知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024043129
(43)【公開日】2024-03-29
(54)【発明の名称】糖尿病性神経障害の検出方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20240322BHJP
C12Q 1/6813 20180101ALI20240322BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20240322BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20240322BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240322BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 D
C12Q1/6813 Z
C12Q1/6851 Z
C12M1/34 F
C12M1/34 Z
C12N15/11 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022148135
(22)【出願日】2022-09-16
(71)【出願人】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】細田 弥生
(72)【発明者】
【氏名】杉田 聡
(72)【発明者】
【氏名】峯岸 慶彦
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029AA23
4B029BB15
4B029BB20
4B029CC01
4B029FA12
4B029FA15
4B029GA03
4B029GA08
4B029GB06
4B029GB10
4B063QA08
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ28
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QQ62
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR42
4B063QR72
4B063QS03
4B063QS25
4B063QS34
4B063QS36
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】生体試料中のタンパク質を用いて糖尿病性神経障害を検出する方法を提供する。
【解決手段】被験者から採取された生体試料について、ＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９、ＰＸＮ、ＰＴＫ７、ＲＡＳＡ１、ＮＥＦＬ、ＩＬ１６、ＣＣＮ５、ＦＭＮＬ１、ＳＣＧＮ、ＣＸＣＬ１４、ＢＡＣＨ１、ＬＹ６Ｄ、ＣＣＬ２４、ＳＰＩＮＴ２、ＣＤＨ１５、ＣＴＳＣ、ＣＣＬ１３、ＮＯＳ１、ＳＣＡＲＡ５、ＣＣＬ１１、ＡＣＶＲＬ１、ＣＤ２７６、ＳＵＳＤ２、ＴＭＳＢ１０、ＮＴ５Ｃ３Ａ、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ及びＳＰＩＮＫ１から選択されるタンパク質の少なくとも１つの発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者における糖尿病性神経障害の検出方法。
【選択図】なし
【解決手段】被験者から採取された生体試料について、ＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９、ＰＸＮ、ＰＴＫ７、ＲＡＳＡ１、ＮＥＦＬ、ＩＬ１６、ＣＣＮ５、ＦＭＮＬ１、ＳＣＧＮ、ＣＸＣＬ１４、ＢＡＣＨ１、ＬＹ６Ｄ、ＣＣＬ２４、ＳＰＩＮＴ２、ＣＤＨ１５、ＣＴＳＣ、ＣＣＬ１３、ＮＯＳ１、ＳＣＡＲＡ５、ＣＣＬ１１、ＡＣＶＲＬ１、ＣＤ２７６、ＳＵＳＤ２、ＴＭＳＢ１０、ＮＴ５Ｃ３Ａ、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ及びＳＰＩＮＫ１から選択されるタンパク質の少なくとも１つの発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者における糖尿病性神経障害の検出方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験者から採取された生体試料について、ＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９、ＰＸＮ、ＰＴＫ７、ＲＡＳＡ１、ＮＥＦＬ、ＩＬ１６、ＣＣＮ５、ＦＭＮＬ１、ＳＣＧＮ、ＣＸＣＬ１４、ＢＡＣＨ１、ＬＹ６Ｄ、ＣＣＬ２４、ＳＰＩＮＴ２、ＣＤＨ１５、ＣＴＳＣ、ＣＣＬ１３、ＮＯＳ１、ＳＣＡＲＡ５、ＣＣＬ１１、ＡＣＶＲＬ１、ＣＤ２７６、ＳＵＳＤ２、ＴＭＳＢ１０、ＮＴ５Ｃ３Ａ、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ及びＳＰＩＮＫ１から選択されるタンパク質の少なくとも１つの発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者における糖尿病性神経障害の検出方法。
【請求項2】
タンパク質がＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９及びＰＸＮから選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項3】
生体試料が血液、血清又は血漿である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項4】
発現レベルの測定が前記タンパク質のタンパク質量の測定である、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
【請求項5】
発現レベルの測定値を前記タンパク質の参照値と比較し、糖尿病性神経障害の存在若しくは不存在を評価する、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
【請求項6】
前記タンパク質に結合する分子又は前記タンパク質をコードする遺伝子と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、請求項１～５のいずれか１項記載の方法に用いられる糖尿病性神経障害を検出するための検査用キット。
【請求項7】
ＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９、ＰＸＮ、ＰＴＫ７、ＲＡＳＡ１、ＮＥＦＬ、ＩＬ１６、ＣＣＮ５、ＦＭＮＬ１、ＳＣＧＮ、ＣＸＣＬ１４、ＢＡＣＨ１、ＬＹ６Ｄ、ＣＣＬ２４、ＳＰＩＮＴ２、ＣＤＨ１５、ＣＴＳＣ、ＣＣＬ１３、ＮＯＳ１、ＳＣＡＲＡ５、ＣＣＬ１１、ＡＣＶＲＬ１、ＣＤ２７６、ＳＵＳＤ２、ＴＭＳＢ１０、ＮＴ５Ｃ３Ａ、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ及びＳＰＩＮＫ１から選択されるタンパク質の少なくとも１つからなる、糖尿病性神経障害の検出マーカー。
【請求項8】
タンパク質がＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９及びＰＸＮから選ばれる、請求項７記載のマーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオマーカーを用いた糖尿病性神経障害の検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
糖尿病患者は現在約４億人であり、世界の健康支出の約１２％が糖尿病もしくはその合併症であるといわれている。糖尿病の怖さは合併症にあるといわれており、主な合併症の一つに糖尿病性神経障害がある。糖尿病性神経障害は、神経長依存性の四肢末端から左右対称性に進行する神経障害であり、初期は痛みやしびれを呈するが、次第に感覚低下や血流障害が起こり、最悪の場合、壊疽により四肢切断に至り、ＱＯＬを著しく低下させる。
【0003】
糖尿病性神経障害は、神経障害が進行するほど、足病変、虚血性脳血管障害、虚血性心疾患の発生頻度が増加することが知られている。また、進行例に関しては治癒が難しい一方、早期症例に関しては改善可能であることが知られている。以上のことから、糖尿病性神経障害は早期発見及び介入が重要である。
【0004】
一方、糖尿病性神経障害の診断には課題がある。すなわち、糖尿病性神経障害の確定診断には神経伝導検査が必要だが、専用の機械が必要、操作に熟練が必要、対象神経の数によっては時間がかかる、電気刺激（痛み／苦痛）を伴うといった課題がある（非特許文献１，２）。また、糖尿病性神経障害患者の半数が自覚症状を伴わないため、気づいたときには壊疽が進行し、脚を切断しなくてはならなくなるような状態が少なくない。
【0005】
以上のことから、簡便かつ確実な神経のモニタリング技術の確立・普及が求められているが、これまでに糖尿病性神経障害を検出できるバイオマーカーは見出されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】臨床神経生理学. 2018, 46: 71-77
【非特許文献2】糖尿病性神経障害の各種スコア. 2013, 糖尿病性神経障害（中山書店）; 37-48
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、バイオマーカーを用いて糖尿病性神経障害を検出する方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、糖尿病患者のうち、神経障害を発症している患者と発症していない患者から採取した血中のタンパク質の発現レベルが両者の間で有意に異なるタンパク質が存在し、これを指標として糖尿病性神経障害を検出することができることを見出した。
【0009】
すなわち、本発明は、以下の１）～３）に係るものである。
１）被験者から採取された生体試料について、ＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９、ＰＸＮ、ＰＴＫ７、ＲＡＳＡ１、ＮＥＦＬ、ＩＬ１６、ＣＣＮ５、ＦＭＮＬ１、ＳＣＧＮ、ＣＸＣＬ１４、ＢＡＣＨ１、ＬＹ６Ｄ、ＣＣＬ２４、ＳＰＩＮＴ２、ＣＤＨ１５、ＣＴＳＣ、ＣＣＬ１３、ＮＯＳ１、ＳＣＡＲＡ５、ＣＣＬ１１、ＡＣＶＲＬ１、ＣＤ２７６、ＳＵＳＤ２、ＴＭＳＢ１０、ＮＴ５Ｃ３Ａ、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ及びＳＰＩＮＫ１から選択されるタンパク質の少なくとも１つの発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者における糖尿病性神経障害の検出方法。
２）前記タンパク質に結合する分子又は前記タンパク質をコードする遺伝子と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、上記１）の方法に用いられる糖尿病性神経障害を検出するための検査用キット。
３）ＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９、ＰＸＮ、ＰＴＫ７、ＲＡＳＡ１、ＮＥＦＬ、ＩＬ１６、ＣＣＮ５、ＦＭＮＬ１、ＳＣＧＮ、ＣＸＣＬ１４、ＢＡＣＨ１、ＬＹ６Ｄ、ＣＣＬ２４、ＳＰＩＮＴ２、ＣＤＨ１５、ＣＴＳＣ、ＣＣＬ１３、ＮＯＳ１、ＳＣＡＲＡ５、ＣＣＬ１１、ＡＣＶＲＬ１、ＣＤ２７６、ＳＵＳＤ２、ＴＭＳＢ１０、ＮＴ５Ｃ３Ａ、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ及びＳＰＩＮＫ１から選択されるタンパク質の少なくとも１つからなる、糖尿病性神経障害の検出マーカー。
１）被験者から採取された生体試料について、ＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９、ＰＸＮ、ＰＴＫ７、ＲＡＳＡ１、ＮＥＦＬ、ＩＬ１６、ＣＣＮ５、ＦＭＮＬ１、ＳＣＧＮ、ＣＸＣＬ１４、ＢＡＣＨ１、ＬＹ６Ｄ、ＣＣＬ２４、ＳＰＩＮＴ２、ＣＤＨ１５、ＣＴＳＣ、ＣＣＬ１３、ＮＯＳ１、ＳＣＡＲＡ５、ＣＣＬ１１、ＡＣＶＲＬ１、ＣＤ２７６、ＳＵＳＤ２、ＴＭＳＢ１０、ＮＴ５Ｃ３Ａ、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ及びＳＰＩＮＫ１から選択されるタンパク質の少なくとも１つの発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者における糖尿病性神経障害の検出方法。
２）前記タンパク質に結合する分子又は前記タンパク質をコードする遺伝子と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、上記１）の方法に用いられる糖尿病性神経障害を検出するための検査用キット。
３）ＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９、ＰＸＮ、ＰＴＫ７、ＲＡＳＡ１、ＮＥＦＬ、ＩＬ１６、ＣＣＮ５、ＦＭＮＬ１、ＳＣＧＮ、ＣＸＣＬ１４、ＢＡＣＨ１、ＬＹ６Ｄ、ＣＣＬ２４、ＳＰＩＮＴ２、ＣＤＨ１５、ＣＴＳＣ、ＣＣＬ１３、ＮＯＳ１、ＳＣＡＲＡ５、ＣＣＬ１１、ＡＣＶＲＬ１、ＣＤ２７６、ＳＵＳＤ２、ＴＭＳＢ１０、ＮＴ５Ｃ３Ａ、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ及びＳＰＩＮＫ１から選択されるタンパク質の少なくとも１つからなる、糖尿病性神経障害の検出マーカー。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、簡便且つ非侵襲的に、糖尿病性神経障害を、高い精度、感度及び特異度で検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【発明を実施するための形態】
【0012】
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
【0013】
本発明において、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」と云う用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれ、「ＲＮＡ」には、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎｏｎ-ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。
【0014】
本発明において「遺伝子」とは、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡの他、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、当該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及びこれらの断片を包含するものであって、ＤＮＡを構成する塩基の配列情報の中に、何らかの生物学的情報が含まれているものを意味する。
また、当該「遺伝子」は特定の塩基配列で表される「遺伝子」だけではなく、これらの同族体（すなわち、ホモログもしくはオーソログ）、遺伝子多型等の変異体、及び誘導体をコードする核酸が包含される。
また、当該「遺伝子」は特定の塩基配列で表される「遺伝子」だけではなく、これらの同族体（すなわち、ホモログもしくはオーソログ）、遺伝子多型等の変異体、及び誘導体をコードする核酸が包含される。
【0015】
本発明において、「糖尿病性神経障害」とは、糖尿病発症後に出現する神経障害を指す。「糖尿病性神経障害」は、遠位性対称性の多発神経障害と局所性の単神経障害に分けられるが、本発明の糖尿病性神経障害には、その両者が含まれる。
遠位性対称性の多発神経障害は、感覚・運動神経障害と自律神経障害に分けられ、感覚・運動神経障害では、発症早期から神経伝導検査による神経伝導速度の低下が認められ、下肢末端に、自発痛・しびれ感・錯感覚・感覚鈍麻などの感覚異常や、筋力低下や筋萎縮、バランス機能の低下などの運動機能異常が出現し、症状が上行するとともに上肢末端にも症状が現れる。さらに、眼球運動や顔面の動きも障害される。自律神経障害は、瞳孔機能異常、起立性低血圧、心臓神経の障害（突然死、無痛性心筋梗塞）、発汗異常、消化管の運動障害（便秘、下痢）、膀胱の機能障害、勃起障害など多彩な病態を呈する。
局所性の単神経障害には、脳神経障害（特に外眼筋麻痺）、体幹・四肢の神経障害、糖尿病筋萎縮（腰仙部根神経叢神経障害）などが含まれる。
遠位性対称性の多発神経障害は、感覚・運動神経障害と自律神経障害に分けられ、感覚・運動神経障害では、発症早期から神経伝導検査による神経伝導速度の低下が認められ、下肢末端に、自発痛・しびれ感・錯感覚・感覚鈍麻などの感覚異常や、筋力低下や筋萎縮、バランス機能の低下などの運動機能異常が出現し、症状が上行するとともに上肢末端にも症状が現れる。さらに、眼球運動や顔面の動きも障害される。自律神経障害は、瞳孔機能異常、起立性低血圧、心臓神経の障害（突然死、無痛性心筋梗塞）、発汗異常、消化管の運動障害（便秘、下痢）、膀胱の機能障害、勃起障害など多彩な病態を呈する。
局所性の単神経障害には、脳神経障害（特に外眼筋麻痺）、体幹・四肢の神経障害、糖尿病筋萎縮（腰仙部根神経叢神経障害）などが含まれる。
【0016】
糖尿病性神経障害の診断は、１）下肢感覚異常（痛み、しびれ、感覚鈍麻)、２）両側アキレス腱反射の低下または消失、３）両側内踝の振動覚低下（C128音叉の振動知覚が10秒以内に消失）の項目中、２項目以上該当する場合、又はこの条件項目に満たない場合でも、神経伝導検査において両足共に異常値を示した場合に、神経障害ありとする基準が提唱されている（糖尿病性神経障害を考える会、糖尿病性多発神経障害の簡易診断基準（小改訂版）.末梢神経23：109-111, 2012）。
【0017】
本発明において、「糖尿病性神経障害の検出」には、糖尿病患者において、神経障害の存在（神経障害あり）又は不存在（神経障害なし）を明らかにすることを意味する。なお、本発明において、「検出」という用語は、検査、測定、判定、評価又は評価支援という用語で言い換えることもできる。なお、本明細書において「判定」又は「評価」という用語は、医師による判定や評価を含むものではない。
【0018】
後述する実施例に示すように、糖尿病を罹患した男女４３名について、上記の診断基準で糖尿病性神経障害の有無を診断し、神経障害を有する糖尿病患者（ＤＰＮ）と神経障害を有さない糖尿病患者（ＤＭ）とに分類し、各群について血漿プロテオーム解析を行い、ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐａｎｅｌ（３６８種）とｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ｐａｎｅｌ（３６７種）の計７３２種類のタンパク質を定量した(２パネル間で３分子重複したため)。その結果、ＤＰＮとＤＭの２群間で血中濃度に有意差を認める以下の２９種類のタンパク質が同定された（図１）。このうち、ＬＩＬＲＡ２のみがＤＰＮで発現が低下するタンパク質であり、その他はＤＰＮで発現が増加するタンパク質であった。
ＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９、ＰＸＮ、ＰＴＫ７、ＲＡＳＡ１、ＮＥＦＬ、ＩＬ１６、ＣＣＮ５、ＦＭＮＬ１、ＳＣＧＮ、ＣＸＣＬ１４、ＢＡＣＨ１、ＬＹ６Ｄ、ＣＣＬ２４、ＳＰＩＮＴ２、ＣＤＨ１５、ＣＴＳＣ、ＣＣＬ１３、ＮＯＳ１、ＳＣＡＲＡ５、ＣＣＬ１１、ＡＣＶＲＬ１、ＣＤ２７６、ＳＵＳＤ２、ＴＭＳＢ１０、ＮＴ５Ｃ３Ａ、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＳＰＩＮＫ１。
したがって、斯かる２９種のタンパク質（以下、「標的タンパク質」とも称す）は、糖尿病性神経障害を検出するための、糖尿病性神経障害マーカーとして有用である。
このうち、検出精度の点から、ＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９、ＰＸＮ、ＰＴＫ７、ＲＡＳＡ１、ＮＥＦＬ、ＩＬ１６、ＳＰＩＮＫ１及びＣＣＮ５から選ばれる１種以上を用いるのが好ましく、ＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９及びＰＸＮから選ばれる１種以上を用いるのがさらに好ましい。
ＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９、ＰＸＮ、ＰＴＫ７、ＲＡＳＡ１、ＮＥＦＬ、ＩＬ１６、ＣＣＮ５、ＦＭＮＬ１、ＳＣＧＮ、ＣＸＣＬ１４、ＢＡＣＨ１、ＬＹ６Ｄ、ＣＣＬ２４、ＳＰＩＮＴ２、ＣＤＨ１５、ＣＴＳＣ、ＣＣＬ１３、ＮＯＳ１、ＳＣＡＲＡ５、ＣＣＬ１１、ＡＣＶＲＬ１、ＣＤ２７６、ＳＵＳＤ２、ＴＭＳＢ１０、ＮＴ５Ｃ３Ａ、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＳＰＩＮＫ１。
したがって、斯かる２９種のタンパク質（以下、「標的タンパク質」とも称す）は、糖尿病性神経障害を検出するための、糖尿病性神経障害マーカーとして有用である。
このうち、検出精度の点から、ＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９、ＰＸＮ、ＰＴＫ７、ＲＡＳＡ１、ＮＥＦＬ、ＩＬ１６、ＳＰＩＮＫ１及びＣＣＮ５から選ばれる１種以上を用いるのが好ましく、ＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９及びＰＸＮから選ばれる１種以上を用いるのがさらに好ましい。
【0019】
ここで、「ＬＩＬＲＡ２」とは、ヒト骨髄系細胞の表面に発現するＬＩＬＲＡ２（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａ２）を指し、ＬＩＬＲＡ２遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「１１０２７」として登録されている。
「ＷＮＴ９Ａ」とは、心臓や子宮内膜をはじめとする臓器に発現する（Ｗｎｔ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ９Ａ）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「７４８３」として登録されている。
「ＫＲＴ１９」とは、上皮細胞の構造的完全性を担う中間フィラメント蛋白質の一種である（ｋｅｒａｔｉｎ １９）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「３８８０」として登録されている。
「ＰＸＮ」とは、細胞外マトリックスへの細胞接着に寄与する細胞骨格蛋白質である（ｐａｘｉｌｌｉｎ）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「５８２９」として登録されている。
「ＰＴＫ７」とは、細胞膜貫通型の蛋白質チロシンキナーゼの一つである（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ７）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「５７５４」として登録されている。
「ＲＡＳＡ１」とは、細胞質中に局在するＧＴＰａｓｅ活性化蛋白質のＧＡＰ１ファミリーの一部である（ＲＡＳ ｐ２１ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ １）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「５９２１」として登録されている。
「ＮＥＦＬ」とは、軽鎖ニューロフィラメントの（ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「
４７４７」として登録されている。
「ＩＬ１６」とは、化学誘引物質、Ｔ細胞活性化のモジュレーター、及びＨＩＶ複製の阻害剤として機能する多面的サイトカインである（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １６）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「３６０３」として登録されている。
「ＣＣＮ５」とは、ＷＮＴ１誘導性シグナル伝達経路を構成するメンバーの一つである（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋ ｆａｃｔｏｒ ５）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「８８３９」として登録されている。
「ＦＭＮＬ１」とは、形態形成、サイトカイン症や細胞極性に関与する（ｆｏｒｍｉｎ ｌｉｋｅ １）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「７５２」として登録されている。
「ＳＣＧＮ」とは、細胞質中のカルシウム結合蛋白質である（ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｉｎ， ＥＦ－ｈａｎｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「１０５９０」として登録されている。
「ＣＸＣＬ１４」とは、免疫調節や炎症に関与するサイトカインである（Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １４）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「９５４７」として登録されている。
「ＢＡＣＨ１」とは、転写因子の一つである（ＢＴＢ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ＣＮＣ ｈｏｍｏｌｏｇ １）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「５７１」として登録されている。
「ＬＹ６Ｄ」とは、リンパ球分化に関与すると推測されている細胞外領域に発現する（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ６ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ Ｄ）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「８５８１」として登録されている。
「ＣＣＬ２４」とは、免疫調節及び炎症過程に関与するサイトカインの一つである（Ｃ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ ２４）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「６３６９」として登録されている。
「ＳＰＩＮＴ２」とは、膜貫通型の蛋白質で様々なセリンプロテアーゼに対する阻害活性を有する（ｓｅｒｉｎｅ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ， Ｋｕｎｉｔｚ ｔｙｐｅ ２）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「１０６５３」として登録されている。
「ＣＤＨ１５」とは、カルシウム依存性細胞間接着糖蛋白質の一つである（ｃａｄｈｅｒｉｎ １５）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「１０１３」として登録されている。
「ＣＴＳＣ」とは、ペプチダーゼＣ１ファミリー及びリソソームシステインプロテイナーゼをコードする（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｃ）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「１０７５」として登録されている。
「ＣＣＬ１３」とは、免疫調節及び炎症過程に関与するサイトカインの一つである（Ｃ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １３）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「６３５７」として登録されている。
「ＮＯＳ１」とは、Ｌ－アルギニンから一酸化窒素を合成する酵素である（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ １）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「４８４２」として登録されている。
「ＳＣＡＲＡ５」とは、フェリチン受容体活性を有すると推測されている（ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｌａｓｓ Ａ ｍｅｍｂｅｒ ５）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「２８６１３３」として登録されている。
「ＣＣＬ１１」とは、免疫調節及び炎症過程に関与するサイトカインの一つである（Ｃ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １１）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「６３５６」として登録されている。
「ＡＣＶＲＬ１」とは、ＴＧＦβリガンドのスーパーファミリーに対する１型細胞表面受容体の一つである（ａｃｔｉｖｉｎ Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｋｅ ｔｙｐｅ １）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「９４」として登録されている。
「ＣＤ２７６」とは、Ｔ細胞媒介性免疫応答の調節に関与する（ＣＤ２７６ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「８０３８１」として登録されている。
「ＳＵＳＤ２」とは、細胞周期や細胞分裂を負に制御する（ｓｕｓｈｉ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「５６２４１」として登録されている。
「ＴＭＳＢ１０」とは、アクチンモノマーの輸送に関与すると考えられている（ｔｈｙｍｏｓｉｎ ｂｅｔａ １０）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「９１６８」として登録されている。
「ＮＴ５Ｃ３Ａ」とは、５’－ヌクレオチダーゼの一つである（５’－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ， ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ＩＩＩＡ）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「５１２５１」として登録されている。
「ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ」とは、ＦａｓＬ及びＬＩＧＨＴ媒介性細胞死の調節に関与する（ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ６ｂ）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「８７７１」として登録されている。
「ＳＰＩＮＫ１」とは、膵臓腺房細胞から膵液中に分泌されるトリプシン阻害剤である（ｓｅｒｉｎｅ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｋａｚａｌ ｔｙｐｅ １）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「６６９０」として登録されている。
「ＷＮＴ９Ａ」とは、心臓や子宮内膜をはじめとする臓器に発現する（Ｗｎｔ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ９Ａ）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「７４８３」として登録されている。
「ＫＲＴ１９」とは、上皮細胞の構造的完全性を担う中間フィラメント蛋白質の一種である（ｋｅｒａｔｉｎ １９）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「３８８０」として登録されている。
「ＰＸＮ」とは、細胞外マトリックスへの細胞接着に寄与する細胞骨格蛋白質である（ｐａｘｉｌｌｉｎ）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「５８２９」として登録されている。
「ＰＴＫ７」とは、細胞膜貫通型の蛋白質チロシンキナーゼの一つである（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ７）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「５７５４」として登録されている。
「ＲＡＳＡ１」とは、細胞質中に局在するＧＴＰａｓｅ活性化蛋白質のＧＡＰ１ファミリーの一部である（ＲＡＳ ｐ２１ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ １）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「５９２１」として登録されている。
「ＮＥＦＬ」とは、軽鎖ニューロフィラメントの（ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「
４７４７」として登録されている。
「ＩＬ１６」とは、化学誘引物質、Ｔ細胞活性化のモジュレーター、及びＨＩＶ複製の阻害剤として機能する多面的サイトカインである（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １６）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「３６０３」として登録されている。
「ＣＣＮ５」とは、ＷＮＴ１誘導性シグナル伝達経路を構成するメンバーの一つである（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋ ｆａｃｔｏｒ ５）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「８８３９」として登録されている。
「ＦＭＮＬ１」とは、形態形成、サイトカイン症や細胞極性に関与する（ｆｏｒｍｉｎ ｌｉｋｅ １）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「７５２」として登録されている。
「ＳＣＧＮ」とは、細胞質中のカルシウム結合蛋白質である（ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｉｎ， ＥＦ－ｈａｎｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「１０５９０」として登録されている。
「ＣＸＣＬ１４」とは、免疫調節や炎症に関与するサイトカインである（Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １４）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「９５４７」として登録されている。
「ＢＡＣＨ１」とは、転写因子の一つである（ＢＴＢ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ＣＮＣ ｈｏｍｏｌｏｇ １）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「５７１」として登録されている。
「ＬＹ６Ｄ」とは、リンパ球分化に関与すると推測されている細胞外領域に発現する（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ６ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ Ｄ）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「８５８１」として登録されている。
「ＣＣＬ２４」とは、免疫調節及び炎症過程に関与するサイトカインの一つである（Ｃ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ ２４）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「６３６９」として登録されている。
「ＳＰＩＮＴ２」とは、膜貫通型の蛋白質で様々なセリンプロテアーゼに対する阻害活性を有する（ｓｅｒｉｎｅ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ， Ｋｕｎｉｔｚ ｔｙｐｅ ２）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「１０６５３」として登録されている。
「ＣＤＨ１５」とは、カルシウム依存性細胞間接着糖蛋白質の一つである（ｃａｄｈｅｒｉｎ １５）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「１０１３」として登録されている。
「ＣＴＳＣ」とは、ペプチダーゼＣ１ファミリー及びリソソームシステインプロテイナーゼをコードする（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｃ）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「１０７５」として登録されている。
「ＣＣＬ１３」とは、免疫調節及び炎症過程に関与するサイトカインの一つである（Ｃ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １３）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「６３５７」として登録されている。
「ＮＯＳ１」とは、Ｌ－アルギニンから一酸化窒素を合成する酵素である（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ １）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「４８４２」として登録されている。
「ＳＣＡＲＡ５」とは、フェリチン受容体活性を有すると推測されている（ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｌａｓｓ Ａ ｍｅｍｂｅｒ ５）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「２８６１３３」として登録されている。
「ＣＣＬ１１」とは、免疫調節及び炎症過程に関与するサイトカインの一つである（Ｃ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ １１）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「６３５６」として登録されている。
「ＡＣＶＲＬ１」とは、ＴＧＦβリガンドのスーパーファミリーに対する１型細胞表面受容体の一つである（ａｃｔｉｖｉｎ Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｋｅ ｔｙｐｅ １）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「９４」として登録されている。
「ＣＤ２７６」とは、Ｔ細胞媒介性免疫応答の調節に関与する（ＣＤ２７６ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「８０３８１」として登録されている。
「ＳＵＳＤ２」とは、細胞周期や細胞分裂を負に制御する（ｓｕｓｈｉ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「５６２４１」として登録されている。
「ＴＭＳＢ１０」とは、アクチンモノマーの輸送に関与すると考えられている（ｔｈｙｍｏｓｉｎ ｂｅｔａ １０）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「９１６８」として登録されている。
「ＮＴ５Ｃ３Ａ」とは、５’－ヌクレオチダーゼの一つである（５’－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ， ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ＩＩＩＡ）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「５１２５１」として登録されている。
「ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ」とは、ＦａｓＬ及びＬＩＧＨＴ媒介性細胞死の調節に関与する（ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ６ｂ）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「８７７１」として登録されている。
「ＳＰＩＮＫ１」とは、膵臓腺房細胞から膵液中に分泌されるトリプシン阻害剤である（ｓｅｒｉｎｅ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｋａｚａｌ ｔｙｐｅ １）を指し、遺伝子（ｇｅｎｅ）は、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ「６６９０」として登録されている。
【0020】
なお、本発明において、上記標的タンパク質には、糖尿病性神経障害を検出するためのバイオマーカーとなり得る限り、当該タンパク質を構成するアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質も包含される。ここで、実質的に同一のアミノ酸配列とは、例えば、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴを用い、期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝－３の条件にて検索をした場合、当該タンパク質を構成するアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましく９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性があることを意味する。
【0021】
本発明の糖尿病性神経障害の検出方法は、被験者から採取された生体試料について、標的タンパク質の発現レベルを測定する工程を含む。
【0022】
本発明において、生体試料を採取する被験者は、性別や人種など特に限定されないが、神経障害の検出を必要とする糖尿病患者又は神経障害の発症が疑われる糖尿病患者が好ましい。
【0023】
本発明において用いられる生体試料としては、糖尿病性神経障害に応じて本発明の標的タンパク質が発現変化する組織及び生体材料であればよい。具体的には臓器、皮膚、血液、尿、唾液、汗、皮膚表上脂質（ＳＳＬ）、組織浸出液等の体液、血液から調製された血清、血漿等が挙げられ、好ましくは血液、又は血液から調製された血清若しくは血漿が挙げられる。
【0024】
本発明において、標的タンパク質の発現レベルの測定対象としては、当該タンパク質の他、当該タンパク質をコードするＲＮＡ、そのＲＮＡから人工的に合成されたｃＤＮＡ、そのＲＮＡをエンコードするＤＮＡ等の遺伝子が挙げられる。よって、本発明において、標的タンパク質の発現レベルとは、標的タンパク質のタンパク質量や活性、当該タンパク質をコードする遺伝子の発現量を包括的に意味する。
【0025】
発現レベルとしてタンパク質量を測定する場合、プロテインチップ解析、免疫測定法（例えば、各種のエンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ法、モノクローナルポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ法、免疫染色法、免疫蛍光法、ウェスタンブロッティング法、ビオチン－アビジン法、免疫沈降法、金コロイド凝集法、イムノクロマト法、ラテックス凝集法（ＬＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）等）、ＰＥＡ（Proximity Extension Assay）法、質量分析（例えば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ）のような方法を用いることができ、対象に応じて適宜選択できる。
例えば、標的タンパク質に対する抗体、相互作用タンパク質、リガンド、ナノ粒子、アプタマー等の標的タンパク質に結合する分子を生体試料と接触させ、当該分子に結合した試料中の標的タンパク質を検出し、そのレベルを測定することによって実施される。
例えば、標的タンパク質に対する抗体、相互作用タンパク質、リガンド、ナノ粒子、アプタマー等の標的タンパク質に結合する分子を生体試料と接触させ、当該分子に結合した試料中の標的タンパク質を検出し、そのレベルを測定することによって実施される。
【0026】
例えば、ウェスタンブロット法によれば、一次抗体として標的タンパク質に対する抗体を用いた後、二次抗体として放射性同位元素、蛍光物質又は酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて、その一次抗体を標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器、蛍光検出器等で測定することが行われる。
尚、上記標的タンパク質に対する抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。これらの抗体は、公知の方法に従って製造することができる。具体的には、ポリクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該タンパク質の部分ポリペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。
一方、モノクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質又は該タンパク質の部分ポリペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞から得ることができる。また、モノクローナル抗体は、ファージディスプレイを用いて作製してもよい（Griffiths, A.D.; Duncan, A.R., Current Opinion in Biotechnology, Volume 9, Number 1, February 1998 , pp. 102-108(7)）。
尚、上記標的タンパク質に対する抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。これらの抗体は、公知の方法に従って製造することができる。具体的には、ポリクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該タンパク質の部分ポリペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。
一方、モノクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質又は該タンパク質の部分ポリペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞から得ることができる。また、モノクローナル抗体は、ファージディスプレイを用いて作製してもよい（Griffiths, A.D.; Duncan, A.R., Current Opinion in Biotechnology, Volume 9, Number 1, February 1998 , pp. 102-108(7)）。
【0027】
発現レベルとして遺伝子（ＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡ）の発現量を測定する場合、これらにハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法、マルチプレックスＰＣＲ、ＳｍａｒｔＡｍｐ法、ＬＡＭＰ法等に代表される核酸増幅法、これらにハイブリダイズする核酸をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法（ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、ドットブロットハイブリダイゼーション、スロットブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロットハイブリダイゼーション等）、塩基配列を決定する方法（シーケンシング）、又はこれらを組み合わせた方法から選ぶことができる。
【0028】
ＰＣＲでは、解析対象である標的タンパク質をコードするＤＮＡを標的としたプライマーペアを用いて標的タンパク質をコードするＤＮＡのみを増幅してもよいし、複数のプライマーペアを用いて、標的タンパク質をコードするＤＮＡを含めた複数のＤＮＡを同時に増幅してもよい。解析対象のＤＮＡのみを増幅する方法としては、ＲＴ－ＰＣＲが挙げられ、複数のＤＮＡを同時に増幅する方法としては、マルチプレックスＰＣＲが挙げられる。マルチプレックスＰＣＲは、ＰＣＲ反応系に複数のプライマー対を同時に使用することで、複数の遺伝子領域を同時に増幅する方法である。マルチプレックスＰＣＲは、市販のキット（例えば、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズジャパン株式会社等）を用いて実施することができる。
【0029】
当該ＰＣＲで得られた反応産物の精製は、反応産物のサイズ分離によって行われることが好ましい。サイズ分離により、目的のＰＣＲ反応産物を、ＰＣＲ反応液中に含まれるプライマーやその他の不純物から分離することができる。
精製したＰＣＲ反応産物に対して、その後の定量解析を行うために必要なさらなる処理を施してもよい。例えば、ＤＮＡのシーケンシングのために、精製したＰＣＲ反応産物を、適切なバッファー溶液へと調製したり、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡに含まれるＰＣＲプライマー領域を切断したり、増幅されたＤＮＡにアダプター配列をさらに付加したりしてもよい。例えば、精製したＰＣＲ反応産物をバッファー溶液へと調製し、増幅ＤＮＡに対してＰＣＲプライマー配列の除去及びアダプターライゲーションを行い、得られた反応産物を、必要に応じて増幅して、定量解析のためのライブラリーを調製することができる。
精製したＰＣＲ反応産物に対して、その後の定量解析を行うために必要なさらなる処理を施してもよい。例えば、ＤＮＡのシーケンシングのために、精製したＰＣＲ反応産物を、適切なバッファー溶液へと調製したり、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡに含まれるＰＣＲプライマー領域を切断したり、増幅されたＤＮＡにアダプター配列をさらに付加したりしてもよい。例えば、精製したＰＣＲ反応産物をバッファー溶液へと調製し、増幅ＤＮＡに対してＰＣＲプライマー配列の除去及びアダプターライゲーションを行い、得られた反応産物を、必要に応じて増幅して、定量解析のためのライブラリーを調製することができる。
【0030】
ノーザンブロットハイブリダイゼーション法を利用して標的タンパク質をコードする遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、まずプローブＤＮＡを放射性同位元素、蛍光物質等で標識し、次いで、得られた標識ＤＮＡを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした生体試料由来のＲＮＡとハイブリダイズさせる。その後、形成された標識ＤＮＡとＲＮＡとの二重鎖を、標識物に由来するシグナルを検出することにより測定する方法が挙げられる。
【0031】
ＲＴ－ＰＣＲ法を用いて標的タンパク質をコードする遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、まず生体試料由来のＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを調製し、これを鋳型として標的タンパク質をコードする遺伝子が増幅できるように調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（－鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせる。その後、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する。増幅された二本鎖ＤＮＡの検出には、予めＲＩ、蛍光物質等で標識しておいたプライマーを用いて上記ＰＣＲを行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法等を用いることができる。
【0032】
ＤＮＡマイクロアレイを用いて標的タンパク質をコードする遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、支持体に標的タンパク質をコードする遺伝子由来の核酸（ｃＤＮＡ又はＤＮＡ）の少なくとも１種を固定化したアレイを用い、ｍＲＮＡから調製した標識化ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡをマイクロアレイ上に結合させ、マイクロアレイ上の標識を検出することによって、ｍＲＮＡの発現量を測定することができる。
前記アレイに固定化される核酸としては、ストリンジェントな条件下に特異的（すなわち、実質的に目的の核酸のみに）にハイブリダイズする核酸であればよく、例えば、標的タンパク質をコードする遺伝子の全配列を有する核酸であってもよく、部分配列からなる核酸であってもよい。ここで、「部分配列」とは、少なくとも１５～２５塩基からなる核酸が挙げられる。ここでストリンジェントな条件は、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の洗浄条件を挙げることができ、より厳しいハイブリダイズ条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件としては「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件を挙げることができる。ハイブリダイズ条件は、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Thrd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等に記載されている。
前記アレイに固定化される核酸としては、ストリンジェントな条件下に特異的（すなわち、実質的に目的の核酸のみに）にハイブリダイズする核酸であればよく、例えば、標的タンパク質をコードする遺伝子の全配列を有する核酸であってもよく、部分配列からなる核酸であってもよい。ここで、「部分配列」とは、少なくとも１５～２５塩基からなる核酸が挙げられる。ここでストリンジェントな条件は、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の洗浄条件を挙げることができ、より厳しいハイブリダイズ条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件としては「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件を挙げることができる。ハイブリダイズ条件は、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Thrd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等に記載されている。
【0033】
シーケンシングによって標的タンパク質をコードする遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、次世代シーケンサー（例えばＩｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて解析することが挙げられる。シーケンシングで作成されたリードの数（リードカウント）に基づいて、ＲＮＡ発現を定量することができる。
【0034】
斯くして、被験者から採取された生体試料中の標的タンパク質の発現レベルが測定され、当該発現レベルに基づいて糖尿病性神経障害が検出される。
検出は、例えば、測定された標的タンパク質の発現レベルを対照レベルと比較することによって行われる。
ここで、「対照レベル」とは、例えば、神経障害を発症していない糖尿病患者（ＤＭ）における標的タンパク質の発現レベルが挙げられる。ＤＭの発現レベルは、ＤＭ集団から測定した標的タンパク質の発現レベルの統計値（例えば平均値等）であってもよい。
発現レベルの比較は、被験者由来の標的タンパク質の発現レベルが、対照レベルに対して好ましくは９１％以下、より好ましくは８３％以下、さらに好ましくは７７％以下であれば、該標的タンパク質の発現レベルは対照レベルより低いと判断され得、標的タンパク質の発現レベルが、対照レベルに対して好ましくは１１０％以上、より好ましくは１２０％以上、さらに好ましくは１３０％以上であれば、該標的タンパク質の発現レベルは対照レベルより高いと判断され得る。あるいは、被験者由来の標的タンパク質の発現レベルと対照レベルとの差異は、例えば両者が統計学的に有意に異なるか否かによって判断することができる。
標的タンパク質として複数の標的タンパク質を用いる場合には、個々の標的タンパク質の発現レベルを基準値と比較し、一定割合、例えば５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは１００％の標的タンパク質の発現レベルが対照レベルと異なるか否かを調べることで、糖尿病性神経障害を検出することができる。
検出は、例えば、測定された標的タンパク質の発現レベルを対照レベルと比較することによって行われる。
ここで、「対照レベル」とは、例えば、神経障害を発症していない糖尿病患者（ＤＭ）における標的タンパク質の発現レベルが挙げられる。ＤＭの発現レベルは、ＤＭ集団から測定した標的タンパク質の発現レベルの統計値（例えば平均値等）であってもよい。
発現レベルの比較は、被験者由来の標的タンパク質の発現レベルが、対照レベルに対して好ましくは９１％以下、より好ましくは８３％以下、さらに好ましくは７７％以下であれば、該標的タンパク質の発現レベルは対照レベルより低いと判断され得、標的タンパク質の発現レベルが、対照レベルに対して好ましくは１１０％以上、より好ましくは１２０％以上、さらに好ましくは１３０％以上であれば、該標的タンパク質の発現レベルは対照レベルより高いと判断され得る。あるいは、被験者由来の標的タンパク質の発現レベルと対照レベルとの差異は、例えば両者が統計学的に有意に異なるか否かによって判断することができる。
標的タンパク質として複数の標的タンパク質を用いる場合には、個々の標的タンパク質の発現レベルを基準値と比較し、一定割合、例えば５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは１００％の標的タンパク質の発現レベルが対照レベルと異なるか否かを調べることで、糖尿病性神経障害を検出することができる。
【0035】
また、本発明における糖尿病性神経障害の検出は、標的タンパク質の発現レベルの上昇／減少により行うこともできる。この場合は、被験者由来の標的タンパク質の発現レベルが、標的タンパク質のカットオフ値（参照値）と比較される。
カットオフ値は、種々の統計解析手法により求めることができる。例えば、ＲＯＣ曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｏｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ、受信者動作特性曲線）解析に基づく値（例えば、Ｙｏｕｄｅｎ’ｓ ｉｎｄｅｘ、ＲＯＣ曲線における左上隅座標（０，１）からの距離値等）が例示される。
ＲＯＣ曲線は、縦軸を陽性患者において陽性の結果がでる確率（真陽性率（ＴＰＦ：Ｔｒｕｅ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ）、感度）、横軸を陰性患者において陰性の結果がでる確率（特異度）を１から減算した値（偽陽性率（ＦＰＦ：Ｆａｌｓｅ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ））とし、検査結果のどの値を所見ありと判断するかの閾値、つまりカットオフポイント（ｃｕｔｏｆｆ ｐｏｉｎｔ）を媒介変数として変化させてプロットしていくことで作成される。
作成したＲＯＣ曲線から、どのカットオフポイントをカットオフ値として採用するかは、検査の位置づけ、その他種々の条件より決定すればよい。通常、カットオフポイントを偽陽性率の低い点に採ると、陰性患者で陽性となる者は減るものの、逆に陽性患者を多数除いてしまう結果、感度が低くなる。反対に感度を高めると陰性患者における偽陽性率が高くなる。
一般に感度、特異度をともに高める（１に近づくようする）ために、カットオフ値は、ＲＯＣ曲線上で点（０，１）に最も近い点を与える値や、「真陽性（感度）」－「偽陽性（１－特異度）」が最大となる値（Ｙｏｕｄｅｎ ｉｎｄｅｘ）に設定される。
カットオフ値は、種々の統計解析手法により求めることができる。例えば、ＲＯＣ曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｏｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ、受信者動作特性曲線）解析に基づく値（例えば、Ｙｏｕｄｅｎ’ｓ ｉｎｄｅｘ、ＲＯＣ曲線における左上隅座標（０，１）からの距離値等）が例示される。
ＲＯＣ曲線は、縦軸を陽性患者において陽性の結果がでる確率（真陽性率（ＴＰＦ：Ｔｒｕｅ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ）、感度）、横軸を陰性患者において陰性の結果がでる確率（特異度）を１から減算した値（偽陽性率（ＦＰＦ：Ｆａｌｓｅ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ））とし、検査結果のどの値を所見ありと判断するかの閾値、つまりカットオフポイント（ｃｕｔｏｆｆ ｐｏｉｎｔ）を媒介変数として変化させてプロットしていくことで作成される。
作成したＲＯＣ曲線から、どのカットオフポイントをカットオフ値として採用するかは、検査の位置づけ、その他種々の条件より決定すればよい。通常、カットオフポイントを偽陽性率の低い点に採ると、陰性患者で陽性となる者は減るものの、逆に陽性患者を多数除いてしまう結果、感度が低くなる。反対に感度を高めると陰性患者における偽陽性率が高くなる。
一般に感度、特異度をともに高める（１に近づくようする）ために、カットオフ値は、ＲＯＣ曲線上で点（０，１）に最も近い点を与える値や、「真陽性（感度）」－「偽陽性（１－特異度）」が最大となる値（Ｙｏｕｄｅｎ ｉｎｄｅｘ）に設定される。
【0036】
例えば、標的タンパク質として、ＤＰＮで発現が低下するＬＩＬＲＡ２を用いる場合、被験者由来のＬＩＬＲＡ２の発現レベルがカットオフ値より低い場合に、当該被験者には糖尿病性神経障害が存在すると判定できる。
【0037】
本発明の糖尿病性神経障害を検出するための検査用キットは、患者から分離した生体試料における標的タンパク質の発現レベルを測定するための検査試薬を含有するものである。具体的には、標的タンパク質に結合する分子（例えば標的タンパク質を認識する抗体等）を含む免疫学的測定等のための試薬、標的タンパク質をコードする遺伝子又はそれに由来する核酸と特異的に結合（ハイブリダイズ）するオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＲ用のプライマー）を含む、核酸増幅、ハイブリダイゼーションのための試薬等が挙げられる。当該キットに包含される抗体やオリゴヌクレオチド等は、上述したとおり公知の方法により得ることができる。
また、当該検査用キットには、上記抗体や核酸の他、標識試薬、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤や、試験に必要な器具やポジティブコントロールやネガティブコントロールとして使用するコントロール試薬、試料を採取するための用具、採取した試料を保存するための試薬、保存用の容器、試料から標的タンパク質や核酸を抽出・精製するための試薬等を含むことができる。
また、当該検査用キットには、上記抗体や核酸の他、標識試薬、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤や、試験に必要な器具やポジティブコントロールやネガティブコントロールとして使用するコントロール試薬、試料を採取するための用具、採取した試料を保存するための試薬、保存用の容器、試料から標的タンパク質や核酸を抽出・精製するための試薬等を含むことができる。
【0038】
本発明の態様及び好ましい実施態様を以下に示す。
＜１＞被験者から採取された生体試料について、ＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９、ＰＸＮ、ＰＴＫ７、ＲＡＳＡ１、ＮＥＦＬ、ＩＬ１６、ＣＣＮ５、ＦＭＮＬ１、ＳＣＧＮ、ＣＸＣＬ１４、ＢＡＣＨ１、ＬＹ６Ｄ、ＣＣＬ２４、ＳＰＩＮＴ２、ＣＤＨ１５、ＣＴＳＣ、ＣＣＬ１３、ＮＯＳ１、ＳＣＡＲＡ５、ＣＣＬ１１、ＡＣＶＲＬ１、ＣＤ２７６、ＳＵＳＤ２、ＴＭＳＢ１０、ＮＴ５Ｃ３Ａ、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ及びＳＰＩＮＫ１から選択されるタンパク質の少なくとも１つの発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者における糖尿病性神経障害の検出方法。
＜２＞タンパク質がＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９、ＰＸＮ、ＰＴＫ７、ＲＡＳＡ１、ＮＥＦＬ、ＩＬ１６、ＳＰＩＮＫ１及びＣＣＮ５から選択される、好ましくはＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９及びＰＸＮから選択される、＜１＞の方法。
＜３＞生体試料が血液、血清又は血漿である、＜１＞又は＜２＞の方法。
＜４＞発現レベルの測定が前記タンパク質のタンパク質量の測定である、＜１＞～＜３＞のいずれかの方法。
＜５＞発現レベルの測定値を前記タンパク質の参照値と比較し、糖尿病性神経障害の存在若しくは不存在を評価する、＜１＞～＜４＞のいずれかの方法。
＜６＞前記タンパク質に結合する分子又は前記タンパク質をコードする遺伝子と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、＜１＞～＜５＞のいずれかの方法に用いられる糖尿病性神経障害を検出するための検査用キット。
＜７＞ＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９、ＰＸＮ、ＰＴＫ７、ＲＡＳＡ１、ＮＥＦＬ、ＩＬ１６、ＣＣＮ５、ＦＭＮＬ１、ＳＣＧＮ、ＣＸＣＬ１４、ＢＡＣＨ１、ＬＹ６Ｄ、ＣＣＬ２４、ＳＰＩＮＴ２、ＣＤＨ１５、ＣＴＳＣ、ＣＣＬ１３、ＮＯＳ１、ＳＣＡＲＡ５、ＣＣＬ１１、ＡＣＶＲＬ１、ＣＤ２７６、ＳＵＳＤ２、ＴＭＳＢ１０、ＮＴ５Ｃ３Ａ、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ及びＳＰＩＮＫ１から選択されるタンパク質の少なくとも１つからなる、糖尿病性神経障害の検出マーカー。
＜８＞タンパク質がＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９、ＰＸＮ、ＰＴＫ７、ＲＡＳＡ１、ＮＥＦＬ、ＩＬ１６、ＳＰＩＮＫ１及びＣＣＮ５から選択される、好ましくはＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９及びＰＸＮから選択される、＜７＞のマーカー。
＜１＞被験者から採取された生体試料について、ＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９、ＰＸＮ、ＰＴＫ７、ＲＡＳＡ１、ＮＥＦＬ、ＩＬ１６、ＣＣＮ５、ＦＭＮＬ１、ＳＣＧＮ、ＣＸＣＬ１４、ＢＡＣＨ１、ＬＹ６Ｄ、ＣＣＬ２４、ＳＰＩＮＴ２、ＣＤＨ１５、ＣＴＳＣ、ＣＣＬ１３、ＮＯＳ１、ＳＣＡＲＡ５、ＣＣＬ１１、ＡＣＶＲＬ１、ＣＤ２７６、ＳＵＳＤ２、ＴＭＳＢ１０、ＮＴ５Ｃ３Ａ、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ及びＳＰＩＮＫ１から選択されるタンパク質の少なくとも１つの発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者における糖尿病性神経障害の検出方法。
＜２＞タンパク質がＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９、ＰＸＮ、ＰＴＫ７、ＲＡＳＡ１、ＮＥＦＬ、ＩＬ１６、ＳＰＩＮＫ１及びＣＣＮ５から選択される、好ましくはＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９及びＰＸＮから選択される、＜１＞の方法。
＜３＞生体試料が血液、血清又は血漿である、＜１＞又は＜２＞の方法。
＜４＞発現レベルの測定が前記タンパク質のタンパク質量の測定である、＜１＞～＜３＞のいずれかの方法。
＜５＞発現レベルの測定値を前記タンパク質の参照値と比較し、糖尿病性神経障害の存在若しくは不存在を評価する、＜１＞～＜４＞のいずれかの方法。
＜６＞前記タンパク質に結合する分子又は前記タンパク質をコードする遺伝子と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、＜１＞～＜５＞のいずれかの方法に用いられる糖尿病性神経障害を検出するための検査用キット。
＜７＞ＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９、ＰＸＮ、ＰＴＫ７、ＲＡＳＡ１、ＮＥＦＬ、ＩＬ１６、ＣＣＮ５、ＦＭＮＬ１、ＳＣＧＮ、ＣＸＣＬ１４、ＢＡＣＨ１、ＬＹ６Ｄ、ＣＣＬ２４、ＳＰＩＮＴ２、ＣＤＨ１５、ＣＴＳＣ、ＣＣＬ１３、ＮＯＳ１、ＳＣＡＲＡ５、ＣＣＬ１１、ＡＣＶＲＬ１、ＣＤ２７６、ＳＵＳＤ２、ＴＭＳＢ１０、ＮＴ５Ｃ３Ａ、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ及びＳＰＩＮＫ１から選択されるタンパク質の少なくとも１つからなる、糖尿病性神経障害の検出マーカー。
＜８＞タンパク質がＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９、ＰＸＮ、ＰＴＫ７、ＲＡＳＡ１、ＮＥＦＬ、ＩＬ１６、ＳＰＩＮＫ１及びＣＣＮ５から選択される、好ましくはＬＩＬＲＡ２、ＷＮＴ９Ａ，ＫＲＴ１９及びＰＸＮから選択される、＜７＞のマーカー。
【実施例0039】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0040】
（１）方法
１）被験者のリクルート
３０～６５歳の糖尿病診断歴のある男女８０名の中から選抜した。ウェブによる事前アンケートにより糖尿病罹患歴や年齢・性別などの被験者背景をもとに選抜を行い、インフォームドコンセントと試験参加への同意を取得した上で、採血及び糖尿病性神経障害の診断を行った。その際、痛みやしびれを治すために通院あるいは服薬中の方、糖尿病性神経障害の治療薬や鎮痛剤を服薬中の方、以下の疾患に該当する方（一型糖尿病、脊柱狭窄症、ヘルニア、変形性膝関節症、リウマチ、痛風、帯状疱疹、外反母趾）、糖尿病性ケトアシドーシスを合併している方、内分泌系及び代謝系に重篤な疾患を有する方、動脈硬化症、狭心症、不整脈などの心血管関連疾患やうつなどの精神疾患の診断歴がある方、直近１年間に骨折、腱断裂、肉離れなどの運動器に重度の損傷を受けた方、自力で歩くことができない方は試験対象者から除外した。
１）被験者のリクルート
３０～６５歳の糖尿病診断歴のある男女８０名の中から選抜した。ウェブによる事前アンケートにより糖尿病罹患歴や年齢・性別などの被験者背景をもとに選抜を行い、インフォームドコンセントと試験参加への同意を取得した上で、採血及び糖尿病性神経障害の診断を行った。その際、痛みやしびれを治すために通院あるいは服薬中の方、糖尿病性神経障害の治療薬や鎮痛剤を服薬中の方、以下の疾患に該当する方（一型糖尿病、脊柱狭窄症、ヘルニア、変形性膝関節症、リウマチ、痛風、帯状疱疹、外反母趾）、糖尿病性ケトアシドーシスを合併している方、内分泌系及び代謝系に重篤な疾患を有する方、動脈硬化症、狭心症、不整脈などの心血管関連疾患やうつなどの精神疾患の診断歴がある方、直近１年間に骨折、腱断裂、肉離れなどの運動器に重度の損傷を受けた方、自力で歩くことができない方は試験対象者から除外した。
【0041】
２）糖尿病性神経障害（ＤＰＮ）及び糖尿病（ＤＭ）の診断基準
以下に示す診察項目（（１）下肢感覚、（２）アキレス腱反射、（３）振動覚）の検査を行い、３項目中２項目以上が該当する方をＤＰＮとした。また、上記条件に満たない場合でも、神経伝導検査において両足共に異常値を示した場合、ＤＰＮとした。上記条件を満たさなかった場合、ＤＭとした（ＤＰＮ２０名、ＤＭ１３名）。
以下に示す診察項目（（１）下肢感覚、（２）アキレス腱反射、（３）振動覚）の検査を行い、３項目中２項目以上が該当する方をＤＰＮとした。また、上記条件に満たない場合でも、神経伝導検査において両足共に異常値を示した場合、ＤＰＮとした。上記条件を満たさなかった場合、ＤＭとした（ＤＰＮ２０名、ＤＭ１３名）。
【0042】
２－ｉ）下肢感覚異常
下肢の痛み、しびれや感覚鈍麻の有無について医師が問診を行った。
下肢の痛み、しびれや感覚鈍麻の有無について医師が問診を行った。
【0043】
２－ｉｉ）アキレス腱反射
参加者は壁を向いて壁際に設置した椅子の上に膝立ちの姿勢をとってもらった。試験者が、アキレス腱反射検査用ハンマーを用いて、アキレス腱を叩き、足が底屈するか否かを評価した。
参加者は壁を向いて壁際に設置した椅子の上に膝立ちの姿勢をとってもらった。試験者が、アキレス腱反射検査用ハンマーを用いて、アキレス腱を叩き、足が底屈するか否かを評価した。
【0044】
２－ｉｉｉ）振動覚
試験者は、振動する振動覚検査用音叉（Ｃ１２８）を椅子に座った状態の参加者の内踝に当てた。振動を感じなくなった時点を参加者に申告させ、その時間を計測値とした。両足について測定し、１０秒以内に振動覚が消失した場合を振動覚低下と判断した。
試験者は、振動する振動覚検査用音叉（Ｃ１２８）を椅子に座った状態の参加者の内踝に当てた。振動を感じなくなった時点を参加者に申告させ、その時間を計測値とした。両足について測定し、１０秒以内に振動覚が消失した場合を振動覚低下と判断した。
【0045】
２－ｉｖ）神経伝導検査
参加者に、診察台にうつぶせに寝てもらい、専用のアルコールシート（プレップパッド）でセンサーが当たる部分を拭いた。神経伝導測定装置（ＨＤＮ‐１０００、オムロン）の電極部位に専用ジェルを塗り、電極を踝とアキレス腱の中央に当て、センサー部を腓腹筋の正中線上に当てた。力を抜いた状態でパルス状に微弱電流を流し、神経伝導速度及び振幅を測定した。測定は左右で実施した。年齢と身長を入力し、正常以外の結果が出た場合、異常と判断した。
参加者に、診察台にうつぶせに寝てもらい、専用のアルコールシート（プレップパッド）でセンサーが当たる部分を拭いた。神経伝導測定装置（ＨＤＮ‐１０００、オムロン）の電極部位に専用ジェルを塗り、電極を踝とアキレス腱の中央に当て、センサー部を腓腹筋の正中線上に当てた。力を抜いた状態でパルス状に微弱電流を流し、神経伝導速度及び振幅を測定した。測定は左右で実施した。年齢と身長を入力し、正常以外の結果が出た場合、異常と判断した。
【0046】
３）検体採取（採血）
参加者は試験参加前日の２１時までに夕食を摂取し、試験参加当日の朝食は摂取しない状態で採血を行った。測定会参加日の朝は、低血糖を防ぐため、糖尿病薬は摂取せずに来院いただき、それ以外の薬については制限しなかった。
血液はＥＤＴＡ－２Ｋ ５ｍｌ真空採血管に回収後、５回以上転倒混和し、すみやかに氷水で冷却した。１２００ｇ×１５分、４℃で遠心し、測定まで血漿は－８０℃で保存した。
参加者は試験参加前日の２１時までに夕食を摂取し、試験参加当日の朝食は摂取しない状態で採血を行った。測定会参加日の朝は、低血糖を防ぐため、糖尿病薬は摂取せずに来院いただき、それ以外の薬については制限しなかった。
血液はＥＤＴＡ－２Ｋ ５ｍｌ真空採血管に回収後、５回以上転倒混和し、すみやかに氷水で冷却した。１２００ｇ×１５分、４℃で遠心し、測定まで血漿は－８０℃で保存した。
【0047】
４）血漿プロテオーム解析
血漿プロテオーム解析には、オーリンクプロテオミクス株式会社のＰＥＡ法を用いた。ＰＥＡ法とは蛋白質の定量情報を蛋白質に対応する配列を持った塩基配列に置き換えることで、蛋白質をＰＣＲベースで定量する方法であり、微量なサンプルから多くの種類の蛋白質を定量することができる。本試験ではｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐａｎｅｌ（３６８種）とｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ｐａｎｅｌ（３６７種）を用い、合計７３２種類の蛋白質について定量を行った（２つのｐａｎｅｌ間で３成分重複している）。
血漿プロテオーム解析には、オーリンクプロテオミクス株式会社のＰＥＡ法を用いた。ＰＥＡ法とは蛋白質の定量情報を蛋白質に対応する配列を持った塩基配列に置き換えることで、蛋白質をＰＣＲベースで定量する方法であり、微量なサンプルから多くの種類の蛋白質を定量することができる。本試験ではｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐａｎｅｌ（３６８種）とｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ｐａｎｅｌ（３６７種）を用い、合計７３２種類の蛋白質について定量を行った（２つのｐａｎｅｌ間で３成分重複している）。
【0048】
（１）結果
１）ＤＰＮとＤＭの血漿プロテオームの比較
ＤＰＮとＤＭの２群間で血中濃度に有意差を認めた２９種類のマーカーの血中濃度をボックスプロットで示した（図１）。統計学的解析にはｔ検定を用い、有意水準として０．０５を用いた。
１）ＤＰＮとＤＭの血漿プロテオームの比較
ＤＰＮとＤＭの２群間で血中濃度に有意差を認めた２９種類のマーカーの血中濃度をボックスプロットで示した（図１）。統計学的解析にはｔ検定を用い、有意水準として０．０５を用いた。
【0049】
２）２９種類の血中マーカーを用いた糖尿病性神経障害の受動者動作特性曲線（ＲＯＣ）
各血中マーカーの相対値データを用いて、糖尿病性神経障害の有無について二値分類判定を試みた。分類判定の評価には受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）を用い、ＲＯＣの曲線下面積（ＡＵＣ）でモデルの精度を評価した。その結果、候補マーカー２９種類（下記表１）について、モデルとしての精度が良好であった（図２、ＡＵＣ≧０．７）。
各血中マーカーの相対値データを用いて、糖尿病性神経障害の有無について二値分類判定を試みた。分類判定の評価には受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）を用い、ＲＯＣの曲線下面積（ＡＵＣ）でモデルの精度を評価した。その結果、候補マーカー２９種類（下記表１）について、モデルとしての精度が良好であった（図２、ＡＵＣ≧０．７）。
【0050】
【表1】
【図1】
【図2】
