特開 2024-41841 食道がんおよびその他のがんに対する免疫療法において使用するための新規ペプチドおよびペプチドの組み合わせ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024041841

(43)【公開日】2024-03-27

(54)【発明の名称】食道がんおよびその他のがんに対する免疫療法において使用するための新規ペプチドおよびペプチドの組み合わせ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20240319BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240319BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240319BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240319BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240319BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240319BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240319BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240319BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240319BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20240319BHJP

   C07K 14/82 20060101ALI20240319BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20240319BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240319BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240319BHJP

   A61K 38/08 20190101ALI20240319BHJP

   A61K 38/10 20060101ALI20240319BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240319BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240319BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240319BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240319BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240319BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12

C12N15/13 ZNA

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N5/10

C12N1/15

C12N1/21

C12N1/19

C12P21/08

C07K14/725

C07K14/82

C07K16/30

C07K19/00

C12P21/02 A

A61K38/08

A61K38/10

A61K48/00

A61K31/7088

A61K35/12

A61K39/395 T

A61K39/00 H

A61P35/00

【審査請求】有

【請求項の数】22

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024000243

(22)【出願日】2024-01-04

(62)【分割の表示】P 2021145069の分割

【原出願日】2016-07-05

(31)【優先権主張番号】1511792.2

(32)【優先日】2015-07-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】62/188,870

(32)【優先日】2015-07-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】506258073

【氏名又は名称】イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100174252

【弁理士】

【氏名又は名称】赤津 豪

(72)【発明者】

【氏名】メア，アンドレア

(72)【発明者】

【氏名】ヴァインシェンク，トニ

(72)【発明者】

【氏名】ソング，コレット

(72)【発明者】

【氏名】スホール，オリバー

(72)【発明者】

【氏名】フリッチェ，イェンス

(72)【発明者】

【氏名】シン，ハープリート

(57)【要約】      （修正有）

【課題】免疫療法において使用するためのペプチド、タンパク質、核酸、および細胞を提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなり、ＭＨＣクラスＩ分子に結合する能力を有し、前記ＭＨＣクラスＩ分子に結合すると、ＣＤ８Ｔ細胞によって認識されることができるようになるペプチド又はその薬学的に許容可能な塩であって、一態様として、修飾された、及び／又は、非ペプチド結合を含み、ＨＬＡ－ＤＲ抗原関連不変鎖のＮ末端アミノ酸を含んでなる融合タンパク質を構成する、ペプチド又はその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１、配列番号２－８、配列番号１０－１２、及び配列番号１４－９３のいずれかに示されるアミノ酸配列からなり、ＭＨＣクラスＩ分子に結合する能力を有し、前記ＭＨＣクラスＩ分子に結合すると、ＣＤ８Ｔ細胞によって認識されることができるようになる、ペプチド又はその薬学的に許容可能な塩。

【請求項2】

修飾された、及び／又は、非ペプチド結合を含む、請求項１に記載のペプチド又はその薬学的に許容可能な塩。

【請求項3】

請求項１又は２に記載のペプチド又はその薬学的に許容可能な塩、及びＨＬＡ－ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸を含んでなる融合タンパク質。

【請求項4】

請求項１若しくは２に記載のペプチド、若しくは、ＭＨＣクラスＩ分子と結合した請求項１若しくは２に記載のペプチドに特異的に結合する、抗体若しくはそのフラグメント、
前記抗体若しくはそのフラグメントが、可溶性若しくは膜結合抗体若しくはそのフラグメントである、抗体若しくはそのフラグメント、又は、
前記抗体が、(i)モノクローナル抗体及び／若しくはヒト化抗体若しくはそのフラグメント、若しくは(ii)二重特異性抗体及び／若しくはキメラ抗体若しくはそのフラグメントである、抗体若しくはそのフラグメント。

【請求項5】

ＭＨＣ分子と結合したＨＬＡリガンドと反応性であり、前記リガンドが請求項１に記載のペプチド若しくはその薬学的に許容可能な塩である、Ｔ細胞受容体、
前記Ｔ細胞受容体が可溶性若しくは膜結合Ｔ細胞受容体である、Ｔ細胞受容体、又は、
前記Ｔ細胞受容体が可溶性分子として提供され、免疫刺激ドメイン若しくは毒素を含むさらなるエフェクター機能を保有する、Ｔ細胞受容体。

【請求項6】

請求項１若しくは２に記載のペプチド若しくはその薬学的に許容可能な塩、請求項４に記載の抗体若しくはそのフラグメント、若しくは請求項５に記載のＴ細胞受容体をエンコードする核酸、又は、前記核酸が異種プロモータ配列と結合している、核酸。

【請求項7】

請求項６に記載の核酸を含有する、発現ベクター。

【請求項8】

請求項１若しくは２に記載のペプチド若しくはその薬学的に許容可能な塩、請求項６に記載の核酸、若しくは請求項７に記載の発現ベクターを含んでなる、組換え宿主細胞、又は
該宿主細胞が樹状細胞を含む抗原提示細胞である、組換え宿主細胞。

【請求項9】

医療において使用するための、請求項１若しくは２に記載のペプチド若しくはその薬学的に許容可能な塩、請求項３に記載の融合タンパク質、請求項６に記載の核酸、請求項７に記載の発現ベクター、又は請求項８に記載の組換え宿主細胞を含む薬剤。

【請求項10】

請求項１に記載のペプチド若しくはその薬学的に許容可能な塩、請求項４に記載の抗体若しくはそのフラグメント、又は請求項５に記載のＴ細胞受容体を製造する方法であって、請求項１に記載のペプチド若しくはその薬学的に許容可能な塩を提示する、請求項６に記載の核酸を発現する、又は請求項７に記載の発現ベクターを有する請求項８に記載の組換え宿主細胞を培養するステップと、前記ペプチド若しくはその薬学的に許容可能な塩、前記抗体若しくはそのフラグメント、又は前記Ｔ細胞受容体を、前記組換え宿主細胞又はその培養液から単離するステップとを含んでなる、方法。

【請求項11】

Ｔ細胞を、適切な抗原提示細胞の表面に、又は抗原提示細胞を模倣する人工コンストラクトの表面に発現される抗原負荷ヒトＭＨＣクラスＩ分子に、前記Ｔ細胞を抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり、生体外で接触させるステップを含んでなり、前記抗原が、請求項１に記載のペプチド若しくはその薬学的に許容可能な塩である、活性化Ｔリンパ球を製造するインビトロ法。

【請求項12】

請求項１１に記載のインビトロ法によって製造される活性化Ｔリンパ球であって、請求項１に記載のペプチドを提示する細胞を選択的に認識する活性化Ｔリンパ球。

【請求項13】

請求項１２に記載の活性化Ｔリンパ球を含み、請求項１に記載のペプチドを提示する患者において、標的細胞を死滅させる治療剤。

【請求項14】

請求項１又は２に記載のペプチド又はその薬学的に許容可能な塩、請求項３に記載の融合タンパク質、請求項４に記載の抗体又はそのフラグメント、請求項５に記載のＴ細胞受容体、請求項６に記載の核酸、請求項７に記載の発現ベクター、請求項８に記載の組換え宿主細胞、及び請求項１２に記載の活性化Ｔリンパ球からなる群から選ばれる少なくとも１つの活性成分と、薬剤的に許容できる担体とを含む医薬組成物、又は、
さらにアジュバントを含む、前記医薬組成物。

【請求項15】

がん治療薬の製造における、請求項１若しくは２に記載のペプチド若しくはその薬学的に許容可能な塩、請求項３に記載の融合タンパク質、請求項４に記載の抗体若しくはそのフラグメント、請求項５に記載のＴ細胞受容体、請求項６に記載の核酸、請求項７に記載の発現ベクター、請求項８に記載の組換え宿主細胞、請求項１２に記載の活性化Ｔリンパ球、又は請求項１４に記載の医薬組成物の使用。

【請求項16】

前記がんが、食道がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、乳がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、及び配列番号１、配列番号２－８、配列番号１０－１２、及び配列番号１４－９３のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドが由来するタンパク質の過剰提示を示すその他の腫瘍の群から選択される、請求項１５に記載の使用。

【請求項17】

請求項１若しくは２に記載のペプチド若しくはその薬学的に許容可能な塩、請求項３に記載の融合タンパク質、請求項４に記載の抗体若しくはそのフラグメント、請求項５に記載のＴ細胞受容体、請求項６に記載の核酸、請求項７に記載の発現ベクター、請求項８に記載の組換え宿主細胞、請求項１２に記載の活性化Ｔリンパ球、又は請求項１４に記載の医薬組成物を含む、がんの診断および／または治療用の薬剤。

【請求項18】

前記がんが、食道がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、乳がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、及び配列番号１、配列番号２－８、配列番号１０－１２、及び配列番号１４－９３のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドが由来するタンパク質の過剰提示を示すその他の腫瘍の群から選択される、請求項１７に記載の薬剤。

【請求項19】

（ａ）請求項１若しくは２に記載のペプチド若しくはその薬学的に許容可能な塩、請求項３に記載の融合タンパク質、請求項４に記載の抗体若しくは前記抗体の抗原に対する結合活性を有するそのフラグメント、請求項５に記載のＴ細胞受容体、請求項６に記載の核酸、請求項７に記載の発現ベクター、請求項８に記載の組換え宿主細胞、若しくは請求項１２に記載の活性化Ｔリンパ球を溶液若しくは凍結乾燥形態で含んでなる容器；及び
（ｂ）凍結乾燥物のための希釈剤若しくは再構成溶液を含有する第２の容器；を含むキット、又は、
前記（ａ）及び前記（ｂ）に加えて、（ｉ）配列番号２～配列番号１０１からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる少なくとももう１つのペプチド若しくはその薬学的に許容可能な塩、
（ｉｉ）緩衝液、（ｉｉｉ）希釈剤、（ｉｖ）フィルター、（ｖ）針、及び（ｖｉ）シリンジからなる群から選ばれる１つまたは複数をさらに含んでなるキット。

【請求項20】

個別化抗がんワクチンを製造する方法であって、
ａ）個々の患者からの腫瘍サンプルによって提示される、腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）を同定するステップと；
ｂ）ａ）で同定された前記ペプチドを、正常組織との比較で腫瘍における免疫原性および／または過剰提示について予備選別されたペプチド貯蔵庫と比較するステップと；
ｃ）前記患者からの前記サンプルにおいて同定されたＴＵＭＡＰと一致する少なくとも１つのペプチドを、前記貯蔵庫から選択するステップと；
ｄ）ステップｃ）に基づいて、個別化ワクチンを調合するステップと、を含み、
前記貯蔵庫が配列番号１、配列番号２－８、配列番号１０－１２、及び配列番号１４－９３のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドを含む、方法。

【請求項21】

請求項２０に記載の方法であって、以下の(1)～(4)からなる群から選ばれる１又は複数を含む方法。
(1) 前記ＴＵＭＡＰが、
ａ１）前記腫瘍サンプルからの発現データを前記腫瘍サンプルの組織型に対応する正常組織サンプルからの発現データと比較して、前記腫瘍サンプルにおいて過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質を同定するステップと；
ａ２）前記発現データを、前記腫瘍サンプル中のＭＨＣクラスＩ及び／又はクラスＩＩ分子と結合しているＭＨＣリガンドの配列と相関させて、前記腫瘍によって過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質に由来するＭＨＣリガンドを同定するステップとによって同定される、
(2) 前記腫瘍サンプルから単離されたＭＨＣ分子から、ＭＨＣ分子に結合したペプチドを溶出させ、前記溶出したリガンドを配列決定することで、ＭＨＣリガンドの配列が同定される、
(3) 前記腫瘍サンプルの組織型に対応する前記正常組織が、前記患者と同一の患者から得られたサンプルである、
(4) 前記貯蔵庫に包含される前記ペプチドの免疫原性が、生体外免疫原性アッセイ、ＭＨＣ多量体染色、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよび／または細胞内サイトカイン染色を含んでなる方法によって判定される

【請求項22】

請求項２０又は請求項２１に記載の方法であって、前記個々の患者からの正常な対応する組織と比較して前記腫瘍サンプルに特有の少なくとも１つの変異を同定するステップと、前記ワクチンに包含するために、若しくは細胞療法用剤を作成するために、前記変異に関連があるペプチドを選択するステップとをさらに含んでなる方法、
又は、前記個々の患者からの正常な対応する組織と比較して前記腫瘍サンプルに特有の少なくとも１つの変異を同定するステップと、前記ワクチンに包含するために、若しくは細胞療法用剤を作成するために、前記変異に関連があるペプチドを選択するステップとをさらに含んでなり、前記少なくとも１つの変異が、全ゲノム配列決定によって同定される方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫療法において使用するためのペプチド、タンパク質、核酸、および細胞に関する。特に、本発明は、がんの免疫療法に関する。本発明は、単独のまたはその他の腫瘍関連ペプチドと組み合わされた、腫瘍関連Ｔ細胞ペプチドエピトープにさらに関し、それは、例えば、抗腫瘍免疫応答を刺激し、または生体外でＴ細胞を刺激して患者に移入する、ワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たし得る。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子と結合しているペプチド、またはペプチドそれ自体もまた、抗体、可溶性Ｔ細胞受容体、およびその他の結合分子の標的になり得る。

【0002】

本発明は、ヒト腫瘍細胞のＨＬＡクラスＩ分子に由来する、いくつかの新規ペプチド配列およびそれらの変異型に関し、それらは抗腫瘍免疫応答を引き起こすためのワクチン組成物中で、または薬理的／免疫学的活性化合物および細胞の開発のための標的として、使用され得る。

【背景技術】

【0003】

食道がんは世界で８番目に頻度の高いがんであり、２０１２年における５年間有病者数は、４６４，０６３人である。死亡率は発症率非常に良く似ており（２０１２において４００，１６９対４５５，７８４）、食道がんの高い死亡率を指し示す（Ｗｏｒｌｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｐｏｒｔ，２０１４；Ｆｅｒｌａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｂｒａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

【0004】

扁平上皮がんおよび腺がんは、食道がんの２つの最も一般的なサブタイプである。どちらのサブタイプも、女性より男性でより一般的であるが、それらは異なる地理的分布を示す。扁平上皮がんは、低資源地域でより一般的であり、イラン・イスラム共和国、中国の一部、およびジンバブエで特に発生率が高い。腺がんは、白人および社会経済的地位の高い集団において最も一般的な食道がんのタイプであり、英国、オーストラリア、オランダ、および米国が先頭に立つ。食道扁平上皮がんの発症の最強のリスク因子としては、アルコールやたばこの摂取が挙げられ、食道腺がんは主に肥満や胃食道逆流症に関連する。高所得国では食道腺がんの発生率が着実に上昇しており、これは肥満や胃食道逆流症の発生率の増加や、胃食道接合部腫瘍の分類の変更に起因するかもしれない。神経内分泌がん、腺様嚢胞がん、腺扁平上皮がん、粘液類上皮がん、混合腺神経内分泌がん、様々な肉腫および黒色腫は、食道がんのより稀なサブタイプに相当する。（Ｗｏｒｌｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｐｏｒｔ，２０１４）。

【0005】

食道がんの一次治療ストラテジーは、腫瘍病期と部位、組織型、および患者の医学的状態に左右される。扁平上皮がん患者の小さなサブグループを除いて、手術のみでは十分でない。一般に、手術は、術前または最終的に術後の化学療法、または術前の化学放射線療法と組み合わされるべきである一方で、術前または術後の放射線単独では生存利益を与えないことが示された。化学療法薬措置としては、オキサリプラチンとフルオロウラシル、カルボプラチンとパクリタキセル、シスプラチンとフルオロウラシル、ＦＯＬＦＯＸ、およびシスプラチンとイリノテカンが挙げられる。食道がんにおける標的療法の無作為化されたデータは非常に限られているため、ＨＥＲ２陽性腫瘍を有する患者は、シスプラチン、フルオロウラシル、およびトラスツズマブの組み合わせを用いた胃がんに関する指針に従って治療されるべきである（Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｌｅｉｔｌｉｎｉｅ Ｍａｇｅｎｋａｒｚｉｎｏｍ，２０１２）。

【0006】

一般に、食道がんの大多数のタイプは、患者が早期段階の腫瘍に罹患している場合、十分に管理可能であるが、より後の段階では治療の成功は非常に限られている。したがって、新たなスクリーニングプロトコールの開発は、食道がん関連死亡率を減少させる上で非常に有効であり得る（Ｗｏｒｌｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｐｏｒｔ，２０１４）。

【0007】

免疫療法は、進行した食道がんを治療するための有望な新規アプローチかもしれない。異なるＭＡＧＥ遺伝子であるＮＹ－ＥＳＯ－１およびＥｐＣＡＭをはじめとするいくつかのがん関連遺伝子およびがん精巣抗原は、食道がんにおいて過剰発現されることが示された（Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５Ｂ；Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｂｕｊａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｑｕｉｌｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。これらの遺伝子は、免疫療法にとって非常に興味深い標的であり、それらの大多数についてその他の悪性病変の治療のために研究が行われている（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ，２０１５）。さらに、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２の上方制御が食道がんで報告され、より芳しくない予後と相関した。したがって、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍を有する食道がん患者は、抗ＰＤ－Ｌ１免疫療法の恩恵を受けるかもしれない（Ｏｈｉｇａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００５）。

【0008】

完了している早期臨床試験の数が非常に限られているので、食道がんにおける免疫療法アプローチに関する臨床データは、現在のところまだ比較的少ない（Ｔｏｏｍｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。３つの異なるがん精巣抗原（ＴＴＫタンパク質キナーゼ、リンパ球抗原６複合遺伝子座Ｋ、およびインスリン様成長因子（ＩＧＦ）－ＩＩｍＲＮＡ結合タンパク質３）から誘導される、３つのペプチドからなるワクチンが、第Ｉ相試験において、進行した食道がんがある患者に投与され、中程度の成績が得られた（Ｋｏｎｏ ｅｔ ａｌ．２００９）。自己由来悪性細胞およびインターロイキン２を用いた生体外攻撃後の活性化Ｔ細胞の腫瘍内注射は、第Ｉ／ＩＩ相試験にある２人の患者の内４人で、完全または部分的腫瘍応答を誘導した（Ｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００２）。食道がんに対する異なる免疫療法の影響を評価するために、養子細胞療法（ＮＣＴ０１６９１６２５、ＮＣＴ０１６９１６６４、ＮＣＴ０１７９５９７６、ＮＣＴ０２０９６６１４、ＮＣＴ０２４５７６５０）予防接種ストラテジー（ＮＣＴ０１１４３５４５、ＮＣＴ０１５２２８２０）、および抗－ＰＤ－Ｌ１療法（ＮＣＴ０２３４０９７５）をはじめとするさらなる臨床試験が現在実施されている（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ，２０１５）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

がんの治療に伴う重度の副作用および費用を考慮すると、がん全般、そして特に食道がんの治療に使用し得る要素を同定する必要がある。がんのより良い診断、予後の評価、および治療成功の予測につながる、がん全般、特に食道がんのためのバイオマーカーに相当する要素を同定する必要性もまたある。

【0010】

がんの免疫療法は、がん細胞を特異的に標的化しながら副作用を最小化する選択肢に相当する。がん免疫療法は、腫瘍関連抗原の存在を利用する。

【0011】

腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の現行の分類は、次の主要群を含んでなる：
ａ）がん精巣抗原：Ｔ細胞によって認識され得る初めて同定されたＴＡＡはこのクラスに属し、元々はがん精巣（ＣＴ）抗原と称されたが、それは、そのメンバーが組織学的に異なるヒト腫瘍において発現し、正常組織では精巣の精母細胞／精原細胞のみに存在し、時として胎盤に存在するためであった。精巣の細胞は、クラスＩおよびＩＩ ＨＬＡ分子を発現しないので、これらの抗原は正常組織のＴ細胞によって認識され得ず、したがって免疫学的に腫瘍特異的と見なされる。ＣＴ抗原の周知の例は、ＭＡＧＥファミリーメンバーおよびＮＹ－ＥＳＯ－１である。
ｂ）分化抗原：これらのＴＡＡは、腫瘍と、それから腫瘍が生じる正常組織との間で共有される。既知の分化抗原のほとんどは、黒色腫および正常メラノサイトに見いだされる。これらのメラノサイト系関連タンパク質の多くは、メラニン生合成に関与し、したがって腫瘍特異的でないが、それでもなおがん免疫療法のために広く利用されている。例としては、黒色腫に対するチロシナーゼとＭｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、または前立腺がんに対するＰＳＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。
ｃ）過剰発現ＴＡＡ：広範に発現されるＴＡＡをエンコードする遺伝子は、組織学的に異なる型の腫瘍において検出され、多数の正常組織においても概してより低い発現レベルで検出されている。正常組織によってプロセスされて潜在的に提示さるエピトープの多くは、Ｔ細胞認識の閾値レベル未満であり得る一方で、腫瘍細胞におけるそれらの過剰発現は、以前確立された免疫寛容を破壊することにより、抗がん応答を始動し得る。このクラスのＴＡＡの顕著な例は、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、サバイビン、テロメラーゼまたはＷＴ１である。
ｄ）腫瘍特異的抗原：これらのユニークなＴＡＡは、正常な遺伝子（β－カテニン、ＣＤＫ４など）の変異から生じる。これらの分子変化のいくつかは、腫瘍性形質転換および／または進行に関連している。腫瘍特異的抗原は、通常、正常組織に対する自己免疫反応のリスクなしに、強力な免疫応答を誘導できる。他方、これらのＴＡＡは、ほとんどの場合、その上でそれらが同定されたまさにその腫瘍のみと関係があり、通常は、多くの個々の腫瘍間で共有されない。腫瘍特異的（関連）イソ型を有するタンパク質では、ペプチドの腫瘍特異性（または関連性）はまた、ペプチドが腫瘍（関連）エクソンに由来する場合に生じてもよい。
ｅ）異常な翻訳後修飾から生じるＴＡＡ：このようなＴＡＡは、特異的でなく腫瘍において過剰発現もされないタンパク質から生じてもよいが、それでもなお、腫瘍において主に活性である翻訳後プロセスによって腫瘍関連になる。このクラスの例は、腫瘍にＭＵＣ１のような新規エピトープをもたらす改変グリコシル化パターン、または腫瘍特異的であってもなくてもよい分解中のタンパク質スプライシングのような事象から生じる。
ｆ）オンコウイルスタンパク質：これらのＴＡＡはウイルスタンパク質であり、それらは発がん過程において重要な役割を果たしてもよく、外来性である（ヒト由来でない）ため、それらはＴ細胞応答を誘起し得る。このようなタンパク質の例は、子宮頸がんにおいて発現されるヒト乳頭腫１６型ウイルスタンパク質Ｅ６およびＥ７である。

【0012】

Ｔ細胞ベースの免疫療法は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子によって提示される、腫瘍関連または腫瘍特異的タンパク質由来ペプチドエピトープを標的とする。腫瘍特異的Ｔリンパ球によって認識される抗原、すなわちそれらのエピトープは、酵素、受容体、転写因子などの全てのタンパク質クラスに由来する分子であり得て、それはそれぞれの腫瘍細胞において発現されて、同一起源の非改変細胞と比較して、通常、上方制御される。

【0013】

ＭＨＣ分子には、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの２つのクラスがある。ＭＨＣクラスＩ分子はα重鎖およびβ２ミクログロブリンから構成され、ＭＨＣクラスＩＩ分子はαおよびβ鎖から構成される。それらの三次元立体構造は結合溝をもたらし、それはペプチドとの非共有結合相互作用のために使用される。

【0014】

ＭＨＣクラスＩ分子は、ほとんどの有核細胞上に見いだされる。それらは、主に内因性タンパク質、欠陥リボソーム産物（ＤＲＩＰ）、およびより大型のペプチドのタンパク質切断から得られる、ペプチドを提示する。しかし、エンドソームコンパートメントまたは外因性起源に由来するペプチドもまた、ＭＨＣクラスＩ分子上に頻繁に見いだされる。この非古典的様式のクラスＩ提示は、文献中で交差提示と称される（Ｂｒｏｓｓａｒｔ ａｎｄ Ｂｅｖａｎ，１９９７；Ｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、大部分はプロフェショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）に見いだされ、例えば、エンドサイトーシス中にＡＰＣに取り込まれて引き続きプロセシングされる、外因性または膜貫通タンパク質のペプチドを主に提示する。

【0015】

ペプチドとＭＨＣクラスＩの複合体が、適切なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識される一方で、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子の複合体は、適切なＴＣＲを有するＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞によって認識される。その結果、ＴＣＲ、ペプチド、およびＭＨＣは、化学量論的に１：１：１の量で存在することが良く知られている。

【0016】

ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞は、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞による、効果的な応答の誘導と維持する上で重要な役割を果たす。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来するＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープの同定は、抗腫瘍免疫応答を始動させる医薬品の開発に非常に重要である（Ｇｎｊａｔｉｃ ｅｔ ａｌ．，２００３）。腫瘍部位では、Ｔヘルパー細胞が、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）親和的サイトカイン環境を維持して（Ｍｏｒｔａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００６）、例えば、ＣＴＬ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、および顆粒球などのエフェクター細胞を引きつける（Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７）。

【0017】

炎症不在下では、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現は、免疫系細胞、特に、例えば、単球、単球由来細胞、マクロファージ、樹状細胞などのプロフェショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）に主に限定される。がん患者においては、腫瘍細胞がＭＨＣクラスＩＩ分子を発現することが判明している（Ｄｅｎｇｊｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００６）。

【0018】

伸長された（より長い）本発明のペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ活性エピトープとして作用し得る。

【0019】

ＭＨＣクラスＩＩエピトープによって活性化されたＴヘルパー細胞は、抗腫瘍免疫におけるＣＴＬのエフェクター機能を統合する上で重要な役割を果たす。ＴＨ１型のＴヘルパー細胞応答を始動するＴヘルパー細胞エピトープは、それらの細胞表面に腫瘍関連ペプチド／ＭＨＣ複合体を提示する腫瘍細胞に向けられた細胞傷害機能をはじめとする、ＣＤ８陽性キラーＴ細胞のエフェクター機能を支持する。このようにして腫瘍関連Ｔヘルパー細胞ペプチドエピトープは、単独で、またはその他の腫瘍関連ペプチドとの組み合わせで、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たし得る。

【0020】

例えば、マウスなどの哺乳類動物モデルにおいて、ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の不在下であっても、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）の分泌による血管新生阻害を通じて腫瘍発現を阻害するには、ＣＤ４陽性Ｔ細胞で十分であることが示された（Ｂｅａｔｔｙ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ，２００１；Ｍｕｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ＣＤ４ Ｔ細胞が、直接抗腫瘍エフェクターであるという証拠がある（Ｂｒａｕｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

【0021】

ＨＬＡクラスＩＩ分子の構成的発現は、通常、免疫細胞に限定されるので、原発性腫瘍からクラスＩＩペプチドを直接単離する可能性があり得るとは、これまで考えられなかった。しかし、Ｄｅｎｇｊｅｌ ｅｔ ａｌ．は、いくつかのＭＨＣクラスＩＩエピトープを腫瘍から直接成功裏に同定した（国際公開第２００７／０２８５７４号パンフレット、欧州特許第１７６００８８Ｂ１号明細書）。

【0022】

ＣＤ８およびＣＤ４依存性の双方のタイプの応答は、抗腫瘍効果に共同して相乗的に寄与するので、ＣＤ８＋Ｔ細胞（リガンド：ＭＨＣクラスＩ分子＋ペプチドエピトープ）、またはＣＤ４陽性Ｔヘルパー細胞（リガンド：ＭＨＣクラスＩＩ分子＋ペプチドエピトープ）のどちらかによって認識される、腫瘍関連抗原の同定および特性解析は、腫瘍ワクチンの開発にとって重要である。

【0023】

ＭＨＣクラスＩペプチドが、細胞性免疫応答を始動（惹起）するためには、それはまた、ＭＨＣ分子に結合しなくてはならない。この過程は、ＭＨＣ分子の対立遺伝子と、ペプチドのアミノ酸配列の特定の多型性とに依存する。ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドは、通常は８～１２アミノ酸残基長であり、通常は、ＭＨＣ分子の対応する結合溝と相互作用するそれらの配列中に、２つの保存残基（「アンカー」）を含有する。このようにして、各ＭＨＣ対立遺伝子は、どのペプチドが結合溝と特異的に結合し得るかを決定する、「結合モチーフ」を有する。

【0024】

ＭＨＣクラスＩ依存免疫反応においては、ペプチドは腫瘍細胞によって発現される特定のＭＨＣクラスＩ分子に結合できるだけでなく、それらはまた、引き続いて特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞によって認識されなくてはならない。

【0025】

タンパク質が、Ｔリンパ球によって腫瘍特異的または腫瘍関連抗原として認識され、治療で利用されるためには、特定の必要条件が満たされなくてはならない。抗原は、主に腫瘍細胞によって発現され、健常組織によって発現されず、または比較的少量発現されるべきである。好ましい実施形態では、ペプチドは、健常組織と比較して、腫瘍細胞によって過剰提示されるべきである。それぞれの抗原は、ある種の腫瘍に存在するだけでなく、高い濃度（すなわち、それぞれのペプチド細胞当たりのコピー数）で存在することもさらに望ましい。腫瘍特異的および腫瘍関連抗原は、例えば、細胞周期調節またはアポトーシス抑制における機能のために、正常細胞から腫瘍細胞への形質転換に直接関与するタンパク質に由来することが多い。さらに、形質転換の直接原因となるタンパク質の下流標的が、上方制御されてもよく、（ｕｎｄ）したがって間接的に腫瘍関連であってもよい。このような間接的腫瘍関連抗原もまた、ワクチン接種アプローチの標的であってもよい（Ｓｉｎｇｈ－Ｊａｓｕｊａ ｅｔ ａｌ．，２００４）。このようなペプチド（「免疫原性ペプチド」）が、腫瘍関連抗原に由来して、生体外または生体内Ｔ細胞応答をもたらすことを確実にするためには、抗原のアミノ酸配列内にエピトープが存在することが必須である。

【0026】

基本的に、ＭＨＣ分子に結合できるあらゆるペプチドが、Ｔ細胞エピトープとして機能してもよい。生体外または生体内Ｔ細胞応答誘導のための必要条件は、対応するＴＣＲを有するＴ細胞の存在、およびこの特定のエピトープに対する免疫寛容の不在である。

【0027】

したがって、ＴＡＡは、腫瘍ワクチンをはじめとするが、これに限定されるものではない、Ｔ細胞ベースの治療法開発の出発点である。ＴＡＡを同定し特性決定する方法は、通常は、患者または健常人から単離され得るＴ細胞の使用に基づき、またはそれらは、腫瘍と正常組織との間の示差的転写プロファイル、または差次的ペプチド発現パターンの生成に基づく。しかし、腫瘍組織またはヒト腫瘍細胞株において過剰発現され、またはこのような組織または細胞株において選択的に発現される遺伝子の同定は、免疫療法においてこれらの遺伝子から転写される抗原の使用に関する、正確な情報を提供しない。これは、これらの抗原のエピトープの個々の亜集団のみが、このような用途に適するためであり、その理由は、対応するＴＣＲを有するＴ細胞が存在しなくてはならず、この特定のエピトープに対する免疫寛容が不在または最小でなくてはならないからである。したがって本発明の非常に好ましい実施形態では、それに対する機能性および／または増殖性Ｔ細胞が見いだされる、過剰にまたは選択的に提示されるペプチドのみを選択することが、重要である。このような機能性Ｔ細胞は、特異的抗原による刺激時にクローン増殖され得て、エフェクター機能を果たすことができるＴ細胞（「エフェクターＴ細胞」）と定義される。

【0028】

本発明による特異的ＴＣＲ（例えば、可溶性ＴＣＲ）および抗体またはその他の結合分子（スキャフォールド）によってペプチドＭＨＣを標的化する場合、基礎となるペプチドの免疫原性は二次的である。これらの場合には、提示が決定要因である。

【課題を解決するための手段】

【0029】

本発明の第１の態様では、本発明は、配列番号１～配列番号９３、または配列番号１～配列番号９３と少なくとも７７％、好ましくは少なくとも８８％相同的な（好ましくは、少なくとも７７％または少なくとも８８％同一の）その変異配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドに関し、その中で前記変異体は、ＭＨＣと結合し、および／またはＴ細胞と前記ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩との交差反応を誘導し、その中で前記ペプチドは、基礎となる完全長ポリペプチドでない。

【0030】

本発明は、配列番号１～配列番号９３、または配列番号１～配列番号９３と少なくとも７７％、好ましくは少なくとも８８％相同的な（好ましくは少なくとも７７％または少なくとも８８％同一の）その変異体からなる群から選択される配列を含んでなる、本発明のペプチドにさらに関し、前記ペプチドまたはその変異型は、８～１００、好ましくは８～３０、最も好ましくは８～１４アミノ酸の全長を有する。

【0031】

続く表は、本発明によるペプチド、それらの各配列番号、およびそれらのペプチドの予測される起源（基礎）遺伝子を示す。表１および表２の全てのペプチドは、ＨＬＡ－Ａ＊０２に結合する。表２のペプチドは、誤り率が高い、またはアルゴリズムを使用して計算された、ハイスループットスクリーニングの結果としての大きなリスト中で以前開示されているが、これまでがんとは全く関連付けられていなかった。表３のペプチドは、本発明のその他のペプチドとの組み合わせで有用であってもよい、追加的なペプチドである。表４のペプチドは、それぞれの基礎ポリペプチドの過剰発現または過剰提示を伴う、様々なその他の悪性腫瘍の診断および／または治療においてさらに有用である。

【0032】

表1: 本発明によるペプチド

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0033】

表2: がん関連性が以前知られていない本発明による追加的なペプチド

【表2】

【0034】

表3: 例えば個別化がん治療で有用なペプチド

【表3】

【0035】

本発明は、さらに、例えば、肺がん、膀胱がん、卵巣がん、黒色腫、子宮がん、肝細胞がん、腎細胞がん、脳がん、結腸直腸がん、乳がん、胃がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、前立腺がん、および白血病などの増殖性疾患の治療において使用するための本発明によるペプチドに一般に関する。

【0036】

特に好ましいのは、配列番号１～配列番号９３からなる群から選択される、本発明による単独のまたは組み合わされたペプチドである。より好ましいのは、配列番号１～配列番号７６（表１を参照されたい）からなる群から選択される単独のまたは組み合わせのペプチドと、食道がん、肺がん、膀胱がん、卵巣がん、黒色腫、子宮がん、肝細胞がん、腎細胞がん、脳がん、結腸直腸がん、乳がん、胃がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、前立腺がん、および白血病、好ましくは食道がんの免疫療法におけるそれらの使用である。

【0037】

特に好ましいのは、配列番号１、２、３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２６、３０、３２、３４、３７、４０、５１、５５、５７、５８、５９、６２、８１、および８２からなる群から選択される本発明による単独のまたは組み合わせのペプチドと、食道がん、肺がん、膀胱がん、卵巣がん、黒色腫、子宮がん、肝細胞がん、腎細胞がん、脳がん、結腸直腸がん、乳がん、胃がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、前立腺がん、および白血病、好ましくは食道がんの免疫療法におけるそれらの使用である。さらに特に好ましいのは、配列番号９に記載のペプチドである。

【0038】

以下の表４Ａに示されるように、本発明によるペプチドの多くは、その他の腫瘍型上にもまた見られ、したがって、その他の適応症のための免疫療法においても使用され得る。
図１および実施例１もまた、参照されたい。

【0039】

表4A: 本発明によるペプチド、およびその他の増殖性疾患、特にその他のがん性疾患における、それらの具体的使用。表は、選択されたペプチドについて、測定された腫瘍サンプルの5%超で過剰提示されるか、または測定された腫瘍サンプルの5%超で3を超える腫瘍対正常組織の幾何学平均比で提示されるかのどちらかである、それらがその上で発見された追加的な腫瘍型を示す。過剰提示は、最大提示がある正常サンプルと比較して、より高い腫瘍サンプル上の提示と定義される。それに対する過剰提示が試験された正常組織は、脂肪組織、副腎、動脈、骨髄、脳、中枢神経、結腸、十二指腸、食道、胆嚢、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、単核白血球細胞、膵臓、末梢神経、腹膜、下垂体、胸膜、直腸、唾液腺、骨格筋、皮膚、小腸、脾臓、胃、胸腺、甲状腺、気管、尿管、膀胱、静脈であった。

【表4A-1】

【表4A-2】

【0040】

表4B: 本発明によるペプチド、およびその他の増殖性疾患、特にその他のがん性疾患における、それらの具体的使用(表４の修正)。表は、表4Aのように、選択されたペプチドについて、測定された腫瘍サンプルの5%超で過剰提示を示すか、または測定された腫瘍サンプルの5%超で3を超える腫瘍対正常組織の幾何学平均比で提示を示す、それらがその上で発見された追加的な腫瘍型を示す。過剰提示は、最大提示がある正常サンプルと比較して、より高い腫瘍サンプル上の提示と定義される。それに対する過剰提示が試験された正常組織は、脂肪組織、副腎、動脈、骨髄、脳、中枢神経、結腸、十二指腸、食道、眼、胆嚢、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、単核白血球細胞、膵臓、副甲状腺、末梢神経、腹膜、下垂体、胸膜、直腸、唾液腺、骨格筋、皮膚、小腸、脾臓、胃、甲状腺、気管、尿管、膀胱、静脈であった。

【表4B-1】

【表4B-2】

【表4B-3】

【0041】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、非小細胞肺がんの併用療法のための、配列番号１、２、３、４、７、８、９、１１、１３、１７、４０、５７、５８、６２、６７、７２、７６、７７、８０、８２、８８、９２、および９４のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0042】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、リンパ腫の併用療法のための、配列番号１８、１９、２５、２９、５５、５８、６２、６８、７５、７６、７７、７９、８１、８４、８６、９０、および９２のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0043】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、小細胞肺がんの併用療法のための、配列番号２２、５５、５８、６２、５７、６１、７６、７９、および８０のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0044】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、腎細胞がんの併用療法のための、配列番号１７、５６、７６、８２、および５４のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0045】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、脳がんの併用療法のための、配列番号１６、２２、６６、６７、８０、８１、８３、８６、８７、および８９のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0046】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、胃がんの併用療法のための、配列番号３１、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４１、４２、４５、４６、４８、５０、５２、５３、５４、５５、６３、６８、７０、７５および７１のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0047】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、結腸直腸がんの併用療法のための、配列番号２６、３４、４０、７４、８０、８８、および９２のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0048】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、肝細胞がんの併用療法のための、配列番号１５、１７、２２、３５、４９、６２、６７、７０、７２、７４、７５、８０、８２、および９２のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0049】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、膵臓がんの併用療法のための、配列番号３７、４０、６８、６９、７１、７８、７９、８７、および９１のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0050】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、前立腺がんの併用療法のための、配列番号７９および９１のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0051】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、白血病の併用療法のための、配列番号４、２８、５８、６１、７２、７８、７９、８０、８２、８４、８６、８８、９２、および８５のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0052】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、乳がんの併用療法のための、配列番号２２、２８、２９、３０、４０、５６、５７、６２、７３、７４、７５、７６、７９、８０、８２、８８、９２、および８９のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0053】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、黒色腫の併用療法のための、配列番号１、１３、１４、１１、１６、１８、１９、２３、２８、３０、４０、５５、５７、５８、６２、６６、７０、７２、７５、７６、８０、８４、８６、８９、９２、および８３のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0054】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、卵巣がんの併用療法のための、配列番号８、６２、７０、７８、７９、８０、および８７のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0055】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、膀胱がんの併用療法のための、配列番号２、３、４、７、８、１０、１２、１３、１５、１７、３０、３２、３４、４０、４７、５３、５７、５８、６２、６６、７２、７４、７５、７７、７８、７９、８３、８６、８７、および８９のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0056】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、子宮がんの併用療法のための、配列番号１３、１５、２９、３０、４０、５６、５７、５８、８０、８１、８３、８４、および８８のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0057】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、胆嚢および胆管がんの併用療法のための、配列番号４、７、１１、１５、１６、２５、３０、３２、４０、５１、５６、６２、６７、７２、７５、７６、８０、８６、８９、および９２のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0058】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、ＨＮＳＣＣの併用療法のための、配列番号配列番号（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ）１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１３、１６、１８、１９、２０、２５、３０、３２、３４、４０、４２、５７、５８、５９、６６、６７、６９、７２、７４、７５、７７、７８、８０、８４、８６、８７、８８、および９０のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0059】

したがって、本発明の別の態様は、好ましくは食道がん、肺がん、膀胱がん、卵巣がん、黒色腫、子宮がん、肝細胞がん、腎細胞、脳がん、結腸直腸がん、乳がん、胃がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、前立腺がん、および白血病の群から選択される増殖性疾患の併用療法のための本発明によるペプチドの使用に関する

【0060】

本発明は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩの分子に結合する能力を有し、または長さ変異体などの伸長形態では、ＭＨＣクラスＩＩに結合する能力を有する、本発明によるペプチドにさらに関する。

【0061】

本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは（それぞれ）配列番号１～配列番号９３に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる。

【0062】

本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは、修飾され、および／または非ペプチド結合を含む。

【0063】

本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは、特にＨＬＡ－ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸に融合した、または例えば樹状細胞に対して特異的な抗体などの抗体（またはその配列中）に融合した、融合タンパク質の一部である。

【0064】

本発明は、本発明によるペプチドをエンコードする核酸にさらに関する。本発明は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである、本発明による核酸にさらに関する。

【0065】

本発明は、本発明による核酸を発現でき、および／または発現する、発現ベクターにさらに関する。

【0066】

本発明は、疾患治療および医療において、特にがんの治療において使用するための本発明によるペプチド、本発明による核酸または本発明による発現ベクターにさらに関する。

【0067】

本発明は、本発明によるペプチドに対して、または前記本発明によるペプチドとＭＨＣの複合体に対して特異的な対抗と、それらを製造する方法とにさらに関する。

【0068】

本発明は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、特に、自己由来または同種異系Ｔ細胞に組み込まれた可溶性ＴＣＲ（ｓＴＣＲ）およびクローン化ＴＣＲ；これらを製造する方法；ならびに前記ＴＣＲを有するまたは前記ＴＣＲと交差反応する、ＮＫ細胞またはその他の細胞を製造する方法にさらに関する。

【0069】

抗体およびＴＣＲは、本発明によるペプチドの免疫療法用途の追加的な実施形態である。

【0070】

本発明は、前述のような本発明による核酸または発現ベクターを含んでなる、宿主細胞にさらに関する。本発明は、抗原提示細胞であり、好ましくは樹状細胞である、本発明による宿主細胞にさらに関する。

【0071】

本発明は、本発明による宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる、本発明によるペプチドを製造する方法にさらに関する。

【0072】

本発明は、十分な量の抗原を抗原提示細胞に接触させることで、適切な抗原提示細胞または人工抗原提示細胞の表面に発現されるクラスＩまたはＩＩ ＭＨＣ分子上に抗原が負荷される、本発明による方法にさらに関する。

【0073】

本発明は、抗原提示細胞が、配列番号１～配列番号９３を含有する、好ましくは配列番号１～配列番号７６または変異アミノ酸配列を含有する、前記ペプチドを発現できまたは発現する、発現ベクターを含んでなる、本発明による方法にさらに関する。

【0074】

本発明は、本発明による方法によって製造される活性化Ｔ細胞にさらに関し、前記Ｔ細胞は、本発明によるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを発現する細胞を選択的に認識する。

【0075】

本発明は、本発明によって製造されるＴ細胞の有効数を患者に投与するステップを含んでなる、患者において、本発明による任意のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する標的細胞を死滅させる方法にさらに関する。

【0076】

本発明は、薬剤としてのまたは薬剤の製造における、記載される任意のペプチド、本発明による核酸、本発明による発現ベクター、本発明による細胞、本発明による活性化Ｔリンパ球、Ｔ細胞受容体または抗体またはその他のペプチド－および／またはペプチド－ＭＨＣ－結合分子の使用にさらに関する。好ましくは、前記薬剤は、がんに対して有効である。

【0077】

好ましくは、前記薬剤は、可溶性ＴＣＲまたは抗体ベースの、細胞療法、ワクチンまたはタンパク質である。

【0078】

本発明は、本発明による使用にさらに関し、その中で前記がん細胞は、食道がん、肺がん、膀胱がん、卵巣がん、黒色腫、子宮がん、肝細胞がん、腎細胞、脳がん、結腸直腸がん、乳がん、胃がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、前立腺がん、および白血病、好ましくは食道がん細胞である。

【0079】

本発明は、がん、好ましくは食道がんの診断において使用され得る、本明細書で「標的」と称される、本発明によるペプチドをベースとするバイオマーカーにさらに関する。マーカーは、ペプチドそれ自体の過剰提示、または対応遺伝子の過剰発現であり得る。マーカーはまた、好ましくは免疫療法、最も好ましくはバイオマーカーによって同定されるのと同じ標的を標的とする免疫療法である、治療の成功確率を予測するのに使用されてもよい。例えば、抗体または可溶性ＴＣＲを使用して腫瘍切片が染色され、ＭＨＣと複合体形成した目的ペプチドの存在が検出され得る。

【0080】

任意選択的に、抗体は、免疫刺激ドメインまたは毒素などのさらなるエフェクター機能を保有する。

【0081】

本発明はまた、がん治療の文脈におけるこれらの新規標的の使用に関する。

【0082】

ＡＢＨＤ１１アンチセンスＲＮＡ１（ＡＢＨＤ１１－ＡＳ１）は、長い非コーディングＲＮＡとして記載されており、それは胃がんにおいて上方制御され、分化およびＬａｕｒｅｎ組織学的分類に関連することが示された。したがって、ＡＢＨＤ１１－ＡＳ１は、胃がんの診断のための潜在的なバイオマーカーかもしれない（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＡＢＨＤ１１活性は、肺腺がんにおける遠隔転移の発生に関連することが示されており、したがって潜在的な新規バイオマーカーであるかもしれない（Ｗｉｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

【0083】

ＡＤＡＭＴＳ２は、Ｔ／骨髄性混合表現型急性白血病を有する患者において脱調節される（ｄｙｓ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）ことが示された。（Ｔｏｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＡＤＡＭＴＳ２は、骨肉腫細胞におけるＩＬ－６を通じた上方制御に際して、ＪＮＫ経路に関連するとして記載された（Ａｌｐｅｒ ａｎｄ Ｋｏｃｋａｒ，２０１４）。ＡＤＡＭＴＳ２は、濾胞性甲状腺がんの潜在的な診断マーカーであってもよい（Ｆｏｎｔａｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＡＤＡＭＴＳ２は、舌扁平上皮がんにおける転移の潜在的なマーカーとして記載された（Ｃａｒｉｎｃｉ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ＡＤＡＭＴＳ２は、腎細胞がんにおいて上方制御されることが示され、より短い患者生存期間に関連している（Ｒｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ＡＤＡＭＴＳ２は、形質転換成長因子β１に関連する細胞増殖によって調節されることが示された（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）。

【0084】

ＡＨＮＡＫ２は、スキャフォールドタンパク質ＡＨＮＡＫ核タンパク質２をコードする（Ｍａｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＡＨＮＡＫ２は、線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ１）の非古典的分泌経路の重要な要素であり、腫瘍増殖および浸潤に関与する因子である（Ｋｉｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。

【0085】

ＡＮＯ１は、小腸肉腫および口腔がんに関連するカルシウム活性化塩素イオンチャネルである、アノクタミン１をコードする（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＡＮＯ１は、食道扁平細胞がん（ＥＳＣＣ）、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、頭頸部扁上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、膵臓がん、および乳がんにおいて増幅される（Ｑｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

【0086】

ＡＲＨＧＤＩＡは、肝細胞がんにおいて、および乳がん発症に際して、下方制御されることが示された（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｂｏｚｚａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＡＲＨＧＤＩＡは、肝細胞がんにおける腫瘍浸潤、転移、全生存期間、および再発までの時間に関連することが示されたしたがって、ＡＲＨＧＤＩＡは、肝細胞がんのための潜在的な治療標的を提供してもよい（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＡＲＨＧＤＩＡは、ペリプロンシン処置時に、肺がん細胞株Ａ５４９において下方制御されることが示された。したがって、肺がん細胞のペリプロンシンで阻害された増殖は、ＡＲＨＧＤＩＡに関連してもよい（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＡＲＨＧＤＩＡノックダウンは、肺由来の正常なおよび培養腫瘍細胞におけるアポトーシスの増加に関連することが示された。したがって、ＡＲＨＧＤＩＡは、潜在的な治療標的に相当してもよいアポトーシスの負の制御因子として記載された（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＡＲＨＧＤＩＡは、卵巣明細胞および高悪性度漿液性がんの病期に関連することが記載された（Ｃａｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＡＲＨＧＤＩＡは、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシス時に線維肉腫ＨＴ１０８０細胞において脱調節されることが示された、アポトーシス経路関連遺伝子として記載された（Ｄａｉｇｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８）。ＡＲＨＧＤＩＡは、オキサリプラチン耐性（ｒｅｓｉｓｔｅｎｔ）結腸がん細胞株ＴＨＣ８３０７／Ｌ－ＯＨＰにおいて上方制御されることが示され、抗アポトーシスに関与する遺伝子として記載された。したがって、ＡＲＨＧＤＩＡは、オキサリプラチン感受性に関連する潜在的なマーカーであってもよい（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＡＲＨＧＤＩＡの過剰発現は、ＡＣＶＲ２フレームシフト変異を保有する野生型ＡＣＶＲ２形質移入ＭＳＩ－Ｈ結腸がん細胞株において、がん関連ＴＧＦＢＲ２ファミリーのメンバーである推定腫瘍抑制因子ＡＣＶＲ２によって調節されることが示された（Ｄｅａｃｕ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ＡＲＨＧＤＩＡは、Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼの重要な調節因子として記載された。ＡＲＨＧＤＩＡ枯渇は、乳がん異種移植動物モデルにおける乳がんの進行に関連したＲｈｏ ＧＴＰアーゼおよびＣＯＸ－２経路の構成的活性化を誘導することが示された（Ｂｏｚｚａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＡＲＨＧＤＩＡシグナル伝達は、結腸直腸がんにおいて脱調節されることが示された（Ｓｅｔｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＡＲＨＧＤＩＡは、ＳＵＭＯ化に際してＭＥＫ１／２－Ｅｒｋを標的とすることが示され、それは、Ｃ－Ｊｕｎ／ＡＰ－１、サイクリンｄ１転写、および細胞周期の進行の阻害に関連する。したがって、ＡＲＨＧＤＩＡは、がん細胞増殖の抑制に関連している（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＡＲＨＧＤＩＡは、前立腺がんにおける新規サプレッサーとして記載されており、それはアンドロゲン受容体シグナル伝達および前立腺がん増殖および進行を調節する上で重要な役割を果たしてもよい（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３ｂ）。

【0087】

ＡＴＩＣは、未分化大細胞（ｌａｒｇｅｒ ｃｅｌｌ）リンパ腫におけるがん関連未分化リンパ腫キナーゼの潜在的な遺伝子融合パートナーとして記載された（Ｃｈｅｕｋ ａｎｄ Ｃｈａｎ，２００１）。ＡＴＩＣは、膀胱の炎症性筋線維芽細胞腫瘍において、ＡＬＫとのキメラ融合体として提示されることが示された（Ｄｅｂｉｅｃ－Ｒｙｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）。モデル乳がん細胞株におけるＡＴＩＣのアミノイミダゾールカルボキシアミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼ（ＡＩＣＡＲ）活性の阻害は、細胞数および細胞分裂速度の用量依存的減少をもたらすことが示された。したがって、ＡＴＩＣは、がん治療における潜在的標的であってもよい（Ｓｐｕｒｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。

【0088】

ＣＡＰＺＢは、ヒト乳頭腫ウイルス１８陽性経口扁平上皮がんで過剰発現されることが報告され、前立腺がん感受性遺伝子座と同定された（Ｌｏ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｎｗｏｓｕ ｅｔ ａｌ．，２００１）。

【0089】

ＣＯＬ６Ａ１は、去勢抵抗性前立腺がんの反応性間質において上方制御され、腫瘍増殖を促進する（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＣＯＬ６Ａ１は、ＣＤ１６６＋がん細胞よりも浸潤性および移動活性がより強い、ＣＤ１６６－膵臓がん細胞において過剰発現される（Ｆｕｊｉｗａｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＣＯＬ６Ａ１は、骨転移において高度に発現される（Ｂｌａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＣＯＬ６Ａ１は、子宮頸がんおよび卵巣がんにおいて上方制御されることが判明した（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＣＯＬ６Ａ１は、星細胞腫および膠芽細胞腫において示差的に発現される（Ｆｕｊｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２００８）。

【0090】

ＣＯＬ６Ａ２は、子宮頸がん、高悪性度漿液性卵巣がんにおける全生存率不良、Ｂ前駆体急性リンパ芽球性白血病、肝細胞がん、原発性および転移性脳腫瘍、肺の扁平上皮がん、頭頸部扁上皮がんに関連し、子宮頸がんの潜在的ＤＮＡメチル化として記載された（Ｃｈｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４ｄ；Ｖａｃｈａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｓｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

【0091】

ＣＹＦＩＰ１は、上皮性腫瘍の浸潤中に下方制御されることが示された（Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＣＹＦＩＰ１の下方制御は、上皮性腫瘍における予後不良に関連している（Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。

【0092】

ＣＹＰ２Ｓ１は、Ｓ－カテニンシグナル伝達のＰＧＥ２媒介活性化との関連性を通じて、細胞株ＨＣＴ１１６における結腸直腸がん増殖を調節することが示された（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ）。ＣＹＰ２Ｓ１は、複数の上皮由来がんおよび低酸素腫瘍細胞において、上方制御されるとして記載された（Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｍａｄａｎａｙａｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。気管支上皮細胞系におけるＣＹＰ２Ｓ１枯渇は、ｍＴＯＲシグナル経路などの細胞増殖および移動に関与する重要な経路における、変化した調節をもたらすことが示された（Ｍａｄａｎａｙａｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＣＹＰ２Ｓ１枯渇は、結腸直腸がんおよび乳がんにおける薬物感受性に関連することが示された（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＣＹＰ２Ｓ１は、乳がんにおける生存率に相関することが示され、結腸直腸がんにおける予後不良と関連する（Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｋｕｍａｒａｋｕｌａｓｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ＣＹＰ２Ｓ１は、ＢａＰ－７，８－ジオールを、高度に変異誘発性かつ発がん性のベンゾ［ａ］ピレン－ｒ－７，ｔ－８－ジヒドロジオール－ｔ－９，１０－エポキシドに代謝することが示されており、したがって、ベンゾ［ａ］ピレン誘発性発がんにおいて重要な役割を果たしてもよい（Ｂｕｉ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＣＹＰ２Ｓ１は、原発性卵巣がんと比較して、卵巣がん転移において、有意に上方制御されることが示された（Ｄｏｗｎｉｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）。

【0093】

結腸直腸がんの間質におけるＤＥＳ発現は、進行した段階の疾患と相関することが示された（Ａｒｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＤＥＳは、結腸直腸がんにおいて上方制御されることが示された（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＤＥＳは、結腸直腸がんの重症度と分化、および生存率の低下に関連することが示された（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＤＥＳは、結腸直腸がんの潜在的ながん胎児性血清腫瘍マーカーとして記載された（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＤＥＳは、横紋筋肉腫の特異的マーカーであることが示された（Ａｌｔｍａｎｎｓｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。ＤＥＳは、免疫組織化学検査を用いて膀胱がんを病期分類するのに潜在的に有用であってもよいタンパク質パネルの３つの構成要素の１つとして記載された（Ｃｏｕｎｃｉｌ ａｎｄ Ｈａｍｅｅｄ，２００９）。

【0094】

ＤＩＳ３は、多発性骨髄腫において頻繁に変異し、急性骨髄性白血病において反復的に変異することが示された（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｌｏｈｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＤＩＳ３の変異多発性骨髄腫は、より短い全生存期間中央値に関連することが示された。マイナーサブクローン中の変異は、メジャーサブクローン中にＤＩＳ３変異を有する患者と比較して、治療に対するより芳しくない応答に関連することが示された（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＤＩＳ３は、結腸直腸がんにおいて、１３ｑの増加によって上方制御されることが示された。ＤＩＳ３のサイレンシングは、生存能力、移動、および浸潤などの重要な腫瘍発生特性に影響を及ぼすことが示された。したがって、ＤＩＳ３は、結腸直腸がんの進行に寄与する新規候補腫瘍遺伝子であってもよい（ｄｅ Ｇｒｏｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＤＩＳ３は、上皮性卵巣がんの早期診断を可能にするために、血漿タンパク質ベースのバイオマーカーと組み合わせて使用されてもよい、遺伝子パネルの一部として記載された（Ｐｉｌｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＤＩＳ３は、多数の多型性が乳がん家系における変異スクリーニングに際して検出されたことから、乳がん感受性の潜在的な候補遺伝子であってもよい（Ｒｏｚｅｎｂｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，２００２）。

【0095】

ＥＥＦ１Ａ１は、結腸直腸がん、卵巣がん、胃がん、前立腺がん、神経膠芽腫、および扁平上皮がんをはじめとする多様ながん実体において上方制御されることがが示され、前立腺がんの可能な血清バイオマーカーとして記載された（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｍａｔａｓｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｖｕｉ－Ｋｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｋｉｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｓｃｒｉｄｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｒｅｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。機構的に、ＥＥＦ１Ａ１は、ｐ５３およびｐ７３との相互作用を通じてアポトーシスを阻害して、細胞周期インヒビターｐ２１の転写を抑制することで増殖を促進し、上皮間葉転換の制御に関与する（Ｂｌａｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｈｕｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

【0096】

ＥＥＦ１Ａ２は、乳がん、卵巣がん、肺がん、膵臓がん、胃がん、前立腺がんおよびＴＦＥ３転座腎細胞がんにおいて上方制御されるとして記載された（Ｐｆｌｕｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｃ；Ｚａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＥＥＦ１Ａ２は卵巣がん、胃がん、膵管腺がんおよび肺腺がんにおける予後不良に関連することが示された（Ｄｕａｎｍｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｃ；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｌｅｅ ａｎｄ Ｓｕｒｈ，２００９）。ＥＥＦ１Ａ２は、リン脂質シグナル伝達を刺激し、最終的に腫瘍発生に有利なＡｋｔ依存性細胞移動およびアクチン再構築を活性化するので、発がんに関連するとして記載された（Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＥＥＦ１Ａ２は、ＭＤＭ４のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ依存性安定化を通じて、肝細胞がんにおけるｐ５３機能を阻害することが記載された。ＥＥＦ１Ａ２／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ／ＭＤＭ４シグナル伝達経路の強力な活性化は、肝細胞がんにおける短い生存期間に関連することが示され、したがって、患者のサブセットにおける治療の標的であってもよい（Ｌｏｎｇｅｒｉｃｈ，２０１４）。ＥＥＦ１Ａ２は、膵臓がん患者における、ＴＮＭ期、浸潤性、および生存率に関連することが示された。したがって、ＥＥＦ１Ａ２は、膵臓がんの治療の潜在的標的かもしれない（Ｚａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＥＥＦ１Ａ２は、増殖の促進およびアポトーシスの阻害を通じて前立腺がん発症に関連することが示されており、したがって前立腺がんにおける潜在的な治療標的の役割を果たすかもしれない（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＥＥＦ１Ａ２は腫瘍抑制タンパク質ｐ１６と相互作用することが示され、それはＥＥＦ１Ａ２の下方制御をもたらし、がん細胞増殖の阻害に関連する（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＥＥＦ１Ａ２は、膵管腺がんにおける結節転移および神経周囲浸潤に関連することが示された（Ｄｕａｎｍｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＥＥＦ１Ａ２は、乳がんにおける生存率に関連することが示された（Ｋｕｌｋａｒｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＥＥＦ１Ａ２は、肺腺がん細胞株および卵巣がんにおける、推定発がん遺伝子および腫瘍抑制遺伝子として記載された（Ｌｅｅ，２００３；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，２００７ａ）。

【0097】

ＥＩＦ２Ｓ１は、リン酸化に際して、腫瘍進行および治療抵抗性のプロモーターとして記載されてた。しかし、ＥＩＦ２Ｓ１が腫瘍発生に対する抑制効果に関与することもまた記載された（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＥＩＦ２Ｓ１は、ｍＴＯＲの下流エフェクターとして記載されており、それは過剰なリン酸化に際してがん細胞の生存率を低下させ、したがって薬剤開発の標的として役立ってもよい（Ｔｕｖａｌ－Ｋｏｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

【0098】

ＥＩＦ４Ｇ２は、小児神経膠腫ＣＤ１３３＋細胞の腫瘍形成の排除に関連することが示された、一連のコア遺伝子の１つの遺伝子として記載された（Ｂａｘｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＥＩＦ４Ｇ２は、ｍｉＲ－５２０Ｃ－３ｐを通じた下方制御に際する、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫発症の抑制に関連することが示された（Ｍａｚａｎ－Ｍａｍｃｚａｒｚ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＥＩＦ４Ｇ２は、細胞周期タンパク質の合成を調節することによって、タンパク質合成および細胞増殖を促進することが示された（Ｌｅｅ ａｎｄ ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，２００６）。ＥＩＦ４Ｇ２は、膀胱腫瘍において下方制御され、下方制御は、浸潤腫瘍に関連することが示された（Ｂｕｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ＥＩＦ４Ｇ２は、ＭｙｃＮ／ＩＦＮγ誘導アポトーシス、ならびに神経芽細胞腫細胞の生存能力および死滅の双方に関与するとして記載された（Ｗｉｔｔｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）。

【0099】

組織因子と複合体形成したＦ７は、卵巣がんをはじめとするがん細胞の表面で、異常に発現されるとして記載された。この複合体は、卵巣がんにおける悪性表現型の誘導に関連するとしてさらに記載された（Ｋｏｉｚｕｍｅ ａｎｄ Ｍｉｙａｇｉ，２０１５）。Ｆ７－組織因子複合体経路は、乳がん細胞における多数の悪性表現型の発現を刺激してもよい、乳がん進行のメディエーターとして記載された。したがって、Ｆ７－組織因子経路は、乳がん治療のための潜在的に魅力的な標的である（Ｋｏｉｚｕｍｅ ａｎｄ Ｍｉｙａｇｉ，２０１４）。Ｆ７は、乳がんにおいて。アンドロゲン受容体によって調節されることが示された（Ｎａｄｅｒｉ，２０１５）。Ｆ７は、肝細胞がん細胞株におけるｍＴＯＲシグナル伝達を通じた、オートファジーの調節に関連することが示された（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４ａ）。Ｆ７は、結腸直腸がんおよび卵巣がんにおける、腫瘍浸潤および転移に関連することが示された（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｋｏｉｚｕｍｅ ｅｔ ａｌ．，２００６）。Ｆ７は、結腸直腸がんにおいて、異所性に上方制御されることが示された（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９）。組織因子と複合体形成したＦ７は、神経芽腫（ｎｅｕｏｂｌａｓｔｏｍａ）における化学療法抵抗性に関連することが示された（Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８ａ）。

【0100】

ＦＡＭ１１５Ｃは、非小細胞肺がんにおいて、低酸素時に上方制御される（Ｌｅｉｔｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

【0101】

ＦＡＭ８３Ａは、肺がんのための潜在的バイオマーカーとして記載された（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ＦＡＭ８３Ａは、乳がん患者の循環がん細胞を検出するために、ＮＰＹ１ＲおよびＫＲＴ１９を有するパネルにおいて使用され得る、マーカー遺伝子として記載された（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４ｄ）。乳がん細胞からのＦＡＭ８３Ａ除去は、生体外での顕著な増殖の抑制と、生体内での腫瘍原性を伴う、ＭＡＰＫシグナル伝達の低下をもたらすことが示された（Ｃｉｐｒｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。さらに、ＦＡＭ８３タンパク質ファミリーは、がんにおけるＭＡＰＫシグナル伝達を調節する腫瘍遺伝子の新規ファミリーとして記載されており、したがって、ＭＡＰＫシグナル伝達の抑制を図るがん治療の開発に適している（Ｃｉｐｒｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＦＡＭ８３Ａは、ＨＥＲ２陽性乳がん細胞株におけるトラスツズマブ耐性に関連することが示された（Ｂｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。一般に、ＦＡＭ８３Ａは、乳がんにおけるＥＧＦＲ－チロシンキナーゼ阻害剤耐性に関連する候補遺伝子であることが示された（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＦＡＭ８３Ａは、乳がんにおける予後不良に関連するとして記載された（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＦＡＭ８３Ａは、非小細胞肺がんにおいて上方制御されることが示された。（Ｑｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＦＡＭ８３Ａは、非小細胞肺がん患者の末梢血中の循環腫瘍細胞を検出する潜在的な特異的かつ高感度のマーカーであることが示された（Ｑｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

【0102】

ＦＡＭ８３Ｄの上方制御は、肝細胞がん細胞の増殖および浸潤に影響を及ぼす（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ａ；Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ）。ＦＡＭ８３Ｄは、乳がん細胞株および原発性ヒト乳がんにおいて有意に上昇する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３ｂ）。

【0103】

ＦＡＴ１は、頭頸部の扁平上皮がんにおいて有意に変異し、子宮頸部腺がん、膀胱がん、早期Ｔ細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病、フルダラビン難治性慢性リンパ球性白血病、神経膠芽腫、および結腸直腸がんにおいて頻繁に変異し、食道扁平上皮がんにおいて変異するとして記載された（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｍｅｓｓｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｍｏｕｎｔｚｉｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｃａｚｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＦＡＴ１は、口腔がんにおいて抑制され、浸潤乳がんにおいて優先的に下方制御されるとして記載された（Ｋａｔｏｈ，２０１２）。ＦＡＴ１は、ｐｒｅＢ急性リンパ芽球性白血病における予後不良に関連する白血病において、上方制御されるとして記載された（Ｋａｔｏｈ，２０１２）。ＦＡＴ１は、膵臓腺がんおよび肝細胞がんにおいて上方制御されることが示された（Ｖａｌｌｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｗｏｊｔａｌｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＦＡＴ１は、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達の活性化を通じて腫瘍増殖を抑制し、アクチン重合の誘導を通じて腫瘍移動を促進することが記載された（Ｋａｔｏｈ，２０１２）。ＦＡＴ１は、皮膚扁平上皮がんにおけるがん駆動機構遺伝子の候補であることが示された（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＦＡＴ１は、Ｗｎｔシグナル伝達および腫瘍発生に関連する腫瘍抑制因子として記載された（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

【0104】

その細胞内局在次第で、フィラミンＡは、がんにおいて二重の役割を果たす：フィラミンＡは、様々な増殖シグナル伝達経路において機能するのに加えて、細胞質においては細胞の移動経路および接着経路に関与する。したがって、その過剰発現は腫瘍促進効果を有する。完全長フィラミンＡとは対照的に、タンパク質のタンパク質分解時に放出されるＣ末端破片は、核に局在し、そこで転写因子と相互作用し、それによって腫瘍増殖および転移を抑制する（Ｓａｖｏｙ ａｎｄ Ｇｈｏｓｈ，２０１３）。

【0105】

ＧＢＰ５の腫瘍特異的Ｃ末端切断は、リンパ腫細胞におけるＧＢＰ５の異常調節（ｄｙｓ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に潜在的に関与するとして記載された（Ｗｅｈｎｅｒ ａｎｄ Ｈｅｒｒｍａｎｎ，２０１０）。ＧＢＰ５は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫腫瘍組織および細胞株ならびに黒色腫細胞株における、３つのＧＢＰ５スプライス変異体の限定発現パターンのために、がん関連機能の可能性があることが記載された（Ｆｅｌｌｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００４）。

【0106】

ＧＪＢ５は、非小細胞肺がん細胞株、喉頭がん、および頭頸部扁平上皮がんにおいて下方制御されることが示された（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｂｒｏｇｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４；ＡｌＭｏｕｓｔａｆａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。ＧＪＢ５は、細胞増殖および転移の阻害を通じて、非小細胞肺がん細胞株において腫瘍抑制因子として作用することが記載された（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＧＪＢ５は、結腸がんの２０〜３０％を占めてもよい前がん病変である、広基性鋸歯状腺腫／ポリープにおいて上方制御されることが示された（Ｄｅｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＧＪＢ５発現は、マウスモデルにおける皮膚腫瘍の促進および進行中に有意に改変されるとして記載された（Ｓｌａｇａ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。

【0107】

ＧＬＳは、がん細胞におけるグルタミン代謝を増加させるために、ＭＹＣがん遺伝子によって間接的に調節されるとして記載された（Ｄａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＧＬＳは、結腸直腸がんにおいて、腫瘍抑制因子ＮＤＲＧ２によって抑制されることが示された（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＧＬＳは 膵管腺がん、三種陰性乳がん、肝細胞がん、口腔扁平上皮がん、結腸直腸がん、および悪性グリア由来腫瘍において上方制御されるとして記載された（ｖａｎ Ｇｅｌｄｅｒｍａｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｓｚｅｌｉｇａ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４ａ；Ｃｅｔｉｎｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５ａ；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＧＬＳは、肝細胞がんにおける生存率に関連することが示されており、肝細胞がんの病理学的診断および予後のための高感度かつ特異的バイオマーカーとしてもまた記載された（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５ａ）。１コピーのＧＬＳの喪失は、肝細胞がんの免疫適格ＭＹＣ媒介マウスモデルにおいて、腫瘍進行を鈍らせることが示された（Ｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＧＬＳは腫瘍発生に必要であることが示され、腫瘍特異的ＧＬＳの阻害はがん治療の潜在的アプローチとして記載された（Ｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＧＬＳは、乳がんにおけるタキソール耐性に関連することが示された（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５ａ）。ＧＬＳ過剰発現は、前立腺がん患者における腫瘍病期および進行と高度に相関することが示された（Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＧＬＳ発現は、結腸がんの腫瘍発生における管状腺がんのより深い腫瘍浸潤および病理学的パターンに関連することが示された。ＧＬＳは、結腸直腸がん治療のための標的として役立ってもよい（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４ａ）。ＧＬＳイソ酵素ＫＧＡのサイレンシングは、神経膠腫細胞株ＳＦｘＬおよびＬＮ２２９において、より低い生存率をもたらすことが示された（Ｍａｒｔｉｎ－Ｒｕｆｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。神経膠腫細胞株ＳＦｘＬおよびＬＮ２２９におけるＧＬＳのサイレンシングはまた、より低いｃ－ｍｙｃおよびｂｃｌ－２発現、ならびにより高いアポトーシス促進ｂｉｄ発現を誘発することによって、アポトーシスの誘導をもたらすことが示された（Ｍａｒｔｉｎ－Ｒｕｆｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＥｒｂＢ２活性化は、乳がん細胞増殖を促進するＮＦ－ｋＢ経路を通じて、ＧＬＳ発現を上方制御することが示された（Ｑｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。高ＧＬＳレベルによる乳がん細胞におけるＧＬＳのノックダウンまたは阻害は、増殖の有意な減少をもたらすことが示された（Ｑｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

【0108】

ＧＮＡ１５は、原発性および転移性小腸神経内分泌新生物において上方制御されることが示された（Ｚａｎｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＧＮＡ１５の発現の増加はより芳しくない生存率に関連することが示され、ＧＮＡ１５は小腸神経内分新生物泌における病理生物学的役割を有してもよく、したがって潜在的な治療標的であり得ることが示唆される（Ｚａｎｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＧＮＡ１５は、多くの非小細胞肺がん細胞株において下方制御されるとして記載された（Ａｖａｓａｒａｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。正常な核型急性骨髄性白血病におけるＧＮＡ１５の高度発現は、有意により芳しくない全生存期間に関連することが示された（ｄｅ Ｊｏｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＧＮＡ１５は、非標準Ｗｎｔシグナル伝達の重要な下流エフェクターであり、非小細胞肺がん細胞増殖および足場非依存性細胞増殖の調節因子であることが示された。したがって、ＧＮＡ１５は、非小細胞肺がんの治療のための潜在的な治療標的である（Ａｖａｓａｒａｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＧＮＡ１５は、膵臓がんにおける腫瘍発生シグナル伝達に関連することが示された（Ｇｉｏｖｉｎａｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＧＮＡ１５は、ヒト胎児腎臓２９３細胞における構成的活性化に際して、Ｃ－Ｓｒｃ／ＪＡＫ依存性およびＥＲＫ依存性機序を通じてＳＴＡＴ３を刺激することが示された（Ｌｏ ｅｔ ａｌ．，２００３）。

【0109】

ＨＡＳ３過小発現は、上部尿路および膀胱の尿路上皮がんにおける、進行した腫瘍病期、結節転移、血管浸潤およびより芳しくない疾患特異的生存期間および無転移生存期間に関連することが示された（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。したがって、ＨＡＳ３は、尿路上皮がんにおける前向き予後バイオマーカーおよび新規治療標的の役割を果たしてもよい（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＨＡＳ３は、ヒアルロナン蓄積によって膵臓がん増殖を支援することが示された（Ｋｕｌｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＨＡＳ３阻害は、結腸直腸腺がん細胞株ＳＷ６２０における生存度を低下させることが示された（Ｈｅｆｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＨＡＳ３阻害は、ＳＷ６２０結腸直腸腫瘍細胞生存の調節に関与する、いくつかの遺伝子の示差的発現に関連することが示された（Ｈｅｆｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＨＡＳ３は、アポトーシスを阻害する結腸がん増殖の仲介に関連することが示された（Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＨＡＳ３は、食道扁平上皮がん、腺の肺がんおよび扁平上皮がん、および結節性基底細胞がんにおいて、上方制御されることが示された（Ｔｚｅｌｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｔｗａｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１；ｄｅＳａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。乳がん患者の間質細胞におけるＨＡＳ３発現は、高再発率および短い全生存期間と相関することが示されたことから、ＨＡＳ３は、乳がんにおける独立予後因子として記載された（Ａｕｖｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＨＡＳ３は、漿液性卵巣がん、腎臓の明細胞がん、類内膜子宮内膜がん、および骨肉腫に関連することが示された（Ｎｙｋｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｔｏｆｕｋｕ ｅｔ ａｌ．，２００６）。

【0110】

ＨＩＦ１Ａは、侵襲性子宮内膜がんにおける腫瘍壊死に関連することが示された。ＨＩＦ１Ａは、この疾患の治療のための潜在的標的であることがさらに記載された（Ｂｒｅｄｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＨＩＦ１Ａは、肝がん発症、肉腫転移、および鼻咽頭がんに関連することが示された（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４ｃ；Ｅｌ－Ｎａｇｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ）。ＨＩＦ１Ａにおける一塩基多型は、手術後の侵襲性肝細胞がん患者の臨床転帰に有意に関連することが示された（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。異常なＨＩＦ１Ａ活性は異常なＳＴＡＴ３活性と共に、悪性末梢神経鞘腫瘍細胞株における腫瘍進行を駆動することが示された。したがって、ＳＴＡＴ３／ＨＩＦ１Ａ／ＶＥＧＦ－Ａシグナル伝達軸の阻害は、実行可能な治療ストラテジーとして記載された（Ｒａｄ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＨＩＦ１Ａは、多発性骨髄腫における低酸素駆動薬剤耐性のための重要標的として記載された（Ｍａｉｓｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＨＩＦ１Ａは、多発性骨髄腫発病の病期に対応する３つの異なる細胞株において非対称的に発現され、ＨＩＦ１Ａが、多発性骨髄腫の腫瘍発生および転移に関与することが示唆された（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４ｂ）。長い非コードＨＩＦ１ＡアンチセンスＲＮＡ－２は、非乳頭状明細胞腎臓がんおよび胃がんにおいて上方制御されるとして記載されており、胃がんにおける腫瘍細胞増殖および予後不良に関連している（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ）。ＨＩＦ１Ａを通じたＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の調節解除は、前立腺がん幹細胞の休止、維持、および生存にとって重要であることが記載された（Ｍａｒｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＨＩＦ１Ａは、Ｉ期肺腺がんの予後徴候である４遺伝子分類指標の１つの遺伝子として記載された（Ｏｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＨＩＦ１Ａの多型は、アジア人集団における消化管がんに対する感受性の増加に関連することが示された（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＨＩＦ１Ａは、散発性男性乳がんにおける予後マーカーとして記載された（Ｄｅｂ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

【0111】

細胞内ＨＹＯＵ１タンパク質の活性は、腫瘍の進行または転移中のがん細胞における生存利益を提供することが示されている。細胞外ＨＹＯＵ１タンパク質は、それらの交差提示のための腫瘍抗原の送達を促進することで、抗腫瘍免疫応答の発生において重要な役割を果たす（Ｆｕ ａｎｄ Ｌｅｅ，２００６；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＨＹＯＵ１タンパク質は、がん免疫療法に導入されており、陽性免疫調節効果を示した（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｕｂｊｅｃｋ，２０１３）。

【0112】

研究により、ＩＧＨＧ１は、隣接する非がん性組織と比較して、ヒト膵臓がん組織において過剰発現されることが示されている。対照的に、ＩＧＨＧ１タンパク質は、浸潤性腺管がん組織において下方制御された（Ｋａｂｂａｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＩＧＨＧ１のｓｉＲＮＡ標的サイレンシングは、細胞生存を阻害してアポトーシスを促進できた（Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

【0113】

研究者らは、乳がんに罹患したサウジアラビアの女性において、ＩＧＨＧ３の発現を観察している。同様に、前立腺がんに罹患しているアフリカ系米国人男性において、ＩＧＨＧ３のコピー数増加ならびにレベル上昇が検出された。別の報告は、ＩＧＨＧ３発現が、扁平上皮非小細胞細胞肺がん、悪性中皮腫において見いだされ、ならびにＭＡＬＴリンパ腫において散発性に見られて形質細胞への分化の傾向を示す腫瘍細胞上で見いだされることを示した（Ｒｅｍｍｅｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２００５；ＢｉｎＡｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｌｅｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

【0114】

ＩＧＨＧ４は、免疫グロブリン重鎖定常γ４（Ｇ４ｍマーカー）をコードして、１４番染色体ｑ３２．３３（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）上に位置する。最近の研究では、ＩＧＨＧ４が関与する再配列が、原発性精巣びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫において検出されている（Ｔｗａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。

【0115】

ＩＧＨＭは、免疫グロブリン重鎖定常ｍｕ（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）をコードする。研究は、横紋筋肉腫に罹患した中国人患者におけるＩＧＨＭの下方制御を観察している。その他の研究者らは、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫におけるＩＧＨＭの発現を検出している。別のグループは、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫において、ＩＧＨＭ遺伝子が、ほとんどのＩｇＭ腫瘍における生産性ＩＧＨ対立遺伝子上でのみ、保存されることを見いだしている。さらに、類上皮様血管筋脂肪腫サンプルは、ＩＧＨＭエンハンサー３または転写因子ＥＢへの転写因子結合に対するいかなる反応性も示さなかった（Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｂｌｅｎｋ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｒｕｍｉｎｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４ｂ）。

【0116】

ＩＬ３６ＲＮは、肺腺がんのステージＩＩＩをステージＩおよびＩＩから有意に区別し得るマーカーとして記載された（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。

【0117】

ＩＮＡの発現低下は、膵臓神経内分泌腫瘍における転移、再発、およびより短い全生存期間に関連することが示された。したがって、ＩＮＡは、膵臓神経内分泌腫瘍侵襲性のための有用な予後バイオマーカーであってもよい（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４ａ）。ＩＮＡは、乏突起膠細胞表現型神経膠腫において上方制御されるとして記載されており、ＩＮＡ発現は、乏突起膠腫および膠芽細胞腫の無増悪生存期間と相関することが示された（Ｓｕｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＩＮＡは、小児の小円形細胞腫瘍の鑑別精密診断に有用な神経芽腫マーカーとして記載された（Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ ｅｔ ａｌ．，２００８）。

【0118】

ＩＴＧＡ６発現は、乳がん、前立腺がん、結腸がん、および胃がんをはじめとする異なるがん実体において上方制御され、腫瘍進行および細胞浸潤に関連する（Ｍｉｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｈａｒａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｚ ａｎｄ Ｍｅｒｃｕｒｉｏ，１９９６）。ＩＴＧＡ６のＡｂｅｔａ４変異体の増殖効果は、Ｗｎｔ／βカテニン経路を通じて媒介されるように見える（Ｇｒｏｕｌｘ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＩＴＧＡ６のＡｂｅｔａ４変異体は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路のＶＥＧＦ依存性活性化をもたらす。この経路は、転移性がん細胞の生存に重要な役割を果たす（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２）。

【0119】

ＫＲＴ１４は、食道、肺、喉頭、子宮子宮頸部などの様々な扁平上皮がんにおいて、ならびに腺腫様歯原性腫瘍において、高度に発現された。しかし、それは、膀胱の小細胞がんでは存在せず、肺腺がん、胃腺がん、結腸直腸腺がん、肝細胞がん、膵管腺がん、乳腺浸潤性管（ｄｕｔａｌ）腺がん、甲状腺乳頭がん、および子宮類内膜腺がんでは弱かった（Ｘｕｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｔｅｒａｄａ，２０１２；Ｖａｓｃａ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｈａｍｍａｍ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｓｈｒｕｔｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。膀胱がんでは、ＫＲＴ１４発現は低生存率と強く関連していた（Ｖｏｌｋｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。

【0120】

ＫＲＴ１６の過剰発現は、基底細胞様乳がん細胞株ならびに上皮内がんにおいて見いだされた。その他の研究者らは、非再発性エナメル上皮腫と再発性エナメル上皮腫との間で、ＫＲＴ１６の免疫組織化学的発現に有意差を見いださなかった（Ｊｏｏｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｉｄａ－Ｙｏｎｅｍｏｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｓａｆａｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。さらに、コンピュータでの分析は、転移性乳がんにおけるＫＲＴ１６発現とより短い無再発生存期間との間の相関を示した（Ｊｏｏｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。

【0121】

ＫＲＴ５は、若年女性の乳がんにおいて上方制御されることが示された（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＫＲＴ５は、若年女性における乳がんのあまり良くない無病生存期間と、ホルモン受容体陽性乳がんを有する閉経前の患者における好ましくない臨床転帰とに、関連することが示された（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＫＲＴ５は、乳がん細胞株ＨＣＣ１９３７およびＴ４７Ｄにおいて、腫瘍抑制因子ＢＲＣＡ１によって調節されることが示された（Ｇｏｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＫＲＴ５は、悪性胸膜中皮腫において脱調節されることが示された（Ｍｅｌａｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＫＲＴ５は、悪性中皮腫の診断中皮マーカーとして記載された（Ａｒｉｆ ａｎｄ Ｈｕｓａｉｎ，２０１５）。ＫＲＴ５は、子宮内膜がんの進行と相関することが示された（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＫＲＴ５は、疣状がんを有する患者の浸潤腫瘍領域において変異し、下方制御されることが示された（Ｓｃｈｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＫＲＴ５は、正常組織サンプルと比較して、結腸直腸がん生検で示差的に発現される４タンパク質パネルの一部であることが示された（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。４タンパク質パネルのＫＲＴ５およびその他の３タンパク質は、結腸直腸がんの治療のための新規マーカーおよび潜在的標的として記載された（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＫＲＴ５は、基底細胞がんに関連しているとして記載された（Ｄｅｐｉａｎｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＫＲＴ５は、尿路上皮がん幹細胞を同定するための候補として記載された（Ｈａｔｉｎａ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｚ，２０１２）。

【0122】

ＫＹＮＵが関与するキヌレニン経路の活性化は、神経膠芽腫において有意により高いことが示され、神経膠腫病態生理学におけるキヌレニン経路の関与が示唆される（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＫＹＮＵは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞株におけるアリール炭化水素受容体ノックダウン時にその発現が変化する、がん関連遺伝子として記載された（Ｇｏｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＫＮＹＵは、高侵襲性および非侵襲性骨肉腫細胞株において示差的に発現されることが示され、それが骨肉腫腫瘍発生過程における重要な役割を有するかもしれないことが示唆される。したがって、ＫＹＮＵはまた、将来の治療標的候補に相当するかもしれない（Ｌａｕｖｒａｋ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＫＹＮＵは、非腫瘍発生性のＨｅＬａおよびヒト皮膚線維芽細胞雑種細胞における、腫瘍原性の再発現に関連することが示された。したがって、ＫＹＮＵは、腫瘍発生の発現調節のための興味深い候補を提供してもよい（Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。

【0123】

２つのその他の遺伝子と組み合わせたＬＡＭＢ３の転写分析は、乳頭状甲状腺がんの診断およびリンパ節転移リスクの予測に、有用であることが示された（Ｂａｒｒｏｓ－Ｆｉｌｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＬＡＭＢ３は、口腔扁平上皮がん、前立腺がん、胃がん、結腸直腸がん、ユーイング家族性（ｆａｍｉｌｙ）腫瘍、肺がん、乳がんおよび卵巣がんのがん実体に関連することが示された（Ｖｏｌｐｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｉｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｒｅｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｓｔｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｉｒｉｆｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｔａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＬＡＭＢ３は、子宮頸部扁平上皮がん、肺がん、胃がん、鼻咽頭がんおよび食道扁平上皮がんにおいて上方制御されることが示された（Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３ａ；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８ｂ）。ＬＡＭＢ３は、細胞分化、移動、癒着、増殖、および生存に影響を及ぼすことが知られているタンパク質として記載されており、それは子宮頸部扁平上皮がんにおける発がん遺伝子として機能する（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＬＡＭＢ３のノックダウンは、生体外および生体内で肺がん細胞浸潤および転移を抑制することが示された。したがって、ＬＡＭＢ３は、肺がんの発症および転移において重要な役割を果たす、主要遺伝子である（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３ａ）。ＬＡＭＢ３は、頭頸部扁上皮がんにおいて、腫瘍抑制因子ｍｉＲ－２１８によって調節されることが示された（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。頭頸部扁上皮がんにおけるＬＡＭＢ３のサイレンシングは、細胞移動および浸潤の阻害をもたらすことが示された（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＬＡＭＢ３発現は、食道扁平上皮がんにおける浸潤の深さおよび静脈の浸潤と相関することが示された（Ｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＬＡＭＢ３のメチル化は、膀胱がんにおける予後不良のいくつかのパラメータと相関することが示された（Ｓａｔｈｙａｎａｒａｙａｎａ ｅｔ ａｌ．，２００４）。

【0124】

ＬＡＰ３の阻害は、ファスシンおよびＭＭＰ－２／９の下方制御を通じて、卵巣がん細胞株ＥＳ－２における浸潤抑制をもたらすことが示された。したがって、ＬＡＰ３は、潜在的な抗転移治療標的として機能してもよい（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｄ）。ＬＡＰ３の高発現は、神経膠腫患者の悪性度および予後不良と相関することが示された（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＬＡＰ３は、細胞増殖、移動、および浸潤を調節することによって神経膠腫進行を促進することが示され、したがって新たな予後因子かもしれない（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＬＡＰ３をはじめとするアミノ酸代謝に関与する遺伝子のフレームシフト変異は、マイクロサテライト高不安定性胃がんおよび結腸直腸がんにおいて検出された（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＬＡＰ３は、肝細胞がん、食道扁平上皮がん、および前立腺がんにおいて上方制御されることが示された（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ＬＡＰ３は、細胞周期および進行した細胞移動において、Ｇ１／Ｓチェックポイントを調節することによって、肝細胞がん細胞増殖を促進することが示された（Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＬＡＰ３の発現は、肝細胞がんの予後および悪性進行と相関することがさらに示された（Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。食道扁平上皮がん細胞株ＥＣＡ１０９におけるＬＡＰ３のサイレンシングは、細胞増殖およびコロニー形成を低減することが示された一方で、ＬＡＰ３ノックダウンは、細胞周期停止をもたらした（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。食道扁平上皮がん細胞株ＴＥ１におけるＬＡＰ３の過剰発現は、細胞増殖および浸潤性を支援することが示された（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。したがって、ＬＡＰ３は、食道扁平上皮がんの悪性進行における役割を果たすことが示された（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

【0125】

研究者らは、大腸がん細胞株ならびに絨毛がん細胞における、Ｍ６ＰＲの発現を報告している（Ｂｒａｕｌｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）。乳がんでは、Ｍ６ＰＲの低レベルの発現は、患者の予後不良に関連していた（Ｅｓｓｅｇｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）。さらに、Ｍ６ＰＲの過剰発現は、生体外での細胞増殖速度の減少およびヌードマウスにおける腫瘍増殖の減少をもたらした（Ｏ‘Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）。

【0126】

ＭＡＰＫ６は、乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１における細胞形態および移動を調節する上で役割を果たすことが示された（Ａｌ－Ｍａｈｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＭＡＰＫ６は、がん関連ＭＡＰＫシグナル伝達経路の一部であり、黒色腫におけるＢＲＡＦおよびＭＥＫ１／２シグナル伝達に関連するとして記載された（Ｌｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｈｏｅｆｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ＭＡＰＫ６は、肺がん、胃がん、および口腔がんにおいて上方制御されることが示された（Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｒａｉ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５ａ）。ＭＡＰＫ６は、発がん遺伝子ＳＲＣ－３のリン酸化によって、肺がん細胞浸潤性を促進することが示された。したがって、ＭＡＰＫ６は、浸潤性肺がんの治療処置のための魅力的な標的であってもよい（Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＭＡＰＫ６は、薬物耐性乳がん細胞に対する抗がん剤開発のための潜在的標的として記載された（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。胃がんにおけるＭＡＰＫ６の過剰発現は、ＴＮＭ病期、漿膜浸潤、およびリンパ節関与と相関することが示された（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５ａ）。ＭＡＰＫ６は、コア細胞周期機構構成要素サイクリンＤ３の結合パートナーであることが示され、ＭＡＰＫ６が細胞増殖における潜在的な活性を有することが示唆された（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。

【0127】

ＭＮＡＴ１は、エストロゲン受容体陽性／ＨＥＲ２陰性乳がんにおける予後不良に関連することが示された（Ｓａｎｔａｒｐｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。顆粒球形成中のＭＮＡＴ１の内因性断片化の喪失は、白血病性骨髄芽球の増殖および転移を促進することが示された（Ｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＭＮＡＴ１は、推定発がん遺伝子ＡＤＲＭ１のノックダウンに際して、卵巣がん細胞株ＯＡＷ４２において、脱調節される（ｄｙｓ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）ことが示された（Ｆｅｊｚｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ｓｉＲＮＡによって媒介されるＭＮＡＴ１遺伝子サイレンシングは、生体外で膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ３の細胞増殖を抑制することが示され、生体内で皮下移植された膵臓腫瘍に対する抗腫瘍効果を有意に達成した（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００７ａ）。ＭＮＡＴ１の遺伝的変異は、肺がんの感受性に関連することが記載された（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００７）。アンチセンスＭＮＡＴ１をコードする組換えアデノウイルスによる、膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ３の感染は、ＭＮＡＴ１の発現低下、およびＧ０／Ｇ１期細胞比の増加をもたらすことが示された。したがって、ＭＮＡＴ１は、膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ３における細胞周期Ｇ１からＳへの転換の調節において、重要な役割を果たすことが示唆される（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ＭＮＡＴ１により調節されるサイクリン依存性キナーゼ活性化キナーゼ活性は、神経芽腫細胞Ｇ１停止を交差調節することが示されており、神経芽腫細胞における増殖から分化への切り替えにおいて重要である（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４）。

【0128】

乳がんにおけるＮＥＦＨのＤＮＡメチル化関連サイレンシングは、頻繁かつがん特異的であり、疾患進行の臨床的特徴と相関することが示された（Ｃａｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＮＥＦＨは、膵臓がん、胃がん、および結腸がんにおけるＤＮＡメチル化を通じて不活性化されることがさらに記載されており、したがって、これらの悪性病変の進行にもまた寄与するかもしれない（Ｃａｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＮＥＦＨ ＣｐＧアイランドメチル化は、腎細胞がんにおける進行した疾患、遠隔転移、および予後に関連することが示された（Ｄｕｂｒｏｗｉｎｓｋａｊａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。したがって、ＮＥＦＨメチル化は、腎細胞がんにおける予後のための候補エピジェネティックマーカーであり得る（Ｄｕｂｒｏｗｉｎｓｋａｊａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＮＥＦＨは、外陰部の骨外性粘液性軟骨肉腫において上方制御されることが示された（Ｄｏｔｌｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。肝細胞細胞株におけるＮＥＦＨの過剰発現は、細胞増殖を減少させることが示された一方で、ＮＥＦＨのノックダウンは、生体外で細胞の浸潤および移動を促進し、マウスにおいて腫瘍を形成する能力を高めた。したがって、ＮＥＦＨは、肝細胞がんにおける腫瘍抑制因子として機能する（Ｒｅｖｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＮＥＦＨは、ユーイング肉腫において頻繁にメチル化されることが示され、したがって腫瘍発生に関連するかもしれない（Ａｌｈｏｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

【0129】

ＮＥＦＬのＤＮＡメチル化媒介性サイレンシングは、乳がんにおける頻繁な事象であることが示され、それは、乳がんの、そして場合により膵臓がん、胃がん、および結腸がんなどのその他の悪性病変の進行に寄与してもよい（Ｃａｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＮＥＦＬは、いくつかの臓器のがんに関連する潜在的な腫瘍抑制遺伝子として記載された（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４ｃ）。ＮＥＦＬは、頭頸部扁上皮がん細胞株におけるがん細胞のアポトーシスおよび浸潤において、潜在的な役割を果たすことが記載された（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４ｃ）。ＮＥＦＬメチル化は、ｍＴＯＲシグナル伝達経路との相互作用を通じて、頭頸部がん細胞株におけるシスプラチン化学療法抵抗性を与える新規機序として記載された（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＮＥＦＬは、頭頸部がんを有する患者における化学療法剤応答および生存率を予測する、候補バイオマーカーとして記載された（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＮＥＦＬの高度発現は、テント上上衣腫におけるより良好な臨床転帰と相関することが記載された（Ｈａｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＮＥＦＬは乳がんにおいて異所的に発現され、陰性リンパ節を有するがんと比較して、リンパ節転移を伴う原発性乳がんにおいて減少した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。低いＮＥＦＬ発現は、早期段階乳がん患者の芳しくない５年無病生存率を示唆することが示され、したがって早期段階乳がん患者の潜在的な予後因子であり得る（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＮＥＦＬは、多形性膠芽腫において下方制御されることが示された（Ｋｈａｌｉｌ，２００７）。ＮＥＦＬが位置する染色体８ｐ２１－２３の対立遺伝子欠失は、肺がんの発がんおよび発症の早期の頻繁な事象として記載されており、乳がん、前立腺がん、およびＢ型肝炎ウイルス陽性肝細胞がんに関連することもまた記載された（Ｓｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｈａｇｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｋｕｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００１）。

【0130】

ＮＥＦＭは、腫瘍進行との関連性および転移に関わる過程との関連性を有する遺伝子として記載された（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＮＥＦＭは、食道がんにおいて低メチル化および上方制御されることが示された（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＮＥＦＭは、神経膠芽腫において頻繁に下方制御される、候補腫瘍抑制遺伝子として記載された（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５ａ）。乳がんにおけるＮＥＦＭのＤＮＡメチル化関連サイレンシングは、頻繁かつがん特異的であり、疾患進行の臨床的特徴と相関することが示された（Ｃａｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＮＥＦＭは、膵臓がん、胃がん、および結腸がんにおけるＤＮＡメチル化を通じて不活性化されることがさらに記載されており、したがって、これらの悪性病変の進行にもまた寄与するかもしれない（Ｃａｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＮＥＦＭは、前立腺がんおよび星細胞腫に関連することが示された（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｐｅｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＮＥＦＭは、腎細胞がんにおいてメチル化されることが示された、新規候補腫瘍抑制遺伝子として記載された（Ｒｉｃｋｅｔｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＮＥＦＭのメチル化は、腎細胞がんにおける予後に関連することが示された（Ｒｉｃｋｅｔｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＮＥＦＭは、非神経内分泌腫瘍細胞株と比較して、神経内分泌腫瘍細胞株において示差的に発現されることが示された、潜在的な診断マーカーとして記載された（Ｈｏｆｓｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）。

【0131】

ＮＵＰ１５５は、乳がんの素因に関連する白血球ＤＮＡの潜在的なエピジェネティックなバイオマーカーとして記載された（Ｋｈａｋｐｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＮＵＰ１５５は、ＮＵＰ２１４－ＡＢＬ１陽性Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病細胞の増殖および生存に厳密に必要とされており、したがって、この疾患における潜在的な薬物標的を構成する（Ｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

【0132】

ＯＡＳ２は、カスパーゼ－３活性化を通じて、ＣＤ３－ζ鎖発現の障害に関連することが示された。ＣＤ３－ζ鎖の欠損は、口腔がんにおいて頻繁に観察されることが記載された（Ｄａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＯＡＳ２は、進行した前立腺がんリスクに関連した先天性免疫および炎症経路の副経路に関与することが記載された（Ｋａｚｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。副経路分析により、ＯＡＳ２が、進行した前立腺がんリスクと名目上関連することが明らかにされた（Ｋａｚｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。

【0133】

非小細胞肺がんにおけるより低いＰＡＢＰＮ１発現は、予後不良と相関することが示された（Ｉｃｈｉｎｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＰＡＢＰＮ１の喪失は、非小細胞肺がんにおけるマイクロＲＮＡ媒介遺伝子制御からがん細胞を解放することによって、腫瘍侵襲性を潜在的に促進することが記載された（Ｉｃｈｉｎｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＰＡＢＰＮ１のＮ末端ポリアラニン伸長変異体は、ＨｅＬａおよびＨＥＫ－２９３細胞株における、ｐ５３経路を通じたアポトーシスの誘導に関連することが示された（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。

【0134】

ＰＣＢＰ１は、前立腺がん細胞におけるがん幹細胞の富化と機能性の中核を成すことが記載された（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５ａ）。ＰＣＢＰ１は、胃がん発病の阻害因子として記載されており、その下方制御は、培養された胃がん細胞と異種移植胃がん細胞の双方における悪性表現型に関連する（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｅ）。ＰＣＢＰ１は、卵巣の漿液性腺がんを有する患者における、良性および悪性の血清および組織サンプル間の示差的発現に基づいて、卵巣がんの病態生理において役割を果たすことが示唆された（Ｗｅｇｄａｍ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＰＣＢＰ１は、胆嚢がん細胞株ＧＢＣ－ＳＤにおいて、腫瘍転移の前提条件であるＴＧＦ－β誘導性上皮間葉転換の重要なメディエーターであることが示された（Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｄｏｕ，２０１４）。ＰＣＢＰ１発現レベルは、胆嚢がん細胞株ＧＢＣ－ＳＤが生体外で移動し侵入する能力を調節することが示された（Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｄｏｕ，２０１４）。したがって、ＰＣＢＰ１は、胆嚢がん転移の潜在的予後マーカーかもしれない（Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｄｏｕ，２０１４）。ＰＣＢＰ１下方制御は、子宮頸がん発病に潜在的に関与するとして記載された（Ｐａｔｈａｋ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＰＣＢＰ１は、転写因子ｐ６３に関連する腫瘍抑制の調節因子として記載された（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。完全胞状奇胎におけるＰＣＢＰ１の高度発現は、より低い妊娠性絨毛性腫瘍への進行リスクに関連することが示された一方で、ＰＣＢＰ１発現は、悪性形質転換奇胎で有意により低かった（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。したがって、ＰＣＢＰ１は、妊娠性絨毛性腫瘍の発病において重要な役割を果たすことが示唆された（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＰＣＢＰ１の過剰発現は、転移関連ＰＲＬ－３タンパク質の翻訳の抑制と、ＡＫＴの不活性化をもたらすことが示されたのに対して、ＰＣＢＰ１のノックダウンは、ＡＫＴの活性化と腫瘍発生の促進を引き起こすことが示された（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＰＣＢＰ１は、肝がん細胞株ＨｅｐＧ２における腫瘍浸潤に負の役割を果たすことが記載された（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ヒト肝臓腫瘍におけるＰＣＢＰ１の喪失は、転移性表現型の形成に寄与することが記載された（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

【0135】

ＰＤＰＮ記載されたは、扁平上皮がん，中皮腫、膠芽細胞腫、および骨肉腫において上方制御される（Ｆｕｊｉｔａ ａｎｄ Ｔａｋａｇｉ，２０１２）。ＰＤＰＮは、上皮間葉転換、集団細胞移動、血小板の活性化、凝集、およびリンパ脈管新生に関与するいくつかの経路に関連することから、ＰＤＰＮは、腫瘍の浸潤および転移調節因子として記載された（Ｄａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＰＤＰＮは、口腔発がんおよび類上皮中皮腫におけるマーカーとして記載された（Ｓｗａｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｏｒｄｏｎｅｚ，２００５）。ＰＤＰＮ上方制御は、上部気道消化管の扁平上皮がんにおける、リンパ節転移および予後不良に関連することが記載された（Ｃｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＰＤＰＮは、血管腫瘍、悪性中皮腫、中枢神経系の腫瘍、胚細胞腫瘍、扁平上皮がん、およびより高い浸潤性および転移能を有する侵襲性腫瘍において、発現されることが記載された（Ｒａｉｃａ ｅｔ ａｌ．，２００８）。したがって、ＰＤＰＮは、腫瘍細胞のための魅力的な治療標的として検討されるかもしれない（Ｒａｉｃａ ｅｔ ａｌ．，２００８）。

【0136】

ＰＨＴＦ２は、舌扁上皮がんにおいて下方制御されることが示された（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７）。

【0137】

ＰＫＭ２は、がん細胞増殖および腫瘍増殖に重要であることが示された（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４ｂ；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４；ＤｅＬａＢａｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。Ｎ－ｍｙｃは、髄芽細胞腫においてＰＫＭ２の転写調節因子の役割を果たす（Ｔｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＰＫＭ２は、肝臓がん発生、上皮間葉転換、および血管新生において役割を果たすようである（Ｎａｋａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＰＫＭ２は、ワールブルク効果の２つの重要な因子の１つである（Ｔａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＰＫＭ２の発現は、がん細胞において上方制御される（Ｃｈａｎｅｔｏｎ ａｎｄ Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，２０１２；Ｌｕｏ ａｎｄ Ｓｅｍｅｎｚａ，２０１２；Ｗｕ ａｎｄ Ｌｅ，２０１３）。悪性細胞では、ＰＫＭ２は、転写共活性化因子として、およびプロテインキナーゼとして、解糖において機能する。後者の機能において、それは核に移行してヒストン３をリン酸化し、最終的に膠芽細胞腫において細胞周期の進行を引き起こす（Ｓｅｍｅｎｚａ，２０１１；Ｌｕｏ ａｎｄ Ｓｅｍｅｎｚａ，２０１２；Ｔａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｖｅｎｎｅｔｉ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，２０１３；Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｌｕ，２０１３；Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｉｑｂａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４ｂ；Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。低活性二量体ＰＫＭ２は、活性四量体形態の代わりに、がんにおいて役割を果たすかもしれない（Ｍａｚｕｒｅｋ，２０１１；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｉｑｂａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｍａｚｕｒｅｋ，２００７）。

【0138】

ＰＫＰ１は、前立腺がんおよび食道腺がんにおいて下方制御されることが示された（Ｋａｚ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ａ）。非新生物、前立腺ＢＰＨ－１細胞株におけるＰＫＰ１のノックダウンは、アポトーシスの減少および前立腺がん関連ＳＰＯＣＫ１遺伝子などの遺伝子の示差的発現の低下をもたらした（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ａ）。集合的に、ＰＫＰ１およびＳＰＯＣＫ１の変化した発現は、前立腺がんにおける頻繁かつ重大な事象であり、ＰＫＰ１は、腫瘍抑制機能を有することが示唆される（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ａ）。ＰＫＰ１の発現低下は、口腔扁平上皮がんにおける遠隔転移の発生までのより短い時間に、有意に関連することが示された（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。プロモーターメチル化を通じたＰＫＰ１の喪失は、バレット食道がんから食道腺がんへの進行に関連することが記載された（Ｋａｚ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＰＫＰ１は、非小細胞肺がんにおいて上方制御されることが示され、扁平上皮がんサンプルを識別するための良好なマーカーであってもよい（Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｐａｌｅｎｃｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＰＫＰ１は、高分化型の脂肪肉腫細胞株ＧＯＴ３において上方制御されることが示された（Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）。ＰＫＰ１の発現低下は、頭頸部扁上皮がん細胞における運動性の増加を促進することが記載された（Ｓｏｂｏｌｉｋ－Ｄｅｌｍａｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＰＫＰ１喪失は、子宮頸部発がんに関連することが示された（Ｓｃｈｍｉｔｔ－Ｇｒａｅｆｆ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＰＫＰ１は、口腔咽頭の扁平上皮がんを有する患者における局所再発または転移ならびに低生存率に関連することが示された（Ｐａｐａｇｅｒａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００３）。

【0139】

ＰＫＰ３ ｍＲＮＡの増加は、バイオマーカーおよび疾患転帰の予測因子として使用され得る（Ｖａｌｌａｄａｒｅｓ－Ａｙｅｒｂｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＰＫＰ３の過剰発現が、乳がん、肺がん、および前立腺がんにおける転帰不良と相関した一方で、膀胱がんにおける下方制御は、浸潤性挙動に関連している（Ｆｕｒｕｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｂｒｅｕｎｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｄｅｍｉｒａｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＰＫＰ３の喪失は、細胞移動および腫瘍形成に必要なＭＭＰ７およびＰＲＬ３のタンパク質レベルの増大をもたらす（Ｋｈａｐａｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｂａｓｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。

【0140】

ＰＰＰ４Ｒ１のノックダウンは、乳がん細胞株ＺＲ－７５－３０における細胞増殖を抑制することが示された（Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。したがって、ＰＰＰ４Ｒ１は、乳がん細胞増殖を促進し、乳がん発症において不可欠な役割を果たすかもしれない（Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。肝細胞がん細胞株ＨｅｐＧ２におけるＰＰＰ４Ｒ１のノックダウンは、細胞増殖、コロニー形成の減少、およびＧ２／Ｍにおける細胞周期停止をもたらすことが示された（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＰＰＰ４Ｒ１のノックダウンは、ＨｅｐＧ２細胞におけるｐ３８およびｃ－ＪｕｎＮ末端キナーゼシグナル伝達カスケードの不活性化をもたらし、ＰＰＰ４Ｒ１が細胞増殖を促進し得ることを示す（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。したがって、ＰＰＰ４Ｒ１は、肝細胞がん細胞増殖を促進する上で重要な役割を果たす（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＰＰＰ４Ｒ１は、リンパ球におけるＮＦ－κＢキナーゼ活性の阻害剤の負の制御因子として記載されており、その下方制御は、Ｔ細胞リンパ腫のサブグループにおいて、発がん性ＮＦ－κＢシグナル伝達を促進する（Ｂｒｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。

【0141】

ＰＲＣ１は、子宮頸がん組織が照射後にＰＲＣ１の高い示差的発現を示したことから、子宮頸がんにおける放射線抵抗性に関連することが記載された（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ）。ＰＲＣ１のイントロン１４中の遺伝子座は、乳がん感受性に関連することが記載された（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＰＲＣ１は、５遺伝子シグネチャーの１つの遺伝子として記載されており、それは乳がん患者の無病生存期間の予後徴候として提案され得る（Ｍｕｓｔａｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＰＲＣ１は、卵巣がん、子宮頸がん、および膀胱がんにおいて上方制御されることが示された（Ｅｓｐｉｎｏｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｅｈｒｌｉｃｈｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｋａｎｅｈｉｒａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＰＲＣ１は、乳房上皮細胞株ＭＣＦ－１０Ａの４－ヒドロキシ－エストラジオール媒介悪性形質転換中に、上方制御されることが示された（Ｏｋｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＰＲＣ１は腫瘍の発病における重要な生物学的意味を有する遺伝子として記載されており、アジュバント化学療法に際して、非小細胞肺がんを有する切除可能な患者の予後を予測するための遺伝子セット中で使用され得る（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＰＲＣ１は、細胞周期関連キナーゼＰｌｋ１によって負に調節されることが示唆された（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。膀胱がん細胞株ＮＩＨ３Ｔ３におけるＰＲＣ１のノックダウンは、多核性細胞と引き続く細胞死に、有意な増加をもたらすことが示された（Ｋａｎｅｈｉｒａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。さらに、ＰＲＣ１は、膀胱がん細胞における新規がん精巣抗原ＭＰＨＯＳＰＨ１と相互作用することが示され、ＭＰＨＯＳＰＨ１／ＰＲＣ１複合体は、膀胱発がんにおいて重要な役割を果たすことが示唆され、新規治療標的であり得る（Ｋａｎｅｈｉｒａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＰＲＣ１は、ｐ５３によって調節されることが示された（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）。

【0142】

発現された配列タグプロファイリングは、ＰＲＤＭ１５をリンパ腫における上方制御された遺伝子として同定した（Ｇｉａｌｌｏｕｒａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＰＲＤＭ１５は、膵臓がんの発症または進行に寄与してもよい候補腫瘍抑制遺伝子として記載された（Ｂａｓｈｙａｍ ｅｔ ａｌ．，２００５）。

【0143】

ＰＴＨＬＨの明確な多型は、肺がんリスクおよび予後に関連することが示された（Ｍａｎｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０００）。自発転移性乳腺がんのＣ５７ＢＬ／６－マウス由来モデルにおけるＰＴＨＬＨの上方制御は、乳がんの転移性播種に潜在的に関与するとして記載された（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＰＴＨＬＨは、口腔扁平上皮がん、軟骨新生物、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫および腎明細胞がんにおいて上方制御されることが示された（Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３ａ；Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｌｖ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＰＴＨＬＨ上方制御は、頭頸部扁平上皮がん患者における病理的識別分化不良および予後不良に、関連することが示された（Ｌｖ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＰＴＨＬＨは、ｐ３８ＭＡＰＫシグナル伝達によって上方制御されることが示されており、それは肺微小血管系（ｍｉｃｒｏｓｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）の内皮細胞におけるカスパーゼ非依存性死滅による、肺の結腸がん細胞の血管外遊出に寄与する（Ｕｒｏｓｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＰＴＨＬＨは、正常皮膚と比較して、扁平上皮がんにおいて有意に示差的に発現されることが示された（Ｐｒａｓａｄ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＰＴＨＬＨは、初期非小細胞肺がんを有する患者生存に関連する４遺伝子シグネチャーの一部として記載された（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＰＴＨＬＨのフレームシフト変異による抗増殖機能の破壊は、遺伝性非ポリープ症結腸直腸がん患者の早期結腸直腸がんの発症に寄与することが記載された（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ＰＴＨＬＨ上方制御は、腎摘出を受けた腎明細胞がん患者の全生存期間および無病生存期間の双方における転帰不良に関連することが示された（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＰＴＨＬＨは、結腸直腸腺がん細胞株Ｃａｃｏ－２において、ＥＲＫ１／２、ｐ３８、ＭＡＰＫ、およびＰＩ３Ｋシグナル伝達経路を通じて、細胞周期の進行を正に調節し、細胞周期調節に関与するタンパク質の発現を変化させることが示された（Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

【0144】

ＲＡＰ１ＧＤＳ１は、膵臓がん細胞の増殖を促進することが示された（Ｓｃｈｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。マウスにおける、非小細胞肺がん細胞株ＮＣＩ－Ｈ１７０３異種移植片中のＲＡＰ１ＧＤＳ１の２つのスプライス変異体の同時喪失は、腫瘍発生の減少をもたらすことが示された（Ｓｃｈｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＲＡＰ１ＧＤＳ１は、複数のがん型における細胞周期の進行を促進し、がん治療薬の有益な標的となることが示された（Ｓｃｈｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＲＡＰ１ＧＤＳ１は、乳がん、前立腺がん、および非小細胞肺がんにおいて上方制御されることが示された（Ｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｔｅｗ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｚｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＲＡＰ１ＧＤＳ１のＳｍｇＧＤＳ－５５８スプライス変異体は、乳がん悪性病変において機能的役割を果たす、ＲｈｏＡおよびＮＦ－ｋＢ活性のユニークなプロモーターであることが示された（Ｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。高いＲＡＰ１ＧＤＳ１発現は、乳がんにおけるより芳しくない臨床転帰に関連することが示された（Ｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＲＡＰ１ＧＤＳ１は、非小細胞肺がんにおいて細胞増殖、移動、およびＮＦ－κＢ転写活性を調節し、したがってこの疾患の悪性表現型を促進することが示された。したがって、ＲＡＰ１ＧＤＳ１は、非小細胞肺がんにおける興味深い治療標的である（Ｔｅｗ ｅｔ ａｌ．，２００８）。ＲＡＰ１ＧＤＳ１は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病において、ＮＵＰ９８に融合されることが示された（Ｒｏｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，２００６）。

【0145】

ＲＮＰＥＰ活性は、結腸直腸腺腫、乳頭状甲状腺がん、乳がん、および腎明細胞がんにおいて上方制御されることが示された（Ｒａｍｉｒｅｚ－Ｅｘｐｏｓｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｌａｒｒｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｖａｒｏｎａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＲＮＰＥＰは、皮下領域に移植されたラットＣ６神経膠腫の腫瘍増殖に関連することが示された（Ｍａｙａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。

【0146】

ＲＯＲＡは、潜在的な肺がんの発がん遺伝子として記載された（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｅ）。ＲＯＲＡは、結腸がんにおいて、潜在的な腫瘍抑制遺伝子ＯＰＣＭＬの発現に関連することが示された（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５ａ）。ＲＯＲＡにおける２つの一塩基多型は、乳がんに関連することが示された（Ｔｒｕｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＲＯＲＡは、乳がんのための潜在的な腫瘍抑制因子および治療標的として記載された（Ｄｕ ａｎｄ Ｘｕ，２０１２）。ＲＯＲＡは、結腸直腸腺がんおよび乳がんにおいて下方制御されることが示された（Ｋｏｔｔｏｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｄｕ ａｎｄ Ｘｕ，２０１２）。肝腫瘍細胞株ＨｅｐＧ２におけるＲＯＲＡの安定した過剰発現は、グルコース代謝および肝臓発がんに関与する遺伝子の発現に影響を及ぼすことが示され、ＲＯＲＡと肝臓起源の細胞における発がんとの関連が示唆される（Ｃｈａｕｖｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＲＯＲＡは、正常な胃粘膜と比較して、胃がんにおいて示差的にメチル化されることが示された（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＲＯＲＡは、アンドロゲン非依存性前立腺がん細胞株ＤＵ１４５における、細胞増殖および分化の調節、および転移性挙動の抑制に関連することが記載された（Ｍｏｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００２）。

【0147】

ＲＰＳ１７は、転移性ぶどう膜黒色腫において、ぶどう膜黒色腫による転移性合併症を起こし易い正常な全血および組織において、示差的に発現されることが示されており、ＲＰＳ１７が、ぶどう膜黒色腫転移の指向性において役割を果たすかもしれないことが示唆される（Ｄｅｍｉｒｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＲＰＳ１７は、肝細胞がんにおいて上方制御されることが示された（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００７ｂ）。

【0148】

ＲＰＳ２６のノックダウンは、ｐ５３安定化および活性化を誘導し、ｐ５３依存性細胞増殖阻害をもたらすことが示された（Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＲＰＳ２６は、ｐ５３転写活性に直接、影響を及ぼすことにより、ＤＮＡ損傷応答において役割を果たすことがさらに示された（Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

【0149】

Ｓ１００Ａ２は、非小細胞肺がんに関連することが示され、肺扁平上皮がん患者における全生存期間不良の予測マーカーとして記載された（Ｈｏｕｎｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｄ）。Ｓ１００Ａ２は、肺がんにおける発がん遺伝子ＫＲＡＳの下流標的、および腫瘍進行プロモーターとして記載された（Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。Ｓ１００Ａ２は、膵管腺がんにおける全生存期間の予測の有望なマーカーとして記載された（Ｊａｍｉｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ニトロソアミンＮ－ニトロソピロリドンによるＳ１００Ａ２の発現の変化は、黒人の南アフリカ人の食道扁平上皮がんの腫瘍進行の潜在的な理由として記載された（Ｐｉｌｌａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。Ｓ１００Ａ２は、非小細胞肺がんの初期段階、鼻咽頭がん患者の血漿、喉頭がん、胃がん、および表皮腫瘍において上方制御されることが示された（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３ａ；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ａ；Ｚｈａ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｃ）。Ｓ１００Ａ２のメチル化関連不活性化は、頭頸部および膀胱がんにおいて高頻度であることが示され、したがって、これらの疾患の腫瘍発生における重要な事象であってもよい（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｃ）。口腔扁平上皮がんにおいて、Ｓ１００Ａ２の細胞質発現は上方制御されることが示された一方で、核発現は下方制御される（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。Ｓ１００Ａ２の細胞質上方調節は、口腔扁平上皮がん患者における再発リスクの潜在的な予測因子であることが示された（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。Ｓ１００Ａ２は、乳がんの転移において役割を果たすことが記載された（Ｎａｂａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。Ｓ１００Ａ２は、ＢＲＣＡ１／ｐ６３同時制御腫瘍抑制遺伝子であることが示され、それは異ｐ５３のＨＳＰ９０への結合を調節することによって、変異ｐ５３安定性の調節における役割を果たす（Ｂｕｃｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。Ｓ１００Ａ２は、候補腫瘍抑制遺伝子として記載され、それは再発性鼻咽頭がんにおいて下方制御され、したがって、再発性鼻咽頭がんの発症において重要な役割を果たしてもよい（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４ｂ）。Ｓ１００Ａ２は、胃がんにおいて下方制御されることが示され、下方制御は、進行した浸潤の深さ、リンパ節転移、無再発確率の減少、および全生存期間の減少と関連することが示された（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４ｅ）。したがって、Ｓ１００Ａ２下方制御は、胃がんのための負の独立した予後バイオマーカーであり得る（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４ｅ）。Ｓ１００Ａ２は、ＭＧＣ－８０３がん細胞において、ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路を負に調節することがさらに示された（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４ｅ）。Ｓ１００Ａ２の過剰発現は、免疫不全マウスにおいて、Ａ５４９肺がん細胞における上皮間葉転換を誘導して、浸潤の増加、Ａｋｔリン酸化の増強、および腫瘍増殖の増大がそれに続くことが示された（Ｎａｚ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。Ｓ１００Ａ２の腫瘍発生促進作用は、ＰＩ３／Ａｋｔシグナル伝達の調節と、ＴＧＦβシグナル伝達様式タンパク質Ｓｍａｄ３との機能的相互作用とに、関与することがさらに記載された（Ｎａｚ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。Ｓ１００Ａ２の発現は、肝門部領域および肝外の胆管がんを有する患者の組織学的グレード、リンパ節転移、臨床病期、および低生存率と相関することが示された（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。したがって、Ｓ１００Ａ２は、胆管がん患者における予後マーカーとして機能してもよい（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

【0150】

Ｓ１００Ａ８は、急性および慢性の炎症における重要なメディエーターとして記載されており、それは正のフィードバックループにおいて骨髄由来サプレッサー細胞と相互作用して、腫瘍の発生および転移を促進する（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。Ｓ１００Ａ８は、非小細胞肺がんにおける潜在的診断バイオマーカー、予後指標、および治療標的として記載された（Ｌｉｍ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，２０１３）。Ｓ１００Ａ８の過剰発現は、膀胱がんにおける、病期進行、浸潤、転移、および低生存率に関連することが示された（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）。Ｓ１００Ａ８は、浸潤性膀胱がんの診断マーカーであることが示された（Ｉｓｍａｉｌ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。Ｓ１００Ａ８は、未分化甲状腺がん、骨巨細胞腫、および結腸直腸がんにおいて上方制御されることが示された（Ｒｅｅｂ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ；Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５ａ）。１００Ａ８ノックダウンを有する未分化甲状腺がん細胞を用いたマウスにおける生体内分析は、腫瘍増殖および肺転移の減少、ならびに有意に延長された動物の生存期間を明らかにした（Ｒｅｅｂ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。Ｓ１００Ａ８は、腫瘍細胞におけるｐ３８、ＥＲＫ１／２、およびＪＮＫシグナル伝達経路を活性化するＲＡＧＥとの相互作用を通じて、未分化甲状腺がん細胞増殖を促進することが示された（Ｒｅｅｂ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。したがって、Ｓ１００Ａ８は未分化甲状腺がんにおける、妥当な治療標的に相当し得る（Ｒｅｅｂ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。Ｓ１００Ａ８は、高リスク型慢性リンパ球性白血病に関連することが示された（Ａｌｓａｇａｂｙ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。Ｓ１００Ａ８は、腎臓がん進行に関連することが示され、腎臓がんの前向きバイオマーカーおよび治療標的として記載された（Ｍｉｒｚａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。Ｓ１００Ａ８は、非炎症駆動性肝腫瘍の進行に必要なヘテロ二量体であるカルプロテクチンの一部として記載されており、肝細胞がんの治療の標的に相当するかもしれない（Ｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。Ｓ１００Ａ８は、ｐ２１を阻害する一方で、Ｉｄ３発現の誘導によって、結腸がん細胞周期および増殖を調節することが示された（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ）。

【0151】

ＳＥＲＰＩＮＨ１は、セリンプロテイナーゼインヒビターである、セルピンペプチダーゼインヒビター、分岐群Ｈ（熱ショックタンパク質４７）、メンバー１、（コラーゲン結合タンパク質１）をコードするＳＥＲＰＩＮＨ１は、小胞体においてコラーゲン特異的分子シャペロンとして機能する（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＳＥＲＰＩＮＨ１は、胃がん、肺がん、膵管腺がん、神経膠腫、および潰瘍性大腸炎関連がんをはじめとする、多くのヒトがんにおいて過剰発現される（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４ａ）。ＳＥＲＰＩＮＨ１は、肝細胞がん、食道扁平上皮がん、胆管細胞がん、胃がん、肺がん、膵管腺がん、潰瘍性大腸炎関連がん、および神経膠腫において、上方制御されることが示された（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４ａ；Ｐａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ；Ｎａｂｏｕｌｓｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＳＥＲＰＩＮＨ１の過剰発現は、食道扁平上皮がんを有する患者の予後不良と関連することが示され、ＳＥＲＰＩＮＨ１および病理的段階の免疫染色のレベルは、全体および再発のない生存と有意に相関することが示された（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ）。したがって、ＳＥＲＰＩＮＨ１は、食道扁平上皮がんの潜在的予後バイオマーカーであってもよい（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ）。神経膠腫細胞におけるＳＥＲＰＩＮＨ１ノックダウンは、生体外で神経膠腫細胞増殖、移動、および浸潤を阻害することが示された一方で、生体内でのＳＥＲＰＩＮＨ１ノックダウンは、腫瘍増殖および誘導アポトーシスを阻害することが示された（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４ａ）。したがって、ＳＥＲＰＩＮＨ１は、神経膠腫の治療のための治療標的であり得る（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４ａ）。ＳＥＲＰＩＮＨ１は、複数のリンパ節転移を伴う口腔扁平上皮がんの原発性腫瘍と比較して、転移において下方制御されることが示され、ＳＥＲＰＩＮＨ１が、これらの腫瘍の転移能に関連するかもしれないことが示唆される（Ｎｉｋｉｔａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＳＬＣ７Ａ１１は、Ｗ１卵巣がん細胞株の薬剤耐性変異体において下方制御されることが示されており、したがって、がん細胞薬剤耐性において役割を果たすかもしれない（Ｊａｎｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＳＬＣ７Ａ１１は腫瘍微小環境を調節し、がんの増殖上の利点をもたらすことが記載された（Ｓａｖａｓｋａｎ ａｎｄ Ｅｙｕｐｏｇｌｕ，２０１０）。ＳＬＣ７Ａ１１は神経膠腫の神経変性プロセスに関与すると報告され、ＳＬＣ７Ａ１１はがん治療の潜在的な最重要標的とされた（Ｓａｖａｓｋａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＳＬＣ７Ａ１１は、フェロトーシスの文脈でｐ５３によって抑制されることが示され、ｐ５３－ＳＬＣ７Ａ１１軸は、ｐ５３（３ＫＲ）変異体中で保存されるとして記載され、古典的な腫瘍抑制機構の非存在下で腫瘍発生を抑制するその能力に寄与する（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＳＬＣ７Ａ１１は、ｓｙｓｔｅｍ Ｘｃの機能的サブユニットとして記載されており、その機能は、攻撃的な乳がん細胞において増加する（Ｌｉｎｈｅｒ－Ｍｅｌｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。シスプラチン耐性膀胱がんにおけるＳＬＣ７Ａ１１の高い膜染色は、より芳しくない臨床転帰と関連することが示され、ＳＬＣ７Ａ１１阻害は、この疾患の治療に対する有望な治療アプローチとして記載された（Ｄｒａｙｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＳＬＣ７Ａ１１は、ベンゼンおよびその代謝産物に曝露されたヒト前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ－６０において、示差的に発現されることが示されており、したがってＳＬＣ７Ａ１１と白血病発生との潜在的関連が強調される（Ｓａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＳＬＣ７Ａ１１の破壊は、リンパ腫、神経膠腫、前立腺がん、および乳がんをはじめとする、様々ながん腫の増殖阻害をもたらすと記載された（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＳＬＣ７Ａ１１の阻害は、食道がん細胞株ＫＹＳＥ１５０の生体外での細胞浸潤と、ヌードマウスにおけるその実験的転移を阻害することが示され、したがって腫瘍転移におけるＳＬＣ７Ａ１１の役割が確立される（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）。

【0152】

ＳＲＰＲは、二重微小染色体を有する急性骨髄性白血病の症例において、増幅されることが示された（Ｃｒｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。

【0153】

ＳＳＲ４のヒトオルソログは、フクロネズミ黒色腫細胞株ＴＤ６ｂおよびＴＤ１５Ｌ２において示差的に発現され、進行期の腫瘍において上方制御されることが示されており、紫外線誘導性黒色腫発生および転移に関連するかもしれない潜在的機能を有する候補遺伝子としてのＳＳＲ４の関与が示唆される（Ｗａｎｇ ａｎｄ ＶａｎｄｅＢｅｒｇ，２００４）。ＳＳＲ４のｍＲＮＡレベルは、正常骨芽細胞と比較して、骨肉腫細胞株ＯＨＳ、ＳａＯＳ－２、およびＫＰＤＸＭにおいて、富化されることが示された。（Ｏｌｓｔａｄ ｅｔ ａｌ．，２００３）。

【0154】

ＳＴＫ１７Ａの脱調節発現は、様々ながん型がんに関連している。子宮頸部がんおよび結腸直腸がんにおける発現低下は、腫瘍進行に関連するＳＴＫ１７Ａのアポトーシス促進特性に関連している。神経膠芽腫および頭頸部がんにおけるＳＴＫ１７Ａは、ＴＧＦ－βのようなその他の腫瘍関連経路に対する影響を通じて、グレード依存様式で過剰発現される（Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｂａｎｄｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ＳＴＫ１７Ａは、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の直接標的であり、活性酸素種（ＲＯＳ）の修飾物質である（Ｋｅｒｌｅｙ－Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

【0155】

ＳＹＫは、腫瘍発生のモジュレーターとして記載され、それは、いくつかの細胞では、生存機能を提供することによって、腫瘍プロモーターとして作用し、その他の細胞では、上皮間葉転換を制限し移動を阻害することによって、腫瘍抑制因子として作用する（Ｋｒｉｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｇｅａｈｌｅｎ，２０１５）。ＳＹＫは、Ｂ細胞リンパ腫におけるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）活性化に関連するとして記載された（Ｓｅｄａ ａｎｄ Ｍｒａｚ，２０１５）。ＳＹＫなどのＢＣＲ経路の重要なキナーゼの阻害は、慢性リンパ球性白血病細胞生存性を低下させるための前臨床モデルにおいて見いだされている（Ｄａｖｉｄｓ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，２０１２）。ＳＹＫは、慢性リンパ球性白血病において上方制御されることが示された（Ｆｅｎｇ ａｎｄ Ｗａｎｇ，２０１４）。ＳＹＫは、慢性リンパ球性白血病の病因と関連するとして記載されており、この疾患の治療効果および予後を評価する上で価値があるかもしれない（Ｆｅｎｇ ａｎｄ Ｗａｎｇ，２０１４）。ＳＹＫは、乳がんにおける潜在的な腫瘍抑制因子として記載されており、原発性乳がんにおけるその非存在は、転帰不良と相関する（Ｎａｖａｒａ，２００４）。ＳＹＫは、卵巣がんにおけるパクリタキセル耐性において、重要な役割を果たすことが示された（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ）。ＳＹＫ下方制御は、結腸直腸がんをはじめとする様々ながんの発症に関連するとして記載された（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＳＹＫプロモーターの明確な多型は、中国南部の漢民族における結腸直腸がん発症の独立したリスク因子であることが示された（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＳＹＫは肝細胞がんにおいて頻繁にメチル化され、ＳＹＫメチル化は予後不良の肝細胞がん症例のサブセットを同定することが実証されている（Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

【0156】

ＴＰ６３転座は、未分化リンパ腫キナーゼ陽性未分化大細胞リンパ腫のサブセットにおける事象として記載され、それは、疾患の侵襲性過程に関連する（Ｈａｐｇｏｏｄ ａｎｄ Ｓａｖａｇｅ，２０１５）。ＴＰ６３は、上皮分化、細胞周期停止、およびアポトーシスに関与するため、がんにおいて複雑な役割を果たすことが記載された（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＴＰ６３イソ型ＴＡｐ６３が、血液悪性腫瘍で過剰発現されると記載された一方で、ＴＰ６３ミスセンス変異は扁平上皮がんで、ＴＰ６３転座はリンパ腫および一部の肺腺がんにおいて報告されている（Ｏｒｚｏｌ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＴＰ６３イソ型ＤｅｌｔａＮｐ６３の過剰発現をもたらす異常なスプライシングは、皮膚の扁平上皮がんなどのヒトがんにおいて頻繁に見いだされ、そこでそれは腫瘍の開始および進行を支援する（Ｍｉｓｓｅｒｏ ａｎｄ Ａｎｔｏｎｉｎｉ，２０１４；Ｉｎｏｕｅ ａｎｄ Ｆｒｙ，２０１４）。

【0157】

ＴＰＭ１は、腎細胞がん、食道の扁平上皮がん細胞株、転移性イヌ乳がん、および神経芽腫細胞株において、下方制御されることが示された（Ｋｌｏｐｆｌｅｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｙａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｚａｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ）。ＴＰＭ１発現は、腎細胞がん患者の腫瘍の大きさ、Ｆｕｈｒｍａｎグレード、および予後に関連することが示された。腎細胞がん細胞株ＯＳＲＣ－２および７８６－ＯのＴＰＭ１形質移入は、アポトーシスを増強しながら、移動および浸潤の能力を低下させることが示された（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ）。したがって、ＴＰＭ１は、腫瘍抑制遺伝子の特徴を示す一方で、腎細胞がん細胞において過剰発現されることが記載された（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ）。ＲＡＳ／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴおよびＲＡＳ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路は、肝臓内胆管がん細胞株ＨｕＣＣＴ１、ならびに食道の扁平上皮がん細胞株における、ＴＰＭ１調節および抑制に関与することが記載された（Ｚａｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３ｂ）。ＴＰＭ１は、乳がん細胞株ＭＣＦ－７におけるその過剰発現が足場非依存性細胞増殖を抑制する、腫瘍抑制因子として記載された（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，２００７ｂ）。ＴＰＭ１のエピジェネティックな抑制は、変化したＴＧＦ－β腫瘍抑制因子機能に関連することが記載されており、腫瘍細胞の転移特性に寄与するかもしれない（Ｖａｒｇａ ｅｔ ａｌ．，２００５）。

【0158】

トリプターゼは、急性骨髄性白血病を有する特定の患者において、上方制御されることが示された（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。トリプターゼの発現は、ＥＲＫ１／２およびｐ３８ＭＡＰＫ経路を通じて、ＳＣＦ／Ｃ－キットシグナル伝達によって調節されることが記載された（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。肥満細胞トリプターゼは、結腸直腸がん血管新生に関与することが記載され、結腸直腸がん患者の血清中で、根治的外科的切除前に、切除後より高く発現されることが示された（Ａｍｍｅｎｄｏｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

【0159】

ＴＳＨＺ３は、非腫瘍発生性細胞株ＯＫＦ６－ＴＥＲＴ１Ｒと比較して、口腔扁平上皮がん細胞株ＳＣＣ－９において、下方制御されることが示された（Ｍａｒｃｉｎｋｉｅｗｉｃｚ ａｎｄ Ｇｕｄａｓ，２０１４）。ＴＳＨＺ３は、高悪性度漿液性卵巣がんのいくつかの症例において、反復的に再配列されることが判明した転写調節因子遺伝子として記載された（ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＴＳＨＺ３は、乳がんおよび前立腺がんにおいて下方制御された発現を有する、候補腫瘍抑制遺伝子として記載された（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

【0160】

ＴＳＰＡＮ１０は、転移性黒色腫サンプルと正常皮膚サンプルとの間で示差的に発現される遺伝子であることが示されており、それは転移性黒色腫治療の潜在的バイオマーカーであってもよい（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４ｃ）。いくつかの遺伝子の中でも、特にＴＳＰＡＮ１０は、原発性平滑筋肉腫と比較して、子宮平滑筋肉腫転移において上方制御されることが示されており、したがって、これらの状態の識別に寄与し、このがんにおける腫瘍進行の理解を助ける（Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

【0161】

ＴＴＰＡＬは、マイクロサテライト不安定性結腸直腸がんにおいて突然変異を示す、候補発がん遺伝子として記載された（Ｔｕｕｐａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

【0162】

ＴＵＢＧＣＰ２は、タキソール耐性卵巣がん細胞株において上方制御されることが示され、タキソールに対する非小細胞肺がん細胞株ＮＣＩ－Ｈ１１５５の感作に関連することが記載された（Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｃｈａｏ，２０１５）。ＴＵＢＧＣＰ２は、神経膠芽腫において上方制御されることが示され、そこでは、その過剰発現が、ＣＤＫ５調節サブユニット関連腫瘍抑制タンパク質３のＤＮＡ損傷Ｇ２／Ｍチェックポイント活性に対する阻害効果に拮抗する（Ｄｒａｂｅｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。

【0163】

ＶＩＭは、ＳＴＡＴ３の調節解除時に乳がんの進行に関連する、ＳＴＡＴ３の下流標的として記載された（Ｂａｎｅｒｊｅｅ ａｎｄ Ｒｅｓａｔ，２０１５）。ＶＩＭは、潜在的な鼻咽頭がん関連タンパク質として記載された（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｃ）。ビメンチンのメチル化状態の陰性は、膵臓がん患者の改善された予後を予測することが示された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＶＩＭは、非小細胞肺がんにおいてＣ６ｏｒｆ１０６を通じて上方制御されることが示され、引き続いてがん細胞浸潤の増強に関連すると記載された（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｃ）。ＶＩＭは、肺扁平上皮がん患者の全生存期間の独立予測因子として記載された（Ｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＶＩＭは、黒色腫サブタイプを潜在的に識別し得るバイオマーカーとして記載されており、黒色腫の異なるサブグループにおける黒色腫の攻撃性を予測するかもしれない（Ｑｅｎｄｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＶＩＭは、腎明細胞がんにおいて上方制御されることが示された（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＶＩＭの高度発現は、腎明細胞がんの独立した予後指標として記載された（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＶＩＭは、スキャフォールドとして機能し、ＳｌｕｇをＥＲＫに動員してＳｌｕｇのリン酸化を促進することが示され、それは腫瘍発生の間に採用される発達過程である、上皮間葉転換の開始の要件として記載された（Ｖｉｒｔａｋｏｉｖｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。

【0164】

ＷＤＲ１は、予後良好の低悪性度肥満細胞腫瘍と比較して、卵巣がん由来の間質液において、および予後不良の高悪性度イヌ皮膚肥満細胞腫瘍において、上方制御されることが示された（Ｓｃｈｌｉｅｂｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｈａｓｌｅｎｅ－Ｈｏｘ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＷＤＲ１は、化学療法抵抗性の進行した漿液性上皮性卵巣がんにおいて、下方制御されることが示された（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。化学療法抵抗性の進行した漿液性上皮性卵巣がんにおけるＷＤＲ１下方制御は、芳しくない全生存期間と相関することが示された（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＷＤＲ１は、乳がんにおいて侵入腫瘍先端および正常組織との間の領域（境界面領域）で上方制御されることが示され、したがって乳んの進行および転移に関連してもよい（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

【0165】

ＹＷＨＡＥとＮＵＴＭ２Ｂ／ＮＵＴＭ２Ｅとの融合は、腎臓の明細胞肉腫の少数で観察された事象として記載された（Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＹＷＨＡＥ－ＮＵＴＭ２融合は、高悪性度の子宮内膜間質肉腫における頻度の高い事象として記載された（Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＹＷＨＡＥ－ＮＵＴＭ２融合体を有する高悪性度の子宮内膜間質肉腫は、侵襲性臨床挙動および予後不良を有する、子宮内膜間質肉腫のサブセットとして記載された（Ｋｒｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＹＷＨＡＥを含む３つの遺伝子座における切断は、子宮血管肉腫の発症に潜在的に寄与するものとして記載された（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＹＷＨＡＥは、胃がんにおいて下方制御されることが示されており、ＹＷＨＡＥレベルの低下は、びまん性胃がんとこの病理の早期発症に関連しており、ＹＷＨＡＥは胃の発がん過程において役割を有してもよい（Ｌｅａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＹＷＨＡＥは、再発の有無にかかわらず、乳がん患者の組織において示差的に発現されることが示され、無病生存期間および全生存期間の双方に関連することが示された（Ｃｉｍｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００８）。したがって、ＹＷＨＡＥは、乳がんの独立予後マーカー、および潜在的な薬物標的として使用されるかもしれない（Ｃｉｍｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００８）。

【0166】

ＺＮＦ２９２の変化は、慢性リンパ球性白血病駆動機構の変化として記載された（Ｐｕｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＺＮＦ２９２は、結腸直腸がんにおける腫瘍抑制遺伝子として記載された（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＺＮＦ２９２は、頭頸部扁上皮がんにおける臨床的関連性がある免疫原性抗原として記載された（Ｈｅｕｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

【発明を実施するための形態】

【0167】

免疫応答の刺激は、宿主免疫系によって外来性として認識された抗原の存在に依存する。腫瘍関連抗原の存在の発見は、宿主の免疫系を用いて腫瘍成長に介入する可能性を高めた。免疫系の体液性および細胞性アームの双方を活用する様々な機構が、がん免疫療法のために目下探求されている。

【0168】

細胞性免疫応答の特定の要素は、腫瘍細胞を特異的に認識して破壊できる。腫瘍浸潤性細胞集団からの、または末梢血からのＴ細胞の単離は、がんに対する自然免疫防御において、このような細胞が重要な役割を果たすことを示唆する。特に、細胞質ゾル内に位置するタンパク質または欠陥リボソーム産物（ＤＲＩＰＳ）に由来する、通常は８～１０アミノ酸残基の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）保有ペプチドのクラスＩ分子を認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞が、この応答において重要な役割を果たす。ヒトのＭＨＣ分子はまた、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも称される。

【0169】

本明細書の用法では、別段の記載がない限り、全ての用語は下述のとおり定義される。

【0170】

「Ｔ細胞応答」という用語は、生体外または生体内でペプチドによって誘導される、エフェクター機能の特異的増殖および活性化を意味する。ＭＨＣクラスＩ拘束性細胞毒性Ｔ細胞では、エフェクター機能は、ペプチドパルスされた、ペプチド前駆体パルスされたまたは天然ペプチド提示標的細胞の溶解；好ましくはペプチドによって誘導されるインターフェロン－γ、ＴＮＦ－α、またはＩＬ－２であるサイトカインの分泌；好ましくはペプチドによって誘導されるグランザイムまたはパーフォリンであるエフェクター分子の分泌；または脱顆粒であってもよい。

【0171】

「ペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα－アミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基を命名するために、本明細書で使用される。ペプチドは、好ましくは９アミノ酸長であるが、８アミノ酸長程度に短くあり得て、１０、１１、１２、１３、または１４以上に長くあり得て、ＭＨＣクラスＩＩペプチド（本発明のペプチドの伸長された変種）の場合、それらは１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸長以上に長くあり得る。

【0172】

さらに「ペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα－アミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基の塩を含むものとする。好ましくは、塩は、例えば、塩化物塩または酢酸塩（トリフルオロ酢酸塩）などの、ペプチドの薬学的に許容可能な塩である。ペプチドは生体内においては塩ではないので、本発明によるペプチドの塩は、それらの生体内の状態が、ペプチドと実質的に異なることに留意すべきである。

【0173】

「ペプチド」という用語は、「オリゴペプチド」もまた含むものとする。「オリゴペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα－アミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基を命名するために、本明細書で使用される。オリゴペプチドの長さは、その中で正しいエピトープまたはエピトープが保持されれば、本発明には重要でない。オリゴペプチドは、典型的に、約３０アミノ酸残基長未満であり、約１５アミノ酸長を超える。

【0174】

「ポリペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα－アミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基を指す。正しいエピトープが保持されれば、ポリペプチドの長さは本発明にとって重要でない。ペプチドまたはオリゴペプチドという用語とは対照的に、ポリペプチドという用語は、約３０を超えるアミノ酸残基を含有する分子を指すことが意図される。

【0175】

ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質またはこのような分子をコードするポリヌクレオチドは、免疫応答を誘導できれば「免疫原性」である（したがって本発明における「免疫原」である）。本発明では、免疫原性は、より具体的には、Ｔ細胞応答を誘導する能力と定義される。したがって「免疫原」は、免疫応答を誘導できる分子であり、本発明では、Ｔ細胞応答を誘導できる分子である。別の態様では、免疫原は、それに対する特異的抗体またはＴＣＲを生じさせるのに使用される、ペプチド、ペプチドとＭＨＣの複合体、オリゴペプチド、および／またはタンパク質であり得る。

【0176】

クラスＩ Ｔ細胞「エピトープ」は、クラスＩ ＭＨＣ受容体に結合している短いペプチドを必要とし、三成分複合体（ＭＨＣクラスＩα鎖、β－２－ミクログロブリン、およびペプチド）を形成し、それは、適切な親和性でＭＨＣ／ペプチド複合体に結合する適合Ｔ細胞受容体を保有するＴ細胞によって、認識され得る。ＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドは、典型的に８～１４アミノ酸長であり、最も典型的には９アミノ酸長である。

【0177】

ヒトにおいては、ＭＨＣクラスＩ分子（ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ともまた称されるヒトのＭＨＣ分子）をコードする、３つの異なる遺伝子座、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃがある。ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２、およびＨＬＡ－Ｂ＊０７は、これらの遺伝子座から発現され得る、異なるＭＨＣクラスＩ対立遺伝子の例である。

【0178】

表5: HLA-A*5およびHLA-A*24の発現頻度F、および最も高頻度のHLA-DR血清型。頻度は、ハーディ・ワインベルグ式、F=1-(1-Gf)²を用いて、Mori et al. (Morietal.,1997)から適応された、米国人母集団内のハプロタイプ頻度Gfから推定される。連鎖不均衡のために、A*02またはA*24と特定のHLA-DR対立遺伝子との組み合わせは、それらの単一頻度から予測されるよりも、豊富でありまたは低頻度であるかもしれない。詳細については、Chanock et al. (Chanock et al., 2004)を参照されたい。

【表5-1】

【表5-2】

【0179】

本発明のペプチドは、好ましくは、本明細書に記載される本発明のワクチンに包含される場合、Ａ＊０２に結合する。ワクチンはまた、汎結合ＭＨＣクラスＩＩペプチドを含んでもよい。したがって、本発明のワクチンを使用して、Ａ＊０２陽性の患者においてがんを治療し得る一方で、これらのペプチドの汎結合特性のために、ＭＨＣクラスＩＩアロタイプを選択する必要はない。

【0180】

本発明のＡ＊０２ペプチドが、例えばＡ＊２４などの別の対立遺伝子に結合するペプチドと組み合わされた場合、ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子のいずれか単独による対処と比較して、任意の患者集団のより高い割合を治療し得る。大多数の集団では、対立遺伝子のいずれか単独によって、５０％未満の患者が対処され得た一方で、ＨＬＡ－Ａ＊２４およびＨＬＡ－Ａ＊０２エピトープを含んでなるワクチンは、任意の妥当な集団で、少なくとも６０％の患者を治療し得る。具体的には、様々な地域において、以下の百分率の患者が、これらの対立遺伝子の少なくとも１つについて陽性である：米国６１％、西欧６２％、中国７５％、韓国７７％、日本８６％（ｗｗｗ．ａｌｌｅｌｅｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ．ｎｅｔから計算された）。

【0181】

好ましい実施形態では、「ヌクレオチド配列」という用語は、デオキシリボヌクレオチドのヘテロ重合体を指す。

【0182】

特定のペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、天然起源であってもよく、またはそれらは合成的に構築されてもよい。一般に、本発明のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質をエンコードするＤＮＡ断片は、ｃＤＮＡフラグメントと短いオリゴヌクレオチドリンカーから構築され、またはひと続きのオリゴヌクレオチドから構築されて、微生物またはウイルスオペロンに由来する調節因子を含んでなる、組換え転写単位で発現できる合成遺伝子が提供される。

【0183】

本明細書の用法では「ペプチドをコーディング（またはコード）するヌクレオチド」という用語は、配列が、例えば、ＴＣＲの製造に有用な樹状細胞または別の細胞株によって発現される生体系と適合性である、人工（人造）開始および停止コドンを含むペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を指す。

【0184】

本明細書の用法では、核酸配列への言及は、一本鎖および二本鎖の核酸の双方を含む。したがって、例えば、特異的配列は、文脈上明らかに別の意味が示唆されない限り、このような配列の一本鎖ＤＮＡ、このような配列とその補体との二本鎖（二本鎖ＤＮＡ）、およびこのような配列の補体を指す。

【0185】

「コード領域」という用語は、その天然ゲノム環境内で、遺伝子の発現産物を天然にまたは正常にコードする遺伝子の部分、すなわち、遺伝子の天然発現産物を生体内でコードする領域を指す。

【0186】

コード領域は、非変異（「正常」）、変異または改変遺伝子に由来し得て、またはＤＮＡ合成技術の当業者に周知の方法を使用して実験室で完全に合成された、ＤＮＡ配列または遺伝子にさえ由来し得る。

【0187】

「発現産物」という用語は、遺伝子の、そして遺伝コード縮重に起因する同等物をコードし、したがって同一アミノ酸をコードする任意の核酸配列の天然翻訳産物である、ポリペプチドまたはタンパク質を意味する。

【0188】

コード配列に言及する場合、「フラグメント」という用語は、その発現産物が、完全コード領域の発現産物と本質的に同一の生物学的機能または活性を保つ、完全未満のコード領域を含んでなるＤＮＡの部分を意味する。

【0189】

「ＤＮＡ断片」という用語は、別々のフラグメントの形態の、またはより大型のＤＮＡコンストラクトの構成要素としての、ＤＮＡポリマーを指し、それは、実質的に純粋な、すなわち、混入内因性物質を含まない形態で、例えばクローニングベクターを使用した標準生化学的方法によって、断片およびその構成ヌクレオチド配列が同定、操作、および回収できる量または濃度で、少なくとも１回単離されたＤＮＡに由来する。このような断片は、典型的に真核生物遺伝子内に存在する内部非翻訳配列またはイントロンによって中断されていない、読み取り枠の形態で提供される。非翻訳ＤＮＡ配列は、それがコード領域の操作または発現を妨げない、読み取り枠下流に存在してもよい。

【0190】

「プライマー」という用語は、短い核酸配列を意味し、それはＤＮＡの１本鎖と対合し得て、ＤＮＡポリメラーゼがそこでデオキシリボヌクレオチド鎖合成を開始する、遊離３’－ＯＨ末端を提供する。

【0191】

「プロモーター」という用語は、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼ結合に関与する、ＤＮＡの領域を意味する。

【0192】

「単離」という用語は、物質が、その元の環境（例えば、それが天然起源であれば天然環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然システムで共存する物質の一部または全部から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得て、および／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり得るが、このようなベクターまたは組成物がその天然環境の一部でないと言う意味では、なおも単離されている。

【0193】

本発明によって開示されるポリヌクレオチド、および組換えまたは免疫原性ポリペプチドは、「精製」形態であってもよい。「精製」という用語は、完全に純粋である必要はなく；むしろ、それは相対的定義であることが意図されて、これらの用語が当業者によって理解されるように、高度に精製された調製物、または部分的にのみ精製された調製物を含み得る。例えば、ｃＤＮＡライブラリーから単離された個々のクローンは、電気泳動的に均一に、従来法で精製されている。少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、より好ましくは４または５桁までの、出発原料または天然物質の精製が明示的に検討される。さらに、重量基準で、好ましくは９９．９９９％、または少なくとも９９．９９％または９９．９％；さらに望ましくは９９％以上の純度を有する、特許請求されるポリペプチドが明示的に包含される。

【0194】

本発明によって開示される核酸およびポリペプチド発現産物、ならびにこのような核酸および／またはこのようなポリペプチドを含有する発現ベクターは、「富化形態」であってもよい。本明細書の用法では、「富化」という用語は、物質濃度が、（例えば）その天然濃度の少なくとも約２、５、１０、１００、または１０００倍であることを意味し、有利には重量基準で０．０１％、好ましくは重量基準で少なくとも約０．１％である。重量基準で約０．５％、１％、５％、１０％、および２０％の富化調製物もまた、検討される。本発明を構成する、配列、コンストラクト、ベクター、クローン、およびその他の物質は、有利には、富化または単離形態であり得る。「活性フラグメント」という用語は、通常は、単独で、または任意選択的に適切なアジュバントと共に、またはベクター中で、例えば、ウサギまたはマウスのようなそしてまたヒトをはじめとする哺乳類などの動物に投与すると免疫応答を生じる（すなわち、免疫原性を有する）ペプチド、ポリペプチドまたは核酸配列のフラグメントを意味し、このような免疫応答は、ヒトなどのレシピエント動物内でＴ細胞応答を刺激する形態を取る。代案としては、「活性フラグメント」はまた、生体外Ｔ細胞応答を誘導するのに使用されてもよい。

【0195】

本明細書の用法では、ポリペプチドとの関連で使用される場合、「部分」、「断片」、および「フラグメント」という用語は、アミノ酸残基などの連続する残基の配列を指し、その配列は、より大型の配列の部分集合を形成する。例えば、ポリペプチドが、トリプシンまたはキモトリプシンなどの一般的エンドペプチダーゼのいずれかによって処理されれば、このような処理から得られるオリゴペプチドは、出発ポリペプチドの部分、断片またはフラグメントに相当するであろう。ポリヌクレオチドに関して使用される場合、これらの用語は、いずれかのエンドヌクレアーゼによる前記ポリヌクレオチドの処理によって生じる生成物を指す。

【0196】

本発明によると、配列に言及する場合、「同一性百分率」または「パーセント同一」という用語は、比較される配列（「比較配列」）と、記載されまたは特許請求される配列（「参照配列」）とのアライメント後に、配列が、特許請求されまたは記載される配列と比較されることを意味する。次に同一性百分率は、次式に従って判定される：
同一性百分率＝１００［１－（Ｃ／Ｒ）］
式中、Ｃは、参照配列と比較される配列との間のアライメント長にわたる、参照配列と比較配列の間の差異の数であり、
（ｉ）比較配列中に対応する整列塩基またはアミノ酸を有しない、参照配列中の各塩基またはアミノ酸、および
（ｉｉ）参照配列中の各ギャップ、および
（ｉｉｉ）比較配列中の整列塩基またはアミノ酸と異なる、参照配列中の各整列塩基またはアミノ酸が差異を構成して、
（ｉｉｉｉ）アライメントは、整合配列の１位から開始しなくてはならず；
Ｒは、比較配列とのアライメント長にわたる参照配列中の塩基またはアミノ酸の数であり、参照配列中に生じる任意のギャップもまた、塩基またはアミノ酸として数えられる。

【0197】

比較配列と、それに対して同一性百分率が上のように計算される参照配列との間に、特定の最小同一性百分率とほぼ同じまたはそれを上回るアライメントが存在すれば、その中に、上記のように計算された同一性百分率が特定の同一性百分率未満であるアライメントが存在したとしても、比較配列は、参照配列との特定の最小同一性百分率を有する。

【0198】

したがって上述したように、本発明は、配列番号１～配列番号９３、または配列番号１～配列番号９３と８８％相同的であるその変異体、またはＴ細胞を前記ペプチドと交差反応させるその変異体からなる群から選択される配列を含んでなる、ペプチドを提供する。本発明のペプチドは、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子または前記ペプチドの伸長バージョンをクラスＩＩに結合する能力を有する。

【0199】

本発明では、「相同的」という用語は，２つのアミノ酸配列、すなわちペプチドまたはポリペプチド配列の配列間の同一性の程度を指す（上の同一性百分率を参照されたい）。前述の「相同性」は、比較される配列にわたり、最適条件下でアライメントされた２つの配列を比較することで判定される。このような配列相同性は、例えばＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用してアライメントを作成することで、計算され得る。一般に利用できる配列解析ソフトウェア、より具体的には、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸまたはその他のツールが、公共データベースによって提供される。

【0200】

当業者は、特定のペプチドの変異体によって誘導されるＴ細胞が、ペプチドそれ自体と交差反応できるかどうかを評価できるであろう（Ａｐｐａｙ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｃｏｌｏｍｂｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｆｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｚａｒｅｍｂａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。

【0201】

所与のアミノ酸配列の「変異型」によって、本発明者らは、ペプチドが、配列番号１～配列番号９３からなる所与のアミノ酸配列からなるペプチドと実質的に同様に、ＨＬＡ分子となおも結合できるように、（例えば、それらを別の天然アミノ酸残基の側鎖で、またはその他の側鎖で置換することにより）例えば、アミノ酸の１つまたは２つの残基の側鎖が変化することを意味する。例えば、ペプチドは、それがＨＬＡ－Ａ＊０２または－ＤＲなどの適切なＭＨＣ分子の結合溝と相互作用して結合する能力を改善せずとも、少なくとも維持するように修飾されてもよく、このようにしてそれは、活性化ＣＴＬのＴＣＲに結合する能力を改善せずとも、少なくとも維持する。

【0202】

これらのＴ細胞は、引き続いて細胞と交差反応して、本発明の態様で定義される同族ペプチドの天然アミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する細胞を殺滅し得る。学術文献およびデータベース（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｇｏｄｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）から演繹され得るように、ＨＬＡ結合ペプチドの特定の位置は、典型的に、アンカー残基であり、結合溝を構成するポリペプチド鎖の極性、電気物理的、疎水性、および空間特性によって画定されるＨＬＡ受容体の結合モチーフと適合する、コア配列を形成する。したがって、当業者は、既知のアンカー残基を保つことで、配列番号１～配列番号９３に記載されるアミノ酸配列を修飾でき、このような変異型がＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力を維持するかどうかを判定できるであろう。本発明の変異型は、活性化Ｔ細胞のＴＣＲに結合する能力を維持し、それは引き続いて、本発明の態様で定義されるような同族ペプチドの天然アミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する細胞と交差反応して、それを殺滅し得る。

【0203】

本明細書で開示される元の（未修飾）ペプチドは、特に明記されない場合は、ペプチド鎖内の異なる、おそらくは選択的な部位における、１つまたは複数の残基の置換によって修飾され得る。好ましくはこれらの置換は、アミノ酸鎖の末端に位置する。このような置換は、保存的性質であってもよく、例えば、疎水性アミノ酸が別の疎水性アミノ酸によって置換されるなど、構造および特徴の類似したアミノ酸によってアミノ酸が置換される。さらにより保存的な置換は、ロイシンのイソロイシンによる置換などの、同一または類似サイズおよび化学的性質のアミノ酸の置換である。天然起源相同タンパク質ファミリーの配列多様性の研究では、特定のアミノ酸置換は、他よりも耐容されることが多く、これらは、元のアミノ酸とその置換物との間のサイズ、電荷、極性、および疎水性の類似性との相関を示すことが多く、これが「保存的置換」の定義の基礎である。

【0204】

保存的置換は、本明細書では、以下の５つのグループの１つの中の交換として定義される：グループ１－小型脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；グループ２－極性の負に帯電した残基およびそれらのアミド（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）；グループ３－極性の正に帯電した残基（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；グループ４－大型脂肪族非極性残基（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ）；およびグループ５－大型芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）。

【0205】

より保存的でない置換は、アラニンのイソロイシン残基による置換などの、類似した特徴を有するがサイズがいくらか異なる別のアミノ酸による置換を伴うかもしれない。高度に非保存的な置換は、極性アミノ酸の、または塩基性アミノ酸の酸性アミノ酸による置換を伴うかもしれない。しかし化学効果は完全に予測可能でなく、遊離基置換は単純な化学的原理からは予測できない偶然の効果を生じさせる可能性があるので、このような「遊離基」置換は、潜在的に無効であるとして却下され得ない。

【0206】

もちろんこのような置換には、通常のＬ－アミノ酸以外の構造体が関与してもよい。したがってＤ－アミノ酸が、本発明の抗原性ペプチドに通常見いだされるＬ－アミノ酸を置換するかもしれず、依然として本明細書の開示に包含される。さらに、非標準アミノ酸（すなわち、一般的な天然タンパク質新生アミノ酸以外）もまた置換目的で使用して、本発明による免疫原および免疫原性ポリペプチドが製造されてもよい

【0207】

２つ以上の位置における置換が、以下に定義されるように実質的に同等のまたはそれを超える抗原活性のあるペプチドをもたらすことが判明した場合、これらの置換の組み合わせを試験して、置換の組み合わせが、ペプチドの抗原性に相加または相乗効果をもたらすかどうかが判定される。最大でも、ペプチド内の４つ以上の位置を超えて同時に置換されることはない。

【0208】

本明細書で示されるようなアミノ酸配列から本質的になるペプチドは、非修飾ペプチドと比較すると、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力が、実質的に変化したり悪影響を受けたりすることなく交換される、１つまたは２つの非アンカーアミノ酸を有し得る（アンカーモチーフについては下記を参照されたい）。別の実施形態では、本明細書で示されるようなアミノ酸配列から本質的になるペプチドにおいては、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ分子に別の実施形態では、本明細書で示されるようなアミノ酸配列から本質的になるペプチドにおいては、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力が非修飾ペプチドと比較して実質的に変化したり悪影響を受けることなく、１つまたは２つのアミノ酸が、それらの保存的交換パートナー（以下を参照されたい）で交換され得る。結合する能力が非修飾ペプチドと比較して実質的に変化したり悪影響を受けることなく、１つまたは２つのアミノ酸が、それらの保存的交換パートナー（以下を参照されたい）で交換され得る。

【0209】

Ｔ細胞受容体との相互作用に実質的に寄与しないアミノ酸残基は、その組み込みが、Ｔ細胞反応性に実質的に影響を及ぼさず、関連ＭＨＣとの結合を排除しない、その他のアミノ酸での置換によって修飾され得る。したがって与えられた但し書きを除いて、本発明のペプチドは、与えられたようなアミノ酸配列またはそれらの部分または変異体を含む、任意のペプチド（本発明者らは、その用語にオリゴペプチドまたはポリペプチドを含める）であってもよい。

【0210】

表6: 配列番号4、9、および18に記載のペプチドの変異型およびモチーフ

【表6-1】

【表6-2】

【0211】

より長い（伸長された）ペプチドもまた、適切であってもよい。ＭＨＣクラスＩエピトープは、通常は８～１１アミノ酸長であるが、実際のエピトープを含むより長いペプチドまたはタンパク質から、ペプチドプロセッシングによって作製することが可能である。実際のエピトープ側面に位置する残基は、プロセッシング中に実際のエピトープを曝露させるのに必要なタンパク質分解切断に、実質的に影響を及ぼさない残基であることが好ましい。

【0212】

本発明のペプチドは、最大４個のアミノ酸によって伸長させ得て、すなわち４：０～０：４の間のあらゆる組み合わせで、どちらかの末端に１，２、３または４個のアミノ酸が付加され得る。本発明による伸長の組み合わせは、表７にある。

【0213】

表7: 本発明のペプチドの伸長の組み合わせ

【表7】

【0214】

伸長／延長のためのアミノ酸は、元のタンパク質配列のペプチドまたは任意のその他のアミノ酸であり得る。伸長を利用して、ペプチドの安定性または溶解度を高め得る。

【0215】

したがって本発明のエピトープは、天然起源腫瘍関連または腫瘍特異的エピトープと同一であってもよく、またはそれらが実質的に同一の抗原活性を有しさえすれば、４つ以下の残基が参照ペプチドと異なるエピトープを含んでもよい。

【0216】

代案の実施形態では、ペプチドは、４つを超えるアミノ酸で、好ましくは最大３０アミノ酸の全長まで、片側または両側で伸長される。これは、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドをもたらしてもよい。ＭＨＣクラスＩＩへの結合は、当該技術分野で公知の方法によって試験される得る。

【0217】

したがって、本発明は、ＭＨＣクラスＩエピトープのペプチドおよび変異型を提供し、ペプチドまたは変異型は、８～１００、好ましくは８～３０、最も好ましくは８～１４、すなわち８、９、１０、１１、１２、１３、１４アミノ酸の全長を有し、伸長されたクラスＩＩ結合ペプチドの場合、長さはまた、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２アミノ酸であり得る。

【0218】

もちろん、本発明によるペプチドまたは変異型は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩの分子に結合する能力を有する。ペプチドまたは変異体のＭＨＣ複合体への結合は、当該技術分野で既知の方法によって試験されてもよい。

【0219】

好ましくは、本発明によるペプチドに特異的なＴ細胞を置換ペプチドについて試験する場合、置換ペプチドが背景に対して最大溶解増加の半分を達成するペプチド濃度は、約１ｍＭ以下、好ましくは約１μＭ以下、より好ましくは約１ｎＭ以下、さらにより好ましくは約１００ｐＭ以下、最も好ましくは約１０ｐＭ以下である。置換ペプチドが、２人以上、少なくとも２人、より好ましくは３人の個人からのＴ細胞によって認識されることもまた好ましい。

【0220】

本発明の特に好ましい実施形態では、ペプチドは、配列番号に１～配列番号９３に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる。

【0221】

「から本質的になる」は、本発明によるペプチドが、配列番号１～配列番号９３のいずれかに記載の配列またはその変異体に加えて、ＭＨＣ分子エピトープのエピトープとして機能するペプチドの一部を必ずしも構成しない、追加的なＮおよび／またはＣ末端に位置するアミノ酸の一連の配列を含有することを意味するものとする。

【0222】

それでもなお、これらの一連の配列は、本発明によるペプチドの細胞への効率的な導入を提供するのに重要であり得る。本発明の一実施形態では、ペプチドは、例えば、ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ００４９７に由来する、ＨＬＡ－ＤＲ抗原関連不変鎖（ｐ３３、以下の「Ｉｉ」）の８０個のＮ末端アミノ酸を含んでなる、融合タンパク質の一部である。その他の融合物においては、本発明のペプチドは、本明細書に記載されるような抗体、またはその機能的部分に、特に抗体の配列に、前記抗体によって特異的に標的化されるように融合し得て、または例えば、本明細書に記載されるような樹状細胞に対して特異的な抗体に、またはその中に融合し得る。

【0223】

さらにペプチドまたは変異型は、より強力な免疫応答を引き起こすために、安定性および／またはＭＨＣ分子への結合を改善するようにさらに修飾されてもよい。ペプチド配列のこのような最適化方法は当該技術分野で周知であり、例えば、逆ペプチド結合または非ペプチド結合の導入が挙げられる。

【0224】

逆ペプチド結合においては、アミノ酸残基はペプチド（－ＣＯ－ＮＨ－）結合によって連結せず、ペプチド結合が逆転する。このようなレトロ－インベルソペプチド模倣剤は、例えば、参照により本明細書に援用される、Ｍｅｚｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ（１９９７）（Ｍｅｚｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７）に記載されるものなどの当該技術分野で既知の方法を使用して製造されてもよい。このアプローチは、側鎖の方向でなく主鎖に関与する変化を含有する、擬ペプチドの生成を伴う。Ｍｅｚｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｚｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７）は、ＭＨＣ結合およびＴヘルパー細胞応答のために、これらの擬ペプチドが有用であることを示す。ＣＯ－ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ－ＣＯ結合を含有するレトロインバースペプチドは、タンパク質分解に対してはるかにより高い耐性がある。

【0225】

非ペプチド結合は、例えば、－ＣＨ２－ＮＨ、－ＣＨ２Ｓ－、－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－ＣＯＣＨ２－、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２－、および－ＣＨ２ＳＯ－である。米国特許第４，８９７，４４５号明細書は、標準手順によって合成されるポリペプチド、およびＮａＣＮＢＨ３の存在下でアミノアルデヒドとアミノ酸を反応させることで合成される非ペプチド結合が関与する、ポリペプチド鎖中の非ペプチド結合（－ＣＨ２－ＮＨ）を固相合成する方法を提供する。

【0226】

上述の配列を含んでなるペプチドは、それらのアミノおよび／またはカルボキシ末端に存在する追加的な化学基と共に合成して、ペプチドの安定性、生物学的利用能、および／または親和性を高めてもよい。例えば、カルボベンゾキシル、ダンシル、またはｔ－ブチルオキシカルボニル基などの疎水性基が、ペプチドのアミノ末端に付加されてもよい。同様に、アセチル基または９－フルオレニルメトキシ－カルボニル基が、ペプチドのアミノ末端に配置されてもよい。さらに、疎水性基、ｔ－ブチルオキシカルボニル、またはアミド基が、ペプチドのカルボキシ末端に付加されてもよい。

【0227】

さらに、本発明のペプチドは、それらの立体配置を改変するように合成されてもよい。例えば、通常のＬ異性体でなく、ペプチドの１つまたは複数のアミノ酸残基のＤ異性体が使用されてもよい。なおもさらに、本発明のペプチドのアミノ酸残基の少なくとも１つは、周知の非天然起源アミノ酸残基の１つで置換されてもよい。これらのような変化は、本発明のペプチドの安定性、生物学的利用能および／または結合作用の増加に役立ってもよい。

【0228】

同様に、本発明のペプチドまたは変異体は、ペプチド合成の前または後のどちらかに、特定のアミノ酸を反応させることで化学的に修飾されてもよい。このような修飾の例は、当該技術分野で周知であり、例えば、参照により本明細書に援用される、Ｒ．Ｌｕｎｄｂｌａｄ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，３ｒｄ ｅｄ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２００４（Ｌｕｎｄｂｌａｄ，２００４）に要約される。アミノ酸の化学修飾としては、これに限定されるものではないが（ａｌｔｈｏｕｇｈ ｗｉｔｈｏｕｔ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ ｔｈｅｒｅｔｏ）、アシル化、アミジン化、リジンのピリドキシル化、還元アルキル化、２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化、システインのシステイン酸への過ギ酸酸化によるカルボキシル基のアミド修飾およびスルフヒドリル修飾、水銀誘導体形成、その他のチオール化合物との混合ジスルフィド形成、マレイミドとの反応、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化、およびアルカリ性ｐＨでのシアネートによるカルバモイル化による修飾が挙げられるが、これに限定されるものではない（ｉｓ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）。この点において、当業者は、タンパク質の化学修飾に関するより詳細な手順について、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｅｄｓ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ ＮＹ １９９５－２０００）（Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）の第１５章を参照されたい。

【0229】

簡単に述べると、例えばタンパク質中のアルギニル残基の修飾は、付加体を形成するためのフェニルグリオキサール，２，３－ブタンジオン、および１，２－シクロヘキサンジオンなどの隣接するジカルボニル化合物の反応に基づくことが多い。別の例は、メチルグリオキサールとアルギニン残基の反応である。システインは、リジンおよびヒスチジンなどのその他の求核性部位の同時の修飾なしに修飾され得る。その結果、システイン修飾のために多数の試薬が利用可能である。Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈなどの会社のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）が、特定の試薬に関する情報を提供する。

【0230】

タンパク質中のジスルフィド結合の選択的還元もまた、一般的である。ジスルフィド結合は、生物医薬品の加熱処理中に形成されて酸化され得る。ウッドワード試薬Ｋを使用して、特定のグルタミン酸残基が修飾されてもよい。Ｎ－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミドを利用して、リジン残基とグルタミン酸残基との間に分子内架橋が形成され得る。例えば、ジエチルピロ炭酸は、タンパク質中のヒスチジル残基修飾のための試薬である。ヒスチジンはまた、４－ヒドロキシ－２－ノネナールを使用して修飾され得る。リジン残基およびその他のα－アミノ基の反応物は、例えば、ペプチドの表面への結合またはタンパク質／ペプチド架橋で有用である。リジンはポリ（エチレン）グリコールの付着部位であり、タンパク質のグリコシル化の主要な修飾部位である。タンパク質中のメチオニン残基は、例えば、ヨードアセトアミド、ブロモエチルアミン、およびクロラミンＴによって修飾され得る。

【0231】

テトラニトロメタンおよびＮ－アセチルイミダゾールを使用して、チロシル残基が修飾され得る。ジチロシンの形成を通じた架橋は、過酸化水素／銅イオンによって達成され得る。

【0232】

トリプトファンの修飾に関する最近の研究では、Ｎ－ブロモサクシニミド、臭化２－ヒドロキシ－５－ニトロベンジルまたは３－ブロモ－３－メチル－２－（２－ニトロフェニルメルカプト）－３Ｈ－インドール（ＢＰＮＳ－スカトール）が使用されている。

【0233】

ＰＥＧによる治療用タンパク質およびペプチドの成功裏の修飾が、循環半減期の延長に関連することが多い一方で、タンパク質と、グルタルアルデヒド、ポリエチレングリコールジアクリレート、およびホルムアルデヒドとの架橋は、ハイドロゲル調製のために使用される。免疫療法のためのアレルゲンの化学修飾は、カリウムシアネートでのカルバミル化によって達成されることが多い。

【0234】

ペプチドが修飾されまたは非ペプチド結合を含む、ペプチドまたは変異体は、本発明の好ましい実施形態である。一般に、ペプチドおよび変異体（少なくともアミノ酸残基間にペプチド結合を含有するもの）は、Ｌｕｋａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｌｕｋａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８１）によって、そしてその中で引用される参考文献によって開示される、Ｆｍｏｃ－ポリアミド様式の固相ペプチド合成によって合成されてもよい。一時的なＮ－アミノ基保護は、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基によってもたらされる。この高度に塩基不安定性の保護基の反復性切断は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンを使用して実施される。側鎖官能基は、それらのブチルエーテル（セリン、スレオニン、およびチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン酸およびアスパラギン酸の場合）、ブチルオキシカルボニル誘導体（リジンおよびヒスチジンの場合）、トリチル誘導体（システインの場合）、および４－メトキシ－２，３，６－トリメチルベンゼンスルホニル誘導体（アルギニンの場合）として保護されてもよい。グルタミンまたはアスパラギンがＣ末端残基である場合、側鎖アミド官能基を保護するために、４，４’－ジメトキシベンズヒドリル基が活用される。固相担体は、ジメチルアクリルアミド（主鎖単量体）、ビスアクリロイルエチレンジアミン（架橋剤）、およびアクリロイルサルコシンメチルエステル（機能化因子）の３つの単量体から構成される、ポリジメチル－アクリルアミドポリマーをベースとする。使用されるペプチド－対－樹脂の切断可能な結合因子は、酸不安定性４－ヒドロキシメチル－フェノキシ酢酸誘導体である。逆転Ｎ，Ｎ－ジシクロヘキシル－カルボジイミド／１ヒドロキシベンゾトリアゾール媒介共役手順を使用して付加されるアスパラギンおよびグルタミンを除いて、全てのアミノ酸誘導体は、それらのあらかじめ形成された対称的な無水物誘導体として付加される。全ての共役および脱保護反応は、ニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸またはイサチン（ｉｓｏｔｉｎ）試験手順を使用してモニターされる。合成完了時に、ペプチドは樹脂担体から切断され、同時に、５０％スカベンジャー混合物を含有する９５％トリフルオロ酢酸での処理によって、側鎖保護基が除去される。一般に使用されるスカベンジャーとしては、エタンジチオール、フェノール、アニソール、および水が挙げられ、正確な選択は、合成されるペプチドの構成アミノ酸に左右される。ペプチドの合成のための固相法と溶液相法の組み合わせもまた、可能である（例えば、（Ｂｒｕｃｋｄｏｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）、およびその中で引用される参考文献を参照されたい）。

【0235】

トリフルオロ酢酸は、真空蒸発によって除去され、引き続くジエチルエーテルを用いた磨砕は、粗製ペプチドをもたらす。存在する任意のスカベンジャーは、単純な抽出手順によって除去され、それは水相の凍結乾燥時に、スカベンジャーを含まない粗製ペプチドを与える。ペプチド合成のための試薬は、通常、例えば、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）から入手できる。

【0236】

精製は、再結晶化、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および（通常は）例えば、アセトニトリル／水勾配分離を使用した逆相高速液体クロマトグラフィーなどの技術の任意の１つまたは組み合わせによって実施されてもよい。

【0237】

ペプチドの分析は、薄層クロマトグラフィー、電気泳動法、特にキャピラリー電気泳動法、固相抽出（ＣＳＰＥ）、逆相高速液体クロマトグラフィー、酸加水分解後のアミノ酸分析を使用して、高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分光分析によって、ならびにＭＡＬＤＩおよびＥＳＩ－Ｑ－ＴＯＦ質量分光分析によって、実施されてもよい。

【0238】

過剰提示ペプチドを選択するために、中央値サンプル提示ならびに反復試験変動を示す、提示プロファイルが計算される。プロファイルは、目的腫瘍実体のサンプルを正常なサンプルのベースラインに並置させる。次に、線形混合効果モデルのｐ値を計算し（Ｐｉｎｈｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、誤検出率によって複数試験について補正する（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ ａｎｄ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ，１９９５）（実施例１参照）ことで、これらの各プロファイルが過剰提示スコアに統合され得る。

【0239】

質量分析によるＨＬＡリガンドの同定と相対的定量化のために、衝撃凍結サンプルからのＨＬＡ分子が精製されて、ＨＬＡ関連ペプチドが単離された。単離ペプチドを分離して、オンラインナノエレクトロスプレーイオン化（ｎａｎｏＥＳＩ）液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）実験によって配列を同定した。その結果生じたペプチド配列は、食道がんサンプル（Ｎ＝１６Ａ＊０２陽性サンプル）から記録された天然腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）の断片化パターンと、同一配列の対応する合成標準ペプチドの断片化パターンとの比較によって、確認された。ペプチドは、原発性腫瘍のＨＬＡ分子のリガンドとして直接、同定されたので、これらの結果は、１６人の食道がん患者から入手された原発性がん組織上における、同定されたペプチドの天然プロセッシングおよび提示の直接的証拠を提供する。

【0240】

発見パイプラインＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴ（登録商標）ｖ２．１（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第２０１３－００９６０１６号明細書を参照されたい）は、いくつかの異なる非がん性組織および臓器と比較した、がん組織上のＨＬＡ拘束性ペプチドレベルの直接相対定量化に基づく、妥当な過剰提示ペプチドワクチン候補の同定と選択ができるようにする。これは、独自仕様のデータ解析パイプラインで処理された獲得ＬＣ－ＭＳデータを使用して、配列同定のためのアルゴリズム、スペクトルクラスタリング、イオン計数、滞留時間アライメント、電荷状態のデコンボリューション、および正規化を組み合わせる、無標識示差定量化の開発によって達成された。

【0241】

各ペプチドおよびサンプルの誤差推定値を含む、提示レベルが確立された。腫瘍組織上で排他的に提示されるペプチド、および腫瘍において過剰提示されるペプチドが、非がん性の組織および臓器との比較で同定されている。

【0242】

食道がん組織サンプルからのＨＬＡペプチド複合体は精製されてＨＬＡ結合ペプチドが単離され、ＬＣ－ＭＳによって分析された（実施例を参照されたい）。本出願に含まれる全てのＴＵＭＡＰは、この原発性食道がんサンプルに対するアプローチを用いて同定され、それらの原発性食道がん上の提示が確認された。

【0243】

複数の食道がんおよび正常組織上で同定されたＴＵＭＡＰは、無標識ＬＣ－ＭＳデータのイオン計数を使用して定量化された。方法は、ペプチドのＬＣ－ＭＳシグナル面積が、サンプル中のその存在量と相関すると仮定する。様々なＬＣ－ＭＳ実験におけるペプチドの全ての定量的シグナルは、中心傾向に基づいて正規化され、サンプル当たりで平均化されて、提示プロファイルと称される棒グラフにマージされた。提示プロファイルは、タンパク質データベース検索、スペクトルクラスタリング、電荷状態デコンボリューション（除電）、および滞留時間アライメントおよび正規化のような、異なる解析法を統合する。

【0244】

ペプチドの過剰提示に加えて、基礎となる遺伝子のｍＲＮＡ発現が試験された。正常組織およびがん組織のＲＮＡＳｅｑ分析を通じて、ｍＲＮＡデータが得られた（実施例２を参照されたい）。正常組織データのさらなる出典は、約３０００の正常組織サンプルに由来する、公的に利用可能なＲＮＡ発現データのデータベースであった（Ｌｏｎｓｄａｌｅ，２０１３）。それがコードするｍＲＮＡが、がん組織では高度に発現されるが、生命維持に必要な正常組織では非常に低いかまたは存在しない、タンパク質に由来するペプチドが、好ましくは本発明に包含される。

【0245】

さらに、発見パイプラインＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴ（登録商標）ｖ２．は、がんまたはその他の感染組織上で、ＭＨＣ拘束性、好ましくはＨＬＡ拘束性のペプチドレベルの直接絶対定量化ができるようにする。簡単に述べると、分析された組織サンプルの全ＤＮＡ含有量から、総細胞数が計算された。組織サンプル中のＴＵＭＡＰの全ペプチド量は、天然ＴＵＭＡＰと、既知量のＴＵＭＡＰの同位体標識バージョン、いわゆる内標準との比率として、ナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定された。ＴＵＭＡＰ単離の効率は、ＴＵＭＡＰ単離手順の可能な限り早い時点で、全ての選択されたＴＵＭＡＰのペプチド：ＭＨＣ複合体を組織溶解産物に添加して、ペプチド単離手順の完了に続く、ナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるそれらの検出によって判定された。総細胞数および全ペプチド量は、組織サンプル当たり三連の測定から計算された。ペプチド単離効率は、それぞれ三連で測定された、１０回の添加実験からの平均として計算された（実施例６および表１２を参照されたい）。

【0246】

本発明は、本発明のペプチドを過剰にまたは排他的に提示する、好ましくは食道がんである、がん／腫瘍を治療するのに有用なペプチドを提供するこれらのペプチドは、原発性ヒト食道がんサンプル上で、ＨＬＡ分子によって天然に提示されることが、質量分析法によって示された。

【0247】

それにペプチドが由来する起源遺伝子／タンパク質（「完全長タンパク質」または「基礎タンパク質」とも称される）の多くは、正常組織と比較してがんにおいて高度に過剰発現されることが示されて、起源遺伝子の高度な腫瘍関連性が実証され、「正常組織」は、本発明との関連で、健康な食道細胞またはその他の正常組織細胞のどちらかを意味するものとする（実施例２を参照されたい）。さらに、ペプチド自体は、腫瘍組織上では強く過剰提示されるが、正常組織上では過剰提示されず、「腫瘍組織」は、本発明との関連で、食道がんに罹患している患者に由来するサンプルを意味するものとする（実施例１を参照されたい）。

【0248】

ＨＬＡ結合ペプチドは、免疫系、特にＴリンパ球によって認識され得る。Ｔ細胞は、例えば誘導ペプチドを提示する食道がん細胞などの、認識されたＨＬＡ／ペプチド複合体を提示する細胞を破壊し得る。

【0249】

本発明のペプチドは、Ｔ細胞応答を刺激でき、および／または過剰提示されることが示されおり、したがって本発明に従って、抗体および／または可溶性ＴＣＲなどのＴＣＲの製造のために使用され得る（実施例３、実施例４を参照されたい）。さらに、ペプチドは、それぞれのＭＨＣと複合体化した場合に、本発明による抗体および／またはＴＣＲ、特にＴＣＲ製造のためにも使用され得る。それぞれの方法は当業者に良く知られており、それぞれの参考文献にもまた見られる。したがって本発明のペプチドは、それによって腫瘍細胞が破壊され得る、患者における免疫応答を生じさせるのに有用である。患者における免疫応答は、理想的には免疫原性を増強する薬剤（すなわちアジュバント）との組み合わせで、記載されるペプチド、または適切な前駆体（例えば伸長ペプチド、タンパク質、またはこれらのペプチドをコードする核酸）を患者に直接投与することで、誘導され得る。本発明の標的ペプチドは、正常組織上では同等のコピー数で提示されないので、このような治療的ワクチン接種から生じる免疫応答は、腫瘍細胞に対して高度に特異的であることが予測され得て、患者の正常細胞に対する望まれない自己免疫反応のリスクを防止する。

【0250】

本明細書は、鎖およびａβ鎖（「α／βＴＣＲ」）を含んでなるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）にさらに関する。ＭＨＣ分子によって提示された際に、ＴＣＲおよび抗体に結合できるＨＡＶＣＲ１－００１ペプチドもまた提供される。本明細書はまた、本明細書のＴＣＲおよびペプチドを発現するための核酸、ベクター、および宿主細胞；そしてそれを使用する方法にも関する。

【0251】

「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲと略記される）という用語は、αポリペプチド鎖（α鎖）およびａβポリペプチド鎖（β鎖）を含んでなるヘテロ二量体分子を指し、ヘテロ二量体受容体は、ＨＬＡ分子によって提示されるペプチド抗原と結合できる。本用語は、いわゆるγ／δＴＣＲもまた含む。

【0252】

一実施形態では、本明細書は、本明細書に記載されるようなＴＣＲを製造する方法を提供し、方法は、ＴＣＲの発現を促進するのに適した条件下でＴＣＲを発現できる、宿主細胞を培養するステップを含んでなる。

【0253】

別の態様における説明は、十分な量の抗原を抗原提示細胞に接触させることで、適切な抗原提示細胞または人工抗原提示細胞の表面に発現されるクラスＩまたはＩＩ ＭＨＣ分子上に抗原が負荷され、または抗原／クラスＩまたはＩＩ ＭＨＣ複合体モノマーを四量体化することで、クラスＩまたはＩＩ ＭＨＣ四量体上に抗原が負荷される、本明細書に記載の方法に関する。

【0254】

α／βＴＣＲのαおよびβ鎖、そしてγ／δＴＣＲのγおよびδ鎖は、一般にそれぞれ２つの「領域」、すなわち可変および定常領域を有すると見なされる。可変領域は、可変領域（Ｖ）の連結と、連結領域（Ｊ）とからなる。可変領域はまた、リーダー領域（Ｌ）を含んでもよい。βおよびδ鎖はまた、多様性領域（Ｄ）を含んでもよい。αおよびβ定常領域はまた、αおよびβ鎖を細胞膜に固着させるＣ末端膜貫通（ＴＭ）領域を含んでもよい。

【0255】

γ／δＴＣＲに関して、「ＴＣＲγ可変領域」という用語は、本明細書の用法ではリーダー領域（Ｌ）のないＴＣＲγＶ（ＴＲＧＶ）領域とＴＣＲγＪ（ＴＲＧＪ）領域との連結を指し、ＴＣＲγ定常領域という用語は、細胞外ＴＲＧＣ領域を指し、またはＣ末端切断型ＴＲＧＣ配列を指す同様に「ＴＣＲδ可変領域」という用語は、リーダー領域（Ｌ）のないＴＣＲδＶ（ＴＲＤＶ）領域とＴＣＲδＤ／Ｊ（ＴＲＤＤ／ＴＲＤＪ）領域との連結を指し、「ＴＣＲδ定常領域」という用語は、細胞外ＴＲＤＣ領域を指し、またはＣ末端切断型ＴＲＤＣ配列を指す。

【0256】

本明細書のＴＣＲは、好ましくは、約１μＭ以下、約００１μＭ以下、約２５μＭ以下、または約１０μＭ以下の結合親和性（ＫＤ）で、ＨＡＶＣＲ１－００１ペプチド－ＨＬＡ分子複合体に結合する。より好ましいのは、約１μＭ以下、約１００ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下の結合親和性を有する、高親和性ＴＣＲである。本発明のＴＣＲの好ましい結合親和性範囲の非限定的例としては、約１ｎＭ～約１０ｎＭ；約１０ｎＭ～約２０ｎＭ；約２０ｎＭ～約３０ｎＭ；約３０ｎＭ～約４０ｎＭ；約４０ｎＭ～約５０ｎＭ；約５０ｎＭ～約６０ｎＭ；約６０ｎＭ～約７０ｎＭ；約７０ｎＭ～約８０ｎＭ；約８０ｎＭ～約９０ｎＭ；および約９０ｎＭ～約１００ｎＭが挙げられる。

【0257】

本明細書の用法では、本明細書のＴＣＲとの関連で、「特異的結合」およびそれらの文法的変種は、ＨＡＶＣＲ１－００１ペプチド－ＨＬＡ分子複合体に対して、１μＭ以下の結合親和性（ＫＤ）を有するＴＣＲを意味するために使用される。

【0258】

本明細書のα／βヘテロ二量体ＴＣＲは、それらの定常領域の間に導入された、ジスルフィド結合を有してもよい。このタイプの好ましいＴＣＲとしては、ＴＲＡＣ定常領域配列とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常領域配列とを有するものが挙げられるが、ただし、ＴＲＡＣのＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のＳｅｒ５７は、システイン残基によって置換されており、前記システインは、ＴＣＲのＴＲＡＣ定常領域配列とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常領域配列との間に、ジスルフィド結合を形成する。

【0259】

上述の導入された鎖間結合の存在下または不在下で、本明細書のα／βヘテロ二量体ＴＣＲは、ＴＲＡＣ定常領域配列とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常領域配列とを有してもよく、ＴＣＲのＴＲＡＣ定常領域配列と、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常領域配列とが、ＴＲＡＣのエクソン２のＣｙｓ４と、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のエクソン２のＣｙｓ２との間の天然ジスルフィド結合によって連結されてもよい。

【0260】

本明細書のＴＣＲは、放射性核種、フルオロフォア、およびビオチンからなる群から選択される、検出可能な標識を含んでなってもよい。本明細書のＴＣＲは、放射性核種、化学療法剤、または毒素などの治療的活性薬剤にコンジュゲートされてもよい。

【0261】

一実施形態では、α鎖に少なくとも１つの変異を有し、および／またはβ鎖に少なくとも１つの変異を有する本明細書のＴＣＲは、非変異ＴＣＲと比較して修飾されたグリコシル化を有する。

【0262】

一実施形態では、ＴＣＲα鎖および／またはＴＣＲβ鎖に少なくとも１つの変異を含んでなるＴＣＲは、ＨＡＶＣＲ１－００１ペプチド－ＨＬＡ分子複合体に対して、非変異ＴＣＲα鎖および／または非変異ＴＣＲβ鎖を含んでなるＴＣＲの少なくとも倍の結合親和性および／または結合半減期を有する。腫瘍特異的ＴＣＲの親和性増強とその利用は、最適ＴＣＲ親和性のウィンドウの存在に依存する。このようなウィンドウの存在は、ＨＬＡ－Ａ２拘束性病原体に対して特異的なＴＣＲが、ＨＬＡ－Ａ２拘束性腫瘍関連自己抗原に対して特異的なＴＣＲと比較して、一般に約１０分の１のＫＤ値を有するという観察に基づく。腫瘍抗原は免疫原性である可能性を有するが、腫瘍は個人自身の細胞から生じるので、改変された翻訳プロセッシングのある変異型タンパク質またはタンパク質のみが、免疫系によって異質と見なされることが今や知られている。上方制御されまたは過剰発現される抗原（いわゆる自己抗原）は、腫瘍に対する機能性免疫応答を必ずしも誘導しない。これらの抗原に対して高度に反応性のＴＣＲを発現するＴ細胞は、中枢性免疫寛容として知られている過程、すなわち自己抗原に対する低親和性ＴＣＲを有するＴ細胞のみが残留する過程によって、胸腺において負選択される。したがって、ＨＡＶＣＲ１－００１に対する本明細書のＴＣＲまたは変異体の親和性は、当技術分野で周知の方法によって高め得る。

【0263】

本明細書は、本明細書に従ってＴＣＲを同定し単離する方法にさらに関し、前記方法は、ＨＬＡ－Ａ＊０２陰性健常ドナーからのＰＢＭＣをＡ２／ＨＡＶＣＲ１－００１Ａ２と共にインキュベートするステップと、ＰＢＭＣを四量体フィコエリトリン（ＰＥ）と共にインキュベートするステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。

【0264】

本明細書は、本明細書に従ってＴＣＲを同定し単離する方法にさらに関し、前記方法は、そのＴ細胞がマウスＴＣＲ欠損を補償する多様なヒトＴＣＲレパートリーを発現する、全ヒトＴＣＲαβ遺伝子遺伝子座（１．１および０．７Ｍｂ）を有する遺伝子組換えマウスを得るステップと、マウスをＨＡＶＣＲ１－００１で免疫化するステップと、四量体フィコエリトリン（ＰＥ）を有する遺伝子組換えマウスから得られたＰＢＭＣをインキュベートするステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。

【0265】

一態様では、本明細書のＴＣＲを発現するＴ細胞を得るために、本明細書のＴＣＲ－αおよび／またはＴＣＲ－β鎖をコードする核酸が、γレトロウイルスまたはレンチウイルスなどの発現ベクターにクローン化される。組換えウイルスが生成され、次に、抗原特異性および機能性結合活性などの機能について試験される。次に、最終生成物のアリコートを使用して、標的Ｔ細胞集団（一般に患者のＰＢＭＣから精製される）が形質導入され、それは患者への輸液前に増殖される。

【0266】

別の態様では、本明細書のＴＣＲを発現するＴ細胞を得るために、例えば、生体外転写システムなどの当該技術分野で公知の技術によって、ＴＣＲ ＲＮＡが合成される。次に生体外で合成されたＴＣＲ ＲＮＡは、健常ドナーから得られた原発性ＣＤ８＋Ｔ細胞内に電気穿孔によって導入され、腫瘍特異的ＴＣＲ－αおよび／またはＴＣＲ－β鎖が再発現される。

【0267】

発現を増加させるために、本明細書のＴＣＲをコードする核酸は、レトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）Ｕ３、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、β－アクチン、ユビキチン、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）／ＣＤ４３複合プロモーター、伸長因子（ＥＦ）－１ａ、および脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーターなどの強力なプロモーターと作動可能に連結されてもよい。好ましい実施形態では、プロモーターは、発現される核酸に対して異種である。

【0268】

強力なプロモーターに加えて、本明細書のＴＣＲ発現カセットは、レンチウイルスコンストラクトの核転座を促進する、中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）（Ｆｏｌｌｅｎｚｉ ｅｔ ａｌ．，２０００）、およびＲＮＡ安定性を増加させることで導入遺伝子発現のレベルを増加させる、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ｗＰＲＥ）（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９）をはじめとする導入遺伝子発現を高め得る追加的な要素を含有してもよい。

【0269】

本発明のＴＣＲのαおよびβ鎖は、別々のベクターにある核酸によってコードされてもよく、または同一ベクターにあるポリヌクレオチドによってコードされてもよい。

【0270】

高レベルのＴＣＲ表面発現の達成には、導入されたＴＣＲのＴＣＲ－αおよびＴＣＲ－β鎖の双方が、高レベルで転写される必要がある。これを行うために、本明細書のＴＣＲ－αおよびＴＣＲ－β鎖は、この障害を克服できることが示されている、単一ベクター内のバイシストロニックコンストラクトにクローン化されてもよい。ＴＣＲ－αおよびＴＣＲ－β鎖は、翻訳中に２つのタンパク質に分かれて等モル比のＴＣＲ－αおよびＴＣＲ－β鎖の生成を確実にする単一転写物から生成されるので、ＴＣＲ－α鎖とＴＣＲ－β鎖との間のウイルス配列内リボソーム進入部位の使用は、双方の鎖の協調発現をもたらす（Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．２００９）。

【0271】

本明細書のＴＣＲをコードする核酸はコドン最適化されて、宿主細胞からの発現が増加されてもよい。遺伝コードの重複は、いくつかのアミノ酸が２つ以上のコドンによってコードされるようにするが、特定のコドンは、適合ｔＲＮＡの相対可用性ならびにその他の要因のために、他のものよりも「最適」でない（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）。各アミノ酸が、哺乳類遺伝子発現のための最適コドンによってコードされるように、ＴＣＲ－αおよびＴＣＲ－β遺伝子配列を修飾すること、ならびにｍＲＮＡ不安定モチーフまたは潜在的なスプライス部位を除去することは、ＴＣＲ－αおよびＴＣＲ－β遺伝子発現を有意に高めることが示されている（Ｓｃｈｏｌｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。

【0272】

さらに、導入ＴＣＲ鎖と内因性ＴＣＲ鎖との間の誤対合は、自己免疫の重大なリスクをもたらす特異性の獲得を引き起こすこともある。例えば、混合ＴＣＲ二量体の形成は、適切に対合するＴＣＲ複合体を形成するために利用できるＣＤ３分子の数を減少させてもよく、ひいては導入ＴＣＲを発現する細胞の機能性結合活性を有意に低下させ得る（Ｋｕｂａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００７）。

【0273】

誤対合を減少させるために、本明細書の導入ＴＣＲ鎖のＣ末端領域は、鎖間親和性を高める一方で、導入鎖が内因性ＴＣＲと対形成する能力を低下させるために、修飾されてもよい。これらのストラテジーは、ヒトＴＣＲ－αおよびＴＣＲ－βのＣ末端領域をそれらのマウス対応物（マウス化Ｃ末端領域）で置換する；導入ＴＣＲのＴＣＲ－αおよびＴＣＲ－β鎖の双方に第２のシステイン残基を導入することで、Ｃ末端領域に第２の鎖間ジスルフィド結合を生成する（システイン修飾）；ＴＣＲ－αおよびＴＣＲ－β鎖Ｃ末端領域内の相互作用残基を交換する（「ノブ・イン・ホール」）；そしてＴＣＲ－αおよびＴＣＲ－β鎖の可変領域をＣＤ３ζに直接融合させる（ＣＤ３ζ融合）ことを含んでもよい。（Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．２００９）。

【0274】

一実施形態では、宿主細胞は、本細書のＴＣＲを発現するように遺伝子操作される。好ましい実施形態では、宿主細胞は、ヒトＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞は、がん患者から得られる。その他の実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞は、健常ドナーから得られる。本明細書の宿主細胞は、治療される患者に関して、同種異系または自己由来であり得る。一実施形態では、宿主は、α／βＴＣＲを発現するように形質転換されたγ／δＴ細胞である。

【0275】

「医薬組成物」は、医学的状況においてヒトへの投与に適する組成物である。好ましくは、医薬組成物は無菌であり、ＧＭＰガイドラインに準拠して製造される。

【0276】

医薬組成物は、遊離形態または薬学的に許容可能な塩の形態のどちらかのペプチドを含んでなる（上記もまた参照されたい）。本明細書の用法では、「薬学的に許容可能な塩」は、開示されたペプチドの誘導体を指し、ペプチドは、薬剤の酸性または塩基性塩を生成することで修飾される。例えば、酸性塩は、適切な酸との反応を伴って、遊離塩基から調製される（典型的に、薬剤の中性形態が中性ＮＨ２基を有する）。酸性塩を調製するための適切な酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸などの有機酸、ならびに例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸リン酸などの無機酸の双方が挙げられる。逆に、ペプチド上に存在してもよい酸部分の塩基性塩の調製物は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、トリメチルアミンなどの薬学的に許容可能な塩基を使用して調製される。

【0277】

特に好ましい一実施形態では、医薬組成物は、酢酸（酢酸塩）、トリフルオロ酢酸または塩酸（塩化物）の塩としてのペプチドを含んでなる。

【0278】

好ましくは、本発明の薬剤は、ワクチンなどの免疫療法剤である。それは、患者に直接、罹患臓器に、または全身的に、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．、およびｉ．ｖ．投与され、または生体外で患者またはヒト細胞株に由来する細胞に適用されて、それが引き続いて患者に投与され、または生体外で使用されて患者に由来する免疫細胞の亜集団が選択され、次にそれが患者に再投与されてもよい。核酸が、生体外で細胞に投与される場合、インターロイキン２などの免疫刺激サイトカインを同時発現させるように、細胞を形質移入することが有用であってもよい。ペプチドは、実質的に純粋であり、または免疫刺激アジュバント（下記参照）と組み合わされ、または免疫賦活性サイトカインと組み合わせて使用され、または例えば、リポソームなどの適切な送達系によって投与されてもよい。ペプチドはまた、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）またはマンナンなどの適切な担体に共役されてもよい（国際公開第９５／１８１４５号パンフレットおよび（Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）を参照されたい）。ペプチドはまた、標識されてもよく、融合タンパク質であってもよく、またはハイブリッド分子であってもよい。その配列が本発明に記載されるペプチドは、ＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞を刺激することが予測される。しかし、ＣＤ８ Ｔ細胞の刺激は、ＣＤ４ Ｔヘルパー細胞によって提供される援助の存在下で、より効率的である。したがって、ＣＤ８ Ｔ細胞を刺激するＭＨＣクラスＩエピトープでは、ハイブリッド分子の融合パートナーまたはセクションは、適切にはＣＤ４陽性Ｔ細胞を刺激するエピトープを提供する。ＣＤ４およびＣＤ８刺激エピトープは、当該技術分野で周知であり、本発明で同定されたものが挙げられる。

【0279】

一態様では、ワクチンは、配列番号１～配列番号９３に記載されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドと、少なくとも１つの追加的なペプチド、好ましくは２～５０、より好ましくは２～２５、なおもより好ましくは２～２０、最も好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８個のペプチドとを含んでなる。ペプチドは、１つまたは複数の特異的ＴＡＡから誘導されてもよく、ＭＨＣクラスＩ分子に結合してもよい。

【0280】

本発明のさらなる態様は、本発明のペプチドまたはペプチド変異体をエンコードする核酸（例えばポリヌクレオチド）を提供する。ポリヌクレオチドは、それがペプチドをコードしさえすれば、例えば、単鎖および／または二本鎖のいずれかのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせであってもよく、または例えばホスホロチオエート主鎖を有するポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドの未変性または安定化形態であってもよく、それはイントロンを含有してもまたはしなくてもよい。もちろん、天然起源ペプチド結合によって連結する天然アミノ酸残基を含有するペプチドのみが、ポリヌクレオチドによってエンコードされ得る。本発明のなおもさらなる態様は、本発明によるポリペプチドを発現できる発現ベクターを提供する。

【0281】

例えば相補的付着端を通じて、ポリヌクレオチド、特にＤＮＡをベクターに連結する、多様な方法が開発されている。例えば、ベクターＤＮＡに挿入されるＤＮＡ断片に、相補的ホモポリマー配列が付加され得る。次に、相補的ホモポリマー尾部間の水素結合によって、ベクターおよびＤＮＡ断片が連結されて組換えＤＮＡ分子が形成する。

【0282】

１つまたは複数の制限酵素認識部位を含有する合成リンカーは、ＤＮＡ断片をベクターに連結する代替え方法を提供する。多様な制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＮ，ＵＳＡをはじめとするいくつかの供給元から商業的に入手できる。

【0283】

本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを修飾する望ましい方法は、Ｓａｉｋｉ ＲＫ，ｅｔ ａｌ．（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８）で開示されるようなポリメラーゼ連鎖反応を用いる。この方法は、例えば、適切な制限酵素認識部位を改変することで、ＤＮＡを適切なベクターに導入するために使用されてもよく、またはそれは、当該技術分野で既知のその他の有用な様式でＤＮＡを修飾するために使用されてもよい。ウイルスベクターを使用するのであれば、ポックスウイルスまたはアデノウイルスベクターが好ましい。

【0284】

次にＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）を適切な宿主において発現させ、本発明のペプチドまたは変異体を含んでなるポリペプチドが製造されてもよい。このようにして、本明細書に含まれる教示を考慮して適切に修正された既知の技術に従って、本発明のペプチドまたは変異体をコードするＤＮＡを使用して、発現ベクターが構築されてもよく、次にそれを使用して、本発明のポリペプチドの発現および製造のために、適切な宿主細胞が形質転換される。このような技術としては、例えば、米国特許第４，４４０，８５９号明細書、米国特許第４，５３０，９０１号明細書、米国特許第４，５８２，８００号明細書、米国特許第４，６７７，０６３号明細書、米国特許第４，６７８，７５１号明細書、米国特許第４，７０４，３６２号明細書、米国特許第４，７１０，４６３号明細書、米国特許第４，７５７，００６号明細書、米国特許第４，７６６，０７５号明細書、および米国特許第４，８１０，６４８号明細書で開示されるものが挙げられる。

【0285】

本発明の化合物を構成するポリペプチドをエンコードするＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）は、適切な宿主への導入のために、多種多様なその他のＤＮＡ配列に連結されてもよい。コンパニオンＤＮＡは、宿主の性質、ＤＮＡの宿主への導入様式、およびエピソームの維持または組み込みが所望されるかどうかに左右される。

【0286】

一般に、ＤＮＡは、発現のための適切な方向および正しい読み枠で、プラスミドなどの発現ベクターに挿入される。必要ならば、ＤＮＡは、所望の宿主によって認識される適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結されてもよいが、このような制御は、一般に発現ベクター中で利用できる。次に、標準的な技術を通じて、ベクターが宿主に導入される。一般に、全ての宿主がベクターによって形質転換されるわけではない。したがって、形質転換された宿主細胞を選択することが必要になる。一選択技術は、抗生物質耐性などの形質転換細胞内で選択可能な形質をコードする、任意の必要な制御因子を有するＤＮＡ配列を発現ベクター内に組み込むことを伴う。

【0287】

代案としては、このような選択可能な形質の遺伝子は、所望の宿主細胞を同時形質転換するのに使用される、別のベクター上にあり得る。

【0288】

次に、本明細書で開示される教示を考慮して、当業者に知られている適切な条件下で十分な時間にわたり、本発明の組換えＤＮＡによって形質転換された宿主細胞が培養されてポリペプチドが発現され、次にそれが回収れされ得る。

【0289】

細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酵母（例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌（例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、植物細胞、動物細胞、および昆虫細胞をはじめとする多数の発現系が知られている。好ましくは、発現系は、ＡＴＣＣ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手できるＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞であり得る。

【0290】

構成的発現のための典型的な哺乳類細胞ベクタープラスミドは、適切なポリＡ尾部と、ネオマイシンなどの耐性マーカーとを有する、ＣＭＶまたはＳＶ４０プロモーターを含んでなる。一例は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡから入手できるｐＳＶＬである。誘導性哺乳類発現ベクターの一例であるｐＭＳＧもまた、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手できる。有用な酵母プラスミドベクターは、ｐＲＳ４０３－４０６およびｐＲＳ４１３－４１６であり、通常、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ９２０３７，ＵＳＡから入手できる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、およびｐＲＳ４０６は、酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐｓ）であり、酵母の選択可能なマーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、およびＵＲＡ３が組み込まれている。プラスミドｐＲＳ４１３－４１６は、酵母セントロメアプラスミド（Ｙｃｐｓ）である。ＣＭＶプロモーターベースのベクター（例えばＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）は、一過性または安定性発現、細胞質内発現または分泌、およびＦＲＡＧ、３ｘＦＬＡＧ、ｃ－ｍｙｃまたはＭＡＴの様々な組み合わせでのＮ末端またはＣ末端標識付けを提供する。これらの融合タンパク質は、組換えタンパク質を検出、精製、および分析できるようにする。二重標識融合物は、検出に融通性を与える。

【0291】

強力なヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター調節領域は、ＣＯＳ細胞において、構成タンパク質発現レベルを１ｍｇ／Ｌ程度の高さに駆動する。効力がより低い細胞株では、タンパク質レベルは、典型的に約０．１ｍｇ／Ｌである。ＳＶ４０複製起点の存在は、ＳＶ４０複製許容ＣＯＳ細胞における高レベルのＤＮＡ複製をもたらす。ＣＭＶベクターは、例えば、細菌細胞におけるｐＭＢ１（ｐＢＲ３２２の誘導体）複製起点、細菌におけるアンピシリン耐性選択のためのｂ－ラクタマーゼ遺伝子、ｈＧＨポリＡ、およびｆ１起点を含有し得る。プレプロトリプシンリーダー（ＰＰＴ）配列を含有するベクターは、抗ＦＲＡＧ抗体、樹脂、およびプレートを使用した精製のために、培養液中へのＦＲＡＧ融合タンパク質分泌を誘導し得る。多様な宿主細胞において使用するためのその他のベクターおよび発現系が、当該技術分野で周知である。

【0292】

別の実施形態では、本発明の２つ以上のペプチドまたはペプチド変異型がコードされ、したがって順次発現される（「数珠玉構造」コンストラクトに類似する）。その際に、ペプチドまたはペプチド変異型は、例えばＬＬＬＬＬＬなどの一続きのリンカーアミノ酸によって、共に連結または融合されてもよく、またはそれらの間のいかなる追加的なペプチドもなしに連結されてもよい。これらのコンストラクトはまた、がん療法のために使用され得て、ＭＨＣ ＩとＭＨＣ ＩＩの双方が関与する免疫応答を誘導してもよい。

【0293】

本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドベクターコンストラクトで形質転換された宿主細胞にも関する。宿主細胞は、原核または真核生物のどちらかであり得る。細菌細胞は、いくつかの状況では、好ましい原核宿主細胞であってもよく、典型的には、例えば、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡから入手できる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５株、および米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡから入手できるＲＲ１（ＡＴＣＣ番号３１３４３）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。好ましい真核宿主細胞としては、酵母、昆虫、および哺乳類細胞、好ましくはマウス、ラット、サルまたはヒト線維芽および結腸細胞株に由来するものなどの脊椎動物細胞が挙げられる。酵母宿主細胞としては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ９２０３７，ＵＳＡから一般に入手できる、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００、およびＹＰＨ５０１が挙げられる。好ましい哺乳類宿主細胞としては、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手できるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手できるＮＩＨ Ｓｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５０として入手できるサル腎臓由来ＣＯＳ－１細胞、およびヒト胎児由来腎細胞である２９３細胞が挙げられる。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現ベクターで形質移入され得るＳｆ９細胞である。発現のための適切な宿主細胞の選択に関する概説は、例えば、Ｐａｕｌｉｎａ ＢａｌｂａｓおよびＡｒｇｅｌｉａ Ｌｏｒｅｎｃｅの教科書”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｒｅｖｉｅｗｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”Ｐａｒｔ Ｏｎｅ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ ９７８－１－５８８２９－２６２－９、および当業者に知られているその他の文献にある。

【0294】

本発明のＤＮＡコンストラクトによる適切な細胞宿主の形質転換は、典型的に使用されるベクターのタイプに左右される周知の方法によって達成される。原核宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９７２）および（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２）を参照されたい。酵母細胞の形質転換は、Ｓｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｓｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６）に記載される。Ｂｅｇｇｓ（Ｂｅｇｇｓ，１９７８）の方法もまた有用である。脊椎動物細胞に関しては、このような細胞を形質移入するのに有用な、例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ－デキストランまたはリポソーム製剤などの試薬が、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｏｒ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ ２０８７７，ＵＳＡから入手できる。電気穿孔もまた、細胞を形質転換および／または形質移入するのに有用であり、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、および脊椎動物細胞を形質転換する技術分野で周知である。

【0295】

成功裏に形質転換された細胞、すなわち本発明のＤＮＡコンストラクトを含有する細胞は、ＰＣＲなどの周知の技術によって同定され得る。代案としては、抗体を使用して、上清中のタンパク質の存在が検出され得る。

【0296】

例えば、細菌、酵母、および昆虫細胞などの本発明の特定の宿主細胞は、本発明のペプチドの調製において有用であることが理解されるであろう。しかしその他の宿主細胞が、特定の治療法において有用であってもよい。例えば、樹状細胞などの抗原提示細胞は、それらが適切なＭＨＣ分子中に負荷されてもよいように、本発明のペプチドを発現するために有用に使用されてもよい。したがって、本発明は、本発明による核酸または発現ベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。

【0297】

好ましい実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞または抗原提示細胞である。前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）を含有する組換え融合タンパク質が負荷されたＡＰＣは、無症候性または微小症候性転移性ＨＲＰＣを治療するために、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって２０１０年４月２０日に認可された（シプロイセルＴ）（Ｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｓｍａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００６）。

【0298】

本発明のさらなる態様は、宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる。ペプチドまたはその変異型を製造する方法を提供する。

【0299】

別の実施形態では、本発明のペプチド、核酸または発現ベクターは、医療において使用される。例えば、ペプチドまたはその変異体は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射のために調合されてもよい。ペプチド注射の好ましい方法としては、ｓ．ｃ．、ｉ．ｄ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、およびｉ．ｖ．が挙げられる。ＤＮＡ注射の好ましい方法としては、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．、およびｉ．ｖ．が挙げられる。例えば、５０μｇ～１．５ｍｇ、好ましくは１２５μｇ～５００μｇのペプチドまたはＤＮＡの用量が投与されてもよく、それぞれのペプチドまたはＤＮＡに左右される。この範囲の用量は、以前の治験で成功裏に使用された（Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。

【0300】

活性ワクチン接種のために使用されるポリヌクレオチドは、実質的に純粋であってもよく、または適切なベクターまたは送達系に含有されてもよい。核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせであってもよい。このような核酸をデザインして導入する方法は、当該技術分野で周知である。概説は、例えば、Ｔｅｕｆｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｔｅｕｆｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００５）によって提供される。ポリヌクレオチドワクチンは調製が容易であるが、免疫応答誘導におけるこれらのベクターの作用機序は、完全には分かっていない。適切なベクターおよび送達系としては、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、または２つ以上のウイルスの構成要素を含有するハイブリッドベースのシステムなどのウイルスＤＮＡおよび／またはＲＮＡが挙げられる。非ウイルス送達系としては、カチオン性脂質およびカチオン性ポリマーが挙げられ、ＤＮＡ送達技術分野において周知である。「遺伝子銃」などを通じた物理的送達もまた、使用されてもよい。核酸によってコードされるペプチド（単数）またはペプチド（複数）は、例えば、上述のように、それぞれの逆ＣＤＲのＴ細胞を刺激する、エピトープとの融合タンパク質であってもよい。

【0301】

本発明の薬剤は、１つまたは複数のアジュバントもまた含んでもよい。アジュバントは、免疫応答（例えば、ＣＤ８陽性Ｔ細胞およびヘルパーＴ（ＴＨ）細胞によって媒介される抗原に対する免疫応答を非特異的に促進または増強する物質であり、したがって本発明の薬剤中で有用であると見なされる。適切なアジュバントとしては、１０１８ ＩＳＳ、アルミニウム塩、ＡＭＰＬＩＶＡＸ（登録商標）、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、フラジェリンまたはフラジェリン由来ＴＬＲ５リガンド、ＦＬＴ３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド（ＡＬＤＡＲＡ（登録商標））、レシキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、ＩＬ－２やＬ－１３やＩＬ－２１などのインターロイキン、インターフェロン－αまたは－βまたはそれらのＰＥＧ化誘導体、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＩＳＣＯＭ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ（登録商標）、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＡＬＰ２、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、モンタニドＩＭＳ１３１２、モンタニドＩＳＡ２０６、モンタニドＩＳＡ５０Ｖ、モンタニドＩＳＡ－５１、油中水型および水中油型エマルション、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＯｓｐＡ、ＰｅｐＴｅｌ（登録商標）ベクター系、ポリ（ラクチドコグリコリド）［ＰＬＧ］ベースおよびデキストラン微粒子、タラクトフェリンＳＲＬ１７２、ビロソームおよびその他のウイルス様粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、β－グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、サポニンに由来するＡｑｕｉｌａ’ｓ ＱＳ２１ ｓｔｉｍｕｌｏｎ、マイコバクテリア抽出物および合成細菌細胞壁模倣体、およびＲｉｂｉ’ｓ ＤｅｔｏｘまたはＱｕｉｌまたはＳｕｐｅｒｆｏｓなどのその他の独自仕様の補助剤が挙げられるが、これに限定されるものではない。フロイントまたはＧＭ－ＣＳＦなどのアジュバントが好ましい。樹状細胞およびそれらの調製物に対して特異的な、いくつかの免疫学的アジュバント（例えばＭＦ５９）が、以前記載されている（Ａｌｌｉｓｏｎ ａｎｄ Ｋｒｕｍｍｅｌ，１９９５）。サイトカインもまた使用されてもよい。数種のサイトカインは、樹状細胞のリンパ組織（例えばＴＮＦ－）への移動に影響を与えること、Ｔリンパ球（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１、およびＩＬ－４）のための効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟を加速すること（その内容全体が参照により本明細書に具体的に援用される、米国特許第５，８４９，５８９号明細書）、および免疫増強剤（例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２３、ＩＬ－７、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β）として作用することと、直接関連付けられている（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。

【0302】

ＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドもまた、ワクチン環境において、アジュバント効果を増強することが報告されている。理論により拘束されることなく、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、主にＴＬＲ９を通じた、内在的（非適応性）免疫系の活性化によって作用する。ＣｐＧ誘導性ＴＬＲ９活性化は、ペプチドまたはタンパク質抗原、生きたまたは死滅ウイルス、樹状細胞ワクチン、自己細胞ワクチン、そして予防的および治療的ワクチンの双方における多糖コンジュゲートをはじめとする多種多様な抗原に対する、抗原特異的体液性および細胞性応答を増強する。より重要なことには、それは樹状細胞の成熟と分化を増強し、ＣＤ４ Ｔ細胞援助の不在下であってさえも、ＴＨ１細胞の活性化の促進、および強力な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）生成をもたらす。ＴＬＲ９刺激によって誘導されるＴＨ１バイアスは、通常はＴＨ２バイアスを促進するミョウバンまたは不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）などのワクチンアジュバント存在下であってさえも、維持される。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、その他のアジュバントと調合されまたは同時投与された際に、または微粒子、ナノ粒子、脂質エマルションなどの配合物、または類似配合物中で、なおもより高いアジュバント活性を示し、それは、抗原が比較的弱い場合、強力な応答を誘導するのに特に必要である。それらは免疫応答もまた加速し、いくつかの実験では、ＣｐＧなしのワクチン総量と同等の抗体応答で、抗原用量のほぼ２桁分の低減を可能にする（Ｋｒｉｅｇ，２００６）。米国特許第６，４０６，７０５Ｂ１号明細書は、抗原特異的免疫応答を誘導するためのＣｐＧオリゴヌクレオチド、非核酸アジュバント、および抗原の併用を記載する。ＣｐＧ ＴＬＲ９拮抗薬は、本発明の医薬組成物の好ましい構成要素である、Ｍｏｌｏｇｅｎ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製のｄＳＬＩＭ（二重ステムループ免疫調節剤）である。ＲＮＡ結合ＴＬＲ７、ＴＬＲ８および／またはＴＬＲ９などのその他のＴＬＲ結合分子もまた、使用されてもよい。

【0303】

有用なアジュバントその他の例としては、化学修飾ＣｐＧ（例えば、ＣｐＲ、Ｉｄｅｒａ）；ポリ（Ｉ：Ｃ）などのｄｓＲＮＡアナログおよびそれらの誘導体（例えばＡｍｐｌｉＧｅｎ（登録商標）、Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）、ポリ（ＩＣＬＣ）、ポリ（ＩＣ－Ｒ）、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）、非ＣｐＧ細菌ＤＮＡまたはＲＮＡ；ならびにシクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ（登録商標）、セレブレックス、ＮＣＸ－４０１６、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフェニブ、テモゾロマイド、テムシロリムス、ＸＬ－９９９、ＣＰ－５４７６３２、パゾパニブ、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ、ＺＤ２１７１、ＡＺＤ２１７１、抗ＣＴＬＡ４などの免疫活性小型分子および抗体；免疫系の重要な構造体を標的にするその他の抗体（例えば、抗ＣＤ４０、抗ＴＧＦβ、抗ＴＮＦα受容体）；ＳＣ５８１７５が挙げられるが、これに限定されるものではなく、これらは治療的におよび／またはアジュバントとして作用してもよい。本発明の文脈で有用なアジュバントおよび添加剤の量と濃度は、過度の実験を実施することなく、当業者によって容易に判定され得る。

【0304】

好ましいアジュバントは、抗ＣＤ４０、イミキモド、レシキモド、ＧＭ－ＣＳＦ、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、インターフェロンα、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび誘導体、ポリ（Ｉ：Ｃ）および誘導体、ＲＮＡ、シルデナフィル、およびＰＬＧまたはビロソーム微粒子調合物である。

【0305】

本発明による薬剤組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、サルグラモスチム）、シクロホスファミド、イミキモド、レシキモド、およびインターフェロンαなどのコロニー刺激因子からなる群から選択される。

【0306】

本発明による医薬組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、サルグラモスチム）、シクロホスファミド、イミキモド、およびレシキモドなどのコロニー刺激因子からなる群から選択される。本発明による薬剤組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、シクロホスファミド、イミキモドまたはレシキモドである。なおもより好ましいアジュバントは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＭＳ １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ２０、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ－５１、ポリＩＣＬＣ（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標））、および抗ＣＤ４０ｍＡＢまたはそれらの組み合わせである。

【0307】

この組成物は、皮下、皮内、筋肉内などの非経口投与、または経口投与のために使用される。このためには、ペプチドおよび任意選択的にその他の分子が、薬学的に許容可能な、好ましくは水性担体に溶解され、または懸濁される。さらに組成物は、緩衝液、結合剤、ブラスチング剤、希釈剤、風味、潤滑剤などの賦形剤を含有し得る。ペプチドはまた、サイトカインなどの免疫刺激物質と共に投与され得る。このような組成物中で使用され得る賦形剤の詳細な一覧は、例えば、Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（Ｋｉｂｂｅ，２０００）から採用され得る。組成物は、腺腫様またはがん性疾患の阻止、予防法および／または治療法のために使用され得る。例示的調合物は、例えば、欧州特許第２１１２２５３号明細書にある。

【0308】

本発明によるワクチンによって引き起こされる免疫応答は、異なる細胞分裂期および異なる発生段階のがんを攻撃することを理解することが重要である。さらに、異なるがん関連シグナル伝達経路が攻撃される。これは、１つまたは少数の標的のみに対処して、攻撃に対する腫瘍の容易な適応（腫瘍エスケープ）を引き起こすこともある、ワクチンに優る利点である。さらに個々の腫瘍の全てが、同一パターンの抗原を発現するとは限らない。したがって、いくつかの腫瘍関連ペプチドの組み合わせによって、ありとあらゆる腫瘍が標的の少なくとも一部を有することが確実になる。組成物は、それぞれの腫瘍が抗原のいくつかを発現することを予期して設計され、腫瘍の増殖と維持に必要ないくつかの独立した経路をカバーする。したがって、ワクチンは、より大きな患者集団のために、容易に「出来合」で使用され得る。これは、ワクチンで治療される患者の予備選択が、ＨＬＡタイピングに限定され得て、抗原発現に関する任意の追加的なバイオマーカーアセスメントを必要としないことを意味するが、いくつかの標的が誘導免疫応答によって同時に攻撃されることはなおも確実であり、これは有効性にとって重要である（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。

【0309】

本明細書の用法では、「スキャフォールド」という用語は、（例えば、抗原性）決定因子に特異的に結合する分子を指す。一実施形態では、スキャフォールドはまた、それが付着する実体（例えば、（第２の）抗原結合部分）を例えば、抗原決定基（例えば本出願書に記載のペプチドとＭＨＣの複合体）を有する特異的腫瘍細胞または腫瘍間質などの型標的部位に誘導できる。別の実施形態では、キャフォールドは、例えば、Ｔ細胞受容体複合体抗原などのその標的抗原を介して、シグナル伝達を活性化できる。スキャフォールドとしては、抗体およびそれらのフラグメント、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含んでなる抗体の抗原結合ドメイン、少なくとも１つのアンキリンリピートモチーフと単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子とを含んでなる結合タンパク質、アプタマー、（可溶性）ＴＣＲ、および同種または自己由来Ｔ細胞などの（改変）細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。分子が標的に結合するスキャフォールドであるかどうかを評価するために、結合アッセイが実施され得る。

【0310】

「特異的」結合は、特異的標的を保有する細胞を殺滅できる活性分子を装備したスキャフォールドが、特異的標的がないがその他のペプチド－ＭＨＣ複合体を提示する別の細胞を殺滅できない程度に、スキャフォールドがその他の天然ペプチド－ＭＨＣ－複合体よりもさらに良好に、目的ペプチド－ＭＨＣ－複合体に結合することを意味する。交差反応性ペプチド－ＭＨＣのペプチドが天然に存在せず、すなわち、ヒトＨＬＡ－ペプチドームに由来しない場合、その他のペプチド－ＭＨＣ複合体への結合は無関係である。標的細胞死滅を評価する試験は、当該技術分野で周知である。それらは、非改変ペプチド－ＭＨＣ提示を有する標的細胞（初代細胞または細胞株）、または天然に存在するペプチド－ＭＨＣレベルに達するようにペプチドを負荷された細胞を使用して、実施されるべきである。

【0311】

各スキャフォールドは標識を含んでなり得て、それは、標識によって提供されるシグナルの存在または不在を判定することで、結合スキャフォールドが検出され得ることを提供する。例えば、スキャフォールドは、蛍光染料または任意のその他の適用可能な細胞マーカー分子で標識され得る。このようなマーカー分子は、当該技術分野で周知である。例えば、蛍光染料によって提供される蛍光標識は、蛍光またはレーザー走査顕微鏡またはフローサイトメトリーによる、結合アプタマーの視覚化を提供し得る。

【0312】

各スキャフォールドは、例えば、ＩＬ－２１、抗－ＣＤ３、抗－ＣＤ２８などの第２の活性分子にコンジュゲートされ得る。

【0313】

ポリペプチドスキャフォールドに関するさらなる情報については、例えば国際公開第２０１４／０７１９７８Ａ１号パンフレットの背景セクション、およびその中で引用された参考文献を参照されたい。

【0314】

本発明は、アプタマーにさらに関する。アプタマー（例えば、国際公開第２０１４／１９１３５９号パンフレット、およびその中で引用される文献を参照されたい）は、短い一本鎖核酸分子であり、それは、所定の三次元構造に折り畳まれて、特異的標的構造体を認識し得る。それらは、標的療法を開発するための適切な代案のようであった。アプタマーは、高い親和性および特異性で、多様な複合体標的と選択的に結合することが示されている。

【0315】

細胞表面に位置する分子を認識するアプタマーは、過去１０年内に同定されており、診断および治療的アプローチを開発する手段を提供する。アプタマーは、毒性および免疫原性がほぼ皆無であることが示されているので、それらは生物医学的用途のための有望な候補である。確かに、例えば、前立腺特異的膜抗原認識アプタマーなどのアプタマーは、標的療法のために成功裏に用いられており、異種移植片生体内モデルにおいて機能できることが示されている。さらに、特異的腫瘍細胞株を認識するアプタマーが同定されている。

【0316】

ＤＮＡアプタマーは、様々ながん細胞、特に固形腫瘍に由来するものに対して広域スペクトル認識特性を示す一方で、非腫瘍発生性および主要健常細胞を認識しないように選択され得る。同定されたアプタマーが、特異的腫瘍サブタイプを認識するだけでなく、むしろ一連の腫瘍と相互作用する場合、これは、アプタマーをいわゆる広域スペクトル診断薬および治療薬として応用可能にする。

【0317】

さらに、フローサイトメトリーによる細胞結合挙動の調査は、アプタマーがナノモル濃度範囲内の非常に良好な見かけの親和性を見せたことを示した。

【0318】

アプタマーは、診断および治療目的で有用である。さらに、アプタマーの一部は腫瘍細胞に取り込まれ、したがって腫瘍細胞内へのｓｉＲＮＡなどの抗がん剤の標的化送達のための分子ビヒクルとして、機能し得ることが示され得た。

【0319】

アプタマーは、細胞ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）技術を使用して、細胞および組織などの複合体標的に対して、および本発明による配列番号１～配列番号９３のいずれかに記載の配列とＭＨＣ分子とを含んでなり、好ましくはそれからなるペプチド複合体などに対して、選択され得る。

【0320】

本発明のペプチドを使用して、ＭＨＣ／ペプチド複合体に対する特異的抗体が生成され、開発され得る。これらは、毒素または放射性物質を患部組織に標的化する治療法のために、使用され得る。これらの抗体の別の用途は、ＰＥＴなどのイメージング目的の放射性核種の患部組織への標的化であり得る。この用途は、小規模な転移の検出、または病的組織の大きさと正確な位置確認の判定を助け得る。

【0321】

したがってＨＬＡ拘束性抗原と複合体化した、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する、組換え抗体を製造する方法を提供することが、本発明のさらなる態様であり、方法は、前記ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩを発現する細胞を含んでなる、遺伝子操作された非ヒト哺乳類を前記ＨＬＡ拘束性抗原と複合体化した可溶性形態のＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子によって免疫化するステップと；ｍＲＮＡ分子を前記非ヒト哺乳類の抗体産生細胞から単離するステップと；前記ｍＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質分子を提示する、ファージディスプレイライブラリーを作製するステップと；少なくとも１つのファージを前記ファージディスプレイライブラリーから単離するステップとを含んでなり、前記少なくとも１つのファージは、前記ＨＬＡ拘束性抗原と複合体化した前記ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する、前記抗体を提示する。

【0322】

ＨＬＡ拘束性抗原と複合体化したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する抗体を提供することも、本発明のさらなる態様であり、その中で抗体は、好ましくは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体および／またはキメラ抗体である。

【0323】

このような抗体および一本鎖クラスＩ主要組織適合性複合体を製造するそれぞれの方法、ならびにこれらの抗体を製造するためのその他のツールは、本発明の目的で、その内容全体が参照により全て明示的に援用される、国際公開第０３／０６８２０１号パンフレット、国際公開第２００４／０８４７９８号パンフレット、国際公開第０１／７２７６８号パンフレット、国際公開第０３／０７０７５２号パンフレット、および文献（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３ａ；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３ｂ；Ｄｅｎｋｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）で開示される。

【0324】

好ましくは、抗体は，２０ナノモル濃度未満、好ましくは１０ナノモル濃度未満の結合親和性で複合体に結合し、それは本発明の文脈で「特異的」とも見なされる。

【0325】

本発明は、配列番号１～配列番号９３からなる群から選択される配列、または配列番号１～配列番号９３と少なくとも８８％相同的な（好ましくは同一の）その変異体を含んでなるペプチド、またはＴ細胞を前記ペプチドと交差反応させるその変異体に関し、前記ペプチドは、基礎となる完全長ポリペプチドでない。

【0326】

本発明は、配列番号１～配列番号９３からなる群から選択される配列、または、配列番号１～配列番号９３と少なくとも８８％相同的な（好ましくは同一の）その変異体を含んでなるペプチドにさらに関し、前記ペプチドまたは変異体は、８～１００、好ましくは８～３０、最も好ましくは８～１４アミノ酸の全長を有する。

【0327】

本発明は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩの分子に結合する能力を有する、本発明によるペプチドにさらに関する。

【0328】

本発明は、ペプチドが、配列番号１～配列番号９３に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる、本発明によるペプチドにさらに関する。

【0329】

本発明は、ペプチドが（化学的に）修飾された、および／または非ペプチド結合を含む、本発明によるペプチドにさらに関する。

【0330】

本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、ペプチドは、融合タンパク質の一部であり、特にＨＬＡ－ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸を含んでなり、またはペプチドは、例えば樹状細胞特異的抗体などの抗体に（またその中に）融合する。

【0331】

本発明の別の実施形態は、非天然ペプチドに関し、前記ペプチドは、配列番号１～配列番号４８に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になり、薬学的に許容可能な塩として合成的に生産される（例えば、合成される）。ペプチドを合成的に生産する方法は、当該技術分野で周知である。生体内で生成されるペプチドは塩でないため、本発明によるペプチドの塩は、ペプチドの生体内での状態と実質的に異なる。ペプチドの非天然塩形態は、特に、ペプチドを含んでなる医薬組成物、例えば、本明細書で開示されるペプチドワクチンなどの文脈で、ペプチドの溶解性を媒介する。治療される対象にペプチドを効率的に提供するためには、ペプチドの十分で少なくとも実質的な溶解性が必要である。好ましくは、塩はペプチドの薬学的に許容可能な塩である。本発明によるこれらの塩としては、ア二オンとしてのＰＯ_４ ^３－、ＳＯ_４ ^２－、ＣＨ_３ＣＯＯ^－、Ｃｌ^－、Ｂｒ^－、ＮＯ^３－、ＣｌＯ^４－、Ｉ^－、ＳＣＮ^－、およびカチオンとしてのＮＨ^４＋、Ｒｂ^＋、Ｋ^＋、Ｎａ^＋、Ｃｓ^＋、Ｌｉ^＋、Ｚｎ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｃｕ^２＋およびＢａ^２＋を含んでなるホフマイスター系列の塩類などのアルカリ塩およびアルカリ土類塩類が挙げられる。特に、塩は、（ＮＨ_４）_３ＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、（ＮＨ_４）Ｈ_２ＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４ＣＨ_３ＣＯＯ、ＮＨ_４Ｃｌ、ＮＨ_４Ｂｒ、ＮＨ_４ＮＯ_３、ＮＨ_４ＣＩＯ_４、ＮＨ_４Ｉ、ＮＨ_４ＳＣＮ、Ｒｂ_３ＰＯ_４、Ｒｂ_２ＨＰＯ_４、ＲｂＨ_２ＰＯ_４、Ｒｂ_２ＳＯ_４、Ｒｂ_４ＣＨ_３ＣＯＯ、Ｒｂ_４Ｃｌ、Ｒｂ_４Ｂｒ、Ｒｂ_４ＮＯ_３、Ｒｂ_４ＣＩＯ_４、Ｒｂ_４Ｉ、Ｒｂ_４ＳＣＮ、Ｋ_３ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、ＫＣＨ_３ＣＯＯ、ＫＣｌ、ＫＢｒ、ＫＮＯ_３、ＫＣｌＯ_４、ＫＩ、ＫＳＣＮ、Ｎａ_３ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ＮａＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＳＯ_４、ＮａＣＨ_３ＣＯＯ、ＮａＣｌ、ＮａＢｒ、ＮａＮＯ_３、ＮａＣＩＯ_４、ＮａＩ、ＮａＳＣＮ、ＺｎＣＩ_２Ｃｓ_３ＰＯ_４、Ｃｓ_２ＨＰＯ_４、ＣｓＨ_２ＰＯ_４、Ｃｓ_２ＳＯ_４、ＣｓＣＨ_３ＣＯＯ、ＣｓＣｌ、ＣｓＢｒ、ＣｓＮＯ_３、ＣｓＣＩＯ_４、ＣｓＩ、ＣｓＳＣＮ、Ｌｉ_３ＰＯ_４、Ｌｉ_２ＨＰＯ_４、ＬｉＨ_２ＰＯ_４、Ｌｉ_２ＳＯ_４、ＬｉＣＨ_３ＣＯＯ、ＬｉＣｌ、ＬｉＢｒ、ＬｉＮＯ_３、ＬｉＣｌＯ_４、ＬｉＩ、ＬｉＳＣＮ、Ｃｕ_２ＳＯ_４、Ｍｇ_３（ＰＯ_４）_２、Ｍｇ_２ＨＰＯ_４、Ｍｇ（Ｈ_２ＰＯ_４）_２、Ｍｇ_２ＳＯ_４、Ｍｇ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_２、ＭｇＣｌ_２、ＭｇＢｒ_２、Ｍｇ（ＮＯ_３）_２、Ｍｇ（ＣｌＯ_４）_２、ＭｇＩ_２、Ｍｇ（ＳＣＮ）_２、ＭｎＣｌ_２、Ｃａ_３（ＰＯ_４），、Ｃａ_２ＨＰＯ_４、Ｃａ（Ｈ_２ＰＯ_４）_２、ＣａＳＯ_４、Ｃａ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_２、ＣａＣｌ_２、ＣａＢｒ_２、Ｃａ（ＮＯ_３）_２、Ｃａ（ＣｌＯ_４）_２、ＣａＩ_２、Ｃａ（ＳＣＮ）_２、Ｂａ_３（ＰＯ_４）_２、Ｂａ_２ＨＰＯ_４、Ｂａ（Ｈ_２ＰＯ_４）_２、ＢａＳＯ_４、Ｂａ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_２、ＢａＣｌ_２、ＢａＢｒ_２、Ｂａ（ＮＯ_３）_２、Ｂａ（ＣｌＯ_４）_２、ＢａＩ_２、およびＢａ（ＳＣＮ）_２から選択される。特に好ましいのは、例えば、塩化物塩または酢酸塩（トリフルオロ酢酸塩）などのＮＨ酢酸塩、ＭｇＣｌ_２、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、およびＣａＣｌ_２である。

【0332】

一般に、ペプチドおよび変異体（少なくともアミノ酸残基間にペプチド結合を含有するもの）は、Ｌｕｋａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｌｕｋａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８１）によって、そしてその中で引用される参考文献によって開示される、Ｆｍｏｃ－ポリアミド様式の固相ペプチド合成によって合成されてもよい。一時的なＮ－アミノ基保護は、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基によってもたらされる。この高度に塩基不安定性の保護基の反復性切断は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンを使用して実施される。側鎖官能基は、それらのブチルエーテル（セリン、スレオニン、およびチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン酸およびアスパラギン酸の場合）、ブチルオキシカルボニル誘導体（リジンおよびヒスチジンの場合）、トリチル誘導体（システインの場合）、および４－メトキシ－２，３，６－トリメチルベンゼンスルホニル誘導体（アルギニンの場合）として保護されてもよい。グルタミンまたはアスパラギンがＣ末端残基である場合、側鎖アミド官能基を保護するために、４，４’－ジメトキシベンズヒドリル基が活用される。固相担体は、ジメチルアクリルアミド（主鎖単量体）、ビスアクリロイルエチレンジアミン（架橋剤）、およびアクリロイルサルコシンメチルエステル（機能化因子）の３つの単量体から構成される、ポリジメチル－アクリルアミドポリマーをベースとする。使用されるペプチド－対－樹脂の切断可能な結合因子は、酸不安定性４－ヒドロキシメチル－フェノキシ酢酸誘導体である。逆転Ｎ，Ｎ－ジシクロヘキシル－カルボジイミド／１ヒドロキシベンゾトリアゾール媒介共役手順を使用して付加されるアスパラギンおよびグルタミンを除いて、全てのアミノ酸誘導体は、それらのあらかじめ形成された対称的な無水物誘導体として付加される。全ての共役および脱保護反応は、ニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸またはイサチン（ｉｓｏｔｉｎ）試験手順を使用してモニターされる。合成完了時に、ペプチドは樹脂担体から切断され、同時に、５０％スカベンジャー混合物を含有する９５％トリフルオロ酢酸での処理によって、側鎖保護基が除去される。一般に使用されるスカベンジャーとしては、エタンジチオール、フェノール、アニソール、および水が挙げられ、正確な選択は、合成されるペプチドの構成アミノ酸に左右される。ペプチドの合成のための固相法と溶液相法の組み合わせもまた、可能である（例えば、（Ｂｒｕｃｋｄｏｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）、およびその中で引用される参考文献を参照されたい）。

【0333】

トリフルオロ酢酸は、真空蒸発によって除去され、引き続くジエチルエーテルを用いた磨砕は、粗製ペプチドをもたらす。存在する任意のスカベンジャーは、単純な抽出手順によって除去され、それは水相の凍結乾燥時に、スカベンジャーを含まない粗製ペプチドを与える。ペプチド合成のための試薬は、通常、例えば、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）から入手できる。

【0334】

精製は、再結晶化、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および（通常は）例えばアセトニトリル／水勾配分離を使用した逆相高速液体クロマトグラフィーなどの技術の任意の１つまたは組み合わせによって、実施されてもよい。

【0335】

本発明は、本発明によるペプチドをエンコードする核酸にさらに関するが、ただしペプチドは完全（完全長）ヒトタンパク質でない。

【0336】

本発明は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせである、本発明による核酸にさらに関する。

【0337】

本発明は、本発明による核酸を発現できる、発現ベクターにさらに関する。

【0338】

本発明は、医療において、特に食道がんの治療において使用するための本発明によるペプチド、本発明による核酸または本発明による発現ベクターにさらに関する。

【0339】

本発明は、本発明による核酸または本発明による発現ベクターを含んでなる、宿主細胞にさらに関する。

【0340】

本発明は、抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞である、本発明による宿主細胞にさらに関する。

【0341】

本発明は、本発明による宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる、本発明によるペプチドを製造する方法にさらに関する。

【0342】

本発明は、十分な量の抗原を抗原提示細胞に接触させることで、適切な抗原提示細胞の表面に発現されるクラスＩまたはＩＩ ＭＨＣ分子上に、抗原が負荷される、本発明による方法にさらに関する。

【0343】

本発明は、抗原提示細胞が、配列番号１～配列番号９３または前記異アミノ酸配列を含有する、前記ペプチドを発現できる、発現ベクターを含んでなる、本発明による方法にさらに関する。

【0344】

本発明は、本発明による方法によって製造される活性化Ｔ細胞にさらに関し、前記Ｔ細胞は、本発明によるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する。

【0345】

本発明は、本発明によるＴ細胞の有効数を患者に投与するステップを含んでなる、患者において、本発明による任意のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する標的細胞を死滅させる方法にさらに関する。

【0346】

本発明は、記載される任意のペプチド、本発明による核酸、本発明による発現ベクター、本発明による細胞、または本発明による活性化細胞傷害性Ｔリンパ球の、薬剤としての、または薬剤の製造における、使用にさらに関する。本発明は、薬剤ががんに対して有効である、本発明による使用にさらに関する。

【0347】

本発明は、薬剤がワクチンである、本発明による使用にさらに関する。本発明は、薬剤ががんに対して有効である、本発明による使用にさらに関する。

【0348】

本発明は、発明による使用にさらに関し、前記がん細胞は、食道がん細胞であり、または肺がん、膀胱がん、卵巣がん、黒色腫、子宮がん、肝細胞がん、腎細胞がん、脳がん、結腸直腸がん、乳がん、胃がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、前立腺がん、および白血病などのその他の固形または血液学的腫瘍細胞である。

【0349】

本発明は、食道がんの診断および／または予後診断において使用され得る、本明細書で「標的」と称される、本発明によるペプチドベースの特定の標識タンパク質およびバイオマーカーにさらに関する。本発明はまた、がん治療のためのこれらの新規標的の使用に関する。

【0350】

「抗体（単数）」または「抗体（複数）」という用語は、本明細書では広義に使用され、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の双方を含む。無処理または「完全」免疫グロブリン分子に加えて、「抗体」という用語には、本発明による所望の特性（例えば、職ふぉうがんマーカー（ポリ）ペプチドの特異的結合、がんマーカー遺伝子を増大レベルで発現する食道がん細胞への毒素の送達、および／または食道がんマーカーポリペプチドの活性阻害）のいずれかを示しさえすれば、フラグメント（例えば、ＣＤＲｓ、Ｆｖ、Ｆａｂ、およびＦｃフラグメント）、またはこれらの免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子ヒト化バージョンのポリマーもまた含まれる。

【0351】

可能な場合は常に、本発明の抗体は、商業的供給元から購入されてもよい。また本発明の抗体は、周知の方法を使用して生成されてもよい。当業者は、本発明の抗体を生成するために、完全長食道がんマーカーポリペプチドまたはそのフラグメントのどちらを使用してもよいことを理解するであろう。本発明の抗体を製造するために使用されるポリペプチドは、天然原料から部分的にまたは完全に精製されてもよく、または組換えＤＮＡ技術を使用して製造されてもよい。

【0352】

例えば、配列番号１～配列番号９３ポリペプチドに記載のペプチドなどの本発明によるペプチドをコードするｃＤＮＡ；またはその変異体またはフラグメントが、原核細胞（例えば、細菌）または真核細胞（例えば、酵母、昆虫、または哺乳類細胞）で発現され得て、その後、組換えタンパク質が精製されて、本発明による抗体を生成するために使用される、食道がんマーカーポリペプチドに特異的に結合する、モノクローナルまたはポリクローナル抗体製剤を生成するために使用され得る。

【0353】

当業者は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の２つ以上の異なるセットの生成が、その目的の用途（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的検査、生体内イメージング、免疫毒素療法）に必要な特異性および親和性を有する抗体を得る可能性を最大化することを理解するであろう。抗体は、それに対して抗体が使用される目的に従って、既知の方法によりそれらの所望の活性について試験される（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的検査、免疫療法など；抗体の生成および試験のさらなるガイダンスについては、例えば、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，２０１４（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，２０１４）を参照されたい））。例えば、抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット、ホルマリン固定がんまたは冷凍組織切片の免疫組織化学染色で試験されてもよい。それらの最初の生体外特性解析後、治療または生体内診断用途を意図した抗体が、既知の臨床試験法によって試験される。

【0354】

「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書の用法では、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体を指し；すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在してもよい可能な自然発生突然変異以外は同一である。本明細書では、「モノクローナル抗体」は、それらが所望の拮抗活性を示しさえすれば、その中で重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来しまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同的である一方、鎖の残部は、別の種に由来しまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同的である、「キメラ」抗体、ならびにこのような抗体のフラグメントを特に含む（その内容全体が本明細書に援用される、米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。

【0355】

本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法を使用して調製されてもよい。ハイブリドーマ法においては、マウスまたはその他の適切な宿主動物が免疫剤によって典型的に免疫化されて、免疫剤と特異的に結合する抗体を産生するまたは産生できるリンパ球を生じさせる。代案としては、リンパ球は、生体外で免疫化されてもよい。

【0356】

モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載されるものなどの組換えＤＮＡ法によって製造されるものであってもよい。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して、容易に単離および配列決定され得る（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合できる、オリゴヌクレオチドプローブの使用によって）。

【0357】

インビトロ法もまた、一価の抗体を調製するのに適する。抗体フラグメント、特にＦａｂフラグメントを作製するための抗体の消化は、当該技術分野で既知の通例の技術を使用して達成され得る。例えば、消化は、パパインを使用して実施され得る。パパイン消化の例は、国際公開第９４／２９３４８号パンフレットおよび米国特許第４，３４２，５６６号明細書に記載される。抗体のパパイン消化は、それぞれ単一抗原結合部位を有するＦａｂフラグメントと称される２つの同一の抗原結合フラグメントと、残りのＦｃフラグメントとを典型的に生じる。ペプシン処理は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびｐＦｃ’フ
ラグメントをもたらす。

【0358】

抗体フラグメントは、その他の配列に付着するかどうかに関わりなく、フラグメントの活性が非修飾抗体または抗体フラグメントと比較して顕著に変化せずまたは損なわれないという条件で、特定領域または特定アミノ酸残基の挿入、欠失、置換、またはその他の選択された修飾もまた含み得る。これらの修飾は、ジスルフィド結合できるアミノ酸の除去／付加、そのバイオ寿命増大、その分泌特性改変などのいくつかの追加的な特性を提供し得る。いずれにしても、抗体フラグメントは、結合活性、結合領域における結合調節などの生理活性特性を有しなくてはならない。抗体の機能性または活性領域は、タンパク質の特定領域の変異誘発と、それに続く発現と、発現したポリペプチドの試験によって同定されてもよい。このような方法は、当該技術分野の熟練した実務家には容易に分かり、抗体フラグメントをエンコードする核酸の部位特異的変異誘発を含み得る。

【0359】

本発明の抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体をさらに含んでなってもよい。非ヒト（例えばマウス）抗体などのヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはその他の抗原結合部分配列など）である。ヒト化抗体としては、その中でレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト生物種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換される、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が挙げられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体または移入ＣＤＲまたはフレームワーク配列のどちらにも見いだされない、残基を含んでなってもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つおよび典型的に２つの可変領域の実質的に全てを含んでなり、その中では、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン共通配列のものである。ヒト化抗体は、至適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部もまた含んでなる。

【0360】

非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野で周知である。通常、ヒト化抗体は、非ヒト起源から導入された、１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「移入」残基と称され、それは典型的に「移入」可変領域から得られる。ヒト化は、齧歯類ＣＤＲ（複数）またはＣＤＲ（単数）配列を対応するヒト抗体配列によって置換することで、基本的に実施され得る。したがって、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）であり、その中では、実質的に非損傷ヒト可変領域未満が、非ヒト生物種からの対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は典型的にヒト抗体であり、その中ではいくつかのＣＤＲ残基と、おそらくはいくつかのＦＲ残基とが、齧歯類抗体中の類似部位からの残基によって置換される。

【0361】

免疫化に際して、内因性免疫グロブリン生成不在下で、ヒト抗体の完全レパートリーを産生できる遺伝子組換え動物（例えばマウス）を用い得る。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異マウスにおける、抗体重鎖連結領域遺伝子のホモ接合型欠失が、内因性抗体生成の完全阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖細胞系変異マウスにおけるヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの転写は、抗原チャレンジに際してヒト抗体の産生をもたらす。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー中でも産生され得る。

【0362】

本発明の抗体は、好ましくは薬学的に許容できる担体中で、対象に投与される。典型的に、製剤中で適当量の薬理的に許容可能な塩が使用されて、製剤を等張にする。薬理的に許容可能な担体の例としては、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、好ましくは約５～約８、より好ましくは約７～約７．５である。さらなる担体としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス徐放性製剤が挙げられ、そのマトリックスは、例えば、フィルム、リポソームまたは微粒子などの造形品の形態である。当業者には、例えば、投与される抗体の投与経路と濃度次第で、特定の担体がより好ましくあってもよいことが明らかであろう。

【0363】

抗体は、注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内）によって、またはその有効形態での血流への送達を確実にする輸液などのその他の方法によって、対象、患者、または細胞に投与され得る。抗体はまた、腫瘍内または腫瘍周囲経路によって投与されて、局所性ならびに全身性の治療効果を発揮してもよい。局所注射または静脈注射が好ましい。

【0364】

抗体を投与するための有効投与量およびスケジュールは、経験的に判定されてもよく、このような測定の実施は、当該技術分野の技術範囲内である。当業者は、投与しなくてはならない抗体用量が、例えば、抗体を投与される対象、投与経路、使用される特定の抗体型、および投与されるその他の薬剤次第で変動することを理解するであろう。単独使用される抗体の典型的な１日量は、上述の要素次第で、１日当たり約１（μｇ／ｋｇ～最大１００ｍｇ／ｋｇ体重またはそれ以上の範囲に及ぶかもしれない。好ましくは食道がんを治療するための抗体投与に続いて、治療用抗体の効力が、熟練した実務家に良く知られている様々な方法で評価され得る。例えば、標準腫瘍イメージング技術を使用して、治療を受ける対象におけるがんの大きさ、数、および／または分布がモニターされてもよい。抗体投与不在下で起こるであろう疾患経過と比較して、腫瘍成長を停止させ、腫瘍収縮をもたらし、および／または新規腫瘍の発生を予防する、治療的に投与された抗体は、がん治療のための有効な抗体である。

【0365】

特異的ペプチド－ＭＨＣ複合体を認識する可溶性Ｔ細胞受容体（ｓＴＣＲ）を製造する方法を提供することもまた、本発明のさらなる態様である。このような可溶性Ｔ細胞受容体は、特異的Ｔ細胞クローンから生成され得て、それらの親和性は、相補性決定領域を標的とする変異誘発によって増加させ得る。Ｔ細胞受容体の選択目的で、ファージディスプレイが利用され得る（米国特許第２０１０／０１１３３００号明細書、（Ｌｉｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０１２））。ファージディスプレイ中に、そして薬剤として実用する際に、Ｔ細胞受容体を安定化させる目的で、例えば、非天然ジスルフィド結合、その他の共有結合（一本鎖Ｔ細胞受容体）、または二量体化ドメインによって、αおよびβ鎖を連結させ得る（Ｂｏｕｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｃａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｗｉｌｌｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。Ｔ細胞受容体は、標的細胞上で特定機能を発揮させるために、毒素、薬剤、サイトカイン（例えば、米国特許第２０１３／０１１５１９１号明細書を参照されたい）、抗ＣＤ３ドメインのようなエフェクター細胞動員ドメインなどに、連結させ得る。さらにそれは、養子免疫伝達のために使用されるＴ細胞において発現され得た。さらなる情報は、国際公開第２００４／０３３６８５Ａ１号パンフレットおよび国際公開第２００４／０７４３２２Ａ１号パンフレットにある。ＴＣＲの組み合わせは、国際公開第２０１２／０５６４０７Ａ１号パンフレットに記載される。さらなる製造法は、国際公開第２０１３／０５７５８６Ａ１号パンフレットで開示される。

【0366】

さらに本発明のペプチドおよび／またはＴＣＲまたは抗体またはその他の結合分子を使用して、病理学者の生検サンプルに基づくがん診断を確認し得る。

【0367】

抗体またはＴＣＲはまた、生体内診断アッセイのために使用されてもよい。通常、抗体は、免疫シンチグラフィー（ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｏｇｒａｐｈｙ）を使用して腫瘍が位置確認され得るように、放射性ヌクレオチド（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、３Ｈ、３２Ｐまたは３５Ｓなど）で標識される。一実施形態では、抗体またはそれらのフラグメントは、上述のタンパク質からなる群から選択されるタンパク質の２つ以上の標的の細胞外ドメインに結合し、親和性（Ｋｄ）は１×１０μＭ未満である。

【0368】

診断用の抗体は、様々なイメージング法による検出に適するプローブで標識されてもよい。プローブの検出方法としては、蛍光、光学、共焦点および電子顕微鏡検査；磁気共鳴画像法および分光法；蛍光透視法、コンピュータ断層撮影および陽電子放射型断層撮影法が挙げられるが、これに限定されるものではない。適切なプローブとしては、フルオレセイン、ローダミン、エオジンおよびその他のフルオロフォア、放射性同位体、金、ガドリニウムおよびその他のランタニド、常磁性鉄、フッ素１８およびその他の陽電子放出放射性核種が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、プローブは二官能価または多官能価であってもよく、列挙される方法の２つ以上によって検出可能であってもよい。これらの抗体は、前記プローブで直接または間接的に標識されてもよい。特に十分に技術分野で承認されている、プローブの抗体への付着としては、プローブの共有結合、プローブの抗体への組み込み、およびプローブ結合のためのキレート化合物の共有結合が挙げられる。免疫組織化学的検査では、疾患組織サンプルは、新鮮または冷凍であってもよく、またはパラフィン包埋されてホルマリンなどの保存料で固定されてもよい。サンプルを含有する固定または包埋切片は、標識一次抗体および二次抗体と接触されて、抗体を使用して原位置タンパク質発現が検出される。

【0369】

本発明の別の態様は、活性化Ｔ細胞を製造するインビトロ法を含み、方法は、生体外Ｔ細胞を、適切な抗原提示細胞の表面に発現される抗原負荷ヒトＭＨＣ分子に、Ｔ細胞を抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり接触させるステップを含んでなり、抗原は本発明によるペプチドである。好ましくは、抗原提示細胞と共に、十分な量の抗原が使用される。

【0370】

好ましくは、哺乳類細胞は、ＴＡＰペプチド輸送体のレベルまたは機能が皆無でありまたは低下している。ＴＡＰペプチド輸送体が欠如している適切な細胞としては、Ｔ２、ＲＭＡ－Ｓ、およびショウジョウバエ細胞が挙げられる。ＴＡＰは、抗原プロセシングに関連している輸送体である。

【0371】

ヒトペプチド負荷欠乏細胞系Ｔ２は、カタログ番号ＣＲＬ１９９２の下に、米国微生物系統保存機関、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２，ＵＳＡから入手でき；ショウジョウバエ細胞株Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ株２は、カタログ番号ＣＲＬ１９８６３の下にＡＴＣＣから入手でき；マウスＲＭＡ－Ｓ細胞株はＬｊｕｎｇｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ ａｎｄ Ｋａｒｒｅ，１９８５）に記載される。

【0372】

好ましくは、移入前に、宿主細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子を実質的に発現しない。刺激因子細胞が、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ－１、およびＬＦＡ３のいずれかなどのＴ細胞のための共刺激シグナルを提供するのに重要な分子を発現することもまた好ましい。多数のＭＨＣクラスＩ分子および共刺激因子分子の核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬデータベースから公的に入手可能である。

【0373】

ＭＨＣクラスＩエピトープが抗原として使用される場合、Ｔ細胞はＣＤ８陽性Ｔ細胞である。

【0374】

抗原提示細胞が、このようなエピトープを発現するために形質移入される場合、好ましくは、細胞は、配列番号１～配列番号９３、またはその変異アミノ酸配列を含有するペプチドを発現する能力がある発現ベクターを含んでなる。

【0375】

生体外でＴ細胞を製造するために、その他のいくつかの方法が使用されてもよい。例えば、自己由来腫瘍浸潤性リンパ球が、ＣＴＬを生成するために使用され得る。Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）は、Ｔ細胞の調製において、自己由来末梢血リンパ球（ＰＬＢ）を利用した。さらに、樹状細胞をペプチドまたはポリペプチドでパルス処理する、または組換えウイルスで感染させることによる、自己由来Ｔ細胞の製造も可能である。Ｂ細胞もまた、自己由来Ｔ細胞の製造において使用され得る。さらに、ペプチドまたはポリペプチドでパルス処理された、または組換えウイルスで感染されたマクロファージが、自己ＣＴＬの調製において使用されてもよい。Ｓ．Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）は、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を使用したＴ細胞の生体外プライミングを記載し、それはまた、選択されたペプチドに対するＴ細胞を製造するための適切な方法でもある。本発明では、ビオチン：ストレプトアビジン生化学によって、あらかじめ形成されたＭＨＣ：ペプチド複合体を表面ポリスチレン粒子（ミクロビーズ）に共役することで、ａＡＰＣが生成された。このシステムは、ａＡＰＣ上のＭＨＣ密度の正確な調節を可能にし、それは、血液サンプルから高効率で、高または低結合活性の抗原特異的Ｔ細胞応答を選択的に引き起こすことを可能にする。ＭＨＣ：ペプチド複合体の他に、ａＡＰＣは、それらの表面に共役する、抗ＣＤ２８抗体のような共刺激活性を有するその他のタンパク質を保有すべきである。さらに、このようなａＡＰＣベースのシステムは、例えばサイトカイン様インターロイキン１２などの適切な可溶性因子の付加を要することが多い。

【0376】

同種異系細胞はまた、Ｔ細胞の調製において使用されてもよく、方法は、参照により本明細書に援用される、国際公開第９７／２６３２８号パンフレットで詳述される。例えば、ショウジョウバエ細胞およびＴ２細胞に加えて、その他の細胞を使用して、ＣＨＯ細胞、バキュロウイルス感染昆虫細胞、細菌、酵母、ワクシニア感染標的細胞などの抗原を提示してもよい。さらに植物ウイルスが使用されてもよい（例えば、外来性ペプチド提示のための高収率システムとしてのササゲモザイクウイルス開発を記載するＰｏｒｔａ ｅｔ ａｌ．（Ｐｏｒｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９４を参照されたい）。

【0377】

本発明のペプチドに向けられた活性化Ｔ細胞は、治療法において有用である。したがって、本発明のさらなる態様は、前述の本発明の方法によって入手可能な活性化Ｔ細胞を提供する。

【0378】

上記方法によって製造される活性化Ｔ細胞は、配列番号１～配列番号９３のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する。

【0379】

好ましくは、Ｔ細胞は、そのＴＣＲを通じた、ＨＬＡ／ペプチド複合体（例えば結合）との相互作用によって、細胞を認識する。Ｔ細胞は、その標的細胞が、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する患者において、標的細胞を死滅させる方法で有用であり、患者には有効数の活性化Ｔ細胞が投与される。患者に投与されるＴ細胞は、患者に由来して、上述のように活性化されてもよい（すなわち、それらは自己Ｔ細胞である）。代案としては、Ｔ細胞は、患者でなく別の個人に由来する。もちろん、個人が健常人であれば、それが好ましい。「健常人」によって、本発明者らは、個人が概して健康良好であり、好ましくは有能な免疫系を有して、より好ましくは容易に検査され検出され得るいかなる疾患にも罹患していないことを意味する。

【0380】

生体内で、本発明によるＣＤ８陽性Ｔ細胞の標的細胞は、（時にＭＨＣクラスＩＩを発現する）腫瘍細胞であり得て、および／または（時にＭＨＣクラスＩＩもまた発現する；（Ｄｅｎｇｊｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００６））腫瘍（腫瘍細胞）周囲の間質細胞であり得る。

【0381】

本発明のＴ細胞は、治療用組成物の活性成分として使用されてもよい。したがって、本発明は、その標的細胞が、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する患者において、標的細胞を死滅させる方法もまた提供し、方法は、上で定義されるようなＴ細胞の有効数を患者に投与するステップを含んでなる。

【0382】

「異常に発現される」によって、本発明者らは、正常な（健康な）組織における発現レベルと比較して、ポリペプチドが過剰発現されること、または腫瘍がそれに由来する組織においては遺伝子がサイレントであるが、腫瘍においてはそれが発現されることもまた意味する。「過剰発現」によって、本発明者らは、ポリペプチドが、正常組織に存在するレベルの少なくとも１．２倍のレベルで；好ましくは正常組織に存在するレベルの少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍または１０倍のレベルで存在することを意味する。

【0383】

Ｔ細胞は、例えば上で記載されるものなどの当該技術分野で公知の方法によって得られてもよい。

【0384】

Ｔ細胞のこのいわゆる養子免疫伝達のためのプロトコルは、当該技術分野で周知である。概説は、Ｇａｔｔｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．およびＭｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）にある。

【0385】

本発明の別の態様は、その核酸がクローン化されて、好ましくはＴ細胞である宿主細胞に導入されるＴ細胞受容体を生成するための、ＭＨＣと複合体形成するペプチドの使用を含む。次に、この遺伝子操作Ｔ細胞は、がん治療のために患者に移入され得る。

【0386】

本発明の任意の分子、すなわちペプチド、核酸、抗体、発現ベクター、細胞、活性化Ｔ細胞、Ｔ細胞受容体またはそれをエンコードする核酸は、免疫応答を逃れた細胞によって特徴付けられる障害の治療に有用である。したがって本発明の任意の分子は、薬剤として、または薬剤の製造において使用されてもよい。分子は、単独で、または本発明のその他
の分子または既知の分子との組み合わせで、使用されてもよい。

【0387】

本発明は、
（ａ）溶液中のまたは凍結乾燥形態の上述の医薬組成物を含有する容器；
（ｂ）任意選択的に、凍結乾燥製剤のための希釈剤または再構成溶液を含有する第２の容器；および
（ｃ）任意選択的に、（ｉ）溶液の使用、または（ｉｉ）凍結乾燥製剤の再構成および／または使用のための取扱説明書
を含んでなるキットをさらに目的とする。

【0388】

キットは、（ｉｉｉ）緩衝液、（ｉｖ）希釈剤、（Ｖ）濾過、（ｖｉ）針、または（Ｖ）シリンジの１つまたは複数をさらに含んでなってもよい。容器は、好ましくは、ボトル、バイアル、シリンジまたは試験管であり；それは、多回使用容器であってもよい。医薬組成物は、好ましくは凍結乾燥される。

【0389】

本発明のキットは、好ましくは、適切な容器内の本発明の凍結乾燥製剤と、その再構成および／または使用のための取扱説明書とを含んでなる。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル（例えば二重チャンバーバイアル）、シリンジ（二重チャンバーシリンジなど）、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成されてもよい。好ましくは、キットおよび／または容器は、容器上の、または容器に付随する、取扱説明を含み、それは再構成および／または使用上の指示を示す。例えば、ラベルは、凍結乾燥製剤が、上述されるようなペプチド濃度に再構成されることを表示してもよい。ラベルは、製剤が皮下投与に有用であり、または皮下投与用であることをさらに表示してもよい。

【0390】

製剤を収容する容器は、多回使用バイアルであってもよく、それは再構成製剤の反復投与（例えば２～６回の投与）を可能にする。キットは、適切な希釈剤（例えば、炭酸水素ナトリウム溶液）を含んでなる、第２の容器をさらに含んでなってもよい。

【0391】

希釈剤と凍結乾燥製剤の混合時に、再構成製剤中の最終ペプチド濃度は、好ましくは少なくとも０．１５ｍｇ／ｍＬ／ペプチド（＝７５μｇ）であり、好ましくは３ｍｇ／ｍＬ／ペプチド（＝１５００μｇ）以下である。キットは、その他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および取扱説明が掲載されるパッケージインサートをはじめとする商業的および使用者観点から望ましい、その他の物品をさらに含んでもよい。

【0392】

本発明のキットは、その他の構成要素（例えば、その他の化合物またはこれらのその他の化合物の医薬組成物）が添加されたまたは添加されない、本発明による医薬組成物製剤を含有する単回容器を有してもよく、または各構成要素のための別個の容器を有してもよい。

【0393】

好ましくは、本発明のキットは、第２の化合物（アジュバント（例えばＧＭ－ＣＳＦ）、化学療法剤、天然物、ホルモンまたは拮抗薬、抗血管新生因子または阻害剤、アポトーシス誘導剤またはキレート剤など）またはその医薬組成物の同時投与と合わせて使用するためにパッケージされた、本発明の製剤を含む。キットの構成要素は、あらかじめ混合されてもよく、または各構成要素は、患者への投与前に別個の異なる容器内にあってもよい。キットの構成要素は、１つまたは複数の液体溶液、好ましくは水溶液、より好ましくは無菌水溶液中で、提供されてもよい。またキットの構成要素は、固体として提供されてもよく、それは、好ましくは別の異なる容器内に提供される、適切な溶媒の添加によって液体に変換されてもよい。

【0394】

治療用キットの容器は、バイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または固体または液体を封入するその他のあらゆる手段であってもよい。通常，２つ以上の構成要素がある場合、キットは、第２のバイアルまたはその他の容器を含有して、別々の投薬を可能にする。キットは、薬学的に許容可能な液体のための別の容器もまた、含有してもよい。好ましくは、治療用キットは、装置（例えば、１本または複数本の針、シリンジ、点眼器、ピペットなど）を含有して、本キットの構成要素である本発明の作用物質の投与を可能にする。

【0395】

本製剤は、経口（腸内）、経鼻、眼、皮下、皮内、筋肉内、静脈内または経皮などの任意の許容できる手段によるペプチド投与に適するものである。好ましくは、投与はｓ．ｃ．であり、最も好ましくはｉ．ｄ．投与であり、輸液ポンプによってもよい。

【0396】

本発明のペプチドは食道がんから単離されるので、本発明の薬剤は、好ましくは食道がんを治療するために使用される。

【0397】

本発明は、予備スクリーニングＴＵＭＡＰの貯蔵庫から選択される少なくとも１つのペプチドを含んでなる、医薬組成物を製造するステップを含んでなる、個々の患者のための個別化医薬品を製造する方法にさらに関し、医薬組成物中で使用される少なくとも１つのペプチドは、個々の患者における適切さについて選択される。一実施形態では、医薬組成物はワクチンである。方法はまた、ＴＣＲ単離などの下流用途、または可溶性抗体、およびその他の治療選択肢のためのＴ細胞クローンを製造するためにも適応され得る。

【0398】

「個別化医薬品」は、積極的個別化がんワクチンおよび自己由来患者組織を使用した養子細胞療法をはじめとするこのような個々の患者の治療のためにのみ使用される、一個人の患者のために特に調整された治療法を意味するものとする。

【0399】

本明細書の用法では、「貯蔵庫」という用語は、特定の腫瘍型における免疫原性および／または過剰提示について予備スクリーニングされている、一群のまたは一組のペプチドを指すものとする。「貯蔵庫」という用語は、ワクチンに含まれる特定のペプチドが、予備製造されて物理的設備内で貯蔵されることを暗示することは意図されないが、その可能性も検討される。ペプチドは、製造される各個別化ワクチンのために新規に製造されてもよく、または予備製造されて貯蔵されてもよいことが、明示的に検討される。貯蔵庫（例えば、データベースの形態）は、多様なＨＬＡ－ＡＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を有する食道がん患者の腫瘍組織において高度に過剰発現される、腫瘍関連ペプチドから構成される。それは、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩペプチドまたは伸長ＭＨＣクラスＩペプチドを含有してもよい。いくつかの食道がん組織から採取された腫瘍関連ペプチドに加えて、貯蔵庫は、ＨＬＡ－Ａ＊０２およびＨＬＡ－Ａ＊２４標識ペプチドを含有してもよい。これらのペプチドは、ＴＵＭＡＰによって誘導されるＴ細胞免疫の規模を定量的に比較できるようにし、したがって抗腫瘍応答を引き起こすワクチンの能力について、重要な結論が導かれるようにする。第２に、それらは、患者において、「自己」抗原に由来するＴＵＭＡＰに対するいかなるワクチン誘導Ｔ細胞応答も観察されない症例において、「非自己」抗原に由来する重要な陽性対照ペプチドとして機能する。第３に、それは、患者の免疫能力状態に関する結論が導かれるようにしてもよい。

【0400】

貯蔵庫のためのＴＵＭＡＰは、遺伝子発現解析、質量分析、およびＴ細胞免疫学を組み合わせた、統合ゲノム機能解析アプローチ（ＸＰｒｅｓｉｄｅｎｔ（登録商標））を使用して同定される。アプローチは、高い割合の腫瘍上に真に存在するが、正常組織上では発現されず、または最小限にのみ発現されるＴＵＭＡＰだけが、さらなる分析のために選択されることを保証する。最初のペプチド選択のために、患者に由来する食道がんサンプルおよび健常ドナーに由来する血液を段階的アプローチで分析した：
１．悪性物質からのＨＬＡリガンドを質量分析法によって同定した
２．ゲノム規模メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）発現解析を使用して、一連の正常器官および組織と比較して悪性組織（食道がん）中の遺伝子過剰発現を同定した
３．同定されたＨＬＡリガンドを遺伝子発現データと比較した。好ましくは、ステップ２で検出されたような選択的に発現されまたは過剰発現される遺伝子によってコードされる、腫瘍組織上で過剰提示されまたは選択的に提示されるペプチドが、多重ペプチドワクチンのための適切なＴＵＭＡＰ候補と見なされた。
４．同定されたペプチドのＴＵＭＡＰとしての妥当性を支持する追加的な証拠を同定するために、文献調査を実施した
５．ｍＲＮＡレベルでの過剰発現の関連性をステップ３からの選択されたＴＵＭＡＰの腫瘍組織上における再検出と、健常組織における検出の欠如（またはまれな）検出によって確認した。
６．選択されたペプチドによる生体内Ｔ細胞応答の誘導が可能かどうかを評価するために、健常ドナーならびに食道がん患者からのヒトＴ細胞を使用して、生体外免疫原性アッセイを実施した。

【0401】

一態様では、貯蔵庫に含める前に、ペプチドが免疫原性について予備スクリーニングされる。制限を意図しない一例として、貯蔵庫に包含されるペプチドの免疫原性は、ペプチド／ＭＨＣ複合体および抗ＣＤ２８抗体が負荷された人工抗原提示細胞による、健常ドナーからのＣＤ８＋Ｔ細胞の反復刺激を通じた、生体外Ｔ細胞プライミングを含んでなる方法によって判定される。

【0402】

この方法は、稀ながんに、そして稀な発現プロファイルを有する患者にとって、好ましい。一定組成を有する多重ペプチド混合物とは対照的に、現在開発されている貯蔵庫は、腫瘍における抗原の実際の発現とワクチンとの顕著により高いマッチングを可能にする。多標的アプローチでは、各患者のために、選択された単一のまたは組み合わされた数種の「既製」ペプチドが利用される。理論上は、例えば５０個の抗原性ペプチドのライブラリーからの５個の異なる抗原性ペプチドの選択に基づくアプローチは、それだけでおよそ１７００万個の可能な医薬品（ＤＰ）組成物をもたらす。

【0403】

一態様では、ペプチドは、本明細書に記載される、または以下のような本発明による方法に基づく、個々の患者に対するそれらの適切さに基づいて、ワクチンへの包含のために選択される。

【0404】

ＨＬＡ表現型、トランスクリプトミクスおよびペプチドミクスデータが、患者の腫瘍材料および血液サンプルから収集されて、「貯蔵庫」および患者に特有の（すなわち変異）ＴＵＭＡＰを含有する、各患者に対して最も適切なペプチドが同定される。患者の腫瘍において選択的にまたは過剰発現されて、可能であれば、患者の個々のＰＢＭＣと共に試験すると、強力な生体外免疫原性を示すペプチドが選択される。

【0405】

好ましくは、ワクチンに含まれるペプチドは、（ａ）個々の患者からの腫瘍サンプルによって提示される腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）を同定するステップと；（ｂ）（ａ）で同定されたペプチドを上述のペプチド貯蔵庫と比較するステップと；（ｃ）少なくとも１つのペプチドを患者において同定された腫瘍関連ペプチドに関連がある貯蔵庫（データベース）から選択するステップとを含んでなる方法によって同定される。例えば、腫瘍サンプルによって提示されるＴＵＭＡＰは、（ａ１）前記腫瘍サンプルからの発現データを前記腫瘍サンプルの組織型に対応する正常組織サンプルからの発現データと比較して、前記腫瘍サンプルにおいて過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質を同定するステップと；（ａ２）発現データを腫瘍サンプル中のＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子と結合しているＭＨＣリガンドの配列と相関させて、腫瘍によって過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質に由来するＭＨＣリガンドを同定するステップとによって同定される。好ましくは、ＭＨＣリガンドの配列は、腫瘍サンプルから単離されたＭＨＣ分子から結合ペプチドを溶出させて、溶出したリガンドを配列決定することで同定される。好ましくは、腫瘍サンプルおよび正常組織は、同一患者から入手される。

【0406】

貯蔵庫（データベース）モデルを使用してペプチドを選択するのに加えて、またはその代案として、ＴＵＭＡＰを患者において新規に同定し、次に、ワクチンに含めてもよい。一実施例として、（ａ１）前記腫瘍サンプルからの発現データを前記腫瘍サンプルの組織型に対応する正常組織サンプルからの発現データと比較して、前記腫瘍サンプルにおいて過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質を同定するステップと；（ａ２）発現データを腫瘍サンプル中のＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子と結合しているＭＨＣリガンドの配列と相関させて、腫瘍によって過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質に由来するＭＨＣリガンドを同定するステップとによって、候補ＴＵＭＡＰが患者において同定されてもよい。別の実施例として、個々の患者からの正常な対応組織と比較して、腫瘍サンプルに特有の変異を含有するタンパク質が同定されてもよく、特異的に変異を標的とするＴＵＭＡＰが同定され得る。例えば、腫瘍のゲノム、および対応する正常組織のゲノムは、全ゲノム配列決定によって配列決定され得る。遺伝子のタンパク質コード領域における非同義の変異を発見するために、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡが腫瘍組織から抽出され、正常な非変異ゲノム生殖細胞系ＤＮＡが末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から抽出される。適用されたＮＧＳアプローチは、タンパク質コード領域の再配列決定（エクソーム再配列決定）に限定される。この目的で、供給業者が提供する標的富化キットを使用して、ヒトサンプルからのエクソンＤＮＡが捕捉され、例えばＨｉＳｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）による配列決定がそれに続く。それに加えて、遺伝子発現の直接定量化と、変異遺伝子が患者の腫瘍において発現されることの妥当性評価とのために、腫瘍ｍＲＮＡが配列決定される。結果として得られる数百万の配列読み取りは、ソフトウェアアルゴリズムを通じて処理される。出力一覧は、変異および遺伝子発現を含有する。ＰＢＭＣ由来生殖細胞系の多様性と比較することで腫瘍特異的体細胞変異が判定され、優先順位がつけられる。次に、新規に同定されたペプチドは、貯蔵庫について上述した免疫原性について試験され得て、適切な免疫原性を保持する候補ＴＵＭＡＰが、ワクチンへの包含のために選択される。

【0407】

例示的一実施形態では、ワクチンに包含されるペプチドは、（ａ）個々の患者からの腫瘍サンプルによって提示される腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）を上述の方法（方法）によって同定するステップと；（ｂ）ａ）で同定されたペプチドを対応する正常組織との比較で腫瘍における免疫原性および過剰提示について予備選別されたペプチドの貯蔵庫と比較するステップと；（ｃ）少なくとも１つのペプチドを患者において同定された腫瘍関連ペプチドに関連がある貯蔵庫から選択するステップと；（ｄ）任意選択的に、（ａ）で新規に同定された少なくとも１つのペプチドを選択して、その免疫原性を確認するステップとによって同定される。

【0408】

例示的一実施形態では、ワクチンに包含されるペプチドは、（ａ）個々の患者からの腫瘍サンプルによって提示される腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）を同定するステップと；（ｂ）（ａ）で新規に同定された少なくとも１つのペプチドを選択して、その免疫原性を確認するステップとによって同定される。

【0409】

ひとたび個別化ペプチドベースのワクチンのためのペプチドを選択したら、ワクチンを製造する。ワクチンは、好ましくは、約３３％ＤＭＳＯなどの２０～４０％ＤＭＳＯ、好ましくは約３０～３５％ＤＭＳＯに溶解された、個々のペプチドからなる液体製剤である。

【0410】

製品に包含される各ペプチドをＤＭＳＯに溶解する。単一ペプチド溶液の濃度は、製品に包含されるペプチド数に応じて選択しなくてはならない。単一ペプチドＤＭＳＯ溶液を等量で混合し、ペプチド当たり約２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、製品に包含される全てのペプチドを含有する溶液を得る。次に、混合溶液を注射用水で１：３に希釈して、３３％ＤＭＳＯ中でペプチド当たり０．８２６ｍｇ／ｍｌの濃度を得る。希釈溶液を０．２２μｍの無菌フィルターを通して濾過する。最終バルク溶液を得る。

【0411】

最終バルク溶液をバイアルに充填して、使用時まで－２０℃で保存する。１本のバイアルは、０．５７８ｍｇの各ペプチドを含有する７００μＬの溶液を含有する。この内、５００μＬ（ペプチド当たりおよそ４００μｇ）を皮内注射のために適用する。

【0412】

がんを治療するために有用であるのに加えて、本発明のペプチドは、診断法としてもまた有用である。ペプチドは食道がん細胞から生成されたので、そしてこれらのペプチドは正常組織には存在せずまたはより低レベルで存在すると判定されたので、これらのペプチドを利用してがんの存在を診断し得る。

【0413】

特許請求されるペプチドの血液サンプル中の組織生検上の存在は、がん診断において病理学者を補佐し得る。抗体、質量分析法またはその他の当該技術分野で公知の方法の手段による特定のペプチドの検出は、組織サンプルが悪性または炎症性または概して病的であることを病理学者に告げ得て、または食道がんのためのバイオマーカーとして利用され得る。ペプチド基の存在は、病的組織の分類または下位分類を可能にし得る。

【0414】

患部組織検体上のペプチドの検出は、特にＴリンパ球が作用機序に関与することが知られておりまたは予測される場合に、免疫系が関与する治療法の利点を判定できるようにする。ＭＨＣ発現の喪失は、それによって感染悪性細胞が免疫監視を逃れる、十分に説明された機序である。したがってペプチドの存在は、この機序が、分析した細胞によって活用されていないことを示す。

【0415】

本発明のペプチドは、ペプチドまたはＭＨＣ分子と複合体化したペプチドに対するＴ細胞応答または抗体応答などの、これらのペプチドに対するリンパ球応答を分析するのに使用されるかもしれない。これらのリンパ球応答は、さらなる治療段階を決定するための予後マーカーとして使用され得る。これらの応答はまた、例えば、タンパク質、核酸、自己材料のワクチン接種や、リンパ球の養子免疫伝達などの異なる手段によるリンパ球応答の誘導を目指す、免疫療法アプローチにおける代理応答マーカーとして使用され得る。遺伝子治療の設定では、副作用の評価において、ペプチドに対するリンパ球応答が考慮され得る。リンパ球応答のモニタリングはまた、例えば移植片対宿主病および宿主対移植片病の検出など、移植治療の経過観察検査のための有益な手段かもしれない。

【0416】

本発明をここで、その好ましい実施形態を描写する以下の実施例において、添付図面を参照して説明するが、それでもなお、それらには限定されないものとする。本発明の目的で、本明細書で引用される全ての参考文献は、その内容全体が参照により援用される。

【図面の簡単な説明】

【0417】

【図1A】正常組織（白色バー）および食道がん（黒色バー）における様々なペプチドの過剰提示を示す。Ａ）遺伝子記号：ＫＲＴ１４／ＫＲＴ１６、ペプチドＳＴＹＧＧＧＬＳＶ（配列番号１）組織左から右：１脂肪組織、３副腎、８動脈、５骨髄、７脳、５乳房、２軟骨、１中枢神経、１３結腸、１十二指腸、２胆嚢、５心臓、１４腎臓、２１肝臓、４４肺、４リンパ節、４白血球サンプル、３卵巣、８膵臓、５末梢神経、１腹膜、３脳下垂体、４胎盤、３胸膜、３前立腺、６直筋、７唾液腺、４骨格筋、６皮膚、２小腸、４脾臓、５胃、６精巣、３胸腺、３甲状腺、７気管、２尿管、６膀胱、２子宮、２静脈、６食道、１６食道がんサンプル。ペプチドは、４／９１肺がん上でさらに検出された。図１Ｂ）遺伝子記号：ＧＪＢ５、ペプチドＳＩＦＥＧＬＬＳＧＶ（配列番号７）。組織左から右：１脂肪組織、３副腎、８動脈、５骨髄、７脳、５乳房、２軟骨、１中枢神経、１３結腸、１十二指腸、２胆嚢、５心臓、１４腎臓、２１肝臓、４４肺、４リンパ節、４白血球サンプル、３卵巣、８膵臓、５末梢神経、１腹膜、３脳下垂体、４胎盤、３胸膜、３前立腺、６直筋、７唾液腺、４骨格筋、６皮膚、２小腸、４脾臓、５胃、６精巣、３胸腺、３甲状腺、７気管、２尿管、６膀胱、２子宮、２静脈、６食道、１６食道がんサンプル。ペプチドは、１／４３前立腺がん、１／３胆嚢がん、１／２０卵巣がん、５／９１肺がん、および１／４膀胱がん上でさらに検出された。図２Ｃ）遺伝子記号：ＰＫＰ３、ペプチドＳＬＶＳＥＱＬＥＰＡ（配列番号３４）。組織左から右：１脂肪組織、３副腎、８動脈、５骨髄、７脳、５乳房、２軟骨、１中枢神経、１３結腸、１十二指腸、２胆嚢、５心臓、１４腎臓、２１肝臓、４４肺、４リンパ節、４白血球サンプル、３卵巣、８膵臓、５末梢神経、１腹膜、３脳下垂体、４胎盤、３胸膜、３前立腺、６直筋、７唾液腺、４骨格筋、６皮膚、２小腸、４脾臓、５胃、６精巣、３胸腺、３甲状腺、７気管、２尿管、６膀胱、２子宮、２静脈、６食道、１６食道がんサンプル。ペプチドは、８／２４結腸直腸がん、１／２０卵巣がん、１／４６胃がん、５／９１肺がん、および２／４膀胱がん上でさらに検出された。図３Ｄ）遺伝子記号：ＲＮＰＥＰ、ペプチドＹＴＱＰＦＳＨＹＧＱＡＬ（配列番号３７）。組織左から右：１脂肪組織、３副腎、８動脈、５骨髄、７脳、５乳房、２軟骨、１中枢神経、１３結腸、１十二指腸、２胆嚢、５心臓、１４腎臓、２１肝臓、４４肺、４リンパ節、４白血球サンプル、３卵巣、８膵臓、５末梢神経、１腹膜、３脳下垂体、４胎盤、３胸膜、３前立腺、６直筋、７唾液腺、４骨格筋、６皮膚、２小腸、４脾臓、５胃、６精巣、３胸腺、３甲状腺、７気管、２尿管、６膀胱、２子宮、２静脈、６食道、１６食道がんサンプル。ペプチドは、１／１９膵臓がん、７／４６胃がん、および１／９１肺がん上でさらに検出された。図４Ｅ）遺伝子記号：ＮＵＰ１５５、ペプチドＡＬＱＥＡＬＥＮＡ（配列番号８０）。サンプル左から右：４細胞株（１腎臓、１膵臓、１前立腺、１骨髄性白血病）、３正常組織（１肺、１前立腺、１小腸）、４７がん組織（５脳がん、２乳がん、１結腸がん、２食道がん、１慢性白血球性白血病、２肝臓がん、２２肺がん、７卵巣がん、４前立腺がん、１直腸がん）。図５Ｆ）遺伝子記号：ＫＲＴ５、ペプチドＳＬＹＮＬＧＧＳＫＲＩＳＩ（配列番号２）。組織左から右：２０がん組織（９頭頸部がん、２食道がん、１食道および胃がん、７肺がん、１膀胱がん）。図６Ｇ）遺伝子記号：ＫＲＴ５、ペプチドＴＡＳＡＩＴＰＳＶ（配列番号３）。組織左から右：１７がん組織（２食道がん、６頭頸部がん、７肺がん、２膀胱がん）。図７Ｈ）遺伝子記号：Ｓ１００Ａ２、ペプチドＳＬＤＥＮＳＤＱＱＶ（配列番号１０）。組織左から右：７がん組織（３頭頸部がん、２食道がん、１肺がん、１膀胱がん）。図８Ｉ）遺伝子記号：ＬＡＭＢ３、ペプチドＡＬＷＬＰＴＤＳＡＴＶ（配列番号１１）。組織左から右：１２がん組織（２食道がん、１胆嚢がん、８肺がん、１皮膚がん）。図９Ｊ）遺伝子記号：ＩＬ３６ＲＮ、ペプチドＳＬＳＰＶＩＬＧＶ（配列番号１３）。組織左から右：２６がん組織（８頭頸部がん、３食道がん、１０肺がん、３皮膚がん、１膀胱がん、１子宮がん）。図１０Ｋ）遺伝子記号：ＡＮＯ１、ペプチドＬＬＡＮＧＶＹＡＡ（配列番号１５）。組織左から右：８がん組織（２食道がん、１胆嚢がん、１肝臓がん、１肺がん、１胃がん、１膀胱がん、１子宮がん）。図１１Ｌ）遺伝子記号：Ｆ７、ＩＧＨＶ４－３１、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２、ＩＧＨＧ３、ＩＧＨＧ４、ＩＧＨＭ、ペプチドＭＩＳＲＴＰＥＶ（配列番号１７）。組織左から右：１９がん組織（２食道がん、２腎臓がん、２肝臓がん、９肺がん、１リンパ節がん、１精巣がん、２膀胱がん。図１２Ｍ）遺伝子記号：ＱＳＥＲ１、ペプチドＳＬＮＧＮＱＶＴＶ（配列番号３０）。組織左から右：１細胞株（１膵臓）、１４がん組織（１頭頸部がん、１胆管がん、１脳がん、１乳がん、１食道がん、１腎臓がん、１肺がん、２皮膚がん、３膀胱がん、２子宮がん）。図１３Ｎ）遺伝子記号：ＨＡＳ３、ペプチドＹＭＬＤＩＦＨＥＶ（配列番号３２）。組織左から右：１正常組織（１子宮）、１５がん組織（１脳がん、２食道がん、１胆嚢がん、３頭頸部がん、４肺がん、４膀胱がん）。図１４Ｏ）遺伝子記号：ＰＫＰ３、ペプチドＳＬＶＳＥＱＬＥＰＡ（配列番号３４）。組織左から右：１細胞株（１膵臓）、１正常組織（１結腸）、２８がん組織（６頭頸部がん、１乳がん、１盲腸がん、３結腸がん、１結腸直腸がん、３食道がん、６肺がん、１卵巣がん、３直腸がん、３膀胱がん）。図１５Ｐ）遺伝子記号：ＳＥＲＰＩＮＨ１、ペプチドＧＬＡＦＳＬＹＱＡ（配列番号４０）。組織左から右：３細胞株（１腎臓、２膵臓）、４正常組織（１副腎、１肺、２胎盤）、４１がん組織（３頭頸部がん、３乳がん、２結腸がん、２食道がん、１胆嚢がん、１肝臓がん、１５肺がん、１卵巣がん、１膵臓がん、３直腸がん、２皮膚がん、１胃がん、４膀胱がん、２子宮がん）。図１６Ｑ）遺伝子記号：ＴＭＥＭ１３２Ａ、ペプチドＡＬＶＥＶＴＥＨＶ（配列番号５６）。組織左から右：７正常組織（５肺、１甲状腺、１気管）、６４がん組織（６頭頸部がん、１２脳がん、４乳がん、３食道がん、１胆嚢がん、５腎臓がん、２１肺がん、１リンパ節がん、７卵巣がん、１膵臓がん、１皮膚がん、２子宮がん）。図１７Ｒ）遺伝子記号：ＰＲＣ１、ペプチドＧＬＡＰＮＴＰＧＫＡ（配列番号５７）。組織左から右：１４がん組織（１頭頸部がん、１乳がん、２食道がん、６肺がん、１卵巣がん、１皮膚がん、１膀胱がん、１子宮がん）。図１８Ｓ）遺伝子記号：ＭＡＰＫ６、ペプチドＬＩＬＥＳＩＰＶＶ（配列番号５８）。組織左から右：２細胞株（１血液細胞、１皮膚）、２５がん組織（５頭頸部がん、１結腸がん、２食道がん、１白血病、８肺がん、２リンパ節がん、３皮膚がん、２膀胱がん、１子宮がん）。図１９Ｔ）遺伝子記号：ＰＰＰ４Ｒ１、ペプチドＳＬＬＤＴＬＲＥＶ（配列番号５９）。組織左から右：１正常組織（１小腸）、８がん組織（１頭頸部がん、２食道がん、４肺がん、１卵巣がん）。図２０Ｕ）遺伝子記号：ＴＰ６３、ペプチドＶＬＶＰＹＥＰＰＱＶ（配列番号７７）。組織左から右：２正常組織（１食道、１気管）、４７がん組織（８頭頸部がん、４食道がん、１胆嚢がん、１４肺がん、７リンパ節がん、２前立腺がん、１皮膚がん、８膀胱がん。図２１Ｖ）遺伝子記号：ＫＩＡＡ０９４７、ペプチドＡＶＬＰＨＶＤＱＶ（配列番号８１）。組織左から右：３細胞株（１血液細胞、１膵臓）、１２がん組織（５脳がん、２食道がん、１肺がん、３リンパ節がん、１子宮がん）。

【図1B】同上

【図1C】同上

【図1D】同上

【図1E】同上

【図1F】同上

【図1G】同上

【図1H】同上

【図1I】同上

【図1J】同上

【図1K】同上

【図1L】同上

【図1M】同上

【図1N】同上

【図1O】同上

【図1P】同上

【図1Q】同上

【図1R】同上

【図1S】同上

【図1T】同上

【図1U】同上

【図1V】同上

【図2A】正常組織（白色バー）および１１食道がんサンプル（黒色バー）のパネル中で、食道がんにおいて高度に過剰発現され、または排他的に発現される、本発明の起源遺伝子の例示的発現プロファイルを示す。組織左から右：７動脈、１脳、１心臓、２肝臓、２肺、２静脈、１脂肪組織、１副腎、４骨髄、１結腸、２食道、２胆嚢、１腎臓、６リンパ節、１膵臓、１脳下垂体、１直腸、１骨格筋、１皮膚、１小腸、１脾臓、１胃、１胸腺、１甲状腺、５気管、１膀胱、１乳房、３卵巣、３胎盤、１前立腺、１精巣、１子宮、１１食道がんサンプル。図２Ａ）遺伝子記号：ＰＴＨＬＨ；図２Ｂ）遺伝子記号：ＫＲＴ１４；図２Ｃ）遺伝子記号：ＦＡＭ８３Ａ；図２Ｄ）遺伝子記号：ＰＤＰＮ。

【図2B】同上

【図2C】同上

【図2D】同上

【図3-1】健常ＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナーのペプチド特異的生体外ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の例示的結果、すなわち、例示的免疫原性データ：ペプチド特異的多量体染色後のフローサイトメトリー結果を示す。図３Ａ）遺伝子記号：ＳＦ３Ｂ３、ペプチドＥＬＤＲＴＰＰＥＶ（配列番号９７）；図３Ｂ）遺伝子記号：ＴＮＣ、ペプチドＡＭＴＱＬＬＡＧＶ（配列番号１０１）。また、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、それぞれ、配列番号：５ペプチド（Ｃ、左側パネル）、配列番号：２ペプチド（Ｄ、左側パネル）および配列番号：７７ペプチド（Ｅ、左側パネル）と複合体形成する、抗ＣＤ２８ｍＡｂおよびＨＬＡ－Ａ＊０２で被覆された、人工ＡＰＣを用いてプライミングされた。３サイクルの刺激後、Ａ＊０２／配列番号５（Ｃ）、Ａ＊０２／配列番号２（Ｄ）またはＡ＊０２／配列番号７７（Ｅ）を用いた２Ｄ多量体染色によって、ペプチド反応性細胞の検出が実施された。右パネル（Ｃ、Ｄ、およびＥ）は、無関係のＡ＊０２／ペプチド複合体で刺激された細胞の対照染色を示す。生存一重細胞は、ＣＤ８＋リンパ球についてゲートされた。ブーリアンゲートは、異なるペプチドに対して特異的な多量体によって検出された、擬陽性事象の排除を助けた。ＣＤ８＋リンパ球の中の特異的多量体＋細胞の頻度が示される。

【図3-2】同上

【図3-3】同上

【実施例0418】

実施例１
細胞表面に提示される腫瘍関連ペプチドの同定および定量化
組織サンプル
患者の腫瘍組織は、Ａｓｔｅｒａｎｄ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＵＳＡ ａｎｄ Ｒｏｙｓｔｏｎ，Ｈｅｒｔｓ，ＵＫ）；ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘ Ｉｎｃ．，（Ｃｕｌｖｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）；Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ．（Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｔｕｂｉｎｇｅｎ． Ｎｏｒｍａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ Ａｓｔｅｒａｎｄ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＵＳＡ ａｎｄ Ｒｏｙｓｔｏｎ，Ｈｅｒｔｓ，ＵＫ）；Ｂｉｏ－Ｏｐｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．（ＣＡ，ＵＳＡ）；ＢｉｏＳｅｒｖｅ（Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）；Ｃａｐｉｔａｌ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）；Ｇｅｎｅｔｉｃｉｓｔ Ｉｎｃ．（Ｇｌｅｎｄａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｋｙｏｔｏ Ｐｒｅｆｅｃｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＫＰＵＭ）；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｍｕｎｉｃｈ；ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘ Ｉｎｃ．（Ｃｕｌｖｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｔｕｂｉｎｇｅｎ；Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ．（Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）から入手された。全ての患者の告知に基づく同意書は、外科手術または検死解剖前に得られた。組織は切除の直後に衝撃凍結されて、ＴＵＭＡＰの単離まで－７０℃未満で保存された。

【0419】

組織サンプルからのＨＬＡペプチドの単離
衝撃凍結組織サンプルからのＨＬＡペプチド貯留は、わずかに修正されたプロトコル（Ｆａｌｋ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｓｅｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９）に従って、ＨＬＡ－Ａ＊０２－特異的抗体ＢＢ７．２、ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ特異的抗体Ｗ６／３２、ＣＮＢｒ活性化セファロース、酸処理、および限外濾過を使用して、免疫沈殿によって固形組織から得られた。

【0420】

質量分析
得られたＨＬＡペプチド貯留は、逆相クロマトグラフィー（ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬ Ｃ ｓｙｓｔｅｍ、Ｗａｔｅｒｓ）によってそれらの疎水性に従って分離し、ＥＳＩ源を装着したＬＴＱ－ｖｅｌｏｓおよびｆｕｓｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄ質量分光計（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ）内で溶出ペプチドを分析した。ペプチド貯留は、毎分４００ｎＬの流速を適用して、１．７μｍ Ｃ１８逆相材料（Ｗａｔｅｒｓ）で充填された分析用融合シリカマイクロキャピラリーカラム（７５μｍ内径×２５０ｍｍ）上に直接挿入した。引き続いて、毎分３００ｎＬの流速で１０％から３３％へのＢの二段階１８０分間二成分勾配を用いて、ペプチドを分離した。勾配は、溶媒Ａ（水中の０．１％ギ酸）および溶媒Ｂ（アセトニトリル中の０．１％ギ酸）から構成された。ｎａｎｏＥＳＩ源への導入には、金被覆ガラス毛管（ＰｉｃｏＴｉｐ，Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）を使用した。ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分光計は、ＴＯＰ５ストラテジーを使用してデータ依存モードで操作した。手短に述べると、Ｏｒｂｉｔｒａｐ（Ｒ＝３００００）内の高質量精度の完全スキャンでスキャンサイクルを開始し、これもまたＯｒｂｉｔｒａｐ（Ｒ＝７５００）内の５種の最も豊富な前駆イオンのＭＳ／ＭＳスキャンがそれに続き、以前選択されたイオンは動的に排除された。タンデム質量スペクトルは、ＳＥＱＵＥＳＴおよび追加的な手動調節によって解釈した。同定されたペプチド配列は、生成された天然ペプチド断片化パターンと、配列が同一の合成参照ペプチドの断片化パターンとの比較によって確認した。

【0421】

イオン計数によって、すなわちＬＣ－ＭＳ特性の抽出と解析（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）によって、無標識相対ＬＣ－ＭＳ定量化を実施した。方法は、ペプチドのＬＣ－ＭＳシグナル面積が、サンプル中のその存在量と相関すると仮定する。抽出された特性は、電荷状態デコンボリューションと滞留時間アライメント（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｓｔｕｒｍ ｅｔ ａｌ．，２００８）によってさらに処理した。最終的に、全てのＬＣ－ＭＳ特性を配列同定結果と相互参照して、異なるサンプルの定量的データと、組織からペプチドへの提示プロファイルとを組み合わせた。定量的データは、技術的および生物学的反復試験内の変動を考慮した中心傾向に従って、二段法で正規化された。このようにして、それぞれの同定されたペプチドが定量的データに関連付けられ得て、サンプルと組織との間の相対定量化ができるようになる。さらに、ペプチド候補について得られた全ての定量的データを手動で検査し、データ整合性を保証して自動解析の確度を確認した。各ペプチドについて提示プロファイルを計算し、平均サンプル提示ならびに反復試験変動を示した。プロファイルは、食道がんサンプルを正常組織サンプルのベースラインに並置する。

【0422】

例示的過剰提示ペプチドの提示プロファイルは、図１に示される。代表的ペプチドの提示スコアは、表８に示される。

【0423】

表8: 提示スコア。表は、正常組織パネルと比較して腫瘍上で非常に高度に過剰提示され(+++)、正常組織パネルと比較して腫瘍上で高度に過剰提示され(++)、正常組織パネルと比較して腫瘍上で過剰提示される(+)、ペプチドを列挙する。正常組織のパネルは、脂肪組織、副腎、動脈、静脈、骨髄、脳、中央および末梢神経、結腸、直腸、十二指腸を含む小腸、食道、胆嚢、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、単核白血球細胞、膵臓、腹膜、下垂体、胸膜、唾液腺、骨格筋、皮膚、脾臓、胃、胸腺、甲状腺、気管、尿管、膀胱からなった。

【表8-1】

【表8-2】

【表8-3】

【0424】

実施例２
本発明のペプチドをコードする遺伝子発現プロファイリング
正常細胞と比較した腫瘍細胞上のペプチドの過剰提示または特異的提示は、免疫療法におけるその有用性にとって十分であり、いくつかのペプチドは、それらの起源タンパク質が正常組織にもまた存在するにもかかわらず、腫瘍特異的である。それでもなお、ｍＲＮＡ発現プロファイリングは、免疫療法のためのペプチド標的の選択において、安全性のレベルを高めることができる。特に、アフィニティ成熟ＴＣＲなどの安全性リスクが高い治療の選択肢では、理想的な標的ペプチドは、腫瘍に特有で正常組織上には見いだされないタンパク質に由来する。

【0425】

ＲＮＡ起源および調製
外科的に除去された組織標本は、告知に基づく同意書が各患者から入手された後に、上述の通り提供された（実施例１を参照されたい）。腫瘍組織標本を手術直後にスナップ凍結し、その後、液体窒素下で乳鉢と乳棒を用いて均質化した。ＴＲＩ試薬（Ａｍｂｉｏｎ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、これらのサンプルから全ＲＮＡを調製し、ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）による精製がそれに続き；どちらの方法も製造業者のプロトコルに従って実施した。

【0426】

ＲＮＡＳｅｑ実験のための腫瘍組織からの全ＲＮＡは、Ｐｒｏｔｅｏ Ｇｅｎｅｘ Ｉｎｃ．（Ｃｕｌｖｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）；Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ．（Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）から入手された。ＲＮＡＳｅｑ実験のための健常ヒト組織からの全ＲＮＡは、Ａｓｔｅｒａｎｄ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＵＳＡ ａｎｄ Ｒｏｙｓｔｏｎ，Ｈｅｒｔｓ，ＵＫ）；Ｐｒｏｔｅｏ Ｇｅｎｅｘ Ｉｎｃ．（Ｃｕｌｖｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）；Ｇｅｎｅｔｉｃｉｓｔ Ｉｎｃ．（Ｇｌｅｎｄａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）；Ｉｓｔｉｔｕｔｏ Ｎａｚｉｏｎａｌｅ Ｔｕｍｏｒｉ”Ｐａｓｃａｌｅ”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｖｉｒａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｔ（ＩＲＣＣＳ）（Ｎａｐｌｅｓ，Ｉｔａｌｙ）；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（Ｇｅｒｍａｎｙ）；ＢｉｏＣａｔ ＧｍｂＨ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手された。

【0427】

全てのＲＮＡサンプルの品質および量は、ＲＮＡ ６０００ Ｐｉｃｏ ＬａｂＣｈｉｐキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で評価した。

【0428】

ＲＮＡｓｅｑ実験
腫瘍および正常組織ＲＮＡサンプルの遺伝子発現解析は、ＣｅＧａＴ（Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、次世代配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）によって実施した。簡単に述べると、配列決定ライブラリーは、ＲＮＡ断片化、ｃＤＮＡ転換、および配列決定アダプターの付加を含む、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ｖ４試薬キットを使用して、販売業者（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）のプロトコルに従って作製される。複数のサンプルに由来するライブラリーは等モル混合され、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００配列決定装置上で、製造会社の使用説明書に従って配列決定され、５０ｂｐのシングルエンドリードが生成される。処理された読み取りは、ＳＴＡＲソフトウェアを使用して、ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８）にマッピングされる。発現データは、ｅｎｓｅｍｂｌ配列データベース（Ｅｎｓｅｍｂｌ７７）の注釈に基づいて、ＲＰＫＭ（１００万個のマッピングされた読み取り当たりキロベース当たり読み取り、ソフトウェアＣｕｆｆｌｉｎｋｓによって生成される）として転写物レベルで、そしてエクソンレベルで（全読み取り、ソフトウェアＢｅｄｔｏｏｌｓによって生成される）提供される。エクソン読み取りは、エクソン長さおよびアライメントサイズについて正規化されて、ＲＰＫＭ値が得られる。

【0429】

食道がんにおいて高度に過剰発現され、または排他的に発現される本発明の起源遺伝子の代表的発現プロファイルは、図２に示される。さらなる例示的遺伝子の発現スコアは、表９に示される。

【0430】

表9: 発現スコア。表は、正常組織パネルと比較して腫瘍において非常に高度に過剰発現され(+++)、正常組織パネルと比較して腫瘍において高度に過剰発現され(++)、正常組織パネルと比較して腫瘍において過剰発現される(+)、遺伝子に由来するペプチドを列挙する。スコアのベースラインは、脂肪組織、副腎、動脈、骨髄、脳、結腸、食道、胆嚢、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、膵臓、下垂体、直腸、骨格筋、皮膚、小腸、脾臓、胃、胸腺、甲状腺、気管、膀胱、静脈の正常組織の測定値から計算された。

【表9-1】

【表9-2】

【0431】

実施例３
ＭＨＣクラスＩ提示ペプチドの生体外免疫原性
本発明のＴＵＭＡＰの免疫原性に関する情報を得るために、本発明者らは、ペプチド／ＭＨＣ複合体および抗ＣＤ２８抗体を負荷した人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）によるＣＤ８＋Ｔ細胞の反復刺激に基づく、生体外Ｔ細胞プライミングアッセイを用いて研究を実施した。このようにして、本発明者らは、本発明のＨＬＡ－Ａ＊０２０１拘束性ＴＵＭＡＰの免疫原性を示し得て、これらのペプチドが、それに対するＣＤ８＋前駆Ｔ細胞がヒトに存在する、Ｔ細胞エピトープであることを実証した（表１０）。

【0432】

ＣＤ８＋Ｔ細胞の生体外プライミング
ペプチドＭＨＣ複合体（ｐＭＨＣ）および抗ＣＤ２８抗体を負荷した、人工抗原提示細胞による生体外刺激を実施するために、本発明者らは、最初に、告知に基づく同意後に、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｃｌｉｎｉｃｓ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙから得られた健常ドナーのＣＤ８ミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ－Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した正の選択を通じて、新鮮ＨＬＡ－Ａ＊０２白血球除去生成物からＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。

【0433】

ＰＢＭＣおよび単離ＣＤ８＋リンパ球またはＰＢＭＣは、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｉｄｅｎｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＣＣ Ｐｒｏ，Ｏｂｅｒｄｏｒｌａ，Ｇｅｒｍａｎｙ），２０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ）を添加した、ＲＰＭＩ－Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からなるＴ細胞培地（ＴＣＭ）中で、使用時まで培養した。２．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および１０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ，Ｎｕｒｎｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）もまた、この段階でＴＣＭに添加した。

【0434】

ｐＭＨＣ／抗ＣＤ２８被覆ビーズの生成、Ｔ細胞刺激、および読み取りは、高度に定義された生体外システム内で、刺激条件当たり４種の異なるｐＭＨＣ分子と、読み取り条件当たり８種の異なるｐＭＨＣ分子を使用して実施した。

【0435】

製造会社（Ｐｅｒｂｉｏ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が推奨する通りにスルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドビオチンを使用して、精製共刺激マウスＩｇＧ２ａ抗ヒトＣＤ２８ Ａｂ９．３（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８７）を化学的にビオチン化した。使用されたビーズは、直径５．６μｍのストレプトアビジン被覆ポリスチレン粒子（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）であった。

【0436】

陽性および陰性対照刺激のために使用されたｐＭＨＣは、それぞれ、Ａ＊０２０１／ＭＬＡ－００１（修飾Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１に由来するペプチドＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１０２））およびＡ＊０２０１／ＤＤＸ５－００１（ＤＤＸ５に由来するＹＬＬＰＡＩＶＨＩ、配列番号１０３）であった。

【0437】

４×１２．５ｎｇの異なるビオチンｐＭＨＣの存在下で、８００，０００個のビーズ／２００μｌを９６ウェルプレート内で被覆し、洗浄して、引き続いて２００μｌの容量中で６００ｎｇのビオチン抗ＣＤ２８を添加した。５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）を添加した２００μｌのＴＣＭ中で、１×１０^６のＣＤ８＋Ｔ細胞を２×１０^５個の洗浄被覆ビーズと、３７℃で３日間にわたり同時インキュベートすることで、９６ウェルプレート内で刺激を開始した。次に８０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を添加した新鮮ＴＣＭで培地の半分を交換し、３７℃で４日間にわたり培養を継続した。この刺激サイクルを合計３回実施した。条件当たり８種の異なるｐＭＨＣ分子を使用したｐＭＨＣ多量体読み取りでは、５種の異なる蛍光色素への共役を包含するわずかな修正を加えて、以前記載されたような（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）二次元コンビナトリアルコーディングアプローチを使用した。最後に、Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ近赤外染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＣＤ８－ＦＩＴＣ抗体クローンＳＫ１（ＢＤ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、および蛍光性ｐＭＨＣ多量体による細胞の染色によって多量体解析を実施した。解析では、適切なレーザーおよびフィルターを装着したＢＤ ＬＳＲＩＩ ＳＯＲＰ血球計数器を使用した。ペプチド特異的細胞を全ＣＤ８＋細胞の百分率として計算した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）を使用して、多量体解析の評価を実施した。陰性対照刺激と比較することで、特異的多量体＋ＣＤ８＋リンパ球の生体外初回刺激を検出した。１人の健常ドナーの少なくとも１つの評価可能生体外刺激ウェルが、生体外刺激後に、特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞株を含有することが判明したら、所与の抗原の免疫原性が検出された（すなわちこのウェルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞内に少なくとも１％の特異的多量体＋を含有し、特異的多量体＋細胞の百分率は、陰性対照刺激の中央値の少なくとも１０倍であった）。

【0438】

食道がんペプチドの生体外免疫原性
ＨＬＡクラスＩペプチドを試験するために、ペプチド特異的Ｔ細胞株の生成によって生体外免疫原性が実証され得た。本発明の２つのペプチド（配列番号９７および配列番号１０１）に対するＴＵＭＡＰ特異的多量体染色後の例示的フローサイトメトリー結果は、対応する陰性対照と共に図３に示される。本発明からの５種のペプチドの結果は、表１０Ａに要約される。

【0439】

表１０Ａ: 本発明のHLAクラスIペプチドの生体外免疫原性
出願人によって実施された本発明のペプチドの生体外免疫原性実験の例示的結果。<20 % = +; 20 % - 49 % = ++; 50 % - 69 %= +++; >= 70 % = ++++

【表10A】

【0440】

表１０Ｂ: 本発明のHLAクラスIペプチドの生体外免疫原性
出願人によって実施された本発明のペプチドの生体外免疫原性実験の例示的結果。生体外免疫原性実験の結果が示される。陽性ウェルおよびドナーの百分率(評価可能内の)は、示されるように要約される <20 % = +; 20 % - 49 % = ++; 50 % - 69 %= +++; >= 70 %= ++++

【表10B】

【0441】

実施例４
ペプチドの合成
Ｆｍｏｃストラテジーを使用した標準的な十分に確立された固相ペプチド合成を使用して、全てのペプチドを合成した。個々のペプチドのアイデンティティーおよび純度は、質量分析および分析用ＲＰ－ＨＰＬＣによって判定された。ペプチドは、純度＞５０％の白色から灰白色の凍結乾燥物（トリフルオロ酢酸塩）として得られた。全てのＴＵＭＡＰは、好ましくはトリフルオロ酢酸塩または酢酸塩として投与され、その他の塩形態もまた可能である。

【0442】

実施例５
ＭＨＣ結合アッセイ
本発明によるＴ細胞ベースの治療法のための候補ペプチドを、それらのＭＨＣ結合能力（親和性）についてさらに試験した。個々のペプチド－ＭＨＣ複合体は、ＵＶリガンド交換によって生成され、ＵＶ感受性ペプチドはＵＶ照射に際して切断されて、分析される目的ペプチドで交換された。ペプチド受容性ＭＨＣ分子と効果的に結合して安定化し得るペプチド候補のみが、ＭＨＣ複合体の分離を防止する。交換反応の収率を判定するために、安定化ＭＨＣ複合体の軽鎖（β２ｍ）の検出に基づくＥＬＩＳＡを実施した。アッセイは、Ｒｏｄｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．（Ｒｏｄｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，２００６）に一般的に記載されるようにして実施した。

【0443】

９６ウェルＭＡＸＩＳｏｒｐプレート（ＮＵＮＣ）をＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌストレプトアビジンにより室温で一晩被覆して４回洗浄し、ブロック緩衝液を含有する２％ＢＳＡ中で３７℃で１時間ブロックした。再折りたたみされたＨＬＡ－Ａ＊０２０１０２：０１／ＭＬＡ－００１単量体が、１５～５００ｎｇ／ｍｌの範囲をカバーする標準物質の役割を果たした。ＵＶ交換反応のペプチド－ＭＨＣ単量体をブロック緩衝液で１００倍に希釈した。サンプルを３７℃で１時間インキュベートして４回洗浄し、２ｕｇ／ｍｌのＨＲＰ共役結合抗β２ｍと共に３７℃で１時間インキュベートして再度洗浄し、ＮＨ_２ＳＯ_４で停止させたＴＭＢ溶液で検出した。吸収は、４５０ｎｍで測定された。抗体またはそれらのフラグメント、および／またはＴ細胞受容体またはそれらのフラグメントの生成および製造のためには、高い交換収率（好ましくは５０％より高い、最も好ましくは７５％より高い）を示す候補ペプチドが、ＭＨＣ分子に対する十分な結合活性を示してＭＨＣ複合体の分離を防止することから、一般に好ましい。

【0444】

表11: MHCクラスI結合スコア。
HLAクラスI拘束性ペプチドとHLA-A*02:01との結合は、ペプチド交換収率によって変動した：>10% = +; >20% =++; >50 = +++; > 75% = ++++

【表11-1】

【表11-2】

【表11-3】

【0445】

実施例６
細胞表面に提示される腫瘍関連ペプチドの絶対定量化
抗体および／またはＴＣＲなどのバインダーの生成は、骨の折れる工程であり、いくつかの選択された標的に対してのみ実施されてもよい。腫瘍関連および特異的ペプチドの場合、選択基準としては、提示の排他性および細胞表面に提示されるペプチドの密度が挙げられるが、これに限定されない。固形腫瘍サンプル中の細胞当たりのＴＵＭＡＰコピーの定量化は、単離されたＴＵＭＡＰの絶対定量化、ＴＵＭＡＰ単離の効率、および分析される組織サンプルの細胞計数を必要とする。

【0446】

ナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるペプチド定量化
質量分析によるペプチドの正確な定量化のために、内標準法を使用して各ペプチドの検量線を作成した。内標準は各ペプチドの二重同位体標識変異体であり、すなわち、２つの同位体標識アミノ酸がＴＵＭＡＰ合成に含まれた。それは、腫瘍関連ペプチドとはその質量異なるのみであるが、他の物理化学的性質に差異を示さない（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。内標準を各ＭＳサンプルに添加して、全てのＭＳシグナルを内標準のＭＳシグナルに対して正規化し、ＭＳ実験間の潜在的な技術的変動を平準化した。

【0447】

少なくとも３つの異なるマトリックス中、すなわち、ルーチンのＭＳサンプルと同様の天然サンプルからのＨＬＡペプチド溶出液中で検量線を作成し、各調製物を二連のＭＳ試験で測定した。評価のために、ＭＳシグナルを内標準のシグナルに対して正規化し、検量線をロジスティック回帰によって算出した。

【0448】

組織サンプルからの腫瘍関連ペプチドの定量化のためには、それぞれのサンプルにも内標準が添加され、ＭＳシグナルが、内標準に対して正規化され、ペプチド検量線を使用して定量化された。

【0449】

ペプチド／ＭＨＣ単離の効率
あらゆるタンパク質精製処理と同様に、組織サンプルからのタンパク質の単離には、目的タンパク質のいくらかの損失が伴う。ＴＵＭＡＰ単離の効率を判定するために、絶対定量化のために選択された全てのＴＵＭＡＰについて、ペプチド／ＭＨＣ複合体を生成した。添加されたものを天然ペプチド／ＭＨＣ複合体から識別できるように、ＴＵＭＡＰの単一同位体標識バージョンが使用され、すなわち、１つの同位体標識アミノ酸がＴＵＭＡＰ合成に含まれた。これらの複合体は、新鮮に調製された組織溶解産物に、すなわち、ＴＵＭＡＰ単離手順の可能な限り早い時点で添加され、次に、以下の親和性精製において、天然ペプチド／ＭＨＣ複合体のように捕捉された。したがって単一標識ＴＵＭＡＰの回収率を測定することで、個々の天然ＴＵＭＡＰの単離効率に関する結論が可能になる。

【0450】

少数のサンプルで単離効率が分析され、これらの組織サンプル間で同等であった。対照的に、単離効率は個々のペプチド間で異なる。これは、単離効率が、限定数の組織サンプルにおいてのみ判定されるが、任意のその他の組織標本に外挿されてもよいことを提案する。しかしながら、単離効率がペプチドからその他のペプチドに外挿されないこともあるので、各ＴＵＭＡＰは個別に分析する必要がある。

【0451】

固体冷凍組織中の細胞数測定
絶対ペプチド定量化に供した組織サンプルの細胞数を測定するために、本発明者らは、ＤＮＡ含量分析を適用した。この方法は、異なる起点の幅広いサンプルに、最も重要なことには、冷凍サンプルに適用できる（Ａｌｃｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｆｏｒｓｅｙ ａｎｄ Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ，２００９；Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ペプチド単離プロトコル中に、組織サンプルを均質溶解産物に処理して、それから小さな溶解産物アリコートを取り出す。アリコートを３つに分割し、それからＤＮＡを単離する（ＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。蛍光ベースのＤＮＡ定量化アッセイ（Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、少なくとも２つの反復試験において、各ＤＮＡ単離からの全ＤＮＡ含有量を定量化する。

【0452】

細胞数を計算するために、一連の定義された細胞数がある、単一健常血液細胞のアリコートから、ＤＮＡ標準曲線を作成した。標準曲線を使用して、各ＤＮＡ単離物からの全ＤＮＡ含有量から、全細胞含有量を計算する。既知の溶解産物アリコートの容量および全溶解産物容量を考慮して、ペプチド単離のために使用された組織サンプルの平均総細胞数を外挿する。

【0453】

ペプチド細胞当たりコピー数
前述の実験のデータを用いて、本発明者らは、サンプルの全ペプチド量を総細胞数で除算して、それに続いて単離効率により除算することで、細胞当たりのＴＵＭＡＰコピー数を算出した。選択されたペプチドの細胞コピー数は、表１２に示される。

【0454】

表12: 絶対コピー数。表は、NSCLC腫瘍サンプルにおける絶対ペプチド定量化の結果を列挙する。細胞当たりコピー数の中央値が、各ペプチドについて示される： <100 = +; >=100 =++; >=1,000 +++; >=10,000 = ++++。評価可能な高品質MSデータが利用できるサンプル数が示される。

【表12】

【0455】

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【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【図1I】

【図1J】

【図1K】

【図1L】

【図1M】

【図1N】

【図1O】

【図1P】

【図1Q】

【図1R】

【図1S】

【図1T】

【図1U】

【図1V】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【配列表】

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