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特開2024-41920製薬におけるフェノチアジン類又は類似の構造を持つ化合物の新しい使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024041920
(43)【公開日】2024-03-27
(54)【発明の名称】製薬におけるフェノチアジン類又は類似の構造を持つ化合物の新しい使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/5415 20060101AFI20240319BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240319BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240319BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240319BHJP
【ＦＩ】
A61K31/5415
A61K35/17
A61P35/00
A61P43/00 121
A61P43/00 111
【審査請求】有
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024003683
(22)【出願日】2024-01-15
(62)【分割の表示】P 2022513507の分割
【原出願日】2020-08-25
(31)【優先権主張番号】201910792478.5
(32)【優先日】2019-08-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】516234063
【氏名又は名称】広州威溶特医薬科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＧＵＡＮＧＺＨＯＵ ＶＩＲＯＴＥＣＨ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ４１６－４２８， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ Ｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｎｏ．３， Ｌａｎｙｕｅ Ｒｏａｄ， Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｋ， Ｈｉｇｈ－ｔｅｃｈ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１０６６３ （ＣＮ）
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100150500
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 靖
(74)【代理人】
【識別番号】100176474
【弁理士】
【氏名又は名称】秋山 信彦
(72)【発明者】
【氏名】陳 良
(72)【発明者】
【氏名】范 真真
(72)【発明者】
【氏名】賀 嵩敏
(72)【発明者】
【氏名】陳 ▲ジエ▼思
(72)【発明者】
【氏名】サンダー，マックス
(72)【発明者】
【氏名】▲ゴン▼ 守芳
(72)【発明者】
【氏名】楊 暁志
(72)【発明者】
【氏名】林 子青
(57)【要約】 （修正有）
【課題】癌治療用の医薬組成物、キット、および製薬におけるフェノチアジン系化合物の新しい使用を提供する。
【解決手段】（ａ）第１の有効成分として、養子細胞療法に適した免疫細胞と、（ｂ）第２の有効成分として、式（Ｉ）で示される化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択される遊離フェノチアジン系化合物とを含む、癌治療用の医薬組成物である。
ここで、前記免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球、キメラ抗原受容体Ｔ細胞、キメラ抗原受容体ＮＫ細胞、及びＴ細胞受容体キメラＴ細胞からなる群から選択される。前記フェノチアジン系化合物はＰＤ－１の機能を阻害し、ＰＤ－１のシグナル伝達を阻止することができ、ＰＤ－１シグナル伝達阻害剤として有用である。
【選択図】なし
【解決手段】（ａ）第１の有効成分として、養子細胞療法に適した免疫細胞と、（ｂ）第２の有効成分として、式（Ｉ）で示される化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択される遊離フェノチアジン系化合物とを含む、癌治療用の医薬組成物である。
ここで、前記免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球、キメラ抗原受容体Ｔ細胞、キメラ抗原受容体ＮＫ細胞、及びＴ細胞受容体キメラＴ細胞からなる群から選択される。前記フェノチアジン系化合物はＰＤ－１の機能を阻害し、ＰＤ－１のシグナル伝達を阻止することができ、ＰＤ－１シグナル伝達阻害剤として有用である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）養子細胞療法に適した免疫細胞と、
（ｂ）式（Ｉ）で示される化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択されるフェノチアジン系化合物とを含む、医薬組成物。
（ここで、ＺはＳ＋、Ｏ＋、Ｃ又はＮから選択され、
Ｙは、Ｎ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。）
（ｂ）式（Ｉ）で示される化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択されるフェノチアジン系化合物とを含む、医薬組成物。
【化1】
Ｙは、Ｎ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。）
【請求項2】
前記Ｘ－は、Ｃｌ－、Ｂｒ－、Ｉ－、メタンスルホン酸根アニオン、エタンスルホン酸根アニオン、ｐ－トルエンスルホン酸根アニオン、ベンゼンスルホン酸根アニオン、エタネジスルホン酸根アニオン、プロパンジスルホン酸根アニオン、及びナフタレンジスルホン酸根アニオンから選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のＣ１～Ｃ６アルキル、置換又は無置換のＣ３～Ｃ８シクロアルキル、置換又は無置換の３～８員ヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のＣ５～Ｃ１０アリール、置換又は無置換の５～１０員ヘテロアリール、置換又は無置換のＣ１～Ｃ６アルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記フェノチアジン系化合物は式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
（ここで、Ｘ－は１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成する。）
【化2】
【請求項5】
前記フェノチアジン系化合物は式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）、その水和物又は溶媒和物から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
（ここで、Ｘ－は１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成する。）
【化3】
【請求項6】
前記フェノチアジン系化合物は３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリドである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記フェノチアジン系化合物はＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアモニウムビスジメシレートである、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）、キメラ抗原受容体ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ細胞）、及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）キメラＴ細胞から選択される、請求項１～７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記免疫細胞はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）キメラＴ細胞である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記ＴＣＲはＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに結合可能である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
ａ）第１の製剤に配合された養子細胞療法に適した免疫細胞と、
ｂ）第２の製剤に配合され、式（Ｉ）で示される化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択されるフェノチアジン系化合物とを含む、キット。
（ここで、ＺはＳ＋、Ｏ＋、Ｃ又はＮから選択され、
Ｙは、Ｎ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。）
ｂ）第２の製剤に配合され、式（Ｉ）で示される化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択されるフェノチアジン系化合物とを含む、キット。
【化4】
Ｙは、Ｎ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。）
【請求項12】
癌治療薬の製造における式（Ｉ）で示される化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態の使用。
（ここで、Ｚは、Ｓ＋、Ｏ＋、Ｃ又はＮから選択され、
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。）
【化5】
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。）
【請求項13】
前記フェノチアジン系化合物は式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択される、請求項１２に記載の使用。
（ここで、Ｘ－は１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成する。）
【化6】
【請求項14】
前記フェノチアジン系化合物は式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）、その水和物又は溶媒和物から選択される、請求項１２に記載の使用。
（ここで、Ｘ－は１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成する。）
【化7】
【請求項15】
前記フェノチアジン系化合物は３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリドである、請求項１２に記載の使用。
【請求項16】
前記フェノチアジン系化合物はＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアモニウムビスジメシレートである、請求項１４に記載の使用。
【請求項17】
前記癌は黒色腫、胸腺腫瘍、肺癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、リンパ腫、食道癌、膀胱癌、尿道癌、非ホジキンリンパ腫、腎臓癌又は脳腫瘍である、請求項１２に記載の使用。
【請求項18】
ＰＤ－１シグナル伝達阻害剤の製造におけるフェノチアジン系化合物の使用であって、前記フェノチアジン系化合物は式（Ｉ）で示される化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択される使用。
（ここで、Ｚは、Ｓ＋、Ｏ＋、Ｃ又はＮから選択され、
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。）
【化8】
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。）
【請求項19】
免疫細胞機能を向上させる薬物の製造におけるフェノチアジン系化合物の使用であって、前記フェノチアジン系化合物は式（Ｉ）で示される化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択される使用。
（ここで、ＺはＳ＋、Ｏ＋、Ｃ又はＮから選択され、
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。）
【化9】
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。）
【請求項20】
ＰＤ－１によるＳＨＰ２タンパク質リクルートを遮断する薬物の製造におけるフェノチアジン系化合物の使用であって、前記フェノチアジン系化合物は式（Ｉ）で示される化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択される使用。
（ここで、ＺはＳ＋、Ｏ＋、Ｃ又はＮから選択され、
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。）
【化10】
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。）
【請求項21】
Ｘ－は、Ｃｌ－、Ｂｒ－、Ｉ－、メタンスルホン酸根アニオン、エタンスルホン酸根アニオン、ｐ－トルエンスルホン酸根アニオン、ベンゼンスルホン酸根アニオン、エタネジスルホン酸根アニオン、プロパンジスルホン酸根アニオン、及びナフタレンジスルホン酸根アニオンから選択される、請求項１８～２０のいずれかに記載の使用。
【請求項22】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のＣ１～Ｃ６アルキル、置換又は無置換のＣ３～Ｃ８シクロアルキル、置換又は無置換の３～８員ヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のＣ５～Ｃ１０アリール、置換又は無置換の５～１０員ヘテロアリール、置換又は無置換のＣ１～Ｃ６アルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される、請求項１８～２０のいずれかに記載の使用。
【請求項23】
前記フェノチアジン系化合物は式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択される、請求項１８～２０のいずれかに記載の使用。
（ここで、Ｘ－は１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成する。）
【化11】
【請求項24】
前記フェノチアジン系化合物は式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）、その水和物又は溶媒和物から選択される、請求項１８～２０のいずれかに記載の使用。
（ここで、Ｘ－は１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成する。）
【化12】
【請求項25】
前記フェノチアジン系化合物は３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリド又はＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアモニウムビスジメシレートである、請求項１８～２０のいずれかに記載の使用。
【請求項26】
（ａ）式（Ｉ）で示される化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択されるフェノチアジン系化合物と、
（ｂ）癌治療用の第２の治療剤とを含む、癌治療用の薬物組成物。
（ここで、ＺはＳ＋、Ｏ＋、Ｃ又はＮから選択され、
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。）
（ｂ）癌治療用の第２の治療剤とを含む、癌治療用の薬物組成物。
【化13】
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。）
【請求項27】
前記フェノチアジン系化合物は式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択される、請求項２６に記載の薬物組成物。
（ここで、Ｘ－は１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成する。）
【化14】
【請求項28】
前記フェノチアジン系化合物は式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）、その水和物又は溶媒和物から選択される、請求項２６に記載の薬物組成物。
（ここで、Ｘ－は１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成する。）
【化15】
【請求項29】
前記フェノチアジン系化合物は３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリド又はＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアモニウムビスジメシレートである、請求項２６に記載の薬物組成物。
【請求項30】
前記第２の化学療法剤は腫瘍免疫治療剤である、請求項２６に記載の薬物組成物。
【請求項31】
前記腫瘍免疫治療剤はＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体又はその機能的断片である、請求項２６に記載の薬物組成物。
【請求項32】
（ａ）第１の製剤に配合され、式（Ｉ）で示される化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択されるフェノチアジン系化合物と、
（ｂ）第２の製剤に配合される癌治療用の第２の治療剤とを含む癌治療用のキット。
（ここで、ＺはＳ＋、Ｏ＋、Ｃ又はＮから選択され、
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。）
（ｂ）第２の製剤に配合される癌治療用の第２の治療剤とを含む癌治療用のキット。
【化16】
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医薬技術分野に関し、特に、製薬におけるフェノチアジン類又は類似の構造を持つ化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態の新しい使用に関する。本発明の別の態様は、フェノチアジン系化合物と養子細胞療法の併用に関する。本発明の別の態様は、フェノチアジン系化合物と腫瘍免疫化学療法剤、特にＰＤ－１抗体との併用に関する。
【背景技術】
【0002】
養子細胞療法（Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）は、哺乳動物から１つ又は複数の異なるタイプの免疫細胞を採取し、採取した免疫細胞をエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で培養及び／又は操作し、培養及び／又は操作した免疫細胞を哺乳動物に戻すことを含む治療方法である。採取された免疫細胞に対するエクスビボ操作は、組換え核酸を免疫細胞に導入することを含む。養子細胞療法には、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ、Ｔｕｍｏｒ Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ）、サイトカイン誘導キラー細胞（ＣＩＫ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ）、樹状細胞（ＤＣ、Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ、Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ）、Ｔ細胞受容体キメラ－Ｔ細胞（ＴＣＲ－Ｔ、Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＴＣＲ－Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌ）、キメラ抗原受容体ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ）、及びキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ、Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌ）などが含まれるが、これらに限定されない。
【0003】
人体免疫系は外来から侵入した病原微生物や変異した細胞に対抗し、除去することができ、免疫細胞は人体免疫機能を実行する重要な細胞である。その中で、Ｔ細胞は人体内の重要な免疫細胞であり、その細胞表面に発現した抗原受容体（ＴＣＲ）を介して標的細胞上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によって提示された抗原を認識することができ、これは第１のシグナルと呼ばれる。標的細胞の適切な第２のシグナル（例えばＢ７分子）との相乗作用により、Ｔ細胞は活性化され、その機能を発揮する。例えば、Ｔ細胞の１つのサブクラスである細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬと略称する）は、活性化された後に標的細胞を直接殺傷することで、ウイルスで感染された細胞や腫瘍細胞を除去することができる。
【0004】
Ｔ細胞が活性化される過程で、Ｔ細胞は負のフィードバックを発現してその免疫機能を阻害するいくつかの分子を開始し、ＰＤ－１（すなわちｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ １、プログラム細胞死１）はその中で最も知られている分子の１つである。ＣＴＬ細胞表面のＰＤ－１タンパク質がそのリガンド（通常は標的細胞（例えば腫瘍細胞）上のＰＤ－Ｌ１）によって刺激されると、ＰＤ－１はそのシグナル伝達を開始し、ＣＴＬの機能を阻害し、Ｔ細胞のアポトーシス又はアネルギーを引き起こす。このようなシグナル伝達により、ＣＴＬは標的細胞を殺傷する機能を失う。ヒトの腫瘍細胞を例にとると、これらの腫瘍細胞は通常、細胞表面にＰＤ－Ｌ１を発現し、ＣＴＬによるその殺傷を阻害し、これにより免疫モニタリングを回避することができる。一方、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の相互作用を薬物で遮断すると、ＰＤ－１のシグナル伝達が阻害され、腫瘍細胞に対するＣＴＬの殺傷能力が回復する。Ｔ細胞に加えて、他の免疫細胞もＰＤ－１を発現することができる。例えばマクロファージ、Ｂ細胞などではＰＤ－１の発現が報告されている。適切な薬物でＰＤ－１の機能を阻害すると、これらの免疫細胞の機能はある程度回復する。例えば、ＰＤ－１の機能を阻害すると、マクロファージはＭ２（すなわちＣＴＬの機能を阻害するタイプ）からＭ１（すなわちＣＴＬの機能を促進するタイプ）に変化し、生体内の腫瘍細胞を除去する。現在、抗体系薬物などの生物製剤は臨床治療用としてＦＤＡの承認を得ている。しかし、これまで臨床的に使用されているＰＤ－１に対する薬物はすべて生物製剤系抗体であり、小分子化合物のＰＤ－１シグナル伝達阻害剤については報告されていない。
【0005】
https://baike.baidu.com/item/%E6%B0%AF%E5%8C%96%E7%89%A9https://baike.baidu.com/item/%E6%9F%93%E6%96%99メチレンブルー（３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリド）はフェノチアジン塩であり、化学指示薬、染料、生物染色剤などに広く応用されている。最近、いくつかの研究は薬物におけるその使用を報告しており、例えば、中国特許公告番号ＣＮ １０４０２７３３８Ａはメチレンブルーの抗急性脳虚血の新しい用途を開示し、中国特許公告番号ＣＮ １０３４１７５４６Ｂはメチレンブルーの麻酔後覚醒促進の新しい使用を開示している。また、いくつかの文献では、メチレンブルーが光増感剤として光増感薬を調製して光線力学療法を行うのに用いられることが開示されている。研究者により、従来の光線力学療法が体内治療に使われている場合、生物組織の光線に対する吸収や散乱の作用により励起光強度が減衰し、悪性腫瘍組織の酸素不足状態が一重項酸素の生産量を低くし、このため、単純な光増感剤が光増感薬として使用される場合、本格的な腫瘍治療作用を有していないことが発現されている（中国特許公告番号ＣＮ １０６６６８８５９Ａ）。
【0006】
したがって、従来技術では、薬物におけるメチレンブルーの使用がいくつか開示されているが、メチレンブルーをＰＤ－１シグナル伝達阻害に応用し、それを腫瘍の予防・治療に応用することを報告した文献はない。現在、臨床では、癌を治療するのに十分に有効な薬物がまだ不足しており、そのため、腫瘍に有効な薬物を提供することには重要な臨床的意義がある。
【発明の概要】
【0007】
本発明は、（ａ）養子細胞療法に適した免疫細胞と、（ｂ）式（Ｉ）で示される化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択されるフェノチアジン系化合物とを含む医薬組成物を提供する。
（ここで、Ｚは、Ｓ＋、Ｏ＋、Ｃ又はＮから選択され、
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。）
【化1】
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。）
【0008】
いくつかの実施形態において、前記Ｘは無機酸根アニオン及び有機酸根アニオンから選択される。さらに、前記無機酸根アニオンは好ましくはＣｌ－、Ｂｒ－、Ｉ－である。前記有機酸根アニオンは好ましくはメタンスルホン酸根アニオン、エタンスルホン酸根アニオン、ｐ－トルエンスルホン酸根アニオン、ベンゼンスルホン酸根アニオン、エタネジスルホン酸根アニオン、プロパンジスルホン酸根アニオン、及びナフタレンジスルホン酸根アニオンである。
【0009】
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のＣ１～Ｃ６アルキル、置換又は無置換のＣ３～Ｃ８シクロアルキル、置換又は無置換の３～８員ヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のＣ５～Ｃ１０アリール、置換又は無置換の５～１０員ヘテロアリール、置換又は無置換のＣ１～Ｃ６アルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリドである。
【0010】
いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択される。
（ここで、Ｘは１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、以上と同義である。）
【化2】
【0011】
いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物の還元形態は式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）、その水和物又は溶媒和物である。
（ここで、Ｘは１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、以上と同義である。）
【化3】
【0012】
いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリド又はＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアモニウムビスジメシレートである。
【0013】
いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）、キメラ抗原受容体ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ）、及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）キメラＴ細胞（ＴＣＲ－Ｔ）から選択される。
【0014】
いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）キメラＴ細胞である。
【0015】
いくつかの実施形態において、前記ＴＣＲはＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに結合可能である。
【0016】
本発明のさらに別の態様は、ａ）第１の剤形に配合された上記免疫細胞のいずれかと、ｂ）第２の剤形に配合された上記の化合物のいずれかとを含むキットを提供する。
【0017】
本発明のさらに別の態様は、癌治療薬の製造における上記化合物のいずれかの使用を提供する。
【0018】
いくつかの実施形態において、前記癌は黒色腫、胸腺腫瘍、肺癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、リンパ腫、食道癌、膀胱癌、尿道癌、非ホジキンリンパ腫、腎臓癌又は脳腫瘍である。
【0019】
本発明の別の態様はまた、免疫細胞機能を向上させる薬物の製造における上記フェノチアジン系化合物のいずれかの使用を提供する。
【0020】
本発明の別の態様は、ＰＤ－１シグナル伝達を阻害する薬物の製造における上記フェノチアジン系化合物のいずれかの使用を提供する。本発明の別の態様は、ＰＤ－１下流シグナル経路を遮断する薬物の製造における上記フェノチアジン系化合物のいずれかの使用を提供する。本発明の別の態様は、ＰＤ－１によるＳＨＰ２タンパク質リクルートを遮断する薬物の製造における上記フェノチアジン系化合物のいずれかの使用を提供する。
【0021】
本発明の別の態様は、ＰＤ－１下流シグナル経路を遮断するステップを含むＰＤ－１シグナル伝達を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記遮断は、ＰＤ－１によるＳＨＰ２タンパク質リクルートを遮断することにより達成される。いくつかの実施形態において、前記ＰＤ－１によるＳＨＰ２リクルートを遮断するステップは、細胞と本発明に記載のいずれかのフェノチアジン系化合物の有効量とを接触させることを含む。
【0022】
本発明の別の態様は対象における癌を治療する方法であって、対象におけるＰＤ－１シグナル伝達を阻害することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記対象におけるＰＤ－１シグナル伝達を阻害することは、ＰＤ－１下流シグナル経路を遮断することを含む。いくつかの実施形態において、前記ＰＤ－１下流シグナル経路を遮断することは、ＰＤ－１によるＳＨＰ２リクルートを遮断することを含む。いくつかの実施形態において、前記ＰＤ－１によるＳＨＰ２リクルートを遮断するステップは、本発明に記載のフェノチアジン系化合物のいずれかの有効量を対象に投与することを含む。
【0023】
本発明の別の態様は、対象における癌を治療する方法であって、本発明に記載のフェノチアジン系化合物のいずれかの有効量を前記対象に投与することと、対象に第２の治療法を施すことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記第２の治療法は化学療法、放射線療法及び手術治療から選択される。いくつかの実施形態において、前記化学療法は腫瘍免疫療法である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍免疫療法は、ＰＤ－１抗体又はＰＤ－Ｌ１抗体又はその機能的断片を前記対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、この態様に記載の方法は相乗的な抗腫瘍作用を発揮する。
【0024】
本発明の別の態様は癌治療用の薬物組成物であって、本発明に記載のフェノチアジン系化合物のいずれかと、第２の化学療法剤とを含む薬物組成物を提供する。いくつかの実施形態において、前記第２の化学療法剤は腫瘍免疫治療剤である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍免疫治療剤はＰＤ－１抗体又はＰＤ－Ｌ１抗体又はその機能的断片である。
【0025】
本発明の別の態様は、対象におけるＰＤ－１抗体又はＰＤ－Ｌ１抗体又はその機能的断片の治療効果を強化させる方法であって、前記ＰＤ－１抗体又はＰＤ－Ｌ１抗体の投与の前、同時又は後に、本発明に記載のフェノチアジン系化合物のいずれかの有効量を前記対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、この方法は相乗的な抗腫瘍作用を発揮する。
【0026】
本発明の発明者らは、大量の創造的労働を通じて、本発明のフェノチアジン類及び類似の構造を持つ化合物を免疫細胞（特に遺伝子改変された免疫細胞）と併用することにより、標的細胞に対する免疫細胞の殺傷作用を顕著に向上させ、相乗効果を達成できることを発見した。本発明のフェノチアジン類及び類似の構造を持つ化合物は、ＰＤ－１の機能を阻害し、ＰＤ－１のシグナル伝達を阻止することができ、ＰＤ－１シグナル伝達阻害剤として有用である。
【0027】
インビトロ実験において、このような化合物はＰＤ－１によって阻害された免疫細胞の機能を回復させ、ＣＴＬなどの免疫細胞によるサイトカイン分泌や標的細胞への殺傷機能を向上させ、生体の免疫機能を向上させることができることを見出した。動物モデルにおいて、本発明のフェノチアジン類及び類似の構造を持つ化合物は、マウス体内の移植腫瘍又は原位置肺癌を縮小し、癌を治療する目的を達成できる。さらに、ＰＤ－１抗体などの大分子に対して、小分子ＰＤ－１シグナル伝達阻害剤は低コストであり、製造技術が簡単（例えば化学合成により）であり、投与経路が多く、患者のコンプライアンスが高く、安全で信頼性が高いなどの優位性がある。また、本発明の実験では、本発明のフェノチアジン系化合物は、ＰＤ－１抗体と同等又はそれ以上の腫瘍阻害効果を有することも実証されている。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】実施例１の実験結果図であり、Ａは、未トランスフェクション及びトランスフェクションＪｕｒｋａｔ細胞の表面のＰＤ－１タンパク質の発現を示し、Ｂは、未トランスフェクション及びトランスフェクションＲａｊｉ細胞の表面のＰＤ－Ｌ１タンパク質の発現を示し、ＣはトランスフェクションされたＲａｊｉ細胞が、トランスフェクションされたＪｕｒｋａｔ細胞中のＰＤ－１タンパク質Ｙ２４８のリン酸化を誘導した結果を示し、Ｄは、ＭＴＣがＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ｌｕｃ細胞のＩＬ－２分泌を促進した結果であり、Ｅは、ＭＴＣ又はＬＭＴ（Ｎ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムビスジメシレート）がＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ｌｕｃ細胞におけるルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）活性の上昇を促進することを示す。
【図2】実施例２におけるＭＴＣによるＯＴ－１細胞の分裂促進を示し、ＡはＯＴ１－ＣＴＬ細胞の表面にＰＤ－１タンパク質を発現させた結果であり、ＢはＭＴＣがＣＴＬ分裂を促進した結果である。
【図3】実施例２におけるＭＴＣによるＯＴ－１細胞のエフェクター分子分泌の促進を示し、ＭＴＣはＣＴＬ細胞におけるＩＬ－２、ＩＦＮγ、パーフォリン及びグランザイムＢの分泌を促進する。
【図4】ＭＴＣがＯＴ－１ Ｔ細胞の標的細胞殺傷能力を回復することを示し、Ａは、ＭＴＣがＣＴＬによるＥＬ４－ＯＶＡ（ＰＤ－Ｌ１）の殺傷を促進することを示し、ＢはＩＦＮγによるＢ１６－Ｆ１０のＰＤ－Ｌ１タンパク質発現の誘導を示し、Ｃ、Ｄは、ＭＴＣ又はＬＭＴがＢ１６－ＯＶＡ細胞に対するＣＴＬの殺傷を相乗的に増加させることを示し、ＥはＭＴＣ又はＬＭＴがＢ１６－ＷＴ細胞に対して殺傷作用がなく、ＣＴＬ細胞と組み合わせても細胞に対して殺傷作用がないことを示す。
【図5】ＭＴＣが細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による標的細胞によって形成された腫瘍の除去を促進した結果図であり、Ａは移植腫の模式図であり、Ｂ、Ｃ、ＤはＭＴＣがＲａｇ１－／－マウス移植腫瘍の成長を阻害することを示し、Ｅは、ＭＴＣがＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス移植腫瘍の成長を阻害することを示す。
【図6】ＭＴＣによる原発腫瘍の治療結果図であり、Ａは原位置腫瘍を治療する実験の模式図であり、ＢはＭＴＣがＣＤ８＋Ｔ細胞を通じて腫瘍を除去した結果である。
【図7】ＭＴＣがＰＤ－１によるＳＨＰ２リクルートを遮断した結果図であり、ＡはＭＴＣがＰＤ１とＳＨＰ２との結合を減少することを実証し、Ｂは、ＭＴＣがＰＤ１によるＳＨＰ２リクルートを阻害することを示し、Ｃは、ＭＴＣがＰＤ１とＳＨＰ２との結合を阻害することを示す。
【発明を実施するための形態】
【0029】
「養子細胞療法」又は「ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ」という用語は、抗腫瘍活性を有する免疫細胞を癌患者に移すことを含む。いくつかの実施例では、ＡＣＴは、抗腫瘍活性を有するリンパ球を使用し、これらの細胞をインビトロで大量に増幅し、癌に罹患している宿主にこれらの細胞を注入することを含む治療方法である。
【0030】
「腫瘍浸潤リンパ球」又はＴＩＬという用語は、血流から離れて腫瘍に移行した白血球を指す。「ＣＡＲ－Ｔ」という用語は「キメラ抗原受容体Ｔ細胞」の略称であり、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）はＣＡＲ－Ｔのコアコンポーネントであり、ＨＬＡ非依存的な方式で標的細胞（例えば腫瘍）の抗原を認識する能力をＴ細胞に付与し、これにより、ＣＡＲで改変されたＴ細胞は、天然Ｔ細胞表面受容体ＴＣＲと比較して、より広範な標的を認識することができる。
【0031】
「ＴＣＲ－Ｔ（Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）キメラ－Ｔ細胞）」という用語は、エンジニアリングされたＴ細胞受容体（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＴＣＲ）又は人工Ｔ細胞受容体（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＴＣＲ）を発現するＴ細胞を指す。前記エンジニアリングされたＴ細胞受容体又は人工Ｔ細胞受容体は、ＴＣＲシグナル伝達経路内のドメイン及び／又はヘルパー分子を保持しながら、目的の抗原を標的とする構造を有するように遺伝子改変されている。いくつかの実施例では、ＴＣＲ－ＴはＴＣＲシグナル伝達経路中のすべてのヘルパー分子を保持し、したがって、少量の抗原刺激では、完全に活性化された状態になり、標的細胞に対する殺傷効果を引き起こすことができる。これらのＴＣＲ－Ｔは、ＣＡＲ－Ｔと比較して、ＴＣＲシグナル伝達経路のすべてのヘルパー分子を保持・応用しているため、ＴＣＲ－Ｔは、低濃度、少コピー数の抗原に対する認識感受性が一部のＣＡＲ－Ｔよりも高く、治療の可能性が期待できる。
【0032】
チロシンプロテインホスファターゼ非受容体１１型（ＰＴＰＮ１１）は、プロテインチロシンホスファターゼ１Ｄ（ＰＴＰ－１Ｄ）とも呼ばれ、Ｓｒｃ相同領域２にドメインホスファターゼ－２（ＳＨＰ－２）又はプロテインチロシンアシッドホスファターゼ２Ｃ（ＰＴＰ－２Ｃ）を含有し、ヒトＰＴＰＮ１１遺伝子によってコードされる酵素である。ＳＨＰ－２はさまざまな組織や細胞タイプに広く発現しており、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ－１などの成長因子、ＩＬ－３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＥＰＯなどのサイトカイン、及びインスリン、インターフェロンを含む複数のシグナル伝達経路にかかわる。ＳＨＰ－２は化合物シグナル伝達機能を有する。Ｒａｓ－Ｒａｆ－ＭＡＰ－ＥＲＫ経路、Ｊａｋ－Ｓｔａｔ経路やＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ経路など、さまざまなシグナル伝達過程が関与しているようである。また、Ｇｒｂ２、ＦＲＳ２、Ｊａｋ２、ＰＩ３キナーゼのｐ８５サブユニット、ＩＲＳ－１、Ｇａｂ１、Ｇａｂ２など、さまざまなシグナル中間体に結合できることも証明されている。ＰＤ－１受容体の下流分子であるＳＨＰ－２は、Ｔ細胞の阻害性シグナル伝達に関与している。ＳＨＰ－２はＰＤ－１シグナル伝達の下流分子であり、Ｔ細胞の活性化を阻害するだけでなく、Ｔ細胞の機能不全を促進することが研究により明らかになっている。Ｔリンパ球上でＳＨＰ２をノックアウトすることにより抗腫瘍免疫を誘発し、マウス大腸炎関連癌の発生を阻害することも研究により明らかになっている。
【0033】
メチオニン（ＭＴ）はレドックス分子であり、環境条件（例えば、ｐＨ、酸素、還元剤）に依存して、還元形態である１０Ｈ－フェノチアジン系化合物（即ち、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム（ＬＭＴ））と酸化形態（ＭＴ＋）との平衡状態で存在する。
【0034】
酸化形態の塩ＭＴＸは式ＩＩで示される。
ＬＭＴはその塩の形態で存在する場合、式ＩＩＩに示されるようにＬＭＴＸ塩と呼ばれる。
Ｘ－は、無機酸根アニオン及び有機酸根アニオンから選択され、適切な有機酸アニオンの例としては、２－アセトキシ安息香酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、桂皮酸、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシ酢酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフトエ酸、ヒドロキシエチルスルホン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸（ｐａｍｏｉｃ）、パントテン酸（ｐａｎｔｏｔｈｅｎｉｃ）、フェニル酢酸、ベンゼンスルホン酸、プロパンジスルホン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、ｐ－アミノベンゼンスルホン酸、酒石酸、トルエンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、及び吉草酸という有機酸から誘導される有機酸アニオンが含まれるが、これらに限定されるものではない。好適な高分子有機アニオン（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｏｒｇａｎｉｃ ａｎｉｏｎ）としては、タンニン酸、カルボキシメチルセルロースという高分子酸（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ａｃｉｄ）から誘導される高分子有機アニオンが含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、前記無機酸根アニオンは、Ｃｌ－、Ｂｒ－、Ｉ－であることが好ましい。前記有機酸根アニオンはメタンスルホン酸根アニオンであることが好ましい。
【化4】
【化5】
【0035】
メチレンブルー（ＭＴＣ）（本明細書では３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリドとも呼ばれる）は、メチオニン（ＭＴ）の酸化形態（すなわちＭＴ＋）の塩化物塩であり、以下の構造式を有する低分子量（３１９．８６）の水溶性三環式有機化合物である。
また、Ｎ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムビスジメシレートの構造は以下に示される。
【化6】
【化7】
【0036】
本願で使用される用語「溶媒和物」は、その一般的な意味であり、溶質（例えば、化合物、化合物の塩）と溶媒との複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を指す。溶媒が水であれば、便宜上、溶媒和物を一水和物、二水和物、三水和物などの水和物と称することができる。特に断らない限り、特定の化合物が言及される場合、該特定の化合物は、その溶媒和物の形態も含む。
【0037】
本明細書で使用される「治療」は、疾患又は障害の症状又は合併症を軽減するか、又は疾患又は障害を除去するために、本願の化合物又は本願の組成物を投与することを含む。本明細書で使用される用語「軽減」は、障害の兆候又は症状の重篤度が低下する過程を説明するものである。症状は軽減されたが解消されなくてもよい。１つの実施形態では、本願の組成物を投与することにより、兆候又は症状が解消される。
【0038】
用途及び治療法
本発明の一態様は、ＰＤ－１シグナル伝達阻害剤の製造におけるフェノチアジン系化合物の使用であって、該フェノチアジン系化合物は式（Ｉ）で示される化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択される使用に関する。
（ここで、Ｚは、Ｓ＋、Ｏ＋、Ｃ又はＮから選択され、
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつ、ＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮから選択され、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋から選択され、Ｘ－は、Ｚ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲン選択される。）
本発明の一態様は、ＰＤ－１シグナル伝達阻害剤の製造におけるフェノチアジン系化合物の使用であって、該フェノチアジン系化合物は式（Ｉ）で示される化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択される使用に関する。
【化8】
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつ、ＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮから選択され、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋から選択され、Ｘ－は、Ｚ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲン選択される。）
【0039】
いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択される。
（ここで、Ｘは１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、上記と同義である。）
【化9】
【0040】
いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物の還元形態は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）、その水和物又は溶媒和物である。
（ここで、Ｘは、１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、上記と同義である。）
【化10】
【0041】
いくつかの実施形態において、該フェノチアジン系化合物類は、３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）であり、好ましくは、前記フェノチアジン系化合物は、３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリドである。
【0042】
本発明の別の態様は、癌治療薬の製造における式Ｉのフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態の使用に関する。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態である。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）である。この態様において、好ましくは、前記フェノチアジン系化合物は、３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリド又はＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムビスジメシレートである。
【0043】
本発明の別の態様は、免疫細胞の機能を向上させる薬物の製造における式Ｉのフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態の使用に関する。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態である。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）である。この態様では、好ましくは、前記フェノチアジン系化合物は、３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリド又はＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムビスジメシレートである。
【0044】
本発明の別の態様は、癌の再発を予防又は治療する薬物の製造における式Ｉのフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態の使用に関する。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態である。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）である。この態様では、好ましくは、前記フェノチアジン系化合物は、３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリド又はＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムビスジメシレートである。
【0045】
本発明の別の態様は、ＰＤ－１下流シグナル経路を遮断する薬物の製造における式Ｉのフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態の使用に関する。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態である。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）である。この態様では、好ましくは、前記フェノチアジン系化合物は、３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリド又はＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムビスジメシレートである。
【0046】
本発明の別の態様は、ＰＤ－１によるＳＨＰ２タンパク質のリクルートを遮断する薬物の製造における式Ｉのフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態の使用に関する。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態である。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）である。この態様では、好ましくは、前記フェノチアジン系化合物は、３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリド又はＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムビスジメシレートである。
【0047】
本発明の別の態様は、癌に罹患している対象に本発明の式Ｉのフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態の治療有効量を投与することを含む、癌治療方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態である。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）である。この態様では、好ましくは、前記フェノチアジン系化合物は、３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリド又はＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムビスジメシレートである。いくつかの実施形態において、前記癌は黒色腫、胸腺腫瘍、肺癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、リンパ腫、食道癌、膀胱癌、尿道癌、非ホジキンリンパ腫、腎臓癌又は脳腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記癌は黒色腫である。いくつかの実施形態において、前記対象は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
【0048】
本発明の別の態様は、免疫細胞機能を向上させる方法であって、式Ｉのフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態の治療有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態である。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）である。この態様では、好ましくは、前記フェノチアジン系化合物は、３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリド又はＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムビスジメシレートである。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞機能の向上は、抗ウイルス効果を達成することができる。いくつかの実施形態において、前記対象は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
【0049】
本発明の別の態様は、癌の再発を予防又は治療する方法であって、式Ｉのフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態の治療有効量を、前記癌に罹患している対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態である。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）である。この態様では、好ましくは、前記フェノチアジン系化合物は、３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリド又はＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムビスジメシレートである。いくつかの実施形態において、前記対象は、手術、放射線療法、又は化学療法を受けたことがある。
【0050】
いくつかの実施形態において、前記方法は、他の癌の療法と併用してもよい。例えば、前記方法は、手術、放射線療法又は化学療法と併用してもよい。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の癌治療方法は、前記癌に罹患している対象に第２の治療剤の治療有効量を投与することをさらに含む。
【0051】
いくつかの実施形態において、前記第２の治療剤は、養子細胞療法に適した免疫細胞である。これらの実施形態において、前記第２の治療剤は、式Ｉのフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態の投与の前、同時又は後に投与される。
【0052】
いくつかの実施形態において、前記第２の治療剤は化学療法剤であり、好ましくは、前記化学療法剤は腫瘍免疫化学療法剤であり、より好ましくは、前記化学療法剤はＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体又はそれらの断片である。いくつかの実施形態において、前記第２の治療剤は、式Ｉのフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態の投与の前、同時又は後に投与される。
【0053】
第２の治療剤が本発明のフェノチアジン系化合物、その水和物又は溶媒和物と同時に投与されない場合、両者は約０．１時間～約７２時間、例えば約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４、３０、３６、７２ｈの間隔で投与される。
【0054】
第２の治療剤が本発明のフェノチアジン系化合物、その水和物又は溶媒和物と同時に投与される場合、いくつかの実施形態において、本発明のフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態は、この第２の治療剤とはそれぞれ別個の薬物組成物の形態で提供される。いくつかの実施形態において、前記別個の薬物組成物は、同一のキットに提供される。第２の治療剤が本発明のフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態と同時に投与される場合、他の実施形態において、本発明のフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態は、この第２の治療剤と単一の薬物組成物の形態で提供される。
【0055】
医薬組成物及びキット
本発明の一態様は、式Ｉで示されるフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態を含む、癌治療用の医薬組成物を提供する。
（ここで、Ｚは、Ｓ＋、Ｏ＋、Ｃ又はＮから選択され、
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮから選択され、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋から選択され、Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。）
本発明の一態様は、式Ｉで示されるフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態を含む、癌治療用の医薬組成物を提供する。
【化11】
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮから選択され、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋から選択され、Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。）
【0056】
いくつかの実施形態において、前記Ｘは無機酸根アニオン及び有機酸根アニオンから選択される。さらに、前記無機酸根アニオンは好ましくはＣｌ－、Ｂｒ－、Ｉ－である。前記有機酸根アニオンは、好ましくはメタンスルホン酸根アニオン、エタンスルホン酸根アニオン、ｐ－トルエンスルホン酸根アニオン、ベンゼンスルホン酸根アニオン、エタンジスルホン酸根アニオン、プロパンジスルホン酸根アニオン、及びナフタレンジスルホン酸根アニオンである。
【0057】
いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択される。
（ここで、Ｘは１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、上記と同義である。）
【化12】
【0058】
いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物の還元形態は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）、その水和物又は溶媒和物である。
（ここで、Ｘは、１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、上記と同義である。）
【化13】
【0059】
いくつかの実施形態において、該フェノチアジン系化合物類は、３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）であり、好ましくは、前記フェノチアジン系化合物は、３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリド（ＭＴＣ）である。
【0060】
いくつかの実施形態において、該フェノチアジン系化合物類は、Ｎ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムビスジメシレートである。
【0061】
本発明の別の態様は、式Ｉで示されるフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態と、養子細胞療法に適した免疫細胞とを含む、癌治療用の医薬組成物であって、式Ｉ及びその置換基は上記と同義である医薬組成物を提供する。
【0062】
いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）、キメラ抗原受容体ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ）及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）キメラＴ細胞から選択される。
【0063】
いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）キメラＴ細胞である。
【0064】
いくつかの実施形態において、前記ＴＣＲはＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに結合可能である。
【0065】
本発明の別の態様は、式Ｉで示されるフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態と、癌化学療法用の免疫治療剤とを含む、癌治療用の医薬組成物であって、式Ｉ及びその置換基は上記と同義である医薬組成物を提供する。
【0066】
いくつかの実施形態において、前記癌化学療法用の免疫治療剤は、ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体又はそれらの機能的断片である。
【0067】
したがって、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体と混合された形態で組成物に存在する有効成分（例えば、式Ｉのいずれかの化合物）を含んでもよい。本発明の組成物はまた、２つの有効成分（例えば、式Ｉのいずれかの化合物及び養子療法免疫細胞、又は式Ｉのいずれかの化合物及びＰＤ－１抗体）を同時に含んでもよく、これらは、適切な形態で同一の薬物組成物に含まれ、この薬物組成物の投与時に、前記２つの有効成分は同時に又は順次対象に投与される。例えば、式Ｉの化合物、養子細胞療法に適した免疫細胞及び担体は、所定の割合の混合物の形態をもって薬物組成物に存在する。あるいは、式Ｉの化合物と担体は所定の割合でこの薬物組成物の一部を構成し、養子細胞療法に適した免疫細胞と担体は所定の割合でこの薬物組成物の他の一部を構成し、２つの部分は組み合わせられて、例えばコアシェル構造で組み合わせられて前記薬物組成物を構成する。薬剤学的又は製薬工学的に利用可能な他の方法も、投与後の各活性成分の作用の発揮に影響を与えることなく、２つの有効成分を組み合わせるために使用してもよい。
【0068】
本発明の別の態様は、独立して存在する、養子細胞療法に適した免疫細胞の治療有効量を含む第１の薬物組成物と、式Ｉのフェノチアジン系化合物又はその水和物又は溶媒和物の治療有効量を含む第２の薬物組成物とを含むキットを提供する。したがって、前記キットのいくつかの実施形態において、前記第１の薬物組成物は単独した剤形で存在することができ、前記第２の薬物組成物は別の単独した剤形で存在することができ、両者の剤形は同一であっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、前記キット内の第１の薬物組成物及び第２の薬物組成物は、それぞれ別個の容器に収容される。
【0069】
本発明の別の態様は、独立して存在する、式Ｉのフェノチアジン系化合物又はその水和物又は溶媒和物の治療有効量を含む第１の薬物組成物と、第２の化学療法剤（例えば、ＰＤ－１抗体のような免疫治療剤）の治療有効量を含む第２の薬物組成物とを含むキットを提供する。したがって、前記キットのいくつかの実施形態において、前記第１の薬物組成物は単独した剤形で存在することができ、前記第２の薬物組成物は別の単独した剤形で存在することができ、両者の剤形は同一であっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、前記キット内の第１の薬物組成物及び第２の薬物組成物は、それぞれ別個の容器に収容される。
【0070】
投与される有効成分の治療的又は予防的有効量は、標準的な手順により決定することができ、考慮される要素には、例えば、化合物のＩＣ５０、生物半減期、対象の年齢、サイズや体重、対象に関連する障害が含まれてもよい。これらの要因及びその他の要因の重要性は当業者にはよく知られている。一般には、投与量は、治療対象の約０．０１ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇの間、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの間である。
【0071】
担体又は賦形剤は、薬物組成物を製造するために使用されてもよい。前記担体又は賦形剤は、化合物の投与を促進するために選択され得る。担体の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖（例えば、乳糖、グルコースやショ糖）、又はデンプン類、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、及び生理学的に適合性のある溶媒が含まれる。生理学的に適合性のある溶媒の例としては、注射用水（ＷＦＩ）無菌溶液、食塩溶液、及びグルコースが含まれる。
【0072】
適切な剤形は、経口、経皮、経粘膜、吸入、又は注射（非経口）などの投与経路に部分的に依存する。このような剤形は有効成分が標的細胞に到達できるようにしなければならない。本発明の薬物又は薬物組成物は、静脈内、腹膜内、皮下、筋内、経口、経粘膜、直腸、経皮、又は吸入を含む異なる経路で投与され得る。いくつかの実施形態において、経口投与が好ましい。経口投与の場合、例えば、化合物は通常の経口投与剤形、例えばカプセル、錠剤、及びシロップ、エリキシル剤及び濃縮点滴剤などの液体製剤として調製されてもよい。
【0073】
実施例
以下では、具体的な実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。
以下の実施例におけるＭＴＣは、ＰＤ－１シグナル伝達阻害剤として以下の構造式の３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリドを指す。
以下の実施例におけるＬＭＴは、以下の構造式のＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムビスジメシレートである。
以下では、具体的な実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。
以下の実施例におけるＭＴＣは、ＰＤ－１シグナル伝達阻害剤として以下の構造式の３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリドを指す。
【化14】
【化15】
【0074】
実施例１ ＭＴＣによるヒトＴ細胞の機能向上
一、実験方法：
（１）Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いてＰＤ－１を高発現する安定的にトランスフェクトされた細胞株を構築した。ｐＣＡＧｉｎ－ＰＤ－１プラスミドをＪｕｒｋａｔ細胞にエレクトロトランスフェクションし、その後、９００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８抗生物質でスクリーニングし、単一クローンをフローソートした。その後、ＮＦＡＴ結合部位によりルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の遺伝子（ＮＦＡＴ－ＬＵＣと表記）を制御するＤＮＡ断片をＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１細胞にエレクトロトランスフェクションした。その後、単一クローンをフローソートし、５番クローンと命名した。この細胞を用いて、ルシフェラーゼの活性を測定することによりＩＬ－２の発現量を反映させることができる。ＰＤ－Ｌ１を安定的に発現するＲａｊｉ細胞を構築し、ｐＣＤＮＡ－ＰＤ－Ｌ１プラスミドをＲａｊｉ細胞にエレクトロトランスフェクションし、２μｇ／ｍＬ ピューロマイシン耐性でスクリーニングした後、単一クローンをフローソートし、１番クローンと命名した。
（２）ＰＤ－Ｌ１を安定的に発現するＲａｊｉ細胞を用いてＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１上のＰＤ－１分子を刺激した。Ｒａｊｉ細胞は、Ｔ細胞の活性化に必要な第２のシグナルを提供し得る、Ｂ７分子を発現するヒト由来のＢリンパ球である。Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣ細胞を２μｇ／ｍＬ ＣＤ３抗体／２μｇ／ｍＬ ＣＤ２８抗体で刺激した後、１：１の割合でＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞と６時間共培養し、さらに免疫ブロットによりＰＤ－１のＹ２４８位のリン酸化を検出した。
（３）９６ウェルプレートにおいて１０μｇ／ｍＬ ＣＤ３抗体／１０μｇ／ｍＬ ＣＤ２８抗体でプレートを被覆し、４℃で一晩放置し、その後、ＰＢＳで余分な抗体を洗い流し、Ｒａｊｉ細胞又はＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞を１：１の割合でＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣ細胞と共培養し、又は、Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞とＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣ細胞を１：１の割合で混合した細胞に１μＭ ＭＴＣ又は１０μｇ／ｍＬのＰＤ１抗体を加えて共培養し、６時間共培養後、上清を採取し、ＥＬＩＳＡを用いてＩＬ－２の分泌を測定した。
（４）９６ウェルプレートにおいて１０μｇ／ｍＬ ＣＤ３抗体／１０μｇ／ｍＬ ＣＤ２８抗体でプレートを被覆し、４℃で一晩放置し、その後、ＰＢＳで余分な抗体を洗い流し、Ｒａｊｉ細胞又はＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞を１：１の割合でＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣ細胞と共培養し、又は、Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞とＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣ細胞を１：１の割合で混合した細胞に４．８６μＭ ＭＴＣ又はＬＭＴを加えて、６時間共培養した後、ルシフェラーゼ基質を加え、マイクロプレートリーダによりルシフェラーゼの読み取り値を測定した。
二、実験結果及び分析：
（１）ＰＤ－１を安定的に発現したＪｕｒｋａｔ細胞については、ＦＡＣＳにより試験したところ、５番クローンはＰＤ－１分子を正しく発現していることが示された（図１Ａ）。構築したＰＤ－Ｌ１を安定的に発現したＲａｊｉ細胞については、ＦＡＣＳにより、１番クローンはＰＤ－Ｌ１を正しく発現していることを示した（図１Ｂ）。
（２）Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞とＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１細胞を６時間共培養した後、免疫ブロット検出によりＰＤ－１のＹ２４８位がリン酸化されていることを確認した（図１Ｃ）。このことから、ＰＤ－１を発現するＪｕｒｋａｔと、ＰＤ－Ｌ１を安定的に発現するＲａｊｉ細胞との共培養では、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１が結合することが分かった。
（３）ＩＬ－２の分泌状況の結果、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣはＰＤ１抗体（ａｎｔｉ－ＰＤ１、ブリストルマイヤーズスクイブ製Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）又はＲａｊｉ細胞を加えた後、ＩＬ－２の分泌を有意に刺激することが明らかになった。Ｒａｊｉ ＰＤＬ１を加えた実験群では、いずれの刺激も加えなかったＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣ群と比較してＩＬ－２分泌量が低下したが、ＭＴＣ又はＰＤ１抗体を加えるとＩＬ－２分泌量が急激に増加した（図１Ｄ）。また、ＭＴＣはＰＤ１抗体群と比較して、ＰＤ１により阻害されたＪｕｒｋａｔ細胞の機能を有意に改善できた。
（４）Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣは、ＣＤ３抗体／ＣＤ２８抗体／Ｒａｊｉ細胞の刺激により、ルシフェラーゼの活性上昇が限定され、Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１を加えた細胞はルシフェラーゼの活性が低下した。Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１を加えた細胞に４．８６μＭ ＭＴＣ又はＬＭＴを加えると、ルシフェラーゼの活性が急激に上昇し（図１Ｅ）、このことから、ＭＴＣ又はＬＭＴはＰＤ－１により阻害されたＪｕｒｋａｔ細胞の機能を改善できることが示された。
一、実験方法：
（１）Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いてＰＤ－１を高発現する安定的にトランスフェクトされた細胞株を構築した。ｐＣＡＧｉｎ－ＰＤ－１プラスミドをＪｕｒｋａｔ細胞にエレクトロトランスフェクションし、その後、９００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８抗生物質でスクリーニングし、単一クローンをフローソートした。その後、ＮＦＡＴ結合部位によりルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の遺伝子（ＮＦＡＴ－ＬＵＣと表記）を制御するＤＮＡ断片をＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１細胞にエレクトロトランスフェクションした。その後、単一クローンをフローソートし、５番クローンと命名した。この細胞を用いて、ルシフェラーゼの活性を測定することによりＩＬ－２の発現量を反映させることができる。ＰＤ－Ｌ１を安定的に発現するＲａｊｉ細胞を構築し、ｐＣＤＮＡ－ＰＤ－Ｌ１プラスミドをＲａｊｉ細胞にエレクトロトランスフェクションし、２μｇ／ｍＬ ピューロマイシン耐性でスクリーニングした後、単一クローンをフローソートし、１番クローンと命名した。
（２）ＰＤ－Ｌ１を安定的に発現するＲａｊｉ細胞を用いてＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１上のＰＤ－１分子を刺激した。Ｒａｊｉ細胞は、Ｔ細胞の活性化に必要な第２のシグナルを提供し得る、Ｂ７分子を発現するヒト由来のＢリンパ球である。Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣ細胞を２μｇ／ｍＬ ＣＤ３抗体／２μｇ／ｍＬ ＣＤ２８抗体で刺激した後、１：１の割合でＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞と６時間共培養し、さらに免疫ブロットによりＰＤ－１のＹ２４８位のリン酸化を検出した。
（３）９６ウェルプレートにおいて１０μｇ／ｍＬ ＣＤ３抗体／１０μｇ／ｍＬ ＣＤ２８抗体でプレートを被覆し、４℃で一晩放置し、その後、ＰＢＳで余分な抗体を洗い流し、Ｒａｊｉ細胞又はＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞を１：１の割合でＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣ細胞と共培養し、又は、Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞とＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣ細胞を１：１の割合で混合した細胞に１μＭ ＭＴＣ又は１０μｇ／ｍＬのＰＤ１抗体を加えて共培養し、６時間共培養後、上清を採取し、ＥＬＩＳＡを用いてＩＬ－２の分泌を測定した。
（４）９６ウェルプレートにおいて１０μｇ／ｍＬ ＣＤ３抗体／１０μｇ／ｍＬ ＣＤ２８抗体でプレートを被覆し、４℃で一晩放置し、その後、ＰＢＳで余分な抗体を洗い流し、Ｒａｊｉ細胞又はＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞を１：１の割合でＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣ細胞と共培養し、又は、Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞とＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣ細胞を１：１の割合で混合した細胞に４．８６μＭ ＭＴＣ又はＬＭＴを加えて、６時間共培養した後、ルシフェラーゼ基質を加え、マイクロプレートリーダによりルシフェラーゼの読み取り値を測定した。
二、実験結果及び分析：
（１）ＰＤ－１を安定的に発現したＪｕｒｋａｔ細胞については、ＦＡＣＳにより試験したところ、５番クローンはＰＤ－１分子を正しく発現していることが示された（図１Ａ）。構築したＰＤ－Ｌ１を安定的に発現したＲａｊｉ細胞については、ＦＡＣＳにより、１番クローンはＰＤ－Ｌ１を正しく発現していることを示した（図１Ｂ）。
（２）Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞とＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１細胞を６時間共培養した後、免疫ブロット検出によりＰＤ－１のＹ２４８位がリン酸化されていることを確認した（図１Ｃ）。このことから、ＰＤ－１を発現するＪｕｒｋａｔと、ＰＤ－Ｌ１を安定的に発現するＲａｊｉ細胞との共培養では、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１が結合することが分かった。
（３）ＩＬ－２の分泌状況の結果、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣはＰＤ１抗体（ａｎｔｉ－ＰＤ１、ブリストルマイヤーズスクイブ製Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）又はＲａｊｉ細胞を加えた後、ＩＬ－２の分泌を有意に刺激することが明らかになった。Ｒａｊｉ ＰＤＬ１を加えた実験群では、いずれの刺激も加えなかったＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣ群と比較してＩＬ－２分泌量が低下したが、ＭＴＣ又はＰＤ１抗体を加えるとＩＬ－２分泌量が急激に増加した（図１Ｄ）。また、ＭＴＣはＰＤ１抗体群と比較して、ＰＤ１により阻害されたＪｕｒｋａｔ細胞の機能を有意に改善できた。
（４）Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣは、ＣＤ３抗体／ＣＤ２８抗体／Ｒａｊｉ細胞の刺激により、ルシフェラーゼの活性上昇が限定され、Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１を加えた細胞はルシフェラーゼの活性が低下した。Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１を加えた細胞に４．８６μＭ ＭＴＣ又はＬＭＴを加えると、ルシフェラーゼの活性が急激に上昇し（図１Ｅ）、このことから、ＭＴＣ又はＬＭＴはＰＤ－１により阻害されたＪｕｒｋａｔ細胞の機能を改善できることが示された。
【0075】
実施例２ ＭＴＣによるＯＴ－１細胞の分裂及びエフェクター分子分泌の促進
ＯＴ－１トランスジェニックマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞で発現したＴＣＲはニワトリ卵白アルブミンのＳＩＩＮＦＥＫＬ－Ｈ－２Ｋｂ複合体を認識できる。このため、ＯＴ－１マウスの脾臓細胞をインビトロで培養する時に、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドセグメントの刺激により、脾臓中のＣＤ８＋Ｔ細胞は活性化され、激しく増幅され、これはＣＴＬ細胞と呼ばれる。
一、実験方法：
（１）ＣＴＬ細胞の調製：ＯＴ１マウスの脾臓を採取し、粉砕後に赤血球溶解液を加えて赤血球を溶解し、単細胞懸濁液を製造し、培養液を１６４０＋１０％ＦＢＳ＋５０μＭ βＭＥ＋１０ｎＭ ＩＬ－２とし、細胞密度を約２～４ｍｉｌｌｉｏｎ／ｍＬに調節し、１０ｎＭ ＯＶＡ２５７－２６４を加えて、３７℃、５％ＣＯ２細胞インキュベーターで培養し、ＣＴＬ調製当日から毎日ＦＩＴＣ標識ＰＤ－１抗体で染色し、その後、この細胞の表面のＰＤ－１発現変化をフロー測定した。
（２）上記のＣＴＬ細胞を５ｎＭ ＣＦＳＥで標識し、１０ｎＭ ＳＩＩＮＦＥＫＬと１０ｎＭ ＩＬ－２を加えて刺激し、同時に１０μｇ／ｍＬ マウスのＰＤ－Ｌ１タンパク質を加え、実験群ではさらに１００ｎＭのＭＴＣ小分子化合物を加え、それぞれ２４、４８、７２時間刺激した後、ＰＤ－Ｌ１タンパク質とＭＴＣによるＣＴＬ細胞分裂への影響をフローサイトメトリーにより観察した。
（３）ＣＴＬ細胞と標的細胞ＥＧ７（ニワトリ卵白アルブミンを発現するＥＬ４リンパ腫細胞）を１：１の濃度で混合培養し、１μＭ タンパク質輸送阻害剤ＧｏｌｇｉＰｌｕｇTMで６時間処理した後、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、０．１％ｓａｐｏｎｉｎで細胞を穿孔し、その後、各エフェクター分子の抗体で染色し、ＭＴＣによるＣＴＬエフェクター分子の分泌への影響をフロー検出した。
二、実験結果及び分析：
（１）ＣＴＬ細胞の細胞表面のＰＤ－１量は、誘導の全過程において誘導時間の増加に伴って徐々に増加した（図２Ａ）。
（２）ＣＴＬをＳＩＩＮＦＥＫＬとＩＬ－２で刺激し、ＰＤ－Ｌ１タンパク質を加えると、ＰＤ－Ｌ１タンパク質はＣＴＬ細胞の分裂を阻害し、一方、１００ｎＭのＭＴＣを加えると、この阻害を逆転させることができた（図２Ｂ）。
（３）ＥＧ７はニワトリ卵白アルブミンを発現するＥＬ４リンパ腫細胞であり、このため、ＣＴＬ細胞は認識してその殺傷機能を実行できる。活性化されたＯＴ－１マウス脾臓細胞とＥＧ７細胞が１：１の割合で混合されると、ＣＴＬ細胞はＩＬ－２、ＩＦＮγ、パーフォリン（Ｐｅｒｆｏｒｉｎ）、グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ）などのエフェクター分子の分泌を開始する。タンパク質輸送阻害剤ＧｏｌｇｉＰｌｕｇTM（ＰＴＩ）を加え、ＦＡＣＳで検出した。その結果、ＰＤ－Ｌ１を表面に過剰発現したＥＧ７細胞（ＥＧ７－ＰＤ－Ｌ１細胞安定株）は、ＣＴＬによるＩＬ－２、ＩＦＮγ、パーフォリン、グランザイムＢの分泌を強く阻害することを見出した。一方、ＭＴＣで処理した後、ＣＴＬ細胞によるＩＬ－２、ＩＦＮγ、パーフォリン、グランザイムＢの分泌量は急激に上昇した（図３）。このことは、ＭＴＣがＰＤ－１の阻害を改善し、ＣＴＬ細胞によるＩＬ－２、ＩＦＮγ、パーフォリン、グランザイムＢの分泌を促進することを示した。
ＯＴ－１トランスジェニックマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞で発現したＴＣＲはニワトリ卵白アルブミンのＳＩＩＮＦＥＫＬ－Ｈ－２Ｋｂ複合体を認識できる。このため、ＯＴ－１マウスの脾臓細胞をインビトロで培養する時に、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドセグメントの刺激により、脾臓中のＣＤ８＋Ｔ細胞は活性化され、激しく増幅され、これはＣＴＬ細胞と呼ばれる。
一、実験方法：
（１）ＣＴＬ細胞の調製：ＯＴ１マウスの脾臓を採取し、粉砕後に赤血球溶解液を加えて赤血球を溶解し、単細胞懸濁液を製造し、培養液を１６４０＋１０％ＦＢＳ＋５０μＭ βＭＥ＋１０ｎＭ ＩＬ－２とし、細胞密度を約２～４ｍｉｌｌｉｏｎ／ｍＬに調節し、１０ｎＭ ＯＶＡ２５７－２６４を加えて、３７℃、５％ＣＯ２細胞インキュベーターで培養し、ＣＴＬ調製当日から毎日ＦＩＴＣ標識ＰＤ－１抗体で染色し、その後、この細胞の表面のＰＤ－１発現変化をフロー測定した。
（２）上記のＣＴＬ細胞を５ｎＭ ＣＦＳＥで標識し、１０ｎＭ ＳＩＩＮＦＥＫＬと１０ｎＭ ＩＬ－２を加えて刺激し、同時に１０μｇ／ｍＬ マウスのＰＤ－Ｌ１タンパク質を加え、実験群ではさらに１００ｎＭのＭＴＣ小分子化合物を加え、それぞれ２４、４８、７２時間刺激した後、ＰＤ－Ｌ１タンパク質とＭＴＣによるＣＴＬ細胞分裂への影響をフローサイトメトリーにより観察した。
（３）ＣＴＬ細胞と標的細胞ＥＧ７（ニワトリ卵白アルブミンを発現するＥＬ４リンパ腫細胞）を１：１の濃度で混合培養し、１μＭ タンパク質輸送阻害剤ＧｏｌｇｉＰｌｕｇTMで６時間処理した後、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、０．１％ｓａｐｏｎｉｎで細胞を穿孔し、その後、各エフェクター分子の抗体で染色し、ＭＴＣによるＣＴＬエフェクター分子の分泌への影響をフロー検出した。
二、実験結果及び分析：
（１）ＣＴＬ細胞の細胞表面のＰＤ－１量は、誘導の全過程において誘導時間の増加に伴って徐々に増加した（図２Ａ）。
（２）ＣＴＬをＳＩＩＮＦＥＫＬとＩＬ－２で刺激し、ＰＤ－Ｌ１タンパク質を加えると、ＰＤ－Ｌ１タンパク質はＣＴＬ細胞の分裂を阻害し、一方、１００ｎＭのＭＴＣを加えると、この阻害を逆転させることができた（図２Ｂ）。
（３）ＥＧ７はニワトリ卵白アルブミンを発現するＥＬ４リンパ腫細胞であり、このため、ＣＴＬ細胞は認識してその殺傷機能を実行できる。活性化されたＯＴ－１マウス脾臓細胞とＥＧ７細胞が１：１の割合で混合されると、ＣＴＬ細胞はＩＬ－２、ＩＦＮγ、パーフォリン（Ｐｅｒｆｏｒｉｎ）、グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ）などのエフェクター分子の分泌を開始する。タンパク質輸送阻害剤ＧｏｌｇｉＰｌｕｇTM（ＰＴＩ）を加え、ＦＡＣＳで検出した。その結果、ＰＤ－Ｌ１を表面に過剰発現したＥＧ７細胞（ＥＧ７－ＰＤ－Ｌ１細胞安定株）は、ＣＴＬによるＩＬ－２、ＩＦＮγ、パーフォリン、グランザイムＢの分泌を強く阻害することを見出した。一方、ＭＴＣで処理した後、ＣＴＬ細胞によるＩＬ－２、ＩＦＮγ、パーフォリン、グランザイムＢの分泌量は急激に上昇した（図３）。このことは、ＭＴＣがＰＤ－１の阻害を改善し、ＣＴＬ細胞によるＩＬ－２、ＩＦＮγ、パーフォリン、グランザイムＢの分泌を促進することを示した。
【0076】
実施例３ ＭＴＣによるＯＴ－１Ｔ細胞の標的細胞への殺傷の回復
一、実験方法：
（１）ＣＴＬ細胞の調製は、実施例２を参照されたい。
（２）ＥＧ－７－ＰＤ－Ｌ１細胞を５ｎＭ ＣＦＳＥで標識し、ＣＴＬ細胞とＥＧ－７－ＰＤ－Ｌ１を５：１の割合で混合した後、それぞれ１μＭ、５μＭ、１０μＭ ＭＴＣで４時間処理し、その後、１０μｇ／ｍＬのＰＩで染色し、標的細胞ＥＧ－７－ＰＤ－Ｌ１のアポトーシスをフロー検出し、標的細胞に対するＣＴＬ細胞の殺傷能力を判定した。
（３）黒色腫細胞Ｂ１６－ＯＶＡ（ＯＶＡ遺伝子を発現するＢ１６細胞）を１０μｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γで２４時間処理した後、１：５の割合でＣＴＬ細胞と４時間混合培養し、同時にＭＴＣ（１μＭ）で処理し、ＩＦＮ－γで処理されておらずＤＭＳＯとＭＴＣのみで処理されたＢ１６－ＯＶＡ細胞を対照とした。Ｂ１６－ＯＶＡのアポトーシスを顕微鏡で観察し、標的細胞に対するＣＴＬ細胞の殺傷能力を判定した。
（４）黒色腫細胞Ｂ１６－ＯＶＡ（ＯＶＡ遺伝子を発現するＢ１６細胞）のうち、Ｂ１６－ＯＶＡ群は何も処理せず、Ｗａｔｅｒ群は培地を水に交換し、残りの各群は１０μｇ／ｍＬのＩＦＮγで処理し、２４時間後、Ｂ１６－ＯＶＡ群以外の各群はすべて１：５の割合でＣＴＬ細胞と４時間混合培養し、同時にＭＴＣ（１μＭ）、ＬＭＴ（１μＭ）又はａｎｔｉ－ＰＤ１（ＰＤ－１抗体、１０μｇ／ｍＬ、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、ＢＭＳ）で処理し、各群Ｂ１６－ＯＶＡの死亡状況を顕微鏡で観察し、標的細胞に対するＣＴＬ細胞の殺傷能力を判定した。また、遺伝子工学的に改変されていない黒色腫Ｂ１６－ＷＴも提供されており、Ｂ１６－ＷＴ群は何の処理もしておらず、ＩＦＮ－γ＋ＭＴＣ群とＩＦＮ－γ＋ＬＭＴ群は１０μｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γで処理し、２４時間後、１：５の割合でＣＴＬ細胞と４時間混合培養し、同時にＭＴＣ（１μＭ）又はＬＭＴ（１μＭ）で処理し、一方、ＭＴＣ群とＬＭＴ群では、ＭＴＣ（１０μＭ）とＬＭＴ（１０μＭ）のみで処理し、標的細胞に対する殺傷能力を観察した。
二、実験結果及び分析：
（１）活性化されたＯＴ－１細胞（ＣＴＬ細胞）は、表面にＰＤ－１を発現しているため、ＥＧ－７－ＰＤ－Ｌ１細胞（ＯＶＡ遺伝子改変マウスＴリンパ腫細胞ＥＧ７ではマウスのＰＤ－Ｌ１が過剰発現している）を殺傷する能力が限られている（図４Ａ）。ただし、http://www.baidu.com/link?url=q8B5c9TWi24eDUzIOTaHGZo86bBcgZgQEWp9h5ckN5cI2O26R80MznVQoIn32SYgDGj2JlcpvycbwLBW_WfMSYN8JaDCEXHQHusvftAJq5_このシステムでは、ＭＴＣはＥＧ－７－ＰＤ－Ｌ１に対するＣＴＬ細胞の殺傷能力を著しく回復できた（図４Ａ）。
（２）図４Ｅに示すように、ＭＴＣ及びＬＭＴはＢ１６－ＷＴ細胞に対して殺傷作用がなく、また、ＯＴ－１細胞がＢ１６－ＷＴ細胞を認識できないため、ＭＴＣ／ＬＭＴとＣＴＬ細胞との併用はＢ１６－ＷＴに対して殺傷作用がない。一方、Ｂ１６－ＯＶＡ細胞はＭＨＣ－Ｉ分子を低発現しており、そのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドセグメントが通常提示されていないため、ＯＴ－１細胞はＢ１６－ＯＶＡ細胞を認識して殺傷することができない（図４Ｃ及び図４Ｄ）。ＣＴＬ細胞は、Ｂ１６－ＯＶＡ細胞をＩＦＮγで処理した後、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドセグメントを提示すると、殺傷作用を有する（図４Ｃ及び図４Ｄ）。しかし、ＩＦＮγ処理後、Ｂ１６－ＯＶＡのＰＤ－Ｌ１発現が誘導された（図４Ｂ）。Ｂ１６－ＯＶＡに対するＣＴＬのこのような殺傷作用がＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用により低減されるため、ＣＴＬ単独では殺傷作用は顕著ではない。またＭＴＣ又はＬＭＴを加えることにより、上記条件におけるＢ１６－ＯＶＡ細胞に対するＣＴＬ細胞の殺傷量を顕著に向上させ（図４Ｃ及び図４Ｄ）、さらに、図４Ｄに示すように、ＭＴＣとＣＴＬ細胞との併用の場合、殺傷作用は、ＬＭＴとＣＴＬとの併用の場合と同等であり、それらの殺傷作用はａｎｔｉ－ＰＤ－１群よりも有意に強かった。したがって、ＭＴＣ又はＬＭＴとＣＴＬ細胞との併用により、Ｂ１６－ＯＶＡに対する殺傷作用を相乗的に増強することができる。
一、実験方法：
（１）ＣＴＬ細胞の調製は、実施例２を参照されたい。
（２）ＥＧ－７－ＰＤ－Ｌ１細胞を５ｎＭ ＣＦＳＥで標識し、ＣＴＬ細胞とＥＧ－７－ＰＤ－Ｌ１を５：１の割合で混合した後、それぞれ１μＭ、５μＭ、１０μＭ ＭＴＣで４時間処理し、その後、１０μｇ／ｍＬのＰＩで染色し、標的細胞ＥＧ－７－ＰＤ－Ｌ１のアポトーシスをフロー検出し、標的細胞に対するＣＴＬ細胞の殺傷能力を判定した。
（３）黒色腫細胞Ｂ１６－ＯＶＡ（ＯＶＡ遺伝子を発現するＢ１６細胞）を１０μｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γで２４時間処理した後、１：５の割合でＣＴＬ細胞と４時間混合培養し、同時にＭＴＣ（１μＭ）で処理し、ＩＦＮ－γで処理されておらずＤＭＳＯとＭＴＣのみで処理されたＢ１６－ＯＶＡ細胞を対照とした。Ｂ１６－ＯＶＡのアポトーシスを顕微鏡で観察し、標的細胞に対するＣＴＬ細胞の殺傷能力を判定した。
（４）黒色腫細胞Ｂ１６－ＯＶＡ（ＯＶＡ遺伝子を発現するＢ１６細胞）のうち、Ｂ１６－ＯＶＡ群は何も処理せず、Ｗａｔｅｒ群は培地を水に交換し、残りの各群は１０μｇ／ｍＬのＩＦＮγで処理し、２４時間後、Ｂ１６－ＯＶＡ群以外の各群はすべて１：５の割合でＣＴＬ細胞と４時間混合培養し、同時にＭＴＣ（１μＭ）、ＬＭＴ（１μＭ）又はａｎｔｉ－ＰＤ１（ＰＤ－１抗体、１０μｇ／ｍＬ、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、ＢＭＳ）で処理し、各群Ｂ１６－ＯＶＡの死亡状況を顕微鏡で観察し、標的細胞に対するＣＴＬ細胞の殺傷能力を判定した。また、遺伝子工学的に改変されていない黒色腫Ｂ１６－ＷＴも提供されており、Ｂ１６－ＷＴ群は何の処理もしておらず、ＩＦＮ－γ＋ＭＴＣ群とＩＦＮ－γ＋ＬＭＴ群は１０μｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γで処理し、２４時間後、１：５の割合でＣＴＬ細胞と４時間混合培養し、同時にＭＴＣ（１μＭ）又はＬＭＴ（１μＭ）で処理し、一方、ＭＴＣ群とＬＭＴ群では、ＭＴＣ（１０μＭ）とＬＭＴ（１０μＭ）のみで処理し、標的細胞に対する殺傷能力を観察した。
二、実験結果及び分析：
（１）活性化されたＯＴ－１細胞（ＣＴＬ細胞）は、表面にＰＤ－１を発現しているため、ＥＧ－７－ＰＤ－Ｌ１細胞（ＯＶＡ遺伝子改変マウスＴリンパ腫細胞ＥＧ７ではマウスのＰＤ－Ｌ１が過剰発現している）を殺傷する能力が限られている（図４Ａ）。ただし、http://www.baidu.com/link?url=q8B5c9TWi24eDUzIOTaHGZo86bBcgZgQEWp9h5ckN5cI2O26R80MznVQoIn32SYgDGj2JlcpvycbwLBW_WfMSYN8JaDCEXHQHusvftAJq5_このシステムでは、ＭＴＣはＥＧ－７－ＰＤ－Ｌ１に対するＣＴＬ細胞の殺傷能力を著しく回復できた（図４Ａ）。
（２）図４Ｅに示すように、ＭＴＣ及びＬＭＴはＢ１６－ＷＴ細胞に対して殺傷作用がなく、また、ＯＴ－１細胞がＢ１６－ＷＴ細胞を認識できないため、ＭＴＣ／ＬＭＴとＣＴＬ細胞との併用はＢ１６－ＷＴに対して殺傷作用がない。一方、Ｂ１６－ＯＶＡ細胞はＭＨＣ－Ｉ分子を低発現しており、そのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドセグメントが通常提示されていないため、ＯＴ－１細胞はＢ１６－ＯＶＡ細胞を認識して殺傷することができない（図４Ｃ及び図４Ｄ）。ＣＴＬ細胞は、Ｂ１６－ＯＶＡ細胞をＩＦＮγで処理した後、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドセグメントを提示すると、殺傷作用を有する（図４Ｃ及び図４Ｄ）。しかし、ＩＦＮγ処理後、Ｂ１６－ＯＶＡのＰＤ－Ｌ１発現が誘導された（図４Ｂ）。Ｂ１６－ＯＶＡに対するＣＴＬのこのような殺傷作用がＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用により低減されるため、ＣＴＬ単独では殺傷作用は顕著ではない。またＭＴＣ又はＬＭＴを加えることにより、上記条件におけるＢ１６－ＯＶＡ細胞に対するＣＴＬ細胞の殺傷量を顕著に向上させ（図４Ｃ及び図４Ｄ）、さらに、図４Ｄに示すように、ＭＴＣとＣＴＬ細胞との併用の場合、殺傷作用は、ＬＭＴとＣＴＬとの併用の場合と同等であり、それらの殺傷作用はａｎｔｉ－ＰＤ－１群よりも有意に強かった。したがって、ＭＴＣ又はＬＭＴとＣＴＬ細胞との併用により、Ｂ１６－ＯＶＡに対する殺傷作用を相乗的に増強することができる。
【0077】
実施例４ 細胞毒性Ｔ細胞が標的細胞によって形成された腫瘍を除去することに対するＭＴＣによる補助
上記の実施例１～３の実験結果から、ＭＴＣは、ＰＤ－Ｌ１を過剰発現した標的細胞を殺傷する細胞毒性Ｔ細胞を強く回復させることが確認された。本実施例は、ＭＴＣの体内における腫瘍治療能力をさらに調べた。
一、実験方法：
（１）ニワトリの卵白アルブミンＯＶＡとマウスのＰＤ－Ｌ１を過剰発現したリンパ腫細胞であるＥＬ４－ＯＶＡ－ｍＰＤＬ１細胞をＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリゲルに再懸濁させた（マウス１匹あたり一側に２×１０６細胞を１００μｌ ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリゲルに再懸濁させる）。
（２）上記細胞とマトリゲルとの混合物をＲａｇ１－／－マウスの左右側の腰背部の皮下に各１００μｌで接種した。
（３）５日程度接種して腫瘍を固定した後、尾静脈を介して活性化したＯＴ－１Ｔ細胞（すなわち２×１０６ＣＴＬ細胞／匹）を注射し、マウスをＣＴＬ細胞単独群、ＣＴＬ細胞＋１０ｍｇ／ｋｇ／２ｄａｙｓ ＰＤ－１抗体群、ＣＴＬ細胞＋４０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ ＭＴＣ群の３群に分けた。
（４）ＣＴＬ細胞を尾静脈注射した日から各群のマウスの移植腫瘍の長さと幅を１日おきに測定し、長さ×幅２／２で腫瘍の体積の大きさを計算した（図５Ａ）。
二、実験結果及び分析：
（１）ＰＤ－１抗体を同時に腹腔注射した群のマウスは、ＣＴＬ細胞のみを尾静脈注射した対照群と比較して、腫瘍の成長が阻害され、腫瘍の体積及び重量の増加がすべて阻害された。このことから、ＰＤ－１抗体群では腫瘍成長が阻害されていることが分かった。
（２）移植腫瘍を有するマウスにＭＴＣを胃内投与することによっても、腫瘍の成長を強く阻害することができた（図５Ｂ、Ｃ、Ｄ）。治療終了後、ＣＴＬ細胞のみを注入した群は腫瘍重量、腫瘍体積ともにこの群のマウスの腫瘍成長が速いことを示しており、このことから、ＣＴＬ単独投与では腫瘍成長を効果的に阻害できないことが分かった。一方、ＣＴＬ＋ＰＤ－１抗体治療群とＣＴＬ＋ＭＴＣ治療群はいずれも腫瘍の成長を有意に阻害でき、ＣＴＬ＋ＭＴＣ治療群の治療効果はＣＴＬ＋ＰＤ－１抗体治療群より優れていた。
本実施例と同様の方法でＥＧ７－ｍＰＤＬ１細胞を用いたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいても同様の結果が得られ（図５Ｅ）、ＣＴＬを投与しない（ＣＴＬ ｆｒｅｅ）マウスでは腫瘍の成長が速く、一方、ＣＴＬのみを投与するとＣＴＬ ｆｒｅｅと比較して腫瘍の成長を阻害できたが、その阻害作用はＣＴＬ＋ＰＤ－１抗体投与群やＣＴＬ＋ＭＴＣ併用群よりも弱かった。このことから、ＭＴＣは細胞毒性Ｔ細胞が標的細胞によって形成された皮下腫瘍を除去することを効果的に補助できることを示した。
上記の実施例１～３の実験結果から、ＭＴＣは、ＰＤ－Ｌ１を過剰発現した標的細胞を殺傷する細胞毒性Ｔ細胞を強く回復させることが確認された。本実施例は、ＭＴＣの体内における腫瘍治療能力をさらに調べた。
一、実験方法：
（１）ニワトリの卵白アルブミンＯＶＡとマウスのＰＤ－Ｌ１を過剰発現したリンパ腫細胞であるＥＬ４－ＯＶＡ－ｍＰＤＬ１細胞をＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリゲルに再懸濁させた（マウス１匹あたり一側に２×１０６細胞を１００μｌ ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリゲルに再懸濁させる）。
（２）上記細胞とマトリゲルとの混合物をＲａｇ１－／－マウスの左右側の腰背部の皮下に各１００μｌで接種した。
（３）５日程度接種して腫瘍を固定した後、尾静脈を介して活性化したＯＴ－１Ｔ細胞（すなわち２×１０６ＣＴＬ細胞／匹）を注射し、マウスをＣＴＬ細胞単独群、ＣＴＬ細胞＋１０ｍｇ／ｋｇ／２ｄａｙｓ ＰＤ－１抗体群、ＣＴＬ細胞＋４０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ ＭＴＣ群の３群に分けた。
（４）ＣＴＬ細胞を尾静脈注射した日から各群のマウスの移植腫瘍の長さと幅を１日おきに測定し、長さ×幅２／２で腫瘍の体積の大きさを計算した（図５Ａ）。
二、実験結果及び分析：
（１）ＰＤ－１抗体を同時に腹腔注射した群のマウスは、ＣＴＬ細胞のみを尾静脈注射した対照群と比較して、腫瘍の成長が阻害され、腫瘍の体積及び重量の増加がすべて阻害された。このことから、ＰＤ－１抗体群では腫瘍成長が阻害されていることが分かった。
（２）移植腫瘍を有するマウスにＭＴＣを胃内投与することによっても、腫瘍の成長を強く阻害することができた（図５Ｂ、Ｃ、Ｄ）。治療終了後、ＣＴＬ細胞のみを注入した群は腫瘍重量、腫瘍体積ともにこの群のマウスの腫瘍成長が速いことを示しており、このことから、ＣＴＬ単独投与では腫瘍成長を効果的に阻害できないことが分かった。一方、ＣＴＬ＋ＰＤ－１抗体治療群とＣＴＬ＋ＭＴＣ治療群はいずれも腫瘍の成長を有意に阻害でき、ＣＴＬ＋ＭＴＣ治療群の治療効果はＣＴＬ＋ＰＤ－１抗体治療群より優れていた。
本実施例と同様の方法でＥＧ７－ｍＰＤＬ１細胞を用いたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいても同様の結果が得られ（図５Ｅ）、ＣＴＬを投与しない（ＣＴＬ ｆｒｅｅ）マウスでは腫瘍の成長が速く、一方、ＣＴＬのみを投与するとＣＴＬ ｆｒｅｅと比較して腫瘍の成長を阻害できたが、その阻害作用はＣＴＬ＋ＰＤ－１抗体投与群やＣＴＬ＋ＭＴＣ併用群よりも弱かった。このことから、ＭＴＣは細胞毒性Ｔ細胞が標的細胞によって形成された皮下腫瘍を除去することを効果的に補助できることを示した。
【0078】
実施例５ ＭＴＣによる原位置腫瘍の効果的な治療
移植腫瘍の利点はＴ細胞が認識する抗原エピトープが非常に明確であり、しかも系が単一であり、問題を明らかにすることである。欠点は、このモデルが原発癌の複雑な癌化、腫瘍形成の過程及び腫瘍と間質細胞の相互作用をシミュレーションできないことである。したがって、マウスの移植腫瘍モデルは、ヒト患者における薬物の効果に対する予測性が低い。したがって、本実施例では、トランスジェニック肺癌マウスモデルを用いて、本発明のＭＴＣによる腫瘍治療作用をさらに調べた。ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒトランスジェニックマウスにテトラサイクリン（ＤＯＸ）含有食物を与えることにより、マウス肺上皮細胞にヒトＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ変異体（ヒト肺癌によく見られる変異体）の発現を誘導することができ、１～２ヶ月後にはコンピュータ断層撮影（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、ＣＴ）によりマウス肺癌を検出し記録することができた。
一、実験方法：
（１）ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ変異マウスにＤＯＸ食物を与えて原位置腫瘍モデルを約４０日間誘導した。
（２）コンピュータ断層撮影（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、ＣＴ）により腫瘍の大きさと重症度を記録した。
（３）担癌マウスをランダムに群分けし、それぞれプラセボ（ＨＫＩ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ＭＴＣ（４０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ ｉｎ ＨＫＩ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を投与した。２週間治療後、ＣＴで腫瘍の大きさを再記録した。
（４）ＭＴＣが腫瘍を除去する過程でＣＤ８＋Ｔ細胞により目的を達成することを実証する場合、本実施例では、以下の実験も行った。まずＣＤ８抗体の腹腔内注射（２００ｍｇ／匹／３日）で１週間処理しておき、担癌マウス中のＣＤ８＋細胞を除去し、次に、ＭＴＣとＣＤ８抗体の両方で２週間治療し、ＣＴにより腫瘍の大きさを再記録した。
二、実験結果及び分析：
本実験の原理は、これらのマウスにＤＯＸ含有食物を与えると、肺上皮細胞中のｒｔＴＡがＤＯＸに結合してコンフォメーションが変化し、ＴｅｔＯという配列に結合し、ＴｅｔＯが制御するＥＧＦＲ変異体の発現が開始されるということである。これらのマウスはテトラサイクリンを与えてから４０日後に原位置肺腺癌を形成した。これらの肺腺癌は、肺上皮細胞がＥＧＦＲ変異体の作用により癌化し、癌が進行し、最後に生物が癌で死亡する臨床過程全体をリアルにシミュレーションした。本実施例の実験結果から、プラセボ治療群の腫瘍は急速に成長し、一方、ＭＴＣで１４日治療後のマウスの腫瘍については、画像学的には、腫瘍がほぼ除去されていることが示され（図６Ｂ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞が除去されたマウスでは、腫瘍は、ＭＴＣ治療後も成長が阻害されなかった（図６Ｂ）。このことから、ＭＴＣは体内のＣＴＬを活性化することによりＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ変異による原位置腫瘍を効果的に治療できることが分かった。
移植腫瘍の利点はＴ細胞が認識する抗原エピトープが非常に明確であり、しかも系が単一であり、問題を明らかにすることである。欠点は、このモデルが原発癌の複雑な癌化、腫瘍形成の過程及び腫瘍と間質細胞の相互作用をシミュレーションできないことである。したがって、マウスの移植腫瘍モデルは、ヒト患者における薬物の効果に対する予測性が低い。したがって、本実施例では、トランスジェニック肺癌マウスモデルを用いて、本発明のＭＴＣによる腫瘍治療作用をさらに調べた。ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒトランスジェニックマウスにテトラサイクリン（ＤＯＸ）含有食物を与えることにより、マウス肺上皮細胞にヒトＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ変異体（ヒト肺癌によく見られる変異体）の発現を誘導することができ、１～２ヶ月後にはコンピュータ断層撮影（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、ＣＴ）によりマウス肺癌を検出し記録することができた。
一、実験方法：
（１）ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ変異マウスにＤＯＸ食物を与えて原位置腫瘍モデルを約４０日間誘導した。
（２）コンピュータ断層撮影（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、ＣＴ）により腫瘍の大きさと重症度を記録した。
（３）担癌マウスをランダムに群分けし、それぞれプラセボ（ＨＫＩ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ＭＴＣ（４０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ ｉｎ ＨＫＩ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を投与した。２週間治療後、ＣＴで腫瘍の大きさを再記録した。
（４）ＭＴＣが腫瘍を除去する過程でＣＤ８＋Ｔ細胞により目的を達成することを実証する場合、本実施例では、以下の実験も行った。まずＣＤ８抗体の腹腔内注射（２００ｍｇ／匹／３日）で１週間処理しておき、担癌マウス中のＣＤ８＋細胞を除去し、次に、ＭＴＣとＣＤ８抗体の両方で２週間治療し、ＣＴにより腫瘍の大きさを再記録した。
二、実験結果及び分析：
本実験の原理は、これらのマウスにＤＯＸ含有食物を与えると、肺上皮細胞中のｒｔＴＡがＤＯＸに結合してコンフォメーションが変化し、ＴｅｔＯという配列に結合し、ＴｅｔＯが制御するＥＧＦＲ変異体の発現が開始されるということである。これらのマウスはテトラサイクリンを与えてから４０日後に原位置肺腺癌を形成した。これらの肺腺癌は、肺上皮細胞がＥＧＦＲ変異体の作用により癌化し、癌が進行し、最後に生物が癌で死亡する臨床過程全体をリアルにシミュレーションした。本実施例の実験結果から、プラセボ治療群の腫瘍は急速に成長し、一方、ＭＴＣで１４日治療後のマウスの腫瘍については、画像学的には、腫瘍がほぼ除去されていることが示され（図６Ｂ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞が除去されたマウスでは、腫瘍は、ＭＴＣ治療後も成長が阻害されなかった（図６Ｂ）。このことから、ＭＴＣは体内のＣＴＬを活性化することによりＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ変異による原位置腫瘍を効果的に治療できることが分かった。
【0079】
実施例６ ＰＤ－１によるＳＨＰ２リクルートへのＭＴＣによる遮断
本実施例では、ＭＴＣがＰＤ－１伝達シグナルを阻害するメカニズムを予備的に調査し、ＭＴＣがＰＤ－１によるＳＨＰ２リクルートに影響を与える能力を調べた。ＰＤ－１はリガンドに結合することにより、ＳＨＰ２タンパク質をＴ細胞受容体の周囲にリクルートし、これにより、Ｔ細胞受容体の近位キナーゼの活性化を阻害し、Ｌｃｋ媒介ＺＡＰ－７０タンパク質のリン酸化及び下流シグナル経路の開始を低下させることができる。ルシフェラーゼはＮ末端とＣ末端の２つのフラグメントに分割することができ、これら２つのフラグメントがそれぞれ他のタンパク質と融合した後、Ｎ末端とＣ末端のルシフェラーゼフラグメントがこれらの融合タンパク質の相互作用のために接近すれば、ルシフェラーゼの活性が検出され得るので、ルシフェラーゼの活性を検出することにより、融合したタンパク質の相互作用の強さを間接的に反映できる。
一、実験方法：
（１）まず、２９３Ｔ細胞にＰＤ－１－ＣｌｕｃとＮｌｕｃ－ＳＨＰ２の２つの融合遺伝子をリポフェクションし、安定的にトランスフェクトされた細胞株を構築し、この細胞に異なる濃度のＭＴＣを加えて６時間培養し、ＭＴＣがルシフェラーゼの読み取り値に与える影響を観察した。
（２）２９３Ｔ細胞にＰＤ－１－ＧＦＰとＳＨＰ２－ｍＣｈｅｒｒｙの２つの融合遺伝子をリポフェクションし、安定的にトランスフェクトされた細胞株を構築し、この細胞に異なる濃度のＭＴＣを加えて６時間培養した後、１μＭ ＰＶＤ（脱リン酸化酵素阻害剤）を加えて５分間処理し、４％パラホルムアルデヒドで固定した後、ＣｏｎｆｏｃａｌによりＭＴＣがＧＦＰとｍＣｈｅｒｒｙすなわちＰＤ－１とＳＨＰ２の局在に及ぼす影響を観察した。
（３）２９３Ｔ細胞にＰＤ－１－ＦｌａｇプラスミドとＳＨＰ２プラスミドを共トランスフェクションした後、異なる濃度のＭＴＣを加えて処理し、ＰＤ－１によるＳＨＰ２リクルート能力をＣｏ－ＩＰで検出した。
二、実験結果及び分析：
（１）２９３ＴにＰＤ－１－ＣｌｕｃとＮｌｕｃ－ＳＨＰ２を安定的にトランスフェクションした安定化株に異なる濃度のＭＴＣを加えたところ、ＭＴＣはルシフェラーゼの読み取り値を減少させることが分かった。ＭＴＣはＰＤ－１によるＳＨＰ２リクルートを阻止できることを示した（図７Ａ）。
（２）以上の結論をさらに実証するために、２９３ＴにＰＤ－１－ＧＦＰとＳＨＰ２－ｍＣｈｅｒｒｙを安定的にトランスフェクションした細胞を用いて検証した。Ｃｏｎｆｏｃａｌの結果から、ホスファターゼの阻害剤であるＰＶＤで処理した場合、ＧＦＰとｍＣｈｅｒｒｙは良好な共局在を示し、リン酸化されたＰＤ－１がＳＨＰ２をリクルートしたことを示している（図７Ｂ）。
（３）上記（２）のシステムでは、ＭＴＣを加えるとｍＣｈｅｒｒｙが膜から解離し、細胞質分布を示す（図６Ｂ）。
（４）Ｃｏ－ＩＰの結果から、ＭＴＣはＰＤ－１とＳＨＰ２の結合を阻止し、意外にもＰＤ－１の下流シグナル伝達を遮断し、これにより、免疫細胞の機能を向上させ、養子細胞療法や他の腫瘍免疫療法と組み合わせた場合の腫瘍細胞への殺傷効果を向上させることを示した（図７Ｃ）。
本実施例では、ＭＴＣがＰＤ－１伝達シグナルを阻害するメカニズムを予備的に調査し、ＭＴＣがＰＤ－１によるＳＨＰ２リクルートに影響を与える能力を調べた。ＰＤ－１はリガンドに結合することにより、ＳＨＰ２タンパク質をＴ細胞受容体の周囲にリクルートし、これにより、Ｔ細胞受容体の近位キナーゼの活性化を阻害し、Ｌｃｋ媒介ＺＡＰ－７０タンパク質のリン酸化及び下流シグナル経路の開始を低下させることができる。ルシフェラーゼはＮ末端とＣ末端の２つのフラグメントに分割することができ、これら２つのフラグメントがそれぞれ他のタンパク質と融合した後、Ｎ末端とＣ末端のルシフェラーゼフラグメントがこれらの融合タンパク質の相互作用のために接近すれば、ルシフェラーゼの活性が検出され得るので、ルシフェラーゼの活性を検出することにより、融合したタンパク質の相互作用の強さを間接的に反映できる。
一、実験方法：
（１）まず、２９３Ｔ細胞にＰＤ－１－ＣｌｕｃとＮｌｕｃ－ＳＨＰ２の２つの融合遺伝子をリポフェクションし、安定的にトランスフェクトされた細胞株を構築し、この細胞に異なる濃度のＭＴＣを加えて６時間培養し、ＭＴＣがルシフェラーゼの読み取り値に与える影響を観察した。
（２）２９３Ｔ細胞にＰＤ－１－ＧＦＰとＳＨＰ２－ｍＣｈｅｒｒｙの２つの融合遺伝子をリポフェクションし、安定的にトランスフェクトされた細胞株を構築し、この細胞に異なる濃度のＭＴＣを加えて６時間培養した後、１μＭ ＰＶＤ（脱リン酸化酵素阻害剤）を加えて５分間処理し、４％パラホルムアルデヒドで固定した後、ＣｏｎｆｏｃａｌによりＭＴＣがＧＦＰとｍＣｈｅｒｒｙすなわちＰＤ－１とＳＨＰ２の局在に及ぼす影響を観察した。
（３）２９３Ｔ細胞にＰＤ－１－ＦｌａｇプラスミドとＳＨＰ２プラスミドを共トランスフェクションした後、異なる濃度のＭＴＣを加えて処理し、ＰＤ－１によるＳＨＰ２リクルート能力をＣｏ－ＩＰで検出した。
二、実験結果及び分析：
（１）２９３ＴにＰＤ－１－ＣｌｕｃとＮｌｕｃ－ＳＨＰ２を安定的にトランスフェクションした安定化株に異なる濃度のＭＴＣを加えたところ、ＭＴＣはルシフェラーゼの読み取り値を減少させることが分かった。ＭＴＣはＰＤ－１によるＳＨＰ２リクルートを阻止できることを示した（図７Ａ）。
（２）以上の結論をさらに実証するために、２９３ＴにＰＤ－１－ＧＦＰとＳＨＰ２－ｍＣｈｅｒｒｙを安定的にトランスフェクションした細胞を用いて検証した。Ｃｏｎｆｏｃａｌの結果から、ホスファターゼの阻害剤であるＰＶＤで処理した場合、ＧＦＰとｍＣｈｅｒｒｙは良好な共局在を示し、リン酸化されたＰＤ－１がＳＨＰ２をリクルートしたことを示している（図７Ｂ）。
（３）上記（２）のシステムでは、ＭＴＣを加えるとｍＣｈｅｒｒｙが膜から解離し、細胞質分布を示す（図６Ｂ）。
（４）Ｃｏ－ＩＰの結果から、ＭＴＣはＰＤ－１とＳＨＰ２の結合を阻止し、意外にもＰＤ－１の下流シグナル伝達を遮断し、これにより、免疫細胞の機能を向上させ、養子細胞療法や他の腫瘍免疫療法と組み合わせた場合の腫瘍細胞への殺傷効果を向上させることを示した（図７Ｃ）。
【0080】
以上に記載の実施例の各技術的特徴は任意に組み合わせてもよいが、説明の便宜上、上記の実施例における各技術的特徴のすべての可能な組み合わせについて説明していないが、これらの技術的特徴の組み合わせに矛盾がない限り、すべて本明細書に記載された範囲であると考えるべきである。
【0081】
以上に記載の実施例は、本発明のいくつかの実施形態だけを示しており、その説明は具体的かつ詳細であるが、これによって発明特許の範囲に対する限定として理解することはできない。なお、当業者にとっては、本発明の構想を逸脱することなく、いくつかの変形及び改良を行うことができ、これらはすべて本発明の保護範囲に属する。したがって、本発明特許の保護の範囲は、添付された特許請求の範囲に準ずるものとする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【手続補正書】
【提出日】2024-01-15
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）第１の有効成分として、養子細胞療法に適した免疫細胞と、
（ｂ）第２の有効成分として、式（Ｉ）で示される化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択される遊離フェノチアジン系化合物とを含む、癌治療用の医薬組成物であって、
（ここで、ＺはＳ＋、Ｏ＋、Ｃ又はＮから選択され、
Ｙは、Ｎ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、および
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９及びＲ１０は、水素であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７及びＲ８は、メチルである。）
ここで、前記還元形態は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）、その水和物又は溶媒和物であり、
（ここで、Ｘ－は１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成する。）
ここで、前記免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）、キメラ抗原受容体ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ細胞）、及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）キメラＴ細胞（ＴＣＲ－Ｔ細胞）からなる群から選択される、医薬組成物。
（ｂ）第２の有効成分として、式（Ｉ）で示される化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択される遊離フェノチアジン系化合物とを含む、癌治療用の医薬組成物であって、
【化1】
Ｙは、Ｎ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、および
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９及びＲ１０は、水素であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７及びＲ８は、メチルである。）
ここで、前記還元形態は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）、その水和物又は溶媒和物であり、
【化2】
ここで、前記免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）、キメラ抗原受容体ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ細胞）、及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）キメラＴ細胞（ＴＣＲ－Ｔ細胞）からなる群から選択される、医薬組成物。
【請求項2】
前記Ｘ－は、Ｃｌ－、Ｂｒ－、Ｉ－、メタンスルホン酸根アニオン、エタンスルホン酸根アニオン、ｐ－トルエンスルホン酸根アニオン、ベンゼンスルホン酸根アニオン、エタネジスルホン酸根アニオン、プロパンジスルホン酸根アニオン、及びナフタレンジスルホン酸根アニオンから選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記フェノチアジン系化合物は式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物又は溶媒和物である、請求項１に記載の医薬組成物。
（ここで、Ｘ－は１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成する。）
【化3】
【請求項4】
前記フェノチアジン系化合物は３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリドである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記フェノチアジン系化合物はＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムジメシレートである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記免疫細胞はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）キメラＴ細胞である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記ＴＣＲはＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに結合可能である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項8】
（ａ）第１の有効成分として、第１の製剤に配合された養子細胞療法に適した免疫細胞と、
（ｂ）第２の有効成分として、第２の製剤に配合され、式（Ｉ）で示される化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択される遊離フェノチアジン系化合物とを含む、癌治療用キットであって、
（ここで、ＺはＳ＋、Ｏ＋、Ｃ又はＮから選択され、
Ｙは、Ｎ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９及びＲ１０は、水素であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７及びＲ８は、メチルである。）
ここで、前記還元形態は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）、その水和物又は溶媒和物であり、
（ここで、Ｘ－は１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成する。）
ここで、前記免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）、キメラ抗原受容体ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ細胞）、及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）キメラＴ細胞（ＴＣＲ－Ｔ細胞）からなる群から選択される、キット。
（ｂ）第２の有効成分として、第２の製剤に配合され、式（Ｉ）で示される化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択される遊離フェノチアジン系化合物とを含む、癌治療用キットであって、
【化4】
Ｙは、Ｎ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９及びＲ１０は、水素であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７及びＲ８は、メチルである。）
ここで、前記還元形態は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）、その水和物又は溶媒和物であり、
【化5】
ここで、前記免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）、キメラ抗原受容体ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ細胞）、及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）キメラＴ細胞（ＴＣＲ－Ｔ細胞）からなる群から選択される、キット。
【請求項9】
癌治療薬の製造におけるフェノチアジン系化合物の使用であって、
ここで、フェノチアジン化合物は、Ｎ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムジメシレートであり、
ここで、癌は、肺癌又はリンパ腫である、使用。
ここで、フェノチアジン化合物は、Ｎ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムジメシレートであり、
ここで、癌は、肺癌又はリンパ腫である、使用。
【請求項10】
ＰＤ－１シグナル伝達阻害剤の製造におけるフェノチアジン系化合物の使用であって、前記フェノチアジン系化合物は式（Ｉ）で示される化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択される使用であって、
（ここで、Ｚは、Ｓ＋、Ｏ＋、Ｃ又はＮから選択され、
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９及びＲ１０は、水素であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７及びＲ８は、メチルである。）
ここで、前記還元形態は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）、その水和物又は溶媒和物である
（ここで、Ｘ－は１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成する。）
、使用。
【化6】
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９及びＲ１０は、水素であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７及びＲ８は、メチルである。）
ここで、前記還元形態は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）、その水和物又は溶媒和物である
【化7】
、使用。
【請求項11】
Ｘ－は、Ｃｌ－、Ｂｒ－、Ｉ－、メタンスルホン酸根アニオン、エタンスルホン酸根アニオン、ｐ－トルエンスルホン酸根アニオン、ベンゼンスルホン酸根アニオン、エタネジスルホン酸根アニオン、プロパンジスルホン酸根アニオン、及びナフタレンジスルホン酸根アニオンから選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項12】
前記フェノチアジン系化合物は式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物又は溶媒和物から選択される、請求項１０に記載の使用。
（ここで、Ｘ－は１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成する。）
【化8】
【請求項13】
前記フェノチアジン系化合物は３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリド又はＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムジメシレートである、請求項１０に記載の使用。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医薬技術分野に関し、特に、製薬におけるフェノチアジン類又は類似の構造を持つ化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態の新しい使用に関する。本発明の別の態様は、フェノチアジン系化合物と養子細胞療法の併用に関する。本発明の別の態様は、フェノチアジン系化合物と腫瘍免疫化学療法剤、特にＰＤ－１抗体との併用に関する。
【背景技術】
【0002】
養子細胞療法（Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）は、哺乳動物から１つ又は複数の異なるタイプの免疫細胞を採取し、採取した免疫細胞をエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で培養及び／又は操作し、培養及び／又は操作した免疫細胞を哺乳動物に戻すことを含む治療方法である。採取された免疫細胞に対するエクスビボ操作は、組換え核酸を免疫細胞に導入することを含む。養子細胞療法には、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ、Ｔｕｍｏｒ Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ）、サイトカイン誘導キラー細胞（ＣＩＫ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ）、樹状細胞（ＤＣ、Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ、Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ）、Ｔ細胞受容体キメラ－Ｔ細胞（ＴＣＲ－Ｔ、Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＴＣＲ－Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌ）、キメラ抗原受容体ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ）、及びキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ、Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌ）などが含まれるが、これらに限定されない。
【0003】
人体免疫系は外来から侵入した病原微生物や変異した細胞に対抗し、除去することができ、免疫細胞は人体免疫機能を実行する重要な細胞である。その中で、Ｔ細胞は人体内の重要な免疫細胞であり、その細胞表面に発現した抗原受容体（ＴＣＲ）を介して標的細胞上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によって提示された抗原を認識することができ、これは第１のシグナルと呼ばれる。標的細胞の適切な第２のシグナル（例えばＢ７分子）との相乗作用により、Ｔ細胞は活性化され、その機能を発揮する。例えば、Ｔ細胞の１つのサブクラスである細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬと略称する）は、活性化された後に標的細胞を直接殺傷することで、ウイルスで感染された細胞や腫瘍細胞を除去することができる。
【0004】
Ｔ細胞が活性化される過程で、Ｔ細胞は負のフィードバックを発現してその免疫機能を阻害するいくつかの分子を開始し、ＰＤ－１（すなわちｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ １、プログラム細胞死１）はその中で最も知られている分子の１つである。ＣＴＬ細胞表面のＰＤ－１タンパク質がそのリガンド（通常は標的細胞（例えば腫瘍細胞）上のＰＤ－Ｌ１）によって刺激されると、ＰＤ－１はそのシグナル伝達を開始し、ＣＴＬの機能を阻害し、Ｔ細胞のアポトーシス又はアネルギーを引き起こす。このようなシグナル伝達により、ＣＴＬは標的細胞を殺傷する機能を失う。ヒトの腫瘍細胞を例にとると、これらの腫瘍細胞は通常、細胞表面にＰＤ－Ｌ１を発現し、ＣＴＬによるその殺傷を阻害し、これにより免疫モニタリングを回避することができる。一方、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の相互作用を薬物で遮断すると、ＰＤ－１のシグナル伝達が阻害され、腫瘍細胞に対するＣＴＬの殺傷能力が回復する。Ｔ細胞に加えて、他の免疫細胞もＰＤ－１を発現することができる。例えばマクロファージ、Ｂ細胞などではＰＤ－１の発現が報告されている。適切な薬物でＰＤ－１の機能を阻害すると、これらの免疫細胞の機能はある程度回復する。例えば、ＰＤ－１の機能を阻害すると、マクロファージはＭ２（すなわちＣＴＬの機能を阻害するタイプ）からＭ１（すなわちＣＴＬの機能を促進するタイプ）に変化し、生体内の腫瘍細胞を除去する。現在、抗体系薬物などの生物製剤は臨床治療用としてＦＤＡの承認を得ている。しかし、これまで臨床的に使用されているＰＤ－１に対する薬物はすべて生物製剤系抗体であり、小分子化合物のＰＤ－１シグナル伝達阻害剤については報告されていない。
【0005】
https://baike.baidu.com/item/%E6%B0%AF%E5%8C%96%E7%89%A9https://baike.baidu.com/item/%E6%9F%93%E6%96%99メチレンブルー（３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリド）はフェノチアジン塩であり、化学指示薬、染料、生物染色剤などに広く応用されている。最近、いくつかの研究は薬物におけるその使用を報告しており、例えば、中国特許公告番号ＣＮ １０４０２７３３８Ａはメチレンブルーの抗急性脳虚血の新しい用途を開示し、中国特許公告番号ＣＮ １０３４１７５４６Ｂはメチレンブルーの麻酔後覚醒促進の新しい使用を開示している。また、いくつかの文献では、メチレンブルーが光増感剤として光増感薬を調製して光線力学療法を行うのに用いられることが開示されている。研究者により、従来の光線力学療法が体内治療に使われている場合、生物組織の光線に対する吸収や散乱の作用により励起光強度が減衰し、悪性腫瘍組織の酸素不足状態が一重項酸素の生産量を低くし、このため、単純な光増感剤が光増感薬として使用される場合、本格的な腫瘍治療作用を有していないことが発現されている（中国特許公告番号ＣＮ １０６６６８８５９Ａ）。
【0006】
したがって、従来技術では、薬物におけるメチレンブルーの使用がいくつか開示されているが、メチレンブルーをＰＤ－１シグナル伝達阻害に応用し、それを腫瘍の予防・治療に応用することを報告した文献はない。現在、臨床では、癌を治療するのに十分に有効な薬物がまだ不足しており、そのため、腫瘍に有効な薬物を提供することには重要な臨床的意義がある。
【発明の概要】
【0007】
本発明は、（ａ）養子細胞療法に適した免疫細胞と、（ｂ）式（Ｉ）で示される化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択されるフェノチアジン系化合物とを含む医薬組成物を提供する。
（ここで、Ｚは、Ｓ＋、Ｏ＋、Ｃ又はＮから選択され、
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。）
【化1】
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮであり、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋であり、
Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。）
【0008】
いくつかの実施形態において、前記Ｘは無機酸根アニオン及び有機酸根アニオンから選択される。さらに、前記無機酸根アニオンは好ましくはＣｌ－、Ｂｒ－、Ｉ－である。前記有機酸根アニオンは好ましくはメタンスルホン酸根アニオン、エタンスルホン酸根アニオン、ｐ－トルエンスルホン酸根アニオン、ベンゼンスルホン酸根アニオン、エタネジスルホン酸根アニオン、プロパンジスルホン酸根アニオン、及びナフタレンジスルホン酸根アニオンである。
【0009】
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のＣ１～Ｃ６アルキル、置換又は無置換のＣ３～Ｃ８シクロアルキル、置換又は無置換の３～８員ヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のＣ５～Ｃ１０アリール、置換又は無置換の５～１０員ヘテロアリール、置換又は無置換のＣ１～Ｃ６アルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリドである。
【0010】
いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択される。
（ここで、Ｘは１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、以上と同義である。）
【化2】
【0011】
いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物の還元形態は式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）、その水和物又は溶媒和物である。
（ここで、Ｘは１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、以上と同義である。）
【化3】
【0012】
いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリド又はＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムジメシレートである。
【0013】
いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）、キメラ抗原受容体ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ）、及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）キメラＴ細胞（ＴＣＲ－Ｔ）から選択される。
【0014】
いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）キメラＴ細胞である。
【0015】
いくつかの実施形態において、前記ＴＣＲはＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに結合可能である。
【0016】
本発明のさらに別の態様は、ａ）第１の剤形に配合された上記免疫細胞のいずれかと、ｂ）第２の剤形に配合された上記の化合物のいずれかとを含むキットを提供する。
【0017】
本発明のさらに別の態様は、癌治療薬の製造における上記化合物のいずれかの使用を提供する。
【0018】
いくつかの実施形態において、前記癌は黒色腫、胸腺腫瘍、肺癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、リンパ腫、食道癌、膀胱癌、尿道癌、非ホジキンリンパ腫、腎臓癌又は脳腫瘍である。
【0019】
本発明の別の態様はまた、免疫細胞機能を向上させる薬物の製造における上記フェノチアジン系化合物のいずれかの使用を提供する。
【0020】
本発明の別の態様は、ＰＤ－１シグナル伝達を阻害する薬物の製造における上記フェノチアジン系化合物のいずれかの使用を提供する。本発明の別の態様は、ＰＤ－１下流シグナル経路を遮断する薬物の製造における上記フェノチアジン系化合物のいずれかの使用を提供する。本発明の別の態様は、ＰＤ－１によるＳＨＰ２タンパク質リクルートを遮断する薬物の製造における上記フェノチアジン系化合物のいずれかの使用を提供する。
【0021】
本発明の別の態様は、ＰＤ－１下流シグナル経路を遮断するステップを含むＰＤ－１シグナル伝達を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記遮断は、ＰＤ－１によるＳＨＰ２タンパク質リクルートを遮断することにより達成される。いくつかの実施形態において、前記ＰＤ－１によるＳＨＰ２リクルートを遮断するステップは、細胞と本発明に記載のいずれかのフェノチアジン系化合物の有効量とを接触させることを含む。
【0022】
本発明の別の態様は対象における癌を治療する方法であって、対象におけるＰＤ－１シグナル伝達を阻害することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記対象におけるＰＤ－１シグナル伝達を阻害することは、ＰＤ－１下流シグナル経路を遮断することを含む。いくつかの実施形態において、前記ＰＤ－１下流シグナル経路を遮断することは、ＰＤ－１によるＳＨＰ２リクルートを遮断することを含む。いくつかの実施形態において、前記ＰＤ－１によるＳＨＰ２リクルートを遮断するステップは、本発明に記載のフェノチアジン系化合物のいずれかの有効量を対象に投与することを含む。
【0023】
本発明の別の態様は、対象における癌を治療する方法であって、本発明に記載のフェノチアジン系化合物のいずれかの有効量を前記対象に投与することと、対象に第２の治療法を施すことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記第２の治療法は化学療法、放射線療法及び手術治療から選択される。いくつかの実施形態において、前記化学療法は腫瘍免疫療法である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍免疫療法は、ＰＤ－１抗体又はＰＤ－Ｌ１抗体又はその機能的断片を前記対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、この態様に記載の方法は相乗的な抗腫瘍作用を発揮する。
【0024】
本発明の別の態様は癌治療用の薬物組成物であって、本発明に記載のフェノチアジン系化合物のいずれかと、第２の化学療法剤とを含む薬物組成物を提供する。いくつかの実施形態において、前記第２の化学療法剤は腫瘍免疫治療剤である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍免疫治療剤はＰＤ－１抗体又はＰＤ－Ｌ１抗体又はその機能的断片である。
【0025】
本発明の別の態様は、対象におけるＰＤ－１抗体又はＰＤ－Ｌ１抗体又はその機能的断片の治療効果を強化させる方法であって、前記ＰＤ－１抗体又はＰＤ－Ｌ１抗体の投与の前、同時又は後に、本発明に記載のフェノチアジン系化合物のいずれかの有効量を前記対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、この方法は相乗的な抗腫瘍作用を発揮する。
【0026】
本発明の発明者らは、大量の創造的労働を通じて、本発明のフェノチアジン類及び類似の構造を持つ化合物を免疫細胞（特に遺伝子改変された免疫細胞）と併用することにより、標的細胞に対する免疫細胞の殺傷作用を顕著に向上させ、相乗効果を達成できることを発見した。本発明のフェノチアジン類及び類似の構造を持つ化合物は、ＰＤ－１の機能を阻害し、ＰＤ－１のシグナル伝達を阻止することができ、ＰＤ－１シグナル伝達阻害剤として有用である。
【0027】
インビトロ実験において、このような化合物はＰＤ－１によって阻害された免疫細胞の機能を回復させ、ＣＴＬなどの免疫細胞によるサイトカイン分泌や標的細胞への殺傷機能を向上させ、生体の免疫機能を向上させることができることを見出した。動物モデルにおいて、本発明のフェノチアジン類及び類似の構造を持つ化合物は、マウス体内の移植腫瘍又は原位置肺癌を縮小し、癌を治療する目的を達成できる。さらに、ＰＤ－１抗体などの大分子に対して、小分子ＰＤ－１シグナル伝達阻害剤は低コストであり、製造技術が簡単（例えば化学合成により）であり、投与経路が多く、患者のコンプライアンスが高く、安全で信頼性が高いなどの優位性がある。また、本発明の実験では、本発明のフェノチアジン系化合物は、ＰＤ－１抗体と同等又はそれ以上の腫瘍阻害効果を有することも実証されている。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】実施例１の実験結果図であり、Ａは、未トランスフェクション及びトランスフェクションＪｕｒｋａｔ細胞の表面のＰＤ－１タンパク質の発現を示し、Ｂは、未トランスフェクション及びトランスフェクションＲａｊｉ細胞の表面のＰＤ－Ｌ１タンパク質の発現を示し、ＣはトランスフェクションされたＲａｊｉ細胞が、トランスフェクションされたＪｕｒｋａｔ細胞中のＰＤ－１タンパク質Ｙ２４８のリン酸化を誘導した結果を示し、Ｄは、ＭＴＣがＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ｌｕｃ細胞のＩＬ－２分泌を促進した結果であり、Ｅは、ＭＴＣ又はＬＭＴ（Ｎ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムジメシレート）がＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ｌｕｃ細胞におけるルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）活性の上昇を促進することを示す。
【図2】実施例２におけるＭＴＣによるＯＴ－１細胞の分裂促進を示し、ＡはＯＴ１－ＣＴＬ細胞の表面にＰＤ－１タンパク質を発現させた結果であり、ＢはＭＴＣがＣＴＬ分裂を促進した結果である。
【図3】実施例２におけるＭＴＣによるＯＴ－１細胞のエフェクター分子分泌の促進を示し、ＭＴＣはＣＴＬ細胞におけるＩＬ－２、ＩＦＮγ、パーフォリン及びグランザイムＢの分泌を促進する。
【図4】ＭＴＣがＯＴ－１ Ｔ細胞の標的細胞殺傷能力を回復することを示し、Ａは、ＭＴＣがＣＴＬによるＥＬ４－ＯＶＡ（ＰＤ－Ｌ１）の殺傷を促進することを示し、ＢはＩＦＮγによるＢ１６－Ｆ１０のＰＤ－Ｌ１タンパク質発現の誘導を示し、Ｃ、Ｄは、ＭＴＣ又はＬＭＴがＢ１６－ＯＶＡ細胞に対するＣＴＬの殺傷を相乗的に増加させることを示し、ＥはＭＴＣ又はＬＭＴがＢ１６－ＷＴ細胞に対して殺傷作用がなく、ＣＴＬ細胞と組み合わせても細胞に対して殺傷作用がないことを示す。
【図5】ＭＴＣが細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による標的細胞によって形成された腫瘍の除去を促進した結果図であり、Ａは移植腫の模式図であり、Ｂ、Ｃ、ＤはＭＴＣがＲａｇ１－／－マウス移植腫瘍の成長を阻害することを示し、Ｅは、ＭＴＣがＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス移植腫瘍の成長を阻害することを示す。
【図6】ＭＴＣによる原発腫瘍の治療結果図であり、Ａは原位置腫瘍を治療する実験の模式図であり、ＢはＭＴＣがＣＤ８＋Ｔ細胞を通じて腫瘍を除去した結果である。
【図7】ＭＴＣがＰＤ－１によるＳＨＰ２リクルートを遮断した結果図であり、ＡはＭＴＣがＰＤ１とＳＨＰ２との結合を減少することを実証し、Ｂは、ＭＴＣがＰＤ１によるＳＨＰ２リクルートを阻害することを示し、Ｃは、ＭＴＣがＰＤ１とＳＨＰ２との結合を阻害することを示す。
【発明を実施するための形態】
【0029】
「養子細胞療法」又は「ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ」という用語は、抗腫瘍活性を有する免疫細胞を癌患者に移すことを含む。いくつかの実施例では、ＡＣＴは、抗腫瘍活性を有するリンパ球を使用し、これらの細胞をインビトロで大量に増幅し、癌に罹患している宿主にこれらの細胞を注入することを含む治療方法である。
【0030】
「腫瘍浸潤リンパ球」又はＴＩＬという用語は、血流から離れて腫瘍に移行した白血球を指す。「ＣＡＲ－Ｔ」という用語は「キメラ抗原受容体Ｔ細胞」の略称であり、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）はＣＡＲ－Ｔのコアコンポーネントであり、ＨＬＡ非依存的な方式で標的細胞（例えば腫瘍）の抗原を認識する能力をＴ細胞に付与し、これにより、ＣＡＲで改変されたＴ細胞は、天然Ｔ細胞表面受容体ＴＣＲと比較して、より広範な標的を認識することができる。
【0031】
「ＴＣＲ－Ｔ（Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）キメラ－Ｔ細胞）」という用語は、エンジニアリングされたＴ細胞受容体（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＴＣＲ）又は人工Ｔ細胞受容体（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＴＣＲ）を発現するＴ細胞を指す。前記エンジニアリングされたＴ細胞受容体又は人工Ｔ細胞受容体は、ＴＣＲシグナル伝達経路内のドメイン及び／又はヘルパー分子を保持しながら、目的の抗原を標的とする構造を有するように遺伝子改変されている。いくつかの実施例では、ＴＣＲ－ＴはＴＣＲシグナル伝達経路中のすべてのヘルパー分子を保持し、したがって、少量の抗原刺激では、完全に活性化された状態になり、標的細胞に対する殺傷効果を引き起こすことができる。これらのＴＣＲ－Ｔは、ＣＡＲ－Ｔと比較して、ＴＣＲシグナル伝達経路のすべてのヘルパー分子を保持・応用しているため、ＴＣＲ－Ｔは、低濃度、少コピー数の抗原に対する認識感受性が一部のＣＡＲ－Ｔよりも高く、治療の可能性が期待できる。
【0032】
チロシンプロテインホスファターゼ非受容体１１型（ＰＴＰＮ１１）は、プロテインチロシンホスファターゼ１Ｄ（ＰＴＰ－１Ｄ）とも呼ばれ、Ｓｒｃ相同領域２にドメインホスファターゼ－２（ＳＨＰ－２）又はプロテインチロシンアシッドホスファターゼ２Ｃ（ＰＴＰ－２Ｃ）を含有し、ヒトＰＴＰＮ１１遺伝子によってコードされる酵素である。ＳＨＰ－２はさまざまな組織や細胞タイプに広く発現しており、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ－１などの成長因子、ＩＬ－３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＥＰＯなどのサイトカイン、及びインスリン、インターフェロンを含む複数のシグナル伝達経路にかかわる。ＳＨＰ－２は化合物シグナル伝達機能を有する。Ｒａｓ－Ｒａｆ－ＭＡＰ－ＥＲＫ経路、Ｊａｋ－Ｓｔａｔ経路やＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ経路など、さまざまなシグナル伝達過程が関与しているようである。また、Ｇｒｂ２、ＦＲＳ２、Ｊａｋ２、ＰＩ３キナーゼのｐ８５サブユニット、ＩＲＳ－１、Ｇａｂ１、Ｇａｂ２など、さまざまなシグナル中間体に結合できることも証明されている。ＰＤ－１受容体の下流分子であるＳＨＰ－２は、Ｔ細胞の阻害性シグナル伝達に関与している。ＳＨＰ－２はＰＤ－１シグナル伝達の下流分子であり、Ｔ細胞の活性化を阻害するだけでなく、Ｔ細胞の機能不全を促進することが研究により明らかになっている。Ｔリンパ球上でＳＨＰ２をノックアウトすることにより抗腫瘍免疫を誘発し、マウス大腸炎関連癌の発生を阻害することも研究により明らかになっている。
【0033】
メチオニン（ＭＴ）はレドックス分子であり、環境条件（例えば、ｐＨ、酸素、還元剤）に依存して、還元形態である１０Ｈ－フェノチアジン系化合物（即ち、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム（ＬＭＴ））と酸化形態（ＭＴ＋）との平衡状態で存在する。
【0034】
酸化形態の塩ＭＴＸは式ＩＩで示される。
ＬＭＴはその塩の形態で存在する場合、式ＩＩＩに示されるようにＬＭＴＸ塩と呼ばれる。
Ｘ－は、無機酸根アニオン及び有機酸根アニオンから選択され、適切な有機酸アニオンの例としては、２－アセトキシ安息香酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、桂皮酸、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシ酢酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフトエ酸、ヒドロキシエチルスルホン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸（ｐａｍｏｉｃ）、パントテン酸（ｐａｎｔｏｔｈｅｎｉｃ）、フェニル酢酸、ベンゼンスルホン酸、プロパンジスルホン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、ｐ－アミノベンゼンスルホン酸、酒石酸、トルエンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、及び吉草酸という有機酸から誘導される有機酸アニオンが含まれるが、これらに限定されるものではない。好適な高分子有機アニオン（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｏｒｇａｎｉｃ ａｎｉｏｎ）としては、タンニン酸、カルボキシメチルセルロースという高分子酸（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ａｃｉｄ）から誘導される高分子有機アニオンが含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、前記無機酸根アニオンは、Ｃｌ－、Ｂｒ－、Ｉ－であることが好ましい。前記有機酸根アニオンはメタンスルホン酸根アニオンであることが好ましい。
【化4】
【化5】
【0035】
メチレンブルー（ＭＴＣ）（本明細書では３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリドとも呼ばれる）は、メチオニン（ＭＴ）の酸化形態（すなわちＭＴ＋）の塩化物塩であり、以下の構造式を有する低分子量（３１９．８６）の水溶性三環式有機化合物である。
また、Ｎ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムジメシレートの構造は以下に示される。
【化6】
【化7】
【0036】
本願で使用される用語「溶媒和物」は、その一般的な意味であり、溶質（例えば、化合物、化合物の塩）と溶媒との複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を指す。溶媒が水であれば、便宜上、溶媒和物を一水和物、二水和物、三水和物などの水和物と称することができる。特に断らない限り、特定の化合物が言及される場合、該特定の化合物は、その溶媒和物の形態も含む。
【0037】
本明細書で使用される「治療」は、疾患又は障害の症状又は合併症を軽減するか、又は疾患又は障害を除去するために、本願の化合物又は本願の組成物を投与することを含む。本明細書で使用される用語「軽減」は、障害の兆候又は症状の重篤度が低下する過程を説明するものである。症状は軽減されたが解消されなくてもよい。１つの実施形態では、本願の組成物を投与することにより、兆候又は症状が解消される。
【0038】
用途及び治療法
本発明の一態様は、ＰＤ－１シグナル伝達阻害剤の製造におけるフェノチアジン系化合物の使用であって、該フェノチアジン系化合物は式（Ｉ）で示される化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択される使用に関する。
（ここで、Ｚは、Ｓ＋、Ｏ＋、Ｃ又はＮから選択され、
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつ、ＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮから選択され、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋から選択され、Ｘ－は、Ｚ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲン選択される。）
本発明の一態様は、ＰＤ－１シグナル伝達阻害剤の製造におけるフェノチアジン系化合物の使用であって、該フェノチアジン系化合物は式（Ｉ）で示される化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択される使用に関する。
【化8】
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつ、ＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮから選択され、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋から選択され、Ｘ－は、Ｚ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲン選択される。）
【0039】
いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択される。
（ここで、Ｘは１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、上記と同義である。）
【化9】
【0040】
いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物の還元形態は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）、その水和物又は溶媒和物である。
（ここで、Ｘは、１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、上記と同義である。）
【化10】
【0041】
いくつかの実施形態において、該フェノチアジン系化合物類は、３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）であり、好ましくは、前記フェノチアジン系化合物は、３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリドである。
【0042】
本発明の別の態様は、癌治療薬の製造における式Ｉのフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態の使用に関する。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態である。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）である。この態様において、好ましくは、前記フェノチアジン系化合物は、３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリド又はＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムジメシレートである。
【0043】
本発明の別の態様は、免疫細胞の機能を向上させる薬物の製造における式Ｉのフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態の使用に関する。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態である。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）である。この態様では、好ましくは、前記フェノチアジン系化合物は、３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリド又はＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムジメシレートである。
【0044】
本発明の別の態様は、癌の再発を予防又は治療する薬物の製造における式Ｉのフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態の使用に関する。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態である。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）である。この態様では、好ましくは、前記フェノチアジン系化合物は、３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリド又はＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムジメシレートである。
【0045】
本発明の別の態様は、ＰＤ－１下流シグナル経路を遮断する薬物の製造における式Ｉのフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態の使用に関する。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態である。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）である。この態様では、好ましくは、前記フェノチアジン系化合物は、３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリド又はＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムジメシレートである。
【0046】
本発明の別の態様は、ＰＤ－１によるＳＨＰ２タンパク質のリクルートを遮断する薬物の製造における式Ｉのフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態の使用に関する。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態である。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）である。この態様では、好ましくは、前記フェノチアジン系化合物は、３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリド又はＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムジメシレートである。
【0047】
本発明の別の態様は、癌に罹患している対象に本発明の式Ｉのフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態の治療有効量を投与することを含む、癌治療方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態である。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）である。この態様では、好ましくは、前記フェノチアジン系化合物は、３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリド又はＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムジメシレートである。いくつかの実施形態において、前記癌は黒色腫、胸腺腫瘍、肺癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、リンパ腫、食道癌、膀胱癌、尿道癌、非ホジキンリンパ腫、腎臓癌又は脳腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記癌は黒色腫である。いくつかの実施形態において、前記対象は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
【0048】
本発明の別の態様は、免疫細胞機能を向上させる方法であって、式Ｉのフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態の治療有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態である。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）である。この態様では、好ましくは、前記フェノチアジン系化合物は、３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリド又はＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムジメシレートである。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞機能の向上は、抗ウイルス効果を達成することができる。いくつかの実施形態において、前記対象は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
【0049】
本発明の別の態様は、癌の再発を予防又は治療する方法であって、式Ｉのフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態の治療有効量を、前記癌に罹患している対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態である。いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）である。この態様では、好ましくは、前記フェノチアジン系化合物は、３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリド又はＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムジメシレートである。いくつかの実施形態において、前記対象は、手術、放射線療法、又は化学療法を受けたことがある。
【0050】
いくつかの実施形態において、前記方法は、他の癌の療法と併用してもよい。例えば、前記方法は、手術、放射線療法又は化学療法と併用してもよい。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の癌治療方法は、前記癌に罹患している対象に第２の治療剤の治療有効量を投与することをさらに含む。
【0051】
いくつかの実施形態において、前記第２の治療剤は、養子細胞療法に適した免疫細胞である。これらの実施形態において、前記第２の治療剤は、式Ｉのフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態の投与の前、同時又は後に投与される。
【0052】
いくつかの実施形態において、前記第２の治療剤は化学療法剤であり、好ましくは、前記化学療法剤は腫瘍免疫化学療法剤であり、より好ましくは、前記化学療法剤はＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体又はそれらの断片である。いくつかの実施形態において、前記第２の治療剤は、式Ｉのフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態の投与の前、同時又は後に投与される。
【0053】
第２の治療剤が本発明のフェノチアジン系化合物、その水和物又は溶媒和物と同時に投与されない場合、両者は約０．１時間～約７２時間、例えば約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４、３０、３６、７２ｈの間隔で投与される。
【0054】
第２の治療剤が本発明のフェノチアジン系化合物、その水和物又は溶媒和物と同時に投与される場合、いくつかの実施形態において、本発明のフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態は、この第２の治療剤とはそれぞれ別個の薬物組成物の形態で提供される。いくつかの実施形態において、前記別個の薬物組成物は、同一のキットに提供される。第２の治療剤が本発明のフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態と同時に投与される場合、他の実施形態において、本発明のフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態は、この第２の治療剤と単一の薬物組成物の形態で提供される。
【0055】
医薬組成物及びキット
本発明の一態様は、式Ｉで示されるフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態を含む、癌治療用の医薬組成物を提供する。
（ここで、Ｚは、Ｓ＋、Ｏ＋、Ｃ又はＮから選択され、
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮから選択され、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋から選択され、Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。）
本発明の一態様は、式Ｉで示されるフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態を含む、癌治療用の医薬組成物を提供する。
【化11】
ＹはＮ又はＮ＋から選択され、かつＺがＳ＋又はＯ＋から選択される場合、ＹはＮから選択され、ＺがＣ又はＮから選択される場合、ＹはＮ＋から選択され、Ｘ－はＺ＋又はＮ＋と塩を形成し得る１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のシクロアルキル、置換又は無置換のヘテロシクロアルキル、置換又は無置換のアリール、置換又は無置換のヘテロアリール、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアリールアルコキシ、チオアルコキシ、アミン、ニトロ、アミノ、ハロゲンから選択される。）
【0056】
いくつかの実施形態において、前記Ｘは無機酸根アニオン及び有機酸根アニオンから選択される。さらに、前記無機酸根アニオンは好ましくはＣｌ－、Ｂｒ－、Ｉ－である。前記有機酸根アニオンは、好ましくはメタンスルホン酸根アニオン、エタンスルホン酸根アニオン、ｐ－トルエンスルホン酸根アニオン、ベンゼンスルホン酸根アニオン、エタンジスルホン酸根アニオン、プロパンジスルホン酸根アニオン、及びナフタレンジスルホン酸根アニオンである。
【0057】
いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物は、式ＩＩの３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）、その水和物、溶媒和物又は還元形態から選択される。
（ここで、Ｘは１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、上記と同義である。）
【化12】
【0058】
いくつかの実施形態において、前記フェノチアジン系化合物の還元形態は、式ＩＩＩのＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウム塩（ＬＭＴＸ）、その水和物又は溶媒和物である。
（ここで、Ｘは、１つ又は複数のアニオンとすることにより、電気的中性を達成し、上記と同義である。）
【化13】
【0059】
いくつかの実施形態において、該フェノチアジン系化合物類は、３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウム塩（ＭＴＸ）であり、好ましくは、前記フェノチアジン系化合物は、３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリド（ＭＴＣ）である。
【0060】
いくつかの実施形態において、該フェノチアジン系化合物類は、Ｎ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムジメシレートである。
【0061】
本発明の別の態様は、式Ｉで示されるフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態と、養子細胞療法に適した免疫細胞とを含む、癌治療用の医薬組成物であって、式Ｉ及びその置換基は上記と同義である医薬組成物を提供する。
【0062】
いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）、キメラ抗原受容体ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ）及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）キメラＴ細胞から選択される。
【0063】
いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）キメラＴ細胞である。
【0064】
いくつかの実施形態において、前記ＴＣＲはＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに結合可能である。
【0065】
本発明の別の態様は、式Ｉで示されるフェノチアジン系化合物、その水和物、溶媒和物又は還元形態と、癌化学療法用の免疫治療剤とを含む、癌治療用の医薬組成物であって、式Ｉ及びその置換基は上記と同義である医薬組成物を提供する。
【0066】
いくつかの実施形態において、前記癌化学療法用の免疫治療剤は、ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体又はそれらの機能的断片である。
【0067】
したがって、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体と混合された形態で組成物に存在する有効成分（例えば、式Ｉのいずれかの化合物）を含んでもよい。本発明の組成物はまた、２つの有効成分（例えば、式Ｉのいずれかの化合物及び養子療法免疫細胞、又は式Ｉのいずれかの化合物及びＰＤ－１抗体）を同時に含んでもよく、これらは、適切な形態で同一の薬物組成物に含まれ、この薬物組成物の投与時に、前記２つの有効成分は同時に又は順次対象に投与される。例えば、式Ｉの化合物、養子細胞療法に適した免疫細胞及び担体は、所定の割合の混合物の形態をもって薬物組成物に存在する。あるいは、式Ｉの化合物と担体は所定の割合でこの薬物組成物の一部を構成し、養子細胞療法に適した免疫細胞と担体は所定の割合でこの薬物組成物の他の一部を構成し、２つの部分は組み合わせられて、例えばコアシェル構造で組み合わせられて前記薬物組成物を構成する。薬剤学的又は製薬工学的に利用可能な他の方法も、投与後の各活性成分の作用の発揮に影響を与えることなく、２つの有効成分を組み合わせるために使用してもよい。
【0068】
本発明の別の態様は、独立して存在する、養子細胞療法に適した免疫細胞の治療有効量を含む第１の薬物組成物と、式Ｉのフェノチアジン系化合物又はその水和物又は溶媒和物の治療有効量を含む第２の薬物組成物とを含むキットを提供する。したがって、前記キットのいくつかの実施形態において、前記第１の薬物組成物は単独した剤形で存在することができ、前記第２の薬物組成物は別の単独した剤形で存在することができ、両者の剤形は同一であっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、前記キット内の第１の薬物組成物及び第２の薬物組成物は、それぞれ別個の容器に収容される。
【0069】
本発明の別の態様は、独立して存在する、式Ｉのフェノチアジン系化合物又はその水和物又は溶媒和物の治療有効量を含む第１の薬物組成物と、第２の化学療法剤（例えば、ＰＤ－１抗体のような免疫治療剤）の治療有効量を含む第２の薬物組成物とを含むキットを提供する。したがって、前記キットのいくつかの実施形態において、前記第１の薬物組成物は単独した剤形で存在することができ、前記第２の薬物組成物は別の単独した剤形で存在することができ、両者の剤形は同一であっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、前記キット内の第１の薬物組成物及び第２の薬物組成物は、それぞれ別個の容器に収容される。
【0070】
投与される有効成分の治療的又は予防的有効量は、標準的な手順により決定することができ、考慮される要素には、例えば、化合物のＩＣ５０、生物半減期、対象の年齢、サイズや体重、対象に関連する障害が含まれてもよい。これらの要因及びその他の要因の重要性は当業者にはよく知られている。一般には、投与量は、治療対象の約０．０１ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇの間、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの間である。
【0071】
担体又は賦形剤は、薬物組成物を製造するために使用されてもよい。前記担体又は賦形剤は、化合物の投与を促進するために選択され得る。担体の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖（例えば、乳糖、グルコースやショ糖）、又はデンプン類、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、及び生理学的に適合性のある溶媒が含まれる。生理学的に適合性のある溶媒の例としては、注射用水（ＷＦＩ）無菌溶液、食塩溶液、及びグルコースが含まれる。
【0072】
適切な剤形は、経口、経皮、経粘膜、吸入、又は注射（非経口）などの投与経路に部分的に依存する。このような剤形は有効成分が標的細胞に到達できるようにしなければならない。本発明の薬物又は薬物組成物は、静脈内、腹膜内、皮下、筋内、経口、経粘膜、直腸、経皮、又は吸入を含む異なる経路で投与され得る。いくつかの実施形態において、経口投与が好ましい。経口投与の場合、例えば、化合物は通常の経口投与剤形、例えばカプセル、錠剤、及びシロップ、エリキシル剤及び濃縮点滴剤などの液体製剤として調製されてもよい。
【0073】
実施例
以下では、具体的な実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。
以下の実施例におけるＭＴＣは、ＰＤ－１シグナル伝達阻害剤として以下の構造式の３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリドを指す。
以下の実施例におけるＬＭＴは、以下の構造式のＮ３,Ｎ３,Ｎ７,Ｎ７－テトラメチル－１０Ｈ－フェノチアジン－３,７－ジアンモニウムジメシレートである。
以下では、具体的な実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。
以下の実施例におけるＭＴＣは、ＰＤ－１シグナル伝達阻害剤として以下の構造式の３,７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン－５－イウムクロリドを指す。
【化14】
【化15】
【0074】
実施例１ ＭＴＣによるヒトＴ細胞の機能向上
一、実験方法：
（１）Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いてＰＤ－１を高発現する安定的にトランスフェクトされた細胞株を構築した。ｐＣＡＧｉｎ－ＰＤ－１プラスミドをＪｕｒｋａｔ細胞にエレクトロトランスフェクションし、その後、９００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８抗生物質でスクリーニングし、単一クローンをフローソートした。その後、ＮＦＡＴ結合部位によりルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の遺伝子（ＮＦＡＴ－ＬＵＣと表記）を制御するＤＮＡ断片をＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１細胞にエレクトロトランスフェクションした。その後、単一クローンをフローソートし、５番クローンと命名した。この細胞を用いて、ルシフェラーゼの活性を測定することによりＩＬ－２の発現量を反映させることができる。ＰＤ－Ｌ１を安定的に発現するＲａｊｉ細胞を構築し、ｐＣＤＮＡ－ＰＤ－Ｌ１プラスミドをＲａｊｉ細胞にエレクトロトランスフェクションし、２μｇ／ｍＬ ピューロマイシン耐性でスクリーニングした後、単一クローンをフローソートし、１番クローンと命名した。
（２）ＰＤ－Ｌ１を安定的に発現するＲａｊｉ細胞を用いてＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１上のＰＤ－１分子を刺激した。Ｒａｊｉ細胞は、Ｔ細胞の活性化に必要な第２のシグナルを提供し得る、Ｂ７分子を発現するヒト由来のＢリンパ球である。Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣ細胞を２μｇ／ｍＬ ＣＤ３抗体／２μｇ／ｍＬ ＣＤ２８抗体で刺激した後、１：１の割合でＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞と６時間共培養し、さらに免疫ブロットによりＰＤ－１のＹ２４８位のリン酸化を検出した。
（３）９６ウェルプレートにおいて１０μｇ／ｍＬ ＣＤ３抗体／１０μｇ／ｍＬ ＣＤ２８抗体でプレートを被覆し、４℃で一晩放置し、その後、ＰＢＳで余分な抗体を洗い流し、Ｒａｊｉ細胞又はＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞を１：１の割合でＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣ細胞と共培養し、又は、Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞とＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣ細胞を１：１の割合で混合した細胞に１μＭ ＭＴＣ又は１０μｇ／ｍＬのＰＤ１抗体を加えて共培養し、６時間共培養後、上清を採取し、ＥＬＩＳＡを用いてＩＬ－２の分泌を測定した。
（４）９６ウェルプレートにおいて１０μｇ／ｍＬ ＣＤ３抗体／１０μｇ／ｍＬ ＣＤ２８抗体でプレートを被覆し、４℃で一晩放置し、その後、ＰＢＳで余分な抗体を洗い流し、Ｒａｊｉ細胞又はＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞を１：１の割合でＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣ細胞と共培養し、又は、Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞とＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣ細胞を１：１の割合で混合した細胞に４．８６μＭ ＭＴＣ又はＬＭＴを加えて、６時間共培養した後、ルシフェラーゼ基質を加え、マイクロプレートリーダによりルシフェラーゼの読み取り値を測定した。
二、実験結果及び分析：
（１）ＰＤ－１を安定的に発現したＪｕｒｋａｔ細胞については、ＦＡＣＳにより試験したところ、５番クローンはＰＤ－１分子を正しく発現していることが示された（図１Ａ）。構築したＰＤ－Ｌ１を安定的に発現したＲａｊｉ細胞については、ＦＡＣＳにより、１番クローンはＰＤ－Ｌ１を正しく発現していることを示した（図１Ｂ）。
（２）Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞とＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１細胞を６時間共培養した後、免疫ブロット検出によりＰＤ－１のＹ２４８位がリン酸化されていることを確認した（図１Ｃ）。このことから、ＰＤ－１を発現するＪｕｒｋａｔと、ＰＤ－Ｌ１を安定的に発現するＲａｊｉ細胞との共培養では、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１が結合することが分かった。
（３）ＩＬ－２の分泌状況の結果、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣはＰＤ１抗体（ａｎｔｉ－ＰＤ１、ブリストルマイヤーズスクイブ製Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）又はＲａｊｉ細胞を加えた後、ＩＬ－２の分泌を有意に刺激することが明らかになった。Ｒａｊｉ ＰＤＬ１を加えた実験群では、いずれの刺激も加えなかったＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣ群と比較してＩＬ－２分泌量が低下したが、ＭＴＣ又はＰＤ１抗体を加えるとＩＬ－２分泌量が急激に増加した（図１Ｄ）。また、ＭＴＣはＰＤ１抗体群と比較して、ＰＤ１により阻害されたＪｕｒｋａｔ細胞の機能を有意に改善できた。
（４）Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣは、ＣＤ３抗体／ＣＤ２８抗体／Ｒａｊｉ細胞の刺激により、ルシフェラーゼの活性上昇が限定され、Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１を加えた細胞はルシフェラーゼの活性が低下した。Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１を加えた細胞に４．８６μＭ ＭＴＣ又はＬＭＴを加えると、ルシフェラーゼの活性が急激に上昇し（図１Ｅ）、このことから、ＭＴＣ又はＬＭＴはＰＤ－１により阻害されたＪｕｒｋａｔ細胞の機能を改善できることが示された。
一、実験方法：
（１）Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いてＰＤ－１を高発現する安定的にトランスフェクトされた細胞株を構築した。ｐＣＡＧｉｎ－ＰＤ－１プラスミドをＪｕｒｋａｔ細胞にエレクトロトランスフェクションし、その後、９００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８抗生物質でスクリーニングし、単一クローンをフローソートした。その後、ＮＦＡＴ結合部位によりルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の遺伝子（ＮＦＡＴ－ＬＵＣと表記）を制御するＤＮＡ断片をＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１細胞にエレクトロトランスフェクションした。その後、単一クローンをフローソートし、５番クローンと命名した。この細胞を用いて、ルシフェラーゼの活性を測定することによりＩＬ－２の発現量を反映させることができる。ＰＤ－Ｌ１を安定的に発現するＲａｊｉ細胞を構築し、ｐＣＤＮＡ－ＰＤ－Ｌ１プラスミドをＲａｊｉ細胞にエレクトロトランスフェクションし、２μｇ／ｍＬ ピューロマイシン耐性でスクリーニングした後、単一クローンをフローソートし、１番クローンと命名した。
（２）ＰＤ－Ｌ１を安定的に発現するＲａｊｉ細胞を用いてＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１上のＰＤ－１分子を刺激した。Ｒａｊｉ細胞は、Ｔ細胞の活性化に必要な第２のシグナルを提供し得る、Ｂ７分子を発現するヒト由来のＢリンパ球である。Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣ細胞を２μｇ／ｍＬ ＣＤ３抗体／２μｇ／ｍＬ ＣＤ２８抗体で刺激した後、１：１の割合でＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞と６時間共培養し、さらに免疫ブロットによりＰＤ－１のＹ２４８位のリン酸化を検出した。
（３）９６ウェルプレートにおいて１０μｇ／ｍＬ ＣＤ３抗体／１０μｇ／ｍＬ ＣＤ２８抗体でプレートを被覆し、４℃で一晩放置し、その後、ＰＢＳで余分な抗体を洗い流し、Ｒａｊｉ細胞又はＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞を１：１の割合でＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣ細胞と共培養し、又は、Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞とＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣ細胞を１：１の割合で混合した細胞に１μＭ ＭＴＣ又は１０μｇ／ｍＬのＰＤ１抗体を加えて共培養し、６時間共培養後、上清を採取し、ＥＬＩＳＡを用いてＩＬ－２の分泌を測定した。
（４）９６ウェルプレートにおいて１０μｇ／ｍＬ ＣＤ３抗体／１０μｇ／ｍＬ ＣＤ２８抗体でプレートを被覆し、４℃で一晩放置し、その後、ＰＢＳで余分な抗体を洗い流し、Ｒａｊｉ細胞又はＲａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞を１：１の割合でＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣ細胞と共培養し、又は、Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞とＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣ細胞を１：１の割合で混合した細胞に４．８６μＭ ＭＴＣ又はＬＭＴを加えて、６時間共培養した後、ルシフェラーゼ基質を加え、マイクロプレートリーダによりルシフェラーゼの読み取り値を測定した。
二、実験結果及び分析：
（１）ＰＤ－１を安定的に発現したＪｕｒｋａｔ細胞については、ＦＡＣＳにより試験したところ、５番クローンはＰＤ－１分子を正しく発現していることが示された（図１Ａ）。構築したＰＤ－Ｌ１を安定的に発現したＲａｊｉ細胞については、ＦＡＣＳにより、１番クローンはＰＤ－Ｌ１を正しく発現していることを示した（図１Ｂ）。
（２）Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１細胞とＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１細胞を６時間共培養した後、免疫ブロット検出によりＰＤ－１のＹ２４８位がリン酸化されていることを確認した（図１Ｃ）。このことから、ＰＤ－１を発現するＪｕｒｋａｔと、ＰＤ－Ｌ１を安定的に発現するＲａｊｉ細胞との共培養では、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１が結合することが分かった。
（３）ＩＬ－２の分泌状況の結果、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣはＰＤ１抗体（ａｎｔｉ－ＰＤ１、ブリストルマイヤーズスクイブ製Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）又はＲａｊｉ細胞を加えた後、ＩＬ－２の分泌を有意に刺激することが明らかになった。Ｒａｊｉ ＰＤＬ１を加えた実験群では、いずれの刺激も加えなかったＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣ群と比較してＩＬ－２分泌量が低下したが、ＭＴＣ又はＰＤ１抗体を加えるとＩＬ－２分泌量が急激に増加した（図１Ｄ）。また、ＭＴＣはＰＤ１抗体群と比較して、ＰＤ１により阻害されたＪｕｒｋａｔ細胞の機能を有意に改善できた。
（４）Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ－ＬＵＣは、ＣＤ３抗体／ＣＤ２８抗体／Ｒａｊｉ細胞の刺激により、ルシフェラーゼの活性上昇が限定され、Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１を加えた細胞はルシフェラーゼの活性が低下した。Ｒａｊｉ－ＰＤ－Ｌ１を加えた細胞に４．８６μＭ ＭＴＣ又はＬＭＴを加えると、ルシフェラーゼの活性が急激に上昇し（図１Ｅ）、このことから、ＭＴＣ又はＬＭＴはＰＤ－１により阻害されたＪｕｒｋａｔ細胞の機能を改善できることが示された。
【0075】
実施例２ ＭＴＣによるＯＴ－１細胞の分裂及びエフェクター分子分泌の促進
ＯＴ－１トランスジェニックマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞で発現したＴＣＲはニワトリ卵白アルブミンのＳＩＩＮＦＥＫＬ－Ｈ－２Ｋｂ複合体を認識できる。このため、ＯＴ－１マウスの脾臓細胞をインビトロで培養する時に、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドセグメントの刺激により、脾臓中のＣＤ８＋Ｔ細胞は活性化され、激しく増幅され、これはＣＴＬ細胞と呼ばれる。
一、実験方法：
（１）ＣＴＬ細胞の調製：ＯＴ１マウスの脾臓を採取し、粉砕後に赤血球溶解液を加えて赤血球を溶解し、単細胞懸濁液を製造し、培養液を１６４０＋１０％ＦＢＳ＋５０μＭ βＭＥ＋１０ｎＭ ＩＬ－２とし、細胞密度を約２～４ｍｉｌｌｉｏｎ／ｍＬに調節し、１０ｎＭ ＯＶＡ２５７－２６４を加えて、３７℃、５％ＣＯ２細胞インキュベーターで培養し、ＣＴＬ調製当日から毎日ＦＩＴＣ標識ＰＤ－１抗体で染色し、その後、この細胞の表面のＰＤ－１発現変化をフロー測定した。
（２）上記のＣＴＬ細胞を５ｎＭ ＣＦＳＥで標識し、１０ｎＭ ＳＩＩＮＦＥＫＬと１０ｎＭ ＩＬ－２を加えて刺激し、同時に１０μｇ／ｍＬ マウスのＰＤ－Ｌ１タンパク質を加え、実験群ではさらに１００ｎＭのＭＴＣ小分子化合物を加え、それぞれ２４、４８、７２時間刺激した後、ＰＤ－Ｌ１タンパク質とＭＴＣによるＣＴＬ細胞分裂への影響をフローサイトメトリーにより観察した。
（３）ＣＴＬ細胞と標的細胞ＥＧ７（ニワトリ卵白アルブミンを発現するＥＬ４リンパ腫細胞）を１：１の濃度で混合培養し、１μＭ タンパク質輸送阻害剤ＧｏｌｇｉＰｌｕｇTMで６時間処理した後、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、０．１％ｓａｐｏｎｉｎで細胞を穿孔し、その後、各エフェクター分子の抗体で染色し、ＭＴＣによるＣＴＬエフェクター分子の分泌への影響をフロー検出した。
二、実験結果及び分析：
（１）ＣＴＬ細胞の細胞表面のＰＤ－１量は、誘導の全過程において誘導時間の増加に伴って徐々に増加した（図２Ａ）。
（２）ＣＴＬをＳＩＩＮＦＥＫＬとＩＬ－２で刺激し、ＰＤ－Ｌ１タンパク質を加えると、ＰＤ－Ｌ１タンパク質はＣＴＬ細胞の分裂を阻害し、一方、１００ｎＭのＭＴＣを加えると、この阻害を逆転させることができた（図２Ｂ）。
（３）ＥＧ７はニワトリ卵白アルブミンを発現するＥＬ４リンパ腫細胞であり、このため、ＣＴＬ細胞は認識してその殺傷機能を実行できる。活性化されたＯＴ－１マウス脾臓細胞とＥＧ７細胞が１：１の割合で混合されると、ＣＴＬ細胞はＩＬ－２、ＩＦＮγ、パーフォリン（Ｐｅｒｆｏｒｉｎ）、グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ）などのエフェクター分子の分泌を開始する。タンパク質輸送阻害剤ＧｏｌｇｉＰｌｕｇTM（ＰＴＩ）を加え、ＦＡＣＳで検出した。その結果、ＰＤ－Ｌ１を表面に過剰発現したＥＧ７細胞（ＥＧ７－ＰＤ－Ｌ１細胞安定株）は、ＣＴＬによるＩＬ－２、ＩＦＮγ、パーフォリン、グランザイムＢの分泌を強く阻害することを見出した。一方、ＭＴＣで処理した後、ＣＴＬ細胞によるＩＬ－２、ＩＦＮγ、パーフォリン、グランザイムＢの分泌量は急激に上昇した（図３）。このことは、ＭＴＣがＰＤ－１の阻害を改善し、ＣＴＬ細胞によるＩＬ－２、ＩＦＮγ、パーフォリン、グランザイムＢの分泌を促進することを示した。
ＯＴ－１トランスジェニックマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞で発現したＴＣＲはニワトリ卵白アルブミンのＳＩＩＮＦＥＫＬ－Ｈ－２Ｋｂ複合体を認識できる。このため、ＯＴ－１マウスの脾臓細胞をインビトロで培養する時に、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドセグメントの刺激により、脾臓中のＣＤ８＋Ｔ細胞は活性化され、激しく増幅され、これはＣＴＬ細胞と呼ばれる。
一、実験方法：
（１）ＣＴＬ細胞の調製：ＯＴ１マウスの脾臓を採取し、粉砕後に赤血球溶解液を加えて赤血球を溶解し、単細胞懸濁液を製造し、培養液を１６４０＋１０％ＦＢＳ＋５０μＭ βＭＥ＋１０ｎＭ ＩＬ－２とし、細胞密度を約２～４ｍｉｌｌｉｏｎ／ｍＬに調節し、１０ｎＭ ＯＶＡ２５７－２６４を加えて、３７℃、５％ＣＯ２細胞インキュベーターで培養し、ＣＴＬ調製当日から毎日ＦＩＴＣ標識ＰＤ－１抗体で染色し、その後、この細胞の表面のＰＤ－１発現変化をフロー測定した。
（２）上記のＣＴＬ細胞を５ｎＭ ＣＦＳＥで標識し、１０ｎＭ ＳＩＩＮＦＥＫＬと１０ｎＭ ＩＬ－２を加えて刺激し、同時に１０μｇ／ｍＬ マウスのＰＤ－Ｌ１タンパク質を加え、実験群ではさらに１００ｎＭのＭＴＣ小分子化合物を加え、それぞれ２４、４８、７２時間刺激した後、ＰＤ－Ｌ１タンパク質とＭＴＣによるＣＴＬ細胞分裂への影響をフローサイトメトリーにより観察した。
（３）ＣＴＬ細胞と標的細胞ＥＧ７（ニワトリ卵白アルブミンを発現するＥＬ４リンパ腫細胞）を１：１の濃度で混合培養し、１μＭ タンパク質輸送阻害剤ＧｏｌｇｉＰｌｕｇTMで６時間処理した後、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、０．１％ｓａｐｏｎｉｎで細胞を穿孔し、その後、各エフェクター分子の抗体で染色し、ＭＴＣによるＣＴＬエフェクター分子の分泌への影響をフロー検出した。
二、実験結果及び分析：
（１）ＣＴＬ細胞の細胞表面のＰＤ－１量は、誘導の全過程において誘導時間の増加に伴って徐々に増加した（図２Ａ）。
（２）ＣＴＬをＳＩＩＮＦＥＫＬとＩＬ－２で刺激し、ＰＤ－Ｌ１タンパク質を加えると、ＰＤ－Ｌ１タンパク質はＣＴＬ細胞の分裂を阻害し、一方、１００ｎＭのＭＴＣを加えると、この阻害を逆転させることができた（図２Ｂ）。
（３）ＥＧ７はニワトリ卵白アルブミンを発現するＥＬ４リンパ腫細胞であり、このため、ＣＴＬ細胞は認識してその殺傷機能を実行できる。活性化されたＯＴ－１マウス脾臓細胞とＥＧ７細胞が１：１の割合で混合されると、ＣＴＬ細胞はＩＬ－２、ＩＦＮγ、パーフォリン（Ｐｅｒｆｏｒｉｎ）、グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ）などのエフェクター分子の分泌を開始する。タンパク質輸送阻害剤ＧｏｌｇｉＰｌｕｇTM（ＰＴＩ）を加え、ＦＡＣＳで検出した。その結果、ＰＤ－Ｌ１を表面に過剰発現したＥＧ７細胞（ＥＧ７－ＰＤ－Ｌ１細胞安定株）は、ＣＴＬによるＩＬ－２、ＩＦＮγ、パーフォリン、グランザイムＢの分泌を強く阻害することを見出した。一方、ＭＴＣで処理した後、ＣＴＬ細胞によるＩＬ－２、ＩＦＮγ、パーフォリン、グランザイムＢの分泌量は急激に上昇した（図３）。このことは、ＭＴＣがＰＤ－１の阻害を改善し、ＣＴＬ細胞によるＩＬ－２、ＩＦＮγ、パーフォリン、グランザイムＢの分泌を促進することを示した。
【0076】
実施例３ ＭＴＣによるＯＴ－１Ｔ細胞の標的細胞への殺傷の回復
一、実験方法：
（１）ＣＴＬ細胞の調製は、実施例２を参照されたい。
（２）ＥＧ－７－ＰＤ－Ｌ１細胞を５ｎＭ ＣＦＳＥで標識し、ＣＴＬ細胞とＥＧ－７－ＰＤ－Ｌ１を５：１の割合で混合した後、それぞれ１μＭ、５μＭ、１０μＭ ＭＴＣで４時間処理し、その後、１０μｇ／ｍＬのＰＩで染色し、標的細胞ＥＧ－７－ＰＤ－Ｌ１のアポトーシスをフロー検出し、標的細胞に対するＣＴＬ細胞の殺傷能力を判定した。
（３）黒色腫細胞Ｂ１６－ＯＶＡ（ＯＶＡ遺伝子を発現するＢ１６細胞）を１０μｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γで２４時間処理した後、１：５の割合でＣＴＬ細胞と４時間混合培養し、同時にＭＴＣ（１μＭ）で処理し、ＩＦＮ－γで処理されておらずＤＭＳＯとＭＴＣのみで処理されたＢ１６－ＯＶＡ細胞を対照とした。Ｂ１６－ＯＶＡのアポトーシスを顕微鏡で観察し、標的細胞に対するＣＴＬ細胞の殺傷能力を判定した。
（４）黒色腫細胞Ｂ１６－ＯＶＡ（ＯＶＡ遺伝子を発現するＢ１６細胞）のうち、Ｂ１６－ＯＶＡ群は何も処理せず、Ｗａｔｅｒ群は培地を水に交換し、残りの各群は１０μｇ／ｍＬのＩＦＮγで処理し、２４時間後、Ｂ１６－ＯＶＡ群以外の各群はすべて１：５の割合でＣＴＬ細胞と４時間混合培養し、同時にＭＴＣ（１μＭ）、ＬＭＴ（１μＭ）又はａｎｔｉ－ＰＤ１（ＰＤ－１抗体、１０μｇ／ｍＬ、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、ＢＭＳ）で処理し、各群Ｂ１６－ＯＶＡの死亡状況を顕微鏡で観察し、標的細胞に対するＣＴＬ細胞の殺傷能力を判定した。また、遺伝子工学的に改変されていない黒色腫Ｂ１６－ＷＴも提供されており、Ｂ１６－ＷＴ群は何の処理もしておらず、ＩＦＮ－γ＋ＭＴＣ群とＩＦＮ－γ＋ＬＭＴ群は１０μｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γで処理し、２４時間後、１：５の割合でＣＴＬ細胞と４時間混合培養し、同時にＭＴＣ（１μＭ）又はＬＭＴ（１μＭ）で処理し、一方、ＭＴＣ群とＬＭＴ群では、ＭＴＣ（１０μＭ）とＬＭＴ（１０μＭ）のみで処理し、標的細胞に対する殺傷能力を観察した。
二、実験結果及び分析：
（１）活性化されたＯＴ－１細胞（ＣＴＬ細胞）は、表面にＰＤ－１を発現しているため、ＥＧ－７－ＰＤ－Ｌ１細胞（ＯＶＡ遺伝子改変マウスＴリンパ腫細胞ＥＧ７ではマウスのＰＤ－Ｌ１が過剰発現している）を殺傷する能力が限られている（図４Ａ）。ただし、http://www.baidu.com/link?url=q8B5c9TWi24eDUzIOTaHGZo86bBcgZgQEWp9h5ckN5cI2O26R80MznVQoIn32SYgDGj2JlcpvycbwLBW_WfMSYN8JaDCEXHQHusvftAJq5_このシステムでは、ＭＴＣはＥＧ－７－ＰＤ－Ｌ１に対するＣＴＬ細胞の殺傷能力を著しく回復できた（図４Ａ）。
（２）図４Ｅに示すように、ＭＴＣ及びＬＭＴはＢ１６－ＷＴ細胞に対して殺傷作用がなく、また、ＯＴ－１細胞がＢ１６－ＷＴ細胞を認識できないため、ＭＴＣ／ＬＭＴとＣＴＬ細胞との併用はＢ１６－ＷＴに対して殺傷作用がない。一方、Ｂ１６－ＯＶＡ細胞はＭＨＣ－Ｉ分子を低発現しており、そのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドセグメントが通常提示されていないため、ＯＴ－１細胞はＢ１６－ＯＶＡ細胞を認識して殺傷することができない（図４Ｃ及び図４Ｄ）。ＣＴＬ細胞は、Ｂ１６－ＯＶＡ細胞をＩＦＮγで処理した後、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドセグメントを提示すると、殺傷作用を有する（図４Ｃ及び図４Ｄ）。しかし、ＩＦＮγ処理後、Ｂ１６－ＯＶＡのＰＤ－Ｌ１発現が誘導された（図４Ｂ）。Ｂ１６－ＯＶＡに対するＣＴＬのこのような殺傷作用がＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用により低減されるため、ＣＴＬ単独では殺傷作用は顕著ではない。またＭＴＣ又はＬＭＴを加えることにより、上記条件におけるＢ１６－ＯＶＡ細胞に対するＣＴＬ細胞の殺傷量を顕著に向上させ（図４Ｃ及び図４Ｄ）、さらに、図４Ｄに示すように、ＭＴＣとＣＴＬ細胞との併用の場合、殺傷作用は、ＬＭＴとＣＴＬとの併用の場合と同等であり、それらの殺傷作用はａｎｔｉ－ＰＤ－１群よりも有意に強かった。したがって、ＭＴＣ又はＬＭＴとＣＴＬ細胞との併用により、Ｂ１６－ＯＶＡに対する殺傷作用を相乗的に増強することができる。
一、実験方法：
（１）ＣＴＬ細胞の調製は、実施例２を参照されたい。
（２）ＥＧ－７－ＰＤ－Ｌ１細胞を５ｎＭ ＣＦＳＥで標識し、ＣＴＬ細胞とＥＧ－７－ＰＤ－Ｌ１を５：１の割合で混合した後、それぞれ１μＭ、５μＭ、１０μＭ ＭＴＣで４時間処理し、その後、１０μｇ／ｍＬのＰＩで染色し、標的細胞ＥＧ－７－ＰＤ－Ｌ１のアポトーシスをフロー検出し、標的細胞に対するＣＴＬ細胞の殺傷能力を判定した。
（３）黒色腫細胞Ｂ１６－ＯＶＡ（ＯＶＡ遺伝子を発現するＢ１６細胞）を１０μｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γで２４時間処理した後、１：５の割合でＣＴＬ細胞と４時間混合培養し、同時にＭＴＣ（１μＭ）で処理し、ＩＦＮ－γで処理されておらずＤＭＳＯとＭＴＣのみで処理されたＢ１６－ＯＶＡ細胞を対照とした。Ｂ１６－ＯＶＡのアポトーシスを顕微鏡で観察し、標的細胞に対するＣＴＬ細胞の殺傷能力を判定した。
（４）黒色腫細胞Ｂ１６－ＯＶＡ（ＯＶＡ遺伝子を発現するＢ１６細胞）のうち、Ｂ１６－ＯＶＡ群は何も処理せず、Ｗａｔｅｒ群は培地を水に交換し、残りの各群は１０μｇ／ｍＬのＩＦＮγで処理し、２４時間後、Ｂ１６－ＯＶＡ群以外の各群はすべて１：５の割合でＣＴＬ細胞と４時間混合培養し、同時にＭＴＣ（１μＭ）、ＬＭＴ（１μＭ）又はａｎｔｉ－ＰＤ１（ＰＤ－１抗体、１０μｇ／ｍＬ、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、ＢＭＳ）で処理し、各群Ｂ１６－ＯＶＡの死亡状況を顕微鏡で観察し、標的細胞に対するＣＴＬ細胞の殺傷能力を判定した。また、遺伝子工学的に改変されていない黒色腫Ｂ１６－ＷＴも提供されており、Ｂ１６－ＷＴ群は何の処理もしておらず、ＩＦＮ－γ＋ＭＴＣ群とＩＦＮ－γ＋ＬＭＴ群は１０μｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γで処理し、２４時間後、１：５の割合でＣＴＬ細胞と４時間混合培養し、同時にＭＴＣ（１μＭ）又はＬＭＴ（１μＭ）で処理し、一方、ＭＴＣ群とＬＭＴ群では、ＭＴＣ（１０μＭ）とＬＭＴ（１０μＭ）のみで処理し、標的細胞に対する殺傷能力を観察した。
二、実験結果及び分析：
（１）活性化されたＯＴ－１細胞（ＣＴＬ細胞）は、表面にＰＤ－１を発現しているため、ＥＧ－７－ＰＤ－Ｌ１細胞（ＯＶＡ遺伝子改変マウスＴリンパ腫細胞ＥＧ７ではマウスのＰＤ－Ｌ１が過剰発現している）を殺傷する能力が限られている（図４Ａ）。ただし、http://www.baidu.com/link?url=q8B5c9TWi24eDUzIOTaHGZo86bBcgZgQEWp9h5ckN5cI2O26R80MznVQoIn32SYgDGj2JlcpvycbwLBW_WfMSYN8JaDCEXHQHusvftAJq5_このシステムでは、ＭＴＣはＥＧ－７－ＰＤ－Ｌ１に対するＣＴＬ細胞の殺傷能力を著しく回復できた（図４Ａ）。
（２）図４Ｅに示すように、ＭＴＣ及びＬＭＴはＢ１６－ＷＴ細胞に対して殺傷作用がなく、また、ＯＴ－１細胞がＢ１６－ＷＴ細胞を認識できないため、ＭＴＣ／ＬＭＴとＣＴＬ細胞との併用はＢ１６－ＷＴに対して殺傷作用がない。一方、Ｂ１６－ＯＶＡ細胞はＭＨＣ－Ｉ分子を低発現しており、そのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドセグメントが通常提示されていないため、ＯＴ－１細胞はＢ１６－ＯＶＡ細胞を認識して殺傷することができない（図４Ｃ及び図４Ｄ）。ＣＴＬ細胞は、Ｂ１６－ＯＶＡ細胞をＩＦＮγで処理した後、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドセグメントを提示すると、殺傷作用を有する（図４Ｃ及び図４Ｄ）。しかし、ＩＦＮγ処理後、Ｂ１６－ＯＶＡのＰＤ－Ｌ１発現が誘導された（図４Ｂ）。Ｂ１６－ＯＶＡに対するＣＴＬのこのような殺傷作用がＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用により低減されるため、ＣＴＬ単独では殺傷作用は顕著ではない。またＭＴＣ又はＬＭＴを加えることにより、上記条件におけるＢ１６－ＯＶＡ細胞に対するＣＴＬ細胞の殺傷量を顕著に向上させ（図４Ｃ及び図４Ｄ）、さらに、図４Ｄに示すように、ＭＴＣとＣＴＬ細胞との併用の場合、殺傷作用は、ＬＭＴとＣＴＬとの併用の場合と同等であり、それらの殺傷作用はａｎｔｉ－ＰＤ－１群よりも有意に強かった。したがって、ＭＴＣ又はＬＭＴとＣＴＬ細胞との併用により、Ｂ１６－ＯＶＡに対する殺傷作用を相乗的に増強することができる。
【0077】
実施例４ 細胞毒性Ｔ細胞が標的細胞によって形成された腫瘍を除去することに対するＭＴＣによる補助
上記の実施例１～３の実験結果から、ＭＴＣは、ＰＤ－Ｌ１を過剰発現した標的細胞を殺傷する細胞毒性Ｔ細胞を強く回復させることが確認された。本実施例は、ＭＴＣの体内における腫瘍治療能力をさらに調べた。
一、実験方法：
（１）ニワトリの卵白アルブミンＯＶＡとマウスのＰＤ－Ｌ１を過剰発現したリンパ腫細胞であるＥＬ４－ＯＶＡ－ｍＰＤＬ１細胞をＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリゲルに再懸濁させた（マウス１匹あたり一側に２×１０６細胞を１００μｌ ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリゲルに再懸濁させる）。
（２）上記細胞とマトリゲルとの混合物をＲａｇ１－／－マウスの左右側の腰背部の皮下に各１００μｌで接種した。
（３）５日程度接種して腫瘍を固定した後、尾静脈を介して活性化したＯＴ－１Ｔ細胞（すなわち２×１０６ＣＴＬ細胞／匹）を注射し、マウスをＣＴＬ細胞単独群、ＣＴＬ細胞＋１０ｍｇ／ｋｇ／２ｄａｙｓ ＰＤ－１抗体群、ＣＴＬ細胞＋４０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ ＭＴＣ群の３群に分けた。
（４）ＣＴＬ細胞を尾静脈注射した日から各群のマウスの移植腫瘍の長さと幅を１日おきに測定し、長さ×幅２／２で腫瘍の体積の大きさを計算した（図５Ａ）。
二、実験結果及び分析：
（１）ＰＤ－１抗体を同時に腹腔注射した群のマウスは、ＣＴＬ細胞のみを尾静脈注射した対照群と比較して、腫瘍の成長が阻害され、腫瘍の体積及び重量の増加がすべて阻害された。このことから、ＰＤ－１抗体群では腫瘍成長が阻害されていることが分かった。
（２）移植腫瘍を有するマウスにＭＴＣを胃内投与することによっても、腫瘍の成長を強く阻害することができた（図５Ｂ、Ｃ、Ｄ）。治療終了後、ＣＴＬ細胞のみを注入した群は腫瘍重量、腫瘍体積ともにこの群のマウスの腫瘍成長が速いことを示しており、このことから、ＣＴＬ単独投与では腫瘍成長を効果的に阻害できないことが分かった。一方、ＣＴＬ＋ＰＤ－１抗体治療群とＣＴＬ＋ＭＴＣ治療群はいずれも腫瘍の成長を有意に阻害でき、ＣＴＬ＋ＭＴＣ治療群の治療効果はＣＴＬ＋ＰＤ－１抗体治療群より優れていた。
本実施例と同様の方法でＥＧ７－ｍＰＤＬ１細胞を用いたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいても同様の結果が得られ（図５Ｅ）、ＣＴＬを投与しない（ＣＴＬ ｆｒｅｅ）マウスでは腫瘍の成長が速く、一方、ＣＴＬのみを投与するとＣＴＬ ｆｒｅｅと比較して腫瘍の成長を阻害できたが、その阻害作用はＣＴＬ＋ＰＤ－１抗体投与群やＣＴＬ＋ＭＴＣ併用群よりも弱かった。このことから、ＭＴＣは細胞毒性Ｔ細胞が標的細胞によって形成された皮下腫瘍を除去することを効果的に補助できることを示した。
上記の実施例１～３の実験結果から、ＭＴＣは、ＰＤ－Ｌ１を過剰発現した標的細胞を殺傷する細胞毒性Ｔ細胞を強く回復させることが確認された。本実施例は、ＭＴＣの体内における腫瘍治療能力をさらに調べた。
一、実験方法：
（１）ニワトリの卵白アルブミンＯＶＡとマウスのＰＤ－Ｌ１を過剰発現したリンパ腫細胞であるＥＬ４－ＯＶＡ－ｍＰＤＬ１細胞をＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリゲルに再懸濁させた（マウス１匹あたり一側に２×１０６細胞を１００μｌ ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリゲルに再懸濁させる）。
（２）上記細胞とマトリゲルとの混合物をＲａｇ１－／－マウスの左右側の腰背部の皮下に各１００μｌで接種した。
（３）５日程度接種して腫瘍を固定した後、尾静脈を介して活性化したＯＴ－１Ｔ細胞（すなわち２×１０６ＣＴＬ細胞／匹）を注射し、マウスをＣＴＬ細胞単独群、ＣＴＬ細胞＋１０ｍｇ／ｋｇ／２ｄａｙｓ ＰＤ－１抗体群、ＣＴＬ細胞＋４０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ ＭＴＣ群の３群に分けた。
（４）ＣＴＬ細胞を尾静脈注射した日から各群のマウスの移植腫瘍の長さと幅を１日おきに測定し、長さ×幅２／２で腫瘍の体積の大きさを計算した（図５Ａ）。
二、実験結果及び分析：
（１）ＰＤ－１抗体を同時に腹腔注射した群のマウスは、ＣＴＬ細胞のみを尾静脈注射した対照群と比較して、腫瘍の成長が阻害され、腫瘍の体積及び重量の増加がすべて阻害された。このことから、ＰＤ－１抗体群では腫瘍成長が阻害されていることが分かった。
（２）移植腫瘍を有するマウスにＭＴＣを胃内投与することによっても、腫瘍の成長を強く阻害することができた（図５Ｂ、Ｃ、Ｄ）。治療終了後、ＣＴＬ細胞のみを注入した群は腫瘍重量、腫瘍体積ともにこの群のマウスの腫瘍成長が速いことを示しており、このことから、ＣＴＬ単独投与では腫瘍成長を効果的に阻害できないことが分かった。一方、ＣＴＬ＋ＰＤ－１抗体治療群とＣＴＬ＋ＭＴＣ治療群はいずれも腫瘍の成長を有意に阻害でき、ＣＴＬ＋ＭＴＣ治療群の治療効果はＣＴＬ＋ＰＤ－１抗体治療群より優れていた。
本実施例と同様の方法でＥＧ７－ｍＰＤＬ１細胞を用いたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいても同様の結果が得られ（図５Ｅ）、ＣＴＬを投与しない（ＣＴＬ ｆｒｅｅ）マウスでは腫瘍の成長が速く、一方、ＣＴＬのみを投与するとＣＴＬ ｆｒｅｅと比較して腫瘍の成長を阻害できたが、その阻害作用はＣＴＬ＋ＰＤ－１抗体投与群やＣＴＬ＋ＭＴＣ併用群よりも弱かった。このことから、ＭＴＣは細胞毒性Ｔ細胞が標的細胞によって形成された皮下腫瘍を除去することを効果的に補助できることを示した。
【0078】
実施例５ ＭＴＣによる原位置腫瘍の効果的な治療
移植腫瘍の利点はＴ細胞が認識する抗原エピトープが非常に明確であり、しかも系が単一であり、問題を明らかにすることである。欠点は、このモデルが原発癌の複雑な癌化、腫瘍形成の過程及び腫瘍と間質細胞の相互作用をシミュレーションできないことである。したがって、マウスの移植腫瘍モデルは、ヒト患者における薬物の効果に対する予測性が低い。したがって、本実施例では、トランスジェニック肺癌マウスモデルを用いて、本発明のＭＴＣによる腫瘍治療作用をさらに調べた。ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒトランスジェニックマウスにテトラサイクリン（ＤＯＸ）含有食物を与えることにより、マウス肺上皮細胞にヒトＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ変異体（ヒト肺癌によく見られる変異体）の発現を誘導することができ、１～２ヶ月後にはコンピュータ断層撮影（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、ＣＴ）によりマウス肺癌を検出し記録することができた。
一、実験方法：
（１）ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ変異マウスにＤＯＸ食物を与えて原位置腫瘍モデルを約４０日間誘導した。
（２）コンピュータ断層撮影（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、ＣＴ）により腫瘍の大きさと重症度を記録した。
（３）担癌マウスをランダムに群分けし、それぞれプラセボ（ＨＫＩ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ＭＴＣ（４０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ ｉｎ ＨＫＩ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を投与した。２週間治療後、ＣＴで腫瘍の大きさを再記録した。
（４）ＭＴＣが腫瘍を除去する過程でＣＤ８＋Ｔ細胞により目的を達成することを実証する場合、本実施例では、以下の実験も行った。まずＣＤ８抗体の腹腔内注射（２００ｍｇ／匹／３日）で１週間処理しておき、担癌マウス中のＣＤ８＋細胞を除去し、次に、ＭＴＣとＣＤ８抗体の両方で２週間治療し、ＣＴにより腫瘍の大きさを再記録した。
二、実験結果及び分析：
本実験の原理は、これらのマウスにＤＯＸ含有食物を与えると、肺上皮細胞中のｒｔＴＡがＤＯＸに結合してコンフォメーションが変化し、ＴｅｔＯという配列に結合し、ＴｅｔＯが制御するＥＧＦＲ変異体の発現が開始されるということである。これらのマウスはテトラサイクリンを与えてから４０日後に原位置肺腺癌を形成した。これらの肺腺癌は、肺上皮細胞がＥＧＦＲ変異体の作用により癌化し、癌が進行し、最後に生物が癌で死亡する臨床過程全体をリアルにシミュレーションした。本実施例の実験結果から、プラセボ治療群の腫瘍は急速に成長し、一方、ＭＴＣで１４日治療後のマウスの腫瘍については、画像学的には、腫瘍がほぼ除去されていることが示され（図６Ｂ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞が除去されたマウスでは、腫瘍は、ＭＴＣ治療後も成長が阻害されなかった（図６Ｂ）。このことから、ＭＴＣは体内のＣＴＬを活性化することによりＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ変異による原位置腫瘍を効果的に治療できることが分かった。
移植腫瘍の利点はＴ細胞が認識する抗原エピトープが非常に明確であり、しかも系が単一であり、問題を明らかにすることである。欠点は、このモデルが原発癌の複雑な癌化、腫瘍形成の過程及び腫瘍と間質細胞の相互作用をシミュレーションできないことである。したがって、マウスの移植腫瘍モデルは、ヒト患者における薬物の効果に対する予測性が低い。したがって、本実施例では、トランスジェニック肺癌マウスモデルを用いて、本発明のＭＴＣによる腫瘍治療作用をさらに調べた。ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒトランスジェニックマウスにテトラサイクリン（ＤＯＸ）含有食物を与えることにより、マウス肺上皮細胞にヒトＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ変異体（ヒト肺癌によく見られる変異体）の発現を誘導することができ、１～２ヶ月後にはコンピュータ断層撮影（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、ＣＴ）によりマウス肺癌を検出し記録することができた。
一、実験方法：
（１）ＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ変異マウスにＤＯＸ食物を与えて原位置腫瘍モデルを約４０日間誘導した。
（２）コンピュータ断層撮影（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、ＣＴ）により腫瘍の大きさと重症度を記録した。
（３）担癌マウスをランダムに群分けし、それぞれプラセボ（ＨＫＩ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ＭＴＣ（４０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ ｉｎ ＨＫＩ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を投与した。２週間治療後、ＣＴで腫瘍の大きさを再記録した。
（４）ＭＴＣが腫瘍を除去する過程でＣＤ８＋Ｔ細胞により目的を達成することを実証する場合、本実施例では、以下の実験も行った。まずＣＤ８抗体の腹腔内注射（２００ｍｇ／匹／３日）で１週間処理しておき、担癌マウス中のＣＤ８＋細胞を除去し、次に、ＭＴＣとＣＤ８抗体の両方で２週間治療し、ＣＴにより腫瘍の大きさを再記録した。
二、実験結果及び分析：
本実験の原理は、これらのマウスにＤＯＸ含有食物を与えると、肺上皮細胞中のｒｔＴＡがＤＯＸに結合してコンフォメーションが変化し、ＴｅｔＯという配列に結合し、ＴｅｔＯが制御するＥＧＦＲ変異体の発現が開始されるということである。これらのマウスはテトラサイクリンを与えてから４０日後に原位置肺腺癌を形成した。これらの肺腺癌は、肺上皮細胞がＥＧＦＲ変異体の作用により癌化し、癌が進行し、最後に生物が癌で死亡する臨床過程全体をリアルにシミュレーションした。本実施例の実験結果から、プラセボ治療群の腫瘍は急速に成長し、一方、ＭＴＣで１４日治療後のマウスの腫瘍については、画像学的には、腫瘍がほぼ除去されていることが示され（図６Ｂ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞が除去されたマウスでは、腫瘍は、ＭＴＣ治療後も成長が阻害されなかった（図６Ｂ）。このことから、ＭＴＣは体内のＣＴＬを活性化することによりＥＧＦＲ－Ｌ８５８Ｒ変異による原位置腫瘍を効果的に治療できることが分かった。
【0079】
実施例６ ＰＤ－１によるＳＨＰ２リクルートへのＭＴＣによる遮断
本実施例では、ＭＴＣがＰＤ－１伝達シグナルを阻害するメカニズムを予備的に調査し、ＭＴＣがＰＤ－１によるＳＨＰ２リクルートに影響を与える能力を調べた。ＰＤ－１はリガンドに結合することにより、ＳＨＰ２タンパク質をＴ細胞受容体の周囲にリクルートし、これにより、Ｔ細胞受容体の近位キナーゼの活性化を阻害し、Ｌｃｋ媒介ＺＡＰ－７０タンパク質のリン酸化及び下流シグナル経路の開始を低下させることができる。ルシフェラーゼはＮ末端とＣ末端の２つのフラグメントに分割することができ、これら２つのフラグメントがそれぞれ他のタンパク質と融合した後、Ｎ末端とＣ末端のルシフェラーゼフラグメントがこれらの融合タンパク質の相互作用のために接近すれば、ルシフェラーゼの活性が検出され得るので、ルシフェラーゼの活性を検出することにより、融合したタンパク質の相互作用の強さを間接的に反映できる。
一、実験方法：
（１）まず、２９３Ｔ細胞にＰＤ－１－ＣｌｕｃとＮｌｕｃ－ＳＨＰ２の２つの融合遺伝子をリポフェクションし、安定的にトランスフェクトされた細胞株を構築し、この細胞に異なる濃度のＭＴＣを加えて６時間培養し、ＭＴＣがルシフェラーゼの読み取り値に与える影響を観察した。
（２）２９３Ｔ細胞にＰＤ－１－ＧＦＰとＳＨＰ２－ｍＣｈｅｒｒｙの２つの融合遺伝子をリポフェクションし、安定的にトランスフェクトされた細胞株を構築し、この細胞に異なる濃度のＭＴＣを加えて６時間培養した後、１μＭ ＰＶＤ（脱リン酸化酵素阻害剤）を加えて５分間処理し、４％パラホルムアルデヒドで固定した後、ＣｏｎｆｏｃａｌによりＭＴＣがＧＦＰとｍＣｈｅｒｒｙすなわちＰＤ－１とＳＨＰ２の局在に及ぼす影響を観察した。
（３）２９３Ｔ細胞にＰＤ－１－ＦｌａｇプラスミドとＳＨＰ２プラスミドを共トランスフェクションした後、異なる濃度のＭＴＣを加えて処理し、ＰＤ－１によるＳＨＰ２リクルート能力をＣｏ－ＩＰで検出した。
二、実験結果及び分析：
（１）２９３ＴにＰＤ－１－ＣｌｕｃとＮｌｕｃ－ＳＨＰ２を安定的にトランスフェクションした安定化株に異なる濃度のＭＴＣを加えたところ、ＭＴＣはルシフェラーゼの読み取り値を減少させることが分かった。ＭＴＣはＰＤ－１によるＳＨＰ２リクルートを阻止できることを示した（図７Ａ）。
（２）以上の結論をさらに実証するために、２９３ＴにＰＤ－１－ＧＦＰとＳＨＰ２－ｍＣｈｅｒｒｙを安定的にトランスフェクションした細胞を用いて検証した。Ｃｏｎｆｏｃａｌの結果から、ホスファターゼの阻害剤であるＰＶＤで処理した場合、ＧＦＰとｍＣｈｅｒｒｙは良好な共局在を示し、リン酸化されたＰＤ－１がＳＨＰ２をリクルートしたことを示している（図７Ｂ）。
（３）上記（２）のシステムでは、ＭＴＣを加えるとｍＣｈｅｒｒｙが膜から解離し、細胞質分布を示す（図６Ｂ）。
（４）Ｃｏ－ＩＰの結果から、ＭＴＣはＰＤ－１とＳＨＰ２の結合を阻止し、意外にもＰＤ－１の下流シグナル伝達を遮断し、これにより、免疫細胞の機能を向上させ、養子細胞療法や他の腫瘍免疫療法と組み合わせた場合の腫瘍細胞への殺傷効果を向上させることを示した（図７Ｃ）。
本実施例では、ＭＴＣがＰＤ－１伝達シグナルを阻害するメカニズムを予備的に調査し、ＭＴＣがＰＤ－１によるＳＨＰ２リクルートに影響を与える能力を調べた。ＰＤ－１はリガンドに結合することにより、ＳＨＰ２タンパク質をＴ細胞受容体の周囲にリクルートし、これにより、Ｔ細胞受容体の近位キナーゼの活性化を阻害し、Ｌｃｋ媒介ＺＡＰ－７０タンパク質のリン酸化及び下流シグナル経路の開始を低下させることができる。ルシフェラーゼはＮ末端とＣ末端の２つのフラグメントに分割することができ、これら２つのフラグメントがそれぞれ他のタンパク質と融合した後、Ｎ末端とＣ末端のルシフェラーゼフラグメントがこれらの融合タンパク質の相互作用のために接近すれば、ルシフェラーゼの活性が検出され得るので、ルシフェラーゼの活性を検出することにより、融合したタンパク質の相互作用の強さを間接的に反映できる。
一、実験方法：
（１）まず、２９３Ｔ細胞にＰＤ－１－ＣｌｕｃとＮｌｕｃ－ＳＨＰ２の２つの融合遺伝子をリポフェクションし、安定的にトランスフェクトされた細胞株を構築し、この細胞に異なる濃度のＭＴＣを加えて６時間培養し、ＭＴＣがルシフェラーゼの読み取り値に与える影響を観察した。
（２）２９３Ｔ細胞にＰＤ－１－ＧＦＰとＳＨＰ２－ｍＣｈｅｒｒｙの２つの融合遺伝子をリポフェクションし、安定的にトランスフェクトされた細胞株を構築し、この細胞に異なる濃度のＭＴＣを加えて６時間培養した後、１μＭ ＰＶＤ（脱リン酸化酵素阻害剤）を加えて５分間処理し、４％パラホルムアルデヒドで固定した後、ＣｏｎｆｏｃａｌによりＭＴＣがＧＦＰとｍＣｈｅｒｒｙすなわちＰＤ－１とＳＨＰ２の局在に及ぼす影響を観察した。
（３）２９３Ｔ細胞にＰＤ－１－ＦｌａｇプラスミドとＳＨＰ２プラスミドを共トランスフェクションした後、異なる濃度のＭＴＣを加えて処理し、ＰＤ－１によるＳＨＰ２リクルート能力をＣｏ－ＩＰで検出した。
二、実験結果及び分析：
（１）２９３ＴにＰＤ－１－ＣｌｕｃとＮｌｕｃ－ＳＨＰ２を安定的にトランスフェクションした安定化株に異なる濃度のＭＴＣを加えたところ、ＭＴＣはルシフェラーゼの読み取り値を減少させることが分かった。ＭＴＣはＰＤ－１によるＳＨＰ２リクルートを阻止できることを示した（図７Ａ）。
（２）以上の結論をさらに実証するために、２９３ＴにＰＤ－１－ＧＦＰとＳＨＰ２－ｍＣｈｅｒｒｙを安定的にトランスフェクションした細胞を用いて検証した。Ｃｏｎｆｏｃａｌの結果から、ホスファターゼの阻害剤であるＰＶＤで処理した場合、ＧＦＰとｍＣｈｅｒｒｙは良好な共局在を示し、リン酸化されたＰＤ－１がＳＨＰ２をリクルートしたことを示している（図７Ｂ）。
（３）上記（２）のシステムでは、ＭＴＣを加えるとｍＣｈｅｒｒｙが膜から解離し、細胞質分布を示す（図６Ｂ）。
（４）Ｃｏ－ＩＰの結果から、ＭＴＣはＰＤ－１とＳＨＰ２の結合を阻止し、意外にもＰＤ－１の下流シグナル伝達を遮断し、これにより、免疫細胞の機能を向上させ、養子細胞療法や他の腫瘍免疫療法と組み合わせた場合の腫瘍細胞への殺傷効果を向上させることを示した（図７Ｃ）。
【0080】
以上に記載の実施例の各技術的特徴は任意に組み合わせてもよいが、説明の便宜上、上記の実施例における各技術的特徴のすべての可能な組み合わせについて説明していないが、これらの技術的特徴の組み合わせに矛盾がない限り、すべて本明細書に記載された範囲であると考えるべきである。
【0081】
以上に記載の実施例は、本発明のいくつかの実施形態だけを示しており、その説明は具体的かつ詳細であるが、これによって発明特許の範囲に対する限定として理解することはできない。なお、当業者にとっては、本発明の構想を逸脱することなく、いくつかの変形及び改良を行うことができ、これらはすべて本発明の保護範囲に属する。したがって、本発明特許の保護の範囲は、添付された特許請求の範囲に準ずるものとする。