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特開2024-49175変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２における二塩基連続置換を高精度に検出する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024049175
(43)【公開日】2024-04-09
(54)【発明の名称】変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２における二塩基連続置換を高精度に検出する方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6888 20180101AFI20240402BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20240402BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6888 Z
C12Q1/6844 Z ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022155477
(22)【出願日】2022-09-28
(71)【出願人】
【識別番号】302019245
【氏名又は名称】タカラバイオ株式会社
(72)【発明者】
【氏名】寺林 靖宣
(72)【発明者】
【氏名】相良 武宏
(72)【発明者】
【氏名】齋藤 憲介
(72)【発明者】
【氏名】秋友 美和
(72)【発明者】
【氏名】下川 彩夏
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ10
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR55
4B063QR56
4B063QR62
4B063QS24
4B063QS25
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株は、これまでに構築されたウイルス検出方法では元のウイルスと区別することが難しかった。ウイルスゲノムの塩基配列を解読することにより変異を網羅的に検出することは可能であるが、高速シーケンサーを必要とするなど、迅速、簡便に実施可能な方法ではない。以上のとおり、変異が生じたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を特異的にかつ簡便に検出できる方法が求められていた。
【解決手段】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ならびにその変異株のゲノムＲＮＡ配列を比較、検討し、スパイクタンパク質に特定の変異が生じたウイルス変異株を核酸増幅法により検出するのに有用なオリゴヌクレオチドを見出した。さらに、当該オリゴヌクレオチドを使用する変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法を構築した。
【選択図】 なし
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株は、これまでに構築されたウイルス検出方法では元のウイルスと区別することが難しかった。ウイルスゲノムの塩基配列を解読することにより変異を網羅的に検出することは可能であるが、高速シーケンサーを必要とするなど、迅速、簡便に実施可能な方法ではない。以上のとおり、変異が生じたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を特異的にかつ簡便に検出できる方法が求められていた。
【解決手段】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ならびにその変異株のゲノムＲＮＡ配列を比較、検討し、スパイクタンパク質に特定の変異が生じたウイルス変異株を核酸増幅法により検出するのに有用なオリゴヌクレオチドを見出した。さらに、当該オリゴヌクレオチドを使用する変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法を構築した。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出に使用されるオリゴヌクレオチドであって、
（ａ）配列番号１４に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、および
（ｂ）配列番号１５に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
から選択されるオリゴヌクレオチド。
（ａ）配列番号１４に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、および
（ｂ）配列番号１５に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
から選択されるオリゴヌクレオチド。
【請求項2】
（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列番号３、４、５、６、７から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項3】
（ｂ）のオリゴヌクレオチドが、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項4】
蛍光物質および／または消光物質で標識されている前記請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項5】
ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＢＮＡ）を含む前記請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項6】
試料中の変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法であって、
（１）試料に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに相補的なＤＮＡまたはその断片を合成する工程、および
（２）前記請求項１～請求項５いずれか記載のオリゴヌクレオチドの一種または二種以上を使用して、工程（１）で得られたＤＮＡまたはその断片に含まれる変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を検出する工程、
を包含することを特徴とする方法。
（１）試料に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに相補的なＤＮＡまたはその断片を合成する工程、および
（２）前記請求項１～請求項５いずれか記載のオリゴヌクレオチドの一種または二種以上を使用して、工程（１）で得られたＤＮＡまたはその断片に含まれる変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を検出する工程、
を包含することを特徴とする方法。
【請求項7】
工程（１）が、合成されたＤＮＡまたはその断片を増幅する工程をさらに含む前記請求項６記載の方法。
【請求項8】
工程（２）において、ＤＮＡまたはその断片とハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの分解により変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部の検出が実施される、前記請求項６記載の方法。
【請求項9】
試料中の変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのキットであって、
（１）前記請求項１～請求項５いずれか記載のオリゴヌクレオチドの一種または二種以上、および
（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに相補的なＤＮＡまたはその断片を合成するための試薬
を含むキット。
（１）前記請求項１～請求項５いずれか記載のオリゴヌクレオチドの一種または二種以上、および
（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに相補的なＤＮＡまたはその断片を合成するための試薬
を含むキット。
【請求項10】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムに相補的なＤＮＡまたはその断片を増幅する試薬をさらに含む前記請求項９記載のキット。
【請求項11】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムに相補的なＤＮＡまたはその断片の増幅に使用されるプライマー対をさらに含む前記請求項９記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出に使用されるオリゴヌクレオチド、当該オリゴヌクレオチドを使用する変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法ならびに当該検出方法に使用されるキットに関する。
【背景技術】
【0002】
細菌やウイルスによりヒトに引き起こされる感染症の中には、もっぱら局地的な感染にとどまるもの、地理的条件とはかかわりなく広く蔓延する可能性のあるものが存在する。ヒト－ヒト間で感染が成立する感染症は後者に該当し、その感染力や感染患者が呈する症状の重篤度によっては社会問題化することもある。天然痘、ペスト、インフルエンザ（スペイン風邪）等、大規模な流行を起こしてその後の歴史に影響を与えた感染症も少なくない。
【0003】
多くの感染症について治療や予防の方法が開発された現代でも、引き続き注意を要する感染症が残されているのに加え、さらに新興感染症のリスクが存在している。２００３年に発見されたＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）は重篤な呼吸器疾患を引き起こすウイルスであることが明らかとされた。さらに、２０１９年には新たなコロナウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が出現し、２０２０年には世界的に蔓延している。
【0004】
感染症への対応手段としては治療薬等の開発と普及、ならびに衛生面での環境整備が挙げられる。加えて、病原体の存在や感染者を特定して早期に隔離措置を講じ、感染経路を遮断することは、感染症の蔓延防止において極めて重要である。上記のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法としては、ウイルスＲＮＡを標的とする核酸検査法（例えば非特許文献１）、ウイルスタンパク質を標的とする抗原検査法、感染が疑われるヒトの血液を試料とする抗体検査法等がすでに開発されている。現在は、主に検出感度の観点から核酸検査法がウイルス検査の主流となっている。一方、当該ウイルスからは複数の変異ウイルス（変異株）が発生しており、これらは元のウイルスとは異なる性質を持つと報告されている（例えば非特許文献２、非特許文献３）。
【0005】
これらの変異株は、これまでに構築されたウイルス検出方法では元のウイルスと区別することが難しく、ウイルスの変異を疫学的に検討する上では問題を有している。さらに、変異株は変異前のウイルスの情報に基づいて構築されたウイルス検出系では検出できない、もしくは検出感度が低下する可能性がある。ウイルスゲノムの塩基配列を解読することにより変異を網羅的に検出することは可能であるが、高速シーケンサーを必要とするなど、迅速、簡便に実施可能な方法ではない。
【0006】
以上のとおり、変異が生じたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を特異的にかつ簡便に検出できる方法が求められていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（２０２０）、７３（４）、３２０－３２２
【非特許文献2】Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０２１）、３７２（６５３８）、ｅａｂｇ３０５５
【非特許文献3】Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０２１）、１８（４）、１０５８－１０６０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の多くはスパイクタンパク質に多重変異が生じている。代表的なものとして、発生国を基に３系統〔英国ＶＯＣ－２０２０１２／０１（Ｂ．１．１．７）、南アフリカ５０１Ｙ．Ｖ２（Ｂ．１．３５１）、ブラジル５０１Ｙ．Ｖ３（Ｐ．１）〕等が報告されている。変異株については感染伝播力の上昇およびワクチン効果を減弱させる免疫逃避の可能性が指摘されている。なお、世界保健機構（ＷＨＯ）は地球規模の広がりを見せている変異株系統について、ギリシャ文字のラベル（ＷＨＯラベル）を付している。２０２１年１月までに出現した代表的な変異株に関する情報を表１に示す。
【0009】
【表1】
【0010】
２０２１年１１月に、南アフリカに新たな変異株（Ｂ．１．１．５２９；ＷＨＯラベルはＯｍｉｃｒｏｎ）の急拡大が報告された。２０２１年１２月８日に国立感染症研究所より公開された「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株Ｂ．１．１．５２９系統（オミクロン株）について（第３報）」によれば、本変異株はスパイクタンパク質に３０か所程度のアミノ酸置換、３か所の小欠損と１か所の挿入部位を持つとされている。オミクロン株は過去に出現していたウイルス株に比較して感染性が高く、また、既存のウイルス株に対する抗体（承認されているモノクローナル抗体医薬を含む）からの逃避の可能性が懸念されている。さらに、すでにオミクロン株の変異株（亜種）も出現している。
【0011】
スパイクタンパク質の受容体結合領域（ＲＢＤ；３１９－５４１位）に生じた変異はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染能や抗体との反応性に影響を与える可能性があると考えられている。このため、前記領域に存在するＮ５０１、Ｅ４８４、L４５２、Ｔ４７８、Ｆ４９０等が変異した変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ならびにＦｕｒｉｎ様プロテアーゼによる切断部位（Ｒ６８５－Ｓ６８６）に近接するアミノ酸が変異した変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２については、その伝播の状況を把握することが重要である。感染力の高いオミクロン株にはさらなる変異、例えばＧ３３９Ｈ（ＢＡ．２．７５系統）やＧ３３９Ｎ（ＢＡ．２．２４系統）のアミノ酸置換を生じた株が出現しており、これらの変異を指標としたオミクロン変異株の検出方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ならびにその変異株のゲノムＲＮＡ配列を比較、検討し、スパイクタンパク質に生じた変異を指標としてオミクロン株の変異株を核酸増幅法により検出するのに有用なオリゴヌクレオチドを見出した。さらに、当該オリゴヌクレオチドを使用する変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法を構築し、本発明を完成させた。
【0013】
本発明は以下に概説するとおりである。
［１］ 変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出に使用されるオリゴヌクレオチドであって、
（ａ）配列番号１４に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、および
（ｂ）配列番号１５に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
から選択されるオリゴヌクレオチド。
［２］ （ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列番号３、４、５、６、７から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記［１]記載のオリゴヌクレオチド。
［３] （ｂ）のオリゴヌクレオチドが、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記［１]記載のオリゴヌクレオチド。
[４] 蛍光物質および／または消光物質で標識されている前記［１]記載のオリゴヌクレオチド。
［５] ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＢＮＡ）を含む前記［１］記載のオリゴヌクレオチド。
［６] 試料中の変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法であって、
（１）試料に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに相補的なＤＮＡまたはその断片を合成する工程、および
（２）前記［１］～［５］いずれか記載のオリゴヌクレオチドの一種または二種以上を使用して、工程（１）で得られたＤＮＡまたはその断片に含まれる変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を検出する工程、
を包含することを特徴とする方法。
［７］ 工程（１）が、合成されたＤＮＡまたはその断片を増幅する工程をさらに含む前記［６］記載の方法。
［８］ 工程（２）において、ＤＮＡまたはその断片とハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの分解により変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部の検出が実施される、前記［６］記載の方法。
［９] 試料中の変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのキットであって、
（１）前記［１］～［５］いずれか記載のオリゴヌクレオチドの一種または二種以上、および
（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに相補的なＤＮＡまたはその断片を合成するための試薬
を含むキット。
［１０］ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムに相補的なＤＮＡまたはその断片を増幅する試薬をさらに含む前記［９］記載のキット。
［１１］ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムに相補的なＤＮＡまたはその断片の増幅に使用されるプライマー対をさらに含む前記［９］記載のキット。
［１］ 変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出に使用されるオリゴヌクレオチドであって、
（ａ）配列番号１４に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、および
（ｂ）配列番号１５に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
から選択されるオリゴヌクレオチド。
［２］ （ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列番号３、４、５、６、７から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記［１]記載のオリゴヌクレオチド。
［３] （ｂ）のオリゴヌクレオチドが、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記［１]記載のオリゴヌクレオチド。
[４] 蛍光物質および／または消光物質で標識されている前記［１]記載のオリゴヌクレオチド。
［５] ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＢＮＡ）を含む前記［１］記載のオリゴヌクレオチド。
［６] 試料中の変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法であって、
（１）試料に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに相補的なＤＮＡまたはその断片を合成する工程、および
（２）前記［１］～［５］いずれか記載のオリゴヌクレオチドの一種または二種以上を使用して、工程（１）で得られたＤＮＡまたはその断片に含まれる変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を検出する工程、
を包含することを特徴とする方法。
［７］ 工程（１）が、合成されたＤＮＡまたはその断片を増幅する工程をさらに含む前記［６］記載の方法。
［８］ 工程（２）において、ＤＮＡまたはその断片とハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの分解により変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部の検出が実施される、前記［６］記載の方法。
［９] 試料中の変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのキットであって、
（１）前記［１］～［５］いずれか記載のオリゴヌクレオチドの一種または二種以上、および
（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに相補的なＤＮＡまたはその断片を合成するための試薬
を含むキット。
［１０］ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムに相補的なＤＮＡまたはその断片を増幅する試薬をさらに含む前記［９］記載のキット。
［１１］ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムに相補的なＤＮＡまたはその断片の増幅に使用されるプライマー対をさらに含む前記［９］記載のキット。
【発明の効果】
【0014】
本発明により、スパイクタンパク質においてＧ３３９ＨまたはＧ３３９Ｎのアミノ酸置換変異を生じた変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、核酸増幅法を利用して短時間に検出する方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【0015】
「本発明のオリゴヌクレオチド」
【0016】
本発明は、変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、具体的にはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質において３３９位のグリシンがヒスチジンまたはアスパラギンンに置換したアミノ酸置換変異を有する変異株ウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチドを提供する。本明細書において「変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」とは、特に本発明を限定するものではないが、Ｗｕｈａｎ株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質とは異なるアミノ酸配列のスパイクタンパク質（変異型スパイクタンパク質）および当該タンパク質をコードする塩基配列を含むゲノムＲＮＡを保持するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株（変異株）を指す。なお、本明細書ではＷｕｈａｎ株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を野生型と記載することがある。
【0017】
本明細書において、Ｇ３３９Ｈ変異とは、ＢＡ．２．７５系統のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に生じているアミノ酸置換であり、ＧｅｎｅＢａｎｋにＮＣ＿０４５５１２．２のアクセッション番号で公開されているＷｕｈａｎ株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のアミノ酸配列（ＹＰ＿００９７２４３９０．１）中、３３９番目のグリシン（Ｇ）がヒスチジン（Ｈ）に置換されていることを指す。ここで、この変異はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡのスパイクタンパク質をコードする領域において、前記のグリシンに対応するコドンであるＧＧＴがＣＡＴに変化していることに起因する。したがって、前記トリプレットの最初の塩基がＧからＣに、２番目の塩基がＧからＡに、それぞれ変化している塩基配列を検出することにより、Ｇ３３９Ｈ変異を有する変異株を検出することができる。
【0018】
本明細書において、Ｇ３３９Ｎ変異とは、ＢＡ．２．２４系統のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に生じているアミノ酸置換であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のアミノ酸配列中、３３９番目のグリシンがアスパラギン（Ｎ）に置換されていることを指す。ここで、この変異はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡのスパイクタンパク質をコードする領域において、前記のグリシンに対応するコドンであるＧＧＴがＡＡＴに変化していることに起因する。したがって、前記トリプレットの最初および２番目の塩基がともにＡに変化している塩基配列を検出することにより、Ｇ３３９Ｎ変異を有する変異株を検出することができる。
【0019】
野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の３３９位のアミノ酸はグリシンであり、オリジナルのオミクロン株（Ｂ．１．１．５２９系統）ではこの位置のアミノ酸はアスパラギン酸（Ｄ）に変異している。したがって、ウイルスゲノムＲＮＡの塩基配列において、スパイクタンパク質の３３９位に相当するコドンがアスパラギン酸、アスパラギン、ヒスチジンのどれをコードしているかを調べることにより、ウイルスがオリジナルのオミクロン株であるか、同株の変異株であるＢＡ．２．２４系統またはＢＡ．２．７５系統であるか、を知ることができる。
【0020】
本発明の、Ｇ３３９Ｈ変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を検出可能なオリゴヌクレオチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡのスパイクタンパク質をコードする領域中の、Ｇ３３９位に該当するコドンがヒスチジンに対応するコドンに変化している塩基配列またはこれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。当該オリゴヌクレオチドとしては、配列番号１４に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド（ａ））を挙げることができる。特に本発明を限定するものではないが、前記のオリゴヌクレオチドとしては１１塩基以上の鎖長のものが例示される。また、当該オリゴヌクレオチドの鎖長は３０塩基以下、好ましくは２５塩基以下、さらに好ましくは２３塩基以下である。例えば、配列番号３、４、５、６、７から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが好ましいものとして挙げられる。
【0021】
Ｇ３３９Ｎ変異を有する変異株を検出可能な本発明のオリゴヌクレオチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡのスパイクタンパク質をコードする領域中の、Ｇ３３９位に該当するコドンがアスパラギンに対応するコドンに変化している塩基配列またはこれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。当該オリゴヌクレオチドとしては、配列番号１５に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド（ｂ））を挙げることができる。特に本発明を限定するものではないが、前記のオリゴヌクレオチドとしては１１塩基以上の鎖長のものが例示される。また、当該オリゴヌクレオチドの鎖長は３０塩基以下、好ましくは２５塩基以下、さらに好ましくは２３塩基以下である。例えば、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが好ましいものとして挙げられる。
【0022】
当然のことながら、本発明のオリゴヌクレオチドは検出しようとする変異株のゲノムＲＮＡ由来の核酸と特異的にハイブリダイズする。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、本発明のオリゴヌクレオチドが、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびオリジナルのオミクロン株のゲノムＲＮＡ由来の核酸とはハイブリダイズしない条件において検出しようとする変異株のゲノムＲＮＡ由来の核酸とハイブリダイズすることができ、変異株由来の核酸と親株由来の核酸とを区別することができることを意味する。
【0023】
本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明を限定するものではないが、ＢＡ．２．７５系統またはＢＡ．２．２４系統のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の核酸、例えば変異株のゲノムＲＮＡに相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはその断片を検出するプローブとして使用することができる。したがって、変異株の検出に使用される検出方法に応じてオリゴヌクレオチドの鎖長や塩基配列、付加する標識を適宜選択することにより、効率よく前記のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出可能なプローブを設計することができる。
【0024】
標的核酸をプローブにより検出する技術としては、古典的なハイブリダイゼーション手法に加え、ＴａｑＭａｎ法、サイクリングプローブ法、モレキュラービーコン法等、種々の方法が知られている。ＴａｑＭａｎ法はＰＣＲによる核酸増幅と並行して標的核酸とハイブリダイズしたプローブを分解する方法であり、核酸増幅に５’－３’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする。サイクリングプローブ法に使用されるプローブは分子内にＲＮＡを含有しており、標的核酸とハイブリダイズした場合にはリボヌクレアーゼＨにより切断される。モレキュラービーコン法に使用されるプローブは分子内で二本鎖を形成しており、標的核酸とハイブリダイズすると分子内二本鎖構造が解消される。これらのプローブは、適切な標識を施すことにより、いずれも標識由来のシグナル（例えば蛍光）の発生を指標とした標的核酸の検出に使用することができる。
【0025】
以下、ＴａｑＭａｎプローブとして使用される本発明のオリゴヌクレオチドを例にとって説明する。本発明のオリゴヌクレオチドは、当該方法に好適に使用でき、その配列や鎖長は適宜調整することができる。特に本発明を限定するものではないが、配列番号３、４、５、６、７から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有する、好ましくは当該配列もしくは当該配列に相補的な配列からなる、Ｇ３３９Ｈ変異を有する変異株検出に使用可能なオリゴヌクレオチド；配列番号８、９、１０、１１、１２、１３から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有する、好ましくは当該配列もしくは当該配列に相補的な配列からなる、Ｇ３３９Ｎ変異を有する変異株検出に使用可能なオリゴヌクレオチドは、本発明の好適な態様である。さらに、本発明を特に限定するものではないが、これらのオリゴデオキシヌクレオチドの３’末端は、当該末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を防止するための修飾を施されていてもよい。前記修飾としては、例えば蛍光物質及び／又は消光物質による標識が例示される。
【0026】
本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明を特に限定するものではないが、通常、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）で構成され、当業者に周知の方法で合成することができる。なお、検出しようとする変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の核酸とハイブリダイズする性質を失わない範囲で、本発明のオリゴヌクレオチドはＤＮＡ以外のヌクレオチド、例えばＲＮＡ、非天然型の塩基（例えばデオキシウリジン、イノシン、７－デアザグアノシン、７－デアザアデノシン等）を有するヌクレオチド、架橋構造を有するリボースを含むヌクレオチド（ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ；ＢＮＡ）を含んでいてもよい。ＢＮＡはリボースの２’位の酸素原子と４’位の炭素原子間が架橋された構造を持つＲＮＡアナログで、２’，４’－ＢＮＡ（ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、２’，４’－ＬＮＡ）、３’－ａｍｉｎｏ－２’，４’－ＢＮＡ等が知られている。ＤＮＡ以外のヌクレオチドの含量には特に限定はなく、ハイブリダイゼーションの安定性や特異性を考慮して適宜設定すればよい。例えば、全ヌクレオチドの半数程度までをこのようなヌクレオチドとすることができる。
【0027】
標的核酸（変異株ゲノムＲＮＡ由来の核酸）と本発明のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出するため、本発明のオリゴヌクレオチドは適切な標識を付加されていてもよい。蛍光物質および消光物質の両方で、両者の間に適切な距離を保って標識された当該オリゴヌクレオチドは、そのままでは蛍光を発することはないが、当該オリゴヌクレオチドの分解、切断等によって蛍光物質と消光物質の距離が増加すると蛍光が発せられるようになる。使用する蛍光物質、消光物質には特に限定はないが、蛍光物質としては６－ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＨＥＸ、ＲＯＸ、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５等、消光物質としてはＤＡＢＣＹＬ、Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）、ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ（登録商標、ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ）等が挙げられる。これらを適宜組み合わせて、二重標識された本発明のオリゴヌクレオチドを作製することができる。蛍光物質および消光物質を付加する位置は、両者が適切な距離を保つ限りにおいて特に限定はない。例えば、蛍光物質および消光物質は本発明のオリゴヌクレオチドの両端に付加してもよく、そのいずれか一方もしくは両方を末端以外の位置に付加してもよい。
【0028】
本発明のオリゴヌクレオチドには副溝結合剤（マイナー・グルーブ・バインダー：ＭＧＢ）が付加されていてもよい。ＭＧＢは二本鎖ＤＮＡの副溝（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ）に入り込む性質を有する物質であり、ＭＧＢが付加されたオリゴヌクレオチドは、ＭＧＢを付加されていない場合に比べ、相補的な配列を有する核酸との間で形成した二本鎖核酸のＴｍ値が上がる（例えば、ＷＯ９６／３２４９６）。ＭＧＢ修飾されたオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズする核酸の１塩基の違いによりＴｍ値により大きな差が生じることから、バックグラウンドを低減して標的核酸を検出することができる。一般的に、ＭＧＢは三日月型の三次元構造と約１５０～約２０００ダルトンの分子量を有する。ＭＧＢの例として、ネトロプシン、ジスタマイシン、ジスタマイシンＡ、レキシトロプシン、ミトラマイシン、クロモマイシンＡ３、オリボマイシン、アントラマイシン、シビロマイシン、ペンタミジン、スチルバミジン、ブレニル、ＣＣ－１０６５、ヘキスト３３２５８、４’－６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰ１）、ＣＤＰＩ３およびそれらの誘導体が挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドにおいてＭＧＢを付加する位置には特に限定はないが、例えば３’末端や５’末端が挙げられる。
【0029】
「本発明の変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出方法」
【0030】
本発明は、前記の本発明のオリゴヌクレオチドを使用して試料中の変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法を提供する。
【0031】
本発明の変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法は、スパイクタンパク質においてＧ３３９ＨまたはＧ３３９Ｎ変異を有する変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、例えばＢＡ．２．７５系統またはＢＡ．２．２４系統の変異株を検出する方法である。具体的には、試料に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに相補的なＤＮＡまたは相補的なＤＮＡの断片を合成し、次いでこれと本発明のオリゴヌクレオチドの一種または二種以上とを接触させる。変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を含むＤＮＡは本発明のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするため、こうして試料中に変異株が存在するかどうかを判断することができる。
【0032】
なお、本発明の方法は、少なくともＧ３３９ＨまたはＧ３３９Ｎのアミノ酸置換変異を有する変異株であれば、さらに他の変異が生じている変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であっても検出することが可能である。
【0033】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はＲＮＡウイルスであり、ウイルス粒子はＲＮＡゲノムを保持している。ＲＮＡゲノムに相補的な配列を有するＤＮＡ、すなわちｃＤＮＡまたはその断片は、ゲノムＲＮＡを鋳型とした逆転写反応により合成される。逆転写反応は逆転写酵素と適切なプライマーを含む、逆転写反応において一般的に使用される反応液を使用して実施することができる。この工程により合成されたｃＤＮＡまたはｃＤＮＡ断片は当業者に周知の方法で二本鎖ＤＮＡに変換されてもよい。
【0034】
逆転写酵素としては、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）由来の逆転写酵素またはその変異体、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）由来の逆転写酵素またはその変異体、逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ等）またはその変異体が使用できるが、これらに限定されるものではない。前記の変異体としては、耐熱性の向上した変異体、ヌクレアーゼ活性（リボヌクレアーゼＨ活性等）が低下または消失した変異体等が例示される。様々な逆転写酵素が多数市販されているが、それらを本発明の方法に使用することもできる。
【0035】
逆転写反応に使用するプライマーはウイルスゲノム上の特定の配列に相補的なもの、ランダムな配列を持つもの、のいずれも本発明に使用することができる。特に本発明を限定するものではないが、ウイルスゲノム上の、スパイクタンパク質をコードする領域に対応する、好ましくはＧ３３９に対応するコドンを含む領域に対応するｃＤＮＡが合成されるように設計されたプライマーを好適に使用することができる。
【0036】
本発明の好適な態様においては、ウイルスの検出感度を向上させる観点から、本発明のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズし得る領域を含むｃＤＮＡ断片の増幅が実施される。当該工程に使用される核酸増幅法には限定はなく、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法をはじめとする公知の方法を使用することができる。前記の核酸増幅法は、ウイルスゲノムＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡまたはｃＤＮＡ断片を鋳型として実施され、増幅産物として変異箇所を含む核酸（ＤＮＡ）断片を生成する。
【0037】
本発明の好適な態様においては、核酸増幅法としてＰＣＲ法が使用される。ＰＣＲ法は１以上のプライマー対、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓを主な構成要素とする反応液を温度サイクル装置で処理する核酸検出技術として広く普及している。使用される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしてはＴｈｅｒｍｕｓ属細菌由来のＴａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼやそれらの変異体、好熱性古細菌由来のＰｆｕポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼやそれらの変異体が例示される。複数種のＤＮＡポリメラーゼを混合してＰＣＲを行うこともできる。ＰＣＲに適した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが多数市販されているが、それらを本発明の方法に使用することもできる。
【0038】
ｃＤＮＡ断片の合成とその増幅は一連の反応で行うことができる。本発明を限定するものではないが、逆転写とＰＣＲを一つの反応容器中で実施する１ステップＲＴ－ＰＣＲは本発明の方法に好適な態様である。ＲＴ－ＰＣＲ反応液は使用する酵素が異なるなど種々のものが知られており、また、キットの形態で市販されているものも多い。本発明の方法を１ステップのＲＴ－ＰＣＲで実施する場合、逆転写酵素と耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの２つの酵素を含むものを使用してもよく、逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ）を単独で含む反応液を使用してもよい。
【0039】
本発明の方法においてｃＤＮＡ断片の増幅に使用されるプライマー対は、本発明のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズし得る領域を含むｃＤＮＡ断片を増幅できるように設計されているものであれば、その配列には特に限定はない。このような１対のプライマーを１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加することにより、その一方のプライマーはｃＤＮＡ合成用のプライマーとしても機能する。本発明に使用されるプライマーは、増幅することが望まれるｃＤＮＡ断片に対応するウイルスゲノムＲＮＡ上の領域において存在する可能性のある変異を考慮して設計される。例えば、塩基置換の存在が懸念される場合には当該塩基部分を混合塩基としてプライマーを設計する、野生型ゲノムＲＮＡ配列と塩基置換の生じたゲノムＲＮＡ配列のそれぞれに対応する複数のプライマーを作製して併用する、等により、塩基置換の有無にかかわらず増幅されたｃＤＮＡ断片を得ることができる。特に本発明を限定するものではないが、Ｇ３３９ＨまたはＧ３３９Ｎ変異を有する変異株の検出には配列番号１の塩基配列のフォワードプライマーおよび配列番号２の塩基配列のリバースプライマーからなるプライマー対が好適である。
【0040】
さらに、適切に修飾した本発明のオリゴヌクレオチドを共存させてＲＴ－ＰＣＲを実施する場合、標的核酸、すなわち変異株のゲノム由来のｃＤＮＡ断片をＤＮＡの増幅と並行して検出することができる。前記のＴａｑＭａｎ法、サイクリングプローブ法、モレキュラービーコン法等に適したデザインとした本発明のオリゴヌクレオチドを作製し、かつ反応液組成を検出手段に適したものとすることにより、経時的、光学的に標的核酸の増幅をモニターする定量的ＲＴ－ＰＣＲを実施することができる。
【0041】
本発明の好適な態様では、１ステップＲＴ－ＰＣＲ法により、変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をリアルタイムに検出する方法が提供される。当該方法では、逆転写酵素および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（もしくは逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）、少なくとも１つのプライマー対、ｄＮＴＰｓ、蛍光物質および消光物質で標識された本発明のオリゴヌクレオチドならびにＲＴ－ＰＣＲに必要なその他の成分を含む反応液が調製され、さらに試料が添加される。この反応液は逆転写反応に適した温度で保温された後、そのまま温度サイクル反応に移行してｃＤＮＡ断片が増幅される。温度サイクル反応中にｃＤＮＡ断片の増幅量に応じた蛍光が反応液より発せられるため、それを指標として試料中に変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が存在することが確認できる。
【0042】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が有している複数の変異を１回のＲＴ－ＰＣＲで検出することができる。即ち、本発明のオリゴヌクレオチド（ａ）および（ｂ）は、一種を単独で使用してもよく、両者を併用してもよい。さらに、その他の変異を検出するためのオリゴヌクレオチドと同時に使用することもできる。このような反応系（マルチプレックスＲＴ－ＰＣＲ）は当業者に周知である。検出しようとする変異に対応する本発明のオリゴヌクレオチドのそれぞれを極大蛍光波長が異なる蛍光物質で標識しておくことにより、反応液が発する蛍光がどの蛍光物質に由来するかに基づいて、試料中に存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に生じている変異の種類を知ることができる。
【0043】
マルチプレックスＲＴ－ＰＣＲによる本発明の検出方法は、複数の本発明のオリゴヌクレオチド、当該オリゴヌクレオチドに対応する変異位置を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム由来のｃＤＮＡ断片を生成、増幅するための逆転写用プライマーおよび増幅用プライマー対、を含む反応液を使用して実施される。逆転写用プライマーと増幅用プライマー対の組合せは検出しようとする変異ごとに複数の組合せが使用されてもよく、複数の変異箇所を含むｃＤＮＡ断片を生成・増幅することができる１種の組合せであってもよい。前記のとおり、逆転写用プライマーは増幅用プライマー対の一方が兼ねていてもよい。
【0044】
ＰＣＲを利用する本発明の検出方法においては、試料中のＰＣＲ阻害物質等の影響を調べるため、さらに陽性対照核酸の増幅と検出を組み合わせてもよい。前記陽性対照核酸は、試料中に存在する、検出の対象となる遺伝子と異なる遺伝子（例えば、ハウスキーピング遺伝子など）由来の核酸であってもよい。試料中に存在する遺伝子を陽性対照核酸とする場合は、当該遺伝子の任意の領域を増幅させるためのプライマー対と検出用プローブを組み合わせて使用する。また、人工核酸を調製して試料にあらかじめ添加してもよく、例えば、標的核酸及び非標的核酸の増幅領域と同じ塩基配列を有する核酸あるいはこれらとは異なる塩基配列の核酸であってもよい。人工核酸を陽性対照核酸とする場合は、その塩基配列に応じて、標的核酸及び非標的核酸の増幅に使用されるプライマー対を使用して増幅してもよく、標的核酸及び非標的核酸の増幅領域とは異なるプライマー対を使用してもよい。当該陽性対照核酸を検出するためのプローブは、これらの陽性対照核酸を選択的に検出できるものを使用する。本発明の標的核酸の検出と同時にこれらの陽性対照核酸の検出を行うことにより、本発明の検出系での増幅に異常かないかどうかの確認、並びに増幅曲線の比較による標的核酸の初期量の半定量的な解析が可能となる。
【0045】
さらに、本発明の検出方法はＰＣＲに有用な公知の成分を含む反応液を使用して実施してもよい。前記成分には特に限定はないが、例えば、界面活性剤、タンパク質（ウシ血清アルブミン、ゼラチン、核酸結合性タンパク質等）、両性物質（ベタイン等）、酸性高分子物質、ＰＣＮＡ（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ）等が挙げられる。
【0046】
１ステップＲＴ－ＰＣＲにおける逆転写反応、ＰＣＲの条件（反応温度、保持時間、熱サイクルの回数等）は適宜設定すればよい。例えば、市販のＲＴ－ＰＣＲキット（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット等）で推奨されている条件や、それを改変した条件で反応を実施してもよい。本発明のオリゴヌクレオチドの塩基配列や鎖長、使用するプライマーの塩基配列や鎖長、増幅されるＤＮＡ断片の鎖長等を考慮して反応条件を設定すべきことは、当業者には周知である。
【0047】
並行して複数のＰＣＲ試験を実施する場合、反応後に生成した増幅ＤＮＡ断片が反応前の他の反応液へ混入すると誤った試験結果を生み出す。このような反応液の汚染を防止する方法が知られている。鎖中にウラシル（Ｕ）が取り込まれているＤＮＡにウラシル－Ｎ－グリコシラーゼ（ＵＮＧ）を作用させると、このＤＮＡはウラシルの位置で切断される。ｄＵＴＰを含有するＰＣＲ反応液を用いて増幅されたＤＮＡ断片はウラシルを含有するが、この増幅ＤＮＡ断片が反応実施前の他の反応液（ｄＵＴＰと易熱性ＵＮＧを含有する反応液）に混入した場合には、反応開始前に反応液をＵＮＧの作用する温度に保温することで、混入ＤＮＡを分解して鋳型としての機能を失わせることができる。続いて行われるＰＣＲの温度サイクルでＵＮＧは失活するため、増幅時にはＵを取り込んだＤＮＡの分解は起こらない。本発明の検出方法においても、ｄＵＴＰと易熱性のＵＮＧを含む反応液を使用して相互汚染を防ぐことができる。
【0048】
本発明の方法が適用される試料には特に限定はない。変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が存在していると疑われるすべての試料、例えば生体由来試料や環境由来試料が本発明の方法の対象となる。前記の生体由来試料は特に限定はされないが、口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻咽頭拭い液、鼻腔吸引液、喀痰、気管支洗浄液、肺胞洗浄液、直腸拭い液、各種の体液（唾液、血液、脳脊髄液、汗）、組織、尿または便懸濁液が例示される。また環境由来試料として、環境水（海水、河川水、湖沼水、下水、家庭排水、産業排水等）、スワブなどによる物体表面の拭取り操作で得られた採取物や空気中からの捕集物の懸濁液が挙げられる。これら試料はそのまま本発明の方法に供してもよいが、簡易的な処理（熱処理、希釈、濃縮、不溶物除去、可溶化処理、細胞溶解処理、夾雑タンパク質の変性または分解等）あるいは核酸の精製を行った後に使用することもできる。処理の方法は、試料中に含まれる核酸量や夾雑物の性質および量を考慮して選択される。前記の試料は、それぞれを個別に本発明の検出方法に供してもよく、複数の試料を混合したうえで本発明の検出方法に供してもよい。
【0049】
「本発明のキット」
【0050】
本発明は、本発明の変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法に使用されるキットを提供する。
【0051】
本発明のキットは、前記の本発明のオリゴヌクレオチドと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに相補的なＤＮＡまたはその断片を合成するための試薬を含むことを特徴とする。
【0052】
「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに相補的なＤＮＡを合成するための試薬」としては、逆転写酵素またはｃＤＮＡ合成用プライマーが挙げられる。本発明のキットには、例えば、本発明のオリゴヌクレオチドとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムを鋳型としたｃＤＮＡの合成に使用されるプライマーとを含むキット、本発明のオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ合成用プライマーに加えて逆転写酵素を含むキット、等が包含される。後者は、さらに、逆転写反応液の調製に使用されるその他の成分（例えば緩衝成分、２価金属塩、ｄＮＴＰｓ等）を含んでいてもよい。これらはそれぞれ、本発明の検出方法において説明されたものを使用することができる。
【0053】
さらに、本発明のキットはｃＤＮＡを増幅するための試薬を含むことができる。特に本発明を限定するものではないが、例えばＰＣＲ法によりｃＤＮＡを増幅するための試薬、すなわち耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ウイルスゲノム上のスパイクタンパク質をコードする領域に相当するｃＤＮＡを増幅できるように設計されたプライマー対、ＰＣＲ用の反応液を調製するための各種の成分を含むことができる。
【0054】
本発明の好適な態様においては、１ステップのＲＴ－ＰＣＲによってウイルスゲノムからのｃＤＮＡ断片の合成、ｃＤＮＡ断片の増幅、標的核酸の検出、を一つの反応容器で実施するための各種試薬を含むキットが提供される。当該キットは、標的核酸を光学的に検出できるよう設計、標識された本発明のオリゴヌクレオチド、逆転写酵素および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（もしくは逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）、少なくとも１対のプライマー、ＲＴ－ＰＣＲ用の反応液を調製するための各種成分（緩衝成分、２価金属塩、ｄＮＴＰｓ、等）を含む。さらに、複数種の本発明のオリゴヌクレオチドを含むキットや、本発明のオリゴヌクレオチドと他の変異を検出するためのオリゴヌクレオチドとを含むキットとしてもよい。本発明の一つの態様としては、例えばＧ３３９位の変異と他の変異の両方を検出可能なマルチプレックスＲＴ－ＰＣＲ用のキットや、Ｇ３３９位における変異（Ｇ３９９Ｄ、Ｇ３９９Ｈ、Ｇ３９９Ｎ）のタイピングキットが例示される。
【0055】
前記の各種成分は、それぞれ別の容器に収納され、用時にＲＴ－ＰＣＲ用の反応液を調製するように構成されていてもよく、複数の成分からなる混合物としてキットに含まれていてもよい。試料以外の反応に必要な成分のすべてを含み、適切に処理および／または希釈した試料と混合するだけで反応液を調製できるプレミックス形態の試薬を含むキットも本発明に包含される。さらに、本発明のキットは、試料の処理や試料からの核酸精製に使用される試薬や器具、反応阻害物質の存在を判断するための指標となる陽性対照と陽性対照増幅・検出用のプライマー、プローブ等を含んでもよい。
【0056】
本発明のキットはＰＣＲに有用な公知の成分を含んでいてもよい。前記成分には特に限定はないが、例えば、界面活性剤、タンパク質（ウシ血清アルブミン、ゼラチン、核酸結合性タンパク質等）、両性物質（ベタイン等）、酸性高分子物質、ＰＣＮＡ等が挙げられる。
【実施例0057】
以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【0058】
実施例１
Ｇ３３９Ｈ、Ｇ３３９Ｎ変異を検出するためのプライマーセットとプローブ
本発明の検出方法によるＧ３３９Ｈ、Ｇ３３９Ｎ変異の検出について検討した。まず、配列番号１と２のフォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ合成し、プライマー対＃１とした（表２）。次にこのプライマー対と、表３に記載した、配列中にＬＮＡを含む計１１種のプローブ（名称に「Ｇ３３９Ｈ」を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＢＡ.２．７５株検出用；名称に「Ｇ３３９Ｎ」を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＢＡ.２．２４株異検出用）を含む１～１１の反応セットをそれぞれ構築した。Ｇ３３９Ｈ変異検出用プローブの５’末端をＦＡＭ、３’末端をＢＨＱ（登録商標）１でそれぞれ標識した。またＧ３３９Ｎ変異検出用のプローブの５’末端をＣｙ５、３’末端をＢＨＱ（登録商標）２でそれぞれ標識した。
Ｇ３３９Ｈ、Ｇ３３９Ｎ変異を検出するためのプライマーセットとプローブ
本発明の検出方法によるＧ３３９Ｈ、Ｇ３３９Ｎ変異の検出について検討した。まず、配列番号１と２のフォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ合成し、プライマー対＃１とした（表２）。次にこのプライマー対と、表３に記載した、配列中にＬＮＡを含む計１１種のプローブ（名称に「Ｇ３３９Ｈ」を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＢＡ.２．７５株検出用；名称に「Ｇ３３９Ｎ」を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＢＡ.２．２４株異検出用）を含む１～１１の反応セットをそれぞれ構築した。Ｇ３３９Ｈ変異検出用プローブの５’末端をＦＡＭ、３’末端をＢＨＱ（登録商標）１でそれぞれ標識した。またＧ３３９Ｎ変異検出用のプローブの５’末端をＣｙ５、３’末端をＢＨＱ（登録商標）２でそれぞれ標識した。
【0059】
【表2】
【0060】
【表3】
【0061】
また試験用の検体として、以下の４種のＲＮＡを作製した。野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムのスパイクタンパク領域配列を有する１本鎖ＲＮＡ（配列番号１６）；スパイクタンパクに対応するＲＮＡの配列において、オミクロン株として報告されている変異、Ａ６７Ｖ、Ｈ６９ｄｅｌ、Ｖ７０ｄｅｌ、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Ｖ１４３ｄｅｌ、Ｙ１４４ｄｅｌ、Ｙ１４５ｄｅｌ、Ｎ２１１ｄｅｌ、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９Ｋ、Ｌ９８１Ｆ、に対応するすべての変異を有する１本鎖ＲＮＡ（配列番号１７）（なお、ｄｅｌは当該アミノ酸の欠失を、ｉｎｓ２１４ＥＰＥはＲ２１４とＤ２１５の間への３アミノ酸の挿入を、それぞれ意味する）；配列番号１７のＲＮＡにおけるＧ３３９Ｄ変異が、ＢＡ．２．７５株の特徴であるＧ３３９Ｈ変異に置換されている１本鎖ＲＮＡ（配列番号１８）；配列番号１７のＲＮＡにおけるＧ３３９Ｄ変異が、ＢＡ．２．２４の特徴であるＧ３３９Ｎ変異に置換されている１本鎖ＲＮＡ（配列番号１９）。これらの１本鎖ＲＮＡは、その塩基配列に対応する二本鎖ＤＮＡを人工合成してプラスミドｐＶＡＸ１のマルチクローニングサイト（Ｎｈｅ Ｉ－Ｘｂａ Ｉ）に既知の手法で挿入した後、この組換えプラスミドを鋳型としたｉｎ ｖｉｔｒｏの転写反応によって調製した。これらの４種のＲＮＡを本明細書中では、Ｇ３３９＿ＷＩＬＤ＿ＲＮＡ、Ｇ３３９Ｄ＿ＯＭＩＣＲＯＮ＿ＲＮＡ、Ｇ３３９Ｈ＿ＢＡ．２．７５＿ＲＮＡ、Ｇ３３９Ｎ＿ＢＡ．２．２４＿ＲＮＡと記載する。
ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏに５０００コピー／μｌとなるようにＧ３３９＿ＷＩＬＤ＿ＲＮＡ、Ｇ３３９Ｄ＿ＯＭＩＣＲＯＮ＿ＲＮＡ、Ｇ３３９Ｈ＿ＢＡ．２．７５＿ＲＮＡ、Ｇ３３９Ｎ＿ＢＡ．２．２４＿ＲＮＡのそれぞれを添加し、試験検体溶液とした。またネガティブコントロールとしてはＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏを用意した。
試験検体の検出には、市販されている製品名ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製、製品＃ＲＣ３３０Ａ）のコンポーネントを使用した。すなわち前記した試験検体溶液１μｌと酵素・基質等を含むＲＴ－ｑＰＣＲ Ｍｉｘ １５μｌ、加熱処理済みのＳｏｌｕｔｉｏｎ Ａ １．２μｌ、ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＤｙｅＩＩ（５０Ｘ） ０．６μｌ、フォワードプライマー（最終濃度０．４μＭ）及びリバースプライマー（最終濃度０．４μＭ）、４種のプローブ（それぞれ最終濃度０．２μＭ）を混合し、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏで、最終容量３０μｌの１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。
ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏに５０００コピー／μｌとなるようにＧ３３９＿ＷＩＬＤ＿ＲＮＡ、Ｇ３３９Ｄ＿ＯＭＩＣＲＯＮ＿ＲＮＡ、Ｇ３３９Ｈ＿ＢＡ．２．７５＿ＲＮＡ、Ｇ３３９Ｎ＿ＢＡ．２．２４＿ＲＮＡのそれぞれを添加し、試験検体溶液とした。またネガティブコントロールとしてはＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏを用意した。
試験検体の検出には、市販されている製品名ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製、製品＃ＲＣ３３０Ａ）のコンポーネントを使用した。すなわち前記した試験検体溶液１μｌと酵素・基質等を含むＲＴ－ｑＰＣＲ Ｍｉｘ １５μｌ、加熱処理済みのＳｏｌｕｔｉｏｎ Ａ １．２μｌ、ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＤｙｅＩＩ（５０Ｘ） ０．６μｌ、フォワードプライマー（最終濃度０．４μＭ）及びリバースプライマー（最終濃度０．４μＭ）、４種のプローブ（それぞれ最終濃度０．２μＭ）を混合し、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏで、最終容量３０μｌの１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。
【0062】
上記の組成で、表３記載の各セットのプライマー・プローブを含む反応液を調製した。実験精度を高めるため２連で試験を実施した。
【0063】
また、サーマルサイクラーは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標） ５ リアルタイムＰＣＲシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いた。ＲＴ－ＰＣＲ条件は、５２℃ ５分、９５℃ １０秒の後、９５℃ ５秒、６０℃ ３０秒を１サイクルとする４５サイクル反応とした。４種の鋳型を用いた反応のうちＣｔ値及び蛍光値が得られたＧ３３９Ｈ＿ＢＡ．２．７５＿ＲＮＡ、Ｇ３３９Ｎ＿ＢＡ．２．２４＿ＲＮＡの鋳型ＲＮＡを用いた反応結果を表４に示した。
【0064】
【表4】
【0065】
結果
検討の結果、表３のすべての組み合わせにおいてプローブに対応するＲＮＡを検出することが確認できた。特に反応セット２、４はＧ３３９Ｈ＿ＢＡ．２．７５＿ＲＮＡを小さなＣｔ値、高い蛍光強度で検出できた。また、反応セット７、９、１０は、Ｇ３３９Ｎ＿ＢＡ．２．２４＿ＲＮＡの鋳型ＲＮＡを小さなＣｔ値、高い蛍光強度で検出できた。
すなわち、配列番号４、６、９、１１、１２のオリゴヌクレオチドはＧ３３９位のアミノ酸置換変異を高感度で判別できることが分かった。
なお、Ｇ３３９＿ＷＩＬＤ＿ＲＮＡ、Ｇ３３９Ｄ＿ＯＭＩＣＲＯＮ＿ＲＮＡを鋳型にした場合および、検体に変えてネガティブコントロールを加えた場合は、増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、表３のすべての組み合わせにおいてプローブに対応するＲＮＡを検出することが確認できた。特に反応セット２、４はＧ３３９Ｈ＿ＢＡ．２．７５＿ＲＮＡを小さなＣｔ値、高い蛍光強度で検出できた。また、反応セット７、９、１０は、Ｇ３３９Ｎ＿ＢＡ．２．２４＿ＲＮＡの鋳型ＲＮＡを小さなＣｔ値、高い蛍光強度で検出できた。
すなわち、配列番号４、６、９、１１、１２のオリゴヌクレオチドはＧ３３９位のアミノ酸置換変異を高感度で判別できることが分かった。
なお、Ｇ３３９＿ＷＩＬＤ＿ＲＮＡ、Ｇ３３９Ｄ＿ＯＭＩＣＲＯＮ＿ＲＮＡを鋳型にした場合および、検体に変えてネガティブコントロールを加えた場合は、増幅産物は確認されなかった。
【0066】
実施例２
Ｇ３３９位のタイピング
本発明の検出方法によるＧ３３９位のタイピングについて検討した。まず、実施例１で用意した表２に記載のプライマー対＃１と、実施例１で作製したプローブの混合物（Ｇ３３９Ｈ＿ＬＮＡ＿５およびＧ３３９Ｎ＿ＬＮＡ＿２の混合物、ならびにＧ３３９Ｈ＿ＬＮＡ＿５およびＧ３３９Ｎ＿ＬＮＡ＿５の混合物）で構成される反応セット１２、１３のセットをそれぞれ構築した。
Ｇ３３９位のタイピング
本発明の検出方法によるＧ３３９位のタイピングについて検討した。まず、実施例１で用意した表２に記載のプライマー対＃１と、実施例１で作製したプローブの混合物（Ｇ３３９Ｈ＿ＬＮＡ＿５およびＧ３３９Ｎ＿ＬＮＡ＿２の混合物、ならびにＧ３３９Ｈ＿ＬＮＡ＿５およびＧ３３９Ｎ＿ＬＮＡ＿５の混合物）で構成される反応セット１２、１３のセットをそれぞれ構築した。
【0067】
試験用の検体として実施例１の４種の鋳型ＲＮＡを使用した。またネガティブコントロールとしてはＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏを用意した。
【0068】
ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏに５０コピー／μｌ、５００コピー／μｌ、５０００コピー／μｌとなるように鋳型ＲＮＡそれぞれを添加し、試験検体溶液とした。試験検体の検出には、市販されている製品名ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製、製品＃ＲＣ３３０Ａ）のコンポーネントを使用した。すなわち前記した試験検体溶液１μｌと酵素・基質等を含むＲＴ－ｑＰＣＲ Ｍｉｘ １５μｌ、加熱処理済みのＳｏｌｕｔｉｏｎ Ａ １．２μｌ、ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＤｙｅＩＩ（５０Ｘ） ０．６μｌ、フォワードプライマー（最終濃度０．４μＭ）及びリバースプライマー（最終濃度０．４μＭ）、２種のプローブ混合物（各プローブはそれぞれ最終濃度０．２μＭ）を混合し、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏで、最終容量３０μｌの１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。
【0069】
上記の組成で、表５記載の各セットのプライマー・プローブを含む反応液を調製した。実験精度を高めるため２連で試験を実施した。
【0070】
【表5】
【0071】
ＲＴ－ＰＣＲ条件は、５２℃ ５分、９５℃ １０秒の後、９５℃ ５秒、６０℃ ３０秒を１サイクルとする４５サイクル反応とした。４種の鋳型を用いた反応のうちＣｔ値及び蛍光値が得られたＧ３３９Ｈ＿ＢＡ．２．７５＿ＲＮＡ、Ｇ３３９Ｎ＿ＢＡ．２．２４＿ＲＮＡの鋳型ＲＮＡを用いた反応結果を表６に示した。
【0072】
【表6】
【0073】
結果
検討の結果、表５すべての組み合わせにおいてプローブに対応するＲＮＡを検出することが確認できた。特に反応セット１２、Ｇ３３９Ｈ＿ＢＡ．２．７５＿ＲＮＡ、Ｇ３３９Ｎ＿ＢＡ．２．２４＿ＲＮＡの鋳型ＲＮＡを小さなＣｔ値、高い蛍光強度で検出できた。なお、Ｇ３３９Ｈ＿ＢＡ．２．７５＿ＲＮＡを含む反応液ではＣｙ５に由来する蛍光は測定されず、また、Ｇ３３９Ｎ＿ＢＡ．２．２４＿ＲＮＡを含む反応液ではＦＡＭに由来する蛍光は測定されなかった。
すなわち、配列番号６、９、１２のオリゴヌクレオチドはＧ３３９位のアミノ酸置換変異を高精度で判別できることが分かった。
なお、Ｇ３３９＿ＷＩＬＤ＿ＲＮＡ、Ｇ３３９Ｄ＿ＯＭＩＣＲＯＮ＿ＲＮＡを鋳型にした場合および、検体に変えてネガティブコントロールを加えた場合は、Ｃｙ５、ＦＡＭのどちらに由来する蛍光も測定されなかった。
検討の結果、表５すべての組み合わせにおいてプローブに対応するＲＮＡを検出することが確認できた。特に反応セット１２、Ｇ３３９Ｈ＿ＢＡ．２．７５＿ＲＮＡ、Ｇ３３９Ｎ＿ＢＡ．２．２４＿ＲＮＡの鋳型ＲＮＡを小さなＣｔ値、高い蛍光強度で検出できた。なお、Ｇ３３９Ｈ＿ＢＡ．２．７５＿ＲＮＡを含む反応液ではＣｙ５に由来する蛍光は測定されず、また、Ｇ３３９Ｎ＿ＢＡ．２．２４＿ＲＮＡを含む反応液ではＦＡＭに由来する蛍光は測定されなかった。
すなわち、配列番号６、９、１２のオリゴヌクレオチドはＧ３３９位のアミノ酸置換変異を高精度で判別できることが分かった。
なお、Ｇ３３９＿ＷＩＬＤ＿ＲＮＡ、Ｇ３３９Ｄ＿ＯＭＩＣＲＯＮ＿ＲＮＡを鋳型にした場合および、検体に変えてネガティブコントロールを加えた場合は、Ｃｙ５、ＦＡＭのどちらに由来する蛍光も測定されなかった。
【産業上の利用可能性】
【0074】
変異型遺伝子を特異的に増幅し、高感度に検出することができる本発明の技術を用いて変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出することが出来る。当該方法は、遺伝子工学、生物学、医学等幅広い分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【0075】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１：Ｇ３３９Ｄ＿６＿Ｆ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２：Ｇ３３９Ｄ＿６＿Ｒ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３：Ｇ３３９Ｈ＿ＬＮＡ＿２．５’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ｂｙ ＦＡＭ ａｎｄ ３’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＢＨＱ１．Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ （ＬＮＡ） Ｐｒｏｂｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４：Ｇ３３９Ｈ＿ＬＮＡ＿３．５’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＦＡＭ ａｎｄ ３’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＢＨＱ１．Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ （ＬＮＡ） Ｐｒｏｂｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５：Ｇ３３９Ｈ＿ＬＮＡ＿４．５’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＦＡＭ ａｎｄ ３’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＢＨＱ１．Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ （ＬＮＡ） Ｐｒｏｂｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ６：Ｇ３３９Ｈ＿ＬＮＡ＿５．５’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＦＡＭ ａｎｄ ３’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＢＨＱ１．Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ （ＬＮＡ） Ｐｒｏｂｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ７：Ｇ３３９Ｈ＿ＬＮＡ＿６．５’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＦＡＭ ａｎｄ ３’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＢＨＱ１．Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ （ＬＮＡ） Ｐｒｏｂｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８：Ｇ３３９Ｎ＿ＬＮＡ＿１．５’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ Ｃｙ５ ａｎｄ ３’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＢＨＱ２．Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ （ＬＮＡ） Ｐｒｏｂｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９：Ｇ３３９Ｎ＿ＬＮＡ＿２．５’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ Ｃｙ５ ａｎｄ ３’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＢＨＱ２．Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ （ＬＮＡ） Ｐｒｏｂｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１０：Ｇ３３９Ｎ＿ＬＮＡ＿３．５’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ Ｃｙ５ ａｎｄ ３’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＢＨＱ２．Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ （ＬＮＡ） Ｐｒｏｂｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１１：Ｇ３３９Ｎ＿ＬＮＡ＿４．５’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ Ｃｙ５ ａｎｄ ３’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＢＨＱ２．Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ （ＬＮＡ） Ｐｒｏｂｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１２：Ｇ３３９Ｎ＿ＬＮＡ＿５．５’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ Ｃｙ５ ａｎｄ ３’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＢＨＱ２．Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ （ＬＮＡ） Ｐｒｏｂｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１３：Ｇ３３９Ｎ＿ＬＮＡ＿６．５’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ Ｃｙ５ ａｎｄ ３’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＢＨＱ２．Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ （ＬＮＡ） Ｐｒｏｂｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１４：Ｇ３３９Ｈ＿Ｃｏｒｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１５：Ｇ３３９Ｎ＿Ｃｏｒｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１６：Ｇ３３９＿ＷＩＬＤ＿ＲＮＡ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１７：Ｇ３３９Ｄ＿ＯＭＩＣＲＯＮ＿ＲＮＡ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１８：Ｇ３３９Ｈ＿ＢＡ．２．７５＿ＲＮＡ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１９：Ｇ３３９Ｎ＿ＢＡ．２．２４＿ＲＮＡ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２：Ｇ３３９Ｄ＿６＿Ｒ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３：Ｇ３３９Ｈ＿ＬＮＡ＿２．５’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ｂｙ ＦＡＭ ａｎｄ ３’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＢＨＱ１．Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ （ＬＮＡ） Ｐｒｏｂｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４：Ｇ３３９Ｈ＿ＬＮＡ＿３．５’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＦＡＭ ａｎｄ ３’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＢＨＱ１．Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ （ＬＮＡ） Ｐｒｏｂｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５：Ｇ３３９Ｈ＿ＬＮＡ＿４．５’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＦＡＭ ａｎｄ ３’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＢＨＱ１．Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ （ＬＮＡ） Ｐｒｏｂｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ６：Ｇ３３９Ｈ＿ＬＮＡ＿５．５’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＦＡＭ ａｎｄ ３’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＢＨＱ１．Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ （ＬＮＡ） Ｐｒｏｂｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ７：Ｇ３３９Ｈ＿ＬＮＡ＿６．５’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＦＡＭ ａｎｄ ３’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＢＨＱ１．Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ （ＬＮＡ） Ｐｒｏｂｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８：Ｇ３３９Ｎ＿ＬＮＡ＿１．５’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ Ｃｙ５ ａｎｄ ３’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＢＨＱ２．Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ （ＬＮＡ） Ｐｒｏｂｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９：Ｇ３３９Ｎ＿ＬＮＡ＿２．５’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ Ｃｙ５ ａｎｄ ３’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＢＨＱ２．Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ （ＬＮＡ） Ｐｒｏｂｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１０：Ｇ３３９Ｎ＿ＬＮＡ＿３．５’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ Ｃｙ５ ａｎｄ ３’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＢＨＱ２．Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ （ＬＮＡ） Ｐｒｏｂｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１１：Ｇ３３９Ｎ＿ＬＮＡ＿４．５’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ Ｃｙ５ ａｎｄ ３’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＢＨＱ２．Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ （ＬＮＡ） Ｐｒｏｂｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１２：Ｇ３３９Ｎ＿ＬＮＡ＿５．５’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ Ｃｙ５ ａｎｄ ３’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＢＨＱ２．Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ （ＬＮＡ） Ｐｒｏｂｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１３：Ｇ３３９Ｎ＿ＬＮＡ＿６．５’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ Ｃｙ５ ａｎｄ ３’－ｅｎｄ ｉｓ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＢＨＱ２．Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ （ＬＮＡ） Ｐｒｏｂｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１４：Ｇ３３９Ｈ＿Ｃｏｒｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１５：Ｇ３３９Ｎ＿Ｃｏｒｅ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１６：Ｇ３３９＿ＷＩＬＤ＿ＲＮＡ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１７：Ｇ３３９Ｄ＿ＯＭＩＣＲＯＮ＿ＲＮＡ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１８：Ｇ３３９Ｈ＿ＢＡ．２．７５＿ＲＮＡ．
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１９：Ｇ３３９Ｎ＿ＢＡ．２．２４＿ＲＮＡ．
【配列表】