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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024050588
(43)【公開日】2024-04-10
(54)【発明の名称】パラポックスウイルスベクター
(51)【国際特許分類】
C12N 15/90 20060101AFI20240403BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240403BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240403BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240403BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240403BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20240403BHJP
A61K 38/19 20060101ALI20240403BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20240403BHJP
A61K 38/21 20060101ALI20240403BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20240403BHJP
A61K 39/12 20060101ALI20240403BHJP
A61K 39/29 20060101ALI20240403BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240403BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240403BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240403BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240403BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240403BHJP
【ＦＩ】
C12N15/90 100Z
C12N7/01
C12N5/10
A61K48/00
A61K35/76
A61K38/17
A61K38/19
A61K38/20
A61K38/21
A61K39/00 A
A61K39/12
A61K39/29
A61P11/00
A61P35/00
A61P31/12
A61P37/04
A61P43/00 105
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024001510
(22)【出願日】2024-01-09
(62)【分割の表示】P 2020546320の分割
【原出願日】2019-03-07
(31)【優先権主張番号】18305237.2
(32)【優先日】2018-03-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】18306424.5
(32)【優先日】2018-10-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】599082883
【氏名又は名称】トランジェーヌ
【氏名又は名称原語表記】ＴＲＡＮＳＧＥＮＥ
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(74)【代理人】
【識別番号】100172557
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 啓靖
(72)【発明者】
【氏名】カローラ、リットナー
(72)【発明者】
【氏名】クリステル、レミ
(72)【発明者】
【氏名】クリスティーヌ、チウデレ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】自然免疫機構および特異的免疫機構の両方を誘発するウイルス免疫療法を提供する。
【解決手段】本発明は、新規な偽牛痘（ＰＣＰＶ）ウイルス（特に、組換えＰＣＰＶ）、その組成物、ならびに疾患、特に、増殖性疾患（例えば、癌および再狭窄）および感染性疾患（例えば、慢性感染性疾患）を予防または治療するためのそれらの治療的使用を提供する。本発明はまた、このようなＰＣＰＶを作製および増幅するための方法、ならびにこのようなＰＣＰＶを使用して免疫応答を惹起もしくは刺激および／または再配向するための方法も提供する。より具体的には、本発明は、既存のポックスウイルスベクター、例えば、ＭＶＡ（改変ウイルスアンカラ）の代替となり、主として、治療的ワクチン接種に使用され得る。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、新規な偽牛痘（ＰＣＰＶ）ウイルス（特に、組換えＰＣＰＶ）、その組成物、ならびに疾患、特に、増殖性疾患（例えば、癌および再狭窄）および感染性疾患（例えば、慢性感染性疾患）を予防または治療するためのそれらの治療的使用を提供する。本発明はまた、このようなＰＣＰＶを作製および増幅するための方法、ならびにこのようなＰＣＰＶを使用して免疫応答を惹起もしくは刺激および／または再配向するための方法も提供する。より具体的には、本発明は、既存のポックスウイルスベクター、例えば、ＭＶＡ（改変ウイルスアンカラ）の代替となり、主として、治療的ワクチン接種に使用され得る。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゲノムに挿入された少なくとも１つの外来核酸を含んでなる、偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ）。
【請求項2】
前記ＰＣＰＶが、ＡＴＣＣ参照番号ＡＴＣＣ ＶＲ－６３４（商標）により特定されるような野生型ＴＪＳ株から、あるいは、同一名もしくは類似名のウイルス株またはその機能的フラグメントもしくは変異体から得られる、請求項１に記載のＰＣＰＶ。
【請求項3】
前記ＰＣＰＶが、さらに、ＰＣＰＶゲノムによりコードされているウイルス機能に欠陥がある、好ましくは、非必須ウイルス機能に欠陥がある、より好ましくは、前記外来核酸の挿入部位にコードされているウイルス遺伝子機能に欠陥がある、請求項１または２に記載のＰＣＰＶ。
【請求項4】
前記外来核酸が、対象において欠陥または欠損タンパク質を補償するポリペプチド；毒性作用を介して身体から罹患細胞を制限または除去する働きをするポリペプチド、例えば、自殺遺伝子産物；抗腫瘍効果を増強し得るポリペプチド、例えば、武装遺伝子産物；ならびに、免疫応答を誘導または活性化し得るポリペプチド、例えば、免疫刺激ポリペプチドおよび抗原ポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項１～３のいずれか一項に記載のＰＣＰＶ。
【請求項5】
前記免疫刺激ポリペプチドが、サイトカイン、例えば、インターロイキン；ケモカイン；インターフェロン；腫瘍壊死因子；コロニー刺激因子；ＡＰＣが露出したタンパク質；抗血管新生作用を有するポリペプチドおよび細胞表面受容体の調節に影響を及ぼすポリペプチド、例えば、免疫チェックポイントのアゴニストまたはアンタゴニストからなる群から選択される、請求項４に記載のＰＣＰＶ。
【請求項6】
前記免疫刺激ポリペプチドが、インターロイキンもしくはコロニー刺激因子、特に、ＧＭ－ＣＳＦであるか、あるいはＯＸ４０に対するアゴニスト抗体である、請求項５に記載のＰＣＰＶ。
【請求項7】
前記抗原ポリペプチドが、癌抗原、例えば、ＭＵＣ－１抗原；ウイルス抗原ポリペプチド、例えば、ＨＰＶ－１６ Ｅ７抗原またはＨＢＶ抗原である、請求項４に記載のＰＣＰＶ。
【請求項8】
前記少なくとも１つの外来核酸が、所望の宿主細胞または対象における発現に好適な調節エレメントに機能的に連結されている、請求項１～７のいずれか一項に記載のＰＣＰＶ。
【請求項9】
前記少なくとも１つの外来核酸が、ポックスウイルスプロモーター、好ましくは、ワクシニアウイルスプロモーター、より好ましくは、７．５Ｋ、Ｈ５Ｒ、１１Ｋ７．５、ＳＥ、ＴＫ、ｐＢ２Ｒ、ｐ２８、ｐ１１およびＫ１Ｌプロモーター、合成プロモーター、ならびに、初期／後期キメラプロモーターからなる群から選択されるプロモーターの制御下に配置される、請求項４に記載のＰＣＰＶ。
【請求項10】
前記少なくとも１つの外来核酸がＶＥＧＦ遺伝子座に挿入されている、請求項１～９のいずれか一項に記載のＰＣＰＶ。
【請求項11】
挿入部位の上流および下流に存在するＰＣＰＶ配列が、それぞれ５’および３’に隣接する外来核酸を含んでなる導入プラスミドと、ＰＣＰＶゲノムとの間の相同組換えにより、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＰＣＰＶを作製するための方法であって、
前記導入プラスミドを作製する工程、および、
前記導入プラスミドを、特に前記導入プラスミドに存在する隣接配列を含んでなるＰＣＰＶウイルスとともに、好適な宿主細胞に導入する工程
を含んでなる、前記方法。
前記導入プラスミドを作製する工程、および、
前記導入プラスミドを、特に前記導入プラスミドに存在する隣接配列を含んでなるＰＣＰＶウイルスとともに、好適な宿主細胞に導入する工程
を含んでなる、前記方法。
【請求項12】
前記ＰＣＰＶゲノム内の前記少なくとも１つの外来核酸の前記挿入部位が、ウイルス遺伝子、好ましくは、非必須ウイルス遺伝子、遺伝子間領域、ＰＣＰＶゲノムの遺伝子産物をコードしない部分、または倍加された遺伝子座に存在する、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ＰＣＰＶゲノムに前記外来核酸を挿入する際に、前記挿入部位のウイルス遺伝子座が、少なくとも部分的に削除され、ウイルス機能に関して欠陥のあるＰＣＰＶウイルスが生じる、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記少なくとも１つの外来核酸がＶＥＧＦ遺伝子座に挿入される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項15】
前記導入プラスミドが、組換えＰＣＰＶの同定を容易にするために１以上の選択遺伝子および／または検出可能遺伝子をさらに含んでなる、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記導入プラスミドが、前記選択遺伝子または前記検出可能遺伝子に二本鎖切断をもたらし得るエンドヌクレアーゼの存在下で宿主細胞に導入される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記選択遺伝子が、選択培地中での増殖を可能とするグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするＧＰＴ遺伝子であり、かつ／あるいは、前記検出可能遺伝子が、ＧＦＰ、ｅ－ＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙをコードする、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項18】
前記好適な宿主細胞がウシ鼻甲介（ＢＴ）細胞である、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
（ａ）一方もしくは両方のＶＥＧＦ遺伝子座に挿入された、好ましくは初期／後期ワクシニアｐＨ５Ｒプロモーターの転写制御下で挿入された、ヒトＭＵＣ－１抗原をコードする核酸を含んでなるＰＣＰＶウイルス、または、（ｂ）一方もしくは両方のＶＥＧＦ遺伝子座に挿入された、好ましくは初期／後期ワクシニアｐ７．５プロモーターの転写制御下で挿入された、膜係留型ＨＰＶ－１６非発癌性Ｅ７抗原をコードする核酸を含んでなるＰＣＰＶ
を作製するための、請求項１１～１８のいずれか一項に記載の方法。
を作製するための、請求項１１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
請求項１～１０のいずれか一項に記載のＰＣＰＶまたは請求項１１～１９のいずれか一項に記載の方法により作製されたＰＣＰＶを増幅するための方法であって、以下の工程：ａ）産生細胞株を準備する工程、
ｂ）前記準備した産生細胞株にトランスフェクトするまたは感染させる工程、
ｃ）前記トランスフェクトされたまたは感染した産生細胞株を、ウイルスの産生を可能とするために好適な条件下で培養する工程、
ｄ）前記産生されたウイルスを、前記産生細胞株の培養物から回収する工程、および、
ｅ）場合により、前記回収されたウイルスを精製する工程
を含んでなる、前記方法。
ｂ）前記準備した産生細胞株にトランスフェクトするまたは感染させる工程、
ｃ）前記トランスフェクトされたまたは感染した産生細胞株を、ウイルスの産生を可能とするために好適な条件下で培養する工程、
ｄ）前記産生されたウイルスを、前記産生細胞株の培養物から回収する工程、および、
ｅ）場合により、前記回収されたウイルスを精製する工程
を含んでなる、前記方法。
【請求項21】
前記産生細胞がＨｅＬａである、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
治療上有効な量の請求項１～１０のいずれか一項に記載のＰＣＰＶまたは請求項２０もしくは２１に記載の方法により増幅されたＰＣＰＶと、薬学上許容可能なビヒクルとを含んでなる組成物。
【請求項23】
前記組成物が、およそ１０３～およそ１０１２ｐｆｕ、有利にはおよそ１０４～およそ１０１１ｐｆｕ、好ましくはおよそ１０５～およそ１０１０ｐｆｕ、より好ましくはおよそ１０６～およそ１０９ｐｆｕのＰＣＰＶを含んでなる個別の用量で調合される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項24】
前記組成物が、静脈内、筋肉内、皮下または腫瘍内投与向けに調合される、請求項２２または２３に記載の組成物。
【請求項25】
病原生物または望まない細胞分裂により引き起こされる疾患または病状の処置または予防に使用するための、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項26】
請求項２２～２５のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする対象に、病原生物または望まない細胞分裂により引き起こされる疾患または病状を処置または予防するために十分な量で投与することを含んでなる、処置方法。
【請求項27】
請求項２２～２５のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法。
【請求項28】
１０６～１０９ｐｆｕを含んでなるＰＣＰＶ組成物の２～６回の毎週の投与と、場合により、その後の３週間隔の２～１５回のさらなる投与とを含んでなる、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項29】
腎臓癌、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、胆管癌、子宮内膜癌、膵臓癌および卵巣癌ならびにＭＵＣ１を過剰発現する癌からなる群から選択される癌を処置するための、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項30】
ＭＵＣ１抗原をコードするＰＶＰＣを使用して、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬ）を有する対象を処置するための、請求項２９に記載の使用または方法。
【請求項31】
ＨＰＶ１６ Ｅ７抗原をコードするＰＶＰＣを使用して、ＨＰＶ陽性癌、例えば、子宮頸癌または頭頸部癌を処置するための、請求項２９に記載の使用または方法。
【請求項32】
手術、放射線療法、化学療法、凍結療法、ホルモン療法、毒素療法、免疫療法、サイトカイン療法、標的癌療法、遺伝子療法、光線力学療法および移植からなる群から選択される１以上のその他の治療法と併用される、請求項２５～３１のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項33】
プライム組成物およびブースト組成物の逐次投与を含んでなるプライム・ブーストアプローチに従って行われる、請求項３２に記載の使用または方法。
【請求項34】
前記プライム組成物が、腫瘍内経路により投与されるＰＣＰＶ組成物であり、前記ブースト組成物が、静脈内経路により投与されるＭＶＡ組成物である、請求項３３に記載の使用または方法。
【請求項35】
免疫応答を惹起もしくは刺激および／または再配向するための方法であって、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする対象に、その対象の免疫を活性化するために十分な量で投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項36】
以下の特性：
ＰＢＭＣからの高レベルのＩＦＮ－αの分泌；
単球由来樹状細胞の活性化；
Ｔ細胞の活性化または増殖の誘導；
ＭＤＳＣにおけるより良いサイトカイン／ケモカインプロファイル；
ＡＰＣの活性化；
ヒトマクロファージのＭ２からＭ１への変換；および／または、
ＴＬＲ９介在経路またはその他の自然免疫刺激経路による免疫の誘導
のうち少なくとも１つをもたらす、請求項３５に記載の方法。
ＰＢＭＣからの高レベルのＩＦＮ－αの分泌；
単球由来樹状細胞の活性化；
Ｔ細胞の活性化または増殖の誘導；
ＭＤＳＣにおけるより良いサイトカイン／ケモカインプロファイル；
ＡＰＣの活性化；
ヒトマクロファージのＭ２からＭ１への変換；および／または、
ＴＬＲ９介在経路またはその他の自然免疫刺激経路による免疫の誘導
のうち少なくとも１つをもたらす、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野
本発明は、ウイルス免疫療法の分野である。本発明は、新規な偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ：pseudocowpox virus）（特に、組換えＰＣＰＶ）、その組成物、ならびに疾患（特に、増殖性疾患（例えば、癌および再狭窄）および感染性疾患）を予防または処置するためのそれらの治療的使用を提供する。本発明はまた、このようなＰＣＰＶを作製および増幅するための方法、ならびにこのようなＰＣＰＶを使用して免疫応答を惹起もしくは刺激および／または再配向するための方法も提供する。より具体的には、本発明は、既存のポックスウイルスベクター、例えば、ＭＶＡ（改変ウイルスアンカラ：Modified Virus Ankara）の代替となり、主として、治療的ワクチン接種に使用され得る。
本発明は、ウイルス免疫療法の分野である。本発明は、新規な偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ：pseudocowpox virus）（特に、組換えＰＣＰＶ）、その組成物、ならびに疾患（特に、増殖性疾患（例えば、癌および再狭窄）および感染性疾患）を予防または処置するためのそれらの治療的使用を提供する。本発明はまた、このようなＰＣＰＶを作製および増幅するための方法、ならびにこのようなＰＣＰＶを使用して免疫応答を惹起もしくは刺激および／または再配向するための方法も提供する。より具体的には、本発明は、既存のポックスウイルスベクター、例えば、ＭＶＡ（改変ウイルスアンカラ：Modified Virus Ankara）の代替となり、主として、治療的ワクチン接種に使用され得る。
【背景技術】
【0002】
背景技術
免疫療法は、宿主の免疫系を増強して、身体を補助し、病原体および異常な細胞を根絶しようというものである。免疫療法は、従来のワクチン接種において広く使用されているが、特異的免疫応答および自然免疫応答を刺激する試みにおいて重篤な慢性疾患または命を脅かす疾患を処置するための潜在的方法として活発に検討されてもいる。膨大な数の免疫療法が、数十年間で文献に記載されてきた。特に、現在、いくつかのウイルスベクターおよび非ウイルス性ベクターが浮上しているが、それらは総て相対的な利益および制限を有し、それらを特定の適応に適合させる（例えば、Ｃａｔｔａｎｅｏ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２０１７，ＰＬＯＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌｐｐａｔ．１００６１９０；Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １４：６４２－６６１；Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１３ ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ １２（１２）：１３９５－１４１６参照）。膨大な数の免疫療法プラットフォームが臨床試験で評価されており、腫瘍溶解性であれそうでないものであれ、ポックスウイルス療法に基づく現在の臨床研究の数が、それらの治療可能性に関心が寄せられていることを表している。例えば、組換えワクシニアウイルス（ＶＶ）に基づくベクターは、それらの優れた安全性プロファイルと、ロバストな細胞性抗原特異的免疫応答および自然免疫系の全般的刺激を組み合わせるそれらの能力とに関して魅力的な候補である。ＴＧ４０１０（またはその研究名を伴うＭＶＡＴＧ９９３１）は、ＭＵＣ１腫瘍関連抗原およびヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）をコードする改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ：modified vaccinia virus Ankara）に基づいた治療用癌ワクチンである。ＴＧ４０１０は、進行して転移した非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の第一選択標準治療化学療法と組み合わせて、２つの異なる無作為化比較対照第２ｂ相臨床試験で有効性を示した（Ｑｕｏｉｘ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １２（１２）：１１２５－３３）。
免疫療法は、宿主の免疫系を増強して、身体を補助し、病原体および異常な細胞を根絶しようというものである。免疫療法は、従来のワクチン接種において広く使用されているが、特異的免疫応答および自然免疫応答を刺激する試みにおいて重篤な慢性疾患または命を脅かす疾患を処置するための潜在的方法として活発に検討されてもいる。膨大な数の免疫療法が、数十年間で文献に記載されてきた。特に、現在、いくつかのウイルスベクターおよび非ウイルス性ベクターが浮上しているが、それらは総て相対的な利益および制限を有し、それらを特定の適応に適合させる（例えば、Ｃａｔｔａｎｅｏ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２０１７，ＰＬＯＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌｐｐａｔ．１００６１９０；Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １４：６４２－６６１；Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１３ ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ １２（１２）：１３９５－１４１６参照）。膨大な数の免疫療法プラットフォームが臨床試験で評価されており、腫瘍溶解性であれそうでないものであれ、ポックスウイルス療法に基づく現在の臨床研究の数が、それらの治療可能性に関心が寄せられていることを表している。例えば、組換えワクシニアウイルス（ＶＶ）に基づくベクターは、それらの優れた安全性プロファイルと、ロバストな細胞性抗原特異的免疫応答および自然免疫系の全般的刺激を組み合わせるそれらの能力とに関して魅力的な候補である。ＴＧ４０１０（またはその研究名を伴うＭＶＡＴＧ９９３１）は、ＭＵＣ１腫瘍関連抗原およびヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）をコードする改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ：modified vaccinia virus Ankara）に基づいた治療用癌ワクチンである。ＴＧ４０１０は、進行して転移した非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の第一選択標準治療化学療法と組み合わせて、２つの異なる無作為化比較対照第２ｂ相臨床試験で有効性を示した（Ｑｕｏｉｘ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １２（１２）：１１２５－３３）。
【0003】
パラポックスウイルスは、ベクターワクチンに使用可能なまた違った候補に相当する。パラポックスウイルスは、ポックスウイルス科、コードポックスウイルス亜科に属する。パラポックスウイルスは、反芻動物の皮膚疾患の病原体として一般に知られており、丘疹性口炎および伝染性嚢胞性皮膚炎を、特に口唇領域、鼻孔領域、口腔粘膜領域および乳頭領域にもたらす。ポックスウイルス科のその他のメンバーと同様に、パラポックスウイルスは、比較的大型で、エンベロープを有する、卵形の二本鎖ＤＮＡウイルスであり、哺乳動物およびヒトの広い選択を含む脊椎動物に感染し得る。パラポックスウイルスは、他のポックスウイルスとは異なるユニークならせん状のコートを有する。
【0004】
ポックスウイルスの場合、パラポックスのウイルス複製の場は細胞質である。宿主細胞への侵入は、宿主細胞へのウイルスのエンドサイトーシスを媒介する宿主のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）にウイルスタンパク質が結合することによって達成される。細胞膜との融合により、宿主の細胞質へのコアの放出が可能となる。初期遺伝子は、ウイルスＲＮＡポリメラーゼによって細胞質内で転写される。初期発現は感染後３０分で開始する。中期は、感染後およそ１００分でゲノムＤＮＡ複製を誘発する。次いで、後期遺伝子が感染後１４０分～４８時間で発現され、総ての構造タンパク質が産生される。子孫ビリオンの組み立ては、細胞質のウイルス工場で開始し、球形の未成熟粒子が産生される。このウイルス粒子が、れんが型の細胞内成熟ビリオン（ＩＭＶ）へと成熟する。ＩＭＶビリオンは、細胞溶解時に放出され得るか、またはトランスゴルジから第二の二重膜を獲得し、細胞外エンベロープビリオン（ＥＥＶ）宿主受容体（external enveloped virion (EEV) host receptors）として出芽し、これがエンドサイトーシスを媒介し得る。ウイルスは、細胞死の後は包埋体内に存在することによって宿主細胞を出て行き、別の宿主を見つけるまで感染性を保持する。
【0005】
複製能があり、かつ、不活性化されたパラポックスウイルスは、それらの免疫調節特性に関して知られている（Ｓｃｈｕｌｚｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３７：２６０－７）。パラポックスウイルス属の原種（prototype species）であるパラポックスウイルス・オヴィス（ＯＲＦＶ）は、獣医学において、動物の慢性持続的ウイルス感染における全般的な耐性を増強するために（例えば、ＵＳ６，３６５，３９３；ＷＯ９７／３２０２９およびＵＳ２００３－００１３０７６）、ならびにヒト医学において、ＨＩＶを処置するために（ＷＯ２００６／００５５２９）、好成績で使用されており、腫瘍溶解性があると考える人もいる（Ｒｉｎｔｏｕｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０（６）：１１４８－５７）。種々の挿入部位がＯＲＦＶゲノム内に特定された（ＷＯ９７／３７０３１）。特に、イヌジステンバー(disempter)ウイルス（ＣＤＶ）抗原をコードする組換えＯＲＦＶは、ＣＤＶに対するワクチン（ＷＯ２０１２／０１１４５）およびブタの偽狂犬病ウイルスに対するワクチンとして使用された（Ｒｏｏｉｊ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｖａｃｃｉｎｅ ２８（７）：１８０８－１３）。化学的に不活化されたＤ１７０１株由来ＯＲＦＶの調製物であるＺｙｌｅｘｉｓ（登録商標）（旧称Ｂａｙｐａｍｕｎｅ（登録商標）としても知られる）は、動物において感染性疾患の予防および治療的処置のため、また、ストレス誘発疾患の予防のために使用される。不活化されたＯＲＦＶは、おそらくＴＬＲ－９依存性経路の関与のために形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を誘導することが示された（Ｖｏｎ Ｂｕｔｔｌａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ９（８）：ｅ１０６１８８）。より最近では、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７，Ｓｕｒｇｅｒｙ，ｄｏｉ １０．１０１６／ｊ．ｓｕｒｇ．２０１７．０９．０３０）は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）腫瘍におけるキメラパラポックスウイルスの強力な細胞傷害活性を報告した。その注射の１週間後に腫瘍組織においてキメラＯＲＦウイルスの活発な複製が検出され、ウイルスで処置した腫瘍組織の辺縁部でナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の浸潤が観察された。
【0006】
命を脅かす疾患、例えば、癌および感染性疾患の処置のために有効なアプローチを開発する重大な必要性が明らかにある。実際に、罹患細胞は、免疫系を回避するための強力な免疫抑制機構を発達させ、有効な免疫療法に対する主要な障害となっている。したがって、自然免疫機構および特異的免疫機構の両方の誘発は、より有効な免疫療法の開発の成功の鍵となり得る。
【発明の概要】
【0007】
本発明は、治療遺伝子の送達のためのベクターとしてのパラポックスウイルスの使用に関する。本発明者らは、意外にも、偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ）は、その限定された病原性および免疫調節特性を考慮すれば、抗癌療法に特に適当であり、顕著な利点を提供することを見出した。本発明者らは、ＰＣＰＶは、免疫エフェクター細胞を刺激するいくつかのサイトカインおよびケモカインの分泌を、従来のＭＶＡおよびＶＶよりも高いレベルで活性化するその能力によって裏づけられるような、その他のポックスウイルスとは異なる強力な自然免疫プロファイルを提供することを見出した。パラポックスウイルス属の別のメンバーであるウシ丘疹性口炎ウイルス（ＢＰＳＶ）は、ＰＢＭＣにおいてＰＣＰＶと類似の効果を示し、上清中の分泌されたＩＦＮ－αが顕著に増加した。さらに、ヒトのｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導されたＭ２型マクロファージにおけるＣＤ８６発現の増加は、Ｍ２マクロファージを抑制性の低い表現型へ再プログラミングする際のＰＣＰＶの役割を示唆する。最後に、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現するように操作された組換えＰＣＰＶウイルスは、シンジェニック動物モデルにおいて腫瘍成長を抑制し、生存率を高めるのに特に有効であることが示された。ＰＣＰＶと抗ＰＤ１抗体との組合せは、「二腫瘍」モデルにおいて腫瘍抑制の統計的に有意な改善を示した。
【0008】
ＰＣＰＶウイルスおよびＢＰＳＶウイルスによって示される免疫原性の改善のため、パラポックスウイルスは、増殖性疾患（例えば、癌）および感染性疾患（例えば、慢性ＨＢＶ）を処置または予防するためのその他のウイルス療法の代替として首尾良く使用され得ることが予想可能である。したがって、ＰＣＰＶまたはＢＰＳＶは、腫瘍環境に効果を及ぼし得る治療ワクチンの候補である。
【0009】
発明の概要
本発明の１つの態様は、ゲノムに挿入された少なくとも１つの外来核酸を含んでなる偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ）に関する。
本発明の１つの態様は、ゲノムに挿入された少なくとも１つの外来核酸を含んでなる偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ）に関する。
【0010】
一実施形態において、ＰＣＰＶは、ＡＴＣＣ参照番号ＡＴＣＣ ＶＲ－６３４（商標）により特定されるような野生型ＴＪＳ株から、あるいは同一名または類似名のウイルス株またはその機能的フラグメントもしくは変異体から得られる。
【0011】
別の実施形態において、ＰＣＰＶは、さらにＰＣＰＶゲノムによりコードされているウイルス機能に欠陥があってよく、好ましくは、非必須ウイルス機能、より好ましくは、外来核酸の挿入部位にコードされているウイルス遺伝子機能に欠陥があってよい。
【0012】
さらなる実施形態において、外来核酸は、対象において欠陥または欠損タンパク質を補償するポリペプチド；毒性作用を介して身体から罹患細胞を制限または除去する働きをするポリペプチド、例えば、自殺遺伝子産物；抗腫瘍効果を増強し得るポリペプチド、例えば、武装遺伝子産物；および免疫応答を誘導または活性化し得るポリペプチド、例えば、免疫刺激ポリペプチドおよび抗原ポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。好ましくは、免疫刺激ポリペプチドが、サイトカイン（例えば、インターロイキン）；ケモカイン；インターフェロン；腫瘍壊死因子；コロニー刺激因子；ＡＰＣが露出したタンパク質；抗血管新生作用を有するポリペプチドおよび細胞表面受容体の調節に影響を及ぼすポリペプチド（例えば、免疫チェックポイントのアゴニストまたはアンタゴニスト）からなる群から選択され、特に好ましくは、インターロイキンまたはコロニー刺激因子（特に、ＧＭ－ＣＳＦ）、またはＯＸ４０に対するアゴニスト抗体である。また、癌抗原（例えば、ＭＵＣ－１抗原）、ウイルス抗原ポリペプチド（例えば、ＨＰＶ－１６ Ｅ７抗原またはＨＢＶ抗原）も好ましい。
【0013】
なおさらなる実施形態において、少なくとも１つの外来核酸は、所望の宿主細胞または対象における発現に好適な調節エレメントに機能的に連結されている。
【0014】
さらなる実施形態において、少なくとも１つの外来核酸は、ＶＥＧＦ遺伝子座に挿入されている。
【0015】
別の態様において、本発明はさらに、挿入部位の上流および下流に存在するＰＣＰＶ配列が、それぞれ５’および３’に隣接する外来核酸を含んでなる導入プラスミドと、ＰＣＰＶゲノムとの間の相同組換えにより、本発明のＰＣＰＶを作製するための方法であって、
前記導入プラスミドを作製する工程、および、
前記導入プラスミドを、特に前記導入プラスミドに存在する隣接配列を含んでなるＰＣＰＶとともに、好適な宿主細胞に導入する工程
を含んでなる方法を提供する。
前記導入プラスミドを作製する工程、および、
前記導入プラスミドを、特に前記導入プラスミドに存在する隣接配列を含んでなるＰＣＰＶとともに、好適な宿主細胞に導入する工程
を含んでなる方法を提供する。
【0016】
一実施形態において、ＰＣＰＶゲノム内の少なくとも１つの外来核酸の挿入部位は、ウイルス遺伝子、好ましくは、非必須ウイルス遺伝子、遺伝子間領域、ＰＣＰＶゲノムの遺伝子産物をコードしない部分、または倍加された遺伝子座、より好ましくは、ＶＥＧＦ遺伝子座に存在する。
【0017】
一実施形態において、導入プラスミドは、組換えＰＣＰＶの同定を容易にするために１以上の選択遺伝子および／または検出可能遺伝子、は、選択用ＧＰＴ遺伝子および／またはＧＦＰ、ｅ－ＧＦＰもしくはｍＣｈｅｒｒｙをコードする検出可能遺伝子をさらに含んでなる。
【0018】
さらなる態様において、本発明はさらに、本発明のＰＣＰＶ、または本発明の方法により作製されたＰＣＰＶを増幅するための方法であって、
以下の工程：
ａ）産生細胞株を準備する工程、
ｂ）前記準備した生産細胞株にトランスフェクトするまたは感染させる工程、
ｃ）前記トランスフェクトされたまたは感染した産生細胞株を、ウイルスの産生を可能とするために好適な条件下で培養する工程、
ｄ）前記産生されたウイルスを、前記産生細胞株の培養物から回収する工程、および、
ｅ）場合により、前記回収されたウイルスを精製する工程
を含んでなる、前記方法に関する。
以下の工程：
ａ）産生細胞株を準備する工程、
ｂ）前記準備した生産細胞株にトランスフェクトするまたは感染させる工程、
ｃ）前記トランスフェクトされたまたは感染した産生細胞株を、ウイルスの産生を可能とするために好適な条件下で培養する工程、
ｄ）前記産生されたウイルスを、前記産生細胞株の培養物から回収する工程、および、
ｅ）場合により、前記回収されたウイルスを精製する工程
を含んでなる、前記方法に関する。
【0019】
なおさらなる態様において、本発明は、治療上有効な量の本発明のＰＣＰＶまたは本発明による方法により増幅されたＰＣＰＶと薬学上許容可能なビヒクルとを含んでなる組成物に関する。好ましくは、この組成物は、およそ１０３～およそ１０１２ｐｆｕを含んでなる個別の用量で調合される。好ましくは、それは静脈内、筋肉内、皮下または腫瘍内投与向けに調合される。
【0020】
一実施形態において、組成物は、病原生物または望まない細胞分裂により引き起こされる疾患または病状の処置または予防に使用するためのものである。
【0021】
なおさらなる態様において、本発明は、腫瘍細胞の増殖を処置する方法および腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法であって、本発明の組成物を、それを必要とする対象に、病原生物または望まない細胞分裂により引き起こされる疾患または病状を処置または予防するために十分な量で投与することを含んでなる方法を提供する。
【0022】
一実施形態において、癌は、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、胆管癌、子宮内膜癌、膵臓癌および卵巣癌、ならびにＭＵＣ１を過剰発現する癌からなる群から選択される。
【0023】
別の実施形態において、上記方法または使用は、手術、放射線療法、化学療法、凍結療法、ホルモン療法、毒素療法、免疫療法、サイトカイン療法、標的癌療法、遺伝子療法、光線力学療法および移植からなる群から選択される１以上のその他の治療法とともに実施される。
【0024】
さらなる実施形態において、上記方法または使用は、プライム組成物およびブースト組成物の逐次投与を含んでなるプライム・ブーストアプローチに従って実行される。
【0025】
さらなる態様において、本発明は、免疫応答を惹起もしくは刺激および／または再配向するための方法であって、本発明の組成物を、それを必要とする対象に、その対象の免疫を活性化させるために十分な量で投与することを含んでなる方法に関する。
【0026】
一実施形態において、その方法は、以下の特性：
（ａ）ＰＢＭＣからの高レベルのＩＦＮ－αの分泌；
（ｂ）単球由来樹状細胞の活性化；
（ｃ）Ｔ細胞増殖の誘導（例えば、グランザイムＢ高発現Ｔ細胞によって間接的に表されるように）；
（ｄ）ＭＤＳＣにおけるより良いサイトカイン／ケモカインプロファイル；
（ｅ）ＡＰＣの活性化；
（ｆ）ヒトマクロファージのＭ２からＭ１への変換；および／または
（ｇ）ＴＬＲ９介在経路またはその他の自然免疫刺激経路による免疫の誘導
のうち少なくとも１つをもたらす。
（ａ）ＰＢＭＣからの高レベルのＩＦＮ－αの分泌；
（ｂ）単球由来樹状細胞の活性化；
（ｃ）Ｔ細胞増殖の誘導（例えば、グランザイムＢ高発現Ｔ細胞によって間接的に表されるように）；
（ｄ）ＭＤＳＣにおけるより良いサイトカイン／ケモカインプロファイル；
（ｅ）ＡＰＣの活性化；
（ｆ）ヒトマクロファージのＭ２からＭ１への変換；および／または
（ｇ）ＴＬＲ９介在経路またはその他の自然免疫刺激経路による免疫の誘導
のうち少なくとも１つをもたらす。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】図１は、種々のＭＯＩ（ＭＯＩ ０．１、ＭＯＩ １およびＭＯＩ ５）での２回の異なる実験（実験１および実験２）において、２名のドナーからのＰＢＭＣにおけるＩＦＮ－αの分泌を示す図である。Ｍｏｃｋは陰性対照を表し、供試した種々のウイルスは、パラポックスウイルス（偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ）およびパラポックスウイルス・オヴィス（ＯＲＦＶ））、ＭＶＡ（ＭＶＡＮ３３．１という名称のエンプティーＭＶＡベクター）、牛痘ウイルス（ＣＰＸ）、コペンハーゲンワクシニアウイルス（Ｃｏｐｗｔ）、鶏痘（ＦＰＶ）、粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）、豚痘（ＳＷＰＶ）、ラクーンポックスウイルス（ＲＣＮ）、コティアウイルス（ＣＴＶ：Cotiavirus）およびヤバ様病ウイルス（ＹＬＤＶ：Yaba-like disease virus）である。
【図2】図２は、３名の異なるドナーから得たｍｏＤＣであって、ウイルス感染したｍｏＤＣにおける、フローサイトメトリーにより測定された活性化マーカーＣＤ８６の発現レベルを示す図である。エンプティーＭＶＡベクターＭＶＡＮ３３．１またはＰＣＰＶに、ＭＯＩ ０．０３、０．３または１で感染後１６時間に、あるいは、陰性対照としてのｍｏｃｋで観察されたｍｏＤＣ（３名のドナー）中のＣＤ８６に関する蛍光強度中央値（ＭｅｄＦＩ）を示す。発現レベルは、フローサイトメトリーによる細胞結合シグナルの抗ＣＤ８６－ＰＥ定量を使用した染色によって測定した。
【図3】図３は、ＭＯＩ ５、１および０．３でＭＶＡＮ３３．１またはＰＣＰＶとともにインキュベートした後に、本明細書に記載されるようなＰＢＭＣ由来のＣＤ１６３＋ＣＤ２０６＋Ｍ２マクロファージの上清において、Ｌｕｍｉｎｅｘ分析により測定されたサイトカインレベルを示す図である。
【図4】図４は、Ａ）ＣＴＬ単独、またはＣＴＬと２０ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ４および１μＭのプロスタグランジンＥ２の存在下で誘導されたＭＤＳＣとの共培養下（ＭＤＳＣ／Ｔ比１／２）において、ＭＯＩ ０．０３、０．３または３のＰＣＰＶで処理した後の相対的なＣＴＬの増殖、Ｂ）高増殖性Ｔ細胞単独またはＭＤＳＣとの共培養下（Ａに示されたように共培養）において、示されたＭＯＩのＰＣＰＶで処理された高増殖性Ｔ細胞の相対的なグランザイムＢの発現、Ｃ）ＭＤＳＣを、示されたＭＯＩのＰＣＰＶで一晩処理した後のＩＦＮ－αの分泌を示す図である。
【図5】図５は、Ａ）ＣＴＬ単独、またはＣＴＬと１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６の存在下で誘導されたＭＤＳＣとの共培養下（ＭＤＳＣ／Ｔ比１／２および１／１）において、ＭＯＩ ０．０３、０．３または３のＰＣＰＶで処理した後の相対的なＣＴＬの増殖、Ｂ）増殖性Ｔ細胞単独またはＭＤＳＣとの共培養下（Ａに示されたように共培養）において、示されたＭＯＩのＰＣＰＶで処理された増殖性Ｔ細胞の相対的なグランザイムＢの発現を示す図である。
【図6】図６は、ＭＣ３８腫瘍モデルにおける腫瘍成長および動物生存の進行を示す図である。動物を１０個体ずつの３群に分けた。総ての群で、（Ａ）に示されるプロトコールに従い、シンジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスの皮下に２．１０６個のＭＣ３８細胞を注射した。注射部位にパーマネントマーカーで印を付けた。この動物に３回の１．１０７ｐｆｕ ＭＶＡ－ＨＰＶ１６Ｅ７ｍ（Ｂ）またはＰＣＰＶ－ＨＰＶ１６Ｅ７ｍ（Ｃ）またはバッファー（Ｄ）の腫瘍内注射を、それぞれ細胞移植（細胞株注射部位に）の２日後、ならびに９日目および１６日目の新生腫瘍中に行った。腫瘍成長は、腫瘍体積を経時的に測定することにより評価した。（Ｅ）：カプラン・マイヤー曲線として表した全生存率（ＯＳ）。実線（－）は、ＭＶＡ－ＨＰＶ１６Ｅ７ｍで処置された動物群（ＭＶＡＴＧ１４１９７）を表し、破線（－－）は、ＰＣＰＶ－ＨＰＶ１６Ｅ７ｍで処置された群（ＰＣＰＶ１９１７８）を表し、点線（..）は、バッファーで処置した群（Ｓ０８）を表す。
【図7】図７は、ＭＣ３８細胞の生存能に及ぼすＰＣＰＶの影響を示す図である。２×１０４個の細胞を播種し、ＰＣＰＶ－ＧＦＰ、陽性対照としてＶＶ－ＧＦＰ（ＶＶＴＧと呼称）および陰性対照としてｍｏｃｋのいずれかに、ＭＯＩ １、１０－１、１０－２および１０－３で感染させた。５日後、細胞を掻き取って採取し、生細胞の数および割合を、トリパンブルー染色および細胞計数器Ｖｉｃｅｌｌを使用して決定した。
【図8】図８は、ＰＣＰＶまたはＭＶＡまたはバッファー（陰性対照として）のｓｃ注射後の局所的サイトカイン・ケモカインプロファイルを示す図である。各群４個体のマウスの剃毛した両側腹部に、５×１０５ｐｆｕウイルス／側腹部をｓｃ注射した。各マウスについて、１６時間後に両側腹部からの皮膚を採取し、細胞を機械的に解離させた（間質／細胞外分析物の遊離）。３００ｇで遠心分離した後、上清をエッペンドルフ管に入れ、低温にて１８０００ｇで遠心分離した。明澄な上清を、ＭａｇＰｉｘ装置を製造者の推奨に従って使用するＰｒｏｃａｒｔａｐｌｅｘマウスケモカイン・サイトカインマルチプレックスキットで分析した。
【図9】図９は、ＴＩＬを含む組成物に関するＰＣＰＶの効果を示す図である。ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋ＣＤ４５＋細胞集団において、好中球のパーセンテージを検出した（Ａ）。ＴＡＭは、Ｌｙ６Ｇ－ＣＤ１１ｂ＋細胞内のＣＤ１１ｃ－亜集団として特定された。種々の亜集団をＭＨＣ ＩＩおよびＬｙ６Ｃで層化した。Ｂｒａｕｎｅｒらによる「ＴＡＭ Ｃ」は、ＭＨＣ ＩＩｌｏおよびＬｙ６Ｃ＋として特徴付けられた。
【図10】図１０は、（Ａ）Ｒ９Ｆペプチドで刺激後の、プールした脾臓中でのＨＰＶ１６ Ｅ７特異的なＴ細胞の生成（ＥＬＩＳＰＯＴ）、（Ｂ）Ｔ８Ｖで刺激後のＭＶＡ特異的なＴ細胞の生成、（Ｃ）示されたウイルスで繰り返し静脈内（ｉｖ）処置したマウスのプールした肺におけるＣＤ３ｄｉｍＣＤ８ｄｉｍＴ細胞集団の出現、および（Ｄ）プールした肺におけるＣＤ３ｄｉｍＣＤ８ｄｉｍＴ細胞集団内のＨＰＶ－１６ Ｅ７特異的なＴ細胞の生成を示す図である。
【図11】図１１は、エンプティーＭＶＡ（ＭＶＡＴＧＮ３３．１）、ＨＰＶ１６Ｅ７コードＭＶＡ（ＭＶＡＴＧ１４１９７）およびＨＰＶ１６Ｅ７コードＰＣＰＶ感染時に、ＩＣＳにより測定されたＣＤ３ｄｉｍＣＤ８ｄｉｍＴ細胞集団内のＨＰＶ１６ Ｅ７特異的なＴ細胞の出現の誘導倍率（fold induction）（対照ペプチドに対する特異的なペプチド）を示す図である。
【図12】図１２は、ＭＣ３８担持マウスにおける、１×１０７ｐｆｕのＰＣＰＶ（Ａ）またはバッファー（Ｅ）の腫瘍内注射時、ならびにそれぞれマウス好中球、ＣＤ８＋細胞およびＣＤ４＋細胞を除去するための除去抗体抗Ｌｙ６Ｇ（Ｂ）、抗ＣＤ８（Ｃ）および抗ＣＤ４（Ｄ）の腹腔内注射時の腫瘍抑制試験を示す図である。各群は１３個体のマウスを含む。
【図13】図１３は、ＰＣＰＶ注射を投与され、３４日目にＭＣ３８腫瘍の退縮または消散を示した生存マウス由来の脾細胞に対するＥＬＩＳＰＯＴ分析を示す図である。脾細胞懸濁液からリンパ球を単離するために、５個体の生存動物（ＰＣＰＶ生存個体プール）および２個体の各生存個体（ＰＣＰＶ生存個体）およびナイーブマウス（ナイーブ）から脾臓を採取した。１×１０７細胞／ｍＬをＥＬＩＳＡプレートに播種し、マイトマイシンＣ処理ＭＣ３８細胞または無関係のＩ８Ｌペプチドまたは完全培地（培地）で刺激した。スポットをＥＬＩＳＰＯＴリーダー（ＣＴＬ Ｉｍｍｕｎｏｑｐｏｔリーダー）で計数した。各条件を４プレートで試験し、結果を１×１０６脾臓リンパ球当たりのスポット形成単位(spot-forming units)（ｓｆｕ）の平均数として表した。
【図14】図１４は、プライム／ブーストセットに従ったＴＣ１担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける腫瘍抑制試験を示す図である。ＴＣ１細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に皮下移植した。１４日後に、腫瘍担持マウスを無作為化し（各群１０個体）、１．１０６ｐｆｕのＭＶＡ－ＨＰＶ１６Ｅ７（ＡおよびＢ）もしくはＰＣＰＶ－ＨＰＶ１６Ｅ７（Ｃ）またはバッファー（Ｄ）を腫瘍内に注射した（プライム注射）。１週間後、マウスに、１×１０６ｐｆｕの対応するウイルス、すなわち、ＰＣＰＶ－ＨＰＶ１６Ｅ７（Ｄ）またはＭＶＡ－ＨＰＶ１６Ｅ７（ＡおよびＣ）またはバッファー（バッファープライムマウスのＢ）の静注によってブーストを実施した。腫瘍成長は経時的であった。
【発明を実施するための形態】
【0028】
発明の詳細な説明
定義
出願全体を通して使用される用語「ａ」および「ａｎ」は、文脈が明らかにそうではないことを示していなければ、「少なくとも１つの」、「少なくとも第１の」、「１以上の」または「複数の」参照成分または工程を意味するという意味で使用される。例えば、用語「細胞（a cell）」は、その混合物を含む複数の細胞を含む。
定義
出願全体を通して使用される用語「ａ」および「ａｎ」は、文脈が明らかにそうではないことを示していなければ、「少なくとも１つの」、「少なくとも第１の」、「１以上の」または「複数の」参照成分または工程を意味するという意味で使用される。例えば、用語「細胞（a cell）」は、その混合物を含む複数の細胞を含む。
【0029】
用語「１以上の」は、１または１を超える数（例えば、２、３、４など）を指す。
【0030】
用語「および／または」は、本明細書で使用する場合、「および」、「または」および「上記の用語でつながれた要素の総てまたはその他のいずれかの組合せ」の意味を含む。
【0031】
用語「約」または「およそ」は、本明細書で使用する場合、所与の値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。
【0032】
本明細書で生成物および組成物を定義するために使用する場合、用語「を含んでなる」（ならびに「を含んでなる(comprising)」のいずれかの形態、例えば、「comprise」および「comprises」）、「を有する」（ならびに「を有する(having)」のいずれかの形態、例えば、「have」および「has」）、「を含む」（ならびに「を含む(including)」のいずれかの形態、例えば、「includes」および「include」）または「を含有する」（ならびに「を含有する(containing)」のいずれかの形態、例えば、「contains」および「contain」）は、オープンエンド形式であり、列挙されていない付加的な要素または方法工程を排除しない。「から本質的になる」という表現は、いずれの本質的に重要なその他の成分または工程を排除することを意味する。したがって、列挙された成分から本質的になる組成物は、微量成分、混入物および薬学上許容可能な担体を排除しない。「からなる」は、その他の成分または工程の微量ではない要素を排除することを意味するものとする。
【0033】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、ペプチド結合を介して結合された少なくとも９個以上のアミノ酸を含んでなるアミノ酸残基のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖、分岐鎖または環状であってよく、天然起源のアミノ酸および／またはアミノ酸類似体を含んでなってもよく、それには非アミノ酸が挿入されていてもよい。一般的な指標として、アミノ酸ポリマーが５０個を超えるアミノ酸残基である場合、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれることが好ましく、５０アミノ酸長以下である場合、「ペプチド」と呼ばれる。
【0034】
本発明の文脈の範囲内では、用語「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」および「ヌクレオチド配列」は、互換的に使用され、いずれの長さのポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミド、ベクター、ウイルスゲノム、単離ＤＮＡ、プローブ、プライマーおよびそれらの混合物）またはポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）（例えば、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＳｉＲＮＡ）または混合ポリリボ－ポリデオキシリボヌクレオチドのポリマーも定義する。それらは一本鎖または二本鎖、直鎖または環状、天然または合成、改変または非改変ポリヌクレオチドを包含する。さらに、ポリヌクレオチドは、非天然起源のヌクレオチドを含んでなってもよく、非ヌクレオチド成分が挿入されていてもよい。
【0035】
用語「変異体」、「類似体」、「誘導体」などは、天然対応物と比較して１以上の修飾を示す成分（ポリペプチド、核酸、ウイルスなど）を指して互換的に使用可能である。１以上のヌクレオチド／アミノ酸残基の置換、挿入および／または欠失を含むいかなる改変も想定することができる。天然対応物の配列との最適なグローバルアラインメントの後、すなわち、全長にわたって全体として行われた比較配列のアラインメントの後に、少なくとも７５％、有利には少なくとも８０％、望ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、一層より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性の程度を保持する変異体が好ましい。例示のため、「少なくとも７５％の同一性」は、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を意味する。一般的には、用語「同一性」は、２つのポリペプチド配列または核酸配列間のアミノ酸に対するアミノ酸またはヌクレオチドに対するヌクレオチドの一致を指す。２つの配列間の同一性パーセンテージは、最適なアラインメントのために導入する必要のあるギャップの数と各ギャップの長さとを考慮した、これらの配列が共有する同一位置の数の関数である。アミノ酸配列間の同一性パーセンテージを決定するために当技術分野では、種々のコンピュータープログラムおよび数学的アルゴリズム、例えば、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ＳｔｒｕｃｔｕｒｅのＮＣＢＩまたはＡＬＩＧＮで利用可能なＢＬＡＳＴプログラム（Ｄａｙｈｏｆｆｅｄ，１９８１，Ｓｕｐｐｌ．，３：４８２－９）が利用可能である。また、ヌクレオチド配列間の同一性を決定するためのプログラムも、専門のデータベース（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ、ウィスコンシン配列分析パッケージ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラム）で利用可能である。最適な包括的アラインメントのためには、例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／で利用可能なＥｍｂｏｓｓ Ｎｅｅｄｌｅソフトウエアを使用して、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３－４５３，１９７０）を、使用することができる。このソフトウエアは、２つのインプット配列を読み取り、それらの最適なグローバル配列アラインメントを記載してファイリングする。このソフトウエアは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアラインメントアルゴリズムを使用して、２つの配列の全長に沿ったそれらの最適アラインメント（ギャップを含む）を見出す。このアルゴリズムは、動的プログラミング法を使用して、可能性のあるあらゆるアラインメントを探索して最良のものを選択することにより、アラインメントが最適であることを保証する。可能性のあるあらゆる残基またはヌクレオチドのマッチ（match）の値を含むスコアリングマトリックスが読み取られる。Ｎｅｅｄｌｅは、アラインメントのスコアがスコアリングマトリックスから得たマッチの合計から、アラインされた配列中のオープニングギャップおよびエクステンディングギャップ（opening and extending gaps）に起因するペナルティーを差し引いたものに相当するあり得る最大スコアを有するアラインメントを見つける。置換マトリックスおよびギャップオープニング・エクステンションペナルティーは、使用者により指定される。本発明に関して、最適な包括的アラインメントを得るために、Ｅｍｂｏｓｓ Ｎｅｅｄｌｅソフトウエアをデフォルトパラメータ、すなわち：
・アミノ酸配列の場合：「ギャップオープン（Gap open）」＝１０．０、「ギャップエクステンド（Gap extend）」＝０．５、「エンドギャップペナルティー（End gap penalty）」＝「フォールス（false）」、「エンドギャップオープン（End gap open）」＝１０．０、「エンドギャップエクステンド（End gap extend）」＝０．５、および「Ｂｌｏｓｕｍ ６２」マトリックス；
・ヌクレオチド配列の場合：「ギャップオープン」＝１０．０、「ギャップエクステンド」＝０．５、「エンドギャップペナルティー」＝「フォールス」、「エンドギャップオープン」＝１０．０、「エンドギャップエクステンド」＝０．５、および「ＤＮＡｆｕｌｌ」マトリックス
で使用することができる。
・アミノ酸配列の場合：「ギャップオープン（Gap open）」＝１０．０、「ギャップエクステンド（Gap extend）」＝０．５、「エンドギャップペナルティー（End gap penalty）」＝「フォールス（false）」、「エンドギャップオープン（End gap open）」＝１０．０、「エンドギャップエクステンド（End gap extend）」＝０．５、および「Ｂｌｏｓｕｍ ６２」マトリックス；
・ヌクレオチド配列の場合：「ギャップオープン」＝１０．０、「ギャップエクステンド」＝０．５、「エンドギャップペナルティー」＝「フォールス」、「エンドギャップオープン」＝１０．０、「エンドギャップエクステンド」＝０．５、および「ＤＮＡｆｕｌｌ」マトリックス
で使用することができる。
【0036】
本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」は、組織、器官、または単離細胞における特定の構成に関して、何ら限定されることなく、広く理解されるべきである。このような細胞は、細胞の独特なタイプまたは異なるタイプの細胞の群、例えば、培養細胞株、初代細胞および分裂細胞であり得る。本発明に関して、用語「宿主細胞」は、より詳しくは、真核細胞、特に、哺乳動物（例えば、ヒトまたは非ヒト）細胞ならびに本発明のＰＣＰＶウイルスを産生し得る細胞（例えば、産生細胞）を指す。この用語にはまた、本明細書に記載のウイルスならびにそのような細胞の後代のレシピエントであり得るかまたはあった細胞が含まれる。
【0037】
用語「ウイルス」、「ウイルス粒子」、「ウイルスベクター」および「ビリオン」は、互換的に使用され、ウイルス粒子に封入され得る野生型ウイルスゲノムの少なくとも１つの要素を含んでなるビヒクル（ウイルスベクターとも呼ばれる）またはウイルス粒子それ自体を意味すると広く理解されるべきである。通常、ウイルスは、ウイルスキャプシドに封入されるＤＮＡまたはＲＮＡウイルスゲノム、エンベロープウイルスの場合には、脂質およびその他の成分（例えば、宿主の細胞膜など）を含んでなる。本発明は、野生型ウイルスおよび操作ウイルス（engineered virus）を包含する。すぐ上に述べたように、用語「ウイルス」などは、ウイルスベクター（例えば、ＤＮＡウイルスベクター）ならびにそれから生じたウイルス粒子を含むと広く理解されるべきである。用語「感染力」とは、宿主細胞または対象に感染し、それらへ侵入するウイルスの能力をさす。
【0038】
用語「天然起源の」、「天然の」または「野生型」は、ヒトにより人工的に作出されたものではなく、自然界に見出すことができる生体分子または生物を表して使用される。例えば、天然起源の、天然のまたは野生型のウイルスは、自然界における出所から単離され得る、あるいは、特定のコレクション（例えば、ＥＣＣＡＣ、ＡＴＣＣ、ＣＮＣＭなど）から取得され得るウイルスを指す。実験室でヒトにより意図的に改変された生体分子または生物は、天然起源でない。天然起源でないウイルスの代表例として、とりわけ、ウイルスゲノム中に対象とする１以上の核酸の挿入により操作された組換えウイルス、および／またはウイルスゲノム中に１以上の改変（例えば、ウイルス遺伝子の完全欠失または部分的欠失）から生じる欠陥ウイルスが含まれる。
【0039】
用語「から得られる」、「に起源する(originating)」または「に起源する(originate)」は、成分（例えば、ポリペプチド、核酸分子、ウイルスなど）の起源を特定するために使用されるが、成分が作製される方法を限定することを意味せず、例えば、化学合成、相同組換え、組換え手段またはその他のいずれかの手段によるものであり得る。
【0040】
用語「処置(treatment)」（および処置のいずれかの形態、例えば、「処置する(treating)」、「処置する(treat)」）は、本明細書で使用する場合、予防（例えば、その病状を有するリスクのある対象における予防的手段）および／または療法（例えば、その病状を有すると診断された対象における）であって、場合により、従来の治療方法と組み合わせた療法を包含する。処置の結果は、標的とする病状の進行を緩徐化する、治癒させる、改善するまたは抑制することである。例えば、本明細書に記載されるようなＰＣＰＶの単独または組合せ投与の後に、対象が観測可能なその臨床状態の改善を示す場合、その対象の癌に対する処置が成功である。
【0041】
用語「投与する(administrating)」（または投与(administration)のいずれかの形態、例えば、「投与される(administrated)」）は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載の治療薬、例えば、ＰＣＰＶの対象への送達を指す。
【0042】
用語「対象」は、一般に、本発明の産物および方法が必要とされる生物、または有益であり得る生物を指す。一般に、対象は、哺乳動物、特に、飼育動物、農用動物、競技動物および霊長類からなる群から選択される哺乳動物である。好ましくは、対象は、病理学的疾患（例えば、癌）を有する、または有するリスクがあると診断されたヒトである。用語「対象」および「患者」は、ヒト生物に関して互換的に使用可能であり、雄および雌を包含する。処置される対象は、新生児、幼児、若年成人、成人または高齢者であり得る。
【0043】
偽牛痘ウイルス
第１の態様において、本発明は、ゲノムに挿入された少なくとも１つの外来核酸を含んでなる偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ）を提供する。一実施形態において、上記ＰＣＰＶは、疾患、例えば、以下に記載されるような増殖性または感染性疾患を処置する使用のためのものである。
第１の態様において、本発明は、ゲノムに挿入された少なくとも１つの外来核酸を含んでなる偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ）を提供する。一実施形態において、上記ＰＣＰＶは、疾患、例えば、以下に記載されるような増殖性または感染性疾患を処置する使用のためのものである。
【0044】
用語「偽牛痘ウイルス」または「ＰＣＰＶ」は、本明細書では、ウイルス学の範囲内のその明白な通常の意味に従って使用され、その宿主の細胞質で複製し、パラポックスウイルス属に属するポックスウイルス科のメンバーを指す。ＰＣＰＶは、一般に１３０～１５０キロベースの直鎖かつ二本鎖ＤＮＡゲノムを有する。本発明は、いずれの系統の偽牛痘ウイルスの天然起源の形態、ならびに本明細書に記載のものを含め、様々な目的で改変され得るその変異体も包含する。
【0045】
パラポックスウイルス属は、一連の異なる種、例えば、パラポックスウイルス・オヴィス（ＯＲＦＶ）、偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ）およびウシ丘疹性口炎（ＢＰＳＶ）を包含し、それぞれの種において、様々な株が、完全または部分的ゲノム配列の開示とともに、当技術分野に記載されており、例えば、ＯＲＦＶの０１７０１、ＮＺ２、ＮＺ７、ＩＡ８２、Ｆ０７．８２１Ｒ、Ｆ０９．１１６０ＳおよびＳＡ００株ならびにウシ丘疹性口炎ウイルスのＡＲ０２およびＶ６６０株である。本明細書で使用するために好適なＰＣＰＶ株の代表例として、限定されるものではないが、ＹＧ２８２８（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＬＣ２３０１１９）、Ｆ０７．８０１Ｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＦ７７３６９３）、Ｆ１０．３０８１Ｃ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＦ７７３６９５）、Ｆ０７．７９８Ｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＦ７７３６９２）、Ｆ９９．１７７Ｃ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ４５３６７８）、ＩＴ１３０３／０５（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＦ８００９０６）、Ｆ００．１２０Ｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＧＱ３２９６６９；Ｔｉｋｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８５：１４１３－８）およびＴＪＳ（ＶＲ６３４とも呼ばれる；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＧＱ３２９６７０；Ｆｒｉｅｄｍａｎ－Ｋｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９６３，Ｓｃｉｅｎｃｅ １４０：１３３５－６；ＡＴＣＣで受託番号ＶＲ６３４として入手可能）が含まれる。このような株は、互いに形態的、構造的および／または遺伝的差異（例えば、ＩＴＲ長、予測される遺伝子の数および／またはＧＣリッチ含量に関して）を持ち得る（例えば、Ｈａｕｔａｎｉｅｍｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９１：１５６０－７６参照）。
【0046】
本発明に関して、ＰＣＰＶ種が好ましい。好ましい実施形態において、本発明のＰＣＰＶウイルスは、ＡＴＣＣ参照番号ＡＴＣＣ ＶＲ－６３４（商標）により特定されるような野生型ＴＪＳ株から、または同一名もしくは類似名のウイルス株またはその機能的フラグメントもしくは変異体から得られる。好ましくは、このような変異体は、野生型ＴＪＳ偽牛痘ウイルスゲノムの少なくとも１０キロベースのセグメント（例えば、１０ｋｂの連続配列）とヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルで少なくとも７５％の同一性を維持する。
【0047】
本発明に関して適当な例示的改変として、限定されるものではないが、野生型偽牛痘ウイルス（例えば、ＴＪＳ株）に比較して１以上のウイルス遺伝子の発現またはウイルス感染性を調節する（例えば、増強もしくは低下させる）こと、またはその治療効力を増強する（例えば、ＰＣＰＶウイルスの、健常細胞に比較して罹患細胞で差次的に発現する能力を増強する）ことを目標としたＰＣＰＶゲノム内の１以上のヌクレオチドの挿入、置換および／または欠失、あるいは治療上注目される１以上の外来核酸の挿入、または異なるウイルス起源から得られるものを含むＰＣＰＶゲノム断片を含有するキメラウイルスを作製する１以上の外来核酸の挿入が含まれる。
【0048】
１つの好ましい実施形態において、本発明のＰＣＰＶは、ゲノムに挿入された少なくとも１つの外来核酸を含んでなる（例えば、組換えＰＣＰＶウイルスを生じる）。それとは別に、またはそれと併せて、ＰＣＰＶウイルスは、ＰＣＰＶゲノムによりコードされているウイルス機能（例えば、非必須ウイルス機能）、好ましくは、外来核酸の挿入部位にコードされているウイルス遺伝子機能に欠陥があってもよい。
【0049】
組換えＰＣＰＶ
用語「組換え」は、本明細書において本発明のウイルスに関して使用される場合、ウイルスが少なくとも１つの外来核酸（組換え遺伝子または核酸とも呼ばれる）、特に、本明細書に記載されるような治療上注目される核酸の導入によって改変されていることを示す。本発明に関して、ＰＣＰＶゲノムに挿入されている「外来核酸」は、天然起源のＰＣＰＶゲノムには見られないか、または天然起源のＰＣＰＶゲノムによっては発現されない。しかしながら、外来核酸は、組換えＰＣＰＶが導入される対象と同種であっても異種であってもよい。より具体的には、それはヒト起源または非ヒト起源（例えば、細菌、酵母、またはＰＣＰＶを除くウイルス起源）であり得る。有利には、上記外来核酸は、ポリペプチドをコードするか、または上記疾患に関与する遺伝子を阻害する目的で、罹患細胞内に存在する相補的細胞性核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）に少なくとも部分的に結合（ハイブリダイゼーションによる）し得る核酸配列である。ポリペプチドは、大きさおよびグリコシル化されているか否かに関わらず、ポリヌクレオチドのあらゆる翻訳産物であると理解され、ペプチドおよびタンパク質を含む。このような外来核酸は、天然遺伝子もしくはその一部（例えば、ｃＤＮＡ）、または１以上のヌクレオチドの突然変異、欠失、置換および／または付加により得られるそのいずれかの変異体であり得る。
用語「組換え」は、本明細書において本発明のウイルスに関して使用される場合、ウイルスが少なくとも１つの外来核酸（組換え遺伝子または核酸とも呼ばれる）、特に、本明細書に記載されるような治療上注目される核酸の導入によって改変されていることを示す。本発明に関して、ＰＣＰＶゲノムに挿入されている「外来核酸」は、天然起源のＰＣＰＶゲノムには見られないか、または天然起源のＰＣＰＶゲノムによっては発現されない。しかしながら、外来核酸は、組換えＰＣＰＶが導入される対象と同種であっても異種であってもよい。より具体的には、それはヒト起源または非ヒト起源（例えば、細菌、酵母、またはＰＣＰＶを除くウイルス起源）であり得る。有利には、上記外来核酸は、ポリペプチドをコードするか、または上記疾患に関与する遺伝子を阻害する目的で、罹患細胞内に存在する相補的細胞性核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）に少なくとも部分的に結合（ハイブリダイゼーションによる）し得る核酸配列である。ポリペプチドは、大きさおよびグリコシル化されているか否かに関わらず、ポリヌクレオチドのあらゆる翻訳産物であると理解され、ペプチドおよびタンパク質を含む。このような外来核酸は、天然遺伝子もしくはその一部（例えば、ｃＤＮＡ）、または１以上のヌクレオチドの突然変異、欠失、置換および／または付加により得られるそのいずれかの変異体であり得る。
【0050】
好ましい実施形態において、外来核酸は、対象に適切に投与された際に治療活性または予防活性を提供し得るポリペプチド（すなわち、治療上注目されるポリペプチド）をコードし、処置される病状の経過または症状に有益な効果をもたらす。治療上注目される膨大な数のポリペプチドが想定可能である。一実施形態において、外来核酸は、対象において欠陥または欠損タンパク質を補償するポリペプチド；毒性作用を介して身体から罹患細胞を制限または除去する働きをするポリペプチド（例えば、自殺遺伝子産物）；抗腫瘍効果を増強し得るポリペプチド（例えば、武装遺伝子産物）；および免疫応答を誘導または活性化することができるポリペプチド（例えば、免疫刺激ポリペプチドおよび抗原ポリペプチド）からなる群から選択されるポリペプチドをコードする。検出可能遺伝子の産物をコードする外来核酸もまた、本発明に関して有用であり得る。
【0051】
免疫刺激ポリペプチド
本明細書で使用する場合、用語「免疫刺激ポリペプチド」は、特異的または非特異的様式で免疫系を刺激する能力を有するポリペプチドを指す。免疫刺激効果を発揮するそれらの能力に関して膨大な数のポリペプチドが当技術分野で公知である。本発明に関して好適な免疫刺激タンパク質の例として、限定されるものではないが、サイトカイン、特に好ましくは、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２４）；ケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１１）；インターフェロン（例えば、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｃ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦなど）；ＡＰＣ（抗原提示細胞）が露出したタンパク質（例えば、Ｂ７．１、Ｂ７．２など）；抗血管新生作用を有するポリペプチド（例えば、血管内皮増殖因子阻害剤（例えば、ベバシズマブまたはラニビズマブ））；細胞表面受容体の調節に影響を及ぼすポリペプチド（例えば、免疫チェックポイントのアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、ＰＤ１またはそのリガンドに対する抗体（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１）、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＯＸ４０などに対する抗体））が含まれる。好ましい実施形態において、免疫刺激ポリペプチドは、インターロイキンまたはコロニー刺激因子（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ）またはＯＸ４０に対するアゴニスト抗体である。
本明細書で使用する場合、用語「免疫刺激ポリペプチド」は、特異的または非特異的様式で免疫系を刺激する能力を有するポリペプチドを指す。免疫刺激効果を発揮するそれらの能力に関して膨大な数のポリペプチドが当技術分野で公知である。本発明に関して好適な免疫刺激タンパク質の例として、限定されるものではないが、サイトカイン、特に好ましくは、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２４）；ケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１１）；インターフェロン（例えば、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｃ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦなど）；ＡＰＣ（抗原提示細胞）が露出したタンパク質（例えば、Ｂ７．１、Ｂ７．２など）；抗血管新生作用を有するポリペプチド（例えば、血管内皮増殖因子阻害剤（例えば、ベバシズマブまたはラニビズマブ））；細胞表面受容体の調節に影響を及ぼすポリペプチド（例えば、免疫チェックポイントのアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、ＰＤ１またはそのリガンドに対する抗体（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１）、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＯＸ４０などに対する抗体））が含まれる。好ましい実施形態において、免疫刺激ポリペプチドは、インターロイキンまたはコロニー刺激因子（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ）またはＯＸ４０に対するアゴニスト抗体である。
【0052】
抗原ポリペプチド
実施例のセクションに示すように、ＰＣＰＶは、注射される対象の自然（非特異的）免疫を刺激することができる。したがって、この効果を抗原ポリペプチドの発現と組み合わせると、自然免疫応答および特異的免疫応答の両方を刺激することができるウイルスが提供され得る。これは、有効な抗癌応答を得るために、また、特定の病原体に対する保護を提供するためのワクチン接種目的に重要であり得る。このような効果は、何週間も持続し得る。
実施例のセクションに示すように、ＰＣＰＶは、注射される対象の自然（非特異的）免疫を刺激することができる。したがって、この効果を抗原ポリペプチドの発現と組み合わせると、自然免疫応答および特異的免疫応答の両方を刺激することができるウイルスが提供され得る。これは、有効な抗癌応答を得るために、また、特定の病原体に対する保護を提供するためのワクチン接種目的に重要であり得る。このような効果は、何週間も持続し得る。
【0053】
用語「抗原性」は、抗原として適格なポリペプチドをコードする組換えＰＣＰＶが導入された対象において測定可能な免疫応答を誘導または刺激する能力を指す。上記組換えＰＣＰＶにより発現される抗原ポリペプチドに対して刺激または誘導される免疫応答は、体液性および／または細胞性（例えば、エフェクター免疫細胞の活性化に関与する抗体、サイトカインおよび／またはケモカインの産生）であり得る。刺激または誘導される免疫応答は、通常、投与された対象における保護効果に寄与する。当技術分野では、ｉｎ ｖｉｖｏ（動物またはヒト対象）またはｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、生体サンプル）でポリペプチドの抗原特性を評価するために、多様な直接的または間接的な生物学的アッセイが利用可能である。例えば、特定の抗原が自然免疫を刺激する能力の評価は、例えば、ＮＫ／ＮＫＴ細胞の測定（例えば、活性化の代表性（representativity）およびレベル）、ならびにＩＦＮ関連サイトカインおよび／またはケモカイン産生カスケード、ＴＬＲの活性化および自然免疫のその他のマーカーの測定によって実施され得る（Ｓｃｏｔｔ－Ａｌｇａｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１０ ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ５（１），ｅ８７６１；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ １０７，２４６１－２４６９；Ｃｈａｎ，２００８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８，２９６４－２９６８）。特定の抗原が細胞介在性免疫応答を刺激する能力の評価は、本明細書に記載されるように、例えば、慣例のバイオアッセイを使用するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含む、活性化Ｔ細胞により産生されるサイトカインの定量（例えば、ＥＬＩＳｐｏｔによるか、マルチパラメータフローサイトメトリーＩＣＳによるか、マルチプレックス技術を使用するサイトカインプロファイル分析によるか、またはＥＬＩＳＡによるＴ細胞の特性評価および／または定量）、Ｔ細胞の増殖能の決定（例えば、［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイによるＴ細胞増殖アッセイ）、感作対象における抗原特異的Ｔリンパ球の細胞傷害能のアッセイ、あるいはフローサイトメトリーおよび適当な動物モデルの免疫誘導によるリンパ球亜集団の同定によって実施され得る。
【0054】
抗原ポリペプチドという用語は、天然抗原ならびにそのフラグメント（例えば、エピトープ、免疫原性ドメインなど）および変異体を（このようなフラグメントまたは変異体が免疫応答の標的とされ得る限り）包含することが企図される。本明細書で使用するために好ましい抗原ポリペプチドは、腫瘍関連抗原および病原生物（細菌、ウイルス、寄生虫、真菌、ウイロイドまたはプリオン）の抗原である。特定の病状を処置するために適当な１以上の抗原ポリペプチドを選択することは当業者の範囲内にある。
【0055】
一実施形態において、ＰＣＰＶウイルスによりコードされる抗原ポリペプチドは、癌に関連する、および／または癌のマーカーとして役立つ癌抗原（腫瘍関連抗原とも呼ばれる）である。癌抗原として、様々なカテゴリーのポリペプチド、例えば、健常細胞では通常サイレントである（すなわち、発現しない）もの、低レベルでのみまたは特定の分化段階でのみ発現するもの、および一時的に発現するもの（例えば、胚・胎児抗原）、加えて、細胞性遺伝子の突然変異から生じるもの、例えば、癌遺伝子（例えば、活性化ｒａｓ癌遺伝子）、癌原遺伝子（例えば、ＥｒｂＢファミリー）の突然変異から生じるもの、または染色体転座から生じるタンパク質を包含する。
【0056】
癌抗原のいくつかの限定されない例として、限定されるものではないが、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ｇｐ１００、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）－Ｃ０１７－１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）ならびにその免疫原性エピトープＣＡＰ－１およびＣＡＰ－２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）ならびにその免疫原性エピトープＰＳＡ－１、ＰＳＡ－２、およびＰＳＡ－３、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３－ζ鎖、ＭＡＧＥファミリーの腫瘍抗原（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｘｐ２（ＭＡＧＥ－Ｂ２）、ＭＡＧＥ－Ｘｐ３（ＭＡＧＥ－Ｂ３）、ＭＡＧＥ－Ｘｐ４（ＭＡＧＥ－Ｂ４）、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＧＥ－Ｃ３、ＭＡＧＥ－Ｃ４、ＭＡＧＥ－Ｃ５）、ＧＡＧＥファミリーの腫瘍抗原（例えば、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７、ＧＡＧＥ－８、ＧＡＧＥ－９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ－１、ＮＡＧ、ＧｎＴ－Ｖ、ＭＵＭ－１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー（例えば、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６など；例えば、ＵＳ６，０５４，４３８；ＷＯ９８／０４７２７またはＷＯ９８／３７０９５参照）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α－フェトタンパク質、Ｅ－カドヘリン、α－カテニン、β－カテニンおよびγ－カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００．ｓｕｐ．Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｃｄｃ２７、腺腫様多発結腸ポリープタンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ－イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、Ｓｍａｄファミリーの癌抗原、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－２（ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０）、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－４、ＳＳＸ－５、ＳＣＰ－１およびＣＴ－７、ならびにｃ－ｅｒｂＢ－２が挙げられる。
【0057】
癌抗原は、対象（特に、慢性的に感染した対象）において悪性病態を誘発し得る病原生物、例えば、ＲＮＡおよびＤＮＡ腫瘍ウイルス（例えば、ＨＰＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＥＢＶなど）および細菌（例えば、ピロリ菌）によりコードされる抗原も含み得る。
【0058】
本発明で使用するためのウイルス抗原ポリペプチドとして、例えば、肝炎ウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥ、免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹、パピローマウイルス（ＨＰＶ）、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、ピコルナウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ポックスウイルス、ライノウイルス、風疹ウイルス、パポウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス由来の抗原が含まれる。ＨＩＶ抗原のいくつかの限定されない例として、ｇｐ１２０ ｇｐ４０、ｇｐ１６０、ｐ２４、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ ｔａｔ、ｎｅｆが含まれる。ヒトヘルペスウイルス抗原のいくつかの限定されない例として、ｇＨ、ｇＬ、ｇＭ、ｇＢ、ｇＣ、ｇＫ、ｇＥもしくはｇＤまたはＨＳＶ１もしくはＨＳＶ２由来の前初期タンパク質、例えば、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ４、ＩＣＰ３６が含まれる。サイトメガロウイルス抗原のいくつかの限定されない例として、ｇＢが含まれる。エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）由来のいくつかの限定されない例として、ｇｐ３５０およびＥＢＶによりコードされる核抗原（ＥＢＮＡ：EBV-encoded nuclear antigen）－１が含まれる。水痘帯状疱疹ウイルス抗原のいくつかの限定されない例として、ｇｐ１、１１、１１１およびＩＥ６３が含まれる。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原のいくつかの限定されない例として、Ｅ１またはＥ２ ｅｎｖタンパク質、コアタンパク質、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａおよびＮＳ５ｂが含まれる。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原のいくつかの限定されない例として、ポリメラーゼ、コアおよびｅｎｖポリペプチド（例えば、ＷＯ２０１３／００７７７２に記載されているＨＢＶ抗原の組合せ）が含まれる。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原のいくつかの限定されない例として、Ｌ１、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７が含まれる。また、その他のウイルス病原体、例えば、呼吸器合胞体ウイルス（例えば、ＦおよびＧタンパク質）、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、フラビウイルス（例えば、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）およびインフルエンザウイルス細胞（例えば、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、またはＭタンパク質）に由来する抗原も本発明において使用可能である。好ましい実施形態において、本発明のＰＣＰＶは、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８ Ｅ６および／またはＥ７抗原をコードおよび発現するように操作される。
【0059】
細菌抗原ポリペプチドとして、例えば、ＴＢおよびらい病を引き起こすマイコバクテリア、肺炎球菌、好気性グラム陰性桿菌、マイコプラズマ、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、サルモネラ菌属、クラミジア、ナイセリアンなどに由来する抗原が含まれる。
【0060】
寄生虫抗原ポリペプチドとして、例えば、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、トキソプラスマ症、住血吸虫症およびフィラリア症由来の抗原が含まれる。
【0061】
本発明のＰＣＰＶによる発現のために好ましい抗原ポリペプチドは、
・異常にグリコシル化され、様々な上皮癌において過剰発現されるＭＵＣ－１抗原、
・ＨＰＶ－１６ Ｅ７抗原、特に、その非発癌性変異体、
・ＨＢＶ抗原、特に、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶコアタンパク質およびＨＢｓＡｇ免疫原性ドメイン（例えば、ＷＯ２０１３／００７７７２に記載のとおり）を含んでなる融合物
である。
・異常にグリコシル化され、様々な上皮癌において過剰発現されるＭＵＣ－１抗原、
・ＨＰＶ－１６ Ｅ７抗原、特に、その非発癌性変異体、
・ＨＢＶ抗原、特に、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶコアタンパク質およびＨＢｓＡｇ免疫原性ドメイン（例えば、ＷＯ２０１３／００７７７２に記載のとおり）を含んでなる融合物
である。
【0062】
自殺遺伝子産物
用語「自殺遺伝子産物」は、「プロドラッグ」とも呼ばれる薬物の前駆体を細胞傷害性化合物へと変換し得るポリペプチドを指す。自殺遺伝子産物の例および対応するプロドラッグを下表に開示する。
用語「自殺遺伝子産物」は、「プロドラッグ」とも呼ばれる薬物の前駆体を細胞傷害性化合物へと変換し得るポリペプチドを指す。自殺遺伝子産物の例および対応するプロドラッグを下表に開示する。
【0063】
【表1】
【0064】
望ましくは、本発明のＰＣＰＶは、そのゲノムに、少なくともシトシンデアミナーゼ（ＣＤａｓｅ）活性を有するポリペプチドをコードする自殺遺伝子を保有する。原核生物および下等な真核生物において（それは哺乳動物には存在しない）、ＣＤａｓｅは、外因性のシトシンが加水分解性脱アミノ化によりウラシルに変換されるピリミジン代謝経路に含まれる。ＣＤａｓｅはまた、シトシンの類似体、すなわち、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）を脱アミノ化し、それにより、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）を生成する。５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）は、それ自体、細胞傷害性であるが、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＵＰＲＴａｓｅ）の作用によって５－フルオロ－ＵＭＰ（５－ＦＵＭＰ）に変換された際にさらにより障害性を増強する化合物である。
【0065】
ＣＤａｓｅおよびＵＰＲＴａｓｅをコードする核酸は、いずれの原核生物および下等真核生物から得てもよい。遺伝子配列およびコードされる酵素は公開されており、専門のデータバンク、例えば、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ ＥＭＢＬ、Ｇｅｎｂａｎｋ、Ｍｅｄｌｉｎｅなどで入手可能である。本発明においては、サッカロミセス・セレビシエのＣＤａｓｅ（ＦＣＹ１遺伝子）および／またはＵＰＲＴａｓｅ（ＦＵＲ１遺伝子）が好ましい（Ｋｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｇｅｎｅ，８８：１４９－５７）。これらの遺伝子の機能的変異体もまた使用可能である。このような変異体は、好ましくは、天然対応物のアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を保持する。Ｎ末端切断型ＵＰＲＴａｓｅの機能的類似体が、天然酵素よりも高いＵＰＲＴａｓｅ活性を示すその能力のために、本発明においては特に有用である（例えば、ＥＰ９９８５６８に記載のとおり、天然タンパク質の２番目のＭｅｔ残基までの最初の３５個の残基の欠失を有する）。また、２つの酵素活性の融合により操作されたＣＤａｓｅ活性およびＵＰＲＴａｓｅ活性の両方を有するポリペプチド（例えば、ＷＯ９６／１６１８３、ＥＰ９９８５６８およびＷＯ２００５／０７８５７に記載されているＦＣＹ１：：ＦＵＲ１およびＦＣＹ１：：ＦＵＲ１［Ｄｅｌｔａ］１０５（ＦＣＵ１）およびＦＣＵ１－８ポリペプチド）も好ましい。ＷＯ２００９／０６５５４６の配列識別子である配列番号１で表されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするＦＣＵ１自殺遺伝子（またはＦＣＹ１：：ＦＵＲ１［Ｄｅｌｔａ］１０５融合物）が特に注目される。
【0066】
武装遺伝子産物
その他の外来核酸も、本発明に関して、抗腫瘍効果を増強する目的でＰＣＰＶウイルスを武装するために使用可能である。一実施形態において、武装遺伝子産物（armed gene product）は、ヌクレオシドプールモジュレーター（例えば、シチジンデアミナーゼ、特に、酵母シチジンデアミナーゼ（ＣＤＤ１）またはヒトシチジンデアミナーゼ（ｈＣＤ）；ＥＰ１６３０６８３１．５参照）；代謝および免疫経路に作用するポリペプチド（例えば、アデノシンデアミナーゼ、特に、ヒトアデノシンデアミナーゼｈｕＡＤＡ１またはｈｕＡＤＡ２；ＥＰ１７３０６０１２．０参照）；アポトーシス経路に作用するポリペプチド；エンドヌクレアーゼ（例えば、制限酵素、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）、および標的特異的ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）からなる群から選択される。
その他の外来核酸も、本発明に関して、抗腫瘍効果を増強する目的でＰＣＰＶウイルスを武装するために使用可能である。一実施形態において、武装遺伝子産物（armed gene product）は、ヌクレオシドプールモジュレーター（例えば、シチジンデアミナーゼ、特に、酵母シチジンデアミナーゼ（ＣＤＤ１）またはヒトシチジンデアミナーゼ（ｈＣＤ）；ＥＰ１６３０６８３１．５参照）；代謝および免疫経路に作用するポリペプチド（例えば、アデノシンデアミナーゼ、特に、ヒトアデノシンデアミナーゼｈｕＡＤＡ１またはｈｕＡＤＡ２；ＥＰ１７３０６０１２．０参照）；アポトーシス経路に作用するポリペプチド；エンドヌクレアーゼ（例えば、制限酵素、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）、および標的特異的ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）からなる群から選択される。
【0067】
検出可能遺伝子の産物
一般に、このようなポリペプチドは、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、またはその他の物理的手段によって検出可能であり、したがって、宿主細胞または対象内の組換えＰＣＰＶを同定可能とする。好適な検出可能遺伝子の産物の限定されない例として、蛍光手段により検出可能なｍＣｈｅｒｒｙ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ホタルルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰおよびその増強型ｅ－ＧＦＰ）ならびに比色定量手段により検出可能なβ－ガラクトシダーゼが含まれる。
一般に、このようなポリペプチドは、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、またはその他の物理的手段によって検出可能であり、したがって、宿主細胞または対象内の組換えＰＣＰＶを同定可能とする。好適な検出可能遺伝子の産物の限定されない例として、蛍光手段により検出可能なｍＣｈｅｒｒｙ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ホタルルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰおよびその増強型ｅ－ＧＦＰ）ならびに比色定量手段により検出可能なβ－ガラクトシダーゼが含まれる。
【0068】
本発明はまた、本明細書に記載されるような対象とする２種以上のポリペプチド、例えば、少なくとも２種抗原ポリペプチド（例えば、ＨＰＶ－１６ Ｅ６およびＥ７ポリペプチド）、少なくとも１種の抗原および１種のサイトカイン（例えば、ＭＵＣ１抗原およびＩＬ－２）、少なくとも２種の抗原および１種のサイトカイン（例えば、ＨＰＶ Ｅ６およびＥ７抗原ならびにＩＬ－２）などを発現するＰＣＰＶを包含する。
【0069】
本発明に関して、本明細書で使用するための対象とするコードされたポリペプチドには、本発明のＰＣＰＶによるその発現および対象におけるその治療効果に有益な構造的特徴が組み込まれていてよく、例えば、ＰＣＰＶゲノムにおけるクローニングの補助を可能とするもの（潜在的切断部位の改変）、抗原性の強化を可能とするもの（グリコシル化部位の改変）ならびに／またはＭＨＣクラスＩおよび／もしくはＭＨＣクラスＩＩ提示の改善を可能とするもの（例えば、膜係留）などがある。膜係留は、対象とするポリペプチドに、天然ポリペプチドがそれを欠く場合に膜係留配列および分泌配列（すなわち、シグナルペプチド）を組み込むことによって達成することができる。簡単に述べれば、シグナルペプチドは、通常、１５～３５個の本質的に疎水性のアミノ酸を含んでなり、これらのアミノ酸は、次いで、特定のＥＲ（小胞体）に局在するエンドペプチダーゼにより除去されて成熟ポリペプチドとなる。膜貫通ペプチドもまた、事実上、疎水性が高く、細胞膜内にポリペプチドを係留する働きをする。本発明に関して使用可能な膜貫通ペプチドおよび／またはシグナルペプチドの選択肢は膨大である。それらは、細胞性ポリペプチドもしくはウイルス性ポリペプチド、例えば、免疫グロブリン、組織プラスミノーゲン活性化因子、インスリン、狂犬病糖タンパク質、ＨＩＶウイルスエンベロープ糖タンパク質もしくは麻疹ウイルスＦタンパク質のポリペプチドから得ることができるか、または合成され得る。好ましくは、分泌配列は、翻訳開始コドンの下流のポリペプチドのＮ末端に、膜係留配列は、Ｃ末端の、好ましくは、終止コドンのすぐ上流に挿入される。
【0070】
外来核酸の作製および発現
本発明のＰＣＰＶにより発現される外来核酸は、当業者に既知のいくつかの方法（例えば、クローニング、ＰＣＲ増幅、ＤＮＡシャッフリング）によって容易に作製することができる。例えば、このような外来核酸は、当業者に利用可能な配列データ（例えば、刊行物、特許出願、Ｇｅｎｂａｎｋなど）を使用して、あらゆる利用可能な供給源（例えば、当技術分野で記載されている生体材料、ｃＤＮＡおよびゲノムライブラリー、またはそれを含むことが知られているあらゆる従来技術ベクター）から単離することもでき、次いで、ＰＣＰＶゲノムに適宜挿入することができる。あるいは、それらは自動化されたプロセスで化学合成によって作製可能である（例えば、オーバーラップする合成オリゴヌクレオチドまたは合成遺伝子から組み立てる）。好ましくは、このような外来核酸は、ｃＤＮＡから得られ、イントロン配列を含まない。当業者に公知のいくつかの方法、例えば、化学合成、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発などによって改変を行うことができる。
本発明のＰＣＰＶにより発現される外来核酸は、当業者に既知のいくつかの方法（例えば、クローニング、ＰＣＲ増幅、ＤＮＡシャッフリング）によって容易に作製することができる。例えば、このような外来核酸は、当業者に利用可能な配列データ（例えば、刊行物、特許出願、Ｇｅｎｂａｎｋなど）を使用して、あらゆる利用可能な供給源（例えば、当技術分野で記載されている生体材料、ｃＤＮＡおよびゲノムライブラリー、またはそれを含むことが知られているあらゆる従来技術ベクター）から単離することもでき、次いで、ＰＣＰＶゲノムに適宜挿入することができる。あるいは、それらは自動化されたプロセスで化学合成によって作製可能である（例えば、オーバーラップする合成オリゴヌクレオチドまたは合成遺伝子から組み立てる）。好ましくは、このような外来核酸は、ｃＤＮＡから得られ、イントロン配列を含まない。当業者に公知のいくつかの方法、例えば、化学合成、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発などによって改変を行うことができる。
【0071】
本発明に関して、外来核酸は、特定の宿主細胞または対象において高レベルの発現を提供するために最適化可能である。生物のコドン使用頻度パターンは極めて非無作為であり、コドンの使用は宿主が異なれば著しく異なり得るということが実際に見られる。外来核酸は原核生物由来（例えば、細菌もしくはウイルス抗原）または下等真核生物起源（例えば、自殺遺伝子産物）であり得るため、高等真核細胞（例えば、ヒト）での効率的な発現のためには不適当なコドン使用頻度パターンである場合もある。一般に、コドンの最適化は、使用頻度の低いコドンに相当する１以上の「天然」コドンを、同じアミノ酸をコードするコドンであって、処置する対象においてより高頻度で使用されている１以上のコドンで置換することによって行われる。部分的な置換であっても発現の増強は達成可能であるため、使用頻度の低いコドンに相当する総ての天然コドンを置換する必要はない。
【0072】
コドン使用頻度の最適化に付け加えて、発現は、外来核酸の付加的改変によっても改善可能である。例えば、核酸配列は、希な最適でないコドンのクラスターが集中した領域に存在しないように、かつ／あるいは、発現レベルに悪影響を及ぼすと予測される「負の」配列要素を抑制または改変するように改変可能である。このような負の配列要素は、限定されるものではないが、極めて高い（＞８０％）または極めて低い（＜３０％）ＧＣ含量を有する領域；ＡＴリッチまたはＧＣリッチ配列区間；不安定な順方向または逆方向反復配列；ＲＮＡ二次構造；ならびに／あるいは内部の隠れた調節エレメント、例えば、内部ＴＡＴＡボックス、Ｃｈｉ部位、リボソーム進入部位、および／またはスプライシングドナー／アクセプター部位が含まれる。
【0073】
さらに、相同的な外来核酸（homologous foreign nucleic acids）が本発明のＰＣＰＶによって発現される必要がある場合、配列同一性を低減するために、少なくとも１つの相同的な配列（少なくともその一部）が全長核酸またはその一部にわたって縮重させることができる。実際には、作製過程での相同組換えの問題を回避するために、高い程度（例えば、少なくとも７０％）の配列同一性を示す配列部分を縮重させることが賢明であり、当業者ならば配列アラインメントによりこのような部分を特定することができる。種々の血清型（例えば、ＨＰＶ－１６およびＨＰＶ－１８ Ｅ６および／またはＥ７抗原）から得られるＨＰＶ抗原に適用される適切な配列縮重の例は、ＷＯ２００８／０９２８５４に見出すことができる。
【0074】
一実施形態において、本発明のＰＣＰＶに挿入され、それによって発現される外来核酸は、所望の宿主細胞または対象における発現に好適な調節エレメントに機能的に連結される。
【0075】
本明細書で使用する場合、用語「調節エレメント」または「調節配列」は、所与の宿主細胞または対象において核酸の発現を可能とする、その発現に寄与する、あるいは、その発現を調節するあらゆるエレメント、例えば、核酸またはその誘導体（すなわち、ｍＲＮＡ）の複製、倍加、転写、スプライシング、翻訳、安定性および／または輸送を指す。本明細書で使用する場合、「機能的に連結される」は、連結されているエレメントが、それらの意図される目的に関してそれらが機能するように配置されていることを意味する。例えば、プロモーターは、そのプロモーターが少なくとも許容される宿主細胞において転写開始から上記核酸のターミネーターまで転写を果たす場合、機能的に連結されている。
【0076】
調節配列の選択は、複数の因子、例えば、核酸それ自体、所望の発現レベルなどによって決まることが当業者に認識されるであろう。プロモーターは特に重要である。本発明に関して、プロモーターは、多くのタイプの細胞において外来核酸を恒常的に発現するようにすることができるか、またはある種の細胞もしくは組織に特異的であり得るか、またはウイルス周期の段階（例えば、後期、中期または初期）に従って調節され得る。また、組換えＰＣＰＶの産生を最適化し、発現されるポリペプチドの潜在毒性を回避するために、産生プロセス中に特定の事象または外因的因子（例えば、特定の成分、温度など）に応答して抑制されるプロモーターを使用することもできる。
【0077】
ポックスウイルスプロモーターは、組換えＰＣＰＶでの発現に特に適合されている。一実施形態において、ＰＣＰＶゲノムに挿入された外来核酸は、ポックスウイルスプロモーター、好ましくは、ワクシニアウイルスプロモーター、より好ましくは、７．５Ｋ、Ｈ５Ｒ、１１Ｋ７．５（Ｅｒｂｓ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５（１）：１８－２８）、ＳＥ、ＴＫ、ｐＢ２Ｒ、ｐ２８、ｐ１１およびＫ１Ｌプロモーター、合成プロモーター（例えば、Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ ｅｔ ａｌ．１９９７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：１０９４－７；Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６６：１３５－８；およびＫｕｍａｒ ａｎｄ Ｂｏｙｌｅ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７９：１５１－８に記載されているもの）ならびに初期／後期キメラプロモーターからなる群から選択されるものの制御下に配置される。
【0078】
当業者は、少なくとも１つの外来核酸の発現を制御する調節エレメントは、転写の適切な開始、調節および／または終結のための付加的エレメント（例えば、ポリＡ転写終結配列）、ｍＲＮＡ輸送のための付加的エレメント（例えば、核局在配列）、翻訳のための付加的エレメント（例えば、イニシエーターＭｅｔ、三分節リーダー配列（tripartite leader sequences）など）、プロセシングのための付加的エレメント（例えば、シグナルペプチド、膜貫通係留配列など）および精製工程のための付加的エレメント（例えば、タグ）をさらに含んでなり得ることを認識するであろう。
【0079】
ＰＣＰＶゲノム内の挿入および組換えＰＣＰＶの作製
ＰＣＰＶゲノムへの少なくとも１つの外来核酸の挿入（適当な調節エレメントを備える）は、従来の手段（適当な制限酵素を使用するか、または好ましくは相同組換えによる）によって実施される。
ＰＣＰＶゲノムへの少なくとも１つの外来核酸の挿入（適当な調節エレメントを備える）は、従来の手段（適当な制限酵素を使用するか、または好ましくは相同組換えによる）によって実施される。
【0080】
別の態様において、本発明は、挿入部位の上流および下流に存在するＰＣＰＶ配列が、それぞれ５’および３’側に隣接する外来核酸（その調節エレメントを含む）を含んでなる導入プラスミド（transfer plasmid）と、ＰＣＰＶゲノムとの相同組換えにより、本発明の組換えＰＣＰＶを作製するための方法を提供する。一実施形態において、上記方法は、上記導入プラスミド（例えば、従来の分子生物学的方法による）を作製する工程、および上記導入プラスミドを、特に、導入プラスミドに存在する隣接配列を含んでなるＰＣＰＶウイルス（例えば、野生型ＰＣＰＶウイルス）とともに、好適な宿主細胞に導入する工程を含んでなる。好ましくは、この導入プラスミドは、トランスフェクションにより宿主細胞に導入され、感染によりＰＣＰＶウイルスに導入される。
【0081】
各隣接ＰＣＰＶ配列の大きさは様々であり得る。この配列は通常、挿入される外来核酸の各側に対して１００ｂｐ～１５００ｂｐ、好ましくはおよそ１５０～５００ｂｐ、有利には１８０～４５０ｂｐ、より好ましくは２００～４００ｂｐ、より一層好ましくは２５０～３５０ｂｐ、より一層好ましくはおよそ３００ｂｐである。
【0082】
種々の挿入部位は、何ら限定されるものではないが、ウイルス遺伝子、好ましくは、非必須ウイルス遺伝子、遺伝子間領域、ＰＣＰＶゲノムの遺伝子産物をコードしない部分、または倍加された遺伝子座（天然ウイルスゲノムに２以上のコピーで存在する遺伝子または遺伝子座）を含むＰＣＰＶゲノム内であると考えられる。本発明の方法に従って外来核酸をＰＣＰＶゲノムに挿入すると、挿入部位におけるウイルス遺伝子座は少なくとも部分的に欠失され得る。一実施形態において、この欠失または部分欠失は、その欠失があるＰＣＰＶ配列によりコードされているウイルス遺伝子産物の発現の抑制がもたらされ、その結果、上記ウイルス機能に関して欠陥のあるＰＣＰＶウイルスが生じ得る。
【0083】
挿入部位の例はＵＳ６，３６５，３９３に示されている。好ましい実施形態において、外来核酸は、ＰＣＰＶゲノムの非必須の倍加された遺伝子座、好ましくは、ＶＥＧＦ遺伝子座に挿入される（Ｒｚｉｈａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８３（１－２）：１３７－１４５）。ＶＥＧＦ遺伝子はＰＣＰＶゲノム内に２コピーで存在し、本発明は、両方のＶＥＧＦ遺伝子座または一方のＶＥＧＦ遺伝子座（ウイルス機能を提供するために１コピーを完全なまま残す）への挿入を企図することに留意されたい。好ましくは、外来核酸は両方のＶＥＧＦ遺伝子座に挿入され、その結果、２コピーの外来核酸がＰＣＰＶゲノムに挿入される。
【0084】
特定の実施形態において、本発明の方法は、組換えＰＣＰＶの同定を容易にするために選択および／または検出可能遺伝子をさらに使用する。好ましい実施形態において、導入プラスミドは、選択培地（例えば、ミコフェノール酸、キサンチンおよびヒポキサンチンの存在下）での成長を可能とする選択マーカー、特に好ましくはＧＰＴ遺伝子（グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする）、または検出可能遺伝子の産物、例えば、ＧＦＰ、ｅ－ＧＦＰもしくはｍＣｈｅｒｒｙをコードする検出可能遺伝子をさらに含んでなる。一実施形態において、導入プラスミドは、上記選択または検出可能遺伝子に二本鎖切断をもたらし得るエンドヌクレアーゼの存在下で宿主細胞に導入される。上記エンドヌクレアーゼは、タンパク質の形態であっても、または発現ベクターによって発現されてもよい。代表的な実施形態は実施例のセクションに示される。
【0085】
組換えＰＣＰＶの作製を可能とする相同組換えは、好ましくは、適当な宿主細胞（例えば、ウシ鼻甲介細胞）で行われる。
【0086】
特に好ましい実施形態は、
・一方もしくは両方のＶＥＧＦ遺伝子座内に挿入された、好ましくは、初期／後期ワクシニアｐＨ５Ｒプロモーターの転写制御下で挿入された、ヒトＭＵＣ－１抗原をコードする核酸（例えば、ＷＯ９２／０７０００およびＵＳ５，８６１，３８１に記載されるとおり）を含んでなるＰＣＰＶウイルス；または
・一方もしくは両方のＶＥＧＦ遺伝子座内に挿入された、好ましくは、初期／後期ワクシニアｐ７．５プロモーターの転写制御下で挿入された、膜係留型ＨＰＶ－１６非発癌性Ｅ７抗原をコードする核酸（ＷＯ９９／０３８８５に記載のとおり）を含んでなるＰＣＰＶウイルス
の作製方法である。
・一方もしくは両方のＶＥＧＦ遺伝子座内に挿入された、好ましくは、初期／後期ワクシニアｐＨ５Ｒプロモーターの転写制御下で挿入された、ヒトＭＵＣ－１抗原をコードする核酸（例えば、ＷＯ９２／０７０００およびＵＳ５，８６１，３８１に記載されるとおり）を含んでなるＰＣＰＶウイルス；または
・一方もしくは両方のＶＥＧＦ遺伝子座内に挿入された、好ましくは、初期／後期ワクシニアｐ７．５プロモーターの転写制御下で挿入された、膜係留型ＨＰＶ－１６非発癌性Ｅ７抗原をコードする核酸（ＷＯ９９／０３８８５に記載のとおり）を含んでなるＰＣＰＶウイルス
の作製方法である。
【0087】
ＰＣＰＶウイルスの産生
別の態様において、本発明は、本発明のＰＣＰＶを増幅するための方法に関する。好ましくは、上記方法は、ａ）産生細胞株を準備する工程、ｂ）準備した産生細胞株にトランスフェクトするまたは感染させる工程、ｃ）トランスフェクトされたまたは感染した産生細胞株を、ウイルス（例えば、感染性ウイルス粒子）の産生を可能とするために好適な条件下で培養する工程、ｄ）産生されたウイルスを上記産生細胞株の培養物から回収する工程、および、ｅ）場合により、上記回収されたウイルスを精製する工程を含んでなる。
別の態様において、本発明は、本発明のＰＣＰＶを増幅するための方法に関する。好ましくは、上記方法は、ａ）産生細胞株を準備する工程、ｂ）準備した産生細胞株にトランスフェクトするまたは感染させる工程、ｃ）トランスフェクトされたまたは感染した産生細胞株を、ウイルス（例えば、感染性ウイルス粒子）の産生を可能とするために好適な条件下で培養する工程、ｄ）産生されたウイルスを上記産生細胞株の培養物から回収する工程、および、ｅ）場合により、上記回収されたウイルスを精製する工程を含んでなる。
【0088】
一実施形態において、産生細胞は、哺乳動物（例えば、ヒトまたは非ヒト）細胞、好ましくはＨｅＬａ細胞（例えば、ＡＴＣＣ－ＣＲＭ－ＣＣＬ－２（商標）またはＡＴＣＣ－ＣＣＬ－２．２（商標））である。
【0089】
好ましくは、必要であれば血清および／もしくは好適な増殖因子を添加することができる、あるいは、添加していない適当な培地（例えば、化学的に定義された培地、好ましくは、動物またはヒト由来産物不含）で産生細胞を培養する。適当な培地は、産生細胞に応じて当業者ならば容易に選択可能である。このような培地は市販されている。好ましくは、＋３０℃～＋３８℃の温度（より好ましくは、およそ３７℃）で、感染前に１～８日間、産生細胞を培養する。必要であれば、細胞総数を増すために１～８日の継代培養を数回行ってもよい。
【0090】
工程ｂ）において、産生細胞の産生的感染を可能とするために適当な多重感染度（ＭＯＩ）を使用し、適当な条件下で本明細書に記載のＰＣＰＶウイルスに産生細胞を感染させる。例示として、適当なＭＯＩは、１０－３～５０の範囲であり、特に好ましくは、ＭＯＩは０．０１～５である。感染工程は、産生細胞の培養に使用した培地と同じであっても異なっていてもよい培地で行われる。
【0091】
工程ｃ）において、次いで、子孫ウイルス（例えば、感染性ウイルス粒子）が産生されるまで、当業者に周知の適当な条件下で感染した産生細胞を培養する。また、好ましくは、産生細胞の培養および感染工程のために使用した培地と同じであっても異なっていてもよい培地中、＋３２℃～＋３７℃の温度で１～５日間、感染した産生細胞の培養を行う。
【0092】
工程ｄ）において、工程ｃ）で産生されたウイルスを、培養上清および／または産生細胞から回収する。産生細胞からの回収は、ウイルスの遊離を可能とするために産生細胞膜の破壊を可能とする工程を必要とする場合がある。産生細胞膜の破壊は、当業者に周知の様々な技術、例えば、限定されるものではないが、凍結／解凍、低張溶解、超音波処理、顕微溶液化(microfluidization)、高剪断（高速とも呼ばれる）ホモジナイゼーションまたは高圧ホモジナイゼーションによって誘導され得る。
【0093】
次いで、当技術分野で周知の精製工程を使用して、さらにウイルスベクターを精製してもよい。清澄化、酵素処理（例えば、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼなど）、クロマトグラフィー工程および濾過工程を含め、様々な精製工程を想定することができる。適当な方法が当技術分野において記載されている（例えば、ＷＯ２００７／１４７５２８）。
【0094】
医薬組成物
１つの態様において、治療上有効な量の本明細書に記載のＰＣＰＶと薬学上許容可能なビヒクルとを含んでなる組成物が提供される。複数の実施形態において、ＰＣＰＶは組換え型であり、ゲノムに挿入された１以上の外来核酸（従前に記載したような好適な調節エレメントを有する）、特に、抗原ポリペプチド、例えば、癌抗原、病原生物に起源する抗原、および／または免疫刺激ポリペプチドなどをコードする１以上の外来核酸を含んでなる。特定の実施形態において、組成物は、ＰＣＰＶ感染後に生成されたエキソソームを含んでなり得る。
１つの態様において、治療上有効な量の本明細書に記載のＰＣＰＶと薬学上許容可能なビヒクルとを含んでなる組成物が提供される。複数の実施形態において、ＰＣＰＶは組換え型であり、ゲノムに挿入された１以上の外来核酸（従前に記載したような好適な調節エレメントを有する）、特に、抗原ポリペプチド、例えば、癌抗原、病原生物に起源する抗原、および／または免疫刺激ポリペプチドなどをコードする１以上の外来核酸を含んでなる。特定の実施形態において、組成物は、ＰＣＰＶ感染後に生成されたエキソソームを含んでなり得る。
【0095】
「治療上有効な量」は、有益な結果を生じるために十分なＰＣＰＶの量に相当する。このような治療上有効な量は、様々なパラメータ、例えば、投与様式；対象の年齢および体重；症状の性質および程度；処置に応答する対象の能力；併用処置の種類；処置の頻度および／または予防もしくは療法の必要などの関数として変動し得る。
【0096】
「予防的」使用に関する場合、組成物は、その病状の発症および／または確立および／または再発を、特にリスクのある対象において予防するまたは遅延させるために十分な用量として投与される。「治療的」使用の場合、組成物は、疾患または病状を有すると診断された対象に、それを処置する目的で、場合により１以上の従来の治療方法とともに投与される。
【0097】
用語「薬学上許容可能なビヒクル」は、哺乳動物、特に、ヒト対象における投与に適合したありとあらゆる担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバント、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、吸収剤などを含むことを意図する。薬学上許容可能なビヒクルの限定されない例として、水、ＮａＣｌ、生理食塩水、乳酸加リンゲル液、糖類溶液（例えば、グルコース、トレハロース、サッカロース、デキストロースなど）、アルコール、オイル、ゼラチン、炭水化物（例えば、ラクトース、アミロースまたはデンプン）、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース(hydroxymethycellulose)などが含まれ、加えて、その他の水性の生理学的平衡塩溶液も使用可能である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓの最新版を参照）。
【0098】
一実施形態において、本発明のＰＣＰＶ組成物は、製造と、冷凍温度（例えば、－７０℃、－２０℃）、冷蔵温度（例えば、４℃）または周囲温度（例えば、２０～２５℃）での長期保存（すなわち、少なくとも６か月、好ましくは少なくとも２年）との条件下でその安定性を保証するように適切に調合される。このような調合物は、一般に、液体担体、例えば、水溶液を含む。
【0099】
有利には、本明細書で使用するための調合物は、好適には、ヒト使用のために、好ましくは、生理学的ｐＨまたはやや塩基性のｐＨ（例えば、およそｐＨ７～およそｐＨ９、特に好ましくは７～８、より詳しくは７．５に近いｐＨ）で緩衝される。好適なバッファーとして、限定されるものではないが、ＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン）、トリス－ＨＣｌ（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン－ＨＣｌ）、ＨＥＰＥＳ（４－２－ヒドロキシエチル－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、リン酸バッファー（例えば、ＰＢＳ）、ＡＣＥＳ（Ｎ－（２－アセトアミド）－アミノエタンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸））、ＭＯＰＳＯ（３－（Ｎ－モルホリノ）－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（２－｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸）、ＤＩＰＳＯ（３－［ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ］－２－ヒドロキシプロパン－１－スルホン酸）、ＭＯＢＳ（４－（Ｎ－モルホリノ）ブタンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（３－［Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳＯ（４－（２－ヒドロキシエチル）－ピペラジン－１－（２－ヒドロキシ）－プロパンスルホン酸）、ＰＯＰＳＯ（２－ヒドロキシ－３－［４－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）ピペラジン－１－イル］プロパン－１－スルホン酸）、ＴＥＡ（トリエタノールアミン）、ＥＰＰＳ（Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－ピペラジン－Ｎ’－３－プロパンスルホン酸）、およびＴＲＩＣＩＮＥ（Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）－メチル］－グリシン）が含まれる。好ましくは、上記バッファーは、トリス－ＨＣｌ、トリス、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＨＥＰＥＳおよびリン酸バッファーであって、Ｎａ２ＨＰＯ４とＫＨ２ＰＯ４の混合物またはＮａ２ＨＰＯ４とＮａＨ２ＰＯ４の混合物を含んでなるリン酸バッファーから選択される。上記バッファー（特に、上述のもの、特に、トリス－ＨＣｌ）は、好ましくは、１０～５０ｍＭの濃度で存在する。適当な浸透圧を保証するためにこのような調合物中に一価の塩も含むことが有益であり得る。上記一価の塩は、特にＮａＣｌおよびＫＣｌから選択することができ、好ましくは、上記一価の塩は、ＮａＣｌであり、好ましくは１０～５００ｍＭの濃度のＮａＣｌである。
【0100】
この調合物はまた、ウイルスに基づく組成物を低い保存温度で保護するために凍結防止剤も含み得る。好適な凍結防止剤として、限定されるものではないが、スクロース（またはサッカロース）、トレハロース、マルトース、ラクトース、マンニトール、ソルビトールおよびグリセロール、好ましくは０．５～２０％（ｗ／ｖで表される重量ｇ／容量Ｌ）の濃度のスクロース（またはサッカロース）、トレハロース、マルトース、ラクトース、マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールが含まれる。例えば、スクロースは、好ましくは、５～１５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。
【0101】
ＰＣＰＶ組成物、特に、その液体組成物は、薬学上許容可能なキレート剤、特に、安定性を改善するためにジカチオンをキレートする作用剤をさらに含んでなってもよい。薬学上許容可能なキレート剤は、特に、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，２－ビス（ｏ－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、および２，３－ジメルカプト－１－プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）から選択され得る。薬学上許容可能なキレート剤は、好ましくは、少なくとも５０μＭの濃度、特に好ましくは５０～１０００μＭの濃度で存在する。好ましくは、上記薬学上許容可能なキレート剤は、１５０μＭ付近の濃度で存在するＥＤＴＡである。
【0102】
ＰＣＰＶ組成物の安定性を増すために付加的化合物がさらに存在してもよい。このような付加的化合物として、限定されるものではないが、Ｃ２－Ｃ３アルコール（望ましくは、０．０５～５％（容量／容量またはｖ／ｖ）の濃度）、グルタミン酸ナトリウム（望ましくは、１０ｍＭ未満の濃度）、非イオン性界面活性剤（例えば、０．１％より低い濃度のＴｗｅｅｎ ８０（ポリソルベート８０としても知られる））（ＵＳ７，４５６，００９、ＵＳ２００７－０１６１０８５）が含まれる。二価塩、例えば、ＭｇＣｌ２またはＣａＣｌ２は、液体状態の様々な生体産物を安定化させることが判明している（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．９３：２４５８－７５およびＵＳ７，４５６，００９参照）。アミノ酸、特に、ヒスチジン、アルギニンまたはメチオニンは、液体状態の様々なウイルスを安定化させることが判明している（ＷＯ２０１６／０８７４５７参照）。
【0103】
高分子量ポリマー、例えば、デキストランまたはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の存在は、凍結乾燥組成物、通常、真空乾燥および凍結乾燥を含む方法によって得られる凍結乾燥組成物に特に適しており、これらのポリマーの存在は、凍結乾燥中に固形状の物（cake）の形成を補助する（例えば、ＷＯ０３／０５３４６３；ＷＯ２００６／０８５０８２；ＷＯ２００７／０５６８４７；ＷＯ２００８／１１４０２１およびＷＯ２０１４／０５３５７１参照）。
【0104】
本発明においては、ＰＣＰＶ組成物の調合はまた、適切な分布を確保するように投与様式を適合させ、ｉｎ ｖｉｖｏにおける放出を遅延させることもできる。生分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸およびポリエチレングリコールが使用可能である（例えば、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｉｎ “Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ”，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８；ＷＯ０１／２３００１；ＷＯ２００６／９３９２４；ＷＯ２００９／５３９３７参照）。
【0105】
例示として、サッカロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸ナトリウム１０ｍＭおよびＮａＣｌ５０ｍＭを含んでなるトリス緩衝調合物（トリス－ＨＣｌ ｐＨ８）は、－２０℃～５℃での本発明の組成物の保存のために適している。
【0106】
用量
本発明の組成物は、個別の用量で調合することができ、各用量は、使用する定量技術に応じて規定された約１０３～１０１２ｖｐ（ウイルス粒子）、ｉｕ（感染単位）またはｐｆｕ（プラーク形成単位）のＰＣＰＶを含有する。サンプル中に存在する規定のＰＣＰＶの量は、慣例の力価測定技術、例えば、感染後の許容細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）のプラークの数を数えてプラーク形成単位（ｐｆｕ）力価を得ること、Ａ２６０吸光度（ｖｐ力価）を測定すること、またはさらに定量的免疫蛍光、例えば、抗ウイルス抗体を使用する定量的免疫蛍光（ｉｕ力価）によって決定することができる。対象または対象群に対する適当な用量を適合させるために必要な計算のさらなる精密化は、関連の状況に照らして現場の人によって慣例的に行うことができる。一般的な指針として、ＰＣＰＶ組成物に好適な個別の用量は、およそ１０３～およそ１０１２ｐｆｕ、有利にはおよそ１０４～およそ１０１１ｐｆｕ、好ましくはおよそ１０５～およそ１０１０ｐｆｕ、より好ましくはおよそ１０６～およそ１０９ｐｆｕを含んでなり、特におよそ１０７、５×１０７、１０８または５×１０８ｐｆｕの個別の用量が特に好ましい。
本発明の組成物は、個別の用量で調合することができ、各用量は、使用する定量技術に応じて規定された約１０３～１０１２ｖｐ（ウイルス粒子）、ｉｕ（感染単位）またはｐｆｕ（プラーク形成単位）のＰＣＰＶを含有する。サンプル中に存在する規定のＰＣＰＶの量は、慣例の力価測定技術、例えば、感染後の許容細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）のプラークの数を数えてプラーク形成単位（ｐｆｕ）力価を得ること、Ａ２６０吸光度（ｖｐ力価）を測定すること、またはさらに定量的免疫蛍光、例えば、抗ウイルス抗体を使用する定量的免疫蛍光（ｉｕ力価）によって決定することができる。対象または対象群に対する適当な用量を適合させるために必要な計算のさらなる精密化は、関連の状況に照らして現場の人によって慣例的に行うことができる。一般的な指針として、ＰＣＰＶ組成物に好適な個別の用量は、およそ１０３～およそ１０１２ｐｆｕ、有利にはおよそ１０４～およそ１０１１ｐｆｕ、好ましくはおよそ１０５～およそ１０１０ｐｆｕ、より好ましくはおよそ１０６～およそ１０９ｐｆｕを含んでなり、特におよそ１０７、５×１０７、１０８または５×１０８ｐｆｕの個別の用量が特に好ましい。
【0107】
投与
本発明に関して、非経口、局所または粘膜経路を含め、従来の投与経路はいずれもが適用可能である。非経口経路は注射または注入（infusion）としての投与を意図し、全身経路ならびに局所経路を包含する。ＰＣＰＶ組成物を投与するために使用可能な非経口注射のタイプとして、静脈内（静脈、例えば、肝臓に供給を行う門脈へ）、血管内（血管へ）、動脈内（動脈、例えば、肝動脈へ）、皮内（真皮へ）、皮下（皮膚下）、筋肉内（筋肉へ）、腹腔内（腹膜へ）および腫瘍内（腫瘍またはその近傍へ）、また、乱刺法（scarification）が含まれる。投与は、単回のボーラス投与の形態であってもよく、または、例えば、連続注入ポンプによってもよい。粘膜投与として、限定されるものではないが、経口／消化管、鼻腔内、気管内、肺内、腟内または直腸内経路が含まれる。局所投与も経皮的手段（例えば、パッチなど）を使用して実施可能である。好ましくは、ＰＣＰＶ組成物は、静脈内、筋肉内、皮下または腫瘍内投与向けに調合される。
本発明に関して、非経口、局所または粘膜経路を含め、従来の投与経路はいずれもが適用可能である。非経口経路は注射または注入（infusion）としての投与を意図し、全身経路ならびに局所経路を包含する。ＰＣＰＶ組成物を投与するために使用可能な非経口注射のタイプとして、静脈内（静脈、例えば、肝臓に供給を行う門脈へ）、血管内（血管へ）、動脈内（動脈、例えば、肝動脈へ）、皮内（真皮へ）、皮下（皮膚下）、筋肉内（筋肉へ）、腹腔内（腹膜へ）および腫瘍内（腫瘍またはその近傍へ）、また、乱刺法（scarification）が含まれる。投与は、単回のボーラス投与の形態であってもよく、または、例えば、連続注入ポンプによってもよい。粘膜投与として、限定されるものではないが、経口／消化管、鼻腔内、気管内、肺内、腟内または直腸内経路が含まれる。局所投与も経皮的手段（例えば、パッチなど）を使用して実施可能である。好ましくは、ＰＣＰＶ組成物は、静脈内、筋肉内、皮下または腫瘍内投与向けに調合される。
【0108】
投与は、従来のシリンジおよび針（例えば、Ｑｕａｄｒａｆｕｓｅ注射針）または対象においてウイルスの送達を容易にし得、または改善し得る当技術分野で利用可能なあらゆる化合物または装置（例えば、筋肉内投与を容易にするするためのエレクトロポレーション）を使用してもよい。別法として無針注射装置（例えば、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ ＴＭ装置）の使用がある。経皮パッチも想定することができる。
【0109】
本発明の組成物は、単回投与または一連の投与に好適である。また、一定の休薬期間の後に反復される逐次的投与サイクルを介して進めることもできる。各投与の間隔は、３日～６か月（例えば、２４時間、４８時間、７２時間、１週間毎、２週間毎、１か月毎または四半期毎など）であり得る。間隔は不規則であってもよい。これらの用量は、上記の範囲内で投与毎に異なってもよい。
【0110】
ＰＣＰＶ組成物の治療的使用および処置方法
別の態様において、本発明は、医薬、特に、病原生物または望まない細胞分裂により引き起こされる疾患または病状を本明細書に記載の方法に従って処置または予防するための医薬として使用するための組換え偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ）または本発明の組成物（特に、医薬組成物）、ならびに組換え偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ）または本発明の組成物を、それを必要とする対象に、そのような疾患または病状を処置または予防するために十分な量で投与することを含んでなる処置方法に関する。本発明はまた、組換え偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ）または本発明の組成物の使用であって、病原生物または望まない細胞分裂により引き起こされる疾患または病状を本明細書に記載の方法に従って処置または予防するための薬物の製造のための使用にも関する。本発明はまた、組換え偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ）または本発明の組成物の使用であって、本明細書に記載の方法に従って病原生物または望まない細胞分裂により引き起こされる疾患または病状を治療または予防するための使用にも関する。好ましい治療スキームまたは処置方法は、１０６～１０９ｐｆｕを含んでなるＰＣＰＶ組成物の２～６回の毎週の投与と、場合により、その後の３週間隔での２～１５回のさらなる投与とを含んでなる。
別の態様において、本発明は、医薬、特に、病原生物または望まない細胞分裂により引き起こされる疾患または病状を本明細書に記載の方法に従って処置または予防するための医薬として使用するための組換え偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ）または本発明の組成物（特に、医薬組成物）、ならびに組換え偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ）または本発明の組成物を、それを必要とする対象に、そのような疾患または病状を処置または予防するために十分な量で投与することを含んでなる処置方法に関する。本発明はまた、組換え偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ）または本発明の組成物の使用であって、病原生物または望まない細胞分裂により引き起こされる疾患または病状を本明細書に記載の方法に従って処置または予防するための薬物の製造のための使用にも関する。本発明はまた、組換え偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ）または本発明の組成物の使用であって、本明細書に記載の方法に従って病原生物または望まない細胞分裂により引き起こされる疾患または病状を治療または予防するための使用にも関する。好ましい治療スキームまたは処置方法は、１０６～１０９ｐｆｕを含んでなるＰＣＰＶ組成物の２～６回の毎週の投与と、場合により、その後の３週間隔での２～１５回のさらなる投与とを含んでなる。
【0111】
好ましい実施形態において、処置される疾患または病状は、増殖性疾患である。したがって、本発明はまた、本発明の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法にも関する。本発明に関して、本発明による方法および使用は、標的疾患の発症または進行を緩徐化する、治癒させる、改善する、または抑制することを目的とする。
【0112】
「疾患」（および疾患のあらゆる形態、例えば、「障害」または「病状」など）は、一般に、識別可能な症状を特徴とする。例示的疾患として、限定されるものではないが、病原生物（例えば、細菌、寄生虫、ウイルス、真菌など）の感染から起こる感染性疾患および細胞の異常な増殖を含む増殖性疾患が含まれる。本明細書で使用する場合、用語「増殖性疾患」は、細胞の制御されていない増殖および拡散から起こるいずれの疾患または病状、例えば、癌およびいくつかの心血管疾患（例えば、血管壁の平滑筋細胞の増殖から生じる再狭窄など）も包含する。用語「癌」は、用語「腫瘍」、「悪性」、「新生物」などのいずれとも互換的に使用され得る。これらの用語は、いずれのタイプの組織、器官または細胞、いずれの病期の悪性腫瘍（例えば、前病変から病期ＩＶまで）も含み、固形腫瘍および血液腫瘍ならびに原発癌および転移癌を包含することを意味する。
【0113】
本発明の組成物および方法を使用して治療され得る癌の代表例として、限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病、より詳しくは、骨癌、消化管癌、肝臓癌、膵臓癌、胃癌、結腸直腸癌、食道癌、口咽頭癌、喉頭癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肺癌、頭部または頸部癌、皮膚癌、扁平上皮細胞癌、黒色腫、子宮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌腫、外陰癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌、軟組織肉腫、膀胱癌、腎臓癌、膠芽腫および様々なタイプの中枢神経系（ＣＮＳ）の癌などが含まれる。一実施形態において、本発明による方法および使用は、腎臓癌（例えば、明細胞癌）、前立腺癌（例えば、ホルモン不応性前立腺腺癌）、乳癌（例えば、転移性乳癌）、結腸直腸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、肝臓癌（例えば、肝癌）、胃癌、胆管癌、子宮内膜癌、膵臓癌および卵巣癌ならびにＭＵＣ１を過剰発現する癌からなる群から選択される癌を処置するためのものである。好ましい実施形態は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬ）を有する対象の処置に使用するためのＰＶＰＣであって、本明細書に記載されるようなＭＵＣ１抗原をコードするＰＶＰＣ、およびＨＰＶ陽性癌、例えば、子宮頸癌または頭頸部癌を有する対象の治療に使用するためのＰＶＰＣであって、本明細書に記載されるようなＨＰＶ１６ Ｅ７抗原をコードするＰＶＰＣに関する。
【0114】
本発明の組成物および方法を使用して処置され得る感染性疾患の代表例として、限定されるものではないが、ａ）ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、またはＶＺＶ）、パピローマウイルス（ＨＰＶ）、天然痘または水痘を引き起こすポックスウイルス、エンテロウイルス、レトロウイルス（例えば、ＡＩＤＳを引き起こすＨＩＶ）、サイトメガロウイルス、フラビウイルス（例えば、日本脳炎、Ｃ型肝炎、デング熱および黄熱を引き起こす）、ヘパドナウイルス（例えば、ＨＢＶ）、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルスおよび呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ））、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ）、ラブドウイルスおよびロタウイルスによる感染から起こるウイルス性疾患；ｂ）細菌、例えば、大腸菌属、エンテロバクター属、サルモネラ菌属、ブドウ球菌属、赤痢菌属、リステリア菌属、アエロバクター属、ヘリコバクター属、クレブシエラ属、プロテウス属、シュードモナス属、連鎖球菌属、クラミジア属、マイコプラズマ属、肺炎球菌属、ナイセリア属、クロストリジウム属、バチルス属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリア属、カンピロバクター属、ビブリオ属、セラチア属、プロビデンシア属、クロモバクテリウム属、ブルセラ属、エルシニア属、ヘモフィルス属、またはボルデテラ属による感染から起こる細菌性疾患；ならびに（ｃ）限定されるものではないが、カンジダ症、アスペルギルス症、ヒストプラスマ症、クリプトコッカス髄膜炎を含む真菌性疾患；およびｄ）限定されるものではないが、マラリア、ニューモシスチス・カリニ肺炎、リーシュマニア症、クリプトスポリジウム症、トキソプラスマ症、およびトリパノソーマ感染を含む寄生虫性疾患が含まれる。
【0115】
一般に、本明細書に記載の方法に従って投与する場合、本発明の組成物は、処置される対象に、ベースラインの状態または処置されなかった場合に予想される状態からの臨床状態の観察可能な改善を証拠とし得る治療利益を提供する。臨床状態の改善は、医師またはその他の医療スタッフにより一般に使用されるあらゆる適切な臨床測定によって容易に評価することができる。本発明に関して、治療利益は、一過性（投与の休止後１または２～３か月間）である場合も、または持続的（数ヶ月または数年間）である場合もある。臨床状態の自然経過は対象ごとに相当異なり得るため、必ずしも各処置対象に治療利益が見られる必要はなく、有意な数の対象に見られればよい（例えば、２つの群の間の統計的有意差は、当技術分野で公知のいずれかの統計学的検定、例えば、テューキーパラメトリック検定、クラスカル・ウォリス検定、マン・ホイットニーのＵ検定、スチューデントのｔ検定、ウィルコクソン検定などによって決定可能である）。
【0116】
本発明の方法または使用が増殖性疾患、特に、癌の処置を目的とする場合、治療利益は、少なくとも一過性で、例えば、腫瘍数の減少、腫瘍サイズの縮小、転移の数または程度の低減、寛解期間の延長、疾患の状態の安定化（すなわち、非増悪）、疾患の進行または重篤度の遅延または緩徐化、生存期間の延長、標準的な処置に対する応答の改善、生活の質の改善、死亡率の低下などを証拠とし得る。「処置」はまた、処置を行わない場合に予想されるものを超える対象の生存期間の延長を意味し得る。
【0117】
本発明の方法または使用が感染性疾患の処置を目的とする場合、治療利益は、例えば、処置された対象の血液、血漿、もしくは血清において定量される感染している病原生物の量の減少、および／または感染性疾患の安定化（非増悪）状態（例えば、感染性疾患に一般に関連する病態、例えば、炎症状態の安定化）、および／または特定の血清マーカーのレベルの低下（例えば、慢性Ｃ型肝炎において通常見られる肝臓不全状態に関連したアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）および／またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の減少）、感染性疾患の発症に関連したいずれかの抗原のレベルの低下、および／または病原生物に対する抗体の出現もしくはそのレベルの変調、および／または従来療法（例えば、抗生物質）に対する処置された対象の応答の改善、および／または組成物処置を受けない場合に予想される生存期間と比較した場合の生存期間の延長を証拠とし得る。
【0118】
適当な測定（例えば、血液検査、体液の分析および生検）ならびに医学的イメージング技術を、臨床利益を評価するために使用することができる。投与前（ベースライン）および処置中の種々の時点および処置の終了後に、それらを実施することができる。一般的な指針として、このような測定値は医学研究室および病院で日常的に評価され、多数のキットが市販されている（例えば、イムノアッセイ、定量的ＰＣＲアッセイ）。
【0119】
別の態様において、処置される対象において免疫応答を惹起もしくは刺激および／または再配向するために本発明の組成物を使用または投与する。したがって、本発明はまた、本発明の組成物を、それを必要とする対象に、その対象の免疫を活性化するために、本明細書に記載の方法に従って十分な量で投与することを含んでなる、免疫応答（例えば、腫瘍または感染細胞に対する）を惹起もしくは刺激および／または再配向するための方法を包含する。惹起、刺激または再配向された免疫応答は、特異的（すなわち、エピトープ／抗原を対象とする）および／または非特異的（自然）、体液性および／または細胞性、特に、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋が介在するＴ細胞応答であり得る。免疫応答を惹起、刺激または再配向する本明細書に記載の組成物の能力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで（例えば、対象から採取された生体サンプルを使用）または当技術分野で標準的な様々な直接的または間接的なアッセイ（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２および１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；ｅｄ Ｊ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈまたは後続版を参照）を使用してｉｎ ｖｉｖｏで評価可能である。ポリペプチドの抗原性に関して上記で引用されたものも適当である。
【0120】
好ましい実施形態において、本発明による方法は、下記の特性：
ＰＢＭＣからの高レベルのＩＦＮ－αの分泌、好ましくは、同じ条件下でＭＶＡの投与後に見られたレベルの少なくとも５０倍のレベルのＩＦＮ－αの分泌または同じ条件下でＯＲＦＶの投与の後に見られたレベルの少なくとも１０倍のレベルでのＰＢＭＣからの高レベルのＩＦＮ－αの分泌；
単球由来樹状細胞の活性化（例えば、活性化マーカーＣＤ８６の誘導により表すことができ、好ましくは、同じ条件下でのＭＶＡの投与後に見られたレベルの少なくとも２倍のレベルの活性化マーカーＣＤ８６の誘導により表すことができる）；
Ｔ細胞の活性化または増殖の誘導（例えば、グランザイムＢ高発現Ｔ細胞により間接的に表される）；
ＭＤＳＣにおけるより良好なサイトカイン／ケモカインプロファイル（例えば、ＰＣＰＶの感染後にＭＤＳＣにより分泌されるＩＦＮ－αおよびＭＩＰ１αのうち少なくとも１つのレベルが、ＭＶＡ感染後よりも高いことで表され得る）；
ＡＰＣの活性化（例えば、ＰＣＰＶの投与後のヒトマクロファージにおけるＣＤ８６の上方調節により表され得る）；
ヒトマクロファージのＭ２からＭ１への変換（例えば、ＰＣＰＶの投与後のヒトマクロファージンにおけるＩＬ－１８、ＩＬ－６およびＩＰ－１０の分泌が、ＭＶＡ感染後よりも高いことで表され得る）；および／または
ＴＬＲ９介在経路またはその他の自然免疫刺激経路、例えば、ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧおよびＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）（例えば、レチノイン酸誘導遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）および黒色腫分化関連遺伝子５（ＭＤＡ５））による免疫の誘導
のうち少なくとも１つをもたらす。
ＰＢＭＣからの高レベルのＩＦＮ－αの分泌、好ましくは、同じ条件下でＭＶＡの投与後に見られたレベルの少なくとも５０倍のレベルのＩＦＮ－αの分泌または同じ条件下でＯＲＦＶの投与の後に見られたレベルの少なくとも１０倍のレベルでのＰＢＭＣからの高レベルのＩＦＮ－αの分泌；
単球由来樹状細胞の活性化（例えば、活性化マーカーＣＤ８６の誘導により表すことができ、好ましくは、同じ条件下でのＭＶＡの投与後に見られたレベルの少なくとも２倍のレベルの活性化マーカーＣＤ８６の誘導により表すことができる）；
Ｔ細胞の活性化または増殖の誘導（例えば、グランザイムＢ高発現Ｔ細胞により間接的に表される）；
ＭＤＳＣにおけるより良好なサイトカイン／ケモカインプロファイル（例えば、ＰＣＰＶの感染後にＭＤＳＣにより分泌されるＩＦＮ－αおよびＭＩＰ１αのうち少なくとも１つのレベルが、ＭＶＡ感染後よりも高いことで表され得る）；
ＡＰＣの活性化（例えば、ＰＣＰＶの投与後のヒトマクロファージにおけるＣＤ８６の上方調節により表され得る）；
ヒトマクロファージのＭ２からＭ１への変換（例えば、ＰＣＰＶの投与後のヒトマクロファージンにおけるＩＬ－１８、ＩＬ－６およびＩＰ－１０の分泌が、ＭＶＡ感染後よりも高いことで表され得る）；および／または
ＴＬＲ９介在経路またはその他の自然免疫刺激経路、例えば、ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧおよびＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）（例えば、レチノイン酸誘導遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）および黒色腫分化関連遺伝子５（ＭＤＡ５））による免疫の誘導
のうち少なくとも１つをもたらす。
【0121】
したがって、本発明はまた、免疫細胞、例えば、ＰＢＭＣからのＩＦＮ－αの分泌を増大させるための方法、単球由来樹状細胞の活性化を誘導するための方法、Ｔ細胞の活性化および／または増殖を誘導するための方法、ヒトマクロファージのＭ２からＭ１への変換を誘導するための方法、ＭＤＳＣが関連する免疫抑制を低減するための方法、および／または免疫抑制を低減するための方法を包含し、このような方法はいずれも、所望の結果を達成するために、本発明の組成物を、それを必要とする対象に投与すること（ｉｎ ｖｉｖｏ法）または前駆細胞を本発明の組成物と接触させること（ｉｎ ｖｉｔｒｏ法）を含んでなる。
【0122】
一実施形態において、本発明の組成物または方法は、処置または予防される疾患または病状を処置または予防するために利用可能な１以上のその他の治療法とともに使用または実施され得る。一実施形態において、その他の治療法は、手術、放射線療法、化学療法、凍結療法、ホルモン療法、毒素療法、免疫療法、サイトカイン療法、標的癌療法、遺伝子療法、光線力学療法および移植などからなる群から選択される。本発明による方法または使用は、第３またはそれよりさらに多い治療法を含んでもよい。
【0123】
このような付加的抗癌療法は、標準的な実施に従って、本発明のＰＣＰＶ組成物の前、後、本質的に同時または散在的に対象に投与される。２種類以上の治療法の本質的に同時の投与は、それらの方法がそれらの治療効果を発揮する期間が重複する限り、作用剤が同時または同じ経路で投与される必要はない。同時投与として、本発明の組成物をその他の治療法と同じ日（例えば、０．５、１、２、４、６、８、１０、１２時間）のうちに投与することを含む。本発明によりいずれの順序も企図されるが、本発明の組成物がその他の治療法の前に対象に投与されることが好ましい。
【0124】
特定の実施形態において、本発明による方法または使用は、手術とともに実施されてもよい。例えば、この組成物は、腫瘍の部分的または完全切除の後に投与されてもよい（例えば、摘出区域内への局所適用による）。
【0125】
その他の実施形態において、本発明による方法または使用は、放射線療法とともに使用することができる。当業者ならば適当な放射線療法プロトコールおよびパラメータを容易に設定することができる（例えば、Ｐｅｒｅｚ ａｎｄ Ｂｒａｄｙ，１９９２，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，第２版 ＪＢ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ参照；当業者に容易に明らかとなるような適当な適合および修正を使用）。特に癌の処置に使用可能な放射線のタイプは、当技術分野で周知であり、電子線、線形加速器からまたは線源（例えば、コバルトもしくはセシウム）からの高エネルギー光子、陽子、および中性子を含む。放射性同位元素の用量範囲は極めて広く、同位体の半減期、放射される放射線の強度およびタイプ、ならびに新生細胞による取り込みによって異なる。長期間（３～６週間）の一定のＸ線量、または高い単回の線量が本発明により企図される。
【0126】
本発明の特定の実施形態において、本発明の組成物は、化学療法とともに使用可能である。癌を処置するために現在利用可能な好適な化学療法剤の代表例として、限定されるものではないが、アルキル化剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、白金誘導体、チロシンキナーゼ受容体阻害剤、シクロホスファミド、代謝拮抗剤、ＤＮＡ傷害剤および細胞分裂抑制剤が挙げられる。感染性疾患を処置するために現在利用可能な好適な化学療法剤の代表例として、とりわけ、抗生物質、代謝拮抗剤、抗有糸分裂剤および抗ウイルス剤（例えば、インターフェロンα）が挙げられる。
【0127】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、免疫治療薬（例えば、抗新生物抗体、ならびにｓｉＲＮＡおよびアンチセンスポリヌクレオチド）とともに使用可能である。代表例として、とりわけ、特定の免疫チェックポイントを遮断するモノクローナル抗体（例えば、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＬＡＧ３、抗ＯＸ４０など（例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、デュルバルマブ、ダクリズマブ、アベルマブ、アテゾリズマブなど））、上皮細胞増殖因子受容体を遮断するモノクローナル抗体（特に、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、トラスツズマブ（ハーセプチン（商標））など）および血管内皮増殖因子を遮断するモノクローナル抗体（特に、ベバシズマブおよびラニビズマブ）が挙げられる。
【0128】
なおさらなる実施形態において、本発明の組成物は、アジュバントとともに使用可能である。好適なアジュバントの代表例として、限定されるものではないが、ＴＬＲ３リガンド（Ｃｌａｕｄｅｐｉｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８８（１０）：５２４２－５５）、ＴＬＲ９リガンド（例えば、ＣｐＧ（例えば、ＯＤＮ１８２６（Ｆｅｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２，１１６３－７４）およびリテニモド（Ｌｉ２８）（Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ８，ｅ１１５－１２７；Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎｅｕｒｏ－Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ８（１）：６０－６；ＥＰ１１６２９８２；ＵＳ７，７００，５６９およびＵＳ７，１０８，８４４）））ならびにＰＤＥ５阻害剤（例えば、シルデナフィル）（ＵＳ５，２５０，５３４、ＵＳ６，４６９，０１２およびＥＰ４６３７５６）が挙げられる。
【0129】
さらなる実施形態において、本発明の組成物または方法は、プライム組成物およびブースト組成物の逐次投与を含んでなるプライム・ブーストアプローチに従って使用可能である。一般に、プライム組成物およびブースト組成物は、少なくとも抗原ドメインを共通に含んでなるまたはコードする異なるベクターを使用する。さらに、同じ投与経路または異なる投与経路によって、同じ部位または別の部位に、プライム組成物およびブースト組成物を投与することができる。本発明に関して好ましいプライム・ブーストアプローチは、本明細書に記載されるようなＰＣＰＶ組成物と対象とする同じポリペプチド（例えば、同じ抗原）をコードするＭＶＡ組成物とを含む。一実施形態において、ＭＶＡをプライムのために使用し、本発明のＰＣＰＶ組成物をブーストのために使用するか、またはその逆（プライムのためのＰＣＰＶおよびブーストのためのＭＶＡ）である。本発明は、プライム組成物および／またはブースト組成物の１回または複数回の投与、好ましくは皮下、腫瘍内および静脈内経路での投与を包含する。特に好ましいプライム・ブースト計画は、腫瘍内経路により投与されるＰＣＰＶプライム組成物と、静脈内経路により投与されるＭＶＡブースト組成物とを含んでなる。好ましい実施形態において、ＰＣＰＶおよびＭＶＡ組成物は、同じ腫瘍関連抗原をコードする。別の実施形態において、プライムおよびブーストの投与間に設ける期間は１週間～６か月、好ましくは１週間～１か月、より好ましくは１～２週間と様々である。およそ１０６～およそ１０９ｐｆｕの個別の用量が、プライム組成物およびブースト組成物には特に適しており、特に、個別の用量はおよそ１０６、５×１０６、１０７、５×１０７、１０８または５×１０８ｐｆｕである。
【0130】
別の態様において、本発明はまた、ウシ丘疹性口炎ウイルス（ＢＰＳＶ）、好ましくは、ゲノムに挿入された少なくとも１つの外来核酸を含んでなる組換えＢＰＳＶを提供する。用語「ウシ丘疹性口炎ウイルス」または「ＢＰＳＶ」は、本明細書では、ウイルス学の範囲内のその明白な通常の意味に従って使用され、パラポックスウイルス属に属するポックスウイルス科のメンバーを指す。
【0131】
組換えＢＰＳＶにより発現される外来核酸は、ＰＣＰＶに関して記載したもの、ならびに所望の宿主細胞または対象での発現のために必要とされる調節エレメントと同様である。ＢＰＳＶゲノム内の外来核酸の挿入部位および組換えＢＰＳＶを産生する方法もまた、当業者の及ぶ範囲内である。ＢＰＳＶの増幅方法は、ＰＣＰＶウイルスに関して本明細書に示される説明および一般知識に基づいて慣例のものであるが、産生細胞株、ＭＯＩ、培養培地などは、当業者がＢＰＳＶウイルスに適合させることができる。
【0132】
また、治療上有効な量のＢＰＳＶと、薬学上許容可能なビヒクルとを含んでなる組成物も本発明の一部である。好適な用量、投与経路および治療的使用は、ＰＣＰＶを含んでなる組成物に関して上記される通りである。
【0133】
上記に引用された特許、刊行物およびデータベースエントリーの開示は総て、引用することによりそれらの全内容が具体的に本明細書の一部とされる。本発明のその他の特徴、目的および利点は、本明細書および図面および特許請求の範囲から明らかとなる。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために組み込まれている。しかしながら、本開示に照らして、当業者は、開示されるそれらの特定の実施形態に、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく変更を行うことができると考えるべきである。
【実施例0134】
いくつかのウイルスおよび株が腫瘍抗原およびサイトカインを発現するように開発されており、それらのいくつかは進んだ段階の臨床試験下にある。しかしながら、免疫原性が改善された新規なウイルス株が求められている。この観点で、本発明者らは、パラポックスウイルス、例えば、偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ）およびパラポックスウイルス・オヴィス（ＯＲＦ）をスクリーニングし、それらを様々なその他のポックスウイルスと比較した。この比較は、ｉｎ ｖｉｔｒｏではヒト初代免疫細胞で、ｉｎ ｖｉｖｏではシンジェニックマウス腫瘍モデルで実施した。
【0135】
実施例１：感染ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における分泌サイトカイン／ケモカインのプロファイル
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、２名の健常ドナー（ＥＦＳ、Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ ｄｅ Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ；ドナーＡおよびＢ）のヒト全血から単離した。ＰＢＭＣをフィコール－パークＰＬＵＳ（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）および血液分離チューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を使用した密度勾配遠心分離により単離し、液体窒素中で保存した。
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、２名の健常ドナー（ＥＦＳ、Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ ｄｅ Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ；ドナーＡおよびＢ）のヒト全血から単離した。ＰＢＭＣをフィコール－パークＰＬＵＳ（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）および血液分離チューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を使用した密度勾配遠心分離により単離し、液体窒素中で保存した。
【0136】
ＰＢＭＣの凍結アリコートを、１０％ウシ胎児血清（ＦＳＣ）を添加したＲＰＭＩ中で解凍し、２４ウェルプレート中に直ぐに播種した（dispatch）（５００μＬ／ウェル中、５．１０５細胞）。５～６時間後、細胞を種々のウイルス（下記参照）に１０－３～１０の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。一晩のインキュベーション（１６時間）後、細胞を掻き取り、細胞および上清をエッペンドルフ管に移し、１０分間３００ｇで遠心分離した。上清を単離し、－８０℃で冷凍した。サイトカインおよびケモカインプロファイルを、Ｐｒｏｃａｒｔａｐｌｅｘ ２０プレックス炎症パネル（ＥＰＸ２００－１２１８５－９０１）を使用し、上清中でＭｕｌｔｉｐｌｅｘアプローチにより定量した。ＭａｇＰｉｘ装置を使用し、製造者の推奨に従って分析を実施した。
【0137】
供試した種々のウイルスは、パラポックスウイルスである偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ）およびパラポックスウイルス・オヴィス（ＯＲＦ）に加えて、ＭＶＡ、牛痘ウイルス（ＣＰＸ）、コペンハーゲンワクシニアウイルス（Ｃｏｐｗｔ）、鶏痘（ＦＰＶ）、粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）、豚痘（ＳＷＰＶ）、ラクーンポックスウイルス（ＲＣＮ）、コティアウイルス（ＣＴＶ）およびヤバ様病ウイルス（ＹＬＤＶ）である。ウイルスは、ＭＶＡＮ３３という名称のエンプティーＭＶＡベクターが使用されているＭＶＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＥＦ６７５１９１）、コペンハーゲンワクシニアウイルス（例えば、ＷＯ２００９／０６５５４６参照）およびＦＰＶ（例えば、Ｌａｉｄｌａｗ ａｎｄ Ｓｋｉｎｎｅｒ，２００４；Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８５：３０５－２２参照）を除いて、ＡＴＣＣコレクション、それぞれＡＴＣＣ－ＶＲ－６４４（ＰＣＰＶ ＴＪＳ）、ＡＴＣＣ ＶＲ－１５４８（ＯＲＦＶ ＮＺ２）、ＡＴＣＣ ＶＲ－３０２（ＣＰＸ Ｂｒｉｇｈｔｏｎ）、ＡＴＣＣ ＶＲ－１１５（ＭＹＸＶ Ｌａｕｓａｎｎｅ）、ＡＴＣＣ ＶＲ－３６３（ＳＷＰＸ Ｋａｓｚａ）、ＡＴＣＣ ＶＲ－８３８（ＲＣＮ Ｈｅｒｍａｎ）、ＡＴＣＣ ＶＲ－４６４（ＣＴＶ ＳＰ ＡＮ ３２）およびＡＴＣＣ ＶＲ－９３７（ＹＬＤＶ Ｄａｖｉｓ）から得られた。
【0138】
図１に示されるように、ＰＣＰＶ感染ＰＢＭＣは、ＭＯＩ依存的に極めて高レベルのＩＦＮ－αの分泌を誘導した。ＰＣＰＶ感染ＰＢＭＣにより分泌されるレベルはこれら２つの実験で異なるが、それらはＳＷＰＸおよびＯＲＦＶ（別のパラポックスウイルス）で見られるＩＦＮ－αの中程度の分泌レベルよりも十分高い。ＭＶＡに比較して、ＰＣＰＶはヒトＰＢＭＣにおいて１０００倍のＩＦＮ－α発現を誘導したが、ＳＷＰＸおよびＯＲＦは、低めの１０～１００倍の誘導を示した。コペンハーゲンＶＶおよびその他の腫瘍溶解性ベクター（例えば、ＲＣＮ、ＲＰＶ、ＣＴＶ、ＣＰＸおよびＭＹＸ）は、ＩＦＮαレベルを上昇させなかった。
【0139】
ウイルス感染時の生存率試験を行った。細胞をＬｉｖｅＤｅａｄ「ＮｅａｒＩＲ」で染色し、フローサイトメトリー（ＭａｃｓＱｕａｎｔ）により分析し、死細胞および生細胞の割合を決定した。結果は、ＯＲＦＶおよびＹＬＤＶは特に毒性があることを示し、ＭＯＩ ５で感染させた細胞の９０％が１６時間以内に死滅したが、ＰＣＰＶを含むその他総てのウイルスでは少なくとも５０％の生細胞が見られた。
【0140】
実施例２：ヒト単球由来樹状細胞、Ｍ２マクロファージおよび骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）に対するＰＣＰＶの効果
ＩＦＮ－αのようなＩ型インターフェロンは癌の免疫療法の重要な役者であり、免疫抑制腫瘍環境を変更し、例えば、Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ １６（３）：１３１－４４）およびＺｉｔｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５（７）：４０５－１４）により記載されるように、ワクチンによりコードされている抗原および／または腫瘍により提示されている抗原に対する適応抗腫瘍応答を改善した。これらの側面に取り組むために、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト初代免疫細胞において、ＰＣＰＶ処理時のヒト単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）の活性化および免疫抑制細胞集団（免疫抑制細胞、例えば、Ｍ２マクロファージおよびＭＤＳＣの再プログラミング）に対する効果を調べた。また、自然免疫および適応免疫に対する前臨床試験もマウスシンジェニック腫瘍モデルで行った。
ＩＦＮ－αのようなＩ型インターフェロンは癌の免疫療法の重要な役者であり、免疫抑制腫瘍環境を変更し、例えば、Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ １６（３）：１３１－４４）およびＺｉｔｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５（７）：４０５－１４）により記載されるように、ワクチンによりコードされている抗原および／または腫瘍により提示されている抗原に対する適応抗腫瘍応答を改善した。これらの側面に取り組むために、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト初代免疫細胞において、ＰＣＰＶ処理時のヒト単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）の活性化および免疫抑制細胞集団（免疫抑制細胞、例えば、Ｍ２マクロファージおよびＭＤＳＣの再プログラミング）に対する効果を調べた。また、自然免疫および適応免疫に対する前臨床試験もマウスシンジェニック腫瘍モデルで行った。
【0141】
ｍｏＤＣの刺激
抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化を調べるために、本発明者らは、単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）で研究した。これらの細胞を得るために、ヒト単球をＰＢＭＣからの分離により富化した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、単球単離キットＩＩ）。単球を顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ ２０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ－４（１０ｎｇ／ｍｌ）中で３日間インキュベートすることにより樹状細胞（ｍｏＤＣ）に分化させた。刺激アッセイにおいて、３名の異なるドナー（ドナー１２Ｊｕｌ１６、ドナー２４Ａｕｇ１６およびドナー３１Ａｕｇ１６）由来のｍｏＤＣを２４ウェルプレートに播種し、ＭＯＩ ０．０３、０．３および１でＭＶＡＮ３３．１またはＰＣＰＶに感染させた。翌日、成熟マーカーＣＤ８６をフローサイトメトリーにより定量した。発現レベルを抗ＣＤ８６－ＰＥでの染色、フローサイトメトリーによる細胞に結合したシグナルの定量によって測定した。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化を調べるために、本発明者らは、単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）で研究した。これらの細胞を得るために、ヒト単球をＰＢＭＣからの分離により富化した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、単球単離キットＩＩ）。単球を顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ ２０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ－４（１０ｎｇ／ｍｌ）中で３日間インキュベートすることにより樹状細胞（ｍｏＤＣ）に分化させた。刺激アッセイにおいて、３名の異なるドナー（ドナー１２Ｊｕｌ１６、ドナー２４Ａｕｇ１６およびドナー３１Ａｕｇ１６）由来のｍｏＤＣを２４ウェルプレートに播種し、ＭＯＩ ０．０３、０．３および１でＭＶＡＮ３３．１またはＰＣＰＶに感染させた。翌日、成熟マーカーＣＤ８６をフローサイトメトリーにより定量した。発現レベルを抗ＣＤ８６－ＰＥでの染色、フローサイトメトリーによる細胞に結合したシグナルの定量によって測定した。
【0142】
図２に示すように、ＰＣＰＶ処理ｍｏＤＣは、ＭＶＡＮ３３．１処理細胞に比較して活性化マーカーＣＤ８６の極めて高い発現レベルを示した。ｍｏＤＣ刺激に関する有益な効果が低ＭＯＩ（０．０３）で見られ、ＭＯＩ ０．３および３で増大した。予想されたように、ｍｏｃｋ処理時にはｍｏＤＣ刺激は検出されなかった。したがって、ＰＣＰＶ感染は、総てのドナーにおいて総てのＭＯＩで、ＭＶＡＮ３３より高いレベルにＣＤ８６発現を増大させたことが明らかである。Ｃｏｐｗｔは、ｍｏＤＣ ＣＤ８６発現に対する効果を示さなかった（データは示されていない）。
【0143】
Ｍ２マクロファージに対する効果
次いで、本発明者らは、免疫抑制細胞種がＰＣＰＶにより変更／再教育され得るか否か、およびどの程度かという問題に取り組んだ。
次いで、本発明者らは、免疫抑制細胞種がＰＣＰＶにより変更／再教育され得るか否か、およびどの程度かという問題に取り組んだ。
【0144】
本発明者らは、Ｍｉａ ｅｔ ａｌ．（２０１４，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９（５）：３０５－１４）から適合させたプロトコールに従い、ｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導性ＣＤ１６３＋ＣＤ２０６＋「Ｍ２型」マクロファージを作製した。簡単に述べれば、健常ドナーから得たＰＢＭＣからの、積極的なＣＤ１４＋選択によるか、または単球単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｂｉｏｔｅｃ）を使用した消極的な選択による単離の後に、４８ウェルプレートにおいて、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を添加した５００μＬマクロファージ基本培地ＤＸＦ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）中で４×１０５の単球を培養した。培地を３日目および７日目に交換した。７日目に、ＣＤ１６ｈｉＣＤ６８＋ＣＤ１１ｂ＋Ｍ０マクロファージを、ＩＬ－４、ＩＬ－１０およびＴＧＦ－β（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を２０ｎｇ／ｍＬの濃度まで添加してＭ２表現型へ分極させた。２日後、ＣＤ１６３＋ＣＤ２０６＋Ｍ２マクロファージをＭＯＩ ５、１および０．３のＭＶＡＮ３３．１またはＰＣＰＶとともにインキュベートし、ＩＬ－１８、ＩＬ－６、ＩＰ－１０およびＣＤ８６の分泌をフローサイトメトリーまたはＬｕｍｉｎｅｘ分析によりアッセイした。この目的で、細胞をヒトＦｃＲブロッキング試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）およびＡＰＣ標識抗ＣＤ８６（クローンＦＭ９５、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）とともに２０分間インキュベートした。死細胞を自動ヨウ化プロピジウム染色により標識した後、細胞取得数を、ＭＡＣＳＱｕａｎｔサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して記録した。Ｋａｌｕｚａソフトウエア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してデータを分析した。刺激した細胞の上清中のサイトカインレベルを、ＭＡＧＰＩＸ装置（Ｌｕｍｉｎｅｘ ＸＭＡＰ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でのＬｕｍｉｎｅｘ分析（ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により定量した。
【0145】
図３に示されるように、ＭＶＡと比較して、ＰＣＰＶは、ＭＯＩ ５および１でＩＬ－１８の分泌、ＭＯＩ ５でのＩＬ－６およびＩＰ－１０の分泌を増強した。したがって、ＰＣＰＶがＭ２マクロファージの表現型をＭ１型表現型に変化させることが明らかである。Ｍ２マクロファージはヒトＮＳＣＬＣにおいて負の転帰に関連し、Ｍ１マクロファージは正の予後マーカーに相当する（Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ，２０１５，Ｎａｔｕｒｅ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ）。これらのデータは、ＭＶＡ処理に比較してＰＣＰＶ処理の後に抑制性の低い表現型への変換を示唆する。
【0146】
骨髄由来サプレッサー細胞ＭＤＳＣに対する効果
自己ＣＤ１４＋単球およびＣＤ８＋Ｔ細胞を健常ドナーから磁性ビーズ技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）により単離した。２つのモデルを検討した。ＭＤＳＣを単球から、２０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－４および１μＭプロスタグランジンＥ２とともに（図４）、あるいは、１０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６の存在下で（図５）６～７日間のインキュベーションによって生成した。抗ＣＤ２、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８でコーティングしたＴ細胞活性化ビーズまたはＴｒａｎｓＡｃｔ Ｔ細胞試薬＋ＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の存在下で、得られたＭＤＳＣを自己ＣＦＳＥ標識ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した。４～５日後、Ｔ細胞の増殖および増殖中のＴ細胞におけるグランザイムＢの発現をフローサイトメトリーにより測定した。加えて、ＭＤＳＣ単独をＰＣＰＶで処理し、翌日、検査物質、例えば、サイトカインおよびケモカイン定量するために上清を採取した。図４に示されるように、活性化Ｔ細胞の増殖は、共培養されたｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導性ＭＤＳＣによって阻害された（図４Ａにおける非感染対照参照；ＭＤＳＣ／Ｔ比１／２）。しかしながら、ＭＤＳＣにより提供される、ＣＴＬの増殖に対する抑制活性は、共培養物に添加したＰＣＰＶによる処理によって阻害可能であり、漸増するＭＯＩでＣＴＬの増殖を回復させるＰＣＰＶの能力に裏付けられ（図４Ａ）、ＰＣＰＶで処理した共培養物におけるグランザイムＢ産生の上方調節と相関する（図４Ｂ）。ＰＣＰＶの存在下における抗抑制効果は低ＭＯＩであっても検出されたことを強調しておくべきである。これらの所見は、ＰＣＰＶ処理の翌日にＭＤＳＣ培養物において測定されたＩＦＮαの分泌と相関する（図４Ｃ）。
自己ＣＤ１４＋単球およびＣＤ８＋Ｔ細胞を健常ドナーから磁性ビーズ技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）により単離した。２つのモデルを検討した。ＭＤＳＣを単球から、２０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－４および１μＭプロスタグランジンＥ２とともに（図４）、あるいは、１０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６の存在下で（図５）６～７日間のインキュベーションによって生成した。抗ＣＤ２、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８でコーティングしたＴ細胞活性化ビーズまたはＴｒａｎｓＡｃｔ Ｔ細胞試薬＋ＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の存在下で、得られたＭＤＳＣを自己ＣＦＳＥ標識ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した。４～５日後、Ｔ細胞の増殖および増殖中のＴ細胞におけるグランザイムＢの発現をフローサイトメトリーにより測定した。加えて、ＭＤＳＣ単独をＰＣＰＶで処理し、翌日、検査物質、例えば、サイトカインおよびケモカイン定量するために上清を採取した。図４に示されるように、活性化Ｔ細胞の増殖は、共培養されたｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導性ＭＤＳＣによって阻害された（図４Ａにおける非感染対照参照；ＭＤＳＣ／Ｔ比１／２）。しかしながら、ＭＤＳＣにより提供される、ＣＴＬの増殖に対する抑制活性は、共培養物に添加したＰＣＰＶによる処理によって阻害可能であり、漸増するＭＯＩでＣＴＬの増殖を回復させるＰＣＰＶの能力に裏付けられ（図４Ａ）、ＰＣＰＶで処理した共培養物におけるグランザイムＢ産生の上方調節と相関する（図４Ｂ）。ＰＣＰＶの存在下における抗抑制効果は低ＭＯＩであっても検出されたことを強調しておくべきである。これらの所見は、ＰＣＰＶ処理の翌日にＭＤＳＣ培養物において測定されたＩＦＮαの分泌と相関する（図４Ｃ）。
【0147】
上記のように、また、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６誘導性ＭＤＳＣモデルを示す図５に示されるように、活性化Ｔ細胞の増殖は、共培養されたｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導性ＭＤＳＣにより強く阻害された。漸増するＭＯＩのＰＣＰＶで共培養物を処理した場合、増殖は部分的に回復され、グランザイムＢの発現は上方調節された。
【0148】
要約すると、ＰＣＰＶは、初代ｍｏＤＣにおいてＣＤ８６の発現を誘発するためにＭＶＡおよびＶＶよりも優れていることが示された。さらに、ＰＣＰＶ処理は、ヒトｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導性ＣＤ１６３＋ＣＤ２０６＋「Ｍ２」型マクロファージにおいてＣＤ８６発現を増大させ、抗原提示表現型への移行を示唆する。これらの細胞において、ＰＣＰＶは、抑制性の低いマクロファージ表現型への変換の徴候であるＩＬ－１８、ＩＬ－６およびＩＰ－１０の分泌を有意に増大させた。ＭＤＳＣに対するＰＣＰＶの作用様式は、抑制性の低い表現型への成熟またはＭＤＳＣに対するＰＣＰＶの毒性作用であり得る。
【0149】
実施例３：組換えＰＣＰＶの構築および抗腫瘍特性
ウイルス骨格としてのＰＣＰＶに対する利益は、腫瘍抗原をコードする組換えＰＣＰＶを作製し、それらを腫瘍抑制試験で試験することによって評価した。
ウイルス骨格としてのＰＣＰＶに対する利益は、腫瘍抗原をコードする組換えＰＣＰＶを作製し、それらを腫瘍抑制試験で試験することによって評価した。
【0150】
組換えＰＣＰＶベクターを、野生株ＴＪＳ（ＡＴＴＣ、ＶＲ－６３４）から構築した。総てのパラポックスウイルスのようにＰＣＰＶは、その他のポックスウイルスに存在する、またはその他のポックスウイルスで保存されている遺伝子を欠く。これらは、ヌクレオチド代謝に関与する可能性のあるほとんどのポックスウイルス遺伝子のホモログ、例えば、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グアニル酸キナーゼおよびチミジル酸キナーゼのホモログを含んでなる。したがって、組換えワクシニアウイルスの作製のために一般に使用される遺伝子座ＴＫは、ＰＣＰＶにおける組換え遺伝子の導入のためには使用不可能であった。しかしながら、組換えＯＲＦウイルスは、非必須ＶＥＧＦ遺伝子への導入遺伝子の挿入により作製可能であることが示された（Ｒｚｉｈａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８３（１－２）：１３７－１４５）。したがって、この遺伝子座を組換えＰＣＰＶの作製に関して評価した。ＶＥＧＦ遺伝子は、ＰＣＰＶゲノムの左および右のゲノム末端に２コピーで存在することに留意されたい。
【0151】
ｐＵＣ１８プラスミド（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃで入手可能）においてＰＣＰＶ ＶＥＧＦ遺伝子に隣接する約３００ｂｐの２配列をクローニングすることによって、導入プラスミドを作製した。ＶＥＧＦ遺伝子の上流の配列は、ＰＣＰＶ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＣ＿０１３８０４）のヌクレオチド配列部位６３９１～６０８９または１３８８９９～１３９２０１に相当する。ＶＥＧＦ遺伝子の下流の配列は、ＰＣＰＶのヌクレオチド配列部位５５４５～５２２５または１３９７４５～１４００６５に相当する。これらの配列によって、導入プラスミドとＰＣＰＶウイルスとの間の相同組換えを可能とし、両ＶＥＧＦ遺伝子座に挿入された外来核酸を有する組換えウイルスをもたらす。
【0152】
ＰＣＰ－ＧＦＰ（ＰＣＰＴＧ１９１０６）の作製
増強型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコード遺伝子およびグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）をコードする遺伝子の融合物である選択カセット（ｅＧＦＰ／ＧＰＴ）（例えば、ＷＯ２００９／０６５５４６参照）を、ｐ１１Ｋ７．５ワクシニアプロモーターの制御下に配置し、導入プラスミドに挿入してｐＴＧ１９１０６を得た。
増強型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコード遺伝子およびグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）をコードする遺伝子の融合物である選択カセット（ｅＧＦＰ／ＧＰＴ）（例えば、ＷＯ２００９／０６５５４６参照）を、ｐ１１Ｋ７．５ワクシニアプロモーターの制御下に配置し、導入プラスミドに挿入してｐＴＧ１９１０６を得た。
【0153】
ＰＣＰＶを感染させ、ｐＴＧ１９１０６をヌクレオフェクション（Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ技術に従う）によりトランスフェクトしたウシ鼻甲介細胞（ＢＴ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１３９０）における相同組換えによって、ＰＣＰＴＧ１９１０６の作製を実施した。蛍光および選択（ＧＰＴ＋）プラークを選択した。より具体的には、ＧＰＴ＋組換えＰＣＰＶは、組換えＰＣＰＶの単離中にＧＰＴ選択マーカーを保持することにより、選択培地（ミコフェノール酸、キサンチン、およびヒポキサンチン）における増殖の利益を有する。組換えウイルスをＧＦＰ蛍光プラークから単離し、ＢＴ細胞においてさらなるプラーク精製を行った。複数回のＰＣＲおよび発現カセットのＤＮＡシークエンシングにより、ウイルスの構造および親ＰＣＰＶが存在しないことを確認した。得られたウイルスＰＣＰＴＧ１９１０６をＢＴ細胞で増幅させた。ウイルスストックの力価をＢＴ細胞におけるプラークアッセイにより測定した。
【0154】
ＰＣＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ＰＣＰＴＧ１９１５３）の作製
ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質をコードする配列をｐＨ５Ｒワクシニアプロモーターの制御下に配置し、導入プラスミドに挿入してｐＴＧ１９１５３を得た。
ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質をコードする配列をｐＨ５Ｒワクシニアプロモーターの制御下に配置し、導入プラスミドに挿入してｐＴＧ１９１５３を得た。
【0155】
ＰＣＰＴＧ１９１０６を感染させ、ｐＴＧ１９１５３をヌクレオフェクションによりトランスフェクトしたＢＴ細胞における相同組換えによって、ＰＣＰＴＧ１９１５３の作製を実施した。組換えウイルスは、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光プラークを選択し、ＢＴ細胞でさらなるプラーク精製を行うことにより単離した。複数回のＰＣＲおよび発現カセットのＤＮＡシークエンシングにより、ウイルスの構造および親ＰＣＰＴＧ１９１０６が存在しないことを確認した。得られたウイルスＰＣＰＴＧ１９１５３をＢＴ細胞で増幅させた。
【0156】
ＰＣＰ－ＨＰＶ１６Ｅ７（ＰＣＰＴＧ１９１７８）の作製
ＳＲ－Ｅ７＊Ｔｍをコードする配列（ＷＯ９９／０３８８５）をｐ７．５Ｋプロモーターの制御下に配置し、導入プラスミドに挿入してｐＴＧ１９１７８を得た。ＰＣＰＴＧ１９１０６を感染させ、ＧＦＰ遺伝子に二本鎖切断を生じるエンドヌクレアーゼの存在下でｐＴＧ１９１７８をヌクレオフェクションによりトランスフェクトしたＢＴ細胞における相同組換えによって、ＰＣＰＴＧ１９１７８の作製を実施した。組換えウイルスは、ＧＦＰ蛍光陰性プラークを選択し、ＢＴ細胞でさらなるプラーク精製を行うことにより単離した。複数回のＰＣＲおよび発現カセットのＤＮＡシークエンシングにより、ウイルスの構造および親ＰＣＰＴＧ１９１０６が存在しないことを確認した。得られたウイルスＰＣＰＴＧ１９１７８をＢＴ細胞で増幅させた。
ＳＲ－Ｅ７＊Ｔｍをコードする配列（ＷＯ９９／０３８８５）をｐ７．５Ｋプロモーターの制御下に配置し、導入プラスミドに挿入してｐＴＧ１９１７８を得た。ＰＣＰＴＧ１９１０６を感染させ、ＧＦＰ遺伝子に二本鎖切断を生じるエンドヌクレアーゼの存在下でｐＴＧ１９１７８をヌクレオフェクションによりトランスフェクトしたＢＴ細胞における相同組換えによって、ＰＣＰＴＧ１９１７８の作製を実施した。組換えウイルスは、ＧＦＰ蛍光陰性プラークを選択し、ＢＴ細胞でさらなるプラーク精製を行うことにより単離した。複数回のＰＣＲおよび発現カセットのＤＮＡシークエンシングにより、ウイルスの構造および親ＰＣＰＴＧ１９１０６が存在しないことを確認した。得られたウイルスＰＣＰＴＧ１９１７８をＢＴ細胞で増幅させた。
【0157】
ＰＣＰＴＧ１９１７８の前臨床バッチの産生は、感染させたＨｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２（商標））によって数本のＦ５００フラスコで行った。ウイルスの増幅を３４～３７℃、５％ＣＯ２で７２時間行った。次いで、感染細胞および培地をペレットとし、凍結した。粗収集物を、高剪断ホモジナイザー（ＳＩＬＶＥＲＳＯＮ Ｌ４Ｒ）を使用して破壊し、精製工程を行った（例えば、Ｗ０２００７／１４７５２８に記載の通り）。簡単に述べれば、溶解したウイルス調製物を濾過により明澄化し、タンジェンシャルフロー・フィルトレーション（ＴＦＦ）工程により精製することができる。精製されたウイルスを好適なウイルス調剤バッファー（例えば、５％（ｗ／ｖ）サッカロース、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム、ｐＨ８）に再懸濁させた。
【0158】
ＰＣＰ－ＭＵＣ１（ＰＣＰＴＧ１９１９４）の作製
Ｍｕｃ１をコードする配列（ＵＳ５，８６１，３８１）をｐＨ５Ｒプロモーターの制御下に配置し、導入プラスミドに挿入してｐＴＧ１９１９４を得た。ＰＣＰＴＧ１９１５３を感染させ、ｍ－Ｃｈｅｒｒｙ遺伝子内に二本鎖切断を生じるエンドヌクレアーゼの存在下でｐＴＧ１９１０６をヌクレオフェクションによりトランスフェクトしたＢＴ細胞における相同組換えによって、ＰＣＰＴＧ１９１９４の作製を実施した。組換えウイルスは、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光陰性プラークを選択し、ＢＴ細胞においてさらなるプラーク精製を行うことにより単離した。複数回のＰＣＲおよび発現カセットのＤＮＡシークエンシングにより、ウイルスの構造および親ＰＣＰＴＧ１９１９４が存在しないことを確認した。得られたウイルスＰＣＰＴＧ１９１９４をＢＴ細胞で増幅させた。前臨床バッチを、上記のようにＨｅｌａ細胞で産生した。
Ｍｕｃ１をコードする配列（ＵＳ５，８６１，３８１）をｐＨ５Ｒプロモーターの制御下に配置し、導入プラスミドに挿入してｐＴＧ１９１９４を得た。ＰＣＰＴＧ１９１５３を感染させ、ｍ－Ｃｈｅｒｒｙ遺伝子内に二本鎖切断を生じるエンドヌクレアーゼの存在下でｐＴＧ１９１０６をヌクレオフェクションによりトランスフェクトしたＢＴ細胞における相同組換えによって、ＰＣＰＴＧ１９１９４の作製を実施した。組換えウイルスは、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光陰性プラークを選択し、ＢＴ細胞においてさらなるプラーク精製を行うことにより単離した。複数回のＰＣＲおよび発現カセットのＤＮＡシークエンシングにより、ウイルスの構造および親ＰＣＰＴＧ１９１９４が存在しないことを確認した。得られたウイルスＰＣＰＴＧ１９１９４をＢＴ細胞で増幅させた。前臨床バッチを、上記のようにＨｅｌａ細胞で産生した。
【0159】
ＰＣＰ－ＨＢＶ（ＰＣＰＴＧ１９１７９）の作製
ＨＢＶコア、Ｐｏｌおよびｅｎｖ抗原の融合物をコードする配列（ＷＯ２０１３／００７７７２に記載の通り）をｐ７．５Ｋプロモーターの制御下に配置し、導入プラスミドに挿入してｐＴＧ１９１７９を得た。ＰＣＰＴＧ１９１０６を感染させ、ＧＦＰ遺伝子内に二本鎖切断を生じるエンドヌクレアーゼの存在下でｐＴＧ１９１７９をヌクレオフェクションによりトランスフェクトしたＢＴ細胞での相同組換えによって、ＰＣＰＴＧ１９１７９の作製を実施した。組換えウイルスは、ＧＦＰ蛍光陰性プラークを選択し、ＢＴ細胞でさらなるプラーク精製を行うことにより単離した。複数回のＰＣＲおよび発現カセットのＤＮＡシークエンシングにより、ウイルスの構造および親ウイルスが存在しないことを確認した。
ＨＢＶコア、Ｐｏｌおよびｅｎｖ抗原の融合物をコードする配列（ＷＯ２０１３／００７７７２に記載の通り）をｐ７．５Ｋプロモーターの制御下に配置し、導入プラスミドに挿入してｐＴＧ１９１７９を得た。ＰＣＰＴＧ１９１０６を感染させ、ＧＦＰ遺伝子内に二本鎖切断を生じるエンドヌクレアーゼの存在下でｐＴＧ１９１７９をヌクレオフェクションによりトランスフェクトしたＢＴ細胞での相同組換えによって、ＰＣＰＴＧ１９１７９の作製を実施した。組換えウイルスは、ＧＦＰ蛍光陰性プラークを選択し、ＢＴ細胞でさらなるプラーク精製を行うことにより単離した。複数回のＰＣＲおよび発現カセットのＤＮＡシークエンシングにより、ウイルスの構造および親ウイルスが存在しないことを確認した。
【0160】
シンジェニックＭＣ３８モデルにおける腫瘍抑制試験
腫瘍成長を抑制し、生存率を高めるＰＣＰＶの能力を、予め剃毛したシンジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した結腸癌細胞株ＭＣ３８（２×１０６細胞）（Ｋｅｒａｆａｓｔから入手可能）で調べた。注射部位にパーマネントマーカーで印を付けた。１×１０７ｐｆｕのＨＰＶ－１６ Ｅ７コードＰＣＰＶもしくはＭＶＡウイルス、またはバッファーを、細胞株注射部位に２日目（Ｄ２）に、その後、出現した腫瘍に９日目および１６日目（Ｄ９およびＤ１６）に注射した。各群１０個体のマウスに注射した。腫瘍成長および生存率は、ＭＣ３８細胞移植後１か月間、経過観察した。投与プロトコールを図６Ａに示す。
腫瘍成長を抑制し、生存率を高めるＰＣＰＶの能力を、予め剃毛したシンジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した結腸癌細胞株ＭＣ３８（２×１０６細胞）（Ｋｅｒａｆａｓｔから入手可能）で調べた。注射部位にパーマネントマーカーで印を付けた。１×１０７ｐｆｕのＨＰＶ－１６ Ｅ７コードＰＣＰＶもしくはＭＶＡウイルス、またはバッファーを、細胞株注射部位に２日目（Ｄ２）に、その後、出現した腫瘍に９日目および１６日目（Ｄ９およびＤ１６）に注射した。各群１０個体のマウスに注射した。腫瘍成長および生存率は、ＭＣ３８細胞移植後１か月間、経過観察した。投与プロトコールを図６Ａに示す。
【0161】
バッファーで処置した総ての動物では、腫瘍は、ＭＣ３８移植後１１～１８日以内に１５００ｍｍ３の体積を超えて急速に成長した（図６Ｄ）。対照的に、組換えＨＰＶ１６Ｅ７コードＭＶＡで処置した動物は、腫瘍成長に遅延を示した。より具体的には、１８日目で５／１０個体に１５００ｍｍ３を超える腫瘍が見られたが、図６Ｂに示されるように、その他の５個体では腫瘍成長はあまり大きくない（腫瘍移植後１８日目で＜１０００ｍｍ３）。意外にも、ＰＣＰＶ処置は、ＭＶＡ処置に比較して強い抗腫瘍防御を提供する。実際に、１５００ｍｍ３の体積に達する腫瘍は、腫瘍移植から１５～２４日後に４／１０個体でのみ見られ、その他の６個体には腫瘍成長は見られなかった（図６Ｃ）。同様に、ＰＣＰＶは、処置した動物で生存率を高めた（図６Ｅ）。
【0162】
結論として、成長の速いＭＣ３８腫瘍に腫瘍内注射する場合、ＰＣＰＶ注射は腫瘍成長の抑制をもたらし、バッファーまたはＭＶＡ注射動物に比較して生存率を高めた。
【0163】
除去試験
ＰＣＰＶ処置前および処置中に適当な除去抗体を注射して、特定の細胞集団、それぞれＣＤ４＋、ＣＤ８＋および好中球を除去した以外は、ＭＣ３８担持マウスにおける腫瘍抑制試験を繰り返した。より具体的には、ＣＤ８＋細胞の除去は、－１、－２、６および１３日目にラットモノクローナル抗体（ＭＡｂ）抗マウスＣＤ８（クローン５３－６－７；ＢｉｏＸＣｅｌｌ）２００μｇの腹腔内（ｉｐ）注射により行った。ＣＤ４＋細胞の除去は、－１、－２、６および１３日目にマウスＣＤ４に対するラットＭａｂ（ＢｉｏＸＣｅｌｌで入手可能なクローンＧＫ１．５）２００μｇの腹腔内注射から達成された。好中球（およびその他のＬｙ６Ｇ細胞）の除去は、－２日目、次いで、週末にかけて１日おきまたは３日毎に、２００μｇの用量でｉｐ注射されるマウスＬｙ６Ｇに対するラットＭＡｂ（クローン１Ａ８；ＢｉｏＸＣｅｌｌ）を使用し、Ｗｏｚｎｉａｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２，ＢＭＣ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３：６５）に記載されているプロトコールに従って行った。
ＰＣＰＶ処置前および処置中に適当な除去抗体を注射して、特定の細胞集団、それぞれＣＤ４＋、ＣＤ８＋および好中球を除去した以外は、ＭＣ３８担持マウスにおける腫瘍抑制試験を繰り返した。より具体的には、ＣＤ８＋細胞の除去は、－１、－２、６および１３日目にラットモノクローナル抗体（ＭＡｂ）抗マウスＣＤ８（クローン５３－６－７；ＢｉｏＸＣｅｌｌ）２００μｇの腹腔内（ｉｐ）注射により行った。ＣＤ４＋細胞の除去は、－１、－２、６および１３日目にマウスＣＤ４に対するラットＭａｂ（ＢｉｏＸＣｅｌｌで入手可能なクローンＧＫ１．５）２００μｇの腹腔内注射から達成された。好中球（およびその他のＬｙ６Ｇ細胞）の除去は、－２日目、次いで、週末にかけて１日おきまたは３日毎に、２００μｇの用量でｉｐ注射されるマウスＬｙ６Ｇに対するラットＭＡｂ（クローン１Ａ８；ＢｉｏＸＣｅｌｌ）を使用し、Ｗｏｚｎｉａｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２，ＢＭＣ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３：６５）に記載されているプロトコールに従って行った。
【0164】
上記のように、結腸癌細胞株ＭＣ３８（２×１０６細胞）を、２日前に剃毛したシンジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。注射部位にパーマネントマーカーで印を付けた。１×１０７ｐｆｕのＰＣＰＶまたはバッファー（陰性対照）を、２日目に細胞株注射部位およびその後は出現した腫瘍（９および１６日目）に注射した。各群１３個体のマウスに注射した。
【0165】
ＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＬｙ６Ｇ＋細胞の除去を、１４日目に屠殺したマウス由来の血液および脾臓（末梢）で確認した（データは示されていない）。しかしながら、Ｌｙ６Ｇで処置したマウス由来のＭＣ３８腫瘍に好中球が存在しないことは実証できなかった（ミエロペルオキシダーゼＭＰＯシグナルはなお検出可能であった）。好中球数の減少は定量的測定値がないために根拠とすることができなかった。腫瘍中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の除去は技術上の理由で調べることができなかった。
【0166】
予想されたように、バッファー処置動物では腫瘍は急速に成長したが（図１２Ｅ）、ＰＣＰＶ処置は腫瘍成長を遅延させた（図１２Ａ）。腫瘍サイズは、ＰＣＰＶ単独で処置した群に比較して、ＰＣＰＶおよび抗Ｌｙ６Ｇで処置した群では１６～２９日目にさらによく抑制された（図１２Ｂ）（ｐ値＜０．００１）。ＰＣＰＶおよび抗ＣＤ８による処置は、ＰＣＰＶ処置群に比較して腫瘍サイズの増大をもたらしたが（ｐ値０．０５）（図１２Ｃ）、ＣＤ４除去抗体による処置は腫瘍成長に有意な効果を示さなかった（図１２Ｄ）。加えて、ＰＣＰＶおよび抗ＣＤ８による処置は生存率を低下させたが、ＰＣＰＶおよび抗Ｌｙ６Ｇによる処置は生存率を上昇させた（ｐ値０．００１）。
【0167】
これらの結果は、ＰＣＰＶに誘導された抗腫瘍応答におけるＣＤ８＋細胞の役割を示唆する。おそらくは循環ＭＤＳＣおよびＮ２好中球の除去のために、Ｌｙ６Ｇによる処置は生存率を高めた。Ｓｈａｕｌ ａｎｄ Ｆｒｉｄｌｅｎｄｅｒ（２０１７，Ｊ．Ｌｅｕｋｏ．Ｂｉｏｌ．１０２（２）：３４３－９）は、好中球の機能的可塑性（特定のサイトカインの影響下で腫瘍に浸潤する好中球の腫瘍形成性(pro-tumor)（Ｎ２）および抗腫瘍性（Ｎ１））を記載している。
【0168】
長期生存個体における腫瘍特異的なＴ細胞の誘導
３４日目に、ＭＣ３８腫瘍が退縮／消散した長期マウス生存個体においてＭＣ－３８特異的なＴ細胞の存在を検討し、ナイーブ動物と比較した。脾細胞を単離し、本質的に以下のように処理した。５個体の生存動物から脾臓を回収し、プールし（ＰＣＰＶ生存個体プール）または２個体の生存マウスの個々の脾臓を完全培地（ＣＭ）中に回収し、次いで、シリンジプランジャーで破砕した。脾細胞懸濁液をＣＭで希釈し、４ｍＬのＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（登録商標）－Ｍ分離細胞培地（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）に載せた。リンパ球を含有する中間層を遠心分離により回収し、赤血球（ＲＢＣ）の溶解が起こるまでＲＢＣ溶解バッファー（ＢＤ ＰｈａｒｍＬｙｓｅ、ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）に再懸濁した。リンパ球をＣＭに再懸濁し、計数した（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）。細胞濃度をＣＭで１×１０７細胞／ｍＬに調整した。マイトマイシンＣ（Mitomycin C）で処理したＭＣ３８細胞、培地（陰性対照）または無関係のペプチドｉ８Ｌ（陰性対照）で刺激した細胞で、刺激を行った。抗原特異的なＩＦＮ－ガンマ（ＩＦＮｇ）産生脾細胞のＥＬＩＳｐｏｔ分析を、標準的プロトコールに従って行った。
３４日目に、ＭＣ３８腫瘍が退縮／消散した長期マウス生存個体においてＭＣ－３８特異的なＴ細胞の存在を検討し、ナイーブ動物と比較した。脾細胞を単離し、本質的に以下のように処理した。５個体の生存動物から脾臓を回収し、プールし（ＰＣＰＶ生存個体プール）または２個体の生存マウスの個々の脾臓を完全培地（ＣＭ）中に回収し、次いで、シリンジプランジャーで破砕した。脾細胞懸濁液をＣＭで希釈し、４ｍＬのＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（登録商標）－Ｍ分離細胞培地（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）に載せた。リンパ球を含有する中間層を遠心分離により回収し、赤血球（ＲＢＣ）の溶解が起こるまでＲＢＣ溶解バッファー（ＢＤ ＰｈａｒｍＬｙｓｅ、ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）に再懸濁した。リンパ球をＣＭに再懸濁し、計数した（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）。細胞濃度をＣＭで１×１０７細胞／ｍＬに調整した。マイトマイシンＣ（Mitomycin C）で処理したＭＣ３８細胞、培地（陰性対照）または無関係のペプチドｉ８Ｌ（陰性対照）で刺激した細胞で、刺激を行った。抗原特異的なＩＦＮ－ガンマ（ＩＦＮｇ）産生脾細胞のＥＬＩＳｐｏｔ分析を、標準的プロトコールに従って行った。
【0169】
図１３は、ＰＣＰＶ処理後の腫瘍特異的（ＭＣ－３８特異的）なＴ細胞が、プールした生存マウスまたは個々の生存マウス（３４日目にＭＣ３８腫瘍が退縮／消散している）の脾細胞で、マイトシチンＣ(Mitocytin C)で処理したＭＣ３８細胞で刺激した後に検出されたことを示す。これに対して、陰性対照（ＣＭまたは無関係のペプチドで刺激）またはナイーブマウスは、ＩＦＮｇ産生細胞を示さなかった。
【0170】
ＰＣＶＰの腫瘍溶解能
ＰＣＰＶの腫瘍溶解能を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手した様々なマウスおよびヒト腫瘍細胞株、例えば、ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２２９（商標））、ＨＣＴ １１６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２４７（商標））、ヒト膠芽腫細胞株Ｕ－８７ ＭＧ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－１４）、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２（商標））およびＭＩＡ－Ｐａｃａ－２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１４２０（商標））（データは示されていない）に加えて、マウス結腸癌ＭＣ３８細胞株で検討した。これらの細胞株の総てで、ＰＣＰＶは軽度の腫瘍溶解性を示すか、腫瘍溶解性を全く示さなかった。ここで、本発明者らは、ＭＯＩ １、１０－１、１０－２および１０－３でＰＣＰＶ－ＧＦＰまたは陽性対照としてＧＦＰを発現するように操作したＶＶ（ＶＶＴＧ）を感染させたＭＣ３８細胞の生存率を示す。５日後、細胞を掻き取って採取し、生細胞の数および割合を、トリパンブルー染色および細胞計数器Ｖｉｃｅｌｌを使用して決定した。図７に示されるように、ＭＣ３８細胞に対するＶＶ感染は、ＭＣ３８の生存能を強く損なった（ＭＯＩ ０．１および１でなお５５％および３０％の細胞が生存）。ＭＣ３８の１９％がＰＣＰＶ－ＧＦＰに感染したが、それらの感染細胞でウイルスは溶解作用を全く示さなかった（ＭＯＩを１０－３から１に引き上げた場合に生細胞の数は同じであったことに裏付けられる）。Ｍｏｃｋ処理は、予想されたように、ＭＣ３８の生存に効果を示さない。
ＰＣＰＶの腫瘍溶解能を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手した様々なマウスおよびヒト腫瘍細胞株、例えば、ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２２９（商標））、ＨＣＴ １１６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２４７（商標））、ヒト膠芽腫細胞株Ｕ－８７ ＭＧ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－１４）、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２（商標））およびＭＩＡ－Ｐａｃａ－２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１４２０（商標））（データは示されていない）に加えて、マウス結腸癌ＭＣ３８細胞株で検討した。これらの細胞株の総てで、ＰＣＰＶは軽度の腫瘍溶解性を示すか、腫瘍溶解性を全く示さなかった。ここで、本発明者らは、ＭＯＩ １、１０－１、１０－２および１０－３でＰＣＰＶ－ＧＦＰまたは陽性対照としてＧＦＰを発現するように操作したＶＶ（ＶＶＴＧ）を感染させたＭＣ３８細胞の生存率を示す。５日後、細胞を掻き取って採取し、生細胞の数および割合を、トリパンブルー染色および細胞計数器Ｖｉｃｅｌｌを使用して決定した。図７に示されるように、ＭＣ３８細胞に対するＶＶ感染は、ＭＣ３８の生存能を強く損なった（ＭＯＩ ０．１および１でなお５５％および３０％の細胞が生存）。ＭＣ３８の１９％がＰＣＰＶ－ＧＦＰに感染したが、それらの感染細胞でウイルスは溶解作用を全く示さなかった（ＭＯＩを１０－３から１に引き上げた場合に生細胞の数は同じであったことに裏付けられる）。Ｍｏｃｋ処理は、予想されたように、ＭＣ３８の生存に効果を示さない。
【0171】
これらの結果に基づけば、ＰＣＰＶで見られた腫瘍抑制は、ＭＣ３８細胞におけるこのウイルスの腫瘍溶解効力で説明することはできないと考えられる。したがって、ＰＣＰＶのｉｎ ｖｉｖｏ有効性と相関があるその他のもの、例えば、サイトカイン／ケモカインプロファイルおよび腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を検討した。
【0172】
ＭＶＡＮ３３．１またはＰＣＰＶの皮下（ｓｃ）適用の後のｉｎ ｖｉｖｏ局所サイトカインプロファイル
局所サイトカインおよびケモカイン検出のために、５．１０５ｐｆｕ／側腹部としてマウスの両側腹部に注射した。各マウスで２つの皮膚サンプルの小片を切り取り、Ｃ型チューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）中の５００μｌ ＰＢＳ中に入れ、機械的に解離させた（ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）。３００ｇでの遠心分離の後、上清をエッペンドルフ管に移し、低温にて１８０００ｇで遠心分離した。明澄な上清を、ＭａｇＰｉｘ装置を製造業者の推奨に従って使用し、Ｐｒｏｃａｒｔａｐｌｅｘマウスケモカイン・サイトカインマルチプレックスキットで分析した。
局所サイトカインおよびケモカイン検出のために、５．１０５ｐｆｕ／側腹部としてマウスの両側腹部に注射した。各マウスで２つの皮膚サンプルの小片を切り取り、Ｃ型チューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）中の５００μｌ ＰＢＳ中に入れ、機械的に解離させた（ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）。３００ｇでの遠心分離の後、上清をエッペンドルフ管に移し、低温にて１８０００ｇで遠心分離した。明澄な上清を、ＭａｇＰｉｘ装置を製造業者の推奨に従って使用し、Ｐｒｏｃａｒｔａｐｌｅｘマウスケモカイン・サイトカインマルチプレックスキットで分析した。
【0173】
各群４個体のマウスを分析した。ＭＶＡおよびＰＣＰＶの注射後に得られたプロファイルをバッファー（陰性対照）と比較した。一般に、各検査物質は、ＭＶＡまたはバッファーの注射後よりもＰＣＰＶの注射後に高い程度で分泌された。予想されたように、バッファーによる処置はサイトカインの分泌に影響を示さなかった。意外にも、ＭＶＡＮ３３．１に比較して、ＰＣＰＶは、有意に高い局所レベルのＩＰ－１０、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１２、ＩＬ－１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ－１８、ＭＣＰ－１およびＭＩＰ１－β（総て図８に示す通り）、ならびにＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＭＩＰ－１α、エオタキシン、ＩＬ－６、ＧＲＯ－α、ＭＣＰ－３、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦおよびＬＩＦ（データは示されていない）を誘導した。
【0174】
マウスＭＣ３８モデルにおけるＴＩＬに対するＰＣＰＶの効果
マウスを６個体の３群に分けた。ＭＣ３８細胞の皮下移植後に成長した明白な（palpable）腫瘍（少なくとも１００ｍｍ３の明白な腫瘍）を、腫瘍細胞移植の９日後に１×１０７ｐｆｕの組換えＰＣＰＶまたはＭＶＡ（両ウイルスはこの腫瘍モデルに関して無関係の抗原であるＨＰＶ１６Ｅ７ｍをコードする）またはバッファー（陰性対照）とともに腫瘍内に注射した。ウイルス注射の翌日、マウスを屠殺し、腫瘍を単離し、酵素的に解離させ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｐｒｏｄｕｃｔｓ：腫瘍解離キット、Ｃチューブ、Ｇｅｎｔｌｅ Ｍａｃｓプログラム：Ｔｕｍｏｒｓ ｍ＿ｉｍｐ ｔｕｍｏｒ ０２の後に撹拌下で３７℃４０分、最後にプログラムｍ＿ｉｍｐｔｕｍｏｒ＿０３を２回）、ＴＩＬを富化した。得られた細胞懸濁液の濾過（孔径７０μｍ）および赤血球溶解（ＢＤ ＰｈａｒｍＬｙｓｅ、５分）の後に、磁性ビーズ技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｐｒｏｄｕｃｔｓ：ＣＤ４５ ＴＩＬマイクロビーズ、ＭｕｌｔｉＭＡＶＳ Ｃｅｌｌ２４で分離、プログラム：ｐｒｏｇ ＰＯＳＳＥＬ＋ｂｌｏｃ ２４）を使用して、ＣＤ４５＋細胞を富化した。ＣＤ４５＋富化細胞内の亜集団は、Ｂｒａｕｎｅｒら（ＡＡＣＲ ２０１７ポスター要約Ｎ°１６７２）に従い、フローサイトメトリーにより識別した。好中球のパーセンテージは、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋ＣＤ４５＋細胞の集団で検出した。ＴＡＭは、Ｌｙ６Ｇ－ＣＤ１１ｂ＋細胞内のＣＤ１１ｃ－亜集団として識別した。様々な亜集団をＭＨＣ ＩＩおよびＬｙ６Ｃで層化した。Ｂｒａｕｎｅｒらによる「ＴＡＭ Ｃ」は、ＭＨＣ ＩＩｌｏおよびＬｙ６Ｃ＋として特徴付けられた。
マウスを６個体の３群に分けた。ＭＣ３８細胞の皮下移植後に成長した明白な（palpable）腫瘍（少なくとも１００ｍｍ３の明白な腫瘍）を、腫瘍細胞移植の９日後に１×１０７ｐｆｕの組換えＰＣＰＶまたはＭＶＡ（両ウイルスはこの腫瘍モデルに関して無関係の抗原であるＨＰＶ１６Ｅ７ｍをコードする）またはバッファー（陰性対照）とともに腫瘍内に注射した。ウイルス注射の翌日、マウスを屠殺し、腫瘍を単離し、酵素的に解離させ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｐｒｏｄｕｃｔｓ：腫瘍解離キット、Ｃチューブ、Ｇｅｎｔｌｅ Ｍａｃｓプログラム：Ｔｕｍｏｒｓ ｍ＿ｉｍｐ ｔｕｍｏｒ ０２の後に撹拌下で３７℃４０分、最後にプログラムｍ＿ｉｍｐｔｕｍｏｒ＿０３を２回）、ＴＩＬを富化した。得られた細胞懸濁液の濾過（孔径７０μｍ）および赤血球溶解（ＢＤ ＰｈａｒｍＬｙｓｅ、５分）の後に、磁性ビーズ技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｐｒｏｄｕｃｔｓ：ＣＤ４５ ＴＩＬマイクロビーズ、ＭｕｌｔｉＭＡＶＳ Ｃｅｌｌ２４で分離、プログラム：ｐｒｏｇ ＰＯＳＳＥＬ＋ｂｌｏｃ ２４）を使用して、ＣＤ４５＋細胞を富化した。ＣＤ４５＋富化細胞内の亜集団は、Ｂｒａｕｎｅｒら（ＡＡＣＲ ２０１７ポスター要約Ｎ°１６７２）に従い、フローサイトメトリーにより識別した。好中球のパーセンテージは、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋ＣＤ４５＋細胞の集団で検出した。ＴＡＭは、Ｌｙ６Ｇ－ＣＤ１１ｂ＋細胞内のＣＤ１１ｃ－亜集団として識別した。様々な亜集団をＭＨＣ ＩＩおよびＬｙ６Ｃで層化した。Ｂｒａｕｎｅｒらによる「ＴＡＭ Ｃ」は、ＭＨＣ ＩＩｌｏおよびＬｙ６Ｃ＋として特徴付けられた。
【0175】
図９は、成長中の腫瘍において好中球のパーセンテージを高める（９Ａ）が、ＴＡＭ Ｃ集団のパーセンテージを引き下げる（９Ｂ）ＰＣＰＶの能力を示す。これらの結果はＰＣＰＶを媒介とする腫瘍抑制の指標となり得る。
【0176】
また、癌において好中球は不均質であり、癌の抑制または進行を増進する異なる好中球集団がある（Ｓｉｎｇｅｌ ａｎｄ Ｓｅｇａｌ，２０１６，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２７３：３２９－４３に総説）という認識も高まりつつある。亜集団のさらなる特性決定ならびにＣＴＬ集団および機能に及ぼすそれらの影響は有用であり得る。
【0177】
ＴＡＭ Ｃマクロファージ（ＭＨＣ ＩＩｌｏ）に関して、Ｍｏｖａｈｅｄｉら（２０１０，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７０：５７２８－３９）は、マウス乳房腫瘍において異なるＴＡＭサブセットを記載している。ＭＨＣ ＩＩｌｏ ＴＡＭＳは、多くがＭ２様表現型であり、低酸素腫瘍領域で存在量が多く、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて優れた血管新生促進活性を有し、腫瘍が進行するにつれ数を増す。この集団の減少は、腫瘍抑制のより良好な予後の指標となり得る。
【0178】
実施例４：ＨＰＶ－Ｅ７ｍを発現するＰＣＰＶを使用したｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性試験
ＥＬＩＳＰＯＴ分析
ＰＣＰＶワクチンベクターにより誘導された免疫原性をＥＬＩＳＰＯＴにより評価し、ＭＶＡと比較した。マウスを６個体の４群に分け、１群をＨＰＶ１６ Ｅ７ｍｕｔをコードするＰＣＰＶで処置し、１群をそのＭＶＡ対応物（ＭＶＡ－ＨＰＶ１６Ｅ７ｍｕｔ）で処置し、１群をエンプティーＭＶＡ（ＭＶＡ Ｎ３３）で処置し、陰性群にはバッファーを施した。１×１０５ｐｆｕのウイルスを１日目および８日目にＣ５７ＢＬ／６マウスに静注した。２回目の免疫誘導の１週間後（１５日目）に、マウスを屠殺し、脾臓および肺を単離した。ＥＬＩＳＰＯＴ分析のため、１つの群の全マウスの脾臓をプールした。肺は、プールするか（実験ＩＣＳ２４）、または細胞内サイトカイン染色により抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞に関して別個に試験した（実験ＩＣＳ２８）。両試験とも、ＨＰＶ１６Ｅ７特異的ペプチドＲ９Ｆ、ＭＶＡ特異的ペプチドＴ８Ｖ、および無関係のペプチドＩ８ＬまたはＫ９ｉ－３Ｃ ＣＴＲＬで、抗原特異性を調べた。
ＥＬＩＳＰＯＴ分析
ＰＣＰＶワクチンベクターにより誘導された免疫原性をＥＬＩＳＰＯＴにより評価し、ＭＶＡと比較した。マウスを６個体の４群に分け、１群をＨＰＶ１６ Ｅ７ｍｕｔをコードするＰＣＰＶで処置し、１群をそのＭＶＡ対応物（ＭＶＡ－ＨＰＶ１６Ｅ７ｍｕｔ）で処置し、１群をエンプティーＭＶＡ（ＭＶＡ Ｎ３３）で処置し、陰性群にはバッファーを施した。１×１０５ｐｆｕのウイルスを１日目および８日目にＣ５７ＢＬ／６マウスに静注した。２回目の免疫誘導の１週間後（１５日目）に、マウスを屠殺し、脾臓および肺を単離した。ＥＬＩＳＰＯＴ分析のため、１つの群の全マウスの脾臓をプールした。肺は、プールするか（実験ＩＣＳ２４）、または細胞内サイトカイン染色により抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞に関して別個に試験した（実験ＩＣＳ２８）。両試験とも、ＨＰＶ１６Ｅ７特異的ペプチドＲ９Ｆ、ＭＶＡ特異的ペプチドＴ８Ｖ、および無関係のペプチドＩ８ＬまたはＫ９ｉ－３Ｃ ＣＴＲＬで、抗原特異性を調べた。
【0179】
抗原特異的なＩＦＮ－γ産生脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴ分析は、標準的なプロトコールに従って行った。
【0180】
プレートの準備
プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＳＩＰＳ４Ｗ１０）をエタノール３５％（１５μｌ／ウェル）で１分間前処理し、無菌水（２００μｌ／ウェル）で５回洗浄した。ウェルを１００μｌの１５μｇ／ｍｌ抗マウスＩＦＮｇ抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ、ＡＮ１８、３３２１－３－１０００；ＰＢＳに希釈）でコーティングし、一晩または週末にかけて＋４℃でインキュベートした。試験当日に、プレートを無菌ＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で５回洗浄し、３７℃にて完全培地（ＣＭ ２００μＬ／ウェル）で少なくとも１時間飽和させた。
プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＳＩＰＳ４Ｗ１０）をエタノール３５％（１５μｌ／ウェル）で１分間前処理し、無菌水（２００μｌ／ウェル）で５回洗浄した。ウェルを１００μｌの１５μｇ／ｍｌ抗マウスＩＦＮｇ抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ、ＡＮ１８、３３２１－３－１０００；ＰＢＳに希釈）でコーティングし、一晩または週末にかけて＋４℃でインキュベートした。試験当日に、プレートを無菌ＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で５回洗浄し、３７℃にて完全培地（ＣＭ ２００μＬ／ウェル）で少なくとも１時間飽和させた。
【0181】
サンプル調製
ｅｘ ｖｉｖｏ Ｅｌｉｓｐｏｔｓは、新鮮な脾臓リンパ球で行った。各試験のため、各群５個体から脾臓を回収し、プールした。脾臓を４ｍＬの完全培地（ＣＭ；Ｘ－Ｖｉｖｏ、Ｌｏｎｚａ ＢＥ０４－３８０Ｑ）に回収し、次いで、６ウェルプレート内で７０μｍのセルストレーナーを通してシリンジプランジャーで破砕した。得られた脾細胞懸濁液をＣＭで２倍希釈し、４ｍＬのＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（登録商標）－Ｍ分離細胞培地（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、ｒｅｆ：ＣＬ５０３５）に載せ、室温にて１５００ｇで２０分間遠心分離した。リンパ球を含有する中間層を回収し、１０ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した（室温にて４００ｇで遠心分離５分）。リンパ球を２ｍＬの赤血球（ＲＢＣ）溶解バッファー（ＢＤ ＰｈａｒｍＬｙｓｅ、ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、ｒｅｆ ５５５８９９）に再懸濁させ、室温で５～１５分間インキュベートして赤血球を溶解させた。ＣＭ中で１回の洗浄工程（室温にて４００ｇで遠心分離５分）の後、リンパ球を１０ｍＬのＣＭに再懸濁させ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒの「Ｚ２ Ｃｏｕｌｔｅｒパーティクルカウント・サイズアナライザー」を使用して計数した。細胞の濃度をＣＭで１×１０７細胞／ｍＬに調整した。
ｅｘ ｖｉｖｏ Ｅｌｉｓｐｏｔｓは、新鮮な脾臓リンパ球で行った。各試験のため、各群５個体から脾臓を回収し、プールした。脾臓を４ｍＬの完全培地（ＣＭ；Ｘ－Ｖｉｖｏ、Ｌｏｎｚａ ＢＥ０４－３８０Ｑ）に回収し、次いで、６ウェルプレート内で７０μｍのセルストレーナーを通してシリンジプランジャーで破砕した。得られた脾細胞懸濁液をＣＭで２倍希釈し、４ｍＬのＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（登録商標）－Ｍ分離細胞培地（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、ｒｅｆ：ＣＬ５０３５）に載せ、室温にて１５００ｇで２０分間遠心分離した。リンパ球を含有する中間層を回収し、１０ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した（室温にて４００ｇで遠心分離５分）。リンパ球を２ｍＬの赤血球（ＲＢＣ）溶解バッファー（ＢＤ ＰｈａｒｍＬｙｓｅ、ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、ｒｅｆ ５５５８９９）に再懸濁させ、室温で５～１５分間インキュベートして赤血球を溶解させた。ＣＭ中で１回の洗浄工程（室温にて４００ｇで遠心分離５分）の後、リンパ球を１０ｍＬのＣＭに再懸濁させ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒの「Ｚ２ Ｃｏｕｌｔｅｒパーティクルカウント・サイズアナライザー」を使用して計数した。細胞の濃度をＣＭで１×１０７細胞／ｍＬに調整した。
【0182】
アッセイ
最初に、プレートを空にして飽和している培地を除き、５０μＬのＣＭを総てのウェルに添加した。ＣＭ中４μｇ／ｍＬの各ペプチド溶液５０μＬまたは５０μＬのＣＭ（陰性対照）を関連のウェルに添加した（予め定義されたピペットスキームに従う；各条件を４反復で試験した）。陽性対照として、５０μＬの２０μｇ／ｍＬコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を所定のウェルに添加した。次いで、１００μＬの各リンパ球懸濁液（１×１０６細胞）をそれらのウェル（３×１０５細胞を添加するのみであるＴ８Ｖウェル以外）に添加し、プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で１８～２０時間インキュベートした。
最初に、プレートを空にして飽和している培地を除き、５０μＬのＣＭを総てのウェルに添加した。ＣＭ中４μｇ／ｍＬの各ペプチド溶液５０μＬまたは５０μＬのＣＭ（陰性対照）を関連のウェルに添加した（予め定義されたピペットスキームに従う；各条件を４反復で試験した）。陽性対照として、５０μＬの２０μｇ／ｍＬコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を所定のウェルに添加した。次いで、１００μＬの各リンパ球懸濁液（１×１０６細胞）をそれらのウェル（３×１０５細胞を添加するのみであるＴ８Ｖウェル以外）に添加し、プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で１８～２０時間インキュベートした。
【0183】
翌日、プレートを空にして細胞を除き、プレートをＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で５回洗浄し、ビオチン化抗マウスＩＦＮｇモノクローナル抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ、Ｒ４－６Ａ２、３３２１－６－１０００；０．５％ＦＣＳ含有ＰＢＳ中、終濃度１μｇ／ｍＬ）を各ウェルに分配した（１００μＬ／ウェル）。プレートを室温で２時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳで５回洗浄し、Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ－アルカリホスファターゼ（ＳＩＧＭＡ、Ｅ２３６、０．５％ＦＣＳ含有ＰＢＳ中１／５０００ｅ）を各ウェルに分配した（１００μＬ／ウェル）。プレートを再び室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳで５回洗浄し、１００μＬのＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質溶液（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ錠、ＳＩＧＭＡ、Ｂ５６５５；０．４５μＭで濾過済み）を各ウェルに分配した。プレートを、陽性対照のウェルに明瞭なスポットが見られるまで（５～１０分間）、暗所に室温でインキュベートした。プレートを空にし、水道水でよく洗浄することで発色を停止させた。プレートを、室温で少なくとも１時間、乾燥するまで蓋をせずに暗所に置いた。
【0184】
データの取得
スポットをＥＬＩＳｐｏｔリーダー（ＣＴＬ Ｉｍｍｕｎｏｑｐｏｔリーダー、Ｓ５ＵＶ）で計数した。ウェル毎に品質管理を行って、ＥＬＩＳｐｏｔリーダーが示した計数値が画像の実態と合致することを保証した。４反復のそれぞれについて、１×１０６の脾臓リンパ球当たりのスポット形成単位（ｓｆｕ）の平均数として、結果を表した。正値性はＲスクリプト（ｌｉｖｅｌｉｎｋ Ｂｉｏｓｔａｔ）により決定した。
スポットをＥＬＩＳｐｏｔリーダー（ＣＴＬ Ｉｍｍｕｎｏｑｐｏｔリーダー、Ｓ５ＵＶ）で計数した。ウェル毎に品質管理を行って、ＥＬＩＳｐｏｔリーダーが示した計数値が画像の実態と合致することを保証した。４反復のそれぞれについて、１×１０６の脾臓リンパ球当たりのスポット形成単位（ｓｆｕ）の平均数として、結果を表した。正値性はＲスクリプト（ｌｉｖｅｌｉｎｋ Ｂｉｏｓｔａｔ）により決定した。
【0185】
結果
ＨＰＶ１６Ｅ７ｍコードＰＣＰＶおよびＭＶＡで処置した動物群から採取した脾細胞は、図１０Ａに示すように、Ｒ９Ｆ特異的にＩＦＮγの分泌を示し、これによりコードされている抗原に対する特異的免疫応答を惹起するこれら２つの組換えウイルスの能力が明らかとなった。一方、エンプティーＭＶＡもしくはバッファーを投与した後または無関係のペプチドＫ９ｉ－３で刺激した後にはＩＦＮγの分泌を検出することができなかった。他方で、ＭＶＡベクター（エンプティーおよび組換えＭＶＡのいずれか）のみが、ＭＶＡ特異的ペプチドＴ８Ｖで刺激した後に応答する（図１０Ｂ）。
ＨＰＶ１６Ｅ７ｍコードＰＣＰＶおよびＭＶＡで処置した動物群から採取した脾細胞は、図１０Ａに示すように、Ｒ９Ｆ特異的にＩＦＮγの分泌を示し、これによりコードされている抗原に対する特異的免疫応答を惹起するこれら２つの組換えウイルスの能力が明らかとなった。一方、エンプティーＭＶＡもしくはバッファーを投与した後または無関係のペプチドＫ９ｉ－３で刺激した後にはＩＦＮγの分泌を検出することができなかった。他方で、ＭＶＡベクター（エンプティーおよび組換えＭＶＡのいずれか）のみが、ＭＶＡ特異的ペプチドＴ８Ｖで刺激した後に応答する（図１０Ｂ）。
【0186】
プールした肺サンプルに対するＩＣＳ分析
免疫したマウスの肺をプールするか（ＩＣＳ ０２４）、またはＲｅｍｙ－Ｚｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１８，Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１４：１４０－５）に記載されているように別個に処理した（ＩＣＳ ０２８）。まず、肺を酵素的および機械的に解離させた（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｐｒｏｄｕｃｔｓ：腫瘍解離キット、ＣチューブおよびＧｅｎｔｌｅＭａｃｓ）。２×１０６細胞をｅｘ ｖｉｖｏにて、１５０μＬのＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中、１μｇの抗ＣＤ２８（ａｂｃａｍ）と、ＨＰＶ１６Ｅ７特異的ペプチドＲ９Ｆ、ＭＶＡ特異的ペプチドＴ８Ｖまたは無関係のペプチドＩ８Ｌのいずれかとの存在下で刺激した。ブレフェルジンの存在下で５時間のインキュベーションの後、抗ＣＤ３および抗ＣＤ８抗体を使用し、フローサイトメトリーにより細胞を分析した。透過処理（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の後、抗ＩＦＮ－γ－ＦＩＴＣ（クローンＸＭＧ１．２、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）またはそのアイソタイプ対照による細胞内染色によって、活性化を評価した。リンパ球亜集団を、短命のエフェクター細胞および初期のエフェクター細胞を含んでなるＣＤ３ｄｉｍＣＤ８ｄｉｍ亜集団として定義した。ドットブロット分析は、組換えＭＶＡまたはＰＣＰＶの２回の注射が、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞から構成されるＣＤ３ｄｉｍＣＤ８ｄｉｍ集団（Ｒｅｍｙ－Ｚｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１８，Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１４：１４０－５に記載の通り）の出現をもたらすことを示す（データは示されていない）。この集団が増殖する程度は、ＰＣＰＶよりもＭＶＡで良好であった（図１０Ｃ）。しかしながら、これらの亜集団では、図１０Ｄに示されるように、ＨＰＶ１６ Ｅ７ｍコードＰＣＰＶまたはＭＶＡの注射の後に、同等の数のＲ９Ｆ特異的なＴ細胞が検出された。言い換えれば、ＰＣＰＶにより誘導されたＣＤ３ｄｉｍＣＤ８ｄｉｍ細胞の全体的な数は少なくても、Ｒ９Ｆ特異的なＩＦＮ－γ分泌細胞の絶対数は、ＨＰＶ１６Ｅ７ｍコードＰＣＰＶおよびＭＶＡを投与された動物で同等であった。このことはＨＰＶ１６ Ｅ７特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導倍率がＭＶＡベクターよりもＰＣＰＶベクターの接種後に高かったことを示唆する。
免疫したマウスの肺をプールするか（ＩＣＳ ０２４）、またはＲｅｍｙ－Ｚｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１８，Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１４：１４０－５）に記載されているように別個に処理した（ＩＣＳ ０２８）。まず、肺を酵素的および機械的に解離させた（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｐｒｏｄｕｃｔｓ：腫瘍解離キット、ＣチューブおよびＧｅｎｔｌｅＭａｃｓ）。２×１０６細胞をｅｘ ｖｉｖｏにて、１５０μＬのＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中、１μｇの抗ＣＤ２８（ａｂｃａｍ）と、ＨＰＶ１６Ｅ７特異的ペプチドＲ９Ｆ、ＭＶＡ特異的ペプチドＴ８Ｖまたは無関係のペプチドＩ８Ｌのいずれかとの存在下で刺激した。ブレフェルジンの存在下で５時間のインキュベーションの後、抗ＣＤ３および抗ＣＤ８抗体を使用し、フローサイトメトリーにより細胞を分析した。透過処理（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の後、抗ＩＦＮ－γ－ＦＩＴＣ（クローンＸＭＧ１．２、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）またはそのアイソタイプ対照による細胞内染色によって、活性化を評価した。リンパ球亜集団を、短命のエフェクター細胞および初期のエフェクター細胞を含んでなるＣＤ３ｄｉｍＣＤ８ｄｉｍ亜集団として定義した。ドットブロット分析は、組換えＭＶＡまたはＰＣＰＶの２回の注射が、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞から構成されるＣＤ３ｄｉｍＣＤ８ｄｉｍ集団（Ｒｅｍｙ－Ｚｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１８，Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１４：１４０－５に記載の通り）の出現をもたらすことを示す（データは示されていない）。この集団が増殖する程度は、ＰＣＰＶよりもＭＶＡで良好であった（図１０Ｃ）。しかしながら、これらの亜集団では、図１０Ｄに示されるように、ＨＰＶ１６ Ｅ７ｍコードＰＣＰＶまたはＭＶＡの注射の後に、同等の数のＲ９Ｆ特異的なＴ細胞が検出された。言い換えれば、ＰＣＰＶにより誘導されたＣＤ３ｄｉｍＣＤ８ｄｉｍ細胞の全体的な数は少なくても、Ｒ９Ｆ特異的なＩＦＮ－γ分泌細胞の絶対数は、ＨＰＶ１６Ｅ７ｍコードＰＣＰＶおよびＭＶＡを投与された動物で同等であった。このことはＨＰＶ１６ Ｅ７特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導倍率がＭＶＡベクターよりもＰＣＰＶベクターの接種後に高かったことを示唆する。
【0187】
ＭＶＡＮ３３．１、ＨＰＶ１６Ｅ７コードＭＶＡおよびＨＰＶ１６Ｅ７コードＰＣＰＶ（すなわち、その非発癌型）を接種したマウスの別個の肺を、ＣＤ３ｄｉｍＣＤ８ｄｉｍ集団内のＲ９Ｆ特異的なＩＦＮ－γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加倍率に関して分析した。図１１に示されるように、ＨＰＶＥ７ ＭＶＡ処置群に比較してＨＰＶＥ７ ＰＣＰＶ処置群では有意に高い数（増加倍率）の計数値が見られた。
【0188】
まとめると、これらのデータは、ＭＶＡ－Ｅ７と同様に、ＰＣＰＶ－Ｅ７は強い細胞応答（脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴおよび抗原特異的な短命のエフェクター細胞の度数）を誘導したが、ＰＣＰＶ－Ｅ７は、ＩＰ－１０、ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１８、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＩＬ－１２およびＩＬ－６を含む亢炎症性サイトカインのレベルの上昇とともに、注射部位に異なるプロファイルを示した。成長の速いＭＣ－３８腫瘍に腫瘍内注射すると、ＰＣＰＶは腫瘍抑制をもたらした。腫瘍浸潤物の分析は、ＰＣＰＶ処置によって、より好中球レベルの上昇およびＭＨＣＩＩｌｏ（Ｍ２）ＴＡＭの頻度低下がもたらされたことを示した。
【0189】
結論として、本発明者らのデータは、ＰＣＰＶは現行のウイルスベクターよりも、局所応答およびプライム活性という点で、エフェクターＴ細胞を誘導し、腫瘍浸潤プロファイルを再形成する能力に、より良好な特性を示し得ることを実証する。その他のポックスウイルスに比較して多くの遺伝的差異があるが、ＰＣＰＶは大きな遺伝子ペイロード（payload）をコードし、送達する能力を有し、これは高度な抗腫瘍ワクチンを設計するために有用である。
【0190】
異種プライム・ブースト（ＰＣＰＶ／ＭＶＡ）
ＰＣＰＶ感染患者は、ワクシニア／ＭＶＡに対する免疫を生じず、逆もまた然りであることが公表されている（Ｆｒｉｅｄｍａｎ－Ｋｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９６３，Ｓｃｉｅｎｃｅ １４０：１３３５－６）。したがって、ＭＶＡ－ＨＰＶ１６Ｅ７およびＰＣＰＶ－ＨＰＶ１６Ｅ７による併用処置をＴＣ１腫瘍モデルで検討した。
ＰＣＰＶ感染患者は、ワクシニア／ＭＶＡに対する免疫を生じず、逆もまた然りであることが公表されている（Ｆｒｉｅｄｍａｎ－Ｋｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９６３，Ｓｃｉｅｎｃｅ １４０：１３３５－６）。したがって、ＭＶＡ－ＨＰＶ１６Ｅ７およびＰＣＰＶ－ＨＰＶ１６Ｅ７による併用処置をＴＣ１腫瘍モデルで検討した。
【0191】
このために、ＨＰＶ１６Ｅ７陽性ＴＣ１細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に皮下移植した。１４日後、腫瘍担持マウスを無作為化し（各群１０個体）、１×１０６ｐｆｕのＭＶＡ－ＨＰＶ１６Ｅ７またはＰＣＰＶ－ＨＰＶ１６Ｅ７を腫瘍内に注射した。１週間後、１×１０６ｐｆｕのＰＣＰＶ－ＨＰＶ１６Ｅ７またはＭＶＡ－ＨＰＶ１６Ｅ７の静注によってブーストを行った。同種ＭＶＡ／ＭＶＡおよび異種ＭＶＡ／ＰＣＰＶおよびＰＣＰＶ／ＭＶＡセットまたは陰性対照として同じ条件下（腫瘍内プライムおよびｉｖブースト）のバッファーで処置したマウスにおいて、腫瘍成長および生存率を経時的に追跡した。
【0192】
図１４に示されるように、異種処置は、同種ＭＶＡ－ＨＰＶ１６Ｅ７プライム・ブースト処置に比較してより良好な腫瘍抑制をもたらした。興味深いことに、ＭＶＡプライム／ＰＣＰＶブーストまたはＰＣＰＶプライム／ＭＶＡブーストは両方とも、ＭＶＡプライム／ＭＶＡブースト群よりも腫瘍成長に低下をもたらしたが、ＰＣＰＶプライム／ＭＶＡブーストは腫瘍成長をより良好に抑制する傾向がある（図１４Ｃに示されるように、より多数のマウスで腫瘍抑制）。予想されたように、バッファー処置動物では、腫瘍はかなり急速に成長した。
【0193】
実施例５：ＰＣＰＶとＩＣＩ（免疫チェックポイント阻害剤）との併用処置
ＰＣＰＶ処置を全身性ＩＣＩ処置と併用する効果をＭＣ３８腫瘍モデルで評価した。ラット抗ｍＰＤ－１（ｍはマウスを表す）抗体ＲＭＰ１－１４（ＢｉｏＸｃｅｌｌから市販）を選択した。この抗体は、ｍＰＤ１とそのリガンドとの相互作用を遮断することが示されている（Ｙａｍａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５（３）：１５８６－９２）。
ＰＣＰＶ処置を全身性ＩＣＩ処置と併用する効果をＭＣ３８腫瘍モデルで評価した。ラット抗ｍＰＤ－１（ｍはマウスを表す）抗体ＲＭＰ１－１４（ＢｉｏＸｃｅｌｌから市販）を選択した。この抗体は、ｍＰＤ１とそのリガンドとの相互作用を遮断することが示されている（Ｙａｍａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５（３）：１５８６－９２）。
【0194】
１日目（Ｄ１）に、結腸癌細胞株ＭＣ３８（２×１０６細胞）を、２日前に剃毛したシンジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に皮下（ｓｃ）注射した。この注射部位にパーマネントマーカーで印を付けた。同日に、４分の１のＭＣ３８細胞（５×１０５）を左側腹部にｓｃ注射した。１×１０７ｐｆｕのＰＣＰＶ（ＰＣＰＴＧ１９１７８）またはＶＶウイルス（ＶＶＴＧ５０９５）（両方ともＨＰＶ１６Ｅ７ｍ（ＭＣ３８モデルとは無関係）をコードする）、またはバッファー（Ｓ０８）を右側の細胞株注射部位の腫瘍内（ｉｔ）に注射し（２日目）、その後は出現した右側の腫瘍に注射した（９および１６日目）。他方、２００μｇの抗ｍＰＤ－１（ＲＭＰＩ１－１４）を５、９および１６日目に腹腔内（ｉｐ）注射した。右（注射）および左の腫瘍の腫瘍成長および生存率を経時的に追跡した。
【0195】
まとめると、マウスを以下のそれぞれ１３個体の６群、
・Ｓ０８バッファーを施す対照群（２、９および１６日目で３回のｉｔ注射）、
・Ｅ７発現ＰＣＰＶウイルスで処置するマウス群（１０７ｐｆｕのＰＣＰＴＧ１９１７８の、２、９および１６日目で３回のｉｔ注射）、
・Ｅ７発現腫瘍溶解性ＶＶウイルスで処置するマウス群（１０７ｐｆｕのＶＶＴＧ５０９５の、２、９および１６日目で３回のｉｔ注射）、
・抗ＰＤ１抗体で処置するマウス群（ＲＭＰ１－１４抗体の、５、９および１６日目で３回のｉｐ注射）、
・Ｅ７発現ＰＣＰＶウイルスおよび抗ＰＤ１抗体の両方を施す群（１０７ｐｆｕのＰＣＰＴＧ１９１７８の、２、９および１６日目で３回のｉｔ注射ならびにＲＭＰ１－１４抗体の、５、９および１６日目で３回のｉｐ注射）、および
・Ｅ７発現ＶＶ腫瘍溶解性ウイルスおよび抗ＰＤ１抗体の両方を施す群（１０７ｐｆｕのＶＶＴＧ５０９５の、２、９および１６日目で３回のｉｔ注射ならびにＲＭＰ１－１４抗体の、５、９および１６日目で３回のｉｐ注射）
に分けた。
・Ｓ０８バッファーを施す対照群（２、９および１６日目で３回のｉｔ注射）、
・Ｅ７発現ＰＣＰＶウイルスで処置するマウス群（１０７ｐｆｕのＰＣＰＴＧ１９１７８の、２、９および１６日目で３回のｉｔ注射）、
・Ｅ７発現腫瘍溶解性ＶＶウイルスで処置するマウス群（１０７ｐｆｕのＶＶＴＧ５０９５の、２、９および１６日目で３回のｉｔ注射）、
・抗ＰＤ１抗体で処置するマウス群（ＲＭＰ１－１４抗体の、５、９および１６日目で３回のｉｐ注射）、
・Ｅ７発現ＰＣＰＶウイルスおよび抗ＰＤ１抗体の両方を施す群（１０７ｐｆｕのＰＣＰＴＧ１９１７８の、２、９および１６日目で３回のｉｔ注射ならびにＲＭＰ１－１４抗体の、５、９および１６日目で３回のｉｐ注射）、および
・Ｅ７発現ＶＶ腫瘍溶解性ウイルスおよび抗ＰＤ１抗体の両方を施す群（１０７ｐｆｕのＶＶＴＧ５０９５の、２、９および１６日目で３回のｉｔ注射ならびにＲＭＰ１－１４抗体の、５、９および１６日目で３回のｉｐ注射）
に分けた。
【0196】
図１５は、ＰＣＰＶ（Ａ）またはＶＶ（Ｂ）を単独でまたはマウス抗ＰＤ１と組み合わせて処置したマウス群の右側腹部に移植した腫瘍の直径の拡大を示す。より具体的には、対照群（Ｓ０８）では腫瘍は急速に成長して、Ｄ１３という早くに平均で２０００ｍｍ３を超え、一方、抗ｍＰＤ１での処置は、平均２０００ｍｍ３の体積を超えるのを数日（Ｄ１６）引き延ばすことを可能とした。図１５Ｂに示されるように、同じ傾向が腫瘍溶解性ＶＶＴＧ５０９５での処置後にも見られた（濃い灰色）。しかし、腫瘍成長は、ＶＶＴＧ５０９５および抗ｍＰＤ１の組合せで処置したマウス（中間の灰色）において抑制され、平均２０００ｍｍ３の体積はＤ２２に見られた。これに対し、図１５Ａに示されるように、ＰＣＰＶウイルスでの処置後には腫瘍成長は有意に遅延され（濃い灰色）、平均腫瘍体積は、Ｄ２２において２０００ｍｍ３を十分下回り、ＰＣＰＴＧ１９１７８および抗ＰＤ１の両方を施す併用群ではさらに顕著に下回った（中間の灰色）。特に、ＰＣＰＶ－ＨＰＶ１６Ｅ７＋抗ＰＤ－１併用群では、腫瘍サイズの差異は、その他の３群ＰＣＰＶ－ＨＰＶ１６Ｅ７、抗ＰＤ－１およびＳ０８で見られる腫瘍サイズに対して有意であることが判明した。
【0197】
反対側の腫瘍（左側腹部）では、抗ｍＰＤ１抗体での処置が腫瘍進行を遅延させた。その他の群に対して抗ＰＤ１群では、有意な腫瘍サイズの縮小が見られた（データは示されていない）。
【0198】
生存期間分析に関して（データは示されていない）、ＰＣＰＶ－ＨＰＶ１６Ｅ７群およびＰＣＰＶ－ＨＰＶ１６Ｅ７＋抗ＰＤ－１併用群の両方で、Ｓ０８バッファー群に対して有意に高いＯＳが見られた（補正ｐ値は両方とも０．０３６であった）。平均生存期間の差異はそれぞれ４．４日および３．４日であった。また、ＶＶ－ＨＰＶ１６Ｅ７＋抗ＰＤ－１併用群でも、ＶＶ－ＨＰＶ１６Ｅ７および対照群に対して有意に高いＯＳが見られた（補正ｐ値は０．０４０および０．００４であった）。平均生存期間の差異はそれぞれ２．９日および３．６日であった。
【0199】
これらの結果から、組換えＰＣＰＶとＩＣＩ（例えば、抗ＰＤ１）との併用は抗腫瘍防御の強化を可能とすることが強調される。
【0200】
実施例６：ウシ丘疹性口炎ウイルスの効果
パラポックスウイルス属は、異なるメンバー、例えば、ＯＲＦウイルス、ＰＣＰＶおよびウシ丘疹性口炎ウイルス（ＢＰＳＶ）を含んでなり、総て反芻動物およびそれらの取扱者の感染を引き起こし得る（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９４：２２９－３４）。ヒトにおけるＰＡＰＶ感染は、強くて短い細胞媒介免疫応答および弱くて短い体液性応答を誘導し、約８～１２％の個体が取扱者に二次感染する（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９４：２２９－３４）。
パラポックスウイルス属は、異なるメンバー、例えば、ＯＲＦウイルス、ＰＣＰＶおよびウシ丘疹性口炎ウイルス（ＢＰＳＶ）を含んでなり、総て反芻動物およびそれらの取扱者の感染を引き起こし得る（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９４：２２９－３４）。ヒトにおけるＰＡＰＶ感染は、強くて短い細胞媒介免疫応答および弱くて短い体液性応答を誘導し、約８～１２％の個体が取扱者に二次感染する（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９４：２２９－３４）。
【0201】
パラポックスウイルス属の別のメンバーである（ＢＰＳＶ）を、２名の異なるドナーから得られたＰＢＭＣにおいてＩＦＮαの分泌を誘導するその能力に関して試験し、ＭＶＡおよびＰＣＰＶと比較した（実施例１参照）。新鮮なＰＢＭＣを単離し、一晩インキュベートし（休止させ）、翌日にＭＯＩ ０．３でウイルスを感染させた。ＣｐＧ型ＴＬＲ９リガンド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎから入手したＯＤＮ２２１６）をｐＤＣ、Ｂ細胞により媒介されるＩＦＮ－αの分泌の対照として添加した。感染２、４、６、１６または２４時間後に上清を採取し、上清中のＩＦＮ－αを、上記のようにＬｕｍｉｎｅｘ技術で定量した。
【0202】
図１６に示されるように、ＰＣＰＶに感染したＰＢＭＣのようにＢＰＳＶに感染したＰＢＭＣは、細胞感染の１６および２４時間後に極めて高レベルのＩＦＮ－αの分泌を誘導した。両場合とも、分泌されたＩＦＮ－αレベルは、ＭＶＡ感染時に見られたＩＦＮ－αの中程度の分泌レベルを十分に超えており（実施例１で得られた結果が確認される）、ＯＤＮ２２１６対照も超えていた。
【0203】
結論として、ＢＰＳＶは、ＰＣＰＶと同様の効果を示し、すなわち、種々のドナーから得られたＰＢＭＣの上清において分泌されたＩＦＮ－αを顕著に増大させた。
【0204】
参照文献
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Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９４：２２９－３４
Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ １０７，２４６１－２４６９
Ｚｉｔｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５（７）：４０５－１４
ＷＯ９２／０７０００
ＷＯ９６／１６１８３
ＷＯ９７／３２０２９
ＷＯ９７／３７０３１
ＷＯ９８／０４７２７
ＷＯ９８／３７０９５
ＷＯ９９／０３８８５
ＷＯ０１／２３００１
ＷＯ０３／０５３４６３
ＷＯ２００５／０７８５７
ＷＯ２００６／００５５２９
ＷＯ２００６／０８５０８２
ＷＯ２００６／９３９２４
ＷＯ２００７／０５６８４７
ＷＯ２００７／１４７５２８
ＷＯ２００８／０９２８５４
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図12E】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【手続補正書】
【提出日】2024-02-08
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゲノムに挿入された少なくとも１つの外来核酸を含んでなる、偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ）。
【外国語明細書】