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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024045047
(43)【公開日】2024-04-02
(54)【発明の名称】肥満改善剤の有効性予測方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20240326BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20240326BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240326BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240326BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20240326BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALN20240326BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
C07K14/47
G01N33/53 M
G01N33/50 Q
C12Q1/68
C12Q1/6869 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023150515
(22)【出願日】2023-09-15
(31)【優先権主張番号】P 2022149573
(32)【優先日】2022-09-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＹＴＨＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】柳本 彩
(72)【発明者】
【氏名】斉藤 慎一郎
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045CB10
2G045DA14
2G045FB02
4B063QA01
4B063QA05
4B063QA13
4B063QQ02
4B063QQ53
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR43
4B063QR62
4B063QS10
4B063QS14
4B063QS24
4B063QS39
4H045AA10
4H045AA30
4H045CA40
4H045EA50
(57)【要約】
【課題】個々人に対するカテキン類含有肥満改善剤の有効性を予測する方法、及びそのためのマーカーを提供する。
【解決手段】男性被験者から採取された試料について、ＴＲＰＳ１、ＴＭＥＭ１６４、ＡＴＰ６Ｖ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｄ及びＲＩＮ３の５種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者に対するカテキン類含有肥満改善剤の有効性の予測方法。
【選択図】なし
【解決手段】男性被験者から採取された試料について、ＴＲＰＳ１、ＴＭＥＭ１６４、ＡＴＰ６Ｖ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｄ及びＲＩＮ３の５種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者に対するカテキン類含有肥満改善剤の有効性の予測方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
男性被験者から採取された試料について、ＴＲＰＳ１、ＴＭＥＭ１６４、ＡＴＰ６Ｖ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｄ及びＲＩＮ３の５種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者に対するカテキン類含有肥満改善剤の有効性の予測方法。
【請求項2】
前記発現レベルを測定する工程において、さらにＣＣＺ１Ｂ、ＨＯＯＫ３、ＲＡＢ３３Ｂ、ＮＬＫ、ＴＥＳＫ２、ＴＭ９ＳＦ１、ＬＳＴ１、ＢＡＧＥ２、ＡＢＣＦ３、ＦＢＸＬ２０、ＲＹＫ、ＳＬＣ２５Ａ４４、ＮＤＵＦＡＦ６、ＴＥＮ１、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＳＭＩＭ５、ＡＬＯＸ１２、ＣＮＮ３、ＺＢＴＢ３、ＳＬＣ６Ａ１４、ＹＡＲＳ２、ＺＮＦ６７２、ＣＡＶ２、ＢＲＤ７及びＳＰＡＧ７の２５種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定される、請求項１記載の方法。
【請求項3】
被験者に対するカテキン類含有肥満改善剤の有効性の予測が、被験者がカテキン類含有肥満改善剤を摂取した場合における内臓脂肪面積の変化量の予測である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項4】
前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値を教師サンプルとして、カテキン類含有肥満改善剤を服用した場合の内臓脂肪面積の変化量を予測する判別式を作成し、被験者から採取された試料から得られた同遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値を当該判別式に代入し、得られた結果から当該被験者がカテキン類含有肥満改善剤を摂取した場合における内臓脂肪面積の変化量を算出する、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
遺伝子又はその発現産物の発現レベルが皮膚表上脂質から採取されたｍＲＮＡの発現量の測定である、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
【請求項6】
前記カテキン類含有肥満改善剤が緑茶ポリフェノールを含有する肥満改善剤である、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
【請求項7】
試料の採取及び保存に必要な、用具及び試薬を含有する、請求項１～６のいずれか１項記載の方法に用いられるカテキン類含有肥満改善剤の有効性予測用キット。
【請求項8】
ＴＲＰＳ１、ＴＭＥＭ１６４、ＡＴＰ６Ｖ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｄ、ＲＩＮ３、ＣＣＺ１Ｂ、ＨＯＯＫ３、ＲＡＢ３３Ｂ、ＮＬＫ、ＴＥＳＫ２、ＴＭ９ＳＦ１、ＬＳＴ１、ＢＡＧＥ２、ＡＢＣＦ３、ＦＢＸＬ２０、ＲＹＫ、ＳＬＣ２５Ａ４４、ＮＤＵＦＡＦ６、ＴＥＮ１、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＳＭＩＭ５、ＡＬＯＸ１２、ＣＮＮ３、ＺＢＴＢ３、ＳＬＣ６Ａ１４、ＹＡＲＳ２、ＺＮＦ６７２、ＣＡＶ２、ＢＲＤ７及びＳＰＡＧ７の３０種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物からなる、男性被験者に対するカテキン類含有肥満改善剤の有効性予測マーカー。
【請求項9】
男性被験者から採取された試料における、ＴＲＰＳ１、ＴＭＥＭ１６４、ＡＴＰ６Ｖ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｄ及びＲＩＮ３の５種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベル、及び、ＴＲＰＳ１、ＴＭＥＭ１６４、ＡＴＰ６Ｖ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｄ及びＲＩＮ３の５種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを変数として含む判別式、に基づいて算出された前記式の値に基づいて、当該被験者に対するカテキン類含有肥満改善剤の有効性を予測する指標となる値を取得する工程を含む、取得方法。
【請求項10】
前記判別式が、教師サンプル集団の各人から取得した１つ以上の前記遺伝子又はその発現産物の発現レベルを説明変数とし、該集団の各人がカテキン類含有肥満改善剤を服用した場合の内臓脂肪面積の変化量を目的変数とした機械学習により構築される、請求項９記載の取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、個々人に対するカテキン類含有肥満改善剤の有効性を予測する方法、及びそのためのマーカーに関する。
【背景技術】
【0002】
近年、多くの人々が肥満の問題を抱えている。日本においても食生活を取り巻く社会環境の変化、すなわち食生活の欧米化や運動不足から肥満の人が急激に増加している。一般的に、肥満とは正常な状態と比較して体重が多い状態、あるいは体脂肪が過剰に蓄積した状態を指す。肥満は糖尿病や脂質異常症・高血圧・心血管疾患などの生活習慣病をはじめとして数多くの疾患の原因となるため、健康づくりにおいて肥満の予防・対策は重要な意味を持つ。また、その治療費や健康対策費の増大など経済への影響も多大であることから、肥満を改善することは重要な課題となっている。
【0003】
肥満にはさまざまな生活環境が関与している。食習慣の変化や運動不足による身体活動量の低下などにより、摂取エネルギー量が消費エネルギー量を上回ることにより、過剰分が体脂肪として蓄積されることが肥満の原因である。したがって肥満の予防・治療には、摂取エネルギー量と消費エネルギー量のバランス改善、すなわち食事制限と運動が重要となる。これまで、肥満改善を目的とする肥満改善素材が多種開発されているが、それらの素材は、必ずしもすべての者において一様に、期待される最大限の効果を発揮するわけではない。肥満改善を求める個人は、多種多様な肥満改善素材を自ら試し、自身に適したものを見つけねばならない。さらに、それらの素材の多くは、効果を発揮するためには長期的に摂取されねばならない。そのため、個人が自身に適した肥満改善素材を見つけるためには、長い期間と、コスト、労力を要する。さらに、たとえ個人が自身に有効な肥満改善素材を見つけたとしても、それが数ある肥満改善素材の中で自身にとって最適なものであるか、又は該素材の最大限の効果が自身に対して発揮されているかを判別することは困難である。
【0004】
緑茶ポリフェノール又はその主要成分であるカテキン類は、肥満を改善する素材として報告されている。特許文献１及び２には、カテキン類の摂取は、肥満改善、例えば、内臓脂肪面積の低下、体重の低下、腹囲の低下、などをもたらすことが開示されている（非特許文献１、２、３）。しかしながら、カテキン類もまた、上述と同様に効果には個人差があり、必ずしも全ての使用者に対して十分な効果が発揮されるわけではなかった。
【0005】
一方、生体試料中のＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の解析によりヒトの生体内の現在、さらには将来の生理状態を調べる技術が開発されている。生体由来の核酸は、血液等の組織、退役、分泌物などから抽出することができ、特許文献１、２には、皮膚表上脂質（ＳＳＬ）から被験者の皮膚細胞に由来するＲＮＡ等の核酸を分離し、生体の解析用の試料として用いることが記載されている。
【0006】
従来、肥満に関連するとされている遺伝子は多数報告されており、また、カテキン類を投与した場合にそれに応じて発現が変化する遺伝子についても報告がある。
しかしながら、前者の遺伝子と後者の遺伝子は共通しておらず、カテキン類の脂質改善効果に関与する遺伝子についてはなんら報告されていない。
しかしながら、前者の遺伝子と後者の遺伝子は共通しておらず、カテキン類の脂質改善効果に関与する遺伝子についてはなんら報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】特開２０１５－１９９６８６号公報
【特許文献2】特開２０１８－１００２９３号公報
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】J Oleo Sci 50(7), 599-605, 2001
【非特許文献2】J Oleo Sci 50(9), 717-728, 2001
【非特許文献3】Prog Med 22(9), 2189-2203, 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、個々人に対するカテキン類含有肥満改善剤の有効性を予測する方法、及びそのためのマーカーを提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、男性被験者（単に、「被験者」とも称す）に対してカテキン類含有肥満改善剤を服用させてその内臓脂肪面積の変化量を調べると共に、被験者から検出された全てのＳＳＬ由来のＲＮＡの発現量のデータを取得して相関検定を行ったところ、当該ＲＮＡの発現量が内臓脂肪面積の変化量と相関する遺伝子が見出され、これを指標として被験者におけるカテキン類含有肥満改善剤の有効性の程度を予測できることを見出した。
【0011】
すなわち、本発明は、以下の１）～４）に係るものである。
１）男性被験者から採取された試料について、ＴＲＰＳ１、ＴＭＥＭ１６４、ＡＴＰ６Ｖ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｄ及びＲＩＮ３の５種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者に対するカテキン類含有肥満改善剤の有効性の予測方法。
２）試料の採取及び保存に必要な、用具及び試薬を含有する、１）の方法に用いられるカテキン類含有肥満改善剤の有効性予測用キット。
３）ＴＲＰＳ１、ＴＭＥＭ１６４、ＡＴＰ６Ｖ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｄ、ＲＩＮ３、ＣＣＺ１Ｂ、ＨＯＯＫ３、ＲＡＢ３３Ｂ、ＮＬＫ、ＴＥＳＫ２、ＴＭ９ＳＦ１、ＬＳＴ１、ＢＡＧＥ２、ＡＢＣＦ３、ＦＢＸＬ２０、ＲＹＫ、ＳＬＣ２５Ａ４４、ＮＤＵＦＡＦ６、ＴＥＮ１、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＳＭＩＭ５、ＡＬＯＸ１２、ＣＮＮ３、ＺＢＴＢ３、ＳＬＣ６Ａ１４、ＹＡＲＳ２、ＺＮＦ６７２、ＣＡＶ２、ＢＲＤ７及びＳＰＡＧ７の３０種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物からなる、男性被験者に対するカテキン類含有肥満改善剤の有効性予測マーカー。
４）男性被験者から採取された試料における、ＴＲＰＳ１、ＴＭＥＭ１６４、ＡＴＰ６Ｖ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｄ及びＲＩＮ３の５種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベル、及び、ＴＲＰＳ１、ＴＭＥＭ１６４、ＡＴＰ６Ｖ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｄ及びＲＩＮ３の５種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを変数として含む判別式、に基づいて算出された前記式の値に基づいて、当該被験者に対するカテキン類含有肥満改善剤の有効性を予測する指標となる値を取得する工程を含む、取得方法。
１）男性被験者から採取された試料について、ＴＲＰＳ１、ＴＭＥＭ１６４、ＡＴＰ６Ｖ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｄ及びＲＩＮ３の５種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該被験者に対するカテキン類含有肥満改善剤の有効性の予測方法。
２）試料の採取及び保存に必要な、用具及び試薬を含有する、１）の方法に用いられるカテキン類含有肥満改善剤の有効性予測用キット。
３）ＴＲＰＳ１、ＴＭＥＭ１６４、ＡＴＰ６Ｖ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｄ、ＲＩＮ３、ＣＣＺ１Ｂ、ＨＯＯＫ３、ＲＡＢ３３Ｂ、ＮＬＫ、ＴＥＳＫ２、ＴＭ９ＳＦ１、ＬＳＴ１、ＢＡＧＥ２、ＡＢＣＦ３、ＦＢＸＬ２０、ＲＹＫ、ＳＬＣ２５Ａ４４、ＮＤＵＦＡＦ６、ＴＥＮ１、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＳＭＩＭ５、ＡＬＯＸ１２、ＣＮＮ３、ＺＢＴＢ３、ＳＬＣ６Ａ１４、ＹＡＲＳ２、ＺＮＦ６７２、ＣＡＶ２、ＢＲＤ７及びＳＰＡＧ７の３０種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物からなる、男性被験者に対するカテキン類含有肥満改善剤の有効性予測マーカー。
４）男性被験者から採取された試料における、ＴＲＰＳ１、ＴＭＥＭ１６４、ＡＴＰ６Ｖ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｄ及びＲＩＮ３の５種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベル、及び、ＴＲＰＳ１、ＴＭＥＭ１６４、ＡＴＰ６Ｖ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｄ及びＲＩＮ３の５種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを変数として含む判別式、に基づいて算出された前記式の値に基づいて、当該被験者に対するカテキン類含有肥満改善剤の有効性を予測する指標となる値を取得する工程を含む、取得方法。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、個々人に対するカテキン類含有脂質改善剤の有効性を、該肥満改善剤を実際に用いることなく予測することができる。本発明により、消費者は、カテキン類含肥満改善剤を実際に服用せずとも、それが自身にとって有効かどうかを予測することができる。すなわち、本発明によれば、個々人が肥満改善素材を選択するための指針が提供され、自身に適した適切な素材を選択するための時間、コスト、労力等の使用者の負担が低減されるだけでなく、使用者の不安による効果の低下を抑えることで、該素材の効果の向上に繋がり得る。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】３０遺伝子の発現量データを変数に用いた予測モデルの精度。
【図2】５遺伝子の発現量データを変数に用いた予測モデルの精度。
【図3】５遺伝子の発現量データに加えて被験者の年齢及び内臓脂肪面積を変数に用いた予測モデルの精度。
【図4】１遺伝子の発現量データを変数に用いた予測モデルの精度。
【図5】１遺伝子の発現量データを変数に用いた予測モデルの精度。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本明細書中で引用されたすべての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
【0015】
本発明において、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」と云う用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれ、「ＲＮＡ」には、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎｏｎ-ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。
【0016】
本発明において「遺伝子」とは、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡの他、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、当該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及びこれらの断片を包含するものであって、ＤＮＡを構成する塩基の配列情報の中に、何らかの生物学的情報が含まれているものを意味する。
また、当該「遺伝子」は特定の塩基配列で表される「遺伝子」だけではなく、これらの同族体（すなわち、ホモログもしくはオーソログ）、遺伝子多型等の変異体、及び誘導体をコードする核酸が包含される。
また、当該「遺伝子」は特定の塩基配列で表される「遺伝子」だけではなく、これらの同族体（すなわち、ホモログもしくはオーソログ）、遺伝子多型等の変異体、及び誘導体をコードする核酸が包含される。
【0017】
本発明において、遺伝子の名称は、ＮＣＢＩ（[www.ncbi.nlm.nih.gov/]）に記載のあ
るＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｙｍｂｏｌに従う。
るＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｙｍｂｏｌに従う。
【0018】
本発明において、遺伝子の「発現産物」とは、遺伝子の転写産物及び翻訳産物を包含する概念である。「転写産物」とは、遺伝子（ＤＮＡ）から転写されて生じるＲＮＡであり、「翻訳産物」とは、ＲＮＡに基づき翻訳合成される、遺伝子にコードされたタンパク質を意味する。
【0019】
本発明において、「肥満改善」とは、肥満度の改善のことをいう。「肥満度」は、例えば、内臓脂肪面積、内臓脂肪量、皮下脂肪面積、皮下脂肪量、体脂肪量、体脂肪率、ウエスト周囲長、腹囲、体重、Ｂｏｄｙ Ｍａｓｓ Ｉｎｄｅｘ（ＢＭＩ）、ローレル指数、カウプ指数等の体格指数、体格指数より算出される肥満度指数、上腕三頭筋部皮下脂肪厚、肩甲骨下部皮下脂肪厚、基礎代謝量等を指標として評価することができる。加えて、内臓脂肪と相関のある血中マーカー（アディポネクチンやレプチン等のサイトカイン類やＴＮＦα、ＩＬ－６、ＣＲＰ等の炎症マーカー、ＬＤＬ－コレステロールや中性脂肪等の血中脂質、肝機能マーカー、血糖値など）でも代替可能である。したがって、「肥満改善剤」の効果指標としては上記評価指標のいずれか１つ以上を使用することができるが、肥満の中でも生活習慣病の発症に大きく影響するのは「内臓脂肪型肥満」であることが知られており、メタボリックシンドロームの診断基準において内臓脂肪蓄積が必須である（厚生労働省 生活習慣病予防のための健康情報サイト ｅ－ヘルスネット）という点から、内臓脂肪面積を用いるのが好ましい。内臓脂肪面積とは、体の断面積に占める脂肪の面積を意味し、男女ともに１００ｃｍ２未満であれば正常、１００ｃｍ２以上であれば内臓脂肪が多い状態とされている。
【0020】
本発明において、「カテキン類含有肥満改善剤」とは、カテキン類を含有し、ヒトに投与又は摂取した場合に肥満改善効果、例えば、内臓脂肪面積の低下、体重の低下などをもたらす（非特許文献１、２、３）、医薬品、医薬部外品又は食品（機能性食品、病者用食品、特定保健用食品、サプリメント等を含む）となる製剤を指す。製剤形態は、固形、半固形又は液状のいずれでも良いが、好ましくは飲料である、
ここで、「カテキン類」としては、カテキン、カテキンガレート、ガロカテキン及びガロカテキンガレート等の非エピ体；エピカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキン及びエピガロカテキンガレート等のエピ体が挙げられる。ここで、カテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピカテキンガレート及びエピガロカテキンガレートはガレート体、カテキン、ガロカテキン、エピカテキン及びエピガロカテキンは非ガレート体と称する。カテキン類は、上記に挙げた非重合体カテキン類のいずれか１種または２種以上の組み合わせであり得る。カテキン類は上記８種を含むのが好ましい。なお、本発明において、カテキン類の含有量は上記８種の合計量に基づいて定義される。
ここで、「カテキン類」としては、カテキン、カテキンガレート、ガロカテキン及びガロカテキンガレート等の非エピ体；エピカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキン及びエピガロカテキンガレート等のエピ体が挙げられる。ここで、カテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピカテキンガレート及びエピガロカテキンガレートはガレート体、カテキン、ガロカテキン、エピカテキン及びエピガロカテキンは非ガレート体と称する。カテキン類は、上記に挙げた非重合体カテキン類のいずれか１種または２種以上の組み合わせであり得る。カテキン類は上記８種を含むのが好ましい。なお、本発明において、カテキン類の含有量は上記８種の合計量に基づいて定義される。
【0021】
本発明のカテキン類含有肥満改善剤において、肥満改善効果の点から、カテキン類は、カテキン類中のエピ体の割合が、好ましくは３５～９５質量％、より好ましくは４５～９２質量％、更に好ましくは５０～９０質量％である。また、カテキン類は、カテキン類中のガレート体の割合が、好ましくは５～９５質量％、より好ましくは１０～８５質量％、更に好ましくは２５～６０質量％、更に好ましくは３５～５３質量％である。
カテキン類の分析は、通常知られている非重合体カテキン類の分析法のうち測定試料の状況に適した分析法により測定することができる。
カテキン類は、一般的には茶葉から抽出した茶抽出物、その濃縮物又はそれらの精製物（以下、これらを包括的に「茶抽出物等」とも称する）に含まれているため、これらから得られるものが好ましく使用される。
カテキン類の分析は、通常知られている非重合体カテキン類の分析法のうち測定試料の状況に適した分析法により測定することができる。
カテキン類は、一般的には茶葉から抽出した茶抽出物、その濃縮物又はそれらの精製物（以下、これらを包括的に「茶抽出物等」とも称する）に含まれているため、これらから得られるものが好ましく使用される。
【0022】
食品におけるカテキン類の含有量は、その使用形態により異なるが、飲料の形態では、通常０．０００１～１０質量％であり、好ましくは０．０００１～５質量％、より好ましくは０．００１～１質量％である。
医薬又は医薬部外品におけるカテキン類の含有量は、一般的に、０．０００１～２０質量％であり、好ましくは０．００１～１０質量％、より好ましくは０．０１～５質量％である。
錠剤や加工食品等の固形食品の形態では、カテキン類の含有量は、好ましくは５～１５質量％であり、より好ましくは６～１４．５質量％であり、より好ましくは７～１４質量％であり、より好ましくは１０．３～１３．５質量％である。
医薬又は医薬部外品におけるカテキン類の含有量は、一般的に、０．０００１～２０質量％であり、好ましくは０．００１～１０質量％、より好ましくは０．０１～５質量％である。
錠剤や加工食品等の固形食品の形態では、カテキン類の含有量は、好ましくは５～１５質量％であり、より好ましくは６～１４．５質量％であり、より好ましくは７～１４質量％であり、より好ましくは１０．３～１３．５質量％である。
【0023】
本発明において、被験者に対するカテキン類含有肥満改善剤の有効性の「予測」とは、被験者がカテキン類含有肥満改善剤が有効に作用する者か否かを明らかにする意味であり、検査、測定、判定又は評価支援などの用語で言い換えることもできる。本発明において、被験者に対するカテキン類含有肥満改善剤の有効性の「予測」、「検出」、「検査」、「測定」、「判定」又は「評価」という用語は、医師による診断を含むものではない。
【0024】
後述の実施例に示すとおり、男性被験者に対してカテキン類含有肥満改善剤を服用させ、その内臓脂肪面積の変化量を調べ、被験者から検出された全てのＳＳＬ由来のＲＮＡの発現量のデータとの相関検定を行い、ｐ＜０．０５かつ相関係数＜０．４、またはｐ＜０．０５かつ相関係数＞０．４となる遺伝子を抽出したところ、後記表１に示す３０種の遺伝子が選択された。
ここで、内臓脂肪面積の変化量とは、カテキン類含有肥満改善剤の摂取開始当日と１０週間摂取後の空腹時に測定された内臓脂肪面積の差（１０週間摂取後の内臓脂肪面積－摂取開始当日の内臓脂肪面積）である。尚、内臓脂肪面積は、パナソニック社製の内臓脂肪計ＥＷ―ＦＡ９０により測定された。
ここで、内臓脂肪面積の変化量とは、カテキン類含有肥満改善剤の摂取開始当日と１０週間摂取後の空腹時に測定された内臓脂肪面積の差（１０週間摂取後の内臓脂肪面積－摂取開始当日の内臓脂肪面積）である。尚、内臓脂肪面積は、パナソニック社製の内臓脂肪計ＥＷ―ＦＡ９０により測定された。
【0025】
したがって、斯かる３０種の遺伝子群より選択される遺伝子又はその発現産物を測定することにより、カテキン類含有肥満改善剤を服用した被験者の内臓脂肪面積の変化量を算出することができる。
すなわち、当該３０種の遺伝子は、被験者に対するカテキン類含有肥満改善剤の有効性を予測するためのバイオマーカーとなり得、該遺伝子又はその発現産物を指標に、カテキン類含有肥満改善剤を服用した被験者の内臓脂肪面積の変化量を予測すること、換言するとカテキン類含有肥満改善剤の個々の被験者に対する有効性の程度を予測することができ、カテキン類含有肥満改善剤の服用に適した被験者を選択することが可能になる。
すなわち、当該３０種の遺伝子は、被験者に対するカテキン類含有肥満改善剤の有効性を予測するためのバイオマーカーとなり得、該遺伝子又はその発現産物を指標に、カテキン類含有肥満改善剤を服用した被験者の内臓脂肪面積の変化量を予測すること、換言するとカテキン類含有肥満改善剤の個々の被験者に対する有効性の程度を予測することができ、カテキン類含有肥満改善剤の服用に適した被験者を選択することが可能になる。
【0026】
なお、上記のカテキン類含有肥満改善剤の被験者に対する有効性予測マーカーとなり得る遺伝子（以下、「標的遺伝子」とも称す）には、カテキン類含有肥満改善剤の被験者に対する有効性を予測するためのバイオマーカーとなり得る限り、当該遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子も包含される。ここで、実質的に同一の塩基配列とは、例えば、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴを用い、期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝－３の条件にて検索をした場合、当該遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらにより好ましく９８％以上の同一性があることを意味する。
【0027】
本発明のカテキン類含有肥満改善剤の被験者に対する有効性の予測方法は、男性被験者から採取された生体試料について、上記標的遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定する工程を含む。
本発明における男性被験者の例としては、肥満状態である者、肥満の改善を所望する者、高脂血症の改善を所望する者、高血糖の改善を所望する者、高血圧の改善を所望する者、それらの予備軍に該当する者、肥満に関連する病態を呈する者、カテキン類含有肥満改善剤を使用しているか又は使用を希望する者、カテキン類含有肥満改善剤の自身に対する有効性を知りたい者、などが挙げられる。好ましくは、該男性被験者は、肥満の改善を所望する者であって、かつカテキン類含有肥満改善剤の自身に対する有効性を知りたい者である。
本発明における男性被験者の例としては、肥満状態である者、肥満の改善を所望する者、高脂血症の改善を所望する者、高血糖の改善を所望する者、高血圧の改善を所望する者、それらの予備軍に該当する者、肥満に関連する病態を呈する者、カテキン類含有肥満改善剤を使用しているか又は使用を希望する者、カテキン類含有肥満改善剤の自身に対する有効性を知りたい者、などが挙げられる。好ましくは、該男性被験者は、肥満の改善を所望する者であって、かつカテキン類含有肥満改善剤の自身に対する有効性を知りたい者である。
【0028】
生体試料は、例えば、細胞、体液（血液等）、尿、分泌物（唾液、ＳＳＬ等）であり得るが、ＳＳＬを用いるのが好ましい。
ここで、「皮膚表上脂質（ＳＳＬ）」とは、皮膚の表上に存在する脂溶性画分をいい、皮脂と呼ばれることもある。一般に、ＳＳＬは、皮膚にある皮脂腺等の外分泌腺から分泌された分泌物を主に含み、皮膚表面を覆う薄い層の形で皮膚表上に存在している。ＳＳＬは、皮膚細胞で発現したＲＮＡを含む（前記特許文献１，２参照）。また、「皮膚」とは、特に限定しない限り、角層、表皮、真皮、毛包、ならびに汗腺、皮脂腺及びその他の腺等の組織を含む領域の総称である。ＳＳＬが採取される皮膚の部位としては、頭、顔、首、体幹、手足等の身体の任意の部位の皮膚が挙げられ、皮脂の分泌が多い部位、例えば顔の皮膚が好ましい。
ここで、「皮膚表上脂質（ＳＳＬ）」とは、皮膚の表上に存在する脂溶性画分をいい、皮脂と呼ばれることもある。一般に、ＳＳＬは、皮膚にある皮脂腺等の外分泌腺から分泌された分泌物を主に含み、皮膚表面を覆う薄い層の形で皮膚表上に存在している。ＳＳＬは、皮膚細胞で発現したＲＮＡを含む（前記特許文献１，２参照）。また、「皮膚」とは、特に限定しない限り、角層、表皮、真皮、毛包、ならびに汗腺、皮脂腺及びその他の腺等の組織を含む領域の総称である。ＳＳＬが採取される皮膚の部位としては、頭、顔、首、体幹、手足等の身体の任意の部位の皮膚が挙げられ、皮脂の分泌が多い部位、例えば顔の皮膚が好ましい。
【0029】
被験者の皮膚からのＳＳＬの採取には、皮膚からのＳＳＬの回収又は除去に用いられているあらゆる手段を採用することができる。好ましくは、後述するＳＳＬ吸収性素材、ＳＳＬ接着性素材、又は皮膚からＳＳＬをこすり落とす器具を使用することができる。ＳＳＬ吸収性素材又はＳＳＬ接着性素材としては、ＳＳＬに親和性を有する素材であれば特に限定されず、例えばポリプロピレン、パルプ等が挙げられる。皮膚からのＳＳＬの採取手順のより詳細な例としては、あぶら取り紙、あぶら取りフィルム等のシート状素材へＳＳＬを吸収させる方法、ガラス板、テープ等へＳＳＬを接着させる方法、スパーテル、スクレイパー等によりＳＳＬをこすり落として回収する方法、などが挙げられる。ＳＳＬの吸着性を向上させるため、脂溶性の高い溶媒を予め含ませたＳＳＬ吸収性素材を用いてもよい。一方、ＳＳＬ吸収性素材は、水溶性の高い溶媒や水分を含んでいるとＳＳＬの吸着が阻害されるため、水溶性の高い溶媒や水分の含有量が少ないことが好ましい。ＳＳＬ吸収性素材は、乾燥した状態で用いることが好ましい。
【0030】
採取されたＳＳＬは、直ちに後述の核酸又はタンパク質の抽出工程に用いられてもよく、又は、該核酸又はタンパク質抽出工程に用いるまで保存されてもよい。保存する場合、ＳＳＬは、好ましくは低温条件で保存される。ＳＳＬの保存の温度条件は、０℃以下であればよく、好ましくは－２０±２０℃～－８０±２０℃、より好ましくは－２０±１０℃
～－８０±１０℃、さらに好ましくは－２０±２０℃～－４０±２０℃、さらに好ましく
は－２０±１０℃～－４０±１０℃、さらに好ましくは－２０±１０℃、さらに好ましく
は－２０±５℃である。ＳＳＬの保存の期間は、特に限定されないが、好ましくは１２ヶ
月以下、例えば６時間以上１２ヶ月以下、より好ましくは６ヶ月以下、例えば１日間以上６ヶ月以下、さらに好ましくは３ヶ月以下、例えば３日間以上３ヶ月以下である。
～－８０±１０℃、さらに好ましくは－２０±２０℃～－４０±２０℃、さらに好ましく
は－２０±１０℃～－４０±１０℃、さらに好ましくは－２０±１０℃、さらに好ましく
は－２０±５℃である。ＳＳＬの保存の期間は、特に限定されないが、好ましくは１２ヶ
月以下、例えば６時間以上１２ヶ月以下、より好ましくは６ヶ月以下、例えば１日間以上６ヶ月以下、さらに好ましくは３ヶ月以下、例えば３日間以上３ヶ月以下である。
【0031】
本発明において、標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定対象としては、ＲＮＡ、そのＲＮＡをエンコードするＤＮＡ、そのＲＮＡにコードされるタンパク質、該タンパク質と相互作用をする分子、そのＲＮＡと相互作用する分子、又はそのＤＮＡと相互作用する分子等が挙げられ、ＲＮＡが好ましく、より好ましくはｍＲＮＡである。ここで、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク質と相互作用する分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、多糖、オリゴ糖、単糖、脂質、脂肪酸、及びこれらのリン酸化物、アルキル化物、糖付加物等、及び上記いずれかの複合体が挙げられる。また、発現レベルとは、当該遺伝子又は発現産物の発現量や活性を包括的に意味する。
【0032】
本発明の方法においては、ＲＮＡを標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定対象とする場合、ＲＮＡの発現レベルが解析されてもよいが、好ましくはＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換した後、該ｃＤＮＡ又はその増幅産物が測定される。
ＳＳＬからのＲＮＡの抽出には、生体試料からのＲＮＡの抽出又は精製に通常使用される方法、例えば、フェノール/クロロホルム法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎ
ｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、又はＴＲＩｚｏｌ（登録商標）、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）等のカラムを用いた方法、シリカをコーティングした特殊な磁性体粒子を用いる方法、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ磁性体粒子を用いる方法、ＩＳＯＧＥＮ等の市販のＲＮＡ抽出試薬による抽出等を用いることができる。
ＳＳＬからのＲＮＡの抽出には、生体試料からのＲＮＡの抽出又は精製に通常使用される方法、例えば、フェノール/クロロホルム法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎ
ｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、又はＴＲＩｚｏｌ（登録商標）、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）等のカラムを用いた方法、シリカをコーティングした特殊な磁性体粒子を用いる方法、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ磁性体粒子を用いる方法、ＩＳＯＧＥＮ等の市販のＲＮＡ抽出試薬による抽出等を用いることができる。
【0033】
該逆転写には、解析したい特定のＲＮＡを標的としたプライマーを用いてもよいが、より包括的な核酸の保存及び解析のためにはランダムプライマーを用いることが好ましい。該逆転写には、一般的な逆転写酵素又は逆転写試薬キットを使用することができる。好適には、正確性及び効率性の高い逆転写酵素又は逆転写試薬キットが用いられ、その例としては、Ｍ－ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ及びその改変体、あるいは市販の逆転写酵素又は逆転写試薬キット、例えばＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（タカラバイオ社）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が挙げられる。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）III Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（
登録商標）ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が好ましく用いられる。
該逆転写における伸長反応は、温度を好ましくは４２℃±１℃、より好ましくは４２℃
±０．５℃、さらに好ましくは４２℃±０．２５℃に調整し、一方、反応時間を好ましく
は６０分間以上、より好ましくは８０～１２０分間に調整するのが好ましい。
登録商標）ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が好ましく用いられる。
該逆転写における伸長反応は、温度を好ましくは４２℃±１℃、より好ましくは４２℃
±０．５℃、さらに好ましくは４２℃±０．２５℃に調整し、一方、反応時間を好ましく
は６０分間以上、より好ましくは８０～１２０分間に調整するのが好ましい。
【0034】
発現レベルを測定する方法は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡを対象とする場合、これらにハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法、マルチプレックスＰＣＲ、ＳｍａｒｔＡｍｐ法、ＬＡＭＰ法等に代表される核酸増幅法、これらにハイブリダイズする核酸をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法（ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、ドットブロットハイブリダイゼーション、スロットブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロットハイブリダイゼーション等）、塩基配列を決定する方法（シーケンシング）、又はこれらを組み合わせた方法から選ぶことができる。
【0035】
ＰＣＲでは、解析したい特定のＤＮＡを標的としたプライマーペアを用いて該特定の１種のＤＮＡのみを増幅してもよいが、複数のプライマーペアを用いて同時に複数の特定のＤＮＡを増幅してもよい。好ましくは、該ＰＣＲはマルチプレックスＰＣＲである。マルチプレックスＰＣＲは、ＰＣＲ反応系に複数のプライマー対を同時に使用することで、複数の遺伝子領域を同時に増幅する方法である。マルチプレックスＰＣＲは、市販のキット（例えば、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズジャパン株式会社等）を用いて実施することができる。
該ＰＣＲにおけるアニーリング及び伸長反応の温度は、使用するプライマーに依存するため一概には言えないが、上記のマルチプレックスＰＣＲキットは用いる場合、好ましくは６２℃±１℃、より好ましくは６２℃±０．５℃、さらに好ましくは６２℃±０．２５
℃である。したがって、該ＰＣＲでは、好ましくはアニーリング及び伸長反応が１ステップで行われる。該アニーリング及び伸長反応のステップの時間は、増幅すべきＤＮＡのサイズ等に依存して調整され得るが、好ましくは１４～１８分間である。該ＰＣＲにおける変性反応の条件は、増幅すべきＤＮＡに依存して調整され得るが、好ましくは９５～９９℃で１０～６０秒間である。上記のような温度及び時間での逆転写及びＰＣＲは、一般的にＰＣＲに使用されるサーマルサイクラーを用いて実行することができる。
該ＰＣＲにおけるアニーリング及び伸長反応の温度は、使用するプライマーに依存するため一概には言えないが、上記のマルチプレックスＰＣＲキットは用いる場合、好ましくは６２℃±１℃、より好ましくは６２℃±０．５℃、さらに好ましくは６２℃±０．２５
℃である。したがって、該ＰＣＲでは、好ましくはアニーリング及び伸長反応が１ステップで行われる。該アニーリング及び伸長反応のステップの時間は、増幅すべきＤＮＡのサイズ等に依存して調整され得るが、好ましくは１４～１８分間である。該ＰＣＲにおける変性反応の条件は、増幅すべきＤＮＡに依存して調整され得るが、好ましくは９５～９９℃で１０～６０秒間である。上記のような温度及び時間での逆転写及びＰＣＲは、一般的にＰＣＲに使用されるサーマルサイクラーを用いて実行することができる。
【0036】
当該ＰＣＲで得られた反応産物の精製は、反応産物のサイズ分離によって行われることが好ましい。サイズ分離により、目的のＰＣＲ反応産物を、ＰＣＲ反応液中に含まれるプライマーやその他の不純物から分離することができる。ＤＮＡのサイズ分離は、例えば、サイズ分離カラムや、サイズ分離チップ、サイズ分離に利用可能な磁気ビーズ等によって行うことができる。サイズ分離に利用可能な磁気ビーズの好ましい例としては、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ等のＳｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ）磁性ビーズが挙げられる。
【0037】
精製したＰＣＲ反応産物に対して、その後の定量解析を行うために必要なさらなる処理を施してもよい。例えば、ＤＮＡのシーケンシングのために、精製したＰＣＲ反応産物を、適切なバッファー溶液へと調製したり、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡに含まれるＰＣＲプライマー領域を切断したり、増幅されたＤＮＡにアダプター配列をさらに付加したりしてもよい。例えば、精製したＰＣＲ反応産物をバッファー溶液へと調製し、増幅ＤＮＡに対してＰＣＲプライマー配列の除去及びアダプターライゲーションを行い、得られた反応産物を、必要に応じて増幅して、定量解析のためのライブラリーを調製することができる。これらの操作は、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×
ＶＩＬＯ ＲＴ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ、及びＩｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ ＨｉＦ
ｉ Ｍｉｘ、及びＩｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｒｅ Ｐａｎｅｌを用いて、各キット付属のプロトコルに従って行うことができる。
ＶＩＬＯ ＲＴ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ、及びＩｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ ＨｉＦ
ｉ Ｍｉｘ、及びＩｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｒｅ Ｐａｎｅｌを用いて、各キット付属のプロトコルに従って行うことができる。
【0038】
ノーザンブロットハイブリダイゼーション法を利用して標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、まずプローブＤＮＡを放射性同位元素、蛍光物質等で標識し、次いで、得られた標識ＤＮＡを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした生体試料由来のＲＮＡとハイブリダイズさせる。その後、形成された標識ＤＮＡとＲＮＡとの二重鎖を、標識物に由来するシグナルを検出することにより測定する方法が挙げられる。
【0039】
ＲＴ－ＰＣＲ法を用いて標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、まず生体試料由来のＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを調製し、これを鋳型として本発明の標的遺伝子が増幅できるように調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（－鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせる。その後、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する。増幅された二本鎖ＤＮＡの検出には、予めＲＩ、蛍光物質等で標識しておいたプライマーを用いて上記ＰＣＲを行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法等を用いることができる。
【0040】
ＤＮＡマイクロアレイを用いて標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、支持体に本発明の標的遺伝子由来の核酸（ｃＤＮＡ又はＤＮＡ）の少なくとも１種を固定化したアレイを用い、ｍＲＮＡから調製した標識化ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡをマイクロアレイ上に結合させ、マイクロアレイ上の標識を検出することによって、ｍＲＮＡの発現量を測定することができる。
前記アレイに固定化される核酸としては、ストリンジェントな条件下に特異的（すなわち、実質的に目的の核酸のみに）にハイブリダイズする核酸であればよく、例えば、本発明の標的遺伝子の全配列を有する核酸であってもよく、部分配列からなる核酸であってもよい。ここで、「部分配列」とは、少なくとも１５～２５塩基からなる核酸が挙げられる。ここでストリンジェントな条件は、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度
の洗浄条件を挙げることができ、より厳しいハイブリダイズ条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件としては「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件を挙げることができる。ハイブリダイズ条件は、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等に記載されている。
前記アレイに固定化される核酸としては、ストリンジェントな条件下に特異的（すなわち、実質的に目的の核酸のみに）にハイブリダイズする核酸であればよく、例えば、本発明の標的遺伝子の全配列を有する核酸であってもよく、部分配列からなる核酸であってもよい。ここで、「部分配列」とは、少なくとも１５～２５塩基からなる核酸が挙げられる。ここでストリンジェントな条件は、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度
の洗浄条件を挙げることができ、より厳しいハイブリダイズ条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件としては「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件を挙げることができる。ハイブリダイズ条件は、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等に記載されている。
【0041】
シーケンシングによって標的遺伝子又はそれに由来する核酸の発現量を測定する場合は、例えば、次世代シーケンサー（例えばＩｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）が用いて解析することが挙げられる。シーケンシングで作成されたリードの数（リードカウント）に基づいて、ＲＮＡ発現を定量することができる。
【0042】
上記の測定に用いられるプローブ又はプライマー、すなわち、本発明の標的遺伝子又はそれに由来する核酸を特異的に認識し増幅するためのプライマー、又は該ＲＮＡ又はそれに由来する核酸を特異的に検出するためのプローブがこれに該当するが、これらは、当該標的遺伝子を構成する塩基配列に基づいて設計することができる。ここで「特異的に認識する」とは、例えばノーザンブロット法において、実質的に本発明の標的遺伝子又はそれに由来する核酸のみを検出できること、また例えばＲＴ－ＰＣＲ法において、実質的に当該核酸のみが増幅される如く、当該検出物又は生成物が当該遺伝子又はそれに由来する核酸であると判断できることを意味する。
具体的には、本発明の標的遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ又はその相補鎖に相補的な一定数のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、当該一定数の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９９％以上の塩基配列上の同一性を有すればよい。塩基配列の同一性は、前記ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
斯かるオリゴヌクレオチドは、プライマーとして用いる場合には、特異的なアニーリング及び鎖伸長ができればよく、通常、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下の鎖長を有するものが挙げられる。また、プローブとして用いる場合には、特異的なハイブリダイゼーションができればよく、本発明の標的遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ（又はその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下の鎖長のものが用いられる。
なお、ここで、「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができ、合成されたものでも天然のものでもよい。又はイブリダイゼーションに用いるプローブは、通常標識したものが用いられる。
具体的には、本発明の標的遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ又はその相補鎖に相補的な一定数のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、当該一定数の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９９％以上の塩基配列上の同一性を有すればよい。塩基配列の同一性は、前記ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
斯かるオリゴヌクレオチドは、プライマーとして用いる場合には、特異的なアニーリング及び鎖伸長ができればよく、通常、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下の鎖長を有するものが挙げられる。また、プローブとして用いる場合には、特異的なハイブリダイゼーションができればよく、本発明の標的遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ（又はその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下の鎖長のものが用いられる。
なお、ここで、「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができ、合成されたものでも天然のものでもよい。又はイブリダイゼーションに用いるプローブは、通常標識したものが用いられる。
【0043】
また、本発明の標的遺伝子の翻訳産物（タンパク質）、当該タンパク質と相互作用する分子、ＲＮＡと相互作用する分子、又はＤＮＡと相互作用する分子を測定する場合は、プロテインチップ解析、免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ等）、質量分析（例えば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ）、１－ハイブリッド法（PNAS 100, 12271-12276(2003)）や２－ハイブリッド法（Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998)）のような方法を
用いることができ、対象に応じて適宜選択できる。
例えば、測定対象としてタンパク質が用いられる場合は、本発明の発現産物に対する抗体を生体試料と接触させ、当該抗体に結合した試料中のタンパク質を検出し、そのレベルを測定することによって実施される。例えば、ウェスタンブロット法によれば、一次抗体として上記の抗体を用いた後、二次抗体として放射性同位元素、蛍光物質又は酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて、その一次抗体を標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器、蛍光検出器等で測定することが行われる。
尚、上記翻訳産物に対する抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。これらの抗体は、公知の方法に従って製造することができる。具体的には、ポリクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該タンパク質の部分ポリペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。
一方、モノクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質又は該タンパク質の部分ポリペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞から得ることができる。また、モノクローナル抗体は、ファージディスプレイを用いて作製してもよい（Griffiths, A.D.; Duncan, A.R., Current Opinion in Biotechnology, Volume 9, Number 1, February 1998 , pp. 102-108(7)）。
用いることができ、対象に応じて適宜選択できる。
例えば、測定対象としてタンパク質が用いられる場合は、本発明の発現産物に対する抗体を生体試料と接触させ、当該抗体に結合した試料中のタンパク質を検出し、そのレベルを測定することによって実施される。例えば、ウェスタンブロット法によれば、一次抗体として上記の抗体を用いた後、二次抗体として放射性同位元素、蛍光物質又は酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて、その一次抗体を標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器、蛍光検出器等で測定することが行われる。
尚、上記翻訳産物に対する抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。これらの抗体は、公知の方法に従って製造することができる。具体的には、ポリクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該タンパク質の部分ポリペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。
一方、モノクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質又は該タンパク質の部分ポリペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞から得ることができる。また、モノクローナル抗体は、ファージディスプレイを用いて作製してもよい（Griffiths, A.D.; Duncan, A.R., Current Opinion in Biotechnology, Volume 9, Number 1, February 1998 , pp. 102-108(7)）。
【0044】
斯くして、被験者から採取された生体試料中の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルが測定され、当該発現レベルに基づいて被験者に対するカテキン類含有肥満改善剤の有効性が予測される。
【0045】
シーケンシングにより複数の標的遺伝子の発現レベルの解析を行う場合は、発現量のデータであるリードカウント値、該リードカウント値をサンプル間の総リード数の違いを補正したＲＰＭ値、当該ＲＰＭ値を底２の対数値に変換した値（Ｌｏｇ２ＲＰＭ値）又は整
数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値）、あるいはＤＥＳｅｑ２を用
いて補正されたカウント値（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ値）又は整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ２（ｃｏｕｎｔ＋１）値）を指標として用いるのが好ましい。ま
た、ＲＮＡ－ｓｅｑの定量値として一般的な、ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓ ｍａｐｐｅｄ（ＦＰＫＭ）、ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓ ｍａｐｐｅｄ（ＲＰＫＭ）、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ（ＴＰＭ）などによって算出される値であってもよい。また、マイクロアレイ法によって得られるシグナル値、及びその補正値であってもよい。また、ＲＴ－ＰＣＲなどにより特定の標的遺伝子のみ発現レベルの解析を行う場合には、対象遺伝子の発現量をハウスキーピング遺伝子の発現量を基準とする相対的な発現量に変換（相対定量）して解析する方法、又は標的遺伝子の領域を含むプラスミドを用いて絶対的なコピー数を定量（絶対定量）して解析する方法が好ましい。デジタルＰＣＲ法によって得られるコピー数であってもよい。
数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値）、あるいはＤＥＳｅｑ２を用
いて補正されたカウント値（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ値）又は整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ２（ｃｏｕｎｔ＋１）値）を指標として用いるのが好ましい。ま
た、ＲＮＡ－ｓｅｑの定量値として一般的な、ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓ ｍａｐｐｅｄ（ＦＰＫＭ）、ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓ ｍａｐｐｅｄ（ＲＰＫＭ）、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ（ＴＰＭ）などによって算出される値であってもよい。また、マイクロアレイ法によって得られるシグナル値、及びその補正値であってもよい。また、ＲＴ－ＰＣＲなどにより特定の標的遺伝子のみ発現レベルの解析を行う場合には、対象遺伝子の発現量をハウスキーピング遺伝子の発現量を基準とする相対的な発現量に変換（相対定量）して解析する方法、又は標的遺伝子の領域を含むプラスミドを用いて絶対的なコピー数を定量（絶対定量）して解析する方法が好ましい。デジタルＰＣＲ法によって得られるコピー数であってもよい。
【0046】
本発明の男性被験者に対するカテキン類含有肥満改善剤の有効性の予測は、被験者がカテキン類含有肥満改善剤を服用した場合の内臓脂肪面積の変化量を予測することにより行われる。
内臓脂肪面積の変化量の予測は、例えば、本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを、カテキン類含有肥満改善剤を服用した場合の内臓脂肪面積の変化量との検量線や予測モデルと照合することにより行われる。
内臓脂肪面積の変化量の予測は、例えば、本発明の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを、カテキン類含有肥満改善剤を服用した場合の内臓脂肪面積の変化量との検量線や予測モデルと照合することにより行われる。
【0047】
予測モデルは、被験者由来の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルの測定値（発現プロファイル）から、各人がカテキン類含有肥満改善剤を服用した場合の内臓脂肪面積の変化量を予測する判別式である。判別式は、教師サンプル集団の各人から取得した１つ以上の標的遺伝子又はその発現産物の発現レベル（特徴量）を説明変数とし、該集団の各人がカテキン類含有肥満改善剤を服用した場合の内臓脂肪面積の変化量を目的変数とした機械学習により構築できる。
被験者から採取された生体試料から標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを同様に測定し、得られた測定値を当該判別式に代入し、当該判別式に基づいて算出された値から、当該被検者がカテキン類含有肥満改善剤を服用した場合の内臓脂肪面積の変化量の予測値を取得することができる。
なお、判別式の作成においては、主成分分析（ＰＣＡ）により次元圧縮を行ない、主要成分を説明変数とすることができる。また、特徴量には、標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルに加えて、該被験者の生体情報、例えば、年齢、身長、体重、カテキン類含有肥満改善剤摂取前の内臓脂肪面積、体脂肪率、性別、血糖値や中性脂肪など空腹時の血液検査項目などを用いることができる。
被験者から採取された生体試料から標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを同様に測定し、得られた測定値を当該判別式に代入し、当該判別式に基づいて算出された値から、当該被検者がカテキン類含有肥満改善剤を服用した場合の内臓脂肪面積の変化量の予測値を取得することができる。
なお、判別式の作成においては、主成分分析（ＰＣＡ）により次元圧縮を行ない、主要成分を説明変数とすることができる。また、特徴量には、標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルに加えて、該被験者の生体情報、例えば、年齢、身長、体重、カテキン類含有肥満改善剤摂取前の内臓脂肪面積、体脂肪率、性別、血糖値や中性脂肪など空腹時の血液検査項目などを用いることができる。
【0048】
判別式の構築するための特徴量には、標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを用いることができる。また、機械学習に用いるアルゴリズムなどの公知のものを利用して特徴量となる標的遺伝子を適宜抽出し、その発現レベルを用いたりすることができる。例えば、下記に示すランダムフォレストにおける変数重要度の高い標的遺伝子またはその発現産物の発現レベルを用いたり、Ｒ言語の“Ｂｏｒｕｔａ”パッケージ、Ｐｙｔｈｏｎ言語の
“Ｅｌｉ５”及び“ＳＨＡＰ”などを用いて標的遺伝子を抽出し、その発現レベルを用い
たりすることができる。
“Ｅｌｉ５”及び“ＳＨＡＰ”などを用いて標的遺伝子を抽出し、その発現レベルを用い
たりすることができる。
【0049】
判別式の構築におけるアルゴリズムは、機械学習に用いるアルゴリズムなどの公知のものを利用することができる。機械学習アルゴリズムとしては、特に限定されず、例えば、線形回帰モデル（Ｌｉｎｅａｒ ｍｏｄｅｌ）、ラッソ回帰（Ｌａｓｓｏ）、ランダムフォレスト（Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔ）、ニューラルネットワーク（Ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔ）、線形カーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ（ｌｉｎｅａｒ））、ｒｂｆカーネルのサポートベクターマシン（ＳＶＭ（ｒｂｆ））などのアルゴリズムが挙げられ、このうちランダムフォレスト及び線形カーネルのサポートベクターマシンが好ましい。
構築した予測モデルに検証用のデータを入力して予測値を算出し、該予測値が実測値と最も適合するモデル、例えば正解率（Ａｃｃｕｒａｃｙ）が最も大きいモデル又は該予測値と実測値の差の二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）が最も小さいモデルを、最適な予測モデルとして選抜することができる。
構築した予測モデルに検証用のデータを入力して予測値を算出し、該予測値が実測値と最も適合するモデル、例えば正解率（Ａｃｃｕｒａｃｙ）が最も大きいモデル又は該予測値と実測値の差の二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）が最も小さいモデルを、最適な予測モデルとして選抜することができる。
【0050】
本発明の被験者に対するカテキン類含有肥満改善剤の有効性の予測モデルを構築するための特徴量として使用される標的遺伝子（特徴量遺伝子）は、前記表１に示す３０種の遺伝子群より選択される少なくとも１種であればよいが、予測精度の点から、好ましくは、少なくとも、後記表２で示されるＴＲＰＳ１、ＴＭＥＭ１６４、ＡＴＰ６Ｖ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｄ及びＲＩＮ３の５種の遺伝子から選ばれる１種以上、より好ましくは２種以上、より好ましくは３種以上、より好ましくは４種以上、より好ましくは５種全ての使用である。 すなわち、男性被験者に対するカテキン類含有肥満改善剤の有効性の予測方法においては、ＴＲＰＳ１、ＴＭＥＭ１６４、ＡＴＰ６Ｖ１Ｆ、ＰＰＭ１Ｄ及びＲＩＮ３の５種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子、必要に応じて、ＣＣＺ１Ｂ、ＨＯＯＫ３、ＲＡＢ３３Ｂ、ＮＬＫ、ＴＥＳＫ２、ＴＭ９ＳＦ１、ＬＳＴ１、ＢＡＧＥ２、ＡＢＣＦ３、ＦＢＸＬ２０、ＲＹＫ、ＳＬＣ２５Ａ４４、ＮＤＵＦＡＦ６、ＴＥＮ１、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＳＭＩＭ５、ＡＬＯＸ１２、ＣＮＮ３、ＺＢＴＢ３、ＳＬＣ６Ａ１４、ＹＡＲＳ２、ＺＮＦ６７２、ＣＡＶ２、ＢＲＤ７及びＳＰＡＧ７の２５種の遺伝子群より選択される少なくとも１つの遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定することが好ましいと云える。
【0051】
斯くして、被験者がカテキン類含有肥満改善剤を服用した場合の内臓脂肪面積の変化量を予測することができ、これは、被験者においてカテキン類含有肥満改善剤がどの程度有効に作用するか否か（有効性の程度）の指標になると云える。
内臓脂肪面積の変化量は、カテキン類含有飲料摂取時の内臓脂肪面積への効果を調べた複数試験の結果を統合したメタアナリシス（Jpn Pharmacol Ther 46(6), 973-981, 2018
）において、カテキン類含有飲料摂取の継続摂取による内臓脂肪面積変化データを統合すると－８．８３ｃｍ２であったという結果より、例えばこの値をカットオフ値とすることができる。このカットオフ値を超える内臓脂肪面積低減効果の認められた者をカテキン類含有肥満改善剤が有効に作用する者と判定でき、カテキン類含有肥満改善剤の服用に適した被験者を選択することが可能になる。
内臓脂肪面積の変化量は、カテキン類含有飲料摂取時の内臓脂肪面積への効果を調べた複数試験の結果を統合したメタアナリシス（Jpn Pharmacol Ther 46(6), 973-981, 2018
）において、カテキン類含有飲料摂取の継続摂取による内臓脂肪面積変化データを統合すると－８．８３ｃｍ２であったという結果より、例えばこの値をカットオフ値とすることができる。このカットオフ値を超える内臓脂肪面積低減効果の認められた者をカテキン類含有肥満改善剤が有効に作用する者と判定でき、カテキン類含有肥満改善剤の服用に適した被験者を選択することが可能になる。
【0052】
カテキン類含有肥満改善剤の有効性の予測キットは、本発明によるカテキン類含有肥満改善剤の有効性の予測方法に従って被験者に対するカテキン類含有肥満改善剤の有効性を予測するためのキットである。
本発明のキットは、ＳＳＬ等の生体試料の採取及び保存に必要な、用具及び試薬、必要に応じて標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定するための試薬を含有する。
例えばＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬としては、例えば、ＳＳＬを採取するための脂取りフィルム、採取したＳＳＬを保存するための試薬、保存用の容器等が挙げられる。
標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定するための試薬としては、例えば採取したＳＳＬからＲＮＡを抽出・精製するための試薬、標的遺伝子に由来する核酸と特異的に結合（ハイブリダイズ）するオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＲ用のプライマー、シーケンシング用アダプター配列等）を含む、核酸増幅又はハイブリダイゼーションのための試薬、遺伝子発現産物（タンパク質）を認識する抗体を含む免疫学的測定のための試薬の他、標識試薬、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤、ポジティブコントロールやネガティブコントロールとして使用するコントロール試薬、試験に必要な器具の他、標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを検出するための指標又はガイダンス等が包含される。
本発明のキットは、ＳＳＬ等の生体試料の採取及び保存に必要な、用具及び試薬、必要に応じて標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定するための試薬を含有する。
例えばＳＳＬの採取及び保存に必要な用具及び試薬としては、例えば、ＳＳＬを採取するための脂取りフィルム、採取したＳＳＬを保存するための試薬、保存用の容器等が挙げられる。
標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを測定するための試薬としては、例えば採取したＳＳＬからＲＮＡを抽出・精製するための試薬、標的遺伝子に由来する核酸と特異的に結合（ハイブリダイズ）するオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＲ用のプライマー、シーケンシング用アダプター配列等）を含む、核酸増幅又はハイブリダイゼーションのための試薬、遺伝子発現産物（タンパク質）を認識する抗体を含む免疫学的測定のための試薬の他、標識試薬、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤、ポジティブコントロールやネガティブコントロールとして使用するコントロール試薬、試験に必要な器具の他、標的遺伝子又はその発現産物の発現レベルを検出するための指標又はガイダンス等が包含される。
【実施例0053】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１ 発現変動遺伝子を用いたカテキン類含有肥満改善剤の有効性を予測する回帰モデルの構築
１）試験参加者
ＢＭＩ２２～３２の２０～５０歳代の健常な男性６０名を試験参加者に選抜した。
実施例１ 発現変動遺伝子を用いたカテキン類含有肥満改善剤の有効性を予測する回帰モデルの構築
１）試験参加者
ＢＭＩ２２～３２の２０～５０歳代の健常な男性６０名を試験参加者に選抜した。
【0054】
２）皮脂の採取
肥満改善剤の摂取試験前に、試験参加者の全顔からあぶら取りフィルム（５ｃｍ×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍ社）を用いてＲＮＡを含む皮脂を採取した。該あぶら取りフィルムはガラスバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで－８０℃で保存した。
肥満改善剤の摂取試験前に、試験参加者の全顔からあぶら取りフィルム（５ｃｍ×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍ社）を用いてＲＮＡを含む皮脂を採取した。該あぶら取りフィルムはガラスバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで－８０℃で保存した。
【0055】
３）肥満改善剤の摂取試験
カテキン類含有肥満改善剤としてカテキン類含有飲料（１日当たり飲料中に有効成分としてカテキン類を５４０ｍｇ含有）を用いた。試験参加者に、肥満改善剤１本を１日１回、１０週間継続摂取させた。肥満改善剤の摂取時間は限定せず、摂取開始から３０分以内で全量を摂取させた。試験参加者は、摂取開始当日と１０週間摂取後の空腹時に、内臓脂肪面積の測定を実施した。内臓脂肪計は、パナソニック社製の内臓脂肪計ＥＷ―ＦＡ９０（医療機器承認番号２２５００ＢＺＸ００５２２０００）を用いた。内臓脂肪面積の変化（１０週間摂取後の内臓脂肪面積－摂取開始当日の内臓脂肪面積）を基にカテキン類含有肥満改善剤による試験参加者の肥満改善効果を評価した。その結果、１０週間の肥満改善剤の摂取前後で、内臓脂肪面積の変化量に基づく肥満改善度合いが、試験参加者間で大きくばらつくことが確認された。
カテキン類含有肥満改善剤としてカテキン類含有飲料（１日当たり飲料中に有効成分としてカテキン類を５４０ｍｇ含有）を用いた。試験参加者に、肥満改善剤１本を１日１回、１０週間継続摂取させた。肥満改善剤の摂取時間は限定せず、摂取開始から３０分以内で全量を摂取させた。試験参加者は、摂取開始当日と１０週間摂取後の空腹時に、内臓脂肪面積の測定を実施した。内臓脂肪計は、パナソニック社製の内臓脂肪計ＥＷ―ＦＡ９０（医療機器承認番号２２５００ＢＺＸ００５２２０００）を用いた。内臓脂肪面積の変化（１０週間摂取後の内臓脂肪面積－摂取開始当日の内臓脂肪面積）を基にカテキン類含有肥満改善剤による試験参加者の肥満改善効果を評価した。その結果、１０週間の肥満改善剤の摂取前後で、内臓脂肪面積の変化量に基づく肥満改善度合いが、試験参加者間で大きくばらつくことが確認された。
【0056】
４）被験者の選抜
試験参加者６０名全ての試験参加者における、２）で回収した皮脂を含むあぶら取りフィルムを以下の解析に供した。
試験参加者６０名全ての試験参加者における、２）で回収した皮脂を含むあぶら取りフィルムを以下の解析に供した。
【0057】
５）ＲＮＡ調製及びシーケンシング
あぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡを元に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、９０分間逆転写を行いｃＤＮＡの合成を行った。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６２℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。得られたＰＣＲ産物は、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した後に、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、及び増幅を行い、ライブラリーを調製した。調製したライブラリーをＩｏｎ ５４０ Ｃｈｉｐにローディングし、Ｉｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。シーケンシングで得られた各リード配列をヒトゲノムのリファレンス配列であるｈｇ１９ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ＥＲＣＣ ｖ１を用いて遺伝子マッピングすることで各リード配列の由来する遺伝子を決定した。
あぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡを元に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、９０分間逆転写を行いｃＤＮＡの合成を行った。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６２℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。得られたＰＣＲ産物は、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した後に、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、及び増幅を行い、ライブラリーを調製した。調製したライブラリーをＩｏｎ ５４０ Ｃｈｉｐにローディングし、Ｉｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。シーケンシングで得られた各リード配列をヒトゲノムのリファレンス配列であるｈｇ１９ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ＥＲＣＣ ｖ１を用いて遺伝子マッピングすることで各リード配列の由来する遺伝子を決定した。
【0058】
６）データ解析及び特徴量遺伝子の選択
上記５）で取得した被験者のＳＳＬ由来ＲＮＡのシーケンシングで得られた各リードのリードカウントを、各ＲＮＡの発現量のデータとし、ＤＥＳｅｑ２を用いて補正されたカウント値（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ値）を解析に使用した。但し、リードカウントが１未満のリードは欠損値として扱った。６０名のサンプルを、機械学習において予測モデルを構築するための学習データと予測モデルの精度を確認するためのテストデータにそれぞれ８割（４８名分）と２割（１２名分）で分割した。学習データにおいて、９０％以上の被験者で欠損値ではない発現量データが得られた８３６０種の遺伝子について、その発現情報に基づいて内臓脂肪面積の変化量（１０週間摂取後の内臓脂肪面積－摂取開始当日の内臓脂肪面積）との相関をＳｐｅａｒｍａｎの相関検定を行い、ｐ＜０．０５かつ相関係数＜０．４、またはｐ＜０．０５かつ相関係数＞０．４となる遺伝子を抽出した。表１に示す、発現量が内臓脂肪面積の変化量と相関する３０種の遺伝子が得られた。これらの遺伝子を以下の予測モデル構築に用いる特徴量遺伝子として選択した。
上記５）で取得した被験者のＳＳＬ由来ＲＮＡのシーケンシングで得られた各リードのリードカウントを、各ＲＮＡの発現量のデータとし、ＤＥＳｅｑ２を用いて補正されたカウント値（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ値）を解析に使用した。但し、リードカウントが１未満のリードは欠損値として扱った。６０名のサンプルを、機械学習において予測モデルを構築するための学習データと予測モデルの精度を確認するためのテストデータにそれぞれ８割（４８名分）と２割（１２名分）で分割した。学習データにおいて、９０％以上の被験者で欠損値ではない発現量データが得られた８３６０種の遺伝子について、その発現情報に基づいて内臓脂肪面積の変化量（１０週間摂取後の内臓脂肪面積－摂取開始当日の内臓脂肪面積）との相関をＳｐｅａｒｍａｎの相関検定を行い、ｐ＜０．０５かつ相関係数＜０．４、またはｐ＜０．０５かつ相関係数＞０．４となる遺伝子を抽出した。表１に示す、発現量が内臓脂肪面積の変化量と相関する３０種の遺伝子が得られた。これらの遺伝子を以下の予測モデル構築に用いる特徴量遺伝子として選択した。
【0059】
【表1】
前記６）で選択した特徴量遺伝子の発現量データを、負の二項分布に従うＲＰＭ値から正規分布に近似するため、整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値）に変換した。得られた３０の特徴量遺伝子の発現量データのＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値を説明変数とし、カテキン類含有肥満改善剤の有効性の程度（内臓脂肪面積の変化量）を目的変数として用いて、有効性の程度を予測する回帰モデルを構築した。Ｐｙｔｈｏｎ言語において線形カーネルのサポートベクターマシンのアルゴリズムをメソッドとして指定し、ハイパーパラメータの最適値を１０分割交叉検証によってチューニングした。チューニングによって決定したハイパーパラメータを用いて、線形カーネルのサポートベクターマシンのアルゴリズムを実行し、予測値と実測値の差の二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）を算出した。ＲＭＳＥは小さい方が予測モデルの精度が高いことを示す。
その結果、３０遺伝子の発現量データを変数に用いた場合のモデルではＲＭＳＥは０．９１１であり、表１に示す遺伝子を、個々人に対するカテキン類を含有する肥満改善剤の有効性を予測するためのマーカーとして使用できることが示された（図１）。
【0060】
実施例２ 異なる分割パターンにおいて共通して相関する遺伝子を用いたカテキン類含有
肥満改善剤の有効性を予測する回帰モデルの構築
１）データ解析及び特徴量遺伝子の選択
実施例１の６）の学習データ（４８名分）とテストデータ（１２名分）の内訳を変更した５つの分割パターンを作成し、５つの各学習データ（４８名分）について、６）と同様に８３６０種の遺伝子の発現情報に基づいて内臓脂肪面積の変化量との相関解析をＳｐｅａｒｍａｎの相関検定を用いて行い、ｐ＜０．０５かつ相関係数＜０．４、またはｐ＜０．０５かつ相関係数＞０．４となる遺伝子を抽出した。５つの学習データから抽出された遺伝子のうち、４つ又は５つで共通して抽出される遺伝子として、下記表２に示す５種の遺伝子が得れた。当該５種の遺伝子を以下の予測モデル構築に用いる特徴量遺伝子として選択した。
肥満改善剤の有効性を予測する回帰モデルの構築
１）データ解析及び特徴量遺伝子の選択
実施例１の６）の学習データ（４８名分）とテストデータ（１２名分）の内訳を変更した５つの分割パターンを作成し、５つの各学習データ（４８名分）について、６）と同様に８３６０種の遺伝子の発現情報に基づいて内臓脂肪面積の変化量との相関解析をＳｐｅａｒｍａｎの相関検定を用いて行い、ｐ＜０．０５かつ相関係数＜０．４、またはｐ＜０．０５かつ相関係数＞０．４となる遺伝子を抽出した。５つの学習データから抽出された遺伝子のうち、４つ又は５つで共通して抽出される遺伝子として、下記表２に示す５種の遺伝子が得れた。当該５種の遺伝子を以下の予測モデル構築に用いる特徴量遺伝子として選択した。
【0061】
【表2】
【0062】
２）モデル構築
１）で選択した特徴量遺伝子の発現量データを、負の二項分布に従うＲＰＭ値から正規分布に近似するため、整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値）に変換した。得られた３０の特徴量遺伝子の発現量データのＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値を説明変数とし、カテキン類含有肥満改善剤の有効性の程度（内臓脂肪面積の変化量）を目的変数として用いて、有効性の程度を予測する回帰モデルを構築した。Ｐｙｔｈｏｎ言語において線形カーネルのサポートベクターマシンのアルゴリズムをメソッドとして指定し、ハイパーパラメータの最適値を１０分割交叉検証によってチューニングした。チューニングによって決定したハイパーパラメータを用いて、線形カーネルのサポートベクターマシンのアルゴリズムを実行し、予測値と実測値の差の二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）を算出した。ＲＭＳＥは小さい方が予測モデルの精度が高いことを示す。
その結果、５遺伝子の発現量データを変数に用いた場合のモデルではＲＭＳＥは０．８２７であり、表２に示す遺伝子を、個々人に対するカテキン類を含有する肥満改善剤の有効性を予測するためのマーカーとして使用できることが示された。また実施例１で示した３０遺伝子で構築した予測モデルと比較して精度が高いことが示された（図２）。
１）で選択した特徴量遺伝子の発現量データを、負の二項分布に従うＲＰＭ値から正規分布に近似するため、整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値）に変換した。得られた３０の特徴量遺伝子の発現量データのＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値を説明変数とし、カテキン類含有肥満改善剤の有効性の程度（内臓脂肪面積の変化量）を目的変数として用いて、有効性の程度を予測する回帰モデルを構築した。Ｐｙｔｈｏｎ言語において線形カーネルのサポートベクターマシンのアルゴリズムをメソッドとして指定し、ハイパーパラメータの最適値を１０分割交叉検証によってチューニングした。チューニングによって決定したハイパーパラメータを用いて、線形カーネルのサポートベクターマシンのアルゴリズムを実行し、予測値と実測値の差の二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）を算出した。ＲＭＳＥは小さい方が予測モデルの精度が高いことを示す。
その結果、５遺伝子の発現量データを変数に用いた場合のモデルではＲＭＳＥは０．８２７であり、表２に示す遺伝子を、個々人に対するカテキン類を含有する肥満改善剤の有効性を予測するためのマーカーとして使用できることが示された。また実施例１で示した３０遺伝子で構築した予測モデルと比較して精度が高いことが示された（図２）。
【0063】
また、表２に示す遺伝子に該被験者の年齢及びカテキン類含有肥満改善剤摂取前の内臓脂肪面積を特徴量として加え、同様の方法でカテキン類含有肥満改善剤の有効性の程度（内臓脂肪面積の変化量）を目的変数として用いて、有効性の程度を予測する回帰モデルを構築した。その結果、５遺伝子の発現量データに加えて該被験者の年齢及び内臓脂肪面積を変数に用いた場合のモデルではＲＭＳＥは０．７９８であり、５遺伝子のみで構築した予測モデルと比較してさらに精度が高いことが示された（図３）。
【0064】
実施例３ 異なる分割パターンにおいて共通して相関する遺伝子中の１遺伝子を用いたカテキン含有肥満改善剤の有効性を予測する回帰モデル
ｉ）データ解析及び特徴量遺伝子の選択
実施例２と同様の方法でサンプルのデータ分割、遺伝子の抽出を行い、表２の５遺伝子を得た。当該５遺伝子を以下の予測モデル構築における特徴量遺伝子としてそれぞれ選択した。
ｉ）データ解析及び特徴量遺伝子の選択
実施例２と同様の方法でサンプルのデータ分割、遺伝子の抽出を行い、表２の５遺伝子を得た。当該５遺伝子を以下の予測モデル構築における特徴量遺伝子としてそれぞれ選択した。
【0065】
ｉｉ）モデル構築
実施例２と同様の方法で、ｉ）で選択した特徴量遺伝子の発現量データを用いて、カテキン類含有肥満改善剤の有効性の程度を予測する回帰モデルを構築した。
その結果、５遺伝子の発現量データをそれぞれ変数に用いた場合のモデルのＲＭＳＥは表３のとおりであり、何れも５遺伝子全てを用いて構築した予測モデルと同程度の精度で、カテキン類含有肥満改善剤の有効性の程度を予測できることが確認された（図４）。
実施例２と同様の方法で、ｉ）で選択した特徴量遺伝子の発現量データを用いて、カテキン類含有肥満改善剤の有効性の程度を予測する回帰モデルを構築した。
その結果、５遺伝子の発現量データをそれぞれ変数に用いた場合のモデルのＲＭＳＥは表３のとおりであり、何れも５遺伝子全てを用いて構築した予測モデルと同程度の精度で、カテキン類含有肥満改善剤の有効性の程度を予測できることが確認された（図４）。
【0066】
【表3】
【0067】
参考例
実施例１で抽出された３０遺伝子のうち、ＡＢＣＦ３、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＴＭ９ＳＦ１の３遺伝子をそれぞれ特徴量遺伝子として選択し、その発現量データを用いて、実施例２と同様の方法で、カテキン類含有肥満改善剤の有効性の程度を予測する回帰モデルを構築した。
その結果、３遺伝子の発現量データをそれぞれ変数に用いた場合のモデルのＲＭＳＥは表４のとおりであり、何れも実施例３に示す５遺伝子を用いて構築した予測モデルと同程度の精度で、カテキン類含有肥満改善剤の有効性の程度を予測できることが確認された（図５）。
実施例１で抽出された３０遺伝子のうち、ＡＢＣＦ３、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＴＭ９ＳＦ１の３遺伝子をそれぞれ特徴量遺伝子として選択し、その発現量データを用いて、実施例２と同様の方法で、カテキン類含有肥満改善剤の有効性の程度を予測する回帰モデルを構築した。
その結果、３遺伝子の発現量データをそれぞれ変数に用いた場合のモデルのＲＭＳＥは表４のとおりであり、何れも実施例３に示す５遺伝子を用いて構築した予測モデルと同程度の精度で、カテキン類含有肥満改善剤の有効性の程度を予測できることが確認された（図５）。
【0068】
【表4】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
