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特開2024-50434イソプレノイドの製造方法、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024050434
(43)【公開日】2024-04-10
(54)【発明の名称】イソプレノイドの製造方法、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12P 5/00 20060101AFI20240403BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240403BHJP
C12N 15/29 20060101ALN20240403BHJP
【ＦＩ】
C12P5/00 ZNA
C12P21/02 C
C12N15/29
【審査請求】未請求
【請求項の数】14
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023139447
(22)【出願日】2023-08-30
(31)【優先権主張番号】P 2022156572
(32)【優先日】2022-09-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000183233
【氏名又は名称】住友ゴム工業株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】504190548
【氏名又は名称】国立大学法人埼玉大学
(71)【出願人】
【識別番号】504157024
【氏名又は名称】国立大学法人東北大学
(71)【出願人】
【識別番号】504160781
【氏名又は名称】国立大学法人金沢大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000914
【氏名又は名称】弁理士法人ＷｉｓｅＰｌｕｓ
(72)【発明者】
【氏名】山口 晴彦
(72)【発明者】
【氏名】井之上（宮城） ゆき乃
(72)【発明者】
【氏名】戸澤 譲
(72)【発明者】
【氏名】高橋 征司
(72)【発明者】
【氏名】中山 亨
(72)【発明者】
【氏名】山下 哲
【テーマコード（参考）】
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B064AB01
4B064AD85
4B064AH01
(57)【要約】
【課題】 生成物への夾雑物の混入を減少させることが可能なイソプレノイドの酵素反応的製造方法を提供する。
【解決手段】 イソプレノイドを内包する脂質一重膜に結合させたプレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質を用いたイソプレノイドの製造方法。
【選択図】図２
【解決手段】 イソプレノイドを内包する脂質一重膜に結合させたプレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質を用いたイソプレノイドの製造方法。
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
イソプレノイドを内包する脂質一重膜に結合させたプレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質を用いたイソプレノイドの製造方法。
【請求項2】
前記脂質一重膜が人工合成された脂質一重膜である請求項１記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項3】
前記プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質が、炭素数６０以上の生成物を合成することができるプレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質である請求項１又は２記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項4】
前記プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質が、
以下のアミノ酸配列（Ａ）：
ＤＧＮＸ１ＲＸ２Ａ （Ａ） （アミノ酸配列（Ａ）中、Ｘ１及びＸ２は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す）
を有するシス型プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質、
又は
以下のアミノ酸配列（Ｂ－１）若しくは（Ｂ－２）：
ＤＤＸ１Ｘ２Ｄ （Ｂ－１） （アミノ酸配列（Ｂ－１）中、Ｘ１、Ｘ２は任意のアミノ酸残基を表す）
ＤＤＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｄ （Ｂ－２）（アミノ酸配列（Ｂ－２）中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す）
を有するトランス型プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質である請求項１又は２記載のイソプレノイドの製造方法。
以下のアミノ酸配列（Ａ）：
ＤＧＮＸ１ＲＸ２Ａ （Ａ） （アミノ酸配列（Ａ）中、Ｘ１及びＸ２は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す）
を有するシス型プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質、
又は
以下のアミノ酸配列（Ｂ－１）若しくは（Ｂ－２）：
ＤＤＸ１Ｘ２Ｄ （Ｂ－１） （アミノ酸配列（Ｂ－１）中、Ｘ１、Ｘ２は任意のアミノ酸残基を表す）
ＤＤＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｄ （Ｂ－２）（アミノ酸配列（Ｂ－２）中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す）
を有するトランス型プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質である請求項１又は２記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項5】
前記プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質が、ポリイソプレノイド産生植物由来である請求項１又は２記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項6】
前記ポリイソプレノイド産生植物が、Ｈｅｖｅａ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ属、又はＭａｎｉｌｋａｒａ属に属する植物である請求項５記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項7】
前記ポリイソプレノイド産生植物が、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（パラゴムノキ）、Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ（ロシアンタンポポ）、Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ（グアユール）、又はＭａｎｉｌｋａｒａ ｚａｐｏｔａ（サポジラ）である請求項５記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項8】
前記脂質一重膜に内包されるイソプレノイドがスクアレン及びカロテノイドからなる群から選択される少なくとも１種である請求項１又は２記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項9】
前記脂質一重膜に内包されるイソプレノイドがスクアレンである請求項１又は２記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項10】
前記脂質一重膜に内包されるイソプレノイドがスクアレン及びカロテノイドである請求項１又は２記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項11】
前記プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質を、生体外で、前記脂質一重膜に結合させる結合工程を含む請求項１又は２記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項12】
前記結合工程が、前記プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液と、前記脂質一重膜とを共存させて蛋白質合成を行い、前記脂質一重膜に、プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質を結合させる工程である請求項１０記載のイソプレノイドの製造方法。
【請求項13】
請求項１又は２に記載のイソプレノイドの製造方法によりイソプレノイドを製造する工程、得られたイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法。
【請求項14】
請求項１又は２に記載のイソプレノイドの製造方法によりイソプレノイドを製造する工程、得られたイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、イソプレノイドの製造方法、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴム（ポリイソプレノイドの１種）は、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）やクワ科植物のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）などのゴム産生植物を栽培することで得られるが、このような天然ゴムは、イソプレン単位がシス型に結合したポリイソプレノイド（シス型の天然ゴム）である。他方、天然には、イソプレン単位がトランス型に結合したポリイソプレノイドであるトランス型ポリイソプレノイドも存在する。
【0003】
これらイソプレノイドを試験管内で合成する試みが行われている（例えば、特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２０１８－０９９１００号公報
【特許文献2】特開２０２１－０１３３６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明者らが鋭意検討した結果、以下の知見が明らかとなった。
従来の膜粒子を利用したポリイソプレノイド合成方法で利用される膜としては、ゴム産生植物から採取したゴム粒子や藻や植物から採取された油滴といった生物から採取した天然由来の膜粒子が利用されていた。
ゴム粒子や油滴は、天然物由来であるため、もともと膜上に酵素が存在する。それにより、膜粒子上に反応させたい酵素を結合させた後に酵素反応を行った際に、もともと膜上に存在する酵素が別反応を起こし、望む生成物以外の副反応物が生成してしまう可能性が高い。
本発明は、前記課題を解決し、生成物への夾雑物の混入を減少させることが可能なイソプレノイドの酵素反応的製造方法を提供することを目的とする。
従来の膜粒子を利用したポリイソプレノイド合成方法で利用される膜としては、ゴム産生植物から採取したゴム粒子や藻や植物から採取された油滴といった生物から採取した天然由来の膜粒子が利用されていた。
ゴム粒子や油滴は、天然物由来であるため、もともと膜上に酵素が存在する。それにより、膜粒子上に反応させたい酵素を結合させた後に酵素反応を行った際に、もともと膜上に存在する酵素が別反応を起こし、望む生成物以外の副反応物が生成してしまう可能性が高い。
本発明は、前記課題を解決し、生成物への夾雑物の混入を減少させることが可能なイソプレノイドの酵素反応的製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下の知見が明らかとなった。
【0007】
本発明者らは、ゴム粒子や油滴等の天然物由来の膜粒子に代えて、人工膜粒子を使用することを考えた。酵素反応に利用される人工膜粒子としては、リポソームが一般的である。しかしながら、リポソームは一般的に脂質二重膜構造で、水溶液を内包していることが多い。また、ナノディスクといったリポソームよりも小さく、内包物を含まない人工膜も存在する。更に油滴のような油（トリアシルグリセロール（ＴＡＧ））を含む人工一重膜の作製方法やそれを用いた酵素アッセイなどの報告例がある。
【0008】
広く利用されているリポソームは水溶液を内包しているため、リポソームの中は親水性であり疎水性の化合物を蓄積する場としては最適ではない。また、疎水性化合物であるトリアシルグリセロールを含む人工一重膜が存在するがイソプレノイドを蓄積する場として最適かどうかが不明である。このように、公知の人工膜粒子は、疎水性の化合物であるイソプレノイドの合成を行う上で、反応場として最適であるのか不明な状況である。
【0009】
特開２０２２－７３２３３号公報には、人工膜粒子として、ダイズ由来リン脂質を使用した脂質二重膜が使用されているが、脂質二重膜内に含まれる化合物については何ら言及がない。
【0010】
本発明者らは、鋭意検討した結果、人工膜粒子として、脂質一重膜が好適なこと、脂質一重膜に内包する物質は、イソプレノイドが好ましいことを見出して、本発明を完成させた。
【0011】
すなわち、本発明は、イソプレノイドを内包する脂質一重膜に結合させたプレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質を用いたイソプレノイドの製造方法に関する。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、イソプレノイドを内包する脂質一重膜に結合させたプレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質を用いたイソプレノイドの製造方法であるので、生成物への夾雑物の混入を減少させることが可能な、イソプレノイドを酵素反応的に生体外で製造する方法を提供することが可能となる。
【0013】
本発明の空気入りタイヤの製造方法は、前記イソプレノイドの製造方法によりイソプレノイドを製造する工程、得られたイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法であるので、夾雑物量が減少したイソプレノイドから空気入りタイヤを製造するため、イソプレノイドを用いた空気入りタイヤを生産性よく製造することができる。
【0014】
本発明のゴム製品の製造方法は、前記イソプレノイドの製造方法によりイソプレノイドを製造する工程、得られたイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法であるので、夾雑物量が減少したイソプレノイドからゴム製品を製造するため、イソプレノイドを用いたゴム製品を生産性よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】ゴム粒子、油滴の構造を模式的に示す図である。
【図2】脂質一重膜の構造を模式的に示す図である。
【図3】ポリイソプレノイドの生合成経路の一部を示す模式図である。
【図4】種々の生物由来のＣＰＴファミリー蛋白質のマルチプルシーケンスアライメントを行った様子を示す概略図である。
【図5】種々の生物由来のｔＰＴファミリー蛋白質のマルチプルシーケンスアライメントを行った様子を示す概略図である。
【図6】ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果の一例を示す図である。
【図7】ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果の一例を示す図である。
【図8】活性測定結果の一例を示す図である。
【図9】ＧＰＣの結果の一例を示す図である。
【図10】ＧＰＣの結果の一例を示す図である。
【図11】活性測定結果の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明のイソプレノイドの製造方法は、イソプレノイドを内包する脂質一重膜に結合させたプレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質を用いる。具体的には、本発明のイソプレノイドの製造方法は、イソプレノイドを内包する脂質一重膜に結合させたプレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質を用いてイソプレノイドを製造（酵素反応的に製造）するイソプレノイド製造工程を含む。
なお、本発明の製造方法は、前記イソプレノイド製造工程を含む限りその他の工程を含んでいてもよく、また、各工程は１回行われてもよいし、複数回繰り返し行われてもよい。
本発明において、前記効果が得られる理由は明らかではないが、以下のように推測される。
なお、本発明の製造方法は、前記イソプレノイド製造工程を含む限りその他の工程を含んでいてもよく、また、各工程は１回行われてもよいし、複数回繰り返し行われてもよい。
本発明において、前記効果が得られる理由は明らかではないが、以下のように推測される。
【0017】
（膜粒子の種類について）
前記の通り、従来の膜粒子を利用したポリイソプレノイド合成方法において利用される膜粒子であるゴム粒子や油滴は、天然物由来であるため、もともと膜上に酵素（例えば、図１で示す膜タンパク質）が存在するため、膜粒子上に反応させたい酵素を結合させた後に酵素反応を行った際に、もともと膜上に存在する酵素が別反応を起こし、望む生成物以外の副反応物が生成してしまう可能性が高い。
一方、本発明では、反応場であり、その内部に生成物を蓄積する人工膜粒子として、脂質一重膜（人工合成された脂質一重膜）を使用する。脂質一重膜（人工合成された脂質一重膜）上には反応に利用したい蛋白質以外の蛋白質が存在しない（例えば、図２）ため、天然物由来の膜粒子を用いた場合に懸念される、反応に利用したい蛋白質以外の蛋白質によって別反応が進行し、望む生成物以外の副反応物が生成してしまうことを抑制でき、生成物への夾雑物の混入を減少させることが可能となる。
前記の通り、従来の膜粒子を利用したポリイソプレノイド合成方法において利用される膜粒子であるゴム粒子や油滴は、天然物由来であるため、もともと膜上に酵素（例えば、図１で示す膜タンパク質）が存在するため、膜粒子上に反応させたい酵素を結合させた後に酵素反応を行った際に、もともと膜上に存在する酵素が別反応を起こし、望む生成物以外の副反応物が生成してしまう可能性が高い。
一方、本発明では、反応場であり、その内部に生成物を蓄積する人工膜粒子として、脂質一重膜（人工合成された脂質一重膜）を使用する。脂質一重膜（人工合成された脂質一重膜）上には反応に利用したい蛋白質以外の蛋白質が存在しない（例えば、図２）ため、天然物由来の膜粒子を用いた場合に懸念される、反応に利用したい蛋白質以外の蛋白質によって別反応が進行し、望む生成物以外の副反応物が生成してしまうことを抑制でき、生成物への夾雑物の混入を減少させることが可能となる。
【0018】
以下において、より詳細に説明する。脂質一重膜（人工合成された脂質一重膜）上には反応に利用したい蛋白質以外の蛋白質が存在しないため、以下（１）～（３）の効果が得られ、夾雑物を減少させることが可能となる。
（１）生成物への夾雑物の混入量の減少
（２）意図しない副反応の減少
（３）（１）による生成物の物性評価・解析の簡易化
（１）生成物への夾雑物の混入量の減少
（２）意図しない副反応の減少
（３）（１）による生成物の物性評価・解析の簡易化
【0019】
（１）については、天然物由来の膜粒子を利用する以上、膜には多くの不要な蛋白質が付着している。それにより、反応後の生成物はこれらの不要な蛋白質が混合している状態になる。蛋白質の中にはアレルギー反応を引き起こす原因（アレルゲン）になるものが存在しており、こういった不要な蛋白質の混入は生成物の安全性に良くない影響を及ぼすこともある。例えば、ゴム粒子であればゴムアレルギーの原因とされるＲＥＦやＳＲＰＰといった蛋白質が生成物中に混入することになる。人工膜を使用することで、生成物中のアレルゲン量を減少させる（無くす）ことができる。
【0020】
（２）については、例えばトランス型天然ゴムを合成しようとトランスプレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質を膜上に結合させて反応を行う際に、膜粒子として、パラゴムノキ由来のゴム粒子を使用した場合、パラゴムノキ由来のゴム粒子上にはシス型天然ゴムを合成するシスプレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質が存在するため、モノマーであるイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）がトランス型天然ゴムの合成以外にもシス型天然ゴムの合成にも消費されてしまう。一方で、人工膜上であれば他酵素が存在しないためトランス型天然ゴム合成以外の反応が起こらなくなる。
【0021】
（３）については、生成物の分析を行いたい場合に、夾雑物が分析の障害になることがある。夾雑物の量を減らすことでより正確な分析が可能となる。
【0022】
また、特開２０２２－７３２３３号公報に記載のような人工合成された脂質二重膜に比べて、本発明のように、人工合成された脂質一重膜の方が、膜の内側に脂質の疎水性尾部が向くような構造をとり、膜内に疎水性の溶媒・化合物を内包できるという理由から、より疎水性の高い高分子の物質を安定して蓄積できるという点で優れている。
【0023】
（膜粒子に内包される物質について）
前述の通り、酵素反応に利用される人工膜粒子としては、リポソームが一般的である。しかしながら、リポソームは一般的に脂質二重膜構造で、水溶液を内包していることが多い。そのため、リポソームは、疎水性の化合物を蓄積する場としては最適ではない。
前述の通り、酵素反応に利用される人工膜粒子としては、リポソームが一般的である。しかしながら、リポソームは一般的に脂質二重膜構造で、水溶液を内包していることが多い。そのため、リポソームは、疎水性の化合物を蓄積する場としては最適ではない。
【0024】
また、公知の人工膜粒子は、疎水性化合物であるトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を内包する。しかしながら、本発明者らの検討の結果、疎水性の化合物であるイソプレノイドの合成を行う上で、膜粒子に内包される物質としては、トリアシルグリセロールよりもイソプレノイドが優れていることが判明した。この理由は、明らかではないが、本発明では、膜粒子に結合する蛋白質としてプレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質を使用していることから、酵素反応による生成物はイソプレン骨格を有するイソプレノイドである。よって、膜粒子に内包されるイソプレノイドと生成物の親和性が高く、従来の内包物であったトリアシルグリセロールよりも生成物を安定して溶解させることができると考えられ、生成物と蓄積場（膜粒子の内部）の親和性が向上するためと推測される。また、天然に存在するゴム粒子では、イソプレン骨格を有するゴムを内包しており、ゴム粒子と類似している条件を再現するためには、従来のトリアシルグリセロールよりもイソプレノイドの方が適しているものと考えられる。
【0025】
（イソプレノイドの製造方法）
本発明は、イソプレノイドを内包する脂質一重膜に結合させたプレニルトランスフェラーゼ（ＰＴ）ファミリー蛋白質を用いたイソプレノイドの製造方法に関する。
前記イソプレノイドの製造方法は、イソプレノイドを内包する脂質一重膜に結合させたプレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質を用いる限り特に限定されないが、イソプレノイドを内包する脂質一重膜に結合させたプレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質は、前記プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質を、生体外で（例えば、反応槽（試験管、プラントなど）内で）、前記脂質一重膜に結合させる結合工程により得られた蛋白質であることが好ましく、前記イソプレノイドの製造方法は、前記プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質を、生体外で、前記脂質一重膜に結合させる結合工程を含むことがより好ましい。
なお、前記脂質膜に結合するＰＴファミリー蛋白質の量は特に限定されない。
本発明は、イソプレノイドを内包する脂質一重膜に結合させたプレニルトランスフェラーゼ（ＰＴ）ファミリー蛋白質を用いたイソプレノイドの製造方法に関する。
前記イソプレノイドの製造方法は、イソプレノイドを内包する脂質一重膜に結合させたプレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質を用いる限り特に限定されないが、イソプレノイドを内包する脂質一重膜に結合させたプレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質は、前記プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質を、生体外で（例えば、反応槽（試験管、プラントなど）内で）、前記脂質一重膜に結合させる結合工程により得られた蛋白質であることが好ましく、前記イソプレノイドの製造方法は、前記プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質を、生体外で、前記脂質一重膜に結合させる結合工程を含むことがより好ましい。
なお、前記脂質膜に結合するＰＴファミリー蛋白質の量は特に限定されない。
【0026】
本明細書において、脂質膜にＰＴファミリー蛋白質が結合するとは、ＰＴファミリー蛋白質の全部又は一部が脂質膜中に取り込まれる又は脂質膜の膜構造に挿入される、といったことを意味するが、これに限らず、脂質膜表面又は内部に局在する等の場合をも意味する。また更には、脂質膜に結合している他の蛋白質とＰＴファミリー蛋白質が複合体を形成し、複合体として脂質膜上に存在する場合も脂質膜に結合しているとの概念範囲に含まれる。
【0027】
（（イソプレノイドを内包する脂質一重膜））
イソプレノイドを内包する脂質一重膜（人工合成された脂質一重膜）としてはイソプレノイドを内包する脂質一重膜であれば特に限定されない。イソプレノイドを内包する脂質一重膜は、単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
イソプレノイドを内包する脂質一重膜（人工合成された脂質一重膜）としてはイソプレノイドを内包する脂質一重膜であれば特に限定されない。イソプレノイドを内包する脂質一重膜は、単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【0028】
脂質一重膜（ＰＭＰ）を構成する脂質としては、脂質一重膜を構成できる脂質であれば特に限定されず、例えば、リン脂質、糖脂質、中性脂質等が挙げられる。天然由来の脂質であっても、合成脂質であってもよい。また、水素添加されていてもよい。また、脂質は、単純脂質（例えば、グリセロルモノオレエート）であっても誘導脂質であってもよい。これらは単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。なかでも、リン脂質、糖脂質が好ましく、リン脂質がより好ましい。リン脂質、糖脂質が好ましく、リン脂質がより好ましい理由は、ゴム粒子を構成する脂質は、リン脂質が主成分（８０％以上）、糖脂質が１５％以上の組成のためと推測される。
【0029】
リン脂質としては、例えば、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質が挙げられる。なかでも、グリセロリン脂質が好ましく、ホスファチジルコリン（レシチン）がより好ましく、大豆由来ホスファチジルコリン（アゾレクチン）やゴム粒子由来のホスファチジルコリンが更に好ましい。
【0030】
グリセロリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ジフィタノイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン等が挙げられる。なかでも、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルコリンが好ましく、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトールがより好ましく、ホスファチジルコリン（レシチン）が更に好ましい。
【0031】
ホスファチジルコリンとしては、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルフォスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等が挙げられる。
ホスファチジルエタノールアミンとしては、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。
ホスファチジルセリンとしては、ジラウロイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン等が挙げられる。
ホスファチジルグリセロールとしては、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール等が挙げられる。
ホスファチジルイノシトールとしては、ジラウロイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、ジステアロイルホスファチジルイノシトール等が挙げられる。
ホスファチジルエタノールアミンとしては、ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。
ホスファチジルセリンとしては、ジラウロイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン等が挙げられる。
ホスファチジルグリセロールとしては、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール等が挙げられる。
ホスファチジルイノシトールとしては、ジラウロイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、ジステアロイルホスファチジルイノシトール等が挙げられる。
【0032】
スフィンゴリン脂質としては、例えば、スフィンゴミエリン等が挙げられる。
【0033】
糖脂質としては、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質等が挙げられる。
【0034】
グリセロ糖脂質としては、例えば、スルホキシリボシルグリセロール、ジグリコシルジグリセロール、ジガラクトシルジグリセロール、ガラクトシルジグリセロール、ジアシルグリセロール及びグリコシルジグリセロール等が挙げられる。また、スフィンゴ糖脂質としては、例えば、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、及びガングリオシド等が挙げられる。
【0035】
脂質一重膜に内包されるイソプレノイドとしては、例えば、スクアレン；フィトエン、リコペン、カロテン、ゼアキサンチン、ルテイン、カンタキサンチン、フコキキサンチン、アスタキサンチン、アンテラキサンチン、ビオラキサンチン等のカロテノイド；レチノール；ステロール脂肪酸エステル等が挙げられる。これらは単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。なかでも、スクアレン、カロテノイドが好ましく、スクアレンがより好ましい。カロテノイドとしては、フィトエン、リコペン、カロテンが好ましく、カロテンがより好ましい。カロテンとしては、αカロテン、βカロテン、γカロテン、δカロテンのいずれでもよいが、βカロテンが好ましい。脂質一重膜に内包されるイソプレノイドとしては、前記の通り、スクアレンがより好ましいが、スクアレン及びカロテノイドが更に好ましい。スクアレンと共にカロテノイドを脂質一重膜に内包することにより、生成物鎖長をより長くすることができ、また酵素の活性もより向上できる傾向がある。
脂質一重膜に内包されるイソプレノイドの炭素数は、好ましくは２５以上、より好ましくは３０以上であり、好ましくは５０以下、より好ましくは４５以下、更に好ましくは４０以下である。
脂質一重膜に内包されるイソプレノイドの炭素数は、好ましくは２５以上、より好ましくは３０以上であり、好ましくは５０以下、より好ましくは４５以下、更に好ましくは４０以下である。
【0036】
イソプレノイドを内包する脂質一重膜の製造方法は、イソプレノイドを内包する脂質一重膜を製造できる限り特に限定されないが、例えば、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｎｏｄｒｏｐｌｅｔ／Ａｄｉｐｏｓｏｍｅ ａｎｄ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｌｉｐｉｄ Ｄｒｏｐｌｅｔｓ（ＡＣＳ Ｎａｎｏ ２０１６，１０，３３１２－３３２２）、Ｖａｌｉｄａｔｉｎｇ ａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｏｒｇａｎｅｌｌｅ： Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｄｒｏｐｌｅｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ａｄｉｐｏｓｏｍｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ（ｉＳｃｉｅｎｃｅ，２４，Ａｕｇｕｓｔ ２０，２０２１）に記載の方法など公知の方法により製造すればよい。当業者であれば、使用する脂質、イソプレノイドを決定すれば、本願実施例における例及び公知の方法を参考に、イソプレノイドを内包する脂質一重膜を容易に製造できる。
【0037】
以下において、イソプレノイドを内包する脂質一重膜の製造方法の一例について説明する。
脂質をクロロホルムに溶解した後、溶媒を窒素流下で揮発させることで乾燥した脂質の薄膜を形成する。この薄膜形成は、エバポレーターを用いた減圧乾固によって行ってもよい。乾燥した脂質に、適当な緩衝液と内封されるイソプレノイドを添加する。そして、この混合液を超音波等により撹拌した後、遠心分離を行うことにより、最上層から脂質一重膜を回収できる。また、遠心分離は、多段階に行ってもよい。また、必要に応じて脂質一重膜を洗浄してもよい。
脂質をクロロホルムに溶解した後、溶媒を窒素流下で揮発させることで乾燥した脂質の薄膜を形成する。この薄膜形成は、エバポレーターを用いた減圧乾固によって行ってもよい。乾燥した脂質に、適当な緩衝液と内封されるイソプレノイドを添加する。そして、この混合液を超音波等により撹拌した後、遠心分離を行うことにより、最上層から脂質一重膜を回収できる。また、遠心分離は、多段階に行ってもよい。また、必要に応じて脂質一重膜を洗浄してもよい。
【0038】
遠心分離処理では、例えば、１，０００～２０，０００×ｇ、１分～１０分の処理を行えばよい。また、遠心分離処理は、多段階の処理としてもよく、例えば、１０，０００～２０，０００×ｇ、１分～１０分の処理を行った後に、１，０００～３，０００×ｇ、１分～１０分の処理を行ってもよい。
また、遠心分離処理の処理温度としては、０～１０℃が好ましく、２～８℃がより好ましく、４℃が特に好ましい。
また、遠心分離処理の処理温度としては、０～１０℃が好ましく、２～８℃がより好ましく、４℃が特に好ましい。
【0039】
イソプレノイドの添加量が少ない場合は、脂質一重膜ではなく、脂質二重膜が形成される傾向があるため、脂質二重膜が形成された場合は、イソプレノイドの添加量を増量すればよい。反対に、遠心分離を行った際にイソプレノイドが上澄みとして現れる場合は、イソプレノイドの添加量が過剰であるため、それを減量すればよい。
【0040】
（（プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質））
次に、プレニルトランスフェラーゼ（ＰＴ）ファミリー蛋白質について説明する。
ＰＴファミリー蛋白質としては、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質、トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ＴＰＴ）ファミリー蛋白質が挙げられる。これらの蛋白質は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
次に、プレニルトランスフェラーゼ（ＰＴ）ファミリー蛋白質について説明する。
ＰＴファミリー蛋白質としては、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質、トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ＴＰＴ）ファミリー蛋白質が挙げられる。これらの蛋白質は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【0041】
ＰＴファミリー蛋白質は、ゴムを産生するゴム産生植物等のポリイソプレノイド産生植物の他、ポリイソプレノイド産生植物以外の植物、動物、微生物等も有しており、これら由来のＰＴファミリー蛋白質は当然、自然状態ではゴム合成に関与していない。にもかかわらず、本発明においては、ＰＴファミリー蛋白質であれば、その由来、種類等に関わらず、前記脂質膜に結合させることで、前記脂質膜中にイソプレノイドを合成することができる。すなわち、ＰＴファミリー蛋白質がゴムを産生する植物由来であるか、それ以外の生物由来であるか、又は、自然状態でゴム合成に関与しているかなどに関わらず、本発明においては、ＰＴファミリー蛋白質でありさえすれば、前記脂質膜中にイソプレノイドを合成することができる。このことは、本発明者らが既にＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０６９１７２において示唆しているメカニズム（シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質の由来や種類よりも、どのような宿主に導入したのか、すなわち、ＣＰＴファミリー蛋白質をどのような環境下に発現させたのかが、ゴム合成活性において重要である、ことを示すメカニズム）から、強く示唆される。
【0042】
プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質は、その由来は特に制限されず、微生物由来であっても、動物由来であっても、植物由来であってもよいが、植物由来であることが好ましく、ポリイソプレノイド産生植物由来であることがより好ましい。ポリイソプレノイド産生植物由来のプレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質（好ましくはゴム合成酵素）を用いることにより、高分子量のゴム（ポリイソプレノイド）を好適に製造できる。
プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質は、Ｈｅｖｅａ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ属、又はＭａｎｉｌｋａｒａ属に属する植物由来であることが更に好ましく、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（パラゴムノキ）、Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ（ロシアンタンポポ）、Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ（グアユール）、又はＭａｎｉｌｋａｒａ ｚａｐｏｔａ（サポジラ）由来であることが特に好ましく、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（パラゴムノキ）、Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ（ロシアンタンポポ）、又はＭａｎｉｌｋａｒａ ｚａｐｏｔａ（サポジラ）由来であることが最も好ましく、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（パラゴムノキ）、又はＭａｎｉｌｋａｒａ ｚａｐｏｔａ（サポジラ）由来であることがより最も好ましい。
プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質は、Ｈｅｖｅａ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ属、又はＭａｎｉｌｋａｒａ属に属する植物由来であることが更に好ましく、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（パラゴムノキ）、Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ（ロシアンタンポポ）、Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ（グアユール）、又はＭａｎｉｌｋａｒａ ｚａｐｏｔａ（サポジラ）由来であることが特に好ましく、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（パラゴムノキ）、Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ（ロシアンタンポポ）、又はＭａｎｉｌｋａｒａ ｚａｐｏｔａ（サポジラ）由来であることが最も好ましく、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（パラゴムノキ）、又はＭａｎｉｌｋａｒａ ｚａｐｏｔａ（サポジラ）由来であることがより最も好ましい。
【0043】
前記ポリイソプレノイド産生植物としては、特に限定されず、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｌｅｉｐｃａｒｐａ ｆ． ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｇｉｇａｎｔｅａ Ａｉｔ． ｖａｒ． ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａ Ｆｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｖｅｎｕｓｔｕｍ Ｈ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｈｏｎｄｏｅｎｓｅ Ｎａｋａｉ）、カントウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍ Ｄａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ Ｗｅｂｅｒ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）、Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（Ｆｉｃｕｓ ｐｕｍｉｌａ Ｌ．）、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ａｍｐｅｌａｓ Ｂｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓ Ｍｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｉｒｉｓａｎａ Ｅｌｍ．）、ガジュマル（Ｆｉｃｕｓ ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ Ｌ．ｆ．）、オオバイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｓｅｐｔｉｃａ Ｂｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、アメリカブクリョウサイ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）、ブタクサ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）等のＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属；サポジラ（Ｍａｎｉｌｋａｒａ ｚａｐｏｔａ）等のＭａｎｉｌｋａｒａ属；トチュウ（Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ）等のＥｕｃｏｍｍｉａ属；レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、ベンガルボダイジュ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）等が挙げられる。
【0044】
なお、本明細書において、プレニルトランスフェラーゼ（ＰＴ）ファミリー蛋白質は、イソプレノイド化合物の鎖長を延長する反応を触媒する酵素である。
また、本明細書において、トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ＴＰＴ）ファミリー蛋白質は、イソプレノイド化合物の鎖長をトランス型に延長する反応を触媒する酵素である。
また、本明細書において、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質は、イソプレノイド化合物の鎖長をシス型に延長する反応を触媒する酵素である。
具体的には、例えば、植物では、図３に示すようなポリイソプレノイド生合成経路によってポリイソプレノイドが生合成されるが、当該経路のうち、ＣＰＴファミリー蛋白質は、図３中の点線の枠で囲まれた部分の反応を触媒する酵素と考えられている。ＣＰＴファミリー蛋白質の特徴としては、Ｃｉｓ ＩＰＰＳ ｄｏｍａｉｎ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ｃｄ００４７５）に含まれるアミノ酸配列を有することである。
一方、ｔＰＴファミリー蛋白質の特徴としては、ｔｒａｎｓ ＩＰＰＳ ＨＴ ｄｏｍａｉｎ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ｃｄ００６８５）に含まれるアミノ酸配列を有することである。
また、本明細書において、トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ＴＰＴ）ファミリー蛋白質は、イソプレノイド化合物の鎖長をトランス型に延長する反応を触媒する酵素である。
また、本明細書において、シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質は、イソプレノイド化合物の鎖長をシス型に延長する反応を触媒する酵素である。
具体的には、例えば、植物では、図３に示すようなポリイソプレノイド生合成経路によってポリイソプレノイドが生合成されるが、当該経路のうち、ＣＰＴファミリー蛋白質は、図３中の点線の枠で囲まれた部分の反応を触媒する酵素と考えられている。ＣＰＴファミリー蛋白質の特徴としては、Ｃｉｓ ＩＰＰＳ ｄｏｍａｉｎ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ｃｄ００４７５）に含まれるアミノ酸配列を有することである。
一方、ｔＰＴファミリー蛋白質の特徴としては、ｔｒａｎｓ ＩＰＰＳ ＨＴ ｄｏｍａｉｎ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ｃｄ００６８５）に含まれるアミノ酸配列を有することである。
【0045】
本明細書において、イソプレノイド化合物とは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）を有する化合物を意味する。また、シス型イソプレノイドは、イソプレン単位がシス型に結合したイソプレノイド化合物を有する化合物であり、例えば、ネリル二リン酸、ウンデカプレニル二リン酸、天然ゴム（シス型ポリイソプレノイド）などが挙げられる。また、トランス型イソプレノイドは、イソプレン単位がトランス型に結合したイソプレノイド化合物を有する化合物であり（特に、全結合中のトランス型の結合の割合が、９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上が更に好ましい。）、例えば、ファルネシル二リン酸、ゲラニルゲラニル二リン酸、ヘキサプレニル二リン酸、ヘプタプレニル二リン酸、トランス型ポリイソプレノイド（トランスゴム）等が挙げられる。
【0046】
ここで、種々の生物由来のＣＰＴファミリー蛋白質のマルチプルシーケンスアライメントを行った様子を示す概略図を図４に示すが、Ｓｈｏｔａ Ｅｎｄｏ ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，Ｎｏ．１６２５（２００３）ｐ．２９１－２９５や、Ｍａｓａｈｉｒｏ Ｆｕｊｉｈａｓｈｉ ｅｔ．ａｌ．，ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．９８，Ｎｏ．８（２００１）ｐ．４３３７－４３４２等の文献から、図４中の囲みＡ（配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１においては、４１位から４９位に相当）、囲みＢ（配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１においては、８１位から９７位に相当）が種々の生物由来のＣＰＴファミリー蛋白質で保存性の高い保存領域の一部であり、保存領域とは、同様の配列（構造）を有する部位を意味し、蛋白質において同様の機能を有する部位であると推察される領域である。そして特に、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４１位に相当する位置はアスパラギン酸残基が保存され（図４中の（１））、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４２位に相当する位置はグリシン残基が保存され（図４中の（２））、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４５位に相当する位置はアルギニン残基が保存され（図４中の（３））、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における８９位に相当する位置はアスパラギン残基が保存されており（図４中の（４））、これらのアミノ酸が、ＣＰＴファミリー蛋白質の酵素反応に必須のアミノ酸であり、当該位置にこれらのアミノ酸を有する蛋白質であればＣＰＴファミリー蛋白質としての機能を有すると考えられる。
なお、前記マルチプルシーケンスアライメントは、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の方法により実施できる。
なお、前記マルチプルシーケンスアライメントは、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の方法により実施できる。
【0047】
すなわち、前記ＣＰＴファミリー蛋白質は、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４１位、及びこれに相当する位置にアスパラギン酸残基を、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４２位、及びこれに相当する位置にグリシン残基を、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４５位、及びこれに相当する位置にアルギニン残基を、並びに、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における８９位、及びこれに相当する位置にアスパラギン残基を、有するものであることが好ましい。上述したように、前記ＣＰＴファミリー蛋白質がこのような配列を有していれば、ＣＰＴファミリー蛋白質としての機能を有すると考えられ、イソプレノイド化合物の鎖長をシス型に延長する反応を触媒する酵素として機能することができる。
【0048】
前記プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質が、以下のアミノ酸配列（Ａ）を有するシス型プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質であることが好ましく、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１における４１位から４９位、及びこれに相当する位置のアミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列（Ａ）を有するシス型プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質であることがより好ましい。
ＤＧＮＸ１ＲＸ２Ａ （Ａ） （アミノ酸配列（Ａ）中、Ｘ１及びＸ２は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す）
ＤＧＮＸ１ＲＸ２Ａ （Ａ） （アミノ酸配列（Ａ）中、Ｘ１及びＸ２は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す）
【0049】
前記アミノ酸配列（Ａ）中、Ｘ１がＨ、ＧもしくはＲを表し、また、Ｘ２がＷ、Ｆ、もしくはＹを表すことが好ましい。
【0050】
具体的には、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１において４１位から４９位に相当する保存領域は、例えば、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４５で示される大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）では２５位から３３位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４６で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）では２９位から３７位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４７で示される酵母由来のＳＲＴ１では７５位から８３位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４４で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５では７９位から８７位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号２２で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８では４３位から５１位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４８で示されるタバコ由来のＤＤＰＳでは４２位から５０位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ２では４１位から４９位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３６で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ３では４１位から４９位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３７で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ４では４２位から５０位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４１で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ５では４１位から４９位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号１４で示されるレタス由来のＬｓＣＰＴ３では５８位から６６位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４３で示されるＴａｒａｘａｃｕｍ ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１では５８位から６６位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４９で示されるマウス由来のＤＤＰＳでは３４位から４２位に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号５０で示されるヒト由来のＨＤＳでは３４位から４２位に相当する。
【0051】
また、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１において４１位に相当するアスパラギン酸残基は、例えば、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４５で示される大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）では２５位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４６で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）では２９位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４７で示される酵母由来のＳＲＴ１では７５位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４４で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５では７９位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号２２で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８では４３位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４８で示されるタバコ由来のＤＤＰＳでは４２位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ２では４１位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３６で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ３では４１位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３７で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ４では４２位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４１で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ５では４１位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号１４で示されるレタス由来のＬｓＣＰＴ３では５８位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４３で示されるＴａｒａｘａｃｕｍ ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１では５８位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４９で示されるマウス由来のＤＤＰＳでは３４位のアスパラギン酸残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号５０で示されるヒト由来のＨＤＳでは３４位のアスパラギン酸残基に相当する。
【0052】
また、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１において４２位に相当するグリシン残基は、例えば、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４５で示される大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）では２６位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４６で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）では３０位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４７で示される酵母由来のＳＲＴ１では７６位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４４で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５では８０位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号２２で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８では４４位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４８で示されるタバコ由来のＤＤＰＳでは４３位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ２では４２位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３６で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ３では４２位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３７で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ４では４３位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４１で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ５では４２位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号１４で示されるレタス由来のＬｓＣＰＴ３では５９位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４３で示されるＴａｒａｘａｃｕｍ ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１では５９位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４９で示されるマウス由来のＤＤＰＳでは３５位のグリシン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号５０で示されるヒト由来のＨＤＳでは３５位のグリシン残基に相当する。
【0053】
また、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１において４５位に相当するアルギニン残基は、例えば、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４５で示される大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）では２９位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４６で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）では３３位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４７で示される酵母由来のＳＲＴ１では７９位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４４で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５では８３位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号２２で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８では４７位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４８で示されるタバコ由来のＤＤＰＳでは４６位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ２では４５位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３６で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ３では４５位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３７で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ４では４６位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４１で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ５では４５位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号１４で示されるレタス由来のＬｓＣＰＴ３では６２位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４３で示されるＴａｒａｘａｃｕｍ ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１では６２位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４９で示されるマウス由来のＤＤＰＳでは３８位のアルギニン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号５０で示されるヒト由来のＨＤＳでは３８位のアルギニン残基に相当する。
【0054】
また、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１において８９位に相当するアスパラギン残基は、例えば、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４５で示される大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）では７３位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４６で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）では７７位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４７で示される酵母由来のＳＲＴ１では１２３位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４４で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５では１２７位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号２２で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ８では９２位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４８で示されるタバコ由来のＤＤＰＳでは９０位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３２で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ２では８９位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３６で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ３では８９位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号３７で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ４では９０位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４１で示されるパラゴムノキ由来のＣＰＴ５では８９位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号１４で示されるレタス由来のＬｓＣＰＴ３では１０６位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４３で示されるＴａｒａｘａｃｕｍ ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＴｂＣＰＴ１では１０６位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号４９で示されるマウス由来のＤＤＰＳでは８２位のアスパラギン残基に相当し、ＷＯ２０１７／００２８１８に記載の配列番号５０で示されるヒト由来のＨＤＳでは８２位のアスパラギン残基に相当する。
【0055】
前記ＣＰＴファミリー蛋白質としては、パラゴムノキ由来のＣＰＴ（ＨＲＴ１、ＨＲＴ２、ＣＰＴ３～５）、シロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ１～９、レタス由来のＣＰＴ１～３、Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ由来のＣＰＴ１～３、大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）、マイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＳ）、酵母由来のＳＲＴ１、タバコ由来のＤＤＰＳ、マウス由来のＤＤＰＳ、ヒト由来のＨＤＳなどが挙げられる。
【0056】
前記ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［１］が挙げられる。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
【0057】
また、蛋白質は、元のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む場合であっても本来持つ機能を有する場合があることが知られている。従って、前記ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［２］も挙げられる。
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をシス型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をシス型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
【0058】
なお、前記ＣＰＴファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１～５８個のアミノ酸、更に好ましくは１～４４個のアミノ酸、更により好ましくは１～２９個のアミノ酸、特に好ましくは１～１５個のアミノ酸、最も好ましくは１～６個のアミノ酸、より最も好ましくは１～３個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【0059】
本明細書において、アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のカッコ内のグループ内での置換が挙げられる。例えば、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。
【0060】
また、蛋白質は、元のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有する蛋白質も同様の機能を有する場合があることが知られている。従って、前記ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［３］も挙げられる。
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をシス型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をシス型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
【0061】
なお、前記ＣＰＴファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号２で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
【0062】
本明細書において、アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。
【0063】
前記酵素活性を有する蛋白質であることを確認する方法としては、例えば、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。
【0064】
前記ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、ＣＰＴファミリー蛋白質をコードし、発現させてＣＰＴファミリー蛋白質を産出できるものであれば特に制限されないが、該遺伝子としては、具体的には、下記［４］又は［５］が挙げられる。
［４］配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［５］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をシス型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［４］配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［５］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をシス型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【0065】
本明細書において、「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。
【0066】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍａｎｕａｌ， Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
【0067】
本明細書において、ストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、前記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
【0068】
前記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。前記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
【0069】
前記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、前記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号１で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
【0070】
前記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、所定の酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。
【0071】
また、前記蛋白質のアミノ酸配列及び塩基配列を同定する方法は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、生育する植物から、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、必要に応じてｍＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。次に目的蛋白質に相当する既知の蛋白質のアミノ酸配列をもとに、縮重プライマーを設計し、ＲＴ－ＰＣＲを行い、部分的にＤＮＡ断片の増幅を行い、部分的に配列を同定する。次いで、ＲＡＣＥ法などを行い、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定する。ＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ法）とは、ｃＤＮＡの塩基配列が部分的に把握されているときに、その既知領域の塩基配列情報を基にＰＣＲを行って、ｃＤＮＡ末端までの未知領域をクローニングする方法で、ｃＤＮＡライブラリーの作製を経ずに、ＰＣＲ法によって全長のｃＤＮＡをクローニングすることができる方法である。
なお、縮重プライマーは、前記目的蛋白質と共通性の高い配列部位を有する植物由来の配列から作製することが好ましい。
また、前記蛋白質をコードする塩基配列が既知の場合には、その知られている塩基配列から開始コドンを含むプライマー及び終止コドンを含むプライマーを設計し、合成したｃＤＮＡを鋳型にしてＲＴ－ＰＣＲを行うことで全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定することができる。
なお、縮重プライマーは、前記目的蛋白質と共通性の高い配列部位を有する植物由来の配列から作製することが好ましい。
また、前記蛋白質をコードする塩基配列が既知の場合には、その知られている塩基配列から開始コドンを含むプライマー及び終止コドンを含むプライマーを設計し、合成したｃＤＮＡを鋳型にしてＲＴ－ＰＣＲを行うことで全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定することができる。
【0072】
次に、種々の生物由来のｔＰＴファミリー蛋白質のマルチプルシーケンスアライメントを行った様子を示す概略図を図５に示すが、Ａｎｄｒｅｗ Ｈ．－Ｊ． Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６９、３３３９－３３５４（２００２）等の文献から、図５中の囲みＡ（配列番号４で示されるサポジラ由来のｔＰＴ２（ＭｚｔＰＴ２）においては、２６０位から２６６位に相当）、囲みＢ（配列番号４で示されるサポジラ由来のｔＰＴ２（ＭｚｔＰＴ２）においては、３９９位から４０３位に相当）が種々の生物由来のｔＰＴファミリー蛋白質で保存性の高い保存領域の一部であり、保存領域とは、同様の配列（構造）を有する部位を意味し、蛋白質において同様の機能を有する部位であると推察される領域である。そして特に、配列番号４で示されるサポジラ由来のｔＰＴ２（ＭｚｔＰＴ２）においては、２６０位から２６６位に相当する位置のアミノ酸配列、及び、配列番号４で示されるサポジラ由来のｔＰＴ２（ＭｚｔＰＴ２）においては、３９９位から４０３位に相当する位置のアミノ酸配列が特定のモチーフとして保存されており、当該位置にこれらのモチーフを有する蛋白質であればｔＰＴファミリー蛋白質としての機能を有すると考えられる。
なお、上記マルチプルシーケンスアライメントは、特開２０１８－０９９１００に記載の方法により実施できる。
なお、上記マルチプルシーケンスアライメントは、特開２０１８－０９９１００に記載の方法により実施できる。
【0073】
すなわち、前記プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質が、以下のアミノ酸配列（Ｂ－１）若しくは（Ｂ－２）を有するトランス型プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質であることが好ましく、配列番号４で示されるサポジラ由来のｔＰＴ２（ＭｚｔＰＴ２）における２６０位から２６６位、及びこれに相当する位置のアミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列（Ｂ－１）若しくは（Ｂ－２）を有するトランス型プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質、又は、配列番号４で示されるサポジラ由来のｔＰＴ２（ＭｚｔＰＴ２）における３９９位から４０３位、及びこれに相当する位置のアミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列（Ｂ－１）を有するトランス型プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質であることがより好ましい。
ＤＤＸ１Ｘ2Ｄ （Ｂ－１） （アミノ酸配列（Ｂ－１）中、Ｘ１、Ｘ2は任意のアミノ酸残基を表す）
ＤＤＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｄ （Ｂ－２）（アミノ酸配列（Ｂ－２）中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す）
上述したように、上記ｔＰＴファミリー蛋白質がこのような配列を有していれば、ｔＰＴファミリー蛋白質としての機能を有すると考えられ、イソプレノイド化合物の鎖長をトランス型に延長する反応を触媒する酵素として機能することができ、ゴム粒子に結合させることで、ゴム粒子中にトランスゴムを合成することが可能となる。
ＤＤＸ１Ｘ2Ｄ （Ｂ－１） （アミノ酸配列（Ｂ－１）中、Ｘ１、Ｘ2は任意のアミノ酸残基を表す）
ＤＤＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｄ （Ｂ－２）（アミノ酸配列（Ｂ－２）中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す）
上述したように、上記ｔＰＴファミリー蛋白質がこのような配列を有していれば、ｔＰＴファミリー蛋白質としての機能を有すると考えられ、イソプレノイド化合物の鎖長をトランス型に延長する反応を触媒する酵素として機能することができ、ゴム粒子に結合させることで、ゴム粒子中にトランスゴムを合成することが可能となる。
【0074】
上記アミノ酸配列（Ｂ－１）及び（Ｂ－２）中、Ｘ１がＭ、Ｉ、もしくはＶを表し、また、Ｘ２がＭ、Ｉ、もしくはＬを表すことであることが好ましい。
【0075】
具体的には、配列番号４で示されるサポジラ由来のｔＰＴ２（ＭｚｔＰＴ２）における２６０位から２６６位に相当する保存領域は、例えば、特開２０１８－０９９１００に記載の配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＳＤＳにおいて１８３位から１８７位に相当し、特開２０１８－０９９１００に記載の配列番号３で示される酵母由来のＦＰＰＳでは１００位から１０４位に相当し、特開２０１８－０９９１００に記載の配列番号４で示されるトチュウ由来のＥｕＦＰＰＳでは９９位から１０３位に相当し、特開２０１８－０９９１００に記載の配列番号５で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＦＰＰＳでは９３位から９７位に相当し、特開２０１８－０９９１００に記載の配列番号６で示される酵母由来のＴＰＴでは９１位から９５位に相当し、特開２０１８－０９９１００に記載の配列番号７で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＳＤＳ１では１７１位から１７５位に相当し、特開２０１８－０９９１００に記載の配列番号８で示されるヒト由来のＨｓＴＰＴでは１４１位から１４５位に相当し、特開２０１８－０９９１００に記載の配列番号９で示されるマウス由来のＭｍＴＰＴでは１０１位から１０５位に相当する。
【0076】
また、配列番号４で示されるサポジラ由来のｔＰＴ２（ＭｚｔＰＴ２）における３９９位から４０３位に相当する保存領域は、例えば、特開２０１８－０９９１００に記載の配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＳＤＳにおいて３１０位から３１４位に相当し、特開２０１８－０９９１００に記載の配列番号３で示される酵母由来のＦＰＰＳでは２４０位から２４４位に相当し、特開２０１８－０９９１００に記載の配列番号４で示されるトチュウ由来のＥｕＦＰＰＳでは２３８位から２４２位に相当し、特開２０１８－０９９１００に記載の配列番号５で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＦＰＰＳでは２３２位から２３６位に相当し、特開２０１８－０９９１００に記載の配列番号６で示される酵母由来のＴＰＴでは２６２位から２６６位に相当し、特開２０１８－０９９１００に記載の配列番号７で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＳＤＳ１では２９８位から３０２位に相当し、特開２０１８－０９９１００に記載の配列番号８で示されるヒト由来のＨｓＴＰＴでは２６８位から２７２位に相当し、特開２０１８－０９９１００に記載の配列番号９で示されるマウス由来のＭｍＴＰＴでは２２８位から２３２位に相当する。
【0077】
上記ｔＰＴファミリー蛋白質としては、サポジラ由来のｔＰＴ２（ＭｚｔＰＴ２）、サポジラ由来のｔＰＴ１（ＭｚｔＰＴ１）、酵母由来のｔＰＴ（ＦＰＰＳ〔Ｅｒｇ２０ｐ［Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｒ１０３］〕、ＴＰＴ〔Ｃｏｑ１ｐ［Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＪＭ１３４２］〕）、トチュウ由来のｔＰＴ（ＥｕＦＰＰＳ〔ｆａｒｎｅｓｙｌ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ［Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ］〕）、パラゴムノキ由来のｔＰＴ（ＨｂＦＰＰＳ〔ｆａｒｎｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ［Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ］〕、ＨｂＳＤＳ〔ｓｏｌａｎｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ［Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ］〕）、シロイヌナズナ由来のｔＰＴ（ＡｔＳＤＳ１〔ｓｏｌａｎｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ １［Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ］〕）、ヒト由来のｔＰＴ（ＨｓＴＰＴ〔ｔｒａｎｓ－ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］〕）、マウス由来のｔＰＴ（ＭｍＴＰＴ〔ｔｒａｎｓ－ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ［Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ］〕）などが挙げられる。
【0078】
前記方法において用いるｔＰＴファミリー蛋白質は脂質一重膜との親和性を上げるためＮ末端側に膜結合領域を持っていることが望ましく、野生型として持っていない場合はｔＰＴファミリー蛋白質のＮ末端側に人工的に膜結合領域を融合させても良い。融合させる膜結合領域のアミノ酸配列は特に限定されないが、自然界で本来脂質膜に結合している蛋白質が持つ膜結合領域のアミノ酸配列であることが望ましい。
【0079】
上記ｔＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［６］が挙げられる。
［６］配列番号４で表されるアミノ酸配列（サポジラ由来のｔＰＴ２のアミノ酸配列）からなる蛋白質
［６］配列番号４で表されるアミノ酸配列（サポジラ由来のｔＰＴ２のアミノ酸配列）からなる蛋白質
【0080】
また、蛋白質は、元のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む場合であっても本来持つ機能を有する場合があることが知られている。従って、前記ｔＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［７］も挙げられる。
［７］配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をトランス型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［７］配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をトランス型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
【0081】
なお、前記ｔＰＴファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１～９５個のアミノ酸、更に好ましくは１～７１個のアミノ酸、更により好ましくは１～４７個のアミノ酸、特に好ましくは１～２４個のアミノ酸、最も好ましくは１～９個のアミノ酸、より最も好ましくは１～５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【0082】
アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のカッコ内のグループ内での置換が挙げられる。例えば、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。
【0083】
また、蛋白質は、元のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有する蛋白質も同様の機能を有する場合があることが知られている。従って、前記ｔＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［８］も挙げられる。
［８］配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をトランス型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［８］配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をトランス型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
【0084】
なお、前記ｔＰＴファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号４で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
【0085】
本明細書において、アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０， ５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８３， ６３ （１９９０）］を用いて決定することができる。
【0086】
前記酵素活性を有する蛋白質であることを確認する方法としては、例えば、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、イソプレノイド化合物の鎖長をトランス型に延長する反応を触媒する酵素活性を有するか否か判定する方法が挙げられる。
【0087】
前記方法において用いるｔＰＴファミリー蛋白質は脂質膜との親和性を上げるためＮ末端側に膜結合領域を持っていることが望ましく、野生型として持っていない場合はｔＰＴファミリー蛋白質のＮ末端側に人工的に膜結合領域を融合させても良い。融合させる膜結合領域のアミノ酸配列は特に限定されないが、自然界で本来脂質膜に結合している蛋白質が持つ膜結合領域のアミノ酸配列であることが望ましい。
【0088】
前記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、ｔＰＴファミリー蛋白質をコードし、発現させて、ｔＰＴファミリー蛋白質を産出できるものであれば特に制限されないが、該遺伝子としては、具体的には、下記［９］又は［１０］が挙げられる。
［９］配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［１０］配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をトランス型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［９］配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［１０］配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をトランス型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【0089】
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。従って、該特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザン又はサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、又はＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。
【0090】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍａｎｕａｌ， Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
【0091】
前記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度及び温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、更に低いストリンジェントな条件としては、前記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
【0092】
前記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、又は変更することにより設定することもできる。前記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
【0093】
前記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、前記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号３で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
【0094】
前記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、所定の酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。
【0095】
また、前記蛋白質のアミノ酸配列及び塩基配列を同定する方法は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、生育する植物から、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、必要に応じてｍＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。次に目的蛋白質に相当する既知の蛋白質のアミノ酸配列をもとに、縮重プライマーを設計し、ＲＴ－ＰＣＲを行い、部分的にＤＮＡ断片の増幅を行い、部分的に配列を同定する。次いで、ＲＡＣＥ法などを行い、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定する。ＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ法）とは、ｃＤＮＡの塩基配列が部分的に把握されているときに、その既知領域の塩基配列情報を基にＰＣＲを行って、ｃＤＮＡ末端までの未知領域をクローニングする方法で、ｃＤＮＡライブラリーの作製を経ずに、ＰＣＲ法によって全長のｃＤＮＡをクローニングすることができる方法である。
なお、縮重プライマーは、前記目的蛋白質と共通性の高い配列部位を有する植物由来の配列から作製することが好ましい。
また、前記蛋白質をコードする塩基配列が既知の場合には、その知られている塩基配列から開始コドンを含むプライマー及び終止コドンを含むプライマーを設計し、合成したｃＤＮＡを鋳型にしてＲＴ－ＰＣＲを行うことで全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定することができる。
なお、縮重プライマーは、前記目的蛋白質と共通性の高い配列部位を有する植物由来の配列から作製することが好ましい。
また、前記蛋白質をコードする塩基配列が既知の場合には、その知られている塩基配列から開始コドンを含むプライマー及び終止コドンを含むプライマーを設計し、合成したｃＤＮＡを鋳型にしてＲＴ－ＰＣＲを行うことで全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定することができる。
【0096】
ＰＴファミリー蛋白質としては、炭素数６０以上の生成物を合成することができるＰＴファミリー蛋白質が好ましい。これにより、ポリイソプレノイドの製造がより好適に可能となる。炭素数６０以上の生成物を合成することができるＰＴファミリー蛋白質としては、例えば、上述のＰＴファミリー蛋白質のうち、ポリイソプレノイド産生植物由来のプレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質が挙げられる。具体的には、サポジラ由来のｔＰＴ（ＭｚｔＰＴ１、ＭｚｔＰＴ２）やトチュウ由来のｔＰＴ（ＥｕｔＰＴ１、ＥｕｔＰＴ３、ＥｕｔＰＴ５）である。
【0097】
（（結合工程））
前記結合工程においては、ＰＴファミリー蛋白質が、生体外で前記脂質膜に結合される限り、更にその他の蛋白質が結合されてもよい。
前記結合工程においては、ＰＴファミリー蛋白質が、生体外で前記脂質膜に結合される限り、更にその他の蛋白質が結合されてもよい。
【0098】
前記その他の蛋白質の由来は特に制限されないが、上述した植物由来であることが好ましく、ポリイソプレノイド産生植物由来であることがより好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることが更に好ましい。なかでも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来であることがより更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。
【0099】
前記その他の蛋白質としては、何ら制限されずいかなる蛋白質であってもよいが、前記脂質膜のゴム合成能力の観点からは、ゴム産生植物体内でもともと脂質膜上に存在する蛋白質であることが好ましい。なお、脂質膜上に存在する蛋白質は、大きく脂質膜の膜表面に結合する蛋白質であってもよいし、脂質膜の膜に挿入されるように結合する蛋白質であってもよいし、前記膜に結合している蛋白質と複合体を形成して膜表面上に存在することになる蛋白質であってもよい。
【0100】
前記ゴム産生植物体内でもともと脂質膜上に存在する蛋白質としては、例えば、Ｎｏｇｏ－Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）、Ｒｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）、Ｓｍａｌｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）、β－１，３－グルカナーゼ、Ｈｅｖｅｉｎなどが挙げられる。
【0101】
ここで、本発明者らの検討の結果、一部のＣＰＴファミリー蛋白質を使用した場合、十分に酵素活性が得られない場合があることが判明した。
この場合、更に、補助酵素を使用することにより、すなわち、補助酵素を前記脂質膜に結合させることにより、酵素活性を増強できることが判明した。
この場合、更に、補助酵素を使用することにより、すなわち、補助酵素を前記脂質膜に結合させることにより、酵素活性を増強できることが判明した。
【0102】
補助酵素としては、特に限定されないが、Ｎｏｇｏ－Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質等が挙げられる。
【0103】
Ｎｏｇｏ－Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質は、Ｎ末端側に有する１つ又は複数の膜結合領域で膜に結合し、Ｃ末端側でＣＰＴファミリー蛋白質又は他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質であり、ＣＰＴファミリー蛋白質を膜上に保持することにより機能を補助する。前記ＮｇＢＲファミリー蛋白質の特徴としては、Ｎ末端側に膜結合ドメインを有し、Ｃ末端側にＣｉｓ ＩＰＰＳ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｄｏｍａｉｎ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＯＧ００２０）に含まれるアミノ酸配列を有することである。
【0104】
ＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、その由来は特に制限されず、微生物由来であっても、動物由来であっても、植物由来であってもよいが、植物由来であることが好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることがより好ましく、Ｈｅｖｅａ属又はＴａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物由来であることが更に好ましく、パラゴムノキ又はロシアンタンポポ由来であることが特に好ましく、最も好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。
また、ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子の由来と、ＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードする遺伝子の由来が同種であることが好ましい。
また、ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子の由来と、ＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードする遺伝子の由来が同種であることが好ましい。
【0105】
前記ＮｇＢＲファミリー蛋白質としては、パラゴムノキ由来のＮｇＢＲ（ＨＲＢＰ）、シロイヌナズナ由来のＡｔＬＥＷ１、レタス由来のＬｓＣＰＴＬ１～２、タンポポ由来のＴｂＲＴＡなどが挙げられる。
【0106】
前記ＮｇＢＲファミリー蛋白質の具体例としては、下記［２０１］が挙げられる。
［２０１］配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［２０１］配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
【0107】
また、蛋白質は、元のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む場合であっても本来持つ機能を有する場合があることが知られている。従って、前記ＮｇＢＲファミリー蛋白質の具体例としては、下記［２０２］も挙げられる。
［２０２］配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつＮ末端側に有する１つ又は複数の膜結合領域で膜に結合し、Ｃ末端側で他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質
［２０２］配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつＮ末端側に有する１つ又は複数の膜結合領域で膜に結合し、Ｃ末端側で他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質
【0108】
なお、前記ＮｇＢＲファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号５で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１～５２個のアミノ酸、更に好ましくは１～３９個のアミノ酸、更により好ましくは１～２６個のアミノ酸、特に好ましくは１～１３個のアミノ酸、最も好ましくは１～６個のアミノ酸、より最も好ましくは１～３個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【0109】
また、上述したように、蛋白質は、元のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有する蛋白質も同様の機能を有する場合があることが知られている。従って、前記ＮｇＢＲファミリー蛋白質の具体例としては、下記［２０３］も挙げられる。
［２０３］配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＮ末端側に有する１つ又は複数の膜結合領域で膜に結合し、Ｃ末端側で他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質
［２０３］配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＮ末端側に有する１つ又は複数の膜結合領域で膜に結合し、Ｃ末端側で他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質
【0110】
なお、前記ＮｇＢＲファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号５で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
【0111】
ここで、補助酵素としては、Ｎ末端側に有する１つ又は複数の膜結合領域で膜に結合し、Ｃ末端側でＣＰＴファミリー蛋白質又は他の蛋白質と相互作用する機能を有していればよいため、ＮｇＢＲファミリー蛋白質の全部であってもよく、一部であってもよい。
補助酵素としては、前記脂質膜の酵素活性をより増強できるという理由から、下記［２０４］～［２０６］が好ましい。
［２０４］配列番号５で表されるアミノ酸配列における１位から８１位のアミノ酸配列からなる蛋白質
補助酵素としては、前記脂質膜の酵素活性をより増強できるという理由から、下記［２０４］～［２０６］が好ましい。
［２０４］配列番号５で表されるアミノ酸配列における１位から８１位のアミノ酸配列からなる蛋白質
【0112】
［２０５］配列番号５で表されるアミノ酸配列における１位から８１位のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつＮ末端側に有する１つ又は複数の膜結合領域で膜に結合し、Ｃ末端側で他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質
なお、前記機能を維持するためには、配列番号５で表されるアミノ酸配列における１位から８１位のアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１～１６個のアミノ酸、更に好ましくは１～１２個のアミノ酸、特に好ましくは１～８個のアミノ酸、最も好ましくは１～４個のアミノ酸、より最も好ましくは１～２個のアミノ酸、更に最も好ましくは１個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
なお、前記機能を維持するためには、配列番号５で表されるアミノ酸配列における１位から８１位のアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１～１６個のアミノ酸、更に好ましくは１～１２個のアミノ酸、特に好ましくは１～８個のアミノ酸、最も好ましくは１～４個のアミノ酸、より最も好ましくは１～２個のアミノ酸、更に最も好ましくは１個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【0113】
［２０６］配列番号５で表されるアミノ酸配列における１位から８１位のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＮ末端側に有する１つ又は複数の膜結合領域で膜に結合し、Ｃ末端側で他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質
なお、前記機能を維持するためには、配列番号５で表されるアミノ酸配列における１位から８１位のアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
なお、前記機能を維持するためには、配列番号５で表されるアミノ酸配列における１位から８１位のアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
【0114】
前記ＮｇＢＲファミリー蛋白質であることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、アミノ酸配列を同定し、Ｃｉｓ ＩＰＰＳ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｄｏｍａｉｎ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＯＧ００２０）に含まれるアミノ酸配列を有しているかどうかを確認する方法が挙げられる。
【0115】
前記ＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、ＮｇＢＲファミリー蛋白質をコードし、発現させてＮｇＢＲファミリー蛋白質を産出できるものであれば特に制限されない。
【0116】
前記結合工程は、生体外で、ＰＴファミリー蛋白質を、前記脂質膜に結合させることができればその手段は特に制限されず、例えば、前記ＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液と前記脂質膜とを共存させて蛋白質合成を行い、前記脂質膜にＰＴファミリー蛋白質を結合させる方法などが挙げられる。
【0117】
前記結合工程としては、なかでも、前記ＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液と前記脂質膜とを共存させて蛋白質合成を行い、前記脂質膜にＰＴファミリー蛋白質を結合させる工程であることが好ましい。
すなわち、ＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液と前記脂質膜とを共存させて（より具体的には、前記ＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液と前記脂質膜とを混合して）蛋白質合成を行うことで、ＰＴファミリー蛋白質の結合した前記脂質膜を得ることが好ましい。
すなわち、ＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液と前記脂質膜とを共存させて（より具体的には、前記ＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液と前記脂質膜とを混合して）蛋白質合成を行うことで、ＰＴファミリー蛋白質の結合した前記脂質膜を得ることが好ましい。
【0118】
前記ＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液と前記脂質膜とを共存させて行われる蛋白質合成は、いわゆる、無細胞蛋白合成法を用いたＰＴファミリー蛋白質の合成であり、生物学的機能を担持した（ｎａｔｉｖｅ状態の）ＰＴファミリー蛋白質を合成でき、当該無細胞蛋白合成法を前記脂質膜の共存下で行うことにより、合成されるＰＴファミリー蛋白質をｎａｔｉｖｅ状態で前記脂質膜に結合することが可能となる。
【0119】
ここで、前記無細胞蛋白合成溶液と前記脂質膜との共存下、蛋白質合成を行うことで、前記脂質膜にＰＴファミリー蛋白質が結合するとは、当該蛋白質合成により合成されたＰＴファミリー蛋白質の各蛋白質の全部又は一部が前記脂質膜中に取り込まれる又は前記脂質膜の膜構造に挿入される、といったことを意味するが、これに限らず、前記脂質膜表面又は内部に局在する等の場合をも意味する。また更には、前記脂質膜に結合している他の蛋白質と複合体を形成し、複合体として前記脂質膜上に存在する場合も前記脂質膜に結合しているとの概念範囲に含まれる。
【0120】
前記ＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡはそれぞれ、翻訳されてＰＴファミリー蛋白質を合成しうる翻訳鋳型である。
【0121】
前記結合工程については、当業者であれば、適宜実施できる。例えば、ＷＯ２０２１／０１０１０１号公報、ＷＯ２０１８／１１６７２６号公報に記載の方法等により実施できる。
【0122】
前記結合工程は、ＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液と前記脂質膜とを共存させて蛋白質合成を行うことが好ましいものであるが、具体的には蛋白質の合成前又は合成後の適当な時期に、好ましくは蛋白質合成前に、前記無細胞蛋白合成溶液に前記脂質膜を加えることにより行うことができる。
また、無細胞蛋白合成溶液と共存させる前記脂質膜の濃度は、５～５０ｇ／Ｌであることが好ましい。すなわち、無細胞蛋白合成溶液１Ｌに対して前記脂質膜を５～５０ｇ共存させることが好ましい。無細胞蛋白合成溶液と共存させる前記脂質膜の濃度が５ｇ／Ｌ未満であると、合成されたＰＴファミリー蛋白質が結合した前記脂質膜を回収するために、超遠心分離等による分離処理を行った際に、ゴム層が形成されず、合成されたＰＴファミリー蛋白質が結合した前記脂質膜を回収することが困難になる場合がある。一方、無細胞蛋白合成溶液と共存させる前記脂質膜の濃度が５０ｇ／Ｌを超えると、前記脂質膜同士が凝集し、合成されたＰＴファミリー蛋白質がうまく前記脂質膜に結合できなくなるおそれがある。前記脂質膜の濃度としてより好ましくは１０～４０ｇ／Ｌ、更に好ましくは１５～３５ｇ／Ｌ、特に好ましくは１５～３０ｇ／Ｌである。
また、無細胞蛋白合成溶液と共存させる前記脂質膜の濃度は、５～５０ｇ／Ｌであることが好ましい。すなわち、無細胞蛋白合成溶液１Ｌに対して前記脂質膜を５～５０ｇ共存させることが好ましい。無細胞蛋白合成溶液と共存させる前記脂質膜の濃度が５ｇ／Ｌ未満であると、合成されたＰＴファミリー蛋白質が結合した前記脂質膜を回収するために、超遠心分離等による分離処理を行った際に、ゴム層が形成されず、合成されたＰＴファミリー蛋白質が結合した前記脂質膜を回収することが困難になる場合がある。一方、無細胞蛋白合成溶液と共存させる前記脂質膜の濃度が５０ｇ／Ｌを超えると、前記脂質膜同士が凝集し、合成されたＰＴファミリー蛋白質がうまく前記脂質膜に結合できなくなるおそれがある。前記脂質膜の濃度としてより好ましくは１０～４０ｇ／Ｌ、更に好ましくは１５～３５ｇ／Ｌ、特に好ましくは１５～３０ｇ／Ｌである。
【0123】
また、前記無細胞蛋白合成溶液と前記脂質膜との共存下での蛋白質合成は、その反応の進展に伴い、適宜前記脂質膜を追加していってもよい。前記脂質膜を前記無細胞蛋白合成溶液に加えてから例えば３～４８時間（好ましくは３～３０時間、より好ましくは３～２４時間）など無細胞蛋白合成系が活性な間、前記無細胞蛋白合成溶液と前記脂質膜とが共存するようにしておくことが好ましい。
【0124】
前記無細胞蛋白合成における蛋白質合成のための反応システム又は装置としては、バッチ（回分）法（Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ，１７９－２０９，Ｂ．Ｄ．＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４））や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋白質合成システム（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２－１１６４（１９８８））、透析法（木川等、第２１回日本分子生物学会、ＷＩＤ６）、重層法（ＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ Ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｃｏｒｅ ｋｉｔ取扱説明書：ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。その他、蛋白質合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法等も用いることができる。
【0125】
なかでも、重層法は操作が簡便であるという利点はあるものの反応溶液中で前記脂質膜が分散してしまい、合成されるＰＴファミリー蛋白質を前記脂質膜に効率よく結合させることが困難であるのに対して、透析法では、合成されるＰＴファミリー蛋白質の原料となるアミノ酸は透析膜を透過できるが前記脂質膜は透過しないため、前記脂質膜の分散を防ぐことができ、効率的に前記脂質膜に合成されるＰＴファミリー蛋白質を結合させることができることから、透析法が好ましい。
【0126】
なお、前記透析法とは、前記無細胞蛋白合成における蛋白質合成の合成反応液を透析内液とし、透析外液と物質移動が可能な透析膜によって隔離される装置を用いて、蛋白質合成を行う方法である。具体的には、例えば、翻訳鋳型を除いた前記合成反応液を必要に応じて適当時間プレインキュベートした後、翻訳鋳型を添加して、適当な透析容器に入れ反応内液とする。透析容器としては、底部に透析膜が付加されている容器（第一化学社製の透析カップ１２，０００等）や、透析用チューブ（三光純薬社製の１２，０００等）が挙げられる。透析膜は、１０，０００ダルトン以上の分子量限界を有するものが用いられるが、１２，０００ダルトン程度の分子量限界を有するものが好ましい。
【0127】
前記透析外液としては、アミノ酸を含む緩衝液が用いられる。透析外液は反応速度が低下した時点で、新鮮なものと交換することにより透析効率を上昇させることができる。反応温度及び時間は用いる蛋白質合成系において適宜選択されるが、例えば、小麦由来の胚芽抽出物を用いた系においては、通常１０～４０℃、好ましくは１８～３０℃、より好ましくは２０～２６℃で、１０分～４８時間（好ましくは１０分～３０時間、より好ましくは１０分～２４時間）行うことができる。
【0128】
また、前記無細胞蛋白合成溶液に含まれるＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡは、分解されやすいことから、前記蛋白質合成反応中に適宜当該ｍＲＮＡを追加することで、蛋白質の合成をより効率的に行うことができる。すなわち、前記蛋白質合成反応中に、前記ＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを更に加えることもまた、好適な実施形態の１つである。
なお、前記ｍＲＮＡの添加時間、添加回数、添加量等は特に制限されず、適宜設定することができる。
なお、前記ｍＲＮＡの添加時間、添加回数、添加量等は特に制限されず、適宜設定することができる。
【0129】
前記製造方法においては、結合工程を行った後、必要に応じて前記脂質膜を回収する工程を行ってもよい。
【0130】
前記脂質膜回収工程は、前記脂質膜を回収することができればその手法は特に制限されず、前記脂質膜を回収する通常行われる方法により行うことができる。具体的には、例えば、遠心分離により行う方法などが挙げられる。当該遠心分離により前記脂質膜を回収する場合、その遠心力や、遠心分離処理時間、遠心分離処理温度は前記脂質膜を回収できるよう適宜設定することができるが、例えば、遠心分離処理の遠心力としては、１５０００×ｇ以上が好ましく、２００００×ｇ以上がより好ましく、２５０００×ｇ以上が更に好ましい。一方、遠心力は大きくしすぎてもそれに見合うだけの分離効果が望めないことから、遠心力の上限としては、５００００×ｇ以下が好ましく、４５０００×ｇ以下がより好ましい。遠心分離処理時間としては、２０分以上が好ましく、３０分以上がより好ましく、４０分以上が更に好ましい。一方、遠心分離処理時間を長くしすぎてもそれに見合うだけの分離効果が望めないことから、遠心分離処理時間の上限としては、１２０分以下が好ましく、９０分以下がより好ましい。
また、遠心分離処理温度としては、前記脂質膜に結合したＰＴファミリー蛋白質のタンパク活性を維持するという観点から、０～１０℃が好ましく、２～８℃がより好ましく、４℃が特に好ましい。
また、遠心分離処理温度としては、前記脂質膜に結合したＰＴファミリー蛋白質のタンパク活性を維持するという観点から、０～１０℃が好ましく、２～８℃がより好ましく、４℃が特に好ましい。
【0131】
例えば、前記無細胞蛋白合成を行った場合には、前記遠心分離処理を行うと、前記脂質膜が上層に、無細胞蛋白合成溶液が下層に分離される。その後、下層の無細胞蛋白合成溶液を除去することで、ＰＴファミリー蛋白質を結合させた前記脂質膜を回収することができる。回収した前記脂質膜はｐＨが中性の適当な緩衝液に再懸濁することで保存することができる。
【0132】
なお、前記脂質膜回収工程を行った後に回収された脂質膜は更なる特別な処理を経ずにイソプレノイド（好ましくはポリイソプレノイド）の製造に用いることができる。
【0133】
イソプレノイド（好ましくはポリイソプレノイド）の製造では、前記脂質膜を懸濁させた溶液に適宜基質を添加して酵素反応を進行させてイソプレノイドを製造すればよい。具体的には、前記脂質膜上で、プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質が有する酵素活性により酵素反応が触媒され、酵素反応により生成した生成物（イソプレノイド（好ましくはポリイソプレノイド））は前記脂質膜内に蓄積される。
添加する基質としては、脂質一重膜に結合させたプレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質が触媒可能な基質を使用すればよい。
添加する基質としては、脂質一重膜に結合させたプレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質が触媒可能な基質を使用すればよい。
【0134】
更に、前記イソプレノイドの製造方法により得られたイソプレノイド（好ましくはポリイソプレノイド）は、前記脂質膜を以下の固化工程に供することで回収することができる。
【0135】
前記固化工程において、固化する方法としては、特に限定されず、エタノール、メタノール、アセトン等のイソプレノイド（好ましくはポリイソプレノイド）を溶解しない溶媒に前記脂質膜を添加する方法や前記脂質膜に酸を添加する方法等が挙げられる。固化工程を行うことにより、前記脂質膜からゴムを固形分として回収できる。得られたゴムは、必要に応じて乾燥してから使用すればよい。
【0136】
（ゴム製品の製造方法）
ゴム製品の製造方法は、前記イソプレノイドの製造方法によりイソプレノイド（好ましくはポリイソプレノイド）を製造する工程、前記イソプレノイドの製造方法により得られたイソプレノイド（好ましくはポリイソプレノイド）と、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法である。
ゴム製品の製造方法は、前記イソプレノイドの製造方法によりイソプレノイド（好ましくはポリイソプレノイド）を製造する工程、前記イソプレノイドの製造方法により得られたイソプレノイド（好ましくはポリイソプレノイド）と、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法である。
【0137】
ゴム製品としては、ゴム（好ましくは天然ゴム）を使用して製造できるゴム製品であれば特に限定されず、例えば、空気入りタイヤ、ゴムローラ、ゴム防舷材、手袋、医療用ゴムチューブ等が挙げられる。
【0138】
ゴム製品が空気入りタイヤの場合、すなわち、前記ゴム製品の製造方法が空気入りタイヤの製造方法の場合、前記生ゴム製品成形工程は、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程に、前記加硫工程は、前記生タイヤを加硫する加硫工程に相当する。すなわち、前記空気入りタイヤの製造方法は、前記イソプレノイドの製造方法によりイソプレノイド（好ましくはポリイソプレノイド）を製造する工程、前記イソプレノイドの製造方法により得られたイソプレノイド（好ましくはポリイソプレノイド）と、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法である。
【0139】
＜混練工程＞
混練工程では、前記イソプレノイドの製造方法により得られたイソプレノイド（好ましくはポリイソプレノイド）と、添加剤とを混練して混練物を得る。
混練工程では、前記イソプレノイドの製造方法により得られたイソプレノイド（好ましくはポリイソプレノイド）と、添加剤とを混練して混練物を得る。
【0140】
添加剤としては特に限定されず、ゴム製品の製造に用いられる添加剤を使用できる。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、例えば、前記イソプレノイド（好ましくはポリイソプレノイド）以外のゴム成分、カーボンブラック、シリカ、炭酸カルシウム、アルミナ、クレー、タルクなどの補強用充填剤、シランカップリング剤、酸化亜鉛、ステアリン酸、加工助剤、各種老化防止剤、オイルなどの軟化剤、ワックス、硫黄などの加硫剤、加硫促進剤等が挙げられる。
【0141】
混練工程における混練は、オープンロール、バンバリーミキサー、密閉式混練機などのゴム混練装置を用いて行えばよい。
【0142】
＜生ゴム製品成形工程（タイヤの場合は生タイヤ成形工程）＞
生ゴム製品成形工程では、混練工程により得られた混練物から生ゴム製品（タイヤの場合は生タイヤ）を成形する。
生ゴム製品の成形方法としては特に限定されず、生ゴム製品の成形に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、混練工程により得られた混練物を、各タイヤ部材の形状に合わせて押し出し加工し、タイヤ成型機上にて通常の方法にて成形し、各タイヤ部材を貼り合わせ、生タイヤ（未加硫タイヤ）を成形すればよい。
生ゴム製品成形工程では、混練工程により得られた混練物から生ゴム製品（タイヤの場合は生タイヤ）を成形する。
生ゴム製品の成形方法としては特に限定されず、生ゴム製品の成形に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、混練工程により得られた混練物を、各タイヤ部材の形状に合わせて押し出し加工し、タイヤ成型機上にて通常の方法にて成形し、各タイヤ部材を貼り合わせ、生タイヤ（未加硫タイヤ）を成形すればよい。
【0143】
＜加硫工程＞
加硫工程では、生ゴム製品成形工程により得られた生ゴム製品を加硫することにより、ゴム製品が得られる。
生ゴム製品を加硫する方法としては特に限定されず、生ゴム製品の加硫に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、生ゴム製品成形工程により得られた生タイヤ（未加硫タイヤ）を加硫機中で加熱加圧して加硫することにより空気入りタイヤが得られる。
加硫工程では、生ゴム製品成形工程により得られた生ゴム製品を加硫することにより、ゴム製品が得られる。
生ゴム製品を加硫する方法としては特に限定されず、生ゴム製品の加硫に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、生ゴム製品成形工程により得られた生タイヤ（未加硫タイヤ）を加硫機中で加熱加圧して加硫することにより空気入りタイヤが得られる。
【実施例0144】
実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【0145】
まず、以下において、各実施例、比較例の概要について記載する。
（１）夾雑物（タンパク）の有無の比較
実施例１ サポジラｔＰＴ＋スクアレン内包ＰＭＰのＳＤＳ－ＰＡＧＥ
比較例１－１ サポジラｔＰＴ＋ゴム粒子のＳＤＳ－ＰＡＧＥ
比較例１－２ サポジラｔＰＴ＋油滴のＳＤＳ－ＰＡＧＥ
（１）夾雑物（タンパク）の有無の比較
実施例１ サポジラｔＰＴ＋スクアレン内包ＰＭＰのＳＤＳ－ＰＡＧＥ
比較例１－１ サポジラｔＰＴ＋ゴム粒子のＳＤＳ－ＰＡＧＥ
比較例１－２ サポジラｔＰＴ＋油滴のＳＤＳ－ＰＡＧＥ
【0146】
実施例２ ゴムノキｃＰＴ（ＨＲＴ）＋ＨＲＢＰ＋スクアレン内包ＰＭＰのＳＤＳ－ＰＡＧＥ
比較例２－１ ゴムノキｃＰＴ（ＨＲＴ）＋ＨＲＢＰ＋ゴム粒子のＳＤＳ－ＰＡＧＥ
比較例２－１ ゴムノキｃＰＴ（ＨＲＴ）＋ＨＲＢＰ＋ゴム粒子のＳＤＳ－ＰＡＧＥ
【0147】
（２）意図しない副反応の有無の比較
実施例３ スクアレン内包ＰＭＰのＩＰＰ消費活性
比較例３ ゴム粒子のＩＰＰのＩＰＰ消費活性
実施例３ スクアレン内包ＰＭＰのＩＰＰ消費活性
比較例３ ゴム粒子のＩＰＰのＩＰＰ消費活性
【0148】
（３）ＰＭＰの内包物の違いによる生成物鎖長の違い
実施例４ サポジラｔＰＴ＋スクアレン内包ＰＭＰ
比較例４ サポジラｔＰＴ＋ＴＡＧ内包ＰＭＰ
実施例５ サポジラｔＰＴ＋スクアレン及びβカロテン内包ＰＭＰ
実施例４ サポジラｔＰＴ＋スクアレン内包ＰＭＰ
比較例４ サポジラｔＰＴ＋ＴＡＧ内包ＰＭＰ
実施例５ サポジラｔＰＴ＋スクアレン及びβカロテン内包ＰＭＰ
【0149】
（スクアレン、ＴＡＧ、又は、スクアレン及びβカロテン内包脂質一重膜（ＰＭＰ）の調製）
クロロホルムに２．５ｍｇのアゾレクチンを溶解させ、チューブ内で乾燥させた。Ｂｕｆｆｅｒを添加した後、２０μＬのスクアレン、２０μＬのＴＡＧ、又は、２０μＬのスクアレン及び０．５ｍｇのβカロテンを加えた。超音波バスにより溶液を十分攪拌した後、１００００×ｇで遠心分離を行い、遠心後の白いトップ層をＰＭＰとして回収した。
クロロホルムに２．５ｍｇのアゾレクチンを溶解させ、チューブ内で乾燥させた。Ｂｕｆｆｅｒを添加した後、２０μＬのスクアレン、２０μＬのＴＡＧ、又は、２０μＬのスクアレン及び０．５ｍｇのβカロテンを加えた。超音波バスにより溶液を十分攪拌した後、１００００×ｇで遠心分離を行い、遠心後の白いトップ層をＰＭＰとして回収した。
【0150】
（ゴム粒子の調製）
ゴム粒子は、５段階の遠心分離によってＨｅｖｅａラテックスから調製した。Ｈｅｖｅａラテックス９００ｍＬに、２０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）１００ｍＬを添加し、ラテックス溶液を調製した。得られたラテックス溶液を、１０００×ｇ、２０００×ｇ、８０００×ｇ、２００００×ｇ、５００００×ｇ、１０，０００×ｇの異なる遠心速度で段階的に遠心分離した。遠心分離はいずれも４℃、４５分で行った。１０００００×ｇでの遠心分離で残ったゴム粒子層に、３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアミノ］－プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）を終濃度０．１～２．０×ＣＭＣ（臨界ミセル濃度ＣＭＣの０．１～２．０倍）になるように加え、ゴム粒子を洗浄した。洗浄処理後、洗浄されたゴム粒子を超遠心分離（１０００００×ｇ、４℃、４５分）によって回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。
ゴム粒子は、５段階の遠心分離によってＨｅｖｅａラテックスから調製した。Ｈｅｖｅａラテックス９００ｍＬに、２０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）１００ｍＬを添加し、ラテックス溶液を調製した。得られたラテックス溶液を、１０００×ｇ、２０００×ｇ、８０００×ｇ、２００００×ｇ、５００００×ｇ、１０，０００×ｇの異なる遠心速度で段階的に遠心分離した。遠心分離はいずれも４℃、４５分で行った。１０００００×ｇでの遠心分離で残ったゴム粒子層に、３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアミノ］－プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）を終濃度０．１～２．０×ＣＭＣ（臨界ミセル濃度ＣＭＣの０．１～２．０倍）になるように加え、ゴム粒子を洗浄した。洗浄処理後、洗浄されたゴム粒子を超遠心分離（１０００００×ｇ、４℃、４５分）によって回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。
【0151】
（クラミドモナス由来油滴の調製）
（クラミドモナスの培養）
クラミドモナス ｓｔａ６株 ［ＣＣ－４３４８ ｓｔａ６－１ ｍｔ＋ （ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ Ｂａｌｌ ｌａｂ． ｂｕｔ ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｚｉ Ｔｅｎｇ Ｗａｎｇ， Ｇｏｏｄｅｎｏｕｇｈ ｌａｂ， ＢＡＦＪ５）］ 、及びその親株であるｃｗ１５株［ＣＣ－４３４９ ｃｗ１５ ｍｔ＋ （ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｏｏｄｅｎｏｕｇｈ， ３３０Ａ）］は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒより入手した。ＴＡＰ液体培地及び寒天培地によって、培養を行った。液体培養の場合は１週間ごとに継代を行い、寒天培地の場合、シャーレであれば１ヵ月、スラントであれば３ヵ月ごとに継代を行った。培養条件は、光量子束密度１００μｍｏｌ ｍ－２ ｓ―１の連続光、２２℃で、液体培地の旋回培養は１２０ｒｐｍで行なった。ただし、スラント培養の場合は、光量子束密度６μｍｏｌ ｍ－２ ｓ―１の連続光照射条件で行なった。
（クラミドモナスの培養）
クラミドモナス ｓｔａ６株 ［ＣＣ－４３４８ ｓｔａ６－１ ｍｔ＋ （ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ Ｂａｌｌ ｌａｂ． ｂｕｔ ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｚｉ Ｔｅｎｇ Ｗａｎｇ， Ｇｏｏｄｅｎｏｕｇｈ ｌａｂ， ＢＡＦＪ５）］ 、及びその親株であるｃｗ１５株［ＣＣ－４３４９ ｃｗ１５ ｍｔ＋ （ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｏｏｄｅｎｏｕｇｈ， ３３０Ａ）］は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒより入手した。ＴＡＰ液体培地及び寒天培地によって、培養を行った。液体培養の場合は１週間ごとに継代を行い、寒天培地の場合、シャーレであれば１ヵ月、スラントであれば３ヵ月ごとに継代を行った。培養条件は、光量子束密度１００μｍｏｌ ｍ－２ ｓ―１の連続光、２２℃で、液体培地の旋回培養は１２０ｒｐｍで行なった。ただし、スラント培養の場合は、光量子束密度６μｍｏｌ ｍ－２ ｓ―１の連続光照射条件で行なった。
【0152】
無細胞翻訳系で使用する油滴（ＬＤ）を精製するためには、窒素欠乏状態で生育する必要がある。その場合は、前記の液体培地で７日間液体培養した培養液５ｍＬを以下のＨＳＭ液体培地９５ｍＬに添加し、光量子束密度３０ μｍｏｌ ｍ－２ ｓ―１、１２０ｒｐｍ、２２℃で培養を行った。２、３日後に、サンプル２μＬを血球計算盤（サンリード硝子）に乗せ、顕微鏡ＢＸ４０（ＯＬＹＭＰＵＳ）を用いて観察することで、細胞密度を算出した。密度が２．６ （±１．２）×１０６個／ｍＬになった時点で、２，０００×ｇ、５分間遠心分離することで、クラミドモナス細胞を回収した。続いて、ＨＳＭ（Ｎ ｆｒｅｅ）培地１００ｍＬで再懸濁し、再度培養を行った。その２日後に、１．５ＭのＫＯＡｃを１．３ｍＬ添加し、更に２日間培養した。その培養液を回収し、２，０００×ｇ、５分間の遠心分離によって、培地を除去し、液体窒素で瞬間冷凍したのちに－８０℃で保存した。
【0153】
（クラミドモナス由来の油滴の調製）
Ｂｕｆｆｅｒ ２０ｍＬで培養したクラミドモナスを懸濁した。これをアミンコ・フレンチプレス細胞破砕機（Ｔｈｅｒｍｏ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を利用しクラミドモナスを破砕した。セレクターバルブはＨｉｇｈ、圧力コントロールバルブ１２５０ ｐｓｉに設定し、２００００ ｐｓｉで破砕を行った。
２０，０００×ｇ、４℃で３０分遠心分離した。Ｆａｔ ｐａｄを回収し、Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ ３ｍＬを加えて懸濁し、１，０００×ｇ、４℃で１０分遠心分離した後、シリンジを用いて、下層の溶液を回収した。この溶液を２０，０００×ｇ、４℃で３０分遠心分離し、下層を除去したのち、ＴＤ Ｂｕｆｆｅｒを６０μＬ添加し再懸濁し、油滴を調製した。
Ｂｕｆｆｅｒ ２０ｍＬで培養したクラミドモナスを懸濁した。これをアミンコ・フレンチプレス細胞破砕機（Ｔｈｅｒｍｏ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を利用しクラミドモナスを破砕した。セレクターバルブはＨｉｇｈ、圧力コントロールバルブ１２５０ ｐｓｉに設定し、２００００ ｐｓｉで破砕を行った。
２０，０００×ｇ、４℃で３０分遠心分離した。Ｆａｔ ｐａｄを回収し、Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ ３ｍＬを加えて懸濁し、１，０００×ｇ、４℃で１０分遠心分離した後、シリンジを用いて、下層の溶液を回収した。この溶液を２０，０００×ｇ、４℃で３０分遠心分離し、下層を除去したのち、ＴＤ Ｂｕｆｆｅｒを６０μＬ添加し再懸濁し、油滴を調製した。
【0154】
＜発現ベクターの作製＞
（サポジラ由来トランス型プレニルトランスフェラーゼ遺伝子の取得）
高分子トランス－１、４－ポリイソプレンを合成するトランス型プレニルトランスフェラーゼの遺伝子を取得するため、高分子トランス－１、４－ポリイソプレンを合成するサポジラのトランスクリプトームデータベースをｄｅ ｎｏｖｏアセンブリを行い、シロイヌナズナ由来のトランス型プレニルトランスフェラーゼ遺伝子と類似する遺伝子を探索し、ＭｚｔＰＴ２を発見し、化学合成した。合成した遺伝子はｐＥＵ－Ｅ０１－Ｈｉｓ－ＴＥＶ－ＭＣＳ－Ｎ２（ＣｅｌｌＦｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｔｓｕｙａｍａ、Ｊａｐａｎ）（以降、ｐＥＵ－Ｎ２と記載する）の制限酵素サイトに導入した。
（サポジラ由来トランス型プレニルトランスフェラーゼ遺伝子の取得）
高分子トランス－１、４－ポリイソプレンを合成するトランス型プレニルトランスフェラーゼの遺伝子を取得するため、高分子トランス－１、４－ポリイソプレンを合成するサポジラのトランスクリプトームデータベースをｄｅ ｎｏｖｏアセンブリを行い、シロイヌナズナ由来のトランス型プレニルトランスフェラーゼ遺伝子と類似する遺伝子を探索し、ＭｚｔＰＴ２を発見し、化学合成した。合成した遺伝子はｐＥＵ－Ｅ０１－Ｈｉｓ－ＴＥＶ－ＭＣＳ－Ｎ２（ＣｅｌｌＦｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｔｓｕｙａｍａ、Ｊａｐａｎ）（以降、ｐＥＵ－Ｎ２と記載する）の制限酵素サイトに導入した。
【0155】
（ゴムノキ由来ＨＲＴ、ＨＲＢＰ遺伝子の取得）
〔ＨｅｖｅａラテックスからのＴｏｔａｌ ＲＮＡ抽出〕
パラゴムノキのラテックスからホットフェノール法により、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ラテックス６ｍＬに１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液６ｍＬ、１０％ＳＤＳ溶液１ｍＬを添加し、さらに６５℃で予温しておいた水飽和フェノールを１２ｍＬ添加した。６５℃で５分間インキュベートしたのち、ボルテックスで撹拌し、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。遠心後、上清を新しいチューブに移し、フェノール：クロロホルム（１：１）溶液１２ｍＬを添加し、２分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）溶液１２ｍＬを添加し、２分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液１．２ｍＬとイソプロパノール１３ｍＬを添加し、ボルテックスで撹拌した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを沈殿させるために、－２０℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を取除くことでＴｏｔａｌ ＲＮＡの沈殿を回収した。回収したＴｏｔａｌ ＲＮＡは７０％エタノールで２度洗浄したのち、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅの水で溶解させた。
〔ＨｅｖｅａラテックスからのＴｏｔａｌ ＲＮＡ抽出〕
パラゴムノキのラテックスからホットフェノール法により、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ラテックス６ｍＬに１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液６ｍＬ、１０％ＳＤＳ溶液１ｍＬを添加し、さらに６５℃で予温しておいた水飽和フェノールを１２ｍＬ添加した。６５℃で５分間インキュベートしたのち、ボルテックスで撹拌し、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。遠心後、上清を新しいチューブに移し、フェノール：クロロホルム（１：１）溶液１２ｍＬを添加し、２分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）溶液１２ｍＬを添加し、２分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液１．２ｍＬとイソプロパノール１３ｍＬを添加し、ボルテックスで撹拌した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを沈殿させるために、－２０℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を取除くことでＴｏｔａｌ ＲＮＡの沈殿を回収した。回収したＴｏｔａｌ ＲＮＡは７０％エタノールで２度洗浄したのち、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅの水で溶解させた。
【0156】
〔Ｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡの合成〕
回収したＴｏｔａｌ ＲＮＡをもとに、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの合成はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）の説明書に従って行った。
回収したＴｏｔａｌ ＲＮＡをもとに、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの合成はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）の説明書に従って行った。
【0157】
〔ｃＤＮＡからＣＰＴ、及びＮｇＢＲ遺伝子の取得〕
作製した１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型にＣＰＴ、及びＮｇＢＲ遺伝子の取得を行った。ＰＣＲはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、説明書に従って行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で１分を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＣＰＴ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー１：５’－ ｔｔｔｇｇａｔｃｃｇａｔｇｇａａｔｔａｔａｃａａｃｇｇｔｇａｇａｇｇ－３’
プライマー２：５’－ ｔｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔａｔｔｔｔａａｇｔａｔｔｃｃｔｔａｔｇｔｔｔｃｔｃｃ－３’
を使用した。
ＮｇＢＲ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー３：５’－ ｔｔｔｃｔｃｇａｇａｔｇｇａｔｔｔｇａａａｃｃｔｇｇａｇｃｔｇ －３’
プライマー４：５’－ ｔｔｔｃｔｃｇａｇｔｃａｔｇｔａｃｃａｔａａｔｔｔｔｇｃｔｇｃａｃ －３’
を使用した。
作製した１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型にＣＰＴ、及びＮｇＢＲ遺伝子の取得を行った。ＰＣＲはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、説明書に従って行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で１分を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＣＰＴ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー１：５’－ ｔｔｔｇｇａｔｃｃｇａｔｇｇａａｔｔａｔａｃａａｃｇｇｔｇａｇａｇｇ－３’
プライマー２：５’－ ｔｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔａｔｔｔｔａａｇｔａｔｔｃｃｔｔａｔｇｔｔｔｃｔｃｃ－３’
を使用した。
ＮｇＢＲ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー３：５’－ ｔｔｔｃｔｃｇａｇａｔｇｇａｔｔｔｇａａａｃｃｔｇｇａｇｃｔｇ －３’
プライマー４：５’－ ｔｔｔｃｔｃｇａｇｔｃａｔｇｔａｃｃａｔａａｔｔｔｔｇｃｔｇｃａｃ －３’
を使用した。
【0158】
上述の方法により、ＴＰＴ遺伝子（ＭｚｔＰＴ２）、ＣＰＴ遺伝子（ＨＲＴ１）、及びＮｇＢＲ遺伝子（ＨＲＢＰ）が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。パラゴムノキ由来のＨＲＴ１をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１、パラゴムノキ由来のＨＲＴ１のアミノ酸配列を配列番号２、サポジラ由来のｔＰＴ２（ＭｚｔＰＴ２）をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３、サポジラ由来のｔＰＴ２（ＭｚｔＰＴ２）のアミノ酸配列を配列番号４、パラゴムノキ由来のＨＲＢＰのアミノ酸配列を配列番号５に示した。
【0159】
〔ベクターの構築〕
上記取得したＤＮＡ断片にｄＡ付加を行った後、ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ｐＧＥＭ－ＨＲＴ１、及びｐＧＥＭ－ＨＲＢＰを作製した。
上記取得したＤＮＡ断片にｄＡ付加を行った後、ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ｐＧＥＭ－ＨＲＴ１、及びｐＧＥＭ－ＨＲＢＰを作製した。
【0160】
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとＸ－ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養し、青／白スクリーニング法によって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとＸ－ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養し、青／白スクリーニング法によって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。
【0161】
〔プラスミドの抽出〕
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＦａｓｔ Ｇｅｎｅプラスミドミニキット（日本ジェネティクス）を使用した。
回収したプラスミドに挿入された遺伝子の塩基配列に変異がないことをシークエンス解析により確認した。
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＦａｓｔ Ｇｅｎｅプラスミドミニキット（日本ジェネティクス）を使用した。
回収したプラスミドに挿入された遺伝子の塩基配列に変異がないことをシークエンス解析により確認した。
【0162】
〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕
上記〔ベクターの構築〕で獲得したｐＧＥＭ－ＨＲＴ１を制限酵素Ｂａｍ ＨＩとＮｏｔ Ｉで処理したのち、同様にＢａｍ ＨＩとＮｏｔ Ｉで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ－Ｅ０１－Ｈｉｓ－ＴＥＶ－ＭＣＳ―Ｎ２に挿入し、ｐＥＵ－Ｈｉｓ－Ｎ２－ＨＲＴ１を作製した。
同様に、ｐＧＥＭ－ＨＲＢＰを制限酵素Ｘｈｏ Ｉで処理したのち、同様にＸｈｏ Ｉで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ－Ｅ０１－ＭＣＳ－ＴＥＶ－Ｈｉｓ－Ｃ１に挿入し、ｐＥＵ－Ｃ１－ＨＲＢＰを作製した。
上記〔ベクターの構築〕で獲得したｐＧＥＭ－ＨＲＴ１を制限酵素Ｂａｍ ＨＩとＮｏｔ Ｉで処理したのち、同様にＢａｍ ＨＩとＮｏｔ Ｉで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ－Ｅ０１－Ｈｉｓ－ＴＥＶ－ＭＣＳ―Ｎ２に挿入し、ｐＥＵ－Ｈｉｓ－Ｎ２－ＨＲＴ１を作製した。
同様に、ｐＧＥＭ－ＨＲＢＰを制限酵素Ｘｈｏ Ｉで処理したのち、同様にＸｈｏ Ｉで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ－Ｅ０１－ＭＣＳ－ＴＥＶ－Ｈｉｓ－Ｃ１に挿入し、ｐＥＵ－Ｃ１－ＨＲＢＰを作製した。
【0163】
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとＸ－ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養し、コロニーＰＣＲによって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとＸ－ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養し、コロニーＰＣＲによって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。
【0164】
〔プラスミドの抽出〕
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＦａｓｔ Ｇｅｎｅプラスミドミニキット（日本ジェネティクス）を使用した。
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＦａｓｔ Ｇｅｎｅプラスミドミニキット（日本ジェネティクス）を使用した。
【0165】
（無細胞発現）
（無細胞発現に用いるｍＲＮＡ合成及び抽出）
ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣｅｌｌＦｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｔｓｕｙａｍａ， Ｊａｐａｎ）を用いて、作製したコンストラクトからｍＲＮＡを合成した。以下の組成で３７℃、３時間反応させた。反応後、エタノール沈殿を行い、得られたペレットを２５μＬの１×ＤＢ Ｂｕｆｆｅｒで溶解させた。回収したｍＲＮＡは－８０℃で保存した。
（無細胞発現に用いるｍＲＮＡ合成及び抽出）
ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣｅｌｌＦｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｔｓｕｙａｍａ， Ｊａｐａｎ）を用いて、作製したコンストラクトからｍＲＮＡを合成した。以下の組成で３７℃、３時間反応させた。反応後、エタノール沈殿を行い、得られたペレットを２５μＬの１×ＤＢ Ｂｕｆｆｅｒで溶解させた。回収したｍＲＮＡは－８０℃で保存した。
【表1】
【0166】
（無細胞翻訳系による膜上への蛋白質の導入）
無細胞翻訳系にて翻訳・フォールディングと共役させながら膜へ外来蛋白質を導入した。作製したｍＲＮＡを用いて、各蛋白質を精製した膜上で発現させるため、コムギ胚芽由来無細胞蛋白質発現キットＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣｅｌｌＦｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて翻訳反応を行った。
７．５μＬの作製したｍＲＮＡに１５μＬの１×ＤＢ Ｂｕｆｆｅｒを加え、ｍＲＮＡ Ｐｒｅｍｉｘを調製した。その後、以下の組成で翻訳反応溶液を調製した。ＬＤは、ＬＤ懸濁液に含まれる総蛋白質量が２０μｇとなる量を添加した。
無細胞翻訳系にて翻訳・フォールディングと共役させながら膜へ外来蛋白質を導入した。作製したｍＲＮＡを用いて、各蛋白質を精製した膜上で発現させるため、コムギ胚芽由来無細胞蛋白質発現キットＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣｅｌｌＦｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて翻訳反応を行った。
７．５μＬの作製したｍＲＮＡに１５μＬの１×ＤＢ Ｂｕｆｆｅｒを加え、ｍＲＮＡ Ｐｒｅｍｉｘを調製した。その後、以下の組成で翻訳反応溶液を調製した。ＬＤは、ＬＤ懸濁液に含まれる総蛋白質量が２０μｇとなる量を添加した。
【表2】
【0167】
プラスチックチューブ（ＰＰ容器、４．５ ｍＬ、５－０９４－０２、アズワン）にＳＤＷを６５０μＬ加え、その中に透析用カップ（ＭＷＣＯ１２０００、コスモ・バイオ株式会社）を透析膜に空気が入り込まないように入れ、１０分以上静置した。その後、チューブ内のＳＤＷを捨て、外液として１×ＤＢ Ｂｕｆｆｅｒを６５０μＬ、内液として透析カップ内に調製した翻訳反応用液を５０μＬ加え、透析膜に空気が入り込まないように透析カップをプラスチックチューブに入れ、パラフィルムでカップを覆い、２６℃で５時間反応させた。反応後、外液を新たな１×ＤＢに入れ替え、内液にｍＲＮＡ Ｐｒｅｍｉｘ５μＬ追加し、更に１３時間反応を行った。反応終了後、反応溶液を回収し、そのうち５０μＬを１．５ｍＬ用チューブに移し、ＴＤ Ｂｕｆｆｅｒ（＋グリセロール２０％（ｗ／ｖ））を５０μＬを加え、２０，０００×ｇ、４℃で３０分遠心分離した。これにより得られた膜粒子画分、可溶性画分、沈殿画分のうち、膜粒子画分を可溶性画分と一緒に新たなチューブに移し、更に２０，０００×ｇ、４℃で３０分遠心分離した。遠心分離溶液のうち、水層を注射器（注射針、ＮＮ－２７１９Ｓ；１ｍＬツベルクリン用シリンジ、ＳＳ－０１Ｔ、Ｔｅｒｕｍｏ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｑｐｎａ）で抜き取り、チューブ内に残されたＬＤ層にＴＤ Ｂｕｆｆｅｒ（＋グリセロール１０％（ｗ／ｖ））１００μＬを加え、更に２０，０００×ｇ、４℃で３０分遠心分離した（ｗａｓｈ作業）。注射器で水層を抜き取り、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ｃＯｍｐｌｅｔｅＴＭ ｍｉｎｉ ＥＤＴＡ ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｒｏｃｈｅ）入りのＴＤ Ｂｕｆｆｅｒ１００μＬで懸濁し、これを精製膜粒子画分とした。
【0168】
（酵素活性測定）
プレニル鎖延長酵素の活性を測定するため、反応溶液を調製し反応させたのちに液体シンチレーションカウンターにて放射活性を測定することでＩＰＰ取り込み活性を測定した。作製した酵素結合膜粒子溶液を［４－１４Ｃ］ＩＰＰ （ＮＥＣ７７３、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を含む以下に示す反応組成で３０℃、１８時間浴槽内にて振とうした。精製ＬＤ溶液は、含まれる総蛋白質量が２μｇとなる量を添加した。
なお、実施例５では、反応条件（３０℃、１８時間）を３０℃、１５時間に変更し、反応組成を以下の通りとした。
プレニル鎖延長酵素の活性を測定するため、反応溶液を調製し反応させたのちに液体シンチレーションカウンターにて放射活性を測定することでＩＰＰ取り込み活性を測定した。作製した酵素結合膜粒子溶液を［４－１４Ｃ］ＩＰＰ （ＮＥＣ７７３、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を含む以下に示す反応組成で３０℃、１８時間浴槽内にて振とうした。精製ＬＤ溶液は、含まれる総蛋白質量が２μｇとなる量を添加した。
【表3】
【表4】
【0169】
反応後、飽和食塩水を２００μＬ添加し撹拌することで、反応を停止した。飽和食塩水飽和ｎ－ブタノールを１ｍＬ加え、１分間ボルテックスにより撹拌し、１５，０００ｒｐｍ、室温で１分間遠心後に上層のブタノール層を回収することで、天然ゴムより短いいドリコールサイズまでの生成物を抽出した。その後、水層にトルエン／ヘキサン（１：１）を５００μＬ加え、ボルテックスで５分間撹拌し、１５，０００ｒｐｍ、室温で１分間遠心後に上層（トルエン／ヘキサン層）を回収することで、天然ゴムサイズの生成物を抽出した。このトルエン／ヘキサン抽出を２回行い、計１ｍＬのトルエン／ヘキサン層を抽出した。両抽出液５０μＬをクリアゾル３ｍＬに加え、液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ―６１００、ＡＬＯＫＡ）で放射活性を測定した。測定した値からバックグラウンドの値を引き、１ｍＬのうち５０μＬを測定したため２０倍することで、抽出物全体のカウント数を計算した。
【0170】
（ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）による生成物鎖長確認）
抽出したトルエン／ヘキサン抽出物をエバポレーターにより溶媒を留去し、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を１９０μＬ加えた。シリンジに接続したフィルターユニット（ＭＳ ＰＴＦＥ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒ、Ｐｏｒｅ Ｓｉｚｅ：０．４５μｍ、Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）に通し、遮光瓶に移すことで凝集物等を除去した。このうち、５０μＬを１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＬＣ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で分離、解析を行った。分析条件は以下の通りである。
カラム構成 ： ガードカラム ＴＳＫｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎ ＭＰ （ＸＬ）（ＴＯＳＯＨ社製）
溶媒カラム ＴＳＫｇｅｌ Ｍｕｌｔｉｐｏｒｅ ＨＸＬ－Ｍ （ＴＯＳＯＨ社製）（２本連結）
測定温度 ： ４０℃
溶出溶媒 ： ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）
流速 ： １ｍＬ／ｍｉｎ
検出 ： 示差屈折計
分子量標準 ： 標準ポリスチレン
インジェクトしてから１０～２５分の間、カラムから流出したＴＨＦを３０秒ごとに回収し、それぞれを０．１ｍＬまで濃縮し、クリアゾル１ｍＬ加えた後、液体シンチレーションカウンターにて放射活性を測定した。
抽出したトルエン／ヘキサン抽出物をエバポレーターにより溶媒を留去し、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を１９０μＬ加えた。シリンジに接続したフィルターユニット（ＭＳ ＰＴＦＥ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒ、Ｐｏｒｅ Ｓｉｚｅ：０．４５μｍ、Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）に通し、遮光瓶に移すことで凝集物等を除去した。このうち、５０μＬを１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＬＣ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で分離、解析を行った。分析条件は以下の通りである。
カラム構成 ： ガードカラム ＴＳＫｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎ ＭＰ （ＸＬ）（ＴＯＳＯＨ社製）
溶媒カラム ＴＳＫｇｅｌ Ｍｕｌｔｉｐｏｒｅ ＨＸＬ－Ｍ （ＴＯＳＯＨ社製）（２本連結）
測定温度 ： ４０℃
溶出溶媒 ： ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）
流速 ： １ｍＬ／ｍｉｎ
検出 ： 示差屈折計
分子量標準 ： 標準ポリスチレン
インジェクトしてから１０～２５分の間、カラムから流出したＴＨＦを３０秒ごとに回収し、それぞれを０．１ｍＬまで濃縮し、クリアゾル１ｍＬ加えた後、液体シンチレーションカウンターにて放射活性を測定した。
【0171】
（１）夾雑物（タンパク）の有無の比較
図６、図７より、人工膜を使用した実施例１、２では、目的蛋白質以外の蛋白質がほぼ検出されていない一方で、天然膜を使用した比較例１－１、１－２、２では目的蛋白質以外の夾雑蛋白質も確認された。これにより人工膜を利用することで生成物への夾雑物の混入を減少させることができることが分かった。
図６、図７より、人工膜を使用した実施例１、２では、目的蛋白質以外の蛋白質がほぼ検出されていない一方で、天然膜を使用した比較例１－１、１－２、２では目的蛋白質以外の夾雑蛋白質も確認された。これにより人工膜を利用することで生成物への夾雑物の混入を減少させることができることが分かった。
【0172】
（２）意図しない副反応の有無の比較
図８より、人工膜を使用している実施例３では膜自体にＩＰＰ消費活性はないが、ゴム粒子を利用している比較例３では膜自体にＩＰＰ消費活性（特にトルエン／ヘキサンで抽出される生成物ができる反応活性）が確認された。これにより、ゴム粒子では目的生成物以外のイソプレノイドが合成されてしまう一方で、イソプレノイドを内包する脂質一重膜では目的の生成物しか生成しないことが分かった。
図８より、人工膜を使用している実施例３では膜自体にＩＰＰ消費活性はないが、ゴム粒子を利用している比較例３では膜自体にＩＰＰ消費活性（特にトルエン／ヘキサンで抽出される生成物ができる反応活性）が確認された。これにより、ゴム粒子では目的生成物以外のイソプレノイドが合成されてしまう一方で、イソプレノイドを内包する脂質一重膜では目的の生成物しか生成しないことが分かった。
【0173】
（３）ＰＭＰの内包物違いによる生成物鎖長の違い
図９より、スクアレン内包ＰＭＰを使用した場合では、ＴＡＧ内包ＰＭＰを使用した場合と比較して生成物鎖長のピークトップ位置が高分子量側にシフトし、重量平均分子量が大きくなっていた。ＴＡＧ内包ＰＭＰではほとんど観測されていない分子量１０＾５の生成物がスクアレン内包ＰＭＰでは確認された。これにより内包する化合物をスクアレン（イソプレノイド）にすることにより生成物鎖長を長くすることができることが分かった。
図９、１０より、スクアレン及びβカロテン内包ＰＭＰを使用した場合には、スクアレン内包ＰＭＰを使用した場合よりも生成物鎖長を長くすることができることが分かった。
図９より、スクアレン内包ＰＭＰを使用した場合では、ＴＡＧ内包ＰＭＰを使用した場合と比較して生成物鎖長のピークトップ位置が高分子量側にシフトし、重量平均分子量が大きくなっていた。ＴＡＧ内包ＰＭＰではほとんど観測されていない分子量１０＾５の生成物がスクアレン内包ＰＭＰでは確認された。これにより内包する化合物をスクアレン（イソプレノイド）にすることにより生成物鎖長を長くすることができることが分かった。
図９、１０より、スクアレン及びβカロテン内包ＰＭＰを使用した場合には、スクアレン内包ＰＭＰを使用した場合よりも生成物鎖長を長くすることができることが分かった。
【0174】
図１１より、スクアレン及びβカロテン内包ＰＭＰを使用した場合には、スクアレン内包ＰＭＰを使用した場合よりも酵素の活性（反応量）が上昇することが分かった。
【0175】
本発明（１）は、イソプレノイドを内包する脂質一重膜に結合させたプレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質を用いたイソプレノイドの製造方法に関する。
【0176】
本発明（２）は、前記脂質一重膜が人工合成された脂質一重膜である本発明（１）記載のイソプレノイドの製造方法に関する。
【0177】
本発明（３）は、前記プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質が、炭素数６０以上の生成物を合成することができるプレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質である本発明（１）又は（２）記載のイソプレノイドの製造方法に関する。
【0178】
本発明（４）は、前記プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質が、
以下のアミノ酸配列（Ａ）：
ＤＧＮＸ１ＲＸ２Ａ （Ａ） （アミノ酸配列（Ａ）中、Ｘ１及びＸ２は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す）
を有するシス型プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質、
又は
以下のアミノ酸配列（Ｂ－１）若しくは（Ｂ－２）：
ＤＤＸ１Ｘ２Ｄ （Ｂ－１） （アミノ酸配列（Ｂ－１）中、Ｘ１、Ｘ２は任意のアミノ酸残基を表す）
ＤＤＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｄ （Ｂ－２）（アミノ酸配列（Ｂ－２）中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す）
を有するトランス型プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質である本発明（１）～（３）のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法に関する。
以下のアミノ酸配列（Ａ）：
ＤＧＮＸ１ＲＸ２Ａ （Ａ） （アミノ酸配列（Ａ）中、Ｘ１及びＸ２は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す）
を有するシス型プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質、
又は
以下のアミノ酸配列（Ｂ－１）若しくは（Ｂ－２）：
ＤＤＸ１Ｘ２Ｄ （Ｂ－１） （アミノ酸配列（Ｂ－１）中、Ｘ１、Ｘ２は任意のアミノ酸残基を表す）
ＤＤＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｄ （Ｂ－２）（アミノ酸配列（Ｂ－２）中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す）
を有するトランス型プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質である本発明（１）～（３）のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法に関する。
【0179】
本発明（５）は、前記プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質が、ポリイソプレノイド産生植物由来である本発明（１）～（４）のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法に関する。
【0180】
本発明（６）は、前記ポリイソプレノイド産生植物が、Ｈｅｖｅａ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ属、又はＭａｎｉｌｋａｒａ属に属する植物である本発明（５）記載のイソプレノイドの製造方法に関する。
【0181】
本発明（７）は、前記ポリイソプレノイド産生植物が、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（パラゴムノキ）、Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋ－ｓａｇｈｙｚ（ロシアンタンポポ）、Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ（グアユール）、又はＭａｎｉｌｋａｒａ ｚａｐｏｔａ（サポジラ）である本発明（５）記載のイソプレノイドの製造方法に関する。
【0182】
本発明（８）は、前記脂質一重膜に内包されるイソプレノイドがスクアレン及びカロテノイドからなる群から選択される少なくとも１種である本発明（１）～（７）のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法に関する。
【0183】
本発明（９）は、前記脂質一重膜に内包されるイソプレノイドがスクアレンである本発明（１）～（８）のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法に関する。
【0184】
本発明（１０）は、前記脂質一重膜に内包されるイソプレノイドがスクアレン及びカロテノイドである本発明（１）～（９）のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法に関する。
【0185】
本発明（１１）は、前記プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質を、生体外で、前記脂質一重膜に結合させる結合工程を含む本発明（１）～（１０）のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法に関する。
【0186】
本発明（１２）は、前記結合工程が、前記プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液と、前記脂質一重膜とを共存させて蛋白質合成を行い、前記脂質一重膜に、プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質を結合させる工程である本発明（１）～（１１）のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法に関する。
【0187】
本発明（１３）は、本発明（１）～（１２）のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法によりイソプレノイドを製造する工程、得られたイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法に関する。
【0188】
本発明（１４）は、本発明（１）～（１２）のいずれかに記載のイソプレノイドの製造方法によりイソプレノイドを製造する工程、得られたイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法に関する。
【0189】
（配列表フリーテキスト）
配列番号１：パラゴムノキ由来のＨＲＴ１をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号２：パラゴムノキ由来のＨＲＴ１のアミノ酸配列
配列番号３：サポジラ由来のｔＰＴ２（ＭｚｔＰＴ２）をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号４：サポジラ由来のｔＰＴ２（ＭｚｔＰＴ２）のアミノ酸配列
配列番号５：パラゴムノキ由来のＨＲＢＰのアミノ酸配列
配列番号６：プライマー１
配列番号７：プライマー２
配列番号８：プライマー３
配列番号９：プライマー４
配列番号１：パラゴムノキ由来のＨＲＴ１をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号２：パラゴムノキ由来のＨＲＴ１のアミノ酸配列
配列番号３：サポジラ由来のｔＰＴ２（ＭｚｔＰＴ２）をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号４：サポジラ由来のｔＰＴ２（ＭｚｔＰＴ２）のアミノ酸配列
配列番号５：パラゴムノキ由来のＨＲＢＰのアミノ酸配列
配列番号６：プライマー１
配列番号７：プライマー２
配列番号８：プライマー３
配列番号９：プライマー４
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】