特開 2024-47513 乾癬治療用製剤としての、又はその調製におけるＡＤＲＢ１活性阻害剤の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024047513

(43)【公開日】2024-04-05

(54)【発明の名称】乾癬治療用製剤としての、又はその調製におけるＡＤＲＢ１活性阻害剤の使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20240329BHJP

   A61K 31/167 20060101ALI20240329BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20240329BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240329BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20240329BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240329BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240329BHJP

【ＦＩ】

A61K45/00

A61K31/167

A61P17/06

A61P43/00 111

C12Q1/02

C12N15/09 100

C12N15/09 110

C12N5/10

【審査請求】有

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022203668

(22)【出願日】2022-12-20

(31)【優先権主張番号】202211174329.0

(32)【優先日】2022-09-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(71)【出願人】

【識別番号】521557687

【氏名又は名称】孫 良丹

【氏名又は名称原語表記】ＳＵＮ Ｌｉａｎｇｄａｎ

【住所又は居所原語表記】２１８ Ｊｉｘｉ Ｒｏａｄ， Ｓｈｕｓｈａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｈｅｆｅｉ Ｃｉｔｙ， Ａｎｈｕｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ２３００２２， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110002262

【氏名又は名称】ＴＲＹ国際弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】孫 良丹

(72)【発明者】

【氏名】王 義睿

(72)【発明者】

【氏名】李 卓

(72)【発明者】

【氏名】陳 微微

(72)【発明者】

【氏名】甄 ▲ち▼

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C084

4C206

【Ｆターム（参考）】

4B063QA20

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QQ13

4B063QQ79

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR72

4B063QR77

4B063QR80

4B063QS36

4B063QS38

4B063QX01

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA01

4B065CA24

4B065CA46

4C084AA17

4C084NA14

4C084ZA262

4C084ZA891

4C084ZA892

4C084ZB112

4C084ZC412

4C084ZC432

4C206AA01

4C206AA02

4C206GA01

4C206GA31

4C206KA01

4C206MA01

4C206MA04

4C206NA14

4C206ZA26

4C206ZA89

4C206ZB11

4C206ZC41

4C206ZC43

(57)【要約】      （修正有）

【課題】本発明は、皮膚疾患薬物の技術分野に属し、具体的には、乾癬治療用製剤としての、又はその調製におけるＡＤＲＢ１活性阻害剤の使用を提供する。
【解決手段】本発明のＡＤＲＢ１活性阻害剤（例えば、アセブトロール塩酸塩（ＡＣＥ））を用いて生体の乾癬を治療することにより、皮膚交感神経の異常活性化に起因するノルエピネフリンの上昇、刺激によるγδＴ細胞のＩＬ－１７分泌が効果的に抑制され、乾癬皮膚部位ＩＬ－１７に媒介される免疫反応が低下することによって、乾癬の治療効果が得られる。
【選択図】図２５

【特許請求の範囲】

【請求項1】

乾癬治療用製剤としての、又はその調製におけるＡＤＲＢ１活性阻害剤の使用。

【請求項2】

前記製剤は、皮膚交感神経の異常活性化を抑制するための製剤であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

前記製剤は、皮膚交感神経の異常活性化に起因するノルエピネフリンの上昇を抑制するための製剤であることを特徴とする、請求項２に記載の使用。

【請求項4】

前記製剤は、γδＴ細胞のＩＬ－１７分泌を抑制するための製剤であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。

【請求項5】

ＡＤＲＢ１活性阻害剤は、ＡＣＥを含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の使用。

【請求項6】

前記製剤は、ＡＤＲＢ１活性阻害剤及び薬学的に許容される添加剤を含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の使用。

【請求項7】

前記製剤は、ＡＤＲＢ１活性阻害剤及び薬学的に許容される添加剤を含むことを特徴とする、請求項５に記載の使用。

【請求項8】

インビトロでγδＴ細胞のＩＬ－１７分泌を抑制する方法であって、
単離された細胞中のＡＤＲＢ１発現遺伝子をノックアウト又はノックダウンすることを含むことを特徴とする、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、皮膚疾患薬物の技術分野に属し、具体的には、乾癬治療用製剤としての、又はその調製におけるＡＤＲＢ１活性阻害剤の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

乾癬は、免疫細胞浸潤、表皮過形成及び角化細胞の異常分化を特徴とする慢性炎症性皮膚疾患である。従来の研究により、角化細胞と免疫細胞との相互作用によりサイトカインネットワーク、特にＩＬ－１７ファミリーとその後のシグナルカスケードが形成されることで乾癬の進行が促進されることが発見された。精神神経的因子は、乾癬の発症及び悪化の誘因の一つである。神経内分泌は、皮膚末梢神経系の重要な機能の１つである。精神的因子は、ストレッサーとして主に２つの主要な神経内分泌系（即ち、視床下部－下垂体－副腎軸（ＨＰＡ）及び交感神経－副腎髄質系（ＳＡＭ））の活性化を引き起こし、神経内分泌ホルモンのカスケードと炎症誘発性サイトカインの放出を引き起こす。乾癬は様々な炎症誘発性サイトカインの活性の向上に関連するため、乾癬はさらに誘発及び悪化する可能性がある。

【0003】

従来の研究から明らかなように、ＩＬ１７Ａ／Ｆは乾癬の重要なエフェクターサイトカインであり、ＩＬ１７Ａ／Ｆを標的とする生物学的製剤の臨床使用は、乾癬に優れた治療効果をもたらす。しかし、関連する生物学的製剤は高価であり、後期では継続して使用する必要があるため、治療費用が高く、完治することもできない。

【0004】

そのため、乾癬を安全で有効に治療できる製剤が必要とされている。

【発明の概要】

【0005】

上記の問題に対して、本発明の一つの目的は、乾癬治療用製剤としての、又はその調製におけるＡＤＲＢ１活性阻害剤の使用を提供することである。このＡＤＲＢ１活性阻害剤（例えば、ＡＣＥ）を用いて生体の乾癬を治療することにより、皮膚交感神経の異常活性化に起因するノルエピネフリンの上昇、刺激によるγδＴ細胞のＩＬ－１７分泌が効果的に抑制され、乾癬皮膚部位ＩＬ－１７に媒介される免疫反応が低下することによって、乾癬の治療効果が得られる。

【0006】

上記の目的を達成するために、本発明は、以下の技術的手段を採用する。
本発明の一態様では、乾癬治療用製剤としての、又はその調製におけるＡＤＲＢ１活性阻害剤の使用が提供される。具体的には、本発明では、ＡＤＲＢ１によりγδＴ－１７を活性化し、即ち、精神神経的因子は、乾癬の発症及び悪化の誘因であるが、乾癬治療のために潜在的な標的を提供し、薬物の研究開発は乾癬の治療に役に立つことを示している。なお、ＡＤＲＢ１活性阻害剤は、当該技術分野で既知のＡＤＲＢ１の活性を阻害できる薬剤であり、化学製剤、例えば、アセブトロール塩酸塩（Ａｃｅｂｕｔｏｌｏｌ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，ＡＣＥ）であってもよく、生物製剤、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９製剤などであってもよい。

【0007】

さらに、前記使用において、製剤は、皮膚交感神経の異常活性化を抑制するための製剤である。

【0008】

さらに、前記使用において、製剤は、皮膚交感神経の異常活性化に起因するノルエピネフリンの上昇を抑制するための製剤である。

【0009】

さらに、前記使用において、製剤は、γδＴ細胞のＩＬ－１７分泌を抑制するための製剤である。

【0010】

なお、いくつかの自己免疫疾患において、自己抗原刺激性炎症は、交感神経系（ＳＮＳ）を慢性的に活性化する。ＳＮＳの調節不全には、無菌性炎症に起因する免疫活性化が伴い、周期的かつ連鎖的な交感神経活動（ＳＮＡ）、全身性炎症及び病変組織における局所免疫活性化を引き起こす。関節リウマチの前向き研究では、研究者らは、ＳＮＳの調節不全が疾患の発症と進行の重要な要因であり、疾患発症の前兆であることを発見した。また、炎症性関節炎を有するげっ歯類の関節炎関節及び自己免疫性糖尿病のげっ歯類モデルの膵臓にも交感神経障害があることが報告されている。ヒト１型糖尿病の膵臓における交感神経の選択的欠失も報告されている。早期アジュバント誘発関節炎（ＡＩＡ）では、交感神経切除術によりＴｈ１及びＴｈ１７型免疫応答を抑制することによって急性ＡＩＡの重症度は大幅に軽減される。これは、ＳＮＳ活性が主に免疫介在性関節炎の急性発症の重症度を悪化させることを示している。乾癬は、自己免疫疾患の１種として、自律神経系（ＡＮＳ）の調節不全の典型的な特徴を有し、交感神経系（ＳＮＳ）と副交感神経系（ＰａＳＮＳ）の活性／反応性の不均衡として現れる。交感神経系（ＳＮＳ）は複数のリンパ器官を制御しており、皮膚にも交感神経が分布している。交感神経ニューロンの主な神経伝達物質はノルエピネフリン（ＮＥ）である。ノルエピネフリンは、皮膚組織で発現される主なカテコールアミンホルモンであり、交感神経節後ニューロンから放出される主な神経伝達物質でもある。交感神経系ストレス試験は、乾癬患者の血液循環中のＮＥの有意な増加を引き起こすことができ、乾癬中のＳＮＳの活性化と障害を示している。

【0011】

なお、本発明では、乾癬患者の血液循環中のＮＥが健康な対照集団よりも有意に高く、ＩＭＱ処理によりマウスの皮膚及び血液循環中のＮＥレベルが高くなることが検証され、ＩＭＱ処理によりマウス皮膚のＴＨリン酸化が有意にアップレギュレーションされることが確定された。ここで、ＴＨはカテコールアミンホルモン合成の律速酵素であり、ＮＥは皮膚組織で発現される主なカテコールアミンホルモンである。皮膚交感神経の薬物除神経及びＮＥの皮下注射により乾癬マウスモデルを構築することによって、皮膚交感神経がＴＨ活性化を介してＮＥの分泌を調節し、γδＴ細胞のＩＬ－１７Ａ産生を促進することが証明された。

【0012】

具体的には、カテコールアミンホルモンは、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）サブセットのバランスに影響を与えることができる。Ｔｈ細胞は、主な表面マーカーがＣＤ４であるＴ細胞であり、活性化されると、異なるエフェクター／メモリー細胞サブセット、例えば、Ｔｈ１、Ｔｈ２及びＴｈ１７細胞に分化し、それぞれ対応するマーカーサイトカインＩＦＮ－γ、ＩＬ－４和ＩＬ－１７Ａを発現する。カテコールアミンホルモンは、交感神経系によって制御される「闘争・逃走」反応において、全身の免疫系反応に影響を与える。ＳＮＳは、Ｔ細胞が位置する領域のアドレナリン作動性神経を介してノルエピネフリンを放出し、Ｔ細胞表面でアドレナリン受容体を発現し、カテコールアミンに応答する。

【0013】

本発明において、乾癬患者の皮膚損傷、マウスモデル皮膚組織の単一細胞のシーケンシング結果、及び免疫蛍光結果により、β１－ＡＲは皮膚組織においてγδＴ細胞内で特異的に発現されることが発見された。また、カテコールアミンは、ＡＰＣに作用することによりＴｈ１７の分化に間接的に影響を与えることができ、樹状細胞（ＤＣ）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞機能に必要な共刺激及びサイトカインを提供し、Ｔｈ１７の増幅に必要なサイトカインＩＬ－２３を産生し、β２－ＡＲアゴニストであるサルブタモールで処理されたマウスＤＣはより多くのＩＬ－２３を産生し、エフェクターＴｈ１７細胞の分化を促進する。ノルエピネフリン（ＮＥ）又はサルブタモール（ｓａｌｂｕｔａｍｏｌ）は、マウスＤＣを刺激してＩＬ－１７Ａを誘導し、ＣＤ４細胞によるＩＦＮ－γ産生を減少させる。しかし、カテコールアミンが皮膚に常在するγδＴ細胞にどのように直接影響するかについては、比較的知られていない。

【0014】

さらに、本発明において、ＮＥはβ１－ＡＲを介してγδＴ１７細胞に直接作用することを検証するために、皮膚表面にそれぞれβ１－ＡＲアゴニスト及びアンタゴニストを塗布したマウスモデル、並びにインビトロでβ１－ＡＲアゴニスト及びアンタゴニストを使用したγδＴ細胞モデルを構築し、ＮＥは、γδＴ表面β１－ＡＲに結合してＩＬ－１７発現の制御に関与する仮説を検証した。

【0015】

また、本発明において、インビトロでβ１－ＡＲアゴニスト及びアンタゴニストを使用したＴ細胞モデルにおいて、β１－ＡＲの活性の変化はＮＦ－κＢの活性化を影響することによりγδＴ細胞の活性化を制御することが検証され、β１－ＡＲアゴニスト／アンタゴニストが塗布されたマウスモデルにおいて、いずれも皮膚組織ＮＦ－κＢ活性の変化が観察され、乾癬の発症では皮膚交感神経がＴＨ－ＮＥ－ＡＤＲＢ１－ＮＦ－κＢ経路を介してγδＴ１７細胞に対する調節を媒介することを示している。

【0016】

さらに、前記使用において、製剤は、ＡＤＲＢ１活性阻害剤及び薬学的に許容される添加剤を含む。なお、ＡＤＲＢ１活性阻害剤と薬学的に許容される添加剤とを混合して臨床に適用する製剤に調製してもよい。例えば、５％ＤＭＳＯ＋９５％（生理食塩水に２０％ＳＢＥ－β－ＣＤ）に溶解してペースト剤に調製し、マウスの背中に塗布し、又は水剤に調製して経口投与する。また、ＡＤＲＢ１活性阻害剤を、乾癬を治療するための他の薬物と併用してもよい。併用は、具体的な臨床状況に応じて調整することができる。

【0017】

本発明の別の態様では、γδＴ細胞がＩＬ－１７を分泌することをインビトロで抑制する方法が提供される。前記方法は、単離された細胞中のＡＤＲＢ１発現遺伝子をノックアウト又はノックダウンすることを含む。なお、本発明において、単離された細胞中のＡＤＲＢ１発現遺伝子をノックアウト又はノックダウンすることにより、γδＴ細胞がＩＬ－１７を分泌することを抑制することができる。ノックアウト又はノックダウンの方法は、当該技術分野で既知の基本的な編集方法、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮ又はＺＦＮなどである。

【0018】

本発明は、以下の有益な効果を有する。
本発明のＡＤＲＢ１活性阻害剤（例えば、ＡＣＥ）を用いて生体の乾癬を治療することにより、皮膚交感神経の異常活性化に起因するノルエピネフリンの上昇、刺激によるγδＴ細胞のＩＬ－１７分泌が効果的に抑制され、乾癬皮膚部位ＩＬ－１７に媒介される免疫反応が低下することによって、乾癬の治療効果が得られる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】健常対照者及び乾癬患者の末梢血中の神経伝達物質の分泌レベルを示す。

【図2】対照マウス及び乾癬マウスの皮膚及び末梢血中のノルエピネフリン及びドーパミンのレベルを示す。

【図3】乾癬患者及び乾癬マウスの皮膚中のＴＨ総タンパク質レベル及びリン酸化された活性タンパク質のレベルを示す。

【図4】６－ＯＨＤＡ及びＩＭＱの皮内注射によりマウス乾癬様表現型を誘導する実験手順を示す。

【図5】６－ＯＨＤＡを皮内注射した後のマウス乾癬様表現型を示す。

【図6】６－ＯＨＤＡを皮内注射した後のマウス皮膚中のＩＬ－１７Ａ＋γδＴ細胞状況を示す。

【図7】６－ＯＨＤＡを皮内注射した後のマウス皮膚中のノルエピネフリンの発現を示す。

【図8】ＮＥ及びＩＭＱの皮下注射によりマウス乾癬様表現型を誘導する実験手順を示す。

【図9】ＮＥを皮下注射した後のマウス乾癬様表現型を示す。

【図10】ＮＥを皮下注射した後のマウス皮膚中のＩＬ－１７Ａ＋γδＴ細胞の比率を示す。

【図11】対照マウス及び乾癬マウスの単一細胞シーケンシング分析を示す。

【図12】ＶＡＳ処理及びＩＭＱ処理マウス皮膚中のβ１－ＡＲ免疫組織化学分析を示す。

【図13】ＶＡＳ処理及びＩＭＱ処理マウス皮膚中のβ１－ＡＲのｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ結果を示す。

【図14】乾癬マウス皮膚中のβ１－ＡＲ、ＩＬ－１７Ａ、γδＴ細胞、αβＴ細胞の免疫蛍光共局在化を示す。

【図15】ＩＭＱ処理後のマウス皮膚中のβ１－ＡＲ＋Ｔ細胞の比率状況を示す。

【図16】乾癬患者の皮膚損傷、非皮膚損傷及び健常対照者の皮膚中のβ１－ＡＲの免疫組織化学分析を示す。

【図17】乾癬患者の皮膚損傷、非皮膚損傷及び健常対照者の皮膚中のβ１－ＡＲのｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ結果を示す。

【図18】乾癬患者の皮膚損傷及び健常対照者の皮膚中のβ１－ＡＲ、γδＴ細胞、αβＴ細胞の免疫蛍光共局在化を示す。

【図19】乾癬患者の皮膚損傷及び健常対照者の皮膚中のβ１－ＡＲ＋細胞のＴ細胞における比率を示す。

【図20】Ｔ細胞サブセットにおけるβ１－ＡＲ＋細胞の分布状況を示す。

【図21】ＩＭＱで処理されたＡｄｒｂ１^＋／－マウス皮膚の表現型を示す。

【図22】フローサイトメトリーにより検出された、ＩＭＱで処理されたＡｄｒｂ１^＋／－マウスの背中皮膚の免疫細胞中の単球細胞の比率を示す。

【図23】フローサイトメトリーにより検出された、ＩＭＱで処理されたＡｄｒｂ１^＋／－マウスのＩＬ－１７Ａ＋真皮γδＴ細胞、ＩＬ－１７Ａ＋表皮γδＴ細胞、ＩＬ－１７Ａ＋αβＴ細胞の比率を示す。

【図24】ＡＣＥが塗布されたＩＭＱ誘導性マウスの皮膚表現型を示す。

【図25】ＡＣＥが塗布されたＩＭＱ誘導性マウスのＩＬ－１７Ａ産生状況を示す。

【図26】ＤＯＢが塗布されたＩＭＱ誘導性マウスの皮膚表現型を示す。

【図27】ＤＯＢが塗布されたＩＭＱ誘導性マウスのＩＬ－１７Ａ産生状況を示す。

【図28】γδＴ細胞欠陥マウス（Ｔｃｒｄ^－／－）にＤＯＢを塗布した後の皮膚表現型を示す。

【図29】γδＴ細胞欠陥マウス（Ｔｃｒｄ^－／－）にＤＯＢを皮下注射した後の皮膚中の単球細胞、好中球細胞の比率を示す。

【図30】γδＴ細胞欠陥マウス（Ｔｃｒｄ^－／－）にＤＯＢを皮下注射した後のαβＴ細胞のＩＬ－１７産生状況を示す。

【図31】ＩＬ－２３刺激とＡＣＥ／ＤＯＢ共刺激後の初代γδＴ細胞中のＩＬ１７Ａ／Ｆ転写状況を示す。

【図32】ＩＬ－２３刺激とＡＣＥ／ＤＯＢ共刺激後の初代γδＴ細胞中のＮＦ－κＢ、ＡＫＴ、ｐ３８、ＥＲＫの活性化状況を示す。

【図33】ＤＯＢで処理した後のＩＭＱ誘導性皮膚中のＮＦ－κＢのリン酸化状況を示す。

【図34】ＡＣＥで処理した後のＩＭＱ誘導性皮膚中のＮＦ－κＢのリン酸化状況を示す。

【発明を実施するための形態】

【0020】

例示される実施例は、本発明をより良く説明するためのものであり、本発明の内容は例示される実施例に限定されない。したがって、当業者が上記の発明の概要に基づいて実施形態に加える非本質的な改良及び調整は、本発明の保護範囲に含まれる。

【0021】

本明細書で使用される用語は、特定の実施例を説明するためのものに過ぎず、本発明を制限するものではない。文脈が明らかに異なる意味を有しない限り、単数形の表現は複数形の表現を含む。本明細書で使用される「含む」、「有する」、「包含」などの用語は、特徴、数字、操作、部材、部品、素子、材料又はそれらの組み合わせの存在を示すことを意図している。本明細書に本発明の用語が開示され、他の特徴、数字、操作、部材、部品、素子、材料若しくはそれらの組み合わせが存在するか又は１つ若しくは複数追加できる可能性を排除することを意図していない。例えば、本明細書で使用される「／」は、状況に応じて「及び」又は「又は」と解釈することができる。

【0022】

本発明をより良く理解するために、以下、具体例により本発明の内容をさらに説明するが、本発明の内容は、以下の例示に限定されない。

【0023】

以下の実施例において、具体的に説明されない実験手順は、全て当該技術分野で既知の操作手順である。

【0024】

実施例１：乾癬患者及びマウス中のノルエピネフリンの発現
本発明の実施例において、ＥＬＩＳＡ検出により乾癬患者の血清中のＮＥ含有量は健常対照者群よりも高く、ドーパミン及び５－ＨＴは有意な差がないこと（図１）、ＩＭＱで処理された乾癬マウスでは、皮膚及び血清中のＮＥ含有量はいずれもＶＡＳで処理された対照マウスよりも高く、ドーパミンは有意な差がないこと（図２）が発見された。従来の文献により、交感神経はＴＨのリン酸化を刺激することによりカテコールアミンの生合成の制御に関与することが証明され、ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ検出により乾癬患者の皮膚損傷及び非皮膚損傷におけるＴＨ総タンパク質レベル及びリン酸化はいずれも健常対照者皮膚よりも高く、ＩＭＱ処理はマウス皮膚ＴＨのリン酸化の有意なアップレギュレーションを引き起こすことが発見された（図３）。

【0025】

実施例２：皮膚交感神経除神経による乾癬モデルの構築
本発明の実施例において、皮膚の局所交感神経切除術は以下の通りである。０．６ｍｇの６－ヒドロキシドーパミン（６－ＯＨＤＡ）を１００μｌの０．１％アスコルビン酸溶液（０．９％無菌塩化ナトリウムで希釈）に溶解して新鮮な交感神経除神経液を調製した。７－８週齢の野生型マウスを取り、皮膚が２ｃｍ×２ｃｍの面積で露出するように背中の毛を剃り、新鮮な交感神経除神経液を１００μｌ皮内注射し、対照群動物に対照薬（０．１％アスコルビン酸溶液１００μｌ）を注射した。注射した４８ｈ後、マウスの露出した皮膚にＩＭＱクリーム又は対照薬ＶＡＳを均一に塗布した。

【0026】

先行文献には、６－ヒドロキシドーパミン（６－ＯＨＤＡ）はカテコールアミン作動性ニューロンの選択的神経毒であり、交感神経の除去に使用され、６－ＯＨＤＡの腹腔内注射はＩＭＱ誘導性耳の腫れを軽減できるが、ＩＬ－１７の産生に影響を与えることがないが、これは、心血管効果及び／又は全身性交感神経切除後の全身性免疫調節不全に起因することが開示されている。

【0027】

本発明の実施例において、乾癬マウスに対する皮膚局部交感神経切除術の影響を観察するために、ＩＭＱ処理前に、マウスに６－ＯＨＤＡを皮内注射した（図４）。その後の研究により、皮膚交感神経除去はＩＭＱ誘導性マウス乾癬様表現型を減少させることが証明された（図５）。また、交感神経が除去された皮膚中のＩＬ－１７Ａ＋γδＴ細胞が減少し、皮膚交感神経がγδＴ細胞のＩＬ－１７産生を調節することにより乾癬様皮膚炎に影響を与えることを示している（図６）。交感神経が除去された皮膚中のＮＥの減少は、交感神経がＮＥの分泌によりγδＴ細胞のＩＬ－１７産生を調節する可能性があることを示している（図７）。

【0028】

実施例３：ノルエピネフリン（ＮＥ）注射による乾癬モデルの構築
本発明の実施例において、ノルエピネフリン（ＮＥ）注射による乾癬モデルの構築は以下の通りである。６μｌのノルエピネフリン保存液（１０ｍＭ）を１００μｌの１×ＰＢＳに溶解し、０．１ｍｇ／ｍｌのＮＥ希釈液を調製した。７－８週齢の野生型マウスを取り、皮膚が２ｃｍ×２ｃｍの面積で露出するように背中の毛を剃り、１００μｌのＮＥ希釈液を皮下注射し、対照群動物に対照薬（６μｌのＤＭＳＯ＋１００μｌのＰＢＳ）を注射した。薬物が吸収された（注射後の皮膚隆起が消えた）後、注射部位を避けてマウスの露出した皮膚にＩＭＱクリーム又は対照薬ＶＡＳを均一に塗布した。上記のように４日間連続注射、塗布した。

【0029】

交感神経は皮膚中のＮＥの主な供給源である。交感神経が除去されたマウス皮膚中のＮＥの減少は、皮膚交感神経が皮膚ＮＥの主な供給源であることをさらに証明した。

【0030】

本発明の実施例において、皮膚中のＮＥの分泌がマウス乾癬表現型に影響を与えるか否かを検証するために、マウス背中の露出皮膚にＩＭＱを塗布すると同時にＮＥを皮下注射した結果（図８）、ＮＥ注射はＩＭＱ誘導性乾癬様表現型を悪化させ（図９）、マウス皮膚中のＩＬ－１７Ａ＋γδＴ細胞の比率を増大した（図１０）。

【0031】

実施例４：マウス皮膚におけるＮＥ受容体の発現態様
アドレナリン受容体（ＡＲ）ファミリーは、通常、α－サブタイプ及びβ－サブタイプの２種類に分けられる。ノルエピネフリン（ＮＥ）は、通常、β１サブタイプ選択的アドレナリン作動性アゴニストであり、比較的高い濃度のみでβ２－アドレナリン受容体に対して直接活性を有すると考えられている。

【0032】

本発明の実施例において、ＶＡＳ処理対照マウス及びＩＭＱ誘導性乾癬マウス皮膚組織に対して単一細胞シーケンシングを行った結果、ＡＤＲＢ１（β１－ＡＲ）は、主に皮膚組織Ｔ細胞内で発現された（図１１）。免疫組織化学及びＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ結果から分かるように、β１－ＡＲは真皮部位に浸潤した免疫細胞上で発現され、乾癬マウス皮膚内での発現は対照マウスよりも高かった（図１２及び図１３）。

【0033】

本発明の実施例において、さらに免疫蛍光及びフローサイトメトリーにより、マウス皮膚組織のβ１－ＡＲは主にγδＴ－１７内で発現され（図１４）、ＶＡＳ処理マウス皮膚において、γδＴとαβＴ中のβ１－ＡＲ＋細胞比率には有意な差がなく、ＩＭＱ処理マウス皮膚において、γδＴ中のβ１－ＡＲ＋細胞がαβＴよりも有意に高く、ＶＡＳ処理マウスとＩＭＱ処理マウス皮膚のαβＴ中のβ１－ＡＲ＋細胞比率には有意な差がなく、ＩＭＱ処理マウス皮膚γδＴ中のβ１－ＡＲ＋細胞がＶＡＳ処理マウスよりも有意に高い（図１５）ことが観察された。これによって、ＩＭＱ誘導性乾癬マウス皮膚においてβ１－ＡＲはαβＴではなく主にγδＴ内で発現され、ＶＡＳ誘導性健康マウスと比較して、乾癬マウス皮膚γδＴにおけるβ１－ＡＲの発現が有意に高いことが判断された。

【0034】

実施例５：乾癬皮膚におけるＮＥ受容体の発現態様

【0035】

本発明の実施例において、乾癬患者皮膚損傷及び健常対照者皮膚に対して免疫組織化学及びＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析を行った結果、β１－ＡＲは真皮部位に浸潤する免疫細胞上で発現され（図１６）、乾癬皮膚損傷での発現が非皮膚損傷よりも高く、非皮膚損傷での発現が健常対照者よりも高かった（図１７）。

【0036】

本発明の実施例において、さらに免疫蛍光及びフローサイトメトリーにより、β１－ＡＲは主にγδＴ細胞内で発現され（図１８及び図１９）、乾癬患者中のβ１－ＡＲ＋Ｔ細胞比率は対照群よりも高い（図２０）ことが観察された。

【0037】

実施例６：ＩＭＱ誘導性Ａｄｒｂ１^＋／－乾癬マウスモデルの構築
本発明の実施例において、乾癬におけるβ１－ＡＲの作用メカニズムを研究するために、ＩＭＱ誘導性Ａｄｒｂ１^＋／－乾癬マウスモデル（マウスAdrb1の完全なノックアウトは胚致死性である）を構築した。結果から分かるように、ＩＭＱ誘導性野生型（ＷＴ）マウスと比較して、Ａｄｒｂ１^＋／－マウスの乾癬様表現型は弱くなり、紅斑が有意に減少し、鱗屑よりも皮膚の厚さに大きな変化はなかった（図２１）。

【0038】

本発明の実施例において、さらに特異的標識抗体を用いて単離されたマウス皮膚免疫細胞をグループ化した。ここで、単球細胞及び好中球細胞は、乾癬皮膚損傷の典型的な炎症浸潤細胞であり、フローサイトメトリー検出によりＩＭＱ誘導性Ａｄｒｂ１^＋／－マウスマウスの背中皮膚中の単球細胞比率及びＩＬ１７Ａ＋真皮γδＴ細胞比率は有意に減少した（図２２及び図２３）。

【0039】

実施例７：β１－ＡＲアンタゴニスト塗布による乾癬マウスモデルの構築
本発明の実施例において、β１－ＡＲアンタゴニスト／アゴニスト塗布による乾癬マウスモデルの構築は、以下の通りである。５μｌのβ１－ＡＲアンタゴニスト／アゴニスト保存液（４０ｍｇ／ｍｌ，溶媒ＤＭＳＯ）を９５μｌの２０％ＳＢＥ－β－ＣＤ溶液（無菌塩化ナトリウム希釈）に溶解し、２ｍｇ／ｍｌアンタゴニスト／アゴニスト希釈液を調製した。７－８週齢の野生型マウスを取り、皮膚が２ｃｍ×２ｃｍの面積で露出するように背中の毛を剃り、１００μｌのアンタゴニスト／アゴニスト希釈液を塗布し、対照群動物に対照薬（５μｌのＤＭＳＯ＋９５μｌの２０％ＳＢＥ－β－ＣＤ溶液）を塗布し、薬物が吸収された後、マウスの露出した皮膚にＩＭＱクリーム又は対照薬ＶＡＳを均一に塗布し、４日間連続塗布した。

【0040】

本発明の実施例において、ＩＭＱ誘導性マウスにＡｃｅｂｕｔｏｌｏｌ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＡＣＥ，アセブトロール塩酸塩，選択的ＡＤＲＢ１アンタゴニスト）に塗布した。結果から明らかなように、対照群と比較して、ＡＣＥが塗布されたマウスは乾癬表現型が軽減し（図２４）、ＩＭＱ誘導性マウス皮膚では、ＡＣＥの塗布により皮膚γδＴ－１７細胞の比率が減少した（図２５）。

【0041】

実施例８：β１－ＡＲアゴニストの塗布による乾癬マウスモデルの構築
本発明の実施例において、β１－ＡＲアンタゴニスト／アゴニストの塗布による乾癬マウスモデルの構築は実施例７と同様である。

【0042】

本発明の実施例において、ＮＥがβ１－ＡＲを介してγδＴ－１７細胞に影響を直接与えるか否かをさらに研究するために、ＩＭＱ誘導性マウスにＤｏｂｕｔａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＯＢ，ドブタミン塩酸塩，選択的ＡＤＲＢ１アゴニスト）塗布した。結果から分かるように、対照群と比較して、ＤＯＢが塗布されたマウスは乾癬表現型が悪化した（背中皮膚厚さの増加、紅斑と鱗屑の悪化を含む）（図２６）。ＩＭＱ誘導性マウス皮膚では、ＤＯＢの塗布はγδＴ細胞のＩＬ－１７Ａ産生を促進した（図２７）。

【0043】

実施例９：ＮＥ－ＡＤＲＢ１シグナル経路によるγδＴ細胞のＩＬ－１７分泌の調節
本発明の実施例において、γδＴ細胞欠陥マウス（Ｔｃｒｄ^－／－）の皮膚にＤＯＢを塗布した結果、γδＴ細胞が欠如するため、乾癬表現型及び炎症浸潤に対するＤＯＢの促進作用は相殺され（図２８、図２９）、ＤＯＢがαβＴ細胞のＩＬ－１７産生能力に影響を与えなかった（図３０）。前の結果と合わせると、皮膚中のＮＥは、主に皮膚交感神経に由来し、ＮＥ－ＡＤＲＢ１シグナル経路を介してαβＴ細胞ではなくγδＴ細胞のＩＬ－１７放出を媒介することが検証された。

【0044】

実施例１０：細胞モデルにおけるβ１－ＡＲの免疫調節作用の検証
本発明の実施例において、ＡＤＲＢ１が如何にγδＴ細胞の炎症反応を調節するかを研究するために、磁気ビーズソーティングキットを用いてマウス脾臓から高純度の初代γδＴ細胞を分離し、それぞれＡＤＲＢ１アゴニスト及びアンタゴニストで刺激した。
結果から分かるように、ＩＬ－２３で活性化した初代γδＴ細胞では、高濃度ＤＯＢの刺激はＩＬ１７Ａ及びＩＬ１７Ｆの転写を増加させる一方、ＡＣＥはＩＬ１７Ａ及びＩＬ１７Ｆの転写を減少させた（図３１）。

【0045】

実施例１１：ＮＥ－ＡＤＲＢ１－ＮＦ－κＢシグナル経路の検証
本発明の実施例において、ＩＬ－２３で活化した初代γδＴ細胞では、ＤＯＢで刺激することによりＮＦ－κＢ（Ｐ６５）のリン酸化が有意に増加する一方、ＡＣＥで処理することによりそのリン酸化が抑制されたが、ＭＡＰＫファミリーのメンバーＰ３８、ＥＲＫ、ＪＮＫ及びＡＫＴの活性化に影響を与えなかった（図３２）。これは、Ｔ細胞の活性化に対するＡＤＲＢ１の調節がＮＦ－κＢの活性化に依存することを示している。

【0046】

本発明の実施例において、ＩＭＱ誘導性マウス乾癬マウス皮膚中のＮＦ－κＢレベルをさらに検出し、ＮＦ－κＢリン酸化がＩＭＱによって活性化され、ＤＯＢ処理によりＩＭＱ誘導性皮膚中のＮＦ－κＢの活性化が増強され、ＡＣＥ処理が抑制作用を示すことが観察された（図３３及び図３４）。

【0047】

以上より、交感神経は、ＮＥ－ＡＤＲＢ１－ＮＦ－κＢ経路を活性化することによりγδＴ細胞のＩＬ－１７産生を促進すると結論付けることができる。

【0048】

以上の実施例は、本発明の技術的手段を説明するためのものに過ぎず、本発明を制限するものではない。好ましい実施例により本発明を詳しく説明したが、当業者が本発明の趣旨及び範囲から逸脱することがなく、本発明の技術的手段を修正又は同等置換することができる。これらの修正及び置換は、本発明の特許請求の範囲に含まれるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【手続補正書】

【提出日】2024-03-04

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

乾癬治療用製剤の調製のためのＡＤＲＢ１活性阻害剤の使用であって、前記ＡＤＲＢ１活性阻害剤は、アセブトロール塩酸塩（ＡＣＥ）であることを特徴とする使用。

【請求項2】

前記製剤は、皮膚交感神経の異常活性化を抑制するための製剤であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

前記製剤は、皮膚交感神経の異常活性化に起因するノルエピネフリンの上昇を抑制するための製剤であることを特徴とする、請求項２に記載の使用。

【請求項4】

前記製剤は、γδＴ細胞のＩＬ－１７分泌を抑制するための製剤であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。

【請求項5】

前記製剤は、ＡＤＲＢ１活性阻害剤及び薬学的に許容される添加剤を含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の使用。