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▶ メニスマート セラピューティクス， インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024050549
(43)【公開日】2024-04-10
(54)【発明の名称】二重特異性Ｔ細胞誘導体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240403BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240403BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240403BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20240403BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240403BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240403BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240403BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240403BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240403BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240403BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240403BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240403BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240403BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240403BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240403BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C12N15/12 ZNA
C12N15/13
C12N15/864 100Z
C07K19/00
C07K14/705
C07K16/28
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 N
A61P31/00
A61P35/00
A61P37/06
【審査請求】有
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023219441
(22)【出願日】2023-12-26
(62)【分割の表示】P 2020565337の分割
【原出願日】2019-05-23
(31)【優先権主張番号】62/675,208
(32)【優先日】2018-05-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】520115635
【氏名又は名称】メニスマート セラピューティクス， インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＭＡＮＹＳＭＡＲＴ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】ホワン， シン－イ
(72)【発明者】
【氏名】リャオ， チェン ハオ
(72)【発明者】
【氏名】リン， チェン－ミン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、又は免疫調節細胞などの除去など、ＡＤＣＣを必要とする分野におけるモノクローナル抗体適用に関連する問題点を克服するための新規融合タンパク質を提供する。
【解決手段】融合タンパク質の一例は、ヒトＣＤ３のエピトープ又はそのフラグメントに特異的に結合する抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合性フラグメントに融合されたヒトＣＤ１６Ａの高親和性バリアントの細胞外ドメインを好ましくは含む。
【選択図】図１Ａ
【解決手段】融合タンパク質の一例は、ヒトＣＤ３のエピトープ又はそのフラグメントに特異的に結合する抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合性フラグメントに融合されたヒトＣＤ１６Ａの高親和性バリアントの細胞外ドメインを好ましくは含む。
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトＣＤ１６Ａの細胞外ドメイン；及び
ヒトＣＤ３のエピトープ又はそのフラグメントに特異的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメント
を含む融合タンパク質。
ヒトＣＤ３のエピトープ又はそのフラグメントに特異的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメント
を含む融合タンパク質。
【請求項2】
前記ＣＤ１６Ａが高親和性ＣＤ１６Ａバリアントである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
ＣＤ１６Ａの細胞外ドメインが配列番号２のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記抗体又はその抗原結合性フラグメントが抗ＣＤ３単鎖可変フラグメントである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記抗体又はその抗原結合性フラグメントが配列番号４のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
ＣＤ１６Ａの細胞外ドメインが前記抗体又はその抗原結合性フラグメントに直接連結する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
分泌シグナルペプチドをさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
前記分泌シグナルペプチドが配列番号６のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を有する、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
タンパク質精製タグをさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
配列番号８のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項11】
請求項１に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項12】
ＣＤ１６Ａの細胞外ドメインをコードするフラグメントを含み、配列番号１の核酸配列又はその実質的に同一の配列を有する、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項13】
前記抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードするフラグメントを含み、配列番号３の核酸配列又はその実質的に同一の配列を有する、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項14】
分泌シグナルペプチドをコードするフラグメントをさらに含み、配列番号５の核酸配列又はその実質的に同一の配列を有する、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項15】
タンパク質精製タグをコードするフラグメントをさらに含む、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項16】
配列番号７の核酸配列又はその実質的に同一の配列を有する、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項17】
アデノ随伴ウイルスベクターに含まれている、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項18】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項19】
前記ポリヌクレオチドがアデノ随伴ウイルスベクターに含まれている、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項20】
治療有効量の請求項１に記載の融合タンパク質を含み、任意選択で薬学的に許容できる担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項21】
１つ又は複数の抗体をさらに含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項22】
それを必要とする対象において抗体依存性細胞毒性を誘導するための医薬の製造における請求項２０に記載の医薬組成物の使用。
【請求項23】
それを必要とする対象において抗体依存性細胞毒性を誘導するための医薬の製造における請求項２１に記載の医薬組成物の使用。
【請求項24】
それを必要とする対象においてがん、感染症、自己免疫疾患、移植片対宿主病、又は移植後リンパ増殖性疾患を治療するための医薬の製造における請求項２０に記載の医薬組成物の使用。
【請求項25】
それを必要とする対象においてがん、感染症、自己免疫疾患、移植片対宿主病、又は移植後リンパ増殖性疾患を治療するための医薬の製造における請求項２１に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
[0001]本開示は、融合タンパク質、特に、ＣＤ１６Ａ－二重特異性Ｔ細胞誘導体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ（ＢｉＴＥ））及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
[0002]治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、最近最も急速に成長しているクラスの薬物の１つになっており、がん、感染症から自己免疫疾患まで、広範囲の適応症の治療に対して承認されている（Ａｌｍａｇｒｏら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８、１７５１ （２０１７））。腫瘍学における使用が承認されている大部分のｍＡｂは、いわゆる直接ターゲティングｍＡｂ、例えばリツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ２０ ｍＡｂ）であり、これらのｍＡｂは腫瘍細胞を直接的に標的とするように設計されている。このタイプのｍＡｂは、通常、ｅｘ ｖｉｖｏで作製され、患者に受動的に注入されるが、この場合、これらのｍＡｂは定着腫瘍又は残存腫瘍に対して作用し、それによって様々なＦｃ受容体媒介性エフェクター経路を活性化して標的細胞を死滅させる。化学療法と組み合わせた場合、これらの治療用ｍＡｂは、濾胞性リンパ腫（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、９、１３１～１４０ （２０１７）及び多発性骨髄腫（ｖａｎ ｄｅ Ｄｏｎｋら、Ｂｌｏｏｄ、１３１、１３～２９ （２０１８））の臨床的有効性の例として、それぞれ抗ＣＤ２０及び抗ＣＤ３８を用いて血液悪性腫瘍に優れた結果をもたらした。代わりに、抗ＣＴＬＡ－４（細胞毒性Ｔリンパ球抗原４）、抗ＰＤ－１（プログラム細胞死－１）、及び抗ＰＤ－Ｌ１（プログラム死－リガンド１）などの承認された免疫調節ｍＡｂは、免疫チェックポイントを遮断して抗腫瘍免疫応答を再活性化するように設計されているが（Ｋ．Ｃｈｉｎら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２８、１６５８～１６６６ （２０１７））、これらの免疫調節ｍＡｂはまた、細胞を取り除く直接ターゲティングｍＡｂとしても機能し得る（Ｈａｍｉｌｔｏｎ及びＲａｔｈ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ、１７、５１５～５２３ （２０１７））。
【0003】
[0003]直接ターゲティング治療用ｍＡｂの作用機序は、抗体の様々な自然機能：中和、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、又は補体依存性細胞毒性に起因する（Ｓｕｚｕｋｉら、Ｊ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐａｔｈｏｌ、２８、１３３～１３９ （２０１５））。それぞれの作用機序が臨床的有効性にどの程度寄与するかは明らかではない。
【0004】
[0004]したがって、ｍＡｂの治療的有効性を改善し、様々な分野におけるｍＡｂの適用を促進するための新規の方法の開発が必要とされている。本開示は、これらの必要性及び他の必要性に対処した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
[0005]本開示は、疾患治療及び他の分野における、特に、例えば腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、又は免疫調節細胞などの除去などＡＤＣＣを必要とする分野におけるｍＡｂ適用に関連する現在の問題点を克服するための新規二重特異性Ｔ細胞誘導体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
[0006]本開示は、
ヒトＣＤ１６Ａの細胞外ドメイン；及び
ヒトＣＤ３のエピトープ又はそのフラグメントに特異的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメント
を含む融合タンパク質を提供する。
ヒトＣＤ１６Ａの細胞外ドメイン；及び
ヒトＣＤ３のエピトープ又はそのフラグメントに特異的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメント
を含む融合タンパク質を提供する。
【0007】
[0007]本開示はまた、本明細書に開示した融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0008】
[0008]本開示はまた、本明細書に開示したポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
【0009】
[0009]本開示はまた、治療有効量の本明細書に開示した融合タンパク質を含み、任意選択で薬学的に許容できる担体又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【0010】
[0010]本開示はまた、それを必要とする対象において抗体依存性細胞毒性を誘導するための医薬の製造における本明細書に開示した医薬組成物の使用を提供する。
【0011】
[0011]本開示は以下の項目において詳細に説明されている。本開示の他の特徴、目的及び利点は、詳細な説明及び特許請求の範囲で確認することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1A】ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの遺伝子構築を示す図である。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）シャトルプラスミドにクローニングされたｈａＣＤ１６Ａ－ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞誘導体の遺伝子構築物を示す図である。Ｈ：６×ヒスチジンタグ；ＩＴＲ：ＡＡＶの逆方向末端反復配列；Ｓ：分泌シグナル；ＷＰＲＥ：ウッドチャックＢ型肝炎ウイルスの転写後調節エレメント。
【図1B】ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの遺伝子構築を示す図である。ヒト高親和性ＣＤ１６Ａ（ｈａＣＤ１６Ａ）の細胞外ドメイン（ｅｄＣＤ１６）及びヒトＣＤ３に対する単鎖抗体（抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ）のコード配列を遺伝子合成によって同一コードフレーム内で融合させた図である。
【図1C】ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの遺伝子構築を示す図である。１３４１ｂｐヌクレオチドの合成遺伝子は４４６アミノ酸の融合タンパク質をコードしている図である。
【図1D-1】ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの遺伝子構築を示す図である。ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのスキームの図である。
【図1D-2】ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの遺伝子構築を示す図である。ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのスキームの図である。
【図1D-3】ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの遺伝子構築を示す図である。ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのスキームの図である。
【図1D-4】ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの遺伝子構築を示す図である。ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのスキームの図である。
【図2A】ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのＴ細胞及び免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体被覆腫瘍細胞への結合を示す図である。ＩｇＧ抗体被覆細胞へのｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ結合の分解的な方略を示す図である。
【図2B】ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのＴ細胞及び免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体被覆腫瘍細胞への結合を示す図である。腫瘍細胞での抗原発現を示す図である。
【図2C】ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのＴ細胞及び免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体被覆腫瘍細胞への結合を示す図である。ＩｇＧ抗体被覆腫瘍細胞へのｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの結合を示す図である。
【図2D】ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのＴ細胞及び免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体被覆腫瘍細胞への結合を示す図である。Ｔ細胞へのｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ結合の分解的な方略を示す図である。
【図2E】ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのＴ細胞及び免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体被覆腫瘍細胞への結合を示す図である。Ｔ細胞へのｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ結合を示す図である。
【図3】Ｔ細胞の存在下で、抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ、リツキシン（Ｒｉｔｕｘｉｎ）（登録商標））及びｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ単独で、又は組合せで処理することによるＣＤ２０発現細胞株の死滅に対する効果を示す図である。
【図4】Ｔ細胞の存在下で、抗ＥＧＦＲ抗体（セツキシマブ、エルビタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）（登録商標））及びｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ単独で、又は組合せで処理することによる上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）発現細胞株の死滅に対する効果を示す図である。
【図5】Ｔ細胞の存在下で、抗ＨＥＲ２抗体（トラスツズマブ、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（登録商標））及びｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのみで、又は組合せで処理することによるヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）発現細胞株の死滅に対する効果を示す図である。
【図6】リツキシマブ及びｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥで処理されたＣＤ２０発現細胞株の死滅に対する血漿の効果を示す図である。
【図7A】ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥでパルスされたＣＤ１６－γ９δ２Ｔ細胞とＣＤ１６＋γ９δ２Ｔ細胞の間のＩｇＧ抗体媒介性細胞死滅の比較研究を示す図である。
【図7B】ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥでパルスされたＣＤ１６－γ９δ２Ｔ細胞とＣＤ１６＋γ９δ２Ｔ細胞の間のＩｇＧ抗体媒介性細胞死滅の比較研究を示す図である。
【図8】抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ）及びｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥでＴ細胞増殖培養物を処理することによりＴ細胞増殖培養物から悪性Ｂ細胞を除去することに対する効果を示す図である。
【図9】Ｔ細胞の存在下で、抗潜伏膜タンパク質１（ＬＭＰ１）抗体及びｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ単独で、又は組合せでＥＢＶ感染細胞株を処理することによるＥＢＶ感染細胞株の死滅に対する効果を示す図である。
【図10】Ｔ細胞の存在下で、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ単独で、又は組合せでＰＤ－Ｌ１発現細胞株を処理することによるＰＤ－Ｌ１発現細胞株の死滅に対する効果を示す図である。
【図11】Ｔ細胞の存在下で、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥとリツキシマブの組合せ療法、及びリツキシマブの単剤療法のがん細胞増殖の軽減に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す図である。
【図12】ＡＡＶ媒介型ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ遺伝子導入後のｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのｉｎ ｖｉｖｏ産生を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
[0024]本開示は、
Ｆｃガンマ受容体又はそのリガンド結合性フラグメント；並びに
Ｔ細胞の表面抗原のエピトープ又はそのフラグメントに特異的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記表面抗原が抗体依存性細胞媒介性細胞毒性を誘導すること、及び／又はＴ細胞を活性化することが可能である、抗体又はその抗原結合性フラグメント
を含む融合タンパク質を提供する。
Ｆｃガンマ受容体又はそのリガンド結合性フラグメント；並びに
Ｔ細胞の表面抗原のエピトープ又はそのフラグメントに特異的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記表面抗原が抗体依存性細胞媒介性細胞毒性を誘導すること、及び／又はＴ細胞を活性化することが可能である、抗体又はその抗原結合性フラグメント
を含む融合タンパク質を提供する。
【0014】
[0025]特に、本開示による融合タンパク質は、標的細胞とＴ細胞の間のブリッジとして作用する、２つの抗原／リガンドに対する二重特異性親和性が提供される二重特異性Ｔ細胞誘導体として知られている。
【0015】
[0026]好ましくは、融合タンパク質はＡＤＣＣ免疫応答を活性化し、この活性化により、Ｔ細胞は、それらの表面で腫瘍由来抗原又は病原体由来抗原を発現する抗体被覆標的細胞を認識し死滅させることができる。
【0016】
[0027]他の治療手段、例えば化学療法などと組み合わせることなく、がんを治療するために治療用ｍＡｂの直接ターゲッティングを使用する単独療法は、一般に、治療効果が限られる（Ｈｉｄｄｅｍａｎｎら、Ｂｌｏｏｄ、１０６、３７２５～３２ （２００５）；Ｓｅｈｎら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ、３３、３４６７～３４７４ （２０１５））。理論により限定されるものではないが、本明細書に開示した本発明は、ＡＤＣＣを増大させることが治療用抗体の臨床的効果を高める有望なアプローチであるという出願人の考えに基づいている。ＡＤＣＣを媒介する主要な免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である（Ｗａｎｇら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、６、３６８ （２０１５））。ＮＫ細胞は、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）、主にＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）を発現し、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分を認識して結合する。Ｆｃγ受容体が標的細胞の表面に結合したＩｇＧのＦｃ領域に結合すると、ナチュラルキラー細胞は、標的細胞の死滅を引き起こす細胞毒性因子を放出する（Ｗａｎｇら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、６、３６８ （２０１５））。したがって、ＡＤＣＣでは、次の３つの構成要素：免疫エフェクター細胞、抗体、及び抗体によりオプソニン化された標的細胞に関与している。ＡＤＣＣは、ＮＫ細胞表面で発現されたＦｃγＲがＩｇＧ分子のＦｃ領域に結合した際に引き起こされる。異なる結合親和性をもたらすＦｃγＲの遺伝的バリエーションがＡＤＣＣの規模の違いに寄与することが知られていることを考慮すると、ＦｃγＲの親和性／量とＮＫ細胞の質／量がＡＤＣＣの規模の違いに寄与する可能性があるということになる。
【0017】
[0028]Ｆｃガンマ受容体の例としては、限定するものではないが、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、及びＣＤ６４Ｃが挙げられる。
【0018】
[0029]Ｔ細胞の表面抗原のエピトープ又はそのフラグメントに特異的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメントの例としては、限定するものではないが、抗ＣＤ３抗体、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ２８抗体、又は抗ＯＸ４０抗体が挙げられる。
【0019】
[0030]好ましくは、本開示は、
ヒトＣＤ１６Ａの細胞外ドメイン；及び
ヒトＣＤ３のエピトープ又はそのフラグメントに特異的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメント
を含む融合タンパク質を提供する。
ヒトＣＤ１６Ａの細胞外ドメイン；及び
ヒトＣＤ３のエピトープ又はそのフラグメントに特異的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメント
を含む融合タンパク質を提供する。
【0020】
[0031]本開示によれば、融合タンパク質は、ＣＤ１６Ａの細胞外ドメインを含む。好ましくは、ＣＤ１６Ａは、ヒトＣＤ１６Ａである。ＦｃγＲＩＩＩＡとしても知られているＣＤ１６Ａは膜貫通型糖タンパク質であり、１５８位にフェニルアラニン（Ｆ）残基又はバリン（Ｖ）残基のいずれかを有するＣＤ１６Ａの２つの対立遺伝子バリアントがある。ＣＤ１６Ａ－１５８ＶバリアントはＩｇＧに対して高親和性を有しているが、ＣＤ１６Ａ－１５８Ｆはヒト集団における優性対立遺伝子である。臨床分析によって、腫瘍を標的とする治療用ｍＡｂの治療効果とＣＤ１６Ａ結合親和性の間に正の相関関係があることが明らかにされた。ＣＤ１６Ａバリンバリアント（ＣＤ１６Ａ－Ｖ／Ｖ）についてホモである患者は、臨床的に承認された治療用抗体、例えばリツキシマブ、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、及びセツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）などへの応答において、低親和性ＣＤ１６Ａアイソフォームについてヘテロ（ＣＤ１６Ａ－Ｖ／Ｆ）又はホモ（ＣＤ１６Ａ－Ｆ／Ｆ）であるいずれかの患者と比較して、抗腫瘍治療抗体による治療後の臨床転帰が改善された（Ｃａｒｔｒｏｎら、Ｂｌｏｏｄ、９９、７５４～７５８ （２００２）；Ｋｉｍら、Ｂｌｏｏｄ、１０８、２７２０～２７２５ （２００６）；Ｚｈａｎｇら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ、２５、３７１２～３７１８ （２００７）；Ｍｕｓｏｌｉｎｏら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ、２６、１７８９～１７９６ （２００８）；Ｖｅｅｒａｍａｎｉら、Ｂｌｏｏｄ、１１８、３３４７～３３４９ （２０１１）；Ｍｅｌｌｏｒら、Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ、６、１ （２０１３））。しかし、一般人口のわずか１０～２０％は高親和性ＣＤ１６Ａバリアントを有する。本開示の好ましい一実施形態において、ＣＤ１６Ａは、高親和性ＣＤ１６Ａバリアントである。
【0021】
[0032]本開示のより好ましい一実施形態において、ＣＤ１６Ａの細胞外ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を有する。
【0022】
[0033]ポリペプチドに適用される場合、用語の「実質的な類似性」又は「実質的に類似の」とは、タンパク質配列が、例えばデフォルトギャップ加重を使用してＧａｐ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムにより別の（参照）タンパク質配列と最適に整列させた場合に、前記参照タンパク質配列の配列全体に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸残基において配列同一性があることを意味する。同一でない残基の位置は、保存的なアミノ酸置換がある点が異なることが好ましい。「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を持つ側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されることである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なっている場合、配列同一性パーセント又は類似性の程度は、置換の保存的性質について修正するために上方に調整され得る。この調整を実施する手段は、当業者に周知である。類似の化学的特性を持つ側鎖を有するアミノ酸のグループの例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；（２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリン及びトレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン及びヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸、並びに、（７）硫黄含有側鎖：システイン及びメチオニン、が挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸、及びアスパラギン－グルタミンである。或いは、保存的置き換えは、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｎｎｅｔら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３～１４４５に開示されているＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的な」置き換えは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負でない値を有する任意の変化である。
【0023】
[0034]配列同一性とも呼ばれる、ポリペプチドに対する配列類似性は、通常、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失及び他の改変に割り当てられた類似性の尺度を使用して類似の配列のマッチングを行う。例えば、ＧＣＧソフトウェアはＧＡＰ及びＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含有し、これをデフォルトパラメーターと共に使用し、密接に関係したポリペプチド間の、例えば、異なる生物の種由来の相同なポリペプチド間の、又は野生型タンパク質とその変異体との間の配列相同性又は配列同一性を決定することができる。ポリペプチド配列はまた、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムである、デフォルト又は推奨パラメーターを使用するＦＡＳＴＡを使用して比較することができる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリー配列と検索配列との間の最良の重複領域の整列及び配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上掲）。本開示の配列を異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを使用するコンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰ又はＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０、及びＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９～４０２を参照されたい。これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【0024】
[0035]本開示によれば、融合タンパク質は、ヒトＣＤ３のエピトープ又はそのフラグメントに特異的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む。
【0025】
[0036]免疫応答において、ＣＤ３はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関連する表面抗原であり、抗原認識及びシグナル伝達に関与する複合体を形成する。ＣＤ３ Ｔ細胞共受容体は、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＤ８＋ Ｔ細胞）とヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋ Ｔ細胞）の両方の活性化を促進する。本開示による融合タンパク質を利用する場合、体内のアルファ－ベータＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、及びナチュラルキラーＴ細胞を含むすべてのＣＤ３発現細胞は、融合タンパク質の抗ＣＤ３部分がＴ細胞のＣＤ３分子に結合することによって、高親和性ＣＤ１６Ａを保有し、ＡＤＣＣを遂行することができる細胞になるように動員され得る可能性がある。
【0026】
[0037]当業者に公知の様々な技術を使用して、抗体がポリペプチド又はタンパク質内の「１つ又は複数のアミノ酸に特異的に結合する」かどうかを判定することができる。例示的な技術としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．、Ｎ．Ｙ．）に記載されているような慣用のクロス・ブロッキングアッセイ、アラニンスキャニング突然変異分析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ、２００４、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３～４６３）、及びペプチド切断分析が挙げられる。さらに、抗原のエピトープ除去、エピトープ抽出、化学修飾などの方法も使用することができる（Ｔｏｍｅｒ、２０００、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７～４９６）。抗体が特異的に結合するポリペプチド内のアミノ酸の同定に使用することができる別の方法は、マススペクトロメトリーによって検出される水素／重水素交換である。一般論として、水素／重水素交換法は、目的のタンパク質の重水素標識、その後の重水素標識タンパク質への抗体の結合を含む。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移し、抗体が（結合し）保護している残基（重水素標識されたままである）を除いたすべての残基で水素－重水素交換を生じさせる。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断及びマススペクトロメトリー分析に供することにより、抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素標識した残基が明らかになる。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２～２５９；Ｅｎｇｅｎ及びＳｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ～２６５Ａを参照されたい。
【0027】
[0038]本開示による抗体は、完全長であってもよく、又は抗原結合部分のみを含んでいてもよく、必要に応じて機能性に影響するように改変されていてもよい。
【0028】
[0039]本明細書で使用される場合の用語「抗体」とは、特定の抗原（例えばＣＤ３）に特異的に結合又は相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む任意の抗原結合分子又は分子複合体を意味する。用語「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖、並びにそれらの多量体（例えばＩｇＭ）を含む免疫グロブリン分子を包含する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと簡略化）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと簡略化）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに再分割され得る。各ＶＨ及びＶＬは３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成されており、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置されている。本開示の異なる実施形態において、抗ＣＤ３抗体（又はその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖細胞系列配列と同一であってもよく、又は天然若しくは人工的に改変されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。
【0029】
[0040]本明細書において使用される場合の用語「抗体」はまた、完全な抗体分子の抗原結合性フラグメントも含む。本明細書において使用される場合の抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合性フラグメント」などの用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然の、酵素によって取得することができる、合成の又は遺伝子操作されたポリペプチド又は糖タンパク質を包含する。抗体の抗原結合性フラグメントは、任意の適切な標準的技術、例えばタンパク質分解消化など、又は抗体の可変ドメイン及び任意選択で定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を含む組換え遺伝子操作技術を使用して、例えば、完全な抗体分子から誘導することができる。そのようなＤＮＡは公知であり、及び／又は、例えば販売元、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ－抗体ライブラリーを含む）から容易に入手することができるか、又は合成することができる。ＤＮＡをシークエンシングし、化学的に又は分子生物学技術を使用して操作して、例えば、１つ又は複数の可変ドメイン及び／又は定常ドメインを適切な形状に整列させるため、又はコドンを導入するため、システイン残基を作製するため、アミノ酸を改変、付加、若しくは欠失などさせることができる。
【0030】
[0041]抗体の抗原結合性フラグメントの非制限的な例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域）を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位、又は束縛されたＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチド、が挙げられる。他の操作された分子、例えば、ドメイン特異性抗体、シングルドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価のナノボディ、二価のナノボディなど）、低分子モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰ）、及びサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどもまた、本明細書において使用される場合の「抗原結合性フラグメント」という表現内に包含される。
【0031】
[0042]抗体の抗原結合性フラグメントは、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズ又はアミノ酸組成のものであってもよく、一般的に、１つ又は複数のフレームワーク配列に隣接するか、又はインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶＬドメインと会合しているＶＨドメインを有する抗原結合性フラグメントにおいて、ＶＨ及びＶＬドメインは、互いに対して任意の適切な配置で配置され得る。例えば、可変領域は二量体であってもよく、ＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬ又はＶＬ－ＶＬ二量体を含有していてもよい。或いは、抗体の抗原結合性フラグメントは、単量体のＶＨ又はＶＬドメインを含有していてもよい。
【0032】
[0043]ある特定の実施形態において、抗体の抗原結合性フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合されている少なくとも１つの可変ドメインを含有し得る。本開示の抗体の抗原結合性フラグメント内に見いだされ得る可変ドメイン及び定常ドメインの非制限的な例示的構成としては、（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１；（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２；（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３；（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２；（ｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ；（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２；（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３；（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３；及び（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬ、が挙げられる。上で列挙した例示的構成のいずれかを含む可変ドメイン及び定常ドメインの任意の構成において、可変ドメイン及び定常ドメインは、互いに直接連結されていてもよく、又は完全な若しくは部分的なヒンジ若しくはリンカー領域によって連結されていてもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子内の隣接する可変ドメイン及び／又は定常ドメイン間で可動性又は半可動性連結が生じる、少なくとも２個（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０個又はそれ以上）のアミノ酸からなり得る。さらに、本開示の抗体の抗原結合性フラグメントは、互いに、及び／又は１つ若しくは複数の一価のＶＨ若しくはＶＬドメインに非共有結合により会合した（例えば、１つ又は複数のジスルフィド結合によって）、上で列挙した可変ドメイン及び定常ドメイン構成のいずれかのホモ二量体又はヘテロ二量体（又は他の多量体）を含み得る。
【0033】
[0044]本発明の好ましい一実施形態において、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、抗ＣＤ３単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。
【0034】
[0045]本発明の別の好ましい実施形態において、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、配列番号４のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を有し；好ましくは、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性又はそれらの実質的に類似の配列を有する。
【0035】
[0046]本明細書に開示されている抗体は、抗体が由来した対応する生殖細胞系列配列と比較して、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域に１つ又は複数のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含み得る。そのような変異は、本明細書に開示されているアミノ酸配列を、例えば公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖細胞系列配列と比較することによって、容易に確認することができる。本開示は、本明細書に開示されているいずれかのアミノ酸配列に由来する抗体及びその抗原結合性フラグメントを含み、ここで１つ又は複数のフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内の１つ又は複数のアミノ酸は、抗体が由来した生殖細胞系列配列の対応する残基（複数可）に、又は別の哺乳動物生殖細胞系列配列の対応する残基（複数可）に、又は対応する生殖細胞系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換に変異される（このような配列の変化は、本明細書においては総称して「生殖細胞系列変異」と呼ぶ）。当業者は、本明細書に開示されている重鎖及び軽鎖可変領域配列から開始して、１つ若しくは複数の個々の生殖細胞系列変異又はそれらの組合せを含む多くの抗体及び抗原結合性フラグメントを容易に産生することができる。特定の実施形態において、ＶＨ及び／又はＶＬドメイン内のフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基のすべては、抗体が由来した元の生殖細胞系列配列内に見いだされる残基へと復帰変異される。他の実施形態において、特定の残基だけが、例えば、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内若しくはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に見いだされる変異残基だけが、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２若しくはＣＤＲ３内に見いだされる変異残基だけが、元の生殖細胞系列配列に復帰変異される。他の実施形態において、１つ又は複数のフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基（複数可）は、異なる生殖細胞系列配列（すなわち、抗体が元々由来した生殖細胞系列配列とは異なる生殖細胞系列配列）の対応する残基（複数可）へと変異される。さらに、本開示の抗体は、フレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖細胞系列変異の任意の組合せを含有していてもよく、例えば、特定の個々の残基は、特定の生殖細胞系列配列の対応する残基へと変異され、一方、元の生殖細胞系列配列とは異なる特定の他の残基は維持されるか、又は異なる生殖細胞系列配列の対応する残基へと変異される。一度得られたならば、１つ又は複数の生殖細胞系列変異を含有する抗体及び抗原結合性フラグメントは、１つ又は複数の所望の特性、例えば、改善された結合特異性、増加した結合親和性、（場合に応じて）改善された若しくは増強されたアンタゴニスト性又はアゴニスト性生物学的特性、減少された免疫原性などについて容易に試験することができる。この一般的な手段で得られた抗体及び抗原結合性フラグメントは、本開示に包含される。
【0036】
[0047]本開示はまた、１つ又は複数の保存的置換を有する本明細書に開示されているＶＨ、ＶＬ及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかのバリアントを含む抗ＣＤ３抗体も含む。例えば、本開示は、本明細書に開示されているＶＨ、ＶＬ及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば１０個以下、８個以下、６個以下、４個以下などの保存的アミノ酸置換を含むＶＨ、ＶＬ及び／又はＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＣＤ３抗体を包含する。
【0037】
[0048]本開示の好ましい一実施形態において、ＣＤ１６の細胞外ドメインは、抗体又はその抗原結合性フラグメントに直接連結する。本開示の別の実施形態において、リンカーは、ＣＤ１６の細胞外ドメインと抗体又はその抗原結合性フラグメントの間に存在する。
【0038】
[0049]本開示の好ましい一実施形態において、融合タンパク質は分泌シグナルペプチドをさらに含む。本明細書で使用される場合のシグナルペプチド（シグナル配列、標的化シグナル、局在化シグナル、局在化配列、輸送ペプチド、リーダー配列又はリーダーペプチドと呼ばれることがある）は、分泌経路に向かうように定められたタンパク質のＮ末端に位置している短鎖ペプチドを意味する。本開示の一実施形態において、分泌シグナルペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を有する。
【0039】
[0050]本開示の好ましい一実施形態において、融合タンパク質は、タンパク質精製タグをさらに含む。
【0040】
[0051]本開示の好ましい一実施形態において、融合タンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列又はその実質的に類似の配列を有する。
【0041】
[0052]本開示の別の好ましい実施形態において、高親和性ＣＤ１６Ａバリアントの細胞外ドメイン及び単鎖抗ＣＤ３抗体からなる新規の二重特異性Ｔ細胞誘導体（ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ；図１Ａ）は、様々な適用分野においてｍＡｂのＡＤＣＣに効果をもたらす。ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのそのような使用によって、次のようないくつかの利点が提供される：（１）体内におけるＣＤ１６Ａ発現ナチュラルキラー細胞の限定的な利用可能性が克服されること、これは、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥを用いると、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの抗ＣＤ３部分がＴ細胞のＣＤ３分子に結合することによって、体内のアルファ－ベータＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞及びナチュラルキラーＴ細胞を含むすべてのＣＤ３発現細胞が、高親和性ＣＤ１６Ａを保有し、ＡＤＣＣを遂行することができる細胞になるように動員される可能性があるためである；（２）高親和性ＣＤ１６Ａバリアントを発現する一般人口のわずか１０～２０％における問題が解決されること、これは、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥを任意の個体に適用し、Ｔ細胞のＣＤ３分子へのｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの抗ＣＤ３部分の結合を介して高親和性ＣＤ１６Ａを有するそれぞれの個体に多数のＣＤ３＋ Ｔ細胞が結果的に付与されることにより、承認されたｍＡｂの治療効果に寄与する；（３）このｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの設計で高親和性ＣＤ１６Ａの細胞外ドメインを採用することによって、活性化ＮＫ細胞のＣＤ１６Ａのダウンレギュレーションが回避されること；（４）このｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥでＴ細胞にＡＤＣＣ活性を付与することによって、免疫療法向けに調製されたＴ細胞増殖培養物の望ましくない細胞をＡＤＣＣ媒介により除去することを実現可能性にすること；（５）ワクチンとこのｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥを組み合わせて使用することにより、抗体誘導性ＡＤＣＣ能力を有するウイルスワクチンを生成し、ウイルス感染症の抗体療法の治療効果を高める有望な方法を提供すること；（６）免疫チェックポイント阻害剤を投与されている患者の抑制解除Ｔ細胞（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ－ｒｅｍｏｖｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ）を、ＡＤＣＣ活性を有するＴ細胞へ変換して、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）様抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂの治療可能性を高めること。
【0042】
[0053]本開示はまた、本明細書に開示した融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0043】
[0054]好ましくは、ポリヌクレオチドは、高親和性ＣＤ１６Ａの細胞外ドメインをコードするフラグメントを含み、配列番号１の核酸配列又はその実質的に同一の配列を有する。
【0044】
[0055]好ましくは、ポリヌクレオチドは、抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードするフラグメントを含み、配列番号３の核酸配列又はその実質的に同一の配列を有する。
【0045】
[0056]好ましくは、ポリヌクレオチドは、分泌シグナルペプチドをコードするフラグメントをさらに含み、配列番号５の核酸配列又はその実質的に同一の配列を有する。
【0046】
[0057]好ましくは、ポリヌクレオチドは、タンパク質精製タグをコードするフラグメントをさらに含む。
【0047】
[0058]より好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号７の核酸配列又はその実質的に同一の配列を有する。
【0048】
[0059]用語の「実質的な同一性」又は「実質的に同一の」とは、核酸又はそのフラグメントに言及する場合、適当なヌクレオチド挿入又は欠失を用いて別の（参照）核酸（又はその相補鎖）と共に最適に整列させた場合に、任意の周知の配列同一性アルゴリズム、例えば後述するようなＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＧａｐなどによって測定した際、前記の参照核酸配列の配列全体に対して少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％又は９９％のヌクレオチド塩基にヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、特定の場合において、参照核酸分子によってコードされているポリペプチドと同一の又は実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。
【0049】
[0060]本開示の好ましい一実施形態において、融合タンパク質は、原核生物及び真核生物の発現系を含む任意の数の発現系を使用して産生することができる。多くのそのような系は、発売元から広く市販されている。一実施形態において、融合タンパク質はベクターを使用して発現させることができ、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはプロモーター配列に作動可能に連結されている。一実施形態において、プロモーターは構成的プロモーターである。別の実施形態において、プロモーターは誘導性プロモーターである。
【0050】
[0061]一実施形態において、ポリヌクレオチド又はベクターはウイルスに含まれている。別の実施形態において、ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスからなる群から選択される。本開示の好ましい一実施形態において、ポリヌクレオチド又はベクターは、アデノ随伴ウイルスシャトルプラスミドに含まれている。
【0051】
[0062]本開示はまた、本明細書に開示したポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。一実施形態において、宿主細胞は原核細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。好ましい実施形態において、宿主細胞はヒト細胞である。
【0052】
[0063]好ましくは、宿主細胞は、本明細書に開示したポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルスベクターを含む。
【0053】
[0064]本開示はまた、治療有効量の本明細書に開示した融合タンパク質を含み、任意選択で薬学的に許容できる担体又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【0054】
[0065]本開示はまた、治療有効量の本開示による宿主細胞を含む医薬組成物を提供する。二重特異性Ｔ細胞誘導体は、一般に、血清半減期が非常に短く、約２時間である。このことによってＢｉＴＥの適用には静脈内持続注入が必要となるが、その方法はヒトにおける使用においては不便である。この欠点を克服するため、ＢｉＴＥのｉｎ ｖｉｖｏ連続産生を媒介するのにウイルスを使用することが好ましい。
【0055】
[0066]本開示の医薬組成物は、改善された移行、送達、耐性などを提供する適切な担体、賦形剤及び他の薬剤と共に製剤化される。多くの適当な製剤は、すべての薬剤師に知られている処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａにおいて見いだすことができる。これらの製剤としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（陽イオン性又は陰イオン性）を含有する小胞（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型及び油中水型エマルジョン、エマルジョンカルボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、並びにカルボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。また、Ｐｏｗｅｌｌら「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８～３１１も参照されたい。
【0056】
[0067]患者に投与される融合タンパク質の用量は、患者の年齢及びサイズ、標的疾患、状態、投与経路などを含む様々な要因に応じて変わり得る。好ましい用量は、典型的には、体重又は体表面積によって計算される。状態の重症度に応じて、頻度及び治療期間を調整することができる。融合タンパク質を投与するための有効な投与量及びスケジュールは、経験的に決定することができる。例えば、患者の進行を定期的な評価によってモニタリングし、それにしたがって用量を調整することができる。さらに、用量の種間スケーリングは当技術分野で周知の方法を使用して実施することができる（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉら、１９９１、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１）。
【0057】
[0068]様々な送達系、例えば、リポソームカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、変異ウイルスの発現が可能な組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスが公知であり、それらを使用して本開示の医薬組成物を投与することができる（例えば、Ｗｕら、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９～４４３２を参照されたい）。投与経路としては、限定するものではないが、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、腫瘍内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路、及び経口経路が挙げられる。組成物は、任意の都合のよい経路によって、例えば、点滴又はボーラス注射によって、上皮又は皮膚粘膜の内壁（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を介した吸収によって投与することができ、また他の生物活性のある薬剤と一緒に投与することができる。投与は、全身的又は局所的であり得る。
【0058】
[0069]本発明の一実施形態において、本開示の医薬組成物は、標準の針及び注射器を用いて、腫瘍内、皮下又は静脈内に送達することができる。
【0059】
[0070]ある特定の状況においては、医薬組成物は、徐放系で送達することができる。一実施形態において、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ、上掲；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照されたい）。別の実施形態において、ポリマー材料を使用することができる；Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．）、１９７４、ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．を参照されたい。さらに別の実施形態において、徐放系は、組成物の標的の近位に置くことができ、それにより、全身用量の一部分のみが必要とされる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、１９８４、ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、上掲、ｖｏｌ．２、１１５～１３８ページを参照されたい）。他の徐放系は、Ｌａｎｇｅｒ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７～１５３３による総説で議論されている。
【0060】
[0071]ある特定の状況において、医薬組成物は、注射可能な調製物で送達することができる。注射可能な調製物は、腫瘍内、静脈内、皮下、皮内、及び筋肉内注射、点滴注入などのための投与剤形を包含し得る。これらの注射可能な調製物は、公知の方法により調製することができる。例えば、注射可能な調製物は、例えば、医薬組成物を注射用に通常使用される滅菌水性媒体又は油性媒体に溶解、懸濁、又は乳化させることによって調製することができる。注射用の水性媒体の例としては、生理食塩水、グルコース及び他の補助剤を含有する等張溶液などが挙げられ、これらの水性媒体は、適切な溶解剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加物）］などと組み合わせて使用することができる。油性媒体の例としては、ゴマ油、ダイズ油などが挙げられ、これらの油性媒体は、溶解剤、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと組み合わせて使用することができる。このように調製された注射剤は、適切なアンプルに充填されることが好ましい。
【0061】
[0072]上記の経口使用又は非経口使用のための医薬組成物は、活性成分の用量に適合するのに適した単位用量の投与剤形で調製することが有利である。そのような単位用量の投与剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが挙げられる。
【0062】
[0073]本開示はまた、必要としている対象において抗体依存性細胞毒性を誘導するための医薬の製造における本明細書に開示した医薬組成物の使用を提供する。
【0063】
[0074]好ましくは、本開示は、それを必要とする対象におけるがん、感染症、自己免疫疾患、移植片対宿主病、又は移植後リンパ増殖性疾患を治療するための医薬の製造における医薬組成物の使用を提供する。
【0064】
[0075]本明細書で使用される場合の用語「治療する」及び「治療」とは、症状の重症度及び／若しくは頻度の低下を達成し、症状及び／若しくはそれらの根本的な原因を除去し、並びに／又は損傷の改善若しくは修復を促進するように、有害な状態、障害、又は疾患に罹患している臨床的に徴候性のある個体に対して薬剤又は製剤を投与することを意味する。用語の「予防する」及び「予防」とは、特定の有害な状態、障害、又は疾患にかかりやすい臨床的に無徴候性の個人に対して薬剤又は組成物を投与することを意味し、したがって、症状及び／又はそれらの根本的な原因の発生の予防に関係する。当業者によって理解されるように、予防又は予防するとは状態の絶対的な（完全な）阻止又は回避を達成する必要はない。むしろ、予防は、予防しようとする疾患又は状態の実質的な（例えば、約５０％を超える）低下又は回避を達成し得る。本明細書で明示的又は意味合い的に別段の指示がない限り、用語の「治療」（又は「治療する」）が予防の可能性に言及することなく使用される場合、同様に予防が包含されることが意図される。
【0065】
[0076]「がん」、「腫瘍」、「悪性転換化（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」などの用語は、前がん性、新生物性、悪性転換化、及びがん性の細胞を包含し、固形腫瘍又は非固形がんを意味し得る（例えば、Ｅｄｇｅら ＡＪＣＣ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｇｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ（７ｔｈ ｅｄ．２００９）；Ｃｉｂａｓ ａｎｄ Ｄｕｃａｔｍａｎ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ：Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ（３ｒｄ ｅｄ．２００９）を参照されたい）。がんは、良性及び悪性新生物（異常増殖）の両方を包含する。「悪性転換」とは、自然発生的又は誘導された表現型の変化、例えば、細胞の不死化、形態学的変化、異常細胞増殖、接触抑制及び足場の減少、及び／又は悪性腫瘍を意味する（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（３ｒｄ ｅｄ．１９９４）を参照されたい）。悪性転換は、悪性転換ウイルスによる感染及び新しいゲノムＤＮＡの組み込み、又は外因性ＤＮＡの取り込みから発生する可能性があるが、自然発生的に又は発がん物質への暴露後に発生する可能性もある。
【0066】
[0077]本開示の好ましい一実施形態において、医薬組成物は、１つ又は複数の抗体をさらに含む。より好ましくは、抗体はＩｇＧ抗体である。別の態様において、抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。抗体の例としては、限定するものではないが、抗ＣＤ２０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗潜伏膜タンパク質１（ＬＭＰ１）抗体、又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体が挙げられる。
【0067】
[0078]がんの発症及び進行は、免疫チェックポイント経路より媒介される腫瘍回避を含む、免疫応答の回避を特徴とする（Ｐａｒｄｏｌｌ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ、１２、２５２～２６４ （２０１２））。ＰＤ－Ｌ１の過剰発現により、腫瘍細胞はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を利用して免疫抑制環境を促進し、腫瘍を増殖させる（Ｔｏｐａｌｉａｎら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２４、２０７～２１２ （２０１２））。ＰＤ－Ｌ１抑制シグナルを遮断するとＴ細胞の抗腫瘍活性を回復させることができ、それによって重要な治療方策となる（Ｔｏｐａｌｉａｎら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２４、２０７～２１２ （２０１２）；Ｐｏｓｔｏｗら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ、３３、１９７４～１９８２（２０１５））。承認されたヒトＩｇＧ抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂであるアベルマブは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ－Ｌ１と抑制性Ｔ細胞受容体ＰＤ－１の間の相互作用を阻止すると考えられる。ＰＤ－Ｌ１遮断は、Ｔ細胞活性の抑制を解除し、Ｔ細胞媒介性抗腫瘍免疫応答をもたらす（Ｈａｍｉｌｔｏｎ及びＲａｔｈ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ、１７、５１５～５２３ （２０１７））。さらに、他の承認された抗ＰＤ－Ｌ１抗体とは異なり、アベルマブは野生型ＩｇＧ Ｆｃ領域を有しており、これによってアベルマブはＮＫ細胞のＦｃγＲとエンゲージし、腫瘍を標的としたＡＤＣＣを誘導することができる（Ｂｏｙｅｒｉｎａｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ、３、１１４８～１１５７ （２０１５）；Ｈａｍｉｌｔｏｎ及びＲａｔｈ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ、１７、５１５～５２３ （２０１７））。その結果、アベルマブはＴ細胞媒介性抗腫瘍免疫応答を再活性化するとともに、ＡＤＣＣによる腫瘍細胞の根絶を媒介する可能性を有する。本開示による医薬組成物は、これらの抑制が解除されたＴ細胞にＡＤＣＣ活性を付与し、ＡＤＣＣ活性及びｍＡｂの治療可能性を有する細胞の数を有意に増加させる。
【0068】
[0079]本開示の一実施形態において、融合タンパク質は、望ましくない細胞を除去するために適用される。例えば、移植片対宿主病を軽減するため、また移植後リンパ増殖性疾患、例えば移植後エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）誘発性リンパ増殖性疾患を予防するためである。
【0069】
[0080]本開示の一実施形態において、融合タンパク質は、感染症を治療するために適用される。本開示によれば、感染症は、好ましくは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などのウイルス感染症が挙げられる。理論によって限定されるものではないが、ＡＤＣＣはＨＩＶワクチンにおいて潜在的に重要な防御メカニズムであると思われる（Ｈａｙｎｅｓら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３６６、１２７５～１２８６ （２０１２）；Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ、１５、５８ （２０１８））。さらに、ウイルス保有を提供する潜伏感染細胞を排除することは、ＨＩＶ治療における主要な取り組みである。中和抗体と広く呼ばれる、ＨＩＶ－１分離株の広域アレイを中和する多くの非常に強力な中和抗体が近年単離されている（Ｍｕｊｉｂら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、９１、ｅ００６３４－１７ （２０１７））。広域中和抗体－ＶＲＣ０１の受動移入は、現在、潜伏感染細胞を排除するその可能性について臨床評価中であり（ＮＣＴ０２７１６６７５及びＮＣＴ０２５６８２１５）、またＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣがその潜在能力に潜伏感染細胞を排除することを有することを示唆する多数の証明がある（Ｍａｄｈａｖｉら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、９１、ｅ００７００－１７ （２０１７））。それにもかかわらず、慢性ＨＩＶ－１感染は、ＮＫ細胞の表現型、機能性、サブセット分布を変化させることが実証されている。例えば本明細書に開示されているような、ＨＩＶ感染患者におけるＡＤＣＣを増強するための新規の方法は、ＨＩＶの治癒の達成に対して極めて寄与する可能性がある。同様の方策が、他のウイルス感染症、例えばＨＢＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶなどのワクチン設計及び治療にも適用され得る（Ｇａｏら、Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、１３、１７６８～１７７３ （２０１７）；Ｃｏｇｈｉｌｌら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２２、３４５１～３４５７ （２０１６）；ＭｃＶｏｙら、Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ、１９、３９８２（２０１８））。
【0070】
[0081]以下の実施例は、本開示を実施する際、当業者に対する一助となるよう提供される。
【実施例0071】
実施例１
ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ構築物
[0082]ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの遺伝子構築を図１Ａ～図１Ｄに示す。図１Ａ：ＣＤ１６Ａ－ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞誘導体の遺伝子構築物をアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）シャトルプラスミドｐＡＡＶ－ＣＤ１６ＣＤ３にクローニングし、４４６アミノ酸の融合タンパク質を発現するためにサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）によって駆動した。Ｈ：６×ヒスチジンタグ；ＩＴＲ：ＡＡＶの逆方向末端反復配列；Ｓ：分泌シグナル；ＷＰＲＥ：ウッドチャックＢ型肝炎ウイルスの転写後調節エレメント。図１Ｂ：ヒト高親和性ＣＤ１６Ａの細胞外ドメイン（ｅｄＣＤ１６）のコード配列とヒトＣＤ３に対する単鎖抗体（抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ）を遺伝子合成によって同じコードフレーム内で融合させた。図１Ｃ：１３４１ｂｐヌクレオチドの合成遺伝子は、４４６アミノ酸の融合タンパク質をコードしている。図１Ｄ：ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのスキーム。
ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ構築物
[0082]ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの遺伝子構築を図１Ａ～図１Ｄに示す。図１Ａ：ＣＤ１６Ａ－ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞誘導体の遺伝子構築物をアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）シャトルプラスミドｐＡＡＶ－ＣＤ１６ＣＤ３にクローニングし、４４６アミノ酸の融合タンパク質を発現するためにサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）によって駆動した。Ｈ：６×ヒスチジンタグ；ＩＴＲ：ＡＡＶの逆方向末端反復配列；Ｓ：分泌シグナル；ＷＰＲＥ：ウッドチャックＢ型肝炎ウイルスの転写後調節エレメント。図１Ｂ：ヒト高親和性ＣＤ１６Ａの細胞外ドメイン（ｅｄＣＤ１６）のコード配列とヒトＣＤ３に対する単鎖抗体（抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ）を遺伝子合成によって同じコードフレーム内で融合させた。図１Ｃ：１３４１ｂｐヌクレオチドの合成遺伝子は、４４６アミノ酸の融合タンパク質をコードしている。図１Ｄ：ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのスキーム。
【0072】
ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイ。
【0073】
[0083]ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥは、ヒトＩｇＧ抗体及びＴ細胞に結合する能力を有する。ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのこの結合能力をまず実証した。ヒスチジンタグを有するｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥを生成し、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ遺伝子をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の上清からアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのＩｇＧ抗体への結合を実証するため、分解的な方略を図２Ａに概説する。Ｒａｊｉ（ＣＤ２０＋ Ｂｕｒｋｅｔｔリンパ腫細胞）及びＡ４３１（ＥＧＦＲ＋ 扁平上皮がん細胞）の細胞を、それぞれ１・ｇのリツキシマブ及びセツキシマブ（両方ともＩｇＧ抗体）と１０分間、まずインキュベートし、次いで、４℃で１０分間、ＰＢＳ １００μｌ中のｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ ５０ｎｇとインキュベートした。次に、細胞を４００×ｇで５分間遠心分離によりペレット化し、ＰＢＳで１回洗浄し、１００μＬのＰＢＳ中に含む２μＬのＰＥ標識した抗６×ヒスチジンタグ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と４℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで１回洗浄した後、細胞をフローサイトメトリー分析にかけ、データをカウント対蛍光のヒストグラムとして表示した。Ｒａｊｉ細胞及びＡ４３１細胞はまた、ＣＤ２０及びＥＧＦＲの発現についてもフローサイトメトリーにより調べた。
【0074】
[0084]図２Ｂに示すように、Ｒａｊｉ細胞及びＡ４３１細胞は、それぞれ、ＣＤ２０及びＥＧＦＲを発現した。ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの存在下では、リツキシマブ又は抗ＥＧＦＲ抗体で処理した９０％超のＲａｊｉ細胞又はＡ４３１細胞が抗６×ヒスチジンタグ（抗Ｈｉｓ）抗体で陽性に染色されたが、未処理の細胞では染色されず（図２Ｃ）、このことは、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥがＩｇＧ抗体に結合する能力を有することを示唆している。これらの実験データは、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥがＩｇＧ抗体被覆腫瘍細胞に結合し得ることを証明している。
【0075】
[0085]ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのＴ細胞への結合を示すため、図２Ｄでは分解的な方略を説明し、図２Ｅでは、９５％超がＣＤ３分子を発現するＣＤ１６陰性Ｔ細胞が、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの存在下で抗ＣＤ１６抗体により検出されたが、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥが存在しない場合には検出されなかったことを示す。これらの結果は、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥがＴ細胞に結合することを示している。使用した実験方法は、ＣＤ１６－ Ｔ細胞を使用し、ＩｇＧ抗体を省いたことを除いて、上記のとおりであった。
【0076】
実施例２
ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイ。
承認された抗ＣＤ２０ ＩｇＧ抗体（リツキシマブ）及びＴ細胞の存在下でのＣＤ２０発現腫瘍細胞の死滅を媒介するｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの能力。
[0086]細胞毒性実験は、Ｓｈｅｅｈｙら（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４９、９９～１１０ （２００１））で開示された方法に従って実施した。この実験では、ＣＤ２０を発現するＲａｊｉ、ＶＡＬ、及びＴｏｅｌｄｏ血液腫瘍細胞株を標的細胞として使用した。ＶＡＬ細胞株は急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）細胞であり、Ｔｏｅｌｄｏ細胞株はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞であった。ＲＳ４細胞株はＣＤ２０－ ＡＬＬ細胞であった。Ｒａｊｉ、ＶＡＬ、Ｔｏｅｌｄｏ及びＲＳ４の細胞を、５（６）－カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で個別に染色し、培養プレートのウェルに播種した（５×１０４／ウェル）。ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ（８０ｎｇ／ウェル）、リツキシマブ（１０μｇ／ウェル）、及びＴ細胞（５×１０５細胞／ウェル）を、異なる腫瘍細胞を含むそれぞれのウェルに、個別に又は一緒に添加した。培養物を６時間インキュベートした後、細胞の生存率を、フローサイトメトリーの使用によりＣＦＳＥ＋細胞をカウントすることによって決定した。Ｔ細胞は、Ｃｈｅｎら（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１０４、５８～６６、（２００２））によって開示された方法に従って、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、ＩＬ－７、及びＩＬ－１５で増殖させた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）培養物から得た。
ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイ。
承認された抗ＣＤ２０ ＩｇＧ抗体（リツキシマブ）及びＴ細胞の存在下でのＣＤ２０発現腫瘍細胞の死滅を媒介するｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの能力。
[0086]細胞毒性実験は、Ｓｈｅｅｈｙら（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４９、９９～１１０ （２００１））で開示された方法に従って実施した。この実験では、ＣＤ２０を発現するＲａｊｉ、ＶＡＬ、及びＴｏｅｌｄｏ血液腫瘍細胞株を標的細胞として使用した。ＶＡＬ細胞株は急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）細胞であり、Ｔｏｅｌｄｏ細胞株はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞であった。ＲＳ４細胞株はＣＤ２０－ ＡＬＬ細胞であった。Ｒａｊｉ、ＶＡＬ、Ｔｏｅｌｄｏ及びＲＳ４の細胞を、５（６）－カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で個別に染色し、培養プレートのウェルに播種した（５×１０４／ウェル）。ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ（８０ｎｇ／ウェル）、リツキシマブ（１０μｇ／ウェル）、及びＴ細胞（５×１０５細胞／ウェル）を、異なる腫瘍細胞を含むそれぞれのウェルに、個別に又は一緒に添加した。培養物を６時間インキュベートした後、細胞の生存率を、フローサイトメトリーの使用によりＣＦＳＥ＋細胞をカウントすることによって決定した。Ｔ細胞は、Ｃｈｅｎら（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１０４、５８～６６、（２００２））によって開示された方法に従って、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、ＩＬ－７、及びＩＬ－１５で増殖させた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）培養物から得た。
【0077】
[0087]図３に示した結果は、Ｔ細胞の存在下で、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥが、リツキシマブと組み合わせた場合に、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ又はリツキシマブ単独を使用する場合と比較して、ＣＤ２０発現血液腫瘍細胞（Ｒａｊｉ、ＶＡＬ、及びＴｏｅｌｄｏ）の死滅において相乗効果を示すことを明らかにしている。＊：ｐ＜０．００１、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ又はリツキシマブ単独との比較。
【0078】
承認された抗ＥＧＦＲ ＩｇＧ抗体（セツキシマブ）及びＴ細胞の存在下でのＥＧＦＲ発現腫瘍細胞の死滅を媒介するｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの能力。
【0079】
[0088]実験は、ＥＧＦＲ発現腫瘍細胞株（Ａ４３１）及びセツキシマブ（２．５μｇ／ウェル）を代わりに使用したことを除き、正確に、図３に記載したように実施した。この実験では、ＥＧＦＲ分子を発現するＡ４３１細胞を標的細胞として使用した。ＭＣＦ－７細胞株は、低ＥＧＦＲ乳房腫瘍細胞であった。
【0080】
[0089]図４に示した結果は、Ｔ細胞の存在下で、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥが、セツキシマブと組み合わせた場合に、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ又はセツキシマブ単独を使用した場合と比較して、ＥＧＦＲ発現細胞（Ａ４３１）の死滅において相乗効果を示すことを明らかにしている。＊：ｐ＜０．００１、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ又はリツキシマブ単独との比較。
【0081】
承認された抗ＨＥＲ２ ＩｇＧ抗体（トラスツズマブ）及びＴ細胞の存在下でのＨＥＲ２発現腫瘍細胞の死滅を媒介するｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの能力。
【0082】
[0090]実験は、ＨＥＲ２発現腫瘍細胞株及びトラスツズマブ（２．５μｇ／ウェル）を代わりに使用したことを除き、正確に、図３に記載したように実施した。この実験では、８０％超の細胞でＨＥＲ２分子を発現するＢＴ４７４腫瘍細胞株を標的細胞として使用した。ＢＴ４７４は乳管がん細胞であった。Ｔ４７Ｄ細胞株は、細胞の１０％がＨＥＲ２を低密度で発現する低ＨＥＲ２乳腺管がん細胞であった。
【0083】
[0091]図５に示した結果は、Ｔ細胞の存在下で、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥが、トラスツズマブと組み合わせた場合に、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ又はトラスツズマブ単独を使用する場合と比較して、高ＨＥＲ２細胞（ＢＴ４７４細胞）の死滅において相乗効果を示すが、低ＨＥＲ２細胞（Ｔ４７Ｄ細胞）では示さないことを明らかにしている。＊：ｐ＜０．０１、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ又はトラスツズマブ単独との比較。
【0084】
[0092]まとめると、実施例２に示した実験データは、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥがＴ細胞を動員し、ＩｇＧ抗体が結合した腫瘍細胞の死滅を媒介することが可能であることを示している。重要なことには、これらの結果はまた、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥが様々なＦＤＡ承認のＩｇＧ治療用抗体と組み合わせて、腫瘍細胞を死滅させることが可能であることも示している。
【0085】
実施例３
ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの活性に対する血漿の影響
[0093]正常な血漿レベルのＩｇＧは、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥへの結合においてＩｇＧアイソタイプの治療用ｍＡｂと競合し、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの活性を喪失させる可能性がある。この競合を評価するため、健康な個体から得た全血を４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を血漿として得た。血漿を、様々な容量比で図３に示した細胞毒性アッセイ実験に使用した無血清培地に添加し、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ及びＴ細胞の存在下でのリツキシマブの細胞毒性に対する血漿の影響を分析した。また血漿はリツキシマブの補体依存性細胞毒性も媒介するため、データは、リツキシマブ／血漿／Ｔ細胞の細胞毒性のデータを減算することにより表した。
ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの活性に対する血漿の影響
[0093]正常な血漿レベルのＩｇＧは、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥへの結合においてＩｇＧアイソタイプの治療用ｍＡｂと競合し、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの活性を喪失させる可能性がある。この競合を評価するため、健康な個体から得た全血を４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を血漿として得た。血漿を、様々な容量比で図３に示した細胞毒性アッセイ実験に使用した無血清培地に添加し、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ及びＴ細胞の存在下でのリツキシマブの細胞毒性に対する血漿の影響を分析した。また血漿はリツキシマブの補体依存性細胞毒性も媒介するため、データは、リツキシマブ／血漿／Ｔ細胞の細胞毒性のデータを減算することにより表した。
【0086】
[0094]図６は、血漿が、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ及びＴ細胞の存在下で、Ｒａｊｉ細胞に対するリツキシマブの細胞毒性を、最大５０％で、有意に低下させなかったことを示す。
【0087】
実施例４
ＣＤ１６＋γ９δ２Ｔ細胞とｈａＧＤ１６Ａ－ＢｉＴＥでパルスされたＣＤ１６－γ９δ２Ｔ細胞の間のＩｇＧ抗体を媒介性細胞死滅の比較研究
[0095]ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥとＴ細胞で発現した高親和性ＣＤ１６Ａとの同等性を評価するため、本発明者らは、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥでパルスしたＣＤ１６－γ９δ２Ｔ細胞の抗体媒介性細胞毒性を、高親和性ＣＤ１６バリアントを有するＣＤ１６＋γ９δ２Ｔ細胞の抗体媒介性細胞毒性と比較した。
ＣＤ１６＋γ９δ２Ｔ細胞とｈａＧＤ１６Ａ－ＢｉＴＥでパルスされたＣＤ１６－γ９δ２Ｔ細胞の間のＩｇＧ抗体を媒介性細胞死滅の比較研究
[0095]ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥとＴ細胞で発現した高親和性ＣＤ１６Ａとの同等性を評価するため、本発明者らは、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥでパルスしたＣＤ１６－γ９δ２Ｔ細胞の抗体媒介性細胞毒性を、高親和性ＣＤ１６バリアントを有するＣＤ１６＋γ９δ２Ｔ細胞の抗体媒介性細胞毒性と比較した。
【0088】
[0096]γ９δ２Ｔ細胞を以下に説明するように生成した。異なるドナーから得たＰＢＭＣ（２×１０６細胞／ｍｌ）を、１４日間、１０％熱不活化ＦＢＳ、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で、３７℃で５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内にて、組換えヒトＩＬ２（２５ｎｇ／ｍｌ；Ｐｒｏｓｐｅｃ）及びゾレドロネート（Ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ）（１μＭ；Ｓｉｇｍａ）により刺激した。続いて、γ９δ２Ｔ細胞培養物をＣＤ１６発現について分析し、またＣＤ１６陽性に染色された培養物については、ＣＤ１６高親和性バリアントに特異的なポリメラーゼ連鎖反応を実施してＣＤ１６＋γ９δ２Ｔ細胞の高親和性バリアント培養物を選択した。ＣＤ１６＋γ９δ２Ｔ細胞を、製造元の指示に従ってＰＥ標識した抗ＣＤ１６抗体と結合させるＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製の抗ＰＥ精製キットを用いて精製したところ、これらの精製したγ９δ２Ｔ細胞の９５％超がＣＤ１６を発現する（図７Ａ）。ＣＤ１６発現が陰性に染色された培養物は、ＣＤ１６－γ９δ２Ｔ細胞の細胞源として使用した。
【0089】
[0097]抗体媒介性細胞死滅は、リツキシマブ及びＲａｊｉ細胞を標的細胞として使用し、実施例２に記載の方法に従って分析した。ＣＤ１６＋γ９δ２Ｔ細胞の抗体媒介性細胞死滅を研究するため、ＲａｊｉをＣＦＳＥで染色し、リツキシマブ（２０μｇ／ウェル）及びＣＤ１６＋γ９δ２Ｔ細胞（５×１０５細胞／ウェル）を入れた培養プレート（５×１０４／ウェル）のウェルに播種した。ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥと組み合わせたＣＤ１６－γ９δ２Ｔ細胞の抗体媒介性細胞死滅を評価するため、ＣＦＳＥで染色したＲａｊｉ細胞（５×１０４／ウェル）、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ（８０ｎｇ／ウェル）、リツキシマブ（２０μｇ／ウェル）、及びＣＤ１６－γ９δ２Ｔ細胞（５×１０５細胞／ウェル）をウェルに一緒に加えた。培養物を６時間インキュベートした後、Ｒａｊｉ細胞の生存率を、フローサイトメトリーを使用してＣＦＳＥ＋細胞をカウントすることにより決定した。
【0090】
[0098]図７Ｂに示した結果は、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥと組み合わせたＣＤ１６－γ９δ２Ｔ細胞のリツキシマブ媒介性Ｒａｊｉ細胞死滅がＣＤ１６＋γ９δ２Ｔ細胞のその死滅に相当することを示しており、このことは、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの機能的活性が、γ９δ２Ｔ細胞で発現した高親和性ＣＤ１６バリアントの活性と同等であることを示唆している。＊：ｐ＜０．００１、ＣＤ１６－γ９δ２Ｔ細胞についてのｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ又はリツキシマブ単独との比較。＊：ｐ＜０．００１、ＣＤ１６＋γ９δ２Ｔ細胞についてのｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ又はリツキシマブ単独との比較。
【0091】
実施例５
Ｔ細胞増殖培養物から望ましくない細胞を除去するためのｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの使用。
[0099]この実施例は、Ｔ細胞増殖培養物から腫瘍細胞などの望ましくない細胞の除去におけるｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの有用性を実証するものである。
Ｔ細胞増殖培養物から望ましくない細胞を除去するためのｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの使用。
[0099]この実施例は、Ｔ細胞増殖培養物から腫瘍細胞などの望ましくない細胞の除去におけるｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの有用性を実証するものである。
【0092】
[0100]慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者から書面のインフォームドコンセントについて同意が得られた後、末梢血試料を採取した。ＰＢＭＣは、製造元の指示に従って、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（Ｓｉｇｍａ）を使用した密度勾配遠心分離によって５ｍｌの静脈血から単離した。γ９δ２Ｔ細胞を増殖させるため、ＰＢＭＣ（２×１０６細胞／ｍｌ）を、１４日間、１０％熱不活化ＦＢＳ、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で、３７℃で５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内にて、組換えヒトＩＬ２（２５ｎｇ／ｍｌ；Ｐｒｏｓｐｅｃ）及びゾレドロネート（１μＭ；Ｓｉｇｍａ）により刺激した。これらのＴ細胞増殖培養物から悪性Ｂ細胞を除去するために、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ（８０ｎｇ／ウェル）及びリツキシマブ（１０μｇ／ウェル）を１０日目に培養物に対して添加した。３日後、培養物を、ＣＤ１９マーカー（悪性Ｂ細胞用のマーカー）とヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色の両方のフローサイトメトリー分析によって、悪性Ｂ細胞死滅について分析した。
【0093】
[0101]図８は、ＣＤ１９－陽性細胞がｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ及びリツキシマブとの処理後に減少していることを示しているが、このことは、リツキシマブと組み合わせたｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥがＴ細胞増殖培養物から悪性Ｂ細胞を除去する能力を有していることを実証している。＊：ｐ＜０．００１、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ又はリツキシマブ単独との比較。
【0094】
実施例６
抗ＥＢＶ ＩｇＧ抗体及びＴ細胞の存在下でのＥＢＶ感染Ｂ細胞の死滅を媒介するｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの能力。
[0102]ウイルス性疾患の治療におけるｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの有用性を確立するため、ＥＢＶ感染Ｂ細胞株をモデルウイルス感染細胞として使用し、抗ＥＢＶ ＩｇＧ抗体及びＴ細胞の存在下でのＥＢＶ感染Ｂ細胞の死滅を媒介するｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの能力を試験した。
抗ＥＢＶ ＩｇＧ抗体及びＴ細胞の存在下でのＥＢＶ感染Ｂ細胞の死滅を媒介するｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの能力。
[0102]ウイルス性疾患の治療におけるｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの有用性を確立するため、ＥＢＶ感染Ｂ細胞株をモデルウイルス感染細胞として使用し、抗ＥＢＶ ＩｇＧ抗体及びＴ細胞の存在下でのＥＢＶ感染Ｂ細胞の死滅を媒介するｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの能力を試験した。
【0095】
[0103]ＥＢＶは、人口の９０％に感染するガンマヘルペスウイルスである。ＥＢＶは、メモリーＢ細胞及び口腔上皮細胞に生涯にわたる潜伏期を確立する。免疫能力を有する宿主においては、循環するＥＢＶ特異的細胞毒性Ｔリンパ球は、ＥＢＶ感染Ｂ細胞をＢ細胞プールの１％未満のレベルに維持する。しかし、免疫抑制された宿主においては、ＥＢＶ感染Ｂ細胞の制御されない増殖が、固形臓器移植又は造血幹細胞移植をした後のリンパ増殖性疾患、例えば、移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）の一因となる。さらに、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及び鼻咽頭癌種のかなりの割合がＥＢＶ感染に関連している。標準の化学療法及び放射線療法を超えたＥＢＶ関連悪性腫瘍に対する治療選択肢は限られている。期待される療法の１つは、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞を使用する養子細胞療法であり、これはＰＴＬＤに対する有効性を示した（症例の７０％における成功）。より理想的な治療薬は、より広く発現された抗原：潜伏膜タンパク質－１（ＬＭＰ１）又はＬＭＰ２の１つを特異的に認識することができる抗体である（Ａｈｍｅｄら、ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ、３、ｅ９７８０５、（２０１８））。
【0096】
[0104]不死化したＥＢＶ感染Ｂ細胞はＬＭＰ１を発現し、これを標的細胞として使用し、またｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を陰性対照細胞として使用した。実験は、ヒト抗ＬＭＰ１ ＩｇＧ抗体（１０μｇ／ウェル）（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂ）を代わりに使用することを除き、正確に、実施例２に記載したように実施した。
【0097】
[0105]図９は、Ｔ細胞の存在下で、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥが、抗ＬＭＰ１ ＩｇＧ抗体と組み合わせた場合に、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ又は抗ＬＭＰ１抗体単独を使用した場合と比較して、ＥＢＶ感染Ｂ細胞の死滅における相乗効果を示すことを明らかにしている。＊：ｐ＜０．００１、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ又は抗ＬＭＰ１抗体単独との比較。
【0098】
実施例７
ＰＤ－Ｌ１発現腫瘍細胞の死滅を媒介するｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイ。
[0106]ＰＤ－Ｌ１の過剰発現により、腫瘍細胞は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を利用して免疫抑制環境を促進し、腫瘍を増殖させる（Ｔｏｐａｌｉａｎら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２４、２０７～２１２ （２０１２））。したがって、ＰＤ－Ｌ１もまた腫瘍関連抗原である。抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ ｍＡｂによるＰＤ－Ｌ１抑制シグナルの遮断は、Ｔ細胞の抗腫瘍活性を回復させることができるだけでなく、ＡＤＣＣによって腫瘍細胞を根絶する機会も提供され得る。
ＰＤ－Ｌ１発現腫瘍細胞の死滅を媒介するｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイ。
[0106]ＰＤ－Ｌ１の過剰発現により、腫瘍細胞は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を利用して免疫抑制環境を促進し、腫瘍を増殖させる（Ｔｏｐａｌｉａｎら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２４、２０７～２１２ （２０１２））。したがって、ＰＤ－Ｌ１もまた腫瘍関連抗原である。抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ ｍＡｂによるＰＤ－Ｌ１抑制シグナルの遮断は、Ｔ細胞の抗腫瘍活性を回復させることができるだけでなく、ＡＤＣＣによって腫瘍細胞を根絶する機会も提供され得る。
【0099】
[0107]抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ ｍＡｂによるＰＤ－Ｌ１発現腫瘍細胞の根絶を媒介するＡＤＣＣ活性をＴ細胞に付与するｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの可能性に関する試験について。本発明者らはＰＤ－Ｌ１発現について腫瘍細胞をスクリーニングし、ＰＤ－Ｌ１発現腫瘍細胞株（Ａ４３１）及びヒト抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ抗体（１０μｇ／ウェル）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を代わりに使用することを除き、正確に、実施例２に記載したように実験を実施した。この実験では、Ａ４３１細胞を標的細胞として使用した。ＭＣＦ－７細胞株は低ＰＤ－Ｌ１乳がん細胞であった。
【0100】
[0108]図１０に示した結果は、Ｔ細胞の存在下で、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥが、抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ抗体と組み合わせた場合に、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体単独を使用する場合と比較して、ＰＤ－Ｌ１発現細胞（Ａ４３１）の死滅の際に相乗効果を示すことを明らかにしている。＊：ｐ＜０．００１、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体単独との比較。
【0101】
実施例８
免疫不全ＮＯＤマウスモデルにおけるＣＤ２０発現腫瘍細胞の死滅に対するｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの活性についてのｉｎ ｖｉｖｏアッセイ。
[0109]治療用抗体の効果を増強するのに有効な本発明者らの発明は、複合体の形成に４つの構成要素が一体となることが必要である。これらの構成要素には、腫瘍細胞、抗体、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ、及びＴ細胞が含まれる。ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのｉｎ ｖｉｖｏ活性の実証に加えて、この複合体形成がｉｎ ｖｉｖｏで起こることを実証するためにｉｎ ｖｉｖｏでの概念実証研究を実施した。
免疫不全ＮＯＤマウスモデルにおけるＣＤ２０発現腫瘍細胞の死滅に対するｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの活性についてのｉｎ ｖｉｖｏアッセイ。
[0109]治療用抗体の効果を増強するのに有効な本発明者らの発明は、複合体の形成に４つの構成要素が一体となることが必要である。これらの構成要素には、腫瘍細胞、抗体、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ、及びＴ細胞が含まれる。ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのｉｎ ｖｉｖｏ活性の実証に加えて、この複合体形成がｉｎ ｖｉｖｏで起こることを実証するためにｉｎ ｖｉｖｏでの概念実証研究を実施した。
【0102】
[0110]これらの実験は、Ｔ細胞欠如の免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＹｃｋＮａｒｌ（ＲＭＲＣ １３２８８）マウスで実施した。最初に、ルシフェラーゼ及び緑色蛍光タンパク質の遺伝子を、レンチウイルスベクターを使用してＲａｊｉ血液腫瘍細胞に形質導入した（Ｚｈｏｕら、Ｂｌｏｏｄ、１２０、４３３４～４３４２ （２０１２））。ルシフェラーゼ及び緑色蛍光タンパク質を発現するＲａｊｉ細胞（１×１０６細胞）を尾部静脈注射によりＮＯＤマウスに移植した。Ｒａｊｉ細胞の移植後７日目に、実施例２に記載したようにして得たＴ細胞を、尾部静脈注射によりＮＯＤマウスに移植した。注射当たりで移植されたＴ細胞の量は、Ｒａｊｉ細胞の量の１０倍であった。Ｔ細胞を４日毎に１回移植し、合計２回移植した。さらに、Ｒａｊｉ細胞の移植後７日目に、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥを連続して９日間、１日量８００ｎｇを尾部静脈から注入し、これは１回のボーラス注射により送達した。リツキシマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）を、Ｒａｊｉ細胞の移植後７日目及び１１日目に、尾部静脈から２回投与した。対照群のマウスはＴ細胞の移植のみを受けた。
【0103】
[0111]生物発光イメージング（ＢＬＩ）を様々な時点で行い、Ｒａｊｉ細胞のクリアランスをモニターした。実験終了時に、治療群の体重は対照の体重と同等であった。図１１の結果は、実験終了時のＢＬＩの差を示す。リツキシマブ及びＴ細胞で処理したマウス（ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥなし）と比較して、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥは、Ｒａｊｉ細胞クリアランスを２倍有意に増強した。したがって、腫瘍細胞、抗体、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ、及びＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで活性が必要とされる場合に一緒に組み合わせることができる。さらに重要なことには、これらのデータは、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのｉｎ ｖｉｖｏ活性を実証している。＊：ｐ＜０．０１、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ、リツキシマブ、及びＴ細胞の組合せとの比較。
【0104】
実施例９
ＡＡＶ－ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥはマウスにおけるｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの末梢発現を媒介する。
[0112]ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が短いことによって治療環境でＢｉＴＥの継続的注入が必要となることを克服するため、ＡＡＶ媒介型遺伝子導入方法を検討した。
ＡＡＶ－ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥはマウスにおけるｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥの末梢発現を媒介する。
[0112]ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が短いことによって治療環境でＢｉＴＥの継続的注入が必要となることを克服するため、ＡＡＶ媒介型遺伝子導入方法を検討した。
【0105】
[0113]マウス（Ｂ６株、オス、８週齢；ｎ＝５）に、ＡＡＶ－ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのウイルスベクターを腹腔内注射した（図１Ａ、１０９ｖｇｃ／動物；ｖｇｃ：ウイルスゲノムコピー）。血清試料をウイルス注射の前（０日目）及び後（２、７、１４日目）に尾部静脈から採取し、ウエスタンブロット分析にかけてｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのタンパク質レベルを評価した。ＨＲＰをコンジュゲートしたポリクローナル抗体を使用して、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのｃ末端の６×ヒスチジンタグをプローブした。検出されたタンパク質のレベルを濃度測定分析によって測定し、血清１ｍｌ当たりの光学密度値として示した。
【0106】
[0114]図１２の結果は、ＡＡＶ－ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥを注射した７日後に、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥがマウスの末梢血で検出され、その存在が少なくとも７日間持続することを示している。これらの結果は、ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥのｉｎ ｖｉｖｏでの持続的産生がｉｎ ｖｉｖｏウイルス媒介型ｈａＣＤ１６Ａ－ＢｉＴＥ遺伝子導入によって達成され得ることを実証している。
【0107】
[0115]本発明を上述の特定の実施形態と併せて説明したが、それに対する多くの代替及びその修正及び変更は当業者には明らかであろう。そのようなすべての代替、修正及び変更は本発明の範囲内にあると考える。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D-1】
【図1D-2】
【図1D-3】
【図1D-4】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-01-25
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＣＤ１６Ａの細胞外ドメイン；及び
ヒトＣＤ３に特異的に結合し、ヒトＴ細胞を活性化する抗ヒトＣＤ３単鎖可変フラグメントであって、ヒトＣＤ１６Ａの細胞外ドメインが前記ヒトＣＤ３単鎖可変フラグメントの重鎖に直接連結する、抗ヒトＣＤ３単鎖可変フラグメント
を含む融合タンパク質。
ヒトＣＤ３に特異的に結合し、ヒトＴ細胞を活性化する抗ヒトＣＤ３単鎖可変フラグメントであって、ヒトＣＤ１６Ａの細胞外ドメインが前記ヒトＣＤ３単鎖可変フラグメントの重鎖に直接連結する、抗ヒトＣＤ３単鎖可変フラグメント
を含む融合タンパク質。
【請求項2】
前記抗ヒトＣＤ３単鎖可変フラグメントが、配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
タンパク質精製タグをさらに含み、前記タンパク質精製タグが６×ヒスチジンタグである、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項5】
ヒトＣＤ１６Ａの細胞外ドメインをコードするフラグメントを含み、配列番号１の核酸配列を有し、かつ、前記抗ヒトＣＤ３単鎖可変フラグメントをコードするフラグメントを含み、配列番号３の核酸配列を有する、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項6】
分泌シグナルペプチドをコードするフラグメントをさらに含み、かつ、配列番号５の核酸配列を有する、請求項４又は５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項7】
配列番号７の核酸配列を有する、請求項４～６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項8】
アデノ随伴ウイルスベクターに含まれている、請求項４～７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項9】
請求項４～８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項10】
治療有効量の請求項１～３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項11】
Ｆｃ領域を有する１つ又は複数の抗体をさらに含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項12】
対象において抗体依存性細胞毒性の誘導に使用するための、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項13】
対象においてがん、感染症、自己免疫疾患、移植片対宿主病、又は移植後リンパ増殖性疾患の治療に使用するための、請求項１０又は１１に記載の医薬組成物。
【外国語明細書】