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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024041254
(43)【公開日】2024-03-27
(54)【発明の名称】糖タンパク質の糖鎖を調製する方法及びキット
(51)【国際特許分類】
C12P 19/04 20060101AFI20240319BHJP
C12P 19/26 20060101ALI20240319BHJP
C12Q 1/34 20060101ALI20240319BHJP
【ＦＩ】
C12P19/04
C12P19/26
C12Q1/34
【審査請求】未請求
【請求項の数】20
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022145957
(22)【出願日】2022-09-14
(71)【出願人】
【識別番号】000002141
【氏名又は名称】住友ベークライト株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100165179
【弁理士】
【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100194250
【弁理士】
【氏名又は名称】福原 直志
(74)【代理人】
【識別番号】100181722
【弁理士】
【氏名又は名称】春田 洋孝
(74)【代理人】
【識別番号】100140718
【弁理士】
【氏名又は名称】仁内 宏紀
(72)【発明者】
【氏名】豊田 雅哲
【テーマコード（参考）】
4B063
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ67
4B063QQ79
4B063QR10
4B063QR56
4B063QR66
4B063QS17
4B063QX01
4B064AF11
4B064AF21
4B064CA21
4B064CB02
4B064CC15
4B064CC30
4B064CE12
(57)【要約】
【課題】糖タンパク質の糖鎖の調製において、糖鎖の収量を向上させる技術を提供する。
【解決手段】糖タンパク質の糖鎖を調製する方法であって、糖タンパク質を含む試料を固相に接触させて、前記糖タンパク質を前記固相に固定する固定工程と、容器内で、前記糖タンパク質に糖鎖遊離酵素を作用させ、糖鎖を含む遊離生成物を得る遊離工程と、前記容器内の前記遊離生成物に標識試薬を加え、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程と、を含み、前記固定工程において、前記試料に０．５μＬ／秒以上３．５μＬ／秒以下の速度で前記固相を通過させる、方法。
【選択図】なし
【解決手段】糖タンパク質の糖鎖を調製する方法であって、糖タンパク質を含む試料を固相に接触させて、前記糖タンパク質を前記固相に固定する固定工程と、容器内で、前記糖タンパク質に糖鎖遊離酵素を作用させ、糖鎖を含む遊離生成物を得る遊離工程と、前記容器内の前記遊離生成物に標識試薬を加え、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程と、を含み、前記固定工程において、前記試料に０．５μＬ／秒以上３．５μＬ／秒以下の速度で前記固相を通過させる、方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
糖タンパク質の糖鎖を調製する方法であって、
糖タンパク質を含む試料を固相に接触させて、前記糖タンパク質を前記固相に固定する固定工程と、
容器内で、前記糖タンパク質に糖鎖遊離酵素を作用させ、糖鎖を含む遊離生成物を得る遊離工程と、
前記容器内の前記遊離生成物に標識試薬を加え、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程と、を含み、
前記固定工程において、前記試料に０．５μＬ／秒以上３．５μＬ／秒以下の速度で前記固相を通過させる、方法。
糖タンパク質を含む試料を固相に接触させて、前記糖タンパク質を前記固相に固定する固定工程と、
容器内で、前記糖タンパク質に糖鎖遊離酵素を作用させ、糖鎖を含む遊離生成物を得る遊離工程と、
前記容器内の前記遊離生成物に標識試薬を加え、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程と、を含み、
前記固定工程において、前記試料に０．５μＬ／秒以上３．５μＬ／秒以下の速度で前記固相を通過させる、方法。
【請求項2】
糖タンパク質の糖鎖を調製する方法であって、
糖タンパク質を含む試料を固相に接触させて、前記糖タンパク質を前記固相に固定する固定工程と、
容器内で、前記糖タンパク質に糖鎖遊離酵素を作用させ、糖鎖を含む遊離生成物を得る遊離工程と、
前記容器内の前記遊離生成物に標識試薬を加え、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程と、を含み、
前記固定工程において、前記試料に３０Ｇ以上３００Ｇ以下の遠心加速度で前記固相を通過させる、方法。
糖タンパク質を含む試料を固相に接触させて、前記糖タンパク質を前記固相に固定する固定工程と、
容器内で、前記糖タンパク質に糖鎖遊離酵素を作用させ、糖鎖を含む遊離生成物を得る遊離工程と、
前記容器内の前記遊離生成物に標識試薬を加え、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程と、を含み、
前記固定工程において、前記試料に３０Ｇ以上３００Ｇ以下の遠心加速度で前記固相を通過させる、方法。
【請求項3】
前記固定工程の後且つ前記遊離工程の前に、前記糖タンパク質に界面活性剤を含む前処理剤を接触させる前処理工程を更に備える、請求項１又は２に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
【請求項4】
前記遊離工程を、酸由来型陰イオン性界面活性剤を含む脱糖鎖促進剤の存在下で行う、請求項１又は２に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
【請求項5】
前記酸由来型陰イオン性界面活性剤が、カルボン酸型陰イオン性界面活性剤、スルホン酸型陰イオン性界面活性剤、硫酸エステル型陰イオン性界面活性剤及びリン酸エステル型陰イオン性界面活性剤からなる群より選ばれる、請求項４に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
【請求項6】
前記遊離工程を開放系かつ加熱条件下で行う、請求項１又は２に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
【請求項7】
前記糖タンパク質が、抗体、ホルモン、酵素又はこれらを含む複合体である、請求項１又は２に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
【請求項8】
前記固相が、陽イオン交換担体、疎水性相互作用担体及び無機担体からなる群より選ばれる、請求項１又は２に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
【請求項9】
前記糖タンパク質が抗体であり、前記固相が、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＨ、プロテインＤ、プロテインＡｒｐからなる群より選ばれるリガンドを表面に有する、請求項１又は２に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
【請求項10】
前記標識試薬が、２－アミノベンズアミド、還元剤及び溶媒を含む、請求項１又は２に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
【請求項11】
前記還元剤がピコリンボランである、請求項１０に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
【請求項12】
前記溶媒がプロトン性化合物を含む、請求項１０に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
【請求項13】
前記溶媒が、前記プロトン性化合物よりも沸点が高い非プロトン性化合物を更に含む、請求項１２に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
【請求項14】
前記遊離工程の後に、固液分離によって前記遊離生成物を含む分離液を得る分離工程を更に含む、請求項１又は２に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
【請求項15】
前記標識工程の後に、固液分離によって前記糖鎖の標識体を含む分離液を得る分離工程を更に含む、請求項１又は２に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
【請求項16】
糖タンパク質を固定するための固相、前記固相を保持し糖鎖の遊離及び標識を行うための容器、並びに糖鎖遊離酵素を備え、請求項１又は２に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法に用いるための、糖タンパク質の糖鎖調製用キット。
【請求項17】
界面活性剤を含む前処理剤、酸由来型陰イオン性界面活性剤を含む脱糖鎖促進剤又は標識試薬を更に備える、請求項１６に記載の糖タンパク質の糖鎖調製用キット。
【請求項18】
前記標識試薬が、２－アミノベンズアミド、還元剤及び溶媒を含む、請求項１６に記載の糖タンパク質の糖鎖調製用キット。
【請求項19】
前記固相が、陽イオン交換担体、疎水性相互作用担体及び無機担体からなる群より選ばれる、請求項１６に記載の糖タンパク質の糖鎖調製用キット。
【請求項20】
前記固相が、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＨ、プロテインＤ、プロテインＡｒｐからなる群より選ばれるリガンドを表面に有する、請求項１６に記載の糖タンパク質の糖鎖調製用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、糖タンパク質の糖鎖を調製する方法及びキットに関する。
【背景技術】
【0002】
糖タンパク質からの糖鎖調製を迅速に行う技術が求められている。例えば、特許文献１には、容器内で、固相に固定された糖タンパク質を含む試料に糖鎖遊離酵素を作用させ、糖鎖を含む遊離生成物を得る遊離工程と、前記容器内の前記遊離生成物に標識試薬を加え、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程と、を含む、糖タンパク質の糖鎖を調製する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特許第６１４２９７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
特許文献１に記載された方法によれば、糖タンパク質から糖鎖を迅速に調製することができる。一方で、特許文献１に記載された方法から、更に糖鎖の収量を向上させる必要がある場合が存在する。本発明は、糖タンパク質の糖鎖の調製において、糖鎖の収量を向上させる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明は以下の態様を含む。
［１］糖タンパク質の糖鎖を調製する方法であって、糖タンパク質を含む試料を固相に接触させて、前記糖タンパク質を前記固相に固定する固定工程と、容器内で、前記糖タンパク質に糖鎖遊離酵素を作用させ、糖鎖を含む遊離生成物を得る遊離工程と、前記容器内の前記遊離生成物に標識試薬を加え、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程と、を含み、前記固定工程において、前記試料に０．５μＬ／秒以上３．５μＬ／秒以下の速度で前記固相を通過させる、方法。
［２］糖タンパク質の糖鎖を調製する方法であって、糖タンパク質を含む試料を固相に接触させて、前記糖タンパク質を前記固相に固定する固定工程と、容器内で、前記糖タンパク質に糖鎖遊離酵素を作用させ、糖鎖を含む遊離生成物を得る遊離工程と、前記容器内の前記遊離生成物に標識試薬を加え、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程と、を含み、前記固定工程において、前記試料に３０Ｇ以上３００Ｇ以下の遠心加速度で前記固相を通過させる、方法。
［３］前記固定工程の後且つ前記遊離工程の前に、前記糖タンパク質に界面活性剤を含む前処理剤を接触させる前処理工程を更に備える、［１］又は［２］に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［４］前記遊離工程を、酸由来型陰イオン性界面活性剤を含む脱糖鎖促進剤の存在下で行う、［１］～［３］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［５］前記酸由来型陰イオン性界面活性剤が、カルボン酸型陰イオン性界面活性剤、スルホン酸型陰イオン性界面活性剤、硫酸エステル型陰イオン性界面活性剤及びリン酸エステル型陰イオン性界面活性剤からなる群より選ばれる、［４］に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［６］前記遊離工程を開放系かつ加熱条件下で行う、［１］～［５］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［７］前記糖タンパク質が、抗体、ホルモン、酵素又はこれらを含む複合体である、［１］～［６］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［８］前記固相が、陽イオン交換担体、疎水性相互作用担体及び無機担体からなる群より選ばれる、［１］～［７］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［９］前記糖タンパク質が抗体であり、前記固相が、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＨ、プロテインＤ、プロテインＡｒｐからなる群より選ばれるリガンドを表面に有する、［１］～［８］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［１０］前記標識試薬が、２－アミノベンズアミド、還元剤及び溶媒を含む、［１］～［９］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［１１］前記還元剤がピコリンボランである、［１０］に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［１２］前記溶媒がプロトン性化合物を含む、［１０］又は［１１］に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［１３］前記溶媒が、前記プロトン性化合物よりも沸点が高い非プロトン性化合物を更に含む、［１２］に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［１４］前記遊離工程の後に、固液分離によって前記遊離生成物を含む分離液を得る分離工程を更に含む、［１］～［１３］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［１５］前記標識工程の後に、固液分離によって前記糖鎖の標識体を含む分離液を得る分離工程を更に含む、［１］～［１４］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［１６］糖タンパク質を固定するための固相、前記固相を保持し糖鎖の遊離及び標識を行うための容器、並びに糖鎖遊離酵素を備え、［１］～［１５］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法に用いるための、糖タンパク質の糖鎖調製用キット。
［１７］界面活性剤を含む前処理剤、酸由来型陰イオン性界面活性剤を含む脱糖鎖促進剤又は標識試薬を更に備える、［１６］に記載の糖タンパク質の糖鎖調製用キット。
［１８］前記標識試薬が、２－アミノベンズアミド、還元剤及び溶媒を含む、［１６］又は［１７］に記載の糖タンパク質の糖鎖調製用キット。
［１９］前記固相が、陽イオン交換担体、疎水性相互作用担体及び無機担体からなる群より選ばれる、［１６］～［１８］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖調製用キット。
［２０］前記固相が、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＨ、プロテインＤ、プロテインＡｒｐからなる群より選ばれるリガンドを表面に有する、［１６］～［１９］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖調製用キット。
［１］糖タンパク質の糖鎖を調製する方法であって、糖タンパク質を含む試料を固相に接触させて、前記糖タンパク質を前記固相に固定する固定工程と、容器内で、前記糖タンパク質に糖鎖遊離酵素を作用させ、糖鎖を含む遊離生成物を得る遊離工程と、前記容器内の前記遊離生成物に標識試薬を加え、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程と、を含み、前記固定工程において、前記試料に０．５μＬ／秒以上３．５μＬ／秒以下の速度で前記固相を通過させる、方法。
［２］糖タンパク質の糖鎖を調製する方法であって、糖タンパク質を含む試料を固相に接触させて、前記糖タンパク質を前記固相に固定する固定工程と、容器内で、前記糖タンパク質に糖鎖遊離酵素を作用させ、糖鎖を含む遊離生成物を得る遊離工程と、前記容器内の前記遊離生成物に標識試薬を加え、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程と、を含み、前記固定工程において、前記試料に３０Ｇ以上３００Ｇ以下の遠心加速度で前記固相を通過させる、方法。
［３］前記固定工程の後且つ前記遊離工程の前に、前記糖タンパク質に界面活性剤を含む前処理剤を接触させる前処理工程を更に備える、［１］又は［２］に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［４］前記遊離工程を、酸由来型陰イオン性界面活性剤を含む脱糖鎖促進剤の存在下で行う、［１］～［３］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［５］前記酸由来型陰イオン性界面活性剤が、カルボン酸型陰イオン性界面活性剤、スルホン酸型陰イオン性界面活性剤、硫酸エステル型陰イオン性界面活性剤及びリン酸エステル型陰イオン性界面活性剤からなる群より選ばれる、［４］に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［６］前記遊離工程を開放系かつ加熱条件下で行う、［１］～［５］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［７］前記糖タンパク質が、抗体、ホルモン、酵素又はこれらを含む複合体である、［１］～［６］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［８］前記固相が、陽イオン交換担体、疎水性相互作用担体及び無機担体からなる群より選ばれる、［１］～［７］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［９］前記糖タンパク質が抗体であり、前記固相が、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＨ、プロテインＤ、プロテインＡｒｐからなる群より選ばれるリガンドを表面に有する、［１］～［８］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［１０］前記標識試薬が、２－アミノベンズアミド、還元剤及び溶媒を含む、［１］～［９］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［１１］前記還元剤がピコリンボランである、［１０］に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［１２］前記溶媒がプロトン性化合物を含む、［１０］又は［１１］に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［１３］前記溶媒が、前記プロトン性化合物よりも沸点が高い非プロトン性化合物を更に含む、［１２］に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［１４］前記遊離工程の後に、固液分離によって前記遊離生成物を含む分離液を得る分離工程を更に含む、［１］～［１３］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［１５］前記標識工程の後に、固液分離によって前記糖鎖の標識体を含む分離液を得る分離工程を更に含む、［１］～［１４］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［１６］糖タンパク質を固定するための固相、前記固相を保持し糖鎖の遊離及び標識を行うための容器、並びに糖鎖遊離酵素を備え、［１］～［１５］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法に用いるための、糖タンパク質の糖鎖調製用キット。
［１７］界面活性剤を含む前処理剤、酸由来型陰イオン性界面活性剤を含む脱糖鎖促進剤又は標識試薬を更に備える、［１６］に記載の糖タンパク質の糖鎖調製用キット。
［１８］前記標識試薬が、２－アミノベンズアミド、還元剤及び溶媒を含む、［１６］又は［１７］に記載の糖タンパク質の糖鎖調製用キット。
［１９］前記固相が、陽イオン交換担体、疎水性相互作用担体及び無機担体からなる群より選ばれる、［１６］～［１８］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖調製用キット。
［２０］前記固相が、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＨ、プロテインＤ、プロテインＡｒｐからなる群より選ばれるリガンドを表面に有する、［１６］～［１９］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖調製用キット。
【発明の効果】
【0006】
本発明によれば、糖タンパク質の糖鎖の調製において、糖鎖の収量を向上させる技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【発明を実施するための形態】
【0008】
＜糖タンパク質の糖鎖を調製する方法＞
一実施形態において、本発明は、糖タンパク質の糖鎖を調製する方法であって、糖タンパク質を含む試料を固相に接触させて、前記糖タンパク質を前記固相に固定する固定工程と、容器内で、前記糖タンパク質に糖鎖遊離酵素（糖鎖分解酵素）を作用させ、糖鎖を含む遊離生成物を得る遊離工程と、前記容器内の前記遊離生成物に標識試薬（標識反応液）を加え、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程と、を含み、前記固定工程において、前記試料に０．５μＬ／秒以上３．５μＬ／秒以下の速度で前記固相を通過させる、方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、糖タンパク質の糖鎖を調製する方法であって、糖タンパク質を含む試料を固相に接触させて、前記糖タンパク質を前記固相に固定する固定工程と、容器内で、前記糖タンパク質に糖鎖遊離酵素（糖鎖分解酵素）を作用させ、糖鎖を含む遊離生成物を得る遊離工程と、前記容器内の前記遊離生成物に標識試薬（標識反応液）を加え、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程と、を含み、前記固定工程において、前記試料に０．５μＬ／秒以上３．５μＬ／秒以下の速度で前記固相を通過させる、方法を提供する。
【0009】
糖タンパク質を含む試料を固相に接触させる方法には、自然落下、吸引、加圧、遠心等の方法が挙げられる。特に固定工程で遠心を用いる場合、本実施形態の方法は、糖タンパク質の糖鎖を調製する方法であって、糖タンパク質を含む試料を固相に接触させて、前記糖タンパク質を前記固相に固定する固定工程と、容器内で、前記糖タンパク質に糖鎖遊離酵素を作用させ、糖鎖を含む遊離生成物を得る遊離工程と、前記容器内の前記遊離生成物に標識試薬を加え、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程と、を含み、前記固定工程において、前記試料に３０Ｇ以上３００Ｇ以下の遠心加速度で前記固相を通過させる、方法であるということもできる。
【0010】
従来、固定工程においては、試料を固相の上部に配置した後、試料に６μＬ／秒以上の速度で固相を通過させていた。これに対し、発明者らは、固定工程において、試料に０．５μＬ／秒以上３．５μＬ／秒以下の速度で固相を通過させることにより、試料に６μＬ／秒以上の速度で固相を通過させた場合と比較して、糖鎖の収量（回収される糖鎖の質量）を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。
【0011】
特に、固定工程において遠心を用いる場合、従来、試料を固相の上部に配置した後、試料に５００Ｇ以上の遠心加速度で固相を通過させていた。ここで、「Ｇ」は遠心加速度の単位を表す。これに対し、発明者らは、固定工程において、試料に３０Ｇ以上３００Ｇ以下の遠心加速度で固相を通過させることにより、試料に５００Ｇ以上の遠心加速度で固相を通過させた場合と比較して、糖鎖の収量を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。
【0012】
本実施形態の方法によれば、固相に固定された糖タンパク質を溶出することなく、固相上で糖鎖遊離を行い、かつ、遊離生成物を分離することなく標識試薬（標識反応液）を重ねて加えることで、糖タンパク質から糖鎖を分析用試料の態様（標識された態様）で極めて迅速に調製することができる。また、従来法と比較して糖鎖の収量を向上させることができる。以下、本実施形態の方法の各工程を説明する。
【0013】
［固定工程］
固定工程では、糖タンパク質を含む試料を固相に接触させて、糖タンパク質を固相に固定する。この場合における固定の態様としては、特異的結合による非共有結合（水素結合及びイオン結合）、並びに共有結合が含まれ、例えば泳動ゲルへのアプライ又はブロッティングメンブレンへ転写されることより単に保持されるに過ぎない態様は含まない。
固定工程では、糖タンパク質を含む試料を固相に接触させて、糖タンパク質を固相に固定する。この場合における固定の態様としては、特異的結合による非共有結合（水素結合及びイオン結合）、並びに共有結合が含まれ、例えば泳動ゲルへのアプライ又はブロッティングメンブレンへ転写されることより単に保持されるに過ぎない態様は含まない。
【0014】
《糖タンパク質》
糖タンパク質は、少なくとも糖鎖を複合成分として含むタンパク質であればよい。糖タンパク質の糖鎖部分は、Ｎ－結合型であってもよく、Ｏ－結合型であってもよい。また、糖鎖部分は、天然の構造を有していてもよいし、人工的に改変されていてもよい。また、糖鎖部分は、中性糖鎖であってもよいし、酸性糖鎖であってもよい。また、糖タンパク質における糖鎖結合部位は、天然物と同じ部位であってもよいし、天然物では糖鎖が結合していない部位であってもよい。
糖タンパク質は、少なくとも糖鎖を複合成分として含むタンパク質であればよい。糖タンパク質の糖鎖部分は、Ｎ－結合型であってもよく、Ｏ－結合型であってもよい。また、糖鎖部分は、天然の構造を有していてもよいし、人工的に改変されていてもよい。また、糖鎖部分は、中性糖鎖であってもよいし、酸性糖鎖であってもよい。また、糖タンパク質における糖鎖結合部位は、天然物と同じ部位であってもよいし、天然物では糖鎖が結合していない部位であってもよい。
【0015】
糖タンパク質のタンパク質部分は、変性前の状態において、糖鎖部分をその内部に取り込むようにフォールディングしていてもよい。このようなタンパク質部分の分子量は、例えば１ｋＤａ以上であってもよく、１０ｋＤａ以上であってもよい。タンパク質部分の分子量範囲内の上限は特に限定されず、例えば１０００ｋＤａであってもよい。
【0016】
具体的な糖タンパク質としては、例えば、抗体、ホルモン、酵素及びこれらを含む複合体からなる群より選ばれる生理活性物質が挙げられる。ここで、複合体としては、抗原と抗体との複合体、ホルモンと受容体との複合体、酵素と基質との複合体等が挙げられる。これらの糖タンパク質は細胞培養工学的に調製される生理活性物質であることから、得られる糖鎖部分は不均一な状態であり、糖鎖分析の時間を短縮することの意義が特に大きい。
【0017】
また、糖タンパク質が抗体を含む場合は、糖鎖解析の重要性が特に高い。この場合、抗体の活性等に影響を及ぼす糖鎖を迅速に遊離することができる。抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等の免疫グロブリン；Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）等の低分子抗体；Ｆｃ領域と他の機能性タンパク質又はペプチドとの融合により構成されるＦｃ融合タンパク質又はペプチド等のＦｃ含有分子；放射性同位元素配位性キレート、ポリエチレングリコール等の化学修飾基を付加した化学的修飾抗体等が挙げられる。また、抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。
【0018】
また、抗体は、抗体医薬品候補又は抗体医薬品であってもよい。抗体医薬品候補は、抗体医薬品の開発途上にある物質であり、抗体医薬品としての活性及び安全性等の評価に供される物質である。抗体医薬品候補から糖鎖遊離を行う場合は、抗体医薬品の開発を迅速化することができ、抗体医薬品から糖鎖遊離を行う場合は、抗体医薬品の品質管理を迅速化することができる。
【0019】
《固相》
糖タンパク質の固相への固定の態様としては、特異的結合による非共有結合（水素結合及びイオン結合）、並びに共有結合が含まれ、例えば泳動ゲルにアプライ又はブロッティングメンブレンに転写されることより単に保持されるに過ぎない態様は含まれない。非共有結合による固定である場合、結合速度定数ｋａ（単位Ｍ－１ｓ－１）が、例えば１０３以上、例えば１０４以上、例えば１０３～１０５、例えば１０４～１０５の親和性を有することが好ましい。
糖タンパク質の固相への固定の態様としては、特異的結合による非共有結合（水素結合及びイオン結合）、並びに共有結合が含まれ、例えば泳動ゲルにアプライ又はブロッティングメンブレンに転写されることより単に保持されるに過ぎない態様は含まれない。非共有結合による固定である場合、結合速度定数ｋａ（単位Ｍ－１ｓ－１）が、例えば１０３以上、例えば１０４以上、例えば１０３～１０５、例えば１０４～１０５の親和性を有することが好ましい。
【0020】
固相としては、糖タンパク質のタンパク質部分と非共有結合的又は共有結合的に連結可能なリンカーを表面に有する担体を用いることができる。リンカーとしては、例えば、糖タンパク質のタンパク質部分を捕捉可能なリガンドが挙げられる。リガンドとしては、糖タンパク質のタンパク質部分に親和性のある分子（以下、単に糖タンパク質に親和性のある分子という場合がある。）、イオン交換基又は疎水性基が表面に化学的に修飾された担体が挙げられる。
【0021】
糖タンパク質に親和性のある分子は特に限定されず、捕捉すべき糖タンパク質に応じて当業者が容易に決定することができる。例えば、糖タンパク質に特異的に結合可能なペプチド性又はタンパク質性リガンド、アプタマー（糖タンパク質に特異的に結合可能な合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ又はペプチド）、化学合成性リガンド（チアゾール誘導体等）が挙げられる。ペプチド性又はタンパク質性リガンドとしては、例えば、糖タンパク質に特異的に結合可能な抗体、抗体断片が挙げられる。糖タンパク質に親和性のある分子は、糖鎖を有しないことが好ましい。
【0022】
糖タンパク質が抗体である場合、糖タンパク質に親和性のある分子は、抗体又は抗体の定常領域であるＦｃ含有分子に特異的に結合するものであってもよい。より具体的には、ペプチド性又はタンパク質性リガンドとして、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＨ、プロテインＤ、プロテインＡｒｐ等の微生物由来リガンド；それらのリガンドの組換え発現により得られる機能的改変体（類縁物質）；抗体のＦｃレセプター等の組換えタンパク質等が挙げられる。これにより、糖鎖解析の重要性が特に高い抗体について、スループット性の高い糖鎖試料調製及び解析が可能となる。
【0023】
イオン交換基は、イオン交換機能により糖タンパク質を捕捉可能であり、かつ、カウンターイオンによってイオン強度依存的に糖タンパク質を脱離可能である官能基であれば特に限定されない。好ましくは、カルボキシル基（より具体的には、カルボキシメチル基等）、スルホン酸基（より具体的には、スルホエチル基、スルホプロピル基等）等の陽イオン交換基が挙げられ、四級アミノ基等の陰イオン交換基であってもよい。
【0024】
疎水性基としては、例えば、炭素数２～８のアルキル基又はアリール基が挙げられる。より具体的には、ブチル基、フェニル基、オクチル基等が挙げられ、これらの基は１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【0025】
担体がその表面に有するリンカーとしては、上記の他、糖タンパク質のタンパク質部分の構成要素であるＣ末端アミノ酸残基のＣ末端と共有結合した連結基であってもよい。このような連結基としては、ペプチド固相合成で用いられる固相表面修飾試薬であるアミノ基含有化合物から誘導される連結基が挙げられる。
【0026】
担体は、水に不溶な基材であって、上記のリンカーを固定化できるものであれば特に限定されず、有機担体、無機担体及びそれらの複合担体が挙げられる。有機担体としては、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン等の合成高分子；架橋セファロース、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アミロース、架橋アガロース、架橋デキストラン等の多糖類からなる担体が挙げられる。これらは１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。無機担体としては、ガラスビーズ、シリカゲル、モノリスシリカ等が挙げられる。
【0027】
有機担体が水を含みやすい性質であるのに対して、無機担体は水を含みにくい。本実施形態の方法では、固相上で種々の反応を行うため、水を含みにくい無機担体を用いることが好ましい。これにより、酵素及び／又は試薬の効果を希釈させないため好ましい。酵素及び／又は試薬の効果の希釈防止は、分析における不要なシグナルの検出の防止に寄与する。したがって、担体は無機担体であることが好ましい。また、担体が無機担体であると、例えば、糖鎖遊離酵素により担体の一部が遊離することがなく、糖由来の樹脂を使用した場合に初めから樹脂に残存する糖の溶出が起こることがない。このため、遊離された糖鎖の分析において、不要なシグナルの出現を抑制しやすい。
【0028】
担体の形状としては特に限定されず、粒子状であってもよく、非粒子状であってもよい。粒子状の担体（ビーズ）の場合、多孔質担体であってもよい。粒子状の担体の場合、平均粒子径は例えば１～１００μｍであってもよい。平均粒子径が上記下限値以上であることは、通液性の点で好ましく、上記上限値以下であることは、理論断数の低下を防ぐ点で好ましい。
【0029】
非粒子状の担体としては、モノリスタイプのシリカゲル及び膜体等が挙げられる。モノリスタイプのシリカゲルは、マイクロメートルサイズの三次元網目状細孔（マクロ孔）と、ナノメートルサイズの細孔（メソ孔）とを有する、シリカゲルのバルク体である。マクロ孔の径は例えば１～１００μｍであってもよく、１～５０μｍであってもよく、１～３０μｍであってもよく、１～２０μｍであってもよい。マクロ孔が上記下限値以上であることは通液性の点で好ましく、上記上限値以下であることは、理論断数の低下を防ぐ点で好ましい。メソ孔の径は例えば１～１００ｎｍであってもよく、１～５０ｎｍであってもよい。これによって糖を効率的に捕捉することができる。
【0030】
担体の使用体積（粒子状担体にあっては、担体自体の体積に、充填時の空隙の体積も含み、非粒子状担体にあっては、担体自体の体積に、メソ孔及びマクロ孔の体積も含む）は、例えば０．００１～０．１ｃｍ３であってもよく、例えば０．００１～０．０１ｃｍ３であってもよい。上記下限値以上であることは、理論断数の低下を防ぐ点で好ましく、上記上限値以下であることは、通液性の点で好ましい。また、上記の体積であることにより、溶出後の分離液を、ＨＰＬＣ分析に適した濃度で得ることも容易となる。
【0031】
固相は、カラム、マルチウェルプレートの各ウェル、フィルタープレートの各ウェル、マイクロチューブ等の容器の中に充填された状態で使用されてもよい。固相は、後述する遊離工程及び標識工程を行う容器と同一の容器に保持されていてもよい。
【0032】
（糖タンパク質の固相への固定）
糖タンパク質を含む試料を上記の固相に接触させて、固相に糖タンパク質を捕捉させることにより、糖タンパク質を固相に固定することができる。糖タンパク質を含む試料は、糖鎖調製を迅速に行う観点から、糖タンパク質の精製（糖タンパク質をその夾雑物から分離すること）が行われていないものであってもよい。例えば、血液（例えば、血清、血漿）、リンパ液、腹腔浸出液、組織間液、脳脊髄液、腹水等の体液；Ｂ細胞、ハイブリドーマ、ＣＨＯ細胞等の抗体産生細胞の培養上清；抗体産生細胞を移植した動物の腹水等が挙げられる。試料は、培養上清等の細胞培養工学的な糖タンパク質の調製物のように、タンパク質部分が均一であり、かつ糖鎖部分が非均一である、糖タンパク質のバリエーションの混合物であってもよい。
糖タンパク質を含む試料を上記の固相に接触させて、固相に糖タンパク質を捕捉させることにより、糖タンパク質を固相に固定することができる。糖タンパク質を含む試料は、糖鎖調製を迅速に行う観点から、糖タンパク質の精製（糖タンパク質をその夾雑物から分離すること）が行われていないものであってもよい。例えば、血液（例えば、血清、血漿）、リンパ液、腹腔浸出液、組織間液、脳脊髄液、腹水等の体液；Ｂ細胞、ハイブリドーマ、ＣＨＯ細胞等の抗体産生細胞の培養上清；抗体産生細胞を移植した動物の腹水等が挙げられる。試料は、培養上清等の細胞培養工学的な糖タンパク質の調製物のように、タンパク質部分が均一であり、かつ糖鎖部分が非均一である、糖タンパク質のバリエーションの混合物であってもよい。
【0033】
固相に固定されたタンパク質を含む試料は、上記の他に、糖タンパク質の固相合成によって得られる生成物であってもよい。
【0034】
固相に接触させるべき糖タンパク質を含む試料における糖タンパク質の濃度は特に限定されず、例えば、０．１μｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬであってもよい。上記下限値以上であることは、検出の点で好ましく、上記上限値以下であることは、定量性の点で好ましい。
【0035】
固相に接触させるべき糖タンパク質は、容器１つあたり０．００１μｇ～１００ｍｇであってもよく、０．００１μｇ～５ｍｇであってもよい。糖タンパク質の量が上記下限値以上であることは検出の点で好ましい。本実施形態の方法は工程数が少なく試料のロスが非常に少ないため、糖タンパク質が小スケール（特に０．００１～５００μｇ）である場合に特に有用である。糖タンパク質の量が上記上限値以下であることは、定量性の点で好ましい。
【0036】
固相に固定された糖タンパク質を含む試料は、固相に固定された糖タンパク質が液体成分中に分散された状態で用意されてもよいし、液体成分が分離された状態で用意されてもよい。
【0037】
糖タンパク質を含む試料を固相に接触させて、糖タンパク質を固相に固定することができる。試料と固相との接触は、試料に固相を通過させることにより行うことが好ましい。すなわち、容器内に保持された固相に試料を通液することにより、糖タンパク質を固相に固定することができる。固相に試料を通液する方法としては、自然落下、吸引、加圧、遠心等の方法が挙げられる。
【0038】
試料に固相を通過させる速度の下限値は、０．５μＬ／秒以上、例えば０．５５μＬ／秒以上であることが好ましい。試料に固相を通過させる速度の上限値は、３．５μＬ／秒以下、例えば３．０μＬ／秒以下、例えば２．５μＬ／秒以下、例えば２．０μＬ／秒以下、例えば１．８μＬ／秒以下であってよい。上記の速度の下限値と上限値は任意に組み合わせることができる。試料に固相を通過させる速度の特に好ましい範囲としては、１．０μＬ／秒以上１．７μＬ／秒以下を例示することができる。実施例において後述するように、遠心加速度が上記の範囲であると、糖鎖の収量を向上させることができる。
【0039】
実施例において後述するように、例えば、６００μＬの試料に固相を通過させる場合、従来法通り６μＬ／秒で通過させると約１００秒で完了する。これを、０．５μＬ／秒以上３．５μＬ／秒以下の速度で通過させると、１５０～１２００秒を要することになる。糖タンパク質からの糖鎖調製を迅速に行う技術が求められているところ、試料に固相を通過させる速度を遅くするプロトコルは好ましくない。しかしながら、敢えてこのような構成を採用することにより、発明者らは、意外にも糖鎖の収量を格段に向上させることができることを見出した。
【0040】
固相に試料を通液する方法として遠心を用いる場合、遠心加速度の下限値は、３０Ｇ以上、例えば５０Ｇ以上であることが好ましい。遠心加速度の上限値は、３００Ｇ以下、例えば２００Ｇ以下、例えば１５０Ｇ以下であってよい。上記の遠心加速度の下限値と上限値は任意に組み合わせることができる。遠心加速度の特に好ましい範囲としては、５０Ｇ以上１５０Ｇ以下を例示することができる。実施例において後述するように、遠心加速度が上記の範囲であると、糖鎖の収量を向上させることができる。
【0041】
実施例において後述するように、例えば、６００μＬの試料に固相を通過させる場合、従来法通り５００Ｇの遠心加速度で通過させると約１００秒で完了する。これを、３０Ｇ以上３００Ｇの遠心加速度で通過させると、１５０～１２００秒を要することになる。糖タンパク質からの糖鎖調製を迅速に行う技術が求められているところ、試料に固相を通過させる速度を遅くするプロトコルは好ましくない。しかしながら、敢えてこのような構成を採用することにより、発明者らは、意外にも糖鎖の収量を格段に向上させることができることを見出した。
【0042】
また、糖タンパク質を含む試料は、固相に接触させ糖タンパク質の捕捉が完了した時点、又は固相合成が完了した時点で、夾雑物を含み得る。夾雑物としては、固相に固定すべき糖タンパク質を含む試料に含まれていた成分、糖タンパク質の固相合成に用いた試薬等が挙げられ、より具体的には、塩、低分子化合物、タンパク質（当該固相への結合性を有さないタンパク質）その他の生体分子が挙げられる。
【0043】
したがって、固相による糖タンパク質の捕捉が完了した後、又は糖タンパク質の固相合成が完了した後に、洗浄処理を行ってもよい。これによって、糖タンパク質を固相に固定したまま、共雑物を除去することができる。洗浄は、固相に洗浄液を通液させることによって行うことができる。通液の方法としては、自然落下、吸引、加圧、遠心等の方法が挙げられる。
【0044】
洗浄液としては、糖タンパク質のタンパク質部分と固相表面のリンカーとの結合を切断しない液性及び組成のものが当業者によって適宜選択される。具体的には、緩衝液その他の水溶液又は水であってもよい。水溶液を用いる場合、ｐＨが５～１０であるものが好ましい。水溶液のｐＨがこの範囲内であれば、後の工程で用いる糖鎖遊離酵素の活性を保ちやすい。また、糖タンパク質が非共有結合によって固相に固定されている場合には、糖タンパク質の遊離を防止しやすい。緩衝液を用いる場合、緩衝剤としては、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、カルバミン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；トリスヒドロキシメチルアンモニウム等のトリス緩衝剤；リン酸塩等が挙げられる。
【0045】
［遊離工程］
遊離工程では、容器内で、固相に固定された糖タンパク質に糖鎖遊離酵素を作用させて糖鎖を遊離し、遊離生成物を得る。好ましくは、脱糖鎖促進剤の存在下で糖鎖遊離酵素を作用させる。本工程は、化学的断片化又は酵素学的断片化等によるタンパク質の断片化工程を実質的に含まない。
遊離工程では、容器内で、固相に固定された糖タンパク質に糖鎖遊離酵素を作用させて糖鎖を遊離し、遊離生成物を得る。好ましくは、脱糖鎖促進剤の存在下で糖鎖遊離酵素を作用させる。本工程は、化学的断片化又は酵素学的断片化等によるタンパク質の断片化工程を実質的に含まない。
【0046】
（容器）
固相に固定された糖タンパク質を含む試料は、容器内に用意される。固相に固定された糖タンパク質は、当該容器内で調製されることが効率的で好ましい。容器は、液体及び固相の保持並びに固相を保持した状態での液体の分離（通液）が可能な容器であれば特に限定されず、例えば、カラム、マルチウェルプレートの各ウェル、フィルタープレートの各ウェル、マイクロチューブ等が挙げられる。
固相に固定された糖タンパク質を含む試料は、容器内に用意される。固相に固定された糖タンパク質は、当該容器内で調製されることが効率的で好ましい。容器は、液体及び固相の保持並びに固相を保持した状態での液体の分離（通液）が可能な容器であれば特に限定されず、例えば、カラム、マルチウェルプレートの各ウェル、フィルタープレートの各ウェル、マイクロチューブ等が挙げられる。
【0047】
（糖鎖遊離酵素）
糖タンパク質に作用させる糖鎖遊離酵素としては、ペプチドＮ－グリカナーゼ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ、ＰＮＧａｓｅ Ａ）、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（Ｅｎｄｏ－Ｈ、Ｅｎｄｏ－Ｆ、Ｅｎｄｏ－Ａ、Ｅｎｄｏ－Ｍ）等が挙げられる。
糖タンパク質に作用させる糖鎖遊離酵素としては、ペプチドＮ－グリカナーゼ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ、ＰＮＧａｓｅ Ａ）、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（Ｅｎｄｏ－Ｈ、Ｅｎｄｏ－Ｆ、Ｅｎｄｏ－Ａ、Ｅｎｄｏ－Ｍ）等が挙げられる。
【0048】
糖鎖遊離酵素は、水又は緩衝液中に分散された状態で用意されてもよい。緩衝液を用いる場合、緩衝剤としては、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、カルバミン酸アンモニウム等が挙げられる。緩衝液は、ｐＨが５～１０であるものが好ましい。緩衝液のｐＨがこの範囲内であると、糖鎖遊離酵素の活性を保ちやすい。水又は緩衝液は、糖鎖遊離酵素とともに、金属塩等の塩類、グリセロール等のタンパク質の安定化剤等の成分を含有していてもよい。
【0049】
（脱糖鎖促進剤）
遊離工程は、脱糖鎖促進剤の存在下で行われてもよい。これによって、糖タンパク質からの糖鎖試料の回収率を向上させることができる。脱糖鎖促進剤は、酸由来型陰イオン性界面活性剤を含有することが好ましい。酸由来型陰イオン性界面活性剤により、糖タンパク質のタンパク質部分が変性して三次構造が変化し、糖鎖遊離酵素が分解標的部位に作用しやすくなる。これによって、糖部分が容易に分解されて遊離する。
遊離工程は、脱糖鎖促進剤の存在下で行われてもよい。これによって、糖タンパク質からの糖鎖試料の回収率を向上させることができる。脱糖鎖促進剤は、酸由来型陰イオン性界面活性剤を含有することが好ましい。酸由来型陰イオン性界面活性剤により、糖タンパク質のタンパク質部分が変性して三次構造が変化し、糖鎖遊離酵素が分解標的部位に作用しやすくなる。これによって、糖部分が容易に分解されて遊離する。
【0050】
酸由来型陰イオン性界面活性剤は、有機酸から誘導される陰イオン性界面活性剤である。例えば、カルボン酸型陰イオン性界面活性剤、スルホン酸型陰イオン性界面活性剤、硫酸エステル型陰イオン性界面活性剤、リン酸エステル型陰イオン性界面活性剤等が挙げられる。中でも、カルボン酸型陰イオン性界面活性剤が好ましい。酸由来型陰イオン性界面活性剤がカルボン酸型陰イオン性界面活性剤であると、糖タンパク質のタンパク質部分を変性させるが、糖鎖遊離酵素を変性させにくい傾向にあると考えられる。
【0051】
《酸由来型陰イオン性界面活性剤－カルボン酸型陰イオン性界面活性剤》
カルボン酸型陰イオン性界面活性剤としては、Ｒ１－ＣＯＯＸ（ここで、Ｒ１は有機基を表し、Ｘは水素原子又は陽イオンを表す。）で表されるカルボン酸及びカルボン酸塩、並びに、Ｒ１ＣＯＮ（Ｒ２）－Ｒ３－ＣＯＯＸ（ここで、Ｒ１は有機基を表し、－Ｎ（Ｒ２）－Ｒ３－ＣＯＯ－はアミノ酸残基を表し、Ｘは水素原子又は陽イオンを表す。）で表されるアミノ酸及びその塩（Ｎ－アシルアミノ酸系界面活性剤）等が挙げられる。中でも、Ｒ１ＣＯＮ（Ｒ２）－Ｒ３－ＣＯＯＸ（ここで、Ｒ１は有機基を表し、－Ｎ（Ｒ２）－Ｒ３－ＣＯＯ－はアミノ酸残基を表し、Ｘは水素原子又は陽イオンを表す。）で表されるアミノ酸及びその塩（Ｎ－アシルアミノ酸系界面活性剤）が好ましい。
カルボン酸型陰イオン性界面活性剤としては、Ｒ１－ＣＯＯＸ（ここで、Ｒ１は有機基を表し、Ｘは水素原子又は陽イオンを表す。）で表されるカルボン酸及びカルボン酸塩、並びに、Ｒ１ＣＯＮ（Ｒ２）－Ｒ３－ＣＯＯＸ（ここで、Ｒ１は有機基を表し、－Ｎ（Ｒ２）－Ｒ３－ＣＯＯ－はアミノ酸残基を表し、Ｘは水素原子又は陽イオンを表す。）で表されるアミノ酸及びその塩（Ｎ－アシルアミノ酸系界面活性剤）等が挙げられる。中でも、Ｒ１ＣＯＮ（Ｒ２）－Ｒ３－ＣＯＯＸ（ここで、Ｒ１は有機基を表し、－Ｎ（Ｒ２）－Ｒ３－ＣＯＯ－はアミノ酸残基を表し、Ｘは水素原子又は陽イオンを表す。）で表されるアミノ酸及びその塩（Ｎ－アシルアミノ酸系界面活性剤）が好ましい。
【0052】
陽イオンＸとしては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属イオン、トリエタノールアミンイオン、アンモニウムイオン等が挙げられる。なお、以下の全ての酸由来型陰イオン性界面活性剤の例示において、「塩」は少なくともナトリウム塩、カリウム塩、トリエタノールアミン塩、アンモニウム塩を例示するものとする。
【0053】
《カルボン酸型陰イオン性界面活性剤－カルボン酸及びカルボン酸塩》
Ｒ１－ＣＯＯＸで示されるカルボン酸塩において、有機基Ｒ１は、少なくとも炭素を有する基であり、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基が挙げられる。
Ｒ１－ＣＯＯＸで示されるカルボン酸塩において、有機基Ｒ１は、少なくとも炭素を有する基であり、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基が挙げられる。
【0054】
高級アルキル基及び高級不飽和炭化水素基の炭素数は６～１８であってもよい。このような高級アルキル基又は高級不飽和炭化水素基を有するカルボン酸型陰イオン性界面活性剤の具体例としては、オクタン酸塩、デカン酸塩、ラウリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、オレイン酸塩、リノール酸塩等が挙げられる。また、上記の高級アルキル基及び高級不飽和炭化水素基は置換されていてもよく、置換基は炭素数が例えば１～３０のアルキル基又はアルコキシカルボニル基であってもよい。
【0055】
オキシアルキレン基が介在した炭化水素基においては、１以上のオキシアルキレン基が主鎖に含まれていてもよい。オキシアルキレン基は、オキシエチレン基、オキシ－ｎ－プロピレン基、オキシイソプロピレン基等が挙げられる。オキシアルキレン基が介在している炭化水素基としては、例えば、Ｒ４－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｒ５－で表される基が挙げられる。
【0056】
ここで、Ｒ４は、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、又は置換若しくは無置換のアリール基であってもよい。高級アルキル基及び高級不飽和炭化水素基の炭素数は６～１８であってもよい。アリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。置換アリール基の場合、置換基は直鎖又は分岐のアルキル基であってもよく、当該直鎖又は分岐のアルキル基の炭素数は１～３０であってもよい。特にフェニル基の場合、当該置換基はスルホニル基に対してパラ位で置換されていてもよい。また、ｎは、１～１０であってもよい。また、Ｒ５は、シグマ結合、又は、エチレン基、メチレン基、ｎ－プロピレン基等のアルキレン基であってもよい。このようなカルボン酸塩の具体例としては、ラウレスカルボン酸塩（例えば、ラウレス－４－カルボン酸塩、ラウレス－６－カルボン酸塩）トリデセスカルボン酸塩（例えば、トリデセス－４－カルボン酸塩、トリデセス－６－カルボン酸塩）等が挙げられる。
【0057】
フッ素置換された高級アルキル基においては、１以上の水素原子がフッ素原子で置換されている。フッ素置換された高級アルキル基は、全ての水素原子がフッ素で置換されたペルフルオロアルキル基であってもよい。また炭素数は、６～１８であってもよい。このようなペルフルオロアルキルカルボン酸及びペルフルオロアルキルカルボン酸塩の具体例としては、ペルフルオロオクタン酸、ペルフルオロノナン酸、ペルフルオロオクタン酸塩、ペルフルオロノナン酸塩等が挙げられる。
【0058】
《カルボン酸型陰イオン性界面活性剤－アミノ酸及びその塩》
Ｒ１ＣＯＮ（Ｒ２）－Ｒ３－ＣＯＯＸで示されるアミノ酸又はその塩において、有機基Ｒ１及び陽イオンＸは、上記のカルボン酸又はカルボン酸塩における有機基Ｒ１及び陽イオンＸと同様である。
Ｒ１ＣＯＮ（Ｒ２）－Ｒ３－ＣＯＯＸで示されるアミノ酸又はその塩において、有機基Ｒ１及び陽イオンＸは、上記のカルボン酸又はカルボン酸塩における有機基Ｒ１及び陽イオンＸと同様である。
【0059】
また、Ｒ２は、水素原子又はアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基等）である。Ｒ３は、置換又は無置換のエチレン基、メチレン基、ｎ－プロピレン基等であってもよく、Ｎ末端側の窒素原子と共に環を形成していてもよい。したがって、－Ｎ（Ｒ２）－Ｒ３－ＣＯＯ－で示されるアミノ酸残基は、α－アミノ酸残基、β－アミノ酸残基、γ－アミノ酸残基等であってもよく、天然アミノ酸由来の残基であってもよく、非天然アミノ酸由来の残基であってもよい。例えば、サルコシン残基、グルタミン酸残基、グリシン残基、アスパラギン酸残基、プロリン残基、β－アラニン残基等のアミノ酸由来の残基が挙げられる。
【0060】
Ｒ２が水素原子である場合の当該アミノ酸又はその塩（つまりＮ－アシルアミノ酸系界面活性剤）の具体例としては、Ｎ－ラウロイルアスパラギン酸塩、Ｎ－ラウロイルグルタミン酸、Ｎ－ラウロイルグルタミン酸塩、Ｎ－ミリストイルグルタミン酸塩、Ｎ－ココイルアラニン塩、Ｎ－ココイルグリシン塩、Ｎ－ココイルグルタミン酸塩、Ｎ－パルミトイルグルタミン酸塩、Ｎ－パルミトイルプロリン、Ｎ－パルミトイルプロリン塩、Ｎ－ウンデシレノイルグリシン、Ｎ－ウンデシレノイルグリシン塩、Ｎ－ステアロイルグルタミン塩等が挙げられる。酸由来型陰イオン性界面活性剤がＮ－アシルアミノ酸系界面活性剤であると、糖タンパク質のタンパク質部分をより変性させやすく、糖鎖遊離酵素を変性させにくい傾向がある。
【0061】
Ｒ２がアルキル基である場合の当該アミノ酸又はその塩（つまりＮ－アシル－Ｎ－アルキルアミノ酸系界面活性剤）の具体例としては、Ｎ－ココイル－Ｎ－メチルアラニン、Ｎ－ココイル－Ｎ－メチルアラニン塩、Ｎ－ミリストイル－Ｎ－メチル－β－アラニン、Ｎ－ミリストイル－Ｎ－メチル－β－アラニン塩、Ｎ－ミリストイルサルコシン塩、Ｎ－ラウロイル－Ｎ－メチルアラニン、Ｎ－ラウロイル－Ｎ－メチルアラニン塩、Ｎ－ラウロイル－Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－ラウロイル－Ｎ－イソプロピルグリシン塩、Ｎ－ラウロイル－Ｎ－メチル－β－アラニン、Ｎ－ラウロイル－Ｎ－メチル－β－アラニン塩、Ｎ－ラウロイル－Ｎ－エチル－β－アラニン、Ｎ－ラウロイル－Ｎ－エチル－β－アラニン塩、Ｎ－ラウロイルサルコシン、Ｎ－ラウロイルサルコシン塩、Ｎ－ココイルサルコシン、Ｎ－ココイルサルコシン塩、Ｎ－オレオイル－Ｎ－メチル－β－アラニン、Ｎ－オレオイル－Ｎ－メチル－β－アラニン塩、Ｎ－オレオイルサルコシン、Ｎ－オレオイルサルコシン塩、Ｎ－リノレイル－Ｎ－メチル－β－アラニン、Ｎ－パルミトイル－Ｎ－メチル－β－アラニン、Ｎ－パルミトイルサルコシン塩等が挙げられる。酸由来型陰イオン性界面活性剤がＮ－アシル－Ｎ－アルキルアミノ酸系界面活性剤であると、糖タンパク質のタンパク質部分をさらに変性させやすく、糖鎖遊離酵素を変性させにくい傾向がある。
【0062】
《酸由来型陰イオン性界面活性剤－スルホン酸型陰イオン性界面活性剤》
スルホン酸型陰イオン性界面活性剤は、Ｒ１－ＳＯ３Ｘ（ここで、Ｒ１は有機基を表し、Ｘは水素原子又は陽イオンを表す。）で表されるスルホン酸又はスルホン酸塩である。有機基Ｒ１は、少なくとも炭素を有する基であり、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基、置換又は無置換のアリール基、二価の連結基（例えば、－Ｏ－、－ＣＯ－、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨ－等）が介在した高級アルキル基又は高級不飽和炭化水素基等が挙げられる。
スルホン酸型陰イオン性界面活性剤は、Ｒ１－ＳＯ３Ｘ（ここで、Ｒ１は有機基を表し、Ｘは水素原子又は陽イオンを表す。）で表されるスルホン酸又はスルホン酸塩である。有機基Ｒ１は、少なくとも炭素を有する基であり、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基、置換又は無置換のアリール基、二価の連結基（例えば、－Ｏ－、－ＣＯ－、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨ－等）が介在した高級アルキル基又は高級不飽和炭化水素基等が挙げられる。
【0063】
有機基Ｒ１のうち、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基、及び陽イオンＸについては、上記のカルボン酸又はカルボン酸塩における有機基Ｒ１及び陽イオンＸと同様である。
【0064】
具体的には、１－ヘキサンスルホン酸塩、１－オクタンスルホン酸塩、１－デカンスルホン酸塩、１－ドデカンスルホン酸塩；ペルフルオロブタンスルホン酸、ペルフルオロブタンスルホン酸塩、ペルフルオロオクタンスルホン酸、ペルフルオロオクタンスルホン酸塩；テトラデセンスルホン酸塩；アルファスルホ脂肪酸メチルエステル塩（ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＨ（ＳＯ３Ｘ）ＣＯＯＣＨ３）等（ｎは、１～３０の整数）が挙げられる。
【0065】
有機基Ｒ１が置換又は無置換のアリール基である場合、アリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。置換アリール基の場合、置換基は直鎖又は分岐のアルキル基であってもよく、当該直鎖又は分岐のアルキル基の炭素数は１～３０であってもよい。特にフェニル基の場合、当該置換基はスルホニル基に対してパラ位で置換されていてもよい。このような芳香属系スルホン酸塩としては、トルエンスルホン酸塩、クメンスルホン酸塩、オクチルベンゼンスルホン酸塩、ドデシルベンゼンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、ナフタレンジスルホン酸塩、ナフタレントリスルホン酸塩、ブチルナフタレンスルホン酸塩等が挙げられる。
【0066】
有機基Ｒ１が、二価の連結基（例えば、－Ｏ－、－ＣＯ－、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨ－等）が介在した高級アルキル基又は高級不飽和炭化水素基である場合のスルホン酸型界面活性剤としては、当該高級アルキル基又は高級不飽和炭化水素基でＯ－置換されたイセチオン酸塩、当該高級アルキル基又は高級不飽和炭化水素基でＮ－置換されたタウリン塩等が挙げられる。当該高級アルキル基又は高級不飽和炭化水素基の炭素数は、６～１８であってもよい。このようなスルホン酸型界面活性剤の具体例としては、ココイルイセチオン酸塩、ココイルタウリン塩、ココイル－Ｎ－メチルタウリン、Ｎ－オレオイル－Ｎ－メチルタウリン塩、Ｎ－ステアロイル－Ｎ－メチルタウリン塩、Ｎ－ラウロイル－Ｎ－メチルタウリン塩等が挙げられる。
【0067】
《酸由来型陰イオン性界面活性剤－硫酸エステル型陰イオン性界面活性剤》
硫酸エステル型陰イオン性界面活性剤は、Ｒ１－ＯＳＯ３Ｘ（ここで、Ｒ１は有機基を表し、Ｘは陽イオンを表す。）で表される硫酸エステル塩である。有機基Ｒ１は、少なくとも炭素を有する基であり、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基であり、それぞれ、上述のカルボン型界面活性剤におけるＲ１と同じである。陽イオンＸとしては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属イオン、トリエタノールアミンイオン、アンモニウムイオン等が挙げられる。
硫酸エステル型陰イオン性界面活性剤は、Ｒ１－ＯＳＯ３Ｘ（ここで、Ｒ１は有機基を表し、Ｘは陽イオンを表す。）で表される硫酸エステル塩である。有機基Ｒ１は、少なくとも炭素を有する基であり、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基であり、それぞれ、上述のカルボン型界面活性剤におけるＲ１と同じである。陽イオンＸとしては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属イオン、トリエタノールアミンイオン、アンモニウムイオン等が挙げられる。
【0068】
硫酸エステル塩の具体例としては、ラウリル硫酸塩、ミリスチル硫酸塩、ラウレス硫酸塩（Ｃ１２Ｈ２５（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＯＳＯ３Ｘ、ここで、ｎは１～３０の整数）、ポリオキシエチレンアルキルフェノールスルホン酸ナトリウム（Ｃ８Ｈ１７Ｃ６Ｈ４Ｏ［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］３ＳＯ３Ｘ）等が挙げられる。
【0069】
《酸由来型陰イオン性界面活性剤－リン酸エステル型陰イオン性界面活性剤》
リン酸エステル型陰イオン性界面活性剤は、Ｒ１－ＯＳＯ３Ｘ（ここで、Ｒ１は有機基を表し、Ｘは水素原子又は陽イオンを表す。）で表されるリン酸エステル又はリン酸エステル塩である。有機基Ｒ１は、少なくとも炭素を有する基であり、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基であり、それぞれ、上述のカルボン型界面活性剤におけるＲ１と同様である。陽イオンＸとしては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属イオン、トリエタノールアミンイオン、アンモニウムイオン等が挙げられる。
リン酸エステル型陰イオン性界面活性剤は、Ｒ１－ＯＳＯ３Ｘ（ここで、Ｒ１は有機基を表し、Ｘは水素原子又は陽イオンを表す。）で表されるリン酸エステル又はリン酸エステル塩である。有機基Ｒ１は、少なくとも炭素を有する基であり、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基であり、それぞれ、上述のカルボン型界面活性剤におけるＲ１と同様である。陽イオンＸとしては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属イオン、トリエタノールアミンイオン、アンモニウムイオン等が挙げられる。
【0070】
リン酸エステル又はリン酸エステル塩の具体例としては、ラウリルリン酸、ラウリルリン酸塩等が挙げられる。
【0071】
《脱糖鎖促進剤の組成》
脱糖鎖促進剤は、水又は緩衝液中に酸由来型陰イオン性界面活性剤が溶解又は分散された状態で用意されてもよい。緩衝液を用いる場合、緩衝剤としては、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、カルバミン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；トリスヒドロキシメチルアンモニウム等のトリス緩衝剤；リン酸塩等が挙げられる。緩衝液は、ｐＨが５～１０であるものが好ましい。緩衝液のｐＨがこの範囲内であると、糖鎖遊離酵素の活性を保ちやすい。脱糖鎖促進剤において、水又は緩衝液中に含まれる酸由来型陰イオン性界面活性剤以外の成分としては、界面活性剤以外の金属塩等の塩類が挙げられる。
脱糖鎖促進剤は、水又は緩衝液中に酸由来型陰イオン性界面活性剤が溶解又は分散された状態で用意されてもよい。緩衝液を用いる場合、緩衝剤としては、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、カルバミン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；トリスヒドロキシメチルアンモニウム等のトリス緩衝剤；リン酸塩等が挙げられる。緩衝液は、ｐＨが５～１０であるものが好ましい。緩衝液のｐＨがこの範囲内であると、糖鎖遊離酵素の活性を保ちやすい。脱糖鎖促進剤において、水又は緩衝液中に含まれる酸由来型陰イオン性界面活性剤以外の成分としては、界面活性剤以外の金属塩等の塩類が挙げられる。
【0072】
（遊離工程の操作及び反応条件）
遊離工程では、糖鎖遊離酵素の至適条件（温度及びｐＨ）が満たされた、糖タンパク質と糖鎖遊離酵素とを含む遊離反応液が調製されればよい。
遊離工程では、糖鎖遊離酵素の至適条件（温度及びｐＨ）が満たされた、糖タンパク質と糖鎖遊離酵素とを含む遊離反応液が調製されればよい。
【0073】
脱糖鎖促進剤を用いる場合は、糖鎖遊離酵素の至適条件（温度及びｐＨ）が満たされた、糖タンパク質と酸由来型陰イオン性界面活性剤と糖鎖遊離酵素とを含む遊離反応液が調製されればよい。したがって、脱糖鎖促進剤を用いる場合には、固定された糖タンパク質を含む試料（以下、単に糖タンパク質を含む試料という場合がある。）、脱糖鎖促進剤、及び糖鎖遊離酵素はどのような操作手順で混合されてもよい。
【0074】
例えば、糖タンパク質を含む試料と、脱糖鎖促進剤と、糖鎖遊離酵素とを同じタイミングで互いに混合して遊離反応液を調製してもよい。また、先に脱糖鎖促進剤を加え、その後に糖鎖遊離酵素を加えることで遊離反応液を調製してもよい。さらに、固相に固定された糖タンパク質が後述する前処理を経て得られたものである場合で、かつ、脱糖鎖促進剤と前処理に用いられる界面活性剤とが同一物質である場合には、前処理の時に、脱糖鎖促進剤に相当する分量の界面活性剤を、前処理剤に相当する分量の界面活性剤に上乗せして先に加えておき、引き続く遊離工程で（すでに脱糖鎖促進剤が存在している状態であるため）糖鎖遊離酵素のみを加えてもよい。
【0075】
具体的には、すべての成分を混合させた遊離反応液を調製し、その後、至適温度に設定して、糖タンパク質から糖鎖を遊離させる反応を行うことができる。この場合、反応時間は例えば５秒～２４時間であってもよい。
【0076】
脱糖鎖促進剤を用いる場合には、糖タンパク質を含む試料と、酸由来型陰イオン性界面活性剤とを先に混合して糖タンパク質のタンパク質部分を変性させた後に、糖鎖遊離酵素と混合してもよい。この場合、変性時間は例えば５秒～２４時間であってもよく、糖鎖遊離時間は例えば５秒～２４時間であってもよい。
【0077】
遊離反応液において、糖タンパク質の濃度は、例えば０．１μｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬであってもよく、例えば１μｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬであってもよい。遊離反応液中の糖タンパク質の濃度が上記下限値以上であることは、検出性の点で好ましく、上記上限値以下であることは、定量性の点で好ましい。
【0078】
脱糖鎖促進剤を用いる場合、遊離反応液において、酸由来型陰イオン性界面活性剤の濃度は、例えば０．０１～３０質量％であってもよく、例えば０．２～１．０質量％であってもよく、例えば０．２～０．３質量％であってもよく、例えば０．２２～０．２７質量％であってもよい。あるいは、酸由来型陰イオン性界面活性剤は、糖タンパク質１μｇに対して０．００１μｇ～１００ｍｇ以下となるように用いてもよい。
【0079】
酸由来型陰イオン性界面活性剤の使用量を上記の範囲に設定することによって、糖鎖遊離酵素の活性維持の点及び遊離糖鎖の回収量の点で良好となり、かつ、回収量の安定性の点でも良好となる。また、例えば遊離糖鎖の精製を固相担体によって行う場合に、乾燥時間の冗長を防止する点でも好ましい。
【0080】
遊離反応液において、糖鎖遊離酵素の濃度は、例えば０．００１μＵ／ｍＬ～１０００ｍＵ／ｍＬであってもよく、例えば０．０１μＵ／ｍＬ～１００ｍＵ／ｍＬであってもよい。あるいは、糖鎖遊離酵素を糖タンパク質１μｇに対して０．００１μＵ～１０００ｍＵとなるように用いてもよい。糖鎖遊離酵素の使用量を上記の範囲に設定することによって、効率的な糖鎖遊離が可能となる。
【0081】
反応ｐＨは、糖鎖遊離酵素の至適ｐＨに合わせればよいが、例えば５～１０であってもよい。反応温度も、糖鎖遊離酵素の至適温度に合わせればよいが、例えば４～９０℃であってもよい。
【0082】
反応時間は、糖タンパク質のスケール等にもよるが、例えば５秒～２４時間であってもよい。好ましくは、遊離工程の反応系を開放系にして溶媒が蒸発するように加熱する。加熱温度としては、例えば４０℃以上、例えば４５℃以上であってもよい。これによって、遊離工程の進行中に溶媒が蒸発して反応液の濃度が徐々に上昇するため、本実施形態の方法に供された糖タンパク質のスケールにかかわらず、糖鎖遊離が効率的に進む濃度に供することが容易である。さらに、遊離反応とともに溶媒除去が併せて行われるため、遊離工程と別に溶媒除去工程を行うための時間が短縮され又は不要となり、更に迅速な糖鎖調製が可能となる。加熱温度の範囲内の上限としては、糖鎖遊離酵素の変性を防ぐ観点から、例えば８０℃であってもよい。
【0083】
（遊離生成物）
遊離工程によって得られる遊離生成物は、遊離した糖鎖と、固相に結合したタンパク質とを含む。固相に結合したタンパク質は、糖タンパク質を構成していたタンパク質部分におけるアミノ酸残基間のペプチド結合が切断されていない。遊離生成物は、溶媒を含む状態で得てもよいし、特に遊離工程において開放系かつ加熱条件に供する場合には、溶媒が完全に蒸発した蒸発乾固物の状態で得てもよい。
遊離工程によって得られる遊離生成物は、遊離した糖鎖と、固相に結合したタンパク質とを含む。固相に結合したタンパク質は、糖タンパク質を構成していたタンパク質部分におけるアミノ酸残基間のペプチド結合が切断されていない。遊離生成物は、溶媒を含む状態で得てもよいし、特に遊離工程において開放系かつ加熱条件に供する場合には、溶媒が完全に蒸発した蒸発乾固物の状態で得てもよい。
【0084】
本実施形態の方法では、糖鎖が遊離する一方、タンパク質部分は固相に固定されたままであるため、当該固相を分離するだけでタンパク質部分が除去される。一方で固相を分離して得られる分離液は、遊離した糖鎖とともに前処理工程で用いられた界面活性剤及び遊離工程で用いられた脱糖促進剤が共に溶存した混合液となっている。糖鎖の分析手法によっては、糖鎖が上述の界面活性剤等と共存している混合液の状態で分析に供してもよい場合もあるが、例えば質量分析等で分析する場合には、分析前に混合液から糖鎖を精製することが好ましい。
【0085】
糖鎖を精製する場合、例えば、ヒドラジド基を有するポリマーを精製用固相担体として用い、当該精製用固相担体に混合液を接触させることができる。混合液中では、遊離糖鎖は環状のヘミアセタール型と非環状のアルデヒド型との平衡状態を生じており、このアルデヒド基－ＣＨＯとヒドラジド基－ＮＨ－ＮＨ２とが特異的に反応し、安定的な結合－Ｃ＝Ｎ－ＮＨ－を形成する。これによって、精製用固相担体に遊離糖鎖を捕捉することができる。
【0086】
精製用固相担体に捕捉された糖鎖は、再遊離させられてもよい。再遊離の手法としては、酸と有機溶媒との混合溶媒又は酸と水と有機溶媒の混合溶媒を固相担体に接触させて反応させることが挙げられる。当該混合溶媒のｐＨは例えば２～９であってもよく、２～７であってもよく、２～６であってもよい。弱酸性から中性付近で反応させる場合には、シアル酸残基の脱離等、糖鎖の加水分解を抑制することができる点で好ましい。しかしながら、さらにｐＨが低い強酸条件も許容される。
【0087】
後述するように、遊離させた糖鎖は、低分子化合物（標識化合物）で修飾することができる。低分子化合物は、分析手法に応じて適宜選択することができる。なお、低分子化合物とは、固相担体を構成する高分子化合物と区別されるものであり、好ましくは水又は緩衝液、有機溶媒に溶解可能な化合物であることが好ましい。
【0088】
［前処理工程］
本実施形態の方法において、固定工程の後且つ遊離工程の前に、前処理工程を更に備えていてもよい。これにより、タンパク質部分の分解処理を行うことなく、糖タンパク質からの糖鎖の遊離が容易になる。その結果、糖鎖遊離処理に要する時間を大幅に短縮することができる。
本実施形態の方法において、固定工程の後且つ遊離工程の前に、前処理工程を更に備えていてもよい。これにより、タンパク質部分の分解処理を行うことなく、糖タンパク質からの糖鎖の遊離が容易になる。その結果、糖鎖遊離処理に要する時間を大幅に短縮することができる。
【0089】
前処理工程では、固相に固定された糖タンパク質を含む試料に界面活性剤を含む前処理剤を接触させる。前処理工程は、糖タンパク質を含む試料を固相に接触させ糖タンパク質の捕捉が完了した後、又は、固相合成が完了した後若しくは更に洗浄処理が行われた後であって、糖鎖遊離酵素に接触させられる前に行われてもよい。前処理工程を実施することにより、遊離工程において糖タンパク質に糖鎖遊離酵素が作用しやすくなる。
【0090】
前処理剤に含まれる界面活性剤は、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、及び非イオン界面活性剤のいずれであってもよい。
【0091】
陰イオン界面活性剤としては特に限定されず、石鹸等の脂肪酸の塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、高級アルコール硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、α－スルホ脂肪酸エステル、α－オレフィンスルホン酸塩、モノアルキルリン酸エステル塩、アルキルスルホン酸塩等が挙げられるが、後の糖鎖遊離工程で用いられる脱糖鎖促進剤として用いることができる陰イオン性界面活性剤（本明細書では、脱糖鎖促進剤としても用いることができる陰イオン性界面活性剤を、特に酸由来型陰イオン性界面活性剤という。）であることが好ましい。酸由来型陰イオン性界面活性剤を前処理工程で用いる場合、糖鎖遊離工程で用いられる脱糖鎖促進剤として挙げた界面活性剤と同じ界面活性剤であってもよいし、異なる界面活性剤であってもよい。
【0092】
陽イオン界面活性剤としては特に限定されず、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩、アミン塩系等が挙げられる。両性界面活性剤としては特に限定されず、アルキルアミノ脂肪酸塩、アルキルベタイン、アルキルアミンオキシド等が挙げられる。非イオン界面活性剤としては特に限定されず、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、アルキルグルコシド、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロックコポリマー等が挙げられる。
【0093】
前処理剤は、界面活性剤が、水又は緩衝液中に溶解した状態で用いられてもよい。緩衝液を用いる場合、緩衝剤としては、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、カルバミン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；トリスヒドロキシメチルアンモニウム等のトリス緩衝剤；リン酸塩等が挙げられる。緩衝液は、ｐＨが５～１０であるものが好ましい。緩衝液のｐＨがこの範囲内であると、後の工程で用いる糖鎖遊離酵素の活性を保ちやすい。糖タンパク質を含む試料において、水又は緩衝液中に含まれる糖タンパク質以外の成分としては、金属塩等の塩類、グリセロール等のタンパク質の安定化剤等が挙げられる。
【0094】
前処理剤中の界面活性剤の濃度は、例えば０．０１～３０質量％であってもよく、例えば０．２～１．０質量％であってもよく、例えば０．２～０．３質量％であってもよく、例えば０．２２～０．２７質量％であってもよい。当該濃度が上記下限値以上であること、及び上記上限値以下であることによって、後の糖鎖遊離工程において遊離させた糖鎖を、良好な回収率で得ることができる。
【0095】
前処理剤は、固相に接触させた後は、固相に固定された糖タンパク質から分離される。分離は、所定の使用量の全てを容器内に入れた後に一度に行ってもよいし、所定の使用量の一部を何回かに分けて入れ、その都度行ってもよい。前処理剤の分離は、減圧又は遠心分離等によって行うことができる。
【0096】
前処理工程を終えた固相に固定された糖タンパク質は、迅速調製の観点で、洗浄されることなく後述の遊離工程に供することができる。しかしながら、前処理工程の後、遊離工程の前に洗浄操作を行ってもよい。
【0097】
［標識工程］
標識工程は、遊離工程を行った容器と同じ容器を用いて行われる。したがって、標識工程では、遊離工程を行った容器中の遊離生成物に標識化合物を含む標識試薬（標識反応液）を加え、糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る。
標識工程は、遊離工程を行った容器と同じ容器を用いて行われる。したがって、標識工程では、遊離工程を行った容器中の遊離生成物に標識化合物を含む標識試薬（標識反応液）を加え、糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る。
【0098】
（標識化合物）
標識化合物は、糖鎖に対する反応性基と、糖鎖に付すべき修飾基とを有するものであれば特に限定されない。糖鎖に対する反応性基としては、オキシルアミノ基、ヒドラジド基、アミノ基等が挙げられる。修飾基は、糖鎖の分析手法に応じて当業者が適宜選択することができる。
標識化合物は、糖鎖に対する反応性基と、糖鎖に付すべき修飾基とを有するものであれば特に限定されない。糖鎖に対する反応性基としては、オキシルアミノ基、ヒドラジド基、アミノ基等が挙げられる。修飾基は、糖鎖の分析手法に応じて当業者が適宜選択することができる。
【0099】
例えば、標識化合物が、糖鎖への反応性基としてオキシルアミノ基又はヒドラジド基を有する場合、糖鎖に付すべき修飾基としては、例えば、アルギニン残基、トリプトファン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、システイン残基、リジン残基からなる群より選ばれるアミノ酸残基を選択することができる。
【0100】
標識化合物がアルギニン残基を含む場合、修飾された糖鎖のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ測定時にイオン化が促進され、検出感度が向上する点で好ましい。標識化合物がトリプトファン残基を含む場合、当該残基は蛍光性かつ疎水性であることから、修飾された糖鎖の逆相ＨＰＬＣ検出時に、分離性が向上及び蛍光検出感度が向上する点で好ましい。標識化合物がフェニルアラニン残基及び／又はチロシン残基を含む場合、修飾された糖鎖のＵＶ吸収による検出に適する点で好ましい。標識化合物がシステイン残基を含む場合、当該残基の－ＳＨ基を標的としてＩＣＡＴ試薬（米国ＡＢＩ社）等のラベル化試薬によるラベル化ができる。標識化合物がリジン残基を含む場合、当該残基のアミノ基を標的としてｉＴＲＡＱ試薬（米国Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＥｘａｃＴａｇ試薬（米国Ｐｅｒｋｉｎ社）等のラベル化試薬によるラベル化ができる。標識化合物がトリプトファン残基を含む場合、当該残基のインドール基を標的としてＮＢＳ試薬（日本国、島津製作所）によるラベル化ができる。
【0101】
また、例えば、標識化合物が糖鎖への反応性基としてアミノ基を有する場合、糖鎖に付すべき修飾基としては、芳香族基が挙げられる。アミノ基及び芳香族基を有する標識化合物の使用では、還元アミノ化による修飾が行われる。芳香族基は、紫外可視吸収特性又は蛍光特性を有するため、ＵＶ検出又は蛍光検出での検出感度が向上する点で好ましい。
【0102】
このような芳香族基を与える標識化合物としては、具体的には、８－アミノピレン－１，３，６－トリスルホネート、８－アミノナフタレン－１，３，６－トリスルホネート、７－アミノ－１，３－ナフタレンジスルホン酸、２－アミノ－９（１０Ｈ）－アクリドン、５－アミノフルオレセイン、ダンシルエチレンジアミン、２－アミノピリジン、７－アミノ－４－メチルクマリン、２－アミノベンズアミド、２－アミノ安息香酸、７－アミノ－１－ナフトール、３－（アセチルアミノ）－６－アミノアクリジン、２－アミノ－６－シアノエチルピリジン、ｐ－アミノ安息香酸エチル、ｐ－アミノベンゾニトリル、７－アミノナフタレン－１，３－ジスルホン酸等が挙げられる。
【0103】
中でも、２－アミノベンズアミドは、反応スケールが大きい場合であっても夾雑物（例えば、塩、タンパク質その他の生体分子）の影響を比較的受けにくい点で好ましい場合がある。一方、本実施形態の方法は、反応スケールが小さい場合に特に有用である。反応スケールが小さいほど夾雑物の影響を受けにくくなるため、より多種多様の標識試薬（標識反応液）へ適用することができる。なお、標識化合物としての機能が維持される限りにおいて、上述の化合物の誘導体もまた好ましく用いられる。
【0104】
標識化合物は、水、緩衝液及び／又は有機溶媒に溶解させて使用される。緩衝液としては、前述の遊離工程で用いられるものと同様の緩衝剤の水溶液が挙げられる。有機溶媒としては、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び酢酸等の極性有機溶媒、並びにヘキサン等の非極性溶媒が挙げられる。
【0105】
還元アミノ化による修飾においては、糖鎖の還元末端に形成されるアルデヒド基と標識化合物のアミノ基とを反応させ、形成されたシッフ塩基を還元剤により還元することで糖鎖の還元末端に修飾基が導入されることで、効率的な標識が可能となる。
【0106】
還元剤としては、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム、メチルアミンボラン、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、ピコリンボラン、ピリジンボラン等が挙げられる。
【0107】
中でも、安全性及び反応性の両方の観点から、ピコリンボラン（２－ピコリン－ボラン）を用いることが好ましい。同様の観点から、ピコリンボランを還元剤として用いる場合、標識化合物としては例えば２－アミノベンズアミドを用いることが好ましい。
【0108】
（標識工程の操作及び反応条件）
標識工程では、遊離生成物に対して標識試薬（標識反応液）を加える。還元アミノ化による修飾を行う場合、標識試薬は、アミノ基及び芳香族基を有する標識化合物、還元剤、及び溶媒を含んでいてもよい。標識工程においては、遊離工程が行われた容器を引き続いて用いるが、標識試薬を加える際に、遊離生成物に対して洗浄等、その相対的組成（溶媒以外の成分比）を変化させる処置は行われない。なお、遊離生成物に対して、水、緩衝液及び／又は有機溶媒を加えて溶解又は希釈することは許容される。
標識工程では、遊離生成物に対して標識試薬（標識反応液）を加える。還元アミノ化による修飾を行う場合、標識試薬は、アミノ基及び芳香族基を有する標識化合物、還元剤、及び溶媒を含んでいてもよい。標識工程においては、遊離工程が行われた容器を引き続いて用いるが、標識試薬を加える際に、遊離生成物に対して洗浄等、その相対的組成（溶媒以外の成分比）を変化させる処置は行われない。なお、遊離生成物に対して、水、緩衝液及び／又は有機溶媒を加えて溶解又は希釈することは許容される。
【0109】
標識化反応系は、水、緩衝液及び／又は有機溶媒を溶媒とし、当該溶媒中に糖鎖及び標識化合物を含む標識反応液が、固相に固定されたタンパク質、その他遊離工程の残存物と混在した状態で構築される。
【0110】
緩衝液としては、前述の遊離工程で用いられるものと同様の緩衝剤の水溶液が挙げられる。有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）等の非プロトン性極性有機溶媒、有機酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸等）及びアルコール（メタノール、エタノール、プロパノール等）等のプロトン性極性有機溶媒、並びにヘキサン等の非プロトン性非極性溶媒が挙げられる。これらの溶媒は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【0111】
標識化反応液において、標識試薬（標識反応液）は、例えば担体の使用体積の０．１～１０倍体積で用いてもよく、例えば０．５～５倍体積で用いてもよい。また、標識試薬中の標識化合物の濃度は、例えば１～２０Ｍであってもよく、例えば２～１５Ｍであってもよい。標識化合物の量が上記下限値以上であることは標識が定量的に行われる点で好ましく、上記上限値以下であることは過剰試薬の除去が容易になる点で好ましい。
【0112】
標識反応液中の還元剤の濃度は、例えば０．５～１０Ｍであってもよく、例えば１～７．５Ｍであってもよい。還元剤の量が上記下限値以上であることは標識が定量的に行われやすい点で好ましく、上記上限値以下であることは過剰試薬の除去が容易になる点で好ましい。
【0113】
溶媒の量は、担体の使用体積の０．５～１０倍体積で用いてもよく、例えば１～５倍体積で用いてもよい。溶媒の量が上記下限値以上であることは溶解性の点で好ましく、上記上限値以下であることは標識が定量的に行われる点で好ましい。
【0114】
標識反応液の反応温度は例えば４～８０℃であってもよく、例えば２５～７０℃であってもよい。反応温度が上記下限値以上であることは反応時間が短くなる点で好ましく、上記上限値以下であることは高温による糖鎖の部分分解が抑制される点で好ましい。標識反応液の反応時間は、例えば５～６００分であってもよく、例えば３０～３００分であってもよい。反応時間が上記下限値以上であることは定量的な標識の点で好ましく、上記上限値以下であることは糖鎖の部分分解が抑制される点で好ましい。
【0115】
標識化反応は常温で速やかに進むため、標識試薬（標識反応液）を加えたときから標識化合物が作用して糖鎖標識体が生成する。したがって、標識試薬を加えた後、当該反応の完了の如何によらず任意のタイミングで後述の分離工程を行うことができる。あるいは、遊離工程後に後述する分離工程を行って分離液を得、その後、分離液に標識試薬を加えてもよい。
【0116】
以下、還元剤としてピコリンボランを用いた場合について説明する。還元剤としてピコリンボランを用いた場合は、溶媒としてプロトン性溶媒を含むことが好ましい。これによって、標識化合物（好ましくは２－アミノベンズアミド。ピコリンボランを用いる場合において以下同様。）及びピコリンボランを高濃度で溶解することができるため、標識工程に要する時間が短縮される。
【0117】
すなわち、標識試薬（標識反応液）は、２－アミノベンズアミド、ピコリンボラン及び溶媒を含んでいてもよい。毒性の低いピコリンボランを用いることにより、安全性の高い標識が可能となる。
【0118】
標識工程に要する時間の短縮効果をより好ましく得る観点から、プロトン性溶媒は、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸等の有機酸であることが好ましい。また、有機酸は標識反応系中で液体であることが好ましい。中でも、操作容易性の観点から、有機酸は酢酸であることが好ましい。
【0119】
溶媒中のプロトン性溶媒の濃度は、例えば４０～１００体積％であってもよい。これによって、良好な標識効率が得られる。より良好な標識効率を得る観点から、溶媒中のプロトン性溶媒の濃度は、５０～１００％以下であってもよく、７５～１００体積％であってもよい。
【0120】
上述したプロトン性溶媒の沸点が比較的低い場合（例えば沸点が１４０℃未満である場合）、プロトン性溶媒に加えて、当該プロトン性溶媒よりも沸点が高い溶媒を併用してもよい。これによって、標識工程における上記の比較的沸点が低いプロトン性溶媒の揮発速度を遅延させることができる。その結果、標識工程中に未反応物の不所望の析出を抑制することができる。このことによって、収量よく標識糖鎖を得ることができる。このような沸点が高い溶媒（以下、高沸点溶媒と記載する。）を併用する態様は、糖鎖のスケールが小さい場合、溶媒の量が少ない場合、及び／又は、反応時間が長くなる場合に選択することができる。
【0121】
上述の高沸点溶媒としては、例えば沸点１４０～２００℃の非プロトン性溶媒であってもよい。具体的な高沸点溶媒としては、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、Ｎ－メチルピロリドン等が挙げられる。
【0122】
高沸点溶媒を併用する場合、その量は、前記標識化合物である２－アミノベンズアミド及び前記還元剤の溶解性・反応性を向上させるという観点から、プロトン性溶媒よりも体積％が低いことが好ましく、プロトン性溶媒の４体積％以上１００体積％未満であってもよく、４～７０体積％であってもよい。高沸点溶媒の量が上記下限値以上であることは、プロトン性溶媒の揮発速度を遅延させやすい点で好ましく、上記上限値以下であることは、プロトン性溶媒の効果（前記標識化合物である２－アミノベンズアミド及び前記還元剤の溶解性・反応性を向上させる効果）を得やすい点で好ましい。
【0123】
還元剤としてピコリンボランを用いる場合には、溶媒として酢酸とジメチルスルホキシドとの混合溶媒を用いることが最も好ましい。
【0124】
還元剤としてピコリンボランを用いる場合には、標識試薬（標識反応液）中の標識化合物の濃度は１～２０Ｍであってもよく、２～１５Ｍであってもよい。標識化合物の濃度が上記下限値以上であることは標識工程の時間短縮の点で好ましく、上記上限値以下であることは過剰試薬の除去が容易になる点で好ましい。
【0125】
標識反応液中のピコリンボランの量は、例えば０．５～１０Ｍであってもよく、例えば１～７．５Ｍであってもよい。ピコリンボランの量が上記下限値以上であることは標識工程の時間短縮の点で好ましく、上記上限値以下であることは過剰試薬の除去が容易になる点で好ましい。
【0126】
還元剤としてピコリンボランを用いた場合は、溶媒の量は、担体の使用体積の０．１～１０倍体積であってもよく、０．５～５倍体積であってもよい。溶媒の量が上記下限値以上であることは溶解性の点で好ましく、上記上限値以下であることは標識工程の時間短縮の点で好ましい。
【0127】
標識反応液の反応温度は例えば４～８０℃であってもよく、例えば２５～７０℃であってもよい。反応温度が上記下限値以上であることは反応時間が短くなる点で好ましく、上記上限値以下であることは高温による糖鎖の部分分解が抑制される点で好ましい。標識反応液の反応時間は、例えば２～１２０分であってもよく、例えば５～４０分であってもよい。反応時間が上記下限値以上であることは定量的な標識の点で好ましく、上記上限値以下であることは糖鎖の部分分解が抑制される点で好ましい。
【0128】
（標識生成物）
標識工程後の容器内には、糖鎖の標識体及び固相に結合したタンパク質が存在する。したがって、標識工程によって得られる標識生成物は、糖鎖の標識体及び固相に結合したタンパク質を含むということもできる。固相に結合したタンパク質は、糖タンパク質を構成していたタンパク質部分におけるアミノ酸残基間のペプチド結合が依然として切断されていない。標識生成物は、水、緩衝液及び／又は有機溶媒中に含まれていてよい。
標識工程後の容器内には、糖鎖の標識体及び固相に結合したタンパク質が存在する。したがって、標識工程によって得られる標識生成物は、糖鎖の標識体及び固相に結合したタンパク質を含むということもできる。固相に結合したタンパク質は、糖タンパク質を構成していたタンパク質部分におけるアミノ酸残基間のペプチド結合が依然として切断されていない。標識生成物は、水、緩衝液及び／又は有機溶媒中に含まれていてよい。
【0129】
［分離工程］
（糖鎖標識体の溶出）
標識工程の後、標識生成物から固液分離によって糖鎖の標識体を含む分離液を得る分離工程を行ってもよい。これにより、糖鎖の標識体を容易に分離することができる。例えば、標識生成物に溶離液を通液することで、糖鎖の標識体を溶出することができる。この場合に用いる溶離液は、水、水溶液、コロイド溶液等の水系溶液であってよい。溶離液として、固相とタンパク質部分との結合に対する切断能を有する性質を具備するものを選択してもよい（標識糖鎖の分析を例えばクロマトグラフィーによって行う場合等）し、そのような性質を具備しないものを選択してもよい（標識糖鎖の分析を例えば質量分析によって行う場合等）。これによって、糖鎖の標識体を含む分離液が得られる。
（糖鎖標識体の溶出）
標識工程の後、標識生成物から固液分離によって糖鎖の標識体を含む分離液を得る分離工程を行ってもよい。これにより、糖鎖の標識体を容易に分離することができる。例えば、標識生成物に溶離液を通液することで、糖鎖の標識体を溶出することができる。この場合に用いる溶離液は、水、水溶液、コロイド溶液等の水系溶液であってよい。溶離液として、固相とタンパク質部分との結合に対する切断能を有する性質を具備するものを選択してもよい（標識糖鎖の分析を例えばクロマトグラフィーによって行う場合等）し、そのような性質を具備しないものを選択してもよい（標識糖鎖の分析を例えば質量分析によって行う場合等）。これによって、糖鎖の標識体を含む分離液が得られる。
【0130】
分離液中には、糖鎖の標識体とともに、標識工程で用いた余剰の標識化合物、及び遊離工程で脱糖鎖促進剤を用いた場合には酸由来型陰イオン性界面活性剤等の不要物が存在している。溶離液として、固相とタンパク質部分との結合に対する切断能を有するものを選択した場合は、分離液中にタンパク質も混入する。溶離液として、固相とタンパク質部分との結合に対する切断能を有さないものを選択した場合は、分離液中にタンパク質は実質的に含まれない。
【0131】
（精製）
糖鎖の分析手法によっては、分離液から不要物を除去することで標識糖鎖を精製してもよい。不要物の除去は、分離液を精製用固相に通液して糖鎖の標識体を捕捉し、捕捉された糖鎖の標識体を再溶出することで行われてよい。
糖鎖の分析手法によっては、分離液から不要物を除去することで標識糖鎖を精製してもよい。不要物の除去は、分離液を精製用固相に通液して糖鎖の標識体を捕捉し、捕捉された糖鎖の標識体を再溶出することで行われてよい。
【0132】
精製用固相の一例として、標識糖鎖を非共有結合によって捕捉する固相が挙げられる。具体的には、シリカゲルカラム、アミノカラム、その他の順相固相を用いることができる。
【0133】
精製用固相の他の例として、標識糖鎖を共有結合によって捕捉する固相が挙げられる。これによって、タンパク質が混在している場合等において標識糖鎖の精製度を向上させることができる。具体的には、ヒドラジド基を有するポリマーを精製用固相担体として用いることができる。分離液中では、遊離糖鎖は環状のヘミアセタール型と非環状のアルデヒド型との平衡状態を生じているため、このアルデヒド基－ＣＨＯとヒドラジド基－ＮＨ－ＮＨ２とが特異的に反応し、安定的な結合－Ｃ＝Ｎ－ＮＨ－を形成する。これによって、精製用固相担体に遊離糖鎖を捕捉することができる。再遊離では、酸と有機溶媒との混合溶媒又は酸と水と有機溶媒の混合溶媒を固相担体に接触させて反応させることができる。当該混合溶媒のｐＨは、例えば２～９であってもよく、２～７であってもよく、２～６であってもよい。弱酸性から中性付近で反応させると、シアル酸残基の脱離等糖鎖の加水分解を抑制することができる点で好ましい。しかしながら、更にｐＨが低い強酸条件も許容される。
【0134】
［分析工程］
本実施形態の方法によって調製された糖鎖の標識体は、質量分析法（例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）、クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィーやＨＰＡＥ－ＰＡＤクロマトグラフィー）、電気泳動（例えば、キャピラリ電気泳動）等の公知の方法により、定性的及び／又は定量的に分析することができる。糖鎖の分析においては、各種データベース（例えば、ＧｌｙｃｏＭｏｄ、Ｇｌｙｃｏｓｕｉｔｅ、ＳｉｍＧｌｙｃａｎ（登録商標）等）を利用することができる。
本実施形態の方法によって調製された糖鎖の標識体は、質量分析法（例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）、クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィーやＨＰＡＥ－ＰＡＤクロマトグラフィー）、電気泳動（例えば、キャピラリ電気泳動）等の公知の方法により、定性的及び／又は定量的に分析することができる。糖鎖の分析においては、各種データベース（例えば、ＧｌｙｃｏＭｏｄ、Ｇｌｙｃｏｓｕｉｔｅ、ＳｉｍＧｌｙｃａｎ（登録商標）等）を利用することができる。
【0135】
このような糖タンパク質の糖鎖分析によって、例えば、抗体医薬品の研究開発、製造及び品質保証等の際に行われる抗体医薬品の糖鎖修飾分析；糖鎖バイオマーカーの検索研究等の際に行われる血清等の検体中の糖タンパク質の分析；幹細胞の糖鎖分析；電気泳動ゲルバンド中の糖鎖分析；植物組織の糖鎖分析等を迅速に行うことが可能となる。
【0136】
＜キット＞
一実施形態において、本発明は、糖タンパク質を固定するための固相、前記固相を保持し糖鎖の遊離及び標識を行うための容器、並びに糖鎖遊離酵素を備える、糖タンパク質の糖鎖調製用キットを提供する。本実施形態のキットは、上述した糖タンパク質の糖鎖を調製する方法を実施するためのものである。
一実施形態において、本発明は、糖タンパク質を固定するための固相、前記固相を保持し糖鎖の遊離及び標識を行うための容器、並びに糖鎖遊離酵素を備える、糖タンパク質の糖鎖調製用キットを提供する。本実施形態のキットは、上述した糖タンパク質の糖鎖を調製する方法を実施するためのものである。
【0137】
したがって、本実施形態のキットを用いて糖タンパク質の糖鎖を調製する場合、固定工程において、試料に０．５μＬ／秒以上３．５μＬ／秒以下の速度で固相を通過させる。特に固定工程で遠心を用いる場合、固定工程において、試料に３０Ｇ以上３００Ｇ以下の遠心加速度で固相を通過させる。
【0138】
本実施形態のキットは、キット使用のためのプロトコル情報を含んでいてもよい。キット使用のためのプロトコル情報は、上述の本発明の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法が示された印刷物であってもよいし、当該方法が示されたウェブ上の情報へのアクセスを可能とするアクセス情報であってもよい。
【0139】
プロトコル情報は、固定工程において、試料に０．５μＬ／秒以上３．５μＬ／秒以下の速度で固相を通過させる旨の情報を含む。プロトコル情報は、特に固定工程で遠心を用いる場合、固定工程において、試料に３０Ｇ以上３００Ｇ以下の遠心加速度で固相を通過させる旨の情報を含む。
【0140】
また、本実施形態のキットは、界面活性剤を含む前処理剤、酸由来型陰イオン性界面活性剤を含む脱糖鎖促進剤、標識試薬、クリーンアップ用固相、クリーンアップ用固相を充填するための容器のいずれか１つ又は全部を更に備えていてもよい。
【0141】
ここで、前処理剤に含まれる界面活性剤と脱糖鎖促進剤に含まれる酸由来型陰イオン界面活性剤とは同一の化合物であってもよい。この場合には、前処理剤と脱糖鎖促進剤とが区別されずに１つの容器に収容されていてもよい。
【0142】
糖タンパク質を固定するための固相固相を保持し糖鎖の遊離及び標識を行うための容器、又はクリーンアップ用固相を充填するための容器は、カラム、マルチウェルプレート、フィルタープレート、マイクロチューブ等であってよいが、好ましくはスピンカラムである。スピンカラムは、遠心分離により固液分離された分離液を回収するコレクションチューブを更に備えていてもよい。容器は、固相を充填した状態でキットに含まれていてもよいし、固相と別個のアイテムとして含まれていてもよい。
【0143】
糖タンパク質を固定するための固相は、糖タンパク質と結合可能な特異的結合性の非共有結合性基（水素結合性基及びイオン結合性基）及び共有結合性基等の結合性官能基を表面に有する固相である。固相としては、例えば、陽イオン交換担体、疎水性相互作用担体、無機担体等が挙げられ、例えば電気泳動ゲル又は転写用メンブレン等、単に糖タンパク質を保持するに過ぎない固相は含まない。
【0144】
固相は、無機担体であってもよい。担体が無機担体であると、例えば、糖鎖遊離酵素により担体の一部が遊離することがない。このため、遊離された糖鎖の分析において、不要なシグナルの出現を抑制しやすい。
【0145】
糖タンパク質が抗体である場合、固相は、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＨ、プロテインＤ、プロテインＡｒｐからなる群より選ばれるリガンドを表面に有していてもよい。これにより、糖鎖解析の重要性が特に高い抗体について、スループット性の高い糖鎖試料調製及び解析が可能となる。
【0146】
また、標識試薬は、２－アミノベンズアミド、還元剤及び溶媒を含んでいてもよい。また、２－アミノベンズアミド、還元剤及び溶媒は別々の容器に収容されており、使用時に混合されてもよい。
【0147】
本実施形態のキットによって、タンパク質部分の分解処理を行うことなく、糖タンパク質からの糖鎖の遊離が可能となる。したがって、糖鎖遊離処理にかかる時間を大幅に短縮することができる。また、糖鎖遊離処理において糖鎖遊離酵素を作用しやすくすることができる。
【0148】
また、キットが標識試薬を含む場合には、遊離生成物を分離することなく標識試薬を重ねて加えることで、糖タンパク質から糖鎖を分析用試料（標識された態様）で極めて迅速に調製することができる。
【0149】
＜装置＞
一実施形態において、本発明は、糖タンパク質を固定する固相が収容された容器を保持する容器保持部と、前記容器の収容物を固液分離する固液分離部と、前記容器に試薬を導入する試薬導入部と、前記固液分離部を制御する制御部と、を備え、前記試薬導入部が、前記容器に糖タンパク質を導入する糖タンパク質導入部と、前記容器に糖鎖遊離酵素を導入する糖鎖遊離酵素導入部と、前記容器に標識試薬を導入する標識試薬導入部とを含む、糖タンパク質の糖鎖を調製する装置を提供する。
一実施形態において、本発明は、糖タンパク質を固定する固相が収容された容器を保持する容器保持部と、前記容器の収容物を固液分離する固液分離部と、前記容器に試薬を導入する試薬導入部と、前記固液分離部を制御する制御部と、を備え、前記試薬導入部が、前記容器に糖タンパク質を導入する糖タンパク質導入部と、前記容器に糖鎖遊離酵素を導入する糖鎖遊離酵素導入部と、前記容器に標識試薬を導入する標識試薬導入部とを含む、糖タンパク質の糖鎖を調製する装置を提供する。
【0150】
以下、本実施形態の装置について説明する。なお、以下に説明する装置の構成はあくまで一例であり、本発明の権利範囲はこの構成に拘束されるものではない。
【0151】
図６は、本実施形態の装置を説明する模式図である。装置１００は、糖タンパク質を固定する固相１０が収容された容器１５を保持する容器保持部２０と、容器１５の収容物を固液分離する固液分離部４０と、固液分離部４０を制御する制御部７０と、容器１５に試薬を導入する試薬導入部３０と、を備え、試薬導入部３０が、容器１５に糖タンパク質を含む試料３１を導入する糖タンパク質導入部３５と、容器１５に糖鎖遊離酵素３２を導入する糖鎖遊離酵素導入部３５と、容器１５に標識試薬３３を導入する標識試薬導入部３５とを含む。本例においては、糖タンパク質導入部、糖鎖遊離酵素導入部及び標識試薬導入部は同一の部材から構成されている。
【0152】
容器保持部２０は、糖タンパク質を固定する固相１０が収容された容器１５を保持するためのものである。容器保持部２０が容器１５を保持する態様は特に限定されず、例えば、容器保持部２０の保持穴又は保持孔に容器の大部分を嵌入させて保持する態様が挙げられる。このほかにも、容器保持部の係合凸部（係合凹部）に容器の係合凹部（係合凸部）を係合させて保持する態様、容器保持部の挟持部で容器を挟持保持する態様等が挙げられる。
【0153】
固液分離部４０は、容器１５中に含まれる収容物から固体と液体とを分離する。固体は容器１５中に残されるものであり、実質的には、固相１０及びそれに固定されている物質である。この場合、容器１５としては、固液分離可能なフィルタを具えるもの（例えばスピンカラム、フィルタ付きマイクロプレート等）が用いられる。さらに、容器１５には、回収容器１６（例えばコレクションチューブ、コレクションプレート等）が装着されて用いられてもよい。この場合、容器保持部２０は、容器１５に装着された回収容器１６を保持する回収容器保持部を含んで構成されてもよい。図６の例では、回収容器保持部と容器保持部２０は同一の部材から構成されている。
【0154】
固液分離部４０の具体的な分離形式は、特に限定されず、遠心ろ過、減圧ろ過、加圧ろ過のいずれであってもよい。図６の例では、固液分離部４０の分離形式は遠心ろ過である。固液分離部４０は、容器１５（又は１６）を保持するラック４１と、ドライブシャフト４２と、モーター４３とを備えている。
【0155】
制御部７０は、固液分離部４０を制御し、固定工程において、糖タンパク質を含む試料３１に０．５μＬ／秒以上３．５μＬ／秒以下の速度で固相１０を通過させる。図６の例では、制御部７０は、固液分離部４０のモーター４３の回転速度を制御し、固定工程において、糖タンパク質を含む試料３１に３０Ｇ以上３００Ｇ以下の遠心加速度で固相１０を通過させる。
【0156】
図６の例のように、固液分離部４０は、遊離工程及び標識工程が行われる容器保持部２０から独立した構成部材として構成されていてもよい。この場合、装置１００は、制御部７０による制御により、容器保持部２０から固液分離部４０へ、容器１５（及び１６）を自動移送させる容器移送部５０を含んでいてもよい。容器移送部５０は、容器１５（及び１６）の移送において、容器１５のみが移送されるように構成されていてもよいし、容器１５が回収容器１６を装着した状態で移送されるように構成されていてもよい。容器移送部５０は、制御部７０による制御により、容器１５を直接的又は間接的に（つまり回収容器１６を介して）把持及び開放し、かつ移動するように作動するアームを含む。
【0157】
制御部７０による制御により、固液分離部４０を作動させることで、液体が回収容器１６に回収される。したがって、例えば、固定工程において、糖タンパク質を含む試料３１を固相１０に接触させ、固相１０に固定された糖タンパク質を容器１５内に残すとともに液体成分を回収容器１６内に廃棄することができる。また、例えば、糖鎖遊離酵素３２と標識試薬３３とを導入することによって得られた容器１５中の反応物（つまり反応後の容器１５の収容物）から、減圧ろ過、加圧ろ過、遠心分離等によって、糖鎖の標識体を含む分離液を回収容器１６中に回収することができる。
【0158】
試薬導入部３０は、容器保持部２０に保持された容器１５内に液体類を導入するためのものである。液体導入部３０は、少なくとも、固定工程で用いられる、糖タンパク質を含む試料３１を導入する糖タンパク質導入部３５と、遊離工程で用いられる糖鎖遊離酵素３２を導入する糖鎖遊離酵素導入部３５と、標識工程で用いられる標識試薬３３を導入する標識試薬導入部３５とを含む。
【0159】
図６の例では、試薬導入部３０は、糖タンパク質を含む試料３１、糖鎖遊離酵素３２、標識試薬３３を収容したタンク３４と、タンク３４が収容した各試薬を送液する送液管３５ａと、制御部７０による制御により、各試薬の送液を制御する弁（３６，３７，３８）と、各試薬を容器１５の内部に導入する導入部３５とを備えている。
【0160】
液体導入部３５は、さらに洗浄液を容器１５内に導入可能となるように構成されていてもよい。これによって、容器１５に洗浄液を通液することができる。タンク３４は、図示しない前処理剤、脱糖鎖促進剤、洗浄液等を収容する区画を更に備えていてもよい。
【0161】
糖タンパク質導入部３５、糖鎖遊離酵素導入部３５及び標識試薬導入部３５は、制御部７０による制御により、同一の反応容器１５内に、糖タンパク質を含む試料３１、糖鎖遊離酵素３２又は標識試薬３３を添加する。試薬導入部３０が反応容器１５内へ液体を導入する態様は特に限定されず、例えば、送液すべき液体が貯留されている送液源（３１，３２，３３）から管状部材を介して反応容器１５内へ送液する態様が挙げられる。このほかにも、管状部材中に採取した液体を反応容器内へ注入する態様等が挙げられる。
【0162】
糖タンパク質導入部３５、糖鎖遊離酵素導入部３５及び標識試薬導入部３５は、別個独立した構成部材として構成されていてもよい。あるいは、糖タンパク質導入部３５、糖鎖遊離酵素導入部３５及び標識試薬導入部３５は、同一の構成部材として構成されていてもよい。
【0163】
装置１００は、容器１５の収容物の温度を調節する温度調節部６０を更に備えていてもよい。装置１００が温度調節部６０を含む場合、温度調節部６０は、少なくともヒータ機能を有していればよい。温度調節部６０は、制御部７０による制御により、容器１５を、遊離工程及び標識工程それぞれに必要な温度に加温する。さらに、装置１００は、容器１５を含む空間と連通する開放空間が確保されるように構成されていてもよい。これによって、遊離工程を開放系で行った場合に容器１５内の溶媒が蒸発するため、糖タンパク質の量にかかわらず、糖鎖遊離が効率的に進む濃度に供することが容易である。さらに、遊離反応とともに溶媒除去が併せて行われるため、遊離工程と別に溶媒除去工程を行うための時間が不要となり、さらに迅速な糖鎖調製が可能となる。
【0164】
容器移送部５０は、標識工程後の固液分離によって回収容器１６内に回収された糖鎖の標識体を含む分離液を、制御部７０による制御により、精製用固相を収容した精製用カラムに移送してもよい。精製用カラムを上述の固液分離部４０に設置して、固液分離を含む精製工程を行ってもよい。
【0165】
装置１００において、固液分離部４０だけでなく、作動しうる構成部分（例えば、液体導入部３５、弁３６、弁３７、弁３８、容器移送部５０、温度調節部６０）の少なくともいずれか、好ましくは全てが制御部７０による制御により自動制御されてもよい。これによって、糖タンパク質の糖鎖の調製をより迅速に行うことができる。図６の例では、制御部７０は、固液分離部４０だけでなく、液体導入部３５、弁３６、弁３７、弁３８、容器移送部５０、温度調節部６０に対して制御信号を送受信するケーブル７１で接続されている。
【0166】
図７は、制御部７０の構成を示すブロック図である。制御部７０は、図７に示すように、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｐｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）３１０と、メモリ３２０と、記憶部３３０と、入出力制御部３４０とを備えるプログラム実行可能な装置（コンピュータ）である。所定のプログラムを実行することにより、複数の機能ブロックとして機能する。なお、制御部７０の少なくとも一部の機能を専用の論理回路等によって構成することができる。
【0167】
記憶部３３０は、上述したプログラムや必要なデータを記憶する不揮発性の記録媒体である。記憶部３３０は、例えばＲＯＭやハードディスク等で構成される。記憶部３３０に記録されたプログラムは、メモリ３２０上に読み込まれ、ＣＰＵ３１０によって実行される。
【0168】
入出力制御部３４０は、ＣＰＵ３１０の指示に基づき、固液分離部４０、液体導入部３５、弁３６、弁３７、弁３８、容器移送部５０、温度調節部６０、に対する制御信号等を生成する。
【0169】
温度調節部６０は、更に、温度センサを備えることができる。そして、入出力制御部３４０は、上記温度センサからのデータを受け取る構成とすることができる。更に、入出力制御部３４０は、ＣＰＵ３１０の指示に基づき、温度調節部６０に対する制御信号を生成する構成とすることができる。これにより、温度調節部６０の温度を所定の温度に制御することができる。
【実施例0170】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。しかしながら本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0171】
［実験例１］
（比較例１）
住友ベークライト社製のＥＺＧｌｙｃｏ ｍＡｂ－Ｎ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ２－ＡＢキット（品番：ＢＳ－Ｘ４４１０、以下、ＥＺＧｌｙｃｏキットと略す）の「２」の溶液（６００μＬ）に４０μｇのヒトＩｇＧ（シグマ社製）を溶解させた液（以下、抗体溶液と略す）を、ＥＺＧｌｙｃｏキットの「１」のカラムに供し、液がすべてカラムを通過するまで５００Ｇで遠心した。
（比較例１）
住友ベークライト社製のＥＺＧｌｙｃｏ ｍＡｂ－Ｎ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ２－ＡＢキット（品番：ＢＳ－Ｘ４４１０、以下、ＥＺＧｌｙｃｏキットと略す）の「２」の溶液（６００μＬ）に４０μｇのヒトＩｇＧ（シグマ社製）を溶解させた液（以下、抗体溶液と略す）を、ＥＺＧｌｙｃｏキットの「１」のカラムに供し、液がすべてカラムを通過するまで５００Ｇで遠心した。
【0172】
続いて、ＥＺＧｌｙｃｏキットのプロトコル通りに処理を行い、精製２－ベンズアミド（２ＡＢ）標識糖鎖を含む分離液を得た。続いて、得られた精製２ＡＢ標識糖鎖を含む分離液１μＬについて、下記表１に示す条件でＨＰＬＣ測定を行った。
【0173】
【表1】
【0174】
表１中、Ａ液及びＢ液は、それぞれ移動相を構成する液体であり、これらＡ液とＢ液とを混合して移動相の極性を調整した。また、表１において、「Ｂ：ａ％（Ｔ１分）→Ｂ：ｂ％（Ｔ２分）」という記載は、Ｂ溶液の濃度を、（Ｔ２－Ｔ１）分間で、ａ％からｂ％まで変化させたことを意味する。ただし、Ｔ１，Ｔ２，ａ，ｂはそれぞれ実数を表わす。また、表１において％は体積％を表わす。
【0175】
（実施例１～５）
遠心加速度を下記表２に示す条件に変更した以外は、上記比較例１と同様にして、抗体から糖鎖を調製し、得られた精製２ＡＢ標識糖鎖を含む分離液１μＬについて、上記表１に示す条件でＨＰＬＣ測定を行った。下記表２には、遠心により抗体溶液がすべてカラムを通過するまでに要した時間も示した。
遠心加速度を下記表２に示す条件に変更した以外は、上記比較例１と同様にして、抗体から糖鎖を調製し、得られた精製２ＡＢ標識糖鎖を含む分離液１μＬについて、上記表１に示す条件でＨＰＬＣ測定を行った。下記表２には、遠心により抗体溶液がすべてカラムを通過するまでに要した時間も示した。
【0176】
【表2】
【0177】
得られたＨＰＬＣスペクトルを図１（ａ）～（ｆ）に示す。横軸は溶出時間を示し、縦軸は蛍光強度を示す。図１（ａ）は比較例１の結果を示し、図１（ｂ）は実施例１の結果を示し、図１（ｃ）は実施例２の結果を示し、図１（ｄ）は実施例３の結果を示し、図１（ｅ）は実施例４の結果を示し、図１（ｆ）は実施例５の結果を示す。
【0178】
その結果、図１（ａ）～（ｆ）に示すように、いずれの試料についても２ＡＢ標識糖鎖が検出されたことが確認された。
【0179】
図２は、比較例１及び実施例１～５のＨＰＬＣスペクトルにおける主要な１０個のピーク面積の和を示すグラフである。その結果、比較例１の収率（１０ピークの面積の和）を１００％とした場合、実施例１の収率は９７．０％、実施例２の収率は１０３．３％、実施例３の収率は１１６．６％、実施例４の収率は１３９．９％、実施例５の収率は１２７．２％であった。
【0180】
また、図３は、比較例１及び実施例１～５のＨＰＬＣスペクトルにおける主要な１０個のピークについて、ピーク面積の和を１００とした場合の各々のピークの面積比率（％）を示すグラフである。その結果、比較例１及び実施例１～５において、ピークパターンは大きく違わないことが確認された。具体的には、面積比率１０％以上を占めるピークでは、比較例１と実施例１～５のピーク面積比率の差は±１０％以下であった。
【0181】
［実験例２］
実験例１における、比較例１、実施例１及び実施例４と同様の操作を再度行い、再現性を確認した。図４は、ＨＰＬＣスペクトルにおける主要な１０個のピーク面積の和を示すグラフである。比較例１の収率（１０ピークの面積の和）を１００％とした場合、実施例１の収率は１１９．２％、実施例４の収率は１６９．８％であった。
実験例１における、比較例１、実施例１及び実施例４と同様の操作を再度行い、再現性を確認した。図４は、ＨＰＬＣスペクトルにおける主要な１０個のピーク面積の和を示すグラフである。比較例１の収率（１０ピークの面積の和）を１００％とした場合、実施例１の収率は１１９．２％、実施例４の収率は１６９．８％であった。
【0182】
［実験例３］
実験例１における、比較例１、実施例１及び実施例４と同様の操作を更に行い、再現性を確認した。図５は、ＨＰＬＣスペクトルにおける主要な１０個のピーク面積の和を示すグラフである。比較例１の収率（１０ピークの面積の和）を１００％とした場合、実施例１の収率は１１４．７％、実施例４の収率は１４８．６％であった。
実験例１における、比較例１、実施例１及び実施例４と同様の操作を更に行い、再現性を確認した。図５は、ＨＰＬＣスペクトルにおける主要な１０個のピーク面積の和を示すグラフである。比較例１の収率（１０ピークの面積の和）を１００％とした場合、実施例１の収率は１１４．７％、実施例４の収率は１４８．６％であった。
【産業上の利用可能性】
【0183】
本発明によれば、糖タンパク質の糖鎖の調製において、糖鎖の収量を向上させる技術を提供することができる。
【符号の説明】
【0184】
１００…糖タンパク質の糖鎖を調製する装置、１０…固相、１５…容器、１６…回収容器、２０…容器保持部、３０…試薬導入部、３１…糖タンパク質を含む試料、３２…糖鎖遊離酵素、３３…標識試薬、３４…タンク、３５…糖タンパク質導入部（糖鎖遊離酵素導入部）（標識試薬導入部）、３５ａ…送液管、３６，３７，３８…弁、４０…固液分離部、４１…ラック、４２…ドライブシャフト、４３…モーター、５０…容器移送部、６０…温度調節部、７０…制御部、７１…ケーブル、３１０…ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｐｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）、３２０…メモリ、３３０…記憶部、３４０…入出力制御部３４０。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】