(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024045268
(43)【公開日】2024-04-02
(54)【発明の名称】新規抗チミジンキナーゼ抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/40 20060101AFI20240326BHJP
C07K 17/00 20060101ALI20240326BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240326BHJP
G01N 33/577 20060101ALI20240326BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240326BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20240326BHJP
【ＦＩ】
C07K16/40
C07K17/00 ZNA
G01N33/53 D
G01N33/577 B
C12N15/13
C12P21/08
【審査請求】有
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024006739
(22)【出願日】2024-01-19
(62)【分割の表示】P 2020557336の分割
【原出願日】2019-04-16
(31)【優先権主張番号】18168009.1
(32)【優先日】2018-04-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(72)【発明者】
【氏名】デューフェル，ハルトムート
(72)【発明者】
【氏名】エンゲル，アルフレート
(72)【発明者】
【氏名】クロナー，フランク
(72)【発明者】
【氏名】マイアー，トーマス
(72)【発明者】
【氏名】ルッツ，ザンドラ
(72)【発明者】
【氏名】シュレームル，ミヒャエル
(72)【発明者】
【氏名】タバレス，グロリア
(72)【発明者】
【氏名】クルトカヤ，ウルリケ
(72)【発明者】
【氏名】ピンチュク，ボリス
(72)【発明者】
【氏名】ツィンマーマン，クリスティナ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】標準のイムノアッセイ方法で用いられた場合、体液試料からのｈＴＫ－１の信頼できる検出および定量化を可能にする新規モノクローナル抗体を提供する。
【解決手段】本発明は、ヒトチミジンキナーゼ１（ｈＴＫ－１）の上の高次構造依存性エピトープに特異的に結合する新規モノクローナル抗体、抗体を用いるｈＴＫ－１の定量化の方法、およびｈＴＫ－１の定量化における抗ｈＴＫ－１抗体の使用を提供する。
【選択図】図１
【解決手段】本発明は、ヒトチミジンキナーゼ１（ｈＴＫ－１）の上の高次構造依存性エピトープに特異的に結合する新規モノクローナル抗体、抗体を用いるｈＴＫ－１の定量化の方法、およびｈＴＫ－１の定量化における抗ｈＴＫ－１抗体の使用を提供する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトチミジンキナーゼ１（ｈＴＫ－１；配列番号１）に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、
ａ）ｈＴＫ－１の高次構造依存性エピトープに結合し、
ｂ）ｈＴＫ－１のアミノ酸１９４～２２５（配列番号２）からなるポリペプチドに結合せず、および
ｃ）ｈＴＫ－１の１５連続アミノ酸からなるいずれのポリペプチドにも結合しない、
ことを特徴とするモノクローナル抗体。
ａ）ｈＴＫ－１の高次構造依存性エピトープに結合し、
ｂ）ｈＴＫ－１のアミノ酸１９４～２２５（配列番号２）からなるポリペプチドに結合せず、および
ｃ）ｈＴＫ－１の１５連続アミノ酸からなるいずれのポリペプチドにも結合しない、
ことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項2】
ｈＴＫ－１に対する１０－９Ｍｏｌまたはより優れた結合親和性を有することを特徴とする、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項3】
配列番号３の重鎖可変ドメインおよび配列番号４の軽鎖可変ドメインを有する抗体またはその抗原結合性断片とｈＴＫ－１への結合に関して競合することをさらに特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項4】
ｈＴＫ－１を定量化するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
ａ）ｈＴＫ－１が定量化されるべき試料を、請求項１、２または３の抗体とインキュベートし、それによって抗体とｈＴＫ－１の間で複合体を生成するステップと、
ｂ）ステップａ）で形成される複合体を定量化し、それによってｈＴＫ－１を定量化するステップと
を含む方法。
ａ）ｈＴＫ－１が定量化されるべき試料を、請求項１、２または３の抗体とインキュベートし、それによって抗体とｈＴＫ－１の間で複合体を生成するステップと、
ｂ）ステップａ）で形成される複合体を定量化し、それによってｈＴＫ－１を定量化するステップと
を含む方法。
【請求項5】
ｈＴＫ－１を定量化するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
ａ）ｈＴＫ－１が定量化されるべき試料を、請求項１、２または３の抗体である第１の抗体、およびｈＴＫ－１に対する第２の抗体とインキュベートし、それによって第１の抗体、ｈＴＫ－１および第２の抗体の間でサンドイッチ複合体を生成するステップと、
ｂ）ステップａ）で形成されるサンドイッチ複合体を定量化し、それによってｈＴＫ－１を定量化するステップと
を含む方法。
ａ）ｈＴＫ－１が定量化されるべき試料を、請求項１、２または３の抗体である第１の抗体、およびｈＴＫ－１に対する第２の抗体とインキュベートし、それによって第１の抗体、ｈＴＫ－１および第２の抗体の間でサンドイッチ複合体を生成するステップと、
ｂ）ステップａ）で形成されるサンドイッチ複合体を定量化し、それによってｈＴＫ－１を定量化するステップと
を含む方法。
【請求項6】
ｈＴＫ－１を定量化するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
ａ）ｈＴＫ－１が定量化されるべき試料を還元剤およびＡＴＰを含む前処理溶液とインキュベートするステップと、
ｂ）ステップａ）において得られる前処理試料を、請求項１、２または３による抗体とインキュベートし、それによって抗体とｈＴＫ－１の間の複合体を生成するステップと、
ｃ）ステップｂ）で形成される複合体を定量化し、それによってｈＴＫ－１を定量化するステップと
を含む方法。
ａ）ｈＴＫ－１が定量化されるべき試料を還元剤およびＡＴＰを含む前処理溶液とインキュベートするステップと、
ｂ）ステップａ）において得られる前処理試料を、請求項１、２または３による抗体とインキュベートし、それによって抗体とｈＴＫ－１の間の複合体を生成するステップと、
ｃ）ステップｂ）で形成される複合体を定量化し、それによってｈＴＫ－１を定量化するステップと
を含む方法。
【請求項7】
ｈＴＫ－１を定量化するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
ａ）ｈＴＫ－１が定量化されるべき試料を還元剤およびＡＴＰを含む前処理溶液とインキュベートするステップと、
ｂ）ステップａ）において得られる前処理試料を、請求項１、２または３の抗体である第１の抗体、およびｈＴＫ－１に対する第２の抗体とインキュベートし、それによって第１の抗体、ｈＴＫ－１および第２の抗体の間でサンドイッチ複合体を生成するステップと、
ｃ）ステップｂ）で形成されるサンドイッチ複合体を定量化し、それによってｈＴＫ－１を定量化するステップと
を含む方法。
ａ）ｈＴＫ－１が定量化されるべき試料を還元剤およびＡＴＰを含む前処理溶液とインキュベートするステップと、
ｂ）ステップａ）において得られる前処理試料を、請求項１、２または３の抗体である第１の抗体、およびｈＴＫ－１に対する第２の抗体とインキュベートし、それによって第１の抗体、ｈＴＫ－１および第２の抗体の間でサンドイッチ複合体を生成するステップと、
ｃ）ステップｂ）で形成されるサンドイッチ複合体を定量化し、それによってｈＴＫ－１を定量化するステップと
を含む方法。
【請求項8】
第１または第２の抗体は固相に結合しているか、固相と結合することが可能であり、第２または第１の抗体は検出可能的に標識されている、請求項５または７に記載の方法。
【請求項9】
Ｂ細胞ＰＣＲ技術によって得られた、請求項１、２または３に記載の抗体。
【請求項10】
ｈＴＫ－１の定量化における、請求項１、２、３または９のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒトチミジンキナーゼ１（ｈＴＫ－１；配列番号１）に特異的に結合する新規モノクローナル抗体、抗体を用いてｈＴＫ－１を定量化する方法、およびｈＴＫ－１の定量化における抗ｈＴＫ－１抗体の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
近年の数十年にわたる全ての進歩にもかかわらず、がんは死の第２の主因（Ｓｉｅｇｅｌら、２０１３年）である。バイオマーカーは、がんの生物学をより深く理解するために、および重要な臨床関連の問題、例えば、２つの主要な話題だけを指摘すると、悪性の診断、または再発の検出をよりよく評価するために最も重要である。
【0003】
腫瘍学の分野において特に興味があるバイオマーカーの１つのクラスは、Ｋｉ－６７、増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）およびチミジンキナーゼ（ＴＫ－１）を含む、増殖バイオマーカーのクラスである。いずれの腫瘍も比較的高い割合の増殖性細胞を含み、増殖マーカーはそれらの増殖性の悪性細胞を同定することが可能であるべきである。組織レベルで、すなわち免疫組織化学によって測定した場合、チミジンキナーゼがかなり有益なマーカーであることを実証する文献が入手可能である。
【0004】
いくつかの異なる悪性疾患において、主に白血病およびリンパ腫の場合、モニタリングおよび予後診断目的のために血清中ＴＫ１活性の測定が使用されてきた。しかし、血清のような体液からの循環チミジンキナーゼの測定のためのイムノアッセイはまれ（ｓｃａｒｅ）であり、血清ＴＫ－１タンパク質のイムノアッセイは臨床診断ルーチンでまだ広く使用されていない。
【0005】
チミジンキナーゼ１（略記号：ＴＫ１またはＴＫ－１）、（ＡＴＰ：チミジン５’－ホスホトランスフェラーゼ、ＥＣ２．７．１．２１）は、ＤＮＡ前駆体合成に関与する酵素である。ヒトチミジンキナーゼ１（ｈＴＫ－１またはｈＴＫ１）の配列は公知であり、配列番号１で与えられる。
【0006】
血清ＴＫ１活性は、放射性基質１２５１－ｄＵｒｄ（ＰＲＯＬＩＦＩＧＥＮ（登録商標）ＴＫ－ＲＥＡ、ＤｉａＳｏｒｉｎ Ｉｎｃ．）を使用して測定することができる。非放射分析ＴＫ１活性アッセイ（ＴＫ ＬＩＡＩＳＯＮ（登録商標）アッセイ、ＤｉａＳｏｒｉｎ Ｉｎｃ．）が、近年利用可能になった。これは高感度で確固としたアッセイであり、特に療法をモニタリングし、再発を予測するために、血液悪性腫瘍を有するヒトおよびイヌにおける臨床的に価値ある情報を提供している。
【0007】
この明細書では、特許出願および製造業者のマニュアルを含むいくつかの文書が引用される。これらの文書の開示は、本発明の特許性に関連すると思われないが、これにより参照によりその全体が組み込まれる。より具体的には、全ての参照文書は、各個々の文書が参照により組み込まれることが具体的におよび個々に示されるのと同じ程度に、参照により組み込まれる。
【0008】
過去数十年にわたって、ｈＴＫ－１への有益で高感度な特異的抗体を生成するために、多くの試みがされてきた。しかし、記載され、今日まで利用可能な抗体は、体液試料からのｈＴＫ－１の測定のための、信頼できて高感度なイムノアッセイの開発の必要条件を満たさなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
したがって、本開示につながった本発明者らの課題は、標準のイムノアッセイ方法で用いられた場合、体液試料からのｈＴＫ－１の信頼できる検出および定量化を可能にする新規モノクローナル抗体を開発することであった。
【0010】
この必要性は、請求項に規定される実施形態を提供することによって、本発明によって対処される。
驚くべきことに、ｈＴＫ－１の高次構造依存性エピトープに結合するが、ｈＴＫ－１のアミノ酸１９４～２２５（配列番号２）からなるポリペプチドに結合せず、ｈＴＫ－１の１５連続アミノ酸からなるいずれのポリペプチドにも結合しない、ヒトチミジンキナーゼ１（ｈＴＫ－１；配列番号１）に対するモノクローナル抗体が、本開示の基調をなす問題を解決することが見出され、示すことができた。
驚くべきことに、ｈＴＫ－１の高次構造依存性エピトープに結合するが、ｈＴＫ－１のアミノ酸１９４～２２５（配列番号２）からなるポリペプチドに結合せず、ｈＴＫ－１の１５連続アミノ酸からなるいずれのポリペプチドにも結合しない、ヒトチミジンキナーゼ１（ｈＴＫ－１；配列番号１）に対するモノクローナル抗体が、本開示の基調をなす問題を解決することが見出され、示すことができた。
【課題を解決するための手段】
【0011】
一実施形態では、本開示は、ヒトチミジンキナーゼ１（ｈＴＫ－１；配列番号１）に特異的に結合するモノクローナル抗体に関し、この抗体は、
ａ）ｈＴＫ－１の高次構造依存性エピトープに結合し、
ｂ）ｈＴＫ－１のアミノ酸１９４～２２５（配列番号２）からなるポリペプチドに結合せず、および
ｃ）ｈＴＫ－１の１５連続アミノ酸からなるいずれのポリペプチドにも結合しない
ことを特徴とする。
ａ）ｈＴＫ－１の高次構造依存性エピトープに結合し、
ｂ）ｈＴＫ－１のアミノ酸１９４～２２５（配列番号２）からなるポリペプチドに結合せず、および
ｃ）ｈＴＫ－１の１５連続アミノ酸からなるいずれのポリペプチドにも結合しない
ことを特徴とする。
【0012】
一実施形態では、本開示は、ｈＴＫ－１を定量化するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
ａ）ｈＴＫ－１が定量化されるべき試料を、ヒトチミジンキナーゼ１（ｈＴＫ－１；配列番号１）に特異的に結合する抗体とインキュベートするステップであって、抗体は、（ｉ）ｈＴＫ－１の高次構造依存性エピトープに結合し、（ｉｉ）ｈＴＫ－１のアミノ酸１９４～２２５（配列番号２）からなるポリペプチドに結合せず、および（ｉｉｉ）請求項１または２のｈＴＫ－１の１５連続アミノ酸からなるいずれのポリペプチドにも結合しないことを特徴とし、それによって、抗体とｈＴＫ－１の間で複合体を生成するステップと、ｂ）ステップａ）で形成される複合体を定量化し、それによってｈＴＫ－１を定量化するステップと
を含む方法に関する。
ａ）ｈＴＫ－１が定量化されるべき試料を、ヒトチミジンキナーゼ１（ｈＴＫ－１；配列番号１）に特異的に結合する抗体とインキュベートするステップであって、抗体は、（ｉ）ｈＴＫ－１の高次構造依存性エピトープに結合し、（ｉｉ）ｈＴＫ－１のアミノ酸１９４～２２５（配列番号２）からなるポリペプチドに結合せず、および（ｉｉｉ）請求項１または２のｈＴＫ－１の１５連続アミノ酸からなるいずれのポリペプチドにも結合しないことを特徴とし、それによって、抗体とｈＴＫ－１の間で複合体を生成するステップと、ｂ）ステップａ）で形成される複合体を定量化し、それによってｈＴＫ－１を定量化するステップと
を含む方法に関する。
【0013】
さらに、ｈＴＫ－１の定量化における、本開示で開示されるｈＴＫ－１に対する抗体の使用が実証される。
【発明を実施するための形態】
【0014】
第１の実施形態では、本記載は、ヒトチミジンキナーゼ１（ｈＴＫ－１；配列番号１）に特異的に結合するモノクローナル抗体に関し、抗体は、ａ）ｈＴＫ－１の高次構造依存性エピトープに結合し、ｂ）ｈＴＫ－１のアミノ酸１９４～２２５（配列番号２）からなるポリペプチドに結合せず、およびｃ）ｈＴＫ－１の１５連続アミノ酸からなるいずれのポリペプチドにも結合しないことを特徴とする。
【0015】
ヒトチミジンキナーゼ１は、配列番号１に示す２３４アミノ酸からなる酵素である。人体では、ＴＫ－１は、二量体、四量体および高分子量のポリマーのような様々な形態で存在する。これらの形態は、ある特定の分子の存在、例えばアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在の有無；ｈＴＫ－１タンパク質自体の濃度、タンパク質のタイプ、すなわち天然または組換えＴＫ１；およびタンパク質の部位／位置、すなわち血清または細胞質、に依存
するようである。
するようである。
【0016】
一般的に、サイトゾルおよび組換えヒトＴＫ１は、ＡＴＰの存在下で、または高い濃度で主に四量体として、およびＡＴＰの非存在下で、または低濃度で二量体として存在する。サイトゾルおよび組換えヒトＴＫ１の四量体形態は高いＴＫ１活性を有するが、二量体形態はより低いＴＫ１活性を有する。
【0017】
ヒト血清ＴＫ１は、明らかに対照的に、血清ＴＫ１活性を有する、オリゴマーなどの、またはそのようなオリゴマーを含む高分子量複合体の形態、ならびに非常に低い血清ＴＫ１活性を有するかそれを欠いてさえいる二量体および四量体形態であり得る。
【0018】
ｈＴＫ－１に対するモノクローナル抗体を生成するために、従来技術において多くの試みが実行され、記載されている。これらの抗体のいくつかは、Ａｂｃａｍからの３Ｂ３．Ｅ１１；ＥＰＲ３１９４およびＥＰＲ３１９３、Ａｂｎｏｖａからのウサギモノクローナル抗体のように市販されているが、血清ＴＫ１と十分に反応しない。これらの抗ＴＫ１抗体は、ヒト組換えＴＫ１に基づいて生成されている。したがって、ヒト組換えＴＫ１に基づくモノクローナル抗ＴＫ１抗体の生成は一般的に非効率的であり、ＴＫ１の血清形態に十分な結合強度で結合することが可能な抗ＴＫ１抗体を一般的に生成しないと仮定された（ＷＯ２０１５／０９４１０６）。
【0019】
否定的な経験に反して、および従来技術における一般的な仮説に反して、今や、本発明による抗体を得るために組換えｈＴＫ－１を免疫原として使用することが可能であることが驚くべきことに見出された。
【0020】
ｈＴＫ－１の配列全体にわたり、１アミノ酸シフトした１５量体線状ペプチドのいずれにも、本発明に開示される抗体のいずれも結合しないので、本発明による抗体は、高次構造依存性エピトープに結合する。
【0021】
抗体の全体的構造は、ジスルフィド結合によって接続される２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。重鎖および軽鎖の各々は、１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインからなる。抗原への結合特異性は、抗体を形成する軽鎖および重鎖の可変ドメインによって提供される。より具体的には、それらの特異性を決定し、特異的リガンドと接触する抗体部分は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる。ＣＤＲは分子の中で最も可変性の部分であり、これらの分子の多様性に寄与する。各可変ドメインに、４つのフレームワーク領域（ＦＷ）に埋められた、３つのＣＤＲ領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がある。本明細書で使用されるように、ＣＤＲ－ＨＣ（または、ＣＤＲ（ＨＣ））は可変重鎖のＣＤＲ領域を表し、ＣＤＲ－ＬＣ（または、ＣＤＲ（ＬＣ））は可変軽鎖のＣＤＲ領域に関する。同様に、ＦＷ－ＨＣ（または、ＦＷ（ＨＣ））は可変重鎖のフレームワーク領域を表し、ＦＷ－ＬＣ（または、ＦＷ（ＬＣ））は可変軽鎖のフレームワーク領域に関する。
【0022】
本発明によって使用される用語「含む」は、具体的に列挙される配列および／または構成成分に加えてさらなる配列／構成成分が含まれてもよいことを意味する。しかし、この用語は、特許請求される主題が、正確に列挙される配列および／または構成成分からなることも包含する。
【0023】
本発明の抗体が列挙されるアミノ酸配列より多くを含む実施形態では、追加のアミノ酸がＮ末端またはＣ末端、または両方に存在してもよい。追加の配列は、本明細書の下で詳細に議論される通り、例えば精製または検出のために導入される配列を例えば含むことができる。さらに、個々の配列が列挙される配列を「含む」場合、それらは、Ｎ末端またはＣ末端、または両方に追加のアミノ酸を含むこともできる。
【0024】
本発明により、抗体は配列番号１のヒトチミジンキナーゼ１（ｈＴＫ－１）に特異的に結合する。上で詳述されるように本発明の抗体が追加のアミノ酸を含む場合も、前記抗体は必ずｈＴＫ－１に特異的に結合しなければならないことが理解される。
【0025】
（本明細書で「特異的に相互作用する」とも呼ばれる）「特異的に結合する」という用語は、本発明により、抗体がｈＴＫ－１だけに特異的に結合するが、異なるタンパク質、特に類似した構造の異なるタンパク質、例えばチミジンキナーゼ２（配列番号５）などと交差反応しないか事実上交差反応しないことを意味する。
【0026】
抗体の特異性を分析するための対応する方法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、およびＨａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ（１９９９年）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている。好適な研究の非限定的な例は、例えば、結合性研究、構造的および／または機能的に緊密に関連した分子によるブロッキングおよび競合研究である。これらの研究は、例えば、ＦＡＣＳ分析、フローサイトメトリー滴定分析（ＦＡＣＳ滴定）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）による）、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、蛍光滴定、または放射標識リガンド結合アッセイなどの方法によって実行することができる。さらなる方法には、例えばウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（競合ＥＬＩＳＡを含む）、ＲＩＡ、ＥＣＬおよびＩＲＭＡ試験が含まれる。
【0027】
本発明との関連で、用語「抗体」は、完全免疫グロブリン分子ならびにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖのようなその抗原結合性断片に関する。さらに、本用語は、改変および／または変更された抗体分子、ならびに組換えまたは合成で生成／合成された抗体に関する。用語「抗体」は、二官能性抗体、三官能性抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体、および抗体構築物、例えば、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）または抗体融合タンパク質も含む。
【0028】
本明細書で使用される「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖ならびに１つの重鎖のＣＨ１および可変領域で構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。「Ｆａｂ’断片」は、１つの軽鎖ならびにＶＨドメインおよびＣＨ１ドメイン、さらにＣＨ１とＣＨ２ドメインの間の領域も含有する１つの重鎖の一部を含有し、そのため、２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合を形成して、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成することができる。「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つの軽鎖、ならびにＣＨ１とＣＨ２ドメインの間の定常領域の一部を含有する２つの重鎖を含有し、そのため、２つの重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがってＦ（ａｂ’）２断片は、２つの重鎖の間のジスルフィド結合によって繋ぎ合わされた２つのＦａｂ’断片で構成される。
【0029】
Ｆａｂ／ｃ断片は、ＦｃおよびＦａｂ決定因子の両方を含有し、「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む２つの重鎖断片を含有する。２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合によって、およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって繋ぎ合わされた。
【0030】
「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠いている。「単鎖Ｆｖ」（「ｓｃＦｖ」とも略される）は、本発明との関連で抗体のＶＨおよびＶＬドメインを有する抗体断片であり、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨとＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含
む。単鎖抗体の生成のために記載される技術は、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．１１３（１９９４年）、２６９～３１５頁において記載される。
む。単鎖抗体の生成のために記載される技術は、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．１１３（１９９４年）、２６９～３１５頁において記載される。
【0031】
用語「キメラ抗体」は、ヒトまたは非ヒト（例えば、マウス、ウマ、ウサギ、イヌ、ウシ、ニワトリ）の別の種からの抗体領域（例えば、定常領域）に融合またはキメラ化される、ヒトまたは非ヒトの種の可変領域を含む抗体を指す。
【0032】
上で指摘した通り、用語「抗体」は、抗体融合タンパク質などの抗体構築物も包含し、抗体は、本明細書で特異的アミノ酸配列によって規定されるドメインに加えて、例えば組換えで生成された構築物の単離および／または調製のための追加のドメイン（複数可）を含む。
【0033】
本発明の抗体は、それが、本発明において開示および規定されるＣＤＲをなお含む組換え抗体、例えば、組換えウサギ抗体またはヘテロハイブリッド抗体であるように、生成することができる。
【0034】
用語「組換え抗体」には、組換え手段によって調製、発現、作製または単離される全ての抗体が含まれる。組換え抗体は、例えば、Ｂ細胞ＰＣＲによって得られる抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離される抗体、宿主細胞にトランスフェクトされる組換え発現ベクターを使用して発現される抗体、組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、または、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製もしくは単離される抗体である。Ｂ細胞ＰＣＲによって生成される組換えウサギ抗体は、ウサギ生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域（存在するならば）を有する。すなわち、Ｂ細胞ＰＣＲの直接の結果は、抗体の結合関連断片であり、当業者は、例えば、完全長抗体、キメラ抗体、または所望／必要とされるいかなる「抗体」でも解釈するのにいかなる問題もない。
【0035】
用語「ヘテロハイブリッド抗体」は、異なる生物体を起源とする軽鎖および重鎖を有する抗体を指す。例えば、マウスの軽鎖に会合したヒト重鎖を有する抗体は、ヘテロハイブリッド抗体である。ヘテロハイブリッド抗体の例には、キメラおよびヒト化抗体が含まれる。
【0036】
本発明による抗体またはその抗原結合性断片は、ａ）ヒトチミジンキナーゼ１（ｈＴＫ－１；配列番号１）の上の高次構造依存性エピトープに結合し、ｂ）ｈＴＫ－１のアミノ酸１９４～２２５（配列番号２）からなるポリペプチドに結合せず、およびｃ）ｈＴＫ－１の１５連続アミノ酸からなるいずれのポリペプチドにも結合しない。
【0037】
配列番号２のペプチドへの抗ｈＴＫ－１抗体の結合、それへの非結合の各々は、配列番号２のＮ末端ビオチン化ペプチドの使用によって判定される。そのようなペプチドはストレプトアビジンでコーティングされた固相に結合され、結合、非結合の各々は、標準手順によって判定される。事実上同じ方法で、ｈＴＫ－１の１５連続アミノ酸からなる任意のポリペプチドへの抗ｈＴＫ－１抗体の結合、非結合の各々が判定される。後者の目的のために、ｈＴＫ－１の１５連続アミノ酸からなる各１５量体ポリペプチドを合成し、Ｎ末端ビオチン化し、抗体を結合、非結合についてそれぞれ試験する。各ペプチドはストレプトアビジンでコーティングされた固相に結合され、結合、非結合の各々は、標準手順によって判定される。
【0038】
一実施形態では、本発明による抗体は、配列番号３の可変重鎖（ｖＨＣ）および配列番号４の可変軽鎖（ｖＬＣ）を含む抗体と同じエピトープに結合する。そのような抗体は、与えられる特異的抗体のバリアントであってよく、例えば、アミノ酸置換を含むことができるか、または代替形態では、異なるｖＨＣもしくは異なるｖＬＣもしくは両方を有することができる
用語「置換」は、本発明により、別のアミノ酸によるアミノ酸の置き換えを指す。したがって、アミノ酸の総数は、同じままである。ある特定の位置のアミノ酸の欠失、および異なる位置の１つ（または複数）のアミノ酸の導入は、用語「置換」に明示的に包含されない。置換は、本発明により、保存的アミノ酸置換であっても非保存的アミノ酸置換であってもよい。用語「保存的アミノ酸置換」は当技術分野で周知であり、類似した構造的および／または化学的特性を有する異なるアミノ酸によるアミノ酸の置き換えを指す。そのような類似性には、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性における類似性が含まれる。アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換であり、その場合、以下の群の１つの１つのアミノ酸が同じ群の別のアミノ酸によって置換される：無極性（疎水性）のアミノ酸には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる；極性の中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる；正電荷（塩基性）のアミノ酸には、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる；負電荷（酸性）のアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
用語「置換」は、本発明により、別のアミノ酸によるアミノ酸の置き換えを指す。したがって、アミノ酸の総数は、同じままである。ある特定の位置のアミノ酸の欠失、および異なる位置の１つ（または複数）のアミノ酸の導入は、用語「置換」に明示的に包含されない。置換は、本発明により、保存的アミノ酸置換であっても非保存的アミノ酸置換であってもよい。用語「保存的アミノ酸置換」は当技術分野で周知であり、類似した構造的および／または化学的特性を有する異なるアミノ酸によるアミノ酸の置き換えを指す。そのような類似性には、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性における類似性が含まれる。アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換であり、その場合、以下の群の１つの１つのアミノ酸が同じ群の別のアミノ酸によって置換される：無極性（疎水性）のアミノ酸には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる；極性の中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる；正電荷（塩基性）のアミノ酸には、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる；負電荷（酸性）のアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【0039】
抗体の「結合親和性」は、以下の式により標的抗原の上のエピトープと抗体の結合部位の間の相互作用の強度を測定する：
ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ
式中：
ＫＤ＝解離平衡定数［Ｍ］
ｋｄ＝解離速度定数［ｓ－１］
ｋａ＝会合速度定数［Ｍ－１ ｓ－１］
抗体の結合親和性のさらなる関連パラメータは、以下の通りである：
ｔ／２＝解離複合体半減期＝ｌｎ２／ｋｄ／６０［分］
Ｒｍａｘ＝分析物の応答最大値［ＲＵ］
ＭＲ：モル比＝分析物の応答最大値（Ｒｍａｘ）の比
一実施形態では、本明細書の上で開示されるｈＴＫ－１に対するモノクローナル抗体は、１０分以上の３７℃のｔ／２－解離でｈＴＫ－１に結合する。
ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ
式中：
ＫＤ＝解離平衡定数［Ｍ］
ｋｄ＝解離速度定数［ｓ－１］
ｋａ＝会合速度定数［Ｍ－１ ｓ－１］
抗体の結合親和性のさらなる関連パラメータは、以下の通りである：
ｔ／２＝解離複合体半減期＝ｌｎ２／ｋｄ／６０［分］
Ｒｍａｘ＝分析物の応答最大値［ＲＵ］
ＭＲ：モル比＝分析物の応答最大値（Ｒｍａｘ）の比
一実施形態では、本明細書の上で開示されるｈＴＫ－１に対するモノクローナル抗体は、１０分以上の３７℃のｔ／２－解離でｈＴＫ－１に結合する。
【0040】
一実施形態では、本開示によるモノクローナル抗体は、それがｈＴＫ－１に対する１０－９Ｍまたはより優れた結合親和性を有することを特徴とする。一実施形態では、本開示によるモノクローナル抗体は、それがｈＴＫ－１に対する５×１０－１０Ｍもしくはより優れた、または２×１０－１０Ｍもしくはより優れた結合親和性を有することを特徴とする。従来技術から公知である抗体は、ｈＴＫ－１の上の線状エピトープにそのような優れた親和性を有しないかまたは結合しないかまたは両方である。
【0041】
そのような抗体の各々は、ａ）ｈＴＫ－１の高次構造依存性エピトープに結合し、ｂ）ｈＴＫ－１のアミノ酸１９４～２２５（配列番号２）からなるポリペプチドに結合せず、およびｃ）ｈＴＫ－１の１５連続アミノ酸からなるいずれのポリペプチドにも結合しないことを特徴とする、ヒトチミジンキナーゼ１（ｈＴＫ－１；配列番号１）に特異的に結合するいくつかの非常に優れたモノクローナル抗体を、実施例のセクションに開示される方法によって生成した。驚くべきことに、３つ全ての例示的な抗体は、非常に類似しているか同じエピトープに結合する。理論に束縛されることを望むことなく、本発明による抗体が結合する立体配置的エピトープは、臨床ルーチンにおいて有益な高感度イムノアッセイ
を確立することにおいて絶対的に重要であるように見えるだろう。この決定的なエピトープが同定された今、このエピトープに結合する他のモノクローナル抗体を見出すことはかなり容易になる。本明細書に開示される手順に従って、または本明細書に開示される抗体の配列を改変することによって、そのような抗体は容易に作製することができる。
を確立することにおいて絶対的に重要であるように見えるだろう。この決定的なエピトープが同定された今、このエピトープに結合する他のモノクローナル抗体を見出すことはかなり容易になる。本明細書に開示される手順に従って、または本明細書に開示される抗体の配列を改変することによって、そのような抗体は容易に作製することができる。
【0042】
驚くべきことに、３つ全ての抗体が同じエピトープに結合することが見出された。それらの生成方法のために、これらの組換えウサギモノクローナル抗体の結合は、Ｂ細胞ＰＣＲにおいて得られる配列、すなわち、Ｂ細胞ＰＣＲによって得られる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの部分によって最もよく規定される。ＭＡＢ ６Ｃ６は、一般的なエピトープの規定のためのプロトタイプ抗体として選択された。ＭＡＢ ６Ｃ６は、配列番号３の重鎖可変ドメインおよび配列番号４の軽鎖可変ドメインによって特徴付けられる。
【0043】
一実施形態では、本発明は、配列番号３の重鎖可変ドメインおよび配列番号４の軽鎖可変ドメインを有する本発明のモノクローナル抗体またはその結合性断片と同じである、ヒトＴＫ－１の上のエピトープに結合する抗体を提供する。ｈＴＫ－１の上の同じエピトープに結合する抗体は、ｈＴＫ－１への結合に関して、配列番号３の重鎖可変ドメインおよび配列番号４の軽鎖可変ドメインを有する抗体と競合する抗体である。
【0044】
そのような競合抗体は、標準のｈＴＫ－１結合アッセイにおいて、モノクローナルウサギ抗体ＭＡＢ６Ｃ６、すなわち配列番号３の重鎖可変ドメインおよび配列番号４の軽鎖可変ドメインを含む抗体と競合するそれらの能力に基づいて、同定することができる。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ分析、ＥＬＩＳＡアッセイまたはフローサイトメトリーを、配列番号３の重鎖可変ドメインおよび配列番号４の軽鎖可変ドメインを有するモノクローナル抗体またはその結合性断片との競合を実証するために使用することができる。
【0045】
ヒトＴＫ－１へのモノクローナルウサギ抗体ＭＡＢ ６Ｃ６の結合を阻害する試験抗体の能力は、試験抗体が、モノクローナルウサギ抗体ＭＡＢ ６Ｃ６と同じｈＴＫ－１の上のエピトープへの結合に関してモノクローナルウサギ抗体ＭＡＢ ６Ｃ６と競合することができ、したがって、それに結合することを実証する。
【0046】
指摘するように、配列番号３の重鎖可変ドメインおよび配列番号４の軽鎖可変ドメインを有するウサギモノクローナル抗体ＭＡＢ ６Ｃ６またはその結合性断片と競合する抗体を同定するために、いくつかの異なる競合アッセイを使用することができる。
【0047】
例示的な競合アッセイでは、固定化されたｈＴＫ－１を、ｈＴＫ－１に結合する第１の標識抗体（例えば、配列番号３の重鎖可変ドメインおよび配列番号４の軽鎖可変ドメインを有する抗ｈＴＫ－１モノクローナル抗体またはその結合性断片）、およびｈＴＫ－１への結合に関して第１の抗体と競合するその能力について試験される第２の非標識抗体を含む溶液の中でインキュベートする。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化されたｈＴＫ－１を、第１の標識抗体を含むが第２の非標識抗体を含まない溶液中でインキュベートする。ｈＴＫ－１への第１の抗体の結合を許容する条件下でのインキュベーションの後、過剰な未結合の抗体を除去し、固定化されたｈＴＫ－１に会合している標識の量を測定する。固定化されたｈＴＫ－１に会合している標識の量が対照試料に対して試験試料で実質的に低減されている場合は、そのことは、ｈＴＫ－１への結合に関して第２の抗体が第１の抗体と競合していることを示す。例えば、ＨａｒｌｏｗらＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８８年）を参照。
【0048】
抗体、例えば抗ｈＴＫ－１抗体の結合特性は、Ｂｉａｃｏｒｅ技術がその同義語になった、表面プラズモン共鳴分光法のようなリアルタイムバイオセンサーベースの分子相互作用測定によって、最もよく判定される。Ｂｉａｃｏｒｅシステムでは、同じエピトープへの競合的結合（すなわち、同一のエピトープまたは重複するエピトープへの結合）に関して、抗体を分析することもできる。実験詳細は実施例３に与えられ、動態学的データは表１に示す。一実施形態では、本明細書で同定される高次構造依存性エピトープへの結合について抗体を特徴付ける競合実験は、実施例のセクションに記載の通りにＢＩＡｃｏｒｅ機器で実行される。
【0049】
ｈＴＫ－１タンパク質の測定のためのいくつかの非自動化アッセイが利用可能である。おそらく、ほとんどの範囲を有するアッセイはＡｒｏｃｅｌｌのｈＴＫ－１アッセイであり、それは、いくつかの手動処理ステップおよびかなり長いインキュベーション時間を必要とするマイクロタイタープレートフォーマットに基づく。しかし、上で指摘した通り、おそらく適当な抗体がないために、今日まで、自動化イムノアッセイアナライザーで実行されるｈＴＫ－１のための利用可能なイムノアッセイはない。しかし、本発明による抗体は、この問題を解決する。それは、ｈＴＫ－１のｉｎ ｖｉｔｒｏ測定において大きな利点で使用することができる。
【0050】
一実施形態では、本開示は、ｈＴＫ－１を定量化するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、ａ）ｈＴＫ－１が定量化されるべき試料を、ヒトチミジンキナーゼ１（ｈＴＫ－１；配列番号１）に特異的に結合する抗体とインキュベートするステップであって、抗体は、（ｉ）ｈＴＫ－１の高次構造依存性エピトープに結合し、（ｉｉ）ｈＴＫ－１のアミノ酸１９４～２２５（配列番号２）からなるポリペプチドに結合せず、および（ｉｉｉ）請求項１または２のｈＴＫ－１の１５連続アミノ酸からなるいずれのポリペプチドにも結合しないことを特徴とし、それによって、抗体とｈＴＫ－１の間で複合体を生成するステップと、ｂ）ステップａ）で形成される複合体を定量化し、それによってｈＴＫ－１を定量化するステップとを含む方法に関する。
【0051】
本発明の抗体を利用することができるイムノアッセイの例は、直接的または間接的なフォーマットのイムノアッセイである。そのようなイムノアッセイの例は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または発光、蛍光、化学発光もしくは電気化学発光の検出に基づくイムノアッセイである。
【0052】
一実施形態では、ｈＴＫ－１の測定でサンドイッチイムノアッセイが用いられる。
本明細書では、ｈＴＫ－１を定量化するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、ａ）ｈＴＫ－１が定量化されるべき試料を本開示による抗体である第１の抗体、およびｈＴＫ－１に対する第２の抗体とインキュベートし、それによって第１の抗体、ｈＴＫ－１および第２の抗体の間でサンドイッチ複合体を生成するステップと、ｂ）ステップａ）で形成されるサンドイッチ複合体を定量化し、それによってｈＴＫ－１を定量化するステップとを含む方法も開示される。
本明細書では、ｈＴＫ－１を定量化するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、ａ）ｈＴＫ－１が定量化されるべき試料を本開示による抗体である第１の抗体、およびｈＴＫ－１に対する第２の抗体とインキュベートし、それによって第１の抗体、ｈＴＫ－１および第２の抗体の間でサンドイッチ複合体を生成するステップと、ｂ）ステップａ）で形成されるサンドイッチ複合体を定量化し、それによってｈＴＫ－１を定量化するステップとを含む方法も開示される。
【0053】
興味深いことに、本発明によるモノクローナル抗体は、そのような試料の前処理有りでも無しでも、血清または血漿試料に存在するｈＴＫ－１の検出のために使用することができる。これは、本発明の抗体が、血清または血漿試料に存在するオリゴマーｈＴＫ－１にも結合することを意味する。一実施形態では、本発明は、ｈＴＫ－１の検出における本発明による抗体の使用に関し、試料は還元剤で前処理されない。
【0054】
従来技術では、ｈＴＫ－１の四量体で酵素的に高い活性の形態を生成するために、血清または血漿試料は通常前処理される。試料の前処理およびそのような前処理試料からのｈ
ＴＫ－１の測定は、非常に魅力的な方法であるが、その理由は、この方法で、ｈＴＫ－１酵素活性との非常に優れた相関を達成することができるからである。
ＴＫ－１の測定は、非常に魅力的な方法であるが、その理由は、この方法で、ｈＴＫ－１酵素活性との非常に優れた相関を達成することができるからである。
【0055】
適当な前処理試薬の選択は、完全に当業者の能力の範囲内である。四量体ｈＴＫ－１へオリゴマーｈＴＫ－１を形質転換するために、そのような前処理試薬は還元剤を少なくとも含む。例えばＳｈａｒｉｆら（ＢＭＣ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１２年）、１３：１２）によって記載される通り、還元剤が有効だったかどうか、および処理後にｈＴＫ－１が主に四量体として存在するかどうかについて、ゲル濾過実験によって評価することは容易である。いくつかの異なる還元剤、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）またはジチオブチルアミン（ＤＴＢＡ）が当業者にとって問題になっている。さらに、前処理試薬の濃度は、適当な時間のインキュベーションの後、または希釈ステップの後に、それがｈＴＫ－１タンパク質を測定するために使用されるいかなる抗体にも負の影響を与えないように選択される。ジチオブチルアミン（ＤＴＢＡ）が還元剤として使用される場合、試料前処理ステップ（試料および前処理試薬の混合物）における適当な最終濃度は５ｍＭの範囲内である。前希釈、および／またはＤＴＴブロック剤の付加、および／または第１の抗体を含む緩衝液による希釈の後、酸化形態のＤＴＴの濃度は、好ましくは１．５ｍＭ以下である。この方法で、使用される免疫学的試薬のいずれにも還元剤は影響を及ぼさない。
【0056】
上記のように、ＡＴＰはｈＴＫ－１の四量体形態を安定化させる。ＡＴＰの後者の機能は、それを、例えば前処理緩衝液への魅力的な添加剤にする。一実施形態では、前処理緩衝液は、上記の還元剤およびＡＴＰを含む。試料前処理ステップにおけるＡＴＰの濃度は、１．２５ｍＭ未満にするべきでない。前処理ステップにおけるＡＴＰ濃度の優れた選択は、２ｍＭ～２０ｍＭの範囲内にある。
【0057】
一実施形態では、本開示は、ｈＴＫ－１を定量化するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、ａ）ｈＴＫ－１が定量化されるべき試料を還元剤およびＡＴＰを含む前処理溶液とインキュベートするステップと、ｂ）ステップａ）において得られる前処理試料を本発明による抗体とインキュベートし、それによって抗体とｈＴＫ－１の間の複合体を生成するステップと、ｃ）ステップｂ）で形成される複合体を定量化し、それによってｈＴＫ－１を定量化するステップとを含む方法に関する。
【0058】
サンドイッチイムノアッセイは、目的の分析物の検出で広く使用される。そのようなアッセイでは、分析物は第１の抗体と第２の抗体の間に「サンドイッチ」される。適当な手段によって、そのようなサンドイッチ複合体は測定され、分析物がそれによって定量化される。
【0059】
一実施形態では、本開示は、ｈＴＫ－１を定量化するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、ａ）ｈＴＫ－１が定量化されるべき試料を還元剤およびＡＴＰを含む前処理溶液とインキュベートするステップと、ｂ）ステップａ）において得られる前処理試料を、本発明による抗体である第１の抗体、およびｈＴＫ－１に対する第２の抗体とインキュベートし、それによって第１の抗体、ｈＴＫ－１および第２の抗体の間でサンドイッチ複合体を生成するステップと、ｃ）ステップｂ）で形成されるサンドイッチ複合体を定量化し、それによってｈＴＫ－１を定量化するステップとを含む方法に関する。
【0060】
一実施形態では、本発明の方法は、サンドイッチアッセイフォーマットで実施される。
一般的なサンドイッチタイプのアッセイでは、固相に結合しているかそれに結合することが可能な第１の抗体、および検出可能的に標識されている第２の抗体は、異なる非重複エピトープで分析物に各々結合する。第１の分析物特異的結合性薬剤（例えば抗体）は、固体表面に共有結合するかまたは受動的に結合している。固体表面は一般的にガラスまた
はポリマーであり、最も一般的に使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。固体支持体は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートのディスク、またはイムノアッセイを実行するのに好適である任意の他の表面の形態であってよい。結合プロセスは当技術分野で周知であり、一般的に架橋共有結合または物理的吸着からなり、ポリマー－抗体複合体は試験試料の調製のために洗浄される。次に、試験される試料のアリコートを固相複合体に加え、第１のまたは捕捉抗体と対応する抗原の間の結合を可能にするために十分な時間（例えば、２～４０分、またはより好都合であれば一晩）および好適な条件（例えば、室温から４０℃、例えば両端を含む２５℃から３７℃の間）の下でインキュベートする。インキュベーション期間の後、第１のまたは捕捉抗体およびそれに結合した抗原を含む固相を洗浄し、抗原の上の別のエピトープに結合する二次のまたは標識された抗体とインキュベートすることができる。第２の抗体は、第１の抗体と目的の抗原の複合体への第２の抗体の結合を示すために使用されるリポーター分子に連結される。
一般的なサンドイッチタイプのアッセイでは、固相に結合しているかそれに結合することが可能な第１の抗体、および検出可能的に標識されている第２の抗体は、異なる非重複エピトープで分析物に各々結合する。第１の分析物特異的結合性薬剤（例えば抗体）は、固体表面に共有結合するかまたは受動的に結合している。固体表面は一般的にガラスまた
はポリマーであり、最も一般的に使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。固体支持体は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートのディスク、またはイムノアッセイを実行するのに好適である任意の他の表面の形態であってよい。結合プロセスは当技術分野で周知であり、一般的に架橋共有結合または物理的吸着からなり、ポリマー－抗体複合体は試験試料の調製のために洗浄される。次に、試験される試料のアリコートを固相複合体に加え、第１のまたは捕捉抗体と対応する抗原の間の結合を可能にするために十分な時間（例えば、２～４０分、またはより好都合であれば一晩）および好適な条件（例えば、室温から４０℃、例えば両端を含む２５℃から３７℃の間）の下でインキュベートする。インキュベーション期間の後、第１のまたは捕捉抗体およびそれに結合した抗原を含む固相を洗浄し、抗原の上の別のエピトープに結合する二次のまたは標識された抗体とインキュベートすることができる。第２の抗体は、第１の抗体と目的の抗原の複合体への第２の抗体の結合を示すために使用されるリポーター分子に連結される。
【0061】
極めて多用途の代替のサンドイッチアッセイフォーマットは、結合対の第１のパートナーでコーティングされた固相、例えば常磁性のストレプトアビジンでコーティングされた微粒子の使用を含む。そのような微粒子は、分析物を含むことが疑われるか含む試料である結合対の第２のパートナー（例えば、ビオチン化抗体）に結合した分析物特異的結合性薬剤と混合およびインキュベートされ、結合対の前記第２のパートナーは、前記分析物特異的結合性薬剤、および、例えば本明細書で使用される電気化学的発光性の標識によって検出可能的に標識されている、第２の分析物特異的結合性薬剤に結合される。当業者にとって明らかであるように、これらの構成成分は適当な条件下で、および、分析物を介して標識抗体、結合対の第２のパートナー（に結合した）分析物特異的結合性薬剤、および結合対の第１のパートナーを、固相微粒子に結合させるのに十分な時間インキュベートされる。適宜、そのようなアッセイは、１つまたは複数の洗浄ステップ（複数可）を含むことができる。
【0062】
一実施形態では、本開示は、サンドイッチアッセイに関し、第１または第２の抗体は固相に結合しているか、固相と結合することが可能であり、第２または第１の抗体はそれぞれ検出可能的に標識されており、これらの抗体の少なくとも１つは、本発明で開示される抗体である。
【0063】
通常、サンドイッチアッセイは、捕捉および検出抗体が目的の分析物の上の異なる、非重複エピトープに結合することを必要とする。血清／血漿ｈＴＫ－１の場合、好ましくは上記の通りに生成される酵素の四量体形態が測定される。ｈＴＫ－１の定量化のためのサンドイッチアッセイ方法では、一実施形態では、本発明による抗体は、１９５位からＣ末端、すなわち２３４位の範囲内のアミノ酸（配列番号５）で表されるｈＴＫ－１のＣ末端部分の上のエピトープに結合する抗体、または、１９５位から２２５位の範囲内のアミノ酸（配列番号２）からなるポリペプチドに含まれるエピトープに結合する抗体と組み合わせて使用される。一実施形態では、本発明による抗体およびｈＴＫ－１のアミノ酸２１１～２３０（配列番号６）に含まれるエピトープに結合する抗体が、ｈＴＫ－１の測定のためのサンドイッチアッセイにおいて使用される。
【0064】
本発明により本発明者らが示すことができたように、本発明による抗体を両方のために、すなわちサンドイッチ複合体の一部分としての捕捉抗体として、ならびにサンドイッチ複合体の他の一部分としての検出抗体として使用することも可能である。一実施形態では、ｈＴＫ－１の定量化は、したがって、捕捉ならびに検出抗体の両方として本発明による抗体を使用するサンドイッチアッセイによって実行される。
【0065】
ｈＴＫ－１の定量化のためのサンドイッチイムノアッセイ方法では、ｈＴＫ－１に対す
る少なくとも１つの抗体は検出可能な標識を含む。
検出可能的に標識されているという用語は、直接的にまたは間接的に検出することができる標識を包含する。
る少なくとも１つの抗体は検出可能な標識を含む。
検出可能的に標識されているという用語は、直接的にまたは間接的に検出することができる標識を包含する。
【0066】
直接的に検出可能な標識は、検出可能なシグナルを提供するか、または、例えばＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）を与えるために、第１もしくは第２の標識によって提供される検出可能なシグナルを改変するために、それらは第２の標識と相互作用する。蛍光色素および発光性の（化学発光性および電気化学発光性を含む）色素（Ｂｒｉｇｇｓら「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｔｏ Ａｍｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ」、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｔｒａｎｓ．１（１９９７年）１０５１～１０５８頁）などの標識は、検出可能なシグナルを提供し、標識化のために一般的に適用可能である。一実施形態では、検出可能的に標識されているとは、検出可能なシグナルを提供するか提供するように誘導することが可能な標識、すなわち蛍光性標識、発光性標識（例えば、化学発光性の標識または電気化学発光性の標識）、放射性標識または金属キレートベースの標識をそれぞれ指す。
【0067】
以下のカテゴリーに一般的に分類することができる多数の標識（色素とも呼ばれる）が利用可能であり、それらの全ておよび各々は、本開示による実施形態を表す：
（ａ）蛍光色素
蛍光色素は、例えば、Ｂｒｉｇｇｓら「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｔｏ Ａｍｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ」、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｔｒａｎｓ．１（１９９７年）１０５１～１０５８頁に記載されている。
（ａ）蛍光色素
蛍光色素は、例えば、Ｂｒｉｇｇｓら「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｔｏ Ａｍｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ」、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｔｒａｎｓ．１（１９９７年）１０５１～１０５８頁に記載されている。
【0068】
蛍光性標識または蛍光団には、希土類キレート（ユウロピウムキレート）、フルオレセインタイプの標識、例えば、ＦＩＴＣ、５－カルボキシフルオレセイン、６－カルボキシフルオレセイン；ローダミンタイプの標識、例えば、ＴＡＭＲＡ；ダンシル；リサミン；シアニン；フィコエリトリン；テキサスレッド；およびその類似体。蛍光性標識は、本明細書に開示される技術を使用して、標的分子に含まれるアルデヒド基にコンジュゲートすることができる。蛍光色素および蛍光性標識試薬には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ、ＵＳＡ）およびＰｉｅｒｃｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）から市販されているものが含まれる。
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）から市販されているものが含まれる。
【0069】
（ｂ）発光色素
発光性の色素または標識は、化学発光性および電気化学発光性の色素にさらに小分類することができる。
発光性の色素または標識は、化学発光性および電気化学発光性の色素にさらに小分類することができる。
【0070】
化学発光原性標識の異なるクラスには、ルミノール、アクリジニウム化合物、セレンテラジンおよび類似体、ジオキセタン、ペルオキシシュウ酸に基づく系、およびそれらの誘導体が含まれる。免疫診断法については、アクリジニウムベースの標識が主に使用される（詳細な概要は、Ｄｏｄｅｉｇｎｅ Ｃ．ら、Ｔａｌａｎｔａ ５１（２０００年）４１５～４３９頁に与えられる）。
【0071】
電気化学発光標識として使用される関連性の強い標識は、ルテニウムおよびイリジウムをそれぞれベースにした電気化学発光複合体である。電気化学発光（ＥＣＬ）は、分析的適用において感度および選択性の高い方法として非常に有益であることが証明された。それは、電極電位を適用することによって、化学発光分析（バックグラウンド光学シグナル
の非存在）の分析的利点を反応制御の容易さと組み合わせる。一般的なルテニウム錯体では、特に液相または液固界面においてＴＰＡ（トリプロピルアミン）で再生する［Ｒｕ（Ｂｐｙ）３］２＋（約６２０ｎｍの光子を放出する）が、ＥＣＬ標識として使用される。
の非存在）の分析的利点を反応制御の容易さと組み合わせる。一般的なルテニウム錯体では、特に液相または液固界面においてＴＰＡ（トリプロピルアミン）で再生する［Ｒｕ（Ｂｐｙ）３］２＋（約６２０ｎｍの光子を放出する）が、ＥＣＬ標識として使用される。
【0072】
電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイは、目的の分析物の存在および濃度の高感度で正確な測定を提供する。そのような技術は、適当な化学的環境において電気化学的に酸化または還元されるときに発光するように誘導することができる標識または他の反応体を使用する。そのような電気化学発光は、特定の時間および特定の様式で、作用電極に課される電圧によって誘発される。標識によって生成される光が測定され、分析物の存在または量を示す。そのようなＥＣＬ技術のより完全な記載に関して、米国特許第５，２２１，６０５号、米国特許第５，５９１，５８１号、米国特許第５，５９７，９１０号、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９０／０５２９６、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９２／１４１３９、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９０／０５３０１、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９６／２４６９０、ＰＣＴ公開出願ＵＳ９５／０３１９０、ＰＣＴ出願ＵＳ９７／１６９４２、ＰＣＴ出願ＵＳ９６／０６７６３、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９５／０８６４４、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９６／０６９４６、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９６／３３４１１、ＰＣＴ公開出願ＷＯ８７／０６７０６、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９６／３９５３４、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９６／４１１７５、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９６／４０９７８、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０３６５３および米国特許出願０８／４３７３４８（米国特許第５，６７９，５１９号）が参照される。Ｋｎｉｇｈｔら（Ａｎａｌｙｓｔ、１９９４年、１１９：８７９～８９０頁）によるＥＣＬの分析的適用の１９９４年のレビューおよびその中の引用文献も参照される。一実施形態では、本記載による方法は、電気化学発光標識を使用して実施される。
【0073】
近年、イリジウムベースのＥＣＬ標識も記載されている（ＷＯ２０１２１０７４１９（Ａ１））。
一実施形態では、直接的に検出可能な標識は、化学発光性または電気化学発光性の標識である。標識によって生成される光が測定され、分析物の存在または量を直接的または間接的に示す。
一実施形態では、直接的に検出可能な標識は、化学発光性または電気化学発光性の標識である。標識によって生成される光が測定され、分析物の存在または量を直接的または間接的に示す。
【0074】
（ｃ）放射性標識は、放射性同位体（放射性核種）、例えば、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇｎ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９９ＴＣ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔまたは１３１Ｂｉを利用する。
【0075】
（ｄ）画像化および治療目的のための標識として好適な金属キレート錯体は、当技術分野で周知である（米国特許出願公開第２０１０／０１１１８５６号；米国特許第５，３４２，６０６号；米国特許第５，４２８，１５５号；米国特許第５，３１６，７５７号；米国特許第５，４８０，９９０号；米国特許第５，４６２，７２５号；米国特許第５，４２８，１３９号；米国特許第５，３８５，８９３号；米国特許第５，７３９，２９４号；米国特許第５，７５０，６６０号；米国特許第５，８３４，４５６号；Ｈｎａｔｏｗｉｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５（１９８３年）１４７～１５７頁；Ｍｅａｒｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４２（１９８４年）６８～７８頁；Ｍｉｒｚａｄｅｈら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１（１９９０年）５９～６５頁；Ｍｅａｒｅｓら、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９０年）、Ｓｕｐｐｌ．１０：２１～２６頁；Ｉｚａｒｄら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３（１９９２年）３４６～３５０頁；Ｎｉｋｕｌａら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２２（１９９５年）３８７～９０頁；Ｃａｍｅｒａら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２０（１９９３年）９５５～６２頁；Ｋｕｋｉｓら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３９（１９９８年）２１０５～２１１０頁；Ｖｅｒｅｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４（２００３年）１６６３～１６７０頁；Ｃａｍｅｒａら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２１（１９９４年）６４０～６４６頁；Ｒｕｅｇｇら、Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０（１９９０年）４２２１～４２２６頁；Ｖｅｒｅｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４（２００３年）１６６３～１６７０頁；Ｌｅｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１（２００１年）４４７４～４４８２頁；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、ら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４（２００３年）１１０５～１１１２頁；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０（１９９９年）１０３～１１１頁；Ｍｉｅｄｅｒｅｒら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４５（２００４年）１２９～１３７頁；ＤｅＮａｒｄｏら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４（１９９８年）２４８３～９０頁；Ｂｌｅｎｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ １８（２００３年）３５５～３６３頁；Ｎｉｋｕｌａら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４０（１９９９年）１６６～７６頁；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３９（１９９８年）８２９～３６頁；Ｍａｒｄｉｒｏｓｓｉａｎら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２０（１９９３年）６５～７４頁；Ｒｏｓｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、１４（１９９９年）２０９～２０頁）。
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０（１９９０年）４２２１～４２２６頁；Ｖｅｒｅｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４（２００３年）１６６３～１６７０頁；Ｌｅｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１（２００１年）４４７４～４４８２頁；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、ら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４（２００３年）１１０５～１１１２頁；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０（１９９９年）１０３～１１１頁；Ｍｉｅｄｅｒｅｒら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４５（２００４年）１２９～１３７頁；ＤｅＮａｒｄｏら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４（１９９８年）２４８３～９０頁；Ｂｌｅｎｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ １８（２００３年）３５５～３６３頁；Ｎｉｋｕｌａら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４０（１９９９年）１６６～７６頁；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３９（１９９８年）８２９～３６頁；Ｍａｒｄｉｒｏｓｓｉａｎら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２０（１９９３年）６５～７４頁；Ｒｏｓｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、１４（１９９９年）２０９～２０頁）。
【0076】
数十年来ｈＴＫ－１が公知である事実にもかかわらず、および、優れたイムノアッセイをもたらす数多くの試みにもかかわらず、立体配置的エピトープに結合し、ｈＴＫ－１の高感度検出において有益である、ｈＴＫ－１に対する高品質な抗体がなお利用可能でないというのは、不可解なはなしである。理論に束縛されることを望まないが、この欠如／失敗は、免疫化によって誘導される抗体によってｈＴＫ－１がある程度ブロックされる可能性があるという事実に関係があると想像するかもしれない。標準のハイブリドーマ技術がハイブリドーマを選択するためにＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン）に依存すること、すなわち、アミノプテリンの有毒な作用に打ち勝つために、ハイブリドーマは選択培地に加えられるチミジンを使用できなければならないことを忘れるべきでない。今や、首尾よく生成されたｈＴＫ－１モノクローナル抗体が、Ｂ細胞ＰＣＲ技術によって得られた。Ｂ細胞ＰＣＲ技術では、ＨＡＴ培地は使用されず、この技術によって生成される抗体によるｈＴＫ－１のブロッキングは、関連性がより低いかまたは完全に無関係かもしれない。
【0077】
本開示の対応するセクションに示す実施例では、ウサギが実験動物として使用され、ｈＴＫ－１で免疫化され、それらのＢ細胞がウサギＢ細胞ＰＣＲ技術において使用された。明らかなように、Ｂ細胞ＰＣＲ技術はマウスのような他の実験動物のために使用することもできるか、または必要であれば、他の実験動物のために同様に確立することができる。したがって、ウサギにおけるＢ細胞ＰＣＲは一実施形態であるが、抗ｈＴＫ－１抗体を生成するためのＢ細胞ＰＣＲ技術の使用は、この種に限定されない。
【0078】
一実施形態では、本発明によるｈＴＫ－１に対する抗体は、Ｂ細胞ＰＣＲ技術によって得られる。
本明細書の上でずっと詳細に記載の通りに、本発明に開示されるＨＴＫ－１に対する抗体は、ｈＴＫ－１の検出において大きな利点で使用することができる。したがって、一実施形態では、本発明は、ｈＴＫ－１の定量化における本明細書に開示される抗体の使用に関する。
本明細書の上でずっと詳細に記載の通りに、本発明に開示されるＨＴＫ－１に対する抗体は、ｈＴＫ－１の検出において大きな利点で使用することができる。したがって、一実施形態では、本発明は、ｈＴＫ－１の定量化における本明細書に開示される抗体の使用に関する。
【0079】
当業者にとって明らかであるように、ｈＴＫ－１の検出のための方法において本発明による抗体を使用することが有利である。
一実施形態では、本開示は、試料中のｈＴＫ－１を検出する方法であって、ａ）抗ｈＴＫ－１抗体／ｈＴＫ－１複合体の形成に十分な時間および条件の下で試料を本開示による抗ｈＴＫ－１抗体と接触させるステップと；ｂ）抗ｈＴＫ－１抗体／ｈＴＫ－１複合体を測定するステップとを含む方法に関し、その複合体の量は、試料中のｈＴＫ－１の濃度を示す。例えば「抗ｈＴＫ－１抗体／ｈＴＫ－１複合体」における用語「／」は、一方には
抗ｈＴＫ－１抗体と他方にはｈＴＫ－１の間で非共有結合性の複合体が形成されることを示すために使用される。
一実施形態では、本開示は、試料中のｈＴＫ－１を検出する方法であって、ａ）抗ｈＴＫ－１抗体／ｈＴＫ－１複合体の形成に十分な時間および条件の下で試料を本開示による抗ｈＴＫ－１抗体と接触させるステップと；ｂ）抗ｈＴＫ－１抗体／ｈＴＫ－１複合体を測定するステップとを含む方法に関し、その複合体の量は、試料中のｈＴＫ－１の濃度を示す。例えば「抗ｈＴＫ－１抗体／ｈＴＫ－１複合体」における用語「／」は、一方には
抗ｈＴＫ－１抗体と他方にはｈＴＫ－１の間で非共有結合性の複合体が形成されることを示すために使用される。
【0080】
一実施形態では、本発明は、試料中のｈＴＫ－１を検出する方法であって、ａ）ｈＴＫ－１に対する第１の抗体およびｈＴＫ－１に対する第２の抗体と試料を、第１の抗ｈＴＫ－１抗体／ｈＴＫ－１／第２の抗ｈＴＫ－１抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件の下で接触させるステップであって、第２の抗体は検出可能的に標識されているステップと；ｂ）（ａ）で形成される複合体を測定するステップとを含む方法に関し、その複合体の量は、試料中のｈＴＫ－１の濃度を示し、第１または第２の抗体は、本発明による抗体である。
【0081】
当業者にとって明らかなように、試料は、第１および第２の抗体と任意の所望の順序で、すなわち、最初に第１の抗体、第２の抗体；第１の抗体より最初に第２の抗体と、または同時に、第１の抗ｈＴＫ－１抗体／ｈＴＫ－１／第２の抗ｈＴＫ－１抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件の下で接触させることができる。
【0082】
当業者が容易に理解するように、特異的抗ｈＴＫ－１抗体とｈＴＫ－１抗原／分析物の間の複合体（＝抗ｈＴＫ－１抗体／ｈＴＫ－１複合体）の形成、または、ｈＴＫ－１に対する第１の抗体、ｈＴＫ－１（分析物）および第２の抗ｈＴＫ－１抗体複合体（＝第１の抗ｈＴＫ－１抗体／ｈＴＫ－１／第２の抗ｈＴＫ－１抗体複合体）を含む二次性もしくはサンドイッチ複合体の形成に適当または十分である時間および条件を確立することは、ルーチンの実験にすぎない。
【0083】
抗ｈＴＫ－１抗体／ｈＴＫ－１複合体の検出は、任意の適当な手段によって実行することができる。当業者は、そのような手段／方法に断然精通している。
「試料」または「目的の試料」または「試験試料」という用語は、本明細書において互換的に使用される。試料はｉｎ ｖｉｔｒｏ試料であり、それはｉｎ ｖｉｔｒｏで分析され、体内に戻されない。試料の例には、液体試料、例えば、血液、血清、血漿、滑液、尿、唾液およびリンパ液、または固体試料、例えば組織抽出物、軟骨、骨、関節滑膜および結合組織が限定されずに含まれる。一実施形態では、試料は、血液、血清、血漿、滑液および尿から選択される。一実施形態では、試料は、血液、血清および血漿から選択される。一実施形態では、試料は、血清または血漿である。
「試料」または「目的の試料」または「試験試料」という用語は、本明細書において互換的に使用される。試料はｉｎ ｖｉｔｒｏ試料であり、それはｉｎ ｖｉｔｒｏで分析され、体内に戻されない。試料の例には、液体試料、例えば、血液、血清、血漿、滑液、尿、唾液およびリンパ液、または固体試料、例えば組織抽出物、軟骨、骨、関節滑膜および結合組織が限定されずに含まれる。一実施形態では、試料は、血液、血清、血漿、滑液および尿から選択される。一実施形態では、試料は、血液、血清および血漿から選択される。一実施形態では、試料は、血清または血漿である。
【0084】
本明細書で使用される用語「参照試料」は、目的の試料と実質的に同一の方法で分析され、その情報が目的の試料のそれと比較される試料を指す。参照試料はそれによって、目的の試料から得た情報の評価を可能にする標準を提供する。参照試料は健康または正常な組織、臓器または個体から誘導し、それによって組織、臓器または個体の健康な状態の標準を提供することができる。正常な参照試料の状態と目的の試料の状態の間の差は、疾患の発症のリスクまたはそのような疾患もしくは障害の存在もしくはさらなる進行を示すことができる。参照試料は異常なまたは病的な組織、臓器または個体から誘導し、それによって組織、臓器または個体の病的な状態の標準を提供することができる。異常な参照試料の状態と目的の試料の状態の間の差は、疾患の発症のリスクの低下またはそのような疾患もしくは障害の非存在もしくは改善を示すことができる。
【0085】
指標の「上昇した」または「増加した」レベルという用語は、試料中のそのような指標のレベルが、参照または参照試料中のそのような指標のレベルと比較してより高いことを指す。例えば、所与の疾患を患っている一個体の液体試料において、前記疾患を患っていない個体の同じ液体試料におけるより高い量で検出可能であるタンパク質は、上昇レベルを有する。
【0086】
ある特定の実施形態では、ｈＴＫ－１に対する第１の抗体、ｈＴＫ－１（分析物）およびｈＴＫ－１に対する第２の抗体を含んでいるサンドイッチが形成され、第２の抗体は検出可能的に標識されている。
【0087】
一実施形態では、ｈＴＫ－１に対する第１の抗体、ｈＴＫ－１（分析物）およびｈＴＫ－１に対する第２の抗体を含んでいるサンドイッチが形成され、第２の抗体は検出可能的に標識されており、第１の抗ｈＴＫ－１抗体は、固相に結合することが可能であるか固相に結合している。
【0088】
一実施形態では、本発明において開示される抗ｈＴＫ－１抗体は、ｈＴＫ－１を測定するためのイムノアッセイで使用される。一実施形態では、本明細書において上で開示される抗ｈＴＫ－１抗体は、サンドイッチタイプのイムノアッセイにおいて使用される。一実施形態では、本発明において開示される抗ｈＴＫ－１抗体は、検出抗体として使用される。一実施形態では、本明細書において開示される抗ｈＴＫ－１抗体は、発光色素、特に化学発光色素または電気化学発光色素で検出可能的に標識されている。
【0089】
これらおよび他の実施形態は、本発明の記載および実施例によって開示され、包含される。本発明によって用いられる方法、使用および化合物のいずれか１つに関するさらなる文献は、例えば電子装置を使用して公開ライブラリーおよびデータベースから検索することができる。例えば、インターネットで利用可能な公開データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」は、例えばｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌからのワールドワイドウェブにおいて利用することができる。ワールドワイドウェブにおいて利用可能なさらなるデータベースおよびアドレス、例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／、ｆｍｉ．ｃｈ／ｂｉｏｌｏｇｙ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／、またはｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎ．ｆｒ／が当業者に公知であり、ｌｙｃｏｓ．ｃｏｍからのワールドワイドウェブのアドレスを使用して得ることもできる。
【0090】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、この発明が属する分野の当業技術者が通常理解するのと同じ意味を有する。相反する場合には、定義を含めた本発明の明細書が優先される。
【0091】
本明細書で提供される全てのアミノ酸配列は、当技術分野で慣例上実行されるように、最もＮ末端の残基から開始して最もＣ末端の残基で終了して提示され（Ｎ→Ｃ）、本発明全体でアミノ酸を識別するために使用される一文字または３文字コードの略記号は、アミノ酸のために一般的に使用されるそれらに対応する。
【0092】
この明細書、特に請求項において特徴付けられる実施形態に関して、従属項で指摘される各実施形態は、前記従属項が従属する各請求項（独立または従属）の各実施形態と組み合わせられることが意図されている。例えば、３つの代替物Ａ、ＢおよびＣを列挙する独立項１、３つの代替物Ｄ、ＥおよびＦを列挙する従属項２、ならびに請求項１および２に従属し、３つの代替物Ｇ、ＨおよびＩを列挙する請求項３の場合には、明細書は、特に別途指摘されない限り、組合せＡ、Ｄ、Ｇ；Ａ、Ｄ、Ｈ；Ａ、Ｄ、Ｉ；Ａ、Ｅ、Ｇ；Ａ、Ｅ、Ｈ；Ａ、Ｅ、Ｉ；Ａ、Ｆ、Ｇ；Ａ、Ｆ、Ｈ；Ａ、Ｆ、Ｉ；Ｂ、Ｄ、Ｇ；Ｂ、Ｄ、Ｈ；Ｂ、Ｄ、Ｉ；Ｂ、Ｅ、Ｇ；Ｂ、Ｅ、Ｈ；Ｂ、Ｅ、Ｉ；Ｂ、Ｆ、Ｇ；Ｂ、Ｆ、Ｈ；Ｂ、Ｆ、Ｉ；Ｃ、Ｄ、Ｇ；Ｃ、Ｄ、Ｈ；Ｃ、Ｄ、Ｉ；Ｃ、Ｅ、Ｇ；Ｃ、Ｅ、Ｈ；Ｃ、Ｅ、Ｉ；Ｃ、Ｆ、Ｇ；Ｃ、Ｆ、Ｈ；Ｃ、Ｆ、Ｉ、に対応する実施形態を明白に開示することを理解すべきである。
【0093】
同様に、さらに独立および／または従属項が代替物を列挙しない場合には、従属項が複
数の先行請求項を参照する場合、それによって包含される主題の任意の組合せが明示的に開示されると考えられるものと理解される。例えば、独立項１、請求項１を参照する従属項２、ならびに請求項２および１の両方を参照する従属項３の場合には、請求項３、２および１の主題の組合せがそうであるように、請求項３および１の主題の組合せが明らかに、および明白に開示されることになる。請求項１～３のいずれか一項を参照するさらなる従属項４が存在する場合は、請求項４および１、請求項４、２および１、請求項４、３および１、ならびに請求項４、３、２および１の主題の組合せが明らかに、および明白に開示されることになる。
数の先行請求項を参照する場合、それによって包含される主題の任意の組合せが明示的に開示されると考えられるものと理解される。例えば、独立項１、請求項１を参照する従属項２、ならびに請求項２および１の両方を参照する従属項３の場合には、請求項３、２および１の主題の組合せがそうであるように、請求項３および１の主題の組合せが明らかに、および明白に開示されることになる。請求項１～３のいずれか一項を参照するさらなる従属項４が存在する場合は、請求項４および１、請求項４、２および１、請求項４、３および１、ならびに請求項４、３、２および１の主題の組合せが明らかに、および明白に開示されることになる。
【0094】
上記の考慮事項は、全ての添付の請求項に準用される。非限定的な例を挙げると、請求項の構造に照らして、請求項８、５および１の組合せは、明らかにおよび明白に想定される。例えば請求項８、７および２の組合せなども、同様とする。
【0095】
本発明のある特定の態様は、添付図面でも例示される。
【図面の簡単な説明】
【0096】
【図1】ｈＴＫ－１エピトープアクセス性を判定するために使用したＢｉａｃｏｒｅアッセイ構成の概略図である。様々なインキュベーションステップの順序が表される。
【図2】プロトタイプＡ）（＝図２ａ）およびプロトタイプＢ）（＝図２ｂ）でそれぞれ得た、イムノアッセイデータのグラフ表示である。図２ａおよび図２ｂそれぞれの左側部分には、ボックス－ウィスカープロット（ボックスプロット）が与えられる。ｙ軸（ｌｏｇスケール）には、ｎｇ／ｍｌの濃度が示される。両方の図の右側部分には、曲線下面積（ＡＵＣ）が示される。（略記号：Ｃｔｒ＝対照試料；ＤＬＢＣＬ＝散在性の大きなＢ細胞リンパ腫患者からの試料）。
【図3】ＬＩＡＩＳＯＮ（登録商標）チミジンキナーゼ（活性）アッセイデータのグラフ表示である。図３の左側部分には、ボックス－ウィスカープロット（ボックスプロット）がｙ軸（ｌｏｇスケール）に１ｍｌあたりの単位で与えられる。この図の右側部分には、曲線下面積（ＡＵＣ）が示される。（略記号：Ｃｔｒ＝対照試料；ＤＬＢＣＬ＝散在性の大きなＢ細胞リンパ腫患者からの試料）。
【0097】
以下の実施例は、本発明を例示する：
【実施例0098】
実施例１
材料および一般的な方法
組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９年、に記載の通りにＤＮＡを人為操作するために、標準の方法を使用した。分子生物学的試薬は、製造業者の指示に従って使用した。
材料および一般的な方法
組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９年、に記載の通りにＤＮＡを人為操作するために、標準の方法を使用した。分子生物学的試薬は、製造業者の指示に従って使用した。
【0099】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ（Ｂａｌｇａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で実行された二本鎖シークエンシングによって決定された。
ＤＮＡ配列は、Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ（Ｂａｌｇａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で実行された二本鎖シークエンシングによって決定された。
【0100】
ＤＮＡおよびタンパク質の配列分析および配列データ管理
配列の生成、マッピング、分析、アノテーションおよび図示のために、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴ１ Ａｄｖａｎｃｅスイートバージョン１１．５．０を使用した。
配列の生成、マッピング、分析、アノテーションおよび図示のために、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴ１ Ａｄｖａｎｃｅスイートバージョン１１．５．０を使用した。
【0101】
タンパク質化学および標識化技術
標準のタンパク質化学および標識化技術は、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｇ．「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」第３版（２０１３年）Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓに提供されている。
標準のタンパク質化学および標識化技術は、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｇ．「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」第３版（２０１３年）Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓに提供されている。
【0102】
生命情報科学
生命情報科学的方法は、例えば、Ｋｅｉｔｈ Ｊ．Ｍ．（編）「Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ」第Ｉ巻および第ＩＩ巻、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ第１５２５巻および第１５２６巻（２０１７年）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、および、Ｍａｒｔｉｎ、Ａ．Ｃ．Ｒ．およびＡｌｌｅｎ、Ｊ．「Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」：Ｄｕｂｅｌ Ｓ．およびＲｅｉｃｈｅｒｔ Ｊ．Ｍ．（編）「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ（２０１４年）に提供されている。
生命情報科学的方法は、例えば、Ｋｅｉｔｈ Ｊ．Ｍ．（編）「Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ」第Ｉ巻および第ＩＩ巻、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ第１５２５巻および第１５２６巻（２０１７年）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、および、Ｍａｒｔｉｎ、Ａ．Ｃ．Ｒ．およびＡｌｌｅｎ、Ｊ．「Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」：Ｄｕｂｅｌ Ｓ．およびＲｅｉｃｈｅｒｔ Ｊ．Ｍ．（編）「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ（２０１４年）に提供されている。
【0103】
電気化学発光イムノアッセイ
イムノアッセイおよび関連方法は、例えば、Ｗｉｌｄ Ｄ．（編）「Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」第４版（２０１３年）Ｅｌｓｅｖｉｅｒに提供されている。電気化学発光標識としてのルテニウム錯体は、例えば、Ｓｔａｆｆｉｌａｎｉ Ｍ．ら、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４２（２００３年）７７８９～７７９８頁に提供されている。一般的に、電気化学発光（ＥＣＬ）ベースのイムノアッセイの実行のために、Ｅｌｅｃｓｙｓ ２０１０アナライザーまたは後継システム、例えば、Ｒｏｃｈｅアナライザー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｇｅｒｍａｎｙ）、例えば、Ｅ１７０、ｃｏｂａｓ ｅ ６０１モジュール、ｃｏｂａｓ ｅ ６０２モジュール、ｃｏｂａｓ ｅ ８０１モジュールおよびｃｏｂａｓ ｅ ４１１、ならびにこれらのアナライザーのために設計されたＲｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓアッセイを使用し、各々は、別途示されなければ、標準の条件下で使用された。
イムノアッセイおよび関連方法は、例えば、Ｗｉｌｄ Ｄ．（編）「Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」第４版（２０１３年）Ｅｌｓｅｖｉｅｒに提供されている。電気化学発光標識としてのルテニウム錯体は、例えば、Ｓｔａｆｆｉｌａｎｉ Ｍ．ら、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４２（２００３年）７７８９～７７９８頁に提供されている。一般的に、電気化学発光（ＥＣＬ）ベースのイムノアッセイの実行のために、Ｅｌｅｃｓｙｓ ２０１０アナライザーまたは後継システム、例えば、Ｒｏｃｈｅアナライザー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｇｅｒｍａｎｙ）、例えば、Ｅ１７０、ｃｏｂａｓ ｅ ６０１モジュール、ｃｏｂａｓ ｅ ６０２モジュール、ｃｏｂａｓ ｅ ８０１モジュールおよびｃｏｂａｓ ｅ ４１１、ならびにこれらのアナライザーのために設計されたＲｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓアッセイを使用し、各々は、別途示されなければ、標準の条件下で使用された。
【0104】
実施例２
抗ｈＴＫ－１抗体の生成
標準のプロトコールによってマウスにおいて抗ｈＴＫ－１モノクローナル抗体を生成するために、先ず多くの試みがなされた。これらの実験では、様々な免疫原（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて産生された組換えｈＴＫ－１；ＨＥＫ細胞において作製された組換えｈＴＫ－１；いくつかのペプチド免疫原）が使用された。非常に少数のモノクローナル抗体だけがこの方法で得られ、これらの初期の実験で得られた抗体のいずれも、ヒト血清試料に含まれるＴＫ－１への優れた結合性を示さなかった。
抗ｈＴＫ１抗体の生成のための最終的に成功した試みでは、実験動物としてウサギが使用された。
抗ｈＴＫ－１抗体の生成
標準のプロトコールによってマウスにおいて抗ｈＴＫ－１モノクローナル抗体を生成するために、先ず多くの試みがなされた。これらの実験では、様々な免疫原（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて産生された組換えｈＴＫ－１；ＨＥＫ細胞において作製された組換えｈＴＫ－１；いくつかのペプチド免疫原）が使用された。非常に少数のモノクローナル抗体だけがこの方法で得られ、これらの初期の実験で得られた抗体のいずれも、ヒト血清試料に含まれるＴＫ－１への優れた結合性を示さなかった。
抗ｈＴＫ１抗体の生成のための最終的に成功した試みでは、実験動物としてウサギが使用された。
【0105】
免疫化：
ヒトチミジンキナーゼ（ｈＴＫ１）に対する抗体の生成のために、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するｒｅｃ ｈＴＫ１またはＨＥＫ２９３細胞に由来するｒｅｃ天然ｈＴＫ１によってウ
サギを免疫化した。全てのウサギは、反復免疫化を受けた。１カ月目には、動物を毎週免疫化した。２カ月目からは、動物を１カ月に１回免疫化した。最初の免疫化については、５００μｇのｒｅｃ ｈＴＫ１（Ｅ．ｃｏｌｉまたはＨＥＫ２９３）を１ｍＬの０．９（ｗ／ｖ）％ＮａＣｌに溶解し、３．５ｍｌのＣＦＡに乳化させ、以降の全ての免疫化については、１．７５ｍＬのＩＦＡをＣＦＡの代わりに使用した。力価の発達は、免疫化の開始から４５日目および１０５日目に評価した。免疫原に対する力価がＥＬＩＳＡによって検出可能なとき、下記のようにＢ細胞クローニングによって抗体が得られた。完全長ウサギＩｇＧの生成のために、組換えＩｇＧクローニングプロセスから誘導された重鎖および軽鎖コードプラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞の一時的なトランスフェクションのために使用した。
ヒトチミジンキナーゼ（ｈＴＫ１）に対する抗体の生成のために、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するｒｅｃ ｈＴＫ１またはＨＥＫ２９３細胞に由来するｒｅｃ天然ｈＴＫ１によってウ
サギを免疫化した。全てのウサギは、反復免疫化を受けた。１カ月目には、動物を毎週免疫化した。２カ月目からは、動物を１カ月に１回免疫化した。最初の免疫化については、５００μｇのｒｅｃ ｈＴＫ１（Ｅ．ｃｏｌｉまたはＨＥＫ２９３）を１ｍＬの０．９（ｗ／ｖ）％ＮａＣｌに溶解し、３．５ｍｌのＣＦＡに乳化させ、以降の全ての免疫化については、１．７５ｍＬのＩＦＡをＣＦＡの代わりに使用した。力価の発達は、免疫化の開始から４５日目および１０５日目に評価した。免疫原に対する力価がＥＬＩＳＡによって検出可能なとき、下記のようにＢ細胞クローニングによって抗体が得られた。完全長ウサギＩｇＧの生成のために、組換えＩｇＧクローニングプロセスから誘導された重鎖および軽鎖コードプラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞の一時的なトランスフェクションのために使用した。
【0106】
Ｂ細胞ＰＣＲ技術によるｈＴＫ１に対するモノクローナル抗体の発達および発現：
組換えヒトチミジンキナーゼ（ｈＴＫ１）に対する抗体は、Ｓｅｅｂｅｒら（２０１４年）、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４、９（２）によるＢ細胞ＰＣＲ方法を使用して得られた。単細胞沈着のためのＰＢＭＣおよびＢ細胞は、異なる時点で免疫化ウサギから取り出された末梢血から調製された。個々のｈＴＫ１ウサギ抗体は、最終的にＨＥＫ２９３細胞において組換えで発現された。完全長ウサギ抗ｈＴＫ１ ＩｇＧの生成のために、組換えＩｇＧクローニングプロセスから誘導された重鎖および軽鎖コードプラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞の一時的なトランスフェクションのために使用した。ＨＥＫ２９３細胞は、８％ＣＯ２を含有する大気中の３７℃で、Ｆ１７培地（Ｇｉｂｃｏ）の中で１２５ｒｐｍの振盪装置の中で成長させた。トランスフェクションの前日に細胞を分割し、０．７～０．８×１０６細胞／ｍｌの密度で播種した。トランスフェクションの当日、４８ウェルのディープウェルプレートにおいて、２ｍｌの容積中の１～１．５×１０６個のＨＥＫ２９３細胞を、１ｍｌのＰＥＩｐｒｏトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ－トランスフェクション）を補充した、８０ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭＨ培地（Ｇｉｂｃｏ）に懸濁させた、０．５ｍｇの重鎖プラスミドプラス０．５ｍｇの軽鎖プラスミドでトランスフェクトした。３７℃および８％ＣＯ２において、１８０ｒｐｍで７日間培養をインキュベートした。インキュベーションの７日後に、培養上清を採収し、抗体含有量および特異性について分析した。
組換えヒトチミジンキナーゼ（ｈＴＫ１）に対する抗体は、Ｓｅｅｂｅｒら（２０１４年）、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４、９（２）によるＢ細胞ＰＣＲ方法を使用して得られた。単細胞沈着のためのＰＢＭＣおよびＢ細胞は、異なる時点で免疫化ウサギから取り出された末梢血から調製された。個々のｈＴＫ１ウサギ抗体は、最終的にＨＥＫ２９３細胞において組換えで発現された。完全長ウサギ抗ｈＴＫ１ ＩｇＧの生成のために、組換えＩｇＧクローニングプロセスから誘導された重鎖および軽鎖コードプラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞の一時的なトランスフェクションのために使用した。ＨＥＫ２９３細胞は、８％ＣＯ２を含有する大気中の３７℃で、Ｆ１７培地（Ｇｉｂｃｏ）の中で１２５ｒｐｍの振盪装置の中で成長させた。トランスフェクションの前日に細胞を分割し、０．７～０．８×１０６細胞／ｍｌの密度で播種した。トランスフェクションの当日、４８ウェルのディープウェルプレートにおいて、２ｍｌの容積中の１～１．５×１０６個のＨＥＫ２９３細胞を、１ｍｌのＰＥＩｐｒｏトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ－トランスフェクション）を補充した、８０ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭＨ培地（Ｇｉｂｃｏ）に懸濁させた、０．５ｍｇの重鎖プラスミドプラス０．５ｍｇの軽鎖プラスミドでトランスフェクトした。３７℃および８％ＣＯ２において、１８０ｒｐｍで７日間培養をインキュベートした。インキュベーションの７日後に、培養上清を採収し、抗体含有量および特異性について分析した。
【0107】
抗ｈＴＫ－１結合性のための組換え抗体の初期試験：
ｈＴＫ－１への結合性は、ＥＬＩＳＡフォーマットで最初に試験した。この目的で、組換え天然ｈＴＫ１（ＨＥＫ２９３に由来する）のビオチン化バリアントを、ストレプトアビジンでプレコートした９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）のウェルに含まれるストレプトアビジンに結合した。ビオチン化タンパク質は、２５０ｎｇ／ｍＬのビオチン化ｈＴＫ－１の濃度でＭＴＰ ５０μｌのウェルの中で固定化した。各抗体のトランスフェクション上清の３０μｌをＭＴＰのウェルに加え、室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、結合した抗体は、ＨＲＰ標識Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ウサギＦｃγ断片（Ｄｉａｎｏｖａ）および基質としてＡＢＴＳ（Ｒｏｃｈｅ）で検出した。
ｈＴＫ－１への結合性は、ＥＬＩＳＡフォーマットで最初に試験した。この目的で、組換え天然ｈＴＫ１（ＨＥＫ２９３に由来する）のビオチン化バリアントを、ストレプトアビジンでプレコートした９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）のウェルに含まれるストレプトアビジンに結合した。ビオチン化タンパク質は、２５０ｎｇ／ｍＬのビオチン化ｈＴＫ－１の濃度でＭＴＰ ５０μｌのウェルの中で固定化した。各抗体のトランスフェクション上清の３０μｌをＭＴＰのウェルに加え、室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、結合した抗体は、ＨＲＰ標識Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ウサギＦｃγ断片（Ｄｉａｎｏｖａ）および基質としてＡＢＴＳ（Ｒｏｃｈｅ）で検出した。
【0108】
このように、４Ｈ４；４Ｈ１１、６Ｃ６および２３Ｃ１１とそれぞれ命名した４つの組換えウサギ抗体が得られた。
全ての組換えウサギ抗体について、可変軽鎖ならびに重鎖の結合関連部分（すなわち、３つのＣＤＲ、フレームワーク領域および定常領域１の部分を含む可変重鎖）の配列を、標準手順によって判定した。
全ての組換えウサギ抗体について、可変軽鎖ならびに重鎖の結合関連部分（すなわち、３つのＣＤＲ、フレームワーク領域および定常領域１の部分を含む可変重鎖）の配列を、標準手順によって判定した。
【0109】
ｈＴＫ１、Ｋｌｏｎ ６Ｃ６、重鎖：（配列番号３）
ＭＥＴＧＬＲＷＬＬＬＶＡＶＬＫＧＶＱＣＱＥＱＬＥＥＳＧＧＤＬＶＫＰＥＧＳＬＴＬＴＣＴＡＳＲＦＳＦＳＳＳＹＷＩＣＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＡＣＩＹＡＧＤＳＧＳＳＹＹＡＳＷＡＫＧＲＦＴＶＳＫＴＳＳＴＴＶＴＬＱＴＴＳＬＴＡＡＤＴＡＴＹＦＣＡＲＡＳ
ＶＧＡＡＹＤＹＦＡＬＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧ
ｈＴＫ１、Ｋｌｏｎ ６Ｃ６、軽鎖：（配列番号４）
ＭＤＴＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣＡＬＶＭＴＱＴＰＡＳＶＥＡＡＭＧＧＴＶＴＩＫＣＱＡＳＥＤＶＳＳＨＬＡＷＹＱＱＲＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＧＡＳＤＬＡＳＧＶＰＳＲＦＴＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＡＩＳＤＬＥＣＡＤＡＡＴＹＹＣＱＧＹＹＹＩＳＤＳＰＹＶＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫＧＤＰＶＡＰＴＶＬＩＦＰＰＡＡＤＱＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＮＲＧＤＣ
ｈＴＫ１、Ｋｌｏｎ ４Ｈ４、重鎖：（配列番号７）
ＭＥＴＧＬＲＷＬＬＬＶＡＶＬＫＧＶＱＣＱＳＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＰＥＧＳＬＴＬＴＣＴＡＳＧＦＳＦＳＳＧＹＤＭＣＷＶＲＱＴＰＧＫＧＬＥＷＩＡＣＩＳＶＤＳＤＧＶＴＹＹＡＳＷＡＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＳＴＴＶＴＬＱＭＴＳＬＴＡＡＤＴＡＴＹＦＣＡＲＧＹＥＳＳＳＧＶＹＩＰＹＦＴＬＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧ
ｈＴＫ１、Ｋｌｏｎ ４Ｈ４、軽鎖：（配列番号８）
ＭＤＭＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣＡＤＩＶＬＴＱＴＰＡＳＶＥＡＡＶＧＧＴＶＴＩＫＣＱＡＳＱＳＩＹＳＹＬＡＷＹＱＨＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＫＡＳＴＬＡＳＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＥＹＴＬＴＩＳＤＬＥＣＡＤＡＡＴＹＹＣＱＨＹＹＹＳＳＴＳＧＧＧＶＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫＧＤＰＶＡＰＴＶＬＩＦＰＰＡＡＤＱＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＮＲＧＤＣ
ｈＴＫ１、Ｋｌｏｎ ２３Ｃ１１、重鎖：（配列番号９）
ＭＥＴＧＬＲＷＬＬＬＶＡＶＬＫＧＶＱＣＱＳＬＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＡＳＧＦＳＬＳＮＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＩＩＹＧＤＤＮＴＹＣＡＮＷＴＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＴＴＶＤＬＴＩＴＳＰＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＧＰＤＹＩＡＡＫＭＤＩＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＬＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧ
ｈＴＫ１、Ｋｌｏｎ ２３Ｃ１１、軽鎖：（配列番号１０）
ＭＤＴＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣＤＶＶＭＴＱＴＰＡＳＶＥＡＡＶＧＧＴＶＴＩＫＣＱＡＳＱＳＩＳＧＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＱＲＰＫＬＬＩＹＲＡＳＴＬＥＳＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＤＬＥＣＡＤＡＡＴＹＹＣＱＣＴＹＧＳＳＴＦＳＳＹＧＮＡＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫＧＤＰＶＡＰＴＶＬＩＦＰＰＡＡＤＱＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＮＲＧＤＣ
明らかなように、完全長免疫グロブリンまたはその任意の結合性断片は、所望／必要な場合、上に開示される配列に基づいていかなる当業者も容易に解釈することができる。
ＭＥＴＧＬＲＷＬＬＬＶＡＶＬＫＧＶＱＣＱＥＱＬＥＥＳＧＧＤＬＶＫＰＥＧＳＬＴＬＴＣＴＡＳＲＦＳＦＳＳＳＹＷＩＣＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＡＣＩＹＡＧＤＳＧＳＳＹＹＡＳＷＡＫＧＲＦＴＶＳＫＴＳＳＴＴＶＴＬＱＴＴＳＬＴＡＡＤＴＡＴＹＦＣＡＲＡＳ
ＶＧＡＡＹＤＹＦＡＬＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧ
ｈＴＫ１、Ｋｌｏｎ ６Ｃ６、軽鎖：（配列番号４）
ＭＤＴＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣＡＬＶＭＴＱＴＰＡＳＶＥＡＡＭＧＧＴＶＴＩＫＣＱＡＳＥＤＶＳＳＨＬＡＷＹＱＱＲＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＧＡＳＤＬＡＳＧＶＰＳＲＦＴＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＡＩＳＤＬＥＣＡＤＡＡＴＹＹＣＱＧＹＹＹＩＳＤＳＰＹＶＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫＧＤＰＶＡＰＴＶＬＩＦＰＰＡＡＤＱＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＮＲＧＤＣ
ｈＴＫ１、Ｋｌｏｎ ４Ｈ４、重鎖：（配列番号７）
ＭＥＴＧＬＲＷＬＬＬＶＡＶＬＫＧＶＱＣＱＳＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＰＥＧＳＬＴＬＴＣＴＡＳＧＦＳＦＳＳＧＹＤＭＣＷＶＲＱＴＰＧＫＧＬＥＷＩＡＣＩＳＶＤＳＤＧＶＴＹＹＡＳＷＡＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＳＴＴＶＴＬＱＭＴＳＬＴＡＡＤＴＡＴＹＦＣＡＲＧＹＥＳＳＳＧＶＹＩＰＹＦＴＬＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧ
ｈＴＫ１、Ｋｌｏｎ ４Ｈ４、軽鎖：（配列番号８）
ＭＤＭＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣＡＤＩＶＬＴＱＴＰＡＳＶＥＡＡＶＧＧＴＶＴＩＫＣＱＡＳＱＳＩＹＳＹＬＡＷＹＱＨＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＫＡＳＴＬＡＳＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＥＹＴＬＴＩＳＤＬＥＣＡＤＡＡＴＹＹＣＱＨＹＹＹＳＳＴＳＧＧＧＶＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫＧＤＰＶＡＰＴＶＬＩＦＰＰＡＡＤＱＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＮＲＧＤＣ
ｈＴＫ１、Ｋｌｏｎ ２３Ｃ１１、重鎖：（配列番号９）
ＭＥＴＧＬＲＷＬＬＬＶＡＶＬＫＧＶＱＣＱＳＬＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＡＳＧＦＳＬＳＮＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＩＩＹＧＤＤＮＴＹＣＡＮＷＴＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＴＴＶＤＬＴＩＴＳＰＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＧＰＤＹＩＡＡＫＭＤＩＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＬＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧ
ｈＴＫ１、Ｋｌｏｎ ２３Ｃ１１、軽鎖：（配列番号１０）
ＭＤＴＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣＤＶＶＭＴＱＴＰＡＳＶＥＡＡＶＧＧＴＶＴＩＫＣＱＡＳＱＳＩＳＧＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＱＲＰＫＬＬＩＹＲＡＳＴＬＥＳＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＤＬＥＣＡＤＡＡＴＹＹＣＱＣＴＹＧＳＳＴＦＳＳＹＧＮＡＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫＧＤＰＶＡＰＴＶＬＩＦＰＰＡＡＤＱＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＮＲＧＤＣ
明らかなように、完全長免疫グロブリンまたはその任意の結合性断片は、所望／必要な場合、上に開示される配列に基づいていかなる当業者も容易に解釈することができる。
【0110】
実施例３：エピトープ特徴付け
実施例２に記載の通りに、それらがイムノアッセイの開発において有用であるために必要な要求された結合特性を示す、４つの異なるモノクローナル抗体を生成することができた。
実施例２に記載の通りに、それらがイムノアッセイの開発において有用であるために必要な要求された結合特性を示す、４つの異なるモノクローナル抗体を生成することができた。
【0111】
新たに生成された抗体に結合するエピトープを特徴付ける第１の試みでは、ＰｅｐＳｃａｎ分析を実行した。この分析のために、各々１５アミノ酸からなり、各々１アミノ酸ずれており（１～１５：２～１６など）、ｈＴＫ－１の全配列（配列番号１）にわたる合成ペプチドを合成した。これらのＰｅｐＳｃａｎペプチドを、顕微鏡スライドの上へスポットした。非特異的結合のためのブロッキングの後、様々なＭＡＢの細胞培養上清を、顕微鏡スライドの上でインキュベートした。未結合のＭＡＢを洗い落とし、結合したＭＡＢは、ルーチンの方法によるＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧの使用によって検出した。
【0112】
実施例２の方法によって得られた４つのＭＡＢのうちの１つだけ（抗体４Ｈ１１）が、線状エピトープと反応した。示すことができるように、この抗体が結合するエピトープは、ｈＴＫ－１のアミノ酸残基２１１～２３０にわたる配列（配列番号６）に含まれる。
【0113】
ｈＴＫ－１のアミノ酸１９４～２２５からなるポリペプチド（配列番号２）に対応する合成ペプチドと反応するポリクローナルならびにモノクローナル抗体は、従来技術で公知である、例えばＷＯ２０１５／０９４１０６を参照。３つのＭＡＢ、４Ｈ４、６Ｃ６および２３Ｃ１１のそれぞれは、ｈＴＫ－１のアミノ酸１９４～２２５からなるポリペプチド（配列番号２）に結合もせず、試験したＰｅｐＳｃａｎペプチドのいずれへの有意な結合も示さなかった。これは、これらの３つのＭＡＢが全てｈＴＫ－１の上の高次構造依存性エピトープに結合することを示す。これらの３つのＭＡＢが最初からさらなるアッセイの開発のためにかなり有望に見えたので、これらの３つのＭＡＢが結合したエピトープに関するより多くの知識を獲得するためにさらに努力した。
【0114】
競合実験によるエピトープ特徴付けは、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉａｃｏｒｅ
４０００機器により２５℃で実行した。Ｂｉａｃｏｒｅビオチン捕捉キット、シリーズＳセンサー（カタログ番号２８－９２０２－３４）を機器に取り付け、製造業者の説明書により流体力学的にアドレスし、事前調整した。システム緩衝液は、ＨＢＳ－Ｎ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）であった。試料緩衝液は、システム緩衝液であった。製造業者ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって提供されたビオチン捕捉試薬はシステム緩衝液で１：５０に希釈し、スポット１、２および４、５にアドレスするためにフローセル１、２、３および４の上に１０μｌ／分で６０秒間注入した。スポット３は、参照の役目をした。４つ全てのフローセルのスポット１および５にアドレスするために、１０ｎＭのビオチン化一次抗体を３０μｌ／分で１２０秒の接触時間注入した。スポット２および４は、対照の役目をした。スポット１、２および４、５にアドレスするために、１０ｎＭのヒト組換えチミジンキナーゼ－１（ｈＴＫ－１、Ｒｏｃｈｅ、１１４ｋＤａ、四量体）を、全てのフローセルに３０μｌ／分で１８０秒の接触時間注入した。一次抗体の残りのアクセス可能なエピトープをブロックするために、全てのフローセルの上のスポット１、２および４、５にアドレスするために、１００ｎＭの非ビオチン化一次抗体を３０μｌ／分で１８０秒の接触時間再び注入した。スポット１、２および４、５にアドレスするために、１００ｎＭの二次抗体を全てのフローセルに３０μｌ／分で１８０秒の接触時間注入した。最終的に、製造業者ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって提供された再生溶液を使用した、全てのフローセルおよび全てのスポットの上での１２０秒の接触時間の再生ステップによって、センサー表面に形成された複合体を完全に除去した。
４０００機器により２５℃で実行した。Ｂｉａｃｏｒｅビオチン捕捉キット、シリーズＳセンサー（カタログ番号２８－９２０２－３４）を機器に取り付け、製造業者の説明書により流体力学的にアドレスし、事前調整した。システム緩衝液は、ＨＢＳ－Ｎ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）であった。試料緩衝液は、システム緩衝液であった。製造業者ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって提供されたビオチン捕捉試薬はシステム緩衝液で１：５０に希釈し、スポット１、２および４、５にアドレスするためにフローセル１、２、３および４の上に１０μｌ／分で６０秒間注入した。スポット３は、参照の役目をした。４つ全てのフローセルのスポット１および５にアドレスするために、１０ｎＭのビオチン化一次抗体を３０μｌ／分で１２０秒の接触時間注入した。スポット２および４は、対照の役目をした。スポット１、２および４、５にアドレスするために、１０ｎＭのヒト組換えチミジンキナーゼ－１（ｈＴＫ－１、Ｒｏｃｈｅ、１１４ｋＤａ、四量体）を、全てのフローセルに３０μｌ／分で１８０秒の接触時間注入した。一次抗体の残りのアクセス可能なエピトープをブロックするために、全てのフローセルの上のスポット１、２および４、５にアドレスするために、１００ｎＭの非ビオチン化一次抗体を３０μｌ／分で１８０秒の接触時間再び注入した。スポット１、２および４、５にアドレスするために、１００ｎＭの二次抗体を全てのフローセルに３０μｌ／分で１８０秒の接触時間注入した。最終的に、製造業者ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって提供された再生溶液を使用した、全てのフローセルおよび全てのスポットの上での１２０秒の接触時間の再生ステップによって、センサー表面に形成された複合体を完全に除去した。
【0115】
このように、４つの組換えモノクローナルウサギＩｇＧ抗体を、それらのｈＴＫ－１エピトープアクセス特性について調査した：抗体４Ｈ１１（配列番号６の上の線状エピトープに結合する抗体）ならびにウサギＭＡＢ、２３Ｃ１１、６Ｃ６および４Ｈ４。
【0116】
各試料注入の前後に、報告ポイントを設定した。応答単位［ＲＵ］での報告ポイントの読出しは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｖ．１．１ソフトウェアを使用して実行した。
【0117】
初期のビオチン化一次抗体捕捉シグナル（ｂｉ－Ａｂ１、［ＲＵ］）に、非ビオチン化一次抗体の第２の結合応答シグナル（ブロックＡｂ１［ＲＵ］）を加えた。モル比エピトープアクセス性ＭＲＥＡ＝Ａｂ２［ＲＵ］／（ｂｉ－Ａｂ１［ＲＵ］＋ブロックＡｂ１［ＲＵ］）を計算し、アッセイで使用したそれぞれの抗体のエピトープアクセス性のための推定値として使用した。
【0118】
ｈＴＫ分析物の四量体状態を検証するために、式ＭＲ＝ｈＴＫ［ＲＵ］／ｂｉ－Ａｂ１［ＲＵ］を使用して、ビオチン化一次抗体のｈＴＫ結合シグナル対捕捉レベルから第２のモル比を計算した＊分子量ｂｉ－Ａｂ１（１５０ｋＤａ）／分子量ｈＴＫ（１１４ｋＤａ）。
【0119】
例えば、抗体４Ｈ１１は、１：１の結合化学量（＝モル比）抗体４Ｈ１１／ｈＴＫ－１
ＭＲを示した。このバイオセンサーアッセイでは、単一の四量体ｈＴＫ－１分子は、単一の抗体４Ｈ１１分子に結合する。記載された抗体の中で、ブロックＡｂとして使用されるとき、抗体４Ｈ１１だけが相同性のｈＴＫ－１複合体形成を示す。したがって、抗体４Ｈ１１を２回使用した連続アッセイプロトコールを使用して、サンドイッチアッセイが可能になるだろう。ウサギモノクローナル抗体ＭＡＢ、２３Ｃ１１、６Ｃ６および４Ｈ４については、相同性の複合体形成を検出できなかった。このことは、ＭＡＢ、２３Ｃ１１、６Ｃ６および４Ｈ４が同じエピトープ領域に結合することを意味する。抗体２３Ｃ１１、６Ｃ６および４Ｈ４は、二次抗体として抗体４Ｈ１１とサンドイッチを形成する。このアッセイにより、最も高性能のサンドイッチ対は、ビオチン化一次抗体として６Ｃ６であり、これは抗体４Ｈ１１とモル比ＭＲＥＡ＝０．４を示す複合体を形成し、これは、ｈＴＫ分析物の上での４０％のエピトープアクセス性を意味する。
ＭＲを示した。このバイオセンサーアッセイでは、単一の四量体ｈＴＫ－１分子は、単一の抗体４Ｈ１１分子に結合する。記載された抗体の中で、ブロックＡｂとして使用されるとき、抗体４Ｈ１１だけが相同性のｈＴＫ－１複合体形成を示す。したがって、抗体４Ｈ１１を２回使用した連続アッセイプロトコールを使用して、サンドイッチアッセイが可能になるだろう。ウサギモノクローナル抗体ＭＡＢ、２３Ｃ１１、６Ｃ６および４Ｈ４については、相同性の複合体形成を検出できなかった。このことは、ＭＡＢ、２３Ｃ１１、６Ｃ６および４Ｈ４が同じエピトープ領域に結合することを意味する。抗体２３Ｃ１１、６Ｃ６および４Ｈ４は、二次抗体として抗体４Ｈ１１とサンドイッチを形成する。このアッセイにより、最も高性能のサンドイッチ対は、ビオチン化一次抗体として６Ｃ６であり、これは抗体４Ｈ１１とモル比ＭＲＥＡ＝０．４を示す複合体を形成し、これは、ｈＴＫ分析物の上での４０％のエピトープアクセス性を意味する。
【0120】
下に示す表から明らかな通り、抗体４Ｈ１１（配列番号６に含まれるＣ末端線状エピトープに結合する）は、２３Ｃ１１、６Ｃ６および４Ｈ４と免疫複合体を形成することが可能である。他方、ウサギモノクローナル抗体ＭＡＢ、２３Ｃ１１、６Ｃ６および４Ｈ４は、同じエピトープを共有することが明白である。
【0121】
【表1】
【0122】
溶液中の分析物として組換えｈ－ＴＫ－１を使用した４つの抗ｈＴＫ－１抗体のサンドイッチ形成を示す。表中の０．０の値は、使用される第１および第２の抗体が同じエピトープに結合することを示す。０．１以上の値は、中間のブロッキングステップにもかかわらず、サンドイッチ形成を示す、すなわち、調査した２つの抗体は異なるエピトープに結合する。
【0123】
実施例４
Ｅｌｅｃｓｙｓイムノアッセイ実験で使用するためのＭＡＢ－コンジュゲートの生成
簡潔には、免疫学的アッセイの捕捉および検出側のための抗体コンジュゲートを得るた
めに、以下の手順／ステップを実行した。
Ｅｌｅｃｓｙｓイムノアッセイ実験で使用するためのＭＡＢ－コンジュゲートの生成
簡潔には、免疫学的アッセイの捕捉および検出側のための抗体コンジュゲートを得るた
めに、以下の手順／ステップを実行した。
【0124】
Ｂ細胞ＰＣＲ生成細胞（上を参照）から得た細胞培養上清（その中に含まれる組換え抗体）は、出発材料として使用した。
組織培養上清に含まれる組換え抗体は、親和性クロマトグラフィーによってプロテインＡに精製した。
組織培養上清に含まれる組換え抗体は、親和性クロマトグラフィーによってプロテインＡに精製した。
【0125】
捕捉抗体として使用した抗体はペプシンによってＦ（ａｂ’）２断片に切断し、Ｆ（ａｂ’）２断片は親和性クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。Ｆ（ａｂ’）２断片は次にチオール化学反応によってＦａｂ’に還元し、部位特異的ビオチン化し、それによってモノビオチン化Ｆａｂ’断片を得た。
【0126】
検出抗体として使用した抗体は、スルホ－ＢＰＲｕＮＨＳエステル（＝ＣＡＳ登録番号４８２６１８－４２－８、当技術分野では、ルテネート（２－）、ビス［［２，２’－ビピリジン］－４，４’－ジメタンスルホナト（２－）－κＮ１、κＮ１’］［１－［４－（４’－メチル［２，２’－ビピリジン］－４－イル－κＮ１、κＮ１’）－１－オキソブトキシ］－２，５－ピロリジンジオン］－、ナトリウム（１：２）、（ＯＣ－６－３１）としても知られる）の使用によってスルホ－ルテニウム（ＷＯ２００３／００２９７４）に化学的にコンジュゲートし、未結合の標識は、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去した。
【0127】
実施例５
試料およびｈＴＫ－１測定
５．１ 試料
「白黒」パネルを調査した。一方では、５０人（一部の実験のためには、４９人だけがなお利用可能だった）の健康ドナーからの血清試料を、様々なアッセイにおいてｈＴＫ－１の定量化のために使用した。他方では、散在性の大きなＢ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の患者からの４８個（一部の実験のために、４７個だけがなお利用可能だった）の試料においてｈＴＫ－１を測定した。
試料およびｈＴＫ－１測定
５．１ 試料
「白黒」パネルを調査した。一方では、５０人（一部の実験のためには、４９人だけがなお利用可能だった）の健康ドナーからの血清試料を、様々なアッセイにおいてｈＴＫ－１の定量化のために使用した。他方では、散在性の大きなＢ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の患者からの４８個（一部の実験のために、４７個だけがなお利用可能だった）の試料においてｈＴＫ－１を測定した。
【0128】
５．２ プロトタイプ電気化学発光イムノアッセイ
実施例３に記載の通りに得られ、実施例４に記載の通りに精製され、コンジュゲートされたモノクローナルウサギ抗体にそれぞれ基づいて、いくつかのプロトタイプイムノアッセイが確立された。
実施例３に記載の通りに得られ、実施例４に記載の通りに精製され、コンジュゲートされたモノクローナルウサギ抗体にそれぞれ基づいて、いくつかのプロトタイプイムノアッセイが確立された。
【0129】
プロトタイプ電気化学発光イムノアッセイの一般的なセットアップは、ビオチン化捕捉抗体（または、その抗原結合性断片）およびルテニウム錯体によって標識された検出抗体（または、その抗原結合性断片）を利用する。
【0130】
イムノアッセイデータは、ほとんどの場合、従来の手順によってビオチン化された従来のＦａｂ’断片を使用して生成された。Ｒｏｃｈｅからのｃｏｂａｓ（登録商標）Ｅ１７０アナライザーによりサンドイッチアッセイフォーマットで測定を実行した。ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｅ１７０アナライザーにおけるシグナル検出は、電気化学発光に基づく。このサンドイッチアッセイでは、ビオチンコンジュゲート（すなわち、捕捉抗体）は、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズの表面に固定化される。検出抗体は、シグナル伝達部分として錯体型ルテニウムカチオンを有する。分析物の存在下で、発色性ルテニウム錯体は固相に架橋され、ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｅ１７０アナライザーの測定セルに含まれる白金電極での励起の後に、６２０ｎｍで発光する。シグナルアウトプットは、恣意的な光単位である。
【0131】
測定は、例えば、ＨＥＫ細胞からの組換えｈＴＫ－１ならびに上で指摘したヒト血清試料でスパイクしたキャリブレータによって実行した。
実験的なｈＴＫ－１アッセイは、以下の通りに実行した。ヒト血清試料またはスパイクされたキャリブレータの２５μｌ、２５μｌの前処理試薬（１０ｍＭのＤＴＢＡを含む）を混合し、９分間インキュベートした；その後、６０μｌの捕捉抗体－ビオチンコンジュゲートおよび６０μｌの検出抗体ルテニウム標識コンジュゲートをさらなる９分間一緒にインキュベートし、続いて、３０μｌのストレプトアビジンでコーティングした常磁性微粒子を添加した。最終混合物は、さらに９分間インキュベートした。その後、ｈＴＫ－１は通常通り検出した（すなわち、これらの実験で生成された電気化学発光シグナルによって）。
実験的なｈＴＫ－１アッセイは、以下の通りに実行した。ヒト血清試料またはスパイクされたキャリブレータの２５μｌ、２５μｌの前処理試薬（１０ｍＭのＤＴＢＡを含む）を混合し、９分間インキュベートした；その後、６０μｌの捕捉抗体－ビオチンコンジュゲートおよび６０μｌの検出抗体ルテニウム標識コンジュゲートをさらなる９分間一緒にインキュベートし、続いて、３０μｌのストレプトアビジンでコーティングした常磁性微粒子を添加した。最終混合物は、さらに９分間インキュベートした。その後、ｈＴＫ－１は通常通り検出した（すなわち、これらの実験で生成された電気化学発光シグナルによって）。
【0132】
興味深いことに、Ｃ末端に対するＭＡＢ（４Ｈ１１）と組み合わせた高次構造依存性エピトープへのＭＡＢの各々は、かなり優れたサンドイッチ組合せをもたらした。すなわち、これらの組合せの各々は、ｈＴＫ－１の測定のための高品質イムノアッセイを確立するために使用することができる。
【0133】
捕捉抗体および検出抗体の両方として、１つのおよび同じ抗体を使用することも試みられた。ビオチン化捕捉抗体およびルテニル化検出抗体として使用した４Ｈ１１の組合せは、かなり低いシグナルカウントを与え、すなわち満足な結果を与えなかった。驚くべきことに、線状エピトープに対する１つの抗体（４Ｈ１１）と高次構造依存性エピトープに対する抗体のいずれか１つ（４Ｈ４；６Ｃ６；または２３Ｃ１１）の組合せとして、高次構造依存性エピトープに対する抗体は、ビオチン化捕捉抗体およびルテニル化検出抗体として使用した場合、高いが若干より低いシグナルカウントを与えた。
【0134】
４Ｈ１１を捕捉抗体として、かつ高次構造的エピトープに対する抗体を検出抗体として使用すること、または抗ｈＴＫ－１抗体の配向を変更すること、すなわち高次構造的エピトープに対する抗体を捕捉抗体として、および４Ｈ１１抗体を検出抗体として使用することも可能であった。
【0135】
下には、ａ）ビオチン化４Ｈ１１（Ｆａｂ’－Ｂｉとして使用される）とルテニル化２３Ｃ１１（ＩｇＧとして使用される）の組合せ、およびｂ）ビオチン化６Ｃ６（Ｆａｂ’－Ｂｉとして使用される）とルテニル化４Ｈ１１（ＩｇＧとして使用される）、について得られた結果を与える。
【0136】
プロトタイプａ）およびｂの両方のための較正結果を、それぞれ下の表２に示す。
【0137】
【表2】
【0138】
表２には、分析物として組換えｈＴＫ－１の様々な量を使用した２つの異なるイムノアッセイプロトタイプで得たシグナルが与えられる。二重測定を実行した。見られる通り、二重判定／カウント数および濃度（＝ｃｏｎｃ）、ｈＴＫ－１の計算／実測濃度（ＭＷｃｏｎｃ）および全体のシグナル規模の一致の点で、両方のアッセイプロトタイプは非常に優れた結果を与える。
【0139】
両方のプロトタイプアッセイでは、黒色と白色のパネルを測定した。ボックス－ウィスカープロットを計算し、受信者動作特性（ＲＯＣ）を分析し、曲線下面積（ＡＵＣ）を判定した。プロトタイプａ）のアッセイについてはＡＵＣは０．９７１であり、プロトタイプｂ）のアッセイについては０．９６５とほとんど同じであった。ｈＴＫ－１の判定された濃度およびＡＵＣによる両方のボックス－ウィスカープロット（ボックスプロット）を、両方のプロトタイプアッセイについて図２に示す。
【0140】
５．３ ＤｉａＳｏｒｉｎ ＴＫ１活性アッセイ
ＤｉａＳｏｒｉｎによって製造されるＬＩＡＩＳＯＮ（登録商標）チミジンキナーゼアッセイは、ヒト血清およびＥＤＴＡ血漿中のＴＫの定量測定のための、間接的な改変された二段階競合的化学発光免疫検定法（ＣＬＩＡ）である。５０個の対照試料およびＤＬＢＣＬ患者からの４８個の試料によって、製造業者によって与えられた説明書に従ってＬＩＡＩＳＯＮ（登録商標）チミジンキナーゼアッセイを実行した。それは、試料中のＴＫがＡＺＴ（３’－アジド－３’－デオキシチミジン）をＡＺＴＭＰ（３’－アジド－３’－デオキシチミジンモノホスフェート）に変換する初期の酵素反応を利用し、これの後に、ＡＺＴＭＰの定量測定のための競合的イムノアッセイが続く。ＡＺＴＭＰに変換されたＡ
ＺＴの量は、試料中に存在するＴＫの量の尺度である。アッセイでは、５０μＬの試料が、１００μＬのアッセイ緩衝液１、２０μＬのアッセイ緩衝液２、および抗ＡＺＴＭＰポリクローナル抗体をコーティングした常磁性粒子の２０μＬとインキュベートされる。ウサギ抗ヤギＩｇＧ、次に抗ＡＺＴＭＰヤギポリクローナルを、固相にコーティングする。これは４０分間インキュベートされ、次に、１００μＬのトレーサ、イソルミノール誘導体にコンジュゲートされたＡＺＴＭＰ類似体を加える。最初のインキュベーションの間、ＡＺＴＭＰは固相に結合する。第２のインキュベーションでは、トレーサコンジュゲートは、溶液中のＡＺＴＭＰとの結合に関して競合する。２０分のインキュベーションの後、未結合の材料は洗浄サイクルで除去する。スターター試薬を次に加え、瞬間化学発光反応を開始する。光シグナルは光電子増倍管によって相対的光単位（ＲＬＵ）として測定され、キャリブレータ、対照または試料に存在するＴＫの濃度に比例する。
ＤｉａＳｏｒｉｎによって製造されるＬＩＡＩＳＯＮ（登録商標）チミジンキナーゼアッセイは、ヒト血清およびＥＤＴＡ血漿中のＴＫの定量測定のための、間接的な改変された二段階競合的化学発光免疫検定法（ＣＬＩＡ）である。５０個の対照試料およびＤＬＢＣＬ患者からの４８個の試料によって、製造業者によって与えられた説明書に従ってＬＩＡＩＳＯＮ（登録商標）チミジンキナーゼアッセイを実行した。それは、試料中のＴＫがＡＺＴ（３’－アジド－３’－デオキシチミジン）をＡＺＴＭＰ（３’－アジド－３’－デオキシチミジンモノホスフェート）に変換する初期の酵素反応を利用し、これの後に、ＡＺＴＭＰの定量測定のための競合的イムノアッセイが続く。ＡＺＴＭＰに変換されたＡ
ＺＴの量は、試料中に存在するＴＫの量の尺度である。アッセイでは、５０μＬの試料が、１００μＬのアッセイ緩衝液１、２０μＬのアッセイ緩衝液２、および抗ＡＺＴＭＰポリクローナル抗体をコーティングした常磁性粒子の２０μＬとインキュベートされる。ウサギ抗ヤギＩｇＧ、次に抗ＡＺＴＭＰヤギポリクローナルを、固相にコーティングする。これは４０分間インキュベートされ、次に、１００μＬのトレーサ、イソルミノール誘導体にコンジュゲートされたＡＺＴＭＰ類似体を加える。最初のインキュベーションの間、ＡＺＴＭＰは固相に結合する。第２のインキュベーションでは、トレーサコンジュゲートは、溶液中のＡＺＴＭＰとの結合に関して競合する。２０分のインキュベーションの後、未結合の材料は洗浄サイクルで除去する。スターター試薬を次に加え、瞬間化学発光反応を開始する。光シグナルは光電子増倍管によって相対的光単位（ＲＬＵ）として測定され、キャリブレータ、対照または試料に存在するＴＫの濃度に比例する。
【0141】
ボックス－ウィスカープロットを計算し、受信者動作特性（ＲＯＣ）を分析し、曲線下面積（ＡＵＣ）を判定した。ＬＩＡＩＳＯＮ（登録商標）チミジンキナーゼアッセイについては、ＡＵＣは０．９５８であることが見出された。ボックス－ウィスカープロット（ボックスプロット）およびＡＵＣの両方を、図３に示す。
【0142】
実施例６
活性アッセイ／イムノアッセイで判定されたＴＫ－１値の比較
一方ではＬＩＡＩＳＯＮ（登録商標）チミジンキナーゼアッセイで、他方では２つのプロトタイプイムノアッセイで得た値を、互いと比較した。１つのアッセイはチミジンキナーゼ活性を測定し、他の２つは免疫反応性ｈＴＫ－１の量を測定することを考慮すると、２つの異なるアッセイの間で驚くべきことに高い相関（０．９５の範囲内、またはさらにそれより上－使用した統計的方法に依存する）が見出された。ｈＴＫ－１に関するこれらの異なるアッセイの間の優れた相関が、図４からも全く明らかである。
活性アッセイ／イムノアッセイで判定されたＴＫ－１値の比較
一方ではＬＩＡＩＳＯＮ（登録商標）チミジンキナーゼアッセイで、他方では２つのプロトタイプイムノアッセイで得た値を、互いと比較した。１つのアッセイはチミジンキナーゼ活性を測定し、他の２つは免疫反応性ｈＴＫ－１の量を測定することを考慮すると、２つの異なるアッセイの間で驚くべきことに高い相関（０．９５の範囲内、またはさらにそれより上－使用した統計的方法に依存する）が見出された。ｈＴＫ－１に関するこれらの異なるアッセイの間の優れた相関が、図４からも全く明らかである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4a】
【図4b】
【配列表】
【外国語明細書】