特開 2024-46854 多糖、多糖の生産方法、細菌およびその利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024046854

(43)【公開日】2024-04-05

(54)【発明の名称】多糖、多糖の生産方法、細菌およびその利用

(51)【国際特許分類】

   C08B 37/00 20060101AFI20240329BHJP

   C12P 1/04 20060101ALI20240329BHJP

   C12P 19/04 20060101ALI20240329BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20240329BHJP

   A61K 31/716 20060101ALI20240329BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20240329BHJP

【ＦＩ】

C08B37/00 P

C12P1/04 A

C12P19/04 C

C12N1/20 E

C12N1/20 A

A61K31/716

A61P31/04

【審査請求】未請求

【請求項の数】13

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022152182

(22)【出願日】2022-09-26

(71)【出願人】

【識別番号】598096991

【氏名又は名称】学校法人東京農業大学

(74)【代理人】

【識別番号】100179578

【弁理士】

【氏名又は名称】野村 和弘

(74)【代理人】

【識別番号】100195062

【弁理士】

【氏名又は名称】野村 涼子

(72)【発明者】

【氏名】浦井 誠

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C086

4C090

【Ｆターム（参考）】

4B064AF11

4B064AF21

4B064CA02

4B064CC04

4B064DA02

4B065AA01X

4B065AA15X

4B065AC14

4B065BC31

4B065BC50

4B065CA22

4B065CA44

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA22

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB35

4C090AA01

4C090AA04

4C090AA09

4C090BA45

4C090BB02

4C090BB18

4C090BB33

4C090BB35

4C090BB36

4C090BB53

4C090BC24

4C090BD03

4C090BD35

4C090BD37

4C090CA42

4C090DA09

(57)【要約】

【課題】水に対する溶解性に優れる多糖を提供する。
【解決手段】多糖は、Ｎ－アセチルグルコサミンがβ－１，３グリコシド結合およびβ－１，４グリコシド結合によって連結した構造を有する。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

多糖であって、
Ｎ－アセチルグルコサミンがβ－１，３グリコシド結合およびβ－１，４グリコシド結合によって連結した構造を有する、多糖。

【請求項2】

請求項１に記載の多糖において、
β－１，３グリコシド結合とβ－１，４グリコシド結合とを交互に備える、
多糖。

【請求項3】

請求項１または請求項２に記載の多糖を含む組成物。

【請求項4】

請求項１または請求項２に記載の多糖を含む抗菌剤。

【請求項5】

請求項４に記載の抗菌剤において、
黄色ブドウ球菌と肺炎桿菌との少なくとも一方の増殖を抑制するための抗菌剤。

【請求項6】

多糖の生産方法であって、
パエニバシラス属細菌とバシラス属細菌とを共培養することにより、前記パエニバシラス属細菌に多糖を分泌させる工程を含む、
多糖の生産方法。

【請求項7】

請求項６に記載の多糖の生産方法において、
前記工程において、寒天培地にて前記パエニバシラス属細菌と前記バシラス属細菌とを共培養する、
多糖の生産方法。

【請求項8】

多糖の生産方法であって、
バシラス属細菌の分泌物の存在下において、パエニバシラス属細菌を培養することにより、前記パエニバシラス属細菌に多糖を分泌させる工程を含む、
多糖の生産方法。

【請求項9】

請求項８に記載の多糖の生産方法において、
前記工程において、寒天培地にて前記パエニバシラス属細菌を培養する、
多糖の生産方法。

【請求項10】

パエニバシラス属細菌であって、
バシラス属細菌と共培養することにより多糖を分泌する、
パエニバシラス属細菌。

【請求項11】

請求項１０に記載のパエニバシラス属細菌において、
受領番号がＮＩＴＥ ＡＰ－０３７５４である、
パエニバシラス属細菌。

【請求項12】

バシラス属細菌であって、
パエニバシラス属細菌に多糖を分泌させるための分泌物を分泌する、
バシラス属細菌。

【請求項13】

請求項１２に記載のバシラス属細菌において、
受領番号がＮＩＴＥ ＡＰ－０３７５５である、
バシラス属細菌。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、多糖、多糖の生産方法、細菌およびその利用に関する。

【背景技術】

【0002】

従来から、機能性物質として、キチンやキトサンが知られている。例えば、特許文献１には、キチンを含む抗菌剤が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２０１９－０９９５７３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかしながら、キチンやキトサンは、水に対する溶解性において改善の余地があった。このため、水に対する溶解性に優れる多糖の開発が求められていた。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明は、以下の形態として実現することが可能である。

【0006】

（１）本発明の一形態によれば、多糖が提供される。この多糖は、Ｎ－アセチルグルコサミンがβ－１，３グリコシド結合およびβ－１，４グリコシド結合によって連結した構造を有する。この形態の多糖によれば、水に対する溶解性に優れる。

【0007】

（２）上記（１）に記載の多糖において、β－１，３グリコシド結合とβ－１，４グリコシド結合とを交互に備えていてもよい。この形態の多糖によれば、水に対する溶解性に優れる。

【0008】

（３）本開示の他の形態によれば、上記（１）または上記（２）に記載の多糖を含む組成物が提供される。この形態の組成物によれば、水に対する溶解性に優れる。

【0009】

（４）本開示の他の形態によれば、上記（１）または上記（２）に記載の多糖を含む抗菌剤が提供される。この形態の抗菌剤によれば、水に対する溶解性に優れる。

【0010】

（５）上記（４）に記載の抗菌剤は、黄色ブドウ球菌と肺炎桿菌との少なくとも一方の増殖を抑制するための抗菌剤であってもよい。この形態の抗菌剤によれば、黄色ブドウ球菌や肺炎桿菌の増殖を抑制できる。

【0011】

（６）本開示の他の形態によれば、多糖の生産方法が提供される。この多糖の生産方法は、パエニバシラス属細菌とバシラス属細菌とを共培養することにより、前記パエニバシラス属細菌に多糖を分泌させる工程を含む。この形態の多糖の生産方法によれば、共培養によってパエニバシラス属細菌に多糖を分泌させるので、生物資源由来の多糖を生産できる。

【0012】

（７）上記（６）に記載の多糖の生産方法において、前記工程において、寒天培地にて前記パエニバシラス属細菌と前記バシラス属細菌とを共培養してもよい。この形態の多糖の生産方法によれば、寒天培地にて共培養を行うので、多糖の分泌量を増大させることができる。

【0013】

（８）本開示の他の形態によれば、多糖の生産方法が提供される。この多糖の生産方法は、バシラス属細菌の分泌物の存在下において、パエニバシラス属細菌を培養することにより、前記パエニバシラス属細菌に多糖を分泌させる工程を含む。この形態の多糖の生産方法によれば、バシラス属細菌の分泌物の存在下においてパエニバシラス属細菌に多糖を分泌させるので、生物資源由来の多糖を生産できる。

【0014】

（９）上記（８）に記載の多糖の生産方法において、前記工程において、寒天培地にて前記パエニバシラス属細菌を培養してもよい。この形態の多糖の生産方法によれば、寒天培地にて培養を行うので、多糖の分泌量を増大させることができる。

【0015】

（１０）本開示の他の形態によれば、パエニバシラス属細菌が提供される。このパエニバシラス属細菌は、バシラス属細菌と共培養することにより多糖を分泌する。この形態のパエニバシラス属細菌によれば、バシラス属細菌と共培養することにより多糖を分泌するので、生物資源由来の多糖の生産に利用できる。

【0016】

（１１）上記（１０）に記載のパエニバシラス属細菌において、受領番号がＮＩＴＥ ＡＰ－０３７５４であってもよい。この形態のパエニバシラス属細菌によれば、生物資源由来の多糖の生産に利用できる。

【0017】

（１２）本開示の他の形態によれば、バシラス属細菌が提供される。このバシラス属細菌は、パエニバシラス属細菌に多糖を分泌させるための分泌物を分泌する。この形態のバシラス属細菌によれば、パエニバシラス属細菌に多糖を分泌させるための分泌物を分泌するので、パエニバシラス属細菌に多糖を分泌させることができる。

【0018】

（１３）上記（１２）に記載のバシラス属細菌において、受領番号がＮＩＴＥ ＡＰ－０３７５５であってもよい。この形態のバシラス属細菌によれば、パエニバシラス属細菌に多糖を分泌させることができる。

【0019】

なお、本発明は、種々の形態で実現することが可能である。例えば、多糖を含む組成物の生産方法、多糖を含む抗菌剤の生産方法、多糖の生産キット、パエニバシラス属細菌とバシラス属細菌とを含む細菌群、多糖の生産方法によって得られた多糖、多糖の抗菌剤としての利用、パエニバシラス属細菌の多糖生産のための利用、バシラス属細菌の多糖生産のための利用等の形態で実現することができる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】多糖の生産方法の一例を示す工程図。

【図2】多糖の生産方法を説明するための説明図。

【図3】多糖の生産方法の他の例を示す工程図。

【図4】実験１の結果を示す説明図。

【図5】実験２の結果を示す説明図。

【図6】実験３の結果を示す説明図。

【図7】実験４の結果を示す説明図。

【図8】実験６の黄色ブドウ球菌の結果を示す説明図。

【図9】実験６のクレブシエラ肺炎桿菌の結果を示す説明図。

【図10】単糖組成分析の結果を示す説明図。

【図11】 ^１Ｈ ＮＭＲ分析の結果を示す説明図。

【図12】 ^１３Ｃ ＮＭＲ分析の結果を示す説明図。

【発明を実施するための形態】

【0021】

本開示の一実施形態によれば、多糖が提供される。この多糖は、Ｎ－アセチルグルコサミンがβ－１，３グリコシド結合およびβ－１，４グリコシド結合によって連結した構造を有する。この多糖は、下記式（１）に示されるように、β－１，３グリコシド結合とβ－１，４グリコシド結合とを交互に備えることが好ましい。

【0022】

【化1】

【0023】

式中、ｎは２４０以上の整数であり、ＮＡｃはＮ－アセチル基を示している。式中のｎは、抗菌性を高める観点から、４８０以上であることが好ましく、１，２００以上であることがより好ましい。式中のｎは、水に対する溶解性を高める観点から、４，８００以下であることが好ましく、３，６００以下であることがより好ましく、２，４００以下であることがさらに好ましい。

【0024】

本開示の多糖の平均分子量は、抗菌性を高める観点から、１０万以上であることが好ましく、２０万以上であることがより好ましく、５０万以上であることがさらに好ましい。本開示の多糖の平均分子量は、水に対する溶解性を高める観点から、２００万以下であることが好ましく、１５０万以下であることがより好ましく、１００万以下であることがさらに好ましい。

【0025】

本開示における多糖は、β－１，６グリコシド結合を実質的に含まないことが好ましい。本明細書において、「β－１，６グリコシド結合を実質的に含まない」とは、多糖を^１３Ｃ ＮＭＲにて分析した場合に、６位炭素が６０ｐｐｍ付近に検出されることを意味する。

【0026】

一般に、Ｎ－アセチルグルコサミンがβ－１，４グリコシド結合によって直鎖状に連結した構造を有するキチンは、水を始めとする多くの溶媒に対して溶解性が低い。これに対し、本開示の多糖は、水に対する溶解性が比較的高いという特徴を有する。このため、本開示の多糖は、汎用性に優れる。

【0027】

本開示の他の形態によれば、Ｎ－アセチルグルコサミンがβ－１，３グリコシド結合およびβ－１，４グリコシド結合によって連結した構造を有する多糖を含む組成物が提供される。この組成物の用途は、特に限定されないが、例えば、抗菌剤、抗真菌剤、保湿剤、創傷治癒剤、柔軟剤、皮膚外用剤、整髪剤、化粧品、機能性食品、医薬品、医療材料、繊維、固定化担体等が挙げられる。この組成物の形態は、特に限定されないが、例えば、液状、ジェル状、ペースト状、粉末状、顆粒状、繊維状等であってもよい。上記組成物には、多糖以外の任意の成分が含まれていてもよい。任意の成分としては、特に限定されないが、例えば、緩衝剤、溶媒、安定剤、増粘剤、防腐剤、酸化防止剤、乳化剤、界面活性剤、芳香剤、着色剤等が挙げられる。任意の成分は、用途や形態に応じて適宜選択されるものであり、１種を用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0028】

本開示の他の形態によれば、Ｎ－アセチルグルコサミンがβ－１，３グリコシド結合およびβ－１，４グリコシド結合によって連結した構造を有する多糖を含む抗菌剤が提供される。多糖が有する抗菌性としては、特に限定されないが、例えば、病原性細菌のバイオフィルムの形成を阻害するような静菌性が挙げられる。病原性細菌としては、特に限定されないが、例えば、黄色ブドウ球菌や肺炎桿菌、表皮ブドウ球菌、ウェルシュ菌、セレウス菌、連鎖球菌、腸球菌、ナイセリア菌、モラクセラ菌、腸炎ビブリオ、ピロリ菌、レジオネラ菌、サルモネラ菌、緑膿菌、結核菌、非結核性抗酸菌、カンジダ、クリプトコッカス、大腸菌、白癬菌、軟腐病菌、潰瘍病菌、黒腐病菌、根頭癌腫病菌等が挙げられる。本開示の抗菌剤は、黄色ブドウ球菌と肺炎桿菌との少なくとも一方の増殖を抑制するための抗菌剤であってもよい。抗菌剤における多糖の濃度は、抗菌性を高める観点から、１０μｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、２０μｇ／ｍＬ以上であることがより好ましく、５０μｇ／ｍＬ以上であることがさらに好ましく、１００μｇ／ｍＬ以上であることが特に好ましい。抗菌剤における多糖の濃度は、多糖の凝集を抑制する観点から、２０００μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく１５００μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、１０００μｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましく、５００μｇ／ｍＬ以下であることが特に好ましい。本開示の抗菌剤によれば、上記構造を有する多糖を含むので、従来報告されているような抗菌剤とは異なる抗菌性を有する。このため、耐性菌の出現や菌叢の破壊等への対応可能性を高めることができる。

【0029】

本開示の他の形態によれば、多糖の生産方法が提供される。図１は、多糖の生産方法の一例を示す工程図である。この生産方法は、パエニバシラス属細菌とバシラス属細菌とを共培養することにより、パエニバシラス属細菌に多糖を分泌させる工程（Ｐ１０）を含む。

【0030】

パエニバシラス属細菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.）としては、バシラス属細菌と共培養することにより多糖を分泌する細菌である限り、特に限定されないが、例えば、ヒトの表皮において生存可能な細菌であってもよい。パエニバシラス属細菌としては、特に限定されないが、例えば、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ－０３７５４で示される細菌や、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａや、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ等が挙げられる。なお、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３７５４にかかる寄託の受領機関は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許微生物寄託センターであり、受領日は２０２２年９月２０日である。

【0031】

バシラス属細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.）としては、パエニバシラス属細菌に多糖を分泌させるための分泌物を分泌する細菌である限り、特に限定されないが、例えば、ヒトの表皮において生存可能な細菌であってもよい。バシラス属細菌としては、特に限定されないが、例えば、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ－０３７５５で示される細菌や、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｎａｔｔｏ等のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ等が挙げられる。なお、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０３７５５にかかる寄託の受領機関は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許微生物寄託センターであり、受領日は２０２２年９月２０日である。

【0032】

本開示において、「共培養」とは、２種以上の細菌を一緒に培養することを意味する。培養の態様としては、特に限定されないが、例えば、液体培地や固体培地を用いた培養が挙げられる。培養の態様としては、多糖の分泌量を増大させる観点から、寒天培地やゼラチン培地等の固体培地を用いて培養を行うことが好ましく、寒天培地にて培養を行うことがより好ましい。培地としては、特に限定されないが、例えば、ＹＮＢ培地、ＬＢ培地、ニュートリエント培地、トリプトソイ培地、ＹＭ培地，ＹＰＤ培地、ＰＤ培地、ＳＤ培地等が挙げられる。共培養の態様としては、特に限定されないが、多糖の分泌量を増大させる観点から、パエニバシラス属細菌がバシラス属細菌によって取り囲まれるように培養されることが好ましい。

【0033】

図２は、多糖の生産方法を説明するための説明図である。図２の紙面上側には、パエニバシラス属細菌を単独で培養した様子が示されており、図２の紙面下側には、パエニバシラス属細菌とバシラス属細菌とを共培養した様子が示されている。図２の紙面下側に示されるように、バシラス属細菌は、シグナル分子としての分泌物を分泌する。これにより、パエニバシラス属細菌のコロニーに形態変化が生じ、菌体外多糖（ＥＰＳ：Extracellular polysaccharides）の生産が誘導される。

【0034】

バシラス属細菌が分泌する分泌物によってパエニバシラス属細菌が多糖を分泌するメカニズムは、定かではないが、以下のような推定メカニズムが推定される。すなわち、近傍に存在する他種細菌同士は、互いに分泌する様々な分子を認識して相互作用していると考えられるところ、パエニバシラス属細菌は、バシラス属細菌からシグナル分子を受容することによって、菌体外多糖を分泌すると推定される。一般に、菌体外多糖は、捕食者からの攻撃や有害物質等のストレスからの保護や、接着能等に関わると考えられるため、細菌にとって重要な役割を担う重要な因子である。

【0035】

多糖の生産方法は、上記工程Ｐ１０の前に、パエニバシラス属細菌とバシラス属細菌とを準備する工程等を備えていてもよい。また、多糖の生産方法は、上記工程Ｐ１０の後に、分泌された多糖を回収する工程や、回収された多糖を精製する工程等を含んでいてもよい。

【0036】

多糖を回収する工程としては、特に限定されないが、例えば、培地からパエニバシラス属細菌の菌体を掻き取る工程を含んでいてもよい。回収された多糖を精製する工程としては、特に限定されないが、例えば、掻き取られた菌体をバッファーに懸濁した後に、遠心分離によって細胞を除去する工程を含んでいてもよい。その後、例えば、酵素処理やアルコール処理、酸処理、アルカリ処理、熱処理、抽出処理、透析処理、フィルター濾過等の各種処理を必要に応じて組み合わせて行うことによって、多糖を精製してもよい。より具体的には、例えば、核酸分解酵素およびタンパク質分解酵素による処理、クロロホルム抽出、エタノール沈殿および透析を、この順番に行う方法が挙げられる。なお、精製された多糖を凍結乾燥してもよい。

【0037】

図３は、多糖の生産方法の他の例を示す工程図である。この生産方法は、バシラス属細菌の分泌物の存在下において、パエニバシラス属細菌を培養することにより、パエニバシラス属細菌に多糖を分泌させる工程（Ｐ２０）を含む。バシラス属細菌、バシラス属細菌の分泌物およびパエニバシラス属細菌は、上述のとおりである。バシラス属細菌の分泌物は、パエニバシラス属細菌を培養するための培地に予め添加されていてもよく、パエニバシラス属細菌の培養途中に、塗布または付着されてもよい。

【0038】

多糖の生産方法は、上記工程Ｐ２０の前に、パエニバシラス属細菌とバシラス属細菌の分泌物とを準備する工程等を備えていてもよい。より具体的に、この工程は、例えば、パエニバシラス属細菌に多糖を分泌させるための分泌物を、バシラス属細菌を培養することによって分泌させる工程や、バシラス属細菌から分泌された分泌物を回収する工程や、回収された分泌物を精製する工程等を備えていてもよい。また、多糖の生産方法は、上記工程Ｐ２０の後に、パエニバシラス属細菌から分泌された多糖を回収する工程や、回収された多糖を精製する工程等を含んでいてもよい。

【0039】

本開示の多糖の生産方法によれば、環境負荷の少ない生物資源由来の多糖を生産できる。このため、環境中への排出に起因する生態系の破壊を抑制できる。また、生物資源由来の多糖を生産できるので、毒性の少ない抗菌剤等の組成物を提供できる。

【実施例0040】

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0041】

＜材料＞
パエニバシラス属細菌として、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ－０３７５４で示されるＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＮＢ２株（以下、単に「ＮＢ２株」とも呼ぶ）を、ヒトの表皮から単離した。また、パエニバシラス属細菌として、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ ＮＢＲＣ １５３０７を、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターから購入した。バシラス属細菌として、受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ－０３７５５で示されるＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. ＮＢ４株（以下、単に「ＮＢ４株」とも呼ぶ）を、ヒトの表皮から単離した。また、バシラス属細菌として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓを、市販の納豆（ミツカン社製）から単離した。

【0042】

＜実験１：ＮＢ４株との共培養によるＮＢ２株の菌体外多糖の生産＞
濁度を０．１に調製したＮＢ４株およびＮＢ２株の菌液を、１％のカザミノ酸および０．１％グルコースを添加したＹＮＢ寒天培地に滴下した。その後、３０℃で２日間培養した。ＮＢ２株のコロニー形態変化を、目視観察した。

【0043】

図４は、実験１の結果を示す説明図である。図４は、寒天培地の写真を示している。図４に示すように、ＮＢ４株のコロニーに近接したＮＢ２株のコロニーについて、形態変化が認められ、顕著にムコイド化することがわかった。この結果から、ＮＢ４株とＮＢ２株とを共培養すると、ＮＢ２株において菌体外多糖（以下、「ＮＢ２ＥＰＳ」とも呼ぶ）の生産が誘導されることがわかった。

【0044】

＜実験２：ＮＢ４株との共培養によるパエニバシラス属細菌の菌体外多糖の生産＞
濁度を０．１に調製したＮＢ４株およびＰ． ｍａｃｅｒａｎｓ ＮＢＲＣ １５３０７の菌液を、１％のカザミノ酸および０．１％グルコースを添加したＹＮＢ寒天培地に滴下した。その後、３０℃で２日間培養した。Ｐ． ｍａｃｅｒａｎｓ ＮＢＲＣ １５３０７のコロニー形態変化を、目視観察した。

【0045】

図５は、実験２の結果を示す説明図である。図５は、寒天培地の写真を示している。図５に示すように、ＮＢ４株のコロニーに近接するＰ． ｍａｃｅｒａｎｓ ＮＢＲＣ １５３０７のコロニーについて、ムコイド型コロニーとなることが認められた。この結果から、バシラス属細菌とパエニバシラス属細菌とを共培養すると、パエニバシラス属細菌において菌体外多糖の生産が誘導されることが示唆された。

【0046】

＜実験３：ＮＢ４株の培養物による菌体外多糖の生産＞
ＮＢ４株を、１％のカザミノ酸および０．１％グルコースを添加したＹＮＢ寒天培地に植菌し、３０℃で５日間培養した。培養した寒天培地を冷凍、解凍した後、１０，０００×Ｇ、１０分間の条件で遠心分離を行った。上清を、０．２２μｍの滅菌フィルター（Millex-GV、メルクミリポア社製）を用いてフィルター滅菌した後、直径８ｍｍのペーパーディスク（アドバンテック社製）に浸漬させた。ＮＢ２株をＹＮＢ寒天培地のプレート全体に塗抹し、塗抹直後にペーパーディスクを留置して、３０℃で２日間培養した。対照区として、ＹＮＢ培地成分を浸漬させたペーパーディスクを用いた。ＮＢ２株のコロニー形態変化を、目視観察した。

【0047】

図６は、実験３の結果を示す説明図である。図６は、寒天培地の写真を示している。図６に示すように、対照区においては、ムコイド化が認められなかった。これに対し、ＮＢ４株の培養物を含むペーパーディスクに近接するＮＢ２株は、顕著にムコイド化することがわかった。この結果から、ＮＢ４株と共培養した場合と同様に、ＮＢ４株の培養物の存在下において、ＮＢ２株において菌体外多糖の生産が誘導されることがわかった。

【0048】

＜実験４：バシラス属細菌の培養抽出物による菌体外多糖の生産＞
Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓを、１％のカザミノ酸および０．１％グルコースを添加したＹＮＢ寒天培地に植菌し、３０℃で５日間培養した。培養した寒天培地を冷凍、解凍した後、１０，０００×Ｇ、１０分間の条件で遠心分離を行った。上清を、０．２２μｍの滅菌フィルター（Millex-GV、メルクミリポア社製）を用いてフィルター滅菌した後、直径８ｍｍのペーパーディスク（アドバンテック社製）に浸漬させた。ＮＢ２株をＹＮＢ寒天培地のプレートに植菌し、植菌直後に、ＮＢ２株と重ならないようにペーパーディスクを留置して、３０℃で２日間培養した。ＮＢ２株のコロニー形態変化を、目視観察した。

【0049】

図７は、実験４の結果を示す説明図である。図７は、寒天培地の写真を示している。図７に示すように、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓの培養抽出物を含むペーパーディスクに近接するパエニバシラス属細菌について、ムコイド型コロニーとなることが認められた。この結果から、バシラス属細菌の培養物の存在下において、パエニバシラス属細菌において菌体外多糖の生産が誘導されることが示唆された。

【0050】

＜実験５：多糖の単離および精製＞
１％のカザミノ酸および０．５％グルコースを添加したＹＮＢ寒天培地上に、ＮＢ４株とＮＢ２株とを共に植菌し、３０℃で５日間培養することによって、多糖を生産した。ムコイド化したＮＢ２株の菌体を、リン酸バッファー（ＰＢＳ（－）、富士フイルム和光純薬社製）に懸濁した後、２００ｒｐｍ、３０℃、１時間の条件で振盪することによって、菌体外物質を細胞から遊離させた。１０，０００×Ｇ、１０分間の条件で遠心分離を行い、上清を回収した。核酸分解酵素としてＤＮａｓｅＩ（NIPPON GENE社製）、ＲＮａｓｅ（nacalai tesque社製）を加えて３７℃で２時間反応させた後、タンパク質分解酵素としてＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（Merck社製）を加えて３７℃で２時間反応させた。この溶液に対して等量のクロロホルムを添加して撹拌し、６，０００×Ｇ、１０分間の条件で遠心分離を行い、水層を回収した。この溶液に対して３倍量のエタノールを加えて撹拌し、１０，０００×Ｇ、１０分間、４℃の条件で遠心分離を行い、沈殿物を回収した。この沈殿物をＭｉｌｌｉ－Ｑ水に溶解後、透析膜（積水マテリアルソリューション社製）を用いてＭｉｌｌｉ－Ｑ水に対して透析し、その後、凍結乾燥した。透析の結果から、ＮＢ２ＥＰＳの分子量は、１５０００以上であることが示唆された。

【0051】

＜実験６：病原性細菌に対する多糖のバイオフィルム形成阻害活性の測定＞
９６穴ポリスチレンプレートに、ＬＢ液体培地および０～２５０μｇ／ｍＬのＮＢ２ＥＰＳ水溶液を添加し、供試菌株を接種した。供試菌として、Staphylococcus aureus ATCC29213（黄色ブドウ球菌）、Klebsiella pneumoniae ATCC10031（クレブシエラ肺炎桿菌）を用いた。３７℃で一晩培養後、培養液を取り除き、蒸留水で３回洗浄した。染色液として０．１％クリスタルバイオレットを添加することによって１５分間染色した後に、染色液を取り除き、蒸留水で３回洗浄した。７０％エタノールを添加し、室温で１５分間放置して色素を抽出し、ＥＰＯＣＨ２（BioTek社製）を用いて５９０ｎｍの吸光度を測定した。なお、サンプル数は、１６とした。

【0052】

図８は、実験６の黄色ブドウ球菌の結果を示す説明図である。図９は、実験６のクレブシエラ肺炎桿菌の結果を示す説明図である。図８および図９において、横軸はＮＢ２ＥＰＳの濃度（μｇ／ｍＬ）を示し、縦軸は５９０ｎｍの吸光度を示している。なお、図８および図９では、ＮＢ２ＥＰＳを添加しなかったサンプル（０μｇ／ｍＬ ＮＢ２ＥＰＳ）に対する１％水準の有意差が示されている。図８および図９に示すように、黄色ブドウ球菌、クレブシエラ肺炎桿菌ともに、ＮＢ２ＥＰＳを添加することによって、５９０ｎｍの吸光度が有意に低下した。この結果から、ＮＢ２ＥＰＳの添加によって、病原性細菌のバイオフィルムの形成が阻害されることが示唆された。

【0053】

＜実験７：多糖の構造解析＞
多糖を構成する単糖の組成分析を、以下のように行った。ＮＢ２ＥＰＳを、４Ｍトリフルオロ酢酸を用いて１００℃、３時間の条件で酸加水分解した後に、ＡＢＥＥ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（株式会社Ｊ－オイルミルズ社製）を用いて、取扱説明書の指示に従ってＡＢＥＥ標識し、その後、ＨＰＬＣ分析に供与した。ＨＰＬＣ分析は、Nexeraシステム（島津社製）、内径４．６ｍｍ、長さ７５ｍｍのＣ１８カラム（Ｊ－ケミカル社製）を用いて、０．２Ｍ ホウ酸カリウム緩衝液／アセトニトリル（９３／７）を溶離液とし、流量を１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度を３０℃として、蛍光検出器 ＲＦ－２０ＡＸＳ（島津社製）で検出した（Ｅｘ．３０５、Ｅｍ．３６０ｎｍ）。保持時間を、標準単糖と比較した。ＮＭＲ分析は、ＮＢ２ＥＰＳを重水に溶解し、ＥＣＺ６００（日本電子社製）を用いてＮＭＲ（６００ＭＨｚ）測定した。

【0054】

図１０は、単糖組成分析の結果を示す説明図である。図１０に示すように、保持時間２５ｍｉｎ．において、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのピークが顕著に検出された。このことから、ＮＢ２ＥＰＳの主要構成単糖は、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンであることがわかった。

【0055】

図１１は、^１Ｈ ＮＭＲ分析の結果を示す説明図である。図１１に示すように、多糖に特徴的なスペクトルが検出された。より具体的に、４．９ｐｐｍのピークは、β結合しているＮ－アセチルグルコサミンの１位のＨであり、４．０ｐｐｍ付近の重複したピークは、Ｎ－アセチルグルコサミンの２～６位のＨであると考えられる。また、２．４ｐｐｍのピークは、Ｎ－アセチル基のＨに由来すると考えられる。

【0056】

図１２は、^１３Ｃ ＮＭＲ分析の結果を示す説明図である。図１２に示すように、^１３Ｃ ＮＭＲ分析においても、^１Ｈ ＮＭＲ分析と同様に、多糖に特徴的なスペクトルが検出された。より具体的には、２種類のＮ－アセチルグルコサミンのシグナルが検出されたことから、ＮＢ２ＥＰＳは、Ｎ－アセチルグルコサミン２残基の繰り返し構造を有することが示唆された。１００ｐｐｍ付近の２つのピークは、β結合しているＮ－アセチルグルコサミンの１位のＣであり、６０ｐｐｍ付近のピークは、グリコシド結合していない６位のＣであると考えられる。Ｎ－アセチルグルコサミンの２位および５位には水酸基が存在しないことから、この２残基のＮ－アセチルグルコサミンは、１→３結合、および１→４結合のグリコシド結合を有することが示唆された。以上の結果から、ＮＢ２ＥＰＳの構造は、以下に示す糖鎖構造の繰り返しであることが示唆された。なお、式中のｎは、整数であり、ＧｌｕＮＡｃは、Ｎ－アセチルグルコサミンを示している。
［→４）－β－Ｄ－ＧｌｃＮＡｃ－（１→３）－β－Ｄ－ＧｌｃＮＡｃ－（１→］ｎ

【0057】

＜実験８：多糖のキチナーゼ処理＞
キチンを分解する酵素であるキチナーゼ（シグマアルドリッチ社製）を、ＮＢ２ＥＰＳに添加し、３７℃で１６時間処理した。その後、上述の方法と同様の方法により^１Ｈ ＮＭＲ分析を行ったところ、キチナーゼ処理の前後においてＮＭＲのスペクトルに差が認められなかった。したがって、ＮＢ２ＥＰＳは、キチナーゼにより分解されないことが示唆された。この結果から、パエニバシラス属細菌が生産する多糖の構造は、キチンのようなβ－１，４結合のポリマーではないことが示唆された。

【0058】

現在報告されている天然に存在するＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのポリマーは、Ｎ－アセチルグルコサミンがβ－１，４結合で直鎖状に結合したキチン、および、β－１，６結合で直鎖状に結合したＰＩＡ（polysaccharide intercellular adhesin）のみであり、ＮＢ２ＥＰＳは、新規構造を有する多糖であると考えられる。

【0059】

本発明は、上述の実施形態に限られるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲において種々の構成で実現することができる。例えば、発明の概要の欄に記載した各形態中の技術的特徴に対応する実施形態、実施例中の技術的特徴は、上述の課題の一部または全部を解決するために、あるいは、上述の効果の一部または全部を達成するために、適宜、差し替えや、組み合わせを行うことが可能である。また、その技術的特徴が本明細書中に必須なものとして説明されていなければ、適宜、削除することが可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】