特開 2024-44416 勾配光干渉顕微鏡

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024044416

(43)【公開日】2024-04-02

(54)【発明の名称】勾配光干渉顕微鏡

(51)【国際特許分類】

   G02B 21/00 20060101AFI20240326BHJP

   G02B 21/18 20060101ALI20240326BHJP

【ＦＩ】

G02B21/00

G02B21/18

【審査請求】未請求

【請求項の数】7

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022149919

(22)【出願日】2022-09-21

(71)【出願人】

【識別番号】000207551

【氏名又は名称】株式会社ＳＣＲＥＥＮホールディングス

(74)【代理人】

【識別番号】100135013

【弁理士】

【氏名又は名称】西田 隆美

(72)【発明者】

【氏名】仁坂 健一

(72)【発明者】

【氏名】大西 葵

【テーマコード（参考）】

2H052

【Ｆターム（参考）】

2H052AA03

2H052AA04

2H052AC05

2H052AC10

2H052AC31

2H052AD34

2H052AF14

(57)【要約】      （修正有）

【課題】勾配光干渉顕微法において、撮像時間を短縮する技術を提供する。
【解決手段】この勾配光干渉顕微鏡１は、光源２０からサンプル配置位置４０へ光を入射させる入射経路３０と、サンプル配置位置４０から出射される透過光または反射光を撮像素子６０へ入射させる出射経路５０とを含む。入射経路３０は順に、入射光を直交する第１偏光波および第２偏光波に分離する第１偏光複像プリズム３２と、コンデンサレンズ３３とを有する。出射経路５０は順に、対物レンズ５１と、第２偏光複像プリズム５２と、第２偏光複像プリズム５２からの出射された合成光を複数経路に分岐する分岐機構５６と、複数の分岐光のそれぞれの第２偏光波に互いに異なる位相遅延を生じさせる位相遅延機構５８と、偏光板７２とを有する。光波を分岐させ、それぞれに位相遅延を行うことで、複数の位相遅延量について同時に撮像することができ、撮像時間を短縮できる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

偏光波を用いて位相イメージングを行う勾配光干渉顕微鏡であって、
光源からサンプル配置位置へ光を入射させる入射経路と、
前記サンプル配置位置から出射される透過光または反射光を撮像素子へ入射させる出射経路と、
を含み、
前記入射経路は、順に、
入射光を直交する第１偏光波および第２偏光波に分離する第１偏光複像プリズムと、
前記第１偏光複像プリズムと前記サンプル配置位置との間に配置されるコンデンサレンズと、
を有し、
前記出射経路は、順に、
前記サンプル配置位置から出射される前記透過光また前記反射光が入射される対物レンズと、
前記第１偏光波および前記第２偏光波を合成する第２偏光複像プリズムと、
前記第２偏光複像プリズムからの出射された合成光を、３経路以上の複数経路に分岐する分岐機構と、
複数の分岐光のそれぞれの前記第２偏光波に、互いに異なる位相遅延を生じさせる位相遅延機構と、
複数の分岐光のそれぞれの前記第１偏光波および前記第２偏光波の偏光方向を揃える偏光板と、
を有する、勾配光干渉顕微鏡。

【請求項2】

請求項１に記載の勾配光干渉顕微鏡であって、
前記分岐機構は回折格子である、勾配光干渉顕微鏡。

【請求項3】

請求項２に記載の勾配光干渉顕微鏡であって、
前記分岐機構は位相格子である、勾配光干渉顕微鏡。

【請求項4】

請求項３に記載の勾配光干渉顕微鏡であって、
前記位相格子は、前記撮像素子の撮像面において２次元的に２行２列にフーリエスペクトル分布が現れるように設けられる、勾配光干渉顕微鏡。

【請求項5】

請求項４に記載の勾配光干渉顕微鏡であって、
前記位相遅延機構は、２次元的に２行２列に配置された４つの波長板であり、
４つの前記波長板は、位相遅延量が互いに異なる、勾配光干渉顕微鏡。

【請求項6】

請求項１に記載の勾配光干渉顕微鏡であって、
前記位相遅延機構は、前記分岐光のそれぞれに対応する複数の波長板である、勾配光干渉顕微鏡。

【請求項7】

請求項１ないし請求項６のいずれか一項に記載の勾配光干渉顕微鏡であって、
前記分岐機構は、前記合成光を４経路以上に分岐し、
前記位相遅延機構は、４つの分岐光のそれぞれの前記第２偏光波に、０、π／２、π、３π／２の位相遅延を生じさせる、勾配光干渉顕微鏡。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、勾配光干渉顕微法に基づいて定量位相イメージングを行うための撮像装置および撮像方法に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞などの無色透明な物体をイメージングする技術として、従来、位相差顕微鏡や微分干渉顕微鏡が開発され、使用されている。これらの顕微鏡で得られる位相分布は定性的な位相分布であり、細胞に関する定量的な情報は得られない。

【0003】

例えば、微分干渉顕微鏡では、サンプルを照射する光を、ウォラストンプリズムやノマルスキプリズム等の微分干渉プリズムによって、偏光方向の直交するＰ偏光とＳ偏光とに分離するとともに、Ｐ偏光とＳ偏光との照射位置をずらす。このＰ偏光とＳ偏光とのずれ量をシア量と称する。そして、各偏光波のサンプルからの透過光または反射光を再度プリズムによって合波させ、干渉させる。このときの干渉強度は、シア量に対する位相差によて変化する。これにより、無色透明な細胞や凹凸のある物体について、形状の変化量（微分）を可視化することができる。しかしながら、この方法では、形状や位相の変化量を可視化できるものの、定量的な情報を取得できない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Nguyen, T.H., Kandel, M.E., Rubessa, M. et al. Gradient light interference microscopy for 3D imaging ofunlabeled specimens. Nat Commun 8, 210 (2017).

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

そこで、計測対象の位相情報を定量的に取得する定量位相イメージングを行うために、微分干渉顕微鏡に液晶変調素子を追加することにより定量位相を取得する、ＧＬＩＭ（Gradient Light Interference Microscopy）と呼ばれる勾配光干渉顕微法が提案されている。勾配光干渉顕微法については、例えば、非特許文献１に記載されている。

【0006】

非特許文献１に記載の勾配光干渉顕微法では、液晶変調素子を用いて、Ｐ偏光とＳ偏光との一方に４通りの異なる位相遅延量を付加し、それぞれの合波における干渉強度分布から、偏光間の位相差を取得している。そして、偏光間の位相差をシア量で除算することによって、局所的な位相微分を算出する。位相の微分値が画像の各位置において算出されるため、これを積分することによって、計測対象の位相分布を取得することができる。

【0007】

ただし、非特許文献１に記載の勾配光干渉顕微法では、４通りの位相遅延量について撮像を行うためには、４回撮像を行わなければならない。すなわち、従来の微分干渉顕微鏡に比べて、撮像時間が４倍となるため、動的なサンプルへの適用が制限される。

【0008】

本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、勾配光干渉顕微法において、撮像時間を短縮する技術を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上記課題を解決するため、本願の第１発明は、偏光波を用いて位相イメージングを行う勾配光干渉顕微鏡であって、光源からサンプル配置位置へ光を入射させる入射経路と、前記サンプル配置位置から出射される透過光または反射光を撮像素子へ入射させる出射経路と、を含み、前記入射経路は、順に、入射光を直交する第１偏光波および第２偏光波に分離する第１偏光複像プリズムと、前記第１偏光複像プリズムと前記サンプル配置位置との間に配置されるコンデンサレンズと、を有し、前記出射経路は、順に、前記サンプル配置位置から出射される前記透過光また前記反射光が入射される対物レンズと、前記第１偏光波および前記第２偏光波を合成する第２偏光複像プリズムと、前記第２偏光複像プリズムからの出射された合成光を、３経路以上の複数経路に分岐する分岐機構と、複数の分岐光のそれぞれの前記第２偏光波に、互いに異なる位相遅延を生じさせる位相遅延機構と、複数の分岐光のそれぞれの前記第１偏光波および前記第２偏光波の偏光方向を揃える偏光板と、を有する。

【0010】

本願の第２発明は、第１発明の勾配光干渉顕微鏡であって、前記分岐機構は回折格子である。

【0011】

本願の第３発明は、第２発明の勾配光干渉顕微鏡であって、前記分岐機構は位相格子である。

【0012】

本願の第４発明は、第３発明の勾配光干渉顕微鏡であって、前記位相格子は、前記撮像素子の撮像面において２次元的に２行２列にフーリエスペクトル分布が現れるように設けられる。

【0013】

本願の第５発明は、第４発明の勾配光干渉顕微鏡であって、前記位相遅延機構は、２次元的に２行２列に配置された４つの波長板であり、４つの前記波長板は、位相遅延量が互いに異なる。

【0014】

本願の第６発明は、第１発明ないし第５発明のいずれか一発明の勾配光干渉顕微鏡であって、前記位相遅延機構は、前記分岐光のそれぞれに対応する複数の波長板である。

【0015】

本願の第７発明は、第１発明ないし第６発明のいずれか一発明の勾配光干渉顕微鏡であって、前記分岐機構は、前記合成光を４経路以上に分岐し、前記位相遅延機構は、４つの分岐光のそれぞれの前記第２偏光波に、０、π／２、π、３π／２の位相遅延を生じさせる。

【発明の効果】

【0016】

本願の第１発明から第７発明によれば、勾配光干渉顕微法において、分離した第１偏光波と第２偏光波とを分岐させ、それぞれに位相遅延を行うことで、複数の位相遅延量について同時に撮像することができる。したがって、従来時間のかかっていた勾配光干渉顕微法において、撮像時間を短縮することができる。

【0017】

特に、本願の第２発明および第３発明によれば、装置を大型化することなく、光波を複数に分岐することができる。

【0018】

特に、本願の第５発明または第６発明によれば、装置を大型化すること無く、複数の分岐光のそれぞれについて、２つの偏向波の一方のみに所定の位相遅延を生じさせることができる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】第１実施形態にかかる勾配光干渉顕微鏡の概略図である。

【図2】第１実施形態にかかる勾配光干渉顕微鏡の位相格子の領域分布を示した図である。

【図3】第１実施形態にかかる勾配光干渉顕微鏡の位相格子のフーリエスペクトル分布を示した図である。

【図4】第１実施形態にかかる勾配光干渉顕微鏡の偏光板の配置を示した図である。

【図5】偏光複像プリズムを用いて試料表面で反射した反射波を観察する様子を示した概略図である。

【図6】第２実施形態にかかる勾配光干渉顕微鏡の概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

以下、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明する。

【0021】

＜１．第１実施形態＞
以下では、本発明の一実施形態に係る勾配光干渉顕微鏡である顕微鏡１について、図１を参照しつつ説明する。図１は、顕微鏡１の構成を示した概略図である。この顕微鏡１は、細胞などの無色透明な物体をイメージングするために、勾配光干渉顕微法を用いて、照射位置をシフトさせた２つの偏光波の一方に複数通りの位相遅延量を付加し、２つの偏光波の合波の強度分布から偏光間の位相差を取得するものである。

【0022】

図１に示すように、顕微鏡１は、光源２０、入射経路３０、サンプル配置部４０、出射経路５０、撮像素子６０、および演算部８０を有する。本実施形態の顕微鏡１は、サンプル配置部４０に配置されたサンプルに光を照射し、その透過光を撮像素子６０にて観察するものである。このため、光源２０からサンプル配置部４０へ向かう入射経路３０と、サンプル配置部４０から撮像素子６０へ向かう出射経路５０を一直線上に配置している。

【0023】

光源２０は、サンプルに照射する光を供給する。光源２０から出射される光は白色光である。

【0024】

入射経路３０は、光源２０からサンプル配置部４０へ光を入射させる光学系である。入射経路３０における光軸は一直線上に配置されている。入射経路３０は、光源２０からサンプル配置部４０へ向かって順に、第１偏光板３１と、第１プリズム３２と、コンデンサレンズ３３とを有する。

【0025】

第１偏光板３１は、光源２０から出射された光のうち、特定方向に進行する光のみを通過（透過）させる光学素子である。

【0026】

第１プリズム３２は、入射光を直交する２つの偏光波に分離する、いわゆる微分干渉プリズム（ＤＩＣプリズム）である。第１プリズム３２は、入射光を直交する第１偏光波および第２偏光波に分離する第１偏光複像プリズムを構成する。具体的には、第１プリズム３２は、入射光を、光軸に直交する第１方向に振動方向を有する第１偏光波と、光軸および第１方向と直交する第２方向に振動方向を有する第２偏光波とを、所定の分離角度で分離させる。第１プリズム３２には、例えば、ウォラストンプリズムやノマルスキプリズムが用いられる。

【0027】

第１偏光板３１における偏光軸（透過軸）と、第１プリズム３２の第１方向および第２方向とはそれぞれ、４５°の角度で交わるように配置されている。これにより、第１偏光板３１から出射された偏光波の第１方向成分と第２方向成分との光エネルギーが同等となる。すなわち、第１プリズム３２から出射される第１偏光波と第２偏光波とが、ほぼ同等の強度となる。

【0028】

コンデンサレンズ３３は、第１プリズム３２において分離した第１偏光波および第２偏光波を、サンプル配置部４０へ適切に照射させるためのレンズである。コンデンサレンズ３３の焦点面Ｐ１は、第１偏向板３１を透過した光が、第１プリズム３２により２つの偏光に分離する面（すなわち、第１プリズムのローカライズ面）に配置される。コンデンサレンズ３３によって、第１偏光波と第２偏光波とは、光軸に対して直交する方向に、所定のシア量ずれて進行する。所定のシア量ずれた第１偏光波および第２偏光波を合わせて「分離合波」と称する。

【0029】

サンプル配置部４０は、生体試料であるサンプルを、サンプル配置位置Ｐ２に配置するための機構である。実際には、サンプル配置部４０には、サンプルが収容されたディッシュやプレパラートを固定する固定機構が設けられている。サンプル配置部４０に配置されたサンプルには、コンデンサレンズ３３から出射される分離合波が照射される。

【0030】

本実施形態の顕微鏡１は、サンプルに照射された光の透過光を観察するものである。このため、光源２０から入射経路３０を介してサンプルに入射された分離合波に含まれる第１偏光波と第２偏光波とがそれぞれ、所定のシア量ずれた位置でサンプルを透過する。このため、サンプルの透過光は、第１偏光波と第２偏光波とがシア量ずれた分離合波となる。

【0031】

出射経路５０は、サンプル配置部４０からの透過光を撮像素子６０へ入射させる光学系である。出射経路５０は、サンプル配置部４０から撮像素子６０へ向かって順に、対物レンズ５１、第２プリズム５２、カラーフィルタ５３、第１結像レンズ５４、第２結像レンズ５５、位相格子５６、第１レンズ５７、位相遅延部５８、第２レンズ５９、第３レンズ７１、および第２偏光板７２を有する。

【0032】

対物レンズ５１は、サンプル配置部４０においてサンプルを透過した透過光（分離した第１偏光波および第２偏光波を含む分離合波）を結像させるレンズである。

【0033】

第２プリズム５２は、対物レンズ５１の焦点面に配置される。第２プリズム５２は、第１プリズムと同様の微分干渉プリズム（ＤＩＣプリズム）である。第２プリズム５２は、第１偏光波および第２偏光波を合成する第２偏光複像プリズムを構成する。第２プリズム５２には、第１偏光波と第２偏光波とが所定のシア量ずれた分離合波が入射される。第２プリズム５２は、分離した第１偏光波と第２偏光波とを第１プリズム３２と逆方向にずらすことにより、第１偏光波と第２偏光波とのずれを無くした（シア量を０とした）、第１偏光波と第２偏光波との合成波を出射する。第２プリズム５２は、対物レンズ５１の焦点面Ｐ２に配置される。

【0034】

カラーフィルタ５３は、第２プリズム５２から出射された合成波から、所定の波長範囲の光のみを通過させる。光源２０から出射される光が広い波長範囲である場合、波長の違いによって第１プリズム３２および第２プリズムにおける分離角が異なるため、光路長の差が生じて像がぼやける虞がある。カラーフィルタ５３によって波長範囲を狭めることにより、撮像素子６０において観察する像がぼやけるのを抑制できる。

【0035】

第１結像レンズ５４および第２結像レンズ５５は、第２プリズム５２から出射され、カラーフィルタ５３を通過した合成波を結像させるためのレンズである。第１結像レンズ５４および第２結像レンズ５５のフーリエ面（瞳面）Ｐ４には、合成波のフーリエスペクトル分布が現れる。

【0036】

位相格子５６は、第１結像レンズ５４および第２結像レンズ５５のフーリエ面（瞳面）に配置される。位相格子５６は、回折格子の一種である。本実施形態の位相格子５６は、屈折率の異なる（位相を変調する）領域を組み合わせた透過型の位相格子である。なお、位相格子５６は、厚さの異なる領域を組み合わせて形成されてもよい。

【0037】

図２は、本実施形態の位相格子５６の領域分布を示した図である。図３は、本実施形態の位相格子５６の点像強度分布を示した図である。図２に示すように、この位相格子５６は、位相遅延を行わない（位相遅延量が０である）領域と、位相遅延量がπである領域とが、２次元的に交互に、市松模様状に配置されている。このような位相格子５６のフーリエスペクトル分布は、第２結像レンズ５５の結像面（ないしは撮像素子６０の撮像面）において、図３に示すような、２次元的に２行２列の分布にサンプルからの光波が畳み込まれて現れる。

【0038】

すなわち、位相格子５６は、第２プリズム５２から出射された合成波を３経路以上の複数経路に分岐する分岐機構である。本実施形態の位相格子５６は、第２プリズム５２から出射され、カラーフィルタ５３を通過した合成波を、２行２列の４つの光波に分離する。ここで、位相格子５６によって分離された４つの光波をそれぞれ、第１分岐波、第２分岐波、第３分岐波および第４分岐波と称する。

【0039】

第１分岐波、第２分岐波、第３分岐波および第４分岐波のそれぞれには、第１方向に振幅を有する第１偏光波と、第２方向に振幅を有する第２偏光波とが含まれている。

【0040】

第１レンズ５７、位相遅延部５８、第２レンズ５９、第３レンズ７１、および第２偏光板７２は、位相格子５６と撮像素子６０との間に順に配置される。第１レンズ５７と第２レンズ５９の間において、第１分岐波、第２分岐波、第３分岐波および第４分岐波は、互いに平行に進行する。

【0041】

位相遅延部５８は、複数の分岐光（第１分岐波、第２分岐波、第３分岐波および第４分岐波）のそれぞれに含まれる第２偏光波に、互いに異なる位相遅延を生じさせる位相遅延機構である。

【0042】

本実施形態の位相遅延部５８は、図４に示すように、フレーム５８０、第１波長板５８１、第２波長板５８２、第３波長板５８３、および第４波長板５８４を有する。フレーム５８０は、第１波長板５８１、第２波長板５８２、第３波長板５８３、および第４波長板５８４を保持する。第１波長板５８１、第２波長板５８２、第３波長板５８３、および第４波長板５８４は、互いに間隔を空けて、２行２列に配置される。

【0043】

第１波長板５８１、第２波長板５８２、第３波長板５８３、および第４波長板５８４は、位相遅延量が互いに異なる。具体的には、第１波長板５８１において、第１偏光波に対する第２偏光波の位相遅延量は０［ｒａｄ］である。第２波長板５８２において、第１偏光波に対する第２偏光波の位相遅延量はπ／２［ｒａｄ］である。第３波長板５８３において、第１偏光波に対する第２偏光波の位相遅延量はπ［ｒａｄ］である。第４波長板５８４において、第１偏光波に対する第２偏光波の位相遅延量は３π／２［ｒａｄ］である。

【0044】

第２偏光波に互いに異なる位相遅延がなされた４つの分岐波は、第２レンズ５９、第３レンズ７１および第２偏光板７２を介して撮像素子６０へと入射する。撮像素子６０は、４つの分岐波を撮像面にて受けることにより干渉像を取得し、取得した干渉像のデータを演算部８０へと送信する。撮像素子６０は、例えばＣＣＤイメージセンサ、もしくはＣＭＯＳイメージセンサなどのイメージセンサである。

【0045】

第２偏光板７２は、第２偏光波に互いに異なる位相遅延がなされた各分岐波について、特定方向（「第３方向」と称する）に進行する光のみを通過（透過）させる光学素子である。第２偏光板７２における偏光軸（透過軸）と、第１偏光波の振幅方向である第１方向および第２偏光波の振幅方向である第２方向とはそれぞれ、４５°の角度で交わるように配置されている。これにより、第２偏光板７２入射前の第１偏光波の光エネルギーに対する第３方向成分の光エネルギーの割合と、第２偏光板７２入射前の第２偏光波の光エネルギーに対する第３方向成分の光エネルギーの割合とが、同等となる。

【0046】

第２偏光板７２を通過することにより、各分岐波について、第１偏光波と第２偏光波の振幅方向が揃い、第１偏光波と第２偏光波とが干渉するようになる。第１偏光波と第２偏光波との干渉によって得られる光波を、干渉波と称する。

【0047】

これにより、撮像素子６０には、２行２列の４つの領域のそれぞれに、第１分岐波の干渉波と、第２分岐波の干渉波と、第３分岐波の干渉波と、第４分岐波の干渉波とが入射される。したがって、撮像素子６０は、第１分岐波の干渉波として位相遅延量０の干渉像、第２分岐波の干渉波として位相遅延量π／２［ｒａｄ］の干渉像、第３分岐波の干渉波として位相遅延量π［ｒａｄ］の干渉像、および、第４分岐波の干渉波として位相遅延量３π／２［ｒａｄ］の干渉像を撮影することができる。

【0048】

演算部８０は、撮像素子６０と電気的に接続されている。演算部８０は、撮像素子６０の撮影した４つの干渉像に基づいて、試料９０の定量位相分布を取得する。具体的には、演算部８０は、撮像素子６０から受信した信号を基に、４つの干渉像のデータを取得し、これら４つの干渉像に基づいて勾配光干渉顕微法による計算により、試料９０の定量位相分布を取得する。演算部８０における具体的な計算手法については、例えば上述の非特許文献１に記載されているため、詳細は割愛する。

【0049】

演算部８０は、勾配光干渉顕微法に基づく演算を実行するためのアルゴリズムを含んだプログラム等を記憶する記憶部と、プログラムに従って演算を実行するプロセッサ（例えばＣＰＵ）とを備える。記憶部は、例えばハードディスクドライブ（ＨＤＤ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）あるいはランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）等により構成される。また、演算部８０は、演算部８０と通信可能に設けられたディスプレイ（図示省略）に、演算結果を表示してもよい。

【0050】

ここで、この顕微鏡１の原理の基礎を、図５を参照しつつ説明する。図５は、試料表面で反射した反射波を観察する様子を示した概略図である。図５の例では、入射光が、微分干渉プリズム９１によってＰ偏光波とＳ偏光波とに分離される。その後、コンデンサレンズ９２によって、Ｐ偏光波およびＳ偏光波は、光軸に直交する方向にシア量ΔＳずれた状態で試料９０へ入射する。図５に示すように、試料９０上のある位置Ａ１に入射されたＰ偏光波に対応するＳ偏光波は、位置Ａ１から所定の方向にシア量ΔＳずれた位置Ａ２に入射される。

【0051】

これにより、試料９０の表面高さが一定でない場合、位置Ａ１における反射高さと、位置Ａ２における反射高さとが異なる。その結果、反射高さの違いに起因して、Ｐ偏光反射波とＳ偏光反射波とに位相差が生じる。その後、Ｐ偏光反射波とＳ偏光反射波とのシア量ΔＳの位置を再び合わせるとともに、偏光方向を揃えて干渉させる。このとき、位相差が０、２π、および２πの整数倍である場合に干渉強度が最大となり、位相差がπ、３π、および２πの整数倍＋πである場合に干渉強度が最小となる。

【0052】

この顕微鏡１では、サンプル配置部４０において分離合波がサンプルを透過する際に、第１プリズム３２およびコンデンサレンズ３３によって第１偏光波と第２偏光波とが光軸に直交する方向にシア量ΔＳずれた位置で、サンプルに入射され、サンプルを透過する。このとき、それぞれの位置におけるサンプルの状態の違いによって、第１偏光波と第２偏光波とに位相差が生じる。ここで、第１偏光波に対する第２偏光波の位相遅延量をθとする。

【0053】

その後、対物レンズ５１および第２プリズム５２によって、第１偏光波と第２偏光波との位置ずれが解消された合成波となる。このとき、第１偏光波と第２偏光波とには位相差が生じた状態のままである。続いて、当該合成波が位相格子５６によって４つに分岐された分岐波（第１分岐波、第２分岐波、第３分岐波、および第４分岐波）の第２偏光波には、それぞれ、０，π／２，π，３π／２の位相遅延が与えられる。これによって、それぞれの分岐波における第１偏光波に対する第２偏光波の位相遅延量は、θ，θ＋π／２，θ＋π，θ＋３π／２となる。

【0054】

そして最後に、当該分岐波のそれぞれについて、第２偏光板７２によって第１偏光波と第２偏光波との偏光方向が揃えられることにより、合成波に含まれる第１偏光波と第２偏光波とが干渉する。

【0055】

このとき、第１偏光波と第２偏光波との位相差がサンプルに依存したθのみでは、定性的な評価しかできない。これに対して、複数の既知の位相差０，π／２，π，３π／２をさらに付加することにより、定量的な評価を行うことができる。

【0056】

非特許文献１に記載の勾配光干渉顕微法では、４通りの位相遅延量について撮像を行うためには、４回撮像を行わなければならない。すなわち、従来の微分干渉顕微鏡に比べて、撮像時間が４倍となるため、動的なサンプルに適用することができない。

【0057】

これに対し、この顕微鏡１では、サンプル照射後の合成波を４つの光波に分岐し、それぞれに対して互いに異なる位相遅延量を付加している。すなわち、１回の撮像で、４通りの位相遅延量について撮像を行うことができる。その結果、定性的な評価しか行えない従来の微分干渉顕微鏡に比べて、撮像時間が長くなることなく、定量的な評価を行うことができる。

【0058】

＜２．第２実施形態＞
以下では、本発明の第２実施形態に係る勾配光干渉顕微鏡である顕微鏡１Ａについて、図６を参照しつつ説明する。図６は、顕微鏡１Ａの構成を示した概略図である。この顕微鏡１Ａは、第１実施形態の顕微鏡１と同様に、細胞などの無色透明な物体をイメージングするために、勾配光干渉顕微法を用いて、照射位置をシフトさせた２つの偏光波の一方に複数通りの位相遅延量を付加し、２つの偏光波の合波の強度分布から偏光間の位相差を取得するものである。

【0059】

図６に示すように、顕微鏡１Ａは、光源２０、入射経路３０Ａ、サンプル配置部４０、出射経路５０、撮像素子６０、および演算部８０を有する。本実施形態の顕微鏡１Ａは、サンプル配置部４０に配置されたサンプルに光を照射し、その反射光を撮像素子６０にて観察するものである。このため、光源２０からサンプル配置部４０へ向かう入射経路３０Ａと、サンプル配置部４０から撮像素子６０へ向かう出射経路５０とがそれぞれ、互いに直交する直線上に配置している。

【0060】

本実施形態の顕微鏡１Ａは、第１実施形態の顕微鏡１と比較して、入射経路３０Ａがハーフミラー３４を有する点と、それに伴い、入射経路３０Ａと出射経路５０とが異なる直線上に配置される点が相違する。その他の構成は、第１実施形態の顕微鏡１と同等である。図６中に付された符号について、図１中の符号と同じ要素については、同等である。

【0061】

本実施形態の顕微鏡１Ａにおいて、ハーフミラー３４は、コンデンサレンズ３３と、サンプル配置部４０との間に配置される。ハーフミラー３４は、コンデンサレンズ３３からサンプル配置部４０へ向かう光を透過するとともに、サンプル配置部４０からコンデンサレンズ３３へ向かう光を垂直方向に反射する。

【0062】

これにより、顕微鏡１Ａにおいて、光源２０から出射し、第１偏光板３１、第１プリズム３２およびコンデンサレンズ３３を介した光は、ハーフミラー３４を透過し、サンプル配置部４０に配置されたサンプルに入射される。そして、サンプルにおいて反射された反射光は、ハーフミラー３４において垂直方向に反射される。

【0063】

そして、当該反射光は、出射経路５０の対物レンズ５１に入射される。出射経路５０から撮像素子６０に至る構成は、第１実施形態に係る顕微鏡１と同様である。

【0064】

このように、本実施形態の顕微鏡１Ａでは、サンプルの反射光について勾配光干渉顕微法を用いて観察することができる。

【0065】

＜３．変形例＞
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は、上記の実施形態に限定されるものではない。

【0066】

上記の実施形態では、第２プリズムから出射された合成光を分岐させる分岐機構が位相格子であるが、本発明はこれに限られない。分岐機構は、振幅格子などの、位相格子以外の回折格子であってもよい。また、分岐機構は、ハーフミラー等のその他の光学素子を用いて光波を分岐させるものであってもよい。

【0067】

また、上記の実施形態では、複数の分岐光のそれぞれについて一方の偏光波の位相を遅延させる位相遅延機構が、複数の波長板であったが、本発明はこれに限られない。例えば、複数の分岐光のそれぞれについて、空間光位相変調器を用いて、一方の偏光波の位相遅延がなされてもよい。

【0068】

また、上記の実施形態や変形例に登場した各要素を、矛盾が生じない範囲で、適宜に組み合わせてもよい。

【符号の説明】

【0069】

１，１Ａ 顕微鏡
２０ 光源
３０，３０Ａ 入射経路
３１ 第１偏光板
３２ 第１プリズム
３３ コンデンサレンズ
４０ サンプル配置部
５０ 出射経路
５１ 対物レンズ
５２ 第２プリズム
５３ カラーフィルタ
５４ 第１結像レンズ
５５ 第２結像レンズ
５６ 位相格子
５８ 位相遅延部（波長板）
６０ 撮像素子
７２ 第２偏光板
５８１ 第１波長板
５８２ 第２波長板
５８３ 第３波長板
５８４ 第４波長板

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】