすように、ステビオシドのＣ１３位で二糖に化学的に付加される。一実施形態では、出発組成物は、部分精製されたステビオシドを含む。別の実施形態では、出発組成物は、精製されたステビオシドを含む。特定の実施形態では、出発組成物は、＞９９％のステビオシドを含む。特定の実施形態では、出発組成物は、約５０％、約６０％、約７０％約８０％又は約９０％より多いステビオシドを含む。
【0096】
特定の実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、ＵＧＴ７６Ｇ１である。ＵＧＴ７６Ｇ１は、Ｒｉｃｈｍａｎら（Ｒｉｃｈｍａｎ、Ａ．、Ｓｗａｎｓｏｎ、Ａ．、Ｈｕｍｐｈｒｅｙ、Ｔ．、Ｃｈａｐｍａｎ、Ｒ．、ＭｃＧａｒｖｅｙ、Ｂ．、Ｐｏｃｓ、Ｒ．、Ｂｒａｎｄｌｅ、Ｊ．ゲノム機能解析は、ステビア・レバウディアナの主要な甘グルコシドの合成に関与する３種のグルコース転移酵素を明らかにする（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｕｎｃｏｖｅｒｓ ｔｈｒｅｅ ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｓｗｅｅｔ ｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓ ｏｆ Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ．）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ、２００５、４１、５６～６７）によって記載されており、Ｇｅｎｂａｎｋ（ＡＣＴ３３４２２．１）及びＵｎｉｐｒｏｔ（Ｃ７ＥＡ０９）において利用可能である。酵素は、大腸菌で過剰発現され、ステビオシドをｒｅｂ Ａに転換することが示された。
【0097】
いくつかの実施形態では、ＵＧＴ７６Ｇ１などのＵＤＰ－グルコース転移酵素は、宿主微生物における発現によって調製できる。好適な宿主微生物は、これだけに限らないが大腸菌、酵母菌種、アスペルギルス菌種、ピキア菌種を含む。特定の実施形態では、ＵＧＴ７６Ｇ１は大腸菌において発現される。
【0098】
ＵＧＴ７６Ｇ１などのＵＤＰ－グルコース転移酵素は、遊離又は固定されていてよい。それは、未精製、半精製及び精製された酵素調製物（単数又は複数）の形態であってよい。ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、全細胞系（例えば、微生物生細胞）、全微生物細胞若しくは細胞可溶化物及び／又は当技術分野において公知の任意の他の形態としても提供される場合がある。
【0099】
変換のための反応媒体は、一般に水性であり、精製水、緩衝液又はこれらの組合せであってよい。特定の実施形態では、反応媒体は緩衝液である。好適な緩衝液は、これだけに限らないがＰＩＰＥＳ緩衝液、酢酸緩衝液及びリン酸緩衝液を含む。一実施形態では、反応媒体はリン酸緩衝液である。
【0100】
一実施形態では、ステビオシドのｒｅｂ Ａへの変換は、ＵＤＰ－グルコース、ステビオシド及びＵＤＰ－グルコース転移酵素以外の化合物の添加をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、反応媒体はＭｇＣｌ２及び／又はＭｎＣｌ２を含む。
【0101】
反応は、例えば、約１０℃、約２０℃、約３０℃、約４０℃、約５０℃又は約６０℃などの約０℃から約６０℃の間の温度で実行できる。特定の実施形態では、反応は、約３０℃で実行される。
【0102】
反応は、例えば、約６時間、約１２時間、約２４時間、約４８時間、約７２時間、約１２０時間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間又は約７日間などの１時間から１週間の間の期間で進行できる。特定の実施形態では、反応は、約１２０時間実行される。
【0103】
任意選択で、グルコース供与体として使用されるＵＤＰ－グルコースは、酵素ショ糖合成酵素の使用によって再利用できる（図３）。ステビオシドは、ショ糖とＵＤＰとの反応によって再利用されるＵＤＰ－グルコースでｒｅｂ Ａに転換される。結果としてステビオシド及びショ糖は化学量論量で使用されるが、ＵＤＰは触媒量で存在する。
【0104】
反応は、これだけに限らないがＨＰＬＣ、ＬＣＭＳ、ＴＬＣ、ＩＲ又はＮＭＲを含む好適な方法によってモニターできる。
【0105】
一実施形態では、ステビオシドのｒｅｂ Ａへの生体触媒変換又は生体内変換は、上に述べた任意の方法によって決定されるとおり、少なくとも約５０％完了である。特定の実施形態では、ステビオシドのｒｅｂ Ａへの変換は、少なくとも約６０％完了、少なくとも約７０％完了、少なくとも約８０％完了又は少なくとも約９０％完了である。特定の実施形態では、ステビオシドのｒｅｂ Ａへの変換は、少なくとも約９５％完了である。
【0106】
ｒｅｂ Ａのｒｅｂ Ｄへの変換
一実施形態では、ｒｅｂ Ａを含む出発組成物は、ｒｅｂ Ｄを産生するためにＵＤＰ－グルコースとｒｅｂ Ａとの反応を触媒できるＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触される。グルコース単位は、ｒｅｂ Ｄをもたらすようにｒｅｂ ＡのＣ１９位で単糖に化学的に付加される。一実施形態では、出発組成物は、部分精製されたｒｅｂ Ａを含む。別
の実施形態では、出発組成物は、精製されたｒｅｂ Ａを含む。特定の実施形態では、出発組成物は、＞９９％のｒｅｂ Ａを含む。特定の実施形態では、出発組成物は、約５０％、約６０％、約７０％約８０％又は約９０％より多いｒｅｂ Ａを含む。
一実施形態では、ｒｅｂ Ａを含む出発組成物は、ｒｅｂ Ｄを産生するためにＵＤＰ－グルコースとｒｅｂ Ａとの反応を触媒できるＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触される。グルコース単位は、ｒｅｂ Ｄをもたらすようにｒｅｂ ＡのＣ１９位で単糖に化学的に付加される。一実施形態では、出発組成物は、部分精製されたｒｅｂ Ａを含む。別
の実施形態では、出発組成物は、精製されたｒｅｂ Ａを含む。特定の実施形態では、出発組成物は、＞９９％のｒｅｂ Ａを含む。特定の実施形態では、出発組成物は、約５０％、約６０％、約７０％約８０％又は約９０％より多いｒｅｂ Ａを含む。
【0107】
特定の実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素はＵＧＴ９１Ｄ２であり、Ｊｏｓｅｐｈらによって記載されている（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＣＥ８７８５５）。類似配列が後に特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８９６７に記載されＵＧＴ９１Ｄ２ｅと名付けられたことは記載されなければならない。ＵＧＴ９１Ｄ２ｅは、ＵＧＴ９１Ｄ１１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＲ０６９１８）と＞９５％同一性を、及びＪｏｓｅｐｈらのＵＧＴ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＣＥ８７８５５）と＞９９％同一性を共有している。
【0108】
いくつかの実施形態では、ＵＧＴ９１Ｄ２などのＵＤＰ－グルコース転移酵素は、宿主微生物における発現によって調製される。好適な宿主微生物は、これだけに限らないが大腸菌、酵母菌種、アスペルギルス菌種、ピキア菌種を含む。特定の実施形態では、ＵＧＴ９１Ｄ２は大腸菌において発現される。
【0109】
ＵＧＴ９１Ｄ２などのＵＤＰ－グルコース転移酵素は、遊離又は固定化形態で提供されてよい。酵素調製物は、未精製、半精製及び精製であってよい。一実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、全細胞系（例えば、微生物生細胞若しくは全微生物細胞）、細胞可溶化物及び／又は当技術分野において公知の任意の他の形態として提供される。
【0110】
変換のための反応媒体は、一般に水性であり、精製水、緩衝液又はこれらの組合せであってよい。特定の実施形態では、反応媒体は緩衝液である。好適な緩衝液は、これだけに限らないがＰＩＰＥＳ緩衝液、酢酸緩衝液及びリン酸緩衝液を含む。一実施形態では、反応媒体はリン酸緩衝液である。
【0111】
一実施形態では、ｒｅｂ Ａのｒｅｂ Ｄへの変換は、ＵＤＰ－グルコース、ｒｅｂ Ａ及びＵＤＰ－グルコース転移酵素以外の化合物の添加をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、反応媒体はＭｇＣｌ２及び／又はＭｎＣｌ２を含む。
【0112】
反応は、例えば、約１０℃、約２０℃、約３０℃、約４０℃、約５０℃又は約６０℃などの約０℃から約６０℃の間の温度で実行できる。特定の実施形態では、反応は、約３０℃で実行される。
【0113】
反応は、例えば、約６時間、約１２時間、約２４時間、約４８時間、約７２時間、約１２０時間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間又は約７日間などの１時間から１週間の間の期間で進行できる。特定の実施形態では、反応は、約１２０時間実行される。
【0114】
任意選択で、グルコース供与体として使用されるＵＤＰ－グルコースは、酵素ショ糖合成酵素の使用によって再利用できる（図３）。ｒｅｂ Ａは、ショ糖とＵＤＰとの反応によって再利用されるＵＤＰ－グルコースでｒｅｂ Ｄに転換される。結果としてｒｅｂ Ａ及びショ糖は化学量論量で使用されるが、ＵＤＰは触媒量で存在する。
【0115】
反応は、これだけに限らないが、ＨＰＬＣ、ＬＣＭＳ、ＴＬＣ、ＩＲ又はＮＭＲを含む好適な方法によってモニターできる。
【0116】
一実施形態では、ｒｅｂ Ａのｒｅｂ Ｄへの変換は、上に述べた任意の方法によって決定されるとおり少なくとも約２％完了である。特定の実施形態では、ｒｅｂ Ａのｒｅｂ Ｄへの変換は、少なくとも約１０％完了、少なくとも約２０％完了、少なくとも約３０％完了、少なくとも約４０％完了、少なくとも約５０％完了、少なくとも約６０％完了、少なくとも約７０％完了、少なくとも約８０％完了又は少なくとも約９０％完了である。特定の実施形態では、ｒｅｂ Ａのｒｅｂ Ｄへの変換は、少なくとも約９５％完了である。
【0117】
ｒｅｂ Ｄのｒｅｂ Ｘへの変換
一実施形態では、出発組成物は、ｒｅｂ Ｄを含み、ｒｅｂ Ｘを産生するためにＵＤＰ－グルコースとｒｅｂ Ｄとの反応を触媒できるＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触される。グルコース単位は、ｒｅｂ Ｘをもたらすようにｒｅｂ ＤのＣ１９位で二糖に化学的に付加される。一実施形態では、出発組成物は、部分精製されたｒｅｂ Ｄを含む。別の実施形態では、出発組成物は、精製されたｒｅｂ Ｄを含む。特定の実施形態では、出発組成物は、＞９９％のｒｅｂ Ｄを含む。特定の実施形態では、出発組成物は、約５０％、約６０％、約７０％約８０％又は約９０％より多いｒｅｂ Ｄを含む。特定の実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、ＵＧＴ７６Ｇ１である。
一実施形態では、出発組成物は、ｒｅｂ Ｄを含み、ｒｅｂ Ｘを産生するためにＵＤＰ－グルコースとｒｅｂ Ｄとの反応を触媒できるＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触される。グルコース単位は、ｒｅｂ Ｘをもたらすようにｒｅｂ ＤのＣ１９位で二糖に化学的に付加される。一実施形態では、出発組成物は、部分精製されたｒｅｂ Ｄを含む。別の実施形態では、出発組成物は、精製されたｒｅｂ Ｄを含む。特定の実施形態では、出発組成物は、＞９９％のｒｅｂ Ｄを含む。特定の実施形態では、出発組成物は、約５０％、約６０％、約７０％約８０％又は約９０％より多いｒｅｂ Ｄを含む。特定の実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、ＵＧＴ７６Ｇ１である。
【0118】
いくつかの実施形態では、ＵＧＴ９１Ｄ２などのＵＤＰ－グルコース転移酵素は、宿主微生物における発現によって調製できる。好適な宿主微生物は、これだけに限らないが大腸菌、酵母菌種、アスペルギルス菌種、ピキア菌種を含む。特定の実施形態では、ＵＧＴ９１Ｄ２は大腸菌において発現される。
【0119】
ＵＧＴ９１Ｄ２などのＵＤＰ－グルコース転移酵素は、遊離又は固定されて提供されてよい。酵素調製物は、未精製、半精製及び精製であってよい。一実施形態では、ＵＤＰ－グルコース転移酵素は、全細胞調製物（例えば、微生物生細胞若しくは全微生物細胞の形態）、細胞可溶化物及び／若しくは当技術分野において公知の任意の他の形態として提供される。
【0120】
変換のための反応媒体は、一般に水性であり、精製水、緩衝液又はこれらの組合せであってよい。特定の実施形態では、反応媒体は緩衝液である。好適な緩衝液は、これだけに限らないがＰＩＰＥＳ緩衝液、酢酸緩衝液及びリン酸緩衝液を含む。一実施形態では、反応媒体はリン酸緩衝液である。
【0121】
一実施形態では、ｒｅｂ Ｄのｒｅｂ Ｘへの変換は、ＵＤＰ－グルコース、ｒｅｂ Ｄ及びＵＤＰ－グルコース転移酵素に加えて化合物を用いる。例えば、いくつかの実施形態では、反応媒体はＭｇＣｌ２及び／又はＭｎＣｌ２を含む。
【0122】
反応は、例えば、約１０℃、約２０℃、約３０℃、約４０℃、約５０℃又は約６０℃などの約０℃から約６０℃の間の温度で実行できる。特定の実施形態では、反応は、約３０℃で実行される。
【0123】
反応は、例えば、約６時間、約１２時間、約２４時間、約４８時間、約７２時間、約１２０時間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間又は約７日間などの１時間から１週間の間の期間で進行できる。特定の実施形態では、反応は、約１２０時間実行される。
【0124】
任意選択で、グルコース供与体として使用されるＵＤＰ－グルコースは、酵素ショ糖合成酵素の使用によって再利用できる（図３）。ｒｅｂ Ｄは、ショ糖とＵＤＰとの反応によって再利用されるＵＤＰ－グルコースでｒｅｂ Ｘに転換される。結果としてｒｅｂ Ｄ及びショ糖は化学量論量で使用されるが、ＵＤＰは触媒量で存在する。
【0125】
反応は、これだけに限らないが、ＨＰＬＣ、ＬＣＭＳ、ＴＬＣ、ＩＲ又はＮＭＲを含む好適な方法によってモニターできる。
【0126】
一実施形態では、ｒｅｂ Ｄのｒｅｂ Ｘへの変換は、上に述べた任意の方法によって決定されるとおり少なくとも約５０％完了である。特定の実施形態では、ｒｅｂ Ｄのｒｅｂ Ｘへの変換は、少なくとも約６０％完了、少なくとも約７０％完了、少なくとも約８０％完了又は少なくとも約９０％完了である。特定の実施形態では、ｒｅｂ Ｄのｒｅｂ Ｘへの変換は、少なくとも約９５％完了である。
【0127】
目標ステビオールグリコシドは、得られた組成物から任意選択で精製される。反応媒体からの目標ステビオールグリコシドの精製は、高度に精製された目標ステビオールグリコシド組成物を提供するための任意の好適な方法によって達成できる。好適な方法は、結晶化、膜による分離、遠心分離、抽出（液相若しくは固相）、クロマトグラフィー分離、ＨＰＬＣ（分取若しくは分析）又はそのような方法の組合せを含む。
【0128】
一実施形態では、特定の生体触媒変換は、反応を停止するためにクエンチされる場合がある。次いで得られた混合物は、遠心分離される。上清は、一般に目標ステビオールグリコシドを含有し、次いで所望によりさらに精製される場合がある。例えば、分析又は分取ＨＰＬＣは、残っている標的若しくは出発ステビオールグリコシド（単数又は複数）又は反応副産物を目標ステビオールグリコシドから分離するために使用できる。一実施形態では、分離は、分析ＨＰＬＣで達成される。別の実施形態では、分離は、分取ＨＰＬＣで達成される。当業者であれば、使用される特定のＨＰＬＣ法を特定の系、溶媒及びカラムに基づいて変更できることを認識されよう。ｒｅｂ Ｘをｒｅｂ Ｄから分離するための好適な系は、実施例２０において提供される。
【0129】
本明細書で提供する方法が反復できることは予測され、最初のプロセスから得られる組成物（すなわち目標ステビオールグリコシドを含む組成物）は、次いで方法が２回目に実行される場合に出発組成物として使用でき、目標ステビオールグリコシドは、任意選択で、高度に精製された目標ステビオールグリコシド又はステビオールグリコシド組成物をもたらすように目標ステビオールグリコシドを含む組成物から精製できる。本実施形態により、方法が１回目に実行された際に産生された目標ステビオールグリコシドは、第一の目標ステビオールグリコシド又は中間目標ステビオールグリコシドと考えられ、第二の目標ステビオールグリコシド、第二の中間目標ステビオールグリコシド又は最終的な目標ステビオールグリコシドの産生のための基質として有用である。プロセスは、最終的な目標ステビオールグリコシドに達するように必要な回数反復できる。一実施形態では、方法は１回反復される。別の実施形態では、方法は、２回反復される。さらに別の実施形態では、方法は、３回反復される。またさらに他の実施形態では、方法は、４回。５回、６回、７回、８回又は９回反復される。当業者であれば、各反応で使用される特定のＵＤＰ－グルコース転移酵素は、グルコースが付加される、ステビオールグリコシド基質上の特定の部位に応じて、同じ又は異なるのいずれでもよいことを認識されよう。
【0130】
したがって一実施形態では、方法は１回反復され、第一の方法の出発組成物はｒｅｂ Ａを含み、目標ステビオールグリコシドはｒｅｂ Ｄであり、第二の方法の出発組成物はｒｅｂ Ｄを含み、目標ステビオールグリコシドはｒｅｂ Ｘである。
【0131】
別の実施形態では、方法は、２回反復され、第一の方法の出発組成物はステビオシドを含み、目標ステビオールグリコシドはｒｅｂ Ａである；第二の方法の出発組成物はｒｅｂ Ａを含み、目標ステビオールグリコシドはｒｅｂ Ｄである；及び第三の方法の出発組成物はｒｅｂ Ｄを含み、目標ステビオールグリコシドはｒｅｂ Ｘである。
【0132】
さらに別の実施形態では、方法は３回反復され、第一の方法の出発組成物はルブソシドを含み、目標ステビオールグリコシドはステビオシドである；第二の方法の出発組成物はステビオシドを含み、目標ステビオールグリコシドはｒｅｂ Ａである；第三の方法の出発組成物はｒｅｂ Ａを含み、目標ステビオールグリコシドはｒｅｂ Ｄである；第四の方法の出発組成物はｒｅｂ Ｄを含み、目標ステビオールグリコシドはｒｅｂ Ｘである。
【0133】
一実施形態では、高度に精製された目標ステビオールグリコシド組成物を産生するための方法は：
ａ．ステビオールグリコシド基質を含む第一の出発組成物を第一のＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触させて、第一の目標ステビオールグリコシドを含む組成物を産生するステップ；
ｂ．任意選択で、第一の目標ステビオールグリコシドを培地から分離して、高度に精製された第一の目標ステビオールグリコシド組成物を得るステップ；
ｃ．第一の目標ステビオールグリコシドを含む組成物又は高度に精製された第一の目標ステビオールグリコシド組成物を第二のＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触させて、第二の目標ステビオールグリコシドを含む組成物を産生するステップ；
ｄ．任意選択で、第二の目標ステビオールグリコシドを培地から分離して、高度に精製された第二の目標ステビオールグリコシド組成物を得るステップ；
ｅ．第二の目標ステビオールグリコシドを含む組成物又は高度に精製された第二の目標ステビオールグリコシド組成物を第三のＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触させて、第三の目標ステビオールグリコシドを含む組成物を産生するステップ；及び
ｆ．任意選択で、第三の目標ステビオールグリコシドを培地から分離して、高度に精製された第三の目標ステビオールグリコシド組成物を得るステップ
を含む。
ａ．ステビオールグリコシド基質を含む第一の出発組成物を第一のＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触させて、第一の目標ステビオールグリコシドを含む組成物を産生するステップ；
ｂ．任意選択で、第一の目標ステビオールグリコシドを培地から分離して、高度に精製された第一の目標ステビオールグリコシド組成物を得るステップ；
ｃ．第一の目標ステビオールグリコシドを含む組成物又は高度に精製された第一の目標ステビオールグリコシド組成物を第二のＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触させて、第二の目標ステビオールグリコシドを含む組成物を産生するステップ；
ｄ．任意選択で、第二の目標ステビオールグリコシドを培地から分離して、高度に精製された第二の目標ステビオールグリコシド組成物を得るステップ；
ｅ．第二の目標ステビオールグリコシドを含む組成物又は高度に精製された第二の目標ステビオールグリコシド組成物を第三のＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触させて、第三の目標ステビオールグリコシドを含む組成物を産生するステップ；及び
ｆ．任意選択で、第三の目標ステビオールグリコシドを培地から分離して、高度に精製された第三の目標ステビオールグリコシド組成物を得るステップ
を含む。
【0134】
一実施形態では、第一の出発組成物は、ステビオシドを含み、第一の目標ステビオールグリコシドはｒｅｂ Ａであり、第一のＵＤＰ－グルコース転移酵素はＵＧＴ７６Ｇ１である。
【0135】
さらなる実施形態では、第二のＵＤＰ－グルコース転移酵素はＵＧＴ９１Ｄ２であり、第二の目標ステビオールグリコシドはｒｅｂ Ｄである。
【0136】
さらにさらなる実施形態では、第三のＵＤＰ－グルコース転移酵素はＵＧＴ９１Ｄ２であり、第三の目標ステビオールグリコシドはｒｅｂ Ｘである。
【0137】
一実施形態では、ステビオールグリコシド基質を含む組成物をＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触させるステップの１つ又は複数は、ＵＤＰの過剰産生及び再利用をできる生体触媒並びに前記再利用のための基質を用意するステップをさらに含む。
【0138】
さらに特定の実施形態では、高度に精製された目標ステビオールグリコシド組成物を産生するための方法は：
ａ．ステビオールグリコシド基質を含む第一の出発組成物を第一のＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触させて、第一の目標ステビオールグリコシドを含む組成物を産生するステップ；
ｂ．任意選択で、ＵＤＰの過剰産生及び再利用をできる生体触媒並びに前記再利用のための基質を用意するステップ；
ｃ．任意選択で、第一の目標ステビオールグリコシドを培地から分離して、高度に精製された第一の目標ステビオールグリコシド組成物を得るステップ；
ｄ．第一の目標ステビオールグリコシドを含む組成物又は高度に精製された第一の目標ステビオールグリコシド組成物を第二のＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触させて、第二の目標ステビオールグリコシドを含む組成物を得るステップ；
ｅ．任意選択で、ＵＤＰの過剰産生及び再利用をできる生体触媒並びに前記再利用のための基質を用意するステップ；
ｆ．任意選択で、第二の目標ステビオールグリコシドを培地から分離して、高度に精製された第二の目標ステビオールグリコシド組成物を得るステップ；
ｇ．第二の目標ステビオールグリコシドを含む組成物又は高度に精製された第二の目標ステビオールグリコシド組成物を第三のＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触させて、第三の目標ステビオールグリコシドを含む組成物を得るステップ；並びに
ｈ．任意選択で、第三の目標ステビオールグリコシドを培地から分離して、高度に精製された第三の目標ステビオールグリコシド組成物を得るステップ
を含む。
ａ．ステビオールグリコシド基質を含む第一の出発組成物を第一のＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触させて、第一の目標ステビオールグリコシドを含む組成物を産生するステップ；
ｂ．任意選択で、ＵＤＰの過剰産生及び再利用をできる生体触媒並びに前記再利用のための基質を用意するステップ；
ｃ．任意選択で、第一の目標ステビオールグリコシドを培地から分離して、高度に精製された第一の目標ステビオールグリコシド組成物を得るステップ；
ｄ．第一の目標ステビオールグリコシドを含む組成物又は高度に精製された第一の目標ステビオールグリコシド組成物を第二のＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触させて、第二の目標ステビオールグリコシドを含む組成物を得るステップ；
ｅ．任意選択で、ＵＤＰの過剰産生及び再利用をできる生体触媒並びに前記再利用のための基質を用意するステップ；
ｆ．任意選択で、第二の目標ステビオールグリコシドを培地から分離して、高度に精製された第二の目標ステビオールグリコシド組成物を得るステップ；
ｇ．第二の目標ステビオールグリコシドを含む組成物又は高度に精製された第二の目標ステビオールグリコシド組成物を第三のＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触させて、第三の目標ステビオールグリコシドを含む組成物を得るステップ；並びに
ｈ．任意選択で、第三の目標ステビオールグリコシドを培地から分離して、高度に精製された第三の目標ステビオールグリコシド組成物を得るステップ
を含む。
【0139】
一実施形態では、第一の出発組成物はステビオシドを含み、第一の目標ステビオールグリコシドはｒｅｂ Ａであり、第一のＵＤＰ－グルコース転移酵素はＵＧＴ７６Ｇ１である。
【0140】
さらなる実施形態では、第二のＵＤＰ－グルコース転移酵素はＵＧＴ９１Ｄ２であり、第二の目標ステビオールグリコシドはｒｅｂ Ｄである。
【0141】
さらにさらなる実施形態では、第三のＵＤＰ－グルコース転移酵素はＵＧＴ９１Ｄ２であり、第三の目標ステビオールグリコシドはｒｅｂ Ｘである。
【0142】
別の特定の実施形態では、高度に精製された目標ステビオールグリコシド組成物を産生するための方法は：
ａ．ステビオールグリコシド基質を含む第一の出発組成物を第一のＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触させて、第一の目標ステビオールグリコシドを含む組成物を産生するステップ；
ｂ．任意選択で、ＵＤＰの過剰産生及び再利用をできる生体触媒並びに前記再利用のための基質を用意するステップ；
ｃ．任意選択で、第一の目標ステビオールグリコシドを培地から分離して、高度に精製された第一の目標ステビオールグリコシド組成物を得るステップ；
ｄ．第一の目標ステビオールグリコシドを含む組成物又は高度に精製された第一の目標ステビオールグリコシド組成物を第二のＵＤＰ－グルコース転移酵素に接触させて、第二の目標ステビオールグリコシドを含む組成物を産生するステップ；
ｅ．任意選択で、ＵＤＰの過剰産生及び再利用をできる生体触媒並びに前記再利用のための基質を用意するステップ；
ｆ．任意選択で、第二の目標ステビオールグリコシドを培地から分離して、高度に精製された第二の目標ステビオールグリコシド組成物を得るステップ；
ｇ．第二の目標ステビオールグリコシドを含む組成物又は高度に精製された第二の目標ステビオールグリコシド組成物を第三のＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触させて、第三の目標ステビオールグリコシドを含む組成物を得るステップ；及び
ｈ．任意選択で、ＵＤＰの過剰産生及び再利用をできる生体触媒並びに前記再利用のための基質を用意するステップ；
ｉ．任意選択で、第三の目標ステビオールグリコシドを培地から分離して、高度に精製された第三の目標ステビオールグリコシド組成物を得るステップ；
ｊ．第三の目標ステビオールグリコシドを含む組成物又は高度に精製された第三の目標ステビオールグリコシド組成物を第四のＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触させて、第四の目標ステビオールグリコシドを含む組成物を産生するステップ；及び
ｋ．任意選択で、ＵＤＰの過剰産生及び再利用をできる生体触媒並びに前記再利用のための基質を用意するステップ；
ｌ．任意選択で、第四の目標ステビオールグリコシドを培地から分離して、高度に精製された第四の目標ステビオールグリコシド組成物を得るステップ
を含む。
ａ．ステビオールグリコシド基質を含む第一の出発組成物を第一のＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触させて、第一の目標ステビオールグリコシドを含む組成物を産生するステップ；
ｂ．任意選択で、ＵＤＰの過剰産生及び再利用をできる生体触媒並びに前記再利用のための基質を用意するステップ；
ｃ．任意選択で、第一の目標ステビオールグリコシドを培地から分離して、高度に精製された第一の目標ステビオールグリコシド組成物を得るステップ；
ｄ．第一の目標ステビオールグリコシドを含む組成物又は高度に精製された第一の目標ステビオールグリコシド組成物を第二のＵＤＰ－グルコース転移酵素に接触させて、第二の目標ステビオールグリコシドを含む組成物を産生するステップ；
ｅ．任意選択で、ＵＤＰの過剰産生及び再利用をできる生体触媒並びに前記再利用のための基質を用意するステップ；
ｆ．任意選択で、第二の目標ステビオールグリコシドを培地から分離して、高度に精製された第二の目標ステビオールグリコシド組成物を得るステップ；
ｇ．第二の目標ステビオールグリコシドを含む組成物又は高度に精製された第二の目標ステビオールグリコシド組成物を第三のＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触させて、第三の目標ステビオールグリコシドを含む組成物を得るステップ；及び
ｈ．任意選択で、ＵＤＰの過剰産生及び再利用をできる生体触媒並びに前記再利用のための基質を用意するステップ；
ｉ．任意選択で、第三の目標ステビオールグリコシドを培地から分離して、高度に精製された第三の目標ステビオールグリコシド組成物を得るステップ；
ｊ．第三の目標ステビオールグリコシドを含む組成物又は高度に精製された第三の目標ステビオールグリコシド組成物を第四のＵＤＰ－グルコース転移酵素と接触させて、第四の目標ステビオールグリコシドを含む組成物を産生するステップ；及び
ｋ．任意選択で、ＵＤＰの過剰産生及び再利用をできる生体触媒並びに前記再利用のための基質を用意するステップ；
ｌ．任意選択で、第四の目標ステビオールグリコシドを培地から分離して、高度に精製された第四の目標ステビオールグリコシド組成物を得るステップ
を含む。
【0143】
一実施形態では、第一の出発組成物は、ルブソシドを含み、第一の目標ステビオールグリコシドはステビオシドであり、第一のＵＤＰ－グルコース転移酵素はＵＧＴ９１Ｄ２である。
【0144】
さらなる実施形態では、第二のＵＤＰ－グルコース転移酵素はＵＧＴ７６Ｇ１であり、第二の目標ステビオールグリコシドはｒｅｂ Ａである。
【0145】
さらなる実施形態では、第三のＵＤＰ－グルコース転移酵素はＵＧＴ９１Ｄ２であり、第三の目標ステビオールグリコシドはｒｅｂ Ｄである。
【0146】
さらにさらなる実施形態では、第四のＵＤＰ－グルコース転移酵素はＵＧＴ９１Ｄ２であり第四の目標ステビオールグリコシドはｒｅｂ Ｘである。
【0147】
本発明により調製される精製されたステビオールグリコシドは、これだけに限らないが、食物、飲料、医薬組成物、タバコ製品、栄養補助組成物、口腔衛生組成物及び化粧用組成物を含む種々の製品において使用できる。
【0148】
分子量１２９１．２９、分子式Ｃ５６Ｈ９０Ｏ３３及び図１に示す構造を有する本発明において得られる高純度ｒｅｂ Ｘは、白色、無臭の粉末形態である。化合物は、１０％ショ糖溶液と比較した場合に砂糖よりも約２００倍甘い。赤外吸収スペクトルは図４に示されている。
【0149】
純粋なｒｅｂ Ｘ化合物の他の特質は、２４９～２５０℃の融点、５０％エタノール（Ｃ＝１．０）中での比旋光度［α］Ｄ２５－１９．０°を含む。ｒｅｂ Ｘの水中での溶解度は、およそ０．３％であり、温度の上昇と共に増加する。
【0150】
ｒｅｂ Ｘは、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール及びイソプロパノールの希釈溶液に可溶性である。しかし、アセトン、ベンゼン、クロロホルム及びエーテルには不溶性である。
【0151】
本発明により得られるｒｅｂ Ｘは、熱及びｐＨ安定性である。
【0152】
本発明により得られる高度に精製された標的グリコシド（単数又は複数）、特にｒｅｂ Ｄ及び／又はｒｅｂ Ｘは、他の甘味料、香料及び食品成分との組合せでそのまま使用できる。
【0153】
香料の非限定的例は、ライム、レモン、オレンジ、果実、バナナ、ブドウ、セイヨウナシ、パイナップル、マンゴー、苦扁桃、コーラノキ、シナモン、砂糖、綿菓子及びバニラ香料を含む。
【0154】
他の食物成分の非限定的例は、香料、酸味料、有機酸及びアミノ酸、着色料、増量剤、加工デンプン、ガム、食感付与剤、保存料、抗酸化物質、乳化剤、安定剤、増粘剤及びゲル化剤を含む。
【0155】
本発明により得られる高度に精製された標的グリコシド（単数又は複数）、特にｒｅｂ Ｄ及び／又はｒｅｂ Ｘは、これだけに限らないが水和物、溶媒和物、無水物、アモルファス形態及び／又はこれらの組合せを含む種々の多様な形態に調製できる。
【0156】
本発明により得られる高度に精製された目標ステビオールグリコシド（単数又は複数）、特にｒｅｂ Ｄ及び／又はｒｅｂ Ｘは、食糧、飲料、医薬組成物、化粧品、チューインガム、卓上製品、シリアル、乳製品、歯磨き粉及び他の口腔組成物などにおいて高甘味度天然甘味料として包含されてよい。
【0157】
甘味化合物としての高度に精製された目標ステビオールグリコシド（単数又は複数）、特にｒｅｂ Ｄ及び／又はｒｅｂ Ｘは、単独で甘味料として用いられる場合がある、又はステビオシド、ｒｅｂ Ａ、ｒｅｂ Ｂ、ｒｅｂ Ｃ、ｒｅｂ Ｄ、ｒｅｂ Ｅ、ｒｅｂ Ｆ、ステビオールビオシド、ズルコシドＡ、ルブソシド、モグロシド（ｍｏｇｒｏｓｉｄｅ）、ブラゼイン（ｂｒａｚｚｅｉｎ）、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン、グリチルリチン酸及びその塩、タウマチン、ペリラルチン、ペルナンズルシン（ｐｅｒｎａｎｄｕｌｃｉｎ）、ムクロジオシド（ｍｕｋｕｒｏｚｉｏｓｉｄｅｓ）、バイユノシド（ｂａｉｙｕｎｏｓｉｄｅ）、フロミソシド（ｐｈｌｏｍｉｓｏｓｉｄｅ）－Ｉ、ジメチル－ヘキサヒドロフルオレン－ジカルボン酸、アブルソシド（ａｂｒｕｓｏｓｉｄｅ）、ペリアンドリン（ｐｅｒｉａｎｄｒｉｎ）、カルノシフロシド（ｃａｒｎｏｓｉｆｌｏｓｉｄｅ）、シクロカリオシド（ｃｙｃｌｏｃａｒｉｏｓｉｄｅ）、ペテロカリオシド（ｐｔｅｒｏｃａｒｙｏｓｉｄｅ）、ポリポドシド（ｐｏｌｙｐｏｄｏｓｉｄｅ）Ａ、ブラジリン（ｂｒａｚｉｌｉｎ）、ヘルアンダルシン（ｈｅｒｎａｎｄｕｌｃｉｎ）、フィロズルシン（ｐｈｉｌｌｏｄｕｌｃｉｎ）、グリシフィリン（ｇｌｙｃｙｐｈｙｌｌｉｎ）、フロリジン、トリロバチン（ｔｒｉｌｏｂａｔｉｎ）、ジヒドロフロボノール、ジヒドロケルセチン－３－アセテート、ネオアスチリビン（ｎｅｏａｓｔｉｌｉｂｉｎ）、トランスシンナムアルデヒド（ｔｒａｎｓ－ｃｉｎｎａｍａｌｄｅｈｙｄｅ）、モナチン（ｍｏｎａｔｉｎ）及びその塩、セリグアイン（ｓｅｌｌｉｇｕｅａｉｎ）Ａ、ヘマトキシリン、モネリン、オスラジン（ｏｓｌａｄｉｎ）、ペテロカリオシド（ｐｔｅｒｏｃａｒｙｏｓｉｄｅ）Ａ、ペテロカリオシド（ｐｔｅｒｏｃａｒｙｏｓｉｄｅ）Ｂ、マビンリン（ｍａｂｉｎｌｉｎ）、ペンタジン（ｐｅｎｔａｄｉｎ）、ミラクリン、クルクリン（ｃｕｒｃｕｌｉｎ）、ネオクリン（ｎｅｏｃｕｌｉｎ）、クロロゲン酸、シナリン（ｃｙｎａｒｉｎ）、Ｌｕｏ Ｈａｎ Ｇｕｏ甘味料、モグロシド（ｍｏｇｒｏｓｉｄｅ）Ｖ、シアメノシド（ｓｉａｍｅｎｏｓｉｄｅ）などの他の天然に存在する高甘味度甘味料と共に使用される場合もある。
【0158】
高度に精製された目標ステビオールグリコシド（単数又は複数）、特にｒｅｂ Ｄ及び／又はｒｅｂ Ｘは、スクラロース、アセサルフェームカリウム、アスパルルテーム、アリターム、サッカリン、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン、シクラミン酸、ネオテーム、ズルシン（ｄｕｌｃｉｎ）、スオサン、Ｎ－［Ｎ－［３－（３－ヒドロキシ－４－メトキシフェニル）プロピル］－Ｌ－α－アスパルチル］－Ｌ－フェニルアラニン１－メチルエステル、Ｎ－［Ｎ－［３－（３－ヒドロキシ－４－メトキシフェニル）－３－メチルブチル］－Ｌ－α－アスパルチル］－Ｌ－フェニルアラニン１－メチルエステル、Ｎ－［Ｎ－［３－（３－メトキシ－４－ヒドロキシフェニル）プロピル］－Ｌ－α－アスパルチル］－Ｌ－フェニルアラニン１－メチルエステル、これらの塩などの合成高甘味度甘味料との組合せでも使用される場合がある。
【0159】
さらに、高度に精製された目標ステビオールグリコシド（単数又は複数）、特にｒｅｂ Ｄ及び／又はｒｅｂ Ｘは、ギムネマ酸、ホズルシン、ジジフィン、ラクチゾール（ｌａｃｔｉｓｏｌｅ）などの天然甘味抑制物質との組合せで使用できる。ｒｅｂ Ｄ及び／又はｒｅｂ Ｘは、種々のうま味増強物質とも組合せられる。ｒｅｂ Ｄ及び／又はｒｅｂ Ｘは、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、アラニン、スレオニン、プロリン、セリン、グルタミン酸及びトリプトファンなどのうま味及び甘味アミノ酸と混合できる。
【0160】
高度に精製された目標ステビオールグリコシド（単数又は複数）、特にｒｅｂ Ｄ及び／又はｒｅｂ Ｘはポリオール又は糖アルコールとも組合せられる。用語「ポリオール」は、複数のヒドロキシル基を含有する分子を指す。ポリオールは、２、３及び４個のヒドロキシル基をそれぞれ含有するジオール、トリオール又はテトラオールであってよい。ポリオールは、５、６又は７個のヒドロキシル基をそれぞれ含有するペンタオール、ヘキサオール、ヘプタオールなどの４個より多いヒドロキシル基を含有してもよい。その上、ポリオールは、炭水化物の還元形態である糖アルコール、多価アルコール又はポリアルコールであってもよく、ここでカルボニル基（アルデヒド又はケトン、還元糖）は、一級又は二級ヒドロキシル基に還元されている。ポリオールの例は、それだけに限らないが、エリスリトール、マルチトール、マンニトール、ソルビトール、ラクチトール、キシリトール、イノシトール、イソマルト、プロピレングリコール、グリセロール、スレイトール、ガラクチトール、水素化イソマルツロース、還元イソマルトオリゴ糖、還元キシロオリゴ糖、還元ゲンチオオリゴ糖、還元マルトースシロップ、還元グルコースシロップ、水素化デンプン加水分解物、ポリグリシトール（ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｔｏｌ）及び糖アルコール、又は甘味料組成物の味に悪影響を与えない還元可能な任意の他の炭水化物を含む。
【0161】
高度に精製された目標ステビオールグリコシド（単数又は複数）、特にｒｅｂ Ｄ及び／又はｒｅｂ Ｘは、Ｄ－タガトース、Ｌ－糖類、Ｌ－ソルボース、Ｌ－アラビノースなどの低カロリー甘味料と組み合わせることができる。
【0162】
高度に精製された目標ステビオールグリコシド（単数又は複数）、特にｒｅｂ Ｄ及び／又はｒｅｂ Ｘは、種々の炭水化物と組み合わせることができる。用語「炭水化物」は、一般式（ＣＨ２Ｏ）ｎ（式中ｎは３～３０）で、複数のヒドロキシル基で置換されたアルデヒド又はケトン化合物並びにそれらのオリゴマー及びポリマーを一般に指す。その上、本発明の炭水化物は、１つ又は複数の位置で置換又は脱酸素化される場合がある。本明細書において使用される炭水化物は、未修飾炭水化物、炭水化物誘導体、置換された炭水化物、及び修飾炭水化物を包含する。本明細書において使用される句「炭水化物誘導体」、「置換された炭水化物」及び「修飾された炭水化物」は、同義語である。修飾された炭水化物は、少なくとも１つの原子が付加、除去若しくは置換されている又はこれらの組合せである任意の炭水化物を意味する。したがって、炭水化物誘導体又は置換された炭水化物は、置換された及び未置換の単糖、二糖、オリゴ糖及び多糖を含む。炭水化物誘導体又は置換された炭水化物は、炭水化物誘導体又は置換された炭水化物が甘味料組成物の甘味を改善するように機能する限り、任意の対応するＣ－位置で任意選択で脱酸素化でき、及び／又は水素、ハロゲン、ハロアルキル、カルボキシル、アシル、アシルオキシ、アミノ、アミド、カルボキシル誘導体、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホ、メルカプト、イミノ、スルホニル、スルフェニル、スルフィニル、スルファモイル、カルボアルコキシ、カルボキシアミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホリル、ホスフィノ、チオエステル、チオエーテル、オキシイミノ、ヒドラジノ、カルバミル、ホスホ、ホスホナート若しくは任意の他の実用的な官能基などの１つ又は複数の成分で置換できる。
【0163】
本発明により使用できる炭水化物の例は、これだけに限らないが、タガトース、トレハロース、ガラクトース、ラムノース、種々のシクロデキストリン、環状オリゴ糖、種々の種類のマルトデキストリン、デキストラン、ショ糖、グルコース、リブロース、フルクトース、トレオース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース（ａｌｔｒｏｓｅ）、マンノース、イドース、乳糖、マルトース、転化糖、イソトレハロース、ネオトレハロース、イソマルツロース、エリトロース、デオキシリボース、グロース、イドース、タロース（ｔａｌｏｓｅ）、エリトルロース（ｅｒｙｔｈｒｕｌｏｓｅ）、キシルロース、プシコース（ｐｓｉｃｏｓｅ）、ツラノース（ｔｕｒａｎｏｓｅ）、セロビオース、アミロペクチン、グルコサミン、マンノサミン、フコース、グルクロン酸、グルコン酸、グルコノラクトン、アベクオース（ａｂｅｑｕｏｓｅ）、ガラクトサミン、ビートオリゴ糖、イソマルト－オリゴ糖（イソマルトース、イソマルトトリオース、パノース（ｐａｎｏｓｅ）など）、キシロ－オリゴ糖（キシロトリオース（ｘｙｌｏｔｒｉｏｓｅ）、キシロビオースなど）、キシロ末端オリゴ糖、ゲンチオ－オリゴ糖（ゲンチオビオース、ゲンチオトリオース、ゲンチオテトラオースなど）、ソルボース、ニゲロ－オリゴ糖、パラチノースオリゴ糖、フルクトオリゴ糖（ケストース（ｋｅｓｔｏｓｅ）、ニストースなど）、マルトテトラオール（ｍａｌｔｏｔｅｔｒａｏｌ）、マルトトリオール（ｍａｌｔｏｔｒｉｏｌ）、マルト－オリゴ糖（マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースなど）、デンプン、イヌリン、イヌロオリゴ糖、ラクツロース、メリビオース、ラフィノース、リボース、異性化液糖（高フルクトースコーンシロップ、カップリングシュガー及びダイズオリゴ糖など）を含む。その上、本明細書において使用される炭水化物は、Ｄ－又はＬ－立体配置のいずれであってもよい。
【0164】
本発明により得られる高度に精製された目標ステビオールグリコシド（単数又は複数）、特にｒｅｂ Ｄ及び／又はｒｅｂ Ｘは、種々の生理学的活性物質又は機能性成分との組合せで使用できる。機能性成分は、カロテノイド、食物繊維、脂肪酸、サポニン、抗酸化物質、栄養補助食品、フラボノイド、イソチオシアン酸、フェノール、植物ステロール及びスタノール（フィトステロール及びフィトスタノール）；ポリオール；プレバイオティクス、プロバイオティクス；フィトエストロゲン；ダイズタンパク質；硫化物／チオール；アミノ酸；タンパク質；ビタミン；及びミネラルなどの部類に一般に分類される。機能性成分は、心血管系、コレステロール低減及び抗炎症性などのそれらの健康効果に基づいても分類できる。
【0165】
本発明により得られる高度に精製された目標ステビオールグリコシド（単数又は複数）、特にｒｅｂ Ｄ及び／又はｒｅｂ Ｘは、味覚特徴が改善されたゼロカロリー、低カロリー又は糖尿病用飲料及び食品を産生するための高甘味度甘味料として適用できる。それは、糖を使用できない飲料、食糧、医薬品及び他の製品においても使用できる。その上、高度に精製された目標ステビオールグリコシド（単数又は複数）、特にｒｅｂ Ｄ及び／又はｒｅｂ Ｘは、飲料、食糧及びヒトが消費するための他の製品だけでなく、特徴が改善された動物用餌及び飼料においても甘味料として使用できる。
【0166】
高度に精製された目標ステビオールグリコシド（単数又は複数）、特にｒｅｂ Ｄ及び／又はｒｅｂ Ｘを甘味化合物として使用できる製品の例は、これだけに限らないが、ウオッカ、ワイン、ビール、酒、及び日本酒などのアルコール性飲料；天然果汁；清涼飲料水；炭酸清涼飲料；ダイエット飲料；ゼロカロリー飲料；低カロリー飲料及び食品；ヨーグルト飲料；インスタント果汁；インスタントコーヒー；粉末型インスタント飲料；缶詰製品；シロップ；発酵ダイズペースト；醤油；ワイン酢；ドレッシング；マヨネーズ；ケチャップ；カレー；スープ；インスタントブイヨン；粉末醤油；粉末酢；ビスケット類；米菓；クラッカー；パン；チョコレート；キャラメル；飴；チューインガム；ゼリー；プディング；保存果実及び野菜；新鮮クリーム；ジャム；マーマレード；フラワーペースト；粉乳；アイスクリーム；シャーベット；瓶詰め野菜及び果実；茹で豆缶詰；甘いソースで煮た肉及び食品；農産植物性食品；海産物；ハム；ソーセージ；魚肉ハム；魚肉ソーセージ；魚すり身；揚げ魚製品；乾燥海産物；冷凍食品；保存海藻；保存食肉；タバコ；医薬品；などを含む。原則としてそれは、無条件で適用できる。
【0167】
食糧、飲料、医薬品、化粧品、卓上製品及びチューインガムなどの製品の製造の際に、混合、混練、溶解、酢洗い、浸透、浸出、散布、微粒化、注入及び他の方法などの従来法は使用できる。
【0168】
さらに、本発明において得られる高度に精製された目標ステビオールグリコシド（単数又は複数）、特にｒｅｂ Ｄ及び／又はｒｅｂ Ｘは、乾燥又は液体形態で使用できる。それは、食品の加熱処理の前又は後に添加できる。高度に精製された目標ステビオールグリコシド（単数又は複数）、特にｒｅｂ Ｄ及び／又はｒｅｂ Ｘの量は、使用目的に依存する。上に考察したとおりそれは、単独で又は他の化合物との組合せで添加できる。
【0169】
次の例は、高度に精製された目標ステビオールグリコシド（単数又は複数）、特にｒｅｂ Ｄ及び／又はｒｅｂ Ｘの調製のための本発明の好ましい実施形態を例示する。本発明が、単に例示的である実施例に示される材料、割合、条件及び手順に限定されないことは理解される。
【実施例0170】
（実施例１）
ＵＧＴ７６Ｇ１のｉｎ－ｖｉｖｏ産生
ＮｃｏＩ及びＮｄｅＩ制限部位をＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＲ０６９１２．１に記載のとおり元の核酸配列に付加した。コドン最適化後に、次の核酸配列（配列番号１）を得た：
配列表フリーテキスト
ＵＧＴ７６Ｇ１のｉｎ－ｖｉｖｏ産生
ＮｃｏＩ及びＮｄｅＩ制限部位をＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＲ０６９１２．１に記載のとおり元の核酸配列に付加した。コドン最適化後に、次の核酸配列（配列番号１）を得た：
配列表フリーテキスト
【0171】
【化2】
【0172】
遺伝子の合成並びにＮｄｅＩ及びＸｈｏＩクローニング部位を使用するｐＥＴ３０Ａ＋ベクターへのサブクローニング後に、ＵＧＴ７６Ｇ１ ｐＥＴ３０ａ＋プラスミドを大腸菌Ｂ１２１（ＤＥ３）及び大腸菌ＥＣ１００に電気穿孔法によって導入した。得られた細胞をカナマイシンの存在下でペトリ皿で増殖させ、好適なコロニーを選択し、液体ＬＢ培地（三角フラスコ）中で増殖させた。グリセロールを懸濁液に凍結保護物質として加え、４００μＬ一定分量を－２０℃及び－８０℃で保存した。
【0173】
ｐＥＴ３０Ａ＋ ＵＧＴ７６Ｇ１プラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の保存一定分量を融解し、ＬＢＧＫＰ培地（２０ｇ／Ｌ Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ Ｌｅｎｎｏｘ；５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．００；５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．００；２．５ｇ／Ｌグルコース及び５０ｍｇ／Ｌカナマイシン）３０ｍＬに加えた。この培養物を１３５ｒｐｍ、３０℃で８時間振盪した。
【0174】
産生培地は、６０ｇ／Ｌ ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ培地（Ｎｏｖａｇｅｎ）、１０ｇ／Ｌグリセロール及び５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有していた。ＯＤ及びｐＨを測定するために試料を採取する間、培地を２０℃で撹拌した。培養物は、顕著な増殖を示し、良好なＯＤが得られた。４０時間後、細胞を遠心分離によって収得及び凍結し、湿重量１２．７ｇの細胞を得た。
【0175】
溶解をＢｕｇｂｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｎｏｖａｇｅｎ）の添加によって実施し、可溶化物を遠心分離によって回収し、凍結保存した。融解した可溶化物を用いて活性試験を実施した。
【0176】
（実施例２）
ＵＧＴ７６Ｇ１のｉｎ－ｖｉｔｒｏ産生
ＰｒｏｍｅｇａからのＳ３０ Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ発現系キットを使用した。大腸菌ＥＣ１００からのＵＧＴ７６Ｇ１ ｐＥＴ３０ａ＋プラスミド４μｇをＳ３０ ｐｒｅｍｉｘ ｐｌｕｓ ８０μＬと混合し、Ｓ３０ Ｔ７抽出物７２μＬを加えた。総容積２００μＬにするためにヌクレアーゼ不含有水を加え、得られた溶液を２時間、３０℃でインキュベートした。１８０μＬを触媒試験反応に使用した。
ＵＧＴ７６Ｇ１のｉｎ－ｖｉｔｒｏ産生
ＰｒｏｍｅｇａからのＳ３０ Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ発現系キットを使用した。大腸菌ＥＣ１００からのＵＧＴ７６Ｇ１ ｐＥＴ３０ａ＋プラスミド４μｇをＳ３０ ｐｒｅｍｉｘ ｐｌｕｓ ８０μＬと混合し、Ｓ３０ Ｔ７抽出物７２μＬを加えた。総容積２００μＬにするためにヌクレアーゼ不含有水を加え、得られた溶液を２時間、３０℃でインキュベートした。１８０μＬを触媒試験反応に使用した。
【0177】
（実施例３）
ＵＧＴ９１Ｄ２のｉｎ－ｖｉｔｒｏ産生
ＮｃｏＩ及びＮｄｅＩ制限部位をＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＣＥ８７８５５．１に記載のとおり元の核酸配列に付加した。コドン最適化後に、次の核酸配列（配列番号２）を得た：
配列表フリーテキスト
ＵＧＴ９１Ｄ２のｉｎ－ｖｉｔｒｏ産生
ＮｃｏＩ及びＮｄｅＩ制限部位をＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＣＥ８７８５５．１に記載のとおり元の核酸配列に付加した。コドン最適化後に、次の核酸配列（配列番号２）を得た：
配列表フリーテキスト
【0178】
【化3】
【0179】
遺伝子の合成並びにＮｃｏＩ及びＸｈｏＩクローニング部位を使用するｐＥＴ３０Ａ＋ベクターへのサブクローニング後に、ＵＧＴ９１Ｄ２ ｐＥＴ３０ａ＋プラスミドを大腸菌ＥＣ１００に電気穿孔法によって導入した。得られた細胞をカナマイシンの存在下で増殖させ、好適なコロニーを選択し、液体ＬＢ培地（三角フラスコ）中で増殖させた。グリセロールを懸濁液に凍結保護物質として加え、４００μＬ一定分量を－２０℃及び－８０℃で保存した。
【0180】
ＰｒｏｍｅｇａからのＳ３０ Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ発現系キットをタンパク質のｉｎ－ｖｉｔｒｏ合成のために使用した。
【0181】
ＵＧＴ９１Ｄ２ ｐＥＴ３０ａ＋プラスミド４μｇをＳ３０ ｐｒｅｍｉｘ ｐｌｕｓ ８０μＬと混合し、Ｓ３０ Ｔ７抽出物７２μＬを加えた。総容積２００μＬにするためにヌクレアーゼ不含有水を加え、得られた溶液を２時間、３０℃でインキュベートした。５μＬをＳＤＳ－ｐａｇｅ分析に使用し、残りの４５μＬを触媒試験反応に使用した。
【0182】
（実施例４）
ｉｎ－ｖｉｖｏ産生ＵＧＴ７６Ｇ１を用いた触媒反応
反応の総容量は５．０ｍＬであり、次の組成を有していた：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ ＵＤＰ－グルコース、０．５ｍＭステビオシド及びＵＧＴ７６Ｇ１融解可溶化物５００μＬ。反応は３０℃、オービタリー振盪機、１３５ｒｐｍで実行した。各試料について、反応混合物４６０μＬを２Ｎ Ｈ２ＳＯ４ ４０μＬ及びメタノール／水（６／４）４２０μＬでクエンチした。試料を直ちに遠心分離し、ＨＰＬＣ（ＣＡＤ）による分析まで１０℃で保存した。ＨＰＬＣは、ステビオシドのレバウジオシドＡへのほぼ完全な変換を示した。
ｉｎ－ｖｉｖｏ産生ＵＧＴ７６Ｇ１を用いた触媒反応
反応の総容量は５．０ｍＬであり、次の組成を有していた：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ ＵＤＰ－グルコース、０．５ｍＭステビオシド及びＵＧＴ７６Ｇ１融解可溶化物５００μＬ。反応は３０℃、オービタリー振盪機、１３５ｒｐｍで実行した。各試料について、反応混合物４６０μＬを２Ｎ Ｈ２ＳＯ４ ４０μＬ及びメタノール／水（６／４）４２０μＬでクエンチした。試料を直ちに遠心分離し、ＨＰＬＣ（ＣＡＤ）による分析まで１０℃で保存した。ＨＰＬＣは、ステビオシドのレバウジオシドＡへのほぼ完全な変換を示した。
【0183】
【化4】
【0184】
（実施例５）
ｉｎ－ｖｉｔｒｏ産生ＵＧＴ９１Ｄ２を用いた触媒反応
反応の総容量は０．５ｍＬであり、次の組成を有していた：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、３．８ｍＭ ＵＤＰ－グルコース、０．１ｍＭレバウジオシドＡ及びｉｎ－ｖｉｔｒｏ産生ＵＧＴ９１Ｄ２ １８０μＬ。反応は３０℃、オービタリー振盪機、１３５ｒｐｍで実行した。各試料について、反応混合物４５０μＬを２Ｎ Ｈ２ＳＯ４ ４５μＬ及び６０％ＭｅＯＨ ４０５μＬでクエンチした。遠心分離後、上清をＨＰＬＣ（ＣＡＤ）で分析した。ＨＰＬＣは、１２０時間後にレバウジオシドＡのレバウジオシドＤへの４．７％変換を示した。
ｉｎ－ｖｉｔｒｏ産生ＵＧＴ９１Ｄ２を用いた触媒反応
反応の総容量は０．５ｍＬであり、次の組成を有していた：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、３．８ｍＭ ＵＤＰ－グルコース、０．１ｍＭレバウジオシドＡ及びｉｎ－ｖｉｔｒｏ産生ＵＧＴ９１Ｄ２ １８０μＬ。反応は３０℃、オービタリー振盪機、１３５ｒｐｍで実行した。各試料について、反応混合物４５０μＬを２Ｎ Ｈ２ＳＯ４ ４５μＬ及び６０％ＭｅＯＨ ４０５μＬでクエンチした。遠心分離後、上清をＨＰＬＣ（ＣＡＤ）で分析した。ＨＰＬＣは、１２０時間後にレバウジオシドＡのレバウジオシドＤへの４．７％変換を示した。
【0185】
（実施例６）
ｉｎ－ｖｉｔｒｏ産生ＵＧＴ７６Ｇ１を用いた触媒反応
反応の総容量は２ｍＬであり、次の組成を有していた：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、３．８ｍＭ ＵＤＰ－グルコース、０．５ｍＭレバウジオシドＤ及びｉｎ－ｖｉｔｒｏ産生ＵＧＴ７６Ｇ１ １８０μＬ。反応は３０℃、オービタリー振盪機、１３５ｒｐｍで実行した。各試料について、反応混合物４００μＬを２Ｎ Ｈ２ＳＯ４ ４０μＬ及び６０％ＭｅＯＨ ３６０μＬでクエンチした。遠心分離後、上清をＨＰＬＣ（ＣＡＤ）で分析した。ＨＰＬＣは、１２０時間後にレバウジオシドＤのレバウジオシドＸへの８０％変換を示した。
ｉｎ－ｖｉｔｒｏ産生ＵＧＴ７６Ｇ１を用いた触媒反応
反応の総容量は２ｍＬであり、次の組成を有していた：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、３．８ｍＭ ＵＤＰ－グルコース、０．５ｍＭレバウジオシドＤ及びｉｎ－ｖｉｔｒｏ産生ＵＧＴ７６Ｇ１ １８０μＬ。反応は３０℃、オービタリー振盪機、１３５ｒｐｍで実行した。各試料について、反応混合物４００μＬを２Ｎ Ｈ２ＳＯ４ ４０μＬ及び６０％ＭｅＯＨ ３６０μＬでクエンチした。遠心分離後、上清をＨＰＬＣ（ＣＡＤ）で分析した。ＨＰＬＣは、１２０時間後にレバウジオシドＤのレバウジオシドＸへの８０％変換を示した。
【0186】
【化5】
【0187】
実施例７～１２について、次の略号を使用した：
ＬＢＧＫＰ培地：２０ｇ／Ｌ Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ Ｌｅｎｎｏｘ；５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．００；５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．００；２．５ｇ／Ｌグルコース及び５０ｍｇ／Ｌカナマイシン又はアンピシリン
ＬＢ培地：（２０ｇ／Ｌ Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ Ｌｅｎｎｏｘ）
ＬＢＧＫＰ培地：２０ｇ／Ｌ Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ Ｌｅｎｎｏｘ；５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．００；５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．００；２．５ｇ／Ｌグルコース及び５０ｍｇ／Ｌカナマイシン又はアンピシリン
ＬＢ培地：（２０ｇ／Ｌ Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ Ｌｅｎｎｏｘ）
【0188】
（実施例７）
ｐＥＴ３０ａ＋プラスミド及びＢＬ２１（ＤＥ３）発現株によって調製されたＵＧＴ７６Ｇ１の調製及び活性
ｐＥＴ３０ａ＋ ＵＧＴ７６Ｇ１プラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）発現株（Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｅ．Ｃｌｏｎｉ（登録商標）ＥＸＰＲＥＳＳ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ）に形質転換した。得られた細胞をカナマイシンの存在下でペトリ皿中のＬＢ Ａｇａｒ培地で増殖させた。好適なコロニーを選択し、カナマイシンを含有する液体ＬＢＧＫＰ培地中で増殖させた。グリセロールを加え、４００μＬ一定分量を－２０℃及び－８０℃で保存した。
ｐＥＴ３０ａ＋プラスミド及びＢＬ２１（ＤＥ３）発現株によって調製されたＵＧＴ７６Ｇ１の調製及び活性
ｐＥＴ３０ａ＋ ＵＧＴ７６Ｇ１プラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）発現株（Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｅ．Ｃｌｏｎｉ（登録商標）ＥＸＰＲＥＳＳ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ）に形質転換した。得られた細胞をカナマイシンの存在下でペトリ皿中のＬＢ Ａｇａｒ培地で増殖させた。好適なコロニーを選択し、カナマイシンを含有する液体ＬＢＧＫＰ培地中で増殖させた。グリセロールを加え、４００μＬ一定分量を－２０℃及び－８０℃で保存した。
【0189】
保存一定分量を融解し、ＬＢＧＫＰ培地３０ｍＬに加えた。この培養物を３０℃で８時間振盪し、続いて「Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ ｍｅｄｉｕｍ」（Ｎｏｖａｇｅｎ、参照番号７１４９１－５）６０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌグリセロール及び５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有する産生培地４００ｍＬに接種するために使用した。ＯＤ（６００ｎｍ）及びｐＨを測定するために試料を採取する間、培地を２０℃で撹拌した。４０時間後、細胞を遠心分離によって回収し、凍結した。得られた細胞湿重量は１０．５８ｇであった。
【0190】
得られた沈殿の３．２４ｇを「Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ」（Ｎｏｖａｇｅｎ、参照番号７１４５６）８．１ｍＬ及び水３．５ｍＬの添加によって溶解した。可溶化物を遠心分離によって回収し、凍結保存した。
【0191】
（実施例８）
ｐＥＴ３０ａ＋プラスミド及びＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）発現株によって調製されたＵＧＴ７６Ｇ１の調製及び活性
ｐＥＴ３０ａ＋ ＵＧＴ７６Ｇ１プラスミドをＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）発現株（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｔｕｎｅｒ（商標）（ＤＥ３）コンピテント細胞）に熱ショック処理によって形質転換した。得られた細胞をカナマイシンの存在下でペトリ皿中のＬＢ Ａｇａｒ培地で増殖させた。好適なコロニーを選択し、カナマイシンを含有する）液体ＬＢＧＫＰ培地中で増殖させた。グリセロールを加え、４００μＬ一定分量を－２０℃及び－８０℃で保存した。
ｐＥＴ３０ａ＋プラスミド及びＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）発現株によって調製されたＵＧＴ７６Ｇ１の調製及び活性
ｐＥＴ３０ａ＋ ＵＧＴ７６Ｇ１プラスミドをＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）発現株（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｔｕｎｅｒ（商標）（ＤＥ３）コンピテント細胞）に熱ショック処理によって形質転換した。得られた細胞をカナマイシンの存在下でペトリ皿中のＬＢ Ａｇａｒ培地で増殖させた。好適なコロニーを選択し、カナマイシンを含有する）液体ＬＢＧＫＰ培地中で増殖させた。グリセロールを加え、４００μＬ一定分量を－２０℃及び－８０℃で保存した。
【0192】
保存一定分量を融解し、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有するＬＢ培地１００ｍＬに加えた。この培養物を３０℃で１５時間振盪した。この培養物４．４ｍＬをＬＢを含有する産生培地２００ｍＬに接種するために使用した。この培地をＯＤ（６００ｎｍ）０．９が得られるまで３７℃で撹拌し、その後１００ｍＭ ＩＰＴＧ溶液４００μＬを加え、培地を３０℃で４時間撹拌した。細胞を遠心分離によって回収し、凍結した。得られた細胞湿重量は１．３８ｇであった。
【0193】
得られた沈殿を「Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ」（Ｎｏｖａｇｅｎ、参照番号７１４５６）４．９ｍＬ及び水２．１ｍＬの添加によって溶解した。可溶化物を遠心分離によって回収し、凍結保存した。
【0194】
（実施例９）
ｐＭＡＬプラスミド及びＢＬ２１発現株によって調製されたＵＧＴ７６Ｇ１の調製及び活性
Ｎｄｅ１及びＳａｌ１クローニング部位を使用する合成ＵＧＴ７６Ｇ１遺伝子のｐＭＡＬプラスミドへのサブクローニング後に、ｐＭＡＬ ＵＧＴ７６Ｇ１プラスミドをＢＬ２１発現株（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＢＬ２１コンピテント大腸菌）に熱ショック処理によって形質転換した。得られた細胞をアンピシリンの存在下でペトリ皿中のＬＢ Ａｇａｒ培地で増殖させた。好適なコロニーを選択し、アンピシリンを含有する）液体ＬＢＧＫＰ培地中で増殖させた。グリセロールを加え、４００μＬ一定分量を－２０℃及び－８０℃で保存した。
ｐＭＡＬプラスミド及びＢＬ２１発現株によって調製されたＵＧＴ７６Ｇ１の調製及び活性
Ｎｄｅ１及びＳａｌ１クローニング部位を使用する合成ＵＧＴ７６Ｇ１遺伝子のｐＭＡＬプラスミドへのサブクローニング後に、ｐＭＡＬ ＵＧＴ７６Ｇ１プラスミドをＢＬ２１発現株（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＢＬ２１コンピテント大腸菌）に熱ショック処理によって形質転換した。得られた細胞をアンピシリンの存在下でペトリ皿中のＬＢ Ａｇａｒ培地で増殖させた。好適なコロニーを選択し、アンピシリンを含有する）液体ＬＢＧＫＰ培地中で増殖させた。グリセロールを加え、４００μＬ一定分量を－２０℃及び－８０℃で保存した。
【0195】
保存一定分量を融解し、ＬＢＧＫＰ培地３０ｍＬに加えた。この培養物を３０℃で８時間振盪し、次いで「Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ ｍｅｄｉｕｍ」（Ｎｏｖａｇｅｎ、参照番号７１４９１－５）６０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌグリセロール及び５０ｍｇ／Ｌアンピシリンを含有する産生培地４００ｍＬに接種するために使用した。ＯＤ及びｐＨを測定するために試料を採取する間、培地を２０℃で撹拌した。４０時間後、細胞を遠心分離によって回収し、凍結した。得られた細胞湿重量は５．８６ｇであった。
【0196】
得られた沈殿の２．７４ｇを「Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」（Ｎｏｖａｇｅｎ、参照番号７１４５６）９．６ｍＬ及び水４．１ｍＬの添加によって溶解した。可溶化物を遠心分離によって回収し、凍結保存した。
【0197】
（実施例１０）
ｐＭＡＬプラスミド及びＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ発現株によって調製されたＵＧＴ７６Ｇ１の調製及び活性
ｐＭＡＬ ＵＧＴ７６Ｇ１プラスミドをＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ発現株（Ａｇｉｌｅｎｔ ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓコンピテント細胞）に熱ショック処理によって形質転換した。得られた細胞をアンピシリン及びジェネテシンの存在下でペトリ皿中のＬＢ Ａｇａｒ培地で増殖させた。好適なコロニーを選択し、アンピシリン及びジェネテシンを含有する液体ＬＢＧＫＰ培地中で増殖させた。グリセロールを加え、４００μＬ一定分量を－２０℃及び－８０℃で保存した。
ｐＭＡＬプラスミド及びＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ発現株によって調製されたＵＧＴ７６Ｇ１の調製及び活性
ｐＭＡＬ ＵＧＴ７６Ｇ１プラスミドをＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ発現株（Ａｇｉｌｅｎｔ ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓコンピテント細胞）に熱ショック処理によって形質転換した。得られた細胞をアンピシリン及びジェネテシンの存在下でペトリ皿中のＬＢ Ａｇａｒ培地で増殖させた。好適なコロニーを選択し、アンピシリン及びジェネテシンを含有する液体ＬＢＧＫＰ培地中で増殖させた。グリセロールを加え、４００μＬ一定分量を－２０℃及び－８０℃で保存した。
【0198】
保存一定分量を融解し、ＬＢＧＫＰ培地３０ｍＬ（アンピシリン及びジェネテシンを含有する）に加えた。この培養物を３０℃で８時間振盪し、次いで「Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ ｍｅｄｉｕｍ」（Ｎｏｖａｇｅｎ、参照番号７１４９１－５）６０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌグリセロール及び５０ｍｇ／Ｌアンピシリンを含有する産生培地４００ｍＬに接種するために使用した。ＯＤ（６００ｎｍ）及びｐＨを測定するために試料を採取する間、培地を１２℃で撹拌した。６８時間後、細胞を遠心分離によって回収し、凍結した。得られた細胞湿重量は８．９６ｇであった。
【0199】
得られた沈殿の２．４７ｇを「Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」（Ｎｏｖａｇｅｎ、参照番号７１４５６）８．７３ｍＬ及び水３．７９ｍＬの添加によって溶解した。可溶化物を遠心分離によって回収し、凍結保存した。
【0200】
（実施例１１）
ｐＣＯＬＤＩＩＩプラスミド及びＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ発現株によって調製されたＵＧＴ７６Ｇ１の調製及び活性
Ｎｄｅ１及びＸｈｏ１クローニング部位を使用する合成ＵＧＴ７６Ｇ１遺伝子のｐＣＯＬＤＩＩＩプラスミドへのサブクローニング後に、ｐＣＯＬＤＩＩＩ ＵＧＴ７６Ｇ１プラスミドをＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ発現株（Ａｇｉｌｅｎｔ ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓコンピテント細胞）に熱ショック処理によって形質転換した。得られた細胞をアンピシリン及びジェネテシンの存在下でペトリ皿中のＬＢ Ａｇａｒ培地で増殖させた。好適なコロニーを選択し、アンピシリン及びジェネテシンを含有する液体ＬＢＧＫＰ培地中で増殖させた。グリセロールを加え、４００μＬ一定分量を－２０℃及び－８０℃で保存した。
ｐＣＯＬＤＩＩＩプラスミド及びＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ発現株によって調製されたＵＧＴ７６Ｇ１の調製及び活性
Ｎｄｅ１及びＸｈｏ１クローニング部位を使用する合成ＵＧＴ７６Ｇ１遺伝子のｐＣＯＬＤＩＩＩプラスミドへのサブクローニング後に、ｐＣＯＬＤＩＩＩ ＵＧＴ７６Ｇ１プラスミドをＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ発現株（Ａｇｉｌｅｎｔ ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓコンピテント細胞）に熱ショック処理によって形質転換した。得られた細胞をアンピシリン及びジェネテシンの存在下でペトリ皿中のＬＢ Ａｇａｒ培地で増殖させた。好適なコロニーを選択し、アンピシリン及びジェネテシンを含有する液体ＬＢＧＫＰ培地中で増殖させた。グリセロールを加え、４００μＬ一定分量を－２０℃及び－８０℃で保存した。
【0201】
保存一定分量を融解し、ＬＢＧＫＰ培地３０ｍＬ（アンピシリン及びジェネテシンを含有する）に加えた。この培養物を３０℃で８時間振盪し、次いで「Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ ｍｅｄｉｕｍ」（Ｎｏｖａｇｅｎ、参照番号７１４９１－５）６０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌのグリセロール及び５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有する産生培地４００ｍＬに接種するために使用した。ＯＤ（６００ｎｍ）及びｐＨを測定するために試料を採取する間、培地を１２℃で撹拌した。６３時間後、細胞を遠心分離によって回収し、凍結した。得られた細胞湿重量は６．５４ｇであった。
【0202】
得られた沈殿の２．８１ｇを「Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」（Ｎｏｖａｇｅｎ、参照番号７１４５６）９．８ｍＬ及び水４．２ｍＬの添加によって溶解した。可溶化物を遠心分離によって回収し、凍結保存した。
【0203】
（実施例１２）
ｐＣＯＬＤＩＩＩプラスミド及びＯｒｉｇａｍｉ２（ＤＥ３）発現株によって調製されたＵＧＴ７６Ｇ１の調製及び活性
ｐＣＯＬＤＩＩＩ ＵＧＴ７６Ｇ１プラスミドをＯｒｉｇａｍｉ２（ＤＥ３）発現株（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｏｒｉｇａｍｉ（商標）２（ＤＥ３）コンピテント細胞）に熱ショック処理によって形質転換した。得られた細胞をアンピシリンの存在下でペトリ皿中のＬＢ Ａｇａｒ培地で増殖させた。好適なコロニーを選択し、アンピシリンを含有する液体ＬＢＧＫＰ培地中で増殖させた。グリセロールを加え、４００μＬ一定分量を－２０℃及び－８０℃で保存した。
ｐＣＯＬＤＩＩＩプラスミド及びＯｒｉｇａｍｉ２（ＤＥ３）発現株によって調製されたＵＧＴ７６Ｇ１の調製及び活性
ｐＣＯＬＤＩＩＩ ＵＧＴ７６Ｇ１プラスミドをＯｒｉｇａｍｉ２（ＤＥ３）発現株（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｏｒｉｇａｍｉ（商標）２（ＤＥ３）コンピテント細胞）に熱ショック処理によって形質転換した。得られた細胞をアンピシリンの存在下でペトリ皿中のＬＢ Ａｇａｒ培地で増殖させた。好適なコロニーを選択し、アンピシリンを含有する液体ＬＢＧＫＰ培地中で増殖させた。グリセロールを加え、４００μＬ一定分量を－２０℃及び－８０℃で保存した。
【0204】
保存一定分量を融解し、ＬＢＧＫＰ培地（アンピシリンを含有する）３０ｍＬに加えた。この培養物を３０℃で８時間振盪し、次いで「Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ ｍｅｄｉｕｍ」（Ｎｏｖａｇｅｎ、参照番号７１４９１－５）６０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌグリセロール及び５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有する産生培地４００ｍＬに接種するために使用した。ＯＤ（６００ｎｍ）及びｐＨを測定するために試料を採取する間、培地を１２℃で撹拌した。６８時間後、細胞を遠心分離によって回収し、凍結した。得られた細胞湿重量は２．５３ｇであった。
【0205】
得られた沈殿の１．７１ｇを「Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ」（Ｎｏｖａｇｅｎ、参照番号７１４５６）６．０ｍＬ及び水１．９ｍＬの添加によって溶解した。可溶化物を遠心分離によって回収し、凍結保存した。
【0206】
（実施例１３）
活性の決定
活性試験を、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２中の０．５ｍＭ基質、２．５ｍＭ ＵＤＰ－グルコース及び３ｍＭ ＭｇＣｌ２を使用して、ステビオシドからレバウジオシドＡへ及びレバウジオシドＤからレバウジオシドＸへの転換について融解した可溶化物５００μＬで５ｍＬスケールで実施した。試料を採取し、ＨＰＬＣによって分析した。ＵＧＴ７６Ｇ１のさまざまな調製物についての結果を次の表に要約する。
活性の決定
活性試験を、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２中の０．５ｍＭ基質、２．５ｍＭ ＵＤＰ－グルコース及び３ｍＭ ＭｇＣｌ２を使用して、ステビオシドからレバウジオシドＡへ及びレバウジオシドＤからレバウジオシドＸへの転換について融解した可溶化物５００μＬで５ｍＬスケールで実施した。試料を採取し、ＨＰＬＣによって分析した。ＵＧＴ７６Ｇ１のさまざまな調製物についての結果を次の表に要約する。
【0207】
【表2】
【0208】
（実施例１４）
レバウジオシドＤからレバウジオシドＸへの転換についての５０ｍＬスケール反応
実施例１２の可溶化物５ｍＬをレバウジオシドＤからレバウジオシドＸへの転換のために５０ｍＬスケールで使用した。反応媒体は、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ ＵＤＰ－グルコース及び０．５ｍＭレバウジオシドＤからなった。反応物を３０℃、９０時間振盪した後、エタノール５０ｍＬを加え、生じた混合物を－２０℃で１ｈ撹拌させた。５０００ｇ、１０分間の遠心分離後、上清を限外ろ過（Ｖｉｖａｆｌｏｗ ＭＷＣＯ ３００００）を介して精製した。透過液７８ｍＬを得て、残余分９ｍＬをエタノール９ｍＬで希釈し、限外ろ過（Ｖｉｖａｆｌｏｗ ＭＷＣＯ ３００００）に再度供した。別にろ液１４ｍＬを得て、最初の透過液と合わせた。合わせた透過液を減圧下、３０℃で３２ｍＬの清澄溶液が得られるまで濃縮した。
レバウジオシドＤからレバウジオシドＸへの転換についての５０ｍＬスケール反応
実施例１２の可溶化物５ｍＬをレバウジオシドＤからレバウジオシドＸへの転換のために５０ｍＬスケールで使用した。反応媒体は、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ ＵＤＰ－グルコース及び０．５ｍＭレバウジオシドＤからなった。反応物を３０℃、９０時間振盪した後、エタノール５０ｍＬを加え、生じた混合物を－２０℃で１ｈ撹拌させた。５０００ｇ、１０分間の遠心分離後、上清を限外ろ過（Ｖｉｖａｆｌｏｗ ＭＷＣＯ ３００００）を介して精製した。透過液７８ｍＬを得て、残余分９ｍＬをエタノール９ｍＬで希釈し、限外ろ過（Ｖｉｖａｆｌｏｗ ＭＷＣＯ ３００００）に再度供した。別にろ液１４ｍＬを得て、最初の透過液と合わせた。合わせた透過液を減圧下、３０℃で３２ｍＬの清澄溶液が得られるまで濃縮した。
【0209】
生成混合物のＨＰＬＣトレースを図５に示す。ＨＰＬＣはバイナリーポンプ、オートサンプラー及び恒温装置カラムコンパートメントを備えたＡｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズで実行した。方法は、７０％水（０．１％ギ酸）：３０％アセトニトリルからなる移動相での均一濃度であった。流速は０．１μＬ／分であった。使用したカラムはＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｐｒｏｄｉｇｙ ５μ ＯＤＳ（３）１００Ａ；２５０ｘ２ｍｍであった。カラム温度は４０℃に維持した。注入容量は２０～４０μｌであった。
【0210】
（実施例１５）
ｐＭＡＬプラスミド及びＢＬ２１発現株を使用するＵＧＴ９１Ｄ２の調製
Ｎｄｅ１及びＳａｌ１クローニング部位を使用して合成ＵＧＴ９１Ｄ２遺伝子をｐＭＡＬプラスミド中にサブクローニングした後に、ｐＭＡＬ ＵＧＴ９１Ｄ２プラスミドをＢＬ２１発現株（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＢＬ２１コンピテント大腸菌）中に熱ショック処理によって形質転換した。得られた細胞をアンピシリンの存在下でペトリ皿中のＬＢ Ａｇａｒ培地で増殖させた。好適なコロニーを選択し、アンピシリンを含有する液体ＬＢＧＫＰ培地中で増殖させた）。グリセロールを加え、４００μＬ一定分量を－２０℃及び－８０℃で保存した。
ｐＭＡＬプラスミド及びＢＬ２１発現株を使用するＵＧＴ９１Ｄ２の調製
Ｎｄｅ１及びＳａｌ１クローニング部位を使用して合成ＵＧＴ９１Ｄ２遺伝子をｐＭＡＬプラスミド中にサブクローニングした後に、ｐＭＡＬ ＵＧＴ９１Ｄ２プラスミドをＢＬ２１発現株（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＢＬ２１コンピテント大腸菌）中に熱ショック処理によって形質転換した。得られた細胞をアンピシリンの存在下でペトリ皿中のＬＢ Ａｇａｒ培地で増殖させた。好適なコロニーを選択し、アンピシリンを含有する液体ＬＢＧＫＰ培地中で増殖させた）。グリセロールを加え、４００μＬ一定分量を－２０℃及び－８０℃で保存した。
【0211】
保存一定分量を融解し、ＬＢＧＫＰ培地３０ｍＬに加えた。この培養物を３０℃で８時間振盪し、次いで「Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ ｍｅｄｉｕｍ」（Ｎｏｖａｇｅｎ、参照番号７１４９１－５）６０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌのグリセロール及び５０ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有する産生培地４００ｍＬに接種するために使用した。ＯＤ及びｐＨを測定するために試料を採取する間、培地を２０℃で撹拌した。４０時間後、細胞を遠心分離によって回収し、凍結した。得られた細胞湿重量は１２．３２ｇであった。
【0212】
得られた沈殿の２．１８ｇを「Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」（Ｎｏｖａｇｅｎ、参照番号７１４５６）７．７ｍＬ及び水３．２ｍＬの添加によって溶解した。可溶化物を遠心分離によって回収し、活性試験に直ちに使用した。
【0213】
（実施例１６）
ｐＭＡＬプラスミド及びＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ発現株を使用するＵＧＴ９１Ｄ２の調製
ｐＭＡＬ ＵＧＴ９１Ｄ２プラスミドをＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ発現株（Ａｇｉｌｅｎｔ ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓコンピテント細胞）に熱ショック処理によって形質転換した。得られた細胞をアンピシリン及びジェネテシンの存在下でペトリ皿中のＬＢ Ａｇａｒ培地で増殖させた。好適なコロニーを選択し、アンピシリン及びジェネテシンを含有する液体ＬＢＧＫＰ培地中で増殖させた。グリセロールを加え、４００μＬ一定分量を－２０℃及び－８０℃で保存した。
ｐＭＡＬプラスミド及びＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ発現株を使用するＵＧＴ９１Ｄ２の調製
ｐＭＡＬ ＵＧＴ９１Ｄ２プラスミドをＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ発現株（Ａｇｉｌｅｎｔ ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓコンピテント細胞）に熱ショック処理によって形質転換した。得られた細胞をアンピシリン及びジェネテシンの存在下でペトリ皿中のＬＢ Ａｇａｒ培地で増殖させた。好適なコロニーを選択し、アンピシリン及びジェネテシンを含有する液体ＬＢＧＫＰ培地中で増殖させた。グリセロールを加え、４００μＬ一定分量を－２０℃及び－８０℃で保存した。
【0214】
保存一定分量を融解し、ＬＢＧＫＰ培地（アンピシリン及びジェネテシンを含有する）３０ｍＬに加えた。この培養物を３０℃で８時間振盪し、次いで「Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ ｍｅｄｉｕｍ」（Ｎｏｖａｇｅｎ、参照番号７１４９１－５）６０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌグリセロール及び５０ｍｇ／Ｌアンピシリンを含有する産生培地４００ｍＬに接種するために使用した。ＯＤ（６００ｎｍ）及びｐＨを測定するために試料を採取する間、培地を２０℃、１６時間、次にさらに５０時間、１２℃で撹拌した。細胞を遠心分離によって回収し、凍結した。得られた細胞湿重量は１５．７７ｇであった。
【0215】
得られた沈殿の２．５７ｇを「Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」（Ｎｏｖａｇｅｎ、参照番号７１４５６）９．０ｍＬ及び水３．８ｍＬの添加によって溶解した。可溶化物を遠心分離によって回収し、活性試験に直ちに使用した。
【0216】
（実施例１７）
ｐＥＴ３０ａ＋プラスミド及びＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）発現株を使用するＵＧＴ９１Ｄ２の調製
ｐＥＴ３０ａ＋ ＵＧＴ９１Ｄ２プラスミドをＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）発現株（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｔｕｎｅｒ（商標）（ＤＥ３）コンピテント細胞）に熱ショック処理によって形質転換した。得られた細胞をカナマイシンの存在下でペトリ皿中のＬＢ Ａｇａｒ培地で増殖させた。好適なコロニーを選択し（カナマイシンを含有する）液体ＬＢＧＫＰ培地中で増殖させた。グリセロールを加え、４００μＬ一定分量を－２０℃及び－８０℃で保存した。
ｐＥＴ３０ａ＋プラスミド及びＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）発現株を使用するＵＧＴ９１Ｄ２の調製
ｐＥＴ３０ａ＋ ＵＧＴ９１Ｄ２プラスミドをＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）発現株（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｔｕｎｅｒ（商標）（ＤＥ３）コンピテント細胞）に熱ショック処理によって形質転換した。得られた細胞をカナマイシンの存在下でペトリ皿中のＬＢ Ａｇａｒ培地で増殖させた。好適なコロニーを選択し（カナマイシンを含有する）液体ＬＢＧＫＰ培地中で増殖させた。グリセロールを加え、４００μＬ一定分量を－２０℃及び－８０℃で保存した。
【0217】
保存一定分量を融解し、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有するＬＢ培地１００ｍＬに加えた。この培養物を３０℃で１５時間振盪した。この培養物６．２ｍＬをＬＢを含有する産生培地５００ｍＬに接種するために使用した。この培地をＯＤ（６００ｎｍ）０．９が得られるまで３７℃で撹拌し、その後１００ｍＭ ＩＰＴＧ溶液５００μＬを加え（培地中のＩＰＴＧ濃度は１００μＭ）、培地を３０℃で４時間撹拌し、細胞を遠心分離によって回収し、凍結した。得られた細胞湿重量は４．０２ｇであった。
【0218】
得られた沈殿の１．９２ｇを「Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ」（Ｎｏｖａｇｅｎ、参照番号７１４５６）６．８ｍＬ及び水２．８ｍＬの添加によって溶解した。可溶化物を遠心分離によって回収し、直ちに活性の試験をした。
【0219】
（実施例１８）
ｐＥＴ３０ａ＋プラスミド及びＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ発現株を使用するＵＧＴ９１Ｄ２の調製
ｐＥＴ３０ａ＋ ＵＧＴ９１Ｄ２プラスミドをＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）発現株（Ａｇｉｌｅｎｔ ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓコンピテント細胞）に熱ショック処理によって形質転換した。得られた細胞をカナマイシン及びジェネテシンの存在下でペトリ皿中のＬＢ Ａｇａｒ培地で増殖させた。好適なコロニーを選択し、カナマイシン及びジェネテシンを含有する液体ＬＢＧＫＰ培地中で増殖させた。グリセロールを加え、４００μＬ一定分量を－２０℃及び－８０℃で保存した。
ｐＥＴ３０ａ＋プラスミド及びＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ発現株を使用するＵＧＴ９１Ｄ２の調製
ｐＥＴ３０ａ＋ ＵＧＴ９１Ｄ２プラスミドをＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）発現株（Ａｇｉｌｅｎｔ ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓコンピテント細胞）に熱ショック処理によって形質転換した。得られた細胞をカナマイシン及びジェネテシンの存在下でペトリ皿中のＬＢ Ａｇａｒ培地で増殖させた。好適なコロニーを選択し、カナマイシン及びジェネテシンを含有する液体ＬＢＧＫＰ培地中で増殖させた。グリセロールを加え、４００μＬ一定分量を－２０℃及び－８０℃で保存した。
【0220】
保存一定分量を融解し、ＬＢＧＫＰ培地（カナマイシン及びジェネテシンを含有する）３０ｍＬに加えた。この培養物を３０℃、８時間振盪し、次いで「Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ ｍｅｄｉｕｍ」（Ｎｏｖａｇｅｎ、参照番号７１４９１－５）６０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌグリセロール及び５０ｍｇ／Ｌアンピシリンを含有する産生培地４００ｍＬに接種するために使用した。ＯＤ（６００ｎｍ）及びｐＨを測定するために試料を採取する間、培地を２０℃で１６時間、次にさらに５０時間１２℃で撹拌した。６０時間後、細胞を遠心分離によって回収し、凍結した。得られた細胞湿重量は１６．０７ｇであった。
【0221】
得られた沈殿の３．２４ｇを「Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ」（Ｎｏｖａｇｅｎ、参照番号７１４５６）１１．４ｍＬ及び水４．８ｍＬの添加によって溶解した。可溶化物を遠心分離によって回収し、活性試験に直ちに使用した。
【0222】
（実施例１９）
ＵＧＴ９１Ｄ２のｉｎ－ｖｉｖｏ調製物の活性の決定
活性試験を、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２中の０．５ｍＭ基質、２．５ｍＭ ＵＤＰ－グルコース及び３ｍＭ ＭｇＣｌ２を使用して、ルブソシドからステビオシドへの転換について可溶化物１０００μＬで５ｍＬスケールで実施した。試料を採取し、ＨＰＬＣによって分析した。ＵＧＴ９１Ｄ２のさまざまな調製物についての結果を次の表に要約する。
ＵＧＴ９１Ｄ２のｉｎ－ｖｉｖｏ調製物の活性の決定
活性試験を、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２中の０．５ｍＭ基質、２．５ｍＭ ＵＤＰ－グルコース及び３ｍＭ ＭｇＣｌ２を使用して、ルブソシドからステビオシドへの転換について可溶化物１０００μＬで５ｍＬスケールで実施した。試料を採取し、ＨＰＬＣによって分析した。ＵＧＴ９１Ｄ２のさまざまな調製物についての結果を次の表に要約する。
【0223】
【表3】
【0224】
（実施例２０）
レバウジオシドＸの単離
実施例１４の産生混合物の量は、分取ＨＰＬＣ法を介して分離するためには十分でなかった。したがって、一連の注入で分析ＨＰＬＣを混合物の構成成分を分離するために使用した。分離は、上の実施例１４に記載の方法に従って行い、図５のＨＰＬＣトレースにおける２つの主要なピークに対応する２つの画分をもたらした：画分Ａ（保持時間２４．１６５分）及び画分Ｂ（保持時間３１．３２５分）。
レバウジオシドＸの単離
実施例１４の産生混合物の量は、分取ＨＰＬＣ法を介して分離するためには十分でなかった。したがって、一連の注入で分析ＨＰＬＣを混合物の構成成分を分離するために使用した。分離は、上の実施例１４に記載の方法に従って行い、図５のＨＰＬＣトレースにおける２つの主要なピークに対応する２つの画分をもたらした：画分Ａ（保持時間２４．１６５分）及び画分Ｂ（保持時間３１．３２５分）。
【0225】
画分Ａの保持時間は、ｒｅｂ Ｄと一致し、生体内変換反応由来の未反応出発材料を示した。
【0226】
精製された画分Ｂの保持時間（図６）は、ｒｅｂ Ｘと一致し、ｒｅｂ Ｄからの順調な生体内変換を示した。画分Ｂで回収された材料のｒｅｂ Ｘとの同一性は精製された画分Ｂとｒｅｂ Ｘ標準品（Ｐｕｒｅ Ｃｉｒｃｌｅから入手可能、ｒｅｂ Ｘ標準品のＨＰＬＣトレースは図７に示される）との同時注射によって確認した。画分Ｂ及びｒｅｂ Ｘ標準品の両方は、同じ保持時間で溶出されたことが見出され（図８）、画分Ｂがｒｅｂ Ｘであることを示した。
【0227】
画分Ｂとｒｅｂ Ｘとの同一性は、ＮＭＲ及びＨＲＭＳによっても別に確認した。試料採取のために画分Ｂは、ロトベーパー（ｒｏｔｏｖａｐｏｒ）で濃縮し、凍結乾燥し、４０時間、４０℃で乾燥した。
【0228】
ＮＭＲ試料を重水素化ピリジン（Ｃ５Ｄ５Ｎ）に溶解し、スペクトルを標準的パルス列を使用してＶａｒｉａｎ Ｕｎｉｔｙ Ｐｌｕｓ ６００ＭＨｚ装置で取得した。画分ＢのＮＭＲスペクトルをｒｅｂ ＸのＮＭＲスペクトルと比較した。重ね合わせた２つのスペクトル（図９）は、画分Ｂとｒｅｂ Ｘのピークとの一致を示した。ｒｅｂ ＸについてのＮＭＲ帰属の表を下に示す：
【0229】
【表4-1】
【0230】
【表4-2】
【0231】
【表4-3】
【0232】
ＨＲＭＳ（図１０）は、陽イオンモードで操作されるエレクトロスプレーイオン化源を備えたＷａｔｅｒｓ Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｑｕａｄｒｏｐｏｌｅ Ｔｉｍｅ－ｏｆ－Ｆｌｉｇｈｔ（Ｑ－ＴＯＦ）質量分析計で作成した。試料をメタノールに溶解し、２：２：１のメタノール：アセトニトリル：水で溶出し、内蔵シリンジポンプを使用する注入で導入した。ｒｅｂ Ｘの存在は、ｍ／ｚ １３１３．５２６５の［Ｍ＋Ｎａ］＋付加体によって確認したが、これは分子式Ｃ５６Ｈ９０Ｏ３３に対応する：
【0233】
【化6】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】