特開 2024-48319 細胞組織の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024048319

(43)【公開日】2024-04-08

(54)【発明の名称】細胞組織の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20240401BHJP

【ＦＩ】

C12N5/071

【審査請求】未請求

【請求項の数】20

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022206880

(22)【出願日】2022-12-23

(31)【優先権主張番号】P 2022153774

(32)【優先日】2022-09-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(71)【出願人】

【識別番号】000102692

【氏名又は名称】ＮＴＮ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】近江 ▲祥▼平

(72)【発明者】

【氏名】塚本 佳也

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065BC01

4B065CA44

4B065CA46

(57)【要約】

【課題】寸法および中心位置を考慮しつつ塗布液を高い位置精度で供給することにより、小スケールかつハイスループットで作用を再現性高く高精度に評価可能な細胞組織の製造方法を提供する。
【解決手段】第２塗布液Ｂを供給する工程においては、Ｎ個の第１塗布液Ａのそれぞれの第１寸法をｒ_１ｎ（１≦ｎ≦Ｎの自然数）、Ｍ個の第２塗布液のそれぞれの第２寸法をｒ_２ｍ（１≦ｍ≦Ｍの自然数）とし、Ｎ個の中から選択された任意の第１寸法がｒ_１ｎの第１塗布液の中心と、Ｍ個の中から選択された任意の第２寸法がｒ_２ｍの第２塗布液の中心との距離をＤ_ｎ，ｍとすれば、任意の第１塗布液と任意の第２塗布液との間で
（数１）Ｄ_ｎ，ｍ＜ｒ_２ｍ－ｒ_１ｎ・・・（１）
および
（数２）Ｄ_ｎ，ｍ＞ｒ_２ｍ＋ｒ_１ｎ・・・（２）
のいずれかが成立するように供給される。
【選択図】図８

【特許請求の範囲】

【請求項1】

塗布対象物内に第１塗布液をＮ個（Ｎ≧１の自然数）供給し、細胞を配置する工程と、
前記Ｎ個の第１塗布液のうち少なくとも１個を覆うように、前記塗布対象物内に第２塗布液をＭ個（Ｍ≧１の自然数）供給する工程とを備え、
前記第２塗布液を供給する工程においては、前記Ｎ個の第１塗布液のそれぞれの中心から外縁までの寸法の最大値である第１寸法をｒ_１ｎ（１≦ｎ≦Ｎの自然数）、前記Ｍ個の第２塗布液のそれぞれの中心から外縁までの寸法の最大値である第２寸法をｒ_２ｍ（１≦ｍ≦Ｍの自然数）とし、Ｎ個の中から選択された任意の前記第１寸法がｒ_１ｎの前記第１塗布液の中心と、Ｍ個の中から選択された任意の前記第２寸法がｒ_２ｍの前記第２塗布液の中心との距離をＤ_ｎ，ｍとすれば、任意の前記第１塗布液と任意の前記第２塗布液との間で
（数１）Ｄ_ｎ，ｍ＜ｒ_２ｍ－ｒ_１ｎ・・・（１）
および
（数２）Ｄ_ｎ，ｍ＞ｒ_２ｍ＋ｒ_１ｎ・・・（２）
のいずれかが成立するように供給される、細胞組織の製造方法。

【請求項2】

前記Ｎ個の第１塗布液のうち前記第２塗布液と重なる１個以上の前記第１塗布液の第１図心を中心とし前記１個以上の第１塗布液を全て覆い前記１個以上の前記第１塗布液のいずれかと内接するよう求められた第１仮想曲線の最大寸法である第１仮想寸法ｒ_１ｖ以上の基準寸法よりも、前記第２寸法ｒ_２ｍの方が大きく、
前記第１図心は、前記第２塗布液と重なる１個以上の前記第１塗布液のそれぞれの中心位置から求められる、請求項１に記載の細胞組織の製造方法。

【請求項3】

前記Ｍ個の第２塗布液の第２図心を中心とし、前記Ｍ個の第２塗布液を全て覆い前記Ｍ個の第２塗布液のいずれかと内接するよう求められた第２仮想曲線の最大寸法である第２仮想寸法ｒ_２ｖ以上の基準寸法よりも、前記塗布対象物の第３寸法ｒ_３の方が大きく、
前記第２図心は、前記Ｍ個の前記第２塗布液のそれぞれの中心位置から求められる、請求項１に記載の細胞組織の製造方法。

【請求項4】

前記塗布対象物内に供給される前記Ｎ個の第１塗布液のうち少なくとも１個に含まれる前記細胞は第１細胞であり、前記少なくとも１個とは異なる他の少なくとも１個の前記第１塗布液に含まれる前記細胞は第２細胞である、請求項１または２に記載の細胞組織の製造方法。

【請求項5】

前記塗布対象物内に供給される前記Ｎ個の第１塗布液のうち少なくとも１個に前記細胞が含まれ、前記少なくとも１個とは異なる他の少なくとも１個の前記第１塗布液には前記細胞を含まずサイトカイン、薬剤、ＥＣＭおよび添加因子からなる群から選択される少なくともいずれかが含まれる、請求項１または２に記載の細胞組織の製造方法。

【請求項6】

前記第１塗布液にサイトカイン、ＥＣＭおよび添加因子からなる群から選択される少なくともいずれかが含まれる、請求項１または２に記載の細胞組織の製造方法。

【請求項7】

前記第１塗布液を供給する工程以降にゲル化剤を用いて、前記塗布対象物内に供給された前記細胞から細胞組織が形成される、請求項１または２に記載の細胞組織の製造方法。

【請求項8】

前記第１塗布液は前記細胞とゲル化剤とを含み、前記第２塗布液は前記ゲル化剤よりも粘度の高い溶液である、請求項７に記載の細胞組織の製造方法。

【請求項9】

前記第１塗布液は前記細胞を含み、前記第２塗布液はゲル化剤を含む、請求項７に記載の細胞組織の製造方法。

【請求項10】

２液混合方式により前記塗布対象物内に前記第１塗布液および前記第２塗布液が供給される、請求項１または２に記載の細胞組織の製造方法。

【請求項11】

前記第１塗布液は前記細胞とゲル化開始剤とを含み、前記第２塗布液はゲル化剤を含む、請求項１０に記載の細胞組織の製造方法。

【請求項12】

前記第１塗布液は前記細胞とゲル化剤とを含み、前記第２塗布液はゲル化開始剤を含む、請求項１０に記載の細胞組織の製造方法。

【請求項13】

前記第１塗布液および前記第２塗布液の少なくともいずれかに、ゲル化剤としてのコラーゲンとフィブリノゲンとの少なくともいずれかが含まれる、請求項１または２に記載の細胞組織の製造方法。

【請求項14】

前記第１塗布液および前記第２塗布液の少なくともいずれかに増粘多糖類が混合された、請求項１または２に記載の細胞組織の製造方法。

【請求項15】

前記細胞は心筋細胞、神経細胞、肝細胞、癌細胞、血管内皮細胞および線維芽細胞からなる群から選択されるいずれかである、請求項１または２に記載の細胞組織の製造方法。

【請求項16】

前記第１塗布液の細胞体積濃度が１ｖｏｌ％以上３０ｖｏｌ％以下である、請求項１または２に記載の細胞組織の製造方法。

【請求項17】

前記Ｎ個の第１塗布液のうち１個の前記第１塗布液中に、前記細胞として、第３細胞と、前記第３細胞とは異なる第４細胞とが含まれるように共培養される、請求項１または２に記載の細胞組織の製造方法。

【請求項18】

前記第１塗布液を供給する工程において塗布針方式が用いられる、請求項１または２に記載の細胞組織の製造方法。

【請求項19】

前記第２塗布液を供給する工程において、塗布針方式、インクジェット方式、ディスペンサ方式、レーザープリント方式、ピペット方式からなる群から選択されるいずれかが用いられる、請求項１または２に記載の細胞組織の製造方法。

【請求項20】

前記第２塗布液をＭ個供給する工程において、前記Ｍ個のうち少なくとも１個の前記第２塗布液は塗布針方式、インクジェット方式、ディスペンサ方式、レーザープリント方式、ピペット方式からなる群から選択される第１方式により供給され、前記Ｍ個のうち少なくとも１個とは異なる他の前記第２塗布液は前記第１方式とは異なる第２方式により供給される、請求項１９に記載の細胞組織の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、細胞組織の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

１つの容器内に、異種の細胞および組織を近接して培養することで、生体と類似した極性のある細胞・組織を形成する技術が、たとえば特開２０２０－１７８６１２号公報（特許文献１）に開示されている。特開２０２０－１７８６１２号公報には、１つの容器内に複数の細胞組織を塗布針方式により形成する方法が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２０２０－１７８６１２号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

特開２０２０－１７８６１２号公報では、たとえば段落００９６および図１７にて、塗布対象物であるウェルと、その中に供給される第１塗布液としての細胞組織との組み合わせについて例示されている。

【0005】

しかし特開２０２０－１７８６１２号公報には、細胞を含む第１塗布液の半径と、それを覆う第２塗布液との半径と、ウェルの大きさとの３つのパラメータの間の関係について開示されていない。仮に特開２０２０－１７８６１２号公報の図１７（ａ）において、ウェルの内壁に近い位置に第２塗布液をディスペンサを用いて滴下すれば、静電気により第２塗布液がウェルの内壁に付着したり、目的の位置からずれたりすることがある。結果として、第２塗布液が第１塗布液を完全に覆うことが出来ず、第１塗布液が崩壊する可能性がある。

【0006】

本開示は上記の課題に鑑みなされたものである。本開示の目的は、寸法および中心位置を考慮しつつ塗布液を高い位置精度で供給することにより、小スケールかつハイスループットで作用を再現性高く高精度に評価可能な細胞組織の製造方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本開示に従った細胞組織の製造方法では、塗布対象物内に第１塗布液がＮ個（Ｎ≧１の自然数）供給され、細胞が配置される。Ｎ個の第１塗布液のうち少なくとも１個を覆うように、塗布対象物内に第２塗布液がＭ個（Ｍ≧１の自然数）供給される。第２塗布液を供給する工程においては、Ｎ個の第１塗布液のそれぞれの中心から外縁までの寸法の最大値である第１寸法をｒ_１ｎ（１≦ｎ≦Ｎの自然数）、Ｍ個の第２塗布液のそれぞれの中心から外縁までの寸法の最大値である第２寸法をｒ_２ｍ（１≦ｍ≦Ｍの自然数）とし、Ｎ個の中から選択された任意の第１寸法がｒ_１ｎの第１塗布液の中心と、Ｍ個の中から選択された任意の第２寸法がｒ_２ｍの第２塗布液の中心との距離をＤ_ｎ，ｍとすれば、任意の第１塗布液と任意の第２塗布液との間で
（数１）Ｄ_ｎ，ｍ＜ｒ_２ｍ－ｒ_１ｎ・・・（１）
および
（数２）Ｄ_ｎ，ｍ＞ｒ_２ｍ＋ｒ_１ｎ・・・（２）
のいずれかが成立するように供給される。

【発明の効果】

【0008】

本開示によれば、寸法および中心位置を考慮しつつ塗布液を高い位置精度で供給することにより、小スケールかつハイスループットで作用を再現性高く高精度に評価可能な細胞組織の製造方法を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】実施の形態１に従った塗布装置の模式図である。

【図2】図１に示した塗布装置の塗布機構を示す模式図である。

【図3】試料塗布セットの概略斜視図である。

【図4】実施の形態１の細胞組織の製造方法の各工程において供給される各塗布液の中心および寸法を示す概略図である。

【図5】２個の第１塗布液の配置関係を示す概略図である。

【図6】第１塗布液と、これを覆う第１仮想曲線との中心、寸法、位置の関係を示す概略図である。

【図7】第１仮想曲線と第２塗布液との関係を示す概略図である。

【図8】第１塗布液と第２塗布液との位置関係の第１例を示す概略図である。

【図9】第１塗布液と第２塗布液との位置関係の第２例を示す概略図である。

【図10】２個の第２塗布液の配置関係を示す概略図である。

【図11】第２塗布液と、これを覆う第２仮想曲線との中心、寸法、位置の関係を示す概略図である。

【図12】第２仮想曲線とウェルとの関係を示す概略図である。

【図13】実施例１における位相差顕微鏡像である。

【図14】実施例２における位相差顕微鏡像である。

【図15】実施例３において供給された各塗布液の位置および寸法を示す概略平面図である。

【図16】図１５と同一の各塗布液の中心位置および中心間の距離を示す概略平面図である。

【図17】実施例３における位相差顕微鏡像である。

【図18】実施例４における位相差顕微鏡像である。

【図19】第２塗布液のウェル内における塗布位置を変化させたときの、塗布されると想定される位置と、実際に塗布された位置とを示す模式図および写真である。

【図20】実施の形態２における第１塗布液が塗布される前の態様を示す概略図である。

【図21】実施の形態２における第１塗布液の組成を示す概略図である。

【図22】実施の形態２における第１塗布液が塗布される工程を示す概略図である。

【図23】実施の形態２における第１塗布液が塗布された後の態様を示す概略図である。

【図24】実施の形態２における第２塗布液が供給される工程を示す概略図である。

【図25】図２４の工程がなされた後のウェル内の態様を示す概略図である。

【図26】実施の形態２における培地が供給される工程を示す概略図である。

【図27】培養前の第１塗布液内の細胞の態様を示す概略図である。

【図28】培養後の第１塗布液内の細胞の態様を示す概略図である。

【図29】ウェル内に塗布液が供給された直後の位相差顕微鏡像（左）、および６日間培養後の位相差顕微鏡像（右）である。

【図30】塗布組織の実験におけるＣａ^２＋トランジエント波形を示すグラフである。

【図31】塗布組織および２Ｄ組織のそれぞれにイソプロテレノールを添加した際のＢＰＭの変化を示すグラフである。

【図32】塗布組織および２Ｄ組織のそれぞれにイソプロテレノールを添加した際のＡＭＰの変化を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0010】

（はじめに）
はじめに、実施の形態１の細胞組織の製造方法の特徴について簡単に説明する。図８を参照して、（Ａ）のように、供給される第１寸法ｒ_１ｎの第１塗布液Ａの中心と、それを覆う第２寸法ｒ_２ｍの第２塗布液Ｂの中心との距離Ｄ_ｎ，ｍは、
（数１）Ｄ_ｎ，ｍ＜ｒ_２ｍ－ｒ_１ｎ・・・（１）
である。あるいは（Ｂ）のように、
（数２）Ｄ_ｎ，ｍ＞ｒ_２ｍ＋ｒ_１ｎ・・・（２）
である。以下、実施の形態１の細胞組織の製造方法について、図に基づいて説明する。

【0011】

（実施の形態１）
（装置構成）
図１は、実施の形態１に従った塗布装置の模式図である。図１を用いて、本実施形態に従った塗布装置を説明する。なお、説明の便宜のため、Ｘ方向、Ｙ方向、Ｚ方向が導入されている。図１を参照して、本実施形態である塗布装置は、処理室と、当該処理室の内部に配置されたＹ軸テーブル２と、Ｘ軸テーブル１と、Ｚ軸テーブル３と、塗布機構４と、観察光学系６と、当該観察光学系６に接続されたＣＣＤカメラ７と、制御部とを主に備えている。制御部は、モニタ９と、制御用コンピュータ１０と、操作パネル８とを含む。

【0012】

処理室の内部においては、当該処理室の底部上にＹ軸テーブル２が設置されている。このＹ軸テーブル２は、Ｙ軸方向に移動可能になっている。具体的には、Ｙ軸テーブル２の下面にガイド部が設置されている。当該ガイド部は、処理室の底面に設置されたガイドレールに摺動可能に接続されている。また、Ｙ軸テーブル２の下面にはボールねじが接続されている。当該ボールねじをモータなどの駆動部材により動作させることにより、Ｙ軸テーブル２はガイドレールに沿って（Ｙ軸方向に）移動可能になっている。また、Ｙ軸テーブル２の上部表面上は、後述の試料塗布セット１１を搭載する搭載面となっている。つまりＹ軸テーブル２は、液体材料を塗布される対象物である試料塗布セット１１を保持する保持台としての機能を有している。

【0013】

Ｙ軸テーブル２上には、Ｘ軸テーブル１が設置されている。Ｘ軸テーブル１は、Ｙ軸テーブル２をＸ軸方向に跨ぐように設置された構造体上に配置されている。Ｘ軸テーブル１には、Ｚ軸テーブル３が接続された移動体がＸ軸方向に移動可能に設置されている。移動体は、たとえばボールねじを用いてＸ軸方向に移動可能となっている。なお、Ｘ軸テーブル１は上記構造体を介して処理室の底面に固定されている。そのため、上述したＹ軸テーブル２は、Ｘ軸テーブル１に対してＹ軸方向に移動可能になっている。

【0014】

Ｘ軸テーブル１に接続された移動体には、上述のようにＺ軸テーブル３が設置されている。Ｚ軸テーブル３には、観察光学系６および塗布機構４が接続されている。観察光学系６は塗布される対象物である試料塗布セット１１の塗布位置を観察するためのものである。ＣＣＤカメラ７は、観察した画像を電気信号に変換する。Ｚ軸テーブル３は、これらの観察光学系６および塗布機構４をＺ軸方向に移動可能に保持している。

【0015】

これらのＹ軸テーブル２、Ｘ軸テーブル１、Ｚ軸テーブル３、観察光学系６および塗布機構４を制御するための制御用コンピュータ１０および操作パネル８、さらに制御用コンピュータに付随するモニタ９は、処理室の外部に設置されている。モニタ９は、上述したＣＣＤカメラ７で変換された画像データや、制御用コンピュータ１０からの出力データを表示する。操作パネル８は、制御用コンピュータ１０への指令を入力するために用いられる。

【0016】

図２は、図１に示した塗布装置の塗布機構を示す模式図である。図２を参照して、本実施の形態の塗布機構４は、サーボモータ４１、カム４３、当該カム４３のカム面に接触した状態で保持されている軸受４４、カム連結板４５、可動部４６、塗布針ホルダ２０を保持する可動ベース３５、および塗布材料容器２１を主に含む。塗布針ホルダ２０は可動ベース３５と着脱可能になっている。言い換えれば、ベース体としての可動ベース３５は、塗布針ホルダ２０を着脱可能に保持する。

【0017】

塗布機構４において、サーボモータ４１は、図１に示したＺ軸方向に沿った方向に中心軸が延びるように設置されている。サーボモータ４１の回転軸にはカム４３が接続されている。カム４３は、サーボモータ４１の中心軸を中心として回転可能になっている。カム４３は、サーボモータ４１の回転軸に接続された中心部と、当該中心部の一方端部に接続されたフランジ部とを含む。フランジ部の上部表面（サーボモータ４１側の表面）はカム面となっている。このカム面は、中心部の外周に沿って円環状に形成されているとともに、フランジ部の底面からの距離が変動するようにスロープ状に形成されている。具体的には、カム面は底面からの距離が最も遠くなっている（厚みの厚い）上端フラット領域と、この上端フラット領域から間隔を隔てて配置された下端フラット領域と、この上端フラット領域と下端フラット領域との間を滑らかに接続するスロープ部とを含む。下端フラット領域は、底面からの距離が最も近くなっている（厚みの薄い）領域である。

【0018】

このカム４３のカム面に接するように軸受４４が配置されている。この軸受４４にカム連結板４５が接続されている。カム連結板４５において、軸受４４と接続された一方端部と反対側の他方端部は可動部４６に固定されている。この可動部４６には、ベース体としての可動ベース３５が接続されている。この可動ベース３５に塗布針ホルダ２０が設置されている。塗布針ホルダ２０は塗布針２４を含む。塗布針２４は、試料塗布セット１１のたとえばウェル１２に液体材料を塗布可能である。塗布針２４は、塗布針ホルダ２０の下面（サーボモータ４１が位置する側と反対側である下側）において塗布針ホルダ２０から突出するように配置されている。塗布針ホルダ２０下には塗布材料容器２１が配置されている。塗布材料容器２１に塗布針２４は挿入された状態で保持されている。

【0019】

可動部４６には固定ピンが固定されている。また、サーボモータ４１を保持している架台には他方の固定ピンが固定されている。この固定ピンの間を繋ぐようにバネが設置されている。このバネにより、可動部４６は塗布材料容器２１側に向けた力を受けた状態になっている。また、このバネの力によって、軸受４４はカム４３のカム面に押圧された状態を維持している。

【0020】

また、可動部４６、可動ベース３５は、サーボモータ４１を保持する架台に設置されたリニアガイドに接続され、Ｚ軸方向に沿って移動可能になっている。

【0021】

上述した塗布機構４においては、サーボモータ４１を駆動することにより当該サーボモータ４１の回転軸を回転させてカム４３を回転させる。この結果、カム４３のカム面に接触している軸受４４のＺ軸方向における位置がサーボモータ４１の回転軸の回転に応じて変動する。そして、この軸受４４のＺ軸方向での位置変動に応じて、可動部４６、可動ベース３５がＺ軸方向に移動することにより、塗布針２４のＺ軸方向における位置を変化させることができる。つまり塗布針２４をＺ軸方向に往復運動させることができる。この動作により、塗布針２４がＺ軸方向の上方にある時には、液体材料が収納された塗布材料容器２１内に塗布針２４の先端が浸漬される。この状態に対し、塗布針２４は塗布材料容器２１の底面の先端穴から下方に突出することで塗布動作がなされる。塗布針２４の先端に液体材料が付着した状態で、塗布針２４の先端が塗布材料容器２１の先端穴から突出し、塗布材料容器２１の外に出る。このとき、表面張力によって液体材料が上方に引き上げられ、塗布針２４の先端にはほぼ一定量の液体材料が付着した状態となる。このように付着した液体材料が試料塗布セット１１に転写されることで、再現性の高い塗布工程が実現できる。

【0022】

より詳しくは、図１および図２を参照して、操作パネル８から出力された塗布速度指令値は、制御用コンピュータ１０の記憶装置に保管される。塗布動作時には、記憶装置から読みだされた塗布速度指令値が、塗布機構４の制御プログラムに送信される。塗布機構４の制御プログラムは、塗布速度指令値に基づいて、サーボモータ４１の回転速度を決定し回転させる。これにより塗布針２４をＺ軸方向に往復運動させながら塗布動作がなされる。制御用コンピュータ１０が図示されない上位の制御システムと通信している場合には、塗布速度指令値は上位の制御システムから塗布機構４の制御プログラムに送信されてもよい。また、塗布される液体材料の種類に応じたパラメータが、制御用コンピュータ１０の記憶装置に保管されてもよい。指定された液体材料の種類、塗布量、塗布寸法に応じて塗布速度指令値が算出されてもよい。

【0023】

（製造方法の特徴）
図３は、試料塗布セットの概略斜視図である。図３を参照して、本実施の形態では、液体材料としての塗布液は、試料塗布セット１１に複数形成されたウェル１２の内部に塗布供給される。ただし塗布液が供給される塗布対象物はこれに限られない。試料塗布セット１１はＺ軸方向に厚みを有し、その最上面に複数のウェル１２が形成されている。複数のウェル１２は、試料塗布セット１１の上面がくぼんだ凹形状の部分である。複数のウェル１２は互いに間隔をあけて、たとえば図３のＹ軸方向に８列、Ｘ軸方向に１２列で合計９６個形成されてもよい。ウェル１２の平面形状はたとえば円形など任意である。

【0024】

図４は、実施の形態１の細胞組織の製造方法の各工程において供給される各塗布液の中心および寸法を示す概略図である。図４以降の各図の塗布液は、Ｚ方向から平面視した形状を示す。図４を参照して、本実施の形態においては、たとえば平面視にて円形の塗布液が供給されることが好ましい。ただしこれに限らず、塗布液は完全な円形からやや崩れたものであったり、やや一方に大きくずれた形状の楕円形の平面形状であったりしてもよい。さらに塗布液は円形、楕円形のいずれとも異なる、たとえば八角形、十二角形などの多角形の平面形状（またはこれらの多角形に近似する平面形状）であってもよい。いずれにしても、以降に述べる塗布液の寸法とは、中心（図心）から外縁までの寸法の最大値を意味することとする。塗布液の平面形状が円形であれば、寸法は図４中の（Ａ）における半径としてのｒ_１ｎを意味し、楕円形であれば寸法は図４中の（Ａ）における長半径としてのｒ_１ｎを意味する。

【0025】

まず試料塗布セット１１の複数のウェル１２から選ばれた１つのウェル１２に、第１塗布液がＮ個供給される。Ｎは１以上の自然数であり、（Ａ）に示す第１塗布液Ａが少なくとも１個供給される。なお複数の第１塗布液Ａは、１つの塗布機構により時間的に連続して供給された液体によるものを１個とする。１つの塗布機構により時間的に分断されながら供給された液体による第１塗布液Ａは互いに別個のものとする。また時間的に同時であっても、互いに異なる塗布機構から供給された液体による第１塗布液Ａは互いに別個のものとする。複数個の第１塗布液Ａが供給される場合、そのうち少なくとも１個に培養すべき細胞が含まれる。このため第１塗布液Ａの供給により、ウェル１２内には培養すべき細胞が配置される。

【0026】

第１塗布液Ａの寸法を第１寸法ｒ_１ｎ（１≦ｎ≦Ｎ）とする。すなわちＮ個の第１塗布液Ａのうち１個目の第１寸法はｒ_１１で表記され、２個目の第１寸法はｒ_１２で表記される。

【0027】

図５は、２個の第１塗布液の配置関係を示す概略図である。図５を参照して、Ｎ個（Ｎは２以上の自然数）のうち任意に選択された２個の第１塗布液Ａのそれぞれの寸法をｒ_１ｎ、ｒ_{１（ｎ＋１）}とする。２個の第１塗布液Ａのそれぞれの中心（図心）間の距離をｄ_{ｎ，ｎ＋１}とする。このとき２個の第１塗布液の配置関係は、図５中の（Ａ）のように互いに重ならない場合と、（Ｂ）のように一方が他方の内部に完全に収まる場合と、（Ｃ）のように両者が部分的に重なる場合とがある。（Ａ）には両者が互いに外接する場合を含む。（Ｂ）には一方が他方に内接する場合を含む。

【0028】

図５中の（Ａ）の場合には以下の式（３）が、（Ｂ）の場合には以下の式（４）が、（Ｃ）の場合には以下の式（５）が、それぞれ成立する。式（３）中の等号は図５の（Ａ）にて２つの第１塗布液Ａが互いに外接する場合である。式（４）中の等号は図５の（Ｂ）にて一方の第１塗布液Ａが他方に内接する場合である。式（５）にてｒ_１ｎ＝ｒ_{１（ｎ＋１）}であれば、ｄ_{ｎ，ｎ＋１}＜ｒ_１ｎ＋ｒ_{１（ｎ＋１）}のみ成立する。

【0029】

（数３）ｄ_{ｎ，ｎ＋１}≧ｒ_１ｎ＋ｒ_{１（ｎ＋１）}・・・（３）
（数４）ｄ_{ｎ，ｎ＋１}≦ｒ_{１（ｎ＋１）}－ｒ_１ｎ・・・（４）
（数５）ｒ_{１（ｎ＋１）}－ｒ_１ｎ＜ｄ_{ｎ，ｎ＋１}＜ｒ_１ｎ＋ｒ_{１（ｎ＋１）}・・・（５）
第２塗布液Ｂ（図４中の（Ｃ）参照）は、Ｎ個の第１塗布液Ａのうち少なくとも１個をＺ軸方向の上側から覆うようにＭ個（Ｍ≧１の自然数）だけ、ウェル１２内に供給される。つまりたとえば、複数の第２塗布液Ｂのうち１個は複数の第１塗布液Ａのうち一部を覆い、第２塗布液Ｂのうち他の１個は複数の第１塗布液Ａのうち他の一部を覆ってもよい。図６は、第１塗布液と、これを覆う第１仮想曲線との中心、寸法、位置の関係を示す概略図である。図６および図４中の（Ｂ）を参照して、第１仮想曲線Ａ’は、第１塗布液Ａと重なる１個の第２塗布液Ｂの寸法を決めるために用いられる仮想の図形（たとえば円形）である。仮想曲線は曲線でない（直線となる）こともあり得るが、以下ではその場合もまとめて仮想曲線と呼称する。Ｎ個の第１塗布液Ａのうち、１個の第２塗布液Ｂと重なる１個以上の第１塗布液Ａが選ばれる。それら１個以上の第１塗布液Ａのそれぞれの中心（図心）から、それらの第１塗布液Ａの図心が、第１仮想曲線Ａ’の第１図心Ｇ１として求められる。

【0030】

たとえばＮ個の第１塗布液Ａの全てを覆う１個の第２塗布液Ｂが供給される場合、図６に示すように、Ｎ個の第１塗布液Ａのそれぞれの中心を考える。１個の第１塗布液Ａの中心の位置は、それぞれの第１塗布液Ａの図心を決める。図心は、その位置を支点にすることにより、塗布液が釣り合う点を意味する。たとえば円形または楕円形などの、重量が均一に作用する第１塗布液Ａであれば、その図心は中心に等しくなる。

【0031】

１個目の第１塗布液Ａの中心の位置座標を（ｘ_１，ｙ_１）とし、同様にＮ個目の第１塗布液Ａの中心を（ｘ_Ｎ，ｙ_Ｎ）とする。この中心位置（中心の座標）は、第１塗布液Ａが円形または楕円形の場合には当該第１塗布液Ａの図心の座標に等しい。当該中心の座標は、塗布装置の制御部に含まれるモニタ９の出力などから求められる。このとき第１図心Ｇ１の座標（Ｘ_１，Ｙ_１）は、Ｎ＝３のときは、各中心点の座標を３で除することにより、各中心点の座標を結んでなる三角形の図心として得られる。Ｎ≧４のときは、各中心を結んでなるＮ角形を（Ｎ－２）個の三角形に分割し、それぞれの三角形の面積ｓ_ｎに三角形の図心座標ｇｘ_ｎ（ｇｙ_ｎ）を乗じたものを合計し、Ｎ角形の全面積で割ることにより得られる。すなわち

【0032】

【数6】

【0033】

【数7】

【0034】

となる。第１塗布液Ａを全て覆うよう、第１仮想曲線Ａ’の第１仮想寸法ｒ_１ｖが求められる。第１仮想寸法ｒ_１ｖは、図６のように最も第１図心Ｇ１から離れたたとえばｎ＝３およびｎ＝Ｎの第１塗布液Ａが第１仮想曲線Ａ’の円形に内接するときの第１仮想曲線Ａ’の（円形の）寸法として求められる。すなわち第１仮想曲線Ａ’は、複数の第１塗布液Ａのうち最も第１図心Ｇ１から見て外側にあり、それと内接することにより他の第１塗布液Ａと内接するよりも寸法が大きくなる（最大寸法を生じる）ように形成される。つまり第１塗布液の寸法ｒ_１ｎと第１仮想曲線Ａ’の第１仮想寸法ｒ_１ｖとの間には、
（数８）ｒ_１ｖ≧ｒ_１ｎ・・・（８）
の関係が成り立ち、特に第１塗布液Ａが１個の場合は上記の式（８）は等式となる。

【0035】

また第１図心Ｇ１と、ｎ＝３（３個目）であり寸法がｒ_１３の第１塗布液Ａ（第１仮想曲線Ａ’に内接）の中心との距離Ｌ１は、
（数９）Ｌ１＝ｒ_１ｖ－ｒ_１３・・・（９）
となる。

【0036】

なお図６のように、単一の第１仮想曲線Ａ’内における複数の第１塗布液Ａ間の配置状態は、図５中の（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）のいかなる態様であってもよい。すなわち（次に述べる）第２塗布液Ｂが覆う複数の第１塗布液Ａ同士は、互いに離れていてもよいし、一方が他方の内部に収まってもよいし、部分的に交わるように配置されてもよい。

【0037】

このようにして形成された第１仮想曲線Ａ’の第１仮想寸法ｒ_１ｖよりも、第２塗布液Ｂの第２寸法ｒ_２ｍの方が大きい。先述した通り、第２塗布液Ｂの第２寸法は、中心（図心）から外縁までの寸法の最大値を意味する。そのことを図７に示す。図７は、第１仮想曲線と第２塗布液との関係を示す概略図である。図７および図４中の（Ｃ）を参照して、第２塗布液Ｂは第１仮想曲線Ａ’の全体を覆うように供給される。また第２塗布液Ｂは第１仮想曲線Ａ’を内接せずにその全体が第２塗布液Ｂと重なるように供給される。このため、Ｍ個の中から選ばれたｍ個目の第２塗布液Ｂの寸法をｒ_２ｍ（１≦ｍ≦Ｍ）とすれば、当然に
（数１０）ｒ_２ｍ＞ｒ_１ｖ・・・（１０）
が成り立つ。また図７において第１図心Ｇ１と、寸法がｒ_２ｍの第２塗布液Ｂの中心との距離Ｌ２は、
（数１１）Ｌ２＜ｒ_２ｍ－ｒ_１ｖ・・・（１１）
で表される。

【0038】

なお、第１仮想寸法ｒ_１ｖよりも大きい寸法ｒ_１ｖ’＝α×ｒ_１ｖ（α＞１．０）を基準寸法とし、当該基準寸法ｒ_１ｖ’よりも大きくなるように第２塗布液Ｂの第２寸法ｒ_２ｍが決定されてもよい。αは１．１以上であることがより好ましい。αを大きくすれば、第１塗布液Ａと第２塗布液Ｂとの外縁同士の隙間を広くできる。このことと、第２寸法ｒ_２ｍが第１仮想寸法ｒ_１ｖ（上記のα＝１．０）よりも大きくなるように決定されることとを全てまとめれば、第１仮想寸法ｒ_１ｖ以上の基準寸法ｒ_１ｖ’よりも、第２寸法ｒ_２ｍの方が大きい。

【0039】

図８は、第１塗布液と第２塗布液との位置関係の第１例を示す概略図である。図８を参照して、たとえば（Ａ）のように、第１塗布液Ａが第２塗布液Ｂに内接することなくその内側に完全に収まるように第２塗布液Ｂに覆われてもよい。あるいは（Ｂ）のように、第１塗布液Ａが第２塗布液Ｂに外接することも重なることもなく第２塗布液Ｂの外側に完全に外れてもよい。（Ｂ）の場合には、第１塗布液Ａは図示される第２塗布液Ｂの左側に存在する図示されない他の第２塗布液に内接しないように完全に覆われる。

【0040】

図８各図の第１塗布液Ａ、第２塗布液Ｂはいずれも１個以上の中から選択された任意のものである。このため、ｎ番目の第１塗布液Ａの中心とｍ番目の第２塗布液の中心との距離をＤ_ｎ，ｍとすれば、（Ａ），（Ｂ）いずれの場合も当然に
（数１２）ｒ_２ｍ＞ｒ_１ｎ・・・（１２）
が成り立つ。その上で、（Ａ）の場合には
（数１３）Ｄ_ｎ，ｍ＜ｒ_２ｍ－ｒ_１ｎ・・・（１）
が成り立つ。また（Ｂ）の場合には
（数１４）Ｄ_ｎ，ｍ＞ｒ_２ｍ＋ｒ_１ｎ・・・（２）
が成り立つ。上記の式（１）と（２）とのいずれかが成立するように、第２塗布液Ｂが供給される。

【0041】

図９は、第１塗布液と第２塗布液との位置関係の第２例を示す概略図である。図９を参照して、本実施の形態では、第２塗布液Ｂに内接、外接のいずれもしないように第１塗布液Ａが配置されればよい。図９では、左側の第１塗布液Ａ１、右側の第１塗布液Ａ２のいずれも第２塗布液Ｂ１，Ｂ２のいずれとも内接、外接しない。このため図９のように、第２塗布液Ｂ１と第２塗布液Ｂ２とが部分的に重なってもよい。図９の場合、第１塗布液Ａ１と第２塗布液Ｂ１との間には式（１）が成立し、第１塗布液Ａ１と第２塗布液Ｂ２との間には式（２）が成立する。また第１塗布液Ａ２と第２塗布液Ｂ２との間には式（１）が成立し、第１塗布液Ａ２と第２塗布液Ｂ１との間には式（２）が成立する。

【0042】

図１０は、２個の第２塗布液の配置関係を示す概略図である。図１０を参照して、Ｍ個（Ｍは２以上の自然数）のうち任意に選択された２個の第２塗布液Ｂのそれぞれの寸法をｒ_２ｍ、ｒ_{２（ｍ＋１）}とする。２個の第２塗布液Ｂのそれぞれの中心（図心）間の距離をｐ_{ｍ，ｍ＋１}とする。このとき２個の第２塗布液の配置関係は、図１０中の（Ａ）のように互いに重ならない場合と、（Ｂ）のように一方が他方の内部に完全に収まる場合と、（Ｃ）のように両者が部分的に重なる場合とがある。（Ａ）には両者が互いに外接する場合を含む。（Ｂ）には一方が他方に内接する場合を含む。

【0043】

図１０中の（Ａ）の場合には以下の式（１３）が、（Ｂ）の場合には以下の式（１４）が、（Ｃ）の場合には以下の式（１５）が、それぞれ成立する。式（１３）中の等号は図１０の（Ａ）にて２つの第２塗布液Ｂが互いに外接する場合である。式（１４）中の等号は図１０の（Ｂ）にて一方の第２塗布液Ｂが他方に内接する場合である。式（１５）にてｒ_２ｍ＝ｒ_{２（ｍ＋１）}であれば、ｐ_{ｍ，ｍ＋１}＜ｒ_２ｍ＋ｒ_{２（ｍ＋１）}のみ成立する。

【0044】

（数１５）ｐ_{ｍ，ｍ＋１}≧ｒ_２ｍ＋ｒ_{２（ｍ＋１）}・・・（１３）
（数１６）ｐ_{ｍ，ｍ＋１}≦ｒ_{２（ｍ＋１）}－ｒ_２ｍ・・・（１４）
（数１７）ｒ_{２（ｍ＋１）}－ｒ_２ｍ＜ｐ_{ｍ，ｍ＋１}＜ｒ_２ｍ＋ｒ_{２（ｍ＋１）}・・・（１５）
次に第２塗布液Ｂと、これらが供給されるウェル１２との寸法の関係を考える。第２塗布液Ｂはすべて同一（単一）のウェル１２内に供給される。図１１は、第２塗布液と、これを覆う第２仮想曲線との中心、寸法、位置の関係を示す概略図である。図１１および図４中の（Ｄ）を参照して、第２仮想曲線Ｂ’は、第２塗布液Ｂを供給すべきウェル１２の寸法を決めるために用いられる仮想の図形（たとえば円形）である。ウェル１２内に供給されるＭ個の第２塗布液Ｂのそれぞれの中心（図心）から、それらＭ個の第２塗布液Ｂ全体の図心が、第２仮想曲線Ｂ’の第２図心Ｇ２として求められる。

【0045】

たとえば図１１に示すように、Ｍ個の第２塗布液Ｂのそれぞれをｍ＝１，２，・・・，Ｍとする。なお第２塗布液Ｂの中心位置の測定方法は第１塗布液Ａと同様である。

【0046】

１個目の第２塗布液Ｂの中心の位置座標を（ｘ_１，ｙ_１）とし、同様にＭ個目の第２塗布液Ｂの中心を（ｘ_Ｍ，ｙ_Ｍ）とする。この中心位置（中心の座標）は、第２塗布液Ｂが円形または楕円形の場合には当該第２塗布液Ｂの図心の座標に等しい。当該中心の座標は、塗布装置の制御部に含まれるモニタ９の出力などから求められる。このとき第２図心Ｇ２の座標（Ｘ_２，Ｙ_２）は、Ｍ＝３のときは、各中心点の座標を３で除することにより、各中心点の座標を結んでなる三角形の図心として得られる。Ｍ≧４のときは、各中心を結んでなるＭ角形を（Ｍ－２）個の三角形に分割し、それぞれの三角形の面積ｓ_ｍに三角形の図心座標ｇｘ_ｍ（ｇｙ_ｍ）を乗じたものを合計し、Ｍ角形の全面積で割ることにより得られる。すなわち

【0047】

【数18】

【0048】

【数19】

【0049】

となる。Ｍ個の第２塗布液Ｂを全て覆うよう、第２仮想曲線Ｂ’の第２仮想寸法ｒ_２ｖが求められる。第２仮想寸法ｒ_２ｖは、図１１のように最も第２図心Ｇ２から離れたたとえばｍ＝３およびｍ＝Ｍの第２塗布液Ｂが第２仮想曲線Ｂ’の円形に内接するときの第２仮想曲線Ｂ’の（円形の）寸法として求められる。すなわち第２仮想曲線Ｂ’は、複数の第２塗布液Ｂのうち最も第２図心Ｇ２から見て外側にあり、それと内接することにより他の第２塗布液Ｂと内接するよりも寸法が大きくなる（最大寸法を生じる）ように形成される。つまり第２塗布液の寸法ｒ_２ｍと第２仮想曲線Ｂ’の第２仮想寸法ｒ_２ｖとの間には、
（数２０）ｒ_２ｖ≧ｒ_２ｍ・・・（１８）
の関係が成り立ち、特に第２塗布液Ｂが１個の場合は上記の式（１８）は等式となる。

【0050】

また第２図心Ｇ２と、ｍ＝３（３個目）であり寸法がｒ_２３の第２塗布液Ｂ（第２仮想曲線Ｂ’に内接）の中心との距離Ｌ２は、
（数２１）Ｌ２＝ｒ_２ｖ－ｒ_２３・・・（１９）
となる。

【0051】

なお図１１のように、第２仮想曲線Ｂ’内における複数の第２塗布液Ａ間の配置状態は、図１０中の（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）のいかなる態様であってもよい。すなわち（次に述べる）ウェル１２内に供給される複数の第２塗布液Ｂ同士は、互いに離れていてもよいし、一方が他方の内部に収まってもよいし、部分的に交わるように配置されてもよい。

【0052】

このようにして形成された第２仮想曲線Ｂ’の第２仮想寸法ｒ_２ｖよりも、ウェル１２の第３寸法ｒ_３の方が大きい。そのことを図１２に示す。図１２は、第２仮想曲線とウェルとの関係を示す概略図である。図１２および図４中の（Ｅ）を参照して、ウェル１２は第２仮想曲線Ｂ’を内接することなく収納する。このため、ウェル１２の寸法をｒ_３とすれば、当然に
（数２２）ｒ_３＞ｒ_２ｖ・・・（２０）
が成り立つ。また図１２において第２図心Ｇ２と、寸法がｒ_３のウェル１２の中心との距離Ｌ３は、
（数２３）Ｌ３＜ｒ_３－ｒ_２ｖ・・・（２１）
で表される。

【0053】

なお、第２仮想寸法ｒ_２ｖよりも大きい寸法ｒ_２ｖ’＝β×ｒ_２ｖ（β＞１．０）を基準寸法とし、当該基準寸法ｒ_２ｖ’よりもウェル１２の第３寸法ｒ_３の方が大きくなってもよい。βは１．１以上であることがより好ましい。βを大きくすれば、第２塗布液Ｂの外縁とウェル１２の内壁面との隙間を広くできる。このことと、第３寸法ｒ_３が第２仮想寸法ｒ_２ｖ（上記のβ＝１．０）よりも大きいこととを全てまとめれば、第２仮想寸法ｒ_２ｖ以上の基準寸法ｒ_２ｖ’よりも、第３寸法ｒ_３の方が大きい。

【0054】

（作用効果）
本実施の形態に係る細胞組織の製造方法では、塗布対象物としてのウェル１２内に第１塗布液ＡがＮ個（Ｎ≧１の自然数）供給され、細胞が配置される。Ｎ個の第１塗布液Ａのうち少なくとも１個を覆うように、ウェル１２内に第２塗布液ＢがＭ個（Ｍ≧１の自然数）供給される。第２塗布液Ｂを供給する工程においては、Ｎ個の第１塗布液Ａのそれぞれの中心から外縁までの寸法の最大値である第１寸法をｒ_１ｎ（１≦ｎ≦Ｎの自然数）、Ｍ個の第２塗布液Ｂのそれぞれの中心から外縁までの寸法の最大値である第２寸法をｒ_２ｍ（１≦ｍ≦Ｍの自然数）とし、Ｎ個の中から選択された任意の第１寸法がｒ_１ｎの第１塗布液Ａの中心と、Ｍ個の中から選択された任意の第２寸法がｒ_２ｍの第２塗布液Ｂの中心との距離をＤ_ｎ，ｍとすれば、任意の第１塗布液Ａと任意の第２塗布液Ｂとの間で
（数２４）Ｄ_ｎ，ｍ＜ｒ_２ｍ－ｒ_１ｎ・・・（１）
および
（数２５）Ｄ_ｎ，ｍ＞ｒ_２ｍ＋ｒ_１ｎ・・・（２）
のいずれかが成立するように供給される。

【0055】

式（１）が成立すれば、図８中の（Ａ）のように、第１塗布液Ａは第２塗布液Ｂと内接することなく収納される。このため第２塗布液Ｂを第１塗布液Ａ上に滴下する際における第１塗布液Ａの崩壊が抑制できる。式（２）が成立すれば、図８中の（Ｂ）のように、第１塗布液Ａは第２塗布液Ｂと全く接触しないため、第２塗布液Ｂを第１塗布液Ａ上に滴下する際における第１塗布液Ａの崩壊が抑制できる。このため寸法および中心位置を考慮しつつ塗布液を高い位置精度で供給することにより、小スケールかつハイスループットで作用を再現性高く高精度に評価可能な細胞組織の製造方法を提供できる。

【0056】

上記細胞組織の製造方法において、Ｎ個の第１塗布液Ａのうち第２塗布液Ｂと重なる１個以上の第１塗布液Ａの第１図心Ｇ１を中心とし１個以上の第１塗布液Ａを全て覆い１個以上の第１塗布液Ａのいずれかと内接するよう求められた第１仮想曲線Ａ’の最大寸法である第１仮想寸法ｒ_１ｖ以上の基準寸法よりも、第２寸法ｒ_２ｍの方が大きい。第１図心Ｇ１は、第２塗布液Ｂと重なる１個以上の第１塗布液Ａのそれぞれの中心位置から求められる。

【0057】

いずれかの第１塗布液Ａと第１仮想曲線Ａ’とが内接し得る最大寸法が第１仮想寸法ｒ_１ｖであるため、それよりも第２寸法ｒ_２ｍを大きくすれば、第１塗布液Ａと重なる第２塗布液Ｂは第１塗布液Ａと内接しない。このため第２塗布液Ｂを第１塗布液Ａ上に滴下する際における第１塗布液Ａの崩壊が抑制できる。

【0058】

上記細胞組織の製造方法において、Ｍ個の第２塗布液Ｂの第２図心Ｇ２を中心とし、Ｍ個の第２塗布液Ｂを全て覆いＭ個の第２塗布液のいずれかと内接するよう求められた第２仮想曲線Ｂ’の最大寸法である第２仮想寸法ｒ_２ｖ以上の基準寸法よりも、ウェル１２の第３寸法ｒ_３の方が大きい。第２図心Ｇ２は、Ｍ個の第２塗布液Ｂのそれぞれの中心位置から求められる。

【0059】

いずれかの第２塗布液Ｂと第２仮想曲線Ｂ’とが内接し得る最大寸法が第２仮想寸法ｒ_２ｖであるため、それよりも第３寸法ｒ_３を大きくすれば、第２塗布液Ｂはウェル１２の内壁面に付着しない。このため第２塗布液Ｂを第１塗布液Ａ上に滴下する際における第１塗布液Ａの崩壊が抑制できる。

【0060】

（塗布液供給方法の変形例）
本実施の形態の細胞組織の製造方法において、図１、図２の塗布装置を用いて上記の塗布工程（塗布液の供給）を行なう場合、第１塗布液Ａを供給する工程において塗布針方式が用いられる。これにより、第１塗布液Ａをウェル１２内に微小量、すなわち非常に小さい寸法となるように塗布することができる。また塗布針方式によれば、第１塗布液Ａが高粘度であっても塗布可能である。

【0061】

上記細胞組織の製造方法では、第２塗布液Ｂを供給する工程において、塗布針方式、インクジェット方式、ディスペンサ方式、レーザープリント方式、ピペット方式からなる群から選択されるいずれかが用いられてもよい。第２塗布液Ｂの粘度が高い（高粘度溶液である）場合には、塗布針方式が用いられてもよい。ただし第２塗布液Ｂは塗布針方式以外の、インクジェット方式、ディスペンサ方式、レーザープリント方式、ピペット方式が用いられることにより、第２塗布液Ｂは滴下により第１塗布液Ａ上に供給される。このためたとえば塗布針を有する塗布装置の第２塗布液Ｂを収納する塗布材料容器内に、第１塗布液Ａが混入し汚染されるなどの不具合を抑制できる。

【0062】

上記細胞組織の製造方法では、第２塗布液ＢをＭ個供給する工程において、Ｍ個のうち少なくとも１個の第２塗布液Ｂは塗布針方式、インクジェット方式、ディスペンサ方式、レーザープリント方式、ピペット方式からなる群から選択される第１方式により供給され、Ｍ個のうち少なくとも１個とは異なる他の第２塗布液Ｂは第１方式とは異なる第２方式により供給されてもよい。つまり第１塗布液Ａは塗布針方式により、第２塗布液Ｂはインクジェット方式により供給されてもよい。あるいは第１塗布液Ａは塗布針方式により、第２塗布液Ｂはディスペンサ方式により供給されてもよい。このように、塗布される塗布液の性質および順序に応じて適宜好ましい方式を用いることで、塗布工程の効率および形成される塗布液の品質を高めることができる。

【0063】

なお塗布針方式以外の方式を用いる場合には、図１、図２の塗布装置に、方式に応じたインクジェット方式用の装置、ディスペンサ方式用の装置等が組み合わされることが好ましい。あるいはたとえば第１塗布液Ａが塗布針方式、第２塗布液Ｂがディスペンサ方式により供給される場合、第１塗布液Ａは図１、図２の塗布装置により供給され、第２塗布液Ｂはこれとは異なるディスペンサ方式用の塗布装置により供給されてもよい。さらに、たとえば図１、図２の塗布装置においては単一の塗布機構４のみを有するが、複数の塗布機構４を有する塗布装置が用いられることにより、複数の塗布液のすべてが単一の塗布装置内の異なる塗布機構４により供給されてもよい。

【0064】

（細胞組織）
形成される細胞組織の第１例は次の通りである。第１塗布液Ａは培養すべき細胞とゲル化剤とを含み、第２塗布液Ｂは高粘度溶液である。高粘度溶液とはゲル化剤よりも粘度の高い溶液である。これにより、ウェル１２内への第２塗布液Ｂおよび培地の添加時に第１塗布液の保形性が向上するという効果が得られる。さらに細胞組織としては、コラーゲンゲルのスキャホールドを含む細胞組織を構築することができる効果が得られる。具体的には、第１塗布液Ａとして、細胞と、ゲル化剤としてのコラーゲン溶液とを混合したものが準備され、ウェル１２内に供給される。第２塗布液Ｂとして、コラーゲン溶液よりも粘度が高いメチルセルロースが用いられ、第１塗布液Ａを覆うように供給される。さらに、ウェル１２内の第１塗布液Ａおよび第２塗布液Ｂの上に培地を滴下することにより、細胞組織が形成される。細胞組織においては、培地の中に第１塗布液Ａおよび第２塗布液Ｂが浸漬される。

【0065】

上記細胞組織は、たとえば３７℃、５％ＣＯ_２の環境下で培養される。これによりコラーゲン溶液がゲル化し、塗布した組織がウェル１２内に固定される。また、第２塗布液Ｂとしての高粘度溶液は培地交換をすることにより除去が可能である。

【0066】

形成される細胞組織の第２例は次の通りである。第１塗布液Ａは培養すべき細胞を含み、第２塗布液Ｂはゲル化剤を含む。これにより、ゲル化剤は第１塗布液Ａと第２塗布液Ｂとの界面でゲル化し、ゲルドーム内にスキャホールドフリーの細胞組織を形成することができるという効果が得られる。具体的には、第１塗布液Ａとして、細胞と、ゲル化開始剤であるトロンビンと、高粘度高分子であるヒアルロン酸ナトリウムとが混合される。ゲル化剤であるフィブリノゲンを含有する第２塗布液Ｂが第１塗布液Ａを覆うように滴下される。これにより第１塗布液Ａと第２塗布液Ｂとの界面がゲル化され、いわゆるゲルドームが形成される。やがて第２塗布液Ｂは全体がゲル化される。ゲルドーム内で第１塗布液Ａ内の細胞が沈殿することで、細胞組織が形成される。その後、第１例と同様に培地が滴下され、第１例と同様の環境下で培養される。第１塗布液Ａを供給する工程以降にゲル化剤を用いて、ウェル１２内に供給された細胞から細胞組織が形成される。ただし仮に第１塗布液Ａにフィブリノゲンが含まれれば、ゲルドームは形成されない。

【0067】

以上をまとめると、第１塗布液Ａおよび第２塗布液Ｂの少なくともいずれかに、ゲル化剤としてのコラーゲンとフィブリノゲンとの少なくともいずれかが含まれる。つまり第１塗布液Ａおよび第２塗布液Ｂの少なくともいずれかに、ゲル化剤としてのコラーゲンとフィブリノゲンとの一方が含まれてもよい。あるいは上記しないが、第１塗布液Ａおよび第２塗布液Ｂの少なくともいずれかに、ゲル化剤としてのコラーゲンとフィブリノゲンとの双方が含まれてもよい。

【0068】

（ゲル化剤について）
上記の細胞組織の第２例のように、本実施の形態において、２液混合方式によりウェル１２内に第１塗布液Ａおよび第２塗布液Ｂが供給されてもよい。なお２液混合方式とは、第１塗布液と第２塗布液との双方がゲル化剤およびゲル化開始剤の少なくともいずれかを含むことである。すなわち第１塗布液Ａは細胞とゲル化開始剤とを含み、第２塗布液Ｂはゲル化剤を含んでもよい。この場合、スキャホールドフリーの細胞組織を構築することができる。第１塗布液Ａは細胞とゲル化剤とを含み、第２塗布液Ｂはゲル化開始剤を含んでもよい。この場合、スキャホールドを含む細胞組織を構築することができる。あるいは第１塗布液Ａと第２塗布液Ｂとの双方がゲル化剤を含んでもよい。

【0069】

ゲル化剤は特に限定されるものではなく、２液混合方式に用いられるゲル化剤の他に、温度応答性のゲル化剤を用いることができる。たとえばゲル化剤に、タンパク質、糖鎖、天然高分子、合成高分子、ペプチド等が含まれてもよい。より具体的には、ゲル化剤に、コラーゲン、フィブリノゲン、ゼラチン、ＧｅｌＭＡ、アルギン酸ナトリウム、ポリアミノ酸、ポリエチレングリコール、感熱応答性高分子、マトリゲル等が含まれてもよい。また、上記のゲル化剤から適宜選ばれた複数種を組み合わせて細胞組織を構築することができる。

【0070】

２液混合方式においてゲル化剤が用いられる場合、ゲル化剤に対応したゲル化開始剤が含まれる必要がある。たとえば、ゲル化剤がフィブリノゲンであればゲル化開始剤はトロンビンが用いられる。またゲル化剤がアルギン酸ナトリウムであればゲル化開始剤は塩化カルシウムである。

【0071】

ゲル化剤よりも粘度の高い高粘度溶液は特に限定されるものではない。具体的には、高粘度溶液は、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシブチルセルロース、セルロースナノファイバーからなる群から選択されるいずれかが用いられる。また、上記の高粘度溶液から適宜選ばれた複数種を組み合わせて用いることができる。

【0072】

（ゲル化剤以外の材料について）
本実施の形態で使用できる細胞は特に限定されるものではない。ただし当該細胞は、たとえば心筋細胞、神経細胞、肝細胞、癌細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞からなる群から選択されるいずれかであってもよい。より詳しくは、当該細胞は、心筋細胞、神経細胞、肝細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞、表皮細胞、平滑筋細胞、消化管細胞、腎細胞、膵細胞などの各種初代細胞、幹細胞由来（ｉＰＳおよびＥＳ等）の分化細胞、および各種癌細胞等のうちのいずれかであってもよい。

【0073】

細胞は、疾患様のものであるか、正常様のものであるかを問わず、複数の細胞を混合したものが培養されてもよい。つまり、Ｎ個の第１塗布液Ａのうち１個の第１塗布液Ａ中に、細胞として、第３細胞と、当該第３細胞とは異なる第４細胞とが含まれるように共培養されてもよい。第３細胞は次に述べる第１細胞と同一でもよいし異なってもよい。第４細胞は次に述べる第２細胞と同一でもよいし異なってもよい。

【0074】

第１塗布液Ａ中に含まれる細胞の体積の割合を第１塗布液Ａの細胞体積濃度とする。つまり細胞体積濃度は、第１塗布液Ａ全体の体積に対する細胞の体積の割合を示すものである。第１塗布液Ａの細胞体積濃度は０．００１ｖｏｌ％以上５０ｖｏｌ％以下であることが好ましい。本明細書では細胞体積濃度は体積百分率（単位ｖｏｌ％）で表記される。たとえば５０ｖｏｌ％は５０ｖ／ｖ％に等しい。また５０ｖｏｌ／％は体積の割合が５０％であることとも等しい。このため体積百分率は単位ｖ／ｖ％で表記されてもよい。あるいは体積百分率は本明細書では単位％で表記されてもよい。つまり単位ｖｏｌ％で表される体積百分率の数値は、単位ｖ／ｖ％で表される体積百分率の数値、および単位％で表される百分率の数値に等しい。上記の中でも第１塗布液Ａの細胞体積濃度は１ｖｏｌ％以上３０ｖｏｌ％以下であることがより好ましい。その中でも第１塗布液Ａの細胞体積濃度は２５ｖｏｌ％であることが最も好ましい。

【0075】

ウェル１２内に第１塗布液ＡがＮ個（Ｎ≧２の自然数）供給されるとき、ウェル１２内に供給されるＮ個の第１塗布液Ａのうち少なくとも１個に細胞が含まれ、上記少なくとも１個とは異なる他の少なくとも１個の第１塗布液Ａには細胞を含まずサイトカイン、薬剤、ＥＣＭおよび添加因子からなる群から選択される少なくともいずれかが含まれてもよい。つまり第１塗布液Ａにサイトカイン、ＥＣＭおよび添加因子からなる群から選択される少なくともいずれかが含まれてもよいし、これらのうち複数が混合されてもよい。上記サイトカイン、薬剤、ＥＣＭ、添加因子は、少なくとも１個の第１塗布液Ａに含まれる細胞に作用する。

【0076】

さらに、１つのウェル１２内に第１塗布液Ａを複数個塗布する場合に、たとえばそのうちの１個が心筋細胞であり、他の１個が癌細胞であるように、第１塗布液Ａ間で異なる種類の細胞が含まれてもよい。あるいは複数個の第１塗布液Ａのうちの１個に心筋細胞が含まれ、他の１個にも同種の心筋細胞が含まれてもよい。つまりウェル１２内に供給されるＮ個の第１塗布液Ａのうち少なくとも１個に含まれる細胞は第１細胞であり、少なくとも１個とは異なる他の少なくとも１個の第１塗布液Ａに含まれる細胞は第２細胞である。第２細胞は第１細胞と同種でも異種でもよい。なお、第１細胞または第２細胞を含む第１塗布液Ａには、フィブロネクチン、ゼラチン、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、マトリゲルなどの細胞外マトリックス成分、線維芽細胞増殖因子、血小板由来成長因子などの細胞増殖因子等の添加剤が含まれてもよい。これにより、当該第１塗布液Ａに内包される細胞が安定して接着および増殖できる環境が与えられる。

【0077】

培地は特に限定されるものではない。培地として、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、Ｍ１９９、ＭＥＭからなる群から選択されるいずれかを用いることができる。培地には、抗生物質、ＦＢＳ、各種成長因子等、特に限定されるものではなく種々の添加物を添加できる。また培地と第２塗布液Ｂとは同じ溶液を使用することができる。ただし培地と第２塗布液Ｂとに同じ溶液を用いる場合には、培地は高粘度溶液とする必要がある。

【0078】

培地を滴下する位置は、第２塗布液Ｂの中心と平面的に重なる位置であることが好ましいが、これに限られない。培地は第２塗布液Ｂと同じ溶液としてもよい。ただし培地を形成するための溶液は第２塗布液Ｂとは独立に、第２塗布液Ｂを浸漬するように供給される。

【0079】

さらに、たとえば上記の細胞組織の第１例または第２例において、第１塗布液Ａおよび第２塗布液Ｂの少なくともいずれかに増粘多糖類が混合されてもよい。増粘多糖類として、具体的にはアルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシブチルセルロース、セルロースナノファイバーからなる群から選択されるいずれかが用いられてもよい。増粘多糖類の混合により、第１塗布液Ａの保形性の向上という効果が得られる。

【実施例0080】

第１塗布液Ａが１個のみ形成され、ゲル化剤が第１塗布液Ａに含まれる実施例について説明する。

【0081】

第１塗布液として、ｉＰＳ心筋細胞（iCell cardiomyocyte2）と心臓線維芽細胞とが４：１の個数比で含まれたものに、１．０５ｍｇ／ｍＬのコラーゲン溶液が混合されたものが用いられた。ｉＰＳ心筋細胞と心臓線維芽細胞とが４：１の個数比で含まれたものの細胞体積濃度は２５ｖｏｌ％であった。第２塗布液として、溶液１００ｍＬ中に０．７５ｇのメチルセルロースが溶解され、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンを含むＰＢＳ（＋）の溶液が用いられた。培地として、iCell播種培地が用いられた。塗布対象物は、９６個のウェル１２を有する試料塗布セット１１（図３参照。９６ウェルプレートと称する）に含まれる１つのウェル１２が用いられた。９６ウェルプレートの直径６．５ｍｍの円形のウェルの中心に、針径が７００μｍの塗布針を用いて、第１塗布液が供給された。第１塗布液の中心の真上に、直径４．５ｍｍの第２塗布液が、ディスペンサにより滴下された。さらに、ピペットを用いて、１００μＬの培地が、第１塗布液および第２塗布液の上に滴下された。

【0082】

図１３は、実施例１における位相差顕微鏡像である。図１３を参照して、第１塗布液が崩壊することなく組織を形成できた。なお、本実施例における上記の各パラメータの数値は以下の通りであり、上記の数式を全て満足する。
ｒ_１１＝ｒ_１ｖ＝０．７ｍｍ、Ｌ１＝０ｍｍ、ｒ_２１＝ｒ_２ｖ＝４．５ｍｍ、Ｌ２＝０ｍｍ、Ｄ_ｎ，ｍ＝０ｍｍ、ｒ_３＝６．５ｍｍ、Ｌ３＝０ｍｍ。

【実施例0083】

第１塗布液Ａが１個のみ形成され、ゲル化剤が第２塗布液Ｂに含まれる実施例について説明する。

【0084】

第１塗布液として、ｉＰＳ心筋細胞（iCell cardiomyocyte2）と心臓線維芽細胞とが４：１の個数比で含まれたものに、３ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウム溶液と、２６０unit／ｍＬのトロンビン溶液とが混合されたものが用いられた。ｉＰＳ心筋細胞と心臓線維芽細胞とが４：１の個数比で含まれたものの細胞体積濃度は１０ｖｏｌ％であった。第２塗布液として、５ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸ナトリウム溶液と、５ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲン溶液とが混合され、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンを含むＰＢＳ（＋）の溶液が準備された。培地として、iCell播種培地が用いられた。塗布対象物は、９６ウェルプレートの１つのウェルが用いられた。９６ウェルプレートの直径６．５ｍｍの円形のウェルの中心に、針径が７００μｍの塗布針を用いて、第１塗布液が供給された。第１塗布液の中心の真上に、直径３．５ｍｍの第２塗布液が、ディスペンサにより滴下された。さらに、ピペットを用いて、１００μＬの培地が、第１塗布液および第２塗布液の上に滴下された。

【0085】

図１４は、実施例２における位相差顕微鏡像である。図１４を参照して、第１塗布液が崩壊することなく組織を形成できた。なお、本実施例における上記の各パラメータの数値は以下の通りであり、上記の数式を全て満足する。
ｒ_１１＝ｒ_１ｖ＝０．７ｍｍ、Ｌ１＝０ｍｍ、ｒ_２１＝ｒ_２ｖ＝３．５ｍｍ、Ｌ２＝０ｍｍ、Ｄ_１，１＝０ｍｍ、ｒ_３＝６．５ｍｍ、Ｌ３＝０ｍｍ。