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▶ 温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024045010
(43)【公開日】2024-04-02
(54)【発明の名称】大腸がん血清バイオマーカーとしての成長ホルモンの使用
(51)【国際特許分類】
G01N 33/574 20060101AFI20240326BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240326BHJP
【ＦＩ】
G01N33/574 A
G01N33/53 B
【審査請求】有
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023122867
(22)【出願日】2023-07-27
(31)【優先権主張番号】202210898777.9
(32)【優先日】2022-07-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】522081152
【氏名又は名称】温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院
(74)【代理人】
【識別番号】100205936
【弁理士】
【氏名又は名称】崔 海龍
(74)【代理人】
【識別番号】100132805
【弁理士】
【氏名又は名称】河合 貴之
(72)【発明者】
【氏名】孫 維建
(72)【発明者】
【氏名】李 丕宏
(72)【発明者】
【氏名】陳 健
(72)【発明者】
【氏名】兪 耀軍
(72)【発明者】
【氏名】林 李▲びょう▼
(72)【発明者】
【氏名】呉 昊
(57)【要約】 （修正有）
【課題】大腸がん血清バイオマーカーキットおよび検出方法を提供する。
【解決手段】非診断目的の大腸がん判定に用いる大腸がん血清バイオマーカーとして成長ホルモン（ＧＨ）を使用する。
【効果】大腸がん血清スクリーニングの感度および特異度（特異性）を向上できる。
【選択図】図１
【解決手段】非診断目的の大腸がん判定に用いる大腸がん血清バイオマーカーとして成長ホルモン（ＧＨ）を使用する。
【効果】大腸がん血清スクリーニングの感度および特異度（特異性）を向上できる。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
成長ホルモンであって、大腸がん判定において大腸がん血清バイオマーカーとして使用される、成長ホルモン。
【請求項2】
成長ホルモンを含む、ことを特徴とする大腸がん血清バイオマーカー。
【請求項3】
前記成長ホルモンがヒト成長ホルモンである、ことを特徴とする請求項２に記載の大腸がん血清バイオマーカー。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載の大腸がん血清バイオマーカーを検出するための大腸がん血清バイオマーカーキットであって、成長ホルモンの免疫グロブリンＧ抗体を含む、ことを特徴とする大腸がん血清バイオマーカーキット。
【請求項5】
定量チップ、サンプル希釈液、２０倍希釈された第１洗浄液、２０倍希釈された第２洗浄液、標準混合物、成長ホルモンの免疫グロブリンＧ抗体、Ｃｙ３－ストレプトアビジン、スライドグラス洗浄乾燥器およびシールを含む、ことを特徴とする請求項４に記載の大腸がん血清バイオマーカーキット。
【請求項6】
請求項１から３のいずれか１項に記載の大腸がん血清バイオマーカーを検出する方法であって、
血清サンプルを取得するステップａと、血清サンプルを検査するステップｂと、を含み、
前記ステップｂは、定量チップを乾燥するステップｂ１と、標準品を調製するステップｂ２と、定量チップを操作するステップｂ３と、を含み、
前記ステップｂ３は、
定量チップの各ウェルに１００μＬのサンプル希釈液を添加し、室温で１時間インキュベートしてから定量チップを封止するステップｂ３１と、
各ウェルからサンプル希釈液を吸引し、ステップｂ２で調製された標準品から８０μＬの標準液を採取し、血清サンプルとともに各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートするステップｂ３２と、
定量チップを洗浄するステップｂ３３であって、まず、希釈されていない第１洗浄液を使用して、１ウェルあたり２５０μＬ、各回１０秒間高強度振とうしながら１０回洗浄してから脱イオン水で第１洗浄液を２０倍希釈し、続いて、希釈されていない第２洗浄液を使用して、１ウェルあたり２５０μＬ、各回１０秒間高強度振とうしながら６回洗浄してから脱イオン水で第２洗浄液を２０倍希釈するステップｂ３３と、
成長ホルモンの免疫グロブリンＧ抗体をインキュベートするステップｂ３４であって、成長ホルモンの免疫グロブリンＧ抗体を充填したチューブレットを遠心分離してから、１．４ｍｌのサンプル希釈液を添加し、均一に混合した後、再度遠心分離し、続いて、各ウェルに成長ホルモンの免疫グロブリンＧ抗体を８０μＬ添加し、室温でシェーカーにおいて２時間インキュベートするステップｂ３４と、
前記ステップｂ３３と同様な洗浄を行うステップｂ３５と、
Ｃｙ３－ストレプトアビジンをインキュベートするステップｂ３６であって、Ｃｙ３－ストレプトアビジンを充填したチューブレットを遠心分離してから１．４ｍｌのサンプル希釈液を添加し、均一に混合した後、再度遠心分離し、続いて、Ｃｙ３－ストレプトアビジン８０μＬを各ウェルに添加し、定量チップをアルミ箔紙で包み込み、光を避けて室温でシェーカーにおいて１時間インキュベートするステップｂ３６と、
前記ステップｂ３３と同様な洗浄を行うステップｂ３７と、
蛍光検出するステップｂ３８であって、レーザースキャナーで信号をスキャンし、Ｃｙ３またはグリーンチャンネルを使用するステップｂ３８と、
ＱＡＨ－ＣＵＳＴのデータ解析ソフトウェアを用いてデータ解析を行い、各血清サンプル中のＧＨの含量を求めるステップｂ３９と、
を含む、ことを特徴とする大腸がん血清バイオマーカーの検出方法。
血清サンプルを取得するステップａと、血清サンプルを検査するステップｂと、を含み、
前記ステップｂは、定量チップを乾燥するステップｂ１と、標準品を調製するステップｂ２と、定量チップを操作するステップｂ３と、を含み、
前記ステップｂ３は、
定量チップの各ウェルに１００μＬのサンプル希釈液を添加し、室温で１時間インキュベートしてから定量チップを封止するステップｂ３１と、
各ウェルからサンプル希釈液を吸引し、ステップｂ２で調製された標準品から８０μＬの標準液を採取し、血清サンプルとともに各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートするステップｂ３２と、
定量チップを洗浄するステップｂ３３であって、まず、希釈されていない第１洗浄液を使用して、１ウェルあたり２５０μＬ、各回１０秒間高強度振とうしながら１０回洗浄してから脱イオン水で第１洗浄液を２０倍希釈し、続いて、希釈されていない第２洗浄液を使用して、１ウェルあたり２５０μＬ、各回１０秒間高強度振とうしながら６回洗浄してから脱イオン水で第２洗浄液を２０倍希釈するステップｂ３３と、
成長ホルモンの免疫グロブリンＧ抗体をインキュベートするステップｂ３４であって、成長ホルモンの免疫グロブリンＧ抗体を充填したチューブレットを遠心分離してから、１．４ｍｌのサンプル希釈液を添加し、均一に混合した後、再度遠心分離し、続いて、各ウェルに成長ホルモンの免疫グロブリンＧ抗体を８０μＬ添加し、室温でシェーカーにおいて２時間インキュベートするステップｂ３４と、
前記ステップｂ３３と同様な洗浄を行うステップｂ３５と、
Ｃｙ３－ストレプトアビジンをインキュベートするステップｂ３６であって、Ｃｙ３－ストレプトアビジンを充填したチューブレットを遠心分離してから１．４ｍｌのサンプル希釈液を添加し、均一に混合した後、再度遠心分離し、続いて、Ｃｙ３－ストレプトアビジン８０μＬを各ウェルに添加し、定量チップをアルミ箔紙で包み込み、光を避けて室温でシェーカーにおいて１時間インキュベートするステップｂ３６と、
前記ステップｂ３３と同様な洗浄を行うステップｂ３７と、
蛍光検出するステップｂ３８であって、レーザースキャナーで信号をスキャンし、Ｃｙ３またはグリーンチャンネルを使用するステップｂ３８と、
ＱＡＨ－ＣＵＳＴのデータ解析ソフトウェアを用いてデータ解析を行い、各血清サンプル中のＧＨの含量を求めるステップｂ３９と、
を含む、ことを特徴とする大腸がん血清バイオマーカーの検出方法。
【請求項7】
前記ステップｂ１は、定量チップを箱から取り出し、室温で２０～３０分放置した後、包装袋を開けてシールを外してから、定量チップを乾燥器または室温で１～２時間乾燥させることを含む、ことを特徴とする請求項６に記載の大腸がん血清バイオマーカーの検出方法。
【請求項8】
前記ステップｂ２は、
５００μＬのサンプル希釈液を標準混合物のチューブレットに添加し、標準混合物を再溶解し、続いて、チューブレットを開く前に、最初に迅速に遠心分離し、溶解粉末を上下に軽く吹き、当該チューブレットをＳｔｄ１とマークするステップｂ２１と、
６つのきれいな遠心管をそれぞれＳｔｄ２、Ｓｔｄ３、Ｓｔｄ４、Ｓｔｄ５、Ｓｔｄ６、Ｓｔｄ７とマークし、各遠心管に２００μＬのサンプル希釈液を添加するステップｂ２２と、
Ｓｔｄ１とマークした遠心管から抽出した１００μＬのサンプル希釈液をＳｔｄ２とマークした遠心管に軽く混合し、続いて、Ｓｔｄ２とマークした遠心管から抽出した１００μＬのサンプル希釈液をＳｔｄ３とマークした遠心管に添加し、順次類推し、このようにＳｔｄ７とマークした遠心管まで勾配希釈し、標準液を得るステップｂ２３と、
Ｓｔｄ７とマークした遠心管から１００μＬの標準液を他の新しい遠心管に抽出して標準品とするステップｂ２４と、
を含む、ことを特徴とする請求項６に記載の大腸がん血清バイオマーカーの検出方法。
５００μＬのサンプル希釈液を標準混合物のチューブレットに添加し、標準混合物を再溶解し、続いて、チューブレットを開く前に、最初に迅速に遠心分離し、溶解粉末を上下に軽く吹き、当該チューブレットをＳｔｄ１とマークするステップｂ２１と、
６つのきれいな遠心管をそれぞれＳｔｄ２、Ｓｔｄ３、Ｓｔｄ４、Ｓｔｄ５、Ｓｔｄ６、Ｓｔｄ７とマークし、各遠心管に２００μＬのサンプル希釈液を添加するステップｂ２２と、
Ｓｔｄ１とマークした遠心管から抽出した１００μＬのサンプル希釈液をＳｔｄ２とマークした遠心管に軽く混合し、続いて、Ｓｔｄ２とマークした遠心管から抽出した１００μＬのサンプル希釈液をＳｔｄ３とマークした遠心管に添加し、順次類推し、このようにＳｔｄ７とマークした遠心管まで勾配希釈し、標準液を得るステップｂ２３と、
Ｓｔｄ７とマークした遠心管から１００μＬの標準液を他の新しい遠心管に抽出して標準品とするステップｂ２４と、
を含む、ことを特徴とする請求項６に記載の大腸がん血清バイオマーカーの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、大腸がん血清バイオマーカーとしての成長ホルモンの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
現在、大腸がん診断のゴールドスタンダードは大腸内視鏡検査である。しかしながら、大腸内視鏡検査は腸管の前処置が必要で侵襲的であり、腸管穿孔を起こしやすく、被験者にとって苦痛が大きく、コンプライアンスが悪く、繰り返し検査や集団調査に適していない。また、大腸がんやその前悪性病変のスクリーニング方法として、便潜血検査、便ＤＮＡ検査、画像検査などもあるが、偽陽性率が高く感度も低いため、さらなる研究が必要である。
【0003】
バイオマーカーとは、疾患診断、リスク評価および予後判断に用いられる生体分子のことである。異なるタイプのがん患者の血漿／血清および尿のプロテオーム解析を通じて、腫瘍の発生や進展に関連する一連のタンパク質マーカーが発見され、これらのマーカーは、がんのスクリーニング、診断、予後のモニターリングに利用できるようになった。大腸がん診断のための臨床バイオマーカーは不足しており、特に非侵襲的バイオマーカーが発見された意義は重大である。
【発明の概要】
【0004】
本発明は、大腸がん血清バイオマーカーとしての成長ホルモン（ＧＨとも称する、以下同じ。）の使用を提供することを目的とする。
【0005】
上記本発明の目的は、以下に示される技術的解決手段によって実現される。
成長ホルモンであって、非診断目的の大腸がん判定において大腸がん血清バイオマーカーとして使用される。
成長ホルモンであって、非診断目的の大腸がん判定において大腸がん血清バイオマーカーとして使用される。
【0006】
大腸がん血清バイオマーカーであって、成長ホルモンを含む。
【0007】
上記成長ホルモンは、ヒト成長ホルモンである。
【0008】
上記のいずれか１つに記載の大腸がん血清バイオマーカーを検出するための大腸がん血清バイオマーカーキットであって、成長ホルモンの免疫グロブリンＧ抗体を含む。
【0009】
上記大腸がん血清バイオマーカーキットであって、定量チップ、サンプル希釈液、２０倍希釈された第１洗浄液（２０×洗浄液Ｉ）、２０倍希釈された第２洗浄液（２０×洗浄液ＩＩ）、標準混合物、成長ホルモンの免疫グロブリンＧ抗体、Ｃｙ３－ストレプトアビジン、スライドグラス洗浄乾燥器およびシールを含む。
【0010】
上記大腸がん血清バイオマーカーを検出する方法であって、
血清サンプルを取得するステップａと、血清サンプルを検査するステップｂと、を含み、
前記ステップｂは、定量チップを乾燥するステップｂ１と、標準品を調製するステップｂ２と、定量チップを操作するステップｂ３と、を含み、
前記ステップｂ１は、定量チップを箱から取り出し、室温で２０～３０分放置した後、包装袋を開けてシールを外してから、定量チップを乾燥器または室温で１～２時間乾燥させることを含み、
前記ステップｂ２は、
５００μＬのサンプル希釈液を標準混合物のチューブレットに添加し、標準混合物を再溶解し、続いて、チューブレットを開く前に、最初に迅速に遠心分離し、溶解粉末を上下に軽く吹き、当該チューブレットをＳｔｄ１とマークするステップｂ２１と、
６つのきれいな遠心管をそれぞれＳｔｄ２、Ｓｔｄ３、Ｓｔｄ４、Ｓｔｄ５、Ｓｔｄ６、Ｓｔｄ７とマークし、各遠心管に２００μＬのサンプル希釈液を添加するステップｂ２２と、
Ｓｔｄ１とマークした遠心管から抽出した１００μＬのサンプル希釈液をＳｔｄ２とマークした遠心管に軽く混合し、続いて、Ｓｔｄ２とマークした遠心管から抽出した１００μＬのサンプル希釈液をＳｔｄ３とマークした遠心管に添加し、順次類推し、このようにＳｔｄ７とマークした遠心管まで勾配希釈し、標準液を得るステップｂ２３と、
Ｓｔｄ７とマークした遠心管から１００μＬの標準液を他の新しい遠心管に抽出して標準品とするステップｂ２４と、
を含み、
前記ステップｂ３は、
定量チップの各ウェルに１００μＬのサンプル希釈液を添加し、室温で１時間インキュベートしてから定量チップを封止するステップｂ３１と、
各ウェルからサンプル希釈液を吸引し、ステップｂ２で調製された標準品から８０μＬの標準液を採取し、血清サンプルとともに各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートするステップｂ３２と、
定量チップを洗浄するステップｂ３３であって、まず、希釈されていない第１洗浄液を使用して、１ウェルあたり２５０μＬ、各回１０秒間高強度振とうしながら１０回洗浄してから脱イオン水で第１洗浄液を２０倍希釈し、続いて、希釈されていない第２洗浄液を使用して、１ウェルあたり２５０μＬ、各回１０秒間高強度振とうしながら６回洗浄してから脱イオン水で第２洗浄液を２０倍希釈するステップｂ３３と、
成長ホルモンの免疫グロブリンＧ抗体をインキュベートするステップｂ３４であって、成長ホルモンの免疫グロブリンＧ抗体を充填したチューブレットを遠心分離してから、１．４ｍｌのサンプル希釈液を添加し、均一に混合した後、再度遠心分離し、続いて、各ウェルに成長ホルモンの免疫グロブリンＧ抗体を８０μＬ添加し、室温でシェーカーにおいて２時間インキュベートするステップｂ３４と、
前記ステップｂ３３と同様な洗浄を行うステップｂ３５と、
Ｃｙ３－ストレプトアビジンをインキュベートするステップｂ３６であって、Ｃｙ３－ストレプトアビジンを充填したチューブレットを遠心分離してから１．４ｍｌのサンプル希釈液を添加し、均一に混合した後、再度遠心分離し、続いて、Ｃｙ３－ストレプトアビジン８０μＬを各ウェルに添加し、定量チップをアルミ箔紙で包み込み、光を避けて室温でシェーカーにおいて１時間インキュベートするステップｂ３６と、
前記ステップｂ３３と同様な洗浄を行うステップｂ３７と、
蛍光検出するステップｂ３８であって、レーザースキャナーで信号をスキャンし、Ｃｙ３またはグリーンチャンネルを使用するステップｂ３８と、
ＱＡＨ－ＣＵＳＴのデータ解析ソフトウェアを用いてデータ解析を行い、各血清サンプル中のＧＨの含量を求めるステップｂ３９と、
を含む。
血清サンプルを取得するステップａと、血清サンプルを検査するステップｂと、を含み、
前記ステップｂは、定量チップを乾燥するステップｂ１と、標準品を調製するステップｂ２と、定量チップを操作するステップｂ３と、を含み、
前記ステップｂ１は、定量チップを箱から取り出し、室温で２０～３０分放置した後、包装袋を開けてシールを外してから、定量チップを乾燥器または室温で１～２時間乾燥させることを含み、
前記ステップｂ２は、
５００μＬのサンプル希釈液を標準混合物のチューブレットに添加し、標準混合物を再溶解し、続いて、チューブレットを開く前に、最初に迅速に遠心分離し、溶解粉末を上下に軽く吹き、当該チューブレットをＳｔｄ１とマークするステップｂ２１と、
６つのきれいな遠心管をそれぞれＳｔｄ２、Ｓｔｄ３、Ｓｔｄ４、Ｓｔｄ５、Ｓｔｄ６、Ｓｔｄ７とマークし、各遠心管に２００μＬのサンプル希釈液を添加するステップｂ２２と、
Ｓｔｄ１とマークした遠心管から抽出した１００μＬのサンプル希釈液をＳｔｄ２とマークした遠心管に軽く混合し、続いて、Ｓｔｄ２とマークした遠心管から抽出した１００μＬのサンプル希釈液をＳｔｄ３とマークした遠心管に添加し、順次類推し、このようにＳｔｄ７とマークした遠心管まで勾配希釈し、標準液を得るステップｂ２３と、
Ｓｔｄ７とマークした遠心管から１００μＬの標準液を他の新しい遠心管に抽出して標準品とするステップｂ２４と、
を含み、
前記ステップｂ３は、
定量チップの各ウェルに１００μＬのサンプル希釈液を添加し、室温で１時間インキュベートしてから定量チップを封止するステップｂ３１と、
各ウェルからサンプル希釈液を吸引し、ステップｂ２で調製された標準品から８０μＬの標準液を採取し、血清サンプルとともに各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートするステップｂ３２と、
定量チップを洗浄するステップｂ３３であって、まず、希釈されていない第１洗浄液を使用して、１ウェルあたり２５０μＬ、各回１０秒間高強度振とうしながら１０回洗浄してから脱イオン水で第１洗浄液を２０倍希釈し、続いて、希釈されていない第２洗浄液を使用して、１ウェルあたり２５０μＬ、各回１０秒間高強度振とうしながら６回洗浄してから脱イオン水で第２洗浄液を２０倍希釈するステップｂ３３と、
成長ホルモンの免疫グロブリンＧ抗体をインキュベートするステップｂ３４であって、成長ホルモンの免疫グロブリンＧ抗体を充填したチューブレットを遠心分離してから、１．４ｍｌのサンプル希釈液を添加し、均一に混合した後、再度遠心分離し、続いて、各ウェルに成長ホルモンの免疫グロブリンＧ抗体を８０μＬ添加し、室温でシェーカーにおいて２時間インキュベートするステップｂ３４と、
前記ステップｂ３３と同様な洗浄を行うステップｂ３５と、
Ｃｙ３－ストレプトアビジンをインキュベートするステップｂ３６であって、Ｃｙ３－ストレプトアビジンを充填したチューブレットを遠心分離してから１．４ｍｌのサンプル希釈液を添加し、均一に混合した後、再度遠心分離し、続いて、Ｃｙ３－ストレプトアビジン８０μＬを各ウェルに添加し、定量チップをアルミ箔紙で包み込み、光を避けて室温でシェーカーにおいて１時間インキュベートするステップｂ３６と、
前記ステップｂ３３と同様な洗浄を行うステップｂ３７と、
蛍光検出するステップｂ３８であって、レーザースキャナーで信号をスキャンし、Ｃｙ３またはグリーンチャンネルを使用するステップｂ３８と、
ＱＡＨ－ＣＵＳＴのデータ解析ソフトウェアを用いてデータ解析を行い、各血清サンプル中のＧＨの含量を求めるステップｂ３９と、
を含む。
【0011】
本発明における選択可能な技術的解決手段は、単独で実施されても組み合わせて実施されてもよく、また、本発明のいずれかの技術的解決手段に係る構成は、他の技術的解決手段においても使用できる。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、非診断目的の大腸がん判定に用いる大腸がん血清バイオマーカーとしてＧＨを使用することによって、大腸がん血清スクリーニングの感度および特異度（特異性）を向上できる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明において、「ＲＯＣ曲線（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ）」または「ＲＯＣプロット」は、判別閾値に応じる二項分類器システムの性能変化を示すグラフ曲線である。この曲線は、個々の閾値の設定で偽陽性率に対する真陽性率のグラフをプロットことによって作成される。真陽性率は、感度とも称する。偽陽性率は、１－特異度として計算される。したがって、ＲＯＣ曲線は、カットオフ値の範囲における真陽性率対偽陽性率（感度 ＶＳ １－特異度）のグラフ表示であり、臨床的に使用する最適なカットオフ値（切捨値）を選択する方法である。精度をＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）として表すと、検査性能の比較するための有用なパラメータが提供される。ＡＵＣが１に近いことは、当該検査が高感度かつ高特異度を有することを示し、ＡＵＣが０．５に近いことは、当該検査が感度も特異度もないことを示す。
【0015】
試験サンプルと対照サンプルまたは参照サンプルとの間の差異に言及する場合の「統計的に差異」または「統計的に有意」という用語は、適切な統計的分析を用いた場合の各群が同じである確率が５％未満（たとえば、ｐ＜０．０５）である状況に対応する。言い換えれば、完全無作為のもとで同じ結果が得られる確率は、１００回の試行のうち５回未満である。いわゆる当業者であれば、適切な統計分析を選択する方法を知っている。通常、適切な統計解析は、調査対象の変数が正規分布を有するか否か（たとえば、コルモゴロフ・スミルノフ（Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ Ｓｍｉｒｎｏｖ）検定を使用する）および分散均一性が存在するか否か（たとえば、ルビーン（Ｌｅｖｅｎｅ）検定を使用する）に基づいて決定される。好ましくは，正規分布と分散均一性が存在する場合，たとえばｔ検定またはＡＮＯＶＡ検定のようなパラメトリックモデルが使用される。また、これら２つの要件の少なくとも１つが満たされない場合、通常、たとえばマンホイットニー（ＭａｎｎＷｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定またはクラスカルウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ）の検定のようなノンパラメトリックモデルが使用される。
【0016】
本発明において、成長ホルモン（ＧＨ）は、ヒト成長ホルモン（ｈｕｍａｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ：ｈＧＨ）であって、ヒトの下垂体前葉から分泌される１９１個のアミノ酸からなるペプチドホルモンであり、骨、内臓および全身の成長を促進し、タンパク質の合成を促進し、脂肪およびミネラルの代謝に影響を与え、ヒトの成長および発育に重要な役割を果たす。ヒトＧＨ遺伝子は１７番染色体の長腕（１７ｑ２２－２４）に位置し、相同性の高い５つの遺伝子からなり、５つのエクソンと４つのイントロンとを含み、全長は約６６ｋｂである。循環血液におけるＧＨの分子形態は非均一で、様々な形態のモノマー、ホモポリマーまたはヘテロポリマー、分子断片、モノマーとその結合タンパク質との複合体などを含む。主な形態は、分子量２２ｋＤ、等電点５．１のＧＨモノマーで、４つのシステインを含む１９１個のアミノ酸残基からなる。
【0017】
以下、図面を参照しながら、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。いわゆる当業者が本発明の実施形態をよりよく理解できるようにするため、図面を参照しながら本発明の実施形態に係る技術的解決手段を明確かつ完全に説明する。なお、以下の実施形態は、本発明を説明するためにのみ用いられ、本発明の範囲を限定するものではない。また、実施形態において具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、従来の条件またはメーカーが推奨する条件に従う。
【0018】
（実施形態１）
一、血清サンプルの取得
募集により合計７０人の被験者からの血清サンプルを取得し、このうち、３９人が健常者、３１人が大腸がん患者からのものである。
一、血清サンプルの取得
募集により合計７０人の被験者からの血清サンプルを取得し、このうち、３９人が健常者、３１人が大腸がん患者からのものである。
【0019】
二、血清サンプルの検査
本実施形態では、ＱＡＨ－ＣＵＳＴキットを用いて各被験者からの血清サンプルを検査することにより、各血清サンプル中のＧＨ含量を求める。ＱＡＨ－ＣＵＳＴキットは、定量チップ（Ｑｕａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｘａｘ Ｇｌａｓｓ Ｃｈｉｐ）、サンプル希釈液、２０倍希釈された第１洗浄液（２０× Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ）、２０倍希釈された第２洗浄液（２０× Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ）、標準混合物（凍結乾燥サイトカイン標準ミックス＊（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｍｉｘ ＊））、ＧＨに対する免疫グロブリンＧ抗体（Detection antibody）、ＣＣｙ３－ストレプトアビジン（Cy3equivalent dye-conjugated Streptavidin）、スライドグラス洗浄乾燥器（Slide washer Dryer）およびシールを含む。具体的に検査方法は、以下に示されるステップを含む。
本実施形態では、ＱＡＨ－ＣＵＳＴキットを用いて各被験者からの血清サンプルを検査することにより、各血清サンプル中のＧＨ含量を求める。ＱＡＨ－ＣＵＳＴキットは、定量チップ（Ｑｕａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｘａｘ Ｇｌａｓｓ Ｃｈｉｐ）、サンプル希釈液、２０倍希釈された第１洗浄液（２０× Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ）、２０倍希釈された第２洗浄液（２０× Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ）、標準混合物（凍結乾燥サイトカイン標準ミックス＊（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｍｉｘ ＊））、ＧＨに対する免疫グロブリンＧ抗体（Detection antibody）、ＣＣｙ３－ストレプトアビジン（Cy3equivalent dye-conjugated Streptavidin）、スライドグラス洗浄乾燥器（Slide washer Dryer）およびシールを含む。具体的に検査方法は、以下に示されるステップを含む。
【0020】
ステップＳ１、定量チップの乾燥
定量チップを箱から取り出し、室温で２０～３０分放置した後、包装袋を開けてシールを外してから、定量チップを乾燥器または室温で１～２時間乾燥させる。
定量チップを箱から取り出し、室温で２０～３０分放置した後、包装袋を開けてシールを外してから、定量チップを乾燥器または室温で１～２時間乾燥させる。
【0021】
ステップＳ２、標準品の調製
ステップＳ２１、５００μＬのサンプル希釈液を標準混合物のチューブレットに添加し、標準混合物を再溶解した。チューブレットを開く前に、最初に迅速に遠心分離し、溶解粉末を上下に軽く吹き、このチューブレットをＳｔｄ１とマークする。
ステップＳ２１、５００μＬのサンプル希釈液を標準混合物のチューブレットに添加し、標準混合物を再溶解した。チューブレットを開く前に、最初に迅速に遠心分離し、溶解粉末を上下に軽く吹き、このチューブレットをＳｔｄ１とマークする。
【0022】
ステップＳ２２、６つのきれいな遠心管をそれぞれＳｔｄ２、Ｓｔｄ３、Ｓｔｄ４、Ｓｔｄ５、Ｓｔｄ６、Ｓｔｄ７とマークし、各遠心管に２００μＬのサンプル希釈液を添加する。
【0023】
ステップＳ２３、Ｓｔｄ１とマークした遠心管から抽出した１００μＬのサンプル希釈液をＳｔｄ２とマークした遠心管に軽く混合し、続いて、Ｓｔｄ２とマークした遠心管から抽出した１００μＬのサンプル希釈液をＳｔｄ３とマークした遠心管に添加し、順次類推し、このようにＳｔｄ７とマークした遠心管まで勾配希釈し、標準液を得る。
【0024】
ステップＳ２４、Ｓｔｄ７とマークした遠心管から１００μＬの標準液を他の新しい遠心管に抽出し、ＣＮＴＲＬとマークし陰性対照とした。
【0025】
ステップＳ３、定量チップの操作フロー
ステップＳ３１、定量チップの各ウェルに１００μＬのサンプル希釈液を添加し、室温でシェーカーにおいて１時間インキュベートしてから、定量チップを封止する。
ステップＳ３１、定量チップの各ウェルに１００μＬのサンプル希釈液を添加し、室温でシェーカーにおいて１時間インキュベートしてから、定量チップを封止する。
【0026】
ステップＳ３２、各ウェルからサンプル希釈液を吸引し、ＣＮＴＲＬとマークした遠心管から８０μＬの標準液を採取し、血清サンプル（サンプル２倍希釈）とともにウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートする。
【0027】
ステップＳ３３、定量チップ（スライドグラス）を洗浄する。本実施形態では、チップウェルウォッシャーとしてセモス・チェンティフィッチ・ヴェルヴァシュヴェーザ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｗｅｌｌｗａｓｈ Ｖｅｒｓａ）を用いて、２段階に分けて行う。まず、１×洗浄液Ｉ（希釈されていない洗浄液Ｉ）を使用して、１ウェルあたり２５０μＬ、各回１０秒間高強度振とうしながら１０回洗浄してから脱イオン水で２０×洗浄液Ｉを希釈（洗浄液Ｉを２０倍希釈）する。続いて、１×洗浄液ＩＩ（希釈されていない洗浄液ＩＩ）を使用して、１ウェルあたり２５０μＬ、各回１０秒間高強度振とうしながら６回洗浄してから脱イオン水で２０×洗浄液ＩＩを希釈（洗浄液ＩＩを２０倍希釈）する。
【0028】
ステップＳ３４、ＧＨの免疫グロブリンＧ抗体のインキュベート
ＧＨの免疫グロブリンＧ抗体を充填したチューブレットを遠心分離し、続いて、１．４ｍｌのサンプル希釈液を添加し、均一に混合した後、再度速やかに遠心分離し、続いて、各ウェルにＧＨの免疫グロブリンＧ抗体を８０μＬ添加し、室温（ＲＴ）でシェーカーにおいて２時間インキュベートする。
ＧＨの免疫グロブリンＧ抗体を充填したチューブレットを遠心分離し、続いて、１．４ｍｌのサンプル希釈液を添加し、均一に混合した後、再度速やかに遠心分離し、続いて、各ウェルにＧＨの免疫グロブリンＧ抗体を８０μＬ添加し、室温（ＲＴ）でシェーカーにおいて２時間インキュベートする。
【0029】
ステップＳ３５、洗浄
ステップＳ３３と同様な洗浄を行う。
ステップＳ３３と同様な洗浄を行う。
【0030】
ステップＳ３６、Ｃｙ３－ストレプトアビジンのインキュベート
Ｃｙ３－ストレプトアビジンを充填したチューブレットを遠心分離してからサンプル希釈液１．４ｍｌを添加し、再度速やかに遠心分離し、続いて、Ｃｙ３－ストレプトアビジン８０μＬを各ウェルに添加し、定量チップ（スライドグラス）をアルミ箔紙で包み込み、光を避けて室温（ＲＴ）でシェーカーにおいて１時間インキュベートする。
Ｃｙ３－ストレプトアビジンを充填したチューブレットを遠心分離してからサンプル希釈液１．４ｍｌを添加し、再度速やかに遠心分離し、続いて、Ｃｙ３－ストレプトアビジン８０μＬを各ウェルに添加し、定量チップ（スライドグラス）をアルミ箔紙で包み込み、光を避けて室温（ＲＴ）でシェーカーにおいて１時間インキュベートする。
【0031】
ステップＳ３７、洗浄
ステップＳ３３と同様な洗浄を行う。
ステップＳ３３と同様な洗浄を行う。
【0032】
ステップＳ３８、蛍光検出
レーザースキャナーで信号をスキャンし、Ｃｙ３またはグリーンチャンネル（励起周波数＝５３２ｎｍ）を採用する。
本実施形態では、ＩｎｎｏＳｃａｎ ３００、装置型番：ＩｎｎｏＳｃａｎ ３００ ＭｉｃｒｏａｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒ、メーカー：Ｉｎｎｏｐｓｙｓ、産地：Ｐａｒｃ ｄ’Ａｃｔｉｖｉｔｅｓ Ａｃｔｉｖｅｓｔｒｅ、３１ ３９０ Ｃａｒｂｏｎｎｅ － Ｆｒａｎｃｅ、スキャンパラメータ： ＷａｖｅＬｅｎｇｈ： ５３２ｎｍ、Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ： １０μｍ、を採用する。
レーザースキャナーで信号をスキャンし、Ｃｙ３またはグリーンチャンネル（励起周波数＝５３２ｎｍ）を採用する。
本実施形態では、ＩｎｎｏＳｃａｎ ３００、装置型番：ＩｎｎｏＳｃａｎ ３００ ＭｉｃｒｏａｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒ、メーカー：Ｉｎｎｏｐｓｙｓ、産地：Ｐａｒｃ ｄ’Ａｃｔｉｖｉｔｅｓ Ａｃｔｉｖｅｓｔｒｅ、３１ ３９０ Ｃａｒｂｏｎｎｅ － Ｆｒａｎｃｅ、スキャンパラメータ： ＷａｖｅＬｅｎｇｈ： ５３２ｎｍ、Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ： １０μｍ、を採用する。
【0033】
ステップＳ３９、ＱＡＨ－ＣＵＳＴのデータ解析ソフトウェアを用いてデータ解析を行い、各血清サンプル中のＧＨの含量を求める。
【0034】
三、実験結果
Ｆｏｌｄｃｈａｎｇｅ（ＦＣ）： 差の倍数を表し、２群の結果の比率を表す。
ｌｏｇＦＣ： 差の倍数を表し、底は２である。
Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ： アップ アップレギュレーション、Ｄｏｗｎ ダウンレギュレーション。
ｅｎｔｒｅｚＩＤ、ｕｎｉｐｒｏｔＩＤ： タンパク質番号である。
具体的なデータは表１に示されるとおりである。
Ｆｏｌｄｃｈａｎｇｅ（ＦＣ）： 差の倍数を表し、２群の結果の比率を表す。
ｌｏｇＦＣ： 差の倍数を表し、底は２である。
Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ： アップ アップレギュレーション、Ｄｏｗｎ ダウンレギュレーション。
ｅｎｔｒｅｚＩＤ、ｕｎｉｐｒｏｔＩＤ： タンパク質番号である。
具体的なデータは表１に示されるとおりである。
【表1】
【0035】
図１に示されるように、大腸がん群ではＧＨ値が上昇し、他の群との統計的に有意である（ここで、図１の健常群と大腸がん群との「＊」は統計的差異ｐ値が０．０５未満であることを示す）。さらに、データを解析し、ＲＯＣ曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ、受信者操作特性曲線）は、図２に示すように、患者のＧＨのＡＵＣ（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｒｏｃ Ｃｕｒｖｅ、ＡＵＣ値はＲＯＣ曲線で覆われた領域の面積であり、ＡＵＣが大きいほど２群間の識別効果が高い）値は０．６１８であった。
【0036】
本発明の任意の実施形態は、独立した技術的解決手段としてもよいし、他の実施形態と組み合わせてもよい。本明細書に記載されたすべての特許文献および刊行物は、これらがいわゆる当業者の周知技術であることを示し、本発明において使用できる。ここで引用されるすべての特許文献および刊行物は、それぞれの刊行が具体的に単独で参照されるのと同様に、参照文献に同様に列挙される。本発明は、任意の１つまたは複数の要素が欠けている場合や１つまたは複数の制限がある場合でも実施でき、ここでは特に説明していない。ここで用いられる用語および表現は、それらに限定されるものではなく、記述されたこれらの用語および解釈を示す意図もなく、いかなる同等の特徴も排除されるものではない。しかし、本明細書および特許請求の範囲内で任意の適切な変更または修正が可能であることが分かる。本明細書に記載された実施形態は、いくつかの実施形態におけるいくつかの実施形態および特徴であることが理解される。いわゆる当業者は、本明細書の説明の真髄に従って、変更および変更を行うことができる。これらの変更および変更は、本発明の保護範囲および独立請求項および従属請求項によって制限される範囲内に属するものとみなされる。
【図1】
【図2】
【外国語明細書】