特開 2024-50504 遺伝子特異的組織情報およびシークエンシング

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024050504

(43)【公開日】2024-04-10

(54)【発明の名称】遺伝子特異的組織情報およびシークエンシング

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20240403BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20240403BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6869 Z

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023167622

(22)【出願日】2023-09-28

(31)【優先権主張番号】22198689

(32)【優先日】2022-09-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(71)【出願人】

【識別番号】520094891

【氏名又は名称】ミルテニー バイオテック ベー．フェー． ウント コー． カー・ゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｂ．Ｖ． ＆ Ｃｏ． ＫＧ

【住所又は居所原語表記】Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ－Ｅｂｅｒｔ－Ｓｔｒａｓｓｅ ６８， ５１４２９ Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100114890

【弁理士】

【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト

(74)【代理人】

【識別番号】100098501

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 拓

(74)【代理人】

【識別番号】100116403

【弁理士】

【氏名又は名称】前川 純一

(74)【代理人】

【識別番号】100134315

【弁理士】

【氏名又は名称】永島 秀郎

(74)【代理人】

【識別番号】100162880

【弁理士】

【氏名又は名称】上島 類

(72)【発明者】

【氏名】ロバート ピナード

(72)【発明者】

【氏名】細野 正裕

(72)【発明者】

【氏名】レート ミュラー

(72)【発明者】

【氏名】エミリー ニール

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA13

4B063QQ53

4B063QR08

4B063QR20

4B063QR32

4B063QR55

4B063QS14

4B063QS25

4B063QS28

4B063QS39

(57)【要約】      （修正有）

【課題】高い分解能で標的配列の空間的位置および配列情報の両方を同時に得る方法を提供する。
【解決手段】ａ．ａ）ｍＲＮＡ鎖結合領域と、ｂ）ＵＭＩ領域を含むアンカー配列と、ｃ）プライマー領域とを含む直鎖状プローブを準備する工程、ｂ．直鎖状プローブをｍＲＮＡ鎖にハイブリダイズする工程、ｃ．逆転写ｃＤＮＡ鎖を得る工程、ｄ．ロケーター分子をハイブリダイズし、ギャップを生成する工程、ｅ．非鎖置換酵素を用いて、環状鋳型を生成する工程、ｆ．環状鋳型分子をＲＣＡによって増加させ、ロロニーを生成する工程、ｇ．組織上のｍＲＮＡの空間的位置を得る工程、ｈ．一本鎖ｃＤＮＡオリゴマーを得る工程、ｉ．プライミング一本鎖オリゴマーをＰＣＲにより増幅する工程、ｊ．ロロニーの空間的情報とプライミング一本鎖オリゴマーの配列情報とをＵＭＩ配列により関連付ける工程を含む、方法とする。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組織サンプル上の少なくとも１つのｍＲＮＡ鎖の標的配列の空間的位置および配列情報を得る方法であって、
ａ．ａ）前記少なくとも１つのｍＲＮＡ鎖に結合することが可能な結合領域と、ｂ）第１のロケーター領域と第２のロケーター領域との間に位置するＵＭＩ領域を含むアンカー配列と、ｃ）プライマー領域とを含む直鎖状プローブを準備する工程、
ｂ．前記直鎖状プローブをその結合領域で前記ｍＲＮＡ鎖にハイブリダイズする工程、
ｃ．前記ｍＲＮＡ鎖を鋳型として用いて前記直鎖状プローブを補完し、それにより逆転写ｃＤＮＡ鎖を得る工程、
ｄ．ロケーター分子をその３’および５’末端で前記第１および第２のロケーター領域にハイブリダイズし、それにより前記直鎖状プローブの前記ＵＭＩの長さに対応するギャップを生成する工程、
ｅ．非鎖置換酵素を用いて、前記ＵＭＩに相補的なヌクレオチドで前記ロケーター分子内のギャップを充填し、それにより前記直鎖状プローブから前記ＵＭＩ領域のコピーを含む環状鋳型を生成する工程、
ｆ．プライマー領域から開始して、前記環状鋳型分子を前記組織サンプル上でＲＣＡによって増加させ、それによりロロニーを生成する工程、
ｇ．前記ロロニーの少なくともＵＭＩ部分をシークエンシングし、それにより前記組織上の前記ｍＲＮＡの空間的位置を得る工程、
ｈ．前記逆転写ｃＤＮＡ鎖を前記組織から除去するとともに前記ｍＲＮＡ鎖を脱ハイブリダイズし、それにより一本鎖ｃＤＮＡオリゴマーを得る工程、
ｉ．前記一本鎖ｃＤＮＡオリゴマーの３’および５’末端に第１および第２のアダプタープライマーを設け、プライミング一本鎖オリゴマーを得て、前記プライミング一本鎖オリゴマーをＰＣＲにより増幅する工程、
ｊ．増幅された前記プライミング一本鎖オリゴマーをシークエンシングするとともに、前記ロロニーの空間的情報と前記増幅されたプライミング一本鎖オリゴマーの配列情報とをＵＭＩ配列により関連付ける工程
を含む、方法。

【請求項2】

工程ａ）～ｄ）をａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の順序で行うことを特徴とする、請求項１記載の方法。

【請求項3】

工程ａ）～ｄ）をａ）、ｄ）、ｂ）およびｃ）の順序で行うことを特徴とする、請求項１記載の方法。

【請求項4】

工程ｅ）における前記ロケーター分子の前記ギャップの充填を、前記環状ロケーターの領域にハイブリダイズしたプライマーを用い、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼまたは非鎖置換ポリメラーゼによって行うことを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。

【請求項5】

ギャップ充填ＤＮＡ分子の３’および５’末端を互いにライゲートし、ＵＭＩおよび直鎖状ロケーターの第１の領域がブリッジスプリントとして作用することを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。

【請求項6】

工程ｅ）におけるライゲーション反応をＤＮＡリガーゼによって行うことを特徴とする、請求項５記載の方法。

【請求項7】

ロケータープローブが、初めに前記直鎖状ロケーターを前記少なくとも１つのｍＲＮＡ鎖にハイブリダイズし、前記ロケータープローブのＲＮＡアンカー領域を逆転写ｃＤＮＡ鎖に補完し、続いて前記環状ロケーターを前記直鎖状ロケーターにハイブリダイズすることによって得られることを特徴とする、請求項６記載の方法。

【請求項8】

第１および第２のアダプタープライマーを３’および５’末端に付加する前に、前記一本鎖オリゴマーをより小さな断片へと物理的に剪断することを特徴とする、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。

【請求項9】

一本鎖適合ＤＮＡオリゴマーを環状化し、シークエンシング前にＲＣＡにより第２のロロニーへと増加させることを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

背景
細胞下レベルで組織上の全ての発現遺伝子を検出し、同時にこれらの遺伝子の配列および／または空間的情報を得ることは困難である。

【0002】

本発明は、逆転写によって捕捉されるｍＲＮＡ上の突然変異または配列変異体を含む関心領域を標的とする部分に並列した、予め定義されていないランダムに生成されたユニーク分子識別子（Unique Molecular Identifier）（ＵＭＩ）を含むプローブと、直鎖状プローブＵＭＩの配列情報をコピーするギャップパドロックロケータープローブとを用いてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）上の特定の領域を認識および増幅する方法を記載する。ライゲートされたパドロックプローブは、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を用いてロケーターＤＮＡナノボールを生成するための環状鋳型として使用される。ロケーターＤＮＡナノボールのシークエンシング後に、ＵＭＩ情報を有するｃＤＮＡを回収し、抽出し、増幅し、ＮＧＳによってシークエンシングする。

【0003】

発明の概要
したがって、本発明の目的は、既知の技術よりも高い分解能で標的配列の空間的位置および配列情報の両方を同時に得る方法を提供することであった。

【0004】

ここでは、以下の方法を記載する：
（１）ＵＭＩを有するハイブリッド環状／直鎖状ＤＮＡプローブを用いることによって、組織上に発現されたｍＲＮＡを空間位置確認する。
（２）ＵＭＩを有するプローブの直鎖部分の領域の下流の隣接領域のヌクレオチド情報を逆転写酵素でコピーする。同時に、プローブの直鎖部分のＵＭＩ部分に隣接する標的配列に相補的な末端を有するパドロックロケータープローブをハイブリダイズし、ＵＭＩの長さに対応する小さなギャップを生じさせ、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼを用いてコピーし、環状鋳型を生成することができる。
（３）環状鋳型を用いて、組織上でＵＭＩ部分がシークエンシングされるＤＮＡナノボールを生成し、直鎖状プローブのハイブリダイゼーションおよびｍＲＮＡ座標生成にレポーターとして使用する。
（４）次いで、逆転写により生成したＵＭＩを含むｃＤＮＡ鎖を組織から抽出する。
（５）次いで、抽出したＵＭＩを含むｃＤＮＡ鎖を、既知の分岐アダプター末端を有するプライマーを用いたＰＣＲにより増幅する。
（６）ＰＣＲ産物を環状化し、ＲＣＡ増幅する。
（７）ＲＣＡ産物をＮＧＳによってシークエンシングすることができる。
（８）シークエンシングして得られたものを、ＵＭＩを用いて実際の組織位置と照合する。

【0005】

本発明の対象は、組織サンプル上の少なくとも１つのｍＲＮＡ鎖の標的配列の空間的位置および配列情報を得る方法であって、
ａ．ａ）少なくとも１つのｍＲＮＡ鎖に結合することが可能な結合領域と、ｂ）第１のロケーター領域と第２のロケーター領域との間に位置するＵＭＩ領域を含むアンカー配列と、ｃ）プライマー領域とを含む直鎖状プローブを準備する工程、
ｂ．直鎖状プローブをその結合領域でｍＲＮＡ鎖にハイブリダイズする工程、
ｃ．ｍＲＮＡ鎖を鋳型として用いて直鎖状プローブを補完し、それにより逆転写ｃＤＮＡ鎖を得る工程、
ｄ．ロケーター分子をその３’および５’末端で第１および第２のロケーター領域にハイブリダイズし、それにより直鎖状プローブのＵＭＩの長さに対応するギャップを生成する工程、
ｅ．非鎖置換酵素を用いて、ＵＭＩに相補的なヌクレオチドでロケーター分子内のギャップを充填し、それにより直鎖状プローブからＵＭＩ領域のコピーを含む環状鋳型を生成する工程、
ｆ．プライマー領域から開始して、環状鋳型分子を組織サンプル上でＲＣＡによって増加させ、それによりロロニーを生成する工程、
ｇ．ロロニーの少なくともＵＭＩ部分をシークエンシングし、それにより組織上のｍＲＮＡの空間的位置を得る工程、
ｈ．逆転写ｃＤＮＡ鎖を組織から除去するとともにｍＲＮＡ鎖を脱ハイブリダイズし、それにより一本鎖ｃＤＮＡオリゴマーを得る工程、
ｉ．一本鎖ｃＤＮＡオリゴマーの３’および５’末端に第１および第２のアダプタープライマーを設け、プライミング一本鎖オリゴマーを得て、プライミング一本鎖オリゴマーをＰＣＲにより増幅する工程、
ｊ．増幅されたプライミング一本鎖オリゴマーをシークエンシングするとともに、ロロニーの空間的情報と増幅されたプライミング一本鎖オリゴマーの配列情報とをＵＭＩ配列により関連付ける工程
を含む、方法である。

【0006】

第１の実施形態では、ロケーター分子を初めにその結合領域でｍＲＮＡ鎖にハイブリダイズした後、直鎖状プローブを続いてロケーター分子にハイブリダイズする。言い換えると、工程ａ）～ｄ）をａ）、ｃ）、ｄ）およびｄ）の順序で行う。

【0007】

第２の実施形態では、ロケーター分子を初めに直鎖状プローブにハイブリダイズした後、その結合領域でｍＲＮＡ鎖にハイブリダイズする。言い換えると、工程ａ）～ｄ）をａ）、ｄ）、ｂ）およびｃ）の順序で行う。

【0008】

本発明は、ｍＲＮＡ上の関心領域の上流の領域に相補的な配列またはｍＲＮＡポリＡテールに相補的なポリＴ配列を含み、さらにパドロックロケータープローブ分子のハイブリダイゼーションに用いられる２つの領域（領域Ａ＆Ｂ）の間に位置するランダム配列（ＵＭＩ）を含む非結合部分を含む直鎖状ＤＮＡプライマーを用いて、所与の組織における目的遺伝子の空間位置確認を行う方法に関する。ｍＲＮＡ上の特定の関心領域の配列情報は、初めに直鎖状ＤＮＡプライマーを用いてｍＲＮＡをｃＤＮＡ分子に逆転写することによって取得される。

【0009】

パドロックロケータープローブ分子は、直鎖状ＤＮＡプライマーの非結合領域（領域Ａ＆Ｂ）に予め付着させてもよく、または直鎖状プライマーが組織上で直接、ｍＲＮＡ上の所望の領域の上流の配列に付着した後、直鎖状ＤＮＡプライマーにハイブリダイズしてもよい（図１）。

【0010】

直鎖状ＤＮＡプライマーへのロケータープローブのハイブリダイゼーションにより、直鎖状プライマー上のランダム配列に対応するギャップを有するオープンサークルのパドロック様構造が生じる。ギャップを非鎖置換酵素によって充填し、両端をライゲートして、閉じた環状分子を形成し、これを続いてオリゴヌクレオチドプライマーを用いたローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって組織上で直接増幅することができる。ＲＣＡにより、組織切片上でｍＲＮＡがｃＤＮＡにコピーされた同じ位置にＤＮＡナノボール（ロロニー）が生成する。次いで、ランダムな予め定義されていない配列を、組織上でＲＣＡ産物をシークエンシングすることによって解読することができ、ここで生成されたロロニーの各々について一連の座標を使用する。

【0011】

次いで、直鎖状プライマーを用いて生成されたｃＤＮＡを物理的に回収し、組織から抽出する。

【0012】

次いで、回収されたｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの５’および３’末端にアニールし、ＤＮＡアダプターを有するＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ増幅する。

【0013】

次いで、２つの末端を接合するスプリントブリッジオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ増幅産物を環状化することができる。

【0014】

次いで、サークルをローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって増幅する。次いで、ＲＣＡ産物をシークエンシングする。

【0015】

ＮＧＳシークエンシングにより、ｃＤＮＡに連結した直鎖状プライマーからのランダム配列を特定した後、組織上の同じランダム配列のシークエンシングによって得られた座標により、正確な組織位置に割り当てることができる。

【0016】

ＮＧＳシークエンシングにより、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡ上の標的関心領域、突然変異またはヌクレオチド変異体を分析することができる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】本発明の方法の最初の３工程を示す図である。

【図2】ＤＮＡナノボールを生成するために鋳型として使用される環状分子を示す図である。

【図3】組織から抽出したｃＤＮＡ鎖をＰＣＲ増幅し、後にＰＣＲプライマーにアダプター領域（Ｐ１およびＰ２）を付加することによって環状化することができる方法を示す図である。

【図4】実験データを示す図である。

【図5】実験データを示す図である。

【0018】

詳細な説明
本発明の方法を図１～３に詳細に説明し、「工程」という用語は、図中のそれぞれの工程を指す。

【0019】

ＲＣＡによるｍＲＮＡ分子の空間位置確認に続く、コピーされたＲＮＡ分子からの関心領域のｅｘ ｓｉｔｕシークエンシングは、組織上で直接行われるＲＣＡおよびＵＭＩのｉｎ ｓｉｔｕシークエンシングを含み、８工程のプロセスからなる。（工程１）ランダム配列と２つのアンカー（Ａ＆Ｂ）とを含む直鎖状プローブを、３’末端に位置する特定の配列部分を介して組織上のｍＲＮＡにハイブリダイズし、プライマーとして直鎖状プローブを用いる逆転写により、下流のｍＲＮＡ関心領域をｃＤＮＡ分子にコピーする。（工程２）サークルロケーターパドロック分子を、ＵＭＩ領域に対応するギャップを残し、領域Ａ＆Ｂを介して直鎖状プローブにハイブリダイズする。非鎖置換酵素を用いてギャップを充填することによりＵＭＩ領域をコピーし、ＤＮＡリガーゼを用いてサークルロケーターパドロックの両端をライゲートし、環状分子を生成する。

【0020】

環状分子を、サークル特異的ＲＣＡプライマーを用いるＲＣＡを用いてＤＮＡナノボール（ロロニー）を生成するための鋳型として使用する（工程３）。ロロニーのＵＭＩ部分を組織上で直接シークエンシングし、標的領域の位置座標を得る（工程４）。ｉｎ ｓｉｔｕシークエンシング中に行われる画像取得は、広視野顕微鏡（単一の焦点面）を用いるか、または共焦点顕微鏡（複数の焦点面）を用いて行うことができる。

【0021】

直鎖状プライマーとＵＭＩ配列とを含むｃＤＮＡを組織から抽出し（工程５）、分岐プライマーアダプター配列（Ｐ２）を用いて第２鎖ｃＤＮＡ合成を行う（工程６）。直鎖状プローブＡ領域に相補的な分岐アダプター配列（Ｐ１）に続いてＰ１／Ｐ２アダプタープライマーを用いてｃＤＮＡをＰＣＲ増幅する（工程７）。ＰＣＲ増幅産物を環状化し、ＵＭＩと関心領域とを含むサークルをＲＣＡ増幅する（工程８）。関心領域およびＵＭＩをＮＧＳシークエンシングし、組織外および組織上のＵＭＩ配列を対応する座標（ｘ、ｙおよび／またはｚ）と照合することにより、関心領域の位置および配列を決定する（工程９）。

【0022】

図１はプロセスの最初の３工程を示し、直鎖状プローブは、２つのアンカー（Ａ＆Ｂ）に挟まれたランダム配列と、シークエンシングする必要がある目的のｍＲＮＡ遺伝子の標的領域に相補的な特定の配列とを含む。直鎖状プローブの特定の部分が初めに標的にハイブリダイズし、続いて逆転写が行われる。関心領域は、変異体の違いのヌクレオチド変化が疑われる配列を含む。直鎖状プローブが伸長してｃＤＮＡコピーを生じ、標的に安定に付着した後、サークルロケーターを、ＵＭＩ領域に対応するギャップを残し、領域Ａ＆Ｂを介して直鎖状プローブにハイブリダイズする。ギャップを充填することによりＵＭＩ領域をコピーし、サークルロケーターをライゲートし、環状分子を生成する（工程２）。環状分子を鋳型として用いてＤＮＡナノボール（ロロニー）を生成する。ロロニーのＵＭＩ部分を組織上で直接シークエンシングし、標的領域の位置座標（ｘ、ｙおよび／またはｚ）を得る。

【0023】

図１は、ランダム配列と２つのアンカー（Ａ＆Ｂ）とを含む直鎖状プローブを、スライド上の固定組織上のｍＲＮＡに対し、３’末端に位置する特定の配列部分を介して特定のｍＲＮＡ（点線）中の関心領域の上流の領域にハイブリダイズすることをさらに示す。ｃＤＮＡへの関心領域の逆転写（工程１）は、プライマーとして使用される直鎖状プローブによって開始する。直鎖状プローブの３’末端は、約３０ｂｐ長の配列からなり、組織上の関心のｍＲＮＡ標的の特定の領域にハイブリダイズすることができる。サークルロケーターパドロック分子を、ＵＭＩ領域に対応するギャップを残し、領域Ａ＆Ｂを介して直鎖状プローブにハイブリダイズすることを工程２に示す。ＵＭＩ領域は、非鎖置換酵素、例えばＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼを用いてギャップを充填し、ＤＮＡリガーゼを用いてサークルロケーターパドロックの両端をライゲートすることにより、サークルロケーターパドロックにコピーされ、環状分子が生成する（工程２）。サークルのサイズは１００～４００ｂｐ長であり、ギャップ部分は約１０～４０ｂｐであり得る。

【0024】

図２は、ＤＮＡナノボールを生成するために鋳型として使用される環状分子を示す。環状分子を（ローリングサークル増幅）ＲＣＡによって増幅し（工程３）、ＵＭＩ部分をｉｎ ｓｉｔｕシークエンシングする（工程４）。次いで、コピーされたＵＭＩを含むｃＤＮＡ鎖を関心領域のシークエンシングのために抽出する（工程５）。

【0025】

図２は、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのような高度の処理能力および鎖置換活性を有する酵素を用い、サークルロケーターに結合するＲＣＡオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた等温ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）により、サークルロケーターを用いて組織上にＤＮＡナノボール（ロロニー）を生成するプロセスをさらに示す（工程３）。得られる組織上のＲＣＡ産物の位置は、組織上でランダムに生成されたＵＭＩをシークエンシングし、全てのロロニーの座標（ｘ、ｙおよび／またはｚ）を得ることによって決定される（工程４）。本発明の一実施形態では、サークルロケータープローブは、最後が特定のｍＲＮＡ（点線）中の関心領域の上流の領域に結合する前に、初めに直鎖状プローブアンカーにハイブリダイズする。工程５において、伸張ｃＤＮＡを組織切片スライドから抽出する。

【0026】

図３は、組織から抽出したｃＤＮＡ鎖をＰＣＲ増幅し、後にＰＣＲプライマーにアダプター領域（Ｐ１およびＰ２）を付加することによって環状化することができる方法を示す。工程６において第２鎖ｃＤＮＡ合成を行い、ＰＣＲ増幅して、Ｐ１／Ｐ２アダプター末端を有する二本鎖ＤＮＡ分子を生成し（工程７）、これをＮＧＳシークエンシングによって分析することができる（工程８）。

【0027】

図３は、実施した第２鎖ｃＤＮＡ合成（工程６）、ならびに分岐プライマー対Ｐ１およびＰ２を用いて実施したその後のＰＣＲ反応（工程７）をさらに示す。結合領域は、プライマーＰ１についてはサークルロケーター領域の上流に位置し、プライマーＰ２については「関心領域」の下流に位置し、関心領域とＵＭＩ部分とを含む適合ＤＮＡライブラリーが生成する。ＤＮＡライブラリーのシークエンシングにより、突然変異／ヌクレオチド変異体のいずれかが標的関心領域に存在するかを決定し、ＵＭＩをシークエンシングすることで、組織上の各関心領域の元の位置／起源を、組織切片上のロロニーのシークエンシングにより生成したサークルロケーターＵＭＩ配列座標と相関させて特定することができる（工程８）。

【0028】

実施例
ＤＮＡライブラリーのシークエンシングにより、標的関心領域における突然変異／ヌクレオチド変異体の存在を検出し、ＵＭＩをシークエンシングすることで、組織上の各関心領域の元の位置／起源を、組織切片上のロロニーのシークエンシングにより生成したサークルロケーターＵＭＩ配列座標と相関させて特定することができる（工程８）。

【0029】

図４は、抽出し、ＰＣＲ増幅したｃＤＮＡ（ＭＳ４Ａ１遺伝子）およびＤＮＡナノボールから生成されたライブラリーに対して行った配列分析の例を示す。シークエンシングは、関心領域およびユニーク分子識別子（ＵＭＩ）部分の上流に位置するプライマーオリゴヌクレオチドを用いてｅｘ ｓｉｔｕで行った。ＵＭＩ部分をロケーターパドロックとともにシークエンシングし、ロケーターロロニーに由来するリードを、ロケーター配列リードを既知のパドロック参照配列にマッピングすることにより特定した。さらに、ＵＭＩ部分だけでなく、ｃＤＮＡ転写産物からのコード配列が、直鎖状プライマーとロケーターパドロックにコピーされたＵＭＩ配列とを含む転写産物もシークエンシングした。ｃＤＮＡ転写産物に由来するリードを、配列リードを目的遺伝子（本実施例ではＭＳ４Ａ１遺伝子）からのコード領域の既知の参照配列にマッピングすることによって特定した。

【0030】

図５は、抽出し、ＰＣＲ増幅したｃＤＮＡの転写産物部分から生成したライブラリーから得られた実際のリードおよび（ＭＳ４Ａ１遺伝子）に実際にマッピングされたものを示す。シークエンシングは、関心領域およびユニーク分子識別子（ＵＭＩ）部分の上流に位置するプライマーオリゴヌクレオチドを用いてｅｘ ｓｉｔｕで行った。直鎖状プライマーの逆転写によって生成したＭＳ４Ａ１のコード配列部分を強調する（ブロック領域）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【外国語明細書】