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特開2024-50534マススペクトロメトリーによるアポリポタンパク質Ｅアイソタイプの検出
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024050534
(43)【公開日】2024-04-10
(54)【発明の名称】マススペクトロメトリーによるアポリポタンパク質Ｅアイソタイプの検出
(51)【国際特許分類】
G01N 27/62 20210101AFI20240403BHJP
C12Q 1/37 20060101ALI20240403BHJP
C12Q 1/60 20060101ALN20240403BHJP
C12Q 1/61 20060101ALN20240403BHJP
【ＦＩ】
G01N27/62 V ZNA
G01N27/62 X
C12Q1/37
C12Q1/60
C12Q1/61
【審査請求】有
【請求項の数】18
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023213576
(22)【出願日】2023-12-19
(62)【分割の表示】P 2022149733の分割
【原出願日】2018-07-31
(31)【優先権主張番号】62/539,478
(32)【優先日】2017-07-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】517308264
【氏名又は名称】クエスト ダイアグノスティックス インヴェストメンツ エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】230104019
【弁護士】
【氏名又は名称】大野 聖二
(74)【代理人】
【識別番号】100119183
【弁理士】
【氏名又は名称】松任谷 優子
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(74)【代理人】
【識別番号】100162503
【弁理士】
【氏名又は名称】今野 智介
(74)【代理人】
【識別番号】100144794
【弁理士】
【氏名又は名称】大木 信人
(72)【発明者】
【氏名】ウェーバー，ダレン
(72)【発明者】
【氏名】クラーク，ニゲル
(57)【要約】 （修正有）
【課題】タンデム型質量分析などのマススペクトロメトリーにより、サンプル中のアポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）の量を検出又は決定する方法を提供する。
【解決手段】サンプル中のアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）表現型を決定する方法であって、サンプル中に存在するＡｐｏＥ対立遺伝子が、マススペクトロメトリーにより検出されたイオンの同一性から決定される方法が提供される。別の態様では、アルツハイマー病又は認知症を診断又は予測する方法が、本明細書に提供される。
【選択図】図１－１
【解決手段】サンプル中のアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）表現型を決定する方法であって、サンプル中に存在するＡｐｏＥ対立遺伝子が、マススペクトロメトリーにより検出されたイオンの同一性から決定される方法が提供される。別の態様では、アルツハイマー病又は認知症を診断又は予測する方法が、本明細書に提供される。
【選択図】図１－１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
サンプル中のアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）表現型を決定する方法であって、
（ａ）サンプル中のＡｐｏＥを精製すること、
（ｂ）前記サンプル中のＡｐｏＥをイオン化させて、ＡｐｏＥの１つ又は複数のイオン
を生成すること、
（ｃ）マススペクトロメトリーにより、ステップ（ｂ）に由来するイオンを検出するこ
と
を含み、前記サンプル中に存在するＡｐｏＥ対立遺伝子が、ステップ（ｃ）において検出
されたイオンの同一性から決定される方法。
（ａ）サンプル中のＡｐｏＥを精製すること、
（ｂ）前記サンプル中のＡｐｏＥをイオン化させて、ＡｐｏＥの１つ又は複数のイオン
を生成すること、
（ｃ）マススペクトロメトリーにより、ステップ（ｂ）に由来するイオンを検出するこ
と
を含み、前記サンプル中に存在するＡｐｏＥ対立遺伝子が、ステップ（ｃ）において検出
されたイオンの同一性から決定される方法。
【請求項2】
前記精製することが、液体クロマトグラフィーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記液体クロマトグラフィーが、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む、
請求項２に記載の方法。
請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記精製することが、固相抽出法（ＳＰＥ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記イオン化が、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を含む、請求項１に記載の方
法。
法。
【請求項6】
前記イオン化が、ポジティブモードでイオン化することを含む、請求項１に記載の方法
。
。
【請求項7】
内部標準を添加することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記内部標準が、同位体で標識されている、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記サンプルが、脳脊髄液（ＣＳＦ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記サンプルが、血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
精製前に、ＡｐｏＥを消化することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
消化が、トリプシン消化を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
消化が、マイクロウェーブ消化を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
前記表現型が、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ２表現型が、６６５．７２±０．５、８３５．９３±０．５
、８６６．９９±０．５、及び９８２．０８±０．５からなる群から選択される質量／電
荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される、請求項１４に記載の方法。
、８６６．９９±０．５、及び９８２．０８±０．５からなる群から選択される質量／電
荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記表現型が、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ３である、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
前記ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ３表現型が、３７４．４２±０．５、５０２．５５±０．５
、６６５．７２±０．５、８３５．９３±０．５、８６６．９９±０．５、及び９８２．
０８±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存
在により決定される、請求項１６に記載の方法。
、６６５．７２±０．５、８３５．９３±０．５、８６６．９９±０．５、及び９８２．
０８±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存
在により決定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記表現型が、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４である、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
前記ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４表現型が、３７４．４２±０．５、５０２．５５±０．５
、６４９．７４±０．５、６６５．７２±０．５、８３５．９３±０．５、８６６．９９
±０．５、８９２．９６±０．５、及び９８２．０８±０．５からなる群から選択される
質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される、請求項１８に記載
の方法。
、６４９．７４±０．５、６６５．７２±０．５、８３５．９３±０．５、８６６．９９
±０．５、８９２．９６±０．５、及び９８２．０８±０．５からなる群から選択される
質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される、請求項１８に記載
の方法。
【請求項20】
前記表現型が、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ３である、請求項１に記載の方法。
【請求項21】
前記ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ３表現型が、３７４．４２±０．５、５０２．５５±０．５
、８６６．９９±０．５、及び９８２．０８±０．５からなる群から選択される質量／電
荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される、請求項２０に記載の方法。
、８６６．９９±０．５、及び９８２．０８±０．５からなる群から選択される質量／電
荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記表現型が、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４である、請求項１に記載の方法。
【請求項23】
前記ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４表現型が、３７４．４２±０．５、５０２．５５±０．５
、６４９．７４±０．５、８６６．９９±０．５、８９２．９６±０．５、及び９８２．
０８±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存
在により決定される、請求項２２に記載の方法。
、６４９．７４±０．５、８６６．９９±０．５、８９２．９６±０．５、及び９８２．
０８±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存
在により決定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記表現型が、ＡｐｏＥ４／ＡｐｏＥ４である、請求項１に記載の方法。
【請求項25】
ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４表現型が、３７４．４２±０．５、５０２．５５±０．５、６
４９．７４±０．５、及び８９２．９６±０．５からなる群から選択される質量／電荷の
比を有するフラグメントイオンの存在により決定される、請求項２４に記載の方法。
４９．７４±０．５、及び８９２．９６±０．５からなる群から選択される質量／電荷の
比を有するフラグメントイオンの存在により決定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
ＡｐｏＥ４対立遺伝子の存在が、アルツハイマー病発症リスクの増加を示唆する、請求
項１に記載の方法。
項１に記載の方法。
【請求項27】
ＡｐｏＥ４／ＡｐｏＥ４対立遺伝子の存在が、アルツハイマー病発症リスクの増加を示
唆する、請求項１に記載の方法。
唆する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アポリポタンパク質Ｅの検出又は定量に関する。ある特定の態様では、本発
明は、マススペクトロメトリーによりアポリポタンパク質Ｅ又はその対立遺伝子を検出す
る方法に関する。
明は、マススペクトロメトリーによりアポリポタンパク質Ｅ又はその対立遺伝子を検出す
る方法に関する。
【背景技術】
【0002】
アルツハイマー病は、高齢者集団に影響を及ぼす最も一般的な認知症の形態である。ア
ルツハイマー病は、認知能力、特に記憶及び学習の進行性の衰退により特徴付けられる。
アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）は、アルツハイマー病発症時の顕著な増加と関連する
。ヒトＡＰＯＥ遺伝子は、３つの多形対立遺伝子、ε２、ε３、及びε４を有し、その結
果６つの異なる表現型：ε２／ε２、ε２／ε３、ε３／ε３、ε２／ε４、ε３／ε４
、及びε４／ε４をもたらす。
ルツハイマー病は、認知能力、特に記憶及び学習の進行性の衰退により特徴付けられる。
アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）は、アルツハイマー病発症時の顕著な増加と関連する
。ヒトＡＰＯＥ遺伝子は、３つの多形対立遺伝子、ε２、ε３、及びε４を有し、その結
果６つの異なる表現型：ε２／ε２、ε２／ε３、ε３／ε３、ε２／ε４、ε３／ε４
、及びε４／ε４をもたらす。
【0003】
現行の臨床診断法でアルツハイマー病を予測又は診断する場合、その正確度及び感度は
低い。アポリポタンパク質Ｅを検出するための正確で高感度なアッセイ法が必要とされる
。特に、様々なアイソフォームを検出するための正確で高感度なアッセイ法が必要とされ
る。
低い。アポリポタンパク質Ｅを検出するための正確で高感度なアッセイ法が必要とされる
。特に、様々なアイソフォームを検出するための正確で高感度なアッセイ法が必要とされ
る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本明細書において、タンデム型質量分析などのマススペクトロメトリーにより、サンプ
ル中のアポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）の量を検出又は決定する方法が提供される。
ル中のアポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）の量を検出又は決定する方法が提供される。
【課題を解決するための手段】
【0005】
特定の実施形態では、アポリポタンパク質Ｅの量を検出又は決定するための本明細書に
提供される方法は、（ａ）サンプル中のアポリポタンパク質Ｅを精製することと、（ｂ）
前記サンプル中のアポリポタンパク質Ｅをイオン化させることと、（ｃ）マススペクトロ
メトリーにより、アポリポタンパク質Ｅイオンの量を検出又は決定することとを含み、そ
の場合、アポリポタンパク質Ｅイオンの量は、サンプル中のアポリポタンパク質Ｅの量と
関連する。
提供される方法は、（ａ）サンプル中のアポリポタンパク質Ｅを精製することと、（ｂ）
前記サンプル中のアポリポタンパク質Ｅをイオン化させることと、（ｃ）マススペクトロ
メトリーにより、アポリポタンパク質Ｅイオンの量を検出又は決定することとを含み、そ
の場合、アポリポタンパク質Ｅイオンの量は、サンプル中のアポリポタンパク質Ｅの量と
関連する。
【0006】
特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、サンプル中のアポリポタンパク質
Ｅ（ＡｐｏＥ）表現型を決定することを目的とし、前記方法は、（ａ）サンプル中のＡｐ
ｏＥを精製することと、（ｂ）前記サンプル中のＡｐｏＥをイオン化させて、１つ又は複
数のＡｐｏＥのイオンを生成することと、（ｃ）マススペクトロメトリーにより、ステッ
プ（ｂ）に由来するイオンを検出することを含み、その場合、ステップ（ｃ）において検
出されたイオンの同一性から、サンプル中に存在するＡｐｏＥ対立遺伝子が決定される。
Ｅ（ＡｐｏＥ）表現型を決定することを目的とし、前記方法は、（ａ）サンプル中のＡｐ
ｏＥを精製することと、（ｂ）前記サンプル中のＡｐｏＥをイオン化させて、１つ又は複
数のＡｐｏＥのイオンを生成することと、（ｃ）マススペクトロメトリーにより、ステッ
プ（ｂ）に由来するイオンを検出することを含み、その場合、ステップ（ｃ）において検
出されたイオンの同一性から、サンプル中に存在するＡｐｏＥ対立遺伝子が決定される。
【0007】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される精製工程は、液体クロマトグラフィー
を含む。いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィーは、高性能液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）を含む。
を含む。いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィーは、高性能液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）を含む。
【0008】
いくつかの実施形態では、サンプル中のＡｐｏＥは消化される。いくつかの実施形態で
は、ＡｐｏＥはトリプシンにより消化される。いくつかの実施形態では、消化されたＡｐ
ｏＥはマイクロウェーブ処理される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥは高速酵素消化
マイクロウェーブ技術により消化される。
は、ＡｐｏＥはトリプシンにより消化される。いくつかの実施形態では、消化されたＡｐ
ｏＥはマイクロウェーブ処理される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥは高速酵素消化
マイクロウェーブ技術により消化される。
【0009】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される精製工程は、固相抽出法（ＳＰＥ）を
含む。
含む。
【0010】
いくつかの実施形態では、イオン化は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を含む
。いくつかの実施形態では、イオン化は、ポジティブモードでイオン化させることを含む
。いくつかの実施形態では、イオン化は、ネガティブモードでイオン化させることを含む
。
。いくつかの実施形態では、イオン化は、ポジティブモードでイオン化させることを含む
。いくつかの実施形態では、イオン化は、ネガティブモードでイオン化させることを含む
。
【0011】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、内部標準を添加することを更
に含む。いくつかの実施形態では、内部標準は同位体標識されている。
に含む。いくつかの実施形態では、内部標準は同位体標識されている。
【0012】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法により決定される表現型は、Ａｐ
ｏＥ２／ＡｐｏＥ２である。いくつかの実施形態では、表現型は、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ
３である。いくつかの実施形態では、表現型は、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４である。いくつ
かの実施形態では、表現型は、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ３である。いくつかの実施形態では
、表現型は、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４である。いくつかの実施形態では、表現型は、Ａｐ
ｏＥ４／ＡｐｏＥ４である。
ｏＥ２／ＡｐｏＥ２である。いくつかの実施形態では、表現型は、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ
３である。いくつかの実施形態では、表現型は、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４である。いくつ
かの実施形態では、表現型は、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ３である。いくつかの実施形態では
、表現型は、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４である。いくつかの実施形態では、表現型は、Ａｐ
ｏＥ４／ＡｐｏＥ４である。
【0013】
いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ２は、５５５．１５±０．５の質量／
電荷の比を有する前駆イオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐｏ
Ｅ２／ＡｐｏＥ２は、６１２．１９±０．５の質量／電荷の比を有する前駆イオンの存在
により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ２は、６６５．７２
±０．５及び８３５．９３±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフ
ラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／Ａｐ
ｏＥ２は、６６５．７２±０．５及び８３５．９３±０．５の質量／電荷の比を有するフ
ラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／Ａｐ
ｏＥ２は、８６６．９９±０．５及び９８２．０８±０．５からなる群から選択される質
量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態
では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ２は、８６６．９９±０．５及び９８２．０８±０．５の質
量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態
では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ２は、６６５．７２±０．５、８３５．９３±０．５、８６
６．９９±０．５、及び９８２．０８±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比
を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐｏ
Ｅ２／ＡｐｏＥ２は、６６５．７２±０．５、８３５．９３±０．５、８６６．９９±０
．５、及び９８２．０８±０．５の質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在に
より決定される。
電荷の比を有する前駆イオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐｏ
Ｅ２／ＡｐｏＥ２は、６１２．１９±０．５の質量／電荷の比を有する前駆イオンの存在
により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ２は、６６５．７２
±０．５及び８３５．９３±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフ
ラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／Ａｐ
ｏＥ２は、６６５．７２±０．５及び８３５．９３±０．５の質量／電荷の比を有するフ
ラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／Ａｐ
ｏＥ２は、８６６．９９±０．５及び９８２．０８±０．５からなる群から選択される質
量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態
では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ２は、８６６．９９±０．５及び９８２．０８±０．５の質
量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態
では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ２は、６６５．７２±０．５、８３５．９３±０．５、８６
６．９９±０．５、及び９８２．０８±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比
を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐｏ
Ｅ２／ＡｐｏＥ２は、６６５．７２±０．５、８３５．９３±０．５、８６６．９９±０
．５、及び９８２．０８±０．５の質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在に
より決定される。
【0014】
いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ３は、５５５．１５±０．５の質量／
電荷の比を有する前駆イオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐｏ
Ｅ２／ＡｐｏＥ３は、６１２．１９±０．５の質量／電荷の比を有する前駆イオンの存在
により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ３は、４７５．０５
±０．５の質量／電荷の比を有する前駆イオンの存在により決定される。いくつかの実施
形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ３は、６６５．７２±０．５及び８３５．９３±０．５
からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定
される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ３は、６６５．７２±０．５及
び８３５．９３±０．５の質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定
される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ３は、８６６．９９±０．５及
び９８２．０８±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフラグメント
イオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ３は、
８６６．９９±０．５及び９８２．０８±０．５の質量／電荷の比を有するフラグメント
イオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ３は、
３７４．４２±０．５及び５０２．５５±０．５からなる群から選択される質量／電荷の
比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐ
ｏＥ２／ＡｐｏＥ３は、３７４．４２±０．５及び５０２．５５±０．５の質量／電荷の
比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐ
ｏＥ２／ＡｐｏＥ３は、３７４．４２±０．５、５０２．５５±０．５、６６５．７２±
０．５、８３５．９３±０．５、８６６．９９±０．５、及び９８２．０８±０．５から
なる群から選択される質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定され
る。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ３は、３７４．４２±０．５、５０
２．５５±０．５、６６５．７２±０．５、８３５．９３±０．５、８６６．９９±０．
５、及び９８２．０８±０．５の質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在によ
り決定される。
電荷の比を有する前駆イオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐｏ
Ｅ２／ＡｐｏＥ３は、６１２．１９±０．５の質量／電荷の比を有する前駆イオンの存在
により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ３は、４７５．０５
±０．５の質量／電荷の比を有する前駆イオンの存在により決定される。いくつかの実施
形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ３は、６６５．７２±０．５及び８３５．９３±０．５
からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定
される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ３は、６６５．７２±０．５及
び８３５．９３±０．５の質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定
される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ３は、８６６．９９±０．５及
び９８２．０８±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフラグメント
イオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ３は、
８６６．９９±０．５及び９８２．０８±０．５の質量／電荷の比を有するフラグメント
イオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ３は、
３７４．４２±０．５及び５０２．５５±０．５からなる群から選択される質量／電荷の
比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐ
ｏＥ２／ＡｐｏＥ３は、３７４．４２±０．５及び５０２．５５±０．５の質量／電荷の
比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐ
ｏＥ２／ＡｐｏＥ３は、３７４．４２±０．５、５０２．５５±０．５、６６５．７２±
０．５、８３５．９３±０．５、８６６．９９±０．５、及び９８２．０８±０．５から
なる群から選択される質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定され
る。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ３は、３７４．４２±０．５、５０
２．５５±０．５、６６５．７２±０．５、８３５．９３±０．５、８６６．９９±０．
５、及び９８２．０８±０．５の質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在によ
り決定される。
【0015】
いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４は、５５５．１５±０．５の質量／
電荷の比を有する前駆イオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐｏ
Ｅ２／ＡｐｏＥ４は、６１２．１９±０．５の質量／電荷の比を有する前駆イオンの存在
により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４は、４７５．０５
±０．５の質量／電荷の比を有する前駆イオンの存在により決定される。いくつかの実施
形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４は、５０３．５６±０．５の質量／電荷の比を有する
前駆イオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４
は、６６５．７２±０．５及び８３５．９３±０．５からなる群から選択される質量／電
荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、
ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４は、６６５．７２±０．５及び８３５．９３±０．５の質量／電
荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、
ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４は、８６６．９９±０．５及び９８２．０８±０．５からなる群
から選択される質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。い
くつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４は、８６６．９９±０．５及び９８２．
０８±０．５の質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。い
くつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４は、３７４．４２±０．５及び５０２．
５５±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存
在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４は、３７４．４
２±０．５及び５０２．５５±０．５の質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存
在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４は、６４９．７
４±０．５及び８９２．９６±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比を有する
フラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／Ａ
ｐｏＥ４は、６４９．７４±０．５及び８９２．９６±０．５の質量／電荷の比を有する
フラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／Ａ
ｐｏＥ４は、３７４．４２±０．５、５０２．５５±０．５、６４９．７４±０．５、６
６５．７２±０．５、８３５．９３±０．５、８６６．９９±０．５、８９２．９６±０
．５、及び９８２．０８±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフラ
グメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／Ａｐｏ
Ｅ４は、３７４．４２±０．５、５０２．５５±０．５、６４９．７４±０．５、６６５
．７２±０．５、８３５．９３±０．５、８６６．９９±０．５、８９２．９６±０．５
、及び９８２．０８±０．５の質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により
決定される。
電荷の比を有する前駆イオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐｏ
Ｅ２／ＡｐｏＥ４は、６１２．１９±０．５の質量／電荷の比を有する前駆イオンの存在
により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４は、４７５．０５
±０．５の質量／電荷の比を有する前駆イオンの存在により決定される。いくつかの実施
形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４は、５０３．５６±０．５の質量／電荷の比を有する
前駆イオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４
は、６６５．７２±０．５及び８３５．９３±０．５からなる群から選択される質量／電
荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、
ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４は、６６５．７２±０．５及び８３５．９３±０．５の質量／電
荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、
ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４は、８６６．９９±０．５及び９８２．０８±０．５からなる群
から選択される質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。い
くつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４は、８６６．９９±０．５及び９８２．
０８±０．５の質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。い
くつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４は、３７４．４２±０．５及び５０２．
５５±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存
在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４は、３７４．４
２±０．５及び５０２．５５±０．５の質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存
在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４は、６４９．７
４±０．５及び８９２．９６±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比を有する
フラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／Ａ
ｐｏＥ４は、６４９．７４±０．５及び８９２．９６±０．５の質量／電荷の比を有する
フラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／Ａ
ｐｏＥ４は、３７４．４２±０．５、５０２．５５±０．５、６４９．７４±０．５、６
６５．７２±０．５、８３５．９３±０．５、８６６．９９±０．５、８９２．９６±０
．５、及び９８２．０８±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフラ
グメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ２／Ａｐｏ
Ｅ４は、３７４．４２±０．５、５０２．５５±０．５、６４９．７４±０．５、６６５
．７２±０．５、８３５．９３±０．５、８６６．９９±０．５、８９２．９６±０．５
、及び９８２．０８±０．５の質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により
決定される。
【0016】
いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ３は、６１２．１９±０．５の質量／
電荷の比を有する前駆イオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐｏ
Ｅ３／ＡｐｏＥ３は、４７５．０５±０．５の質量／電荷の比を有する前駆イオンの存在
により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ３は、８６６．９９
±０．５及び９８２．０８±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフ
ラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／Ａｐ
ｏＥ３は、８６６．９９±０．５及び９８２．０８±０．５の質量／電荷の比を有するフ
ラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／Ａｐ
ｏＥ３は、３７４．４２±０．５及び５０２．５５±０．５からなる群から選択される質
量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態
では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ３は、３７４．４２±０．５及び５０２．５５±０．５の質
量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態
では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ３は、３７４．４２±０．５、５０２．５５±０．５、８６
６．９９±０．５、及び９８２．０８±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比
を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐｏ
Ｅ３／ＡｐｏＥ３は、３７４．４２±０．５、５０２．５５±０．５、８６６．９９±０
．５、及び９８２．０８±０．５の質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在に
より決定される。
電荷の比を有する前駆イオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐｏ
Ｅ３／ＡｐｏＥ３は、４７５．０５±０．５の質量／電荷の比を有する前駆イオンの存在
により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ３は、８６６．９９
±０．５及び９８２．０８±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフ
ラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／Ａｐ
ｏＥ３は、８６６．９９±０．５及び９８２．０８±０．５の質量／電荷の比を有するフ
ラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／Ａｐ
ｏＥ３は、３７４．４２±０．５及び５０２．５５±０．５からなる群から選択される質
量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態
では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ３は、３７４．４２±０．５及び５０２．５５±０．５の質
量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態
では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ３は、３７４．４２±０．５、５０２．５５±０．５、８６
６．９９±０．５、及び９８２．０８±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比
を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐｏ
Ｅ３／ＡｐｏＥ３は、３７４．４２±０．５、５０２．５５±０．５、８６６．９９±０
．５、及び９８２．０８±０．５の質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在に
より決定される。
【0017】
いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、６１２．１９±０．５の質量／
電荷の比を有する前駆イオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐｏ
Ｅ３／ＡｐｏＥ４は、４７５．０５±０．５の質量／電荷の比を有する前駆イオンの存在
により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、５０３．５６
±０．５の質量／電荷の比を有する前駆イオンの存在により決定される。いくつかの実施
形態では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、８６６．９９±０．５及び９８２．０８±０．５
からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定
される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、８６６．９９±０．５及
び９８２．０８±０．５の質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定
される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、３７４．４２±０．５及
び５０２．５５±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフラグメント
イオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、
３７４．４２±０．５及び５０２．５５±０．５の質量／電荷の比を有するフラグメント
イオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、
６４９．７４±０．５及び８９２．９６±０．５からなる群から選択される質量／電荷の
比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐ
ｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、６４９．７４±０．５及び８９２．９６±０．５の質量／電荷の
比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐ
ｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、３７４．４２±０．５、５０２．５５±０．５、６４９．７４±
０．５、８６６．９９±０．５、８９２．９６±０．５、及び９８２．０８±０．５から
なる群から選択される質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定され
る。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、３７４．４２±０．５、５０
２．５５±０．５、６４９．７４±０．５、８６６．９９±０．５、８９２．９６±０．
５、及び９８２．０８±０．５の質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在によ
り決定される。
電荷の比を有する前駆イオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐｏ
Ｅ３／ＡｐｏＥ４は、４７５．０５±０．５の質量／電荷の比を有する前駆イオンの存在
により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、５０３．５６
±０．５の質量／電荷の比を有する前駆イオンの存在により決定される。いくつかの実施
形態では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、８６６．９９±０．５及び９８２．０８±０．５
からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定
される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、８６６．９９±０．５及
び９８２．０８±０．５の質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定
される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、３７４．４２±０．５及
び５０２．５５±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフラグメント
イオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、
３７４．４２±０．５及び５０２．５５±０．５の質量／電荷の比を有するフラグメント
イオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、
６４９．７４±０．５及び８９２．９６±０．５からなる群から選択される質量／電荷の
比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐ
ｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、６４９．７４±０．５及び８９２．９６±０．５の質量／電荷の
比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐ
ｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、３７４．４２±０．５、５０２．５５±０．５、６４９．７４±
０．５、８６６．９９±０．５、８９２．９６±０．５、及び９８２．０８±０．５から
なる群から選択される質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定され
る。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、３７４．４２±０．５、５０
２．５５±０．５、６４９．７４±０．５、８６６．９９±０．５、８９２．９６±０．
５、及び９８２．０８±０．５の質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在によ
り決定される。
【0018】
いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、４７５．０５±０．５の質量／
電荷の比を有する前駆イオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐｏ
Ｅ３／ＡｐｏＥ４は、５０３．５６±０．５の質量／電荷の比を有する前駆イオンの存在
により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、３７４．４２
±０．５及び５０２．５５±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフ
ラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／Ａｐ
ｏＥ４は、３７４．４２±０．５及び５０２．５５±０．５の質量／電荷の比を有するフ
ラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／Ａｐ
ｏＥ４は、６４９．７４±０．５及び８９２．９６±０．５からなる群から選択される質
量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態
では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、６４９．７４±０．５及び８９２．９６±０．５の質
量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態
では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、３７４．４２±０．５、５０２．５５±０．５、６４
９．７４±０．５、及び８９２．９６±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比
を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐｏ
Ｅ３／ＡｐｏＥ４は、３７４．４２±０．５、５０２．５５±０．５、６４９．７４±０
．５、及び８９２．９６±０．５の質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在に
より決定される。
電荷の比を有する前駆イオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐｏ
Ｅ３／ＡｐｏＥ４は、５０３．５６±０．５の質量／電荷の比を有する前駆イオンの存在
により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、３７４．４２
±０．５及び５０２．５５±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフ
ラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／Ａｐ
ｏＥ４は、３７４．４２±０．５及び５０２．５５±０．５の質量／電荷の比を有するフ
ラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ３／Ａｐ
ｏＥ４は、６４９．７４±０．５及び８９２．９６±０．５からなる群から選択される質
量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態
では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、６４９．７４±０．５及び８９２．９６±０．５の質
量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態
では、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４は、３７４．４２±０．５、５０２．５５±０．５、６４
９．７４±０．５、及び８９２．９６±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比
を有するフラグメントイオンの存在により決定される。いくつかの実施形態では、Ａｐｏ
Ｅ３／ＡｐｏＥ４は、３７４．４２±０．５、５０２．５５±０．５、６４９．７４±０
．５、及び８９２．９６±０．５の質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在に
より決定される。
【0019】
いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ４対立遺伝子の存在は、アルツハイマー病発症リス
クの増加を示唆する。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ４／ＡｐｏＥ４対立遺伝子の存
在は、アルツハイマー病発症リスクの増加を示唆する。
クの増加を示唆する。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ４／ＡｐｏＥ４対立遺伝子の存
在は、アルツハイマー病発症リスクの増加を示唆する。
【0020】
いくつかの実施形態では、総ＡｐｏＥの定量は、４８５．０６±０．５の質量／電荷の
比を有する前駆イオンを測定することを含む。いくつかの実施形態では、総ＡｐｏＥの定
量は、４８９．５１±０．５及び５８８．６４±０．５から選択される質量／電荷の比を
有するフラグメントイオンを測定することを含む。
比を有する前駆イオンを測定することを含む。いくつかの実施形態では、総ＡｐｏＥの定
量は、４８９．５１±０．５及び５８８．６４±０．５から選択される質量／電荷の比を
有するフラグメントイオンを測定することを含む。
【0021】
特定の実施形態では、方法の定量限界は、１０ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。い
くつかの実施形態では、方法の定量限界は、５ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いく
つかの実施形態では、方法の定量限界は、４ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつ
かの実施形態では、方法の定量限界は、３ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつか
の実施形態では、方法の定量限界は、２ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの
実施形態では、方法の定量限界は、１ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの実
施形態では、方法の定量限界は、０．５ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの
実施形態では、方法の定量限界は、０．２ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつか
の実施形態では、方法の定量限界は、０．１ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。
くつかの実施形態では、方法の定量限界は、５ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いく
つかの実施形態では、方法の定量限界は、４ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつ
かの実施形態では、方法の定量限界は、３ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつか
の実施形態では、方法の定量限界は、２ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの
実施形態では、方法の定量限界は、１ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの実
施形態では、方法の定量限界は、０．５ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの
実施形態では、方法の定量限界は、０．２ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつか
の実施形態では、方法の定量限界は、０．１ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。
【0022】
いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、５ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。
いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、１ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。い
くつかの実施形態では、方法の検出限界は、０．５ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。
いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、０．１ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい
。いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、０．０５ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等
しい。いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、０．０１ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれ
に等しい。
いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、１ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。い
くつかの実施形態では、方法の検出限界は、０．５ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。
いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、０．１ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい
。いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、０．０５ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等
しい。いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、０．０１ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれ
に等しい。
【0023】
いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥは、マススペクトロメトリーの前に誘導体化されな
い。
い。
【0024】
いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥは、マススペクトロメトリーの前に誘導体化される
。
。
【0025】
特定の実施形態では、サンプルは、体液である。いくつかの実施形態では、サンプルは
、脳脊髄液（ＣＳＦ）である。いくつかの実施形態では、サンプルは、血漿又は血清であ
る。いくつかの実施形態では、サンプルは、全血である。いくつかの実施形態では、サン
プルは、唾液又は尿である。
、脳脊髄液（ＣＳＦ）である。いくつかの実施形態では、サンプルは、血漿又は血清であ
る。いくつかの実施形態では、サンプルは、全血である。いくつかの実施形態では、サン
プルは、唾液又は尿である。
【0026】
いくつかの実施形態では、方法は、サンプルをタンパク質除去するのに十分な量で、薬
剤をサンプルに添加することを含み得る。
剤をサンプルに添加することを含み得る。
【0027】
本明細書で用いる場合、別途記載がなければ、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ
」は、複数形の意味を含む。従って、例えば、「１つのタンパク質」と言う場合、複数の
タンパク質分子も含まれる。
」は、複数形の意味を含む。従って、例えば、「１つのタンパク質」と言う場合、複数の
タンパク質分子も含まれる。
【0028】
本明細書で用いる場合、用語「精製」又は「精製すること」とは、サンプルから目的と
する分析物以外のすべての物質を除去することを意味しない。むしろ、精製とは、目的と
する分析物の検出を妨害する可能性がある、サンプル中のその他の成分と比較して、目的
とする１つ又は複数の分析物の量を富化させる手順を意味する。サンプルは、本明細書で
は、１つ又は複数の妨害物質、例えば、マススペクトロメトリーによる、選択されたＡｐ
ｏＥの親及び娘イオンの検出を妨害する１つ又は複数の物質の除去を可能にする様々な手
段により精製される。
する分析物以外のすべての物質を除去することを意味しない。むしろ、精製とは、目的と
する分析物の検出を妨害する可能性がある、サンプル中のその他の成分と比較して、目的
とする１つ又は複数の分析物の量を富化させる手順を意味する。サンプルは、本明細書で
は、１つ又は複数の妨害物質、例えば、マススペクトロメトリーによる、選択されたＡｐ
ｏＥの親及び娘イオンの検出を妨害する１つ又は複数の物質の除去を可能にする様々な手
段により精製される。
【0029】
本明細書で用いる場合、用語「試験サンプル」とは、ＡｐｏＥを含み得る任意のサンプ
ルを意味する。本明細書で用いる場合、用語「体液」とは、個人の身体から単離可能な任
意の液を意味する。例えば、「体液」として、血液、血漿、血清、胆汁、唾液、尿、涙、
汗等を挙げることができる。
ルを意味する。本明細書で用いる場合、用語「体液」とは、個人の身体から単離可能な任
意の液を意味する。例えば、「体液」として、血液、血漿、血清、胆汁、唾液、尿、涙、
汗等を挙げることができる。
【0030】
本明細書で用いる場合、用語「誘導体化すること」とは、２つの分子を反応させて新規
分子を形成することを意味する。誘導体化薬は、イソチオシアネート基、ジニトロフルオ
ロフェニル基、ニトロフェノキシカルボニル基、及び／又はフタルアルデヒド基等を含み
得る。
分子を形成することを意味する。誘導体化薬は、イソチオシアネート基、ジニトロフルオ
ロフェニル基、ニトロフェノキシカルボニル基、及び／又はフタルアルデヒド基等を含み
得る。
【0031】
本明細書で用いる場合、用語「クロマトグラフィー」とは、液体又は気体により搬送さ
れる化学的混合物が、静止した液相又は固相の周辺又は上方を流通する際に、化学的実体
の差動的分配の結果として成分に分離するプロセスを意味する。
れる化学的混合物が、静止した液相又は固相の周辺又は上方を流通する際に、化学的実体
の差動的分配の結果として成分に分離するプロセスを意味する。
【0032】
本明細書で用いる場合、用語「液体クロマトグラフィー」又は「ＬＣ」とは、微細な物
質からなるカラムを通じて、又はキャピラリー通路を通じて流体が均一に浸透する際に、
流体の溶液の１つ又は複数の成分が選択的に遅延するプロセスを意味する。遅延は、１つ
又は複数の固定相とバルク液（すなわち、移動相）の間で、この流体が固定相に対して相
対的に移動する際に生ずる、混合物中の成分の分配に起因する。「液体クロマトグラフィ
ー」の例として、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）、高性能液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）、及び高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）が挙げられる。
質からなるカラムを通じて、又はキャピラリー通路を通じて流体が均一に浸透する際に、
流体の溶液の１つ又は複数の成分が選択的に遅延するプロセスを意味する。遅延は、１つ
又は複数の固定相とバルク液（すなわち、移動相）の間で、この流体が固定相に対して相
対的に移動する際に生ずる、混合物中の成分の分配に起因する。「液体クロマトグラフィ
ー」の例として、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）、高性能液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）、及び高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）が挙げられる。
【0033】
本明細書で用いる場合、用語「高性能液体クロマトグラフィー」又は「ＨＰＬＣ」とは
、固定相、一般的には稠密充填カラムを通じて、加圧条件下で移動相に力を加えることに
より、分離度が増加する液体クロマトグラフィーを意味する。
、固定相、一般的には稠密充填カラムを通じて、加圧条件下で移動相に力を加えることに
より、分離度が増加する液体クロマトグラフィーを意味する。
【0034】
本明細書で用いる場合、用語「高乱流液体クロマトグラフィー」又は「ＨＴＬＣ」とは
、分離を実施する基本原理として、カラム充填材を通じてアッセイされる物質の乱流を活
用するクロマトグラフィーの一形態を意味する。ＨＴＬＣは、マススペクトロメトリーに
よる分析前に、２つの無名の薬物を含有するサンプルを調製するのに適用されてきた。例
えば、Ｚｉｍｍｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ８５４巻：２３～３５頁（１９９
９年）を参照；ＨＴＬＣについて更に説明する米国特許第５，９６８，３６７号、同第５
，９１９，３６８号、同第５，７９５，４６９号、及び同第５，７７２，８７４号も参照
。当業者は「乱流」について理解している。流体がゆっくりとスムーズに流れる場合、こ
の流れは「層流」と呼ばれる。例えば、ＨＰＬＣカラムを通じて、低い流速で移動する流
体は、層流である。層流内では、流体中の粒子の動きは規律正しく、粒子は直線的に移動
するのが一般的である。より高速では、水の慣性力が流体の摩擦力を上回り、その結果乱
流が生ずる。不規則な境界と接触しない流体は、摩擦により低速化した、又は不均等な表
面により向きが変わった流体を「追い越す」。流体が乱れた状態で流れるとき、ぐるぐる
渦巻いて（又は渦状に）流れ、流れが層状の場合よりもより「抵抗性」となる。どの場合
に流体の流れが層流又は乱流であるか判断するのに役立つ多くの参考資料が入手可能であ
る（例えば、Ｔｕｒｂｕｌｅｎｔ Ｆｌｏｗ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎ
ｔ ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ、Ｐ．Ｓ．Ｂｅｒｎａｒｄ＆Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｌａｃｅ
、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、（２０００年）；Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｔｕｒｂｕｌｅｎｔ Ｆｌｏｗ Ｆｌｏｗ、Ｊｅａｎ Ｍａｔｈｉｅ
ｕ＆Ｊｕｌｉａｎ Ｓｃｏｔｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓ
ｓ（２００１年））。
、分離を実施する基本原理として、カラム充填材を通じてアッセイされる物質の乱流を活
用するクロマトグラフィーの一形態を意味する。ＨＴＬＣは、マススペクトロメトリーに
よる分析前に、２つの無名の薬物を含有するサンプルを調製するのに適用されてきた。例
えば、Ｚｉｍｍｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ８５４巻：２３～３５頁（１９９
９年）を参照；ＨＴＬＣについて更に説明する米国特許第５，９６８，３６７号、同第５
，９１９，３６８号、同第５，７９５，４６９号、及び同第５，７７２，８７４号も参照
。当業者は「乱流」について理解している。流体がゆっくりとスムーズに流れる場合、こ
の流れは「層流」と呼ばれる。例えば、ＨＰＬＣカラムを通じて、低い流速で移動する流
体は、層流である。層流内では、流体中の粒子の動きは規律正しく、粒子は直線的に移動
するのが一般的である。より高速では、水の慣性力が流体の摩擦力を上回り、その結果乱
流が生ずる。不規則な境界と接触しない流体は、摩擦により低速化した、又は不均等な表
面により向きが変わった流体を「追い越す」。流体が乱れた状態で流れるとき、ぐるぐる
渦巻いて（又は渦状に）流れ、流れが層状の場合よりもより「抵抗性」となる。どの場合
に流体の流れが層流又は乱流であるか判断するのに役立つ多くの参考資料が入手可能であ
る（例えば、Ｔｕｒｂｕｌｅｎｔ Ｆｌｏｗ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎ
ｔ ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ、Ｐ．Ｓ．Ｂｅｒｎａｒｄ＆Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｌａｃｅ
、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、（２０００年）；Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｔｕｒｂｕｌｅｎｔ Ｆｌｏｗ Ｆｌｏｗ、Ｊｅａｎ Ｍａｔｈｉｅ
ｕ＆Ｊｕｌｉａｎ Ｓｃｏｔｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓ
ｓ（２００１年））。
【0035】
本明細書で用いる場合、用語「ガスクロマトグラフィー」又は「ＧＣ」とは、サンプル
混合物が気化され、そして液体又は微粒子固体から構成される固定相を含有するカラムを
通じて移動するキャリヤガス（窒素又はヘリウム）の流れの中に注入され、そして化合物
の固定相に対する親和性に基づき、その構成化合物に分離されるクロマトグラフィーを意
味する。
混合物が気化され、そして液体又は微粒子固体から構成される固定相を含有するカラムを
通じて移動するキャリヤガス（窒素又はヘリウム）の流れの中に注入され、そして化合物
の固定相に対する親和性に基づき、その構成化合物に分離されるクロマトグラフィーを意
味する。
【0036】
本明細書で用いる場合、用語「大型の粒子カラム」又は「抽出カラム」とは、約３５μ
ｍを上回る平均粒子径を含有するクロマトグラフィーカラムを意味する。この文脈で使用
される場合、用語「約」とは±１０％を意味する。好ましい実施形態では、カラムは、直
径約６０μｍの粒子を含有する。
ｍを上回る平均粒子径を含有するクロマトグラフィーカラムを意味する。この文脈で使用
される場合、用語「約」とは±１０％を意味する。好ましい実施形態では、カラムは、直
径約６０μｍの粒子を含有する。
【0037】
本明細書で用いる場合、用語「分析カラム」は、カラムから溶出するサンプル中の物質
について、分析物の存否又は量の決定を可能にするのに十分な分離を有効にする、十分な
クロマトグラフプレートを有するクロマトグラフィーカラムを意味する。そのようなカラ
ムは、更なる分析用として精製されたサンプルを取得するために、保持された物質を保持
されない物質から分離又は抽出するという一般的な目的を有する「抽出カラム」から多く
の場合区別される。この文脈で使用される場合、用語「約」とは、±１０％を意味する。
好ましい実施形態では、分析カラムは、直径約４μｍの粒子を含有する。
について、分析物の存否又は量の決定を可能にするのに十分な分離を有効にする、十分な
クロマトグラフプレートを有するクロマトグラフィーカラムを意味する。そのようなカラ
ムは、更なる分析用として精製されたサンプルを取得するために、保持された物質を保持
されない物質から分離又は抽出するという一般的な目的を有する「抽出カラム」から多く
の場合区別される。この文脈で使用される場合、用語「約」とは、±１０％を意味する。
好ましい実施形態では、分析カラムは、直径約４μｍの粒子を含有する。
【0038】
本明細書で用いる場合、例えば「オンライン自動化方式」又は「オンライン抽出」とし
て使用されるような用語「オンライン」又は「インライン」とは、オペレーターの介入を
必要とせずに実施される手順を意味する。対照的に、用語「オフライン」とは、本明細書
で使用する場合、オペレーターの手動介入を必要とする手順を意味する。従って、サンプ
ルが沈殿処理され、そして次に上清が手作業によりオートサンプラーに負荷される場合、
沈殿及び負荷ステップは後続ステップからオフラインの状態にある。本方法の様々な実施
形態では、１つ又は複数のステップが、オンライン自動化方式で実施され得る。
て使用されるような用語「オンライン」又は「インライン」とは、オペレーターの介入を
必要とせずに実施される手順を意味する。対照的に、用語「オフライン」とは、本明細書
で使用する場合、オペレーターの手動介入を必要とする手順を意味する。従って、サンプ
ルが沈殿処理され、そして次に上清が手作業によりオートサンプラーに負荷される場合、
沈殿及び負荷ステップは後続ステップからオフラインの状態にある。本方法の様々な実施
形態では、１つ又は複数のステップが、オンライン自動化方式で実施され得る。
【0039】
本明細書で用いる場合、用語「マススペクトロメトリー」又は「ＭＳ」とは、化合物を
その質量別に識別する分析技法を意味する。ＭＳは、イオンを、その質量対電荷の比、又
は「ｍ／ｚ」に基づきフィルター処理、検出、及び測定する方法を意味する。ＭＳ技術は
、（１）化合物をイオン化して、荷電した化合物を形成すること；及び（２）荷電した化
合物の分子量を検出し、そして質量対電荷の比を計算すること一般的に含む。化合物は、
任意の適する手段によりイオン化及び検出され得る。「質量分析装置」は、イオン化装置
及びイオン検出器を一般的に含む。一般的に、１つ又は複数の目的とする分子がイオン化
され、イオンがその後マススペクトログラフィック装置に導入され、そこでは磁場と電場
の組合せにより、イオンは、質量（「ｍ」）及び電荷（「ｚ」）に依存する空間内の経路
をたどる。例えば、「Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｆｒｏｍ Ｓｕｒｆａｃｅ
ｓ」と題する米国特許第６，２０４，５００号、「Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐａｒ
ａｔｕｓ ｆｏｒ Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」と題する同第
６，１０７，６２３号、「ＤＮＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｂａｓｅｄ Ｏｎ Ｍａｓ
ｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」と題する同第６，２６８，１４４号、「Ｓｕｒｆａｃｅ
－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ａｎｄ Ｒｅｌ
ｅａｓｅ Ｆｏｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎａ
ｌｙｔｅｓ」と題する同第６，１２４，１３７号、Ｗｒｉｇｈｔら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ
Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、第２巻：２６４～７６
頁（１９９９年）；並びにＭｅｒｃｈａｎｔ及びＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、Ｅｌｅｃｔｒｏ
ｐｈｏｒｅｓｉｓ、第２１巻：１１６４～６７頁（２０００年）を参照。
その質量別に識別する分析技法を意味する。ＭＳは、イオンを、その質量対電荷の比、又
は「ｍ／ｚ」に基づきフィルター処理、検出、及び測定する方法を意味する。ＭＳ技術は
、（１）化合物をイオン化して、荷電した化合物を形成すること；及び（２）荷電した化
合物の分子量を検出し、そして質量対電荷の比を計算すること一般的に含む。化合物は、
任意の適する手段によりイオン化及び検出され得る。「質量分析装置」は、イオン化装置
及びイオン検出器を一般的に含む。一般的に、１つ又は複数の目的とする分子がイオン化
され、イオンがその後マススペクトログラフィック装置に導入され、そこでは磁場と電場
の組合せにより、イオンは、質量（「ｍ」）及び電荷（「ｚ」）に依存する空間内の経路
をたどる。例えば、「Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｆｒｏｍ Ｓｕｒｆａｃｅ
ｓ」と題する米国特許第６，２０４，５００号、「Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐａｒ
ａｔｕｓ ｆｏｒ Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」と題する同第
６，１０７，６２３号、「ＤＮＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｂａｓｅｄ Ｏｎ Ｍａｓ
ｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」と題する同第６，２６８，１４４号、「Ｓｕｒｆａｃｅ
－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ａｎｄ Ｒｅｌ
ｅａｓｅ Ｆｏｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎａ
ｌｙｔｅｓ」と題する同第６，１２４，１３７号、Ｗｒｉｇｈｔら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ
Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、第２巻：２６４～７６
頁（１９９９年）；並びにＭｅｒｃｈａｎｔ及びＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、Ｅｌｅｃｔｒｏ
ｐｈｏｒｅｓｉｓ、第２１巻：１１６４～６７頁（２０００年）を参照。
【0040】
本明細書で用いる場合、用語「陰イオンモードでの操作」とは、陰イオンが生成及び検
出されるマススペクトロメトリー法を意味する。用語「陽イオンモードでの操作」とは、
本明細書で用いる場合、陽イオンが生成及び検出されるマススペクトロメトリー法を意味
する。
出されるマススペクトロメトリー法を意味する。用語「陽イオンモードでの操作」とは、
本明細書で用いる場合、陽イオンが生成及び検出されるマススペクトロメトリー法を意味
する。
【0041】
本明細書で用いる場合、用語「イオン化」又は「イオン化すること」とは、１又は複数
のエレクトロンユニットに等しい正味の電荷を有する分析物イオンを生成するプロセスを
意味する。陰イオンは、１又は複数のエレクトロンユニットの正味負電荷を有するイオン
である一方、陽イオンは、１又は複数のエレクトロンユニットの正味正電荷を有するイオ
ンである。
のエレクトロンユニットに等しい正味の電荷を有する分析物イオンを生成するプロセスを
意味する。陰イオンは、１又は複数のエレクトロンユニットの正味負電荷を有するイオン
である一方、陽イオンは、１又は複数のエレクトロンユニットの正味正電荷を有するイオ
ンである。
【0042】
本明細書で用いる場合、用語「電子イオン化法」又は「ＥＩ法」とは、気相〔gaseous
phase〕又は気相〔vapor phase〕の目的とする分析物が電子の流れと相互作用する方法を
意味する。分析物への電子の衝撃は分析物イオンを産生し、次にマススペクトロメトリー
技術の対象となり得る。
phase〕又は気相〔vapor phase〕の目的とする分析物が電子の流れと相互作用する方法を
意味する。分析物への電子の衝撃は分析物イオンを産生し、次にマススペクトロメトリー
技術の対象となり得る。
【0043】
本明細書で用いる場合、用語「化学イオン化法」又は「ＣＩ法」とは、試薬気体（例え
ば、アンモニア）が電子の衝撃を受け、そして試薬気体イオンと分析物分子との相互作用
により、分析物イオンが形成される方法を意味する。
ば、アンモニア）が電子の衝撃を受け、そして試薬気体イオンと分析物分子との相互作用
により、分析物イオンが形成される方法を意味する。
【0044】
本明細書で用いる場合、用語「高速原子衝撃法」又は「ＦＡＢ法」とは、高エネルギー
原子（多くの場合Ｘｅ又はＡｒ）のビームが、不揮発性サンプルに衝撃を与え、サンプル
に含まれる分子を脱離及びイオン化させる方法を意味する。試験サンプルは、粘稠性の液
体マトリックス、例えばグリセロール、チオグリセロール、ｍ－ニトロベンジルアルコー
ル、１８－クラウン－６－クラウンエーテル、２－ニトロフェニルオクチルエーテル、ス
ルホラン、ジエタノールアミン、及びトリエタノールアミン等に溶解する。化合物又はサ
ンプルに適するマトリックスの選択は、実験に基づいたプロセスである。
原子（多くの場合Ｘｅ又はＡｒ）のビームが、不揮発性サンプルに衝撃を与え、サンプル
に含まれる分子を脱離及びイオン化させる方法を意味する。試験サンプルは、粘稠性の液
体マトリックス、例えばグリセロール、チオグリセロール、ｍ－ニトロベンジルアルコー
ル、１８－クラウン－６－クラウンエーテル、２－ニトロフェニルオクチルエーテル、ス
ルホラン、ジエタノールアミン、及びトリエタノールアミン等に溶解する。化合物又はサ
ンプルに適するマトリックスの選択は、実験に基づいたプロセスである。
【0045】
本明細書で用いる場合、用語「マトリックス支援レーザー脱離イオン化法」又は「ＭＡ
ＬＤＩ」とは、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化、及びクラスター崩壊を含む様々
なイオン化経路によって、不揮発性サンプルが、サンプル中の分析物を脱離及びイオン化
させるレーザー照射に曝露される方法を意味する。ＭＡＬＤＩの場合、サンプルは、分析
物分子の脱離を促進するエネルギー吸収性マトリックスと混合される。
ＬＤＩ」とは、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化、及びクラスター崩壊を含む様々
なイオン化経路によって、不揮発性サンプルが、サンプル中の分析物を脱離及びイオン化
させるレーザー照射に曝露される方法を意味する。ＭＡＬＤＩの場合、サンプルは、分析
物分子の脱離を促進するエネルギー吸収性マトリックスと混合される。
【0046】
本明細書で用いる場合、用語「表面増強レーザー脱離イオン化法」又は「ＳＥＬＤＩ法
」とは、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化、及びクラスター崩壊を含む様々なイオ
ン化経路によって、非揮発性サンプルが、サンプル中の分析物を脱離及びイオン化させる
レーザー照射に曝露される別の方法を意味する。ＳＥＬＤＩでは、サンプルは、１つ又は
複数の目的とする分析物を優先的に保持する表面に一般的に結合する。ＭＡＬＤＩと同様
に、このプロセスも、イオン化を促進するために、エネルギー吸収性材料を利用し得る。
」とは、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化、及びクラスター崩壊を含む様々なイオ
ン化経路によって、非揮発性サンプルが、サンプル中の分析物を脱離及びイオン化させる
レーザー照射に曝露される別の方法を意味する。ＳＥＬＤＩでは、サンプルは、１つ又は
複数の目的とする分析物を優先的に保持する表面に一般的に結合する。ＭＡＬＤＩと同様
に、このプロセスも、イオン化を促進するために、エネルギー吸収性材料を利用し得る。
【0047】
本明細書で用いる場合、用語「エレクトロスプレーイオン化法」又は「ＥＳＩ法」は、
溶液が短尺のキャピラリー管に沿って通過し、そのキャピラリー管の端部に正又は負の高
電位が印加される方法を意味する。溶液が管の端部に到達すると気化（噴霧化）されて、
溶媒蒸気内で溶液の非常に小さい液滴からなるジェット又はスプレーとなる。この液滴の
ミストは、凝結を防止し、溶媒を蒸発させるためにわずかに加熱された蒸発チャンバーを
流通する。液滴がより小型になるに従い、表面電荷密度は増加し、やがて同一荷電間で自
然反発して、イオン並びに中性分子の放出が引き起こされる。
溶液が短尺のキャピラリー管に沿って通過し、そのキャピラリー管の端部に正又は負の高
電位が印加される方法を意味する。溶液が管の端部に到達すると気化（噴霧化）されて、
溶媒蒸気内で溶液の非常に小さい液滴からなるジェット又はスプレーとなる。この液滴の
ミストは、凝結を防止し、溶媒を蒸発させるためにわずかに加熱された蒸発チャンバーを
流通する。液滴がより小型になるに従い、表面電荷密度は増加し、やがて同一荷電間で自
然反発して、イオン並びに中性分子の放出が引き起こされる。
【0048】
本明細書で用いる場合、用語「大気圧化学イオン化法」又は「ＡＰＣＩ法」とは、ＥＳ
Ｉと類似する質量分析法を意味するが、しかしＡＰＣＩは、大気圧でプラズマ内に生ずる
イオン－分子反応によりイオンを産生する。プラズマは、スプレーキャピラリーと対電極
の間の放電により維持される。次にイオンは、差次的にポンプ搬送される一連のスキマー
ステージの使用により質量分析器中に一般的に抽出される。乾燥及び事前加熱されたＮ２
ガスの向流を使用して、溶媒の除去を改善することができる。極性がより低い種を分析す
る場合、ＡＰＣＩにおける気相イオン化の方がＥＳＩよりも有効であり得る。
Ｉと類似する質量分析法を意味するが、しかしＡＰＣＩは、大気圧でプラズマ内に生ずる
イオン－分子反応によりイオンを産生する。プラズマは、スプレーキャピラリーと対電極
の間の放電により維持される。次にイオンは、差次的にポンプ搬送される一連のスキマー
ステージの使用により質量分析器中に一般的に抽出される。乾燥及び事前加熱されたＮ２
ガスの向流を使用して、溶媒の除去を改善することができる。極性がより低い種を分析す
る場合、ＡＰＣＩにおける気相イオン化の方がＥＳＩよりも有効であり得る。
【0049】
用語「大気圧光イオン化法」又は「ＡＰＰＩ法」とは、本明細書で使用する場合、分子
Ｍを光イオン化する機構が、分子イオンＭ＋を形成する光子吸収及び電子放出である質量
分析法の形態を意味する。光子エネルギーは、一般的にイオン化電位のすぐ上にあるので
、分子イオンは、それほど解離しやすくない。多くの場合、クロマトグラフィーを必要と
せずにサンプルを分析することができると考えられ、従ってかなりの時間及び出費が抑え
られる。水蒸気又はプロトン性溶媒の存在下で、分子イオンは、Ｈを取り出してＭＨ＋を
形成することができる。これは、Ｍが高プロトン親和性を有する場合に生ずる傾向がある
。Ｍ＋とＭＨ＋の合計は一定なので、これは定量の正確性に影響を及ぼさない。プロトン
性溶媒中の薬物化合物は、通常ＭＨ＋として観察される一方、非極性化合物、例えばナフ
タレン又はテストステロン等は、通常Ｍ＋の形態を採る。Ｒｏｂｂ、Ｄ．Ｂ．、Ｃｏｖｅ
ｙ、Ｔ．Ｒ．及びＢｒｕｉｎｓ、Ａ．Ｐ．（２０００年）：例えば、Ｒｏｂｂら、Ａｔｍ
ｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｐｈｏｔｏｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：Ａｎ ｉｏｎ
ｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
－ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．第７２巻（１５号）：３
６５３～３６５９頁を参照。
Ｍを光イオン化する機構が、分子イオンＭ＋を形成する光子吸収及び電子放出である質量
分析法の形態を意味する。光子エネルギーは、一般的にイオン化電位のすぐ上にあるので
、分子イオンは、それほど解離しやすくない。多くの場合、クロマトグラフィーを必要と
せずにサンプルを分析することができると考えられ、従ってかなりの時間及び出費が抑え
られる。水蒸気又はプロトン性溶媒の存在下で、分子イオンは、Ｈを取り出してＭＨ＋を
形成することができる。これは、Ｍが高プロトン親和性を有する場合に生ずる傾向がある
。Ｍ＋とＭＨ＋の合計は一定なので、これは定量の正確性に影響を及ぼさない。プロトン
性溶媒中の薬物化合物は、通常ＭＨ＋として観察される一方、非極性化合物、例えばナフ
タレン又はテストステロン等は、通常Ｍ＋の形態を採る。Ｒｏｂｂ、Ｄ．Ｂ．、Ｃｏｖｅ
ｙ、Ｔ．Ｒ．及びＢｒｕｉｎｓ、Ａ．Ｐ．（２０００年）：例えば、Ｒｏｂｂら、Ａｔｍ
ｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｐｈｏｔｏｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：Ａｎ ｉｏｎ
ｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
－ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．第７２巻（１５号）：３
６５３～３６５９頁を参照。
【0050】
本明細書で用いる場合、用語「誘導結合プラズマ法」又は「ＩＣＰ法」とは、ほとんど
の元素が微粒化及びイオン化されるような十分に高温度において、サンプルが部分的にイ
オン化した気体と相互作用する方法を意味する。
の元素が微粒化及びイオン化されるような十分に高温度において、サンプルが部分的にイ
オン化した気体と相互作用する方法を意味する。
【0051】
本明細書で用いる場合、用語「電界脱離法」とは、非揮発性の試験サンプルがイオン化
表面上に配置され、そして分析物イオンを生成するのに強電界が使用される方法を意味す
る。
表面上に配置され、そして分析物イオンを生成するのに強電界が使用される方法を意味す
る。
【0052】
本明細書で用いる場合、用語「脱離」とは、表面から分析物を取り出すこと、及び／又
は分析物を気相に導入することを意味する。
は分析物を気相に導入することを意味する。
【0053】
本明細書で用いる場合、用語「定量化限界〔limit of quantification〕」、「定量限
界〔limit of quantitation〕」、又は「ＬＯＱ」とは、測定が定量的に意味を有するよ
うになるポイントを意味する。このＬＯＱにおける分析物の応答は、識別可能であり、個
別的であり、並びに２０％の精密度及び８０％～１２０％の正確度で再現性を有する。
界〔limit of quantitation〕」、又は「ＬＯＱ」とは、測定が定量的に意味を有するよ
うになるポイントを意味する。このＬＯＱにおける分析物の応答は、識別可能であり、個
別的であり、並びに２０％の精密度及び８０％～１２０％の正確度で再現性を有する。
【0054】
本明細書で用いる場合、用語「検出限界」又は「ＬＯＤ」は、測定値が、それと関連し
た不確実性より大きくなるポイントである。ＬＯＤは、ゼロ濃度から２標準偏差（ＳＤ）
として任意に定義される。
た不確実性より大きくなるポイントである。ＬＯＤは、ゼロ濃度から２標準偏差（ＳＤ）
として任意に定義される。
【0055】
本明細書で用いる場合、体液サンプル中のＡｐｏＥの「量」とは、体液の容積中で検出
可能なＡｐｏＥの質量を反映する絶対値を一般的に意味する。但し、量は、別のＡｐｏＥ
の量と比較した相対的な量についても考慮する。例えば、体液中のＡｐｏＥの量は、通常
存在するＡｐｏＥの対照レベル又は正常レベルを上回る又はそれ未満である量であり得る
。
可能なＡｐｏＥの質量を反映する絶対値を一般的に意味する。但し、量は、別のＡｐｏＥ
の量と比較した相対的な量についても考慮する。例えば、体液中のＡｐｏＥの量は、通常
存在するＡｐｏＥの対照レベル又は正常レベルを上回る又はそれ未満である量であり得る
。
【0056】
用語「約」とは、イオン質量測定を除き定量測定と関連して本明細書で使用する場合、
表示の数値±１０％を意味する。マススペクトロメトリー装置は、所与の分析物の質量を
決定する際に、ほとんど変化し得ない。用語「約」とは、イオンの質量又はイオンの質量
／電荷の比の文脈において、±０．５原子質量単位を意味する。
表示の数値±１０％を意味する。マススペクトロメトリー装置は、所与の分析物の質量を
決定する際に、ほとんど変化し得ない。用語「約」とは、イオンの質量又はイオンの質量
／電荷の比の文脈において、±０．５原子質量単位を意味する。
【0057】
上記した本発明の概要は、非限定的であり、また本発明のその他の特性及び長所は、下
記の発明を実施するための形態から、及び特許請求の範囲から明白である。
記の発明を実施するための形態から、及び特許請求の範囲から明白である。
【図面の簡単な説明】
【0058】
【図1-1】約０．２％の頻度を有するＡｐｏＥ２／Ｅ２表現型のクロマトグラムの例を示す図である。
【図1-2】約０．２％の頻度を有するＡｐｏＥ２／Ｅ２表現型のクロマトグラムの例を示す図である。
【図2-1】約９．４％の頻度を有するＡｐｏＥ２／Ｅ３表現型のクロマトグラムの例を示す図である。
【図2-2】約９．４％の頻度を有するＡｐｏＥ２／Ｅ３表現型のクロマトグラムの例を示す図である。
【図3-1】約２．２％の頻度を有するＡｐｏＥ２／Ｅ４表現型のクロマトグラムの例を示す図である。
【図3-2】約２．２％の頻度を有するＡｐｏＥ２／Ｅ４表現型のクロマトグラムの例を示す図である。
【図4-1】約６６％の頻度を有するＡｐｏＥ３／Ｅ３表現型のクロマトグラムの例を示す図である。
【図4-2】約６６％の頻度を有するＡｐｏＥ３／Ｅ３表現型のクロマトグラムの例を示す図である。
【図5-1】約２０％の頻度を有するＡｐｏＥ３／Ｅ４表現型のクロマトグラムの例を示す図である。
【図5-2】約２０％の頻度を有するＡｐｏＥ３／Ｅ４表現型のクロマトグラムの例を示す図である。
【図6-1】約２．５％の頻度を有するＡｐｏＥ４／Ｅ４表現型のクロマトグラムの例を示す図である。
【図6-2】約２．５％の頻度を有するＡｐｏＥ４／Ｅ４表現型のクロマトグラムの例を示す図である。
【図7】ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより決定された、３１９例の個別血清サンプルに基づくＡｐｏＥ対立遺伝子の頻度を示す図である。
【図8】リスクアセスメントモデルに対する各アルツハイマー病バイオマーカーの寄与を示す図である。ＭＣＩ又はアルツハイマー病について線形予測子（スコア）を計算するための式：スコア＝２．８３３６－９．９０２６×比＋０．７３５８×ＡｐｏＥ４－０．２１８３×総ＡｐｏＥ。但し、Ａβ４２（ｐｇ／ｍＬ）／Ａβ４０（ｐｇ／ｍＬ）の比；ＡｐｏＥ４対立遺伝子カウント；総ＡｐｏＥ（μｇ／ｍＬ）。リスクは、３群：低リスク；平均的なリスク；高リスクに分類される。
【図9】対立遺伝子数毎に、Ａβ４２／４０比モデルに対する疾患確率のプロットを示す図である。
【図10】ＡｐｏＥ４対立遺伝子数毎に、Ａβ４２／４０の比＋総ＡｐｏＥモデルに対する疾患リスクのプロットを示す図である。
【図11】ＡｐｏＥ４対立遺伝子の数に対するリスクアセスメントスコアを示す図である。
【図12】ＡＤＭａｒｋに対するロジスティック回帰分析モデルを示す図である。
【図13】マススペクトロメトリーによるＡｐｏＥアイソタイプ表現型のグラフィック表現を示す図である。ＡｐｏＥ２／Ｅ２表現型は、固有のＥ２と関連するイオンを検出することにより決定される。
【発明を実施するための形態】
【0059】
アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）は、晩期発症型のアルツハイマー病（ＡＤ）に対す
る十分に定義されている遺伝子リスク因子である。ヒトＡＰＯＥ遺伝子は、３つの多形対
立遺伝子、ε２、ε３、及びε４を有し、その結果、６つの異なる表現型：ε２／ε２、
ε２／ε３、ε３／ε３、ε２／ε４、ε３／ε４、及びε４／ε４をもたらす。ＡＤ患
者の約半数（一般集団内の１４％と比較して）がε４対立遺伝子を担持し、その大部分は
異型接合体（ε３／ε４）である。遺伝性のε４対立遺伝子の数は、ε２又はε３対立遺
伝子の遺伝質と比較して、疾患リスクの上昇、及び平均発現年齢の低下の両方と関連する
。３つのＡｐｏＥアイソフォーム間の差異は、その構造、したがってタンパク質と様々な
脂質及びβアミロイド（Ａβ）との相互作用及び結合に影響を及ぼす２つのアミノ酸に基
づく。ＡｐｏＥ及びＡβは脳内で共存する可能性があり、従ってＡＤにおけるその補完的
な役割について広範に試験されている。循環性の血漿及びＣＳＦのＡｐｏＥレベルは、Ａ
Ｄに対する潜在的バイオマーカーであることが近年判明した。更に、ＣＳＦ Ａｐｏ－Ｅ
２又は－Ｅ３レベルの増加は、ＡＤにおける傷害に対する防御性の応答を表している可能
性があり、またそのアミロイド排除に対する効果に付加して、τ及びアミロイド沈着とは
独立して神経傷害を減少させることにより、神経保護効果を有し得る。ＡｐｏＥレベルの
低下は、多発性硬化症及び脳の脂質代謝に影響を及ぼすその他の神経変性疾患とも関連し
ている可能性がある。
る十分に定義されている遺伝子リスク因子である。ヒトＡＰＯＥ遺伝子は、３つの多形対
立遺伝子、ε２、ε３、及びε４を有し、その結果、６つの異なる表現型：ε２／ε２、
ε２／ε３、ε３／ε３、ε２／ε４、ε３／ε４、及びε４／ε４をもたらす。ＡＤ患
者の約半数（一般集団内の１４％と比較して）がε４対立遺伝子を担持し、その大部分は
異型接合体（ε３／ε４）である。遺伝性のε４対立遺伝子の数は、ε２又はε３対立遺
伝子の遺伝質と比較して、疾患リスクの上昇、及び平均発現年齢の低下の両方と関連する
。３つのＡｐｏＥアイソフォーム間の差異は、その構造、したがってタンパク質と様々な
脂質及びβアミロイド（Ａβ）との相互作用及び結合に影響を及ぼす２つのアミノ酸に基
づく。ＡｐｏＥ及びＡβは脳内で共存する可能性があり、従ってＡＤにおけるその補完的
な役割について広範に試験されている。循環性の血漿及びＣＳＦのＡｐｏＥレベルは、Ａ
Ｄに対する潜在的バイオマーカーであることが近年判明した。更に、ＣＳＦ Ａｐｏ－Ｅ
２又は－Ｅ３レベルの増加は、ＡＤにおける傷害に対する防御性の応答を表している可能
性があり、またそのアミロイド排除に対する効果に付加して、τ及びアミロイド沈着とは
独立して神経傷害を減少させることにより、神経保護効果を有し得る。ＡｐｏＥレベルの
低下は、多発性硬化症及び脳の脂質代謝に影響を及ぼすその他の神経変性疾患とも関連し
ている可能性がある。
【0060】
特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、サンプル中のアポリポタンパク質
Ｅ（ＡｐｏＥ）表現型を決定することを目的とし、前記方法は：（ａ）サンプル中のＡｐ
ｏＥを精製することと、（ｂ）前記サンプル中のＡｐｏＥをイオン化させて、ＡｐｏＥの
１つ又は複数のイオンを生成することと、（ｃ）マススペクトロメトリーにより、ステッ
プ（ｂ）に由来するイオンを検出することとを含み、その場合、サンプル中に存在するＡ
ｐｏＥ対立遺伝子は、ステップ（ｃ）において検出されたイオンの同一性から決定される
。
Ｅ（ＡｐｏＥ）表現型を決定することを目的とし、前記方法は：（ａ）サンプル中のＡｐ
ｏＥを精製することと、（ｂ）前記サンプル中のＡｐｏＥをイオン化させて、ＡｐｏＥの
１つ又は複数のイオンを生成することと、（ｃ）マススペクトロメトリーにより、ステッ
プ（ｂ）に由来するイオンを検出することとを含み、その場合、サンプル中に存在するＡ
ｐｏＥ対立遺伝子は、ステップ（ｃ）において検出されたイオンの同一性から決定される
。
【0061】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される精製工程は、液体クロマトグラフィー
を含む。いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィーは、高性能液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）を含む。
を含む。いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィーは、高性能液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）を含む。
【0062】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される精製工程は、固相抽出法（ＳＰＥ）を
含む。
含む。
【0063】
いくつかの実施形態では、イオン化は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を含む
。いくつかの実施形態では、イオン化は、ポジティブモードでイオン化させることを含む
。いくつかの実施形態では、イオン化は、ネガティブモードでイオン化させることを含む
。
。いくつかの実施形態では、イオン化は、ポジティブモードでイオン化させることを含む
。いくつかの実施形態では、イオン化は、ネガティブモードでイオン化させることを含む
。
【0064】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、内部標準を添加することを更
に含む。いくつかの実施形態では、内部標準は同位体標識されている。
に含む。いくつかの実施形態では、内部標準は同位体標識されている。
【0065】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法により決定される表現型は、Ａｐ
ｏＥ２／ＡｐｏＥ２である。いくつかの実施形態では、表現型は、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ
３である。いくつかの実施形態では、表現型は、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４である。いくつ
かの実施形態では、表現型は、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ３である。いくつかの実施形態では
、表現型は、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４である。いくつかの実施形態では、表現型は、Ａｐ
ｏＥ４／ＡｐｏＥ４である。
ｏＥ２／ＡｐｏＥ２である。いくつかの実施形態では、表現型は、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ
３である。いくつかの実施形態では、表現型は、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４である。いくつ
かの実施形態では、表現型は、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ３である。いくつかの実施形態では
、表現型は、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４である。いくつかの実施形態では、表現型は、Ａｐ
ｏＥ４／ＡｐｏＥ４である。
【0066】
いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ４対立遺伝子の存在は、アルツハイマー病発症リス
クの増加を示唆する。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ４／ＡｐｏＥ４対立遺伝子の存
在は、アルツハイマー病発症リスクの増加を示唆する。
クの増加を示唆する。いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥ４／ＡｐｏＥ４対立遺伝子の存
在は、アルツハイマー病発症リスクの増加を示唆する。
【0067】
特定の実施形態では、方法の定量限界は、１０ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。い
くつかの実施形態では、方法の定量限界は、５ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いく
つかの実施形態では、方法の定量限界は、４ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつ
かの実施形態では、方法の定量限界は、３ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつか
の実施形態では、方法の定量限界は、２ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの
実施形態では、方法の定量限界は、１ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの実
施形態では、方法の定量限界は、０．５ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの
実施形態では、方法の定量限界は、０．２ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつか
の実施形態では、方法の定量限界は、０．１ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。
くつかの実施形態では、方法の定量限界は、５ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いく
つかの実施形態では、方法の定量限界は、４ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつ
かの実施形態では、方法の定量限界は、３ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつか
の実施形態では、方法の定量限界は、２ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの
実施形態では、方法の定量限界は、１ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの実
施形態では、方法の定量限界は、０．５ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの
実施形態では、方法の定量限界は、０．２ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつか
の実施形態では、方法の定量限界は、０．１ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。
【0068】
いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、５ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。
いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、１ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。い
くつかの実施形態では、方法の検出限界は、０．５ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。
いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、０．１ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい
。いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、０．０５ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等
しい。いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、０．０１ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれ
に等しい。
いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、１ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。い
くつかの実施形態では、方法の検出限界は、０．５ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。
いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、０．１ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい
。いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、０．０５ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等
しい。いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、０．０１ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれ
に等しい。
【0069】
いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥは、マススペクトロメトリーの前に誘導体化されな
い。
い。
【0070】
いくつかの実施形態では、ＡｐｏＥは、マススペクトロメトリーの前に誘導体化される
。
。
【0071】
特定の実施形態では、サンプルは、体液である。いくつかの実施形態では、サンプルは
、脳脊髄液（ＣＳＦ）である。いくつかの実施形態では、サンプルは、血漿又は血清であ
る。いくつかの実施形態では、サンプルは、全血である。いくつかの実施形態では、サン
プルは、唾液又は尿である。
、脳脊髄液（ＣＳＦ）である。いくつかの実施形態では、サンプルは、血漿又は血清であ
る。いくつかの実施形態では、サンプルは、全血である。いくつかの実施形態では、サン
プルは、唾液又は尿である。
【0072】
いくつかの実施形態では、方法は、サンプルのタンパク質除去に十分な量で、薬剤をサ
ンプルに添加することを含み得る。
ンプルに添加することを含み得る。
【0073】
適する試験サンプルは、目的とする分析物を含有し得る任意の試験サンプルを含む。い
くつかの好ましい実施形態では、サンプルは、生体サンプルである；すなわち、任意の生
物起源物質、例えば動物、細胞培養物、臓器培養物等から得られるサンプルである。特定
の好ましい実施形態では、サンプルは、哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ等から得られ
る。特に好ましい哺乳動物は、霊長類、最も好ましくは男性又は女性のヒトである。特に
好ましいサンプルとして、血液、血漿、血清、毛髪、筋肉、尿、唾液、涙、脳脊髄液、又
はその他の組織サンプルが挙げられる。そのようなサンプルは、例えば患者；すなわち、
疾患又は状態を診断、予測、又は処置するために、臨床現場において自己を提示する生存
者、男性又は女性から取得され得る。試験サンプルは、好ましくは患者から得られ、例え
ば血清である。
くつかの好ましい実施形態では、サンプルは、生体サンプルである；すなわち、任意の生
物起源物質、例えば動物、細胞培養物、臓器培養物等から得られるサンプルである。特定
の好ましい実施形態では、サンプルは、哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ等から得られ
る。特に好ましい哺乳動物は、霊長類、最も好ましくは男性又は女性のヒトである。特に
好ましいサンプルとして、血液、血漿、血清、毛髪、筋肉、尿、唾液、涙、脳脊髄液、又
はその他の組織サンプルが挙げられる。そのようなサンプルは、例えば患者；すなわち、
疾患又は状態を診断、予測、又は処置するために、臨床現場において自己を提示する生存
者、男性又は女性から取得され得る。試験サンプルは、好ましくは患者から得られ、例え
ば血清である。
【0074】
マススペクトロメトリーのためのサンプル調製
サンプル中のその他の成分（例えば、タンパク質）と比較してそれよりもＡｐｏＥを富
化させるのに利用可能である方法として、例えば、フィルター処理法、遠心分離法、薄層
クロマトグラフィー（ＴＬＣ）法、キャピラリー電気泳動法を含む電気泳動法、免疫親和
性分離法を含む親和性分離法、酢酸エチル抽出法及びメタノール抽出法を含む抽出法、及
びカオトロピック薬剤の使用、又は上記の任意の組合せ等が挙げられる。
サンプル中のその他の成分（例えば、タンパク質）と比較してそれよりもＡｐｏＥを富
化させるのに利用可能である方法として、例えば、フィルター処理法、遠心分離法、薄層
クロマトグラフィー（ＴＬＣ）法、キャピラリー電気泳動法を含む電気泳動法、免疫親和
性分離法を含む親和性分離法、酢酸エチル抽出法及びメタノール抽出法を含む抽出法、及
びカオトロピック薬剤の使用、又は上記の任意の組合せ等が挙げられる。
【0075】
タンパク質沈殿法は、試験サンプルを調製する１つの好ましい方法である。そのような
タンパク質精製法は、当技術分野に周知であり、例えば、Ｐｏｌｓｏｎらの、Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ、第７８５巻：２６３～２７５頁（２０
０３年）は、本方法で使用するのに適するタンパク質沈殿技術について記載する。タンパ
ク質沈殿法は、上清にＡｐｏＥを残して、サンプルからほとんどのタンパク質を取り除く
のに利用可能である。サンプルは、沈殿したタンパク質から液体上清を分離するために遠
心分離され得る。得られた上清は、次に、液体クロマトグラフィー及び後続するマススペ
クトロメトリー分析に適用され得る。特定の実施形態では、タンパク質沈殿法、例えばア
セトニトリルタンパク質沈殿法等を使用すれば、ＨＰＬＣ及びマススペクトロメトリーを
行う前に、高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）又はその他のオンライン抽出を行
う必要がなくなる。従って、そのような実施形態では、方法は、（１）目的とするサンプ
ルのタンパク質沈殿を実施すること；及び（２）オンライン抽出又は高乱流液体クロマト
グラフィー（ＨＴＬＣ）を使用することなく、上清をＨＰＬＣ－質量分析装置に直接負荷
することと関係する。
タンパク質精製法は、当技術分野に周知であり、例えば、Ｐｏｌｓｏｎらの、Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ、第７８５巻：２６３～２７５頁（２０
０３年）は、本方法で使用するのに適するタンパク質沈殿技術について記載する。タンパ
ク質沈殿法は、上清にＡｐｏＥを残して、サンプルからほとんどのタンパク質を取り除く
のに利用可能である。サンプルは、沈殿したタンパク質から液体上清を分離するために遠
心分離され得る。得られた上清は、次に、液体クロマトグラフィー及び後続するマススペ
クトロメトリー分析に適用され得る。特定の実施形態では、タンパク質沈殿法、例えばア
セトニトリルタンパク質沈殿法等を使用すれば、ＨＰＬＣ及びマススペクトロメトリーを
行う前に、高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）又はその他のオンライン抽出を行
う必要がなくなる。従って、そのような実施形態では、方法は、（１）目的とするサンプ
ルのタンパク質沈殿を実施すること；及び（２）オンライン抽出又は高乱流液体クロマト
グラフィー（ＨＴＬＣ）を使用することなく、上清をＨＰＬＣ－質量分析装置に直接負荷
することと関係する。
【0076】
いくつかの好ましい実施形態では、ＨＰＬＣは、単独で、又は１つ若しくは複数の精製
法と組み合わせて、マススペクトロメトリーの前にＡｐｏＥを精製するのに利用可能であ
る。そのような実施形態では、サンプルは、分析物を捕捉するＨＰＬＣ抽出カートリッジ
を使用して抽出され、次に溶出され、そして第２のＨＰＬＣカラム上でクロマトグラフさ
れ得る、又はイオン化前に分析用ＨＰＬＣカラム上に溶出され得る。このようなクロマト
グラフィー手順に関与するステップは、自動化方式で連結可能であるので、分析物の精製
期間中にオペレーターが関与する必要性は、最低限に抑えることができる。このような特
性は、その結果、時間とコストの節約をもたらし、またオペレーターがミスする機会を取
り除くことができる。
法と組み合わせて、マススペクトロメトリーの前にＡｐｏＥを精製するのに利用可能であ
る。そのような実施形態では、サンプルは、分析物を捕捉するＨＰＬＣ抽出カートリッジ
を使用して抽出され、次に溶出され、そして第２のＨＰＬＣカラム上でクロマトグラフさ
れ得る、又はイオン化前に分析用ＨＰＬＣカラム上に溶出され得る。このようなクロマト
グラフィー手順に関与するステップは、自動化方式で連結可能であるので、分析物の精製
期間中にオペレーターが関与する必要性は、最低限に抑えることができる。このような特
性は、その結果、時間とコストの節約をもたらし、またオペレーターがミスする機会を取
り除くことができる。
【0077】
例えば、ＨＴＬＣカラムや諸方法等が引き起こす乱流は、物質移動速度を増強する可能
性があり、分離特性を改善すると考えられている。ＨＴＬＣカラムは、剛性粒子を含有す
る充填カラムを通じた、クロマトグラフィーの高い流速によって成分を分離する。高速流
速（例えば、３～５ｍＬ／分）を利用することにより、乱流がカラム内に生じ、固定相と
目的とする分析物の間でほぼ完全な相互作用を引き起こす。ＨＴＬＣカラムを使用する長
所として、高分子量の種は、乱流条件下では保持されないので、生体液マトリックスと関
連した高分子の蓄積が回避されることが挙げられる。１つの手順において複数の分離法を
組み合わせるＨＴＬＣ法では、サンプル調製を長時間行う必要性が低下し、また著しく高
速で作動する。そのような方法は、層流（ＨＰＬＣ）クロマトグラフィーよりも優れた分
離性能も実現する。ＨＴＬＣは、生体サンプル（血漿、尿、等）の直接注入を可能にする
。直接注入する場合、変性したタンパク質及びその他の生物学的デブリが分離カラムを急
速にブロックするので、従来型のクロマトグラフィーでは実現が難しい。また、ＨＴＬＣ
は、１ｍＬ未満、好ましくは０．５ｍＬ未満、好ましくは０．２ｍＬ未満、好ましくは０
．１ｍＬの非常に少ないサンプルボリュームも可能にする。
性があり、分離特性を改善すると考えられている。ＨＴＬＣカラムは、剛性粒子を含有す
る充填カラムを通じた、クロマトグラフィーの高い流速によって成分を分離する。高速流
速（例えば、３～５ｍＬ／分）を利用することにより、乱流がカラム内に生じ、固定相と
目的とする分析物の間でほぼ完全な相互作用を引き起こす。ＨＴＬＣカラムを使用する長
所として、高分子量の種は、乱流条件下では保持されないので、生体液マトリックスと関
連した高分子の蓄積が回避されることが挙げられる。１つの手順において複数の分離法を
組み合わせるＨＴＬＣ法では、サンプル調製を長時間行う必要性が低下し、また著しく高
速で作動する。そのような方法は、層流（ＨＰＬＣ）クロマトグラフィーよりも優れた分
離性能も実現する。ＨＴＬＣは、生体サンプル（血漿、尿、等）の直接注入を可能にする
。直接注入する場合、変性したタンパク質及びその他の生物学的デブリが分離カラムを急
速にブロックするので、従来型のクロマトグラフィーでは実現が難しい。また、ＨＴＬＣ
は、１ｍＬ未満、好ましくは０．５ｍＬ未満、好ましくは０．２ｍＬ未満、好ましくは０
．１ｍＬの非常に少ないサンプルボリュームも可能にする。
【0078】
マススペクトロメトリーによる分析前に、サンプル調製に適用されるＨＴＬＣの例は、
別途記載されている。例えば、Ｚｉｍｍｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ８５４巻
：２３～３５頁（１９９９年）を参照；米国特許第５，９６８，３６７号；同第５，９１
９，３６８号；同第５，７９５，４６９号；及び同第５，７７２，８７４号も参照。本方
法の特定の実施形態では、サンプルは、ＨＴＬＣカラムに負荷する前に上記のようなタン
パク質沈殿処理がなされる；代替的な好ましい実施形態では、サンプルは、タンパク質沈
殿処理されることなく、ＨＴＬＣ上に直接負荷され得る。ＨＴＬＣ抽出カラムは、好まし
くは大型の粒子カラムである。様々な実施形態では、方法の１つ又は複数のステップは、
オンラインの自動化された方式で実施され得る。例えば、１つの実施形態では、ステップ
（ｉ）～（ｖ）は、オンラインの自動化された方式で実施される。別の場合、イオン化及
び検出のステップは、ステップ（ｉ）～（ｖ）の後に、オンラインで実施される。
別途記載されている。例えば、Ｚｉｍｍｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ８５４巻
：２３～３５頁（１９９９年）を参照；米国特許第５，９６８，３６７号；同第５，９１
９，３６８号；同第５，７９５，４６９号；及び同第５，７７２，８７４号も参照。本方
法の特定の実施形態では、サンプルは、ＨＴＬＣカラムに負荷する前に上記のようなタン
パク質沈殿処理がなされる；代替的な好ましい実施形態では、サンプルは、タンパク質沈
殿処理されることなく、ＨＴＬＣ上に直接負荷され得る。ＨＴＬＣ抽出カラムは、好まし
くは大型の粒子カラムである。様々な実施形態では、方法の１つ又は複数のステップは、
オンラインの自動化された方式で実施され得る。例えば、１つの実施形態では、ステップ
（ｉ）～（ｖ）は、オンラインの自動化された方式で実施される。別の場合、イオン化及
び検出のステップは、ステップ（ｉ）～（ｖ）の後に、オンラインで実施される。
【0079】
高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む液体クロマトグラフィー（ＬＣ）は
、比較的低速の層流技術に基づく。従来型のＨＰＬＣ分析法は、カラムを通過するサンプ
ルの層流が、サンプルから目的とする分析物を分離する基礎となる、カラム充填材に依存
する。当業者は、そのようなカラムにおける分離は、拡散プロセスであると理解している
。ＨＰＬＣは、生体サンプル中の化合物の分離に問題なく適用されるが、かなりの量のサ
ンプル調製が、分離及び質量分析装置（ＭＳ）によるその後の分析の前に必要とされ、こ
の技術を労働集約的なものとしている。更に、ほとんどのＨＰＬＣシステムは、質量分析
装置をその能力の最大限まで活用しておらず、１つのＨＰＬＣシステムが１つのＭＳ装置
に接続可能としているにすぎず、その結果、多数のアッセイを実施するのに冗長な時間を
必要とする。
、比較的低速の層流技術に基づく。従来型のＨＰＬＣ分析法は、カラムを通過するサンプ
ルの層流が、サンプルから目的とする分析物を分離する基礎となる、カラム充填材に依存
する。当業者は、そのようなカラムにおける分離は、拡散プロセスであると理解している
。ＨＰＬＣは、生体サンプル中の化合物の分離に問題なく適用されるが、かなりの量のサ
ンプル調製が、分離及び質量分析装置（ＭＳ）によるその後の分析の前に必要とされ、こ
の技術を労働集約的なものとしている。更に、ほとんどのＨＰＬＣシステムは、質量分析
装置をその能力の最大限まで活用しておらず、１つのＨＰＬＣシステムが１つのＭＳ装置
に接続可能としているにすぎず、その結果、多数のアッセイを実施するのに冗長な時間を
必要とする。
【0080】
マススペクトロメトリー分析前のサンプル除去を目的としたＨＰＬＣの使用について、
様々な方法が記載されている。例えば、Ｔａｙｌｏｒら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒ
ｕｇ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ、第２２巻：６０８～１２頁（２０００年）；及びＳａｌｍ
ら、Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２２巻Ｓｕｐｌ．Ｂ：Ｂ７１～Ｂ８５頁（２
０００年）を参照。
様々な方法が記載されている。例えば、Ｔａｙｌｏｒら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒ
ｕｇ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ、第２２巻：６０８～１２頁（２０００年）；及びＳａｌｍ
ら、Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２２巻Ｓｕｐｌ．Ｂ：Ｂ７１～Ｂ８５頁（２
０００年）を参照。
【0081】
当業者は、ＡｐｏＥと共に利用するのに適するＨＰＬＣ装置及びカラムを選択し得る。
クロマトグラフ用カラムは、化学的部分の分離（すなわち、分画）を促進する媒体（すな
わち、充填材料）を一般的に含む。媒体として微細粒子を挙げることができる。粒子は、
様々な化学的部分と相互作用して化学的部分の分離を促進する結合表面を備える。１つの
適する結合表面は、疎水結合表面、例えばアルキル結合表面等である。アルキル結合表面
は、Ｃ－４、Ｃ－８、Ｃ－１２、又はＣ－１８結合アルキル基、好ましくはＣ－１８結合
基を含み得る。クロマトグラフ用カラムは、サンプルを受け取るための注入ポートと、分
画されたサンプルを含む流出物を排出するための排出ポートを備える。１つの実施形態で
は、サンプル（又は事前精製されたサンプル）が、注入ポートにおいてカラムに適用され
、溶媒又は溶媒混合物により溶出され、そして排出ポートから排出される。異なる溶媒モ
ードが、目的とする分析物を溶出させるのに選択され得る。例えば、液体クロマトグラフ
ィーは、勾配モード、アイソクラチックモード、又は多型（すなわち、混合）モードを使
用して実施され得る。クロマトグラフィー期間中に、材料の分離は、変動要因、例えば溶
離液（「移動相」としても知られている）の選択、溶出モード、勾配条件、温度等により
影響を受ける。
クロマトグラフ用カラムは、化学的部分の分離（すなわち、分画）を促進する媒体（すな
わち、充填材料）を一般的に含む。媒体として微細粒子を挙げることができる。粒子は、
様々な化学的部分と相互作用して化学的部分の分離を促進する結合表面を備える。１つの
適する結合表面は、疎水結合表面、例えばアルキル結合表面等である。アルキル結合表面
は、Ｃ－４、Ｃ－８、Ｃ－１２、又はＣ－１８結合アルキル基、好ましくはＣ－１８結合
基を含み得る。クロマトグラフ用カラムは、サンプルを受け取るための注入ポートと、分
画されたサンプルを含む流出物を排出するための排出ポートを備える。１つの実施形態で
は、サンプル（又は事前精製されたサンプル）が、注入ポートにおいてカラムに適用され
、溶媒又は溶媒混合物により溶出され、そして排出ポートから排出される。異なる溶媒モ
ードが、目的とする分析物を溶出させるのに選択され得る。例えば、液体クロマトグラフ
ィーは、勾配モード、アイソクラチックモード、又は多型（すなわち、混合）モードを使
用して実施され得る。クロマトグラフィー期間中に、材料の分離は、変動要因、例えば溶
離液（「移動相」としても知られている）の選択、溶出モード、勾配条件、温度等により
影響を受ける。
【0082】
特定の実施形態では、分析物は、目的とする分析物がカラム充填材料により可逆的に保
持される一方、１つ又は複数のその他の物質は保持されない条件下で、サンプルをカラム
に適用することにより精製され得る。このような実施形態では、第１の移動相の条件は、
目的とする分析物がカラムにより保持されるように設定可能であり、また第２の移動相の
条件は、その後、保持されなかった物質が洗い出されたら、保持された物質がカラムから
取り出されるように、設定可能である。或いは、分析物は、１つ又は複数のその他の物質
と比較して、異なる速度で目的とする分析物が溶出するような移動相の条件下でサンプル
をカラムに適用することにより精製され得る。そのような手順は、サンプルの１つ又は複
数のその他の成分と比較して、目的とする１つ又は複数の分析物の量を富化させる可能性
がある。
持される一方、１つ又は複数のその他の物質は保持されない条件下で、サンプルをカラム
に適用することにより精製され得る。このような実施形態では、第１の移動相の条件は、
目的とする分析物がカラムにより保持されるように設定可能であり、また第２の移動相の
条件は、その後、保持されなかった物質が洗い出されたら、保持された物質がカラムから
取り出されるように、設定可能である。或いは、分析物は、１つ又は複数のその他の物質
と比較して、異なる速度で目的とする分析物が溶出するような移動相の条件下でサンプル
をカラムに適用することにより精製され得る。そのような手順は、サンプルの１つ又は複
数のその他の成分と比較して、目的とする１つ又は複数の分析物の量を富化させる可能性
がある。
【0083】
１つの好ましい実施形態では、ＨＴＬＣは、疎水性カラムクロマトグラフィーシステム
上のＨＰＬＣに後続し得る。特定の好ましい実施形態では、Ｃｏｈｅｓｉｖｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＴｕｒｂｏＦｌｏｗ Ｃｙｃｌｏｎｅ Ｐ（登録商標）ポリマー
ベースカラム（粒径６０μｍ、カラム寸法５０×１．０ｍｍ、ポアサイズ１００Å）が使
用される。関連する好ましい実施形態では、親水性エンドキャッピングを有する、Ｐｈｅ
ｎｏｍｅｎｅｘ Ｉｎｃ社製のＳｙｎｅｒｇｉ Ｐｏｌａｒ－ＲＰ（登録商標）エーテル
結合型フェニルの分析カラム（粒径４μｍ、カラム寸法１５０×２．０ｍｍ、ポアサイズ
８０Å）が使用される。特定の好ましい実施形態では、ＨＴＬＣ及びＨＰＬＣが、移動相
としてＨＰＬＣグレード超純水及び１００％メタノールを使用して実施される。
上のＨＰＬＣに後続し得る。特定の好ましい実施形態では、Ｃｏｈｅｓｉｖｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＴｕｒｂｏＦｌｏｗ Ｃｙｃｌｏｎｅ Ｐ（登録商標）ポリマー
ベースカラム（粒径６０μｍ、カラム寸法５０×１．０ｍｍ、ポアサイズ１００Å）が使
用される。関連する好ましい実施形態では、親水性エンドキャッピングを有する、Ｐｈｅ
ｎｏｍｅｎｅｘ Ｉｎｃ社製のＳｙｎｅｒｇｉ Ｐｏｌａｒ－ＲＰ（登録商標）エーテル
結合型フェニルの分析カラム（粒径４μｍ、カラム寸法１５０×２．０ｍｍ、ポアサイズ
８０Å）が使用される。特定の好ましい実施形態では、ＨＴＬＣ及びＨＰＬＣが、移動相
としてＨＰＬＣグレード超純水及び１００％メタノールを使用して実施される。
【0084】
慎重なバルブの選択及びコネクター配管作業により、手動ステップを一切必要とせずに
、物質が１つのカラムから次のカラムへと通過するように、２つ以上のクロマトグラフィ
ーカラムが、必要に応じて接続され得る。好ましい実施形態では、バルブの選択及び配管
作業は、必要なステップを実施するように事前プログラムされたコンピューターにより管
理される。最も好ましくは、クロマトグラフィーシステムも、検出器システム、例えばＭ
Ｓシステムと、そのようなオンライン方式で接続される。従って、オペレーターは、サン
プルのトレーをオートサンプラーに配置すればよく、そして残りの作業は、コンピュータ
ー制御下で実施され、その結果、選択されたすべてのサンプルの精製及び分析が完了する
。
、物質が１つのカラムから次のカラムへと通過するように、２つ以上のクロマトグラフィ
ーカラムが、必要に応じて接続され得る。好ましい実施形態では、バルブの選択及び配管
作業は、必要なステップを実施するように事前プログラムされたコンピューターにより管
理される。最も好ましくは、クロマトグラフィーシステムも、検出器システム、例えばＭ
Ｓシステムと、そのようなオンライン方式で接続される。従って、オペレーターは、サン
プルのトレーをオートサンプラーに配置すればよく、そして残りの作業は、コンピュータ
ー制御下で実施され、その結果、選択されたすべてのサンプルの精製及び分析が完了する
。
【0085】
特定の好ましい実施形態では、サンプル中のＡｐｏＥ又はそのフラグメントは、イオン
化の前に精製され得る。特に好ましい実施形態では、クロマトグラフィーは、ガスクロマ
トグラフィーではない。
化の前に精製され得る。特に好ましい実施形態では、クロマトグラフィーは、ガスクロマ
トグラフィーではない。
【0086】
マススペクトロメトリーによる検出及び定量
様々な実施形態では、ＡｐｏＥ又はそのフラグメントは、当業者にとって公知の任意の
方法によりイオン化することができる。マススペクトロメトリーは、分画されたサンプル
をイオン化し、そして更なる分析用として荷電分子を生み出すイオン源を備える質量分析
装置を使用して実施される。例えば、サンプルのイオン化は、電子イオン化、化学イオン
化、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、光子イオン化、大気圧化学イオン化（ＡＰ
ＣＩ）、光イオン化、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）、高速原子衝撃（ＦＡＢ）、液体二
次イオン化（ＬＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電界イ
オン化、電界脱離、サーモスプレー／プラズマスプレーイオン化、表面増強レーザー脱離
イオン化（ＳＥＬＤＩ）、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）、及び粒子ビームイオン化により
実施され得る。当業者は、イオン化法の選択は、測定される分析物、サンプルの種類、検
出器の種類、ポジティブモードとネガティブモードの選択等に基づき決定され得るものと
理解する。
様々な実施形態では、ＡｐｏＥ又はそのフラグメントは、当業者にとって公知の任意の
方法によりイオン化することができる。マススペクトロメトリーは、分画されたサンプル
をイオン化し、そして更なる分析用として荷電分子を生み出すイオン源を備える質量分析
装置を使用して実施される。例えば、サンプルのイオン化は、電子イオン化、化学イオン
化、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、光子イオン化、大気圧化学イオン化（ＡＰ
ＣＩ）、光イオン化、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）、高速原子衝撃（ＦＡＢ）、液体二
次イオン化（ＬＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電界イ
オン化、電界脱離、サーモスプレー／プラズマスプレーイオン化、表面増強レーザー脱離
イオン化（ＳＥＬＤＩ）、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）、及び粒子ビームイオン化により
実施され得る。当業者は、イオン化法の選択は、測定される分析物、サンプルの種類、検
出器の種類、ポジティブモードとネガティブモードの選択等に基づき決定され得るものと
理解する。
【0087】
好ましい実施形態では、ＡｐｏＥ又はそのフラグメントは、ポジティブモード又はネガ
ティブモードでの加熱式エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）によりイオン化する。
代替的実施形態では、ＡｐｏＥ又はそのフラグメントは、ポジティブモード又はネガティ
ブモードでのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）又は大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ
）によりイオン化する。
ティブモードでの加熱式エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）によりイオン化する。
代替的実施形態では、ＡｐｏＥ又はそのフラグメントは、ポジティブモード又はネガティ
ブモードでのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）又は大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ
）によりイオン化する。
【0088】
サンプルがイオン化した後、これにより生成した正に荷電したイオン又は負に荷電した
イオンは、質量対電荷の比を決定するために分析され得る。質量対電荷の比を決定するた
めの適するアナライザーとして、四重極型アナライザー、イオントラップアナライザー、
及び飛行時間アナライザーが挙げられる。イオンは、いくつかの検出モードを使用して検
出可能である。例えば、選択されたイオンは、すなわち、選択的イオンモニタリングモー
ド（ＳＩＭ）を使用して検出可能であるか、また或いは、イオンは、スキャニングモード
、例えば、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）又は選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）を使
用して検出可能である。好ましくは、質量対電荷の比は、四重極型アナライザーを使用し
て決定される。例えば、「四重極」又は「四重極型イオントラップ」装置では、電極間に
印加されたＤＣ電位、ＲＦシグナルの振幅、及び質量／電荷の比に比例した力が、振動性
ラジオ周波数場内のイオンに加わる。電圧及び振幅は、特定の質量／電荷の比を有するイ
オンのみが、四重極の長さを移動する一方、その他のすべてのイオンは外れるように選択
され得る。従って、四重極型装置は、装置に注入されたイオンに対して、「マスフィルタ
ー」及び「マス検出器」の両方として作用し得る。
イオンは、質量対電荷の比を決定するために分析され得る。質量対電荷の比を決定するた
めの適するアナライザーとして、四重極型アナライザー、イオントラップアナライザー、
及び飛行時間アナライザーが挙げられる。イオンは、いくつかの検出モードを使用して検
出可能である。例えば、選択されたイオンは、すなわち、選択的イオンモニタリングモー
ド（ＳＩＭ）を使用して検出可能であるか、また或いは、イオンは、スキャニングモード
、例えば、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）又は選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）を使
用して検出可能である。好ましくは、質量対電荷の比は、四重極型アナライザーを使用し
て決定される。例えば、「四重極」又は「四重極型イオントラップ」装置では、電極間に
印加されたＤＣ電位、ＲＦシグナルの振幅、及び質量／電荷の比に比例した力が、振動性
ラジオ周波数場内のイオンに加わる。電圧及び振幅は、特定の質量／電荷の比を有するイ
オンのみが、四重極の長さを移動する一方、その他のすべてのイオンは外れるように選択
され得る。従って、四重極型装置は、装置に注入されたイオンに対して、「マスフィルタ
ー」及び「マス検出器」の両方として作用し得る。
【0089】
「タンデム型質量分析」又は「ＭＳ／ＭＳ」を利用することにより、ＭＳ技術の分解能
を強化することができる。この技術では、目的とする分子から生成した前駆イオン（親イ
オンとも呼ばれる）を、ＭＳ装置内でフィルター処理することができ、そして前駆イオン
は、その後フラグメント化されて、次に第２のＭＳ手順において分析の対象とされる１つ
又は複数のフラグメントイオン（娘イオン又はプロダクトイオンとも呼ばれる）となる。
前駆イオンを慎重に選択することにより、特定の分析物より産生するイオンのみが、フラ
グメント化チャンバーを通過し、そこで、不活性気体の原子と衝突してフラグメントイオ
ンが産生する。前駆イオン及びフラグメントイオンのいずれも、イオン化／フラグメント
化させる一連の所定条件下で再現的に産生するので、ＭＳ／ＭＳ技術は、極めて強力な分
析ツールを提供し得る。例えば、フィルター処理／フラグメント化の組合せは、妨害物質
を取り除くのに利用可能であり、また複合サンプル、例えば生体サンプル等において特に
有用であり得る。
を強化することができる。この技術では、目的とする分子から生成した前駆イオン（親イ
オンとも呼ばれる）を、ＭＳ装置内でフィルター処理することができ、そして前駆イオン
は、その後フラグメント化されて、次に第２のＭＳ手順において分析の対象とされる１つ
又は複数のフラグメントイオン（娘イオン又はプロダクトイオンとも呼ばれる）となる。
前駆イオンを慎重に選択することにより、特定の分析物より産生するイオンのみが、フラ
グメント化チャンバーを通過し、そこで、不活性気体の原子と衝突してフラグメントイオ
ンが産生する。前駆イオン及びフラグメントイオンのいずれも、イオン化／フラグメント
化させる一連の所定条件下で再現的に産生するので、ＭＳ／ＭＳ技術は、極めて強力な分
析ツールを提供し得る。例えば、フィルター処理／フラグメント化の組合せは、妨害物質
を取り除くのに利用可能であり、また複合サンプル、例えば生体サンプル等において特に
有用であり得る。
【0090】
質量分析装置は、一般的に、イオンスキャン；すなわち、所定の範囲（例えば、１００
～１０００ａｍｕ）において、特定の質量／電荷を有する各イオンの相対的存在量をユー
ザーに提供する。分析物アッセイの結果、すなわち質量スペクトルは、当技術分野におい
て公知の非常に多くの方法により、オリジナルサンプル内の分析物の量と関連付けること
ができる。例えば、サンプリング及び分析パラメーターが慎重に管理されることを前提と
すれば、所定のイオンの相対的存在量は、相対的存在量をオリジナル分子の絶対量に変換
する表と比較することができる。或いは、分子標準をサンプルと共にランニングすること
ができ、そしてその標準から生成したイオンに基づき、標準曲線が構築される。そのよう
な標準曲線を使用して、所定のイオンの相対的存在量が、オリジナル分子の絶対量に変換
され得る。特定の好ましい実施形態では、内部標準が、ＡｐｏＥの量を計算するための標
準曲線を生成するのに使用される。そのような標準曲線を生成及び使用する方法は、当技
術分野に周知であり、また当業者は、適切な内部標準を選択する能力を有する。例えば、
ＡｐｏＥの同位体が、内部標準として利用可能である。イオンの量をオリジナル分子の量
と関連付けるための非常に多くのその他の方法が、当業者に周知である。
～１０００ａｍｕ）において、特定の質量／電荷を有する各イオンの相対的存在量をユー
ザーに提供する。分析物アッセイの結果、すなわち質量スペクトルは、当技術分野におい
て公知の非常に多くの方法により、オリジナルサンプル内の分析物の量と関連付けること
ができる。例えば、サンプリング及び分析パラメーターが慎重に管理されることを前提と
すれば、所定のイオンの相対的存在量は、相対的存在量をオリジナル分子の絶対量に変換
する表と比較することができる。或いは、分子標準をサンプルと共にランニングすること
ができ、そしてその標準から生成したイオンに基づき、標準曲線が構築される。そのよう
な標準曲線を使用して、所定のイオンの相対的存在量が、オリジナル分子の絶対量に変換
され得る。特定の好ましい実施形態では、内部標準が、ＡｐｏＥの量を計算するための標
準曲線を生成するのに使用される。そのような標準曲線を生成及び使用する方法は、当技
術分野に周知であり、また当業者は、適切な内部標準を選択する能力を有する。例えば、
ＡｐｏＥの同位体が、内部標準として利用可能である。イオンの量をオリジナル分子の量
と関連付けるための非常に多くのその他の方法が、当業者に周知である。
【0091】
方法の１つ又は複数のステップは、自動化された機械を使用して実施され得る。特定の
実施形態では、１つ又は複数の精製ステップが、オンラインで実施され、またより好まし
くは、精製及びマススペクトロメトリーステップのすべてが、オンライン方式で実施され
得る。
実施形態では、１つ又は複数の精製ステップが、オンラインで実施され、またより好まし
くは、精製及びマススペクトロメトリーステップのすべてが、オンライン方式で実施され
得る。
【0092】
特定の実施形態、例えば前駆イオンが更なるフラグメント化を目的として単離されるよ
うなＭＳ／ＭＳ等では、衝突活性化解離法〔collision activation dissociation〕が、
更なる検出を目的としてフラグメントイオンを生成するのに多くの場合使用される。ＣＡ
Ｄでは、前駆イオンは、不活性気体との衝突を通じてエネルギーを獲得するが、その後「
単分子分解反応」と呼ばれるプロセスによりフラグメント化する。振動エネルギーの増加
に起因して、イオン内の特定の結合が破壊され得るように、十分なエネルギーが、前駆イ
オン内に蓄積しなければならない。
うなＭＳ／ＭＳ等では、衝突活性化解離法〔collision activation dissociation〕が、
更なる検出を目的としてフラグメントイオンを生成するのに多くの場合使用される。ＣＡ
Ｄでは、前駆イオンは、不活性気体との衝突を通じてエネルギーを獲得するが、その後「
単分子分解反応」と呼ばれるプロセスによりフラグメント化する。振動エネルギーの増加
に起因して、イオン内の特定の結合が破壊され得るように、十分なエネルギーが、前駆イ
オン内に蓄積しなければならない。
【0093】
特に好ましい実施形態では、ＡｐｏＥが、ＭＳ／ＭＳを使用して、以下のように検出及
び／又は定量化される。サンプルは、液体クロマトグラフィー、好ましくはＨＰＬＣで処
理され、クロマトグラフ用カラムからの液体溶媒の流れは、ＭＳ／ＭＳアナライザーの加
熱されたネブライザーインターフェースに進入し、そして溶媒／分析物混合物が、インタ
ーフェースの加熱されたチューブ内で蒸気に変換される。分析物は、選択されたイオン化
装置によりイオン化される。イオン、例えば前駆イオンは、装置の開口部を通過し、そし
て第１の四重極に進入する。四重極１及び３（Ｑ１及びＱ３）は、質量フィルターであり
、その質量対電荷の比（ｍ／ｚ）に基づき、イオン（すなわち、「前駆」及び「フラグメ
ント」イオン）の選択を可能にする。四重極２（Ｑ２）は衝突セルであり、そこでイオン
がフラグメント化される。質量分析装置の第１の四重極（Ｑ１）は、ＡｐｏＥの質量対電
荷の比を用いて分子を選択する。ＡｐｏＥの正しい質量／電荷の比を有する前駆イオンが
、衝突チャンバー（Ｑ２）に導入可能となる一方、その他の質量／電荷の比を有する望ま
しくないイオンはいずれも四重極の側面と衝突し、除去される。Ｑ２に進入する前駆イオ
ンは、中性のアルゴン気体分子と衝突して、フラグメント化する。このプロセスは衝突活
性化解離（ＣＡＤ）と呼ばれる。生成したフラグメントイオンは、四重極３（Ｑ３）に導
入され、そこでは、ＡｐｏＥフラグメントのイオンが選択される一方、その他のイオンは
除去される。
び／又は定量化される。サンプルは、液体クロマトグラフィー、好ましくはＨＰＬＣで処
理され、クロマトグラフ用カラムからの液体溶媒の流れは、ＭＳ／ＭＳアナライザーの加
熱されたネブライザーインターフェースに進入し、そして溶媒／分析物混合物が、インタ
ーフェースの加熱されたチューブ内で蒸気に変換される。分析物は、選択されたイオン化
装置によりイオン化される。イオン、例えば前駆イオンは、装置の開口部を通過し、そし
て第１の四重極に進入する。四重極１及び３（Ｑ１及びＱ３）は、質量フィルターであり
、その質量対電荷の比（ｍ／ｚ）に基づき、イオン（すなわち、「前駆」及び「フラグメ
ント」イオン）の選択を可能にする。四重極２（Ｑ２）は衝突セルであり、そこでイオン
がフラグメント化される。質量分析装置の第１の四重極（Ｑ１）は、ＡｐｏＥの質量対電
荷の比を用いて分子を選択する。ＡｐｏＥの正しい質量／電荷の比を有する前駆イオンが
、衝突チャンバー（Ｑ２）に導入可能となる一方、その他の質量／電荷の比を有する望ま
しくないイオンはいずれも四重極の側面と衝突し、除去される。Ｑ２に進入する前駆イオ
ンは、中性のアルゴン気体分子と衝突して、フラグメント化する。このプロセスは衝突活
性化解離（ＣＡＤ）と呼ばれる。生成したフラグメントイオンは、四重極３（Ｑ３）に導
入され、そこでは、ＡｐｏＥフラグメントのイオンが選択される一方、その他のイオンは
除去される。
【0094】
本方法は、ポジティブ又はネガティブイオンモードのいずれかで実施されるＭＳ／ＭＳ
と関係し得る。当技術分野において周知の標準法を使用して、当業者は、四重極３（Ｑ３
）における選択で利用可能な、特定のＡｐｏＥの前駆イオンの１つ又は複数のフラグメン
トイオンを識別する能力を有する。
と関係し得る。当技術分野において周知の標準法を使用して、当業者は、四重極３（Ｑ３
）における選択で利用可能な、特定のＡｐｏＥの前駆イオンの１つ又は複数のフラグメン
トイオンを識別する能力を有する。
【0095】
ＡｐｏＥの前駆イオンがアルコール又はアミン基を含む場合、一般的に、前駆イオンの
脱水又は脱アミノに該当するフラグメントイオンがそれぞれ形成される。アルコール基を
含む前駆イオンの場合、脱水により形成されるそのようなフラグメントイオンは、前駆イ
オンから１つ又は複数の水分子の喪失により引き起こされる（すなわち、前駆イオンとフ
ラグメントイオンの間の質量対電荷の比の差異は、水分子１個の喪失では約１８であり、
又は水分子２個の喪失では約３６である、等）。アミン基を含む前駆イオンの場合、脱ア
ミノにより形成されるそのようなフラグメントイオンは、１つ又は複数のアンモニア分子
の喪失により引き起こされる（すなわち、前駆イオンとフラグメントイオンの間の質量対
電荷の比の差異は、アンモニア分子１個の喪失では約１７であり、又はアンモニア分子２
個の喪失では約３４である、等）。同様に、１つ又は複数のアルコール及びアミン基を含
む前駆イオンは通常、１つ若しくは複数の水分子及び／又は１つ若しくは複数のアンモニ
ア分子の喪失に該当するフラグメントイオンを形成する（すなわち、前駆イオンとフラグ
メントイオンの間の質量対電荷の比の差異は、水分子１個の喪失、及びアンモニア分子１
個の喪失について約３５である）。概して、前駆イオンの脱水又は脱アミノに該当するフ
ラグメントイオンは、特定の分析物に対する固有のフラグメントイオンではない。従って
、本発明の好ましい実施形態では、ＭＳ／ＭＳは、ＡｐｏＥの少なくとも１つのフラグメ
ントイオンが検出され、それが、前駆イオンから１つ若しくは複数の水分子が喪失した唯
一のもの、及び／又は１つ若しくは複数のアンモニア分子が喪失した唯一のものに該当し
ないように実施される。
脱水又は脱アミノに該当するフラグメントイオンがそれぞれ形成される。アルコール基を
含む前駆イオンの場合、脱水により形成されるそのようなフラグメントイオンは、前駆イ
オンから１つ又は複数の水分子の喪失により引き起こされる（すなわち、前駆イオンとフ
ラグメントイオンの間の質量対電荷の比の差異は、水分子１個の喪失では約１８であり、
又は水分子２個の喪失では約３６である、等）。アミン基を含む前駆イオンの場合、脱ア
ミノにより形成されるそのようなフラグメントイオンは、１つ又は複数のアンモニア分子
の喪失により引き起こされる（すなわち、前駆イオンとフラグメントイオンの間の質量対
電荷の比の差異は、アンモニア分子１個の喪失では約１７であり、又はアンモニア分子２
個の喪失では約３４である、等）。同様に、１つ又は複数のアルコール及びアミン基を含
む前駆イオンは通常、１つ若しくは複数の水分子及び／又は１つ若しくは複数のアンモニ
ア分子の喪失に該当するフラグメントイオンを形成する（すなわち、前駆イオンとフラグ
メントイオンの間の質量対電荷の比の差異は、水分子１個の喪失、及びアンモニア分子１
個の喪失について約３５である）。概して、前駆イオンの脱水又は脱アミノに該当するフ
ラグメントイオンは、特定の分析物に対する固有のフラグメントイオンではない。従って
、本発明の好ましい実施形態では、ＭＳ／ＭＳは、ＡｐｏＥの少なくとも１つのフラグメ
ントイオンが検出され、それが、前駆イオンから１つ若しくは複数の水分子が喪失した唯
一のもの、及び／又は１つ若しくは複数のアンモニア分子が喪失した唯一のものに該当し
ないように実施される。
【0096】
イオンが検出器と衝突すると、イオンは、デジタルシグナルに変換される電子のパルス
を産生する。取得されたデータは、収集されたイオンのカウントを時間に対してプロット
するコンピューターに伝達される。得られた質量クロマトグラムは、従来型のＨＰＬＣ法
で生成されるクロマトグラムと類似している。特定のイオンに対応するピーク下面積、又
はそのようなピークの振幅が測定され、そして面積又は振幅が、目的とする分析物の量と
関連付けられる。特定の実施形態では、フラグメントイオン及び／又は前駆イオンに関す
る曲線下面積又はピークの振幅が、ＡｐｏＥの量を決定するために測定される。上記のよ
うに、内部分子標準の１つ又は複数のイオンに由来するピークに基づく校正標準曲線を使
用して、所定のイオンの相対的存在量は、オリジナルの分析物の絶対量に変換され得る。
を産生する。取得されたデータは、収集されたイオンのカウントを時間に対してプロット
するコンピューターに伝達される。得られた質量クロマトグラムは、従来型のＨＰＬＣ法
で生成されるクロマトグラムと類似している。特定のイオンに対応するピーク下面積、又
はそのようなピークの振幅が測定され、そして面積又は振幅が、目的とする分析物の量と
関連付けられる。特定の実施形態では、フラグメントイオン及び／又は前駆イオンに関す
る曲線下面積又はピークの振幅が、ＡｐｏＥの量を決定するために測定される。上記のよ
うに、内部分子標準の１つ又は複数のイオンに由来するピークに基づく校正標準曲線を使
用して、所定のイオンの相対的存在量は、オリジナルの分析物の絶対量に変換され得る。
【0097】
下記の実施例は、本発明を説明する役目を果たす。これらの実施例には、本方法の範囲
に制限を設けるような意図は一切存在しない。
に制限を設けるような意図は一切存在しない。
【実施例0098】
実施例１：マススペクトロメトリーによるＡｐｏＥ表現型の決定
試薬の概要：表１
試薬の概要：表１
【0099】
【表1】
【0100】
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイによりＣＳＦアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）アイソフォ
ームを同定すれば、ＡｐｏＥにおける３つの異なるアイソフォームが判明し、次に表現型
を推測するのに使用可能である。アポリポタンパク質Ｅタンパク質（ＡｐｏＥ２、Ａｐｏ
Ｅ３、及びＡｐｏＥ４）をコードする３つの対立遺伝子が存在し、それらは共優性的に発
現して６つの固有の表現型；ＡｐｏＥ２／Ｅ２、ＡｐｏＥ２／Ｅ３、ＡｐｏＥ２／Ｅ４、
ＡｐｏＥ３／Ｅ３、ＡｐｏＥ３／Ｅ４、及びＡｐｏＥ４／Ｅ４をもたらす。
ームを同定すれば、ＡｐｏＥにおける３つの異なるアイソフォームが判明し、次に表現型
を推測するのに使用可能である。アポリポタンパク質Ｅタンパク質（ＡｐｏＥ２、Ａｐｏ
Ｅ３、及びＡｐｏＥ４）をコードする３つの対立遺伝子が存在し、それらは共優性的に発
現して６つの固有の表現型；ＡｐｏＥ２／Ｅ２、ＡｐｏＥ２／Ｅ３、ＡｐｏＥ２／Ｅ４、
ＡｐｏＥ３／Ｅ３、ＡｐｏＥ３／Ｅ４、及びＡｐｏＥ４／Ｅ４をもたらす。
【0101】
各ＡｐｏＥ表現型を判定するために、タンパク質のトリプシン消化を実施し、そして固
有のペプチドを、各タンパク質アイソフォームを識別する代用物として使用する。Ａｐｏ
Ｅ２アイソフォーム及びＡｐｏＥ４アイソフォームの両方について固有のペプチドが存在
する。ＡｐｏＥ３アイソフォームは、ＡｐｏＥ２及びＡｐｏＥ３アイソフォーム間の共通
するペプチド、並びにＡｐｏＥ３及びＡｐｏＥ４アイソフォーム間の共通するペプチドを
使用して決定する。各アイソフォームに対する内部標準を、リテンションタイム参照ポイ
ントとして役に立つように各サンプル中にスパイクする。
有のペプチドを、各タンパク質アイソフォームを識別する代用物として使用する。Ａｐｏ
Ｅ２アイソフォーム及びＡｐｏＥ４アイソフォームの両方について固有のペプチドが存在
する。ＡｐｏＥ３アイソフォームは、ＡｐｏＥ２及びＡｐｏＥ３アイソフォーム間の共通
するペプチド、並びにＡｐｏＥ３及びＡｐｏＥ４アイソフォーム間の共通するペプチドを
使用して決定する。各アイソフォームに対する内部標準を、リテンションタイム参照ポイ
ントとして役に立つように各サンプル中にスパイクする。
【0102】
ＣＳＦ ＡｐｏＥサンプルを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｑｕａｎｔｉｖａ三連四
重極型質量分析装置に接続したＴｈｅｒｍｏ Ａｒｉａ Ｃｏｈｅｓｉｖｅ ＴＬＸ－４
大流量ＬＣを用いたタンデム型質量分析を使用して分析する。データは複数反応モニタリ
ング（ＭＲＭ）によりモニタリングし、そしてＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＬＣ Ｑｕ
ａｎデータ分析ソフトウェアを使用して分析する。
重極型質量分析装置に接続したＴｈｅｒｍｏ Ａｒｉａ Ｃｏｈｅｓｉｖｅ ＴＬＸ－４
大流量ＬＣを用いたタンデム型質量分析を使用して分析する。データは複数反応モニタリ
ング（ＭＲＭ）によりモニタリングし、そしてＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＬＣ Ｑｕ
ａｎデータ分析ソフトウェアを使用して分析する。
【0103】
様々なＡｐｏＥ対立遺伝子を同定するすべての質量対電荷の比（ｍ／ｚ）をいくつかの
図に記載し、下記の表２にまとめる。
図に記載し、下記の表２にまとめる。
【0104】
【表2】
【0105】
予測値：ＣＳＦ中のアポリポタンパク質Ｅ：２．８４～７．２４μｇ／ｍＬ；血清中の
アポリポタンパク質Ｅ：２０．０７～１０１．６８μｇ／ｍＬ。
アポリポタンパク質Ｅ：２０．０７～１０１．６８μｇ／ｍＬ。
【0106】
各品質管理レベルについて５回の技術的反復実験を、５日間にわたり、各日、低、中、
及び高レベルの順番で測定した。
及び高レベルの順番で測定した。
【0107】
ＣＳＦ低レベル品質管理：１．２μｇ／ｍＬ
アポリポタンパク質Ｅ：
平均：１．１６～１．３７
ＳＤ：０．０３～０．１２
ＣＶ（％）：２．２７～１０．３５％
回収率（％）：９７．００～１０４．００％
アポリポタンパク質Ｅ：
平均：１．１６～１．３７
ＳＤ：０．０３～０．１２
ＣＶ（％）：２．２７～１０．３５％
回収率（％）：９７．００～１０４．００％
【0108】
ＣＳＦ中レベル品質管理：３．０μｇ／ｍＬ
アポリポタンパク質Ｅ：
平均：２．６８～３．３７
ＳＤ：０．０５～０．３３
ＣＶ（％）：１．７４～１０．５９％
回収率（％）：８９．２７～１１２．４０％
アポリポタンパク質Ｅ：
平均：２．６８～３．３７
ＳＤ：０．０５～０．３３
ＣＶ（％）：１．７４～１０．５９％
回収率（％）：８９．２７～１１２．４０％
【0109】
ＣＳＦ高レベル品質管理：１５．０μｇ／ｍＬ
アポリポタンパク質Ｅ：
平均：１３．３８～１６．５４
ＳＤ：０．４０～１．６５
ＣＶ（％）：４．７１～１１．３６％
回収率（％）：８９．２０～１１０．２９％
アポリポタンパク質Ｅ：
平均：１３．３８～１６．５４
ＳＤ：０．４０～１．６５
ＣＶ（％）：４．７１～１１．３６％
回収率（％）：８９．２０～１１０．２９％
【0110】
正確度：ＡＰＯＥ遺伝子型既知（分析法：制限長さ多形性分析法（ＲＬＰＭ））の患者
サンプル２０例を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析した。ＡｐｏＥ表現型を次に既知遺伝子
型と比較した。下記の表３に示すように、各患者サンプルについて、遺伝子型と表現型の
間に１００％の一致が認められた。
サンプル２０例を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析した。ＡｐｏＥ表現型を次に既知遺伝子
型と比較した。下記の表３に示すように、各患者サンプルについて、遺伝子型と表現型の
間に１００％の一致が認められた。
【0111】
【表3】
【0112】
凍結－解凍安定性：スパイクされた６つの表現型を４つの等しい一定分量に分割し、そ
れを分析することにより、凍結解凍分析を実施した。各表現型に関する一定分量を、４つ
すべてについて－９０～－６０℃で凍結した。２～４番目の一定分量を、１回の凍結－解
凍用として、１８～２５℃の周囲温度において解凍し、そして凍結した。３～４番目の一
定分量を、２回の凍結－解凍用として、１８～２５℃の周囲温度において解凍し、そして
凍結した。４番目の一定分量を、次に３回の凍結－解凍用として、１８～２５℃の周囲温
度において解凍し、そして凍結した。
れを分析することにより、凍結解凍分析を実施した。各表現型に関する一定分量を、４つ
すべてについて－９０～－６０℃で凍結した。２～４番目の一定分量を、１回の凍結－解
凍用として、１８～２５℃の周囲温度において解凍し、そして凍結した。３～４番目の一
定分量を、２回の凍結－解凍用として、１８～２５℃の周囲温度において解凍し、そして
凍結した。４番目の一定分量を、次に３回の凍結－解凍用として、１８～２５℃の周囲温
度において解凍し、そして凍結した。
【0113】
最終的に、アリコートすべてを１８～２５℃の周囲温度で解凍し、そして技術的に三連
で分析した。凍結解凍分析は、３種類の凍結解凍サイクルに関わるデータを含有する。Ａ
ｐｏＥ表現型は、最大３回の凍結解凍サイクルに対して許容される安定性を有する。表４
：
で分析した。凍結解凍分析は、３種類の凍結解凍サイクルに関わるデータを含有する。Ａ
ｐｏＥ表現型は、最大３回の凍結解凍サイクルに対して許容される安定性を有する。表４
：
【0114】
【表4】
【0115】
抽出後のサンプルの安定性：ベースライン値としてサンプル抽出した日と同じ日に、１
０サンプルを分析した。翌日、同一サンプルを再注入して、ベースライン値と対比分析し
た。このアッセイでは、２回の注入に十分なサンプルが得られる。ＡｐｏＥは、ＣＴＣオ
ートサンプラーのＣスタック内、２～８℃で、少なくとも１日間の抽出後サンプル安定性
を示す。表５：
０サンプルを分析した。翌日、同一サンプルを再注入して、ベースライン値と対比分析し
た。このアッセイでは、２回の注入に十分なサンプルが得られる。ＡｐｏＥは、ＣＴＣオ
ートサンプラーのＣスタック内、２～８℃で、少なくとも１日間の抽出後サンプル安定性
を示す。表５：
【0116】
【表5】
【0117】
室温安定性：サンプルは、１８～２５℃で最長７日間安定である。表６：
【0118】
【表6】
【0119】
冷蔵安定性：サンプルは、２～８℃で最長７日間安定である。表７：
【0120】
【表7】
【0121】
凍結安定性：サンプルは－３０～－１０℃で少なくとも３１日間安定である。表８：
【0122】
【表8】
【0123】
妨害試験
合否基準：潜在的妨害物質に起因する差異は、≦２ＳＤであるべきである、又は２０％
ＣＶは許容されるとみなされる。
合否基準：潜在的妨害物質に起因する差異は、≦２ＳＤであるべきである、又は２０％
ＣＶは許容されるとみなされる。
【0124】
溶血による妨害：患者プール品６例を、ヘモグロビン（Ｓｉｇｍａ社カタログ番号Ｈ７
３７９）でスパイクし、そしてベースライン、小規模、中規模、及び大規模な溶血による
妨害について三連で分析した。１０ｍｇ／ｍＬのヘモグロビン溶液を「大規模な」妨害に
対して使用した。中規模及び小規模の妨害用として、１０ｍｇ／ｍＬ溶液を、１０ｍＭの
ＢＳでそれぞれ１：１０及び１：２０稀釈した。
３７９）でスパイクし、そしてベースライン、小規模、中規模、及び大規模な溶血による
妨害について三連で分析した。１０ｍｇ／ｍＬのヘモグロビン溶液を「大規模な」妨害に
対して使用した。中規模及び小規模の妨害用として、１０ｍｇ／ｍＬ溶液を、１０ｍＭの
ＢＳでそれぞれ１：１０及び１：２０稀釈した。
【0125】
血清由来のアポリポタンパク質Ｅの起こり得る汚染のために、いずれの溶血レベルも許
容されない。表９：
容されない。表９：
【0126】
【表9】
【0127】
脂肪血症による妨害：患者プール品６例を、イントラリピド（Ｓｉｇｍａ社カタログ番
号Ｉ１４１）でスパイクし、そしてベースライン、小規模、中規模、及び大規模な脂肪血
症による妨害について三連で分析した。１：５希釈（イントラリピド：１０ｍＭのＰＢＳ
）を、「大規模な」妨害用として使用した。中規模及び小規模の妨害用として、１：５溶
液を、１０ｍＭのＰＢＳで、それぞれ１：１０及び１：２０稀釈した。ＡｐｏＥは、ＣＳ
Ｆサンプルの脂肪血症の程度について、そのすべてが許容される。表１０：
号Ｉ１４１）でスパイクし、そしてベースライン、小規模、中規模、及び大規模な脂肪血
症による妨害について三連で分析した。１：５希釈（イントラリピド：１０ｍＭのＰＢＳ
）を、「大規模な」妨害用として使用した。中規模及び小規模の妨害用として、１：５溶
液を、１０ｍＭのＰＢＳで、それぞれ１：１０及び１：２０稀釈した。ＡｐｏＥは、ＣＳ
Ｆサンプルの脂肪血症の程度について、そのすべてが許容される。表１０：
【0128】
【表10】
【0129】
ビリルビンによる妨害：患者プール品６例を、ビリルビン（Ｓｉｇｍａ社カタログ番号
Ｂ４１２６）でスパイクし、そしてベースライン、小規模、中規模、及び大規模な黄疸に
よる妨害について三連で分析した。「大規模な」妨害用として１ｍｇ／ｍＬのビリルビン
溶液を使用した。１ｍｇ／ｍＬ溶液を、中規模及び小規模の妨害用として、１０ｍＭのＰ
ＢＳでそれぞれ１：１０及び１：２０稀釈した。ＡｐｏＥは、ＣＳＦサンプルの黄疸の程
度について、そのいずれも許容される。表１１：
Ｂ４１２６）でスパイクし、そしてベースライン、小規模、中規模、及び大規模な黄疸に
よる妨害について三連で分析した。「大規模な」妨害用として１ｍｇ／ｍＬのビリルビン
溶液を使用した。１ｍｇ／ｍＬ溶液を、中規模及び小規模の妨害用として、１０ｍＭのＰ
ＢＳでそれぞれ１：１０及び１：２０稀釈した。ＡｐｏＥは、ＣＳＦサンプルの黄疸の程
度について、そのいずれも許容される。表１１：
【0130】
【表11】
【0131】
イオン抑制：患者サンプル１０例を抽出した。サンプル１０例を、分析カラムを通じて
注入した（injected）一方、ＡｐｏＥの消化ペプチド混合物をポストカラム注入した（in
fused）。ＡｐｏＥの内部標準が溶出したときに、ＡｐｏＥの全イオンクロマトグラム（
ＴＩＣ）が、シグナル強度について≧１５％の減少を示した場合、アッセイにおいてイオ
ン抑制が存在すると判断される。ＡｐｏＥの消化されたペプチドのＴＩＣは、分析物の溶
出時に、勾配内で抑制を示さなかった。ＴＩＣシグナル強度は一定であり、シグナル強度
の差異は≦１５％であることを示しており、許容されるアッセイパラメーターの範囲内で
ある。
注入した（injected）一方、ＡｐｏＥの消化ペプチド混合物をポストカラム注入した（in
fused）。ＡｐｏＥの内部標準が溶出したときに、ＡｐｏＥの全イオンクロマトグラム（
ＴＩＣ）が、シグナル強度について≧１５％の減少を示した場合、アッセイにおいてイオ
ン抑制が存在すると判断される。ＡｐｏＥの消化されたペプチドのＴＩＣは、分析物の溶
出時に、勾配内で抑制を示さなかった。ＴＩＣシグナル強度は一定であり、シグナル強度
の差異は≦１５％であることを示しており、許容されるアッセイパラメーターの範囲内で
ある。
【0132】
総ＡｐｏＥの定量分析：ＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイによるＣＳＦアポリポタンパク質Ｅ
（ＡｐｏＥ）は、ＣＳＦ内の総ＡｐｏＥレベルを測定する。総ＡｐｏＥを測定するために
、タンパク質のトリプシン消化を実施し、そして３つのアイソフォーム（ＡｐｏＥ２、Ａ
ｐｏＥ３、及びＡｐｏＥ４）すべてにおいて、その固有のペプチドを、総ＡｐｏＥタンパ
ク質濃度を測定するための代用物として使用する。ＣＳＦ ＡｐｏＥサンプルを、Ｔｈｅ
ｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｑｕａｎｔｉｖａ三連四重極型質量分析装置に接続したＴｈｅｒ
ｍｏ Ａｒｉａ Ｃｏｈｅｓｉｖｅ ＴＬＸ－４大流量ＬＣを用いたタンデム型質量分析
を使用して分析する。データを、複数反応モニタリング（ＭＲＭ）によりモニタリングし
、そしてＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＬＣ Ｑｕａｎデータ分析ソフトウェアを使用し
て分析する。下記のイオンについて測定した：
（ＡｐｏＥ）は、ＣＳＦ内の総ＡｐｏＥレベルを測定する。総ＡｐｏＥを測定するために
、タンパク質のトリプシン消化を実施し、そして３つのアイソフォーム（ＡｐｏＥ２、Ａ
ｐｏＥ３、及びＡｐｏＥ４）すべてにおいて、その固有のペプチドを、総ＡｐｏＥタンパ
ク質濃度を測定するための代用物として使用する。ＣＳＦ ＡｐｏＥサンプルを、Ｔｈｅ
ｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｑｕａｎｔｉｖａ三連四重極型質量分析装置に接続したＴｈｅｒ
ｍｏ Ａｒｉａ Ｃｏｈｅｓｉｖｅ ＴＬＸ－４大流量ＬＣを用いたタンデム型質量分析
を使用して分析する。データを、複数反応モニタリング（ＭＲＭ）によりモニタリングし
、そしてＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＬＣ Ｑｕａｎデータ分析ソフトウェアを使用し
て分析する。下記のイオンについて測定した：
【0133】
【表12】
【0134】
ＣＳＦ ＡｐｏＥの検出限界（ＬＯＤ）：０．３３μｇ／ｍＬ。ＣＳＦ ＡｐｏＥの定
量限界は１．０μｇ／ｍＬとして決定される。ＣＳＦ ＡｐｏＥのＬＯＢ：０．３μｇ／
ｍＬ。
量限界は１．０μｇ／ｍＬとして決定される。ＣＳＦ ＡｐｏＥのＬＯＢ：０．３μｇ／
ｍＬ。
【0135】
本明細書に記載又は引用する文献、特許、及び特許出願、並びにその他のすべての文書
及び電子的に利用可能な情報の内容は、個々の公開資料が参照として組み込まれるものと
特別及び個別に示唆されたのと同程度に、参照により本明細書にその全体が援用される。
出願者らは、任意のそのような文献、特許、特許出願、又はその他の物理的及び電子的な
文書に由来する任意の及びすべての資料及び情報を本出願に物理的に組み込む権利を留保
する。
及び電子的に利用可能な情報の内容は、個々の公開資料が参照として組み込まれるものと
特別及び個別に示唆されたのと同程度に、参照により本明細書にその全体が援用される。
出願者らは、任意のそのような文献、特許、特許出願、又はその他の物理的及び電子的な
文書に由来する任意の及びすべての資料及び情報を本出願に物理的に組み込む権利を留保
する。
【0136】
本明細書に事例的に記載する方法は、本明細書に特に開示されない、任意の１つの要素
又は複数の要素、１つの制限又は複数の制限が存在しなくても、好適に実践できる。従っ
て、例えば、用語「含む〔comprising〕」、「含む〔including〕」、「含有する〔conta
ining〕」等は、拡大的及び非限定的に解釈されなければならない。更に、本明細書で採
用されている用語及び表現は、制限の用語としてではなく、説明の用語として使用されて
おり、そのような用語及び表現の使用において、提示及び記載された特性の任意の等価物
又はその一部分を排除する意図は存在しない。様々な修正が、主張された本発明の範囲内
で可能であると認識される。従って、本発明は、好ましい実施形態及び任意選択的な特性
により特別に開示されているが、本明細書に開示する本発明に取り込まれた本発明の修正
及び変更は、当業者により実施可能であるものと理解し、またそのような修正及び変更は
、本発明の範囲内であるとみなされるものと理解すべきである。
又は複数の要素、１つの制限又は複数の制限が存在しなくても、好適に実践できる。従っ
て、例えば、用語「含む〔comprising〕」、「含む〔including〕」、「含有する〔conta
ining〕」等は、拡大的及び非限定的に解釈されなければならない。更に、本明細書で採
用されている用語及び表現は、制限の用語としてではなく、説明の用語として使用されて
おり、そのような用語及び表現の使用において、提示及び記載された特性の任意の等価物
又はその一部分を排除する意図は存在しない。様々な修正が、主張された本発明の範囲内
で可能であると認識される。従って、本発明は、好ましい実施形態及び任意選択的な特性
により特別に開示されているが、本明細書に開示する本発明に取り込まれた本発明の修正
及び変更は、当業者により実施可能であるものと理解し、またそのような修正及び変更は
、本発明の範囲内であるとみなされるものと理解すべきである。
【0137】
本発明は、本明細書において広範且つ全体的に記載されている。一般的な開示の範囲に
含まれるより狭い種及び亜属のグルーピングのそれぞれも、本方法の一部をなす。これに
は、属から主題のいずれかを除去する条件又は否定的限定を伴う方法の一般的な説明が、
切り取られた題材が本明細書において特に列挙されるか、又はされないかを問わず含まれ
る。
含まれるより狭い種及び亜属のグルーピングのそれぞれも、本方法の一部をなす。これに
は、属から主題のいずれかを除去する条件又は否定的限定を伴う方法の一般的な説明が、
切り取られた題材が本明細書において特に列挙されるか、又はされないかを問わず含まれ
る。
【0138】
その他の実施形態は、下記の特許請求の範囲内に含まれる。更に、方法の特徴又は態様
が、マーカッシュ群によって記載されている場合、当業者は、発明は、これにより、マー
カッシュ群の個々のメンバー又はメンバーのサブグループのいずれについても記載されて
いるものと認識する。
が、マーカッシュ群によって記載されている場合、当業者は、発明は、これにより、マー
カッシュ群の個々のメンバー又はメンバーのサブグループのいずれについても記載されて
いるものと認識する。
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【手続補正書】
【提出日】2024-01-15
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
サンプル中のアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）表現型を決定する方法であって、
（ａ）精製前に、ＡｐｏＥを消化すること、
（ｂ）前記サンプル中のＡｐｏＥを精製すること、
（ｃ）前記サンプル中のＡｐｏＥをイオン化させて、ＡｐｏＥの１つ又は複数のイオンを生成すること、
（ｄ）マススペクトロメトリーにより、ステップ（ｃ）に由来するイオンを検出すること、ならびに、
（ｅ）前記サンプル中に存在するＡｐｏＥ対立遺伝子の表現型が、ステップ（ｄ）において検出されたイオンから決定されること、ここで決定される表現型がＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４、またはＡｐｏＥ４／ＡｐｏＥ４であること、
を含む、方法。
（ａ）精製前に、ＡｐｏＥを消化すること、
（ｂ）前記サンプル中のＡｐｏＥを精製すること、
（ｃ）前記サンプル中のＡｐｏＥをイオン化させて、ＡｐｏＥの１つ又は複数のイオンを生成すること、
（ｄ）マススペクトロメトリーにより、ステップ（ｃ）に由来するイオンを検出すること、ならびに、
（ｅ）前記サンプル中に存在するＡｐｏＥ対立遺伝子の表現型が、ステップ（ｄ）において検出されたイオンから決定されること、ここで決定される表現型がＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４、またはＡｐｏＥ４／ＡｐｏＥ４であること、
を含む、方法。
【請求項2】
前記精製することが、液体クロマトグラフィーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記液体クロマトグラフィーが、高性能液体クロマトグラフィーを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記精製することが、固相抽出法を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記イオン化が、エレクトロスプレーイオン化を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記イオン化が、ポジティブモードでイオン化することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
内部標準を添加することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記内部標準が、同位体で標識されている、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記サンプルが、脳脊髄液である、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記サンプルが、血漿又は血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
消化が、トリプシン消化を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
消化が、マイクロウェーブ消化を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ２表現型が、６６５．７２±０．５、８３５．９３±０．５、８６６．９９±０．５、及び９８２．０８±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記ＡｐｏＥ２／ＡｐｏＥ４表現型が、３７４．４２±０．５、５０２．５５±０．５、６４９．７４±０．５、６６５．７２±０．５、８３５．９３±０．５、８６６．９９±０．５、８９２．９６±０．５、及び９８２．０８±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ３表現型が、３７４．４２±０．５、５０２．５５±０．５、８６６．９９±０．５、及び９８２．０８±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記ＡｐｏＥ３／ＡｐｏＥ４表現型が、３７４．４２±０．５、５０２．５５±０．５、６４９．７４±０．５、８６６．９９±０．５、８９２．９６±０．５、及び９８２．０８±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
前記ＡｐｏＥ４／ＡｐｏＥ４表現型が、３７４．４２±０．５、５０２．５５±０．５、６４９．７４±０．５、及び８９２．９６±０．５からなる群から選択される質量／電荷の比を有するフラグメントイオンの存在により決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
１つ又は二つのＡｐｏＥ４対立遺伝子の存在が、アルツハイマー病発症リスクの増加を示唆する、請求項１に記載の方法。