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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024000455
(43)【公開日】2024-01-05
(54)【発明の名称】不完全なＳＳＲ領域を有するプライマー
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6876 20180101AFI20231225BHJP
C40B 40/06 20060101ALI20231225BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALN20231225BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6876 Z
C40B40/06 ZNA
C12Q1/6869 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022099233
(22)【出願日】2022-06-20
(71)【出願人】
【識別番号】504132272
【氏名又は名称】国立大学法人京都大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】中▲崎▼ 鉄也
(72)【発明者】
【氏名】西村 和紗
(72)【発明者】
【氏名】中野 龍平
(72)【発明者】
【氏名】元木 航
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QA20
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR42
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】 （修正有）
【課題】本発明は、ＭＩＧ法のデメリットである多型解析数を上昇させることを課題とする。
【解決手段】プライマーであって、
該プライマーは、その５’末端から順に、
（Ａ）他のプライマーがアニーリングする塩基配列からなる領域、
（Ｂ）不完全なＳＳＲ領域、及び
（Ｃ）アンカー領域
を有し、
（Ｂ）領域は、２～４個の連続する塩基が２～８回繰り返された塩基配列において１又は複数個の塩基が置換された塩基配列からなり、
（Ｃ）領域は、１～３個の塩基配列からなる、
プライマー
の提供。
【選択図】図１
【解決手段】プライマーであって、
該プライマーは、その５’末端から順に、
（Ａ）他のプライマーがアニーリングする塩基配列からなる領域、
（Ｂ）不完全なＳＳＲ領域、及び
（Ｃ）アンカー領域
を有し、
（Ｂ）領域は、２～４個の連続する塩基が２～８回繰り返された塩基配列において１又は複数個の塩基が置換された塩基配列からなり、
（Ｃ）領域は、１～３個の塩基配列からなる、
プライマー
の提供。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
プライマーであって、
該プライマーは、その５’末端から順に、
（Ａ）他のプライマーがアニーリングする塩基配列からなる領域、
（Ｂ）不完全なＳＳＲ領域、及び
（Ｃ）アンカー領域
を有し、
（Ｂ）領域は、２～４個の連続する塩基が２～８回繰り返された塩基配列において１又は複数個の塩基が置換された塩基配列からなり、
（Ｃ）領域は、１～３個の塩基配列からなる、
プライマー。
該プライマーは、その５’末端から順に、
（Ａ）他のプライマーがアニーリングする塩基配列からなる領域、
（Ｂ）不完全なＳＳＲ領域、及び
（Ｃ）アンカー領域
を有し、
（Ｂ）領域は、２～４個の連続する塩基が２～８回繰り返された塩基配列において１又は複数個の塩基が置換された塩基配列からなり、
（Ｃ）領域は、１～３個の塩基配列からなる、
プライマー。
【請求項2】
（Ｂ）領域における前記置換塩基数が、１～１２個である、請求項１に記載のプライマー。
【請求項3】
前記置換塩基が、（Ｂ）領域の３’末端から１～３２番目の少なくとも１個の塩基である、請求項１又は２に記載のプライマー。
【請求項4】
１５～５０塩基長である、請求項１に記載のプライマー。
【請求項5】
配列番号１７～２７２の何れかに記載の塩基配列からなる、請求項１に記載のプライマー。
【請求項6】
次世代シークエンスに使用される、請求項１に記載のプライマー。
【請求項7】
請求項１～６のプライマーからなる群より選択される２種以上の異なるプライマーを組み合わせてなるプライマーセット。
【請求項8】
ＤＮＡライブラリーの製造方法であって、
検出対象のゲノム、及び
請求項１～６の何れか一項に記載のプライマー又は請求項７に記載のプライマーセット
を含む混合物を核酸増幅反応に供する工程を含有する、
製造方法。
検出対象のゲノム、及び
請求項１～６の何れか一項に記載のプライマー又は請求項７に記載のプライマーセット
を含む混合物を核酸増幅反応に供する工程を含有する、
製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、不完全なＳＳＲ領域を有するプライマーに関する。特に、次世代シークエンスに使用される不完全なＳＳＲ領域を有するプライマーに関する。
【背景技術】
【0002】
育種学の分野において、次世代シーケンサーを使用した全ゲノムの解析は、ＳＮＰ(一塩基多型)、ｉｎｄｅｌ（挿入欠失遺伝子）等の多型数に関する品種間のＤＮＡ配列の差を解析するために使用される。次世代シーケンサーを使用したＤＮＡ解析には、ＤＮＡライブラリーを調製する必要があり、その一例として、
（１）解析対象とするゲノムＤＮＡを超音波又は制限酵素によって断片化する工程、
（２）工程１により得られる断片化したＤＮＡに対して、アダプターをライゲーションする工程、
（３）工程２により得られるアダプターを有する断片化ＤＮＡに対して、ｉｎｄｅｘ配列をＰＣＲにより付加する工程、及び
（４）工程３により得られるＰＣＲ産物をプーリング及びサイズ選別する工程
を挙げることができる。
（１）解析対象とするゲノムＤＮＡを超音波又は制限酵素によって断片化する工程、
（２）工程１により得られる断片化したＤＮＡに対して、アダプターをライゲーションする工程、
（３）工程２により得られるアダプターを有する断片化ＤＮＡに対して、ｉｎｄｅｘ配列をＰＣＲにより付加する工程、及び
（４）工程３により得られるＰＣＲ産物をプーリング及びサイズ選別する工程
を挙げることができる。
【0003】
全ゲノムを解析する必要のない場合又は解析することができない場合の例として、交雑集団の遺伝子型を特定する場合又は解析するゲノムサイズが大きすぎる場合を挙げることができる。このように、全ゲノム解析する必要がない場合、すなわちゲノムの一部を解析することにより多型数を評価することが、育種学や生態学等の幅広い分野にて利用されている。
【0004】
このようなゲノムの一部を解析する方法として、ＭＩＧ－ｓｅｑ法（非特許文献１）、ｄｄＲＡＤ－ｓｅｑ法（非特許文献２）及びＧｒａｓ－ｄｉ法（特許文献１）を挙げることができる。
【0005】
ＭＩＧ－ｓｅｑ法は、ＩＳＳＲのＤＮＡ配列を解析することができ、これを実施するコストが全ゲノム解析よりも遙かに低いものの、解析できる多型数が少ないといったデメリットがあることが知られている。ｄｄＲＡＤ－ｓｅｑ法は、制限酵素サイト近傍のＤＮＡ配列を解析することができ、ＭＩＧ－ｓｅｑ法よりも実施コストが高く、ＳＮＰ解析数がＭＩＧ－ｓｅｑ法よりも多いことが知られている。Ｇｒａｓ－ｄｉ法は、ランダムにＤＮＡ配列を解析することができ、ＭＩＧ－ｓｅｑ法及びｄｄＲＡＤ－ｓｅｑ法より実施コストが高く、多型解析数がＭＩＧ－ｓｅｑ法よりも多いものの、全ゲノム解析には及ばないことが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開２０１８－１２９０８０号公報
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｓｕｙａｍａ Ｙ，ａｎｄ Ｍａｔｓｕｋｉ Ｙ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１５；５：１６９６３．
【非特許文献2】Ｓｈｉｒａｓａｗａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．ＤＮＡ Ｒｅｓ．２０１６；２３（２）：１４５－５３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
ＭＩＧ－ｓｅｑ法では、解析対象ＤＮＡに含有されるＳＳＲ領域に対して相補的な塩基配列を含有するプライマーを使用したＰＣＲ工程を有するため、たとえ解析対象のＤＮＡ品質が低くとも、次世代シーケンサーを使用したＤＮＡ解析のために必要なＤＮＡライブラリーを比較的容易に作成することができるメリットを有する。一方で、ｄｄＲＡＤ－ｓｅｑ法では、解析対象のＤＮＡ品質が低いと当該方法にて使用する制限酵素による処理を実行できなくなる可能性が高くなるため、当該方法に使用するＤＮＡ品質を高くする必要がある。また、Ｇｒａｓ－ｄｉ法でも、解析対象とするＤＮＡ品質が高いことが要求される。よって、解析対象のＤＮＡ品質が低くともＭＩＧ法のデメリットであるＳＮＰやｉｎｄｅｌ数といった多型の解析数を上昇させることを、本発明の主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、検出対象のゲノムＤＮＡに含有されるＳＳＲ領域に完全に相補的な塩基配列を有さないプライマーを使用したＭＩＧ－ｓｅｑ法により、多型解析数を上昇させることを見出した。本発明は、このような知見に基づいて完成された発明であって、下記の各項に示す主題を広く包含する。
【0010】
項１ プライマーであって、
該プライマーは、その５’末端から順に、
（Ａ）他のプライマーがアニーリングする塩基配列からなる領域、
（Ｂ）不完全なＳＳＲ領域、及び
（Ｃ）アンカー領域
を有し、
（Ｂ）領域は、２～４個の連続する塩基が２～８回繰り返された塩基配列において１又は複数個の塩基が置換された塩基配列からなり、
（Ｃ）領域は、１～３個の塩基配列からなる、
プライマー。
該プライマーは、その５’末端から順に、
（Ａ）他のプライマーがアニーリングする塩基配列からなる領域、
（Ｂ）不完全なＳＳＲ領域、及び
（Ｃ）アンカー領域
を有し、
（Ｂ）領域は、２～４個の連続する塩基が２～８回繰り返された塩基配列において１又は複数個の塩基が置換された塩基配列からなり、
（Ｃ）領域は、１～３個の塩基配列からなる、
プライマー。
【0011】
項２ （Ｂ）領域における前記置換塩基数が、１～１２個である、項１に記載のプライマー。
【0012】
項３ 前記置換塩基が、（Ｂ）領域の３’末端から１～３２番目の少なくとも１個の塩基である項１又は項２に記載のプライマー。
【0013】
項４ １５～５０塩基長である、項１～項３の何れかに記載のプライマー。
る。
る。
【0014】
項５ 配列番号１７～２７２の何れかに記載の塩基配列からなる、項１～項４の何れかに記載のプライマー。
【0015】
項６ 次世代シークエンスに使用される、項１～項５の何れかに記載のプライマー。
【0016】
項７ 項１～６のプライマーからなる群より選択される２種以上の異なるプライマーを組み合わせてなる核酸増幅用プライマーセット。
【0017】
項８
配列番号１７～３２の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号３３～４８の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号４９～６４の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号６５～８０の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号８１～９６の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号９７～１１２の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号１１３～１２８の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも種以上、
配列番号１２９～１４４の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号１４５～１６０の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号１６１～１７６の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号１７７～１９２の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号１９３～２０８の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号２０９～２２４の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号２２５～２４０の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号２４１～２５６の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上又は
配列番号２５７～２７２の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上
を組み合わせてなる、項７に記載のプライマーセット。
配列番号１７～３２の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号３３～４８の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号４９～６４の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号６５～８０の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号８１～９６の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号９７～１１２の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号１１３～１２８の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも種以上、
配列番号１２９～１４４の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号１４５～１６０の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号１６１～１７６の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号１７７～１９２の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号１９３～２０８の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号２０９～２２４の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号２２５～２４０の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上、
配列番号２４１～２５６の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上又は
配列番号２５７～２７２の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上
を組み合わせてなる、項７に記載のプライマーセット。
【0018】
項９ ＤＮＡライブラリーの製造方法であって、
検出対象のゲノム、及び
項１～６の何れか一項に記載のプライマー又は項７又は８に記載のプライマーセット
を含む混合物を核酸増幅反応に供する工程を含有する、
製造方法。
検出対象のゲノム、及び
項１～６の何れか一項に記載のプライマー又は項７又は８に記載のプライマーセット
を含む混合物を核酸増幅反応に供する工程を含有する、
製造方法。
【発明の効果】
【0019】
本発明によると、品質が低いＤＮＡを用いてもＳＮＰやｉｎｄｅｌ数といった多型の検出数を上昇させたゲノム解析を提供することができる。より詳細に、本発明によって解析することができる多型は、異なる遺伝子座における多型を検出することができる。また、本発明によると、品質が低いＤＮＡであっても多型の解析数を上昇させることができるので、ゲノム解析のコストを低く抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【発明を実施するための形態】
【0021】
以下、本発明について説明する。なお、以下において、特に断らない限り、数値範囲を示す「～」との標記は、「未満」及び「超過」の意味ではなく「以上」及び「以下」を示す。つまり、「Ａ～Ｂ」は「Ａ以上Ｂ以下」を意味し、Ａ及びＢも含まれる。
【0022】
本明細書において、「含む」及び「含有する」の用語には、「からなる」及び「から実質的になる」という意味が含まれる。
【0023】
プライマー
本発明のプライマーは、その５’末端から順に以下の（Ａ）～（Ｃ）領域を有する。
（Ａ）他のプライマーがアニーリングする塩基配列からなる領域。
（Ｂ）不完全なＳＳＲ領域。
（Ｃ）アンカー領域。
本発明のプライマーは、その５’末端から順に以下の（Ａ）～（Ｃ）領域を有する。
（Ａ）他のプライマーがアニーリングする塩基配列からなる領域。
（Ｂ）不完全なＳＳＲ領域。
（Ｃ）アンカー領域。
【0024】
上記（Ｂ）領域は、２～４個の連続する塩基が２～８回繰り返された塩基配列において１又は複数個の塩基が置換された塩基配列からなる。
【0025】
上記（Ｃ）領域は、１～３個の塩基配列からなる。
【0026】
本発明のプライマーは、様々な用途に使用する事ができ、特に限定されないが、例えば、次世代シーケンサーに使用されることを挙げることができる。より好ましい本発明のプライマーの使用態様として、次世代シーケンサーで必要とされるＤＮＡライブラリーを製造するために使用される態様を挙げることができる。更に好ましい本発明の使用態様として、当該ＤＮＡライブラリーを製造する１ｓｔＰＣＲにおいて使用される態様を挙げることができる。
【0027】
（Ａ）領域における他のプライマーがアニーリングする領域の塩基配列は、特に限定されず、例えば、上記する次世代シーケンサーのＤＮＡライブラリーの製造時における２ｎｄＰＣＲを実施する際のプライマーがアニーリングする塩基配列を挙げることができる。当該２ｎｄＰＣＲは、当該ＤＮＡライブラリーに含有される各ＰＣＲ産物を区別するためのｉｎｄｅｘ配列、次世代シーケンサーのフローセルに当該ＤＮＡライブラリーに含有される各ＰＣＲ産物を結合させるために必要となる、例えば、Ｐ５配列、Ｐ７配列等のアダプター配列等を付加させるためのＰＣＲである。
【0028】
（Ａ）領域の塩基数は、本発明の効果を発揮できる範囲において特に限定されず、例えば、１０～３０個とすることができる。より好ましくは、１５～１９個であり、１６～１８個が最も好ましい。
【0029】
（Ｂ）領域は、不完全なＳＳＲ領域であり、２～４個の連続する塩基が２～８回繰り返された塩基配列において１又は複数個の塩基が置換された塩基配列からなる。
【0030】
完全なＳＳＲ領域とは２～４個の連続する塩基が２～８回繰り返された塩基配列であり、例えば、ＡＴＣを単位とする３個の塩基がＡＴＣＡＴＣと２回繰り返された塩基配列を挙げることができる。従来のＭＩＧ－ｓｅｑ法では、このような完全なＳＳＲ領域が、検出対象ゲノムＤＮＡに含有されうるＳＳＲ領域と結合する。
【0031】
不完全なＳＳＲ領域とは、上記完全なＳＳＲ領域を構成する塩基配列において１又は複数個の塩基が置換されたものであり、例えば、上記に例示したＡＴＣＡＴＣとの完全なＳＳＲ領域に対して、ＧＴＣＡＴＣと一番始めのＡをＧに置換した塩基配列を挙げることができる。
【0032】
このように、完全なＳＳＲ領域に置換変異を導入することにより、すなわち不完全なＳＳＲ領域を設けることにより、ＭＩＧ－ｓｅｑ法におけるＰＣＲ反応が非効率となることが想定されるが、後記する実施例にて示すように、解析される多型数が増大することは驚くべきことである。
【0033】
（Ｂ）領域における置換塩基数は、本発明の効果を発揮する範囲において特に限定されず、例えば１～１２個とすることができ、１～４個とすることが好ましく、１～３個とすることが更に好ましく、２個又は３個とすることが最も好ましい。
【0034】
なお、上記の通り、（Ｂ）領域は、完全なＳＳＲ領域を構成する塩基配列において１又は複数個の塩基が置換されたものということができるところ、置換塩基数は、完全なＳＳＲ領域の塩基数の３０％を超えない１以上の整数であることが好ましく、２５％を超えない１以上の整数であることがより好ましい。例えば、完全なＳＳＲ領域は、上記の通り２～４個の連続する塩基が２～８回繰り返された塩基配列であるので、その塩基長は４～３２塩基であるところ、４塩基における２５％は１塩基であるため、「２５％を超えない１以上の整数」は１のみである。また、３２塩基における２５％は８塩基であるため、「２５％を超えない１以上の整数」は１、２、３、４、５、６、７、又は８である。
【0035】
（Ｂ）領域における置換を設ける塩基の位置は、本発明の効果を発揮する範囲において特に限定されず、例えば（Ｂ）領域の３’末端から１～３２番目の少なくとも１個の塩基とすることができ、１～１２番目の少なくとも１個の塩基とすることが好ましく、１～６番目の少なくとも１個の塩基とすることが更に好ましく、１～４番目の少なくとも１個の塩基とすることが最も好ましい。なお、前記「（Ｂ）領域の３’末端から１～Ｘ番目」との記載は、（Ｂ）領域が短い塩基数からなる場合には、その（Ｂ）領域の塩基数までのことを指す。例えば（Ｂ）領域が４塩基からなる場合においては、「（Ｂ）領域の３’末端から１～３２番目」との記載は、「（Ｂ）領域の３’末端から１～４番目」のことを指す。
【0036】
（Ｃ）領域は、塩基１～３個の塩基配列からなる。当該（Ｃ）領域は、ＰＣＲ反応をより進行しやすくするために設けられる配列であり、より好ましくは、塩基２個の塩基配列からなる。このような好ましい（Ｃ）領域の塩基配列は、本発明の効果を発揮する範囲において特に限定されず、具体的には、（Ｃ）領域の５’末端から順に、ＴＧ、ＡＣ、ＣＣ、ＡＣ等を挙げることができる。
【0037】
本発明のプライマーの塩基長は、本発明の効果を発揮する範囲において特に限定されず、例えば１５～８０個程度、好ましくは２０～７０個程度、好ましくは２０～６０個程度、更に好ましくは２０～５０個程度とすることができ、２５～３５個程度の塩基長とすることが最も好ましい。
る。
る。
【0038】
本発明の具体的な塩基配列は、本発明の効果を発揮する範囲において特に限定されず、例えば配列番号１７～２７２の何れかに記載の塩基配列を挙げることができる。これらの塩基配列は、下記表１～１７又は配列表に記載するものである。
【0039】
プライマーセット
本発明のプライマーセットは、上記本発明のプライマーからなる群より選択される２種以上の異なるプライマーを組み合わせてなるものとすることができる。このようなプライマーセットは、次世代シーケンス法におけるマルチプレックス法として有効に使用する事ができる。
本発明のプライマーセットは、上記本発明のプライマーからなる群より選択される２種以上の異なるプライマーを組み合わせてなるものとすることができる。このようなプライマーセットは、次世代シーケンス法におけるマルチプレックス法として有効に使用する事ができる。
【0040】
好ましいプライマーセットとして、例えば、下記表２に記載する配列番号１６～３２の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上を組み合わせてなるプライマーセットを挙げることができる。ただし、このようなプライマーセットには、下記表２におけるプライマー名に「ｆ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｆ＿３、ＣＴＡ４ＴＧ－ｆ＿３、ＴＴＧ４ＡＣ－ｆ＿３、ＧＴＴ４ＣＣ－ｆ＿３、ＧＴＴ４ＴＣ－ｆ＿３、ＧＴＧ４ＡＣ－ｆ＿３、ＧＴ６ＴＣ－ｆ＿３又はＴＧ６ＡＣ－ｆ＿３）、及び「ｒ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｒ＿３、ＣＴＡ４ＴＧ－ｒ＿３、ＴＴＧ４ＡＣ－ｒ＿３、ＧＴＴ４ＣＣ－ｒ＿３、ＧＴＴ４ＴＣ－ｒ＿３、ＧＴＧ４ＡＣ－ｒ＿３、ＧＴ６ＴＣ－ｒ又はＴＧ６ＡＣ－ｒ＿３）の、それぞれ１種以上が含有される。
【0041】
更に好ましいプライマーセットは、上記配列番号１６～３２の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、１４種以上又は１５種以上を組み合わせてなるプライマーセットであり、最も好ましいプライマーセットは、上記配列番号１６～３２に記載の塩基配列からなるプライマーの全てを組み合わせてなるプライマーセットである。
【0042】
他の好ましいプライマーセットとして、例えば、下記表３に記載する配列番号３３～４８の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上を組み合わせてなるプライマーセットを挙げることができる。ただし、このようなプライマーセットには、下記表３におけるプライマー名に「ｆ」との記載があるもの（具体的には、ＣＴＡ４ＴＧ－ｆ＿４、ＴＴＧ４ＡＣ－ｆ＿４、ＧＴＴ４ＣＣ－ｆ＿４、ＧＴＴ４ＴＣ－ｆ＿４、ＧＴＧ４ＡＣ－ｆ＿４、ＧＴ６ＴＣ－ｆ＿４又はＴＧ６ＡＣ－ｆ＿４）、及び「ｒ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｒ＿４、ＣＴＡ４ＴＧ－ｒ＿４、ＴＴＧ４ＡＣ－ｒ＿４、ＧＴＴ４ＣＣ－ｒ＿４、ＧＴＴ４ＴＣ－ｒ＿４、ＧＴＧ４ＡＣ－ｒ＿４、ＧＴ６ＴＣ－ｒ＿４又はＴＧ６ＡＣ－ｒ＿４）の、それぞれ１種以上が含有される。
【0043】
更に好ましいプライマーセットは、上記配列番号３３～４８の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、１４種以上又は１５種以上を組み合わせてなるプライマーセットであり、最も好ましいプライマーセットは、上記配列番号３３～４８に記載の塩基配列からなるプライマーの全てを組み合わせてなるプライマーセットである。
【0044】
他の好ましいプライマーセットとして、例えば、下記表４に記載する配列番号４９～６４の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上を組み合わせてなるプライマーセットを挙げることができる。ただし、このようなプライマーセットには、下記表４におけるプライマー名に「ｆ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｆ＿５、ＣＴＡ４ＴＧ－ｆ＿５、ＴＴＧ４ＡＣ－ｆ＿５、ＧＴＴ４ＣＣ－ｆ＿５、ＧＴＴ４ＴＣ－ｆ＿５、ＧＴＧ４ＡＣ－ｆ＿５、ＧＴ６ＴＣ－ｆ＿５又はＴＧ６ＡＣ－ｆ＿５）、及び「ｒ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｒ＿５、ＣＴＡ４ＴＧ－ｒ＿５、ＴＴＧ４ＡＣ－ｒ＿５、ＧＴＴ４ＣＣ－ｒ＿５、ＧＴＴ４ＴＣ－ｒ＿５、ＧＴＧ４ＡＣ－ｒ＿５、ＧＴ６ＴＣ－ｒ＿５又はＴＧ６ＡＣ－ｒ＿５）の、それぞれ１種以上が含有される。
【0045】
更に好ましいプライマーセットは、上記配列番号４９～６４の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、１４種以上又は１５種以上を組み合わせてなるプライマーセットであり、最も好ましいプライマーセットは、上記配列番号４９～６４に記載の塩基配列からなるプライマーの全てを組み合わせてなるプライマーセットである。
【0046】
他の好ましいプライマーセットとして、例えば、下記表５に記載する配列番号６５～８０の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上を組み合わせてなるプライマーセットを挙げることができる。ただし、このようなプライマーセットには、下記表５におけるプライマー名に「ｆ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｆ＿７、ＣＴＡ４ＴＧ－ｆ＿７、ＴＴＧ４ＡＣ－ｆ＿７、ＧＴＴ４ＣＣ－ｆ＿７、ＧＴＴ４ＴＣ－ｆ＿７、ＧＴＧ４ＡＣ－ｆ＿７、ＧＴ６ＴＣ－ｆ＿７又はＴＧ６ＡＣ－ｆ＿７）、及び「ｒ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｒ＿７、ＣＴＡ４ＴＧ－ｒ＿７、ＴＴＧ４ＡＣ－ｒ＿７、ＧＴＴ４ＣＣ－ｒ＿７、ＧＴＴ４ＴＣ－ｒ＿７、ＧＴＧ４ＡＣ－ｒ＿７、ＧＴ６ＴＣ－ｒ＿７又はＴＧ６ＡＣ－ｒ＿７）の、それぞれ１種以上が含有される。
【0047】
更に好ましいプライマーセットは、上記配列番号６５～８０の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、１４種以上又は１５種以上を組み合わせてなるプライマーセットであり、最も好ましいプライマーセットは、上記配列番号６５～８０に記載の塩基配列からなるプライマーの全てを組み合わせてなるプライマーセットである。
【0048】
他の好ましいプライマーセットとして、例えば、下記表６に記載する配列番号８１～９６の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上を組み合わせてなるプライマーセットを挙げることができる。ただし、このようなプライマーセットには、下記表６におけるプライマー名に「ｆ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｆ＿１０、ＣＴＡ４ＴＧ－ｆ＿１０、ＴＴＧ４ＡＣ－ｆ＿１０、ＧＴＴ４ＣＣ－ｆ＿１０、ＧＴＴ４ＴＣ－ｆ＿１０、ＧＴＧ４ＡＣ－ｆ＿１０、ＧＴ６ＴＣ－ｆ＿１０又はＴＧ６ＡＣ－ｆ＿１０）、及び「ｒ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｒ＿１０ＣＴＡ４ＴＧ－ｒ＿１０、ＴＴＧ４ＡＣ－ｒ＿１０、ＧＴＴ４ＣＣ－ｒ＿１０、ＧＴＴ４ＴＣ－ｒ＿１０、ＧＴＧ４ＡＣ－ｒ＿１０、ＧＴ６ＴＣ－ｒ＿１０又はＴＧ６ＡＣ－ｒ＿１０）の、それぞれ１種以上が含有される。
【0049】
更に好ましいプライマーセットは、上記配列番号８１～９６の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、１４種以上又は１５種以上を組み合わせてなるプライマーセットであり、最も好ましいプライマーセットは、上記配列番号８１～９６に記載の塩基配列からなるプライマーの全てを組み合わせてなるプライマーセットである。
【0050】
他の好ましいプライマーセットとして、例えば、下記表７に記載する配列番号９７～１１２の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上を組み合わせてなるプライマーセットを挙げることができる。ただし、このようなプライマーセットには、下記表７におけるプライマー名に「ｆ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｆ＿１４、ＣＴＡ４ＴＧ－ｆ＿１４、ＴＴＧ４ＡＣ－ｆ＿１４、ＧＴＴ４ＣＣ－ｆ＿１４、ＧＴＴ４ＴＣ－ｆ＿１４、ＧＴＧ４ＡＣ－ｆ＿１４、ＧＴ６ＴＣ－ｆ＿１４及びＴＧ６ＡＣ－ｆ＿１４）、及び「ｒ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｒ＿１４、ＣＴＡ４ＴＧ－ｒ＿１４、ＴＴＧ４ＡＣ－ｒ＿１４、ＧＴＴ４ＣＣ－ｒ＿１４、ＧＴＴ４ＴＣ－ｒ＿１４、ＧＴＧ４ＡＣ－ｒ＿１４、ＧＴ６ＴＣ－ｒ＿１４及びＴＧ６ＡＣ－ｒ＿１４）の、それぞれ１種以上含有される。
【0051】
更に好ましいプライマーセットは、上記配列番号９７～１１２の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、１４種以上又は１５種以上を組み合わせてなるプライマーセットであり、最も好ましいプライマーセットは、上記配列番号９７～１１２に記載の塩基配列からなるプライマーの全てを組み合わせてなるプライマーセットである。
【0052】
他の好ましいプライマーセットとして、例えば、下記表８に記載する配列番号１１３～１２８の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上を組み合わせてなるプライマーセットを挙げることができる。ただし、このようなプライマーセットには、下記表８におけるプライマー名に「ｆ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｆ＿３＿４、ＣＴＡ４ＴＧ－ｆ＿３＿４、ＴＴＧ４ＡＣ－ｆ＿３＿４、ＧＴＴ４ＣＣ－ｆ＿３＿４、ＧＴＴ４ＴＣ－ｆ＿３＿４、ＧＴＧ４ＡＣ－ｆ＿３＿４、ＧＴ６ＴＣ－ｆ＿３＿４又はＴＧ６ＡＣ－ｆ＿３＿４）、及び「ｒ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｒ＿３＿４、ＣＴＡ４ＴＧ－ｒ＿３＿４、ＴＴＧ４ＡＣ－ｒ＿３＿４、ＧＴＴ４ＣＣ－ｒ＿３＿４、ＧＴＴ４ＴＣ－ｒ＿３＿４、ＧＴＧ４ＡＣ－ｒ＿３＿４、ＧＴ６ＴＣ－ｒ＿３＿４又はＴＧ６ＡＣ－ｒ＿３＿４）の、それぞれ１種以上が含有される。
【0053】
更に好ましいプライマーセットは、上記配列番号１１３～１２８の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、１４種以上又は１５種以上を組み合わせてなるプライマーセットであり、最も好ましいプライマーセットは、上記配列番号１１３～１２８に記載の塩基配列からなるプライマーの全てを組み合わせてなるプライマーセットである。
【0054】
他の好ましいプライマーセットとして、例えば、下記表９に記載する配列番号１２９～１４４の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上を組み合わせてなるプライマーセットを挙げることができる。ただし、このようなプライマーセットには、下記表９におけるプライマー名に「ｆ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｆ＿３＿５、ＣＴＡ４ＴＧ－ｆ＿３＿５、ＴＴＧ４ＡＣ－ｆ＿３＿５、ＧＴＴ４ＣＣ－ｆ＿３＿５、ＧＴＴ４ＴＣ－ｆ＿３＿５、ＧＴＧ４ＡＣ－ｆ＿３＿５、ＧＴ６ＴＣ－ｆ＿３＿５又はＴＧ６ＡＣ－ｆ＿３＿５）、及び「ｒ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｒ＿３＿５、ＣＴＡ４ＴＧ－ｒ＿３＿５、ＴＴＧ４ＡＣ－ｒ＿３＿５、ＧＴＴ４ＣＣ－ｒ＿３＿５、ＧＴＴ４ＴＣ－ｒ＿３＿５、ＧＴＧ４ＡＣ－ｒ＿３＿５、ＧＴ６ＴＣ－ｒ＿３＿５又はＴＧ６ＡＣ－ｒ＿３＿５）の、それぞれ１種以上が含有される。
【0055】
更に好ましいプライマーセットは、上記配列番号１２９～１４４の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、１４種以上又は１５種以上を組み合わせてなるプライマーセットであり、最も好ましいプライマーセットは、上記配列番号１２９～１４４に記載の塩基配列からなるプライマーの全てを組み合わせてなるプライマーセットである。
【0056】
他の好ましいプライマーセットとして、例えば、下記表１０に記載する配列番号１４５～１６０の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上を組み合わせてなるプライマーセットを挙げることができる。ただし、このようなプライマーセットには、下記表１０における各プライマー名に「ｆ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｆ＿４＿５、ＣＴＡ４ＴＧ－ｆ＿４＿５、ＴＴＧ４ＡＣ－ｆ＿４＿５、ＧＴＴ４ＣＣ－ｆ＿４＿５、ＧＴＴ４ＴＣ－ｆ＿４＿５、ＧＴＧ４ＡＣ－ｆ＿４＿５、ＧＴ６ＴＣ－ｆ＿４＿５又はＴＧ６ＡＣ－ｆ＿４＿５）、及び「ｒ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｒ＿４＿５、ＣＴＡ４ＴＧ－ｒ＿４＿５、ＴＴＧ４ＡＣ－ｒ＿４＿５、ＧＴＴ４ＣＣ－ｒ＿４＿５、ＧＴＴ４ＴＣ－ｒ＿４＿５、ＧＴＧ４ＡＣ－ｒ＿４＿５、ＧＴ６ＴＣ－ｒ＿４＿５又はＴＧ６ＡＣ－ｒ＿４＿５）の、それぞれ１種以上が含有される。
【0057】
更に好ましいプライマーセットは、上記配列番号１４５～１６０の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、１４種以上又は１５種以上を組み合わせてなるプライマーセットであり、最も好ましいプライマーセットは、上記配列番号１４５～１６０に記載の塩基配列からなるプライマーの全てを組み合わせてなるプライマーセットである
【0058】
他の好ましいプライマーセットとして、例えば、下記表１１に記載する配列番号１６１～１７６の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上を組み合わせてなるプライマーセットを挙げることができる。ただし、このようなプライマーセットには、下記表１１における各プライマー名に「ｆ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｆ＿４＿６、ＣＴＡ４ＴＧ－ｆ＿４＿６、ＴＴＧ４ＡＣ－ｆ＿４＿６、ＧＴＴ４ＣＣ－ｆ＿４＿６、ＧＴＴ４ＴＣ－ｆ＿４＿６、ＧＴＧ４ＡＣ－ｆ＿４＿６、ＧＴ６ＴＣ－ｆ＿４＿６又はＴＧ６ＡＣ－ｆ＿４＿６）、及び「ｒ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｒ＿４＿６、ＣＴＡ４ＴＧ－ｒ＿４＿６、ＴＴＧ４ＡＣ－ｒ＿４＿６、ＧＴＴ４ＣＣ－ｒ＿４＿６、ＧＴＴ４ＴＣ－ｒ＿４＿６、ＧＴＧ４ＡＣ－ｒ＿４＿６、ＧＴ６ＴＣ－ｒ＿４＿６又はＴＧ６ＡＣ－ｒ＿４＿６）の、それぞれ１種以上が含有される。
【0059】
更に好ましいプライマーセットは、上記配列番号１６１～１７６の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、１４種以上又は１５種以上を組み合わせてなるプライマーセットであり、最も好ましいプライマーセットは、上記配列番号１６１～１７６に記載の塩基配列からなるプライマーの全てを組み合わせてなるプライマーセットである。
【0060】
他の好ましいプライマーセットとして、例えば、下記表１２に記載する配列番号１７７～１９２の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上を組み合わせてなるプライマーセットを挙げることができる。ただし、このようなプライマーセットには、下記表１２における各プライマー名に「ｆ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｆ＿４＿７、ＣＴＡ４ＴＧ－ｆ＿４＿７、ＴＴＧ４ＡＣ－ｆ＿４＿７、ＧＴＴ４ＣＣ－ｆ＿４＿７、ＧＴＴ４ＴＣ－ｆ＿４＿７、ＧＴＧ４ＡＣ－ｆ＿４＿７、ＧＴ６ＴＣ－ｆ＿４＿７又はＴＧ６ＡＣ－ｆ＿４＿７）、及び「ｒ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｒ＿４＿７、ＣＴＡ４ＴＧ－ｒ＿４＿７、ＴＴＧ４ＡＣ－ｒ＿４＿７、ＧＴＴ４ＣＣ－ｒ＿４＿７、ＧＴＴ４ＴＣ－ｒ＿４＿７、ＧＴＧ４ＡＣ－ｒ＿４＿７、ＧＴ６ＴＣ－ｒ＿４＿７又はＴＧ６ＡＣ－ｒ＿４＿７）の、それぞれ１種以上が含有する。
【0061】
更に好ましいプライマーセットは、上記配列番号１７７～１９２の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、１４種以上又は１５種以上を組み合わせてなるプライマーセットであり、最も好ましいプライマーセットは、上記配列番号１７７～１９２に記載の塩基配列からなるプライマーの全てを組み合わせてなるプライマーセットである。
【0062】
他の好ましいプライマーセットとして、例えば、下記表１３に記載する配列番号１９３～２０８の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上を組み合わせてなるプライマーセットを挙げることができる。ただし、このようなプライマーセットには、下記表１３における各プライマー名に「ｆ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｆ＿４＿８、ＣＴＡ４ＴＧ－ｆ＿４＿８、ＴＴＧ４ＡＣ－ｆ＿４＿８、ＧＴＴ４ＣＣ－ｆ＿４＿８、ＧＴＴ４ＴＣ－ｆ＿４＿８、ＧＴＧ４ＡＣ－ｆ＿４＿８、ＧＴ６ＴＣ－ｆ＿４＿８又はＴＧ６ＡＣ－ｆ＿４＿８）、及び「ｒ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｒ＿４＿８、ＣＴＡ４ＴＧ－ｒ＿４＿８、ＴＴＧ４ＡＣ－ｒ＿４＿８、ＧＴＴ４ＣＣ－ｒ＿４＿８、ＧＴＴ４ＴＣ－ｒ＿４＿８、ＧＴＧ４ＡＣ－ｒ＿４＿８、ＧＴ６ＴＣ－ｒ＿４＿８又はＴＧ６ＡＣ－ｒ＿４＿８）の、それぞれ１種以上が含有される。
【0063】
更に好ましいプライマーセットは、上記配列番号１９３～２０８の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、１４種以上又は１５種以上を組み合わせてなるプライマーセットであり、最も好ましいプライマーセットは、上記配列番号１９３～２０８に記載の塩基配列からなるプライマーの全てを組み合わせてなるプライマーセットである。
【0064】
他の好ましいプライマーセットとして、例えば、下記表１４に記載する配列番号２０９～２２４の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上を組み合わせてなるプライマーセットを挙げることができる。ただし、このようなプライマーセットには、下記表１４における各プライマー名に「ｆ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｆ＿４＿９、
ＣＴＡ４ＴＧ－ｆ＿４＿９、ＴＴＧ４ＡＣ－ｆ＿４＿９、ＧＴＴ４ＣＣ－ｆ＿４＿９、ＧＴＴ４ＴＣ－ｆ＿４＿９、ＧＴＧ４ＡＣ－ｆ＿４＿９、ＧＴ６ＴＣ－ｆ＿４＿９又はＴＧ６ＡＣ－ｆ＿４＿９）、及び「ｒ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｒ＿４＿９、ＣＴＡ４ＴＧ－ｒ＿４＿９、ＴＴＧ４ＡＣ－ｒ＿４＿９、ＧＴＴ４ＣＣ－ｒ＿４＿９、ＧＴＴ４ＴＣ－ｒ＿４＿９、ＧＴＧ４ＡＣ－ｒ＿４＿９、ＧＴ６ＴＣ－ｒ＿４＿９又はＴＧ６ＡＣ－ｒ＿４＿９）の、それぞれ１種以上が含有される。
ＣＴＡ４ＴＧ－ｆ＿４＿９、ＴＴＧ４ＡＣ－ｆ＿４＿９、ＧＴＴ４ＣＣ－ｆ＿４＿９、ＧＴＴ４ＴＣ－ｆ＿４＿９、ＧＴＧ４ＡＣ－ｆ＿４＿９、ＧＴ６ＴＣ－ｆ＿４＿９又はＴＧ６ＡＣ－ｆ＿４＿９）、及び「ｒ」との記載があるもの（具体的には、ＡＣＴ４ＴＧ－ｒ＿４＿９、ＣＴＡ４ＴＧ－ｒ＿４＿９、ＴＴＧ４ＡＣ－ｒ＿４＿９、ＧＴＴ４ＣＣ－ｒ＿４＿９、ＧＴＴ４ＴＣ－ｒ＿４＿９、ＧＴＧ４ＡＣ－ｒ＿４＿９、ＧＴ６ＴＣ－ｒ＿４＿９又はＴＧ６ＡＣ－ｒ＿４＿９）の、それぞれ１種以上が含有される。
【0065】
更に好ましいプライマーセットは、上記配列番号２０９～２２４の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、１４種以上又は１５種以上を組み合わせてなるプライマーセットであり、最も好ましいプライマーセットは、上記配列番号２０９～２２４に記載の塩基配列からなるプライマーの全てを組み合わせてなるプライマーセットである。
【0066】
他の好ましいプライマーセットとして、例えば、下記表１５に記載する配列番号２２５～２４０の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上を組み合わせてなるプライマーセットを挙げることができる。ただし、このようなプライマーセットには、下記表１５における各プライマー名に「ｆ」との記載があるもの（具体的には、ＴＣＡ４ＡＧ－ｆ、ＣＡＴ４ＡＧ－ｆ、ＡＡＧ４ＴＣ－ｆ、ＧＡＡ４ＣＣ－ｆ、ＧＡＡ４ＡＣ－ｆ、ＧＡＧ４ＴＣ－ｆ、ＧＡ６ＡＣ－ｆ又はＡＧ６ＴＣ－ｆ）、及び「ｒ」との記載があるもの（具体的には、ＴＣＡ４ＡＧ－ｒ、ＣＡＴ４ＡＧ－ｒ、ＡＡＧ４ＴＣ－ｒ、ＧＡＡ４ＣＣ－ｒ、ＧＡＡ４ＡＣ－ｒ、ＧＡＧ４ＴＣ－ｒ、ＧＡ６ＡＣ－ｒ又はＡＧ６ＴＣ－ｒ）の、それぞれ１種以上が含有される。
【0067】
更に好ましいプライマーセットは、上記配列番号２２５～２４０の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、１４種以上又は１５種以上を組み合わせてなるプライマーセットであり、最も好ましいプライマーセットは、上記配列番号２２５～２４０に記載の塩基配列からなるプライマーの全てを組み合わせてなるプライマーセットである。
【0068】
他の好ましいプライマーセットとして、例えば、下記表１６に記載する配列番号２４１～２５６の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上を組み合わせてなるプライマーセットを挙げることができる。ただし、このようなプライマーセットには、下記表１６における各プライマー名に「ｆ」との記載があるもの（具体的には、ＴＣＡ４ＡＧ－ｆ＿４、ＣＡＴ４ＡＧ－ｆ＿４、ＡＡＧ４ＴＣ－ｆ＿４、ＧＡＡ４ＣＣ－ｆ＿４、ＧＡＡ４ＡＣ－ｆ＿４、ＧＡＧ４ＴＣ－ｆ＿４、ＧＡ６ＡＣ－ｆ＿４又はＡＧ６ＴＣ－ｆ＿４）、及び「ｒ」との記載があるもの（具体的には、ＴＣＡ４ＡＧ－ｒ＿４、ＣＡＴ４ＡＧ－ｒ＿４、ＡＡＧ４ＴＣ－ｒ＿４、ＧＡＡ４ＣＣ－ｒ＿４、ＧＡＡ４ＡＣ－ｒ＿４、ＧＡＧ４ＴＣ－ｒ＿４、ＧＡ６ＡＣ－ｒ＿４又はＡＧ６ＴＣ－ｒ＿４）の、それぞれ１種以上が含有される。
【0069】
更に好ましいプライマーセットは、上記配列番号２４１～２５６の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、１４種以上又は１５種以上を組み合わせてなるプライマーセットであり、最も好ましいプライマーセットは、上記配列番号２４１～２５６に記載の塩基配列からなるプライマーの全てを組み合わせてなるプライマーセットである。
【0070】
他の好ましいプライマーセットとして、例えば、下記表１７に記載する配列番号２５７～２７２の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも２種以上を組み合わせてなるプライマーセットを挙げることができる。ただし、このようなプライマーセットには、下記表１７における各プライマー名に「ｆ」との記載があるもの（具体的には、ＴＣＡ４ＡＧ－ｆ＿４＿５、ＣＡＴ４ＡＧ－ｆ＿４＿５、ＡＡＧ４ＴＣ－ｆ＿４＿５、ＧＡＡ４ＣＣ－ｆ＿４＿５、ＧＡＡ４ＡＣ－ｆ＿４＿５、ＧＡＧ４ＴＣ－ｆ＿４＿５、ＧＡ６ＡＣ－ｆ＿４＿５又はＡＧ６ＴＣ－ｆ＿４＿５）及び「ｒ」との記載があるもの（具体的には、ＴＣＡ４ＡＧ－ｒ＿４＿５、ＣＡＴ４ＡＧ－ｒ＿４＿５、ＡＡＧ４ＴＣ－ｒ＿４＿５、ＧＡＡ４ＣＣ－ｒ＿４＿５、ＧＡＡ４ＡＣ－ｒ＿４＿５、ＧＡＧ４ＴＣ－ｒ＿４＿５、ＧＡ６ＡＣ－ｒ＿４＿５又はＡＧ６ＴＣ－ｒ＿４＿５）の、それぞれ１種以上が含有される。
【0071】
更に好ましいプライマーセットは、上記配列番号２５７～２７２の何れかに記載の塩基配列からなるプライマーの少なくとも３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上、１３種以上、１４種以上又は１５種以上を組み合わせてなるプライマーセットであり、最も好ましいプライマーセットは、上記配列番号２５７～２７２に記載の塩基配列からなるプライマーの全てを組み合わせてなるプライマーセットである。
【0072】
ＤＮＡライブラリーの製造方法
本発明のＤＮＡライブラリーの製造方法は、検出対象のゲノム及び上記本発明のプライマー又はプライマーセットを含む混合物を核酸増幅反応に供する工程を含有する。
本発明のＤＮＡライブラリーの製造方法は、検出対象のゲノム及び上記本発明のプライマー又はプライマーセットを含む混合物を核酸増幅反応に供する工程を含有する。
【0073】
上記本発明のＤＮＡライブラリーの製造方法は、次世代シーケンスに用いられるＤＮＡライブラリーに最適化することが可能である。そのため、当該次世代シーケンスの検出方法に応じて上記核酸増幅工程における温度、時間を適宜調節することが可能である。また、本発明のＤＮＡライブラリーの製造方法において使用するＤＮＡポリメラーゼ、検出対象ゲノム、本発明のプライマー又はプライマーセットの濃度も当該次世代シーケンスの検出方法に応じて適宜調製することが可能である。
【0074】
上記本発明のＤＮＡライブラリーの製造方法には、核酸増幅反応に供して得られる産物を、プーリング、精製、サイズセレクション等の追加工程に供することも可能である。これらの追加工程は、公知の方法を広く採用することができ、特に限定されず、製造したＤＮＡライブラリーを使用する次世代シーケンスの検出方法に応じて、適宜選択することができる。
【0075】
上述した本発明の各実施態様又は実施形態について説明した性質、構造、機能等の各種の特性は、本発明に包含される態様又は主題を特定するにあたり、適宜組み合わせることができる。すなわち、本発明には、本明細書で開示する、組み合わせることができる各特性の態様の全ての発明を包含することができる。
【実施例0076】
以下に、本発明をより詳細に説明するための実施例を示す。本発明が下記に示す実施例に限定されないのは言うまでもない。
【0077】
実施例１
以下の方法にて検出対象のゲノムをテンプレートにして多型検出用のＤＮＡライブラリーを合成した。具体的には、トマト品種ＭＰＫ－１およびＭｉｃｒｏ－Ｔｏｍに対して、複数のｄｐＭＩＧ－ｓｅｑのマルチプレックスプライマーセットを用いた、ＰＣＲによって、１ｓｔＰＣＲを行いライブラリー作成を行なった。
以下の方法にて検出対象のゲノムをテンプレートにして多型検出用のＤＮＡライブラリーを合成した。具体的には、トマト品種ＭＰＫ－１およびＭｉｃｒｏ－Ｔｏｍに対して、複数のｄｐＭＩＧ－ｓｅｑのマルチプレックスプライマーセットを用いた、ＰＣＲによって、１ｓｔＰＣＲを行いライブラリー作成を行なった。
【0078】
１．１ｓｔＰＣＲ
１ｓｔＰＣＲでは、検出ゲノム全体の一部の領域を満遍なく増幅させる。
１ｓｔＰＣＲでは、検出ゲノム全体の一部の領域を満遍なく増幅させる。
【0079】
下記表１～１７のそれぞれに示すプライマーセットに含有される１６種類の各プライマー（１０μｌ）を混したｓｔＰＣＲ用プライマーＭｉｘを調整した。
【0080】
表１～１７に示す塩基配列において、下線部が（Ｂ）であり、その３’末端側が（Ａ）領域であり及びその５’末端側が（Ｃ）領域である。また、プライマー名は、前から（Ｂ）領域における繰り返し配列、その繰り返し数及び（Ｃ）領域の塩基配列を示し、ハイフン（－）の後のアルファベットは、Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（ｆ）又はリバースプライマー（ｒ）を示す。表２～１４、１６及び１７に記載するＮは、縮重塩基（Ａ，Ｃ，Ｇ又はＴの何れか）を示す。
【0081】
なお、表１に記載のプライマーは、ＳｕｙａｍａらのＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ｜５：１６９６３に記載された塩基配列からなるものである。
【0082】
なお、下記表におけるＰＣＲ酵素は、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（ＴＡＫＡＲＡ）を使用した。具体的な１ｓｔＰＣＲ反応液を以下のように調整した。
・２．２４μＬの１ｓｔＰＣＲ用プライマーＭｉｘ
・３．５μＬの２ｘ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｂｕｆｆｅｒ
・０．０３５のμＬＰＣＲ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ
・０．２２５μＬのｓｔＤＷ
・２．２４μＬの１ｓｔＰＣＲ用プライマーＭｉｘ
・３．５μＬの２ｘ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｂｕｆｆｅｒ
・０．０３５のμＬＰＣＲ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ
・０．２２５μＬのｓｔＤＷ
【0083】
上記１ｓｔＰＣＲ反応液をチューブに入れて、その後、テンプレートとするトマト品種ＭＰＫ－１及びＭｉｃｒｏ－Ｔｏｍの葉から抽出した２０ｎｇ／μＬのＤＮＡ溶液を１μＬ加えて混合し、下記の条件で１ｓｔＰＣＲに供した。
【0084】
９４℃ １ｍｉｎ（初期変性）
２５ｃｙｃｌｅ－－－－－
９４℃ ３０ｓｅｃ（変性）
３８℃ １ｍｉｎ（アニーリング）
７２℃ １ｍｉｎ（伸長反応）
－－－－－－－－－－－－－
７２℃ １０ｍｉｎ
２５ｃｙｃｌｅ－－－－－
９４℃ ３０ｓｅｃ（変性）
３８℃ １ｍｉｎ（アニーリング）
７２℃ １ｍｉｎ（伸長反応）
－－－－－－－－－－－－－
７２℃ １０ｍｉｎ
【0085】
１ｓｔＰＣＲに供した反応物をアガロース電気泳動にてスメアを呈することを確認した後に、これをｓｔＤＷにて５０倍に薄めて２ｎｄＰＣＲ工程に供した。
【0086】
【表1】
【0087】
【表2】
【0088】
【表3】
【0089】
【表4】
【0090】
【表5】
【0091】
【表6】
【0092】
【表7】
【0093】
【表8】
【0094】
【表9】
【0095】
【表10】
【0096】
【表11】
【0097】
【表12】
【0098】
【表13】
【0099】
【表14】
【0100】
【表15】
【0101】
【表16】
【0102】
【表17】
【0103】
２．２ｎｄＰＣＲ
２ｎｄＰＣＲでは、サンプル識別のためのバーコードを付加し、最終的にＤＮＡ配列を検出する次世代シーケンサー（ｉｌｌｕｍｉｎａ社：ＨｉｓｅｑＸ）のプラットフォームに対応するＰ５及びＰ７アダプター配列を付加した塩基配列の構造にする。具体的な２ｎｄＰＣＲ反応の１０ｘワーキングミックス液を以下のように調整した。
２ｎｄＰＣＲでは、サンプル識別のためのバーコードを付加し、最終的にＤＮＡ配列を検出する次世代シーケンサー（ｉｌｌｕｍｉｎａ社：ＨｉｓｅｑＸ）のプラットフォームに対応するＰ５及びＰ７アダプター配列を付加した塩基配列の構造にする。具体的な２ｎｄＰＣＲ反応の１０ｘワーキングミックス液を以下のように調整した。
【0104】
・１．５μＬ Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒ（商標） ＧＸＬ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）
・６４．５μＬ ｓｔＤＷ
・１２.０μＬ ｄＮＴＰｓ
・６４．５μＬ ｓｔＤＷ
・１２.０μＬ ｄＮＴＰｓ
【0105】
具体的な２ｎｄＰＣＲ反応液を以下のように調整した。
１０．８μＬの上記ワーキングミックス
３μＬの１ｓｔＰＣＲ産物（５０倍希釈物）
０．６μＬのｉｎｄｅｘｉｎｇプライマーＦ（１０μＭ）
０．６μＬのｉｎｄｅｘｉｎｇプライマーＲ（１０μＭ）
１０．８μＬの上記ワーキングミックス
３μＬの１ｓｔＰＣＲ産物（５０倍希釈物）
０．６μＬのｉｎｄｅｘｉｎｇプライマーＦ（１０μＭ）
０．６μＬのｉｎｄｅｘｉｎｇプライマーＲ（１０μＭ）
【0106】
各サンプルの上記２ｎｄＰＣＲに使用したプライマー名（配列番号）と１ｓｔＲＣＲのプライマーセットとの組み合わせを下記の表１８に示す。また、表１９に２ｎｄＰＣＲに使用した各プライマーの塩基配列を示す。なお、各サンプルで２セットずつの２ｎｄＰＣＲに使用したプライマーを使用して、それらのサンプルによって得られた結果を統合した。
【0107】
なお、対照実験として使用する１ｓｔＲＣＲのプライマーセットのＭＩＧについて、ＭＰＫ－１サンプルの２ｎｄフォワードプライマーとしてＳ５７６と、２ｎｄリバースプライマーとしてＳ７４２との組み合わせを使用した。また、Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍサンプルの２ｎｄフォワードプライマーとしてＳ５８２と、２ｎｄリバースプライマーとしてＳ７９５との組み合わせを使用した。
・Ｓ５７６（配列番号２７３）
５’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGGACATCAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTG-３’
・Ｓ７４２（配列番号２７４）
５’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGGATTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAC-３’
・Ｓ５８２（配列番号２７５）
５’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGGTGTACAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTG-３’
・Ｓ７９５（配列番号２７６）
５’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGCTCATGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAC-３’
・Ｓ５７６（配列番号２７３）
５’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGGACATCAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTG-３’
・Ｓ７４２（配列番号２７４）
５’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGGATTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAC-３’
・Ｓ５８２（配列番号２７５）
５’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGGTGTACAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTG-３’
・Ｓ７９５（配列番号２７６）
５’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGCTCATGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAC-３’
【0108】
【表18】
【0109】
【表19】
【0110】
２ｎｄＰＣＲの条件は以下の通りである。
９８℃ ３０ｓｅｃ（初期変性）
２０ｃｙｃｌｅ－－－－－
９８℃ １０ｓｅｃ（変性）
５４℃ １５ｓｅｃ（アニーリング）
６８℃ ３０ｓｅｃ（伸長）
－－－－－－－－－－－－－
６８℃ ７ｍｉｎ
９８℃ ３０ｓｅｃ（初期変性）
２０ｃｙｃｌｅ－－－－－
９８℃ １０ｓｅｃ（変性）
５４℃ １５ｓｅｃ（アニーリング）
６８℃ ３０ｓｅｃ（伸長）
－－－－－－－－－－－－－
６８℃ ７ｍｉｎ
【0111】
３．プーリング・精製・サイズセレクション工程
上記に得られた２ｎｄＰＣＲ産物を、ＡＭｐｕｒｅＸＰ（日本ジェネティクス社）による以下の方法により精製した。
１．２ｎｄＰＣＲ産物を電気泳動で確認後、各１０μＬを混合する
２．ｐｏｏｌｉｎｇライブラリー１００μＬに１８０μＬのＡＭｐｕｒｅ加えてピペッティング後、５分間静置する。
３．マグネットスタンド上で２分静置し、その後、上澄みを捨てる。
４．７０％のＥｔＯＨを加えて３０秒静置し、７０％ＥｔＯＨを捨てる洗浄を２回繰り返す。
５．１００μＬのＴＥを加えて１分静置する。
６．マグネットスタンドで１分静置する。
７．上澄み１００μＬを回収する。
上記に得られた２ｎｄＰＣＲ産物を、ＡＭｐｕｒｅＸＰ（日本ジェネティクス社）による以下の方法により精製した。
１．２ｎｄＰＣＲ産物を電気泳動で確認後、各１０μＬを混合する
２．ｐｏｏｌｉｎｇライブラリー１００μＬに１８０μＬのＡＭｐｕｒｅ加えてピペッティング後、５分間静置する。
３．マグネットスタンド上で２分静置し、その後、上澄みを捨てる。
４．７０％のＥｔＯＨを加えて３０秒静置し、７０％ＥｔＯＨを捨てる洗浄を２回繰り返す。
５．１００μＬのＴＥを加えて１分静置する。
６．マグネットスタンドで１分静置する。
７．上澄み１００μＬを回収する。
【0112】
また、ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ（ベックマン社）以下に示す方法にてサイズセレクションに供した。
レフトサイドセレクション１：０．７５＝サンプル：ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ
・１００μＬの精製したＤＮＡに７５μＬのＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔを加える。
・マグネットスタンドへ置き１分静置する。
・上澄みを捨てて８５％エタノール２００μＬで洗浄する。
・１００μＬのＴＥを加えて１分静置する。
・マグネットスタンドへ移動し上澄みを回収する。
ライトサイドセレクション１：０．５６＝サンプル：ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ
・１００μＬの精製したＤＮＡに５６μＬのＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔを加える。
・マグネットスタンドへ置き１分静置する。
・上澄みを新しいチューブに移動させ、１２４μＬのＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔを加えて１０回以上ピペッティングし、１分静置する。
・マグネットスタンドへ置き、上澄みを捨てて８５％エタノール２００μＬで洗浄する。
・１２～４２μＬのＴＥを加えて、ピペッティングし１分静置する。
・マグネットスタンドへ移動し上澄みを回収する。
レフトサイドセレクション１：０．７５＝サンプル：ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ
・１００μＬの精製したＤＮＡに７５μＬのＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔを加える。
・マグネットスタンドへ置き１分静置する。
・上澄みを捨てて８５％エタノール２００μＬで洗浄する。
・１００μＬのＴＥを加えて１分静置する。
・マグネットスタンドへ移動し上澄みを回収する。
ライトサイドセレクション１：０．５６＝サンプル：ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ
・１００μＬの精製したＤＮＡに５６μＬのＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔを加える。
・マグネットスタンドへ置き１分静置する。
・上澄みを新しいチューブに移動させ、１２４μＬのＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔを加えて１０回以上ピペッティングし、１分静置する。
・マグネットスタンドへ置き、上澄みを捨てて８５％エタノール２００μＬで洗浄する。
・１２～４２μＬのＴＥを加えて、ピペッティングし１分静置する。
・マグネットスタンドへ移動し上澄みを回収する。
【0113】
得られたサンプルを次世代シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社：ＨｉｓｅｑＸ）で１５１ｂｐ ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄの塩基配列からｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃによるリードのトリミング、ｂｗａによるマッピングｓａｍｔｏｏｌｓ ｍｐｉｌｅｕｐによるバリアントコールを行い、従来のＭＩＧ－ｓｅｑと多型（ＳＮＰ／ｉｎｄｅｌｓ）の数の比較を行なった。結果を図１に示す。
【0114】
図１に示すように、トマト品種ＭＰＫ－１およびＭｉｃｒｏ－Ｔｏｍにおいて、１塩基のみ縮重塩基を導入した場合（図中の３Ｎ、４Ｎ、５Ｎ、７Ｎ、１４Ｎ）、今回利用したプライマーセットについては、いずれの位置が縮重塩基であっても、シーケンスできる遺伝子座が増加することが明らかとなった。また、３’末端から４塩基目と５塩基目に縮重塩基を導入した場合（図中の４＿５Ｎ）に、最も検出できる多型の数が増加することも明らかとなった。また、本発明の実験時に新たに作成したＭＩＧ－ｓｅｑプライマーセットにおいても、４塩基目と５塩基目に縮重塩基を導入した場合（図中のｃｍ４＿５）に、検出できる多型の数が増加した。
【0115】
一方で縮重塩基を４つ以上導入した場合（図中の４＿７Ｎ、４＿８Ｎ及び４＿９Ｎ）、多型の数は減少し、特に４～９塩基目の場合（４＿９Ｎ）は、１ｓｔＰＣＲの増幅がほとんど認められなかった。
【0116】
また、図２に示す結果から、各プライマーセット間では通常のＭＩＧ－ｓｅｑと多くとも３割程度しか多型が共通しておらず、従来のＭＩＧ（図中のＣｏｎｔｒｏｌ）で読める遺伝子座とは違う遺伝子座をシーケンスできることが明らかとなった。
【0117】
実施例２
上記実施例１におけるトマト品種ＭＰＫ－１及びＭｉｃｒｏ－Ｔｏｍに代えて、モモ系統ＰＰ７及びＰＰ９並びにトウガラシ品種「鷹ヶ峰」及び「Ｒｅｄ ｈａｂａｎｅｒｏ」を使用した。また、プライマーセットとして、表１に記載のＭＩＧ、表３のＭＩＧ－４Ｎ及び表１０のＭＩＧ－４：５Ｎを使用した。その他は、実施例１と同様にしてＤＮＡライブラリーを作成し、多型解析を行った。この実験にて使用した２ｎｄＰＣＲプライマー名（配列番号）と１ｓｔＲＣＲのプライマーセットとの組み合わせを下記の表２０に示す。また、表２１に２ｎｄＰＣＲに使用した各プライマーの塩基配列を示す。その結果を図３に示す。
上記実施例１におけるトマト品種ＭＰＫ－１及びＭｉｃｒｏ－Ｔｏｍに代えて、モモ系統ＰＰ７及びＰＰ９並びにトウガラシ品種「鷹ヶ峰」及び「Ｒｅｄ ｈａｂａｎｅｒｏ」を使用した。また、プライマーセットとして、表１に記載のＭＩＧ、表３のＭＩＧ－４Ｎ及び表１０のＭＩＧ－４：５Ｎを使用した。その他は、実施例１と同様にしてＤＮＡライブラリーを作成し、多型解析を行った。この実験にて使用した２ｎｄＰＣＲプライマー名（配列番号）と１ｓｔＲＣＲのプライマーセットとの組み合わせを下記の表２０に示す。また、表２１に２ｎｄＰＣＲに使用した各プライマーの塩基配列を示す。その結果を図３に示す。
【0118】
なお、対照実験として使用する１ｓｔＲＣＲのプライマーセットのＭＩＧについて、ＰＰ７サンプルの２ｎｄフォワードプライマーとしてＳ５８５と、２ｎｄリバースプライマーとしてＳ７７２との組み合わせを使用した。また、ＰＰ９サンプルの２ｎｄフォワードプライマーとしてＳ５４８と、２ｎｄリバースプライマーとしてＳ７５５との組み合わせを使用した。また、「鷹ヶ峰」サンプルの２ｎｄフォワードプライマーとして上記Ｓ５４３と、２ｎｄリバースプライマーとしてＳ７０４との組み合わせを使用した。また、Ｒｅｄ ｈａｂａｎｅｒｏサンプルの２ｎｄフォワードプライマーとして上記Ｓ５７５と、２ｎｄリバースプライマーとしてＳ７１５との組み合わせを使用した。
・Ｓ５８５（配列番号２９８）
５’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGAACGGTTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTG-３’
・Ｓ７７２（配列番号２９９）
５’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAGATGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAC-３’
・Ｓ５４８（配列番号３００）
５’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTCATCGTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTG-３’
・Ｓ７５５（配列番号３０１）
５’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTCGCAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAC-３’
・Ｓ７０４（配列番号３０２）
５’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTCCTCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAC-３’
・Ｓ７１５（配列番号３０３）
５’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTCCTCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAC-３’
・Ｓ５８５（配列番号２９８）
５’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGAACGGTTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTG-３’
・Ｓ７７２（配列番号２９９）
５’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAGATGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAC-３’
・Ｓ５４８（配列番号３００）
５’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTCATCGTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTG-３’
・Ｓ７５５（配列番号３０１）
５’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTCGCAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAC-３’
・Ｓ７０４（配列番号３０２）
５’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTCCTCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAC-３’
・Ｓ７１５（配列番号３０３）
５’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTCCTCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAC-３’
【0119】
【表20】
【0120】
【表21】
【0121】
図３に示すように、モモおよびトウガラシにおいても、実施例１のトマトと同様に３’末端から４、５塩基目を縮重塩基にした場合（図中のｄｐＭＩＧ＿４：５Ｎ）に検出された多型数が一番多く、３’末端から４塩基目を縮重塩基にした場合（図中のｄｐＭＩＧ＿４Ｎ）検出された多型数が２番目であり、ＭＩＧ（図中のＭＩＧ－ｓｅｑ）の場合に検出された多型数が一番少なかった。また、ｄｐＭＩＧ＿４：５Ｎ及びｄｐＭＩＧ＿４Ｎにおいて、多くの多型がＭＩＧ－ｓｅｑでシーケンス場合とは違う領域由来であった。これらの結果から、プライマーの３’末端側の内部配列の縮重塩基への置換による検出できる多型数の増加傾向は、トマト以外の種においても確認され、本発明の汎用性が示された。
【0122】
実施例３
ＭＩＧ法では、ＤＮＡライブラリー構築の最初の反応がＰＣＲのため、夾雑物の多いＤＮＡや劣化したＤＮＡ等のような品質の低いＤＮＡからでも比較的ライブラリー構築が容易であるという利点が、上記実施例１及び２のような変異導入プライマーを使用した場合においても確認されるかを調査するため、ろ紙にダイコン系統ｒｓ５及びｒｓ６の葉の汁液を塗りつけたものをテンプレートとした１ｓｔＰＣＲによるライブラリー作成を行なった。
ＭＩＧ法では、ＤＮＡライブラリー構築の最初の反応がＰＣＲのため、夾雑物の多いＤＮＡや劣化したＤＮＡ等のような品質の低いＤＮＡからでも比較的ライブラリー構築が容易であるという利点が、上記実施例１及び２のような変異導入プライマーを使用した場合においても確認されるかを調査するため、ろ紙にダイコン系統ｒｓ５及びｒｓ６の葉の汁液を塗りつけたものをテンプレートとした１ｓｔＰＣＲによるライブラリー作成を行なった。
【0123】
Ｊｉａら（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０２１；６２（１０）：１５０３－１５０５．）の方法に従い、ろ紙をｓｏａｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ［２％のＳＤＳ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、６０ｍＭのＴｒｉ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）］に浸漬した後、風乾した。ダイコンの選抜系統ｒｓ５及びｒｓ６の若い葉（葉長２－３ｃｍ）を採取し、上記のろ紙とパラフィルムの間に挟んで上から１．５ｍＬエッペンチューブの先端をこすりつけることにより、葉の汁液をろ紙に染み込ませた。
【0124】
実施例２と同様に、表１に記載のＭＩＧ、表３のＭＩＧ－４Ｎ及び表１０のＭＩＧ－４：５Ｎをプライマーセットとして使用した。ＰＣＲ酵素は、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（ＴＡＫＡＲＡ）を使用した。具体的な１ｓｔＰＣＲ反応液を、実施例１と同様に調整した。テンプレートとして、上記のろ紙を生研トレパン（カイ インダストリーズ株式会社）でくり抜いて１ｓｔＰＣＲ反応液に入れた。その後、実施例１と同様に１ｓｔＰＣＲ及び２ｎｄＰＣＲに供して、従来のＭＩＧ－ｓｅｑと多型（ＳＮＰ／ｉｎｄｅｌｓ）の数の比較を行なった。この実験にて使用した２ｎｄＰＣＲプライマー名（配列番号）と１ｓｔＲＣＲのプライマーセットとの組み合わせを下記の表２２に示す。また、表２３に２ｎｄＰＣＲに使用した各プライマーの塩基配列を示す。結果を図４に示す。
【0125】
なお、対照実験として使用する１ｓｔＲＣＲのプライマーセットのＭＩＧについて、ｒｓ５サンプルの２ｎｄフォワードプライマーとしてＭＩＧ＿Ｓ５０５又はＳ５０１と、２ｎｄリバースプライマーとしてＳ７２７との組み合わせを使用した。また、ｒｓ６サンプルの２ｎｄフォワードプライマーとしてＳ５５４又はＳ５９８と、２ｎｄリバースプライマーとしてＳ７２７との組み合わせを使用した。
・Ｓ５０５（配列番号３１０）
５’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCGTATCTCACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTG-３’
・Ｓ５０１（配列番号３１１）
５’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTTACGTGCACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTG-３’
・Ｓ７２７（配列番号３１２）
５’- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGGTTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAC-３’
・Ｓ５５４（配列番号３１３）
５’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGCTAAGCACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTG-３’
・Ｓ５９８（配列番号３１４）
５’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAAGACACCACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTG-３’
・Ｓ５０５（配列番号３１０）
５’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCGTATCTCACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTG-３’
・Ｓ５０１（配列番号３１１）
５’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTTACGTGCACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTG-３’
・Ｓ７２７（配列番号３１２）
５’- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGGTTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAC-３’
・Ｓ５５４（配列番号３１３）
５’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGCTAAGCACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTG-３’
・Ｓ５９８（配列番号３１４）
５’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAAGACACCACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTG-３’
【0126】
【表22】
【0127】
【表23】
【0128】
図４に示すように、遺伝子座の数はＭＩＧよりもＭＩＧ－４ＮおよびＭＩＧ－４：５Ｎの方が多く、ＭＩＧ－４：５Ｎでは一番多くの遺伝子座をシーケンスすることができた。このように、品質の低いＤＮＡからでも所定の位置に縮重塩基を設けたプライマーを用いた場合、多くの遺伝子座を検出できることが明らかとなった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】