特開 2024-48692 糖類含有化合物の処理方法及び糖類含有化合物の分析方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024048692

(43)【公開日】2024-04-09

(54)【発明の名称】糖類含有化合物の処理方法及び糖類含有化合物の分析方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/32 20060101AFI20240402BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240402BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20240402BHJP

   C07K 2/00 20060101ALI20240402BHJP

【ＦＩ】

C07K1/32

G01N33/53 V

G01N33/53 S

G01N33/543 541A

C07K2/00

【審査請求】未請求

【請求項の数】12

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022154753

(22)【出願日】2022-09-28

(71)【出願人】

【識別番号】000002141

【氏名又は名称】住友ベークライト株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100165179

【弁理士】

【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡

(74)【代理人】

【識別番号】100194250

【弁理士】

【氏名又は名称】福原 直志

(74)【代理人】

【識別番号】100181722

【弁理士】

【氏名又は名称】春田 洋孝

(74)【代理人】

【識別番号】100140718

【弁理士】

【氏名又は名称】仁内 宏紀

(72)【発明者】

【氏名】金安 美雨

(72)【発明者】

【氏名】豊田 雅哲

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA20

4H045BA10

4H045BA53

4H045GA20

(57)【要約】

【課題】目的の糖タンパク質から生じた糖類含有化合物の処理方法および分析方法を提供する。
【解決手段】糖タンパク質を含む混合試料に抗体固定化担体を接触させ、前記抗体固定化担体に前記糖タンパク質を吸着させる工程と、前記混合試料から前記糖タンパク質を吸着させた前記抗体固定化担体を分離し、分離した前記抗体固定化担体に遊離試薬を含む液体を添加して前記糖タンパク質から遊離させた糖類含有化合物を含む混合液とし、前記混合液に精製剤を接触させて前記精製剤に前記糖類含有化合物を吸着させる工程と、前記混合液から分離した前記精製剤を、水を含む溶液に接触させ、前記精製剤から前記水に前記糖類含有化合物を溶出させる工程と、を含み、前記精製剤は、ベタイン構造を有するポリマー、又は前記ポリマーと前記ポリマーを担持する支持体とを有する複合体の少なくともいずれか一方を含有する、糖類含有化合物の処理方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

糖タンパク質を含む混合試料に抗体固定化担体を接触させ、前記抗体固定化担体に前記糖タンパク質を吸着させる工程と、
前記混合試料から前記糖タンパク質を吸着させた前記抗体固定化担体を分離し、分離した前記抗体固定化担体に遊離試薬を含む液体を添加して前記糖タンパク質から遊離させた糖類含有化合物を含む混合液とし、前記混合液に精製剤を接触させて前記精製剤に前記糖類含有化合物を吸着させる工程と、
前記混合液から分離した前記精製剤を、水を含む溶液に接触させ、前記精製剤から前記水に前記糖類含有化合物を溶出させる工程と、を含み、
前記精製剤は、ベタイン構造を有するポリマー、又は前記ポリマーと前記ポリマーを担持する支持体とを有する複合体の少なくともいずれか一方を含有する、糖類含有化合物の処理方法。

【請求項2】

前記混合液は、０．０１体積％～２０体積％の水を含む、請求項１に記載の糖類含有化合物の処理方法。

【請求項3】

前記ベタイン構造はアニオン基と、カチオン基と、及び前記アニオン基と前記カチオン基とを連結するリンカーと、を有し、
前記アニオン基は、リン酸基、ホスホン酸基、カルボキシル基及びスルホン酸基からなる群より選択される基であり、
前記カチオン基は、４級アンモニウム基であり、
前記リンカーは炭素数１～４のアルキレン基である、請求項１に記載の糖類含有化合物の処理方法。

【請求項4】

前記アニオン基がリン酸基である請求項３に記載の糖類含有化合物の処理方法。

【請求項5】

前記ベタイン構造が、ホスホリルコリン基である請求項３に記載の糖類含有化合物の処理方法。

【請求項6】

前記支持体に固定された前記ポリマーの重量が、前記支持体の単位表面積（ｍ^２）当たり０．５ｍｇ～１．５ｍｇである請求項１に記載の糖類含有化合物の処理方法。

【請求項7】

前記支持体が、無機化合物を材料とする請求項６に記載の糖類含有化合物の処理方法。

【請求項8】

前記複合体の比重が、１．０５～３．００である、請求項６に記載の糖類含有化合物の処理方法。

【請求項9】

前記複合体は、形状が球状であり、平均粒径が０．５μｍ～１００μｍである、請求項６に記載の糖類含有化合物の処理方法。

【請求項10】

前記ポリマーが、（メタ）アクリル化合物に由来する繰り返し単位を含む請求項１に記載の糖類含有化合物の処理方法。

【請求項11】

前記抗体固定化担体が、磁性ビーズである、請求項１に記載の糖類含有化合物の処理方法。

【請求項12】

請求項１に記載の糖類含有化合物の処理方法と、
溶出させた前記糖類含有化合物を分析する工程と、を有する、糖類含有化合物の分析方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、糖類含有化合物の処理方法及び糖類含有化合物の分析方法に関する。

【背景技術】

【0002】

生体を構成するタンパク質の多くは、タンパク質を構成するアミノ酸の一部に糖鎖が結合した糖タンパク質として存在している。糖タンパク質は、細胞や生物の構造、免疫系、ホルモン、細胞間シグナル伝達等、生体内において、重要な役割を担っている。このような糖タンパク質の構造解析は、生命科学、医療、創薬等の種々の技術分野において、非常に重要視されており、検討されている。

【0003】

糖タンパク質の構造解析は、目的とする糖タンパク質をタンパク質混合溶液から分画する。さらに分画後の目的の糖タンパク質を消化酵素などによって分解し、生じる糖類や糖ペプチドを分析することによって行われる。構造解析の前処理段階として、目的の糖タンパク質を検出する方法が、特許文献１に記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２０１３-１５２１３２号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

特許文献１に記載された糖タンパク質または多糖類の検出方法を用いると、染色した薄膜上の糖タンパク質または多糖類を検出することができる。検出された糖タンパク質や多糖類の量が十分に確保できれば、糖タンパク質や多糖類を構成する糖類含有化合物について、構造決定等の分析を行うことが可能となる。しかしながら、上記方法では、目的の糖タンパク質が微量である場合に、分画後の目的の糖タンパク質から糖類含有化合物を回収することが困難であり、改善が求められていた。

【0006】

本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであって、目的の糖タンパク質から生じた糖類含有化合物の処理方法を提供することを目的とする。また、得られた糖類含有化合物の分析方法を提供することをあわせて目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記の課題を解決するため、本発明の一態様は、以下の態様を包含する。

【0008】

［１］糖タンパク質を含む混合試料に抗体固定化担体を接触させ、前記抗体固定化担体に前記糖タンパク質を吸着させる工程と、前記混合試料から前記糖タンパク質を吸着させた前記抗体固定化担体を分離し、分離した前記抗体固定化担体に遊離試薬を含む液体を添加して前記糖タンパク質から遊離させた糖類含有化合物を含む混合液とし、前記混合液に精製剤を接触させて前記精製剤に前記糖類含有化合物を吸着させる工程と、前記混合液から分離した前記精製剤を、水を含む溶液に接触させ、前記精製剤から前記水に前記糖類含有化合物を溶出させる工程と、を含み、前記精製剤は、ベタイン構造を有するポリマー、又は前記ポリマーと前記ポリマーを担持する支持体とを有する複合体の少なくともいずれか一方を含有する、糖類含有化合物の処理方法。

【0009】

［２］前記混合液は、０．０１体積％～２０体積％の水を含む、［１］に記載の糖類含有化合物の処理方法。

【0010】

［３］前記ベタイン構造はアニオン基と、カチオン基と、及び前記アニオン基と前記カチオン基とを連結するリンカーと、を有し、前記アニオン基は、リン酸基、ホスホン酸基、カルボキシル基及びスルホン酸基からなる群より選択される基であり、前記カチオン基は、４級アンモニウム基であり、前記リンカーは炭素数１～４のアルキレン基である、［１］又は［２］に記載の糖類含有化合物の処理方法。

【0011】

［４］前記アニオン基がリン酸基である［３］に記載の糖類含有化合物の処理方法。

【0012】

［５］前記ベタイン構造が、ホスホリルコリン基である［３］又は［４］に記載の糖類含有化合物の処理方法。

【0013】

［６］前記支持体に固定された前記ポリマーの重量が、前記支持体の単位表面積（ｍ^２）当たり０．５ｍｇ～１．５ｍｇである［１］～［５］いずれか１つに記載の糖類含有化合物の処理方法。

【0014】

［７］前記支持体が、無機化合物を材料とする［６］に記載の糖類含有化合物の処理方法。

【0015】

［８］前記複合体の比重が、１．０５～３．００である、［６］又は［７］に記載の糖類含有化合物の処理方法。

【0016】

［９］前記複合体は、形状が球状であり、平均粒径が０．５μｍ～１００μｍである、［６］～［８］いずれか１つに記載の糖類含有化合物の処理方法。

【0017】

［１０］前記ポリマーが、（メタ）アクリル化合物に由来する繰り返し単位を含む［１］～［９］いずれか１つに記載の糖類含有化合物の処理方法。

【0018】

［１１］前記抗体固定化担体が、磁性ビーズである、［１］～［１０］のいずれか１つに記載の糖類含有化合物の処理方法。

【0019】

［１２］［１］に記載の糖類含有化合物の処理方法と、溶出させた前記糖類含有化合物を分析する工程と、を有する、糖類含有化合物の分析方法。

【発明の効果】

【0020】

本発明によれば、目的の糖タンパク質から生じた糖類含有化合物の処理方法を提供することができる。また、得られた糖類含有化合物の分析方法をあわせて提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】図１は、本実施形態の分析方法で用いる精製剤の一例を示す模式図である。

【図2】図２は、本実施形態の分析方法を実施する装置の一例を説明する模式図である。

【図3】図３は、実施例１の結果を示すＨＰＬＣチャートである。

【図4】図４は、推定される糖鎖構造を示す模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本明細書において、数値範囲について、「Ａ以上Ｂ以下」を「Ａ～Ｂ」と表記する場合がある。例えば「０．０１体積％～２０体積％」と記載した場合、０．０１体積％から２０体積％までの範囲であって下限値（０．０１体積％）と上限値（２０体積％）を含む数値範囲、すなわち「０．０１体積％以上２０体積％以下」を意味する。

【0023】

本実施形態の糖類含有化合物の処理方法は、下記（Ｉ）～（III）の工程を含む。
（Ｉ）糖タンパク質を含む混合試料に抗体固定化担体を接触させ、抗体固定化担体に糖タンパク質を吸着させる工程
（II）混合試料から糖タンパク質を吸着させた抗体固定化担体を分離し、分離した抗体固定化担体に遊離試薬を含む液体を添加して糖タンパク質から遊離させた糖類含有化合物を含む混合液とし、混合液に精製剤を接触させて精製剤に糖類含有化合物を吸着させる工程
（III）混合液から分離した精製剤を、水を含む溶液に接触させ、精製剤から水に糖類含有化合物を溶出させる工程

【0024】

ここで、本明細書においては、以下のように用語を定義する。
「糖類」とは、単糖及び糖鎖をまとめた集合を指す。単糖は、誘導体であってもよい。「糖鎖」とは、２以上の単糖がグリコシド結合により直鎖状又は分岐鎖状につながった化合物を指す。糖鎖を構成する単糖は、誘導体であってもよい。
「糖ペプチド」は、糖類により修飾されたペプチドのことを指す。
「糖類含有化合物」は、糖類及び糖ペプチドをまとめた総称である。
「糖タンパク質」は、糖鎖修飾を受けたタンパク質のことをさす。

【0025】

「糖タンパク質を含む混合試料」としては、糖タンパク質を含有している可能性のある試料であれば特に制限はない。糖タンパク質を含む混合試料としては、生体試料及び環境試料を挙げることができる。このような試料としては、例えば、全血、血清、血漿、尿、唾液、糞便、脳脊髄液、細胞、細胞培養物及び細胞組織等の生体試料が挙げられる。生体試料及び環境試料は、未精製のものであってもよく、脱脂、脱塩、電気泳動等のタンパク質分画、濃縮、希釈、熱変性等の必要な前処理を行ったものであってもよい。

【0026】

生体試料及び環境試料を濃縮又は希釈する場合、適宜、予備実験を行い、混合試料として適切な濃度を設定しておくとよい。希釈時には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いるとよい。

【0027】

上記試料は、有機溶媒の溶液であってもよく、水溶液であってもよい。

【0028】

混合試料は、０．０１体積％～２０体積％の水を含むことが好ましく、０．１体積％～１５体積％の水を含むことがより好ましく、０．５体積％～１２体積％の水を含むことがさらに好ましい。混合試料が上記量の水を含むことにより、糖類を効果的に精製剤に吸着させることができる。

【0029】

以下の説明においては、糖類含有化合物の処理方法を単に「処理方法」と称することがある。以下、処理方法について、順に説明する。

【0030】

［工程（Ｉ）］
まず、糖タンパク質を含む混合試料に抗体固定化担体を接触させ、抗体固定化担体に糖タンパク質を吸着させる。これにより、混合試料から抗体固定化担体に吸着可能な糖タンパク質を選択的に分離することができる。

【0031】

（抗体固定化担体）
抗体固定化担体とは、固相の表面に抗体を固定した担体をいう。固定の態様としては、特異的結合による非共有結合（水素結合およびイオン結合）、ならびに共有結合が含まれる。

【0032】

ここで、担体は、水に不溶な基材であって、抗体を固定化できるものであれば特に限定されず、有機担体、無機担体およびそれらの複合担体が挙げられる。有機担体としては、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子；架橋セファロース、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アミロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる担体が挙げられ、これらは単独担体、または複数の複合担体として用いることができる。無機担体としては、ガラスビーズ、シリカゲル、モノリスシリカ、磁性ビーズなどの担体が挙げられる。
混合試料中の糖タンパク質、上記抗体固定化担体の抗体を介して捕捉される。

【0033】

（糖タンパク質）
抗体固定化担体に吸着させる糖タンパク質は、部分構造として下記のような糖類含有化合物を有する。

【0034】

糖類含有化合物を構成する単糖又はその誘導体としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、アラビノース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、シアル酸、及びこれらの誘導体が挙げられる。

【0035】

糖類含有化合物としては、単糖及びその誘導体、多糖類、糖タンパク質、並びに、糖ペプチド、プロテオグリカン、及び、糖脂質等の複合糖質から遊離又は誘導された糖鎖等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0036】

ここで、糖タンパク質を構成する糖類含有化合物は、主にアスパラギン残基に糖類が結合するＮ－グリコシド結合糖鎖（Ｎ型糖鎖）、及び、セリン及びスレオニン等と結合するＯ－グリコシド結合糖鎖（Ｏ型糖鎖）の２種類に大別される。精製剤は、いずれの糖類をも濃縮対象とし、糖類の種類、鎖長、構造等は特に制限されない。

【0037】

［工程（II）］
次いで、混合試料から糖タンパク質を吸着させた抗体固定化担体を分離し、分離した抗体固定化担体に遊離試薬を含む液体を添加して糖タンパク質から遊離させた糖類含有化合物を含む混合液とし、混合液に精製剤を接触させて精製剤に糖類含有化合物を吸着させる。

【0038】

本工程においては、まず、混合試料から抗体固定化担体を分離する。分離後には、抗体固定化担体を洗浄すると良い。洗浄により、抗体固定化担体に捕捉された糖タンパク質以外の夾雑物を除去することができる。

【0039】

洗浄は、糖タンパク質を吸着させた抗体固定化担体を、マイクロチューブ、遠心管、マイクロプレート等の容器中で洗浄液に浸漬し、洗浄液の交換を繰り返すことにより行うことができる。例えば、容器に抗体固定化担体を入れ、洗浄液を加え、振とう又は撹拌した後、固液分離により液相部分を除去する操作を繰り返すことにより行う。また、フィルター入りチューブを使用することで、抗体固定化担体の回収を効率的に行うことができる。

【0040】

次いで、分離した抗体固定化担体に遊離試薬を含む液体を添加し混合液を得る。混合試料から分離した抗体固定化担体を、サンプル管やマイクロチューブ等の容器に集め、遊離試薬を加えることで、抗体固定化担体が吸着した糖タンパク質のタンパク質（アミノ酸）と糖類含有化合物との間の結合を切る。これにより、抗体固定化担体に吸着させた糖タンパク質から、糖類含有化合物を遊離させる。抗体固定化担体には、糖タンパク質のうちタンパク質部分が残存する。

【0041】

糖鎖遊離処理は、糖タンパク質から糖鎖を遊離することができるものであれば、特に制限はなく、酵素的処理及び化学的処理等を用いることができる。また、糖鎖遊離処理に先立って、糖タンパク質や糖ペプチド等に対してタンパク質分解酵素を作用させ、タンパク質及びペプチド部分の断片化処理等を行ってもよい。

【0042】

（遊離試薬）
遊離試薬としては、糖鎖遊離酵素を採用することができる。糖鎖遊離酵素としては、アスパラギン側鎖に結合したＮ型糖鎖を特異的に切断する糖切断酵素（例えば、ＰＮＧａｓｅ Ｆ）を用いることができる。また、糖鎖を遊離させる公知の方法で採用される試薬を、遊離試薬として採用することができる。このような公知の方法としては、Ｏ型糖鎖遊離法である「脱離オキシム化法」を挙げることができる。

【0043】

（精製剤）
本願発明においては、精製剤は、下記の（Ａ）（Ｂ）の少なくともいずれか一方を含有する。
（Ａ）ベタイン構造を有するポリマー
（Ｂ）ベタイン構造を有するポリマーと、当該ポリマーを担持する支持体と、を有する複合体

【0044】

本実施形態の糖類含有化合物の精製方法で用いる上記（Ａ）（Ｂ）の精製剤は、いずれもベタイン構造を有する。このような精製剤は、ベタイン構造を有する部分において、試料中の糖類含有化合物を吸着する。

【0045】

「ベタイン構造」とは、下記（ａ）～（ｃ）の要件を満たす分子構造を意味する。
（ａ）正電荷と負電荷を同一分子構造内の隣り合わない位置に有する。
（ｂ）正電荷を持つ原子には解離しうる水素が結合していない。
（ｃ）分子構造全体としては電荷を持たない。

【0046】

（精製剤）
精製剤に含まれるベタイン構造は、具体的には、下記式（１）又は式（２）のいずれかの構造である。下記式（１）又は式（２）のいずれかの構造を分子内に有する化合物は、分子末端にベタイン構造を有する。
－Ｚ－Ｌ－Ａ …（１）
－Ａ－Ｌ－Ｚ …（２）
［式（１）（２）中、Ｚは、２級アミノ基、３級アミノ基、４級アンモニウム基、イミノ基及びイミニウム基からなる群より選択されるカチオン基を表す。
Ｌは、炭素数１～１０のアルキレン基を表す。
Ａは、リン酸基、カルボキシル基、ホスホン酸基、ホスフィン酸基、スルホン酸基、スルフィン基、スルフェン基、水酸基、チオール基及びボロン酸基からなる群より選択されるアニオン基を表す。］

【0047】

すなわち、精製剤におけるベタイン構造は、アニオン基と、カチオン基と、アニオン基とカチオン基とを連結するリンカーと、を有する。

【0048】

（（Ｂ）ベタイン構造を有するポリマーと、ポリマーを担持する支持体と、を有する複合体）
精製剤としては、上記ポリマーＡを単独で用いてもよく、ポリマーＡを不溶性の支持体に担持させた複合体として用いてもよい。上記ポリマーＡを不溶性の支持体に担持させた複合体は、糖類含有化合物を吸着させた後、混合液から分離しやすく、精製操作が簡便になるため好ましい。

【0049】

図１は、本実施形態の精製方法で用いる精製剤の一例を示す模式図である。図１に示すように、精製剤１は、ベタイン構造を有するポリマー（ポリマーＡ)と、当該ポリマーを担持する支持体２とを有する複合体である。図１に示す精製剤１では、支持体２が球状（粒子状）であり、ベタイン構造を有するポリマーは、支持体２の表面に層状に設けられている。図１では、層状に設けられたポリマーの層を符号３で示しており、層３を構成するベタイン構造を有するポリマーを符号３ａで示している。

【0050】

（支持体）
図１では、支持体２を、球状であることとして示したがこれに限らない。例えば、支持体の形状は、基板やマルチウェルプレート等の板状、シートやフィルム、メンブレン等の膜状、繊維状であってもよい。

【0051】

支持体２が球状であり、精製剤１が球状である場合、精製剤１の平均粒径は、０．５μｍ以上１００μｍ以下が好ましく、１μｍ以上５０μｍ以下がより好ましく、１μｍ以上１０μｍ以下がさらに好ましく、３μｍ以上１０μｍ以下が特に好ましい。精製剤１の平均粒径が上記下限値以上であると、取り扱いが容易となり好ましい。また、精製剤１の平均粒径が上記上限値以下であると、工程（Ｉ）で調製する混合液中で、糖類含有化合物と精製剤１とを良好に接触させ、精製剤１に糖類含有化合物を吸着させやすいため好ましい。

【0052】

精製剤１の平均粒径は、例えば、粒度分布計等で測定することができる。

【0053】

精製剤１は、スピンカラム等のフィルターカップ、マルチウェルプレートの各ウェル、フィルタープレートの各ウェル、マイクロチューブ等の容器の中に充填された状態で用いてもよい。

【0054】

また、図１では、ポリマー３ａが支持体２の表面の全体を覆っているが、これに限らず、支持体２の表面が露出していてもよい。

【0055】

支持体２の材料は、糖類含有化合物の精製過程で使用する有機溶媒及び水に不溶な基材であり、上述のベタイン構造を有するポリマー（ポリマーＡ）を担持できるものを採用できる。このような支持体２の材料は、無機材料（無機化合物）であってもよく、有機材料であってもよく、無機材料と有機材料との複合材料であってもよい。

【0056】

無機材料としては、ガラス、酸化鉄（フェライト、マグネタイト等）、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア等の酸化物、鉄、銅、金、銀、白金、コバルト、アルミニウム、パラジウム、イリジウム、ロジウム等の金属及びその合金、グラファイト等の炭素材料等が挙げられる。
これらの材料は１種のみで用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0057】

有機材料としては、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン等の合成高分子、架橋セファロース、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アミロース、架橋アガロース、架橋デキストラン等の多糖類等が挙げられる。
これらの材料は１種のみで用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0058】

支持体２としては、無機材料を用いることが好ましい。支持体２となりうる有機材料は比重が１前後であり、精製で用いる混合液との比重差が小さい。そのため、支持体２の材料として有機材料を採用すると、固液分離が煩雑になることがある。一方、支持体２の材料として無機材料を用いると、容易かつ簡便に混合液と精製剤とを固液分離できる。これにより、作業効率の向上に寄与することができる。
支持体２の材料としては、シリカが特に好ましい。

【0059】

支持体２は、多孔質体であってもよい。多孔質の支持体２を用いることにより、支持体２表面に固定するベタイン構造を有するポリマーＡの量を増加できる。これにより、作業効率の向上に寄与することができる。

【0060】

また、空隙を有する支持体と空隙を有さない支持体とを併用する、または、多孔質体である支持体の空隙の量を調製することにより、精製剤全体の比重を調製することもできる。

【0061】

ポリマーＡを支持体の表面に担持させる方法は、物理吸着、又は、化学結合のいずれであってもよい。糖類含有化合物の精製過程において、支持体からポリマーＡが遊離し難いため、上記担持させる方法は、化学結合が好ましい。

【0062】

［工程（III）］
次いで、糖類含有化合物を吸着させた精製剤を混合液から分離し、分離した精製剤を、水を含む溶液に接触させる。これにより、精製剤から水に糖類含有化合物を溶出させる。

【0063】

本工程においては、まず、混合液から精製剤を分離する。分離後には、精製剤を洗浄すると良い。洗浄により、精製剤に捕捉された糖類含有化合物以外の夾雑物を除去することができる。

【0064】

洗浄は、糖類含有化合物を吸着させた精製剤を、マイクロチューブ、遠心管、マイクロプレート等の容器中で洗浄液に浸漬し、洗浄液の交換を繰り返すことにより行うことができる。例えば、容器に精製剤を入れ、洗浄液を加え、振とう又は撹拌した後、固液分離により液相部分を除去する操作を繰り返すことにより行う。また、フィルター入りチューブを使用することで、精製剤の回収を効率的に行うことができる。

【0065】

次いで、糖類含有化合物を吸着させた精製剤から糖類含有化合物を溶出させる。糖類含有化合物の溶出は、精製剤を溶出液に浸漬することによって行う。例えば、精製剤から十分に洗浄液を取り除いた後、マイクロチューブ、遠心管、マイクロプレート等の容器中で精製剤に溶出液を加え、振とう又は撹拌することで行う。

【0066】

溶出液には、水を含む溶液を用いる。具体的には、溶出液は有機溶媒と水との混合溶媒であってもよい。混合溶媒を使用する場合は、溶出液中の水の含有率は２５体積％以上であるとよい。

【0067】

有機溶媒としては、糖類含有化合物を溶解可能なものである限り特に制限はない。例えば、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、アセトン、ジオキサン、ピリジン、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、および１－ブタノール等を挙げることができる。これらの有機溶媒は、１種のみ用いてもよく、２種以上を併用してもよい。混合液に用いられる有機溶媒は、アセトニトリル、１－ブタノール又はエタノールが好ましい。

【0068】

また、溶出液は、前記標識物質とは異なる標識試薬を含んでもよい。溶出液を、標識試薬を含んだ状態で加熱することによって、溶出液に含まれる糖類含有化合物を標識することができる。
標識試薬としては、たとえば、２－アミノベンズアミド（２－ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、２－アミノ安息香酸（２－ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）等が挙げられる。
なお、上記標識試薬は、溶出液中に含めず、溶出後に添加してもよい。

【0069】

［工程（IV）］
本実施形態の糖類含有化合物の分析方法は、上記糖類含有化合物の処理方法（（Ｉ）～（III）の工程）と、溶出させた糖類含有化合物を分析する工程と、を有する。必要に応じて溶出液から溶媒を留去し、糖類含有化合物を濃縮してもよい。

【0070】

糖類含有化合物の分析方法としては、たとえば、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）等を挙げることができる。

【0071】

図２は、本実施形態の分析方法を実施する装置の一例を説明する模式図である。装置１００は、抗体固定化担体１０を収容した容器１５を保持する保持部２０と、容器１５に試薬を導入する導入部３０と、精製剤１０－２を収容した容器１５－２を保持する保持部２０－２を備える。装置１００は、容器１５の収容物を固液分離する分離部４０を備えていてもよい。また、装置１００は、容器１５の収容物の温度を調節する温度調節部６０を更に備えていてもよい。

【0072】

保持部２０は、抗体固定化担体１０を収容した容器１５を直接又は間接的に保持する。装置１００では保持部２０が回収容器１６を保持し、容器１５が回収容器１６に装着されていることで、保持部２０が容器１５を間接的に保持している。回収容器１６は、例えばコレクションチューブ、コレクションプレート等を挙げることができる。

【0073】

導入部３０は、保持部２０に保持された容器１５内に液体類（混合試料Ｌ１（試料Ｌ１）、有機溶媒Ｌ２、洗浄液Ｌ３、溶出液Ｌ４）を導入する。導入部３０は、液体類をそれぞれ収容したタンク３４と、タンク３４が収容した液体類を送液する送液管３５ａと、液体類を容器１５に導入するノズル３５とを備えている。送液管３５ａは、各タンク３４に分岐している。分岐した各送液管３５ａには、各液体類の送液を制御する弁（３６，３７，３８，３９）を備える。

【0074】

分離部４０は、容器１５の収容物から固体（抗体固定化担体１０）と液体とを分離する。容器１５には、回収容器１６が装着されていてもよい。

【0075】

分離部４０は、容器１５を保持するラック４１と、ラック４１が接続されるドライブシャフト４２と、ドライブシャフト４２を回転させるモーター４３とを備えている。

【0076】

分離部４０は、保持部２０から独立して構成されてもよい。この場合、装置１００は、保持部２０から分離部４０へ、容器１５を自動移送させる移送部５０を含んでいてもよい。

【0077】

分離部４０は、遠心力によって、精製剤１０－２に固定された糖類含有化合物を容器１５内に残すとともに、洗浄液を回収容器１６中に廃棄することができる。また、溶出過程においては、糖類含有化合物を含む溶出液を回収容器１６中に回収することができる。

【0078】

装置１００においては、抗体固定化担体１０を収容する容器１５を保持部２０にて保持し、導入部３０を用いて容器１５に試料Ｌ１を導入する。これにより、容器１５において試料Ｌ１に含まれる糖タンパク質を抗体固定化担体１０に吸着させる（工程（Ｉ））。

【0079】

次いで、分離部４０を用いて糖タンパク質を吸着させた抗体固定化担体１０を固液分離し、容器１５から液相を抜き出す。固体である抗体固定化担体１０が残された容器１５に対し、導入部３０を用いて洗浄液Ｌ３を導入し分離部４０を用いて固液分離することで、抗体固定化担体１０の洗浄を行う。

【0080】

次いで、洗浄後の抗体固定化担体１０が収容された容器１５に、導入部３０を用いて遊離試薬を導入する。これにより、抗体固定化担体１０に吸着させた糖タンパク質から糖類含有化合物を遊離させる（工程（II））。抗体固定化担体１０には糖タンパク質が残存する。

【0081】

次いで、分離部４０を用いて糖類含有化合物を精製剤１０－２に吸着させ、糖類含有化合物を吸着させた精製剤１０－２を固液分離し、容器１５から液相を抜き出す。固体である精製剤１０－２が残された容器１５に対し、導入部３０を用いて洗浄液Ｌ３を導入し分離部４０を用いて固液分離することで、精製剤１０の洗浄を行う。

【0082】

次いで、洗浄後の精製剤１０－２が収容された容器１５－２に、導入部３０を用いて溶出液Ｌ４を導入する。これにより、精製剤１０－２に吸着させた糖類含有化合物を溶出液Ｌ４に溶出させ、糖類含有化合物を精製する（工程（III））。

【0083】

次いで、溶出液Ｌ４に溶出させた糖類含有化合物を、不図示の分析装置（例えばＬＣ－ＭＳ）を用いて分析する（工程（IV））。

【0084】

以上のような操作により、装置１００を用いて本実施形態の分析方法を実施することができる。

【0085】

以上のような糖類含有化合物の処理方法によれば、目的の糖タンパク質を処理し糖類含有化合物を容易に得ることができる。

【0086】

以上のような糖類含有化合物の分析方法によれば、目的の糖タンパク質から生じた糖類含有化合物を容易に分析することができる。

【実施例0087】

以下に本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0088】

［実施例１］
（１）抗体結合磁性ビーズの作製
磁性ビーズ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製。品番：１４３１１Ｄ）付属のプロトコルに従い、磁性ビーズに抗ＣＡ１９－９抗体（ＯＲＩＧＥＮＥ製。品番：ＣＦ１９００８３）を結合させた。「抗ＣＡ１９－９抗体を結合させた磁性ビーズ」を、以下の説明では単に「ビーズ」と称する。

【0089】

ビーズを、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ：９９．９５質量％，Ｔｗｅｅｎ２０：０．０５質量％の混合液）に添加し、ビーズ含有量１０ｍｇ／ｍＬのビーズ液を調整した。

【0090】

（２）血清からの目的糖タンパク質の回収
（２－１）
２．０ｍＬチューブに（１）で調製したビーズ液５０μＬ（ビーズ０．５ｍｇ）を分注した。その後、チューブを磁石上に配置してビーズを磁力で固定し、上清を除去した。同じものを２本用意した。

【0091】

（２－２）
健常者血清（ＳＩＧＭＡ製。品番：Ｈ６９１４－１００ＭＬ）１ｍＬにCA19-9 native protein（MYBioSource製。品番：ＭＢＳ５３７６４４）１０００Ｕを添加して混合試料を調製した。

【0092】

（２－３）
（２－２）で調製した混合試料全量にＰＢＳを加えて２倍希釈した溶液を調製した。この溶液を（２－１）で用意したビーズ入りの各チューブに１ｍＬずつ添加し、ビーズに糖タンパク質を結合させた。

【0093】

（２－４）
室温にて１時間チューブローテーターを用いて攪拌した。

【0094】

（２－５）
チューブを磁石上に配置してビーズを磁力で固定し、上清を除去した。
続けて、ＰＢＳＴをチューブに添加した後、ボルテックスミキサーを用いて軽く撹拌した。チューブを磁石上に配置してビーズを磁力で固定し、上清を除去した。ＰＢＳＴの添加から上清の除去までを１回として、この操作を計３回実施した。

【0095】

（２－６）
チューブにＰＢＳＴを添加してビーズを懸濁させ、懸濁液を新しい１．５ｍＬチューブに移した。このとき、２本のチューブに分けていたビーズを一つの１．５ｍＬチューブに入れて統合した。

【0096】

（３）糖鎖の遊離
（２－６）で準備した１．５ｍＬチューブを磁石上に配置し、ビーズを磁力で固定して上清を除去した。

【0097】

その後、試薬２（住友ベークライト製、品番：ＢＳ－４１６０１に付属）と試薬３（住友ベークライト製、品番：ＢＳ－４１６０１に付属）を５：２の比率で混合した糖鎖遊離溶液１５μＬを上記１．５ｍＬチューブに添加して混合した。その後、ビーズごと混合溶液を３７℃で７５分加熱して反応させた。

【0098】

（４）糖鎖の回収
（３）の反応終了後、混合溶液にアセトニトリル（富士フイルム和光純薬製。製品コード：０１８－１９８５３、純度９９．９％）を添加し、数回ピペッティングした。この混合溶液を精製剤封入チューブ４（住友ベークライト製、品番：ＢＳ－４１６０１に付属）に添加し、懸濁させた。

【0099】

得られた懸濁液をカラム５（住友ベークライト製、品番：ＢＳ－４１６０１に付属）に加え、卓上遠心機を用いて遠心分離して溶液を除去した。遠心分離条件は、３０００×ｇ、１分間とした。以下の操作においては、同じ条件で遠心分離を行った。

【0100】

続いて、カラム５にアセトニトリル２００μＬを加え、遠心分離してアセトニトリルを主成分とする溶液を除去した。再度、カラム５にアセトニトリル２００μＬを加え、遠心分離してアセトニトリルを主成分とする溶液を除去した。

【0101】

（５）糖鎖標識
（５－１）
試薬６（住友ベークライト製、品番：ＢＳ－４１６０１に付属）８ｍｇをメタノール４５μＬと酢酸１０μＬの混合溶液に溶かした後、超純水４５μＬを加えた溶液１を調製した。また、試薬７（住友ベークライト製、品番：ＢＳ－４１６０１に付属）４ｍｇをメタノール４５μＬと酢酸１０μＬの混合溶液に溶かした後、超純水４５μＬを加えた溶液２を調製した。溶液１に２μＬの溶液２を加えて攪拌し、標識溶液とした。

【0102】

（５－２）
（４）でカラム５に残留した固体に（５－１）の標識溶液５０μＬを加えて、遠心分離により溶液をマイクロチューブに回収した。得られた溶液を５０℃で２．５時間加熱した。

【0103】

（５－３）
反応終了後の（５－２）のマイクロチューブにアセトニトリル１ｍＬを加え、攪拌した。

【0104】

（５－４）
（５－３）をカラム８（住友ベークライト製、品番：ＢＳ－４１６０１に付属）に全量添加後、遠心分離によりカラム８に通液させ、溶液を除去した。その後、カラム８にアセトニトリル６００μＬを加え、遠心分離によりカラム８に通液させ、溶液を除去した。再度、カラム８にアセトニトリル６００μＬを加え、遠心分離によりカラム８に通液させ、溶液を除去した。

【0105】

（５－５）
上記カラム８に超純水５０μＬを加えて遠心分離し、標識糖鎖溶液をマイクロチューブに回収した。

【0106】

（６）標識糖鎖溶液の濃縮
（５－５）で得られた標識糖鎖溶液を凍結させた後、遠心乾燥機に１時間かけることで水分を乾燥させた。水分が完全になくなり糖鎖が残っているこのマイクロチューブに超純水１０μＬを加えて攪拌した。これにより５倍濃縮標識糖鎖溶液を得た。

【0107】

（７）ＨＰＬＣ分析
（６）で調製した溶液のうち１μＬを用いて、下記表１の条件でＨＰＬＣ分析を実施した。

【0108】

【表1】

【0109】

図３は、実施例の結果を示すＨＰＬＣチャートである。（７）のＨＰＬＣ分析で得られたチャートにおいて、溶出時間３４．７分の位置にＣＡ１９－９（シアリルルイスＡ構造を持つ糖鎖）のピークが見られた。図３において、該当するピークを符号Ａで示す。
また、図４は、推定される糖鎖構造を示す模式図である。

【0110】

以上の結果より、CA19-9を持つ糖タンパク質を混合試料から回収し、その糖タンパク質から本キットでＯ型糖鎖を調製して糖鎖解析することが可能であると示された。

【0111】

従って、本発明により、混合試料からターゲットの糖タンパク質を回収し、抗体固定化担体から糖タンパク質を遊離することなく、本キットでＯ型糖鎖を調製し糖鎖解析することが可能であると示された。

【符号の説明】

【0112】

１，１０…精製剤
２…支持体
３…ポリマーの層
３ａ…ポリマー
Ｌ１…試料
Ｌ２…有機溶媒

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】