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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024044062
(43)【公開日】2024-04-02
(54)【発明の名称】リパーゼ変異体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/55 20060101AFI20240326BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20240326BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240326BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240326BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240326BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240326BHJP
C12N 9/20 20060101ALI20240326BHJP
【ＦＩ】
C12N15/55 ZNA
C12N15/10 200Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N9/20
【審査請求】未請求
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022149382
(22)【出願日】2022-09-20
(71)【出願人】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】日置 貴大
(72)【発明者】
【氏名】川原 彰人
【テーマコード（参考）】
4B050
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B050CC04
4B050DD02
4B050EE10
4B065AA01Y
4B065AA15X
4B065AA26X
4B065AB01
4B065BA01
4B065CA31
4B065CA60
(57)【要約】 （修正有）
【課題】異種発現性が向上したリパーゼ変異体の提供。
【解決手段】親リパーゼのアミノ酸配列に対して、ある特定のアミノ酸配列を基準とした番号付けでの所定位置におけるアミノ酸残基が所定のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる、リパーゼ変異体。前記親リパーゼは、Ｐｒｏｔｅｕｓ属細菌やＹｅｒｓｉｎｉａ属細菌に由来するリパーゼを含む同一のクレード（Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレード）に属するリパーゼであってよい。
【選択図】なし
【解決手段】親リパーゼのアミノ酸配列に対して、ある特定のアミノ酸配列を基準とした番号付けでの所定位置におけるアミノ酸残基が所定のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる、リパーゼ変異体。前記親リパーゼは、Ｐｒｏｔｅｕｓ属細菌やＹｅｒｓｉｎｉａ属細菌に由来するリパーゼを含む同一のクレード（Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレード）に属するリパーゼであってよい。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記（ａ）～（ｖ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置にアスパラギン酸を有するリパーゼ変異体；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にチロシンを有するリパーゼ変異体；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にシステインを有するリパーゼ変異体；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にロイシンを有するリパーゼ変異体；
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置にアラニン、スレオニン、ヒスチジン又はグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置にリジンを有するリパーゼ変異体；
（ｈ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置にスレオニンを有するリパーゼ変異体；
（ｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置にプロリンを有するリパーゼ変異体；
（ｊ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置にグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ｋ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にチロシンを有するリパーゼ変異体；
（ｌ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にチロシンを有するリパーゼ変異体；
（ｍ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ｎ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置にグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ｏ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置にグルタミンを有するリパーゼ変異体；
（ｐ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にチロシンを有するリパーゼ変異体；
（ｑ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ｒ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置にリジンを有するリパーゼ変異体；
（ｓ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にロイシンを有するリパーゼ変異体；
（ｔ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にシステインを有するリパーゼ変異体；
（ｕ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にロイシンを有するリパーゼ変異体；
（ｖ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にチロシンを有するリパーゼ変異体。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置にアスパラギン酸を有するリパーゼ変異体；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にチロシンを有するリパーゼ変異体；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にシステインを有するリパーゼ変異体；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にロイシンを有するリパーゼ変異体；
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置にアラニン、スレオニン、ヒスチジン又はグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置にリジンを有するリパーゼ変異体；
（ｈ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置にスレオニンを有するリパーゼ変異体；
（ｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置にプロリンを有するリパーゼ変異体；
（ｊ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置にグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ｋ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にチロシンを有するリパーゼ変異体；
（ｌ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にチロシンを有するリパーゼ変異体；
（ｍ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ｎ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置にグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ｏ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置にグルタミンを有するリパーゼ変異体；
（ｐ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にチロシンを有するリパーゼ変異体；
（ｑ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ｒ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置にリジンを有するリパーゼ変異体；
（ｓ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にロイシンを有するリパーゼ変異体；
（ｔ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にシステインを有するリパーゼ変異体；
（ｕ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にロイシンを有するリパーゼ変異体；
（ｖ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にチロシンを有するリパーゼ変異体。
【請求項2】
下記（ａａ）～（ａｅ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体：
（ａａ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、９０位に相当する位置におけるシステイン、及び１８１位に相当する位置におけるロイシンから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｂ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるリジン、１２５位に相当する位置におけるスレオニン、１２６位に相当する位置におけるプロリン、及び２９３位に相当する位置におけるグリシンから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｃ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるチロシン、３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、及び１８６位に相当する位置におけるグリンから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｄ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、７７位に相当する位置におけるリジン、及び１８１位に相当する位置におけるロイシンから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｅ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるシステイン及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体。
（ａａ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、９０位に相当する位置におけるシステイン、及び１８１位に相当する位置におけるロイシンから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｂ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるリジン、１２５位に相当する位置におけるスレオニン、１２６位に相当する位置におけるプロリン、及び２９３位に相当する位置におけるグリシンから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｃ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるチロシン、３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、及び１８６位に相当する位置におけるグリンから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｄ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、７７位に相当する位置におけるリジン、及び１８１位に相当する位置におけるロイシンから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｅ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるシステイン及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体。
【請求項3】
上記（ａ）、（ｃ）～（ｇ）、（ｉ）～（ｋ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｒ）及び（ｔ）～（ｖ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体である、請求項１に記載のリパーゼ変異体。
【請求項4】
下記（ａａ－１）～（ａｅ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体である、請求項２に記載のリパーゼ変異体：
（ａａ－１）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン及び３２位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－２）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるシステイン及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－３）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置におけるグリシン及び９０位に相当する位置におけるシステインを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－４）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、９０位に相当する位置におけるシステイン、及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－１）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置におけるスレオニン及び１２６位に相当する位置におけるプロリンを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－２）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるリジン及び２９３位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－３）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置におけるスレオニン、１２６位に相当する位置におけるプロリン、及び２９３位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－４）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるリジン、１２５位に相当する位置におけるスレオニン、及び１２６位に相当する位置におけるプロリンを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－５）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるリジン、１２６位に相当する位置におけるプロリン、及び２９３位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－６）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるリジン、１２５位に相当する位置におけるスレオニン、１２６位に相当する位置におけるプロリン、及び２９３位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｃ－１）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるチロシン及び１８６位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｃ－２）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、又は配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるチロシン、３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、及び１８６位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－１）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン及び３２位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－２）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置におけるリジン及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－３）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－４）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、７７位に相当する位置におけるリジン、及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｅ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるシステイン及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体。
（ａａ－１）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン及び３２位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－２）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるシステイン及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－３）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置におけるグリシン及び９０位に相当する位置におけるシステインを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－４）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、９０位に相当する位置におけるシステイン、及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－１）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置におけるスレオニン及び１２６位に相当する位置におけるプロリンを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－２）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるリジン及び２９３位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－３）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置におけるスレオニン、１２６位に相当する位置におけるプロリン、及び２９３位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－４）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるリジン、１２５位に相当する位置におけるスレオニン、及び１２６位に相当する位置におけるプロリンを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－５）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるリジン、１２６位に相当する位置におけるプロリン、及び２９３位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－６）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるリジン、１２５位に相当する位置におけるスレオニン、１２６位に相当する位置におけるプロリン、及び２９３位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｃ－１）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるチロシン及び１８６位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｃ－２）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、又は配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるチロシン、３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、及び１８６位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－１）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン及び３２位に相当する位置におけるグリシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－２）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置におけるリジン及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－３）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－４）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるチロシン、３２位に相当する位置におけるグリシン、７７位に相当する位置におけるリジン、及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体；
（ａｅ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるシステイン及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項に記載のリパーゼ変異体を含有する、酵素組成物。
【請求項6】
請求項１～４のいずれか１項に記載のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項7】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
【請求項8】
請求項７に記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
【請求項9】
微生物である、請求項８に記載の形質転換細胞。
【請求項10】
大腸菌又はバチルス属細菌である、請求項９記載の形質転換細胞。
【請求項11】
請求項８～１０のいずれか１項に記載の形質転換細胞を培養する工程を含む、リパーゼ変異体の製造方法。
【請求項12】
下記（ｉ）～（ｘｘｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼ変異体の製造方法：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置のアミノ酸残基をアスパラギン酸に置換する工程；
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程；
（ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程；
（ｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をロイシンに置換する工程；
（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置のアミノ酸残基をアラニン、スレオニン、ヒスチジン又はグリシンに置換する工程；
（ｖｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基をリジンに置換する工程；
（ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置のアミノ酸残基をスレオニンに置換する工程；
（ｉｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をプロリンに置換する工程；
（ｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
（ｘｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程；
（ｘｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程；
（ｘｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
（ｘｉｖ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
（ｘｖ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置のアミノ酸残基をグルタミンに置換する工程；
（ｘｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程；
（ｘｖｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置のアミノ酸残基をリジンに置換する工程；
（ｘｉｘ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をロイシンに置換する工程；
（ｘｘ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程；
（ｘｘｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をロイシンに置換する工程；
（ｘｘｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程。
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置のアミノ酸残基をアスパラギン酸に置換する工程；
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程；
（ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程；
（ｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をロイシンに置換する工程；
（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置のアミノ酸残基をアラニン、スレオニン、ヒスチジン又はグリシンに置換する工程；
（ｖｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基をリジンに置換する工程；
（ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置のアミノ酸残基をスレオニンに置換する工程；
（ｉｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をプロリンに置換する工程；
（ｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
（ｘｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程；
（ｘｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程；
（ｘｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
（ｘｉｖ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
（ｘｖ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置のアミノ酸残基をグルタミンに置換する工程；
（ｘｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程；
（ｘｖｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置のアミノ酸残基をリジンに置換する工程；
（ｘｉｘ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をロイシンに置換する工程；
（ｘｘ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程；
（ｘｘｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をロイシンに置換する工程；
（ｘｘｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程。
【請求項13】
下記（ｘｘｉｉｉ）～（ｘｘｖｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼ変異体の製造方法：
（ｘｘｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、９０位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３１位に相当する位置ではチロシン、３２位に相当する位置ではグリシン、９０位に相当する位置ではシステイン、及び１８１位に相当する位置ではロイシンに置換する工程；
（ｘｘｉｖ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３９位に相当する位置ではリジン、１２５位に相当する位置ではスレオニン、１２６位に相当する位置ではプロリン、及び２９３位に相当する位置ではグリシンに置換する工程；
（ｘｘｖ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位、３１位、３２位及び１８６位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を２９位に相当する位置ではチロシン、３１位に相当する位置ではチロシン、３２位に相当する位置ではグリシン、及び１８６位に相当する位置ではグリシンに置換する工程；
（ｘｘｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、７７位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３１位に相当する位置ではチロシン、３２位に相当する位置ではグリシン、７７位に相当する位置ではリジン、及び１８１位に相当する位置ではロイシンに置換する工程；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をシステインに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をロイシンに置換する工程。
（ｘｘｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、９０位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３１位に相当する位置ではチロシン、３２位に相当する位置ではグリシン、９０位に相当する位置ではシステイン、及び１８１位に相当する位置ではロイシンに置換する工程；
（ｘｘｉｖ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３９位に相当する位置ではリジン、１２５位に相当する位置ではスレオニン、１２６位に相当する位置ではプロリン、及び２９３位に相当する位置ではグリシンに置換する工程；
（ｘｘｖ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位、３１位、３２位及び１８６位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を２９位に相当する位置ではチロシン、３１位に相当する位置ではチロシン、３２位に相当する位置ではグリシン、及び１８６位に相当する位置ではグリシンに置換する工程；
（ｘｘｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、７７位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３１位に相当する位置ではチロシン、３２位に相当する位置ではグリシン、７７位に相当する位置ではリジン、及び１８１位に相当する位置ではロイシンに置換する工程；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をシステインに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をロイシンに置換する工程。
【請求項14】
下記（ｉ）～（ｘｘｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼの異種発現性の向上方法：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置のアミノ酸残基をアスパラギン酸に置換する工程；
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程；
（ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程；
（ｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をロイシンに置換する工程；
（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置のアミノ酸残基をアラニン、スレオニン、ヒスチジン又はグリシンに置換する工程；
（ｖｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基をリジンに置換する工程；
（ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置のアミノ酸残基をスレオニンに置換する工程；
（ｉｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をプロリンに置換する工程；
（ｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
（ｘｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程；
（ｘｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程；
（ｘｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
（ｘｉｖ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
（ｘｖ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置のアミノ酸残基をグルタミンに置換する工程；
（ｘｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程；
（ｘｖｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置のアミノ酸残基をリジンに置換する工程；
（ｘｉｘ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をロイシンに置換する工程；
（ｘｘ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程；
（ｘｘｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をロイシンに置換する工程；
（ｘｘｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程。
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置のアミノ酸残基をアスパラギン酸に置換する工程；
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程；
（ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程；
（ｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をロイシンに置換する工程；
（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置のアミノ酸残基をアラニン、スレオニン、ヒスチジン又はグリシンに置換する工程；
（ｖｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基をリジンに置換する工程；
（ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置のアミノ酸残基をスレオニンに置換する工程；
（ｉｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をプロリンに置換する工程；
（ｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
（ｘｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程；
（ｘｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程；
（ｘｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
（ｘｉｖ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
（ｘｖ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置のアミノ酸残基をグルタミンに置換する工程；
（ｘｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程；
（ｘｖｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をグリシンに置換する工程；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置のアミノ酸残基をリジンに置換する工程；
（ｘｉｘ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をロイシンに置換する工程；
（ｘｘ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をシステインに置換する工程；
（ｘｘｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をロイシンに置換する工程；
（ｘｘｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をチロシンに置換する工程。
【請求項15】
下記（ｘｘｉｉｉ）～（ｘｘｖｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼの異種発現性の向上方法：
（ｘｘｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、９０位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３１位に相当する位置ではチロシン、３２位に相当する位置ではグリシン、９０位に相当する位置ではシステイン、及び１８１位に相当する位置ではロイシンに置換する工程；
（ｘｘｉｖ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３９位に相当する位置ではリジン、１２５位に相当する位置ではスレオニン、１２６位に相当する位置ではプロリン、及び２９３位に相当する位置ではグリシンに置換する工程；
（ｘｘｖ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位、３１位、３２位及び１８６位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を２９位に相当する位置ではチロシン、３１位に相当する位置ではチロシン、３２位に相当する位置ではグリシン、及び１８６位に相当する位置ではグリシンに置換する工程；
（ｘｘｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、７７位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３１位に相当する位置ではチロシン、３２位に相当する位置ではグリシン、７７位に相当する位置ではリジン、及び１８１位に相当する位置ではロイシンに置換する工程；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をシステインに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をロイシンに置換する工程。
（ｘｘｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、９０位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３１位に相当する位置ではチロシン、３２位に相当する位置ではグリシン、９０位に相当する位置ではシステイン、及び１８１位に相当する位置ではロイシンに置換する工程；
（ｘｘｉｖ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３９位に相当する位置ではリジン、１２５位に相当する位置ではスレオニン、１２６位に相当する位置ではプロリン、及び２９３位に相当する位置ではグリシンに置換する工程；
（ｘｘｖ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位、３１位、３２位及び１８６位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を２９位に相当する位置ではチロシン、３１位に相当する位置ではチロシン、３２位に相当する位置ではグリシン、及び１８６位に相当する位置ではグリシンに置換する工程；
（ｘｘｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、７７位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３１位に相当する位置ではチロシン、３２位に相当する位置ではグリシン、７７位に相当する位置ではリジン、及び１８１位に相当する位置ではロイシンに置換する工程；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をシステインに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をロイシンに置換する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、リパーゼ変異体に関する。
【背景技術】
【0002】
リパーゼは、脂質中のエステル結合を加水分解して脂肪酸を生成することによって油を含む汚れの除去に寄与し、洗浄用途において有用である。洗浄に有用なリパーゼとして、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ由来のリパーゼ（以下ＴＬＬ）がＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）の商品名で販売されている。特許文献１にはＣｅｄｅｃｅａ ｓｐ－１６６４０株由来のリパーゼＬｉｐｒ１３９がＴＬＬと比較して優れた洗浄性能を有することが開示されている。特許文献２には、１つ又は複数の参照脂肪分解酵素と比較した場合に改善された洗浄性能を有するＰｒｏｔｅｕｓ属細菌由来リパーゼ（以下ＰｖＬｉｐ）の変異体が開示されている。特許文献３にはメタゲノム由来のリパーゼＬｉｐｒ１３８がＴＬＬと比較して優れた洗浄性能を有することが開示されている。Ｌｉｐｒ１３９、ＰｖＬｉｐ及びＬｉｐｒ１３８はＰｒｏｔｅｕｓ属細菌やＹｅｒｓｉｎｉａ属細菌に由来するリパーゼを含む同一のクレード（Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレード）に属するリパーゼである。
【0003】
グラム陰性菌由来のリパーゼの多くは、活性型への折りたたみにリパーゼ特異的シャペロンを必要とし（非特許文献１）、異種発現による安価製造に課題を有する。特異的シャペロンの共発現によって異種発現が改善することが報告されている（非特許文献２）が、その生産性は低く、異種発現による安価製造には依然として大きな課題がある。一方、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードのバクテリアリパーゼは特異的シャペロンを必要とせず、異種発現による安価製造において優位性を持つ（非特許文献３、４）。
以上のように、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードのバクテリアリパーゼは洗浄への適性と安価製造可能性の両者において、洗浄用酵素として優れたポテンシャルを有する。
以上のように、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードのバクテリアリパーゼは洗浄への適性と安価製造可能性の両者において、洗浄用酵素として優れたポテンシャルを有する。
【0004】
リパーゼは、エステル加水分解反応以外にも、エステル合成反応、エステル交換反応、アシドリシスなど様々な反応を触媒する。この反応性を利用して、洗浄、光学分割、バイオ燃料製造、油脂加工、廃水処理、パルプ製造、レザー製造など様々な用途でリパーゼが利用されている。非特許文献５及び６にはＬｉｐＣ１２（Ｌｉｐｒ１３８と同配列）のエステル合成用途における優れた性能が示されており、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードのバクテリアリパーゼは洗浄に限らず多様な産業用途における有用性が期待される。
【0005】
アシルグリセロール中のエステル結合の位置特異性、脂肪酸鎖長特異性、光学分割におけるエナンチオ選択性といった基質特異性はリパーゼ種によって大きく異なる。近縁配列のリパーゼ間でもこれらの基質特異性には違いが見られ、最適な反応を行うためには反応系ごとにリパーゼのスクリーニングを行う必要がある。そのため、産業上利用できるリパーゼの配列多様性を広げることが求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特表２０１５－５２３０７８号公報
【特許文献2】国際公開公報第２０２０／０４６６１３号
【特許文献3】特表２０１５－５２５２４８号公報
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Hobson, Audrey H., et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 90.12 (1993): 5682-5686.
【非特許文献2】Quyen, ThiDinh, ChiHai Vu, and GiangThi Thu Le. Microbial cell factories 11.1 (2012): 1-12.
【非特許文献3】Lee, Hong-Weon, et al. Biotechnology letters 22.19 (2000): 1543-1547.
【非特許文献4】Glogauer, Arnaldo, et al. Microbial cell factories 10.1 (2011): 1-15.
【非特許文献5】Madalozzo, Aline Dutra, et al. Journal of molecular catalysis b: enzymatic 116 (2015): 45-51.
【非特許文献6】Madalozzo, Aline Dutra, et al. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology 8 (2016): 294-300.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明者らは、タンパク質の進化を表す有根系統樹上でＰｒｏｔｅｕｓ属細菌及びＹｅｒｓｉｎｉａ属細菌に由来するリパーゼを含むＰｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属する多様な１６種のリパーゼについて、枯草菌における異種発現性を評価したところ、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードのリパーゼは異種発現にて優位性を持つとの報告があるにもかかわらず、明確な発現が確認できたのは３種のみであり、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードのリパーゼにおいて異種発現可能な配列の多様性が実際には小さいという課題を初めて見出した。よって、本発明は、異種発現性が向上したリパーゼ変異体を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、斯かる課題に鑑み鋭意検討した結果、上記１６種のうちの８種のリパーゼ及びこれらに近縁の１種のリパーゼを用い、リパーゼの異種発現性を向上させる変異を見出した。
【0010】
すなわち、本発明は、下記１）～１１）に係るものである。
１）下記（ａ）～（ｖ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置にＤを有するリパーゼ変異体；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にＣを有するリパーゼ変異体；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置にＡ、Ｔ、Ｈ又はＧを有するリパーゼ変異体；
（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置にＫを有するリパーゼ変異体；
（ｈ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置にＴを有するリパーゼ変異体；
（ｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置にＰを有するリパーゼ変異体；
（ｊ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｋ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｌ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｍ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｎ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｏ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置にＱを有するリパーゼ変異体；
（ｐ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｑ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｒ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置にＫを有するリパーゼ変異体；
（ｓ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｔ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にＣを有するリパーゼ変異体；
（ｕ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｖ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体。
２）下記（ａａ）～（ａｅ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体：
（ａａ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、９０位に相当する位置におけるＣ、及び１８１位に相当する位置におけるＬから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｂ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２５位に相当する位置におけるＴ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｃ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＹ、３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、及び１８６位に相当する位置におけるＧから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｄ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、７７位に相当する位置におけるＫ、及び１８１位に相当する位置におけるＬから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｅ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるＣ及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体。
３）１）又は２）に記載のリパーゼ変異体を含有する、酵素組成物。
４）１）又は２）に記載のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
５）４）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
６）５）に記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
７）６）に記載の形質転換細胞を培養する工程を含む、リパーゼ変異体の製造方法。
８）下記（ｉ）～（ｘｘｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼ変異体の製造方法：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置のアミノ酸残基をＤに置換する工程；
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換する工程；
（ｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置のアミノ酸残基をＡ、Ｔ、Ｈ又はＧに置換する工程；
（ｖｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換する工程；
（ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置のアミノ酸残基をＴに置換する工程；
（ｉｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をＰに置換する工程；
（ｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｘｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｘｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｉｖ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｖ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置のアミノ酸残基をＱに置換する工程；
（ｘｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｘｖｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換する工程；
（ｘｉｘ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換する工程；
（ｘｘｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程。
９）下記（ｘｘｉｉｉ）～（ｘｘｖｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼ変異体の製造方法：
（ｘｘｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、９０位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、９０位に相当する位置ではＣ、及び１８１位に相当する位置ではＬに置換する工程；
（ｘｘｉｖ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３９位に相当する位置ではＫ、１２５位に相当する位置ではＴ、１２６位に相当する位置ではＰ、及び２９３位に相当する位置ではＧに置換する工程；
（ｘｘｖ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位、３１位、３２位及び１８６位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を２９位に相当する位置ではＹ、３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、及び１８６位に相当する位置ではＧに置換する工程；
（ｘｘｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、７７位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、７７位に相当する位置ではＫ、及び１８１位に相当する位置ではＬに置換する工程；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程。
１０）上記（ｉ）～（ｘｘｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼの異種発現性の向上方法。
１１）上記（ｘｘｉｉｉ）～（ｘｘｖｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼの異種発現性の向上方法。
１）下記（ａ）～（ｖ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置にＤを有するリパーゼ変異体；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にＣを有するリパーゼ変異体；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置にＡ、Ｔ、Ｈ又はＧを有するリパーゼ変異体；
（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置にＫを有するリパーゼ変異体；
（ｈ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置にＴを有するリパーゼ変異体；
（ｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置にＰを有するリパーゼ変異体；
（ｊ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｋ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｌ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｍ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｎ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｏ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置にＱを有するリパーゼ変異体；
（ｐ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｑ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｒ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置にＫを有するリパーゼ変異体；
（ｓ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｔ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にＣを有するリパーゼ変異体；
（ｕ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｖ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体。
２）下記（ａａ）～（ａｅ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体：
（ａａ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、９０位に相当する位置におけるＣ、及び１８１位に相当する位置におけるＬから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｂ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２５位に相当する位置におけるＴ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｃ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＹ、３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、及び１８６位に相当する位置におけるＧから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｄ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、７７位に相当する位置におけるＫ、及び１８１位に相当する位置におけるＬから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｅ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるＣ及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体。
３）１）又は２）に記載のリパーゼ変異体を含有する、酵素組成物。
４）１）又は２）に記載のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
５）４）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
６）５）に記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
７）６）に記載の形質転換細胞を培養する工程を含む、リパーゼ変異体の製造方法。
８）下記（ｉ）～（ｘｘｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼ変異体の製造方法：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置のアミノ酸残基をＤに置換する工程；
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換する工程；
（ｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置のアミノ酸残基をＡ、Ｔ、Ｈ又はＧに置換する工程；
（ｖｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換する工程；
（ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置のアミノ酸残基をＴに置換する工程；
（ｉｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をＰに置換する工程；
（ｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｘｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｘｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｉｖ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｖ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置のアミノ酸残基をＱに置換する工程；
（ｘｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｘｖｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換する工程；
（ｘｉｘ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換する工程；
（ｘｘｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程。
９）下記（ｘｘｉｉｉ）～（ｘｘｖｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼ変異体の製造方法：
（ｘｘｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、９０位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、９０位に相当する位置ではＣ、及び１８１位に相当する位置ではＬに置換する工程；
（ｘｘｉｖ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３９位に相当する位置ではＫ、１２５位に相当する位置ではＴ、１２６位に相当する位置ではＰ、及び２９３位に相当する位置ではＧに置換する工程；
（ｘｘｖ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位、３１位、３２位及び１８６位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を２９位に相当する位置ではＹ、３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、及び１８６位に相当する位置ではＧに置換する工程；
（ｘｘｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、７７位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、７７位に相当する位置ではＫ、及び１８１位に相当する位置ではＬに置換する工程；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程。
１０）上記（ｉ）～（ｘｘｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼの異種発現性の向上方法。
１１）上記（ｘｘｉｉｉ）～（ｘｘｖｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼの異種発現性の向上方法。
【発明の効果】
【0011】
本発明のリパーゼ変異体は、親リパーゼと比べて異種発現性が向上している。斯かるリパーゼ変異体は、異種発現による安価製造が可能であり、洗浄用途だけでなく、光学分割、バイオ燃料製造、油脂加工、廃水処理、パルプ製造、レザー製造などの産業用途全般に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】各リパーゼのエステラーゼ活性。ｐＨＹ３００ＰＬＫはリパーゼをコードしていない空ベクターの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
【0014】
本明細書において、「リパーゼ」とは、トリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）を指し、脂質中のエステル結合を加水分解して脂肪酸を生成する活性を有する酵素群を意味する。リパーゼ活性は、典型的にはエステラーゼ活性であり、オクタン酸４－ニトロフェニルの加水分解による４－ニトロフェノールの遊離に伴う吸光度の増加速度を測定することによって決定することができる。リパーゼ活性の測定の具体的手順は、後述の実施例に詳述されている。
【0015】
本明細書において、「Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレード」とは、タンパク質の進化を表す有根系統樹上でＰｒｏｔｅｕｓ属細菌及びＹｅｒｓｉｎｉａ属細菌に由来するリパーゼを含むクレードを指し、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０及び３２のアミノ酸配列は、いずれもＰｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属するリパーゼのアミノ酸配列である。
【0016】
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【0017】
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列に関する「少なくとも８０％の同一性」とは、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の同一性をいう。「少なくとも８１％の同一性」とは、８１％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の同一性をいう。「少なくとも８３％の同一性」とは、８３％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の同一性をいう。「少なくとも９１％の同一性」とは、９１％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の同一性をいう。「少なくとも９４％の同一性」とは、９４％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の同一性をいう。「少なくとも９７％の同一性」とは、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の同一性をいう。
【0018】
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａは、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｄｕｂｌｉｎが運営するＣｌｕｓｔａｌのウェブサイト［ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇ］、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ－ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。
【0019】
当業者であれば、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントを、最適化するようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリシン又はグルタミン；グルタミン酸とアスパラギン酸又はグルタミン；セリンとスレオニン又はアラニン；グルタミンとアスパラギン又はアルギニン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。
【0020】
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。
【0021】
本明細書において、アミノ酸の位置及び変異体の記載は、公認されているＩＵＰＡＣの１文字のアミノ酸略記を用いて、以下のように表記される。
所定位置のアミノ酸は、[アミノ酸、位置]で表記される。例えば位置３１のフェニルアラニンは、「Ｆ３１」と示される。
アミノ酸の「置換」に関しては、[元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸]で表記される。例えば位置３１のフェニルアラニンのチロシンへの置換は、「Ｆ３１Ｙ」と示される。
１つの位置で異なる改変を導入可能である場合、異なる改変はスラッシュ（「／」）によって分けられ、例えば、「Ｉ２２２Ａ／Ｔ／Ｈ／Ｇ」は、位置２２２のイソロイシンのアラニン、スレオニン、ヒスチジン又はグリシンへの置換を表す。
所定位置のアミノ酸は、[アミノ酸、位置]で表記される。例えば位置３１のフェニルアラニンは、「Ｆ３１」と示される。
アミノ酸の「置換」に関しては、[元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸]で表記される。例えば位置３１のフェニルアラニンのチロシンへの置換は、「Ｆ３１Ｙ」と示される。
１つの位置で異なる改変を導入可能である場合、異なる改変はスラッシュ（「／」）によって分けられ、例えば、「Ｉ２２２Ａ／Ｔ／Ｈ／Ｇ」は、位置２２２のイソロイシンのアラニン、スレオニン、ヒスチジン又はグリシンへの置換を表す。
【0022】
本明細書において、プロモーターなどの制御領域と遺伝子の「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
【0023】
本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３’側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５’側の領域を意味する。
【0024】
本明細書において、所与の変異ポリペプチドの「親」ポリペプチドとは、そのアミノ酸残基に所定の変異がなされることにより、当該変異ポリペプチドとなるポリペプチドをいう。言い換えると、「親」ポリペプチドとは、変異ポリペプチドに当該変異が加えられる前のポリペプチドである。斯かる親ポリペプチドは、天然（野生型）ポリペプチド又はその変異体であり得る。
【0025】
＜１．リパーゼ変異体及びその製造方法＞
本発明は、異種発現性が向上したリパーゼ変異体、及びその製造方法を提供する。
本発明は、異種発現性が向上したリパーゼ変異体、及びその製造方法を提供する。
【0026】
一態様において、本発明は、リパーゼ変異体の製造方法を提供する。当該本発明の方法は、親リパーゼにおいて、配列番号２を基準とした番号付けでの所定位置におけるアミノ酸残基を所定のアミノ酸残基に置換することを含む。
【0027】
本発明のリパーゼ変異体の親リパーゼの一例としては、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、配列番号２のアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．由来のリパーゼＳｓｐＬｉｐ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＷＰ＿０２５１２２４４１．１）である。配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドである親リパーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置にＥを有するものが好ましい。
【0028】
該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置のアミノ酸残基がＤに置換される。
【0029】
該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、より具体的には、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置のＥがＤに置換される。
【0030】
親リパーゼの別の一例としては、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０、９１又は９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、配列番号４のアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ由来のリパーゼＰｆＬｉｐ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＷＰ＿１２３５９８５０７．１）である。配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも上記所定の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドである親リパーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＦを有するもの、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＥを有するもの、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にＡを有するもの、又は配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＶを有するものが好ましく、配列番号２のアミノ酸配列の３１位及び３２に相当する位置にそれぞれＦ及びＥを有するもの、配列番号２のアミノ酸配列の９０位及び１８１位に相当する位置にそれぞれＡ及びＶを有するもの、又は配列番号２のアミノ酸配列の３２位及び９０位に相当する位置にそれぞれＥ及びＡを有するものがより好ましく、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、９０位及び１８１位に相当する位置にそれぞれＦ、Ｅ、Ａ及びＶを有するものがさらに好ましい。
【0031】
該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基がＹに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基がＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基がＣに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基がＬに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、９０位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つ（好ましくは３つ、より好ましくは４つ）の位置のアミノ酸残基が３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、９０位に相当する位置ではＣ、及び１８１位に相当する位置ではＬに置換される。より好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基がＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基がＣに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基がＬに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３１位及び３２位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＹ及びＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の９０位及び１８１位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＣ及びＬに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３２位及び９０位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＧ及びＣに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、９０位及び１８１位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＹ、Ｇ、Ｃ及びＬに置換される。
【0032】
該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、より具体的には、好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のＦがＹに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のＥがＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のＡがＣに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のＶがＬに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のＦ、３２位に相当する位置のＥ、９０位に相当する位置のＡ及び１８１位に相当する位置のＶから選択される少なくとも２つ（好ましくは３つ、より好ましくは４つ）のアミノ酸残基が３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、９０位に相当する位置ではＣ及び１８１位に相当する位置ではＬに置換される。より好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のＥがＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のＡがＣに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のＶがＬに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３１位及び３２位に相当する位置のＦ及びＥがそれぞれＹ及びＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の９０位及び１８１位に相当する位置のＡ及びＶがそれぞれＣ及びＬに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の３２位及び９０位に相当する位置のＥ及びＡがそれぞれＧ及びＣに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、９０位及び１８１位に相当する位置のＦ、Ｅ、Ａ及びＶがそれぞれＹ、Ｇ、Ｃ及びＬに置換される。
【0033】
親リパーゼの別の一例としては、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、配列番号６のアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｒｉｂｏｌｉｉ由来のリパーゼＥｔＬｉｐ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＷＰ＿１１５４５７１９５．１）である。配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドである親リパーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置にＩを有するものが好ましい。
【0034】
該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置のアミノ酸残基がＡ、Ｔ、Ｈ又はＧに置換される。
【0035】
該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、より具体的には、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置のＩがＡ、Ｔ、Ｈ又はＧに置換される。
【0036】
親リパーゼの別の一例としては、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、配列番号８のアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈａｇａ由来のリパーゼＹｅＬｉｐ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＷＰ＿０６４５１７８９８．１）である。配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドである親リパーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置にＶを有するもの、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置にＶを有するもの、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置にＥを有するもの、又は配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置にＳを有するものが好ましく、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位及び１２６位に相当する位置にそれぞれＶ及びＥを有するもの、又は配列番号２のアミノ酸配列の３９位及び２９３位に相当する位置にそれぞれＶ及びＳを有するものがより好ましく、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置にそれぞれＶ、Ｅ及びＳを有するもの、配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位及び１２６位に相当する位置にそれぞれＶ、Ｖ及びＥを有するもの、又は配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２６位及び２９３位に相当する位置にそれぞれＶ、Ｅ及びＳを有するものがさらに好ましく、配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置にそれぞれＶ、Ｖ、Ｅ及びＳを有するものがさらに好ましい。
【0037】
該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基がＫに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置のアミノ酸残基がＴに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置のアミノ酸残基がＰに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置のアミノ酸残基がＧに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置から選択される少なくとも２つ（好ましくは３つ、より好ましくは４つ）の位置のアミノ酸残基が３９位に相当する位置ではＫ、１２５位に相当する位置ではＴ、１２６位に相当する位置ではＰ、及び２９３位に相当する位置ではＧに置換される。より好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基がＫに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置のアミノ酸残基がＰに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置のアミノ酸残基がＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位及び１２６位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＴ及びＰに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３９位及び２９３位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＫ及びＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＴ、Ｐ及びＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位及び１２６位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＫ、Ｔ及びＰに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２６位及び２９３位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＫ、Ｐ及びＧに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＫ、Ｔ、Ｐ及びＧに置換される。
【0038】
該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、より具体的には、好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のＶがＫに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置のＶがＴに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置のＥがＰに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置のＳがＧに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のＶ、１２５位に相当する位置のＶ、１２６位に相当する位置のＥ及び２９３位に相当する位置のＳから選択される少なくとも２つ（好ましくは３つ、より好ましくは４つ）のアミノ酸残基が３９位に相当する位置ではＫ、１２５位に相当する位置ではＴ、１２６位に相当する位置ではＰ及び２９３位に相当する位置ではＧに置換される。より好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のＶがＫに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置のＥがＰに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置のＳがＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位及び１２６位に相当する位置のＶ及びＥがそれぞれＴ及びＰに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３９位及び２９３位に相当する位置のＶ及びＳがそれぞれＫ及びＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置のＶ、Ｅ及びＳがそれぞれＴ、Ｐ及びＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位及び１２６位に相当する位置のＶ、Ｖ及びＥがそれぞれＫ、Ｔ及びＰに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２６位及び２９３位に相当する位置のＶ、Ｅ及びＳがそれぞれＫ、Ｐ及びＧに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置のＶ、Ｖ、Ｅ及びＳがそれぞれＫ、Ｔ、Ｐ及びＧに置換される。
【0039】
親リパーゼの別の一例としては、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、配列番号１０のアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、Ａｒｓｅｎｏｐｈｏｎｕｓ ｎａｓｏｎｉａｅ由来のリパーゼＡｎＬｉｐ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＷＰ＿０２６８２２４９７．１）である。配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドである親リパーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＣを有するもの、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＦを有するもの、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＡを有するもの、又は配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置にＲを有するものが好ましく、配列番号２のアミノ酸配列の２９位及び１８６位に相当する位置にそれぞれＣ及びＲを有するものがより好ましく、配列番号２のアミノ酸配列の２９位、３１位、３２位及び１８６位に相当する位置にそれぞれＣ、Ｆ、Ａ及びＲを有するものがさらに好ましい。
【0040】
該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基がＹに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基がＹに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基がＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置のアミノ酸残基がＧに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の２９位、３１位、３２位及び１８６位に相当する位置から選択される少なくとも２つ（好ましくは３つ、より好ましくは４つ）の位置のアミノ酸残基が２９位に相当する位置ではＹ、３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、及び１８６位に相当する位置ではＧに置換される。より好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基がＹに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置のアミノ酸残基がＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の２９位及び１８６位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＹ及びＧに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の２９位、３１位、３２位及び１８６位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＹ、Ｙ、Ｇ及びＧに置換される。
【0041】
該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、より具体的には、好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のＣがＹに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のＦがＹに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のＡがＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置のＲがＧに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のＣ、３１位に相当する位置のＦ、３２位に相当する位置のＡ及び１８６位に相当する位置のＲから選択される少なくとも２つ（好ましくは３つ、より好ましくは４つ）のアミノ酸残基が２９位に相当する位置ではＹ、３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ及び１８６位に相当する位置ではＧに置換される。より好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のＣがＹに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置のＲがＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の２９位及び１８６位に相当する位置のＣ及びＲがそれぞれＹ及びＧに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の２９位、３１位、３２位及び１８６位に相当する位置のＣ、Ｆ、Ａ及びＲがそれぞれＹ、Ｙ、Ｇ及びＧに置換される。
【0042】
本発明のリパーゼ変異体の親リパーゼの一例としては、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、配列番号１２のアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎｉｉ由来のリパーゼＹｆＬｉｐ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＷＰ＿１４５５３０７４５．１）である。配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドである親リパーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置にＧを有するものが好ましい。
【0043】
該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置のアミノ酸残基がＱに置換される。
【0044】
該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、より具体的には、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置のＧがＱに置換される。
【0045】
親リパーゼの別の一例としては、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０、８３又は９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、配列番号１４のアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．由来のリパーゼＰｓｐＬｉｐ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＷＰ＿０５６８４０９２７．１）である。配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも上記所定の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドである親リパーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＦを有するもの、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＤを有するもの、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置にＲを有するもの、又は配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＭを有するものが好ましく、配列番号２のアミノ酸配列の３１位及び３２位に相当する位置にそれぞれＦ及びＤを有するもの、又は配列番号２のアミノ酸配列の７７位及び１８１位に相当する位置にそれぞれＲ及びＭを有するものがより好ましく、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位及び１８１位に相当する位置にそれぞれＦ、Ｄ及びＭを有するものがさらに好ましく、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、７７位及び１８１位に相当する位置にそれぞれＦ、Ｄ、Ｒ及びＭを有するものがさらに好ましい。
【0046】
該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基がＹに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基がＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置のアミノ酸残基がＫに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基がＬに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、７７位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つ（好ましくは３つ、より好ましくは４つ）の位置のアミノ酸残基が３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、７７位に相当する位置ではＫ及び１８１位に相当する位置ではＬに置換される。より好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置のアミノ酸残基がＫに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３１位及び３２位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＹ及びＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の７７位及び１８１位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＫ及びＬに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位及び１８１位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＹ、Ｇ及びＬに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、７７位及び１８１位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＹ、Ｇ、Ｋ及びＬに置換される。
【0047】
該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、より具体的には、好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のＦがＹに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のＤがＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置のＲがＫに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のＭがＬに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のＦ、３２位に相当する位置のＤ、７７位に相当する位置のＲ及び１８１位に相当する位置のＭから選択される少なくとも２つ（好ましくは３つ、より好ましくは４つ）のアミノ酸残基が３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、７７位に相当する位置ではＫ及び１８１位に相当する位置ではＬに置換される。より好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置のＲがＫに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３１位及び３２位に相当する位置のＦ及びＤがそれぞれＹ及びＧに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の７７位及び１８１位に相当する位置のＲ及びＭがそれぞれＫ及びＬに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位及び１８１位に相当する位置のＦ、Ｄ及びＭがそれぞれＹ、Ｇ及びＬに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、７７位及び１８１位に相当する位置のＦ、Ｄ、Ｒ及びＭがそれぞれＹ、Ｇ、Ｋ及びＬに置換される。
【0048】
親リパーゼの別の一例としては、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０又は８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、配列番号１６のアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．由来のリパーゼＰｓｐＬｉｐ２（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＷＰ＿０８８４２４９２８．１）である。配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも上記所定の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドである親リパーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にＡを有するもの、又は配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＶを有するものが好ましく、配列番号２のアミノ酸配列の９０位及び１８１位に相当する位置にそれぞれＡ及びＶを有するものがより好ましい。
【0049】
該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基がＣに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基がＬに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の９０位及び１８１位に相当する位置のアミノ酸残基がそれぞれＣ及びＬに置換される。
【0050】
該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、より具体的には、好ましくは、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のＡがＣに置換されるか、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のＶがＬに置換されるか、又は配列番号２のアミノ酸配列の９０位及び１８１位に相当する位置のＡ及びＶがそれぞれＣ及びＬに置換される。
【0051】
親リパーゼの別の一例としては、配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、配列番号１６のアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｂｉｅｔａｎｉｐｈｉｌａ由来のリパーゼＰａＬｉｐ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＷＰ＿０６２３８１４２２．１）である。配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドである親リパーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＭを有するものが好ましい。
【0052】
該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基がＹに置換される。
【0053】
該親リパーゼから本発明のリパーゼ変異体を製造する場合、より具体的には、該親リパーゼにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のＭがＹに置換される。
【0054】
本発明はまた、リパーゼ変異体を提供する。本発明のリパーゼ変異体は、親リパーゼのアミノ酸配列に対して、配列番号２を基準とした番号付けでの所定位置におけるアミノ酸残基が所定のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる、リパーゼ活性を有するポリペプチドである。
【0055】
本発明のリパーゼ変異体は、具体的には、下記（ａ）～（ｖ）及び（ａａ）～（ａｅ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体である。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置にＤを有するリパーゼ変異体；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にＣを有するリパーゼ変異体；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置にＡ、Ｔ、Ｈ又はＧを有するリパーゼ変異体；
（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置にＫを有するリパーゼ変異体；
（ｈ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置にＴを有するリパーゼ変異体；
（ｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置にＰを有するリパーゼ変異体；
（ｊ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｋ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｌ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｍ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｎ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｏ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置にＱを有するリパーゼ変異体；
（ｐ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｑ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｒ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置にＫを有するリパーゼ変異体；
（ｓ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｔ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にＣを有するリパーゼ変異体；
（ｕ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｖ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ａａ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、９０位に相当する位置におけるＣ、及び１８１位に相当する位置におけるＬから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｂ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２５位に相当する位置におけるＴ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｃ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＹ、３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、及び１８６位に相当する位置におけるＧから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｄ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、７７位に相当する位置におけるＫ、及び１８１位に相当する位置におけるＬから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｅ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるＣ及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置にＤを有するリパーゼ変異体；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にＣを有するリパーゼ変異体；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置にＡ、Ｔ、Ｈ又はＧを有するリパーゼ変異体；
（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置にＫを有するリパーゼ変異体；
（ｈ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置にＴを有するリパーゼ変異体；
（ｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置にＰを有するリパーゼ変異体；
（ｊ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｋ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｌ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｍ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｎ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｏ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置にＱを有するリパーゼ変異体；
（ｐ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｑ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｒ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置にＫを有するリパーゼ変異体；
（ｓ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｔ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にＣを有するリパーゼ変異体；
（ｕ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｖ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ａａ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、９０位に相当する位置におけるＣ、及び１８１位に相当する位置におけるＬから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｂ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２５位に相当する位置におけるＴ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｃ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＹ、３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、及び１８６位に相当する位置におけるＧから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｄ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、７７位に相当する位置におけるＫ、及び１８１位に相当する位置におけるＬから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｅ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるＣ及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体。
【0056】
リパーゼ変異体（ａ）～（ｖ）のうち、好ましいリパーゼ変異体は、リパーゼ変異体（ａ）、（ｃ）～（ｇ）、（ｉ）～（ｋ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｒ）及び（ｔ）～（ｖ）である。
【0057】
リパーゼ変異体（ａａ）は、好ましくは下記リパーゼ変異体（ａａ－１）～（ａａ－４）であり、リパーゼ変異体（ａｂ）は、好ましくは下記リパーゼ変異体（ａｂ－１）～（ａｂ－６）であり、リパーゼ変異体（ａｃ）は、好ましくは下記リパーゼ変異体（ａｃ－１）～（ａｃ－２）であり、リパーゼ変異体（ａｄ）は、好ましくは下記リパーゼ変異体（ａｄ－１）～（ａｄ－４）である。
（ａａ－１）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ及び３２位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－２）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるＣ及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－３）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置におけるＧ及び９０位に相当する位置におけるＣを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－４）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、９０位に相当する位置におけるＣ、及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－１）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置におけるＴ及び１２６位に相当する位置におけるＰを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－２）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ及び２９３位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－３）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置におけるＴ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－４）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２５位に相当する位置におけるＴ、及び１２６位に相当する位置におけるＰを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－５）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－６）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２５位に相当する位置におけるＴ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｃ－１）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＹ及び１８６位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｃ－２）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、又は配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＹ、３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、及び１８６位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－１）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ及び３２位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－２）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置におけるＫ及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－３）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－４）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、７７位に相当する位置におけるＫ、及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体。
（ａａ－１）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ及び３２位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－２）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるＣ及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－３）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置におけるＧ及び９０位に相当する位置におけるＣを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－４）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、９０位に相当する位置におけるＣ、及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－１）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置におけるＴ及び１２６位に相当する位置におけるＰを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－２）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ及び２９３位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－３）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置におけるＴ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－４）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２５位に相当する位置におけるＴ、及び１２６位に相当する位置におけるＰを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－５）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－６）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２５位に相当する位置におけるＴ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｃ－１）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＹ及び１８６位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｃ－２）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、又は配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＹ、３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、及び１８６位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－１）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ及び３２位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－２）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置におけるＫ及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－３）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－４）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、７７位に相当する位置におけるＫ、及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体。
【0058】
上述の所定位置のアミノ酸残基の置換は、リパーゼの異種発現性を向上させるための置換であり、したがって、本発明のリパーゼ変異体は、親リパーゼ、すなわち所定位置のアミノ酸残基の置換前のリパーゼと比して、異種における発現性が向上している。
【0059】
本発明のリパーゼ変異体において、アミノ酸残基の置換部位（変異位置）は、配列番号２を基準とした番号付けで示される。下記表１に、各親リパーゼについて、アミノ酸残基の置換部位を、該各親リパーゼのアミノ酸配列を基準とした番号付けと配列番号２のアミノ酸配列を基準とした番号付けとで示す。
【0060】
【表1】
【0061】
表１に示すように、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるアミノ酸残基のＹへの置換は、配列番号１０又は３４と少なくとも上記所定の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドを親リパーゼとする場合に共通する置換である。配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるアミノ酸残基のＹへの置換は、配列番号４、１０又は１４と少なくとも上記所定の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドを親リパーゼとする場合に共通する置換である。配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置におけるアミノ酸残基のＧへの置換は、配列番号４、１０又は１４と少なくとも上記所定の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドを親リパーゼとする場合に共通する置換である。配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるアミノ酸残基のＣへの置換は、配列番号４又は１６と少なくとも上記所定の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドを親リパーゼとする場合に共通する置換である。配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置におけるアミノ酸残基のＬへの置換は、配列番号４、１４又は１６と少なくとも上記所定の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドを親リパーゼとする場合に共通する置換である。
【0062】
本発明のリパーゼ変異体は、上記所定位置における変異に加えて、その異種発現性を妨げない限り、親リパーゼに対して他の任意の位置における変異（例えば、欠失、置換、付加、挿入）を有するものであってもよい。当該変異は、天然に生じたものであっても、人工的に導入したものであってもよい。
【0063】
＜２．本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド＞
本発明のリパーゼ変異体は、当技術分野で公知の各種の変異導入技術を使用して製造することができる。例えば、その基準アミノ酸配列をコードする親リパーゼ遺伝子（基準リパーゼ遺伝子）内の置換対象のアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドを、置換後のアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドに変異させ、更にその変異遺伝子から変異体を発現させることにより、製造することができる。
本発明のリパーゼ変異体は、当技術分野で公知の各種の変異導入技術を使用して製造することができる。例えば、その基準アミノ酸配列をコードする親リパーゼ遺伝子（基準リパーゼ遺伝子）内の置換対象のアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドを、置換後のアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドに変異させ、更にその変異遺伝子から変異体を発現させることにより、製造することができる。
【0064】
本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は人工核酸の形態であり得、あるいはｃＤＮＡ、又はイントロンを含まない化学合成ＤＮＡであり得る。
【0065】
本発明において、親リパーゼのアミノ酸残基を変異させる手段としては、当技術分野で公知の各種変異導入技術を使用することができる。例えば、親リパーゼのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（以下、親遺伝子ともいう）において、変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を、変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列に変異させることにより、本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
【0066】
親遺伝子への目的の変異の導入は、基本的には、当業者に周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法などの任意の手法により行うことができる。市販の部位特異的変異導入用キット（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ等）を使用することもできる。
【0067】
親遺伝子への部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異用プライマーを用いて行うことができる。該変異用プライマーは、親遺伝子における変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。変異前及び変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。あるいは、部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な２つのプライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：ｐ６１－６８）により１つに連結する方法を用いることもできる。
【0068】
親遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、上述したリパーゼを産生する微生物から、常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって、調製することができる。あるいは、親リパーゼのアミノ酸配列に基づいて、対応するヌクレオチド配列を化学合成して鋳型ＤＮＡとして用いてもよい。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び３４で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼをコードする塩基配列を含むＤＮＡ配列をそれぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５及び３３に示した。
【0069】
変異用プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ４ｅｓｅａｒｃｈ，１９８９，１７：７０５９－７０７１）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。そのようなプライマー合成は、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成装置（ＡＢＩ社製など）を用いて実施することもできる。該変異用プライマーを含むプライマーセットを使用し、親遺伝子を鋳型ＤＮＡとして上記のような部位特異的変異導入を行うことにより、目的の変異を有する本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
【0070】
当該本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖又は２本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡもしくは他の人工核酸を含み得る。該ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡは、化学合成されていてもよい。また当該ポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に加えて、非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。また当該ポリヌクレオチドは、本発明の変異ポリペプチド産生用の形質転換体の種にあわせて、コドン至適化されていてもよい。各種生物が使用するコドンの情報は、Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（[www.kazusa.or.jp/codon/]）から入手可能である。
【0071】
＜３．ベクター又はＤＮＡ断片＞
得られた本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドはベクターに組み込むことができる。当該ポリヌクレオチドを含有するベクターの種類としては、特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクターなどの任意のベクターであってよい。また該ベクターは、限定ではないが、好ましくは、細菌内、好ましくはバチルス属細菌（例えば枯草菌又はその変異株）内で増幅可能なベクターであり、より好ましくは、バチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターである。中でも、バチルス属細菌と他の生物のいずれでも複製可能なベクターであるシャトルベクターは、本発明のパーゼ変異体を組換え生産する上で好適に用いることができる。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＨＡ３０４０ＳＰ６４、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｊｐｎ Ｊ Ｇｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５－２４３）、ｐＡＣ３（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９８８，１６：８７３２）などのシャトルベクター；ｐＵＢ１１０（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８－３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８－１５）などのバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミドベクター、などが挙げられる。また大腸菌由来のプラスミドベクター（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ５７、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど）を用いることもできる。
得られた本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドはベクターに組み込むことができる。当該ポリヌクレオチドを含有するベクターの種類としては、特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクターなどの任意のベクターであってよい。また該ベクターは、限定ではないが、好ましくは、細菌内、好ましくはバチルス属細菌（例えば枯草菌又はその変異株）内で増幅可能なベクターであり、より好ましくは、バチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターである。中でも、バチルス属細菌と他の生物のいずれでも複製可能なベクターであるシャトルベクターは、本発明のパーゼ変異体を組換え生産する上で好適に用いることができる。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＨＡ３０４０ＳＰ６４、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｊｐｎ Ｊ Ｇｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５－２４３）、ｐＡＣ３（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９８８，１６：８７３２）などのシャトルベクター；ｐＵＢ１１０（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８－３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８－１５）などのバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミドベクター、などが挙げられる。また大腸菌由来のプラスミドベクター（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ５７、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど）を用いることもできる。
【0072】
上記ベクターは、ＤＮＡの複製開始領域又は複製起点を含むＤＮＡ領域を含み得る。あるいは、上記ベクターにおいては、本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド（すなわちリパーゼ変異体遺伝子）の上流に、該遺伝子の転写を開始させるためのプロモーター領域、ターミネーター領域、又は発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させるための分泌シグナル領域などの制御配列が作動可能に連結されていてもよい。
【0073】
上記プロモーター領域、ターミネーター領域、分泌シグナル領域などの制御配列の種類は、特に限定されず、導入する宿主に応じて、通常使用されるプロモーターや分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができる。例えば、ベクターに組み込むことができる制御配列の好適な例としては、Ｂａｃｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ－Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子のプロモーター、分泌シグナル配列などが挙げられる。
【0074】
あるいは、上記本発明のベクターには、該ベクターが適切に導入された宿主を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤の耐性遺伝子）がさらに組み込まれていてもよい。あるいは、宿主に栄養要求性株を使用する場合、要求される栄養の合成酵素をコードする遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。またあるいは、生育のために特定の代謝を必須とする選択培地を用いる場合、該代謝の関連遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。このような代謝関連遺伝子の例としては、アセトアミドを窒素源として利用するためのアセトアミダーゼ遺伝子が挙げられる。
【0075】
上記本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドと、制御配列及びマーカー遺伝子との連結は、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１－６８）などの当該分野で公知の方法によって行うことができる。連結した断片のベクターへの導入手順は、当該分野で周知である。
【0076】
＜４．形質転換細胞＞
本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主へ導入するか、又は本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を宿主のゲノムに導入することにより、本発明の形質転換細胞を得ることができる。
本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主へ導入するか、又は本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を宿主のゲノムに導入することにより、本発明の形質転換細胞を得ることができる。
【0077】
宿主細胞としては、細菌、糸状菌などの微生物が挙げられる。細菌の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌などが挙げられ、このうち、大腸菌及びバチルス属細菌が好ましく、バチルス属細菌がより好ましく、枯草菌（例えば、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）又はその変異株）がさらに好ましい。枯草菌変異株の例としては、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００７，１０４（２）：１３５－１４３に記載のプロテアーゼ９重欠損株ＫＡ８ＡＸ、ならびにＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２０１１，３３（９）：１８４７－１８５２に記載の、プロテアーゼ８重欠損株にタンパク質のフォールディング効率を向上させたＤ８ＰＡ株を挙げることができる。糸状菌の例としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス属（Ｒｉｚｈｏｐｕｓ）などが挙げられる。
【0078】
宿主へのベクターの導入の方法としては、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法などの当該分野で通常使用される方法を用いることができる。導入が適切に行われた株をマーカー遺伝子の発現、栄養要求性などを指標に選択することで、ベクターが導入された目的の形質転換体を得ることができる。
【0079】
あるいは、本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド、制御配列及びマーカー遺伝子を連結した断片を、宿主のゲノムに直接導入することもできる。例えば、ＳＯＥ－ＰＣＲ法などにより、上記連結断片の両端に宿主のゲノムと相補的な配列を付加したＤＮＡ断片を構築し、これを宿主に導入して、宿主ゲノムと該ＤＮＡ断片との間に相同組換えを起こさせることによって、本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドが宿主のゲノムに導入される。
【0080】
斯くして得られた、本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクターが導入された形質転換体を適切な培地で培養すれば、該ベクター上のタンパク質をコードする遺伝子が発現して本発明のリパーゼ変異体が生成される。当該形質転換体の培養に使用する培地は、当該形質転換体の微生物の種類にあわせて、当業者が適宜選択することができる。
【0081】
あるいは、本発明のリパーゼ変異体は、無細胞翻訳系を使用して本発明のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸などの試薬を加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。
【0082】
上記培養物又は無細胞翻訳系にて生成された本発明のリパーゼ変異体は、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、単離又は精製することができる。培養物から回収されたタンパク質は、公知の手段でさらに精製されてもよい。
【0083】
＜５．リパーゼの異種発現性の向上方法＞
斯くして得られる本発明のリパーゼ変異体は、親リパーゼと比して、異種発現性が向上している。
「異種発現性の向上」とは、親リパーゼが由来する生物種と異なる生物種にて発現させた場合の発現量が親リパーゼより増加していることを意味する。ここで、異種とは、親リパーゼが由来する生物種と異なる生物種であれば特に制限されないが、タンパク質発現系に広く用いられる微生物が好ましく、大腸菌又はバチルス属細菌がより好ましく、バチルス属細菌がさらに好ましく、枯草菌がさらに好ましい。本発明のリパーゼ変異体の発現量は、当業者に公知のタンパク質の発現量の測定方法により測定してもよいし、該リパーゼ変異体のリパーゼ活性を指標として測定してもよい。本発明のリパーゼ変異体の異種発現性（異種におけるリパーゼ変異体発現量）は、親リパーゼに対して、好ましくは１３０％以上、より好ましくは１５０％以上であり得る。
斯くして得られる本発明のリパーゼ変異体は、親リパーゼと比して、異種発現性が向上している。
「異種発現性の向上」とは、親リパーゼが由来する生物種と異なる生物種にて発現させた場合の発現量が親リパーゼより増加していることを意味する。ここで、異種とは、親リパーゼが由来する生物種と異なる生物種であれば特に制限されないが、タンパク質発現系に広く用いられる微生物が好ましく、大腸菌又はバチルス属細菌がより好ましく、バチルス属細菌がさらに好ましく、枯草菌がさらに好ましい。本発明のリパーゼ変異体の発現量は、当業者に公知のタンパク質の発現量の測定方法により測定してもよいし、該リパーゼ変異体のリパーゼ活性を指標として測定してもよい。本発明のリパーゼ変異体の異種発現性（異種におけるリパーゼ変異体発現量）は、親リパーゼに対して、好ましくは１３０％以上、より好ましくは１５０％以上であり得る。
【0084】
したがって、別の一態様において、本発明は、リパーゼの異種発現性の向上方法を提供する。当該本発明の方法は、親リパーゼにおいて、配列番号２を基準とした番号付けでの所定位置におけるアミノ酸残基を所定のアミノ酸残基に置換することを含む。当該方法の詳細は、上述した本発明のリパーゼ変異体の製造方法と同様である。
【0085】
＜６．リパーゼ変異体の用途＞
リパーゼは、エステル加水分解反に加え、エステル合成反応、エステル交換反応、アシドリシスなど様々な反応を触媒する。この反応性を利用して、洗浄、光学分割、バイオ燃料製造、油脂加工、廃水処理、パルプ製造、レザー製造など様々な産業用途でリパーゼが利用されている。本発明のリパーゼ変異体は、親リパーゼと比して、異種発現性が向上しているため、異種発現により工業的に有利に大量に製造することが可能となり、斯かる産業用途に好適に使用することができる。また本発明のリパーゼ変異体配列群は配列が多様であり様々な異なる特性を有することから、基質や用途に応じた好適なリパーゼの探索に使用することができる。よって、本発明のリパーゼ変異体は、洗浄剤、光学分割剤、エステル合成用触媒、油脂加工用触媒、廃水処理剤、パルプ処理剤、皮革処理剤などとなり得、好ましくは洗浄剤となり得る。洗浄剤としては、衣料洗浄剤、食器洗浄剤、漂白剤、硬質表面洗浄用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、医療器具用の殺菌洗浄剤などが挙げられる。
リパーゼは、エステル加水分解反に加え、エステル合成反応、エステル交換反応、アシドリシスなど様々な反応を触媒する。この反応性を利用して、洗浄、光学分割、バイオ燃料製造、油脂加工、廃水処理、パルプ製造、レザー製造など様々な産業用途でリパーゼが利用されている。本発明のリパーゼ変異体は、親リパーゼと比して、異種発現性が向上しているため、異種発現により工業的に有利に大量に製造することが可能となり、斯かる産業用途に好適に使用することができる。また本発明のリパーゼ変異体配列群は配列が多様であり様々な異なる特性を有することから、基質や用途に応じた好適なリパーゼの探索に使用することができる。よって、本発明のリパーゼ変異体は、洗浄剤、光学分割剤、エステル合成用触媒、油脂加工用触媒、廃水処理剤、パルプ処理剤、皮革処理剤などとなり得、好ましくは洗浄剤となり得る。洗浄剤としては、衣料洗浄剤、食器洗浄剤、漂白剤、硬質表面洗浄用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、医療器具用の殺菌洗浄剤などが挙げられる。
【0086】
上記剤は、本発明のリパーゼ変異体単体であってもよく、また、これを含有する酵素組成物であってもよい。斯かる酵素組成物は、粉末等の固形組成物であっても液体組成物であってもよい。
【0087】
本発明のリパーゼ変異体を含有する酵素組成物には、リパーゼ変異体に加えて、不活性担体、ｐＨ調整剤、分散剤、緩衝剤、防腐剤等の任意の添加剤を適宜配合することができる。酵素組成物に含まれるリパーゼ変異体は、１種であっても２種以上の組み合わせであってもよい。
【0088】
本発明の酵素組成物における本発明のリパーゼ変異体の含有量は、当該リパーゼ変異体が活性を示す量であれば特に制限されないが、例えば、酵素組成物１ｋｇ当たり好ましくは０．１ｍｇ以上、より好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは５ｍｇ以上であり、且つ好ましくは５００００ｍｇ以下、より好ましくは５０００ｍｇ以下、より好ましくは５００ｍｇ以下である。また０．１～５００００ｍｇであるのが好ましく、１～５０００ｍｇであるのがより好ましく、５～５００ｍｇであるのがより好ましい。
【0089】
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞下記（ａ）～（ｖ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置にＤを有するリパーゼ変異体；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にＣを有するリパーゼ変異体；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置にＡ、Ｔ、Ｈ又はＧを有するリパーゼ変異体；
（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置にＫを有するリパーゼ変異体；
（ｈ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置にＴを有するリパーゼ変異体；
（ｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置にＰを有するリパーゼ変異体；
（ｊ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｋ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｌ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｍ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｎ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｏ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置にＱを有するリパーゼ変異体；
（ｐ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｑ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｒ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置にＫを有するリパーゼ変異体；
（ｓ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｔ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にＣを有するリパーゼ変異体；
（ｕ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｖ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体。
＜２＞下記（ａａ）～（ａｅ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体：
（ａａ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、９０位に相当する位置におけるＣ、及び１８１位に相当する位置におけるＬから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｂ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２５位に相当する位置におけるＴ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｃ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＹ、３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、及び１８６位に相当する位置におけるＧから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｄ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、７７位に相当する位置におけるＫ、及び１８１位に相当する位置におけるＬから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｅ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるＣ及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体。
＜３＞上記（ａ）、（ｃ）～（ｇ）、（ｉ）～（ｋ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｒ）及び（ｔ）～（ｖ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体である、＜１＞に記載のリパーゼ変異体。
＜４＞下記（ａａ－１）～（ａｅ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体である、＜２＞に記載のリパーゼ変異体：
（ａａ－１）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ及び３２位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－２）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるＣ及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－３）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置におけるＧ及び９０位に相当する位置におけるＣを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－４）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、９０位に相当する位置におけるＣ、及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－１）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置におけるＴ及び１２６位に相当する位置におけるＰを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－２）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ及び２９３位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－３）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置におけるＴ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－４）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２５位に相当する位置におけるＴ、及び１２６位に相当する位置におけるＰを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－５）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－６）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２５位に相当する位置におけるＴ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｃ－１）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＹ及び１８６位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｃ－２）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、又は配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＹ、３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、及び１８６位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－１）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ及び３２位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－２）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置におけるＫ及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－３）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－４）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、７７位に相当する位置におけるＫ、及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａｅ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるシステイン及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体。
＜５＞＜１＞～＜４＞のいずれか１項に記載のリパーゼ変異体を含有する、酵素組成物。
＜６＞洗浄剤、光学分割剤、エステル合成用触媒、油脂加工用触媒、廃水処理剤、パルプ処理剤、又は皮革処理剤であり、好ましくは洗浄剤である、＜５＞記載の酵素組成物。
＜１＞下記（ａ）～（ｖ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置にＤを有するリパーゼ変異体；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にＣを有するリパーゼ変異体；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置にＡ、Ｔ、Ｈ又はＧを有するリパーゼ変異体；
（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置にＫを有するリパーゼ変異体；
（ｈ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置にＴを有するリパーゼ変異体；
（ｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置にＰを有するリパーゼ変異体；
（ｊ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｋ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｌ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｍ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｎ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｏ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置にＱを有するリパーゼ変異体；
（ｐ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体；
（ｑ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置にＧを有するリパーゼ変異体；
（ｒ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置にＫを有するリパーゼ変異体；
（ｓ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｔ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置にＣを有するリパーゼ変異体；
（ｕ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置にＬを有するリパーゼ変異体；
（ｖ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＹを有するリパーゼ変異体。
＜２＞下記（ａａ）～（ａｅ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体：
（ａａ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、９０位に相当する位置におけるＣ、及び１８１位に相当する位置におけるＬから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｂ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２５位に相当する位置におけるＴ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｃ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＹ、３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、及び１８６位に相当する位置におけるＧから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｄ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、７７位に相当する位置におけるＫ、及び１８１位に相当する位置におけるＬから選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基を有するリパーゼ変異体；
（ａｅ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるＣ及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体。
＜３＞上記（ａ）、（ｃ）～（ｇ）、（ｉ）～（ｋ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｒ）及び（ｔ）～（ｖ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体である、＜１＞に記載のリパーゼ変異体。
＜４＞下記（ａａ－１）～（ａｅ）から選択されるいずれかのリパーゼ変異体である、＜２＞に記載のリパーゼ変異体：
（ａａ－１）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ及び３２位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－２）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるＣ及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－３）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置におけるＧ及び９０位に相当する位置におけるＣを有するリパーゼ変異体；
（ａａ－４）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、９０位に相当する位置におけるＣ、及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－１）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置におけるＴ及び１２６位に相当する位置におけるＰを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－２）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ及び２９３位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－３）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置におけるＴ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－４）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２５位に相当する位置におけるＴ、及び１２６位に相当する位置におけるＰを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－５）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｂ－６）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置におけるＫ、１２５位に相当する位置におけるＴ、１２６位に相当する位置におけるＰ、及び２９３位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｃ－１）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＹ及び１８６位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｃ－２）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、又は配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＹ、３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、及び１８６位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－１）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ及び３２位に相当する位置におけるＧを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－２）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置におけるＫ及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－３）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａｄ－４）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置におけるＹ、３２位に相当する位置におけるＧ、７７位に相当する位置におけるＫ、及び１８１位に相当する位置におけるＬを有するリパーゼ変異体；
（ａｅ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置におけるシステイン及び１８１位に相当する位置におけるロイシンを有するリパーゼ変異体。
＜５＞＜１＞～＜４＞のいずれか１項に記載のリパーゼ変異体を含有する、酵素組成物。
＜６＞洗浄剤、光学分割剤、エステル合成用触媒、油脂加工用触媒、廃水処理剤、パルプ処理剤、又は皮革処理剤であり、好ましくは洗浄剤である、＜５＞記載の酵素組成物。
【0090】
＜７＞＜１＞～＜４＞のいずれか１項に記載のリパーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
＜８＞＜７＞に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
＜９＞＜７＞に記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
＜１０＞微生物である、＜９＞に記載の形質転換細胞。
＜１１＞大腸菌又はバチルス属細菌であり、好ましくはバチルス属細菌であり、より好ましくは枯草菌である、＜１０＞に記載の形質転換細胞。
＜１２＞＜９＞～＜１１＞のいずれか１項に記載の形質転換細胞を培養する工程を含む、リパーゼ変異体の製造方法。
＜８＞＜７＞に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
＜９＞＜７＞に記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
＜１０＞微生物である、＜９＞に記載の形質転換細胞。
＜１１＞大腸菌又はバチルス属細菌であり、好ましくはバチルス属細菌であり、より好ましくは枯草菌である、＜１０＞に記載の形質転換細胞。
＜１２＞＜９＞～＜１１＞のいずれか１項に記載の形質転換細胞を培養する工程を含む、リパーゼ変異体の製造方法。
【0091】
＜１３＞下記（ｉ）～（ｘｘｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼ変異体の製造方法：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置のアミノ酸残基をＤに置換する工程；
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換する工程；
（ｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置のアミノ酸残基をＡ、Ｔ、Ｈ又はＧに置換する工程；
（ｖｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換する工程；
（ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置のアミノ酸残基をＴに置換する工程；
（ｉｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をＰに置換する工程；
（ｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｘｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｘｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｉｖ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｖ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置のアミノ酸残基をＱに置換する工程；
（ｘｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｘｖｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換する工程；
（ｘｉｘ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換する工程；
（ｘｘｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程。
＜１４＞下記（ｘｘｉｉｉ）～（ｘｘｖｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼ変異体の製造方法：
（ｘｘｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、９０位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、９０位に相当する位置ではＣ、及び１８１位に相当する位置ではＬに置換する工程；
（ｘｘｉｖ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３９位に相当する位置ではＫ、１２５位に相当する位置ではＴ、１２６位に相当する位置ではＰ、及び２９３位に相当する位置ではＧに置換する工程；
（ｘｘｖ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位、３１位、３２位及び１８６位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を２９位に相当する位置ではＹ、３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、及び１８６位に相当する位置ではＧに置換する工程；
（ｘｘｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、７７位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、７７位に相当する位置ではＫ、及び１８１位に相当する位置ではＬに置換する工程；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程。
＜１５＞上記（ｉ）～（ｘｘｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼの異種発現性の向上方法。
＜１６＞上記（ｘｘｉｉｉ）～（ｘｘｖｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼの異種発現性の向上方法。
＜１７＞工程が上記（ｉ）、（ｉｉｉ）～（ｖｉｉ）、（ｉｘ）～（ｘｉ）、（ｘｉｖ）、（ｘｖ）、（ｘｖｉｉｉ）及び（ｘｘ）～（ｘｘｉｉ）から選択されるいずれかの工程である、＜１３＞又は＜１５＞に記載の方法。
＜１８＞工程が下記（ｘｘｉｉｉ－１）～（ｘｘｖｉｉ）から選択されるいずれかの工程である、＜１４＞又は＜１６＞に記載の方法：
（ｘｘｉｉｉ－１）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換し、かつ３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｘｉｉｉ－２）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘｉｉｉ－３）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換し、かつ９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換する工程；
（ｘｘｉｉｉ－４）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換し、３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換し、９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘｉｖ－１）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置のアミノ酸残基をＴに置換し、かつ１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をＰに置換する工程；
（ｘｘｉｖ－２）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換し、かつ２９３位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｘｉｖ－３）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置のアミノ酸残基をＴに置換し、１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をＰに置換し、かつ２９３位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｘｉｖ－４）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換し、１２５位に相当する位置のアミノ酸残基をＴに置換し、かつ１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をＰに置換する工程；
（ｘｘｉｖ－５）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換し、１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をＰに置換し、かつ２９３位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｘｉｖ－６）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換し、１２５位に相当する位置のアミノ酸残基をＴに置換し、１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をＰに置換し、かつ２９３位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｘｖ－１）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換し、かつ１８６位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｘｖ－２）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換し、３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換し、３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換し、かつ１８６位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｘｖｉ－１）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換し、かつ３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｘｖｉ－２）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘｖｉ－３）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換し、３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘｖｉ－４）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換し、３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換し、７７位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程。
＜１９＞リパーゼ変異体が、親リパーゼに比べて異種発現性が向上している、＜１３＞～＜１８＞のいずれか１項に記載の方法。
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１１８位に相当する位置のアミノ酸残基をＤに置換する工程；
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換する工程；
（ｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２２２位に相当する位置のアミノ酸残基をＡ、Ｔ、Ｈ又はＧに置換する工程；
（ｖｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換する工程；
（ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置のアミノ酸残基をＴに置換する工程；
（ｉｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をＰに置換する工程；
（ｘ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９３位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｘｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｘｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｉｖ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８６位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｖ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２０６位に相当する位置のアミノ酸残基をＱに置換する工程；
（ｘｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程；
（ｘｖｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換する工程；
（ｘｉｘ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換する工程；
（ｘｘｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換する工程。
＜１４＞下記（ｘｘｉｉｉ）～（ｘｘｖｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼ変異体の製造方法：
（ｘｘｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、９０位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、９０位に相当する位置ではＣ、及び１８１位に相当する位置ではＬに置換する工程；
（ｘｘｉｖ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位、１２５位、１２６位及び２９３位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３９位に相当する位置ではＫ、１２５位に相当する位置ではＴ、１２６位に相当する位置ではＰ、及び２９３位に相当する位置ではＧに置換する工程；
（ｘｘｖ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位、３１位、３２位及び１８６位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を２９位に相当する位置ではＹ、３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、及び１８６位に相当する位置ではＧに置換する工程；
（ｘｘｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位、３２位、７７位及び１８１位に相当する位置から選択される少なくとも２つの位置のアミノ酸残基を３１位に相当する位置ではＹ、３２位に相当する位置ではＧ、７７位に相当する位置ではＫ、及び１８１位に相当する位置ではＬに置換する工程；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程。
＜１５＞上記（ｉ）～（ｘｘｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼの異種発現性の向上方法。
＜１６＞上記（ｘｘｉｉｉ）～（ｘｘｖｉｉ）から選択されるいずれかの工程を含む、リパーゼの異種発現性の向上方法。
＜１７＞工程が上記（ｉ）、（ｉｉｉ）～（ｖｉｉ）、（ｉｘ）～（ｘｉ）、（ｘｉｖ）、（ｘｖ）、（ｘｖｉｉｉ）及び（ｘｘ）～（ｘｘｉｉ）から選択されるいずれかの工程である、＜１３＞又は＜１５＞に記載の方法。
＜１８＞工程が下記（ｘｘｉｉｉ－１）～（ｘｘｖｉｉ）から選択されるいずれかの工程である、＜１４＞又は＜１６＞に記載の方法：
（ｘｘｉｉｉ－１）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換し、かつ３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｘｉｉｉ－２）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘｉｉｉ－３）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換し、かつ９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換する工程；
（ｘｘｉｉｉ－４）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換し、３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換し、９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘｉｖ－１）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置のアミノ酸残基をＴに置換し、かつ１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をＰに置換する工程；
（ｘｘｉｖ－２）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換し、かつ２９３位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｘｉｖ－３）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の１２５位に相当する位置のアミノ酸残基をＴに置換し、１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をＰに置換し、かつ２９３位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｘｉｖ－４）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換し、１２５位に相当する位置のアミノ酸残基をＴに置換し、かつ１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をＰに置換する工程；
（ｘｘｉｖ－５）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換し、１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をＰに置換し、かつ２９３位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｘｉｖ－６）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３９位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換し、１２５位に相当する位置のアミノ酸残基をＴに置換し、１２６位に相当する位置のアミノ酸残基をＰに置換し、かつ２９３位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｘｖ－１）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換し、かつ１８６位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｘｖ－２）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の２９位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換し、３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換し、３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換し、かつ１８６位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｘｖｉ－１）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換し、かつ３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換する工程；
（ｘｘｖｉ－２）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の７７位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘｖｉ－３）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換し、３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘｖｉ－４）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の３１位に相当する位置のアミノ酸残基をＹに置換し、３２位に相当する位置のアミノ酸残基をＧに置換し、７７位に相当する位置のアミノ酸残基をＫに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の９０位に相当する位置のアミノ酸残基をＣに置換し、かつ１８１位に相当する位置のアミノ酸残基をＬに置換する工程。
＜１９＞リパーゼ変異体が、親リパーゼに比べて異種発現性が向上している、＜１３＞～＜１８＞のいずれか１項に記載の方法。
【実施例0092】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0093】
（１）リパーゼ発現プラスミドの構築
リパーゼ発現プラスミドは、ＷＯ２０２１／１５３１２９に記載の枯草菌ｓｐｏＶＧ遺伝子由来プロモーターを含む配列番号２６のＶＨＨの発現用プラスミドを鋳型として構築した。上記プラスミドのＶＨＨ遺伝子を含むＯＲＦ全長に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応によって各リパーゼ遺伝子を載せ替えることで構築した。人工遺伝子合成したリパーゼ遺伝子ＳｓｐＬｉｐ、ＰｆＬｉｐ、ＥｔＬｉｐ、ＹｅＬｉｐ、ＡｎＬｉｐ、ＹｆＬｉｐ、ＰｓｐＬｉｐ、ＰｓｐＬｉｐ２、ＳａＬｉｐ、ＢｂＬｉｐ、ＥｓｐＬｉｐ、ＡｓｐＬｉｐ、ＹｅＬｉｐ２、ＹｍＬｉｐ、ＥｓｐＬｉｐ２、ＭｉＬｉｐ、ＰａＬｉｐ（それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１及び３３のポリヌクレオチド、それぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２及び３４のアミノ酸配列をコードする）から、それぞれプラスミドｐＨＹ－ＳｓｐＬｉｐ、ｐＨＹ－ＰｆＬｉｐ、ｐＨＹ－ＥｔＬｉｐ、ｐＨＹ－ＹｅＬｉｐ、ｐＨＹ－ＡｎＬｉｐ、ｐＨＹ－ＹｆＬｉｐ、ｐＨＹ－ＰｓｐＬｉｐ、ｐＨＹ－ＰｓｐＬｉｐ２、ｐＨＹ－ＳａＬｉｐ、ｐＨＹ－ＢｂＬｉｐ、ｐＨＹ－ＥｓｐＬｉｐ、ｐＨＹ－ＡｓｐＬｉｐ、ｐＨＹ－ＹｅＬｉｐ２、ｐＨＹ－ＹｍＬｉｐ、ｐＨＹ－ＥｓｐＬｉｐ２、ｐＨＹ－ＭｉＬｉｐ、ｐＨＹ－ＰａＬｉｐを構築した。各リパーゼへの変異導入は、相補的プライマー対を用いたＰＣＲによる部位特異的導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，３２（１４）：ｅ１１５参照）によって行った。各リパーゼに導入した変異と変異導入位置（各親酵素を基準とした位置と配列番号２を基準とした位置）を表２に示す。尚、以下の実施例においては、各リパーゼの変異導入位置はそれぞれの親酵素を基準とした位置で示す。
リパーゼ発現プラスミドは、ＷＯ２０２１／１５３１２９に記載の枯草菌ｓｐｏＶＧ遺伝子由来プロモーターを含む配列番号２６のＶＨＨの発現用プラスミドを鋳型として構築した。上記プラスミドのＶＨＨ遺伝子を含むＯＲＦ全長に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応によって各リパーゼ遺伝子を載せ替えることで構築した。人工遺伝子合成したリパーゼ遺伝子ＳｓｐＬｉｐ、ＰｆＬｉｐ、ＥｔＬｉｐ、ＹｅＬｉｐ、ＡｎＬｉｐ、ＹｆＬｉｐ、ＰｓｐＬｉｐ、ＰｓｐＬｉｐ２、ＳａＬｉｐ、ＢｂＬｉｐ、ＥｓｐＬｉｐ、ＡｓｐＬｉｐ、ＹｅＬｉｐ２、ＹｍＬｉｐ、ＥｓｐＬｉｐ２、ＭｉＬｉｐ、ＰａＬｉｐ（それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１及び３３のポリヌクレオチド、それぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２及び３４のアミノ酸配列をコードする）から、それぞれプラスミドｐＨＹ－ＳｓｐＬｉｐ、ｐＨＹ－ＰｆＬｉｐ、ｐＨＹ－ＥｔＬｉｐ、ｐＨＹ－ＹｅＬｉｐ、ｐＨＹ－ＡｎＬｉｐ、ｐＨＹ－ＹｆＬｉｐ、ｐＨＹ－ＰｓｐＬｉｐ、ｐＨＹ－ＰｓｐＬｉｐ２、ｐＨＹ－ＳａＬｉｐ、ｐＨＹ－ＢｂＬｉｐ、ｐＨＹ－ＥｓｐＬｉｐ、ｐＨＹ－ＡｓｐＬｉｐ、ｐＨＹ－ＹｅＬｉｐ２、ｐＨＹ－ＹｍＬｉｐ、ｐＨＹ－ＥｓｐＬｉｐ２、ｐＨＹ－ＭｉＬｉｐ、ｐＨＹ－ＰａＬｉｐを構築した。各リパーゼへの変異導入は、相補的プライマー対を用いたＰＣＲによる部位特異的導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，３２（１４）：ｅ１１５参照）によって行った。各リパーゼに導入した変異と変異導入位置（各親酵素を基準とした位置と配列番号２を基準とした位置）を表２に示す。尚、以下の実施例においては、各リパーゼの変異導入位置はそれぞれの親酵素を基準とした位置で示す。
【0094】
【表2】
【0095】
（２）野生型リパーゼの発現性評価
Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属する多様な１６配列（ＳｓｐＬｉｐ、ＰｆＬｉｐ、ＥｔＬｉｐ、ＹｅＬｉｐ、ＡｎＬｉｐ、ＹｆＬｉｐ、ＰｓｐＬｉｐ、ＰｓｐＬｉｐ２、ＳａＬｉｐ、ＢｂＬｉｐ、ＥｓｐＬｉｐ、ＡｓｐＬｉｐ、ＹｅＬｉｐ２、ＹｍＬｉｐ、ＥｓｐＬｉｐ２、ＭｉＬｉｐ（それぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０及び３２））を公共データベースから選定し、異種発現性を評価した。（１）で得た野生型リパーゼ発現プラスミドまたは空ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（ＴａＫａＲａ）を枯草菌Ｄｐｒ９株（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｉｅｓ ２０．１（２０２１）：１－１３．参照）にプロトプラスト法によって導入し、２×Ｌ－マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン五水和物、０．０４％塩化カルシウム二水和物、１０ｐｐｍテトラサイクリン；％は（ｗ／ｖ）％）で、３０℃、３日間培養した後、培養上清を遠心分離により回収した。培養上清を１００ｍＭ ＤＴＴを含む２×Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と等容量で混合し、１００℃で３分間インキュベートした。各サンプルをＡｎｙ ｋＤＴＭ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標） ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－ＦｒｅｅＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にアプライした後、２００Ｖの定電圧で電気泳動を行った。Ｃｈｅｍｉ Ｄｏｃ ＭＰ Ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて泳動後のゲルを撮影した。
空ベクターと比較して、リパーゼの分子量近傍に明確なバンドが確認できたものを”〇”、わずかにバンドが確認できたものを”△”、バンドが確認できなかったものを”－”で表３に示す。検証した１６配列のうち、明確なリパーゼのバンドが確認できたのは３配列のみであったことから、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードのリパーゼにおいて、異種大量発現可能な配列の多様性が小さいという課題があることを見出した。
Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属する多様な１６配列（ＳｓｐＬｉｐ、ＰｆＬｉｐ、ＥｔＬｉｐ、ＹｅＬｉｐ、ＡｎＬｉｐ、ＹｆＬｉｐ、ＰｓｐＬｉｐ、ＰｓｐＬｉｐ２、ＳａＬｉｐ、ＢｂＬｉｐ、ＥｓｐＬｉｐ、ＡｓｐＬｉｐ、ＹｅＬｉｐ２、ＹｍＬｉｐ、ＥｓｐＬｉｐ２、ＭｉＬｉｐ（それぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０及び３２））を公共データベースから選定し、異種発現性を評価した。（１）で得た野生型リパーゼ発現プラスミドまたは空ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（ＴａＫａＲａ）を枯草菌Ｄｐｒ９株（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｉｅｓ ２０．１（２０２１）：１－１３．参照）にプロトプラスト法によって導入し、２×Ｌ－マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン五水和物、０．０４％塩化カルシウム二水和物、１０ｐｐｍテトラサイクリン；％は（ｗ／ｖ）％）で、３０℃、３日間培養した後、培養上清を遠心分離により回収した。培養上清を１００ｍＭ ＤＴＴを含む２×Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と等容量で混合し、１００℃で３分間インキュベートした。各サンプルをＡｎｙ ｋＤＴＭ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標） ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－ＦｒｅｅＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にアプライした後、２００Ｖの定電圧で電気泳動を行った。Ｃｈｅｍｉ Ｄｏｃ ＭＰ Ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて泳動後のゲルを撮影した。
空ベクターと比較して、リパーゼの分子量近傍に明確なバンドが確認できたものを”〇”、わずかにバンドが確認できたものを”△”、バンドが確認できなかったものを”－”で表３に示す。検証した１６配列のうち、明確なリパーゼのバンドが確認できたのは３配列のみであったことから、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードのリパーゼにおいて、異種大量発現可能な配列の多様性が小さいという課題があることを見出した。
【0096】
【表3】
【0097】
（３）リパーゼ変異体の発現性評価
（２）と同様の手法でリパーゼ変異体の異種発現を行った。リパーゼＰＳアマノＳＤ（富士フイルム和光純薬）を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に溶解し、ＤＣプロテインアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でＢＳＡを標準として濃度を測定した。濃度既知のリパーゼＰＳアマノＳＤと共に培養上清を（２）と同様の手法でＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。リパーゼＰＳアマノＳＤを標準として、バンド強度から培養上清中のリパーゼ濃度を定量した（表４）。Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードの様々なリパーゼについて、部位特異的改変により異種発現性が大幅に改善した。
（２）と同様の手法でリパーゼ変異体の異種発現を行った。リパーゼＰＳアマノＳＤ（富士フイルム和光純薬）を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に溶解し、ＤＣプロテインアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でＢＳＡを標準として濃度を測定した。濃度既知のリパーゼＰＳアマノＳＤと共に培養上清を（２）と同様の手法でＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。リパーゼＰＳアマノＳＤを標準として、バンド強度から培養上清中のリパーゼ濃度を定量した（表４）。Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードの様々なリパーゼについて、部位特異的改変により異種発現性が大幅に改善した。
【0098】
【表4】
【0099】
（４）配列同一性の計算
異種発現性が大幅に向上した変異体（ＳｓｐＬｉｐ Ｅ１１８Ｄ、ＰｆＬｉｐ Ｆ３０Ｙ Ｅ３１Ｇ Ａ８９Ｃ Ｖ１８０Ｌ、ＥｔＬｉｐ Ｉ２２２Ｇ、ＹｅＬｉｐ Ｖ３８Ｋ Ｖ１２４Ｔ Ｅ１２５Ｐ Ｓ２９２Ｇ、ＡｎＬｉｐ Ｃ２４Ｙ Ｆ２６Ｙ Ａ２７Ｇ Ｒ１８１Ｇ、ＹｆＬｉｐ Ｇ２０６Ｑ、ＰｓｐＬｉｐ Ｆ３０Ｙ Ｄ３１Ｇ Ｒ７６Ｋ Ｍ１７９Ｌ、ＰｓｐＬｉｐ２ Ａ８９Ｃ Ｖ１８０Ｌ）間の配列同一性を、Ｇｅｎｅｔｙｘを用いて計算した（表５）。これらの変異体は、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードのリパーゼにおいて、異種大量発現可能な配列の多様性を大幅に拡張した。
異種発現性が大幅に向上した変異体（ＳｓｐＬｉｐ Ｅ１１８Ｄ、ＰｆＬｉｐ Ｆ３０Ｙ Ｅ３１Ｇ Ａ８９Ｃ Ｖ１８０Ｌ、ＥｔＬｉｐ Ｉ２２２Ｇ、ＹｅＬｉｐ Ｖ３８Ｋ Ｖ１２４Ｔ Ｅ１２５Ｐ Ｓ２９２Ｇ、ＡｎＬｉｐ Ｃ２４Ｙ Ｆ２６Ｙ Ａ２７Ｇ Ｒ１８１Ｇ、ＹｆＬｉｐ Ｇ２０６Ｑ、ＰｓｐＬｉｐ Ｆ３０Ｙ Ｄ３１Ｇ Ｒ７６Ｋ Ｍ１７９Ｌ、ＰｓｐＬｉｐ２ Ａ８９Ｃ Ｖ１８０Ｌ）間の配列同一性を、Ｇｅｎｅｔｙｘを用いて計算した（表５）。これらの変異体は、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードのリパーゼにおいて、異種大量発現可能な配列の多様性を大幅に拡張した。
【0100】
【表5】
【0101】
（５）ＰａＬｉｐ変異体の発現性評価
Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードのリパーゼと近縁のリパーゼであるＰａＬｉｐ（配列番号３４）について、（２）と同様の手法で異種発現を行った。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で１００倍に希釈した培養上清２μＬと基質溶液１００μＬを９６穴アッセイプレートの各ウェルで混合し、３０℃で４０５ｎｍの吸光度変化（ＯＤ／ｍｉｎ）を測定した。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中の２ｍＭ オクタン酸４－ニトロフェニルを基質溶液として用いた。野生型ＰａＬｉｐでは培養上清中にエステラーゼ活性が検出されず活性型リパーゼは異種発現されていないと考えられたが、ＰａＬｉｐ Ｍ２８Ｙ変異体では培養上清中にリパーゼに由来するエステラーゼ活性が検出された（図１）。
Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードのリパーゼと近縁のリパーゼであるＰａＬｉｐ（配列番号３４）について、（２）と同様の手法で異種発現を行った。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で１００倍に希釈した培養上清２μＬと基質溶液１００μＬを９６穴アッセイプレートの各ウェルで混合し、３０℃で４０５ｎｍの吸光度変化（ＯＤ／ｍｉｎ）を測定した。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中の２ｍＭ オクタン酸４－ニトロフェニルを基質溶液として用いた。野生型ＰａＬｉｐでは培養上清中にエステラーゼ活性が検出されず活性型リパーゼは異種発現されていないと考えられたが、ＰａＬｉｐ Ｍ２８Ｙ変異体では培養上清中にリパーゼに由来するエステラーゼ活性が検出された（図１）。
【図1】
【配列表】