(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024045138
(43)【公開日】2024-04-02
(54)【発明の名称】ヒンジが修飾された抗体断片及び作製方法
(51)【国際特許分類】
C07K 16/00 20060101AFI20240326BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240326BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240326BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240326BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240326BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240326BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240326BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240326BHJP
【ＦＩ】
C07K16/00
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
A61K39/395 A
C12N15/13 ZNA
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023221318
(22)【出願日】2023-12-27
(62)【分割の表示】P 2021120669の分割
【原出願日】2016-10-27
(31)【優先権主張番号】62/346,905
(32)【優先日】2016-06-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/248,792
(32)【優先日】2015-10-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＵＮＩＸ
(71)【出願人】
【識別番号】509012625
【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】モン， ユイ－チュイ ジー．
(72)【発明者】
【氏名】キム， ホックスン
(72)【発明者】
【氏名】キム， イングリッド
(72)【発明者】
【氏名】シュピース， クリストフ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】既存の抗ヒンジ抗体（ＡＨＡ）に対して低減された反応性を有するまたは反応性を有しない抗体断片（例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２）、及びかかる抗体断片を含む組成物、ならびにかかる抗体断片及び組成物の作製方法及び使用方法を提供する。
【解決手段】抗体断片がＦａｂである場合、このＦａｂは、残基Ｄ２２１又はＫ２２２で終端する、あるいは、Ｆａｂは、ＣＤＫＴＨＴ、ＣＤＫＴＨＬ、ＣＤＫＴＨ、ＣＤＫＴ、ＣＤＫ及びＣＤからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアミノ酸で終端する、あるいは、Ｆａｂは、ＫＹＧＰＰ、ＫＹＧＰ、ＫＹＧ、ＫＹ及びＫからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアミノ酸で終端する。また、Ｆ（ａｂ’）２では、Ｃ末端の１、２、３、４、または５つのアミノ酸の欠失を含む組成物を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】抗体断片がＦａｂである場合、このＦａｂは、残基Ｄ２２１又はＫ２２２で終端する、あるいは、Ｆａｂは、ＣＤＫＴＨＴ、ＣＤＫＴＨＬ、ＣＤＫＴＨ、ＣＤＫＴ、ＣＤＫ及びＣＤからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアミノ酸で終端する、あるいは、Ｆａｂは、ＫＹＧＰＰ、ＫＹＧＰ、ＫＹＧ、ＫＹ及びＫからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアミノ酸で終端する。また、Ｆ（ａｂ’）２では、Ｃ末端の１、２、３、４、または５つのアミノ酸の欠失を含む組成物を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
単離された抗体断片を含む組成物であって、前記抗体断片は、既存の抗ヒンジ抗体に対して低減された反応性を有するまたは反応性を有しない、前記組成物。
【請求項2】
前記抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記抗体断片は、Ｆａｂである、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
前記Ｆａｂは、残基Ｄ２２１で終端する、請求項３に記載の組成物。
【請求項5】
前記Ｆａｂは、残基Ｋ２２２で終端する、請求項３に記載の組成物。
【請求項6】
前記Ｆａｂは、Ｔ２２５Ｘ突然変異を含み、Ｘは、Ｔを除く任意のアミノ酸である、請求項３に記載の組成物。
【請求項7】
前記Ｆａｂは、ＣＤＫＴＨＴ（配列番号１４）、ＣＤＫＴＨＬ（配列番号１５）、ＣＤＫＴＨ（配列番号１６）、ＣＤＫＴ（配列番号１７）、ＣＤＫ及びＣＤからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアミノ酸で終端する、請求項３に記載の組成物。
【請求項8】
前記Ｆａｂは、ＫＹＧＰＰ（配列番号１８）、ＫＹＧＰ（配列番号１９）、ＫＹＧ、ＫＹ及びＫからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアミノ酸で終端する、請求項３に記載の組成物。
【請求項9】
前記Ｆａｂは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３及びその保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項10】
前記抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２である、請求項２に記載の組成物。
【請求項11】
前記Ｆ（ａｂ’）２は、Ｃ末端の１、２、３、４、または５つのアミノ酸の欠失を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項12】
前記Ｆ（ａｂ’）２は、ＥＵ２３１位における欠失を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項13】
前記Ｆ（ａｂ’）２は、ＥＵ２３１～２３２位における欠失を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項14】
前記Ｆ（ａｂ’）２は、ＥＵ２３１～２３３における欠失を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項15】
前記Ｆ（ａｂ’）２は、ＥＵ２３１～２３４における欠失を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項16】
前記Ｆ（ａｂ’）２は、ＥＵ２３０～２３４における欠失を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項17】
前記単離された抗体断片は、ＦｃγＲＩＩＩａ、Ｃ１ｑまたはそれらの組み合わせへの低減された結合を示す、請求項１に記載の組成物。
【請求項18】
請求項１に記載の抗体断片をコードする単離された核酸を含む組成物。
【請求項19】
請求項１８に記載の組成物を含む宿主細胞。
【請求項20】
前記抗体断片が生産されるように請求項１９に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体断片の生産方法。
【請求項21】
請求項１～１７のいずれか１項に記載の組成物と薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤。
【請求項22】
医薬品として使用するための請求項１～１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項23】
疾患の治療に使用するための請求項１～１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項24】
分子経路及び／または機構の阻害に使用するための請求項１～１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項25】
疾患の治療用の医薬品の製造における請求項１～１７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項26】
分子経路及び／または機構の阻害用の医薬品の製造における請求項１～１７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項27】
分子経路及び／または機構の活性化用の医薬品の製造における請求項１～１７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項28】
疾患を有する個体の治療方法であって、前記個体に有効量の請求項１～１７のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項29】
個体における分子経路及び／または機構の阻害方法であって、前記個体に、分子経路及び／または機構を阻害するために有効量の請求項１～１７のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項30】
個体における分子経路及び／または機構の活性化方法であって、前記個体に、分子経路及び／または機構を活性化するために有効量の請求項１～１７のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１０月３０日出願の米国仮特許出願第６２／２４８，７９２号、及び２０１６年６月７日出願の米国仮特許出願第６２／３４６，９０５号の優先権を主張するものであり、これらの各々の内容は、優先権が主張されるこれらの各々への参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１５年１０月３０日出願の米国仮特許出願第６２／２４８，７９２号、及び２０１６年６月７日出願の米国仮特許出願第６２／３４６，９０５号の優先権を主張するものであり、これらの各々の内容は、優先権が主張されるこれらの各々への参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１６年１０月２６日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、００Ｂ２０６＿０２７１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、２６，１８５バイトのサイズである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１６年１０月２６日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、００Ｂ２０６＿０２７１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、２６，１８５バイトのサイズである。
【0003】
本開示は、既存の抗ヒンジ抗体（ＡＨＡ）に対して低減された反応性を有するまたは反応性を有しない抗体断片（例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２）、及びかかる抗体断片を含む組成物、ならびにかかる抗体断片及び組成物の作製方法及び使用方法に関する。
【背景技術】
【0004】
抗体は、可動性ヒンジ領域によってＦｃに接続されている２つのＦａｂ領域から構成される。Ｆａｂが抗原の認識及び結合を媒介する一方で、Ｆｃの２つの重要な機能は、Ｆｃγ受容体との結合によってエフェクター機能を媒介すること（１）、及びサルベージ受容体ＦｃＲｎへの結合によって長期の血清半減期を付与すること（２）、である。特に、ＩｇＧの緩徐な薬物動態は、それが他のバイオ治療薬と比較して頻度の低い投薬を可能にするため、治療薬としての抗体の奏功に寄与する。結果として、大半の承認された治療用抗体は、完全長ＩｇＧフォーマットを有する。ＩｇＧとは異なり、単離されたＦａｂ断片の血清半減期は短く（３）、かかる特性は、ＦＤＡにより承認された３つのＦａｂ分子にあてはまるように、短い血漿半減期が所望される適応に必要とされる（４）。血小板表面受容体ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対して指向される１つの治療用Ｆａｂ分子（アブシキシマブ、ＲＥＯＰＲＯ（登録商標））は、パパインによるタンパク質分解切断によって商業的に生産され（５）、これはＦａｂ生産の元来の方法である（６）。分子クローニングの前進に伴い、抗体断片の組換え発現は、Ｆａｂ分子を生成するための魅力的な経路となっており、これらは第２の承認されたＦａｂ治療薬である抗ＶＥＧＦ（ラニビズマブ、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））（７）及び最近承認されたダビガトランに対するＦａｂ（イダルシズマブ、Ｐｒａｘｂｉｎｄ（登録商標））（３３）により例示される。Ｆａｂ分子は、例えば、投薬後に持続しない一過性の全身活性が所望される場合、または投与及び活性が眼などの末梢分画に限局される場合に、有利である。
【0005】
抗体ヒンジ領域に対する多くのプロテアーゼが、病原体及び腫瘍細胞が宿主の免疫応答を回避しようとする機構として関連付けられてきた（１３）。結果として生じるＣ末端ネオエピトープは、しかしながら、やがては免疫系によって認識され、抗ヒンジ抗体（ＡＨＡ）が生成される。Ｆａｂの上部ヒンジ領域及びＦ（ａｂ’）２の下部ヒンジ領域へのかかる自己抗体が、いくつかの研究において示されてきた（１７～２１）。これらの既存のＡＨＡ価はドナー間で異なり（２０）、それはかかるネオエピトープへの過去及び現在の曝露を表し得る。ある特定の例において、ＡＨＡは、代理Ｆｃとして作用して、タンパク質分解により不活化された抗体のエフェクター機能を復元し得る（２２）。ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２分子を治療フォーマットとして使用することの１つの理論的根拠は、エフェクター機能を排除することであるため、エフェクター機能を既存のＡＨＡによって回復させて、いかなる潜在的な安全性に関する懸念も危険にさらすことは望ましくないであろう。したがって、とりわけ、薬物治療後の免疫応答を最小限に抑えることによって治療場面においてより優れた安全性プロファイルを提供する可能性がある、ヒト血清中の既存のＡＨＡとの低減された反応性を有するまたは反応性を有しない新規のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２分子が当該技術分野で必要とされている。
【発明の概要】
【0006】
本開示は、既存の抗ヒンジ抗体（ＡＨＡ）に対して低減された反応性を有するまたは反応性を有しない抗体断片（例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２）、及びかかる抗体断片を含む組成物、ならびにかかる抗体断片及び組成物の作製方法及び使用方法に関する。
【0007】
ある特定の実施形態において、本開示は、単離された抗体断片及びそれを含む組成物を対象とし、この抗体断片は、既存の抗ヒンジ抗体に対して低減された反応性を有するかまたは反応性を有しない。ある特定の実施形態において、本開示の単離された抗体断片は、ＦｃγＲＩＩＩａ及び／またはＣ１ｑへの低減された結合を示す、かつ／または結合を示さない。ある特定の実施形態において、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２である。
【0008】
ある特定の実施形態において、本開示は、抗体断片及びそれを含む組成物を対象とし、この抗体断片は、Ｆａｂである。ある特定の実施形態において、本開示は、Ｆａｂ分子を対象とし、このＦａｂは、残基Ｄ２２１で終端する。ある特定の実施形態において、Ｆａｂは、ＣＤＫＴＨＴ（配列番号１４）、ＣＤＫＴＨＬ（配列番号１５）、ＣＤＫＴＨ（配列番号１６）、ＣＤＫＴ（配列番号１７）、ＣＤＫ及びＣＤからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアミノ酸で終端する。ある特定の実施形態において、Ｆａｂは、ＫＹＧＰＰ（配列番号１８）、ＫＹＧＰ（配列番号１９）、ＫＹＧ、ＫＹ及びＫからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアミノ酸で終端する。ある特定の実施形態において、Ｆａｂは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３及びその保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。
【0009】
ある特定の実施形態において、本開示は、抗体断片及びそれを含む組成物を対象とし、この抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２である。ある特定の実施形態において、本開示は、Ｆ（ａｂ’）２分子を対象とし、このＦ（ａｂ’）２は、Ｃ末端の１、２、３、４、または５つのアミノ酸の欠失を含む。本開示のある特定の実施形態において、Ｆ（ａｂ’）２は、ＥＵ２３１位における欠失を含む。本開示のある特定の実施形態において、Ｆ（ａｂ’）２は、ＥＵ２３１～２３２における欠失を含む。本開示のある特定の実施形態において、Ｆ（ａｂ’）２は、ＥＵ２３１～２３３における欠失を含む。本開示のある特定の実施形態において、Ｆ（ａｂ’）２は、ＥＵ２３１～２３４位における欠失を含む。ある特定の実施形態において、Ｆ（ａｂ’）２は、ＥＵ２３０～２３４位における欠失を含む。
【0010】
ある特定の実施形態において、本開示は、単離された核酸及びそれを含む組成物を対象とし、この核酸は、ＡＨＡに対して低減された反応性を有するまたは反応性を有しない抗体断片をコードする。ある特定の実施形態において、本開示は、該核酸を含む宿主細胞を対象とする。ある特定の実施形態において、本開示は、抗体が生産されるように該宿主細胞を培養することを含む、抗体断片の生産方法を対象とする。ある特定の実施形態において、本開示は、ＡＨＡに対して低減された反応性を有するまたは反応性を有しない抗体断片と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的製剤を対象とする。
【0011】
ある特定の実施形態において、本開示は、医薬品として使用するための、ＡＨＡに対して低減された反応性を有するまたは反応性を有しない抗体断片を対象とする。ある特定の実施形態において、本開示は、疾患の治療に使用するための、ＡＨＡに対して低減された反応性を有するまたは反応性を有しない抗体断片を対象とする。ある特定の実施形態において、本開示は、分子経路及び／または機構の阻害または活性化に使用するための、ＡＨＡに対して低減された反応性を有するまたは反応性を有しない抗体断片を対象とする。ある特定の実施形態において、本開示は、疾患の治療用の医薬品の製造における、ＡＨＡに対して低減された反応性を有するまたは反応性を有しない抗体断片の使用を対象とする。ある特定の実施形態において、本開示は、分子経路及び／または機構の阻害または活性化用の医薬品の製造における、ＡＨＡに対して低減された反応性を有するまたは反応性を有しない抗体断片の使用を対象とする。
【0012】
ある特定の実施形態において、本開示は、疾患を有する個体に、ＡＨＡに対して低減された反応性を有するまたは反応性を有しない有効量の抗体断片を投与することを含む、個体の治療方法を対象とする。ある特定の実施形態において、本開示は、分子経路及び／または機構を阻害するまたは活性化するために、個体に、ＡＨＡに対して低減された反応性を有するまたは反応性を有しない有効量の抗体断片を投与することを含む、個体における分子経路及び／または機構の阻害方法または活性化方法を対象とする。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】図１Ａ～１Ｄは、既存のヒト抗体の、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のＦａｂへの結合を示す。（１Ａ）上部ヒンジを含むＦａｂ領域（ＰＤＢ：１ＨＺＨ）のＸ線結晶構造；軽鎖（１０１）、重鎖（１０２）、鎖間ジスルフィド（１０３）、及び上部ヒンジ（１０４）。単離されたＦａｂ分子において、上部ヒンジは、構造的及び機能的役割を有しない突出した非構造化（ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ）領域である。上部ヒンジの残基は、既存のＡＨＡへの結合を乱しているＴ２２５Ｌ突然変異（１０５）を示すようにマゼンタ色で表示される。残基の番号付けは、ＥＵ付番命名法に従う。図１Ａは、それぞれ出現順に配列番号１４～１５を開示する。（１Ｂ）プールされたヒト血清を、異なる上部ヒンジ長及び末端を有するヒトＩｇＧ１ Ｆａｂとともにインキュベートした。既存の結合抗体を抗Ｆｃ ＥＬＩＳＡによって検出した。Ｆａｂ Ｃ末端のＤ２２１（Ｄ）における切断及びＣ末端変異型Ｔ２２５Ｌ（ＤＫＴＨＬ（配列番号２０））は、既存の抗体の結合をほぼバックグラウンドにまで大幅に低減した。ヒト好中球エラスターゼの切断部位と一致する、Ｃ末端残基としてのＴ２２３（ＤＫＴ）に対して強力な応答が観察された。個々のデータ点の平均値は、水平線によって表される。図１Ｂは、それぞれ出現順に配列番号２０～２１及び２７を開示する。（１Ｃ）３つの異なるＦａｂをプールされたヒト血清とともにインキュベートし、既存の抗体の結合をＥＬＩＳＡによって検出した。ＤＫＴＨＴ（配列番号２１）Ｃ末端を有する異なるＦａｂについて著しいシグナルが観察された。既存の抗体のＤ２２１及びＴ２２５Ｌ Ｃ末端への低減された結合が、異なるＦａｂにわたって検出された。Ｆａｂ－１は、（Ｂ）及び実施例１全体を通してすべての他のＡＨＡ結合実験において使用された抗体可変ドメインを含む。図１Ｃは、それぞれ出現順に配列番号２１、２０、２１、２０、２１及び２０を開示する。（１Ｄ）プールされたヒト血清を、異なる上部ヒンジ長を有するヒトＩｇＧ２ Ｆａｂ及びＩｇＧ４ Ｆａｂとともにインキュベートし、結合抗体をＥＬＩＳＡによって検出した。ヒトＩｇＧ２及びＩｇＧ４の上部ヒンジへの既存の抗体は何ら検出可能でない。図１Ｄは、配列番号１８を開示する。
【図2】図２Ａ～２Ｃは、ＩｄｅＳによるＩｇＧ１－２キメラの切断を示す。（２Ａ）ＭＯＥでモデリングした抗体ｃＡＣ１０のＦ（ａｂ’）２領域のモデル；軽鎖（２０１）、重鎖（２０２）、鎖間ジスルフィド（２０３）、及び下部ヒンジ（２０４）。ＩｄｅＳのＰ１位は、Ｇ２３６である。残基の番号付けは、ＥＵ付番命名法に従う。図２Ａは、配列番号３０を開示する。（２Ｂ）ＩｇＧ１及びＩｇＧ１－２キメラの下部ヒンジのアライメント。シアン色の残基は、ＩｇＧ２の下部ヒンジに導入されたＩｇＧ２アイソタイプ残基である。図２Ｂは、それぞれ出現順に配列番号３１及び５９を開示する。（２Ｃ）ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ１－２キメラの切断効率。１ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ１及びＩｇＧ１－２を、表示される異なるＩｄｅＳ量とともに３７℃で２４時間インキュベートした。切断をキャピラリー電気泳動法によって分析した。ＩｇＧ１が１：５００のＩｄｅＳ：ＩｇＧ比でＦ（ａｂ’）２へと効率的に切断された一方で、ＩｇＧ１－２は、完全な切断のために５０倍高いＩｄｅＳ濃度を必要とする。
【図3A-B】図３Ａ～３Ｅは、Ｐ１及びＰ２位において変異型を有するヒトＩｇＧ１のＩｄｅＳによる切断を示す。（３Ａ）Ｐ１及びＰ２位に変異型を有する抗体のキャピラリー電気泳動を、１ｍｇ／ｍｌで１：１０比のＩｄｅＳ：ＩｇＧにより３７℃で２４時間消化させた。Ｐ１及びＰ２残基は、１文字コードで表記される。ロイシン及びグリシン（Ｌ２３５Ｇ２３６）は、これらの位置における天然アミノ酸である。すべての抗体変異型は、Ｆ（ａｂ’）２断片へと完全に切断することができる。（３Ｂ）変異型の切断効率を、異なるＩｄｅＳ：ＩｇＧ比で生産されたＦ（ａｂ’）２の量によって評価した。変異型ＶＧが野生型配列（ＬＧ）と同等に切断される一方で、他の変異型は、完全な消化のために増加した量のＩｄｅＳを必要とする。
【図3C】（３Ｃ）変異型の切断効率を、１：１０のＩｄｅＳ：ＩｇＧ比で生産されたＦ（ａｂ’）２の量によって評価した。
【図4】図４Ａ～４Ｂは、既存のＡＨＡに対するＰ１及びＰ２変異型の反応性を示す。（４Ａ）ＩｄｅＳは、精製中に効率的に除去され、精製Ｆ（ａｂ’）２変異型において、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、続いてクマシー染色（上部パネル）または抗ＩｄｅＳ抗体での免疫ブロット分析（下部パネル）によって検出不可能である。（４Ｂ）プールされたヒト血清を、Ｔ２２５ Ｃ末端を有するヒトＩｇＧ１ Ｆａｂ、ならびにＰ１及びＰ２位において変異型を有する抗体のＩｄｅＳ切断によって生成されたＦ（ａｂ’）２とともにインキュベートした。既存の結合抗体をＥＬＩＳＡによって検出した。Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆａｂと比較して約１．７倍高いシグナルを示した。ヒンジ変異型は、反応性をＦａｂと同等のレベルまで低減したが、反応性を完全には排除しなかった。
【図5A-C】図５Ａ～５Ｆは、既存のＡＨＡ応答に対する切断された変異型の反応性を示す。（５Ａ）ＩｄｅＳ Ｐ３、Ｐ４、及びＰ５部位において欠失を有する抗体のＩｄｅＳ切断下部ヒンジにおけるＩｄｅＳ Ｐ３残基（Ｌ２３４）の欠失が、切断効率に重大な影響を及ぼした一方で、Ｐ４（Ｅ２３３）またはＰ５（Ｐ２３２）位の欠失は、野生型（ＷＴ）と比較してＩｄｅＳでの切断に影響を及ぼさなかった。（５Ｂ）Ｐ４及びＰ５位の欠失は、既存のＡＨＡの結合を回避するには十分でなかった。（５Ｃ）ＩｄｅＳ Ｐ４～Ｐ６（ΔＰ４５６）及びＰ４～Ｐ７（ΔＰ４５６７）部位の欠失を有する抗体のＩｄｅＳ切断。１：２００のＩｄｅＳ：ＩｇＧ比で、ΔＰ４５６７変異型の切断効率が、野生型下部ヒンジ配列（ＷＴ）と比較して若干低減された一方で、ΔＰ４５６は、野生型と同等の切断効率を示した。
【図5D-E】（５Ｄ）プールされたヒト血清を、ＩｄｅＳ消化によって生産されたＦ（ａｂ’）２とともにインキュベートし、結合抗体をＥＬＩＳＡによって検出した。下部ヒンジ欠失ΔＰ４５６及びΔＰ４５６７は、既存のＡＨＡによって認識されなかった。（５Ｅ）ＩｄｅＳは、ΔＰ４５６ヒンジ変異型を高い特異性で切断した。野生型（ＷＴ）及びΔＰ４５６ヒンジＩｇＧの消化後、還元されたＦ（ａｂ’）２を質量分析によって分析した。予想された分子量に対応する単一重鎖種のみが観察された。
【図6】図６Ａ～６Ｂは、ヒト、カニクイザル及びアカゲザルのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４アイソタイプの上部、コア及び下部ヒンジ領域における、アミノ酸残基のアライメント（６Ａ）及びアミノ酸残基のＥＵ付番（６Ｂ）を示す。図６Ａは、それぞれ出現順に配列番号４３～５４を開示する。図６Ｂは、それぞれ出現順に配列番号４３、４６、５５及び５２を開示する。
【図7】Ｅ．ｃｏｌｉにおける上部ヒンジ切断または突然変異を有するＦａｂの発現レベルを示す。図は、それぞれ出現順に配列番号１４～１５を開示する。
【図8】１：５００または１：１０のＩｄｅＳ：ＩｇＧ比で生産されたΔＰ４５６及びΔＰ４５６７変異型の切断の効率を示す。図は、それぞれ出現順に配列番号５６～５８を開示する。
【図9A】図９Ａ～９Ｄは、修飾Ｐ１及びＰ２残基を有する欠失変異型の、既存のＡＨＡとの反応性を示す。（９Ａ）変異型の切断効率を、１：１０のＩｄｅＳ：ＩｇＧ比で生産されたＦ（ａｂ’）２の量によって評価した。図９Ａは、配列番号３１を開示する。
【図10A】図１０Ａ～１０Ｂは、修飾Ｐ１及びＰ２残基を有するΔＰ４５６及びΔＰ４５６７変異型の、既存のＡＨＡへの反応性を示す。（１０Ａ）変異型の切断効率を、１：１０及び１：２００のＩｄｅＳ：ＩｇＧ比で生産されたＦ（ａｂ’）２の量によって評価した。図１０Ａは、それぞれ出現順に配列番号５６～５７を開示する。
【図11】ＡＨＡ ＥＬＩＳＡにおけるＦ（ａｂ’）２及びＦａｂ分子の力価曲線を示す。Ｆ（ａｂ’）２力価曲線の中央におけるＯＤ ４５０ｎｍ（１．１５）に対応する希釈率は、Ｆ（ａｂ’）２及びＦａｂについてそれぞれ７０及び１４であった。ゆえに、Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧ１ Ｆａｂよりも５倍高いＡＨＡ反応性を有する。Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）２ΔＰ４５６、Ｆａｂ Ｔ２２５、Ｆａｂ Ｔ２２５Ｌ及びＦａｂ Ｄ２２１をウェルにコーティングした。プールされたヒト血清の段階希釈をウェルに添加し、対照ウェルは未コーティングとした。同様の結果が４つの他の実験において得られた。この図ならびに図１Ｂ及び図５Ｄに示されるデータは、同じ実験から収集された。図は、それぞれ出現順に配列番号２１及び２０を開示する。
【発明を実施するための形態】
【0014】
Ｉ．定義
本明細書における「抗体」という用語は、最も広義に使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含むがこれらに限定されない、種々の抗体構造を包含する。
本明細書における「抗体」という用語は、最も広義に使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含むがこれらに限定されない、種々の抗体構造を包含する。
【0015】
「抗体断片」とは、無傷抗体が結合する抗原と結合する無傷抗体の一部を含む、無傷抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線状抗体；１本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、抗体断片は、Ｆａｂ分子である。ある特定の実施形態において、抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２分子である。
【0016】
「完全長抗体」、「無傷抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書で、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、または本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指して交換可能に使用される。
【0017】
「天然抗体」とは、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ ｈｅａｖｙ ｄｏｍａｉｎ）または重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｉｇｈｔ ｄｏｍａｉｎ）または軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて定常軽（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの型うちの１つに割り当てられ得る。
【0018】
本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義して使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異型Ｆｃ領域を含む。本明細書で別途明記されない限り、Ｆｃ領域または定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載される、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ付番系に従う。
【0019】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を表す。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含み、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる同様のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（例えば、Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３－２３４（１９９７）を参照されたい）。ＦｃＲｓは、例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－９２（１９９１）、Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５－３４（１９９４）、及びｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０－４１（１９９５）に概説される。今後特定されるものも含む他のＦｃＲが、本明細書における「ＦｃＲ」という用語に包含される。
【0020】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」という用語はまた、母体ＩｇＧの胎児への移行（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））、ならびに免疫グロブリンの恒常性の調節に関与する、新生児受容体ＦｃＲｎも含む。ＦｃＲｎへの結合の測定方法は既知である（例えば、Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １８（１２）：５９２－５９８（１９９７）、Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５（７）：６３７－６４０（１９９７）、Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３－６２１６（２００４）、ＷＯ２００４／９２２１９（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）を参照されたい。
【0021】
インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合及びヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウスもしくはトランスフェクトヒト細胞株で、または変異型Ｆｃ領域を有するポリペプチドが投与された霊長類で、アッセイすることができる。ＷＯ２０００／０４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）は、ＦｃＲへの結合が改善また低減された抗体変異型について記載している。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）を参照されたい。
【0022】
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより異なる、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、ならびにＢ細胞活性化が挙げられる。
【0023】
「ヒンジ領域」は、一般に、ヒトＩｇＧ１の２１６～２３８（ＥＵ付番）または２２６～２５１（Ｋａｂａｔ付番）の区間として定義される。ヒンジは、３つの明確に異なる領域、すなわち上部、中部（例えば、コア）及び下部ヒンジにさらに分類され得る。例えば、Ｂｒｅｚｓｋｉ ａｎｄ Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０，６２－６９（２０１６）を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態において、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ領域は、一般に、次のように定義される。
【0024】
上部ヒンジは、配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号２２）を有するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態において、上部ヒンジは、２１６～２２５位（ＥＵ付番）または２２６～２３８位（Ｋａｂａｔ付番）のアミノ酸を含む。
【0025】
中部（例えば、コア）ヒンジは、配列ＣＰＰＣ（配列番号２３）を有するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態において、コアヒンジは、２２６～２２９位（ＥＵ付番）または２３９～２４２位（Ｋａｂａｔ付番）のアミノ酸を含む。
【0026】
下部ヒンジは、配列ＰＡＰＥＬＬＧＧＰ（配列番号２４）を有するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態において、下部ヒンジは、２３０～２３８位（ＥＵ付番）または２４３～２５１位（Ｋａｂａｔ付番）のアミノ酸を含む。
【0027】
抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域の型を指す。５つの主要なクラスの抗体、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分類され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【0028】
「単離された」抗体または抗体断片とは、その天然環境の構成成分から分離された抗体である。抗体または抗体断片は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動法）またはクロマトグラフ（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９５％または９９％超の純度に精製され得る。抗体純度の評価のための方法の概説に関しては、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。
【0029】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、いずれの保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、最大配列同一性パーセントを達成するために配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的での整列は、当該技術分野の技術範囲内の様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成され得る。当業者であれば、比較される配列の全長にわたる最大整列を達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、配列の整列に適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が作成したものであり、ソースコードは、米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９）においてユーザ文書とともに申請されており、これは、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公的に入手可能であるか、またはソースコードから編集され得る。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用する場合は編集すべきである。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定され、変更はない。
【0030】
ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に用いられる状況下で、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（代替的に、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対するある特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、または含む所与のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、以下のように計算される。
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、配列整列プログラムＡＬＩＧＮ－２によってそのプログラムのＡとＢとの整列において完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは等しくないことが理解される。別途具体的に示されない限り、本明細書で使用されるすべてのアミノ酸配列同一性％値は、直前の段落に記載されるようにＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して得られる。
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、配列整列プログラムＡＬＩＧＮ－２によってそのプログラムのＡとＢとの整列において完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは等しくないことが理解される。別途具体的に示されない限り、本明細書で使用されるすべてのアミノ酸配列同一性％値は、直前の段落に記載されるようにＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して得られる。
【0031】
「単離された」核酸とは、その天然環境の構成成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、通常は核酸分子を含有する細胞内に含有される核酸分子を含むが、その核酸分子が染色体外に、またはその天然染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【0032】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、ならびにそれが導入された宿主細胞のゲノム内に組み込まれたベクターを含む。ある特定のベクターは、それらが作動的に連結されている核酸の発現を誘導することができる。かかるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。
【0033】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は交換可能に使用され、外因性核酸が中に導入された細胞を指し、かかる細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び継代の数にかかわらずそれに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一であり得るか、または突然変異を含み得る。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物活性を有する突然変異子孫が、本明細書に含まれる。
【0034】
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、個体または対象は、ヒトである。
【0035】
本明細書で使用される場合、「治療」（及び「治療する」または「治療すること」などのその文法上の変形）とは、治療されている個体の自然経過を変更することを目的とした臨床介入を指し、予防のために、または臨床病理過程中に実施され得る。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的病理学的帰結の縮小、転移の予防、疾患進行速度の減少、病状の回復または寛解、及び緩解または予後の改善が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、本開示の抗体断片は、疾患の発症を遅延させるために、または疾患の進行を減速させるために使用される。
【0036】
薬剤、例えば、本明細書に記載される抗体断片、または薬剤を含む薬学的製剤の「有効量」とは、必要な投与量で必要な期間にわたって所望の治療または予防結果を達成するのに有効な量を指す。
【0037】
「添付文書」という用語は、かかる治療薬の適応症、使用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌症についての情報、及び／またはその使用に関する警告を含有する、治療剤製品の市販パッケージに通例含まれる指示書を指して使用される。
【0038】
「薬学的製剤」という用語は、調製物の中に含有される活性成分の生物学的活性が有効になるような形態であり、かつ製剤が投与される対象にとって許容できないほど有毒である追加の構成成分を何ら含有しない調製物を指す。
【0039】
「薬学的に許容される担体」は、対象にとって無毒である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝液、賦形剤、安定剤、または保存剤が含まれるが、これらに限定されない。
【0040】
本明細書で使用される「細胞傷害性薬剤」という用語は、細胞機能を阻害もしくは阻止する、かつ／または細胞死もしくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害性薬剤には、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤もしくは化学療法薬（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他のインターカレート剤）；成長阻害剤；核酸分解酵素などの酵素及びそれらの断片；抗生物質；細菌、真菌、植物、または動物起源の小分子毒素または酵素活性毒素（それらの断片及び／または変異型を含む）などの毒素；ならびに下に記載される種々の抗腫瘍または抗癌薬剤が含まれるが、これらに限定されない。
【0041】
本明細書で使用されるとき、「約」または「およそ」という用語は、通常の当業者によって決定される、特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し、それは、その値がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定系の限度に部分的に依存するであろう。例えば、「約」は、当該技術分野における実施につき、３以内のまたは３を超える標準偏差を意味することができる。代替的に、「約」は、所与の値の最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、さらにより好ましくは最大１％の範囲を意味することができる。代替的に、特に生体系またはプロセスに関して、この用語は、値の一桁以内、好ましくは５倍以内、及びより好ましくは２倍以内であることを意味することができる。
【0042】
ＩＩ．組成物及び方法
ある特定の実施形態において、本開示は、部分的に、既存の抗ヒンジ抗体（ＡＨＡ）を回避するように抗体断片を操作する方法に基づく。ある特定の実施形態において、ＡＨＡに対して低減された反応性を有するまたは反応性を有しない抗体断片（例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２）、及びこれらの抗体断片を作製する方法が提供される。ある特定の実施形態において、本開示の抗体断片は、薬物治療後の免疫応答を最小限に抑えることによって治療場面においてより優れた安全性を提供し得る。
ある特定の実施形態において、本開示は、部分的に、既存の抗ヒンジ抗体（ＡＨＡ）を回避するように抗体断片を操作する方法に基づく。ある特定の実施形態において、ＡＨＡに対して低減された反応性を有するまたは反応性を有しない抗体断片（例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２）、及びこれらの抗体断片を作製する方法が提供される。ある特定の実施形態において、本開示の抗体断片は、薬物治療後の免疫応答を最小限に抑えることによって治療場面においてより優れた安全性を提供し得る。
【0043】
Ａ．例となる抗体断片
ある特定の実施形態において、本開示は、ＡＨＡに対して低減された反応性を有するまたは反応性を有しない、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２）、及びそれを含む組成物を提供する。例えば、限定するものではないが、本明細書に記載される抗体断片は、参照抗体断片、例えば、天然ヒンジ領域を有する抗体断片と比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％低減されるＡＨＡ反応性を示す。ある特定の実施形態において、参照抗体断片は、天然ヒンジ領域を有するＩｇＧ１抗体断片である。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＡＨＡに対して低減された反応性を有するまたは反応性を有しない、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２）、及びそれを含む組成物を提供する。例えば、限定するものではないが、本明細書に記載される抗体断片は、参照抗体断片、例えば、天然ヒンジ領域を有する抗体断片と比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％低減されるＡＨＡ反応性を示す。ある特定の実施形態において、参照抗体断片は、天然ヒンジ領域を有するＩｇＧ１抗体断片である。
【0044】
ある特定の実施形態において、本開示の単離された抗体断片、及びそれを含む組成物は、ＦｃγＲＩＩＩａ及び／またはＣ１ｑへの低減された結合を示す、かつ／または結合を示さない。例えば、限定することなく、本開示の抗体断片は、参照抗体断片、例えば、天然ヒンジ領域を有する抗体断片と比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％低減される、ＦｃγＲＩＩＩａ及び／またはＣ１ｑへの結合を示す。ある特定の実施形態において、参照抗体断片は、天然ヒンジ領域を有するＩｇＧ１抗体断片である。
【0045】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される方法の関連において用いられる抗体断片は、天然ヒンジ領域または修飾ヒンジ領域を含む。例えば、限定することなく、本開示の抗体断片は、天然ヒンジ領域または修飾ヒンジ領域を含むＦａｂ断片であり得る。ある特定の実施形態において、本開示の抗体断片は、天然ヒンジ領域または修飾ヒンジ領域を含むＦ（ａｂ’）２である。
【0046】
天然ヒンジ領域は、通常は抗体分子のＣＨ１ドメインと会合したヒンジ領域である。ある特定の実施形態において、本明細書に開示される抗体断片の天然ヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのものであり得る。例えば、限定することなく、Ｆａｂ断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのものであり得る。ある特定の実施形態において、抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片は、天然ヒンジ領域を含むＩｇＧ２アイソタイプのものである。ある特定の実施形態において、抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片は、天然ヒンジ領域を含むＩｇＧ４アイソタイプのものである。
【0047】
修飾ヒンジ領域は、長さ及び／または組成が天然ヒンジ領域とは異なる任意のヒンジである。かかるヒンジは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマまたはヤギのヒンジ領域などの、他の種由来のヒンジ領域を含み得る。他の修飾ヒンジ領域は、ＣＨ１ドメインのそれとは異なるクラスまたはサブクラスの抗体に由来する完全なヒンジ領域を含み得る。ゆえに、例えば、クラスγ１のＣＨ１ドメインがクラスγ４のヒンジ領域に結合され得る。代替的に、修飾ヒンジ領域は、天然ヒンジ、または反復における各単位が天然ヒンジ領域に由来する反復単位を一部含み得る。
【0048】
ある特定の実施形態において、天然ヒンジ領域は、修飾ヒンジ領域を生成するように１つ以上のアミノ酸残基を置換する、欠失させる及び／または付加することによって改変される。ある特定の実施形態において、Ｆａｂ断片は、修飾ヒンジ領域を含むＩｇＧ１アイソタイプのものである。ある特定の実施形態において、Ｆａｂ断片は、修飾ヒンジ領域を含むＩｇＧ２アイソタイプのものである。ある特定の実施形態において、Ｆａｂ断片は、修飾ヒンジ領域を含むＩｇＧ４アイソタイプのものである。
【0049】
ある特定の実施形態において、修飾ヒンジ領域は、上部ヒンジ領域内の１つ以上のアミノ酸の置換、欠失及び／または付加を含む。例えば、限定することなく、開示される発明の主題の修飾ヒンジ領域は、アミノ酸ＥＵ２１６～２２５位において１つ以上の置換、欠失及び／または付加を有し得る。代替的にまたは追加的に、修飾ヒンジ領域は、下部ヒンジ領域内の１つ以上のアミノ酸の置換、欠失及び／または付加を含む。ある特定の実施形態において、開示される発明の主題の修飾ヒンジ領域は、アミノ酸ＥＵ２３０～２３８位において１つ以上の置換、欠失及び／または付加を有し得る。代替的にまたは追加的に、修飾ヒンジ領域は、アミノ酸ＥＵ２３８位よりもＣ末端側に１つ以上のアミノ酸の付加を含み得る。ある特定の実施形態において、修飾ヒンジ領域は、中部、例えばコアのヒンジ領域内の１つ以上のアミノ酸の置換、欠失及び／または付加を含む。例えば、限定することなく、開示される発明の主題の修飾ヒンジ領域は、アミノ酸ＥＵ２２６～２２９位において１つ以上の置換、欠失及び／または付加を有し得る。
【0050】
ある特定の実施形態において、修飾または改変は、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上または６つ以上のアミノ酸残基の置換である。ある特定の実施形態において、置換は、上部ヒンジ領域、中部ヒンジ領域及び／または下部ヒンジ領域内で生成され得る。ある特定の実施形態において、２２５位のアミノ酸残基が置換され得る。例えば、限定することなく、２２５位のアミノ酸残基が、スレオニン（Ｔ）を除く任意のアミノ酸に変更され得る。ある特定の実施形態において、２２５位のアミノ酸、例えば、スレオニンは、ロイシン（Ｌ）に変更され得る（例えば、ＥＵ付番に従ってＴ２２５Ｌ）。ある特定の実施形態において、本開示の抗体断片は、置換Ｔ２２５Ｌを含むＦａｂ断片である。
【0051】
ある特定の実施形態において、ＩｇＧ１抗体断片の上部ヒンジ領域は、ＩｇＧ２及び／またはＩｇＧ４抗体の上部ヒンジ領域内に存在する１つ以上のアミノ酸残基で置換され得、これは、例えば、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４抗体の上部ヒンジ領域がＡＨＡに対して低減された反応性を示すか、または反応性を示さないためである（例えば、図１を参照されたい）。例えば、限定することなく、ＩｇＧ１抗体断片の上部ヒンジ領域は、ＩｇＧ２及び／またはＩｇＧ４抗体の天然ヒンジ領域内に存在する１つ以上のアミノ酸残基で置換され得る（図６を参照されたい）。ある特定の実施形態において、ＩｇＧ１抗体断片の修飾ヒンジ領域は、（例えば、ＩｇＧ１抗体の天然ヒンジ領域と比較して）アミノ酸ＥＵ２２０位のシステインを保持する。ある特定の実施形態において、ＩｇＧ１抗体断片の修飾ヒンジ領域は、例えば、ＩｇＧ１抗体断片の上部ヒンジ領域がＩｇＧ４の上部ヒンジ領域（例えば、上部ヒンジ領域全体）と置き換えられているＩｇＧ抗体断片において、アミノ酸ＥＵ２２０位のシステインを保持しない。ある特定の実施形態において、ＩｇＧ１抗体断片の上部ヒンジ領域は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及び／またはＩｇＧ４抗体の上部ヒンジ領域内に存在する１つ以上のアミノ酸残基で置換され得、ここでＩｇＧ１抗体の１３１位のアミノ酸残基が、セリン（Ｓ）からシステイン（Ｃ）に変更される（すなわち、Ｓ１３１Ｃ）。
【0052】
ある特定の実施形態において、本開示の抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂ’は、アミノ酸ＥＵ２３５～２３６位において置換を含み得る。例えば、限定することなく、２３６位のアミノ酸、例えば、グリシン（Ｇ）が、アラニン（Ａ）に変更され得る（例えば、Ｇ２３６Ａ）。ある特定の実施形態において、抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２は、ＥＵ付番に従って２３５位における置換を含み得る。ある特定の実施形態において、２３５位のアミノ酸、例えば、ロイシン（Ｌ）が、バリン（Ｖ）に変更（例えば、Ｌ２３５Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）に変更（例えば、Ｌ２３５Ｉ）、またはメチオニン（Ｍ）に変更（例えば、Ｌ２３５Ｍ）され得る。
【0053】
ある特定の実施形態において、修飾または改変は、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上または６つ以上のアミノ酸残基の欠失である。ある特定の実施形態において、１つ以上の欠失は、上部ヒンジ領域、中部ヒンジ領域及び／または下部ヒンジ領域内で生成され得る。ある特定の実施形態において、本開示の抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂ’は、ＥＵ２３０～２３８位における１つ以上のアミノ酸の１つ以上の欠失を有する修飾ヒンジ領域を含む。ある特定の実施形態において、抗体断片は、ＥＵ２３１位における欠失を含む。ある特定の実施形態において、抗体断片は、ＥＵ２３１及びＥＵ２３２における欠失を含む。ある特定の実施形態において、抗体断片は、ＥＵ２３１、ＥＵ２３２及びＥＵ２３３における欠失を含む。ある特定の実施形態において、抗体断片は、ＥＵ２３１、ＥＵ２３２、ＥＵ２３３及びＥＵ２３４における欠失を含む。ある特定の実施形態において、抗体断片は、ＥＵ２３０、ＥＵ２３１、ＥＵ２３２、ＥＵ２３３及びＥＵ２３４における欠失を含む。
【0054】
ある特定の実施形態において、本開示の抗体断片は、Ｃ末端の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上または６つ以上のアミノ酸の欠失を含む。ある特定の実施形態において、本発明の抗体断片は、例えば、Ｃ末端切断を生成するような、上部ヒンジ領域における１つ以上のアミノ酸の欠失を含む。ある特定の実施形態において、Ｃ末端切断を得るために、ＥＵ２２２～２２５における１つ以上のアミノ酸が欠失され得る。ある特定の実施形態において、本明細書に記載される抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片は、Ｃ末端切断を含む。例えば、限定することなく、本明細書に記載される抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片のＣ末端は、アミノ酸残基Ｄ２２１（ＥＵ付番に従う）で終端する。ある特定の実施形態において、本明細書に記載される抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片のＣ末端は、アミノ酸残基Ｋ２２２（ＥＵ付番に従う）で終端する。
【0055】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される、抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片の重鎖のＣ末端は、ＣＤＫＴＨＴ（配列番号１４）、ＣＤＫＴＨＬ（配列番号１５）、ＣＤＫＴＨ（配列番号１６）、ＣＤＫＴ（配列番号１７）、ＣＤＫ及びＣＤから選択される配列を有するアミノ酸で終端する。ある特定の実施形態において、Ｆａｂ断片の重鎖のＣ末端は、アミノ酸配列ＣＤＫＴＨＸ（配列番号２５）において終端し、ここでＸは、Ｔを除く任意のアミノ酸である。ある特定の実施形態において、Ｆａｂ断片は、表１に開示されるように「ＣＤＫＴＨＴ」、（配列番号１４）「ＣＤＫＴＨＬ」、（配列番号１５）「ＣＤＫＴＨ」、（配列番号１６）「ＣＤＫＴ」、（配列番号１７）「ＣＤＫ」または「ＣＤ」から選択される重鎖定常領域を含む。ある特定の実施形態において、本明細書に開示される発明の主題は、配列番号１、２、３、４、５または６に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む、抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片を提供する。ある特定の実施形態において、本開示の抗体断片は、配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。ある特定の実施形態において、本開示の抗体断片は、配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。
【0056】
ある特定の実施形態において、Ｃ末端における切断及び／または突然変異の代替手段として、既存のＡＨＡ応答を回避するために、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ Ｆａｂ断片が使用され得る。例えば、限定することなく、本開示の抗体断片は、配列番号７または８におけるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含み得る。ある特定の実施形態において、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ Ｆａｂ断片は、Ｃ末端の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上または５つ以上のアミノ酸の欠失を含み得る。ある特定の実施形態において、本開示のＦａｂは、配列ＶＥＲＫ（配列番号２６）で終了する重鎖定常領域を含むＩｇＧ２ Ｆａｂ断片である。ある特定の実施形態において、本明細書に記載される、抗体断片、例えば、ＩｇＧ４ Ｆａｂ断片の重鎖のＣ末端は、ＫＹＧＰＰ（配列番号１８）、ＫＹＧＰ（配列番号１９）、ＫＹＧ、ＫＹ及びＫから選択される配列を有するアミノ酸で終端する。ある特定の実施形態において、本開示のＦａｂは、表１に開示されるように、「ＫＹＧＰＰ」、（配列番号１８）「ＫＹＧＰ」、（配列番号１９）「ＫＹＧ」、「ＫＹ」及び「Ｋ」から選択される重鎖定常領域を含むＩｇＧ４ Ｆａｂ断片である。例えば、限定することなく、本開示の抗体断片は、配列番号９、１０、１１、１２または１３に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含み得る。
表１－Ｆａｂ重鎖配列
表１－Ｆａｂ重鎖配列
【0057】
本開示は、本明細書に記載される配列の保存的修飾を含む抗体断片をさらに提供する。例えば、限定することなく、本開示は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３に記載されるアミノ酸配列またはその保存的修飾を含む重鎖定常領域を含む、抗体断片を提供し、この抗体断片は、本明細書に記載される抗体断片の所望の特性を保持する。例えば、限定することなく、かかる抗体断片は、上記に開示されるように、ＡＨＡに対して低減された反応性を有するまたは反応性を有しない。
【0058】
本明細書で使用されるとき、「保存的配列修飾」という用語は、そのアミノ酸配列を含有する抗体断片の特性に大きな影響を及ぼさないアミノ酸修飾を指すことを意図する。かかる保存的修飾には、アミノ酸置換、付加及び欠失が含まれる。修飾は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ介在性突然変異誘発などの当該技術分野で既知の標準技法によって、本開示の抗体断片に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられる置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。例となる保存的アミノ酸置換が表２に示される。
【0059】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される配列は、最大約１、最大約２、最大約３、最大約４、最大約５、最大約６、最大約７、最大約８、最大約９または最大約１０個のアミノ酸残基が修飾及び／または置換され得る。
【0060】
アミノ酸は、共通の側鎖特性に従って下記のように群分けされ得る。
【0061】
ある特定の実施形態において、非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴い得る。
表２
表２
【0062】
本開示の他の修飾ヒンジ領域は、全体的に合成であり得、長さ、組成及び可動性などの所望の特性を保有するように設計することができる。例えば、限定することなく、本開示の修飾ヒンジ領域は、ヒンジ領域の可動性を増加させるまたは減少させるように改変することができる。例えば、限定することなく、ヒンジ領域の可動性を増加させ得る修飾には、１つ以上のアミノ酸残基の、可動性を増加させる１つ以上のアミノ酸残基（例えば、グリシン）での置換が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、ヒンジ領域の可動性を減少させ得る修飾には、１つ以上のアミノ酸残基の、ポリペプチドの剛性に折り目をつける（ｃｒｅａｓｅ）１つ以上のアミノ酸残基（例えば、プロリン）での置換が含まれるが、これらに限定されない。
【0063】
Ｂ．抗体断片の作製方法
ある特定の実施形態において、抗体断片は、ヒンジ操作技術によって作製される。
ある特定の実施形態において、抗体断片は、ヒンジ操作技術によって作製される。
【0064】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される方法に関連して使用するための抗体断片出発材料は、任意の好適な酵素的切断及び／または消化技法を用いて、任意の全抗体（例えば、全モノクローナル抗体）から得ることができる。ある特定の実施形態において、抗体断片は、ＩｄｅＳでの切断によって得ることができる。
【0065】
ある特定の実施形態において、Ｆａｂ分子は、タンパク質分解消化または組換え発現によって生成される。タンパク質分解消化は、Ｆａｂ生産の元来の方法であった（６）。タンパク質分解消化を介したＦａｂ分子の生成は、プロテアーゼ切断部位によって規定されるＦａｂ重鎖のＣ末端配列をもたらす。転じて、Ｆａｂ分子は典型的に、抗体の上部ヒンジの一部分を含む。抗体のこの上部ヒンジ領域は、ＦａｂとＦｃ領域との間のリンカーとしての役目を果たすが、Ｆａｂ分子において何の構造的または機能的役割も有しない。それは、しばしばＦａｂ分子の結晶構造に完全には分解されないため、非構造化付属部とみなされ得る（図１Ａを参照されたい）。血小板表面受容体ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対して指向される１つの治療用Ｆａｂ分子（アブシキシマブ、ＲＥＯＰＲＯ（登録商標））は、パパインによるタンパク質分解切断によって商業的に生産される。
【0066】
分子クローニングの前進に伴い、抗体断片の組換え発現は、Ｆａｂ分子を生成するための魅力的な経路である（７）。生産経路としてのタンパク質分解消化とは対照的に、Ｆａｂ分子の組換え発現は、組み込まれる上部ヒンジ領域の長さを定める際に柔軟性を提供する。ある特定の実施形態において、Ｆａｂ断片は、組換え発現によって生産される。
【0067】
抗体の高い親和性はしばしば、結合活性を促進する二価標的結合によって可能になる。対照的に、Ｆａｂの標的結合は、一価性である。これはしばしば、完全長ＩｇＧと比較してより低い標的親和性につながる。２つのＦａｂ断片をつなげてＦ（ａｂ’）２を作り出すことによって、短い血清半減期などのＦａｂの主要な特性を保存しながら結合活性が復元され得る。それに加えて、特異的抗体によって複数の疾患媒介因子を標的とすることは、治療用抗体の開発のためにますます重要となってきている（８）。Ｆ（ａｂ’）２分子は、小さな二重特異性抗体断片を生産するための天然の足場を提供する。Ｆａｂ分子の生産とは対照的に、Ｆ（ａｂ’）２の組換え発現は、発現されるＦａｂ’分子が融合部として非天然のホモまたはヘテロ二量体化ドメインを必要とするため、天然には可能でない（９、１０）。よって、Ｆ（ａｂ’）２分子を生成するための２つの主要な手法、すなわち（ｉ）化学的コンジュゲーション及び（ｉｉ）タンパク質分解消化がある。化学的コンジュゲーションの場合、組換え発現されたＦａｂ’分子がホモまたはヘテロ二官能性架橋剤によって連結される（３、９、１１、１２）。Ｆａｂ分子を生産するためのタンパク質分解消化手法と類似して、いくつかの既知のプロテアーゼが、下部ヒンジ領域において無傷抗体を切断して、Ｆ（ａｂ’）２分子を生産し得る（１３）。かかるタンパク質分解消化は、２つのＦａｂ分子がコア－ヒンジの２つのジスルフィド結合によって結合されている、非常に安定したＦ（ａｂ’）２分子をもたらすペプシンが最も広く使用されるが（１４）、より最近ではＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓの高度に特異的なＩｇＧ分解酵素ＩｄｅＳが記載されている（１５、１６）。ＩｄｅＳの使用は、ペプシン消化で観察されるＣ末端における不均一性を排除することによって、高度に均一な産物の生成を可能にする（３）。ある特定の実施形態において、Ｆ（ａｂ’）２断片は、ＩｄｅＳ切断によって生産される。
【0068】
Ｃ．組換え法及び組成物
抗体断片は、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載される、組換え法及び組成物を使用して生産され得る。ある特定の実施形態において、本明細書に記載される抗体断片をコードする単離された核酸またはかかる核酸を含む組成物が提供される。それに加えて、かかる核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。かかる核酸を含む宿主細胞もまた提供される。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。ある特定の実施形態において、Ｆａｂ分子を作製する方法が提供され、本方法は、上記に提供されるＦａｂをコードする核酸を含む宿主細胞を、Ｆａｂの発現に好適な条件下で培養することと、任意選択で、Ｆａｂを宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することとを含む。
抗体断片は、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載される、組換え法及び組成物を使用して生産され得る。ある特定の実施形態において、本明細書に記載される抗体断片をコードする単離された核酸またはかかる核酸を含む組成物が提供される。それに加えて、かかる核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。かかる核酸を含む宿主細胞もまた提供される。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。ある特定の実施形態において、Ｆａｂ分子を作製する方法が提供され、本方法は、上記に提供されるＦａｂをコードする核酸を含む宿主細胞を、Ｆａｂの発現に好適な条件下で培養することと、任意選択で、Ｆａｂを宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することとを含む。
【0069】
Ｆａｂの組換え生産については、例えば、上述のＦａｂをコードする核酸が単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／または発現のために、１つ以上のベクター中に挿入される。かかる核酸は、従来の手順を使用して（例えば、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離され、配列決定され得る。
【0070】
Ｆａｂをコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞には、本明細書に記載される原核生物細胞または真核生物細胞が含まれる。例えば、Ｆａｂは、細菌において生産することができる。細菌におけるＦａｂなどの抗体断片の発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号を参照されたい。（また、Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗体断片の発現について記載している、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５－２５４も参照されたい。）発現後、Ｆａｂは、可溶性画分中で細菌細胞ペーストから単離され得、さらに精製され得る。
【0071】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物が、Ｆａｂをコードするベクターに好適なクローニングまたは発現宿主であり、これには、そのグリコシル化経路が「ヒト化」された真菌及び酵母株が含まれる。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９－１４１４（２００４）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０－２１５（２００６）を参照されたい。
【0072】
グリコシル化タンパク質の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために昆虫細胞と併せて使用され得る、多数のバキュロウイルス株が特定されている。
【0073】
植物細胞培養物も宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を生産するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術について記載する）を参照されたい。
【0074】
脊椎動物細胞も宿主として使用することができる。例えば、懸濁液中で成長するように適合された哺乳類細胞株が、有用であり得る。有用な哺乳類宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）、ヒト胚性腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載されるような２９３または２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頚部癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）、例えばＭａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載される、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳類宿主細胞株には、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ならびにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。Ｆａｂ生産に好適なある特定の哺乳類宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照されたい。
【0075】
Ｄ．薬学的製剤
本明細書に記載される抗体断片、例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有する抗体を、１つ以上の任意選択的な薬学的に許容される担体と混合することによって（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製される。例えば、限定するものではないが、凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。ある特定の実施形態において、水性抗体製剤には、米国特許第６，１７１，５８６号及びＷＯ２００６／０４４９０８に記載されるものが含まれ得、後者の製剤は、ヒスチジン－酢酸緩衝液を含む。
本明細書に記載される抗体断片、例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有する抗体を、１つ以上の任意選択的な薬学的に許容される担体と混合することによって（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製される。例えば、限定するものではないが、凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。ある特定の実施形態において、水性抗体製剤には、米国特許第６，１７１，５８６号及びＷＯ２００６／０４４９０８に記載されるものが含まれ得、後者の製剤は、ヒスチジン－酢酸緩衝液を含む。
【0076】
ある特定の実施形態において、本開示の抗体断片は、約８０％超、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、約９９％超、約９９．１％超、約９９．２％超、約９９．３％超、約９９．４％超、約９９．５％超、約９９．６％超、約９９．７％超、約９９．８％超または約９９．９％超の純度のものであり得る。
【0077】
薬学的に許容される担体は、一般に、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、これには、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書における例となる薬学的に許容される担体には、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質などの、介在性薬物分散剤がさらに含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある特定の例となるｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ以上のさらなるグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
【0078】
本明細書における製剤はまた、治療される特定の適応症に必要な２つ以上の活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有し得る。かかる活性成分は、好適には、意図される目的に有効である量で組み合わせて存在する。
【0079】
本開示の組成物は、当該技術分野で既知の多様な方法によって投与することができる。投与の経路及び／または様式は、所望の結果に応じて変動する。活性化合物は、化合物を、埋め込み物、経皮パッチ、及びマイクロカプセル封入送達系を含む放出制御製剤などの、急速な放出から保護する担体とともに調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。かかる製剤の調製のための多くの方法は、例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８によって記載されている。ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、米国食品医薬品局の医薬品の製造及び品質管理に関する基準（ＧＭＰ）条件の下で製造される。
【0080】
担体は、（例えば、注射または注入による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、または上皮投与に好適であり得る。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち抗体断片は、化合物を、酸の作用及び化合物を不活化し得る他の天然の条件から保護するために材料中にコーティングされ得る。
【0081】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技法もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ－（メチルメタシレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル中、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中、またはマイクロエマルジョン中に封入され得る。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示される。
【0082】
徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の好適な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、これらのマトリックスは、成形物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。
【0083】
インビボ投与に使用される製剤は、一般に、滅菌のものである。滅菌性は、例えば、滅菌濾過膜を介した濾過によって容易に達成され得る。
【0084】
開示される薬学的組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などのアジュバントを含有することができる。微生物の存在の防止は、上記の滅菌手順によって、ならびに、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの種々の抗菌剤及び抗真菌剤の包含によって、の両方で確実にすることができる。糖、塩化ナトリウムなどのような等張剤を組成物に含めることもまた、望ましくあり得る。さらに、注射用剤型の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤の包含によってもたらすことができる。
【0085】
ある特定の実施形態において、本発明の抗体が医薬品としてヒト及び動物に投与されるとき、それらは単独で、または、例えば、約０．０１％～約９９．５％（または約０．１～約９０％）の抗体断片を薬学的に許容される担体と組み合わせて含有する薬学的組成物として、与えることができる。
【0086】
Ｅ．治療法及び組成物
本明細書に提供される抗体断片のいずれも、治療方法において使用することができる。ある特定の実施形態において、抗体断片として使用するための医薬品が提供される。ある特定の実施形態において、特定の疾患適応症の治療に使用するための抗体断片が提供される。ある特定の実施形態において、本開示の抗体断片を使用して、眼疾患及び／または障害を治療することができる。ある特定の実施形態において、本開示の抗体断片を使用して、短い半減期を示す抗体断片の適用が有益であろう疾患及び／または障害を治療することができる。ある特定の実施形態において、治療方法において使用するための抗体断片が提供される。
本明細書に提供される抗体断片のいずれも、治療方法において使用することができる。ある特定の実施形態において、抗体断片として使用するための医薬品が提供される。ある特定の実施形態において、特定の疾患適応症の治療に使用するための抗体断片が提供される。ある特定の実施形態において、本開示の抗体断片を使用して、眼疾患及び／または障害を治療することができる。ある特定の実施形態において、本開示の抗体断片を使用して、短い半減期を示す抗体断片の適用が有益であろう疾患及び／または障害を治療することができる。ある特定の実施形態において、治療方法において使用するための抗体断片が提供される。
【0087】
ある特定の実施形態において、本開示は、個体に有効量の抗体断片またはそれを含む組成物を投与することを含む、特定の疾患を有する個体の治療方法において使用するための抗体断片を提供する。ある特定の実施形態において、本方法は、個体に、例えば下記に記載される、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を投与することをさらに含む。ある特定の実施形態において、本開示は、特定の分子経路及び／または機構の阻害に使用するための抗体断片を提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、個体に、特定の分子経路及び／または機構を阻害するために有効の抗体断片を投与することを含む、個体における特定の分子経路及び／または機構の阻害方法において使用するための抗体断片を提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、特定の分子経路及び／または機構の活性化に使用するための抗体断片を提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、個体に、特定の分子経路及び／または機構を活性化するために有効の抗体断片を投与することを含む、個体における特定の分子経路及び／または機構の阻害方法において使用するための抗体断片を提供する。上記の実施形態のいずれかによる「個体」は、ヒトであり得る。
【0088】
ある特定の実施形態において、本開示は、医薬品の製造または調製における抗体断片の使用を提供する。ある特定の実施形態において、医薬品は、特定の疾患の治療のためのものである。ある特定の実施形態において、医薬品は、特定の疾患を有する個体に有効量の医薬品を投与することを含む、該疾患の治療方法において使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本方法は、個体に、例えば下記に記載される、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を投与することをさらに含む。ある特定の実施形態において、医薬品は、特定の分子経路及び／または機構の阻害または活性化のためのものである。ある特定の実施形態において、医薬品は、個体に、特定の分子経路及び／または機構を阻害するために有効量の医薬品を投与することを含む、個体における特定の分子経路及び／または機構の阻害方法または活性化方法において使用するためのものである。上記の実施形態のいずれかによる「個体」は、ヒトであり得る。
【0089】
ある特定の実施形態において、本開示は、特定の疾患の治療方法を提供する。ある特定の実施形態において、本方法は、かかる疾患を有する個体に有効量の抗体断片を投与することを含む。ある特定の実施形態において、本方法は、個体に、例えば下記に記載される、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を投与することをさらに含む。上記の実施形態のいずれかによる「個体」は、ヒトであり得る。
【0090】
ある特定の実施形態において、本開示は、個体における特定の分子経路及び／または機構の阻害方法を提供する。ある特定の実施形態において、本方法は、個体に、特定の分子経路及び／または機構を阻害するために有効量の抗体断片を投与することを含む。ある特定の実施形態において、「個体」は、ヒトである。
【0091】
ある特定の実施形態において、本開示は、例えば、上記の治療方法のいずれかにおいて使用するための、本明細書に提供される抗体断片のうちのいずれかを含む薬学的製剤を提供する。ある特定の実施形態において、薬学的製剤は、本明細書に提供される抗体断片のうちのいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。ある特定の実施形態において、薬学的製剤は、本明細書に提供される抗体断片のうちのいずれかと、例えば下記に記載される、少なくとも１つの追加の治療剤とを含む。
【0092】
本開示の抗体断片は、療法において単独で、または他の薬剤と組み合わせてのいずれでも使用することができる。例えば、本開示の抗体断片は、少なくとも１つの追加の治療薬と共投与され得る。
【0093】
上述のかかる併用療法は、組み合わせた投与（２つ以上の治療薬が同じまたは別個の製剤に含まれる）、及び別個の投与を包含し、別個の投与の場合、本開示の抗体の投与は、追加の治療剤（単数または複数）の投与前に、投与と同時に、及び／または投与後に生じ得る。ある特定の実施形態において、抗体断片の投与及び追加の治療剤の投与は、互いの約１ヶ月以内、または約１週間、２週間もしくは３週間以内、または約１、２、３、４、５、もしくは６日以内に生じる。本明細書に記載される抗体断片は、放射線療法と併用することもできる。
【0094】
抗体断片（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、眼内、及び鼻腔内、ならびに局所治療で所望の場合、病変内投与を含む、任意の好適な手段によって投与され得る。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、眼内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。投薬は、投与が短時間であるか、または慢性的であるかに部分的に応じて、例えば、静脈注射または皮下注射などの注射によって任意の好適な経路で行われ得る。単回投与または様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投薬スケジュールが本明細書で企図される。
【0095】
抗体断片は、グッドメディカルプラクティス（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）と一致した様式で製剤化、投薬、及び投与される。これに関連して考慮する要因には、治療されている特定の疾患、治療されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジューリング、及び医師に既知の他の要因を含む。抗体断片は、必ずしもそうである必要はないが、任意選択で、問題の疾患を予防または治療するために現在使用されている１つ以上の薬剤とともに製剤化される。かかる他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体断片の量、疾患または治療の種類、及び上で考察される他の要因に左右される。これらは一般に、本明細書に記載されるものと同じ投薬量及び投与経路で使用されるか、または本明細書に記載される投薬量の約１～９９％、または経験的／臨床的に適切と判断される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。
【0096】
疾患の予防または治療について、本開示の抗体断片の適切な投薬量（単独でまたは１つ以上の他の追加の治療薬と組み合わせて使用される場合）は、治療される疾患の種類、抗体断片の種類、疾患の重症度及び経過、抗体断片が予防目的または治療目的のために投与されるか、以前の療法、患者の病歴、及び抗体断片への応答、ならびに主治医の裁量に依存する。抗体断片は、１回で、または一連の治療にわたって患者に好適に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、１回以上の別個の投与によってであれ連続注入によってであれ、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体断片が、患者に投与するための初回候補投薬量となり得る。１つの典型的な１日用量は、上述の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。病態に応じて数日間以上にわたる反復投与では、治療は一般に、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続されるだろう。抗体断片の１つの例となる投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ（またはそれらの任意の組み合わせ）のうちの１つ以上の用量が患者に投与され得る。かかる用量は、断続的に、例えば、毎週または３週間に１回（例えば、患者が約２～約２０回、または例えば約６回用量の抗体断片を受けるように）投与され得る。より高い初回負荷量、続いて１回以上のより低い用量が、投与されてもよい。この療法の進行は、従来の技法及びアッセイによって容易に監視される。
【0097】
上の製剤または治療方法のうちのいずれも、本開示の抗体断片の代わりに、またはそれに加えて、免疫複合体を使用して行われ得ることが理解される。
【0098】
Ｆ．免疫複合体
本明細書に開示される発明の主題はまた、化学療法剤もしくは化学療法薬、成長阻害剤、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはそれらの断片）、または放射性同位体などの１つ以上の細胞傷害性薬剤と複合された本明細書に記載される抗体断片を含む、免疫複合体を提供する。例えば、開示される発明の主題の抗体断片は、別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣体などの１つ以上の他の結合分子に（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合またはその他によって）機能的に連結され得る。
本明細書に開示される発明の主題はまた、化学療法剤もしくは化学療法薬、成長阻害剤、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはそれらの断片）、または放射性同位体などの１つ以上の細胞傷害性薬剤と複合された本明細書に記載される抗体断片を含む、免疫複合体を提供する。例えば、開示される発明の主題の抗体断片は、別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣体などの１つ以上の他の結合分子に（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合またはその他によって）機能的に連結され得る。
【0099】
ある特定の実施形態において、免疫複合体は、抗体断片が１つ以上の薬物に複合された抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）であり、この薬物には、マイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号、及び欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号を参照されたい）；モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦなどのオーリスタチン（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５，６３５，４８３号及び同第５，７８０，５８８号及び同第７，４９８，２９８号を参照されたい）；ドラスタチン：カリケアマイシンまたはその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号、及び同第５，８７７，２９６号、Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６－３３４２（１９９３）、及びＬｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９２５－２９２８（１９９８）を参照されたい）；ダウノマイシンまたはドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：４７７－５２３（２００６）、Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １６：３５８－３６２（２００６）、Ｔｏｒｇｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１６：７１７－７２１（２００５）、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：８２９－８３４（２０００）、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １２：１５２９－１５３２（２００２）、Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６－４３４３（２００２）、及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照されたい）；メトトレキサート；ビンデシン、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどのタキサン；トリコテシン；ならびにＣＣ１０６５を含むが、これらに限定されない。
【0100】
ある特定の実施形態において、免疫複合体には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、ならびにトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）を含むがこれらに限定されない酵素活性毒素またはその断片に複合された本明細書に記載される抗体断片が含まれる。
【0101】
ある特定の実施形態において、免疫複合体には、放射性原子に複合されて放射性複合体を形成する、本明細書に記載される抗体断片が含まれる。放射性複合体の産生には、様々な放射性同位体が利用可能である。非限定的な例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。放射性複合体を検出のために使用する場合、それは、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えば、ｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（別名、磁気共鳴画像法、ｍｒｉ）のためのスピン標識、例えば、ヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガン、もしくは鉄を含み得る。
【0102】
抗体断片及び細胞傷害性薬剤の複合体は、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアネート）、及びビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）などの多様な二官能性タンパク質結合剤を使用して作製され得る。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製することができる。炭素－１４で標識された１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への複合のための例となるキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞内において細胞傷害性薬物の放出を容易にする「切断可能リンカー」であり得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７－１３１（１９９２）、米国特許第５，２０８，０２０号）が使用されてもよい。リンカーの非限定的な例は、上記に開示される。
【0103】
本明細書のイムヌオ複合体（ｉｍｍｕｎｕｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）は、（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａから）市販されている、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、及びスルホ－ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むがこれらに限定されない架橋剤試薬で調製された、かかる複合体を明示的に企図するが、これらに限定されない。
【0104】
Ｇ．製品
本開示のある特定の実施形態において、上述の障害の治療、予防及び／または診断に有用な材料を含有する製造品が提供される。製品は、容器と、容器上のまたは容器に関連付けられたラベルまたは添付文書とを含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成され得る。容器は、それ自体で、または別の組成物と組み合わせて、病態の治療、予防及び／または診断に有効である組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静注溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアルであり得る）。組成物本中の少なくとも１つの活性薬剤は、本開示の抗体断片である。ラベルまたは添付文書は、組成物が選定の病態を治療するために使用されることを指示する。さらに、製品は、（ａ）本開示の抗体断片を含む組成物を中に収容した第１の容器、及び（ｂ）さらなる細胞傷害性薬剤あるいは治療剤を含む組成物を中に収容した第２の容器を含み得る。本開示のこの実施形態の製品は、これらの組成物が特定の病態を治療するために使用され得ることを指示する添付文書をさらに含み得る。代替的に、または追加的に、製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝剤を含む第２の（または第３の）容器をさらに含み得る。それは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
本開示のある特定の実施形態において、上述の障害の治療、予防及び／または診断に有用な材料を含有する製造品が提供される。製品は、容器と、容器上のまたは容器に関連付けられたラベルまたは添付文書とを含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成され得る。容器は、それ自体で、または別の組成物と組み合わせて、病態の治療、予防及び／または診断に有効である組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静注溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアルであり得る）。組成物本中の少なくとも１つの活性薬剤は、本開示の抗体断片である。ラベルまたは添付文書は、組成物が選定の病態を治療するために使用されることを指示する。さらに、製品は、（ａ）本開示の抗体断片を含む組成物を中に収容した第１の容器、及び（ｂ）さらなる細胞傷害性薬剤あるいは治療剤を含む組成物を中に収容した第２の容器を含み得る。本開示のこの実施形態の製品は、これらの組成物が特定の病態を治療するために使用され得ることを指示する添付文書をさらに含み得る。代替的に、または追加的に、製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝剤を含む第２の（または第３の）容器をさらに含み得る。それは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
【0105】
上記の製品はいずれも、本明細書に記載される抗体断片の代わりに、またはそれに加えて、免疫複合体を含み得ることが理解される。
【実施例0106】
以下は、本開示の方法及び組成物の実施例である。上記に提供された概要を得ると、様々な他の実施形態が実施され得ることが理解される。
【0107】
実施例１－ヒンジ操作による既存の抗ヒンジ抗体応答の回避
Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２抗体断片は、治療アッセイ及び免疫アッセイにおいて完全長抗体の代替的フォーマットとしての役目を果たす。それらは、小さなサイズ、短い血清半減期、及びエフェクター機能の欠如という利点を提供する。侵襲性疾患に関連するいくつかのプロテアーゼは、抗体をヒンジ領域において切断し、ネオエピトープに対する抗ヒンジ抗体（ＡＨＡ）をもたらすことが知られている。血清中の既存のＡＨＡは、代理Ｆｃとして作用して、抗体断片において欠如しているＦｃの特性を再導入し得る。この応答は、疾患と闘う自然過程の間には所望されるが、それは一般的には、治療用抗体断片に不要である。この研究において、ＩｄｅＳプロテアーゼによる効率的なタンパク質分解切断を維持する、抗体の下部ヒンジ領域における切断部を特定した。結果として生じたＦ（ａｂ’）２Ｃ末端におけるネオエピトープは、検出可能な既存のＡＨＡを有さず、これは、既存のＡＨＡ応答が所望されない場合のタンパク質分解消化によるインビトロでのＦ（ａｂ’）２生産のための実用的な経路を提供した。この研究において、抗体の上部ヒンジ領域もまた研究され、これは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４の上部ヒンジのＣ末端残基の、ヒト血清中の既存のＡＨＡ反応性への寄与に関する詳細な分析を提供した。既存の抗体はＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプのＦａｂに対して何ら観察されなかったが、ヒトＩｇＧ１の上部ヒンジのほとんどの残基に対しては著しい応答が観察された。Ｔ２２５Ｌ突然変異（本明細書で「Ｔ２２５Ｌ変異型」とも称される）及び天然Ｃ末端Ｄ２２１を、血清反応性が最小である解決策として特定した。この研究は、既存のＡＨＡに対して最小の反応性を有する、治療アッセイ及び免疫アッセイ用のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の生産を可能にした。
Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２抗体断片は、治療アッセイ及び免疫アッセイにおいて完全長抗体の代替的フォーマットとしての役目を果たす。それらは、小さなサイズ、短い血清半減期、及びエフェクター機能の欠如という利点を提供する。侵襲性疾患に関連するいくつかのプロテアーゼは、抗体をヒンジ領域において切断し、ネオエピトープに対する抗ヒンジ抗体（ＡＨＡ）をもたらすことが知られている。血清中の既存のＡＨＡは、代理Ｆｃとして作用して、抗体断片において欠如しているＦｃの特性を再導入し得る。この応答は、疾患と闘う自然過程の間には所望されるが、それは一般的には、治療用抗体断片に不要である。この研究において、ＩｄｅＳプロテアーゼによる効率的なタンパク質分解切断を維持する、抗体の下部ヒンジ領域における切断部を特定した。結果として生じたＦ（ａｂ’）２Ｃ末端におけるネオエピトープは、検出可能な既存のＡＨＡを有さず、これは、既存のＡＨＡ応答が所望されない場合のタンパク質分解消化によるインビトロでのＦ（ａｂ’）２生産のための実用的な経路を提供した。この研究において、抗体の上部ヒンジ領域もまた研究され、これは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４の上部ヒンジのＣ末端残基の、ヒト血清中の既存のＡＨＡ反応性への寄与に関する詳細な分析を提供した。既存の抗体はＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプのＦａｂに対して何ら観察されなかったが、ヒトＩｇＧ１の上部ヒンジのほとんどの残基に対しては著しい応答が観察された。Ｔ２２５Ｌ突然変異（本明細書で「Ｔ２２５Ｌ変異型」とも称される）及び天然Ｃ末端Ｄ２２１を、血清反応性が最小である解決策として特定した。この研究は、既存のＡＨＡに対して最小の反応性を有する、治療アッセイ及び免疫アッセイ用のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の生産を可能にした。
【0108】
材料及び方法
プラスミド構築及び抗体発現：抗体を標準的な分子生物学技法によって、以前に記載されたようにＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター（９、２３）、または哺乳類発現ベクター（２４）にクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ発現は、Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．（２３）に記載されるように行った。ＩｇＧ及びＦａｂは、以前に記載されたように、ＣＨＯ（２５）またはＨＥＫ２９３Ｔ（２６）細胞の３０ｍＬの一過性トランスフェクション培養物中で発現させた。
プラスミド構築及び抗体発現：抗体を標準的な分子生物学技法によって、以前に記載されたようにＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター（９、２３）、または哺乳類発現ベクター（２４）にクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ発現は、Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．（２３）に記載されるように行った。ＩｇＧ及びＦａｂは、以前に記載されたように、ＣＨＯ（２５）またはＨＥＫ２９３Ｔ（２６）細胞の３０ｍＬの一過性トランスフェクション培養物中で発現させた。
【0109】
ＩｄｅＳのクローニング、発現、及び精製：ＩｄｅＳをＮ末端グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として発現させた。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＭＧＡＳ１８８２（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｈ８ＨＤＲ０）由来のＩｄｅＳの成熟配列を、Ｅ．ｃｏｌｉ発現に対してコドン最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）によって合成し、標準的な分子生物学技法によってＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター（２３）にクローニングした。ＩｄｅＳを、Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．（２３）に記載される条件を用いて発現させ、グルタチオンセファロース（ＧＳＨ）カラムを使用して精製した。ＧＳＨ カラムからの５０ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８，０）、２０ｍＭグルタチオン中の溶出画分を濃縮し、Ｓ２００カラムに負荷し、２００ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ６．２）、２５０ｍＭ ＫＣｌで溶出した。
【0110】
抗体及びＦａｂ精製：発現後、細胞を重力によってペレット化した。上清を５０ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）に移した。４００μｌの５０％ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）タンパク質親和性スラリーまたはＧａｍｍａ Ｂｉｎｄ（商標）Ｐｌｕｓスラリー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）を、それぞれＩｇＧ及びＦａｂ精製のために上清に添加した。混合物をＩｎｎｏｖａ ２０００プラットフォーム加振機（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｎｆｉｅｌｄ，ＣＴ，ＵＳＡ）上で室温で一晩インキュベートした。上清を除去し、樹脂を、２５μｍサイズ膜を有する９６ウェルの２ｍｌフィルタープレート（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｏｃｅａｎｓｉｄｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）に移した。樹脂を、Ｓｏｒｖａｌｌ（商標）ＨＴ６遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用した１，１２０倍ｇで５分間の遠心分離によって、１ｍｌの１倍ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。Ｆａｂ精製については、溶出前に樹脂を０．２倍ＰＢＳ ｐＨ５．０でさらに洗浄した。ＩｇＧを５０ｍＭリン酸 ｐＨ２．９を使用して溶出し、溶出液を１，０００倍ｇで５分間の遠心分離によって、２０倍ＰＢＳ ｐＨ１１．０で中和した。Ｆａｂ断片を１０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ２．９を使用して溶出し、０．３Ｍトリス ｐＨ９．０で中和した。溶出されたＩｇＧ及びＦａｂを、Ｓｏｒｖａｌｌ（商標）ＨＴ６遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用した１，０００倍ｇで５分間の遠心分離によって、０．２μｍの９６ウェルフィルタープレート（Ｏｒｏｃｈｅｍ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ，ＵＳＡ）に通して濾過した。
【0111】
ＩｇＧヒンジ変異型のＩｄｅＳ消化：１ｍｇ／ｍｌのＩｇＧを定められたＩｄｅＳ：ＩｇＧ比（ｗ／ｗ）とともに３７℃で２４時間インキュベートした。ＡＨＡアッセイ用の高度に純粋なＦ（ａｂ’）２材料を大量に生成するための規模拡大消化については、最大１：１０のＩｄｅＳ：ＩｇＧ比を使用して完全な消化を促進した。
【0112】
ＩｄｅＳによるＩｇＧ切断後のＦ（ａｂ’）２精製：ＩｄｅＳ切断された試料を２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．４）（緩衝液Ａ）で希釈し、緩衝液Ａにおいて１５０ｃｍ／時（０．７ｃｍ直径、１０ｃｍベッド高さ）で平衡化した１ｍＬ ＳＰセファロース高性能強陽イオン交換カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）に負荷した。カラムをベースラインまで緩衝液Ａで洗浄し、Ｆ（ａｂ’）２を３０カラム体積にわたって０～０．５Ｍ ＮａＣｌの直線塩勾配により溶出した。溶出液を３Ｍトリス（ｐＨ９．０）の添加によってｐＨを７．０に調整するように中和し、０．２２μｍ ＳＴＥＲＩＦＬＩＰ（登録商標）（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）に通して濾過した。ＳＰ溶出されたＦ（ａｂ’）２を、伝導率を＜５ｍＳ／ｃｍに低下させるために緩衝液Ａで希釈した後のＭｏｎｏＳ ５／５０ ＧＬ強陽イオン交換カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）によりさらに精製した。カラムをベースライン（＜０．０５ｍＡＵ）まで緩衝液Ａで洗浄し、Ｆ（ａｂ’）２を４０カラム体積にわたって０～０．６Ｍ ＮａＣｌの塩勾配を用いて溶出した。溶出されたＦ（ａｂ’）２溶液を３Ｍトリス（ｐＨ９．０）でｐＨを７．０に調整するように中和し、０．２２μｍ ＳＴＥＲＩＦＬＩＰ（登録商標）（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）に通して濾過した。
【0113】
Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の質量分析：Ａｇｉｌｅｎｔ ６２２４ ＴＯＦ ＬＣ－ＭＳシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して質量分析データを取得した。Ｆ（ａｂ’）２を１００ｍＭジチオトレイトールで３７℃で２０分間還元した。ポリペプチド鎖をＰＬＲＰ－Ｓ逆相カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）により分離させた。還元された軽鎖及び重鎖の無傷な質量を、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェア（Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｂ．０３．０１）を使用したＭａｘｉｍｕｎ Ｅｎｔｒｏｐｙ Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎによって得た。
【0114】
キャピラリー電気泳動法によるタンパク質の分析：すべての試料を、５μｌの試料体積を７μｌのＨＴタンパク質発現試料緩衝液と混合することによって調製し、７０℃で５分間インキュベートした。３２μｌの水を試料に添加し、１，０００倍ｇで５分間遠心分離した。ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩユーザーガイドに提供された製造業者の指示に従ってチップを調製し、試料をＣａｌｉｐｅｒ ＧＸ ＩＩマイクロ流体システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）により分析した。試料をＣａｌｉｐｅｒ ＧＸ ＩＩマイクロ流体システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）により分析した。すべての試薬はＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標）から得た。
【0115】
既存の抗ヒンジ抗体酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）：ＭＡＸＩＳＯＲＰ（登録商標） プレート（３８４ウェル、Ｎｕｎｃ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）を５０ｍＭ炭酸塩（ｐＨ９．６）中の１μｇ／ｍｌ Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂで４℃で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ（ｐＨ７．４）中０．０５％ポリソルベート２０で洗浄し、次いでＰＢＳ（ｐＨ７．４）中０．５％ＢＳＡ、１５ｐｐｍプロクリンでブロッキングした。２５人の女性及び２５人の男性個人からのプールされたヒト血清（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ，ＵＳＡ）をアッセイ緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０、１５ｐｐｍ ＰＲＯＣＬＩＮ（商標））中に段階希釈し、プレートに添加した。２時間のインキュベーション後、結合した既存の抗ヒンジ抗体を、アッセイ緩衝液中の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）ヤギ抗Ｆ（ａｂ’）２標識抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）、続いて基質として３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Ｍｏｓｓ Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して検出した。反応を１Ｍリン酸で停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。すべての試料の提示を可能にするために１：３０希釈での吸光度読取り値を図に使用した。比較結果は、１：１０血清希釈率で観察された。相対的ＡＨＡ反応性を計算するために、Ｆ（ａｂ’）２の力価曲線を４パラメータ曲線当てはめプログラム（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ、Ｓｙｎｅｒｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｒｅａｄｉｎｇ，ＰＡ）により当てはめた。Ｆ（ａｂ’）２力価曲線の中央ＯＤ（最上位及び最下位ＯＤ読取り値の平均ＯＤ）を決定した。この中央ＯＤに対応するＦａｂ ＤＫＴＨＴ（配列番号２１）及びＦ（ａｂ’）２の希釈率を計算し、これを使用して相対的ＡＨＡ反応性を計算した。
【0116】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び免疫ブロット：ＳＤＳ－ＰＡＧＥについては、５μｇの精製Ｆ（ａｂ’）２変異型及びＧＳＴ－ＩｄｅＳをＳＤＳ－試料緩衝液と混合し、９５℃で５分間加熱し、１６，０００の相対遠心力で１分間スピンした。試料をＮｕＰＡＧＥ ４－１２％ ＢｉｓＴｒｉｓ／ＭＥＳゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に負荷した。免疫ブロッティングについては、５ｎｇのタンパク質試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥに使用した。ゲルをＩＢＬＯＴ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってニトロセルロース膜上に移し、一次抗体として抗ＩｄｅＳ（Ｇｅｎｏｖｉｓ、ＵＳＡ、カタログ番号Ａ３－ＡＦ１－０１０、ロット番号Ａ３ＡＦ１－７Ｃ１７Ｈ）及び二次抗体としてＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識ロバ抗ヤギ抗体（Ｌｉ－ＣＯＲ（登録商標）、ＵＳＡ、カタログ番号９２６－３２２１４、ロット番号Ｂ８０８２１－０３）で免疫ブロットし、ＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）イメージャ（ＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）、ＵＳＡ）で撮像した。Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）２色タンパク質分子量マーカー（ＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）、ＵＳＡ）を免疫ブロットに使用し、染色済みＳＥＥＢＬＵＥ（登録商標）Ｐｌｕｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）をクマシー染色ゲルに使用した。
【0117】
示差走査蛍光定量によるタンパク質安定性測定：タンパク質安定性をＢｉｏｒａｄ ＣＦＸ９６ ＴＯＵＣＨ（商標）リアルタイムシステム（Ｂｉｏｒａｄ、ＵＳＡ）において、ＳＹＰＲＯ（登録商標）オレンジ色素原液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（商標）、ＵＳＡ）の１：２００の最終希釈率で決定した。１μｌのＳＹＰＲＯ（登録商標）オレンジ色素原液を２４μｌの精製抗体１００μｇ／ｍｌに添加した。ＰＢＳ中の最終２５μｌ試料の蛍光度を２０～１００℃（０．２℃の増分、工程ごとに１０秒間保持）で記録した。
【0118】
結果
Ｆａｂ Ｃ末端は、既存のＡＨＡへの応答を決定する：元々、ヒト血清中の自己抗体の、Ｆａｂ分子の上部ヒンジに対する反応は、パパイン切断抗体であるアブシキシマブで研究された（５）。パパイン切断は、Ｃ末端Ｈ２２４をＦａｂ上に残す。後に、上部ヒンジの個々のＣ末端残基の寄与を詳細に吟味するために、より包括的な研究がビオチン化ペプチド類似体を使用して行われた（２０）。この研究において、上部ヒンジ残基Ｋ２２２～Ｈ２２４に対して最小のＡＨＡ反応性のみが観察された。Ｃ末端残基としてＴ２２５を有するペプチドに対してはシグナルは何ら観察されなかった。合成ペプチドの使用は、上部ヒンジ残基Ｄ２２１～Ｔ２２５に及ぶＦａｂ－テール（図１Ａ）が無傷分子の関連性の外側に提示されるため、結果を混乱させ得る。ゆえに、無傷Ｆａｂの設定におけるＦａｂ－テールの、既存のＡＨＡへの結合への寄与を研究した。
Ｆａｂ Ｃ末端は、既存のＡＨＡへの応答を決定する：元々、ヒト血清中の自己抗体の、Ｆａｂ分子の上部ヒンジに対する反応は、パパイン切断抗体であるアブシキシマブで研究された（５）。パパイン切断は、Ｃ末端Ｈ２２４をＦａｂ上に残す。後に、上部ヒンジの個々のＣ末端残基の寄与を詳細に吟味するために、より包括的な研究がビオチン化ペプチド類似体を使用して行われた（２０）。この研究において、上部ヒンジ残基Ｋ２２２～Ｈ２２４に対して最小のＡＨＡ反応性のみが観察された。Ｃ末端残基としてＴ２２５を有するペプチドに対してはシグナルは何ら観察されなかった。合成ペプチドの使用は、上部ヒンジ残基Ｄ２２１～Ｔ２２５に及ぶＦａｂ－テール（図１Ａ）が無傷分子の関連性の外側に提示されるため、結果を混乱させ得る。ゆえに、無傷Ｆａｂの設定におけるＦａｂ－テールの、既存のＡＨＡへの結合への寄与を研究した。
【0119】
Ｅ．ｃｏｌｉ及び哺乳類細胞中でのＦａｂ分子の組換え発現は、タンパク質分解切断の必要性なしに、規定のＣ末端を有する分子を容易に生産することを可能にする。Ｃ末端の完全性を確実にするために、精製Ｆａｂの正確な質量を無傷質量分析法によって確認した。Ｆａｂ分子をマイクロタイタープレート上にコーティングし、プールされたヒトドナー血清とのインキュベーション後、既存のＡＨＡの結合を抗Ｆｃ検出によって定量した。以前の研究と一致するように（２０）、Ｃ末端のＴ２２３（配列ＤＫＴを有する、本明細書で「ＣＤＫＴ」（配列番号１７）とも称される）が、既存のＡＨＡに対して、すべての上部ヒンジ変異型のうち最も高い反応性を示した（図１Ｂ）。以前の研究との著しい差異が、Ｃ末端のＴ２２５（配列ＤＫＴＨＴ（配列番号２１）を有する、本明細書で「ＣＤＫＴＨＴ」（配列番号１４）とも称される）で観察される。この変異型は、ペプチドとしてＡＨＡに結合しなかったが（２０）、Ｆａｂとして試験したときには実質的なＡＨＡ反応性が観察された。Ｃ末端のＤ２２１（配列Ｄを有する、本明細書で「ＣＤ」とも称される「ＣＤ」）の場合、ＡＨＡの結合は、ほぼバックグラウンドまで低減された。ゆえに、ＦａｂをＤ２２１で終端することは、天然抗体配列を維持しながら既存のＡＨＡによる認識を最低限に抑えるための解決策を提供する。
【0120】
これらの実験によって実証されるように、Ｃ末端Ｆａｂ残基は、ＡＨＡ結合に対して多大な影響を有する。既存の抗体による結合がＣ末端における単一のアミノ酸変化によっても防止され得、ＡＨＡに対する反応性を最小限に抑えるためのＤ２２１の代替となる経路を提供するかどうかを調査した。Ｆａｂ Ｃ末端に非天然残基を配置するためにＴ２２５Ｌ変異型を導入し、それへのＡＨＡの結合を試験した。Ｔ２２５Ｌ変異型は、以前に記載されている（７）。突然変異は、既存のＡＨＡの結合を乱し（図１Ｂ）、このことは、結合におけるＣ末端の重要性をさらに強調した。Ｔ２２５Ｌにおける低減されたＡＨＡが低減されたコーティング効率に起因したという可能性を除外するために、抗原捕捉フォーマットを使用してＦａｂ分子を捕捉すると、同様の倍率のＡＨＡシグナル低減が再び観察された。この観察が一般化され得るかどうかを決定するために、３つの異なるＦａｂをプールされたヒト血清とともにインキュベートし、既存の抗体の結合をＥＬＩＳＡによって検出した。ＤＫＴＨＴ（配列番号２１）Ｃ末端を有する３つの異なるＦａｂについて著しいシグナルが観察された一方で、既存の抗体の、Ｄ２２１及びＴ２２５Ｌ Ｃ末端への低減された結合が確かに検出された。（図１Ｃ）。
【0121】
次に、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプのＦａｂ分子を研究した。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４は治療用抗体に一般的に使用されているが、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４ Ｆａｂの使用は、これまで治療薬開発に活かされてこなかった。ゆえに、完全な上部ヒンジ領域を有するＩｇＧ２及びＩｇＧ４ Ｆａｂ（図１Ｄ、それぞれＣ末端Ｋ２１８及びＰ２２５）を試験した。ＩｇＧ１ Ｆａｂとは対照的に、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４ Ｆａｂは、既存のＡＨＡによって認識されなかった。次に、ＩｇＧ４の上部ヒンジを切断した。ＩｇＧ４アイソタイプの上部ヒンジの長さは、ＩｇＧ１と比較するとより短いが（図６Ａ～Ｂを参照されたい）、重鎖－軽鎖間ジスルフィドに関与するシステインがＣＨ１一次構造の中心に位置することから、切断実験において残基Ｋ２１８及びＹ２１９を含めることが可能であった。これらの切断された上部ヒンジＦａｂは、無傷ＩｇＧ１上部ヒンジと同様のシグナルを示した（図１Ｂ）。
【0122】
同じアイソタイプ内のすべてのＦａｂ分子が、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＣＨＯにおいて同様の発現レベルを生み出した（図７）。同じアイソタイプ内で熱安定性の変化は何ら観察されなかった（表３）。ＩｇＧ２及びＩｇＧ４ Ｆａｂの熱安定性は、ＩｇＧ１アイソタイプと比較して約６℃減少した。
【0123】
結論として、既存のＡＨＡに対して最小の反応性を有する下記の複数のＦａｂフォーマットが存在する。ＩｇＧ１－Ｄ２２１、ＩｇＧ１－Ｔ２２５Ｌ、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４。
表３．示差走査蛍光定量によって決定されたＴ３０Ｍ Ｆａｂの熱安定性
表３．示差走査蛍光定量によって決定されたＴ３０Ｍ Ｆａｂの熱安定性
【0124】
ＩｇＧ２の下部ヒンジを有するＩｇＧ１は、効率的に切断できない：Ｆ（ａｂ’）２の下部ヒンジ領域に対する既存のＡＨＡは、文献に広範に記載されている（１３、２７）。Ｆａｂ分子の上部ヒンジへのＡＨＡに類似して、これらのＡＨＡは、代理Ｆｃとして作用し得、すなわちアッセイアーチファクトを導入し得る。ゆえに、ＡＨＡ結合を妨げるＦ（ａｂ’）２フォーマットの開発が望ましい。血清中のＡＨＡがＩｇＧ１アイソタイプのＦ（ａｂ’）２に向かうことが見出されている一方で、ＩｇＧ２アイソタイプの下部ヒンジへの自己抗体の存在を確立することは可能でなかった。興味深いことに、かかる自己抗体の欠如は、生理的に関連性のあるヒトプロテアーゼがＩｇＧ２をＦ（ａｂ’）２断片へと効率的に切断する能力の欠如と一致する（２８）。しかしながら、ＩｇＧ２の非効率的な切断が、ＩｄｅＳプロテアーゼを使用して観察された（２８）。ＩｄｅＳは、Ｇ２３６の後を切断するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ由来のＩｇＧ特異的エンドプロテアーゼである。抗体ヒンジ領域における切断部位に加えて、それは、ＩｇＧに対するその高い特異性に寄与するＦｃにおける第２の部位を認識する（１５、１６）。ＩｇＧ２抗体の非効率的な切断は、切断部位の外側の非活性部位によって引き起こされる可能性がある。ゆえに、ＩｇＧ２の下部ヒンジ残基をＩｇＧ１にグラフティングして、ＩｇＧ１－２キメラを作り出した（図２Ｂ）。異なるＩｄｅＳ：ＩｇＧ比での切断効率を試験した（図２Ｃ）。ＩｇＧ１野生型が１：５００のＩｄｅＳ：ＩｇＧ比でＦ（ａｂ’）２へと効率的に切断された一方で、ＩｇＧ１－２キメラの同様の切断を達成するためには少なくとも５０倍高いプロテアーゼ濃度が必要であった。下部ヒンジにおける配列差異が、ＩｇＧ２抗体の良好でない切断効率に少なくとも部分的に寄与すると結論付けられた。ゆえに、ＩｇＧ１－２キメラは、既存のＡＨＡに結合しないＦ（ａｂ’）２分子を生成するための実用的な戦略でない可能性がある。
【0125】
効率的なＩｄｅＳ切断のためのＰ１及びＰ２位の特徴付け：記載されたＦａｂ実験で、既存のＡＨＡの結合が単一のＣ末端Ｔ２２５Ｌ突然変異によって阻止され得ることが実証された。同様の戦略をＦ（ａｂ’）２に用いた。第１の工程として、ＩｄｅＳプロテアーゼによる切断を可能にするＰ１（ＥＵ２３６）及びＰ２（ＥＵ２３５）部位における残基を特定した。ＩｄｅＳのためのＰ２位におけるＬ２３５、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２３５Ｉ、またはＬ２３５Ｍを含んだ７６個のＦａｂ変異型の組を生成し、Ｐ１におけるシステインを除く任意のアミノ酸と組み合わせた（図３Ｄ及びＥ）。抗体を精製し、ＩｄｅＳによって切断され得る変異型を特定するために１：１０のＩｄｅＳ：ＩｇＧ比でＩｄｅＳにより消化させた。かかる高いプロテアーゼ対抗体比は、切断効率を考慮に入れることなくタンパク質分解を評価するために選定した。ＩｄｅＳによって切断される７つの変異型を特定した（図３Ａ）。Ｐ２位が試験した４つすべての残基を許容した一方で、Ｐ１位においては非常に小さな側鎖を有する２つのアミノ酸、すなわち天然グリシン及びアラニンのみが受け入れられた。この下位組を、３つの異なるＩｄｅＳ：ＩｇＧ比、すなわち１：５００、１：２００及び１：１００（図３Ｂ）ならびに１：１０（図３Ｃ）で、切断効率についてさらに調査した。Ｐ２位における変異型Ｌ２３５Ｖは、野生型配列と比較して、切断効率において最小の変化を実証した。すべての他の変異型は、ヒンジの片側のみで優勢な単一の切断によって特徴付けられ、抗体の他方の側を無傷で残した。Ｐ１位においてグリシンを有するＬ２３５Ｉ及びＬ２３５Ｍ変異型は、１：２００のＩｄｅＳ：ＩｇＧ比で完全に切断可能であった一方で、Ｐ１においてアラニンを有するすべてのＰ２変異型は、著しくより高いプロテアーゼ量を必要とした。よって、ＩｄｅＳによる効率的な切断は、Ｐ１位におけるグリシンを必要とする。
【0126】
Ｃ末端Ｆ（ａｂ’）２変異型は、既存のＡＨＡによる認識を阻止しない：ＩｄｅＳは、擬陽性結果により既存のＡＨＡアッセイの結果を混乱させ得る。これは、ＩｄｅＳによる血清抗体の結合、及び抗Ｆｃ検出抗体によるそれらのその後の認識によって説明され得る。したがって、アッセイに使用したＦ（ａｂ’）２分子が、先行のタンパク質分解反応からのＩｄｅＳを含有しないことを確実にした。精製Ｆ（ａｂ’）２タンパク質中のＩｄｅＳの除去は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、続いてクマシー染色及び抗ＩｄｅＳ免疫ブロットによって確認した（図４Ａ）。
【0127】
精製Ｐ１及びＰ２ Ｆ（ａｂ’）２変異型を次いで、既存のＡＨＡによるそれらの認識について試験した（図４Ｂ）。野生型と比較してシグナルは低減したが、Ｃ末端修飾を有する抗体のうち血清自己抗体との反応性を排除したものは何もなかった。Ｐ２位に対する変化は、中程度の影響を有するのみであった。Ｐ１位におけるＧ２３６Ａ変化は、シグナルをＦａｂと同等のレベルまで低減した。ゆえに、特定の理論に限定されるものではないが、ＩｄｅＳによる切断を保持すると同時に、Ｆ（ａｂ’）２に対する既存の抗体応答を排除するアミノ酸変異型を有する、下部ヒンジを設計することは可能でない。
【0128】
下部ヒンジにおける欠失は、ＩｄｅＳ切断を保持しながら既存のＡＨＡによる認識を阻止する：下部ヒンジを切断することによってＡＨＡのエピトープを除去する別の戦略を用いた。Ｐ１（ＥＵ２３６）及びＰ２（ＥＵ２３５）残基を切断効率におけるそれらの重要性からそのまま残し、切断効率において最小の影響を有する残基を特定するためにＩｄｅＳのＰ３（ＥＵ２３４）、Ｐ４（ＥＵ２３３）及びＰ５（ＥＵ２３２）部位における単一及び二重の残基欠失を生成した（図５Ｆを参照されたい）。著しく低い切断効率がＰ３位の欠失で観察され、ゆえに、この位置はさらなる研究で考慮されなかった（図５Ａ）。Ｐ４、Ｐ５及びこれら両方の組み合わせの欠失（ΔＰ４５、本明細書でＥＵ２３２～２３３位におけるアミノ酸残基の欠失とも称される）を有する抗体を、ＡＨＡへの結合について試験した（図５Ｂ）。これらの変異型について、野生型ヒンジ配列と比較してより低いシグナルが観察された。既存のＡＨＡによるヒンジ認識をさらに低減するために、欠失を、Ｐ６（ＥＵ２３１）及びＰ７（ＥＵ２３０）残基を含むように延長した（図５Ｆを参照されたい）。Ｐ４～Ｐ７部位の欠失（ΔＰ４５６７、本明細書でＥＵ２３０～２３３位におけるアミノ酸残基の欠失とも称される）は、中程度に低減された切断効率をもたらし、Ｐ４～Ｐ６部位の欠失（ΔＰ４５６、本明細書でＥＵ２３１～２３３位におけるアミノ酸残基の欠失とも称される）は、１：２００のＩｄｅＳ：ＩｇＧ比で、野生型と同等の切断効率を有した（図５Ｃ及び図８）。両変異型とも既存のＡＨＡ認識をもたらさなかった（図５Ｄ）。ＩｄｅＳの高い切断特異性が維持されることを確実にするために、ＥＳＩ－ＴＯＦ質量分析を用いて、ＩｄｅＳにより切断されたＦ（ａｂ’）２を分析した。Ｇ２３６の予想された切断部位に対応する単一の質量が、野生型由来のＦ（ａｂ’）２ならびにΔＰ４５６変異型Ｆ（ａｂ’）２で観察された（図５Ｅ）。
【0129】
図１１に示されるように、観察されたΔＰ４５６変異型Ｆ（ａｂ’）２のＡＨＡ結合シグナルは、２つのＦａｂ Ｃ末端変異型、すなわちＦａｂ Ｄ２２１及びＦａｂ Ｔ２２５Ｌと同等である。Ｆ（ａｂ’）２力価曲線の中央におけるＯＤ（１．１５）に対応する希釈率は、Ｆ（ａｂ’）２及びＦａｂについてそれぞれ７０及び１４であった。特定の理論に限定されるものではないが、Ｆ（ａｂ’）２で見られた、Ｆａｂ Ｔ２２５と比較して５倍高いＡＨＡ活性は、ＡＨＡのＦ（ａｂ’）２への二価結合の可能性によって説明され得、これはＦ（ａｂ’）２分子が既存のＡＨＡを回避する必要があることを示す。Ｆ（ａｂ’）２ΔＰ４５６及びＦａｂ Ｔ２２５Ｌで見られた低減されたＡＨＡ反応性が低減されたコーティング効率に起因したという可能性を除外するために、抗原捕捉フォーマットを使用してＡＨＡを検出した。ＯＤ読取り値（ｎ＝４）は、１：３０血清希釈でＦ（ａｂ’）２、ΔＰ４５６ Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ Ｔ２２５Ｌ及び緩衝液を受容した抗原コーティングウェルに関して、それぞれ２．２±０．１、０．３４±０．０３、１．３±０．１、０．３６±０．０２及び０．３２±０．０１であった。ゆえに、これらの結果は、ΔＰ４５６ Ｆ（ａｂ’）２及びＦａｂ Ｔ２２５Ｌがそれらの対応する野生型分子と比較して低減されたＡＨＡ反応性を有したことを確証した。
【0130】
これらのデータは、ΔＰ４５６変異型が、タンパク質分解消化という十分に確立された経路によってＦ（ａｂ’）２抗体断片を生産する可能性を維持しながら、Ｆ（ａｂ’）２の下部ヒンジに対する既存のＡＨＡ応答を回避する解決策を提供することを示す。
【0131】
Ｃ末端Ｆ（ａｂ’）２変異型の下部ヒンジにおける欠失：既存のＡＨＡによる認識が改変されるかどうかを決定するために、下部ヒンジ領域における欠失を有するＣ末端変異型を分析した。Ｐ１におけるアラニンまたはグリシンとともに、ＩｄｅＳのためのＰ２位におけるＬ２３５、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２３５Ｉ、またはＬ２３５Ｍを含んだ６つのＦａｂ変異型の組を、種々のヒンジ領域を欠失させて生成した（図９）。この下位組を、３つの異なるＩｄｅＳ：ＩｇＧ比、すなわち１：１０（図９Ａ）、１：１００（図９Ｂ）及び１：５００（図９Ｃ）で、切断効率についてさらに調査した。図９Ｄに示されるように、Ｐ５における欠失と組み合わせた変異型Ｌ２３５ＶまたはＧ２３６Ａは、Ｐ５の欠失単独と比較して低減されたＡＨＡシグナルをもたらした。図１０に示されるように、Ｐ１におけるアラニンまたはグリシンとともにＰ２位におけるＬ２３５Ｖ、Ｌ２３５Ｉ、またはＬ２３５Ｍを含んだΔＰ４５６変異型は、ΔＰ４５６単独と比較して、ＡＨＡシグナルにおける同様の低減を示したが（図１０Ｂ）、ΔＰ４５６の欠失単独は、ΔＰ４５６と組み合わせた変異型と比較してより良好な切断効率を示した（図１０Ａ）。
【0132】
考察
Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２などの抗体断片は、全身にわたる短い半減期及びエフェクターサイレントな（ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｓｉｌｅｎｔ）分子が同時に所望される場合、魅力的な治療フォーマットである。ある特定の断片はまた、腫瘍細胞などの侵襲性疾患及び細菌に関連するプロテアーゼの天然産物であり、免疫監視機構を回避しようとして生成されるものである。結果として、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片のＣ末端ネオエピトープは、免疫系によって認識され、代理Ｆｃを提供し得るＡＨＡをもたらす。
Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２などの抗体断片は、全身にわたる短い半減期及びエフェクターサイレントな（ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｓｉｌｅｎｔ）分子が同時に所望される場合、魅力的な治療フォーマットである。ある特定の断片はまた、腫瘍細胞などの侵襲性疾患及び細菌に関連するプロテアーゼの天然産物であり、免疫監視機構を回避しようとして生成されるものである。結果として、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片のＣ末端ネオエピトープは、免疫系によって認識され、代理Ｆｃを提供し得るＡＨＡをもたらす。
【0133】
この研究において、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプの上部ヒンジ領域に及ぶ個々のＣ末端残基に対する既存のＡＨＡの反応性を詳細に吟味した。ＩｄｅＳ切断されたヒトＩｇＧ２抗体の下部ヒンジにおけるネオエピトープに対する既存のＡＨＡは存在しないことが以前に報告されたが、ヒトアイソタイプの上部ヒンジに対する反応性は、これまでに調査が不完全であった。この研究において、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプの上部ヒンジに対する既存のＡＨＡは、検出されなかった。これは転じて、これらのアイソタイプが侵襲性疾患のプロテアーゼの標的ではないことを示唆し得る。これは、これらのアイソタイプのエフェクター減弱された性質、ならびにこれらのアイソタイプのＦｃ領域の除去が腫瘍及び細菌に利点を提供しないという事実によって説明され得る。対照的に、ＩｇＧ１アイソタイプは、これらのプロテアーゼの主要な標的であるように思われる。実際、プラスミン、ヒト好中球エラスターゼ及びＬｙｓＣを含む、いくつかのプロテアーゼは、ヒトＩｇＧ１の上部ヒンジにおいて切断することが記載されている。この研究は、Ｄ２２１を除いてヒトＩｇＧ１の上部ヒンジのすべての切断部位に対する既存のＡＨＡが存在することを示す。特定の理論に限定されるものではないが、Ｄ２２１に対するＡＨＡの不在は、ヒトプロテアーゼがこの残基の後を切断する能力の欠如、またはこのネオエピトープに対して抗体を産生する能力の欠如の反映であり得る。Ｃ末端Ｔ２２３Ｆａｂに対して最も高い反応性が観察された。興味深いことに、このＣ末端は、細菌及び宿主組織を破壊するための炎症の間に好中球及びマクロファージによって分泌されるプロテアーゼである、ヒト好中球エラスターゼの切断点と一致する（２９）。
【0134】
既存のＡＨＡは、エフェクター機能を、エフェクターを欠損するように設計されている分子に迅速に動員することができる。ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプのＦａｂを使用することで、既存の抗体応答を伴わずに分子を供給する１つの戦略を提供することができる。代替的に、重鎖Ｃ末端にＴ２２５Ｌ突然変異のような非天然残基を導入すること、または上部ヒンジをＤ２２１において切断することは、ＩｇＧ１アイソタイプのための戦略である。Ｔ２２５Ｌ突然変異は既存のＡＨＡに対する応答を排除するが、このことは原則として、免疫応答もまた引き出し得ることを暗示する。これは、抗ＴＮＦＲ１ドメイン抗体に関する最近の研究によってさらに支持される（３４）。インビトロでのスクリーニング中、既存のヒト抗ＶＨ抗体の結合を低減するにはＣ末端アラニンの付加で十分であったが、１人の被験者は、第Ｉ相臨床試験において、修飾Ｃ末端に対して特異的な抗体を高レベルで発達することが見出された。それに加えて、より長いテール上にある潜在的なエキソペプチダーゼ活性が、やがては、既存のＡＨＡによって認識されるネオエピトープをもたらし得る。Ｆａｂ－Ｄ２２１のように非構造化上部ヒンジを完全に除去することは、かかる二次応答の危険性をさらに最小化する。これは、ヒトＩｇＧ１のＩｄｅＳ切断された下部ヒンジに及ぶペプチドと複合して結晶化した抗ヒンジ抗体の結晶構造によって支持される（３０）。このペプチドは拡張した立体構造において抗体に結合していることから、上部または下部ヒンジを切断することで、ネオエピトープを成功裏に除去し、ヒンジ領域に対する抗体の免疫応答を抑制し得ることが示唆される。
【0135】
これらの知見はまた、カニクイザルにおける研究のデザインに含意を有し得る。下部ヒンジ領域は、カニクイザルとヒトＩｇＧとの間で高度に保存されているが、上部ヒンジ領域において相当の差異が存在し（３１）、これが異種間の反応性を阻止する。これは、ヒトＦａｂに対する既存のＡＨＡからの不利点がこれらの研究によって対処され得ないため、カニクイザルにおける毒性学的研究に影響を有し得る。
【0136】
治療的使用を越えて、Ｆａｂ－Ｄ２２１はまた、上部ヒンジが、非構造化性質に起因して結晶構造に一般的に溶解されないことから、結晶学的研究のためのＦａｂの組換え発現に対して考慮することができる。この実施例は、等しい安定性及び発現がＦａｂ－Ｄ２２１構築物で達成され得ることを実証する。非構造化領域を排除することは、結晶化の成果をさらに改善し得る。
【0137】
これまでのところＦ（ａｂ’）２分子を生成するための最も効率的な経路は、タンパク質分解消化によるものであり、ＩｄｅＳなどの高特異性を有するプロテアーゼが好ましい。先に考察されたように、Ｆ（ａｂ’）２分子の下部ヒンジに対しても既存のＡＨＡが存在する。ＩｄｅＳ切断された抗体に対するＡＨＡ価は、Ｆａｂと比較してより高い。特定の理論に限定されるものではないが、これは、本アッセイにおいて結合活性に基づく結合要素を提供するＦ（ａｂ’）２の二価性質、または増加した力価につながるＦ（ａｂ’）２の元々のより高い存在量に起因し得る。ＩｄｅＳによる切断効率を維持しながらＡＨＡ反応性を除去するために、いくつかの戦略を用いた。
【0138】
Ｃ末端残基は、エピトープ認識において重要な役割を有することから（２２）、第１の戦略は、ＡＨＡの結合活性を除去するようにＦ（ａｂ’）２のＣ末端残基を突然変異させることであった。しかしながら、これは、ＩｄｅＳによる効率的な切断のためのＰ１位におけるグリシンの厳格な必要性に起因して可能でなかった。Ｐ２位における選択された突然変異の組は、ＡＨＡ結合に中程度の影響しか有さず、このことは、ＡＨＡとの反応性に対するＣ末端残基の重要性をさらに確証した。Ｐ１及びＰ２変異型のＩｄｅＳ切断効率とのＡＨＡ結合の一致する差異は、おそらく、Ｐ２にバリンを有し、Ｐ１位にアラニンを有するＩｇＧ２アイソタイプが抗ヒンジ抗体応答に対して感受性がより低いことの理由を説明する。効率的な切断のためのＰ１位におけるグリシンの必要性に伴い、異なるアイソタイプ内での及び複数の種にわたるこの残基の高度な保存が起きる。
【0139】
下部ヒンジにおける３つの残基を欠失させることによって（ΔＰ４５６）、既存のＡＨＡ認識を除去しながらＩｄｅＳの切断効率を維持することが可能であった。それは、Ｐ３部位の上流の位置が効率的な切断に軽微な関連性を有することを実証する。既存のＡＨＡに対する反応性を除去することに加えて、下部ヒンジを切断することは、このエピトープに対する免疫応答を減衰させ得る。構造研究に基づいて、ＡＨＡは、拡張した立体構造において下部ヒンジに結合し、５つのＣ末端残基は、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）と相互作用する（３０）。下部ヒンジから３つの残基を除去することによって、４つの残基のみがＩｄｅＳ切断後に残った。この短い配列は、強固な免疫応答には不十分であり得、操作されたヒンジに対するデノボ抗体の発達の可能性を低減し得る。
【0140】
既存の抗体はまた、インビトロでエフェクター機能を減少させることが実証されており（３２）、これはまた薬物開発中の免疫原性アッセイを混乱させ得る。ヒト化抗体に対する抗治療薬抗体（ＡＴＡ）の大多数は、イディオタイプであるリウマトイド因子を標的としているが、Ｆｃ領域に対する低親和性抗体が記載されている。免疫原性アッセイにおいてリウマトイド因子によるアーチファクトを排除する１つの方法は、Ｆｃ領域が欠けている抗体断片を使用することである。しかしながら、他の既存の抗体によって認識されない断片を使用することが重要である。これらの知見は、これらの基準を満たし得る複数のＦａｂフォーマット及びＦ（ａｂ’）２フォーマットを提供する。
【0141】
要約すると、適切な抗体断片を選定することによって、既存のＡＨＡによる認識を回避することが可能である。Ｆａｂ分子に関して、下記のいくつかの選択肢が存在する。（１）ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプを使用すること、（２）Ｃ末端残基（Ｔ２２５Ｌ）の突然変異、または（３）Ｆａｂを残基Ｄ２２１で終端すること。選択肢は、タンパク質分解消化に対する必要性に起因して、Ｆ（ａｂ’）２分子に関してより限定される。しかしながら、高い切断効率及び特異性を維持し、かつ既存のＡＨＡとの反応性を除去する、ＩｇＧ１の下部ヒンジにおける欠失を特定した。これらのフォーマットを使用することで、治療場面における抗体断片に伴う安全性に関する懸念のさらなる最小化を可能にし、アッセイ開発における妨げを除去し得る。
【0142】
実施例２－Ｆ（ａｂ’）２ΔＰ４５６は、低減されたＡＨＡ介在性ＦｃγＲＩＩＩａ及びＣ１ｑ結合を有する
精製ＡＨＡ抗体が代理Ｆｃとして作用して、ＩｄｅＳ生成Ｆ（ａｂ’）２によって喪失したＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能を復元し得ることが以前に記載された（２０、２２）。開示される操作Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２変異型によるＡＨＡの低減された結合が、Ｆｃγ受容体及びＣ１ｑの低減された動員によってさらに反映されるかどうかを研究するために、架橋実験を用いた。ＡＨＡのＦｃγＲＩＩＩａへの結合を評価するために、上述のようにヒト血清をＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２コーティングウェルに添加し、２時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、可溶性ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）－Ｈｉｓ－ＧＳＴ（カルボキシ末端においてＧｌｙ－Ｈｉｓ６－グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（配列番号２８に開示される「Ｇｌｙ－Ｈｉｓ６」）と融合された細胞外ドメインからなる）を０．５μｇ／ｍｌで添加した。結合したＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）－Ｈｉｓ－ＧＳＴを、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識マウス抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ（配列番号２９）、Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）、続いて基質としてＴＭＢを使用して検出した。ＡＨＡのヒトＣ１ｑへの結合を評価するために、上述のようにヒト血清をＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２コーティングウェルに添加し、２時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、精製ヒトＣ１ｑ（Ｑｕｉｄｅｌ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を添加した。結合したＣ１ｑをヤギ抗Ｃ１ｑ抗体（Ｎｏｒｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｔｉｌｂｕｒｇ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、続いてウサギ抗ヤギＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）及び基質としてＴＭＢで検出した。
精製ＡＨＡ抗体が代理Ｆｃとして作用して、ＩｄｅＳ生成Ｆ（ａｂ’）２によって喪失したＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能を復元し得ることが以前に記載された（２０、２２）。開示される操作Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２変異型によるＡＨＡの低減された結合が、Ｆｃγ受容体及びＣ１ｑの低減された動員によってさらに反映されるかどうかを研究するために、架橋実験を用いた。ＡＨＡのＦｃγＲＩＩＩａへの結合を評価するために、上述のようにヒト血清をＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２コーティングウェルに添加し、２時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、可溶性ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）－Ｈｉｓ－ＧＳＴ（カルボキシ末端においてＧｌｙ－Ｈｉｓ６－グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（配列番号２８に開示される「Ｇｌｙ－Ｈｉｓ６」）と融合された細胞外ドメインからなる）を０．５μｇ／ｍｌで添加した。結合したＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）－Ｈｉｓ－ＧＳＴを、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識マウス抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ（配列番号２９）、Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）、続いて基質としてＴＭＢを使用して検出した。ＡＨＡのヒトＣ１ｑへの結合を評価するために、上述のようにヒト血清をＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２コーティングウェルに添加し、２時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、精製ヒトＣ１ｑ（Ｑｕｉｄｅｌ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を添加した。結合したＣ１ｑをヤギ抗Ｃ１ｑ抗体（Ｎｏｒｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｔｉｌｂｕｒｇ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、続いてウサギ抗ヤギＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）及び基質としてＴＭＢで検出した。
【0143】
Ｆ（ａｂ’）２に対するＦｃγＲＩＩＩａ及びＣ１ｑの著しい結合が観察された一方で、ΔＰ４５６ Ｆ（ａｂ’）２変異型に対してはシグナルはほとんど検出されなかったことから、Ｆ（ａｂ’）２変異型の操作がＡＤＣＣ／ＣＤＣ活性化の危険性を著しく低減したことが示される。ＯＤ読取り値（ｎ＝３）は、１：１０希釈血清でＦ（ａｂ’）２、ΔＰ４５６変異型、及び未コーティングのウェルに関して、それぞれ、ＦｃγＲＩＩＩａ結合の場合は０．４５±０．０５、０．１０±０．０２及び０．０９±０．０２、ならびにＣ１ｑ結合の場合は０．９８±０．０９、０．１５８±０．００４及び０．１０７±０．００９であった。
【0144】
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１４．Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．，Ｗｉｓｓｌｅｒ，Ｆ．Ｃ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｌ．Ｎ．（１９６０）Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ａ ｐｅｐｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ ｏｆ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１３２，１７７０－１７７１．
１５．Ｐａｗｅｌ－Ｒａｍｍｉｎｇｅｎ，ｖｏｎ，Ｕ．，Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｂ．Ｐ．，ａｎｄ Ｂｊｏｒｃｋ，Ｌ．（２００２）ＩｄｅＳ，ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｕｎｉｑｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ．ＥＭＢＯ Ｊ．２１，１６０７－１６１５．
１６．Ｖｉｎｃｅｎｔｓ，Ｂ．，Ｐａｗｅｌ－Ｒａｍｍｉｎｇｅｎ，ｖｏｎ，Ｕ．，Ｂｊｏｒｃｋ，Ｌ．，ａｎｄ Ａｂｒａｈａｍｓｏｎ，Ｍ．（２００４）Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ，ＩｄｅＳ，ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈａｔ ｉｔ ｉｓ ａ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｗｉｔｈ ｓｔｒｉｃｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ＩｇＧ ｃｌｅａｖａｇｅ ｄｕｅ ｔｏ ｅｘｏｓｉｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４３，１５５４０－１５５４９．
１７．Ｏｓｔｅｒｌａｎｄ，Ｃ．Ｋ．，Ｈａｒｂｏｅ，Ｍ．，ａｎｄ Ｋｕｎｋｅｌ，Ｈ．Ｇ．（１９６３）Ａｎｔｉ－ｇａｍｍａ－ｇｌｏｂｕｌｉｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒａ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉ－Ｒｈ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．８，１３３－１５２．
１８．Ｍｅｌｌｂｙｅ，Ｏ．Ｊ．，ａｎｄ Ｎａｔｖｉｇ，Ｊ．Ｂ．（１９７１）Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｔｈｅ ｐｅｐｓｉｎ ｓｉｔｅ ｏｆ ＩｇＧ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄｓ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．８，８８９－８９９．
１９．Ｔｅｒｎｅｓｓ，Ｐ．，Ｋｏｈｌ，Ｉ．，Ｈｕｂｅｎｅｒ，Ｇ．，Ｂａｔｔｉｓｔｕｔｔａ，Ｒ．，Ｍｏｒｏｄｅｒ，Ｌ．，Ｗｅｌｓｃｈｏｆ，Ｍ．，Ｄｕｆｔｅｒ，Ｃ．，Ｆｉｎｇｅｒ，Ｍ．，Ｈａｉｎ，Ｃ．，ａｎｄ Ｊｕｎｇ，Ｍ．（１９９５）Ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ａｎｔｉ－Ｆ（ａｂ’）２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ａ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ ｅｐｉｔｏｐｅ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４，６４４６－６４５２．
２０．Ｂｒｅｚｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．，Ｌｕｏｎｇｏ，Ｊ．Ｌ．，Ｐｅｔｒｏｎｅ，Ｄ．，Ｒｙａｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｚｈｏｎｇ，Ｄ．，Ｔａｍ，Ｓ．Ｈ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ａ．Ｐ．，Ｋｒｕｓｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．，Ｗｈｉｔａｋｅｒ，Ｂ．Ｐ．，Ｋｎｉｇｈｔ，Ｄ．Ｍ．，ａｎｄ Ｊｏｒｄａｎ，Ｒ．Ｅ．（２００８）Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ－ＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ＩｇＧｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１，３１８３－３１９２．
２１．Ｒｉｓｐｅｎｓ，Ｔ．，ｄｅ Ｖｒｉｅｚｅ，Ｈ．，ｄｅ Ｇｒｏｏｔ，Ｅ．，Ｗｏｕｔｅｒｓ，Ｄ．，Ｓｔａｐｅｌ，Ｓ．，Ｗｏｌｂｉｎｋ，Ｇ．Ｊ．，ａｎｄ Ａａｒｄｅｎ，Ｌ．Ａ．（２０１２）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａｎｔｉ－ｈｉｎｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．３７５，９３－９９．
２２．Ｂｒｅｚｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．，Ｋｉｎｄｅｒ，Ｍ．，Ｇｒｕｇａｎ，Ｋ．Ｄ．，Ｓｏｒｉｎｇ，Ｋ．Ｌ．，Ｃａｒｔｏｎ，Ｊ．，Ｇｒｅｅｎｐｌａｔｅ，Ａ．Ｒ．，Ｐｅｔｌｅｙ，Ｔ．，Ｃａｐａｌｄｉ，Ｄ．，Ｂｒｏｓｎａｎ，Ｋ．，Ｅｍｍｅｌｌ，Ｅ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．，ａｎｄ Ｊｏｒｄａｎ，Ｒ．Ｅ．（２０１４）Ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｈｉｎｇｅ－ｃｌｅａｖｅｄ ＩｇＧ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ＩｇＧｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．ＭＡｂｓ．
２３．Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｌ．Ｃ．，Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．，Ｋｌｉｍｏｗｓｋｉ，Ｌ．，Ｒａｊｕ，Ｔ．Ｓ．，Ｍｅｎｇ，Ｇ．，Ｓｉｍｓ，Ｐ．，Ｈｏｎｇ，Ｋ．，Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，Ｄａｍｉｃｏ，Ｌ．Ａ．，Ｒａｎｃａｔｏｒｅ，Ｐ．，ａｎｄ Ｙａｎｓｕｒａ，Ｄ．Ｇ．（２００２）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２６３，１３３－１４７
２４．Ｅａｔｏｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｗｏｏｄ，Ｗ．Ｉ．，Ｅａｔｏｎ，Ｄ．，Ｈａｓｓ，Ｐ．Ｅ．，Ｈｏｌｌｉｎｇｓｈｅａｄ，Ｐ．，Ｗｉｏｎ，Ｋ．，Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．，Ｌａｗｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｖｅｈａｒ，Ｇ．Ａ．，ａｎｄ Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．（１９８６）Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｃｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｖａｒｉａｎｔ ｌａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｏｎｅ－ｔｈｉｒｄ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２５，８３４３－８３４７．
２５．Ｗｏｎｇ，Ａ．Ｗ．，Ｂａｇｉｎｓｋｉ，Ｔ．Ｋ．，ａｎｄ Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｅ．（２０１０）Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｕｐｔａｋｅ ｉｎ ＦＵＴ８－ｄｅｌｅｔｅｄ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１０６，７５１－７６３．
２６．Ｂｏｓ，Ａ．Ｂ．，Ｄｕｑｕｅ，Ｊ．Ｎ．，Ｂｈａｋｔａ，Ｓ．，Ｆａｒａｈｉ，Ｆ．，Ｃｈｉｒｄｏｎ，Ｌ．Ａ．，Ｊｕｎｕｔｕｌａ，Ｊ．Ｒ．，Ｈａｒｍｓ，Ｐ．Ｄ．，ａｎｄ Ｗｏｎｇ，Ａ．Ｗ．（２０１４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｅｍｉ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１８０，１０－１６．
２７．Ｖａｎ Ｓｃｈｉｅ，Ｋ．Ａ．，Ｗｏｌｂｉｎｋ，Ｇ．－Ｊ．，ａｎｄ Ｒｉｓｐｅｎｓ，Ｔ．（２０１５）Ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｐｒｅ－ｅｘｉｓｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．ＭＡｂｓ．７，６６２－６７１．
２８．Ｂｒｅｚｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．，Ｏｂｅｒｈｏｌｔｚｅｒ，Ａ．，Ｓｔｒａｋｅ，Ｂ．，ａｎｄ Ｊｏｒｄａｎ，Ｒ．Ｅ．（２０１１）Ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ＩｇＧ２ ｔｏ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｔｔａｃｋ ｃｏｎｃｕｒｓ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐａｕｃｉｔｙ ｏｆ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＩｇＧ２ ｈｉｎｇｅ．ＭＡｂｓ．３，５５８－５６７．
２９．Ｂｅｌａａｏｕａｊ，Ａ．，Ｋｉｍ，Ｋ．Ｓ．，ａｎｄ Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｓ．Ｄ．（２０００）Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｋｉｌｌｉｎｇ ｂｙ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｌａｓｔａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８９，１１８５－１１８８
３０．Ｍａｌｉａ，Ｔ．Ｊ．，Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ，Ａ．，Ｂｒｅｚｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．，Ｌｕｏ，Ｊ．，Ｋｉｎｄｅｒ，Ｍ．，Ｓｗｅｅｔ，Ｒ．Ｗ．，Ａｌｍａｇｒｏ，Ｊ．Ｃ．，Ｊｏｒｄａｎ，Ｒ．Ｅ．，ａｎｄ Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｇ．Ｌ．（２０１４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｃｌｅａｖｅｄ ＩｇＧ ｈｉｎｇｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．１０．１００２／ｐｒｏｔ．２４５４５．
３１．Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｆ．Ｗ．，Ｐａｄａｋｉ，Ｒ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ａ．Ｅ．，Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔ．Ｌ．，Ａｒｍｉｔａｇｅ，Ｒ．Ｊ．，Ａｌｌｅｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｌａｖａｌｌｅｅ，Ｊ．Ｃ．，ａｎｄ Ａｒｏｒａ，Ｔ．（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ Ｍｏｎｋｅｙ ＩｇＧ Ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８６，３４１－３４９．
３２．Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｓｈｙｕ，Ｉ．，Ｎｅｗｋｉｒｋ，Ｍ．Ｍ．，ａｎｄ Ｒｉｇｂｙ，Ｗ．Ｆ．Ｃ．（２０１３）Ａ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ｆａｃｔｏｒ ｐａｒａｄｏｘ：ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．１５，Ｒ２０．
３３．Ｐｏｌｌａｃｋ，Ｃ．Ｖ．，Ｒｅｉｌｌｙ，Ｐ．Ａ．，Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ，Ｊ．，Ｇｌｕｎｄ，Ｓ．，Ｖｅｒｈａｍｍｅ，Ｐ．，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ａ．，Ｄｕｂｉｅｌ，Ｒ．，Ｈｕｉｓｍａｎ，Ｍ．Ｖ．，Ｈｙｌｅｋ，Ｅ．Ｍ．，Ｋａｍｐｈｕｉｓｅｎ，Ｐ．Ｗ．，Ｋｒｅｕｚｅｒ，Ｊ．，Ｌｅｖｙ，Ｊ．Ｈ．，Ｓｅｌｌｋｅ，Ｆ．Ｗ．，Ｓｔａｎｇｉｅｒ，Ｊ．，Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｔ．，Ｗａｎｇ，Ｂ．，Ｋａｍ，Ｃ．－Ｗ．，ａｎｄ Ｗｅｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．（２０１５）Ｉｄａｒｕｃｉｚｕｍａｂ ｆｏｒ Ｄａｂｉｇａｔｒａｎ Ｒｅｖｅｒｓａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７３，５１１－５２０．
３４．Ｃｏｒｄｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｍｏｒｌｅｙ，Ｐ．Ｊ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｉｒｃｈｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｌｅｗｉｓ，Ａ．Ｐ．，Ｅｍｍｉｎｓ，Ｒ．，Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｚ．，Ｐｏｗｌｅｙ，Ｗ．Ｍ．，Ｂａｒｅｉｌｌｅ，Ｐ．Ｊ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｒ．，Ｔｏｎｋｙｎ，Ｊ．，Ｂａｙｌｉｆｆｅ，Ａ．Ｉ．，ａｎｄ Ｌａｚａａｒ，Ａ．Ｌ．（２０１５）Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ－ｖａｒｉａｂｌｅ ｈｅａｖｙ（ＶＨ）ｃｈａｉｎ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ａ ＶＨ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｏｆ ＴＮＦ－α ｒｅｃｅｐｔｏｒ １．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０．１１１１／ｃｅｉ．１２６８０．
１．Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ Ｌａｚａｒ，Ｇ．Ａ．（２０１１）Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３１７，１２７８－１２８５．
２．Ｏｌａｆｓｅｎ，Ｔ．（２０１２）Ｆｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｓｅｒｕｍ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ＦｃＲｎ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．９０７，５３７－５５６．
３．Ｇａｄｋａｒ，Ｋ．，Ｐａｓｔｕｓｋｏｖａｓ，Ｃ．Ｖ．，Ｌｅ Ｃｏｕｔｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｊ．Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｃ．Ｖ．，Ｓａｎｏｗａｒ，Ｓ．，Ｆｕｈ，Ｇ．，Ｋｉｍ，Ｈ．Ｓ．，Ｌｏｍｂａｎａ，Ｔ．Ｎ．，Ｓｐｉｅｓｓ，Ｃ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｍ．，Ｈａｓｓ，Ｐ．，Ｓｈａｔｚ，Ｗ．，Ｍｅｎｇ，Ｙ．Ｇ．，ａｎｄ Ｓｃｈｅｅｒ，Ｊ．Ｍ．（２０１５）Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒｍａｔｓ ｆｏｒ Ｏｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．５６，５３９０－５４００．
４．Ｗａｌｓｈ，Ｇ．（２０１４）Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｂｅｎｃｈｍａｒｋｓ ２０１４．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２，９９２－１０００．
５．Ｃｕｒｔｉｓ，Ｂ．Ｒ．，Ｓｗｙｅｒｓ，Ｊ．，Ｄｉｖｇｉ，Ａ．，ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｊ．Ｇ．，ａｎｄ Ａｓｔｅｒ，Ｒ．Ｈ．（２００２）Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ ａｆｔｅｒ ｓｅｃｏｎｄ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ａｂｃｉｘｉｍａｂ ｉｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ａｂｃｉｘｉｍａｂ－ｃｏａｔｅｄ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ．Ｂｌｏｏｄ．９９，２０５４－２０５９．
６．Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．（１９５０）Ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｂｙ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｏｖａｌｂｕｍｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．４６，４７９－４８４．
７．Ｃｈｅｎ，Ｙ．，Ｗｉｅｓｍａｎｎ，Ｃ．，Ｆｕｈ，Ｇ．，Ｌｉ，Ｂ．，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｗ．，ＭｃＫａｙ，Ｐ．，ｄｅ Ｖｏｓ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．（１９９９）Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ－ｍａｔｕｒｅｄ ｆａｂ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｇｅｎ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２９３，８６５－８８１．
８．Ｓｐｉｅｓｓ，Ｃ．，Ｚｈａｉ，Ｑ．，ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．Ｊ．（２０１５）Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍａｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７，９５－１０６．
９．Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．，Ｋｅｌｌｅｙ，Ｒ．Ｆ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ｍ．Ｌ．，ａｎｄ Ｓｎｅｄｅｃｏｒ，Ｂ．（１９９２）Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂｉｖａｌｅｎｔ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ．Ｎａｔｕｒｅ．１０．１０３８／ｎｂｔ０２９２－１６３．
１０．Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．，Ｃｏｌｅ，Ｍ．Ｓ．，ａｎｄ Ｔｓｏ，Ｊ．Ｙ．（１９９２）Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｙ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７－１５５３．
１１．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．，ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｈ．Ｍ．，Ｗｏｒｔｈ，Ａ．Ｔ．，ａｎｄ Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９８７）Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｆ（ａｂ’ｇａｍｍａ）２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ－ｌｉｎｋｅｄ Ｆａｂ”ｇａｍｍａ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９，２３６７－２３７５．
１２．Ｅｌｌｅｒｍａｎ，Ｄ．，ａｎｄ Ｓｃｈｅｅｒ，Ｊ．Ｍ．（２０１１）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｅ．ｅｄ），ｐｐ．４７－６３，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１０．１００７／９７８－３－６４２－２０９１０－９＿３．
１３．Ｂｒｅｚｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．，ａｎｄ Ｊｏｒｄａｎ，Ｒ．Ｅ．（２０１０）Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ＩｇＧｓ ｂｙ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ：ａｎ ｅｖａｓｉｏｎ ｔａｃｔｉｃ ａｇａｉｎｓｔ ｈｏｓｔ ｉｍｍｕｎｉｔｙ？ＭＡｂｓ．２，２１２－２２０．
１４．Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．，Ｗｉｓｓｌｅｒ，Ｆ．Ｃ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｌ．Ｎ．（１９６０）Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ａ ｐｅｐｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ ｏｆ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１３２，１７７０－１７７１．
１５．Ｐａｗｅｌ－Ｒａｍｍｉｎｇｅｎ，ｖｏｎ，Ｕ．，Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｂ．Ｐ．，ａｎｄ Ｂｊｏｒｃｋ，Ｌ．（２００２）ＩｄｅＳ，ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｕｎｉｑｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ．ＥＭＢＯ Ｊ．２１，１６０７－１６１５．
１６．Ｖｉｎｃｅｎｔｓ，Ｂ．，Ｐａｗｅｌ－Ｒａｍｍｉｎｇｅｎ，ｖｏｎ，Ｕ．，Ｂｊｏｒｃｋ，Ｌ．，ａｎｄ Ａｂｒａｈａｍｓｏｎ，Ｍ．（２００４）Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ，ＩｄｅＳ，ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈａｔ ｉｔ ｉｓ ａ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｗｉｔｈ ｓｔｒｉｃｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ＩｇＧ ｃｌｅａｖａｇｅ ｄｕｅ ｔｏ ｅｘｏｓｉｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４３，１５５４０－１５５４９．
１７．Ｏｓｔｅｒｌａｎｄ，Ｃ．Ｋ．，Ｈａｒｂｏｅ，Ｍ．，ａｎｄ Ｋｕｎｋｅｌ，Ｈ．Ｇ．（１９６３）Ａｎｔｉ－ｇａｍｍａ－ｇｌｏｂｕｌｉｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒａ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉ－Ｒｈ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．８，１３３－１５２．
１８．Ｍｅｌｌｂｙｅ，Ｏ．Ｊ．，ａｎｄ Ｎａｔｖｉｇ，Ｊ．Ｂ．（１９７１）Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｔｈｅ ｐｅｐｓｉｎ ｓｉｔｅ ｏｆ ＩｇＧ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄｓ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．８，８８９－８９９．
１９．Ｔｅｒｎｅｓｓ，Ｐ．，Ｋｏｈｌ，Ｉ．，Ｈｕｂｅｎｅｒ，Ｇ．，Ｂａｔｔｉｓｔｕｔｔａ，Ｒ．，Ｍｏｒｏｄｅｒ，Ｌ．，Ｗｅｌｓｃｈｏｆ，Ｍ．，Ｄｕｆｔｅｒ，Ｃ．，Ｆｉｎｇｅｒ，Ｍ．，Ｈａｉｎ，Ｃ．，ａｎｄ Ｊｕｎｇ，Ｍ．（１９９５）Ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ａｎｔｉ－Ｆ（ａｂ’）２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ａ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ ｅｐｉｔｏｐｅ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４，６４４６－６４５２．
２０．Ｂｒｅｚｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．，Ｌｕｏｎｇｏ，Ｊ．Ｌ．，Ｐｅｔｒｏｎｅ，Ｄ．，Ｒｙａｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｚｈｏｎｇ，Ｄ．，Ｔａｍ，Ｓ．Ｈ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ａ．Ｐ．，Ｋｒｕｓｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．，Ｗｈｉｔａｋｅｒ，Ｂ．Ｐ．，Ｋｎｉｇｈｔ，Ｄ．Ｍ．，ａｎｄ Ｊｏｒｄａｎ，Ｒ．Ｅ．（２００８）Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ－ＩｇＧ１ ｈｉｎｇｅ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ＩｇＧｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１，３１８３－３１９２．
２１．Ｒｉｓｐｅｎｓ，Ｔ．，ｄｅ Ｖｒｉｅｚｅ，Ｈ．，ｄｅ Ｇｒｏｏｔ，Ｅ．，Ｗｏｕｔｅｒｓ，Ｄ．，Ｓｔａｐｅｌ，Ｓ．，Ｗｏｌｂｉｎｋ，Ｇ．Ｊ．，ａｎｄ Ａａｒｄｅｎ，Ｌ．Ａ．（２０１２）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａｎｔｉ－ｈｉｎｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．３７５，９３－９９．
２２．Ｂｒｅｚｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．，Ｋｉｎｄｅｒ，Ｍ．，Ｇｒｕｇａｎ，Ｋ．Ｄ．，Ｓｏｒｉｎｇ，Ｋ．Ｌ．，Ｃａｒｔｏｎ，Ｊ．，Ｇｒｅｅｎｐｌａｔｅ，Ａ．Ｒ．，Ｐｅｔｌｅｙ，Ｔ．，Ｃａｐａｌｄｉ，Ｄ．，Ｂｒｏｓｎａｎ，Ｋ．，Ｅｍｍｅｌｌ，Ｅ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｓ．，ａｎｄ Ｊｏｒｄａｎ，Ｒ．Ｅ．（２０１４）Ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｈｉｎｇｅ－ｃｌｅａｖｅｄ ＩｇＧ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ＩｇＧｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．ＭＡｂｓ．
２３．Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｌ．Ｃ．，Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．，Ｋｌｉｍｏｗｓｋｉ，Ｌ．，Ｒａｊｕ，Ｔ．Ｓ．，Ｍｅｎｇ，Ｇ．，Ｓｉｍｓ，Ｐ．，Ｈｏｎｇ，Ｋ．，Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，Ｄａｍｉｃｏ，Ｌ．Ａ．，Ｒａｎｃａｔｏｒｅ，Ｐ．，ａｎｄ Ｙａｎｓｕｒａ，Ｄ．Ｇ．（２００２）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２６３，１３３－１４７
２４．Ｅａｔｏｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｗｏｏｄ，Ｗ．Ｉ．，Ｅａｔｏｎ，Ｄ．，Ｈａｓｓ，Ｐ．Ｅ．，Ｈｏｌｌｉｎｇｓｈｅａｄ，Ｐ．，Ｗｉｏｎ，Ｋ．，Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．，Ｌａｗｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｖｅｈａｒ，Ｇ．Ａ．，ａｎｄ Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．（１９８６）Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｃｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｖａｒｉａｎｔ ｌａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｏｎｅ－ｔｈｉｒｄ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２５，８３４３－８３４７．
２５．Ｗｏｎｇ，Ａ．Ｗ．，Ｂａｇｉｎｓｋｉ，Ｔ．Ｋ．，ａｎｄ Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｅ．（２０１０）Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｕｐｔａｋｅ ｉｎ ＦＵＴ８－ｄｅｌｅｔｅｄ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１０６，７５１－７６３．
２６．Ｂｏｓ，Ａ．Ｂ．，Ｄｕｑｕｅ，Ｊ．Ｎ．，Ｂｈａｋｔａ，Ｓ．，Ｆａｒａｈｉ，Ｆ．，Ｃｈｉｒｄｏｎ，Ｌ．Ａ．，Ｊｕｎｕｔｕｌａ，Ｊ．Ｒ．，Ｈａｒｍｓ，Ｐ．Ｄ．，ａｎｄ Ｗｏｎｇ，Ａ．Ｗ．（２０１４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｅｍｉ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１８０，１０－１６．
２７．Ｖａｎ Ｓｃｈｉｅ，Ｋ．Ａ．，Ｗｏｌｂｉｎｋ，Ｇ．－Ｊ．，ａｎｄ Ｒｉｓｐｅｎｓ，Ｔ．（２０１５）Ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｐｒｅ－ｅｘｉｓｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．ＭＡｂｓ．７，６６２－６７１．
２８．Ｂｒｅｚｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．，Ｏｂｅｒｈｏｌｔｚｅｒ，Ａ．，Ｓｔｒａｋｅ，Ｂ．，ａｎｄ Ｊｏｒｄａｎ，Ｒ．Ｅ．（２０１１）Ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ＩｇＧ２ ｔｏ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｔｔａｃｋ ｃｏｎｃｕｒｓ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐａｕｃｉｔｙ ｏｆ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＩｇＧ２ ｈｉｎｇｅ．ＭＡｂｓ．３，５５８－５６７．
２９．Ｂｅｌａａｏｕａｊ，Ａ．，Ｋｉｍ，Ｋ．Ｓ．，ａｎｄ Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｓ．Ｄ．（２０００）Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｋｉｌｌｉｎｇ ｂｙ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｌａｓｔａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８９，１１８５－１１８８
３０．Ｍａｌｉａ，Ｔ．Ｊ．，Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ，Ａ．，Ｂｒｅｚｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．，Ｌｕｏ，Ｊ．，Ｋｉｎｄｅｒ，Ｍ．，Ｓｗｅｅｔ，Ｒ．Ｗ．，Ａｌｍａｇｒｏ，Ｊ．Ｃ．，Ｊｏｒｄａｎ，Ｒ．Ｅ．，ａｎｄ Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｇ．Ｌ．（２０１４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｃｌｅａｖｅｄ ＩｇＧ ｈｉｎｇｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．１０．１００２／ｐｒｏｔ．２４５４５．
３１．Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｆ．Ｗ．，Ｐａｄａｋｉ，Ｒ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ａ．Ｅ．，Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔ．Ｌ．，Ａｒｍｉｔａｇｅ，Ｒ．Ｊ．，Ａｌｌｅｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｌａｖａｌｌｅｅ，Ｊ．Ｃ．，ａｎｄ Ａｒｏｒａ，Ｔ．（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ Ｍｏｎｋｅｙ ＩｇＧ Ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８６，３４１－３４９．
３２．Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｓｈｙｕ，Ｉ．，Ｎｅｗｋｉｒｋ，Ｍ．Ｍ．，ａｎｄ Ｒｉｇｂｙ，Ｗ．Ｆ．Ｃ．（２０１３）Ａ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ｆａｃｔｏｒ ｐａｒａｄｏｘ：ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．１５，Ｒ２０．
３３．Ｐｏｌｌａｃｋ，Ｃ．Ｖ．，Ｒｅｉｌｌｙ，Ｐ．Ａ．，Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ，Ｊ．，Ｇｌｕｎｄ，Ｓ．，Ｖｅｒｈａｍｍｅ，Ｐ．，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ａ．，Ｄｕｂｉｅｌ，Ｒ．，Ｈｕｉｓｍａｎ，Ｍ．Ｖ．，Ｈｙｌｅｋ，Ｅ．Ｍ．，Ｋａｍｐｈｕｉｓｅｎ，Ｐ．Ｗ．，Ｋｒｅｕｚｅｒ，Ｊ．，Ｌｅｖｙ，Ｊ．Ｈ．，Ｓｅｌｌｋｅ，Ｆ．Ｗ．，Ｓｔａｎｇｉｅｒ，Ｊ．，Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｔ．，Ｗａｎｇ，Ｂ．，Ｋａｍ，Ｃ．－Ｗ．，ａｎｄ Ｗｅｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．（２０１５）Ｉｄａｒｕｃｉｚｕｍａｂ ｆｏｒ Ｄａｂｉｇａｔｒａｎ Ｒｅｖｅｒｓａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７３，５１１－５２０．
３４．Ｃｏｒｄｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｍｏｒｌｅｙ，Ｐ．Ｊ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｉｒｃｈｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｌｅｗｉｓ，Ａ．Ｐ．，Ｅｍｍｉｎｓ，Ｒ．，Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｚ．，Ｐｏｗｌｅｙ，Ｗ．Ｍ．，Ｂａｒｅｉｌｌｅ，Ｐ．Ｊ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｒ．，Ｔｏｎｋｙｎ，Ｊ．，Ｂａｙｌｉｆｆｅ，Ａ．Ｉ．，ａｎｄ Ｌａｚａａｒ，Ａ．Ｌ．（２０１５）Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ－ｖａｒｉａｂｌｅ ｈｅａｖｙ（ＶＨ）ｃｈａｉｎ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ａ ＶＨ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｏｆ ＴＮＦ－α ｒｅｃｅｐｔｏｒ １．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０．１１１１／ｃｅｉ．１２６８０．
【0145】
前述の組成物及び方法は、明確な理解のために例証及び例によって多少詳しく説明されてきたが、これらの説明及び例は、本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用されるすべての特許及び科学文献の開示は、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。
SEQUENCE LISTING
<110> F. HOFFMANN-LA ROCHE AG
GENENTECH, INC.
<120> HINGE MODIFIED ANTIBODY FRAGMENTS AND METHODS OF MAKING
<130> 00B206.0271
<140>
<141>
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Lys Tyr Gly Pro
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Asp Lys Thr His Thr
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Val Glu Arg Lys
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His His His His His
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
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<211> 14
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<213> Homo sapiens
<400> 32
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
1 5 10
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<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
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<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10 15
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<211> 23
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<213> Homo sapiens
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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
20
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Gly Gly Pro Ser Val
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Leu Gly Gly Pro Ser Val
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
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Cys Pro Pro Cys Pro Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
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Cys Pro Pro Cys Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10
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<211> 23
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<213> Homo sapiens
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Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
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Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
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<213> Macaca fascicularis
<400> 44
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<211> 26
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<213> Macaca mulatta
<400> 45
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Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
20 25
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<213> Homo sapiens
<400> 46
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Pro Pro Pro Val
1 5 10 15
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<213> Macaca fascicularis
<400> 47
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<400> 48
Gly Leu Pro Cys Arg Ser Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Glu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Gly Pro
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<213> Homo sapiens
<400> 49
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1 5 10 15
Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys
20 25 30
Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser
35 40 45
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50 55 60
Gly Gly Pro
65
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<213> Macaca fascicularis
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1 5 10 15
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
20 25
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<211> 25
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<213> Macaca mulatta
<400> 51
Glu Phe Thr Pro Pro Cys Gly Asp Thr Thr Pro Pro Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
20 25
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<211> 20
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<213> Homo sapiens
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Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro
20
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<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 53
Glu Phe Thr Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 54
<211> 18
<212> PRT
<213> Macaca mulatta
<400> 54
Glu Phe Thr Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro
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<213> Homo sapiens
<400> 55
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys
1 5 10 15
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
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Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro
50 55 60
Glu Leu Leu Gly Gly Pro
65 70
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<213> Homo sapiens
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
1 5 10
SEQUENCE LISTING
<110> F. HOFFMANN-LA ROCHE AG
GENENTECH, INC.
<120> HINGE MODIFIED ANTIBODY FRAGMENTS AND METHODS OF MAKING
<130> 00B206.0271
<140>
<141>
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<151> 2016-06-07
<150> 62/248,792
<151> 2015-10-30
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<170> PatentIn version 3.5
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
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50 55 60
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
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Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
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Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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Thr Val Glu Arg Lys
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
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Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
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Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
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Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
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Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
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Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
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<400> 15
Cys Asp Lys Thr His Leu
1 5
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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peptide"
<400> 16
Cys Asp Lys Thr His
1 5
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<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<221> source
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peptide"
<400> 17
Cys Asp Lys Thr
1
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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peptide"
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Lys Tyr Gly Pro Pro
1 5
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<211> 4
<212> PRT
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peptide"
<400> 19
Lys Tyr Gly Pro
1
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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peptide"
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Asp Lys Thr His Leu
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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peptide"
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Asp Lys Thr His Thr
1 5
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<212> PRT
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Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
1 5 10
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<211> 4
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<213> Artificial Sequence
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peptide"
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Cys Pro Pro Cys
1
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<213> Artificial Sequence
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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1 5
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<221> MOD_RES
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<223> Any amino acid except Thr
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Cys Asp Lys Thr His Xaa
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Val Glu Arg Lys
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Asp Lys Thr His
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<213> Artificial Sequence
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peptide"
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Gly His His His His His His
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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peptide"
<400> 29
His His His His His
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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peptide"
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10
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<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10 15
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<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
1 5 10
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<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10 15
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10 15
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<211> 23
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
20
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<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10
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<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<221> source
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peptide"
<400> 37
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10
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<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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peptide"
<400> 38
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10
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<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<221> source
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peptide"
<400> 39
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Leu Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10
<210> 40
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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peptide"
<400> 40
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10
<210> 41
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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peptide"
<400> 41
Cys Pro Pro Cys Pro Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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peptide"
<400> 42
Cys Pro Pro Cys Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10
<210> 43
<211> 23
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
20
<210> 44
<211> 26
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 44
Glu Ile Lys Thr Cys Gly Gly Gly Ser Lys Pro Pro Thr Cys Pro Pro
1 5 10 15
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
20 25
<210> 45
<211> 26
<212> PRT
<213> Macaca mulatta
<400> 45
Glu Ile Lys Thr Cys Gly Gly Gly Ser Lys Pro Pro Thr Cys Pro Pro
1 5 10 15
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
20 25
<210> 46
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Pro Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro
<210> 47
<211> 19
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 47
Gly Leu Pro Cys Arg Ser Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Glu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Gly Pro
<210> 48
<211> 19
<212> PRT
<213> Macaca mulatta
<400> 48
Gly Leu Pro Cys Arg Ser Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Glu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Gly Pro
<210> 49
<211> 67
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Glu Pro
1 5 10 15
Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys
20 25 30
Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser
35 40 45
Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
50 55 60
Gly Gly Pro
65
<210> 50
<211> 25
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 50
Glu Phe Thr Arg Pro Cys Asp Asp Thr Thr Pro Pro Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
20 25
<210> 51
<211> 25
<212> PRT
<213> Macaca mulatta
<400> 51
Glu Phe Thr Pro Pro Cys Gly Asp Thr Thr Pro Pro Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
20 25
<210> 52
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro
20
<210> 53
<211> 18
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 53
Glu Phe Thr Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 54
<211> 18
<212> PRT
<213> Macaca mulatta
<400> 54
Glu Phe Thr Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 55
<211> 70
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 55
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys
1 5 10 15
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
35 40 45
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro
50 55 60
Glu Leu Leu Gly Gly Pro
65 70
<210> 56
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 56
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10 15
<210> 57
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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peptide"
<400> 57
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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peptide"
<400> 58
Thr Cys Pro Pro Cys Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10
<210> 59
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 59
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
1 5 10
【図1】
【図2】
【図3A-B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図4】
【図5A-C】
【図5D-E】
【図5F】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-01-26
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載された一発明。
【外国語明細書】