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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024045608
(43)【公開日】2024-04-02
(54)【発明の名称】制御性ＲＮＡを発現させるためのベクターシステム
(51)【国際特許分類】
C12N 15/867 20060101AFI20240326BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240326BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20240326BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240326BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20240326BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240326BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240326BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20240326BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240326BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240326BHJP
【ＦＩ】
C12N15/867 Z
C12N5/10 ZNA
C12N5/0775
C12N15/113 130Z
C12N15/86 Z
C12N7/01
A61P35/00
A61K35/28
A61K35/76
A61K48/00
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024022729
(22)【出願日】2024-02-19
(62)【分割の表示】P 2021523916の分割
【原出願日】2019-11-05
(31)【優先権主張番号】62/755,985
(32)【優先日】2018-11-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】517428713
【氏名又は名称】アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】テイラー ラフーゼン
(72)【発明者】
【氏名】リンジ シャオ
(72)【発明者】
【氏名】チャールズ デイビッド パウザ
(57)【要約】
【課題】制御性ＲＮＡを発現させるためのベクターシステムの提供。
【解決手段】ウイルスベクター、レンチウイルス粒子、および改変された細胞が開示される。それらは、ＫＩＦ１１遺伝子を標的化することができるスモールＲＮＡをコードまたは発現する。実施形態では、ウイルスベクターおよびレンチウイルス粒子は、その非コード領域がスモールＲＮＡによる活性に対して抵抗性であるように改変されているＫＩＦ１１遺伝子をさらに含む。
【選択図】なし
【解決手段】ウイルスベクター、レンチウイルス粒子、および改変された細胞が開示される。それらは、ＫＩＦ１１遺伝子を標的化することができるスモールＲＮＡをコードまたは発現する。実施形態では、ウイルスベクターおよびレンチウイルス粒子は、その非コード領域がスモールＲＮＡによる活性に対して抵抗性であるように改変されているＫＩＦ１１遺伝子をさらに含む。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１８年１１月５日に出願され、「ＶＥＣＴＯＲ ＳＹＳＴＥＭ ＦＯＲ
ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＲＥＧＵＬＡＴＯＲＹ ＲＮＡ」との表題の米国仮特許出願第６２／７５５，９８５号（この開示は、参照により本明細書に援用される）への優先権を主張する。
本出願は、２０１８年１１月５日に出願され、「ＶＥＣＴＯＲ ＳＹＳＴＥＭ ＦＯＲ
ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＲＥＧＵＬＡＴＯＲＹ ＲＮＡ」との表題の米国仮特許出願第６２／７５５，９８５号（この開示は、参照により本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【0002】
分野
本開示は、一般に、遺伝子療法、具体的には、制御性ＲＮＡをコードまたは発現するベクターおよび改変された細胞の使用に関する遺伝子療法の分野に関する。
本開示は、一般に、遺伝子療法、具体的には、制御性ＲＮＡをコードまたは発現するベクターおよび改変された細胞の使用に関する遺伝子療法の分野に関する。
【背景技術】
【0003】
背景
悪性または新生物性細胞は、細胞成長の不可欠な機構を遮断することができる制御性ＲＮＡ、特に阻害ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）により制御され得る。部分的には、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）はＲＮＡｉを産生するので、それらは細胞療法のためにますます使用されており、がん処置用の細胞送達ビヒクルとして想定される。ＭＳＣはまた、ＴＧＦ－βなどの免疫阻害性サイトカインを産生し、ｉｎ ｖｉｖｏで短い半減期を有するので、同種異系細胞療法のための良好な候補である。さらに、ＭＳＣは、腫瘍細胞膜上のコネキシン細孔と相互作用することができる形質膜細孔を作製するコネキシンファミリーの遺伝子を発現する。これらの細孔は、ＲＮＡｉなどの細胞質材料の交換を可能とし、腫瘍細胞中に成長阻害性ＲＮＡｉを送達するために活用され得る。ＭＳＣ療法は、再生医療のためおよび自己免疫性または炎症性疾患と戦うために現在使用されている。
悪性または新生物性細胞は、細胞成長の不可欠な機構を遮断することができる制御性ＲＮＡ、特に阻害ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）により制御され得る。部分的には、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）はＲＮＡｉを産生するので、それらは細胞療法のためにますます使用されており、がん処置用の細胞送達ビヒクルとして想定される。ＭＳＣはまた、ＴＧＦ－βなどの免疫阻害性サイトカインを産生し、ｉｎ ｖｉｖｏで短い半減期を有するので、同種異系細胞療法のための良好な候補である。さらに、ＭＳＣは、腫瘍細胞膜上のコネキシン細孔と相互作用することができる形質膜細孔を作製するコネキシンファミリーの遺伝子を発現する。これらの細孔は、ＲＮＡｉなどの細胞質材料の交換を可能とし、腫瘍細胞中に成長阻害性ＲＮＡｉを送達するために活用され得る。ＭＳＣ療法は、再生医療のためおよび自己免疫性または炎症性疾患と戦うために現在使用されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
ある態様では、ＫＩＦ１１の宿主コピーの非コード領域に結合することができるスモールＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列を含むウイルスベクターが提供される。
【0005】
実施形態では、ＫＩＦ１１の宿主コピーの非コード領域は、３’非翻訳領域または５’非翻訳領域である。実施形態では、スモールＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。実施形態では、スモールＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つを含む。実施形態では、ウイルスベクターは、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントをコードする第２のヌクレオチド配列をさらに含み、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントは、少なくとも１つの配列部分を欠いている。実施形態では、配列部分は、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントのコード領域または非コード領域を含む。配列部分が非コード領域を含む場合、配列部分は、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントの５’非翻訳領域または３’非翻訳領域のうちの少なくとも１つを含み得る。
【0006】
別の態様では、パッケージング細胞によって生産され、標的細胞を感染させることができるレンチウイルス粒子が提供され、レンチウイルス粒子は、標的細胞に感染することができるエンベロープタンパク質、およびＫＩＦ１１の宿主コピーの非コード領域に結合することができるスモールＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列を含む。
【0007】
実施形態では、非コード領域は、ＫＩＦ１１の宿主コピーの３’非翻訳領域または５’非翻訳領域である。実施形態では、スモールＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。実施形態では、スモールＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つを含む。実施形態では、レンチウイルス粒子は、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントをコードする第２のヌクレオチド配列をさらに含み、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントは、少なくとも１つの配列部分を欠いている。実施形態では、配列部分は、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントのコード領域または非コード領域を含む。配列部分が非コード領域を含む場合、配列部分は、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントの５’非翻訳領域または３’非翻訳領域のうちの少なくとも１つを含み得る。実施形態では、標的細胞は間葉系幹細胞である。
【0008】
別の態様では、レンチウイルス粒子に感染した間葉系幹細胞を含む改変された間葉系幹細胞であって、レンチウイルス粒子が、間葉系幹細胞に感染することができるエンベロープタンパク質、およびＫＩＦ１１の宿主コピーの非コード領域に結合することができるスモールＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列を含む、改変された間葉系幹細胞が提供される。
【0009】
実施形態では、非コード領域は、ＫＩＦ１１の宿主コピーの３’非翻訳領域または５’非翻訳領域である。実施形態では、スモールＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。実施形態では、スモールＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つを含む。実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、改変された間葉系幹細胞中に１細胞あたり約１～約１０コピーで存在する。
【0010】
実施形態では、レンチウイルス粒子は、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントをコードする第２のヌクレオチド配列をさらに含み、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントは、少なくとも１つの配列部分を欠いている。実施形態では、配列部分は、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントのコード領域または非コード領域を含む。配列部分が非コード領域を含む場合、配列部分は、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントの５’非翻訳領域または３’非翻訳領域のうちの少なくとも１つを含み得る。
【0011】
別の態様では、改変された間葉系幹細胞を生産する方法であって、間葉系幹細胞を有効量のレンチウイルス粒子に感染させることを含み、レンチウイルス粒子が、間葉系幹細胞に感染することができるエンベロープタンパク質、およびＫＩＦ１１の宿主コピーの非コード領域に結合することができるスモールＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列を含む、方法が提供される。
【0012】
実施形態では、非コード領域は、ＫＩＦ１１の宿主コピーの３’非翻訳領域または５’非翻訳領域である。実施形態では、スモールＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。実施形態では、スモールＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つを含む。実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、改変された間葉系幹細胞中に１細胞あたり約１～約１０コピーで存在する。
【0013】
実施形態では、レンチウイルス粒子は、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントをコードする第２のヌクレオチド配列をさらに含み、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントは、少なくとも１つの配列部分を欠いている。実施形態では、配列部分は、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントのコード領域または非コード領域を含む。配列部分が非コード領域を含む場合、配列部分は、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントの５’非翻訳領域または３’非翻訳領域のうちの少なくとも１つを含み得る。
【0014】
別の態様では、対象においてがんを処置する方法が提供される。方法は、治療有効量の任意の本明細書に記載の改変された間葉系幹細胞を対象に投与することを含む。実施形態では、改変された間葉系幹細胞は、対象にとって同種異系である。実施形態では、改変された間葉系幹細胞は、対象にとって自家である。実施形態では、がんは、癌腫、肉腫、骨髄腫、リンパ腫、混合型、またはそれらの混合物のうちのいずれか１つまたは複数から選択される。
【0015】
別の態様では、本明細書に記載の改変された間葉系幹細胞のいずれかを含む、がんを処置するための、改変された間葉系幹細胞の使用が提供される。
【0016】
別の態様では、対象においてがんを処置する方法であって、治療有効量の任意の本明細書に記載のレンチウイルス粒子を対象に投与することを含む、方法が提供される。
【0017】
実施形態では、がんは、癌腫、肉腫、骨髄腫、リンパ腫、混合型、またはそれらの混合物のうちのいずれか１つまたは複数から選択される。実施形態では、レンチウイルス粒子は、感染した標的細胞を介して対象に投与される。実施形態では、標的細胞は体細胞を含む。実施形態では、体細胞は肝細胞またはリンパ球を含む。実施形態では、体細胞はリンパ球を含み、リンパ球は腫瘍特異的Ｔ細胞を含む。実施形態では、標的細胞は幹細胞を含む。実施形態では、幹細胞は人工多能性幹細胞または間葉系幹細胞を含む。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
レンチウイルス粒子に感染した間葉系幹細胞を含む改変された間葉系幹細胞であって、前記レンチウイルス粒子が、
前記間葉系幹細胞に感染することができるエンベロープタンパク質、および
ＫＩＦ１１の宿主コピーの非コード領域に結合することができるスモールＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列
を含む、改変された間葉系幹細胞。
（項目２）
ＫＩＦ１１の前記宿主コピーの前記非コード領域が３’非翻訳領域または５’非翻訳領域である、項目１に記載の改変された間葉系幹細胞。
（項目３）
前記スモールＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、項目１に記載の改変された間葉系幹細胞。
（項目４）
前記スモールＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つを含む、項目３に記載の改変された間葉系幹細胞。
（項目５）
スモールＲＮＡをコードする前記第１のヌクレオチド配列が、前記改変された間葉系幹細胞中に１細胞あたり約１～約１０コピーで存在する、項目１に記載の改変された間葉系幹細胞。
（項目６）
改変された間葉系幹細胞を生産する方法であって、
間葉系幹細胞に有効量のレンチウイルス粒子を感染させることを含み、前記レンチウイルス粒子が、
前記間葉系幹細胞に感染することができるエンベロープタンパク質、および
ＫＩＦ１１の宿主コピーの非コード領域に結合することができるスモールＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列
を含む、方法。
（項目７）
ＫＩＦ１１の前記宿主コピーの前記非コード領域が３’非翻訳領域または５’非翻訳領域である、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記スモールＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記スモールＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つを含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記第１のヌクレオチド配列が、前記改変された間葉系幹細胞中に１細胞あたり約１～約１０コピーで存在する、項目６に記載の方法。
（項目１１）
対象においてがんを処置する方法であって、治療有効量の項目１に記載の改変された間葉系幹細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目１２）
前記改変された間葉系幹細胞が、前記対象にとって同種異系である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記改変された間葉系幹細胞が、前記対象にとって自家である、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記がんが、癌腫、肉腫、骨髄腫、リンパ腫、混合型、またはそれらの混合物のうちのいずれか１つまたは複数から選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
がんを処置するための、項目１に記載の改変された間葉系幹細胞の使用。
（項目１６）
ＫＩＦ１１の宿主コピーの非コード領域に結合することができるスモールＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列を含む、ウイルスベクター。
（項目１７）
ＫＩＦ１１の前記宿主コピーの前記非コード領域が３’非翻訳領域または５’非翻訳領域である、項目１６に記載のウイルスベクター。
（項目１８）
前記スモールＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、項目１６に記載のウイルスベクター。
（項目１９）
前記スモールＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つを含む、項目１８に記載のウイルスベクター。
（項目２０）
ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントをコードする第２のヌクレオチド配列をさらに含み、前記ＫＩＦ１１遺伝子または前記そのバリアントが、少なくとも１つの配列部分を欠いている、項目１７に記載のウイルスベクター。
（項目２１）
前記配列部分が、前記ＫＩＦ１１遺伝子の非コード領域中にあり、前記ＫＩＦ１１遺伝子の前記非コード領域が、５’非翻訳領域または３’非翻訳領域のうちの少なくとも１つの中にある、項目２０に記載のウイルスベクター。
（項目２２）
パッケージング細胞により産生され、標的細胞に感染することができるレンチウイルス粒子であって、前記レンチウイルス粒子が、
前記標的細胞に感染することができるエンベロープタンパク質、および
ＫＩＦ１１の宿主コピーの非コード領域に結合することができるスモールＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列
を含む、レンチウイルス粒子。
（項目２３）
ＫＩＦ１１の前記宿主コピーの前記非コード領域が３’非翻訳領域または５’非翻訳領域である、項目２２に記載のレンチウイルス粒子。
（項目２４）
前記スモールＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、項目２２に記載のレンチウイルス粒子。
（項目２５）
前記スモールＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つを含む、項目２４に記載のレンチウイルス粒子。
（項目２６）
前記レンチウイルス粒子が、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントをコードする第２のヌクレオチド配列をさらに含み、前記ＫＩＦ１１遺伝子または前記そのバリアントが、少なくとも１つの配列部分を欠いている、項目２３に記載のレンチウイルス粒子。
（項目２７）
前記配列部分が、前記ＫＩＦ１１遺伝子の非コード領域中にあり、前記ＫＩＦ１１遺伝子の前記非コード領域が、５’非翻訳領域または３’非翻訳領域のうちの少なくとも１つの中にある、項目２６に記載のウイルスベクター。
（項目２８）
前記標的細胞が間葉系幹細胞である、項目２２に記載のレンチウイルス粒子。
（項目２９）
対象においてがんを処置する方法であって、治療有効量の項目２２に記載のレンチウイルス粒子を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目３０）
前記がんが、癌腫、肉腫、骨髄腫、リンパ腫、混合型、またはそれらの混合物のうちのいずれか１つまたは複数から選択される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記レンチウイルス粒子が、感染した標的細胞を介して前記対象に投与される、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記標的細胞が体細胞を含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記体細胞が肝細胞またはリンパ球を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記体細胞がリンパ球を含み、前記リンパ球が腫瘍特異的Ｔ細胞を含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記標的細胞が幹細胞を含む、項目３１に記載の方法。
（項目３６）
前記幹細胞が人工多能性幹細胞または間葉系幹細胞を含む、項目３５に記載の方法。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
レンチウイルス粒子に感染した間葉系幹細胞を含む改変された間葉系幹細胞であって、前記レンチウイルス粒子が、
前記間葉系幹細胞に感染することができるエンベロープタンパク質、および
ＫＩＦ１１の宿主コピーの非コード領域に結合することができるスモールＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列
を含む、改変された間葉系幹細胞。
（項目２）
ＫＩＦ１１の前記宿主コピーの前記非コード領域が３’非翻訳領域または５’非翻訳領域である、項目１に記載の改変された間葉系幹細胞。
（項目３）
前記スモールＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、項目１に記載の改変された間葉系幹細胞。
（項目４）
前記スモールＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つを含む、項目３に記載の改変された間葉系幹細胞。
（項目５）
スモールＲＮＡをコードする前記第１のヌクレオチド配列が、前記改変された間葉系幹細胞中に１細胞あたり約１～約１０コピーで存在する、項目１に記載の改変された間葉系幹細胞。
（項目６）
改変された間葉系幹細胞を生産する方法であって、
間葉系幹細胞に有効量のレンチウイルス粒子を感染させることを含み、前記レンチウイルス粒子が、
前記間葉系幹細胞に感染することができるエンベロープタンパク質、および
ＫＩＦ１１の宿主コピーの非コード領域に結合することができるスモールＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列
を含む、方法。
（項目７）
ＫＩＦ１１の前記宿主コピーの前記非コード領域が３’非翻訳領域または５’非翻訳領域である、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記スモールＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記スモールＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つを含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記第１のヌクレオチド配列が、前記改変された間葉系幹細胞中に１細胞あたり約１～約１０コピーで存在する、項目６に記載の方法。
（項目１１）
対象においてがんを処置する方法であって、治療有効量の項目１に記載の改変された間葉系幹細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目１２）
前記改変された間葉系幹細胞が、前記対象にとって同種異系である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記改変された間葉系幹細胞が、前記対象にとって自家である、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記がんが、癌腫、肉腫、骨髄腫、リンパ腫、混合型、またはそれらの混合物のうちのいずれか１つまたは複数から選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
がんを処置するための、項目１に記載の改変された間葉系幹細胞の使用。
（項目１６）
ＫＩＦ１１の宿主コピーの非コード領域に結合することができるスモールＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列を含む、ウイルスベクター。
（項目１７）
ＫＩＦ１１の前記宿主コピーの前記非コード領域が３’非翻訳領域または５’非翻訳領域である、項目１６に記載のウイルスベクター。
（項目１８）
前記スモールＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、項目１６に記載のウイルスベクター。
（項目１９）
前記スモールＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つを含む、項目１８に記載のウイルスベクター。
（項目２０）
ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントをコードする第２のヌクレオチド配列をさらに含み、前記ＫＩＦ１１遺伝子または前記そのバリアントが、少なくとも１つの配列部分を欠いている、項目１７に記載のウイルスベクター。
（項目２１）
前記配列部分が、前記ＫＩＦ１１遺伝子の非コード領域中にあり、前記ＫＩＦ１１遺伝子の前記非コード領域が、５’非翻訳領域または３’非翻訳領域のうちの少なくとも１つの中にある、項目２０に記載のウイルスベクター。
（項目２２）
パッケージング細胞により産生され、標的細胞に感染することができるレンチウイルス粒子であって、前記レンチウイルス粒子が、
前記標的細胞に感染することができるエンベロープタンパク質、および
ＫＩＦ１１の宿主コピーの非コード領域に結合することができるスモールＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列
を含む、レンチウイルス粒子。
（項目２３）
ＫＩＦ１１の前記宿主コピーの前記非コード領域が３’非翻訳領域または５’非翻訳領域である、項目２２に記載のレンチウイルス粒子。
（項目２４）
前記スモールＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、項目２２に記載のレンチウイルス粒子。
（項目２５）
前記スモールＲＮＡが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つを含む、項目２４に記載のレンチウイルス粒子。
（項目２６）
前記レンチウイルス粒子が、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントをコードする第２のヌクレオチド配列をさらに含み、前記ＫＩＦ１１遺伝子または前記そのバリアントが、少なくとも１つの配列部分を欠いている、項目２３に記載のレンチウイルス粒子。
（項目２７）
前記配列部分が、前記ＫＩＦ１１遺伝子の非コード領域中にあり、前記ＫＩＦ１１遺伝子の前記非コード領域が、５’非翻訳領域または３’非翻訳領域のうちの少なくとも１つの中にある、項目２６に記載のウイルスベクター。
（項目２８）
前記標的細胞が間葉系幹細胞である、項目２２に記載のレンチウイルス粒子。
（項目２９）
対象においてがんを処置する方法であって、治療有効量の項目２２に記載のレンチウイルス粒子を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目３０）
前記がんが、癌腫、肉腫、骨髄腫、リンパ腫、混合型、またはそれらの混合物のうちのいずれか１つまたは複数から選択される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記レンチウイルス粒子が、感染した標的細胞を介して前記対象に投与される、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記標的細胞が体細胞を含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記体細胞が肝細胞またはリンパ球を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記体細胞がリンパ球を含み、前記リンパ球が腫瘍特異的Ｔ細胞を含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記標的細胞が幹細胞を含む、項目３１に記載の方法。
（項目３６）
前記幹細胞が人工多能性幹細胞または間葉系幹細胞を含む、項目３５に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【発明を実施するための形態】
【0030】
詳細な説明
本開示の概観
一態様では、本開示は、ＫＩＦ１１の宿主細胞コピーに結合することができるスモールＲＮＡをコードまたは発現するベクターおよび改変された細胞に関する。実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。実施形態では、改変された細胞は、改変された間葉系幹細胞である。
本開示の概観
一態様では、本開示は、ＫＩＦ１１の宿主細胞コピーに結合することができるスモールＲＮＡをコードまたは発現するベクターおよび改変された細胞に関する。実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。実施形態では、改変された細胞は、改変された間葉系幹細胞である。
【0031】
別の態様では、本開示は、（ｉ）ＫＩＦ１１の宿主コピーに結合することができるスモールＲＮＡ、および（ｉｉ）スモールＲＮＡに対して抵抗性の改変されたＫＩＦ１１をコードまたは発現するベクターおよび改変された細胞に関する。実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。実施形態では、改変された細胞は間葉系幹細胞である。
【0032】
別の態様では、本開示は、（ｉ）ＫＩＦ１１の宿主コピーに結合することができるスモールＲＮＡ、および（ｉｉ）スモールＲＮＡに対して抵抗性の外因性ＫＩＦ１１遺伝子をコードまたは発現するベクターおよび改変された細胞に関する。実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。実施形態では、改変された細胞は間葉細胞である。実施形態では、スモールＲＮＡは、例えば５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ中で、ＫＩＦ１１の宿主コピーの非コード領域に結合することができる。実施形態では、外因性ＫＩＦ１１遺伝子は、標的配列の少なくとも部分（例えば、その配列部分）を欠いている。そのような実施形態では、外因性ＫＩＦ１１は、スモールＲＮＡによる活性に対して、例えば、外因性ＫＩＦ１１に結合するスモールＲＮＡの能力に対して抵抗性である。そのような実施形態では、外因性ＫＩＦ１１の発現をモジュレートするスモールＲＮＡの能力は、減少および／または予防される。
【0033】
定義および解釈
本明細書中で別様に定義しない限り、本開示との関連で使用する科学技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、文脈上別様に要求されない限り、単数の語は複数を包含し、複数の語は単数を包含する。一般に、本明細書中に記載する細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションとの関連で使用する学術用語およびそれらの技術は周知であり、当該技術分野において一般に使用されている。本開示の方法および技術は、別段の記載がなければ、当該技術分野において周知の、本明細書全体で引用し議論する様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載される従来の方法にしたがって一般に行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ Ｄ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ， Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．（２００２年）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９８年）；およびＣｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ， Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．（２００３年）を参照。あらゆる酵素反応または精製技術は、当該技術分野において一般に遂行されるように、または本明細書中に記載するように、製造業者の仕様にしたがって行われる。本明細書中に記載する分析化学、合成有機化学、医薬品化学、および製薬化学との関連で使用する学術用語、ならびに実験の手順および技術は、当該技術分野において周知であり一般に使用されるものである。
本明細書中で別様に定義しない限り、本開示との関連で使用する科学技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、文脈上別様に要求されない限り、単数の語は複数を包含し、複数の語は単数を包含する。一般に、本明細書中に記載する細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションとの関連で使用する学術用語およびそれらの技術は周知であり、当該技術分野において一般に使用されている。本開示の方法および技術は、別段の記載がなければ、当該技術分野において周知の、本明細書全体で引用し議論する様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載される従来の方法にしたがって一般に行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ Ｄ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ， Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．（２００２年）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９８年）；およびＣｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ， Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．（２００３年）を参照。あらゆる酵素反応または精製技術は、当該技術分野において一般に遂行されるように、または本明細書中に記載するように、製造業者の仕様にしたがって行われる。本明細書中に記載する分析化学、合成有機化学、医薬品化学、および製薬化学との関連で使用する学術用語、ならびに実験の手順および技術は、当該技術分野において周知であり一般に使用されるものである。
【0034】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は交換可能に使用し、文脈が明確にそうでないと示さない限り、複数形も包含すること、およびそれぞれの意味の範囲内に包含されることを意図する。また、本明細書中で使用する場合、「および／または」は、挙げた項目の１つまたは複数のあらゆる全ての可能な組み合わせ、ならびに、選択肢（「または」）として解釈する場合には組み合わせないことを指し、およびこれらを包含する。
【0035】
例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量といった、範囲などの数値による全ての指定は、０．１の増分で（＋）または（－）に変動する近似値である。必ずしも明示的には述べないが、数値による全ての指定には「約」という用語が先行することを理解するべきである。「約」という用語は、「Ｘ＋０．１」または「Ｘ－０．１」などの「Ｘ」の小さな増分に加えて、「Ｘ」という正確な値も包含する。必ずしも明示的には述べないが、本明細書中に記載する試薬は単に例示的なものであり、そのようなものの同等物が当該技術分野で公知であることも理解するべきである。
【0036】
本明細書中で使用する場合、「約」という用語は、当業者によって理解され、また、それが使用される文脈に応じてある程度変動する。使用されている文脈を考慮すると当業者に明確でない用語が使用されている場合、「約」は、特定の用語のプラスまたはマイナス１０％までを意味する。
【0037】
活性剤の「投与」または活性剤を「投与する」という用語は、処置を必要とする被験体に対して活性剤を、治療的に有用な形態かつ治療有効量でその個体の体内に導入できる形態で与えることを意味すると理解するべきである。
【0038】
本明細書で使用される場合、「同種異系」という用語は、処置において使用されるドナー細胞または組織がドナー細胞または組織で処置されている対象に由来しない処置を指す。よって、「対象にとって同種異系の」処置は、ドナー細胞または組織が対象に由来しない処置を指す。
【0039】
本明細書で使用される場合、「自家の」という用語は、処置において使用されるドナー細胞または組織がドナー細胞または組織で処置されている対象に由来する処置を指す。よって、「対象にとって自家の」処置は、ドナー細胞または組織が対象に由来する処置を指す。
【0040】
本明細書で使用される場合、「相補的な」という用語は、２つのヌクレオチド配列間の１つまたは複数のピリミジンとの１つまたは複数のプリンの水素結合を通じて互いにハイブリダイズする２つのヌクレオチド配列の能力を指す。アデニン（プリン）は、チミン（ピリミジン）およびウラシル（ピリミジン）の両方への水素結合の能力を有する。グアニン（プリン）は、シトシン（ピリミジン）への水素結合の能力を有する。「相補的な」という用語は、１つのヌクレオチド配列上の各核酸塩基が他のヌクレオチド配列上のその対応物核酸塩基に水素結合した完璧に「相補的な」２つのヌクレオチド配列を含む。「相補的な」という用語は、１つのヌクレオチド配列上の少なくとも１つの核酸塩基が他のヌクレオチド配列上のその対応物核酸塩基に水素結合しない不完全に「相補的な」２つのヌクレオチド配列を含む。不完全に「相補的」であることは、ヌクレオチド配列のうちの１つにおける核酸塩基が他のヌクレオチド配列上のその対応物核酸塩基に水素結合する能力を有しない場合に起こる。例えば、ヌクレオチド配列のうちの１つにおけるアデニンへの対応物がグアニンである場合、または、例えば、ヌクレオチド配列のうちの１つにおけるウラシルへの対応物がシトシンである場合である。「相補的な」２つのヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡのヌクレオチド配列に「相補的な」スモールＲＮＡのヌクレオチド配列を含み得る。スモールＲＮＡのヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡのヌクレオチド配列に完璧に「相補的」または不完全に「相補的」であり得る。
【0041】
本明細書中で使用する場合、「含む」という用語は、組成物および方法が、記載した要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味することを意図する。組成物および方法を定義するために使用する場合、「から本質的になる」は、組成物または方法に対して何らかの本質的な重要性を持つその他の要素を除外することを意味する。「からなる」は、特許請求される組成物および実体的な方法ステップにとって軽微ではないその他の成分の要素を除外することを意味する。これらの移行句のそれぞれによって定義される実施形態は、本開示の範囲内にある。したがって、方法および組成物は、追加のステップおよび成分を含み得るか（含む）、あるいは重要でないステップおよび組成物を含むか（から本質的になる）、あるいは記載した方法ステップまたは組成物のみを意図する（からなる）ことが意図される。
【0042】
本明細書中で使用する場合、「発現」、「発現される」、または「コードする」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される過程、および／または、転写されたｍＲＮＡがその後にペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される過程をいう。発現は、真核細胞中でのｍＲＮＡのスプライシング、または転写後修飾もしくは翻訳後修飾というその他の形態を包含し得る。
【0043】
「個体」、「被験体」、および「患者」という用語は本明細書中では交換可能に使用され、任意の個体である哺乳動物被験体（例えば、マウス、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、非ヒト霊長類またはヒト霊長類）を指す。
【0044】
「ＫＩＦ１１」という用語は、キネシン－５としても公知の、遺伝子キネシンファミリーメンバー１１を指す。ＫＩＦ１１は、有糸分裂紡錘体との相互作用を通じて有糸分裂において機能する。用語ＫＩＦ１１は、ヌクレオチド配列およびペプチド配列の両方を含む、全ての野生型およびバリアントＫＩＦ１１配列を含む。非限定的に、用語ＫＩＦ１１は、配列番号４への参照を含み、それと少なくとも約８０％の同一性を有するバリアントをさらに含む。
【0045】
「ｍｉＲＮＡ」という用語はマイクロＲＮＡを指し、本明細書において「ｍｉＲ」とも称され得る。
【0046】
「非コード配列」または「非コード領域」という用語は、タンパク質をコードしない遺伝子の部分を指す。該用語は、遺伝子の５’非翻訳配列または領域、遺伝子の３’非翻訳配列または領域、および遺伝子のイントロンを非限定的に指す。
【0047】
「パッケージング細胞株」という用語は、レンチウイルス粒子を発現するために使用できる任意の細胞株を指す。
【0048】
２つまたはそれより多くの核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における「同一性パーセント」という用語は、下記する配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ、または当業者に利用可能なその他のアルゴリズム）の１つを使用して、または目視検査によって測定されるように、最大の一致のために比較およびアラインメントした時に同一となるヌクレオチドまたはアミノ酸残基を特定のパーセンテージで有する２つまたはそれより多くの配列または部分配列を指す。適用に応じて、「同一性パーセント」は、比較されている配列の一領域にわたり（例えば、機能ドメインにわたり）存在し得るか、あるいは比較される２つの配列の全長にわたり存在し得る。配列比較のために、通常は１つの配列が、試験配列がそれに対して比較される参照配列の役目を持つ。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、部分配列座標を指定し、必要であれば配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【0049】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．２巻：４８２頁（１９８１年）の局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．４８巻：４４３頁（１９７０年）の相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５巻：２４４４頁（１９８８年）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、または目視検査（一般には後述のＡｕｓｕｂｅｌらを参照）によって実行することができる。
【0050】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するために好適なアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３～４１０頁（１９９０年）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを通じて公開されている。
【0051】
２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて利用可能）中のＧＡＰプログラムを使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重み付け、および１、２、３、４、５、または６の長さ重み付けを使用して決定することができる。また、２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ． ＭｅｙｅｒｓおよびＷ． Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、４巻：１１～１７頁、（１９８９年））のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長さペナルティーとして１２、およびギャップペナルティーとして４を使用して決定することもできる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて利用可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（４８巻）：４４４～４５３頁（１９７０年））のアルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み付け、および１、２、３、４、５、または６の長さ重み付けを使用して決定することができる。
【0052】
本開示の核酸配列およびタンパク質配列は、例えば関連配列を同定するために、公共データベースに対して検索を行うための「クエリ配列」としてさらに使用することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３～１０頁のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本開示中に提供される核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラムをスコア＝１００、ワード長＝１２で用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本開示のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラムをスコア＝５０、ワード長＝３で用いて行うことができる。比較目的のギャップ付きアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５巻（１７号）：３３８９～３４０２頁に記載されるようにＧａｐｐｅｄ
ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメーターを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照。
ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメーターを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照。
【0053】
本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容される」とは、妥当な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合うように、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症を起こすことなくヒトおよび動物の組織、臓器、および／または体液との接触に使用するために好適な化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。
【0054】
本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性の、あらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などを指す、およびそれらを包含する。組成物は、薬学的に許容される塩、例えば酸付加塩または塩基付加塩を含み得る（例えば、Ｂｅｒｇｅら、（１９７７年）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ６６巻：１～１９頁を参照）。
【0055】
本明細書中で使用する場合、「配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）」という用語は、「配列ＩＤ番号（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ Ｎｏ．）」という用語と同義である。
【0056】
本明細書中で使用する場合、「スモールＲＮＡ」とは、一般に約２００ヌクレオチドまたはそれ未満の長さの、サイレンシング機能または干渉機能を持つノンコーディングＲＮＡをいう。その他の実施形態では、スモールＲＮＡは、約１７５ヌクレオチドまたはそれ未満、約１５０ヌクレオチドまたはそれ未満、約１２５ヌクレオチドまたはそれ未満、約１００ヌクレオチドまたはそれ未満、あるいは約７５ヌクレオチドまたはそれ未満の長さである。そのようなＲＮＡとしては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられる。本開示の「スモールＲＮＡ」は、一般に、標的遺伝子のｍＲＮＡの破壊を生じさせる経路を通じて、標的遺伝子の遺伝子発現を阻害することまたはノックダウンすることができるべきである。
【0057】
本明細書で使用される場合、「標的細胞」は、ベクターまたはプラスミドなどの生化学的剤が結合することができる、細胞表面受容体などの表面分子を含有する任意の細胞である。表面分子および生化学的剤の間の相互作用があると、「標的細胞」は、例えば形質導入を手段として、生化学的剤の取込みが可能である。生化学的剤の取込みは、「標的細胞」の遺伝子型、表現型、または遺伝子型および表現型の両方に対する改変を生じさせ得る。
【0058】
本明細書で使用される場合、「標的配列」という用語は、スモールＲＮＡなどの核酸に相補的な遺伝子またはそのバリアント上の配列部分を指す。「標的配列」は、遺伝子のコード領域上の配列部分を含み得る。あるいは、「標的配列」は、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲなどの遺伝子の非コード領域上の配列部分を含み得る。例えば、「標的配列」は、ＫＩＦ１１遺伝子の３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲ上の配列部分を含み得る。
【0059】
「治療有効量」という用語は、所与の病気、傷害、疾患、または状態に罹患した患者に見られる症状、進行、または合併症の発症を処置し、または防止するために好適な組成物中および好適な剤形中の本開示の活性剤の十分な量を指す。治療有効量は、患者の状態の状況またはその重篤度、および処置される被験体の年齢、体重などに応じて変化する。治療有効量は、例えば、投与経路、被験体の状態などのいくつかの要因、ならびに当業者によって理解されるその他の要因のいずれかに応じて変化し得る。
【0060】
本明細書で使用される場合、「治療ベクター」という用語は、組込みベクターまたは非組込みベクターなどの任意の好適なウイルスベクターを非限定的に含む。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターまたはＡＡＶベクターが使用される。ある特定の実施形態では、レトロウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、アレナウイルス、ピコルナウイルス、ヘルペスウイルス、またはポックスウイルスが使用される。さらに、レンチウイルスベクターシステムに関して本明細書中で使用する場合、「ベクター」という用語は、「プラスミド」と同義である。例えば、２ベクターおよび３ベクターのパッケージングシステムを含む３ベクターシステムおよび４ベクターシステムは、３プラスミドシステムおよび４プラスミドシステムとも称され得る。
【0061】
「処置」は、疾患状態を標的化し、それと戦うこと、すなわち、疾患状態を改善し、または予防することを意図する。よって、特定の処置は、標的化される疾患状態、ならびに医薬療法および治療アプローチの現在または将来の状況に依存する。処置は、関連する毒性を有し得る。
【0062】
「処置」または「処置すること」という用語は、一般に、処置されている被験体の自然経過を変えようとする介入を指し、予防のため、または臨床病理の経過の間に行われ得る。望ましい効果としては、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的帰結の抑制、減少、または阻害、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後改善の惹起が挙げられるが、これらに限定されない。
【0063】
本明細書において使用される「ＵＴＲ」または「非翻訳領域」という用語は、遺伝子のコード領域の５’または３’にある遺伝子の領域を表す。
【0064】
本明細書で使用される場合、「３’ＵＴＲ」または「３’非翻訳領域」という用語は、遺伝子のコード領域の３’にある「ＵＴＲ」または「非翻訳領域」である。
【0065】
本明細書で使用される場合、「５’ＵＴＲ」または「５’非翻訳領域」という用語は、遺伝子のコード領域の５’にある「ＵＴＲ」または「非翻訳領域」である。
【0066】
本明細書において使用される「バリアント」という用語は、本明細書において、類似体または変形とも表され得る。バリアントは、ヌクレオチド配列に対するあらゆる置換、欠失または付加を表す。
本開示の態様および実施形態の説明
本開示の態様および実施形態の説明
【0067】
一態様では、ＫＩＦ１１の宿主コピーの非コード領域に結合することができるスモールＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列を含む、ウイルスベクターが提供される。
【0068】
一態様では、本明細書に記載のウイルスベクター粒子はウイルスに由来する。実施形態では、ウイルスは、麻疹ウイルス、ピコルナウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、アレナウイルスまたは本明細書に記載の任意の他のウイルスのうちのいずれかである。実施形態では、ウイルスは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、およびｐｉＲＮＡのうちのいずれか１つまたは複数を含むスモールＲＮＡをコードする。
【0069】
一態様では、本明細書に記載のウイルスベクター粒子はレトロウイルスに由来する。実施形態では、レトロウイルスはＨＩＶウイルスである。実施形態では、レトロウイルスは、本明細書に記載の任意のレトロウイルスである。実施形態では、レトロウイルスは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、およびｐｉＲＮＡのうちのいずれか１つまたは複数を含むスモールＲＮＡをコードする。
【0070】
実施形態では、非コード領域はＫＩＦ１１の宿主コピーの３’非翻訳領域または５’非翻訳領域である。実施形態では、スモールＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。実施形態では、スモールＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つを含む。実施形態では、ウイルスベクターは、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントをコードする第２のヌクレオチド配列をさらに含み、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントは、少なくとも１つの配列部分を欠いている。実施形態では、配列部分は、ＫＩＦ１１遺伝子の非コード領域中にある。実施形態では、ＫＩＦ１１遺伝子の非コード領域は、５’非翻訳領域または３’非翻訳領域のうちの少なくとも１つの中にある。
【0071】
実施形態では、スモールＲＮＡはｓｈＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはマイクロＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはｓｉＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはｄｓＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはｐｉＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはリボザイムである。
【0072】
実施形態では、スモールＲＮＡは、配列番号１、配列番号２または配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【0073】
実施形態では、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントは、１つより多くの定義された標的配列を欠いており、例えば、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントは、２個の定義された標的配列を欠いており、３個の定義された標的配列を欠いており、４個の定義された標的配列を欠いており、５個の定義された標的配列を欠いており、６個の定義された標的配列を欠いており、７個の定義された標的配列を欠いており、８個の定義された標的配列を欠いており、９個の定義された標的配列を欠いており、または１０個の定義された標的配列を欠いている。実施形態では、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントは、１０個より多くの定義された標的配列を欠いている。
【0074】
別の態様では、パッケージング細胞によって生産され、標的細胞を感染させることができるレンチウイルス粒子が提供され、レンチウイルス粒子は、標的細胞に感染することができるエンベロープタンパク質、およびＫＩＦ１１の宿主コピーの非コード領域に結合することができるスモールＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列を含む。
【0075】
実施形態では、レンチウイルス粒子はＧａｇタンパク質をさらに含む。実施形態では、レンチウイルス粒子はＰｏｌタンパク質をさらに含む。
【0076】
実施形態では、非コード領域は３’非翻訳領域または５’非翻訳領域である。実施形態では、スモールＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。実施形態では、スモールＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つを含む。実施形態では、レンチウイルス粒子は、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントをコードする第２のヌクレオチド配列をさらに含み、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントは、少なくとも１つの配列部分を欠いている。実施形態では、配列部分は、ＫＩＦ１１遺伝子の非コード領域中にある。実施形態では、ＫＩＦ１１遺伝子の非コード領域は、５’非翻訳領域または３’非翻訳領域のうちの少なくとも１つの中にある。実施形態では、標的細胞は間葉系幹細胞である。
【0077】
実施形態では、スモールＲＮＡはｓｈＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはマイクロＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはｓｉＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはｄｓＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはｐｉＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはリボザイムである。
【0078】
実施形態では、スモールＲＮＡは、配列番号１、配列番号２または配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【0079】
実施形態では、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントは、２個の定義された標的配列を欠いており、３個の定義された標的配列を欠いており、４個の定義された標的配列を欠いており、５個の定義された標的配列を欠いており、６個の定義された標的配列を欠いており、７個の定義された標的配列を欠いており、８個の定義された標的配列を欠いており、９個の定義された標的配列を欠いており、または１０個の定義された標的配列を欠いている。実施形態では、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントは、１０個より多くの定義された標的配列を欠いている。
【0080】
別の態様では、レンチウイルス粒子に感染した間葉系幹細胞を含む改変された間葉系幹細胞であって、レンチウイルス粒子が、間葉系幹細胞に感染することができるエンベロープタンパク質、およびＫＩＦ１１の宿主コピーの非コード領域に結合することができるスモールＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列を含む、改変された間葉系幹細胞が提供される。
【0081】
実施形態では、レンチウイルス粒子はＧａｇタンパク質をさらに含む。実施形態では、レンチウイルス粒子はＰｏｌタンパク質をさらに含む。
【0082】
実施形態では、非コード領域は３’非翻訳領域または５’非翻訳領域である。実施形態では、スモールＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。実施形態では、スモールＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つを含む。実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、改変された間葉系幹細胞中に１細胞あたり約１～約１０コピーで存在する。
【0083】
実施形態では、スモールＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、１細胞あたり１コピー、１細胞あたり２コピー、１細胞あたり３コピー、１細胞あたり４コピー、１細胞あたり５コピー、１細胞あたり６コピー、１細胞あたり７コピー、１細胞あたり８コピー、１細胞あたり９コピー、または１細胞あたり１０コピーで存在する。実施形態では、スモールＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、１細胞あたり約１０～約２０コピーで存在する。
【0084】
実施形態では、スモールＲＮＡはｓｈＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはマイクロＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはｓｉＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはｄｓＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはｐｉＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはリボザイムである。
【0085】
実施形態では、スモールＲＮＡは、配列番号１、配列番号２または配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【0086】
別の態様では、改変された間葉系幹細胞を生産する方法であって、有効量のレンチウイルス粒子で間葉系幹細胞を感染させることを含み、レンチウイルス粒子が、間葉系幹細胞に感染することができるエンベロープタンパク質、およびＫＩＦ１１の宿主コピーの非コード領域における少なくとも１つの相補性領域に結合することができるスモールＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列を含む、方法が提供される。
【0087】
実施形態では、レンチウイルス粒子はＧａｇタンパク質をさらに含む。実施形態では、レンチウイルス粒子はＰｏｌタンパク質をさらに含む。
【0088】
実施形態では、非コード領域は３’非翻訳領域または５’非翻訳領域である。実施形態では、スモールＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。実施形態では、スモールＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つを含む。実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、改変された間葉系幹細胞中に１細胞あたり約１～約１０コピーで存在する。
【0089】
実施形態では、スモールＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、１細胞あたり１コピー、１細胞あたり２コピー、１細胞あたり３コピー、１細胞あたり４コピー、１細胞あたり５コピー、１細胞あたり６コピー、１細胞あたり７コピー、１細胞あたり８コピー、１細胞あたり９コピー、または１細胞あたり１０コピーで存在する。実施形態では、スモールＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、１細胞あたり約１０～約２０コピーで存在する。
【0090】
実施形態では、スモールＲＮＡはｓｈＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはマイクロＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはｓｉＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはｄｓＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはｐｉＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはリボザイムである。
【0091】
実施形態では、スモールＲＮＡは、配列番号１、配列番号２または配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【0092】
実施形態では、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントは、２個の定義された標的配列を欠いており、３個の定義された標的配列を欠いており、４個の定義された標的配列を欠いており、５個の定義された標的配列を欠いており、６個の定義された標的配列を欠いており、７個の定義された標的配列を欠いており、８個の定義された標的配列を欠いており、９個の定義された標的配列を欠いており、または１０個の定義された標的配列を欠いている。実施形態では、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントは、１０個より多くの定義された標的配列を欠いている。
【0093】
別の態様では、対象においてがんを処置する方法であって、治療有効量の任意の本明細書に記載の改変された間葉系幹細胞を対象に投与することを含む、方法が提供される。
【0094】
実施形態では、改変された間葉系幹細胞は、対象にとって同種異系である。実施形態では、改変された間葉系幹細胞は、対象にとって自家である。
【0095】
実施形態では、がんは、癌腫、肉腫、骨髄腫、リンパ腫、混合型、またはそれらの混合物のうちのいずれか１つまたは複数から選択される。実施形態では、がんは、本明細書に記載の任意のがんである。
【0096】
別の態様では、本明細書に記載の改変された間葉系幹細胞のいずれかを含む、がんを処置するための、改変された間葉系幹細胞の使用が提供される。
【0097】
別の態様では、対象においてがんを処置する方法であって、治療有効量の任意の本明細書に記載のレンチウイルス粒子を対象に投与することを含む、方法が提供される。
【0098】
実施形態では、がんは、癌腫、肉腫、骨髄腫、リンパ腫、混合型、またはそれらの混合物のうちのいずれか１つまたは複数から選択される。
【0099】
実施形態では、レンチウイルス粒子は、感染した標的細胞を介して対象に投与される。実施形態では、標的細胞は体細胞を含む。施形態では、体細胞は、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞、上皮細胞、筋肉細胞、血液細胞、導電性細胞、結合性細胞、腺細胞、または支持性細胞を含む。
【0100】
実施形態では、体細胞は肝細胞を含む。
【0101】
実施形態では、体細胞はリンパ球を含む。実施形態では、リンパ球はＢ細胞を含む。実施形態では、リンパ球はＴ細胞を含む。実施形態では、Ｔ細胞は腫瘍特異的Ｔ細胞を含む。
【0102】
実施形態では、標的細胞は幹細胞を含む。実施形態では、幹細胞は胚性幹細胞を含む。実施形態では、幹細胞は体性幹細胞を含む。実施形態では、幹細胞は人工多能性幹細胞を含む。実施形態では、幹細胞は間葉系幹細胞を含む。
【0103】
別の態様では、ウイルスベクターであって、（ｉ）コード領域、および５’非翻訳領域および３’非翻訳領域のうちの少なくとも１つを含む、コードされるＫＩＦ１１遺伝子であって、５’非翻訳領域または３’非翻訳領域のうちの少なくとも１つにおける少なくとも１つの定義された標的配列を欠いている、ＫＩＦ１１遺伝子、ならびに（ｉｉ）ＫＩＦ１１の宿主コピーの非コード領域中の少なくとも１つの相補的な領域に結合することができるスモールＲＮＡであって、コードされるＫＩＦ１１遺伝子の発現が、スモールＲＮＡによる活性に対して抵抗性である、スモールＲＮＡを含むウイルスベクターが提供される。
【0104】
実施形態では、ＫＩＦ１１遺伝子は、５’非翻訳領域中の少なくとも１つの定義された標的配列を欠いている。実施形態では、ＫＩＦ１１遺伝子は、３’非翻訳領域中の少なくとも１つの定義された標的配列を欠いている。実施形態では、ＫＩＦ１１遺伝子は、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域の両方における少なくとも１つの定義された標的配列を欠いている。
【0105】
実施形態では、ＫＩＦ１１遺伝子は、１つより多くの定義された標的配列を欠いており、例えば、ＫＩＦ１１遺伝子は、２個の定義された標的配列を欠いており、３個の定義された標的配列を欠いており、４個の定義された標的配列を欠いており、５個の定義された標的配列を欠いており、６個の定義された標的配列を欠いており、７個の定義された標的配列を欠いており、８個の定義された標的配列を欠いており、９個の定義された標的配列を欠いており、または１０個の定義された標的配列を欠いている。実施形態では、ＫＩＦ１１遺伝子は、１０個より多くの定義された標的配列を欠いている。
【0106】
実施形態では、ＫＩＦ１１遺伝子は、ＫＩＦ１１の宿主コピーと比べてその非コード領域の部分中にバリアントを含む。実施形態では、バリアントは、ＫＩＦ１１のヌクレオチド配列中の置換を含む。実施形態では、バリアントは、ＫＩＦ１１のヌクレオチド配列中の欠失を含む。実施形態では、バリアントは、ＫＩＦ１１のヌクレオチド配列への付加を含む。実施形態では、バリアントは、ＫＩＦ１１遺伝子の３’非翻訳領域中にある。実施形態では、バリアントは、ＫＩＦ１１遺伝子の５’非翻訳領域中にある。実施形態では、バリアントは、ＫＩＦ１１遺伝子が少なくとも１つの標的配列（例えば、その配列部分）を欠くことを引き起こす。
【0107】
実施形態では、ＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントは、配列番号４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【0108】
実施形態では、スモールＲＮＡはｓｈＲＮＡである。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、および配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【0109】
実施形態では、スモールＲＮＡは、同じレンチウイルスベクターの遺伝子発現構築物中に存在しない配列を標的化して、ベクターまたはベクター構成成分をコードするプラスミドの遺伝子内組換えの可能性を回避させる。実施形態では、タンパク質コード領域が少数の突然変異により異なる場合に、スモールＲＮＡは、同じレンチウイルスベクターの遺伝子発現構築物中に存在しない配列を標的化する。
【0110】
実施形態では、少数の突然変異は２０個未満の突然変異である。実施形態では、少数の突然変異は１５個未満の突然変異である。実施形態では、少数の突然変異は１０個未満の突然変異である。実施形態では、少数の突然変異は５個未満の突然変異である。実施形態では、少数の突然変異は４個の突然変異である。実施形態では、少数の突然変異は３個の突然変異である。実施形態では、少数の突然変異は２個の突然変異である。実施形態では、少数の突然変異は１個の突然変異である。
【0111】
実施形態では、スモールＲＮＡはマイクロＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはｓｉＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはｄｓＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはｐｉＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはリボザイムである。
【0112】
実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。実施形態では、ウイルスベクターはＡＡＶベクターである。
【0113】
別の態様では、パッケージング細胞により産生されるレンチウイルス粒子が提供される。実施形態では、レンチウイルス粒子は、２９３Ｔ／１７ ＨＥＫパッケージング細胞系中で産生される。実施形態では、レンチウイルス粒子は、レンチウイルス粒子を産生することができる当該技術分野において公知の任意の細胞中で産生される。
【0114】
実施形態では、レンチウイルス粒子は、標的細胞に感染することができるエンベロープタンパク質を含む。実施形態では、レンチウイルス粒子は、（ｉ）コード領域、および５’非翻訳領域および３’非翻訳領域のうちの少なくとも１つを含む、ＫＩＦ１１遺伝子であって、５’非翻訳領域または３’非翻訳領域のうちの少なくとも１つにおける少なくとも１つの定義された標的配列を欠いている、ＫＩＦ１１遺伝子、ならびに（ｉｉ）ＫＩＦ１１の宿主コピーの非コード領域中の少なくとも１つの相補的な領域に結合することができるスモールＲＮＡであって、レンチウイルス粒子中のＫＩＦ１１遺伝子が、スモールＲＮＡによる活性に対して抵抗性である、スモールＲＮＡを含む。
【0115】
実施形態では、レンチウイルス粒子中のＫＩＦ１１遺伝子は、５’非翻訳領域中の少なくとも１つの定義された標的配列を欠いている。実施形態では、レンチウイルス粒子中のＫＩＦ１１遺伝子は、３’非翻訳領域中の少なくとも１つの定義された標的配列を欠いている。実施形態では、レンチウイルス粒子中のＫＩＦ１１遺伝子は、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域の両方における少なくとも１つの定義された標的配列を欠いている。
【0116】
実施形態では、レンチウイルス粒子中のＫＩＦ１１遺伝子は、１つより多くの定義された標的配列を欠いており、例えば、レンチウイルス粒子中のＫＩＦ１１遺伝子は、２個の定義された標的配列を欠いており、３個の定義された標的配列を欠いており、４個の定義された標的配列を欠いており、５個の定義された標的配列を欠いており、６個の定義された標的配列を欠いており、７個の定義された標的配列を欠いており、８個の定義された標的配列を欠いており、９個の定義された標的配列を欠いており、または１０個の定義された標的配列を欠いている。実施形態では、レンチウイルス粒子中のＫＩＦ１１遺伝子は、１０個より多くの定義された標的配列を欠いている。
【0117】
実施形態では、レンチウイルス粒子中のＫＩＦ１１遺伝子は、ＫＩＦ１１遺伝子の宿主コピーと比べてその非コード配列の部分中にバリアントを含む。実施形態では、バリアントは、ＫＩＦ１１の非コード配列中の置換を含む。実施形態では、バリアントは、ＫＩＦ１１の非コード配列中の欠失を含む。実施形態では、バリアントは、ＫＩＦ１１の非コード配列への付加を含む。実施形態では、バリアントは、レンチウイルス粒子中のＫＩＦ１１遺伝子の３’非翻訳領域中にある。実施形態では、バリアントは、レンチウイルス粒子中のＫＩＦ１１遺伝子の５’非翻訳領域中にある。実施形態では、バリアントは、ＫＩＦ１１遺伝子が少なくとも１つの標的配列（例えば、その配列部分）を欠くことを引き起こす。
【0118】
実施形態では、レンチウイルス粒子中のＫＩＦ１１遺伝子またはそのバリアントは、配列番号４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【0119】
実施形態では、スモールＲＮＡはｓｈＲＮＡである。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【0120】
実施形態では、スモールＲＮＡはｓｉＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはマイクロＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはｄｓＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはｐｉＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはリボザイムである。
【0121】
別の態様では、免疫療法ベースの組成物を使用して対象においてがんを処置する方法が提供される。実施形態では、方法は、治療有効量の免疫療法ベースの組成物を対象に投与すること、またはそれが投与されていることを含む。
【0122】
実施形態では、免疫療法ベースの組成物は、改変された細胞を含む。実施形態では、改変された細胞は、改変された間葉系幹細胞である。
【0123】
実施形態では、免疫療法ベースの組成物はレンチウイルス粒子をさらに含み、レンチウイルス粒子は、（ｉ）がん細胞に感染することができるエンベロープタンパク質、（ｉｉ）コード領域、および５’非翻訳領域および３’非翻訳領域のうちの少なくとも１つを含む、ＫＩＦ１１遺伝子であって、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域のうちの少なくとも１つにおける少なくとも１つの定義された標的配列を欠いている、ＫＩＦ１１遺伝子、ならびに（ｉｉｉ）ＫＩＦ１１遺伝子の宿主コピーの非コード領域中の少なくとも１つの相補的な領域に結合することができるスモールＲＮＡであって、レンチウイルス粒子中のＫＩＦ１１遺伝子が、スモールＲＮＡによる活性に対して抵抗性である、スモールＲＮＡを含む。
【0124】
実施形態では、レンチウイルス粒子中のＫＩＦ１１遺伝子は、５’非翻訳領域中の少なくとも１つの定義された標的配列を欠いている。実施形態では、レンチウイルス粒子中のＫＩＦ１１遺伝子は、３’非翻訳領域中の少なくとも１つの定義された標的配列を欠いている。実施形態では、レンチウイルス粒子中のＫＩＦ１１遺伝子は、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域の両方における少なくとも１つの定義された標的配列を欠いている。
【0125】
実施形態では、レンチウイルス粒子中のＫＩＦ１１遺伝子は、１つより多くの定義された標的配列を欠いており、例えば、レンチウイルス粒子中のＫＩＦ１１遺伝子は、２個の定義された標的配列を欠いており、３個の定義された標的配列を欠いており、４個の定義された標的配列を欠いており、５個の定義された標的配列を欠いており、６個の定義された標的配列を欠いており、７個の定義された標的配列を欠いており、８個の定義された標的配列を欠いており、９個の定義された標的配列を欠いており、または１０個の定義された標的配列を欠いている。実施形態では、レンチウイルス粒子中のＫＩＦ１１遺伝子は、１０個より多くの定義された標的配列を欠いている。
【0126】
実施形態では、レンチウイルス粒子中のＫＩＦ１１遺伝子は、ＫＩＦ１１の宿主コピーと比べてその非コード配列の部分中にバリアントを含む。実施形態では、バリアントは、ＫＩＦ１１のヌクレオチド配列中の置換を含む。実施形態では、バリアントは、ＫＩＦ１１のヌクレオチド配列中の欠失を含む。実施形態では、バリアントは、ＫＩＦ１１のヌクレオチド配列への付加を含む。実施形態では、バリアントは、第１のヌクレオチド配列の３’非翻訳領域中にある。実施形態では、バリアントは、第１のヌクレオチド配列の５’非翻訳領域中にある。実施形態では、バリアントは、ＫＩＦ１１遺伝子が少なくとも１つの標的配列（例えば、その配列部分）を欠くことを引き起こす。
【0127】
実施形態では、レンチウイルス粒子中のＫＩＦ１１遺伝子は、配列番号４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【0128】
実施形態では、スモールＲＮＡはｓｈＲＮＡである。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、および配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【0129】
実施形態では、スモールＲＮＡはマイクロＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはｓｉＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはｄｓＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはｐｉＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはリボザイムである。
【0130】
別の態様では、ＫＩＦ１１遺伝子のコード領域を含む改変された細胞であって、ＫＩＦ１１遺伝子が、５’非翻訳領域または３’非翻訳領域のうちの少なくとも１つにおける少なくとも１つの定義された標的配列を欠いている、改変された細胞が提供される。実施形態では、改変された細胞は、ＫＩＦ１１遺伝子の宿主コピーの非コード領域中の少なくとも１つの相補的な領域に結合することができるスモールＲＮＡを発現する。
【0131】
実施形態では、改変された細胞は、当該技術分野において公知の任意の細胞の改変された細胞である。実施形態では、改変された細胞は、改変された骨細胞である。実施形態では、改変された細胞は、改変された軟骨細胞である。実施形態では、改変された細胞は、改変された神経細胞である。実施形態では、改変された細胞は、改変された上皮細胞である。実施形態では、改変された細胞は、改変された筋肉細胞である。実施形態では、改変された細胞は、改変された血液細胞である。実施形態では、改変された細胞は、改変された導電性細胞である。実施形態では、改変された細胞は、改変された結合性細胞である。実施形態では、改変された細胞は、改変された腺細胞である。実施形態では、改変された細胞は、改変された支持性細胞である。
【0132】
実施形態では、改変された細胞は、改変された間葉系幹細胞である。
【0133】
実施形態では、改変された細胞は、それが拡大増殖および／または増殖して、療法において使用することができる細胞のシードストックを作製するように培養される。
【0134】
実施形態では、改変された細胞またはシードストックは、がんを処置するために使用される。実施形態では、改変された細胞またはシードストックは、本明細書に記載のがんのいずれかを処置するために使用される。
【0135】
実施形態では、改変された細胞またはシードストックは、腫瘍を処置するために使用される。実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。実施形態では、腫瘍は良性腫瘍である。実施形態では、腫瘍は転移性腫瘍である。実施形態では、腫瘍は流体充満（ｆｌｕｉｄ－ｆｉｌｌｅｄ）腫瘍である。
【0136】
実施形態では、改変された細胞またはシードストックは、改変された細胞またはシードストックとは異なる細胞または細胞の群を処置するために使用される。
【0137】
実施形態では、改変された細胞またはシードストックは、細胞療法において使用される。実施形態では、細胞療法は同種異系細胞療法である。実施形態では、細胞療法は自家細胞療法である。
【0138】
実施形態では、改変された細胞中で外因的に発現されるＫＩＦ１１遺伝子は、５’非翻訳領域中の少なくとも１つの定義された標的配列を欠いている。実施形態では、改変された細胞中で外因的に発現されるＫＩＦ１１遺伝子は、３’非翻訳領域中の少なくとも１つの定義された標的配列を欠いている。実施形態では、改変された細胞中で外因的に発現されるＫＩＦ１１遺伝子は、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域の両方における少なくとも１つの定義された標的配列を欠いている。
【0139】
実施形態では、改変された細胞中で外因的に発現されるＫＩＦ１１遺伝子は、非翻訳領域中に、１つより多くの定義された標的配列を欠いており、例えば、２個の定義された標的配列を欠いており、３個の定義された標的配列を欠いており、４個の定義された標的配列を欠いており、５個の定義された標的配列を欠いており、６個の定義された標的配列を欠いており、７個の定義された標的配列を欠いており、８個の定義された標的配列を欠いており、９個の定義された標的配列を欠いており、または１０個の定義された標的配列を欠いている。実施形態では、改変された細胞中で外因的に発現されるＫＩＦ１１遺伝子は、１０個より多くの定義された標的配列を欠いている。
【0140】
実施形態では、改変された細胞中で外因的に発現されるＫＩＦ１１遺伝子は、ＫＩＦ１１遺伝子の宿主コピーと比べてその非コード配列の部分中にバリアントを含む。実施形態では、バリアントは、ＫＩＦ１１のヌクレオチド配列中の置換を含む。実施形態では、バリアントは、ＫＩＦ１１のヌクレオチド配列中の欠失を含む。実施形態では、バリアントは、ＫＩＦ１１のヌクレオチド配列への付加を含む。実施形態では、バリアントは、第１のヌクレオチド配列の３’非翻訳領域中にある。実施形態では、バリアントは、改変された細胞中で外因的に発現されるＫＩＦ１１遺伝子の５’非翻訳領域中にある。実施形態では、バリアントは、ＫＩＦ１１遺伝子が少なくとも１つの標的配列（例えば、その配列部分）を欠くことを引き起こす。
【0141】
実施形態では、改変された細胞中で外因的に発現されるＫＩＦ１１遺伝子は、配列番号４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。
【0142】
実施形態では、制御性ＲＮＡはｓｈＲＮＡである。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、および配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【0143】
実施形態では、スモールＲＮＡはｓｉＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはマイクロＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはｄｓＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはｐｉＲＮＡである。実施形態では、スモールＲＮＡはリボザイムである。
【0144】
実施形態では、スモールＲＮＡは、遺伝子の３’非翻訳領域への結合を通じてＫＩＦ１１遺伝子の宿主コピーの発現を阻害する。
【0145】
実施形態では、スモールＲＮＡは、細胞療法の部分としてがん細胞に送達される。実施形態では、細胞療法は自家細胞療法である。実施形態では、細胞療法は同種異系細胞療法である。
【0146】
実施形態では、がん細胞は、当該技術分野において公知の任意の種類のがん細胞である。実施形態では、がん細胞は、本明細書に記載の任意のがんに由来する。
【0147】
実施形態では、スモールＲＮＡは、対照処置と比べてＫＩＦ１１ ｍＲＮＡ発現における低減を生じさせる。実施形態では、ＫＩＦ１１ ｍＲＮＡ発現における低減は、対照処置と比べて１％またはより大きい、例えば、５％より大きい、１０％より大きい、１５％より大きい、２０％より大きい、２０％より大きい、２５％より大きい、３０％より大きい、３５％より大きい、４０％より大きい、４５％より大きい、５０％より大きい、５５％より大きい、６０％より大きい、７０％より大きい、７５％より大きい、８０％より大きい、８５％より大きい、９０％より大きい、または９５％より大きい。
【0148】
実施形態では、ＫＩＦ１１ ｍＲＮＡ発現における低減は、対照処置と比べて細胞数の低減を生じさせる。実施形態では、細胞数は、１％より大きく、５％より大きく、１０％より大きく、１５％より大きく、２０％より大きく、２５％より大きく、３０％より大きく、３５％より大きく、４０％より大きく、４５％より大きく、５０％より大きく、５５％より大きく、６０％より大きく、６５％より大きく、７０％より大きく、７５％より大きく、８０％より大きく、８５％より大きく、９０％より大きく、または９５％より大きく低減される。
【0149】
別の態様では、（ｉ）スモールＲＮＡおよび（ｉｉ）ＫＩＦ１１遺伝子を共発現するレンチウイルスベクターが提供される。実施形態では、スモールＲＮＡは、ＫＩＦ１１遺伝子の宿主コピーを標的化し、レンチウイルスベクターにより発現されるＫＩＦ１１遺伝子は、スモールＲＮＡに対して抵抗性である。実施形態では、レンチウイルスベクターにより発現されるＫＩＦ１１遺伝子は切断されている。実施形態では、切断は３’非翻訳領域におけるものである。実施形態では、切断は５’非翻訳領域におけるものである。実施形態では、レンチウイルスベクターにより発現されるＫＩＦ１１遺伝子は突然変異している。実施形態では、突然変異は３’非翻訳領域中にある。実施形態では、突然変異は５’非翻訳領域中にある。
【0150】
実施形態では、スモールＲＮＡはｓｈＲＮＡである。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、および配列番号３のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【0151】
実施形態では、レンチウイルスベクターは、細胞療法の部分としてがん細胞に送達される。実施形態では、がん細胞は、当該技術分野において公知の任意のがん細胞である。実施形態では、細胞療法は同種異系細胞療法である。実施形態では、細胞療法は自家細胞療法である。
【0152】
実施形態では、ＫＩＦ１１遺伝子は、ＫＩＦ１１遺伝子の宿主コピーと比べてその３’非翻訳領域中に少なくとも１つのバリアントを有する。実施形態では、バリアントは、ＫＩＦ１１遺伝子のヌクレオチド配列中の置換を含む。実施形態では、バリアントは、ＫＩＦ１１遺伝子のヌクレオチド配列中の欠失を含む。実施形態では、バリアントは、ＫＩＦ１１遺伝子のヌクレオチド配列への付加を含む。
【0153】
実施形態では、遺伝材料を有するベクターシステムは２構成成分ベクターシステムである。実施形態では、遺伝材料を有するベクターシステムは３構成成分ベクターシステムである。
【0154】
別の態様では、改変された間葉系幹細胞が提供される。実施形態では、改変された間葉系幹細胞は、ＫＩＦ１１に対する阻害ＲＮＡを産生する。実施形態では、改変された間葉系幹細胞は、ＫＩＦ１１の外因性発現を通じてそれらの成長能力を保持する。実施形態では、外因的に発現されるＫＩＦ１１は、スモールＲＮＡにより標的化され得る非コード配列を欠いている。
【0155】
実施形態では、間葉幹（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍｓ）は、２構成成分レンチウイルスベクターシステムを使用して遺伝子改変される。実施形態では、２構成成分レンチウイルスベクターシステムは、ＫＩＦ１１を標的化する阻害ＲＮＡを送達する。実施形態では、２構成成分レンチウイルスベクターシステムは、外因性ＫＩＦ１１遺伝子を送達する。
【0156】
実施形態では、改変された間葉細胞は、腫瘍細胞との細胞間接触に従事することを可能とする特別な特性を有する。実施形態では、細胞間接触は、コネキシンタンパク質により形成される入口を介してがん細胞にＫＩＦ１１を標的化するスモールＲＮＡの送達を可能とする。
【0157】
がん
本明細書中に提供する組成物および方法は、がんを処置するために使用される。細胞、組織、または標的は、がん細胞であり得、がん性組織であり得、がん性組織を有し得、あるいは疾患または状態を発症していると診断されたまたはそのリスクがある被験体または患者であり得る。ある特定の態様では、細胞は、上皮細胞、内皮細胞、中皮細胞、グリア細胞、間質細胞、または粘膜細胞であり得る。がん細胞集団は、脳細胞、神経細胞、血液細胞、子宮内膜細胞、髄膜細胞、食道細胞、肺細胞、心臓血管細胞、肝細胞、リンパ細胞、乳房細胞、骨細胞、結合組織細胞、脂肪細胞、網膜細胞、甲状腺細胞、腺細胞、副腎細胞、膵臓細胞、胃細胞、腸細胞、腎臓細胞、膀胱細胞、結腸細胞、前立腺細胞、子宮細胞、卵巣細胞、子宮頸部細胞、精巣細胞、脾臓細胞、皮膚細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、または横紋筋細胞を含み得るが、これらに限定されず、前述のもののいずれかに由来するがん細胞集団も含むことができ、癌腫、肉腫、骨髄腫、リンパ腫、混合型、または前述のものの混合物の１つまたは複数に関連することもできる。他のさらなる態様では、がんとしては、星状細胞腫、急性骨髄性未分化大細胞リンパ腫、血管肉腫、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、乳癌、膀胱癌、頭頸部癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道扁平上皮癌、ユーイング肉腫、線維肉腫、神経膠腫、膠芽腫、ガストリノーマ、胃癌、胚芽腫、肝細胞癌、カポジ肉腫、ホジキンリンパ腫、喉頭扁平上皮癌、喉頭癌、平滑筋肉腫、脂肪腫、脂肪肉腫、黒色腫、マントル細胞リンパ腫、髄芽腫、中皮腫、粘液線維肉腫、粘膜関連リンパ組織Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、高リスク骨髄異形成症候群、鼻咽腔癌、神経芽腫、神経線維腫、高悪性度非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、食道癌、骨肉腫、膵臓癌、褐色細胞腫、前立腺癌、腎細胞癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺腫瘍、シュワン細胞腫（Ｓｃｈｗａｎｏｍｍａ）、小細胞肺がん、頭頸部の扁平上皮癌、精巣腫瘍、甲状腺癌、尿路上皮癌、およびウィルムス腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中に提供する組成物および方法は、がんを処置するために使用される。細胞、組織、または標的は、がん細胞であり得、がん性組織であり得、がん性組織を有し得、あるいは疾患または状態を発症していると診断されたまたはそのリスクがある被験体または患者であり得る。ある特定の態様では、細胞は、上皮細胞、内皮細胞、中皮細胞、グリア細胞、間質細胞、または粘膜細胞であり得る。がん細胞集団は、脳細胞、神経細胞、血液細胞、子宮内膜細胞、髄膜細胞、食道細胞、肺細胞、心臓血管細胞、肝細胞、リンパ細胞、乳房細胞、骨細胞、結合組織細胞、脂肪細胞、網膜細胞、甲状腺細胞、腺細胞、副腎細胞、膵臓細胞、胃細胞、腸細胞、腎臓細胞、膀胱細胞、結腸細胞、前立腺細胞、子宮細胞、卵巣細胞、子宮頸部細胞、精巣細胞、脾臓細胞、皮膚細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、または横紋筋細胞を含み得るが、これらに限定されず、前述のもののいずれかに由来するがん細胞集団も含むことができ、癌腫、肉腫、骨髄腫、リンパ腫、混合型、または前述のものの混合物の１つまたは複数に関連することもできる。他のさらなる態様では、がんとしては、星状細胞腫、急性骨髄性未分化大細胞リンパ腫、血管肉腫、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、乳癌、膀胱癌、頭頸部癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道扁平上皮癌、ユーイング肉腫、線維肉腫、神経膠腫、膠芽腫、ガストリノーマ、胃癌、胚芽腫、肝細胞癌、カポジ肉腫、ホジキンリンパ腫、喉頭扁平上皮癌、喉頭癌、平滑筋肉腫、脂肪腫、脂肪肉腫、黒色腫、マントル細胞リンパ腫、髄芽腫、中皮腫、粘液線維肉腫、粘膜関連リンパ組織Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、高リスク骨髄異形成症候群、鼻咽腔癌、神経芽腫、神経線維腫、高悪性度非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、食道癌、骨肉腫、膵臓癌、褐色細胞腫、前立腺癌、腎細胞癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺腫瘍、シュワン細胞腫（Ｓｃｈｗａｎｏｍｍａ）、小細胞肺がん、頭頸部の扁平上皮癌、精巣腫瘍、甲状腺癌、尿路上皮癌、およびウィルムス腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
【0158】
本明細書中に提供する組成物および方法は、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、小児悪性疾患、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）によって惹起または助長される子宮頸部およびその他の腫瘍、黒色腫、バレット食道（前悪性症候群）、副腎がん、および皮膚がん、ならびに自己免疫疾患、腫瘍性皮膚疾患を処置するためにも使用される。
【0159】
遺伝子医薬
遺伝子医薬は、疾患の治療または予防を目的として、遺伝子構築物を宿主細胞に送達するために使用されるウイルスベクターへの言及を含む。遺伝子薬としては、細胞が該細胞への遺伝子構築物の送達を通じて改変されている細胞療法が挙げられる。
遺伝子医薬は、疾患の治療または予防を目的として、遺伝子構築物を宿主細胞に送達するために使用されるウイルスベクターへの言及を含む。遺伝子薬としては、細胞が該細胞への遺伝子構築物の送達を通じて改変されている細胞療法が挙げられる。
【0160】
遺伝子構築物には、既存の欠陥を修正または補完する機能的遺伝子または遺伝子の一部、調節タンパク質をコードするＤＮＡ配列、アンチセンス、低分子相同性ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ＲＮＡ）、長い非コードＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡまたはその他を含む制御性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列、ならびに病状を変化させるために、重大な細胞因子について競合するように設計されたＲＮＡまたはタンパク質のいずれかをコードするデコイ配列が含まれ得るが、これらに限定されない。遺伝子構築物としては、遺伝子発現をノックダウンすることができる調節配列をコードまたは発現する構築物が挙げられる。遺伝子医薬は、特定の疾患の処置または緩和を与えるために、直接的にまたは細胞療法を介してのいずれかでこれらの治療的遺伝子構築物を標的細胞へ送達することを含む。
治療ベクター
治療ベクター
【0161】
本明細書における種々の態様および実施形態に従うレンチウイルスのビリオン（粒子）は、ビリオン（ウイルス粒子）を産生するために必要なウイルスタンパク質をコードするベクターシステムによって発現される。種々の実施形態では、レンチウイルスのＰｏｌタンパク質をコードする核酸配列を含有する１つのベクターは、プロモーターに作動可能に連結されて、逆転写および組込みのために提供される。別の実施形態では、ｐｏｌタンパク質は、複数のベクターによって発現される。別の実施形態では、プロモーターに作動可能に連結された、ウイルスカプシドを形成するためのレンチウイルスのＧａｇタンパク質をコードする核酸配列を含有するベクターが提供される。実施形態では、このｇａｇの核酸配列は、ｐｏｌの核酸配列の少なくとも一部とは別のベクター上にある。他の実施形態では、ｇａｇの核酸は、ｐｏｌタンパク質をコードする全てのｐｏｌの核酸配列とは別のベクター上にある。
【0162】
野生型復帰変異体を得る機会をさらに最小化するための粒子の作製に使用される多数の改変を、本明細書におけるベクターに対して行うことができる。これらとしては、ＬＴＲのＵ３領域の欠失、ｔａｔの欠失、およびマトリックス（ＭＡ）の欠失が挙げられるが、これらに限定されない。実施形態では、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖのベクターは、レンチウイルスパッケージング配列と称される、レンチウイルスＲＮＡをパッケージングするレンチウイルスゲノム由来のヌクレオチドを含有しない。
【0163】
粒子を形成するベクターは、好ましくは、エンベロープタンパク質を発現するレンチウイルスゲノム由来の核酸配列を含有しない。好ましくは、プロモーターに作動可能に連結されたエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含有する別のベクターが使用される。このｅｎｖベクターもまた、レンチウイルスパッケージング配列を含有しない。一実施形態では、ｅｎｖの核酸配列は、レンチウイルスのエンベロープタンパク質をコードする。
【0164】
別の実施形態では、エンベロープタンパク質は、レンチウイルス由来のものではなく、異なるウイルスに由来する。そのような例では、生じる粒子は、シュードタイプ化粒子と称される。エンベロープの適切な選択により、実質的にあらゆる細胞に「感染」することができる。例えば、エンドサイトーシス区画を標的化するエンベロープタンパク質をコードするｅｎｖ遺伝子を使用することができる。そのようなｅｎｖ遺伝子およびエンベロープタンパク質が由来し得るウイルスの例としては、インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス、インフルエンザＤウイルス、イサウイルス、クアランジャウイルス、およびトゴトウイルス）、ベシクロウイルス（例えば、インディアナベシクロウイルス）、アルファウイルス（数ある中でも例えば、セムリキフォレストウイルス、シンドビスウイルス、アウラウイルス、バーマフォレストウイルス、ベバルウイルス、カバソウウイルス（Ｃａｂａｓｓｏｕ ｖｉｒｕｓ）、ゲタウイルス、ハイランズＪウイルス、トロカラウイルス（Ｔｒｏｃａｒａ ｖｉｒｕｓ）、ウナウイルス、ヌドゥムウイルス、およびミドルブルグウイルス）、アレナウイルス（例えば、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、マチュポウイルス、フニンウイルスおよびラッサ熱ウイルス）、フラビウイルス（数ある中でも例えば、ダニ媒介性脳炎ウイルス、デングウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＧＢウイルス、アポイウイルス、バガザウイルス、エッジヒルウイルス、ジュグラウイルス（Ｊｕｇｒａ ｖｉｒｕｓ）、カダムウイルス（Ｋａｄａｍ ｖｉｒｕｓ）、ダカールコウモリウイルス、モドックウイルス、ポワッサンウイルス、ウスツウイルス、およびサルビエハウイルス（Ｓａｌ Ｖｉｅｊａ ｖｉｒｕｓ））、ラブドウイルス（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、流行性耳下腺炎または麻疹）およびオルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）が挙げられる。
【0165】
好ましく使用され得る他のエンベロープタンパク質としては、内在性レトロウイルス（例えば、ネコ内在性レトロウイルスおよびヒヒ内在性レトロウイルス）ならびに密接に関連するガンマレトロウイルス（数ある中でも例えば、モロニー白血病ウイルス、ＭＬＶ－Ｅ、ＭＬＶ－Ａ、テナガザル白血病ウイルス、ＧＡＬＶ、ネコ白血病ウイルス、コアラレトロウイルス、トレーガーアヒル脾臓壊死ウイルス、クサリヘビレトロウイルス、ヒヨコ合胞体ウイルス（Ｃｈｉｃｋ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、ガードナー－アーンスタインネコ肉腫ウイルス、およびブタＣ型がんウイルス）に由来するものが挙げられる。これらのガンマレトロウイルスは、初代細胞を標的化するためのｅｎｖ遺伝子およびエンベロープタンパク質の供給源として使用することができる。宿主細胞が初代細胞である場合、ガンマレトロウイルスは特に好ましい。
【0166】
エンベロープタンパク質は、特定の所望の宿主細胞を標的化するために選択することができる。例えば、ドーパミン受容体などの特定の受容体を標的化することは、脳送達のために使用することができる。別の標的は血管内皮であり得る。これらの細胞は、フィロウイルス科の任意のウイルス（例えば、クウェバウイルス、ディアンロウイルス（Ｄｉａｎｌｏｖｉｒｕｓｅｓ）、エボラウイルス、およびマールブルグウイルス）に由来するエンベロープタンパク質を使用して標的化することができる。エボラウイルスの種としては、タイフォレストエボラウイルス、ザイールエボラウイルス、スーダンエボラウイルス、ブンディブギョエボラウイルス、およびレストンエボラウイルスが挙げられる。
【0167】
追加的に、実施形態では、糖タンパク質は、転写後修飾を起こすことができる。例えば、一実施形態では、エボラのＧＰは、翻訳後に修飾されてＧＰ１およびＧＰ２糖タンパク質になることができる。別の実施形態では、シュードタイプ化エンベロープを有する異なるレンチウイルスカプシドを使用することができる（例えば、ＦＩＶまたはＳＨＩＶ［米国特許第５，６５４，１９５号］）。ＳＨＩＶシュードタイプ化ベクターは、サルなどの動物モデルにおいて容易に使用することができる。
【0168】
本明細書中で提供される通りのレンチウイルスベクターシステムは、通常、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、またはｒｅｖ遺伝子のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つのヘルパープラスミドを含む。ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｒｅｖ遺伝子のそれぞれが個々のプラスミド上に提供されてもよいし、あるいは１つまたは複数の遺伝子が一緒に同一のプラスミド上に提供されてもよい。一実施形態では、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｒｅｖ遺伝子は、同一のプラスミド上に提供される（例えば、図１）。別の実施形態では、ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子は第１のプラスミド上に提供され、ｒｅｖ遺伝子は第２のプラスミド上に提供される（例えば、図２）。したがって、３ベクターシステムおよび４ベクターシステムの両方が、本明細書中に記載するようなレンチウイルスを製造するために使用され得る。実施形態では、治療ベクター、少なくとも１つのエンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドは、パッケージング細胞、例えば、パッケージング細胞株中にトランスフェクトされる。パッケージング細胞株の非限定的な例は、２９３Ｔ／１７ ＨＥＫ細胞株である。治療ベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞株中にトランスフェクトされた時に、レンチウイルス粒子が最終的に生産される。
【0169】
別の態様では、レンチウイルス粒子を発現するためのレンチウイルスベクターシステムが開示される。システムは、本明細書中に記載するレンチウイルスベクター、細胞に感染するために最適化されたエンベロープタンパク質を発現するためのエンベローププラスミド、ならびにｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｒｅｖ遺伝子を発現するための少なくとも１つのヘルパープラスミドを含み、レンチウイルスベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞株中にトランスフェクトされた時に、レンチウイルス粒子がパッケージング細胞株によって生産され、レンチウイルス粒子は、ＫＩＦ１１の生産を阻害し、かつ／または内因性ＫＩＦ１１の発現を阻害することができる。
【0170】
別の態様では、また図１および図２に詳述されるように、治療ベクターとしても本明細書において言及されるレンチウイルスベクターは、以下のエレメントを含み得る：ハイブリッド５’末端反復配列（ＲＳＶ／５’ＬＴＲ）（配列番号５および配列番号６）、プサイ配列（ＲＮＡパッケージング部位）（配列番号７）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）（配列番号８）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）（配列番号９）、Ｈ１プロモーター（配列番号１０）、ＫＩＦ１１のｓｈＲＮＡ（配列番号１、配列番号２または配列番号３）、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号１１）、および３’デルタＬＴＲ（配列番号１２）。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列変化が、本明細書中で言及する配列を改変するために使用され得る。
【0171】
別の態様では、本明細書において治療ベクターとも称され得るレンチウイルスベクターは、以下のエレメント：５’長鎖末端反復配列、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）、Ｈ１プロモーター、ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ、ＣＭＶプロモーター、ＩｇＧ１ Ｆｃと融合したトランスフェリン受容体膜貫通領域、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、および３’デルタＬＴＲを含むことができる。
【0172】
別の態様では、本明細書中に詳述するように、ヘルパープラスミドは、以下のエレメントを含むように設計されている：ＣＡＧプロモーター（配列番号１３）、ＨＩＶ構成成分ｇａｇ（配列番号１４）、ＨＩＶ構成成分ｐｏｌ（配列番号１５）、ＨＩＶのＩｎｔ（配列番号１６）、ＨＩＶのＲＲＥ（配列番号１７）、およびＨＩＶのＲｅｖ（配列番号１８）。
【0173】
別の態様では、ヘルパープラスミドは、以下のエレメント：ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータアクチンプロモーター、ウサギベータグロビンイントロン、ＨＩＶ構成成分ｇａｇ、ＨＩＶ構成成分ｐｏｌ、ＨＩＶ Ｉｎｔ、ＨＩＶ ＲＲＥ、ＨＩＶ Ｒｅｖ、およびウサギベータグロビンポリＡを含むように設計されている。
【0174】
別の態様では、ヘルパープラスミドは、ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子を発現するための第１のヘルパープラスミド、ならびにｒｅｖ遺伝子を発現するための第２の別のプラスミドを含むように改変され得る。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列変化が、本明細書中で言及する配列を改変するために使用され得る。
【0175】
別の態様では、レンチウイルスのパッケージングのために使用されるプラスミドは、類似のエレメントを用いて改変することができ、また、イントロン配列は、ベクター機能を失うことなく取り除くことが可能であり得る。例えば、以下のエレメントは、パッケージングシステムを構成するプラスミド中の類似のエレメントの代わりとなり得る：伸長因子－１（ＥＦ－１）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、およびユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターは、ＣＭＶプロモーターまたはＣＡＧプロモーターの代わりとなり得る。ＳＶ４０ポリＡおよびｂＧＨポリＡは、ウサギベータグロビンポリＡの代わりとなり得る。ヘルパープラスミド中のＨＩＶ配列は、異なるＨＩＶの株またはクレードから構築され得る。ＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質は、ＨＥＲＶ－Ｗを含むヒト内因性レトロウイルス、ヒヒ内因性レトロウイルスＢａＥＶネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、狂犬病（ＦＵＧ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、Ａ型インフルエンザ家禽ペストウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｆｏｗｌ ｐｌａｇｕｅ ｖｉｒｕｓ）（ＦＰＶ）、ロスリバーアルファウイルス（ＲＲＶ）、マウス白血病ウイルス１０Ａ１（ＭＬＶ）、またはエボラウイルス（ＥｂｏＶ）由来の膜糖タンパク質で置換することができる。
【0176】
なお、レンチウイルスパッケージングシステムは市販のものを入手でき（例えば、Ｌｅｎｔｉ－ｖｐａｋ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｋｉｔ、ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、また本明細書中に記載するように設計することもできる。さらに、レンチウイルスパッケージングシステムの態様を置換または改変して、レンチウイルス粒子の生産効率などのいくつもの関連因子を向上させることは当業者の技術的範囲内である。
【0177】
別の態様では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターもまた使用することができる。
【0178】
ＡＡＶベクターの構築。ＫＩＦ１１配列（配列番号４）またはＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列（例えば、配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号３）をｐＡＡＶプラスミド（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）に挿入することができる。ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含有するＫＩＦ１１オリゴヌクレオチド配列をＥｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎにより合成する。重複するセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を混合し、７０℃から室温へと冷却しながらアニーリングさせる。３７℃で１時間、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いてｐＡＡＶを消化する。消化したｐＡＡＶプラスミドをアガロースゲル電気泳動により精製し、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤＮＡゲル抽出キットを使用してゲルから抽出する。ＤＮＡ濃度を決定し、ベクターをオリゴに混合し（３：１の比）、アニーリングおよびライゲートさせる。ライゲーション反応は、室温で３０分間、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて行う。２．５マイクロリットルのライゲーション混合物を２５マイクロリットルのＳＴＢＬ３コンピテント細菌細胞に加える。４２℃での熱ショック後に形質転換は達成される。アンピシリンを含有する寒天プレート上に細菌細胞を広げ、薬物抵抗性コロニー（アンピシリン抵抗性プラスミドの存在を指し示す）を回収し、ＬＢブロス中で拡大増殖させる。オリゴ配列の挿入を確認するために、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤＮＡミニプレップキットを用いて、回収した細菌培養物からプラスミドＤＮＡを抽出する。ｐＡＡＶプラスミド中へのｓｈＲＮＡ配列の挿入は、ｓｈＲＮＡの発現を調節するために使用されるプロモーター用の特異的プライマーを使用してＤＮＡシークエンシングにより検証する。
【0179】
ＡＡＶ粒子の産生。ＡＡＶ－ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡプラスミドをプラスミドｐＡＡＶ－ＲＣ２（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）およびｐＨｅｌｐｅｒ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）と合わせる。ｐＡＡＶ－ＲＣ２プラスミドはＲｅｐおよびＡＡＶ２カプシド遺伝子を含有し、ｐＨｅｌｐｅｒはアデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡ遺伝子を含有する。ＡＡＶ粒子を産生するために、これらのプラスミドを比１：１：１（ｐＡＡＶ－ｓｈＫＩＦ１１：ｐＡＡＶ－ＲＣ２：ｐＨｅｌｐｅｒ）で２９３Ｔ細胞にトランスフェクトする。１５０ｍｍディッシュ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）中での細胞のトランスフェクションのために、１０マイクログラムの各プラスミドを１ｍｌのＤＭＥＭに共に加える。別のチューブ中で、６０マイクロリットルのトランスフェクション試薬ＰＥＩ（１マイクログラム／ｍｌ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１ｍｌのＤＭＥＭに加える。２つのチューブを共に混合し、１５分間インキュベートさせる。次いでトランスフェクション混合物を細胞に加え、細胞を３日後に収集する。凍結／解凍溶解により細胞をドライアイス／イソプロパノールに溶解する。３７℃で３０分間、ベンゾナーゼヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ）を細胞溶解液に加える。４℃で１５分間の１２，０００ｒｐｍでの遠心分離により細胞デブリを次いでペレット化する。上清を収集した後、標的細胞に加える。
投薬量および剤形
間葉系幹細胞
投薬量および剤形
間葉系幹細胞
【0180】
実施形態では、ベクター組成物は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に投与され得る。ＭＳＣは、骨髄、胎盤、および臍帯などの複数の供給源から単離され得る。単離の後に、ＭＳＣは遺伝子改変され、拡大増殖されてシードストックが作製される。シードストックは次いで、自家または同種異系細胞療法において使用され得る。ＭＳＣの単離の方法、ＭＳＣの拡大増殖、およびＭＳＣの投与は以下に記載される。
【0181】
ＭＳＣの単離および拡大増殖：ＭＳＣを単離および拡大増殖するための多数の方法が当該技術分野において公知である。実施形態では、ＭＳＣは胎盤から単離され、胎盤を満期新生児のための選択的帝王切開による出産後に回収する。胎盤をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、母系脱落膜を除去する。約１ｃｍ３または４グラムの湿潤重量の組織部分を胎児境界部の絨毛から解剖する。組織部分を再びＰＢＳ中で洗浄し、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＡ溶液を用いて３７℃で６０分間処理する。消化した材料を遠心分離により収集し、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液に３７℃で１０分間再懸濁する。トリプシン処理した材料を再び遠心分離により収集し、１回洗浄し、１％のペニシリン－ストレプトマイシン溶液＋５ｍＭのＬ－グルタミンを含むＢｉｏ－ＡＭＦ－１培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）に再懸濁する。細胞をＴ－２５培養フラスコに移し、加湿雰囲気中３７℃で５％のＣＯ２と共にインキュベートする。ＭＳＣがＴ－２５フラスコ中でコンフルエンスに達した時に、それらをトリプシン／ＥＤＴＡで処理してプラスチックに結合した細胞を解放させ、培地で希釈し、新たなＴ－２５フラスコ中に再プレーティングする。
【0182】
当該技術分野において公知のＭＳＣを単離および拡大増殖する他の方法を使用することができる。ＭＳＣを単離および拡大増殖するための詳細なプロトコールは以下の参考文献に記載されており、これらは参照により全体が本明細書に援用される：（ｉ）Ｈｕａｎｇ
Ｑ， Ｙａｎｇ Ｙ， Ｌｕｏ Ｃ， Ｗｅｎ Ｙ， Ｌｉｕ Ｒ， Ｌｉ Ｓ， Ｃｈｅｎ Ｔ， Ｓｕｎ Ｈ， ａｎｄ Ｔａｎｇ Ｌ． ２０１９． Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｐｌａｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：３０１、（ｉｉ）Ｈａｓｓａｎ Ｇ， Ｋａｓｅｍ Ｉ， Ａｎｔａｋｉ， Ｒ， Ｍｏｈａｍｍａｄ ＭＢ， ＡｌＫａｄｒｙ Ｒ， ａｎｄ Ａｌｊａｍａｌｉ Ｍ． ２０１９． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｂｌｏｏｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ ｗｉｔｈ ｅｘｐｌａｎｔ ｍｅｔｈｏｄ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ６：２９。
Ｑ， Ｙａｎｇ Ｙ， Ｌｕｏ Ｃ， Ｗｅｎ Ｙ， Ｌｉｕ Ｒ， Ｌｉ Ｓ， Ｃｈｅｎ Ｔ， Ｓｕｎ Ｈ， ａｎｄ Ｔａｎｇ Ｌ． ２０１９． Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｐｌａｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：３０１、（ｉｉ）Ｈａｓｓａｎ Ｇ， Ｋａｓｅｍ Ｉ， Ａｎｔａｋｉ， Ｒ， Ｍｏｈａｍｍａｄ ＭＢ， ＡｌＫａｄｒｙ Ｒ， ａｎｄ Ａｌｊａｍａｌｉ Ｍ． ２０１９． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｂｌｏｏｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ ｗｉｔｈ ｅｘｐｌａｎｔ ｍｅｔｈｏｄ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ６：２９。
【0183】
ＭＳＣの表現型の同定：ＭＳＣ表現型は起源の組織にしたがって変動する。絨毛ＭＳＣについて、細胞素性の主要な表現型マーカーとしては、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、アルファ－ＳＭＡ、およびＳｔｒｏ－１が挙げられる。これらの細胞表面マーカーを検出するための抗体染色およびフローサイトメトリーはＭＳＣの存在を裏付け、絨毛ＭＳＣに最も類似した細胞の画分をさらに指し示す。遺伝子発現の特定のパターンもまたＭＳＣについて同定されている。絨毛ＭＳＣはＳＯＸ－２を発現するがＮＡＮＯＧもＰＯＵ５Ｆ１も発現しない。これらの遺伝子の３つ全ての発現は、胚性幹細胞多能性の共通のマーカーであり、ＳＯＸ－２に限定された発現はＭＳＣの部分的に多能性の表現型と合致する。
【0184】
レンチウイルスベクターの生産：レンチウイルスベクターは、ビリオン酵素および構造タンパク質、エンベロープ糖タンパク質、ならびに治療用導入遺伝子をコードする３つ（実験室の目的のため）または４つ（臨床使用のため）のプラスミドをトランスフェクトしたパッケージング細胞から生産される。典型的には、エンベロープ糖タンパク質は、水疱性口内炎ウイルスからの糖タンパク質Ｇである。ＶＳＶ－Ｇを補完した典型的なレンチウイルスベクターは、ＭＳＣ形質導入および安定な遺伝子改変のために好適である。
【0185】
ＭＳＣのレンチウイルスベクター遺伝子改変：ＭＳＣの遺伝子改変のためのいくつかのアプローチが当該技術分野において公知である。レンチウイルスベクターはＭＳＣの安定な遺伝子改変のための好ましい方法であり、骨髄由来および他の種類のＭＳＣの短期および長期培養において評価されている。マーカータンパク質（緑色または赤色蛍光タンパク質）およびピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ（ピューロマイシンへの抵抗性を付与する）の両方を発現するレンチウイルスベクターの作製は、表現型変化、細胞モビリティの変更、または長期培養における細胞増幅の能力についての多数の試験後に非改変ＭＳＣと同一であるらしい遺伝子改変されたＭＳＣの薬物選択を可能とする。
【0186】
レンチウイルスベクター粒子形質導入は、３つのステップにおいて行うことができる：
【0187】
ステップ１：コンフルエントなＭＳＣをトリプシン処理し、１：３で希釈し、２日間再プレーティングする。
【0188】
ステップ２：ＰＢＳ＋８ｕｇ／ｍＬのポリブレン中のレンチウイルスベクターストックをＭＳＣ細胞単層上に４時間重層し、次いで細胞を培地ですすぐことにより除去する。
【0189】
ステップ３：規定された長さの期間にわたりＭＳＣを培養する。期間は、適宜、１日未満、１日、または１日より長くであり得る。
【0190】
ステップ４：トリプシン溶液を用いてＭＳＣをプレートから剥がし、形質導入の効率を測定するＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質抽出のために使用する。
【0191】
ほとんどのレンチウイルスベクターについて、５に等しい多重感染度を有する形質導入は、＞８０％のＭＳＣが遺伝子改変されることを生じさせる。改変は安定であり、導入遺伝子発現は多くの世代にわたり持続する。
【0192】
臨床使用のための遺伝子改変されたＭＳＣの大規模製造のために、１０００万～５０００万の形質導入されたＭＳＣを含有するシードストックを連続継代を通じて拡大し、懸濁培養に適合させる。最終の細胞培養体積は１００～２００Ｌに達し得、細胞収率は５×１０９／リットルに接近し得る。細胞を遠心分離および／または濾過により回収し、洗浄し、ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために培地に再懸濁する。ＭＳＣの大規模拡大増殖は、ＧＭＰ条件下で２００Ｌまでの懸濁培養物中で行うことができる。
細胞組成物（細胞療法）の投与
細胞組成物（細胞療法）の投与
【0193】
ＭＳＣの遺伝子改変および拡大増殖は、シードストックの作製を生じさせ、これを次いで細胞療法の部分として使用することができる。対象は、同種異系または自家細胞療法を投与され得る。
【0194】
細胞療法は、１日に１回または２回、あるいは任意のその他の好適な期間で定期的に投与され得る。例えば、細胞組成物は、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、１カ月に１回、２カ月毎、３カ月毎、６カ月毎、９カ月毎、１年に１回、１８カ月毎、２年毎、３０カ月毎、または３年毎に、必要とする被験体に投与され得る。
【0195】
実施形態では、細胞組成物は、医薬組成物として投与される。実施形態では、医薬組成物は、多様な剤形に製剤化され得、これらの剤形としては、臨床適用のための経鼻、経肺、経口、局所、または非経口の剤形が挙げられるが、これらに限定されない。各剤形は、様々な可溶化剤、崩壊剤、界面活性剤、充填剤、増粘剤、結合剤、湿潤剤などの希釈剤、またはその他の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。医薬組成物は、注射、ガス注入（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）、注入、または皮内曝露用にも製剤化され得る。例えば、注射製剤は、好適なｐＨおよび張度の水性または非水性の溶液中に細胞組成物を含み得る。
【0196】
細胞組成物は、腫瘍部位中へのまたは感染部位における直接の注射を介して被験体に投与され得る。実施形態では、細胞組成物は、全身投与され得る。実施形態では、細胞組成物は、腫瘍または感染の部位のすぐ周囲の組織へのガイドされたカニューレ挿入を介して投与され得る。
【0197】
細胞組成物は、例えば、鼻腔内投与、口腔内投与、舌下投与、経口投与、直腸投与、眼投与、非経口（静脈内、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内）投与、経肺投与、腟内投与、局所投与、局部投与、乱切後の局部投与、粘膜投与、エアロゾルを介して、アガロースまたはゼラチンなどの半固体媒体中で、あるいは口腔内または経鼻噴霧製剤を介してなど、任意の薬学的に許容される方法を使用して投与され得る。
【0198】
さらに、細胞組成物は、例えば、カプセル剤、液体分散物、ゲル剤、エアロゾル剤、肺エアロゾル剤、鼻エアロゾル剤、軟膏剤、クリーム剤、半固体剤形、液剤、乳剤、および懸濁剤などの任意の薬学的に許容される剤形に製剤化され得る。さらに、医薬組成物は、経皮送達システムであり得る。
【0199】
実施形態では、医薬組成物は、舌下剤形または口腔内剤形として製剤化され得る。そのような剤形は、舌下に投与される舌下錠または舌下溶液組成物を含む。
【0200】
実施形態では、医薬組成物は、経鼻剤形として製剤化され得る。そのような剤形としては、経鼻送達用の溶液組成物、懸濁物組成物、およびゲル組成物が挙げられる。
【0201】
実施形態では、医薬組成物は、懸濁剤、乳剤、またはシロップ剤などの経口投与用の液体剤形として製剤化され得る。実施形態では、液体剤形は、水および液体パラフィンなどの一般に使用される単純な希釈剤に加えて、保湿剤、甘味剤、芳香剤、または防腐剤などの様々な賦形剤を含み得る。実施形態では、医薬組成物は、小児患者への投与のために好適となるように製剤化され得る。
【0202】
実施形態では、医薬組成物は、滅菌水性液剤、懸濁剤、乳剤、非水性液剤、または坐剤などの非経口投与用剤形として製剤化され得る。
【0203】
医薬組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、投与の時間および様式、排泄速度、ならびに疾患の重篤度に応じて変化し得る。
【0204】
実施形態では、がんの処置は、針を使用した腫瘍中への細胞組成物のガイド下の直接注射、または血管内カニューレ挿入によって達成される。実施形態では、ベクター組成物は、静脈もしくは動脈へのカニューレ挿入または注射、皮内送達、筋肉内送達、または疾患部位近くの排液臓器（ｄｒａｉｎｉｎｇ ｏｒｇａｎ）中への注射によって、脳脊髄液、血液、またはリンパ循環中に投与される。
【実施例0205】
以下の実施例は、本発明の実施形態の態様の実例を挙げるために与えたものである。しかしながら、実施形態は、これらの実施例に記載する特定の条件または詳細に限定されないことを理解するべきである。本明細書中で参照する全ての出版物は、参照することにより具体的に組み込まれる。
【0206】
（実施例１：レンチウイルスベクターシステムの開発）
図１および図２に要約するように、レンチウイルスベクターシステムを開発した（環状形態）。治療ベクター、エンベローププラスミド、およびヘルパープラスミドのトランスフェクション後に、２９３Ｔ／１７ ＨＥＫ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡより購入）中でレンチウイルス粒子を生産した。２９３Ｔ／１７ ＨＥＫ細胞のトランスフェクションにより、機能的なウイルス粒子が生産できる。このトランスフェクションには、プラスミドＤＮＡの取込み効率を増加させるために試薬ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を使用する。最初に、血清を含まない培養培地中にプラスミドおよびＤＮＡを３：１の比（ＤＮＡに対するＰＥＩの質量比）で別々に加える。２～３日後、細胞培地を回収し、高速遠心分離および／または濾過とその後の陰イオン交換クロマトグラフィーによってレンチウイルス粒子を精製する。レンチウイルス粒子の濃度は、形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ／ｍｌ）で表すことができる。ＴＵの決定は、培養液中のＨＩＶ ｐ２４レベルの測定（ｐ２４タンパク質はレンチウイルス粒子中に組み込まれる）、定量ＰＣＲによる細胞あたりのウイルスＤＮＡコピー数の測定、または細胞の感染および光の使用（ベクターがルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質マーカーをコードする場合）によって達成する。
図１および図２に要約するように、レンチウイルスベクターシステムを開発した（環状形態）。治療ベクター、エンベローププラスミド、およびヘルパープラスミドのトランスフェクション後に、２９３Ｔ／１７ ＨＥＫ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡより購入）中でレンチウイルス粒子を生産した。２９３Ｔ／１７ ＨＥＫ細胞のトランスフェクションにより、機能的なウイルス粒子が生産できる。このトランスフェクションには、プラスミドＤＮＡの取込み効率を増加させるために試薬ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を使用する。最初に、血清を含まない培養培地中にプラスミドおよびＤＮＡを３：１の比（ＤＮＡに対するＰＥＩの質量比）で別々に加える。２～３日後、細胞培地を回収し、高速遠心分離および／または濾過とその後の陰イオン交換クロマトグラフィーによってレンチウイルス粒子を精製する。レンチウイルス粒子の濃度は、形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ／ｍｌ）で表すことができる。ＴＵの決定は、培養液中のＨＩＶ ｐ２４レベルの測定（ｐ２４タンパク質はレンチウイルス粒子中に組み込まれる）、定量ＰＣＲによる細胞あたりのウイルスＤＮＡコピー数の測定、または細胞の感染および光の使用（ベクターがルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質マーカーをコードする場合）によって達成する。
【0207】
上記の通り、３プラスミドシステム（すなわち、２プラスミドのレンチウイルスパッケージングシステム）をレンチウイルス粒子を生産するために設計した。３プラスミドシステムの概略図を図１に示す。図１に関して簡潔に述べれば、一番上のベクターはヘルパープラスミドであり、これはこの場合、Ｒｅｖを含み、中央に見られるベクターはエンベローププラスミドであり、一番下のベクターは、本明細書中に記載する治療ベクターである。
【0208】
図１をより詳細に参照して、ヘルパープラスＲｅｖプラスミドは、ＣＡＧエンハンサー（配列番号１９）、ＣＡＧプロモーター（配列番号１３）、ニワトリベータアクチンイントロン（配列番号２０）、ＨＩＶ ｇａｇ（配列番号１４）、ＨＩＶ Ｐｏｌ（配列番号１５）、ＨＩＶ Ｉｎｔ（配列番号１６）、ＨＩＶ ＲＲＥ（配列番号１７）、ＨＩＶ Ｒｅｖ（配列番号１８）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２１）を含む。ヘルパープラスＲｅｖプラスミドは、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータアクチンプロモーター、ウサギベータグロビンイントロン、ＨＩＶ ｇａｇ、ＨＩＶ Ｐｏｌ、ＨＩＶ Ｉｎｔ、ＨＩＶ ＲＲＥ、ＨＩＶ Ｒｅｖ、およびウサギベータグロビンポリＡを含む。
【0209】
エンベローププラスミドは、ＣＭＶプロモーター（配列番号２２）、ベータグロビンイントロン（配列番号２３）、ＶＳＶ－Ｇ（配列番号２４）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２５）を含む。
【0210】
ヘルパー（プラスＲｅｖ）プラスミドおよびエンベローププラスミドを含む２ベクターレンチウイルスパッケージングシステムの合成
【0211】
材料および方法：
ヘルパープラスミドの構築：Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ遺伝子を含有するｐＮＬ４－３ ＨＩＶプラスミド（ＮＩＨ Ａｉｄｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）由来のＤＮＡ断片の初期ＰＣＲ増幅によってヘルパープラスミドを構築した。ｐＣＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の同じ部位に挿入するために使用され得るＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限部位を有する断片を増幅するためのプライマーを設計した。フォワードプライマーは（５’－ＴＡＡＧＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＴＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＴ－３’）（配列番号４４）であり、リバースプライマーは（５’－ＣＣＡＴＡＣＡＡＴＧＡＡＴＧＧＡＣＡＣＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＡＡＴ－３’）（配列番号４５）であった。
ヘルパープラスミドの構築：Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ遺伝子を含有するｐＮＬ４－３ ＨＩＶプラスミド（ＮＩＨ Ａｉｄｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）由来のＤＮＡ断片の初期ＰＣＲ増幅によってヘルパープラスミドを構築した。ｐＣＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の同じ部位に挿入するために使用され得るＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限部位を有する断片を増幅するためのプライマーを設計した。フォワードプライマーは（５’－ＴＡＡＧＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＴＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＴ－３’）（配列番号４４）であり、リバースプライマーは（５’－ＣＣＡＴＡＣＡＡＴＧＡＡＴＧＧＡＣＡＣＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＡＡＴ－３’）（配列番号４５）であった。
【0212】
Ｇａｇ、Ｐｏｌ、インテグラーゼの断片の配列は以下の通りであった：
【化1-1】
【化1-2】
【化1-3】
【0213】
次に、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ隣接制限部位と共にＲｅｖ、ＲＲＥ、およびウサギベータグロビンポリＡの配列を含有するＤＮＡ断片は、ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。次いで、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位においてＤＮＡ断片をプラスミドに挿入した。ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
【化2-1】
【化2-2】
【0214】
最後に、ｐＣＤＮＡ３．１のＣＭＶプロモーターをＣＡＧエンハンサー／プロモータープラスニワトリベータアクチンイントロン配列で置換した。ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ隣接制限部位と共にＣＡＧエンハンサー／プロモーター／イントロン配列を含有するＤＮＡ断片は、ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。次いで、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位においてＤＮＡ断片をプラスミドに挿入した。ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
【化3-1】
【化3-2】
【0215】
ＶＳＶ－Ｇエンベローププラスミドの構築：
水疱性口内炎インディアナウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）配列は、隣接ＥｃｏＲＩ制限部位を用いてＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。次いで、ＥｃｏＲＩ制限部位においてＤＮＡ断片をｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、ＣＭＶ特異的プライマーを使用するシークエンシングによって正しい配向であることを決定した。ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
水疱性口内炎インディアナウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）配列は、隣接ＥｃｏＲＩ制限部位を用いてＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。次いで、ＥｃｏＲＩ制限部位においてＤＮＡ断片をｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、ＣＭＶ特異的プライマーを使用するシークエンシングによって正しい配向であることを決定した。ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
【化4-1】
【化4-2】
【0216】
本明細書中に記載する方法および材料を使用して、４ベクターシステム（すなわち、３ベクターレンチウイルスパッケージングシステム）も設計し、生産した。４ベクターシステムの概略図を図２に示す。図２に関して簡潔に述べれば、上のベクターはヘルパープラスミドであり、これはこの場合、Ｒｅｖを含まず、上から２つ目のベクターは別個のＲｅｖプラスミドであり、下から２つ目のベクターはエンベローププラスミドであり、下のベクターは、前に記載した治療ベクターである。
【0217】
図１に示されるように、ヘルパープラスミドは、ＣＡＧエンハンサー（配列番号１９）、ＣＡＧプロモーター（配列番号１３）、ニワトリベータアクチンイントロン（配列番号２０）、ＨＩＶ ｇａｇ（配列番号１４）、ＨＩＶ Ｐｏｌ（配列番号１５）、ＨＩＶ Ｉｎｔ（配列番号１６）、ＨＩＶ ＲＲＥ（配列番号１７）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２１）を含む。ヘルパープラスミドは、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータアクチンプロモーター、ウサギベータグロビンイントロン、ＨＩＶ ｇａｇ、ＨＩＶ Ｐｏｌ、ＨＩＶ Ｉｎｔ、ＨＩＶ ＲＲＥ、およびウサギベータグロビンポリＡを含む。
【0218】
図２に示すように、Ｒｅｖプラスミドは、ＲＳＶプロモーター（配列番号２９）、ＨＩＶ Ｒｅｖ（配列番号１８）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２１）を含む。
【0219】
図１および図２に示されるように、エンベローププラスミドは、ＣＭＶプロモーター（配列番号２２）、ベータグロビンイントロン（配列番号２３）、ＶＳＶ－Ｇ（配列番号２４）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２５）を含む。
【0220】
ヘルパープラスミド、Ｒｅｖプラスミド、およびエンベローププラスミドを含む３ベクターシステムの合成
材料および方法：
Ｒｅｖを含まないヘルパープラスミドの構築：
ＲＲＥおよびウサギベータグロビンポリＡ配列を含有するＤＮＡ断片を挿入することによって、Ｒｅｖを含まないヘルパープラスミドを構築した。この配列は、隣接ＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位を用いてＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。次いで、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位においてＲＲＥ／ウサギポリＡベータグロビン配列をヘルパープラスミドに挿入した。ＤＮＡ配列は以下の通りである：
材料および方法：
Ｒｅｖを含まないヘルパープラスミドの構築：
ＲＲＥおよびウサギベータグロビンポリＡ配列を含有するＤＮＡ断片を挿入することによって、Ｒｅｖを含まないヘルパープラスミドを構築した。この配列は、隣接ＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位を用いてＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。次いで、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位においてＲＲＥ／ウサギポリＡベータグロビン配列をヘルパープラスミドに挿入した。ＤＮＡ配列は以下の通りである：
【化5】
【0221】
Ｒｅｖプラスミドの構築：
ＲＳＶプロモーターおよびＨＩＶ Ｒｅｖ配列は、隣接ＭｆｅＩおよびＸｂａＩ制限部位を用いて、ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎによって単一のＤＮＡ断片として合成された。次いで、ＣＭＶプロモーターがＲＳＶプロモーターで置換されたＭｆｅＩおよびＸｂａＩ制限部位において、ＤＮＡ断片をｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
ＲＳＶプロモーターおよびＨＩＶ Ｒｅｖ配列は、隣接ＭｆｅＩおよびＸｂａＩ制限部位を用いて、ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎによって単一のＤＮＡ断片として合成された。次いで、ＣＭＶプロモーターがＲＳＶプロモーターで置換されたＭｆｅＩおよびＸｂａＩ制限部位において、ＤＮＡ断片をｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
【化6】
【0222】
２ベクターおよび３ベクターのパッケージングシステムのためのプラスミドは、類似のエレメントを用いて改変することができ、また、イントロン配列は、ベクター機能を失うことなく取り除くことが可能であった。例えば、以下のエレメントは、２ベクターおよび３ベクターのパッケージングシステム中の類似のエレメントの代わりとなることができた：
【0223】
プロモーター：伸長因子－１（ＥＦ－１）（配列番号３１）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）（配列番号３２）、およびユビキチンＣ（ＵｂＣ）（配列番号３３）は、ＣＭＶプロモーター（配列番号２２）またはＣＡＧプロモーター（配列番号１３）の代わりとなり得る。これらの配列を、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることもできる。
【0224】
ポリＡ配列：ＳＶ４０ポリＡ（配列番号３４）およびｂＧＨポリＡ（配列番号３５）は、ウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２１）の代わりとなり得る。これらの配列を、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることもできる。
【0225】
ＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ配列：ヘルパープラスミド中のＨＩＶ配列は、異なるＨＩＶの株またはクレードから構築することができる。例えば、Ｂａｌ株由来のＨＩＶ Ｇａｇ（配列番号１４）、ＨＩＶ Ｐｏｌ（配列番号１５）、およびＨＩＶ Ｉｎｔ（配列番号１６）を、本明細書中に概説したように、ヘルパー／ヘルパープラスＲｅｖプラスミド中に含有されるｇａｇ、ｐｏｌ、およびｉｎｔ配列と交換することができる。これらの配列を、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることもできる。
【0226】
エンベロープ：ＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質は、ネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）（配列番号３６）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）（配列番号３７）、狂犬病（ＦＵＧ）（配列番号３８）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）（配列番号３９）、Ａ型インフルエンザ家禽ペストウイルス（ＦＰＶ）（配列番号４０）、ロスリバーアルファウイルス（ＲＲＶ）（配列番号４１）、マウス白血病ウイルス１０Ａ１（ＭＬＶ）（配列番号４２）、またはエボラウイルス（ＥｂｏＶ）（配列番号４３）由来の膜糖タンパク質と置換することができる。これらのエンベロープの配列は、本明細書中の配列の表として特定される。さらに、これらの配列を、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることもできる。
【0227】
要約すると、３ベクターシステムと４ベクターシステムとを以下の通りに、部分的に、比較および対比することができる。３ベクターレンチウイルスベクターシステムは以下を含有する：１．ヘルパープラスミド：ＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、インテグラーゼ、およびＲｅｖ／Ｔａｔ；２．エンベローププラスミド：ＶＳＶ－Ｇ／ＦＵＧエンベロープ；および３．治療ベクター：ＲＳＶ ５’ＬＴＲ、プサイパッケージングシグナル、Ｇａｇ断片、ＲＲＥ、Ｅｎｖ断片、ｃＰＰＴ、ＷＰＲＥ、および３’δ ＬＴＲ。４ベクターレンチウイルスベクターシステムは以下を含有する：１．ヘルパープラスミド：ＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ；２．Ｒｅｖプラスミド：Ｒｅｖ；３．エンベローププラスミド：ＶＳＶ－Ｇ／ＦＵＧエンベロープ；および４．治療ベクター：ＲＳＶ ５’ＬＴＲ、プサイパッケージングシグナル、Ｇａｇ断片、ＲＲＥ、Ｅｎｖ断片、ｃＰＰＴ、ＷＰＲＥ、および３’デルタＬＴＲ。上記エレメントと対応する配列は、本明細書中の配列表の部分として特定される。
（実施例２）
ヒトＫＩＦ１１（Ｅｇ５）非翻訳領域を標的化するレンチウイルス粒子送達性ｓｈＲＮＡベースＲＮＡ干渉はＫＩＦ１１ ｍＲＮＡの有意に低減したレベルを生じさせる。
（実施例２）
ヒトＫＩＦ１１（Ｅｇ５）非翻訳領域を標的化するレンチウイルス粒子送達性ｓｈＲＮＡベースＲＮＡ干渉はＫＩＦ１１ ｍＲＮＡの有意に低減したレベルを生じさせる。
【0228】
Ｈ１プロモーターならびに非標的化ｓｈＲＮＡ（対照として使用）（配列番号５６）または３つの異なるＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列：ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列＃１（配列番号１）、ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列＃２（配列番号２）、およびＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列＃３（配列番号３）のうちのいずれか１つを含有するレンチウイルスベクター粒子をＰＣ３ヒト前立腺癌細胞に感染させた。
【0229】
ＰＣ３ヒト前立腺癌細胞を２４ウェルプレートに５×１０４細胞／ウェルで播種した。２４時間後、Ｈ１プロモーターおよび３つの異なるＫＩＦ１１ ＵＴＲ ｓｈＲＮＡ配列（配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号３）のうちの１つを含有するレンチウイルスベクター粒子またはＧＦＰのみを発現するレンチウイルスベクター粒子を用いて５ＭＯＩで細胞への形質導入を行った。７２時間後、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを細胞から抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いてｃＤＮＡに変換した。ＦＡＭ標識ＫＩＦ１１ ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号４８）およびＫＩＦ１１用のプライマー（フォワードプライマー（配列番号４６）；リバースプライマー（配列番号４７））を使用して定量ＰＣＲによりＫＩＦ１１ ｃＤＮＡの発現を決定した。ＫＩＦ１１ ＲＮＡ発現を各試料についてアクチンレベルに対して正規化した（アクチンフォワードプライマー（配列番号４９）；アクチンリバースプライマー＃１（配列番号５０）；アクチンプローブ（配列番号５２））。
【0230】
ＬＶ－ＧＦＰ％と比べたＫＩＦ１１ ｍＲＮＡのレベルを図５に示す。ＬＶ－ＧＦＰ形質導入細胞と比較した場合に、ＫＩＦ１１ ＲＮＡは、（ｉ）ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列＃１（配列番号１）を使用して６３％減少し（ｓｈＫＩＦ１１－１を用いた形質導入後のＫＩＦ１１ ｍＲＮＡ発現を示すバーを参照）、（ｉｉ）ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列＃２（配列番号２）を使用して６９％減少し（ｓｈＫＩＦ１１－２を用いた形質導入後のＫＩＦ１１ ｍＲＮＡ発現を示すバーを参照）、（ｉｉｉ）ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列＃３（配列番号３）を使用して７９％減少した（ｓｈＫＩＦ１１－３を用いた形質導入後のＫＩＦ１１ ｍＲＮＡ発現を示すバーを参照）。
（実施例３）
（ｉ）ヒトＫＩＦ１１非翻訳領域を標的化するｓｈＲＮＡベースＲＮＡ干渉および（ｉｉ）ＫＩＦ１１コード配列の両方のレンチウイルス粒子送達性共発現はＫＩＦ１１の高い発現レベルを生じさせる。
（実施例３）
（ｉ）ヒトＫＩＦ１１非翻訳領域を標的化するｓｈＲＮＡベースＲＮＡ干渉および（ｉｉ）ＫＩＦ１１コード配列の両方のレンチウイルス粒子送達性共発現はＫＩＦ１１の高い発現レベルを生じさせる。
【0231】
ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ（ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列＃３（配列番号３））の発現を調節するＨ１プロモーターを含有するレンチウイルスベクター粒子ならびに（ｉ）ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ（ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列＃３）（配列番号３））の発現を調節するＨ１プロモーター、および（ｉｉ）そのコード配列および切断された３’ＵＴＲを含むＫＩＦ１１配列（配列番号４）の発現を調節するＣＭＶプロモーターの両方を含有するレンチウイルスベクター粒子をＰＣ３ヒト前立腺癌細胞に感染させた。この実験において使用したベクターの一実施形態を図３（環状）および図４（直鎖状）に提供する。
【0232】
ＰＣ３ヒト前立腺癌細胞を２４ウェルプレートに５×１０４細胞／ウェルで播種した。２４時間後、ＫＩＦ１１ ＵＴＲ ｓｈＲＮＡ ＃３（配列番号３）およびＫＩＦ１１コード配列（配列番号４）の発現を調節するＣＭＶプロモーターを発現するレンチウイルスベクター粒子を用いて５ＭＯＩで細胞への形質導入を行った。７２時間後、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを細胞から抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いてｃＤＮＡに変換した。ＦＡＭ標識ＫＩＦ１１ ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号４８）およびＫＩＦ１１用のプライマー（フォワードプライマー（配列番号４６）；リバースプライマー（配列番号４７））を使用して定量ＰＣＲによりＫＩＦ１１ ｃＤＮＡの発現を決定した。ＫＩＦ１１発現を各試料についてアクチンレベルに対して正規化した（アクチンフォワードプライマー（配列番号４９）；アクチンリバースプライマー＃１（配列番号５０）；およびアクチンプローブ（配列番号５２））。
【0233】
図６に示すように、対照処理ＬＶ－ＧＦＰ処理細胞と比べて、ＫＩＦ１１ ｍＲＮＡは、（ｉ）ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列＃３（配列番号３）を発現するベクターを用いて細胞への形質導入を行った場合に７７％減少し（ｓｈＫＩＦ１１を用いた形質導入後のＫＩＦ１１ ｍＲＮＡ発現を示すバーを参照）、（ｉｉ）ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列＃３（配列番号３）およびＫＩＦ１１配列（配列番号４）を発現するベクターを用いて細胞への形質導入を行った場合に１４．５倍に増加した（ｓｈＫＩＦ１１＋ＣＭＶ ＫＩＦ１１を用いた形質導入後のＫＩＦ１１ ｍＲＮＡ発現を示すバーを参照）。これは、ｓｈＲＮＡは内因性ＫＩＦ１１ ｍＲＮＡを抑制しており、導入遺伝子からのＫＩＦ１１の発現に影響していないことを示す。
（実施例４）
ヒトＫＩＦ１１（Ｅｇ５）非翻訳領域を標的化するレンチウイルス粒子送達性ｓｈＲＮＡベースＲＮＡ干渉は生存細胞の数の低減を生じさせる。
（実施例４）
ヒトＫＩＦ１１（Ｅｇ５）非翻訳領域を標的化するレンチウイルス粒子送達性ｓｈＲＮＡベースＲＮＡ干渉は生存細胞の数の低減を生じさせる。
【0234】
Ｈ１プロモーターおよびＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列＃２（配列番号２）または配列＃３（配列番号３）のいずれかを含有するレンチウイルスベクター粒子を用いてＰＣ３ヒト前立腺癌細胞への形質導入を行った。
【0235】
ＰＣ３ヒト前立腺癌細胞を２４ウェルプレートに５×１０４細胞／ウェルで播種した。２４時間後、ＫＩＦ１１ ＵＴＲ ｓｈＲＮＡ ＃２または＃３（それぞれ配列番号２または配列番号３）のいずれかを発現するレンチウイルスベクター粒子を用いて５ＭＯＩで細胞への形質導入を行った。４日後、ＭＴＴ試薬（Ｓｉｇｍａ）を用いて５７０ｎｍで細胞数を決定した。ＭＴＴ試薬はテトラゾリウム色素（３－（４，５，－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミドである。代謝的に活性の生存細胞においてＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性オキシドレダクターゼ酵素は、紫色であるホルマザンとして公知のその不溶性形態へのＭＴＴ試薬の還元を引き起こす。細胞生存能のためのＭＴＴアッセイは、ＭＴＴ試薬を細胞懸濁液に加え、次いで顕微鏡下で細胞を調べて紫色で現れる割合を数え上げることにより行った。ＭＴＴアッセイの自動化バージョンでは、細胞をプラスチックプレートの個々のウェルに分布させ、続いて比色分析により紫色の強度を測定する。
【0236】
図７に示すように、ＬＶ－ＧＦＰ形質導入細胞と比較した場合に、細胞の数は、（ｉ）ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ ＃２配列（配列番号２）を用いて形質導入を行った細胞において４６％減少し（ｓｈＫＩＦ１１－２を用いた形質導入後の細胞数％を示すバーを参照）、（ｉｉ）ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ ＃３配列（配列番号３）を用いて形質導入を行った細胞において７０％減少した（ｓｈＫＩＦ１１－３を用いた形質導入後の細胞数％を示すバーを参照）。これは、ＫＩＦ１１はがん細胞増殖を低減するための有効な標的であることを示唆する。
（実施例５）
（ｉ）ヒトＫＩＦ１１非翻訳領域を標的化するｓｈＲＮＡベースＲＮＡ干渉および（ｉｉ）ＫＩＦ１１コード配列の両方のレンチウイルス粒子送達性共発現は細胞数の高いレベルの維持を生じさせる。
（実施例５）
（ｉ）ヒトＫＩＦ１１非翻訳領域を標的化するｓｈＲＮＡベースＲＮＡ干渉および（ｉｉ）ＫＩＦ１１コード配列の両方のレンチウイルス粒子送達性共発現は細胞数の高いレベルの維持を生じさせる。
【0237】
（ｉ）ＧＦＰ（対照）、（ｉｉ）ｓｈＫＩＦ１１（ＵＴＲ）、および（ｉｉｉ）ｓｈＫＩＦ１１（ＵＴＲ）ならびにＣＭＶプロモーターにより駆動されるＫＩＦ１１をコードする配列（配列番号４）を発現するレンチウイルスベクター粒子を用いてＰＣ３ヒト前立腺癌細胞への形質導入を行った。レンチウイルスベクター粒子のそれぞれにおいて使用したｓｈＫＩＦ１１（ＵＴＲ）配列はＫＩＦ ｓｈＲＮＡ配列＃３（配列番号３）であった。ＫＩＦ１１をコードする配列（配列番号４）は、ＫＩＦ１１遺伝子の３’ＵＴＲにおいて切断を含んでいた。
【0238】
ＰＣ３ヒト前立腺癌細胞を２４ウェルプレートに５×１０４細胞／ウェルで播種した。２４時間後、単独またはＫＩＦ１１コード配列との共発現でＫＩＦ１１ ＵＴＲ ｓｈＲＮＡ ＃３（配列番号３）を発現するレンチウイルスベクター粒子の他に、ＧＦＰのみを発現するレンチウイルスベクター粒子（対照）を用いて５ＭＯＩで細胞への形質導入を行った。４日後、生細胞中に暗青色ホルマザン生成物を生じるＭＴＴ試薬（（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（ＳｉｇｍａＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）との培養により細胞数を決定した。ＭＴＴアッセイは、実施例４に記載したように実行した。
【0239】
図８に示すように、ＬＶ－ＧＦＰ形質導入細胞と比較した場合に（ＬＶ－ＧＦＰを用いた形質導入後の細胞数％を示すバーを参照）（対照ベクターを１００％に設定）、細胞の数は、ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列＃３（配列番号３）を用いて形質導入を行った細胞において４２％減少した（ＬＶ－ｓｈＫＩＦ１１（ＵＴＲ）を用いた形質導入後の細胞数％を示すバーを参照。細胞の数におけるこの低減は、ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列＃３（配列番号３）およびＫＩＦ１１コード配列を発現するベクターを用いて形質導入を行った細胞において９％のみの減少までレスキューされた（ＬＶ－ｓｈＫＩＦ１１（ＵＴＲ）－ＣＭＶ－ＫＩＦ１１を用いた形質導入後の細胞数％を示すバーを参照）。したがって、切断された３’ＵＴＲを含有する外因性ＫＩＦ１１を発現させた場合にＰＣ３の増殖はＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡにより最小に影響された。
（実施例６）
間葉系幹細胞は、２構成成分レンチウイルスベクターを使用することにより、要求される細胞周期タンパク質に対する阻害ＲＮＡを産生し、成長能力を保持するように改変され得る。
（実施例６）
間葉系幹細胞は、２構成成分レンチウイルスベクターを使用することにより、要求される細胞周期タンパク質に対する阻害ＲＮＡを産生し、成長能力を保持するように改変され得る。
【0240】
この実施例は、細胞成長のために不可欠な機能を遮断する高いレベルの阻害ＲＮＡも発現しながら培養において増殖する間葉系幹細胞生成物の、シードストックからのバルク製造を可能にする２構成成分レンチウイルスベクターの使用の実例を示す。
【0241】
キネシンファミリーメンバータンパク質ＫＩＦ１１は、紡錘体形成および有糸分裂のために要求される。ＫＩＦ１１のレベルを低減することができる阻害ＲＮＡは悪性腫瘍成長を低減することが観察されている。結果として、腫瘍微環境へのそのような阻害ＲＮＡの送達は治療的な価値を持つ。阻害ＲＮＡを送達する１つの方法は間葉系幹細胞の使用を伴う。細胞は、腫瘍細胞との細胞間接触に従事し、コネキシンタンパク質により形成された入口を介して様々な分子を送達するための特別な特性を有する。
【0242】
間葉系幹細胞の治療用量のための通常の製造は、高度に特徴付けられた細胞のシードストックを用いて開始され、該シードストックは数日の細胞成長を通じて拡大増殖されて、ｉｎ ｖｉｖｏ療法のために要求される細胞の数が達成される。明確なことに、腫瘍細胞成長を抑制することが運命付けられた高いレベルの阻害ＲＮＡを産生するようにプログラムされた遺伝子改変された間葉系幹細胞の治療用量を製造するために代替的な戦略が必要とされる。
【0243】
２構成成分レンチウイルスベクターシステムは、改変された間葉系幹細胞の製造の問題を克服する。この実施形態では、レンチウイルスベクターは、正常タンパク質コード配列を含有するが、メッセンジャーＲＮＡ中に通常見出される３’非翻訳領域を欠いた改変バージョンのＫＩＦ１１遺伝子を発現する。別々のカセットから、同じレンチウイルスベクターはまた、正常ＫＩＦ１１ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域に対して標的化されたｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡの形態の１つまたは複数の阻害ＲＮＡを発現する。このようにして改変された間葉系幹細胞は十分なレベルのＫＩＦ１１タンパク質を発現して細胞成長を維持し、そしてまたコネキシンチャネルを介して腫瘍細胞にエクスポートされ得る高いレベルの阻害ＲＮＡを産生し、腫瘍細胞において阻害ＲＮＡは悪性成長を抑制する。これは、シードストックから改変された間葉系幹細胞の大細胞用量を製造する能力を犠牲にすることなく達成される。そのため、シードストックは、臨床使用のために適格であり、複数の腫瘍種のための細胞および遺伝子療法として利用可能な、事前に特徴付けられた２構成成分レンチウイルスベクターにより改変されている。
（実施例７）
ＧＦＰを発現するレンチウイルスベクター粒子を用いた間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の形質導入はＧＦＰ発現における用量依存的な増加を生じさせる。
（実施例７）
ＧＦＰを発現するレンチウイルスベクター粒子を用いた間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の形質導入はＧＦＰ発現における用量依存的な増加を生じさせる。
【0244】
ＭＳＣを３回継代し、次いで２４ウェルプレートに２×１０４細胞／ウェルで播種した。２４時間後、４および２０の多重感染度（ＭＯＩ）（２９３Ｔの力価値に基づく）でＧＦＰを発現するレンチウイルスベクター（ＬＶ）粒子を用いて細胞への形質導入を行った。３日後、細胞をＧＦＰ蛍光についてイメージングした。図９に示すように、細胞のＧＦＰ明度における用量依存的な増加があった。中央パネル（ＬＶ－ＧＦＰ ４ＭＯＩ）に示すように、ＭＳＣの約８０％はＧＦＰについて陽性に染色された。右パネル（ＬＶ－ＧＦＰ ２０ＭＯＩ）に示すように、ＭＳＣの１００％近くはＧＦＰについて陽性に染色された。
（実施例８）
４に等しい多重感染度は１個の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）あたり１０個のベクターゲノムを達成するために十分であった。
（実施例８）
４に等しい多重感染度は１個の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）あたり１０個のベクターゲノムを達成するために十分であった。
【0245】
ＭＳＣを３回継代し、次いで６ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルで播種した。２４時間後、ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列＃３（配列番号３）単独、またはＫＩＦ１１配列（配列番号４）と共にＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列＃３（配列番号３）を発現するレンチウイルスベクター粒子を用いて細胞への形質導入を行った。ベクター粒子はまた、形質導入マーカーとしてＧＦＰを発現した。７２時間後、ＤＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。ベクター特異的Ｇａｇプライマー（Ｇａｇフォワードプライマー（配列番号５３）；Ｇａｇリバースプライマー（配列番号５４））およびＦＡＭ標識プローブ（配列番号５５））ならびに細胞対照としてアクチンプライマー（アクチンフォワードプライマー（配列番号４９）；アクチンリバースプライマー＃２（配列番号５１））およびＶＩＣ標識プローブ（配列番号５２））を使用してＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３ ｑＰＣＲ装置で２５および５０ｎｇのＤＮＡを用いてデュプレックスＰＣＲ反応を行った。Ｇａｇおよびアクチン配列を含有するレンチウイルスプラスミドを使用して標準曲線を用いて細胞試料からのベクターコピーの数を決定した。式：（Ｇａｇ配列の量平均／アクチン配列の量平均）を使用してベクターコピー数を算出した。
【0246】
ベクターコピー数を示す結果を図１０に示す。４ＭＯＩを使用したベクター粒子のそれぞれにおいて、ベクターコピー数は７～２０であった（（ｉ）ＧＦＰ ４ＭＯＩ、（ｉｉ）ｓｈＫＩＦ１１ ＧＦＰ ４ＭＯＩ、（ｉｉｉ）ｓｈＫＩＦ１１ ＣＭＶ ＫＩＦ１１
ＧＦＰ ４ＭＯＩ、（ｉｖ）ｓｈＫＩＦ１１ ４ＭＯＩ、および（ｉｖ）ｓｈＫＩＦ１１ ＣＭＶ ＫＩＦ１１ ４ＭＯＩの４ＭＯＩで形質導入されたベクターのベクターコピー数を示すバーを参照）。２０ＭＯＩを使用したベクターのそれぞれにおいて、ベクターコピー数は６０～１００であった（（ｉ）ＧＦＰ ２０ＭＯＩ、（ｉｉ）ｓｈＫＩＦ１１
ＧＦＰ ２０ＭＯＩ、（ｉｉｉ）ｓｈＫＩＦ１１ ＣＭＶ ＫＩＦ１１ ＧＦＰ ２０ＭＯＩ、（ｉｖ）ｓｈＫＩＦ１１ ２０ＭＯＩ、および（ｖ）ｓｈＫＩＦ１１ ＣＭＶ ＫＩＦ１１ ２０ＭＯＩの２０ＭＯＩで形質導入されたベクターのベクターコピー数を示すバーを参照）。
ＧＦＰ ４ＭＯＩ、（ｉｖ）ｓｈＫＩＦ１１ ４ＭＯＩ、および（ｉｖ）ｓｈＫＩＦ１１ ＣＭＶ ＫＩＦ１１ ４ＭＯＩの４ＭＯＩで形質導入されたベクターのベクターコピー数を示すバーを参照）。２０ＭＯＩを使用したベクターのそれぞれにおいて、ベクターコピー数は６０～１００であった（（ｉ）ＧＦＰ ２０ＭＯＩ、（ｉｉ）ｓｈＫＩＦ１１
ＧＦＰ ２０ＭＯＩ、（ｉｉｉ）ｓｈＫＩＦ１１ ＣＭＶ ＫＩＦ１１ ＧＦＰ ２０ＭＯＩ、（ｉｖ）ｓｈＫＩＦ１１ ２０ＭＯＩ、および（ｖ）ｓｈＫＩＦ１１ ＣＭＶ ＫＩＦ１１ ２０ＭＯＩの２０ＭＯＩで形質導入されたベクターのベクターコピー数を示すバーを参照）。
【0247】
好ましいベクターコピー数は１～１０に及び、５またはそれ未満が典型的には標的である。ベクターコピー数の理想的な標的は、ベクターの機能的な効率により影響される。例えば、標的に対するｓｈＲＮＡを発現するベクターは、５またはそれ未満のベクターコピー数を用いて標的遺伝子発現を８０％より大きく低減するはずである。しかしながら、１０より多いベクターコピー数は遺伝毒性を引き起こし得ることが公知である。そのため、データは、２０ＭＯＩの使用は高すぎることを指し示す。
（実施例９）
ＫＩＦ１１ ＵＴＲ標的化ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクター粒子は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）においてＫＩＦ１１ ｍＲＮＡレベルを低減し、ｍＲＮＡレベルは、切断されたＫＩＦ１１およびＵＴＲ標的化ｓｈＲＮＡを共発現するレンチウイルスを用いて形質導入された細胞において回復される。
（実施例９）
ＫＩＦ１１ ＵＴＲ標的化ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクター粒子は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）においてＫＩＦ１１ ｍＲＮＡレベルを低減し、ｍＲＮＡレベルは、切断されたＫＩＦ１１およびＵＴＲ標的化ｓｈＲＮＡを共発現するレンチウイルスを用いて形質導入された細胞において回復される。
【0248】
ＭＳＣを３回継代し、次いで６ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルで播種した。２４時間後、ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列＃３（配列番号３）単独、またはＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列＃３（配列番号３）およびＫＩＦ１１コード配列（配列番号４）のいずれかを発現するレンチウイルスベクター粒子を用いて細胞への形質導入を行った。ある特定のレンチウイルスベクター粒子はまた、形質導入マーカーとしてＧＦＰを発現した。７２時間後、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを細胞から抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いてｃＤＮＡに変換した。ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号４８）およびＫＩＦ１１用（ＫＩＦ１１フォワードプライマー（配列番号４６）；ＫＩＦ１１リバースプライマー（配列番号４７））およびアクチン用（アクチンフォワードプライマー（配列番号４９；アクチンリバースプライマー＃１（配列番号５０））のプライマー、およびＶＩＣ標識プローブ（配列番号５２）を使用して定量ＰＣＲによりＫＩＦ１１ ｃＤＮＡの発現を決定した。ＫＩＦ１１発現を各試料についてアクチンレベルに対して正規化した。
【0249】
図１１Ａは、非形質導入細胞（ＬＶ無し）のパーセンテージとしてのＫＩＦ１１ ＲＮＡ発現を表す。非形質導入ＭＳＣと比較した場合に、ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列＃３（配列番号３）およびＧＦＰを含有するベクターは、４ＭＯＩ（ｓｈＫＩＦ１１ ＧＦＰ ４ＭＯＩを用いた形質導入後のＫＩＦ１１ ｍＲＮＡのデータを示すバーを参照）および２０ＭＯＩ（ｓｈＫＩＦ１１ ＧＦＰ ２０ＭＯＩを用いた形質導入後のＫＩＦ１１ ｍＲＮＡのデータを示すバーを参照）でそれぞれＫＩＦ１１ ＲＮＡにおける７９パーセントの減少およびＫＩＦ１１ ＲＮＡにおいて９２．５％の減少を生じさせた。非形質導入ＭＳＣと比較した場合に、ＧＦＰなしでＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列＃３（配列番号３）を含有するベクターは、４ＭＯＩ（ｓｈＫＩＦ１１ ４ＭＯＩを用いた形質導入後のＫＩＦ１１ ｍＲＮＡのデータを示すバーを参照）および２０ＭＯＩ（ｓｈＫＩＦ１１ ２０ＭＯＩを用いた形質導入後のＫＩＦ１１ ｍＲＮＡのデータを示すバーを参照）でそれぞれＫＩＦ１１ ＲＮＡにおける５９パーセントの減少およびＫＩＦ１１ ＲＮＡにおける８５パーセントの減少を生じさせた。そのため、ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡを発現する両方のベクターにおいて、ＭＯＩの増加は、ベクターがＧＦＰを発現するかどうかにかかわらず、ＫＩＦ１１ ｍＲＮＡ発現におけるより大きい減少を生じさせた。
【0250】
注記として、ＧＦＰのみを含有するベクターを用いた形質導入はＫＩＦ１１ ｍＲＮＡの低減を生じさせた。例えば、非形質導入ＭＳＣと比較した場合に、ベクターを２０ＭＯＩで形質導入した場合に、ＧＦＰのみを発現するベクターはＫＩＦ１１ ｍＲＮＡにおける５９パーセントの減少を生じさせた（ＧＦＰ ２０ＭＯＩを用いた形質導入後のＫＩＦ１１ ｍＲＮＡのデータを示すバーを参照）。ＫＩＦ１１ ｍＲＮＡにおけるそのような減少が観察された理由は明確でない。しかしながら、ベクターコピー数データ（図１０を参照）から明らかにされるように、２０ＭＯＩは高いベクターコピー数を生じさせる。この高いベクターコピー数が毒性を引き起こしている可能性があり、したがって、ＫＩＦ１１ ｍＲＮＡに対するそのｓｈＲＮＡ非依存性効果を説明する可能性がある。
【0251】
図１１Ｂは、非形質導入細胞（ＬＶ無し）と比べた倍数変化としてのＫＩＦ１１ ｍＲＮＡ発現を表す。ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列＃３（配列番号３）、ＫＩＦ１１コード配列（配列番号４）、およびＧＦＰを発現するベクターにおいて、ＫＩＦ１１ ｍＲＮＡおよびＫＩＦ１１コード配列において９．８倍の増加があった（ｓｈＫＩＦ１１ ＣＭＶ ＫＩＦ１１ ＧＦＰ ４ＭＯＩを用いた形質導入後のＫＩＦ１１ ｍＲＮＡを示すバーを参照）。ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列＃３（配列番号３）、ＫＩＦ１１コード配列（配列番号４）、および無ＧＦＰを発現するベクターにおいて、ＫＩＦ１１ ｍＲＮＡおよびＫＩＦ１１コード配列における１２１倍の増加があった（ｓｈＫＩＦ１１ ＣＭＶ ＫＩＦ１１ ４ＭＯＩを用いた形質導入後のＫＩＦ１１ ｍＲＮＡを示すバーを参照）。これは、ベクターの複雑性の増加（すなわち、ＧＦＰの追加）はベクター発現ＫＩＦ１１における低減を引き起こすことを指し示す。
【0252】
（実施例１０）
ＫＩＦ１１ ＵＴＲ標的化ｓｈＲＮＡは単一細胞継代の間の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の増殖に対して効果を有しない。
ＫＩＦ１１ ＵＴＲ標的化ｓｈＲＮＡは単一細胞継代の間の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の増殖に対して効果を有しない。
【0253】
ＭＳＣを３回継代し、次いで２４ウェルプレートに２×１０４細胞／ウェルで播種した。２４時間後、ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列＃３（配列番号３）単独、またはＫＩＦ１１
ｓｈＲＮＡ配列＃３（配列番号３）およびＫＩＦ１１コード配列（配列番号４）のいずれかを発現するレンチウイルスベクター粒子を用いて細胞への形質導入を行った。６日後、ＭＴＴ試薬（Ｓｉｇｍａ）との２時間のインキュベーションおよびプレートリーダーを用いた５７０ｎｍでの検出後に細胞数を決定した。
ｓｈＲＮＡ配列＃３（配列番号３）およびＫＩＦ１１コード配列（配列番号４）のいずれかを発現するレンチウイルスベクター粒子を用いて細胞への形質導入を行った。６日後、ＭＴＴ試薬（Ｓｉｇｍａ）との２時間のインキュベーションおよびプレートリーダーを用いた５７０ｎｍでの検出後に細胞数を決定した。
【0254】
図１２に示すように、ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列を単独で発現するレンチウイルスベクター粒子（ｓｈＫＩＦ１１ ４ＭＯＩおよびｓｈＫＩＦ１１ ２０ＭＯＩを用いた形質導入後の細胞数を示すバーを参照）またはＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列およびＫＩＦ１１コード配列を発現するレンチウイルスベクター粒子（ｓｈＫＩＦ１１ ＣＭＶ ＫＩＦ１１ ４ＭＯＩおよびｓｈＫＩＦ１１ ＣＭＶ ＫＩＦ１１ ２０ＭＯＩを用いた形質導入後の細胞数を示すバーを参照）のいずれかを用いた形質導入は、対照処理（ＧＦＰ ４ＭＯＩおよびＧＦＰ ２０ＭＯＩのいずれかを用いた形質導入後の細胞数を示すバーを参照）と比較した場合にＭＳＣにおける最小の変化を生じさせた。このデータは、間葉系幹細胞の生存を維持するためにベクターはＫＩＦ１１コード配列を共発現する必要はないことを示唆し得る。あるいは、ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡの発現は、ＭＳＣを大きい商業的規模の細胞体積まで拡大増殖しようとする場合に間葉系幹細胞の生存に対して負の影響を有し得る。そのため、大規模の拡大増殖は、ＭＳＣの細胞収率を維持するＫＩＦ１１の外因性共発現の利益を明らかにし得る。
【0255】
（実施例１１）
材料および方法
材料および方法
【0256】
本明細書においてデータを生成するために使用された（ｉ）レンチウイルスベクター発現ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡを生成し、（ｉｉ）ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列を生成し、（ｉｉｉ）ＫＩＦ１１ ＲＮＡ発現を測定し、（ｉｖ）ベクターコピー数を測定し、（ｖ）細胞増殖を測定する詳細な方法を以下に記載する。
【0257】
ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクター粒子の生成
【0258】
Ｂｒｏａｄ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのｓｈＲＮＡ設計プログラムまたはＴｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＢＬＯＣＫ－ｉＴＴＭ ＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒを用いて選択された候補から潜在的なＲＮＡ干渉配列を選択した。ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含有するショートヘアピンオリゴヌクレオチド配列をＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓにより合成した。７０℃でインキュベートし、次いで室温に１時間冷却することによりオリゴヌクレオチド配列をアニーリングさせた。並行して、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いて３７℃で１時間レンチウイルスベクターを消化した。消化したレンチウイルスベクターをアガロースゲル電気泳動により精製し、ＤＮＡゲル抽出キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してゲルから抽出した。ＤＮＡ濃度をそれぞれについて決定し、５０ｎｇのベクターを２マイクロリットルのアニーリングしたオリゴに加えた。ライゲーション反応は、室温で３０分間、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて行った。２．５マイクロリットルのライゲーション混合物を２５マイクロリットルのＳｔｂｌ３コンピテント細菌細胞に加えた。形質転換を４２℃での熱ショックステップと共に行った。アンピシリンを含有する寒天プレート上に細菌細胞を塗り付け、選択されたコロニーをＬＢブロス中で拡大増殖させた。オリゴ配列の挿入を確認するために、ＤＮＡミニプレップキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、回収した細菌培養物からプラスミドＤＮＡを抽出した。レンチウイルスベクター中へのｓｈＲＮＡ配列の挿入は、Ｈ１プライマーを使用してＤＮＡシークエンシングにより検証した。ｓｈＲＮＡ配列を含有するレンチウイルスベクターをレンチウイルス粒子にパッケージングして、ＫＩＦ１１
ＲＮＡをノックダウンするそれらの能力について試験した。
ＲＮＡをノックダウンするそれらの能力について試験した。
【0259】
ＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列の生成
【0260】
Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓキネシンファミリーメンバー１１（ＫＩＦ１１）（Ｅｇ５）（ＮＭ＿００４５２３．４）ｍＲＮＡの配列を使用して、ヒト細胞におけるＫＩＦ１１レベルを低減するための潜在的なｓｈＲＮＡ候補を検索した。検索により３つのＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ候補（配列番号１、配列番号２、および配列番号３）が同定された。
【0261】
ＫＩＦ１１ ＲＮＡ発現の測定
【0262】
レンチウイルスベクターを用いた形質導入後のｍＲＮＡ発現を測定することによりＫＩＦ１１発現に対する３つの異なるＫＩＦ１１ ｓｈＲＮＡ配列の効果を決定した。５のＭＯＩ（２９３Ｔ力価に基づく）のレンチウイルスベクターおよび８μｇ／ｍＬのポリブレン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を細胞に加え、終夜インキュベートすることによりＰＣ３細胞への形質導入を行った。２４時間後、培地を交換し、細胞をさらに７２時間培養した。７２時間後、細胞を溶解し、ＲＮｅａｓｙミニキットを使用してＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ合成キットを使用して１００ｎｇのＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用してＰＣＲ反応を行い、次いでＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３ ｑＰＣＲ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により試料を分析した。ＫＩＦ１１プライマー／プローブ（ＫＩＦ１１フォワードプライマー（配列番号４６）；ＫＩＦ１１リバースプライマー（配列番号４７）；ＫＩＦ１１プローブ（配列番号４８））を使用してＫＩＦ１１発現を検出し、アクチン（アクチンフォワードプライマー（配列番号４９；アクチンリバースプライマー＃１（配列番号５０）；アクチンプローブ（配列番号５２）に対して正規化した。ＫＩＦ１１の相対発現をそのＣｔ値により決定し、各試料についてアクチンのレベルに対して正規化した。
ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３ ｑＰＣＲ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により試料を分析した。ＫＩＦ１１プライマー／プローブ（ＫＩＦ１１フォワードプライマー（配列番号４６）；ＫＩＦ１１リバースプライマー（配列番号４７）；ＫＩＦ１１プローブ（配列番号４８））を使用してＫＩＦ１１発現を検出し、アクチン（アクチンフォワードプライマー（配列番号４９；アクチンリバースプライマー＃１（配列番号５０）；アクチンプローブ（配列番号５２）に対して正規化した。ＫＩＦ１１の相対発現をそのＣｔ値により決定し、各試料についてアクチンのレベルに対して正規化した。
【0263】
ベクターコピー数の測定
【0264】
レンチウイルスベクターおよび８μｇ／ｍＬのポリブレン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を細胞に加え、終夜インキュベートすることによりＭＳＣへの形質導入を行った。２４時間後、培地を交換し、細胞をさらに４８～７２時間培養した。次いで細胞をＰＢＳで２回洗浄し、細胞ペレットを収集し、ＤＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの５０ｎｇ／ｍＬの溶液を調製した。形質導入細胞からのゲノムＤＮＡ上のレンチウイルスベクター、Ｇａｇ（Ｇａｇフォワードプライマー（配列番号５３）；Ｇａｇリバースプライマー（配列番号５４）；Ｇａｇプローブ（配列番号５５）、および細胞ベータアクチン遺伝子（アクチンフォワードプライマー（配列番号４９）；アクチン（Ａｃｔｉｎｇ）リバースプライマー＃２（配列番号５１）；アクチン（Ａｃｔｉｎｇ）プローブ（配列番号５２））によりコードされる配列用のプライマーおよびプローブセットを、ｇａｇおよびベータアクチンをコードするプラスミドを使用して作製された標準曲線試料と共に用いてｑＰＣＲを行うことによりベクターコピー数を決定した。ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用してＰＣＲ反応を行い、次いでＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３ ｑＰＣＲ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｑＰＣＲにより試料を分析した。組み込まれたレンチウイルスのコピー数を、ｑＰＣＲにより決定されたＣｔ値に基づいて算出した。以下の式を使用してベクターコピー数を測定した：ベクターコピー数＝（Ｇａｇ配列の量平均／アクチン配列の量平均）。
【0265】
細胞増殖の測定
ＰＣ３およびＭＳＣ細胞を２４ウェルプレートに播種した。指定された培養時間後、培地を除去し、０．５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴを含有する０．５ｍＬのＤＭＥＭを細胞に加えた。プレートを３７℃のインキュベーターにＰＣ３細胞について３０分間、ＭＳＣについて２時間戻した。培地を除去し、０．５ｍＬのイソプロパノールをウェルに加えた。プレートを低速度で５分間ロッカーに置き、Ｂｉｏ－Ｔｅｋプレートリーダーを用いて５７０ｎｍの吸光度で色を検出した。
ＰＣ３およびＭＳＣ細胞を２４ウェルプレートに播種した。指定された培養時間後、培地を除去し、０．５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴを含有する０．５ｍＬのＤＭＥＭを細胞に加えた。プレートを３７℃のインキュベーターにＰＣ３細胞について３０分間、ＭＳＣについて２時間戻した。培地を除去し、０．５ｍＬのイソプロパノールをウェルに加えた。プレートを低速度で５分間ロッカーに置き、Ｂｉｏ－Ｔｅｋプレートリーダーを用いて５７０ｎｍの吸光度で色を検出した。
【0266】
（実施例１２）
ＭＳＣの単離、精製、拡大増殖、および特徴付け
ＭＳＣの単離、精製、拡大増殖、および特徴付け
【0267】
単離、精製および拡大増殖：ＭＳＣを単離および拡大増殖するための多数の方法が当該技術分野において公知である。実施形態では、ＭＳＣは胎盤から単離され、胎盤を満期新生児のための選択的帝王切開による出産後に回収する。胎盤をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、母系脱落膜を除去する。約１ｃｍ３または４グラムの湿潤重量の組織部分を胎児境界部の絨毛から解剖する。組織部分を再びＰＢＳ中で洗浄し、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＡ溶液を用いて３７℃で６０分間処理する。消化した材料を遠心分離により収集し、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液に３７℃で１０分間再懸濁する。トリプシン処理した材料を再び遠心分離により収集し、１回洗浄し、１％のペニシリン－ストレプトマイシン溶液＋５ｍＭのＬ－グルタミンを含むＢｉｏ－ＡＭＦ－１培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）に再懸濁する。細胞をＴ－２５培養フラスコに移し、加湿雰囲気中３７℃で５％のＣＯ２と共にインキュベートする。ＭＳＣがＴ－２５フラスコ中でコンフルエンスに達した時に、それらをトリプシン／ＥＤＴＡで処理してプラスチックに結合した細胞を解放させ、培地で希釈し、新たなＴ－２５フラスコ中に再プレーティングする。
【0268】
臨床使用のための遺伝子改変されたＭＳＣの大規模製造のために、１０００万～５０００万の形質導入されたＭＳＣを含有するシードストックを連続継代を通じて拡大し、懸濁培養に適合させる。最終の細胞培養体積は１００～２００Ｌに達し得、細胞収率は５×１０９／リットルに接近し得る。細胞を遠心分離および／または濾過により回収し、洗浄し、ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために培地に再懸濁する。ＭＳＣの大規模拡大増殖は、ＧＭＰ条件下で２００Ｌまでの懸濁培養物中で行うことができる。
【0269】
当該技術分野において公知のＭＳＣを単離および拡大増殖する他の方法を使用することができる。ＭＳＣを単離および拡大増殖するための詳細なプロトコールは以下の参考文献に記載されており、これらは参照により全体が本明細書に援用される：（ｉ）Ｈｕａｎｇ
Ｑ， Ｙａｎｇ Ｙ， Ｌｕｏ Ｃ， Ｗｅｎ Ｙ， Ｌｉｕ Ｒ， Ｌｉ Ｓ， Ｃｈｅｎ Ｔ， Ｓｕｎ Ｈ， ａｎｄ Ｔａｎｇ Ｌ． ２０１９． Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｐｌａｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：３０１、（ｉｉ）Ｈａｓｓａｎ Ｇ， Ｋａｓｅｍ Ｉ， Ａｎｔａｋｉ， Ｒ， Ｍｏｈａｍｍａｄ ＭＢ， ＡｌＫａｄｒｙ Ｒ， ａｎｄ Ａｌｊａｍａｌｉ Ｍ． ２０１９． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｂｌｏｏｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ ｗｉｔｈ ｅｘｐｌａｎｔ ｍｅｔｈｏｄ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ６：２９。
Ｑ， Ｙａｎｇ Ｙ， Ｌｕｏ Ｃ， Ｗｅｎ Ｙ， Ｌｉｕ Ｒ， Ｌｉ Ｓ， Ｃｈｅｎ Ｔ， Ｓｕｎ Ｈ， ａｎｄ Ｔａｎｇ Ｌ． ２０１９． Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｐｌａｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：３０１、（ｉｉ）Ｈａｓｓａｎ Ｇ， Ｋａｓｅｍ Ｉ， Ａｎｔａｋｉ， Ｒ， Ｍｏｈａｍｍａｄ ＭＢ， ＡｌＫａｄｒｙ Ｒ， ａｎｄ Ａｌｊａｍａｌｉ Ｍ． ２０１９． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｂｌｏｏｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ ｗｉｔｈ ｅｘｐｌａｎｔ ｍｅｔｈｏｄ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ６：２９。
【0270】
特徴付け：ＭＳＣ表現型は起源の組織にしたがって変動する。絨毛ＭＳＣについて、細胞素性の主要な表現型マーカーとしては、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、アルファ－ＳＭＡ、およびＳｔｒｏ－１が挙げられる。これらの細胞表面マーカーを検出するための抗体染色およびフローサイトメトリーはＭＳＣの存在を裏付け、絨毛ＭＳＣに最も類似した細胞の画分をさらに指し示す。遺伝子発現の特定のパターンもまたＭＳＣについて同定されている。絨毛ＭＳＣはＳＯＸ－２を発現するがＮＡＮＯＧもＰＯＵ５Ｆ１も発現しない。これらの遺伝子の３つ全ての発現は、胚性幹細胞多能性の共通のマーカーであり、ＳＯＸ－２に限定された発現はＭＳＣの部分的に多能性の表現型と合致する。
【0271】
（実施例１３）
ＭＳＣのレンチウイルス粒子遺伝子改変
ＭＳＣのレンチウイルス粒子遺伝子改変
【0272】
レンチウイルスベクターはＭＳＣの安定な遺伝子改変のための好ましい方法であり、骨髄由来および他の種類のＭＳＣの短期および長期培養において評価されている。マーカータンパク質（緑色または赤色蛍光タンパク質）およびピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ（ピューロマイシンへの抵抗性を付与する）の両方を発現するレンチウイルスベクターの作製は、表現型変化、細胞モビリティの変更、または長期培養における細胞増幅の能力についての多数の試験後に非改変ＭＳＣと同一であるらしい遺伝子改変されたＭＳＣの薬物選択を可能とする。
【0273】
レンチウイルスベクター粒子形質導入は、３つのステップにおいて行うことができる：
【0274】
ステップ１：コンフルエントなＭＳＣをトリプシン処理し、１：３で希釈し、２日間再プレーティングする。
【0275】
ステップ２：ＰＢＳ＋８ｕｇ／ｍＬのポリブレン中のレンチウイルスベクターストックをＭＳＣ細胞単層上に４時間重層し、次いで細胞を培地ですすぐことにより除去する。
【0276】
ステップ３：トリプシン溶液を用いてＭＳＣをプレートから剥がし、形質導入の効率を測定するＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質抽出のために使用する。
【0277】
ほとんどのレンチウイルスベクターについて、５に等しい多重感染度を有する形質導入は、＞８０％のＭＳＣが遺伝子改変されることを生じさせる。改変は安定であり、導入遺伝子発現は多くの世代にわたり持続する。
【0278】
配列
【0279】
以下の配列を本明細書において参照する。
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【表1-7】
【表1-8】
【表1-9】
【表1-10】
【表1-11】
【表1-12】
【表1-13】
【表1-14】
【表1-15】
【表1-16】
【表1-17】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【外国語明細書】