特開 2024-42259 消化管障害抑制用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024042259

(43)【公開日】2024-03-28

(54)【発明の名称】消化管障害抑制用組成物

(51)【国際特許分類】

   A23L 33/135 20160101AFI20240321BHJP

   A61K 35/744 20150101ALI20240321BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20240321BHJP

【ＦＩ】

A23L33/135

A61K35/744

A61P1/00

【審査請求】未請求

【請求項の数】13

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022146850

(22)【出願日】2022-09-15

(71)【出願人】

【識別番号】505164690

【氏名又は名称】有限会社バイオ研

(71)【出願人】

【識別番号】504157024

【氏名又は名称】国立大学法人東北大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000800

【氏名又は名称】デロイトトーマツ弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】渡邉 卓巳

(72)【発明者】

【氏名】生天目 由里子

(72)【発明者】

【氏名】菅野 恵美

(72)【発明者】

【氏名】川上 和義

(72)【発明者】

【氏名】丹野 寛大

【テーマコード（参考）】

4B018

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B018MD86

4B018ME11

4B018ME14

4B018MF04

4B018MF10

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BC56

4C087MA52

4C087NA06

4C087NA14

4C087ZA66

(57)【要約】

【課題】消化管障害に対して有効な処置を施すことができる組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
消化管障害抑制用組成物であって、乳酸菌の酸加熱処理物を含有する、該組成物である。この消化管障害抑制用組成物においては、前記乳酸菌の酸加熱処理物は、そのＩＬ－１０産生誘導能が、酸加熱処理しない前記乳酸菌の死菌体のＩＬ－１０産生誘導能を基準にして２０％以上を保ちつつ、そのＩＬ－１２産生誘導能が、酸加熱処理しない前記乳酸菌の死菌体のＩＬ－１２産生誘導能を基準にして３０％を超えないものであることが好ましい。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

消化管障害抑制用組成物であって、乳酸菌の酸加熱処理物を含有する、該組成物。

【請求項2】

前記乳酸菌の酸加熱処理物は、そのＩＬ－１０産生誘導能が、酸加熱処理しない前記乳酸菌の死菌体のＩＬ－１０産生誘導能を基準にして２０％以上を保ちつつ、そのＩＬ－１２産生誘導能が、酸加熱処理しない前記乳酸菌の死菌体のＩＬ－１２産生誘導能を基準にして３０％を超えないものである、請求項１記載の組成物。

【請求項3】

薬剤の投与に起因する消化管障害の処置のためのものである、請求項１記載の組成物。

【請求項4】

制癌剤の投与を受けているヒト又は動物を対象とするものである、請求項１記載の組成物。

【請求項5】

前記乳酸菌は、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＫＨ４株（ＲＤ０１２１３１、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３３７５）である、請求項１記載の組成物。

【請求項6】

経口用である、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項7】

食品組成物、医薬品組成物、又は動物食餌製品組成物の形態である、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項8】

消化管障害抑制用組成物の製造方法であって、乳酸菌に酸性条件下で加熱処理を施す工程を有する、該組成物の製造方法。

【請求項9】

前記乳酸菌の酸加熱処理物として、そのＩＬ－１０産生誘導能が、酸加熱処理しない前記乳酸菌の死菌体のＩＬ－１０産生誘導能を基準にして２０％以上を保ちつつ、そのＩＬ－１２産生誘導能が、酸加熱処理しない前記乳酸菌の死菌体のＩＬ－１２産生誘導能を基準にして３０％を超えないものを得る、請求項８記載の組成物の製造方法。

【請求項10】

前記乳酸菌は、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＫＨ４株（ＲＤ０１２１３１、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３３７５）である、請求項８記載の組成物の製造方法。

【請求項11】

請求項８～１０のいずれか１項に記載の製造方法で得られた組成物を用いる、食品の製造方法。

【請求項12】

請求項８～１０のいずれか１項に記載の製造方法で得られた組成物を用いる、医薬品の製造方法。

【請求項13】

請求項８～１０のいずれか１項に記載の製造方法で得られた組成物を用いる、動物食餌製品の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、乳酸菌を利用した消化管障害抑制用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

従来、医薬品による副作用の一つとして消化管障害が知られている。特に、抗がん剤による化学療法を受ける患者の副作用の中で頻度が高いといわれている。

【0003】

このような問題に関連して、例えば、下記非特許文献１には、マウス実験において、制癌剤である５－フルオロウラシルの投与による消化管障害が、アミノ酸、糖質、脂肪、電解質、微量元素、及びビタミンを成分とする栄養製剤である「エレメンタール」（登録商標、ＥＡファーマ株式会社）の経口投与により、唾液腺や結腸粘膜の形態的障害が抑制されることが報告されている。

【0004】

一方、乳酸菌の死菌体には、マクロファージ、ヘルパーＴ細胞等の免疫担当細胞によるサイトカインの産生を誘導する能力があることが知られている。例えば、ＩＬ－１０及びＩＬ－１２などに対する産生誘導能である（特許文献１，２）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Rei Kawashima et al.,「Influence of an elemental diet on 5-fluorouracil-induced morphological changes in the mouse salivary gland and colon」Support Care Cancer (2016) 24:1609-1616.

【非特許文献2】大道卓也、江草憲太郎、増田游 他：口腔内潰瘍と活性酸素との関連－実験的潰瘍による検討－口咽科 1983 年 5: 2; p.1-7.

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特許第４６２１２１８号公報

【特許文献2】特許第６６４９９２０号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかしながら、消化管障害に対する乳酸菌による作用効果は明らかではなかった。

【0008】

本発明の目的は、乳酸菌を利用して、消化管障害に対して有効な処置を施すことができる組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上記目的を達成するため、本発明者らは、種々研究した結果、乳酸菌の酸加熱処理物に、消化管障害に対する作用効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0010】

すなわち、本発明は、消化管障害抑制用組成物であって、乳酸菌の酸加熱処理物を含有する、該組成物を提供するものである。

【0011】

本発明にかかる消化管障害抑制用組成物においては、前記乳酸菌の酸加熱処理物は、そのＩＬ－１０産生誘導能が、酸加熱処理しない前記乳酸菌の死菌体のＩＬ－１０産生誘導能を基準にして２０％以上を保ちつつ、そのＩＬ－１２産生誘導能が、酸加熱処理しない前記乳酸菌の死菌体のＩＬ－１２産生誘導能を基準にして３０％を超えないものであることが好ましい。

【0012】

また、本発明にかかる消化管障害抑制用組成物は、薬剤の投与に起因する消化管障害の処置のためのものであることができる。

【0013】

また、本発明にかかる消化管障害抑制用組成物は、制癌剤の投与を受けているヒト又は動物を対象とするものであることができる。

【0014】

また、本発明にかかる消化管障害抑制用組成物においては、前記乳酸菌は、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＫＨ４株（ＲＤ０１２１３１、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３３７５）であることが好ましい。

【0015】

また、本発明にかかる消化管障害抑制用組成物は、経口用であることができる。

【0016】

また、本発明にかかる消化管障害抑制用組成物は、食品組成物、医薬品組成物、又は動物食餌製品組成物の形態であることができる。

【0017】

本発明は、別の観点では、消化管障害抑制用組成物の製造方法であって、乳酸菌に酸性条件下で加熱処理を施す工程を有する、該組成物の製造方法を提供するものである。

【0018】

本発明にかかる消化管障害抑制用組成物の製造方法においては、前記乳酸菌の酸加熱処理物として、そのＩＬ－１０産生誘導能が、酸加熱処理しない前記乳酸菌の死菌体のＩＬ－１０産生誘導能を基準にして２０％以上を保ちつつ、そのＩＬ－１２産生誘導能が、酸加熱処理しない前記乳酸菌の死菌体のＩＬ－１２産生誘導能を基準にして３０％を超えないものを得ることが好ましい。

【0019】

また、本発明にかかる消化管障害抑制用組成物の製造方法においては、前記乳酸菌は、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＫＨ４株（ＲＤ０１２１３１、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３３７５）であることが好ましい。

【0020】

本発明は、更に別の観点では、上記の製造方法で得られた消化管障害抑制用組成物を用いる食品、医薬品、又は動物食餌製品の製造方法を提供するものである。

【発明の効果】

【0021】

本発明によれば、乳酸菌を利用して、消化管障害に対して有効な処置を施すことができる組成物を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】試験例１，２として行った動物試験においてマウスに投与した各試料の投与スケジュールを示す図表である。

【図2】試験例１として行った動物試験の結果を示す図表であり、図２Ａはマウスの体重推移を示す図表であり、図２Ｂはマウスの餌摂取量の推移を示す図表である。

【図3】試験例１として行った動物試験の結果を示す図表であり、図４Ａには、試料を投与しないマウス（（図中「Ｎａｉｖｅ」で示す。）について、小腸組織切片を調製してＨＥ染色により調べた結果を示し、図４Ｂには、マウスに５－ＦＵを腹腔内投与したうえ蒸留水（図中「Ｖｅｈｉｃｌｅ」で示す。）を経口投与し、小腸組織切片を調製してＨＥ染色により調べた結果を示し、図４Ｃには、マウスに５－ＦＵを腹腔内投与したうえ乳酸菌の死菌体（図中「ＫＨ４Ｂ」で示す。）を経口投与し、小腸組織切片を調製してＨＥ染色により調べた結果を示し、図４Ｄには、マウスに５－ＦＵを腹腔内投与したうえ乳酸菌の酸加熱処理物（図中「ＫＨ４Ｂ」で示す。）を経口投与し、小腸組織切片を調製してＨＥ染色により調べた結果を示す。

【図4】試験例１として行った動物試験の結果を示す図表であり、図４Ａには、マウスに５－ＦＵを腹腔内投与したうえ蒸留水（図中「Ｖｅｈｉｃｌｅ」で示す。）を経口投与し、小腸組織切片を調製してＨＥ染色により調べた結果を示し、図４Ｂには、マウスに５－ＦＵを腹腔内投与したうえ乳酸菌の酸加熱処理物（図中「ＫＨ４Ｂ」で示す。）を経口投与し、小腸組織切片を調製してＨＥ染色により調べた結果を示し、図４Ｃには、顕微観察により得られた視野イメージから見積もられた絨毛長さを平均した結果を示す。

【図5】試験例２として行った動物試験の結果を示す図表であり、図５Ａには、マウスに５－ＦＵを腹腔内投与したうえ蒸留水（図中「Ｖｅｈｉｃｌｅ」で示す。）、乳酸菌の死菌体（図中「ＫＨ４Ａ」で示す。）、又は乳酸菌の酸加熱処理物（図中「ＫＨ４Ｂ」で示す。）を経口投与し、腸間膜リンパ節から細胞試料を調製してその細胞試料をフローサイトメトリーに供して解析した結果を示し、図５Ｂには、制御性Ｔ細胞（Ｔｒeｇ）の割合をグラフにした結果を示す。

【図6】試験例３として行った細胞試験の結果を示す図表であり、図６Ａには、乳酸菌の死菌体（図中「ＫＨ４Ａ」で示す。）又は酸加熱処理物（図中「ＫＨ４Ｂ」で示す。）をマウスマクロファージ由来のＲＡＷ２６４．７細胞に作用させたときの培養上清中のＩＬ－１２濃度を測定した結果を示し、図６Ｂには、同様に乳酸菌の処理物をＲＡＷ２６４．７細胞に作用させたときの培養上清中のＩＬ－６産生量を測定した結果を示し、図６Ｃには、同様に乳酸菌の処理物をＲＡＷ２６４．７細胞に作用させたときの培養上清中のＩＬ－１０産生量を測定した結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本発明は、乳酸菌の酸加熱処理物を消化管障害抑制用組成物の有効成分として用いるものである。その乳酸菌としては、ヒト又は動物に適用できればよく、特に制限はない。例えば、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）等のラクトバチルス属に属する乳酸菌、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）等のエンテロコッカス属に属する乳酸菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptcoccus thermophilus）等のストレプトコッカス属に属する乳酸菌、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）等のラクトコッカス属に属する乳酸菌、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）等のロイコノストック属に属する乳酸菌、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Tetragenococcus halophilus）等のテトラジェノコッカス属に属する乳酸菌、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）等のビフィドバクテリウム属に属する乳酸菌などが挙げられる。

【0024】

上記乳酸菌の培養、維持、保管等は、当業者に周知の技術によって行うことができる。例えば、乳酸菌の培養に適した培地としては、脱脂粉乳培地が挙げられ、あるいは、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、塩類、ミネラル類等を含む液体培地が挙げられる。市販の培地として「ＭＲＳブイヨン ＭＥＲＣＫ」（商品名、Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）、「Ｄｉｆｃｏ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ」（商品名、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）などがあり、そのような市販の培地を用いてもよい。

【0025】

（酸加熱処理）
乳酸菌の酸加熱処理物は、例えば、以下のようにして調製することができる。

【0026】

ステップ１：乳酸菌を準備する。乳酸菌としては、すでに培養されたものを調達してもよく、また、適当な培地で培養し、対数増殖期、その後期、ないし定常期に集菌して、これを、集菌後のフレッシュなうちに用いてもよく、あるいは、培養して集菌後、冷凍保管しておいたものを解凍して用いてもよい。

【0027】

ステップ２：乳酸菌に、酸性条件下で、加熱処理を施す。

【0028】

上記ステップ２において、酸性条件下とするには、各ｐＨに調製した溶液、例えば、０．１Ｍクエン酸と０．２Ｍリン酸水素ナトリウムとを混合して所定のｐＨに調製して作製したクエン酸－リン酸緩衝液や、酢酸－酢酸ナトリウムとを混合して所定のｐＨに調製して作製した酢酸緩衝液を用いることができる。各種ｐＨ溶液のｐＨはｐＨ自動制御装置等（ｐＨスタット）で確認することが好ましい。ｐＨ条件としては、酸性条件下であればよいが、例えば、ｐＨ７．０～ｐＨ６．０であってよく、ｐＨ６．０～ｐＨ５．０であってよく、ｐＨ５．０～ｐＨ４．０であってよく、ｐＨ４．０～ｐＨ３．０であってよく、ｐＨ３．０～ｐＨ２．０であってよく、ｐＨ２．０～ｐＨ１．０であってもよい。また、例えば、ｐＨ７．０以下であってよく、ｐＨ６．０以下であってよく、ｐＨ５．０以下であってよく、ｐＨ４．０以下であってよく、ｐＨ３．０以下であってよく、ｐＨ２．０以下であってもよい。更に、例えば、ｐＨ７．０～ｐＨ１．０であってよく、ｐＨ６．０～ｐＨ１．０であってよく、ｐＨ５．０～ｐＨ１．０であってよく、ｐＨ４．０～ｐＨ２．０であってよく、ｐＨ３．０～ｐＨ２．０であってもよい。

【0029】

上記ステップ２において、加熱処理は、一圧タンク、レトルト食品製造機、オートクレーブやＵＨＴ、チューブラーヒーター等によって行うことができる。温度条件としては、加温条件下であればよいが、例えば、９０℃～１４０℃であってよく、９５℃～１４０℃であってよく、９５℃～１２５℃であってよく、１２０℃～１２５℃であってもよい。

【0030】

上記ステップ２において、熱処理の時間条件としては、特に限定されないが、例えば、６０分～１８０分間であってよく、３０分～１２０分間であってよく、２０分～６０分間であってよく、５分～３０分間であってもよい。

【0031】

上記ステップ２におけるｐＨ、温度、時間等の条件は、上記範囲を適宜組み合わせて設定することができる。ただし、本発明の範囲は、上記に具体的に例示した調製条件によって限定されるものではなく、適宜、他の調製条件によっても調製し得る。

【0032】

ここで、後述する実施例の結果にも示されるように、乳酸菌に酸加熱処理を施すことにより、過剰な免疫応答を抑える働きをもつＩＬ－１０の産生誘導能は保ったまま、過剰な免疫応答を引き起こす働きをもつＩＬ－１２の産生誘導能を低減させることができる。そして、消化管障害に対する作用効果が顕著に認められる。

【0033】

そこで、本発明の限定されない任意の態様においては、乳酸菌が、十分に酸加熱処理が施されたものであるかどうかを、ＩＬ－１０及びＩＬ－１２に対する産生誘導能を指標にして、評価することができる。例えば、乳酸菌の酸加熱処理物を、適当な培養細胞の培養液中に存在せしめて、その培養細胞が産生するＩＬ－１０量についてのＩＬ－１０産生誘導能が、酸加熱処理しない場合の乳酸菌の死菌体のＩＬ－１０産生誘導能を基準にして所定値以上を保ちつつ、そのＩＬ－１２産生誘導能が、酸加熱処理しない場合の乳酸菌の死菌体のＩＬ－１２産生誘導能を基準にして所定値を超えない、などを指標にして、乳酸菌に酸加熱処理が十分に施されたかどうかを評価することができる。

【0034】

ＩＬ－１０産生誘導能としては、乳酸菌の酸加熱処理物を乾燥物換算で終濃度１μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬで用いたとき、酸加熱処理しない乳酸菌の死菌体を乾燥物換算で同じ終濃度１μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬで培地に添加したときのＩＬ－１０産生誘導能を基準にして、例えば、その基準誘導能の２０％以上であることを指標にしてよく、３０％以上であることを指標にしてよく、４０％以上であることを指標にしてよく、５０％以上であることを指標にしてよく、６０％以上であることを指標にしてもよい。また、ＩＬ－１２産生誘導能としては、乳酸菌の酸加熱処理物を乾燥物換算で終濃度１μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬで用いたとき、酸加熱処理しない乳酸菌の死菌体を乾燥物換算で同じ終濃度１μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬで培地に添加したときのＩＬ－１２産生誘導能を基準にして、例えば、その基準誘導能の３０％以下であることを指標にしてよく、２０％以下であることを指標にしてよく、１０％以下であることを指標にしてよく、５％以下であることを指標にしてもよい。

【0035】

そのような評価系に用いる、細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＲＡＷ２６４．７、Ｊ７７４．１、マウス等哺乳類の脾細胞、マウス等の哺乳類の腹腔細胞等を挙げることができる。また、評価の客観性を確保するには、その評価系は、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）又はピシバニール（ＯＫ－４３２）を終濃度０．１μｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬで作用させたととき、ＩＬ－１０を培養上清中に１００ｐｇ／ｍＬ～３０００ｐｇ／ｍＬ程度を産生し、且つ、ＩＬ－１２を培養上清中に１００ｐｇ／ｍＬ～３０００ｐｇ／ｍＬ程度を産生するように調整されていることが好ましい。

【0036】

上記のようにして調製した乳酸菌の酸加熱処理物は、調製後のものを、そのまま、あるいは希釈等して用いてもよいが、安定性や保存性、あるいは取り扱い性の観点から、中和、遠心洗浄等の手段により酸加熱処理後の酸溶媒を除去したうえ、乾燥粉末化することが好ましい。乾燥粉末化方法としては、凍結乾燥、減圧噴霧乾燥、熱風を用いた噴霧乾燥等の手法が挙げられる。また、乾燥粉末化の際には、適宜、賦形剤を添加してもよい。賦形剤としては、特に限定されず、例えば、デキストリン；マルトデキストリン；キサンタンガム；ラクチトール、マルチトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール等の糖アルコール類；デキストロース、フルクトース、グルコース、ラクトース、ショ糖等の糖類；アジピン酸、クエン酸、フマル酸、グルタル酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸等の有機酸類等が挙げられる。

【0037】

上記のようにして調製した乳酸菌の酸加熱処理物は、後述する実施例の結果にも示されるように消化管障害の症状を抑える効果に優れている。特には、一般に、制癌剤の投与を受けているヒト又は動物では、その制癌剤の投与に起因して免疫力が低下し、著しい消化管障害の症状となる場合も多いが、本発明にかかる消化管障害抑制用組成物を、そのような対象に適用することで、有効に、その消化管障害の症状を抑えることができる。制癌剤としては、限定されないが、例えば、細胞障害性抗癌剤としてアルキル化薬のナイトロジェンマスタード類（シクロホスファミドなど）、代謝拮抗薬のフッ化ピリミジン系（フルオロウラシルなど）、シタラビン系（シタラビンなど）、葉酸拮抗薬（メトトレキサートなど）、ヌクレオシド系（トリフルリジン・チピラシルなど）、抗腫瘍性抗生物質のアントラサイクリン系（ドキソルビシンなど）、ブレオマイシン系（ブレオマイシンなど）、マイトマイシン系（マイトマイシンＣなど）、その他（アクチノマイシンＤなど）、植物アルカロイドのビンカアルカノイド系（ビンクリスチンなど）、タキサン系（パクリタキセルなど）、微小管伸長阻害薬（エリブリンなど）、トポイソメラーゼＩ阻害薬（イリノテカンなど）、トポイソメラーゼＩＩ阻害薬（エトポシドなど）、白金製剤（シスプラチンなど）など、分子標的薬として、シグナル伝達系阻害薬のｍＴＯＲ阻害薬（エベロリムスなど）、血管新生阻害薬・マルチキナーゼ阻害薬（ソラフェニブなど）、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ）阻害薬（アファチニブなど）、抗体薬のＥＧＦＲに対する抗体薬（セツキシマブなど）などが挙げられる。

【0038】

なお、本明細書において消化管障害とは、小腸の絨毛や粘膜層の減退、胃の痛み、上腹部通、胃もたれ、胸やけ、呑酸、胸の痛み、胸のつかえ、大腸運動の増加、悪心、嘔吐、吐き気、下痢、便秘、便通異常、腹部膨満感、腹痛などの症状を含む意味である。また、本明細書において消化管障害の処置には、消化管障害の症状のない対象にあらかじめ処置して症状を起こさないようにする予防の目的や、消化管障害の症状がある対象に処置してその症状の緩和や緩解、治療の目的の双方が含まれる。

【0039】

本発明にかかる消化管障害抑制用組成物は、食品組成物の形態で消化管障害の処置に利用されてもよい。すなわち、上記のようにして調製した乳酸菌の酸加熱処理物（以下、単に「乳酸菌酸加熱処理物」という。）を、そのまま、あるいは他の食品用の原料を組み合わせて、食品組成物の形態となしてもよい。上記乳酸菌酸加熱処理物に組み合わせる食品用の原料としては、例えば、各種糖質や乳化剤、甘味料、酸味料、果汁、フレーバー等が挙げられる。より具体的には、グルコース、シュークロース、フラクトース、蜂蜜等の糖類、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット等の糖アルコール、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン糖脂肪酸エステル、レシチン等の乳化剤が挙げられる。この他にも、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ等の各種ビタミン類やハーブエキス、穀物成分、野菜成分、乳成分等が挙げられる。

【0040】

飲食品としては、例えば、クッキー、せんべい、ゼリー、ようかん、ヨーグルト、まんじゅう等の菓子類、清涼飲料、栄養飲料、スープ等が挙げられるが、これらに限られるものではない。また、食品の他の例としては、消化管障害抑制用の健康食品、サプリメント、特定保健用食品、ないし機能性表示食品が挙げられ、例えば、錠剤、顆粒、粉末、カプセル、ドリンク、ゼリーなどの形態で提供されてもよい。

【0041】

一方、本発明にかかる消化管障害抑制用組成物は、そのような消化管障害抑制用の食品に添加されるものとして、食品用の添加用素材の形態で利用されてもよい。

【0042】

本発明にかかる消化管障害抑制用組成物は、医薬品組成物の形態で消化管障害の処置に利用されてもよい。すなわち、上記乳酸菌酸加熱処理物を、そのまま、あるいは他の医薬品用の原料と組み合わせて、医薬品組成物の形態となしてもよい。上記乳酸菌酸加熱処理物に組み合わせる他の医薬品用の原料に特に制限はなく、必要に応じて、薬学的に許容される基材や担体を添加して、公知の製剤方法によって、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、散剤、液剤、粉末剤、ゼリー状剤、飴状剤等の形態にして、これを経口摂取用として利用することができる。また、軟膏剤、クリーム剤、ジェル、ローション等の形態にして、これを口内塗布用として利用することができる。なお、医薬とは、ヒトのみでなく動物用の医薬も含む意味である。

【0043】

一方、本発明にかかる消化管障害抑制用組成物は、そのような消化管障害抑制用の医薬品に添加されるものとして、医薬品用の添加用素材の形態で利用されてもよい。

【0044】

本発明にかかる消化管障害抑制用組成物は、動物食餌製品用組成物の形態で消化管障害の処置に利用されてもよい。すなわち、上記乳酸菌酸加熱処理物を、そのまま、あるいは他の動物食餌製品用の原料と組み合わせて、動物食餌製品用組成物の形態となしてもよい。動物食餌製品としては、例えば、家畜、競走馬、鑑賞用動物等の飼料、ペットフード等が挙げられるが、これらに限られるものではない。

【0045】

一方、本発明にかかる消化管障害抑制用組成物は、そのような消化管障害抑制用の動物食餌製品に添加されるものとして、動物食餌製品用の添加用素材の形態で利用されてもよい。

【0046】

本発明にかかる消化管障害抑制用組成物において、上記乳酸菌酸加熱処理物の含有量は、各種の形態とした場合に、それが使用される量と所望する投与量との関係を勘案して適宜定めればよい。典型的に、上記乳酸菌酸加熱処理物を乾燥物換算にして、０．１質量％～１００質量％含有するものであってよく、１質量％～５０質量％含有するものであってよく、１０質量％～３０質量％含有するものであってもよい。

【0047】

また、投与量としては、その対象者の健康状態や年齢、あるいはどの程度の作用効果を必要としているかなどに応じて、適宜設定すればよい。典型的に、上記乳酸菌酸加熱処理物の乾燥物換算での経口摂取量として（カッコ内は菌数換算値：１×１０^１２～４×１０^１２ｃｅｌｌｓ／ｇ）、０．００１～１０００ｍｇ（１×１０^６～４×１０^１２ｃｅｌｌｓ）／ｋｇ体重／日であってよく、０．０１ｍｇ～１００ｍｇ（１×１０^７～４×１０^１１ｃｅｌｌｓ）／ｋｇ体重／日であってよく、後述の実施例から、より好ましくは０．２５ｍｇ～２５ｍｇ（２．５×１０^８～１×１０^１１ｃｅｌｌｓ）／ｋｇ体重／日または体表面積換算で０．０２ｍｇ～２ｍｇ（２×１０^７～８×１０^９ｃｅｌｌｓ）／ｋｇ体重／日であってもよい。

【実施例0048】

以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

【0049】

［１．乳酸菌の培養］
乳酸菌としてラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＫＨ４株（ＲＤ０１２１３１、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３３７５）を用意し、培地としてDifco Lactobacilli MRS Broth（商品名、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）を使用して、３７℃で通気攪拌することにより培養した。

【0050】

［２．乳酸菌の処理］
乳酸菌の培養液を遠心分離装置にかけて、培養上清を除き、集菌した。菌体濃度がおよそ２０ｖ／ｖ％となるようにリン酸緩衝液に懸濁し、これをテフロン（登録商標）ホモジナイザーにかけて、菌体同士が凝集するのを避け、できるだけ分散させるようにした。

【0051】

乳酸菌を処理して、下記のサンプルを調製した。
（乳酸菌サンプル）
・乳酸菌の死菌体：リン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．４）に菌体濃度がおよそ２ｖ／ｖ％となるよう懸濁し、１２１℃で１５分間、オートクレーブで加熱した。
・乳酸菌の酸加熱処理物：酢酸にてｐＨ調整した溶液（ｐＨ３．０）に菌体濃度がおよそ２ｖ／ｖ％となるよう懸濁し、１２１℃で１５分間、オートクレーブで加熱した。

【0052】

＜試験例１＞
マウスに制癌剤である５－フルオロウラシル（５－ＦＵ；５－Ｆｕｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）を投与したときに生じる消化管障害について、上記に調製した乳酸菌サンプル（「乳酸菌の酸加熱処理物」）の経口投与がどのような影響を与えるか調べた。なお、本動物試験は、東北大学の動物実験倫理委員会の承認を得て行った。

【0053】

〔１．動物〕
動物は、日本クレア（東京）より購入した成熟雄Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴマウス（７－１０週齢）を用いた。購入したマウスは東北大学大学院医学系研究科動物実験施設内の実験室にて飼育し、餌及び水を常時摂取可能とした。

【0054】

〔２．５－ＦＵの投与〕
生理食塩水を用いて溶解、希釈した５－フルオロウラシル（５－ＦＵ；５－Ｆｕｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）を、図１に示す投与スケジュールにより、マウスに５０ｍｇ／ｋｇ体重／日の投与量で腹腔内投与した（投与スケジュール：基準日（Ｄａｙ０）に対し－Ｄａｙ５、－Ｄａｙ３、及び－Ｄａｙ１に投与）。

【0055】

〔３．乳酸菌サンプルの投与〕
生理食塩水にて希釈した乳酸菌サンプルを、図１に示す投与スケジュールにより、マウスに経口ゾンデを用いて１００μＬの投与量（乳酸菌乾燥重量で０．２２ｍｇ／ｋｇ体重／日になるよう調整）で経口投与した。一方、対照マウスには、蒸留水を生理食塩水にて５００倍希釈して、乳酸菌サンプルと同スケジュールで経口投与した（投与スケジュール：基準日（Ｄａｙ０）に対し－Ｄａｙ５、－Ｄａｙ４、－Ｄａｙ３、Ｄａｙ１、及びＤａｙ２に投与）。

【0056】

〔４．体重と餌摂取量の測定〕
５－ＦＵ投与開始日からマウスの体重とケージあたりの餌摂取量を連日測定した。

【0057】

〔５．顕微観察〕
小腸組織を摘出して４％パラホルムアルデヒド・ＰＢＳにて固定し、パラフィンに包埋した。断面の厚さ３μｍの切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を施し、２０倍の対物レンズ（「Olympus UPLFLN40X」、オリンパス株式会社）を用いて写真を撮影した。

【0058】

〔６．結果〕
（１）マウス体重及び餌摂取量の推移
図２（Ａ）には、５－ＦＵ投与開始日（－Ｄａｙ５）から投与スケジュール基準日（Ｄａｙ０）にわたるマウスの体重推移を示す。また、図２（Ｂ）には、５－ＦＵ投与開始後の１日日（－Ｄａｙ４）から投与スケジュール基準日（Ｄａｙ０）にわたるマウスの餌摂取量の推移を示す。

【0059】

図２（Ａ）に示されるように、対照マウス（５－ＦＵ投与通常飼料）に比べて、乳酸菌の酸加熱処理物を経口投与したマウスでは、体重の減少割合が少なくなった。また、図２（Ｂ）に示されるように、対照マウス（５－ＦＵ投与通常飼料）に比べて、乳酸菌の酸加熱処理物を経口投与したマウスでは、５－ＦＵを３回投与後も餌摂取量が維持されていた。

【0060】

（２）小腸組織の顕微観察
図３には、試料を投与しないマウス、又は各試料を投与したマウス（Ｄａｙ３）から小腸組織切片を作成し、ＨＥ染色して顕微観察した一例の写真を示す。

【0061】

図３に示されるように、５―ＦＵ投与通常飼料マウス（Ｖｅｈｉｃｌｅ）では、５－ＦＵ非投与通常飼料マウス（Ｎａｉｖｅ）に比べ、絨毛の短縮が認められた。これに対して、乳酸菌の酸加熱処理物を経口投与したマウス（ＫＨ４Ｂ）では、腸管の長さが保たれており損傷が軽微であった。一方、乳酸菌の加熱死菌体を経口投与したマウス（ＫＨ４Ａ）では、そのような障害の抑制効果は顕著には認められなかった。

【0062】

なお、図４には、顕著な差がみられた５―ＦＵ投与通常飼料マウス（Ｖｅｈｉｃｌｅ）と乳酸菌の酸加熱処理物を経口投与したマウス（ＫＨ４Ｂ）について、より詳細に顕微観察した結果を示し（図４（Ａ）、（Ｂ））、図４（Ｃ）には、顕微観察により得られた視野イメージから見積もられた絨毛長さを平均した結果を、Ｗｅｌｃｈ’ｓｔ検定による有意差とともに示す。

【0063】

＜試験例２＞
試験例１の結果によれば、乳酸菌の酸加熱処理物の経口投与により、制癌剤である５－ＦＵを投与したときのマウスの消化管障害が抑制されることが明らかとなった。

【0064】

本試験例では、試験例１と同様にして各試料をマウスに投与した後の腸間膜リンパ節から細胞試料を調製し、その細胞試料に含まれる制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ：ＲｅｇｕｌａｔｏｒｙＴ ｃｅｌｌ）（炎症抑制に働くことが知られている）の割合について、フローサイトメトリー解析を行った。

【0065】

〔１．フローサイトメトリー〕
各試料を投与したマウス（Ｄａｙ１）から腸間膜リンパ節を摘出し、セルストレイナー上ですりつぶし、細胞組織片を除去した後に遠心して、細胞試料を調製した。この細胞試料に対して、特異抗体等による染色の処理を施してフローサイトリーに供した。具体的には、細胞表面マーカー特異抗体として、抗ＣＤ４抗体（「Pacific Blue-anti-CD4 mAb (clone GK1.5)」、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ３抗体（「FITC-anti-CD3ε mAb (clone 145-2C11)」 ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、抗Foxp3「Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Setを使用し、抗Ｆｏｘｐ３抗体（「PE-anti-Foxp3 mAb (clone FJK-16s)」、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用し、更に、Ｆｃγ受容体のブロッキング、死細胞除去のための7-Amino-ActinomycinD（7-AAD）染色を行ったうえ、染色を施した細胞はフローサイトメーター（「BD FACS CantoTM II」、BD Bioscience, NJ, USA）を用いて解析を行った。なお、アイソタイプが一致したＩｇＧを使用してコントロール染色を行った。

【0066】

〔２．結果〕
図５には、フローサイトメトリー解析の結果を示す。

【0067】

図５に示されるように、乳酸菌の酸加熱処理物（図中「ＫＨ４Ｂ」で示す。）を経口投与したマウスでは、腸間膜リンパ節中の制御性Ｔ細胞（Ｔｒeｇ）の割合が、蒸留水（図中「Ｖｅｈｉｃｌｅ」で示す。）や乳酸菌の死菌体（図中「ＫＨ４Ａ」で示す。）を経口投与したマウスと比較して有意に高くなっていることが明らかとなった。

【0068】

＜試験例３＞
試験例１の結果によれば、乳酸菌の酸加熱処理物の経口投与により、制癌剤である５－ＦＵを投与したときのマウスの消化管障害が抑制されることが明らかとなった。

【0069】

試験例２の結果によれば、乳酸菌の酸加熱処理物による作用効果は、腸間膜リンパ節中のＴ細胞のうち炎症抑制に働くことが知られている制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の割合の増加によることが示唆され、また、そのような作用効果は、単なる乳酸菌の加熱死菌体では起こらない作用効果であることが示唆された。

【0070】

本試験例では、上記に調製した乳酸菌サンプル（「乳酸菌の死菌体」と「乳酸菌の酸加熱処理物」）について、マウスマクロファージ由来のＲＡＷ２６４．７細胞に作用させたときのＩＬ－１２、ＩＬ－６、及びＩＬ－１０の産生誘導能を比較した。

【0071】

具体的には、ＲＡＷ２６４．７細胞を、１０％ＦＢＳ、２－メルカプトエタノール（５０μＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で、常法に従い浮遊培養し、これを細胞濃度１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬで９６ウェルプレートに播種して、２４時間３７℃、５％ＣＯ_２の条件で培養した。１０％ＦＢＳ、２－メルカプトエタノール（５０μＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて希釈した乳酸菌サンプルを終濃度１０μｇ／ｍＬ（菌固形分換算濃度）となるように培地に添加後、同条件で更に２４時間培養した。その後、培養上清を回収し、ＩＬ－１２及びＩＬ－１０の濃度を、ＩＬ－１２検出キット（「Mouse IL-12 p40 ELISA Kit」、ａｂｃａｍ社製）、ＩＬ－６検出キット（「Mouse IL-6 ELISA Kit」、ａｂｃａｍ社製）、又はＩＬ－１０検出キット（「Mouse IL-10 ELISA Kit」、ａｂｃａｍ社製）にて、製品プロトコールに従い、測定した。

【0072】

図６（Ａ）には、培養上清中のＩＬ－１２濃度を測定した結果を示し、図６（Ｂ）には、ＩＬ－６濃度を測定した結果を示し、図６（Ｃ）には、ＩＬ－１０濃度を測定した結果を示す。

【0073】

図６（Ａ）に示されるように、乳酸菌の死菌体を１０μｇ／ｍＬでＲＡＷ２６４．７細胞に作用させたときのＩＬ－１２産生量は、培養上清中の濃度として５６５ｐｇ／ｍＬ（平均値、標準偏差：５６５±９５）であったのに対して（図中「ＫＨ４Ａ」で示す。）、乳酸菌の酸化熱処理物を１０μｇ／ｍＬでＲＡＷ２６４．７細胞に作用させたときのＩＬ－１２産生量は、培養上清中の濃度として０．１ｐｇ／ｍＬ（平均値、標準偏差：０．１±５）であり、前者の濃度を基準にして、９９．９％と減少していた（図中「ＫＨ４Ｂ」で示す。）。

【0074】

図６（Ｂ）に示されるように、乳酸菌の死菌体を１０μｇ／ｍＬでＲＡＷ２６４．７細胞に作用させたときのＩＬ－６産生量は、培養上清中の濃度として１４４ｐｇ／ｍＬ（平均値、標準偏差：１４４±２３）であったのに対して（図中「ＫＨ４Ａ」で示す。）、乳酸菌の酸化熱処理物を１０μｇ／ｍＬでＲＡＷ２６４．７細胞に作用させたときのＩＬ－６産生量は、培養上清中の濃度として４７ｐｇ／ｍＬ（平均値、標準偏差：４７±１８）であり、前者の濃度を基準にして、６８％と減少していた（図中「ＫＨ４Ｂ」で示す。）。

【0075】

図６（Ｃ）に示されるように、乳酸菌の死菌体を１０μｇ／ｍＬでＲＡＷ２６４．７細胞に作用させたときのＩＬ－１０産生量は、培養上清中の濃度として８３７ｐｇ／ｍＬ（平均値、標準偏差：８３７±４６）であったのに対して（図中「ＫＨ４Ａ」で示す。）、乳酸菌の酸化熱処理物を１０μｇ／ｍＬでＲＡＷ２６４．７細胞に作用させたときのＩＬ－１０産生量は、培養上清中の濃度として２０３４ｐｇ／ｍＬ（平均値、標準偏差：２０３４±１３１）であり、前者の濃度を基準にして、２４３％と増加していた（図中「ＫＨ４Ｂ」で示す。）。

【0076】

以上から、乳酸菌を酸性条件下に加熱処理すると、炎症性のサイトカインであるＩＬ－１２やＩＬ－６についての産生誘導能が低下する一方、炎症抑制性のサイトカインであるＩＬ－１０についての産生誘導能が高められることが明らかとなった。

【0077】

＜試験例４＞
試験例３の結果によれば、乳酸菌を酸性条件下に加熱処理すると、マウスマクロファージ由来細胞に作用させたときのＩＬ－１０の産生誘導能については維持されつつ、ＩＬ－１２産生誘導能が低下することが明らかとなった。

【0078】

本試験例では、加熱処理条件により、ＩＬ－１２及びＩＬ－１０の産生誘導能がどのように変化するかについて調べた。具体的には、上記した乳酸菌サンプルの調製において、乳酸菌ＫＨ４株を表１に示す温度と時間の条件で加熱処理して乳酸菌の酸加熱処理物を調製し、次いで、試験例１と同様にして、調製した乳酸菌の酸加熱処理物について、マウス脾臓細胞に作用させたときのＩＬ－１２及びＩＬ－１０の培養上清濃度を測定した。

【0079】

表１には、得られた結果を、試験例１と同様にして、調製した乳酸菌の加熱死菌体を同様に作用させたときの、ＩＬ－１２及びＩＬ－１０のそれぞれの培養上清濃度を１００としたときの相対値で示す。

【0080】

【表1】

【0081】

その結果、表１に示されるように、ＩＬ－１２及びＩＬ－１０誘導能の低下は、乳酸菌に対する加熱処理時間に依存して、それらの低下量が増加することが明らかとなった。ただし、その低下の程度は、ＩＬ－１２においてより顕著であることが明らかとなった。

【0082】

＜試験例５＞
試験例３，４の結果によれば、乳酸菌を酸性条件下に加熱処理すると、マウスマクロファージ由来細胞に作用させたときのＩＬ－１０の産生誘導能については維持されつつ、ＩＬ－１２産生誘導能が低下することが明らかとなった。

【0083】

本試験例では、他の代表的な乳酸菌の菌株を用いた場合にも、同様にそのような酸加熱処理によるＩＬ－１２及びＩＬ－１０にかかる誘導能の変化が惹起されるかについて調べた。具体的には、試験例１と同様にして、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＢＫ０３株（社内で保有する典型株）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）ＢＫ０１株（社内で保有する典型株）、及びラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）ＢＫ１１株（社内で保有する典型株）について、マウス脾臓細胞に作用させたときのＩＬ－１２及びＩＬ－１０の培養上清濃度を測定した。

【0084】

表２には、得られた結果を、試験例１と同様にして、調製した乳酸菌の加熱死菌体を同様に作用させたときの、ＩＬ－１２及びＩＬ－１０のそれぞれの培養上清濃度を１００としたときの相対値で示す。

【0085】

【表2】

【0086】

酸加熱処理によってＩＬ－１２を３０％以下に低下させＩＬ－１０を２０％以上保持した菌株を表２に示した。他の乳酸菌株を用いた場合にも、酸加熱処理により、ＩＬ－１２誘導能が処理の影響を受けやすく、その一方で、ＩＬ－１０誘導能については、影響が限定的であり誘導能が維持されやすい傾向がみられた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】