特開 2024-50726 グルコース測定用バイオセンサ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024050726

(43)【公開日】2024-04-10

(54)【発明の名称】グルコース測定用バイオセンサ

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/34 20060101AFI20240403BHJP

   C12N 15/53 20060101ALN20240403BHJP

   C12N 9/04 20060101ALN20240403BHJP

【ＦＩ】

C12M1/34 E ZNA

C12N15/53

C12N9/04 D

【審査請求】有

【請求項の数】7

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024012365

(22)【出願日】2024-01-31

(62)【分割の表示】P 2022166564の分割

【原出願日】2007-06-29

(31)【優先権主張番号】P 2006180491

(32)【優先日】2006-06-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(31)【優先権主張番号】P 2006247535

(32)【優先日】2006-09-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(71)【出願人】

【識別番号】592031097

【氏名又は名称】ＰＨＣ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】230104019

【弁護士】

【氏名又は名称】大野 聖二

(74)【代理人】

【識別番号】100119183

【弁理士】

【氏名又は名称】松任谷 優子

(72)【発明者】

【氏名】矢田 貴子

(72)【発明者】

【氏名】宮本 浩士

(72)【発明者】

【氏名】本田 通済

(57)【要約】      （修正有）

【課題】グルコースに対する反応性、熱安定性、基質認識性に優れ、しかもマルトースに対する作用性が低いＦＡＤ結合型グルコース脱水素酵素を使用した、グルコース測定用のバイオセンサを提供する。
【解決手段】バイオセンサは、電極系と、電極系上に配置された酵素反応層とを備え、酵素反応層は、ＦＡＤ結合型グルコース脱水素酵素及び電子受容体を含み、ＦＡＤ結合型グルコース脱水素酵素が、アスペルギルス・オリゼ株由来のタンパク質であって、タンパク質当たりの比活性が３００Ｕ／ｍｇ以上であり、かつ、Ｄ－グルコースに対する酵素活性を１００％とした場合に、マルトースに対する酵素活性値が５％以下の酵素であり、ＦＡＤ結合型グルコース脱水素酵素は、アミノ酸配列ＡＧＶＰＷＶを含むポリペプチドであり、電子受容体が、オスミウム化合物、キノン化合物、及びフェリシアン化合物からなる群から選ばれるいずれかの化合物である。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

グルコース測定用バイオセンサであって、
電極系と、前記電極系上に配置された酵素反応層とを備え、
前記酵素反応層は、ＦＡＤ結合型グルコース脱水素酵素及び電子受容体を含み、
前記ＦＡＤ結合型グルコース脱水素酵素が、アスペルギルス・オリゼ株由来のタンパク質であって、タンパク質当たりの比活性が３００Ｕ／ｍｇ以上であり、かつ、Ｄ－グルコースに対する酵素活性を１００％とした場合に、マルトースに対する酵素活性値が５％以下の酵素であり、
前記ＦＡＤ結合型グルコース脱水素酵素は、アミノ酸配列ＡＧＶＰＷＶを含むポリペプチドであり、かつ、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個～数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列から成り、ＦＡＤ結合型グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド；又は
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成り、かつ、ＦＡＤ結合型グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド、であり
前記電子受容体が、オスミウム化合物、キノン化合物、及びフェリシアン化合物からなる群から選ばれるいずれかの化合物である、バイオセンサ。

【請求項2】

（ｂ）のポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成り、かつ、ＦＡＤ結合型グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドである、請求項１に記載のバイオセンサ。

【請求項3】

（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドが、配列番号１の１２９番目に該当するバリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）への置換、及び、配列番号１の３８６番目に該当するアラニン（Ａ）のバリン（Ｖ）への置換を含む、請求項１に記載のバイオセンサ。

【請求項4】

（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドが、配列番号１の１２１番目に該当するアルギニン（Ｒ）のセリン（Ｓ）への置換、及び、配列番号１の１２９番目に該当するバリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）への置換を含む、請求項１に記載のバイオセンサ。

【請求項5】

（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドが、配列番号１の２０２～２０７番目に該当する位置にアミノ酸配列ＡＧＶＰＷＶを含む、請求項１に記載のバイオセンサ。

【請求項6】

酵素反応層が、ＦＡＤ結合型グルコース脱水素酵素を０．１から５０単位含む、請求項１～５のいずれかに記載のバイオセンサ。

【請求項7】

酵素反応層が、さらに親水性高分子を含む、請求項１～５のいずれかに記載のバイオセンサ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）結合型グルコース脱水素酵素をコ
ードする新規な遺伝子（ポリヌクレオチド）、該遺伝子により組換えられた形質転換細胞
を用いる該酵素の製造方法、組換えFAD結合型グルコース脱水素酵素、並びに、該酵素を
使用することを特徴とするグルコースの測定方法、グルコース測定試薬組成物、及びグル
コース測定用のバイオセンサ等に関する。

【背景技術】

【0002】

血中グルコース量は糖尿病の重要なマーカーである。糖尿病の検査は、病院検査室等で
の臨床検査の他、診療スタッフ等による簡易検査や患者自身による自己検査といった簡易
測定（Point-of-Care Testing:POCT）が実施されている。

【0003】

この簡易測定は、グルコース診断キットやバイオセンサ等の測定装置（ＰＯＣＴ装置）
によって実施されているが、従来、これらのＰＯＣＴ装置にはグルコース酸化酵素が用い
られてきた。しかし、グルコース酸化酵素は溶存酸素濃度の影響を受け、計測値に誤差が
生じるため、酸素の影響を受けないグルコース脱水素酵素の使用が推奨されている。

【0004】

グルコース脱水素酵素には、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）又はニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を補酵素とする補酵素非結合型
グルコース脱水素酵素と、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレ
オチド（ＦＡＤ）等を補酵素とする補酵素結合型グルコース脱水素酵素がある。その中で
補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、補酵素非結合型グルコース脱水素酵素に比べ夾雑
成分の影響を受けにくいこと、測定感度が高いこと、更に原理上、ＰＯＣＴ装置を安価に
製造することが可能であるという利点を有している。

【0005】

しかしながら、従来のＰＱＱ結合型グルコース脱水素酵素は安定性が低く、しかもマル
トースやガラクトースにも反応してしまうという欠点を有している。マルトースは輸液に
用いられる糖であり、ＰＱＱ結合型グルコース脱水素酵素がマルトースと反応すると血糖
ＰＯＣＴ装置は実際より高い血糖値を表示してしまう。このため、患者が不必要なインシ
ュリン注射を行ってしまう結果、意識障害や昏睡状態に陥る等の低血糖事故が発生し、大
きな問題となっている。

【0006】

特に現在の血糖ＰＯＣＴ装置の用途としては、単に簡易的に血糖を測る目的から、さら
に患者の自己管理及び治療の一手段としての重要性が高まっており、そのために使用され
る自己血糖測定装置（Self-Monitoring of Blood Glucose:SMBG）の家庭への普及は拡大
の一途を辿っていることから、測定精度への要求性は非常に高いと考えられる。

【0007】

現に、２００５年２月には、日本において、厚生労働省よりマルトース輸液やイコデキ
ストリンを含む透析液を投与中の患者に対して、補酵素としてＰＱＱを利用している酵素
を用いた血糖測定器の使用に関し、注意を喚起する通達が出されている（２００５年２月
７日；薬食安発第０２０７００５号など）。

【0008】

一方、グルコースの脱水素反応を触媒し、ＦＡＤを補酵素とする補酵素結合型グルコー
ス脱水素酵素としては、Agrobacterium tumefaciens由来(J. Biol. Chem. (1967) 242 :
3665-3672)、Cytophaga marinoflava由来(Appl. Biochem. Biotechnol. (1996) 56 : 301
-310)、Halomonas sp.α-15由来(Enzyme Microb. Technol. (1998) 22 : 269-274)、Agar
icus bisporus由来(Arch. Microbiol.(1997)167:119-125、Appl. Microbiol. Biotechnol
. (1999)51:58-64)及びMacrolepiota rhacodes由来(Arch. Microbiol.(2001)176:178-186
)の酵素が報告されているが、これらの酵素はグルコースの２位及び／又は３位の水酸基
を酸化し、いずれもマルトースに対する作用性が高く、グルコースに対する選択性が低い
。また、同じくマルトースへの作用性が高い、ブルクホルデリア・セパシア（Burkholder
ia cepacia）由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素も知られているが、これは本来の
天然型の酵素がα、β、γの３種のサブユニットからなるヘテロオリゴマー酵素で、膜結
合性酵素として知られている。したがって、酵素を得るには可溶化の処理が必要であった
り、クローニングで十分な活性を発現させる為には、必要なサブユニットを同時にクロー
ニングしなければならない等の課題があった。

【0009】

これに対して、本発明者らは、ＦＡＤを補酵素とする、膜結合型ではない新規な可溶性
の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をアスペルギルス・テレウスから精製している（特
許文献１）。この特許文献１の補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、グルコースの１位
の水酸基を酸化し、グルコースに対する基質認識性に優れ、溶存酸素の影響を受けず、し
かもマルトースに対する作用性が低い（対グルコース活性を１００％とした場合の対マル
トース活性は５％以下、対ガラクトース活性も５％以下）というこれまでに無い優れた特
性を有するものである。

【0010】

しかしながら、この特許文献１の補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、野生の微生物
（例えばアスペルギルス属微生物など）の液体培養物から単離、抽出されたものであり、
その生産量には限りがあった。また、酵素生産量が極微量である上に、糖が多量に酵素に
結合し、通常の酵素に結合しているＮ型やＯ型糖鎖とは異なる種類の糖に覆われた「糖包
埋型酵素」とでも言うべき形態となっていることにより、その活性を検出しにくいこと（
酵素活性が低い）、糖鎖を酵素的あるいは化学的に除去できないこと、その結果、電気泳
動において、通常のタンパク質染色（Coomassie Brilliant Blue G-250等による）により
ほとんど染色されず、遺伝子取得に必要な情報である酵素のアミノ末端や内部のアミノ酸
配列を解読することも通常の精製酵素からでは難しく、酵素遺伝子のクローニングに成功
し、本酵素活性の発現を確認した事例は公知ではない。

【0011】

一方、アスペルギルス・オリゼ由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素については１
９６７年にその存在が示唆されたことがあったが（非特許文献１）、部分的に酵素学的性
質が明らかにされたのみで、マルトースに作用しないという特性は示唆されていたにも関
わらず、それ以降はアスペルギルス・オリゼ由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素に
関する詳細な報告はもちろんその他微生物由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素につ
いても、グルコースの１位の水酸基を酸化する酵素については続報が無く、補酵素結合型
グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列や遺伝子に関する報告も全く知られていなかった。

【0012】

また、グルコースデヒドロゲナーゼＥＣ １．１．９９．１０をグルコース測定に用い
るアイデアは知られていたが（特許文献２参照）、FAD結合型グルコース脱水素酵素が実
用的なレベルで生産されたことはなく、実際にセンサに利用され実用化されるには至って
いなかった。その理由は、本酵素の菌体内での活性は微弱であり、菌体外に分泌されても
その量は極僅かで、しかも多量の糖に覆われており活性が弱く、検出するのさえ困難であ
ったために、遺伝子をクローニングできなかったためと推察される。

【0013】

【特許文献1】国際公開第２００４／０５８９５８号パンフレット

【特許文献2】特開昭５９-２５７００号公報

【0014】

【非特許文献1】Biochem.Biophys.Acta.,139,277-293,1967

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0015】

ＰＱＱ結合型グルコース脱水素酵素の改変に関する遺伝子工学的方法に関しては既に多
くの技術が知られており、これらの従来技術は、主に該酵素の基質特異性の低さや安定性
の低さといった従来のＰＱＱ結合型グルコース脱水素酵素の欠点を改良するための改変型
ＰＱＱ結合型グルコース脱水素酵素と、それを遺伝子工学的に作成するための改変型遺伝
子材料を提供している。

【0016】

しかしながら、改変型遺伝子材料を用いて作成した改変型のＰＱＱ結合型グルコース脱
水素酵素の場合には、依然としてグルコースに対する作用性を１００％とした際のマルト
ースへの作用性が概ね１０％より高かったり、あるいはマルトースへの反応性を低くさせ
た結果として、本来のグルコースへの反応性（比活性）までもが落ちてしまい、基質十分
量の条件で電気化学的な測定法で活性を見るとグルコースセンサとしての機能は不充分で
、ＰＯＣＴ装置等への使用には至っていないのが実情である。更に、ＰＱＱ結合型グルコ
ース脱水素酵素の活性発現に必要な補酵素ＰＱＱは、広く一般的に組換え宿主として用い
られる大腸菌では作られず、ＰＱＱを生産する宿主微生物（シュードモナス等）に限定し
て組換え体を作らなければならないという問題もあった。

【0017】

従って、本発明は、上記課題を解決し、グルコースに対する反応性、熱安定性、基質認
識性に優れ、しかもマルトースに対する作用性が低いという優れた特性を有するFAD結合
型グルコース脱水素酵素をコードする新規な遺伝子（ポリヌクレオチド）、該遺伝子によ
り組換えられた形質転換細胞を用いる該酵素の製造方法、並びに、得られた該酵素を使用
することを特徴とするグルコースの測定方法、グルコース測定試薬組成物、及びグルコー
ス測定用のバイオセンサ等を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0018】

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、アスペルギルス・オリゼ（Asperg
illus oryzae）菌株において、FAD結合型グルコース脱水素酵素が有意に発現するには、
その遺伝子がコードするポリペプチドに、アミノ酸配列（AGVPWV）を含んでいることが必
要であることを見出し、更に、その内の少なくとも１個のアミノ酸が欠失した場合には活
性が実質的に失われることを確認し、本発明を完成した。即ち、本発明は以下の各態様に
係るものである。

【0019】

［態様１］アミノ酸配列：X1-X2-X3-X4-X5-X6
（Ｘ１及びＸ２は脂肪族アミノ酸、Ｘ３及びＸ６は分岐アミノ酸、並びに、Ｘ４及びＸ５
は複素環式アミノ酸又は芳香族アミノ酸を示す）を含むポリペプチドから成るFAD結合型
グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチド。
［態様２］以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）のアミノ酸配列において、１個～数個のアミノ酸が置換、欠失
又は付加されたアミノ酸配列から成り、FAD結合型グルコース脱水素酵素活性を有するポ
リペプチド、又は
（ｃ）アミノ酸配列（ａ）と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成り、かつ、
FAD結合型グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
［態様３］以下の（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリヌクレオチド：
（ｄ）配列番号２又は配列番号３に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｅ）塩基配列（ｄ）から成るポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレ
オチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、FAD結合型グルコース脱
水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
（ｆ）塩基配列（ｄ）から成るポリヌクレオチドと７０％以上の相同性を有する塩基配列
を含み、かつ、FAD結合型グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド。
［態様４］アミノ酸配列：AGVPWVをコードする塩基配列から成るセンスプライマー及びア
スペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来のFAD結合型グルコース脱水素酵素を
コードするポリヌクレオチドの３' 末端側の塩基配列から成るリバースプライマー、又は
、アミノ酸配列：AGVPWVをコードする塩基配列に対するアンチセンスプライマー及びアス
ペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来のFAD結合型グルコース脱水素酵素をコ
ードするポリヌクレオチドの５' 末端側の塩基配列から成るフォワードプライマーの組み
合わせを用いるＰＣＲによって増幅可能なＤＮＡ断片を有する、FAD結合型グルコース脱
水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［態様５］アミノ酸配列：AGVPWVをコードする塩基配列から成るプローブとストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズし、かつ、FAD結合型グルコース脱水素酵素活性を有する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［態様６］Ｄ－グルコースに対する酵素活性値を１００％とした場合、マルトースに対す
る酵素活性値が１０％以下、Ｄ－ガラクトースに対する酵素活性値が５％以下であること
を特徴とする、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来の、FAD結合型グル
コース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチド。
［態様７］３００Ｕ／ｍｇ以上の酵素活性を有することを特徴とする、アスペルギルス・
オリゼ（Aspergillus oryzae）由来のFAD結合型グルコース脱水素酵素をコードするポリ
ヌクレオチド。
［態様８］上記のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
［態様９］上記の組換えベクターを用いることによって作成された形質転換細胞。
［態様１０］上記の形質転換細胞を培養し、得られた培養物から、グルコースを脱水素す
る作用を有するFAD結合型グルコース脱水素酵素を採取することを特徴とするFAD結合型グ
ルコース脱水素酵素の製造方法。
［態様１１］上記の記載のポリヌクレオチドにコードされる、組換えFAD結合型グルコー
ス脱水素酵素。
［態様１２］上記のFAD結合型グルコース脱水素酵素を使用することを特徴とするグルコ
ースの測定方法。
［態様１３］上記のFAD結合型グルコース脱水素酵素を含有することを特徴とするグルコ
ース測定試薬組成物。
［態様１４］上記のFAD結合型グルコース脱水素酵素を使用することを特徴とするグルコ
ース測定用のバイオセンサ。

【発明の効果】

【0020】

本発明のポリヌクレオチドを利用することにより、グルコースに対する基質認識性に優
れ、しかもマルトースに対する作用性が低いという優れた特性を有するFAD結合型グルコ
ース脱水素酵素を、例えば、遺伝子組み換え技術により均質かつ大量に生産することが可
能となる。
また、このように生産された酵素は、FAD結合型グルコース脱水素酵素で問題となって
いた糖の量を目的に応じてコントロールできるため、糖含量を減らした酵素を調製するこ
とで、血糖測定などにおいて、試料中の糖（グルコースなど）に対する作用性を変えるこ
とも可能である。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】酵素固定化電極によるグルコース濃度の検量線を示す。

【図2】PCRによる目的遺伝子の検出結果を示す。図中の記号は以下の通り。M ：200bp DNAラダーマーカー（タカラバイオ社製）1：アスペルギルス・オリゼNBRC42682：アスペルギルス・オリゼNBRC53753：アスペルギルス・オリゼNBRC62154：アスペルギルス・オリゼNBRC41815：アスペルギルス・オリゼNBRC42206：アスペルギルス・オリゼNBRC100959

【図3】サザンハイブリダイゼーションによる目的遺伝子の検出結果を示す。図中の記号は図２と同じである。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本発明のFAD結合型グルコース脱水素酵素においてはアミノ酸配列：X1-X2-X3-X4-X5-X6
（Ｘ１及びＸ２は同一又は互いに異なる脂肪族アミノ酸、Ｘ３及びＸ６は同一又は互いに
異なる分岐アミノ酸、並びに、Ｘ４及びＸ５は同一又は互いに異なる複素環式アミノ酸又
は芳香族アミノ酸を示す）、即ち、６個のアミノ酸から成るポリペプチドが含まれている
ことが技術的に重要な点の一つであり、その為に、該酵素が菌体内で有意に発現される。
尚、発現した該酵素は必ずしも菌体外に分泌される必要はなく、菌体内に留まる場合もあ
る。対照的に、本明細書の実施例に具体的に示されるように、アミノ酸配列全体の相同性
等からFAD結合型グルコース脱水素酵素と考えられる酵素をコードする遺伝子であっても
、該アミノ酸配列から成るポリペプチドをコードしていない遺伝子はFAD結合型グルコー
ス脱水素酵素活性を有する蛋白質を発現しない。

【0023】

上記６個のアミノ酸配列は、好ましくは、FAD結合型グルコース脱水素酵素であるポリ
ペプチドの２０２～２０７番目に位置し、又は、Ｘ１～Ｘ６の少なくとも一つが、X1がア
ラニン（A）、X2がグリシン（G）、X3がバリン（V）、X4がプロリン（P）、X5がトリプト
ファン（W）、又は、X6がバリン（V）である。例えば、その好適例として、アミノ酸配列
：AGVPWV（配列番号４）を挙げることができる。

【0024】

本発明において、「FAD結合型グルコース脱水素酵素」とは、電子受容体存在下で、グ
ルコースの１位の水酸基を脱水素（酸化）する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対
してマルトースへの作用性が１０％以下である可溶性の蛋白質を意味し、該酵素は以下の
性質を特徴とする。
１）フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とする、
２）酸素を電子受容体としない、及び
３）グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が１０％以下である。

【0025】

本発明のFAD結合型グルコース脱水素酵素の中で、アミノ酸配列：AGVPWVを有するもの
としては、特に、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来のものが好ましい
。その代表的な菌株として以下の表１に示されるような、ＮＢＲＣ５３７５株、ＮＢＲＣ
４０７９株、ＮＢＲＣ４２０３株、ＮＢＲＣ４２１４株、ＮＢＲＣ４２６８株、ＮＢＲＣ
５２３８株、ＮＢＲＣ６２１５株、ＮＢＲＣ３０１０４株 及び、ＮＢＲＣ３０１１３株
等を挙げることが出来る。アミノ酸配列：AGVPWVは、該酵素のアミノ酸配列において、シ
グナル配列部分の開始アミノ酸Ｍを１番目とした時の第２０２～２０７番目（ＮＢＲＣ５
３７５株由来）付近（その他の菌株由来の酵素の場合には、その位置に相当する場所）に
含まれている。

【0026】

例えば、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）ＮＢＲＣ５３７５株が発現す
るFAD結合型グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列は配列番号１（シグナルペプチドを含
む）、それをコードする染色体ＤＮＡの塩基配列は配列番号２、又、配列番号１に示され
るアミノ酸に対応するｃＤＮＡは配列番号３で夫々示される。尚、配列番号２又は３にお
いて、アミノ酸配列：AGVPWVをコードする塩基配列はGCTGGTGTTCCATGGGTT（配列番号５）
である。

【0027】

従って、本発明のポリヌクレオチドは、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae
）の菌株由来の上記のものに加えて、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１個～数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加された
アミノ酸配列から成り、FAD結合型グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド、又
は
（ｃ）アミノ酸配列（ａ）と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成り、かつ、
FAD結合型グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド、が含まれる。

【0028】

更に、本発明のポリヌクレオチドには、以下の（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のポリヌクレ
オチド：
（ｄ）配列番号２又は配列番号３に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｅ）塩基配列（ｄ）から成るポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレ
オドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、FAD結合型グルコース脱水
素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
（ｆ）塩基配列（ｄ）から成るポリヌクレオチドと７０％以上の相同性を有する塩基配列
を含み、かつ、FAD結合型グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド、が含まれる。

【0029】

特に、上記の（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドが上記アミノ酸配列：X1-X2-X3-X4-X5-X
6を含むもの、又は、（ｅ）又は（ｆ）のポリヌクレオチドが該アミノ酸配列をコードす
る塩基配列を含むものが好ましい。更に、このアミノ酸配列がAGVPWVであるものが好まし
い。

【0030】

本明細書において、７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列又は塩基配列とは、夫々
比較対象となる基準配列の全長にわたり、少なくとも７０％の同一性を示し、好ましくは
７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、特に好まし
くは９５％以上の同一性を有する各配列をいう。このような配列の同一性パーセンテージ
は、基準配列を照会配列として比較するアルゴリズムをもった公開又は市販されているソ
フトウェアを用いて計算することができる。例として、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、又はＧ
ＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社製）などを用いることができ、これらはデフォ
ルトパラメーターで使用することができる。

【0031】

更に、本発明のポリヌクレオチドは、アミノ酸配列：AGVPWVをコードする塩基配列から
成るセンスプライマー及びアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来のFAD結
合型グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドの３’ 末端側の塩基配列から
成るリバースプライマー、又は、アミノ酸配列：AGVPWVをコードする塩基配列対するアン
チセンスプライマー及びアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来のFAD結合
型グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドの５’ 末端側の塩基配列から成
るフォワードプライマーの組み合わせを用いるＰＣＲによって増幅可能なＤＮＡ断片を有
する、FAD結合型グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドを含む。

【0032】

或いは、本発明のポリヌクレオチドは、アミノ酸配列：AGVPWVをコードする塩基配列か
ら成るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、FAD結合型グル
コース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0033】

好ましくは、アミノ酸配列：AGVPWVをコードする塩基配列は（GCTGGTGTTCCATGGGTT）で
ある。又、上記のＰＣＲ及びストリンジェントな条件下でのハイブリダイズに関する各種
の条件は本明細書中の実施例の記載に準じて当業者が適宜選択することが出来る。

【0034】

更に、本発明のポリヌクレオチドには、Ｄ－グルコースに対する酵素活性値を１００％
とした場合、マルトースに対する酵素活性値が１０％以下、好ましくは５％以下、より好
ましくは３％以下であり、Ｄ－ガラクトースに対する酵素活性値が５％以下、好ましくは
３％以下、より好ましくは２％以下、更に好ましくは１％以下である、FAD結合型グルコ
ース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチド、又はタンパク質当たりの比活性が３００
Ｕ／ｍｇ以上、好ましくは５００Ｕ／ｍｇ以上、より好ましくは１，０００Ｕ／ｍｇ以上
の酵素活性を有するFAD結合型グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドが含
まれる。尚、ここで、「タンパク質当たりの比活性」とは、例えば、本明細書の実施例７
に記載のような、培養上清を濃縮しＳＤＳ－ＰＡＧＥで単一バンドとして確認された状態
で測定されたものである。

【0035】

尚、本発明において、「ポリヌクレオチド」とは、プリン又はピリミジンが糖にβ-Ｎ-
グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）、Ｇ
ＴＰ（グアノシン三リン酸）、ＣＴＰ（シチジン三リン酸）、ＵＴＰ（ウリジン三リン酸
）；又はｄＡＴＰ（デオキシアデノシン三リン酸）、ｄＧＴＰ（デオキシグアノシン三リ
ン酸）、ｄＣＴＰ（デオキシシチジン三リン酸）、ｄＴＴＰ（デオキシチミジン三リン酸
））が１００個以上結合した分子を言い、具体的にはFAD結合型グルコース脱水素酵素を
コードする染色体ＤＮＡ、染色体ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成され
たｃＤＮＡ及び、それらを鋳型としてＰＣＲ増幅したポリヌクレオチドを含む。「オリゴ
ヌクレオチド」とはヌクレオチドが２-９９個連結した分子を言う。また「ポリペプチド
」とは、アミド結合（ペプチド結合）又は非天然の残基連結によって互いに結合した３０
個以上のアミノ酸残基から構成された分子を意味し、さらには、これらに糖鎖が付加した
ものや、人工的に化学的修飾がなされたもの等も含む。

【0036】

本発明のポリヌクレオチド（遺伝子）の最も具体的な態様は、配列番号２又は配列番号
３の塩基配列を含むポリヌクレオチドである。配列番号２に代表される染色体ＤＮＡであ
るポリヌクレオチドは、例えば、アスペルギルス・オリゼＮＢＲＣ５３７５株から染色体
ＤＮＡライブラリーを調製し、特許文献１に記載のアスペルギルス・テレウス由来のFAD
結合型グルコース脱水素酵素のＮ末端及び内部配列のアミノ酸をエドマン法等によって決
定して得られるアミノ酸配列、及び、「Aspergillus oryzae のゲノム解析プロジェクト
」の成果として、２００６年１月にDOGAN (Database of the Genomes Analyzed at NITE)
（ウェブサイトhttp://www.bio.nite.go.jp/dogan/Top）で公開されたアスペルギルス・
オリゼ（ＮＢＲＣ１００９５９株）のゲノム配列情報に基づいて作成した複数のオリゴヌ
クレオチドプローブを用いて当業者に公知の方法によって上記染色体ＤＮＡライブラリー
をスクリーニングすることによって取得することができる。

【0037】

プローブの標識は、当業者に公知の任意の方法、例えば、ラジオアイソトープ（ＲＩ）
法又は非ＲＩ法によって行うことができるが、非ＲＩ法を用いることが好ましい。非ＲＩ
法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を
用いることが好ましい。蛍光物質としては、オリゴヌクレオチドの塩基部分と結合できる
ものを適宜に選択して用いることができるが、シアニン色素（例えば、Ｃｙ ＤｙｅＴＭ
シリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ-アセトキシ-Ｎ２-アセチルア
ミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）などを使用することがで
きる。

【0038】

或いは、配列番号３に代表されるｃＤＮＡであるポリヌクレオチドは、例えば、本明細
書の実施例に具体的に記載されているように、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、上記で
作成したオリゴヌクレオチドプライマー（プローブ）のセットを用いた当業者に公知の各
種ＰＣＲ法によって、もしくはアスペルギルス・オリゼＮＢＲＣ５３７５株から抽出した
全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ-ＰＣＲ法によっても得ることができる。尚
、プライマーを設計する場合には、プライマーのサイズ（塩基数）は鋳型ＤＮＡとの間の
特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、１５-４０塩基、望ましくは１５-３０
塩基である。ただし、ＬＡ（ｌｏｎｇ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ）ＰＣＲを行う場合には
、少なくとも３０塩基が効率的である。センス鎖（５'末端側）とアンチセンス鎖（３'末
端側）からなる一組あるいは一対（２本）のプライマーが互いにアニールしないよう、両
プライマー間の相補的配列を避けるようにする。さらに、鋳型ＤＮＡとの安定な結合を確
保するためＧＣ含量を約５０％にし、プライマー内においてＧＣ-ｒｉｃｈあるいはＡＴ-
ｒｉｃｈが偏在しないようにする。アニーリング温度はＴｍ（melting temperature）に
依存するので、特異性の高いＰＣＲ産物を得るため、Ｔｍ値が５５-６５℃で互いに近似
したプライマーを選定する。また、ＰＣＲにおけるプライマー使用の最終濃度が約０．１
から約１μＭになるよう調整する等を留意することも必要である。また、プライマー設計
用の市販のソフトウエア、例えばＯｌｉｇｏＴＭ ［National Bioscience Inc.（米国）
製］、ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社製）等を用いることもできる。

【0039】

尚、このようなオリゴヌクレオチドプローブやオリゴヌクレオチドプライマーセットは
、例えば本発明のポリヌクレオチドであるｃＤＮＡを適当な制限酵素で切断して作成する
こともできる。

【0040】

又、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、前記のアスペルギルス・オリゼＮＢＲＣ５
３７５株由来のFAD結合型グルコース脱水素酵素ｃＤＮＡを、公知のミューテーション導
入法や変異導入ＰＣＲ法等によって改変して作成することができる。更に、ＮＢＲＣ５３
７５株以外のアスペルギルス・オリゼ菌株の染色体ＤＮＡやそのｃＤＮＡライブラリーか
ら、配列番号１のヌクレオチド配列情報に基づいて作成したオリゴヌクレオチドを用いる
プローブハイブリダイゼーション法によって取得することができる。ハイブリダイゼーシ
ョンに際して、ストリンジェント条件を様々に変化させることによって、上記ポリヌクレ
オチドを取得することができる。ストリンジェント条件は、ハイブリダイゼーション及び
洗浄工程における塩濃度、有機溶媒（ホルムアルデヒド等）の濃度、温度条件等によって
規定され、例えば、米国特許No.6,100,037号明細書等に開示されているような、当業者ら
に周知の様々な条件を採用することができる。

【0041】

更に、文献（例えばCarruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411
-418;Adams(1983)J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov(1997)Nucleic Acid Res. 25:34
40-3444; Frenkel(1995)Free Radic. Biol. Med. 19:373-380;Blommers(1994)Biochemist
ry 33:7886-7896; Narang(1979)Meth. Enzymol. 68:90;Brown(1979)Meth. Enzymol. 68:1
09; Beaucage(1981)Tetra. Lett. 22:1859; 米国特許第4,458,066号）に記載されている
ような周知の化学合成技術により、in vitroにおいて本発明のポリヌクレオチドを合成す
ることができる。

【0042】

本発明の組換えベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであり、インサー
トとしてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に応じて適宜のものを使用する。
例えば、ｃＤＮＡ又はそのＯＲＦ領域をインサートとしてFAD結合型グルコース脱水素酵
素を生産する場合には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の
原核細胞、酵母、カビなどの糸状菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに
適した発現ベクターを使用することもできる。

【0043】

本発明の形質転換細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ
、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。これらの形質転換細
胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公
知の方法によって組換えベクターを細胞に導入することによって調製することができる。
組換えベクター及び形質転換細胞の具体例として、下記実施例に示した組換えベクターと
、このベクターによる形質転換大腸菌及び形質転換カビが挙げられる。

【0044】

本発明のFAD結合型グルコース脱水素酵素を大腸菌などの微生物でＤＮＡを発現させて
生産させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部
位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター配列等を有する発現ベクターに前記のポリ
ヌクレオチドを組換えた発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換
したのち、得られた形質転換体を培養すれば、FAD結合型グルコース脱水素酵素を微生物
で大量生産することができる。この際、任意の翻訳領域の前後に開始コドンと停止コドン
を付加して発現させれば、任意の領域を含むFAD結合型グルコース脱水素酵素断片を得る
こともできる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。こ
の融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによっても目的とするFAD結合型グル
コース脱水素酵素を取得することができる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システム、ｐＣｏｌｄ
発現システムなどが例示できる。

【0045】

或いは、FAD結合型グルコース脱水素酵素を真核細胞で発現させて生産させる場合には
、前記ポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等
を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作成し、真核細胞内に導入
すれば、FAD結合型グルコース脱水素酵素を真核細胞で生産することができる。プラスミ
ドのような状態で細胞内に維持することもできるし、染色体中に組みこませて維持するこ
ともできる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐ
ＢＫ-ＣＭＶ、ｐＢＫ-ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥ８２などが例示できる。
また、ｐＩＮＤ／Ｖ５-Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ-ＣＭＶ-２、ｐＥＧＦＰ-Ｎ１、ｐＥＧＦＰ-
Ｃ１などを発現ベクターとして用いれば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＦＰなど各種タ
グを付加した融合蛋白質としてFAD結合型グルコース脱水素酵素ポリペプチドを発現させ
ることもできる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ-７、チャイニーズハムスター
卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カビ、カイコ細胞、アフ
リカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、FAD結合型グルコース脱水素酵素を発
現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入する
には、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公
知の方法を用いることができる。

【0046】

特に、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来の本発明のFAD結合型グル
コース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドを保有する組換えベクターで、適当なア
スペルギルス・オリゼ株を形質転換するセルフクローニングが好適である。

【0047】

FAD結合型グルコース脱水素酵素を原核細胞や真核細胞で発現させた後、培養物（菌体
、もしくは菌体外に分泌された酵素を含む培養液、培地組成物等）から目的蛋白質を単離
精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素など
の変性剤や界面活性剤による処理、熱処理、ｐＨ処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶
媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、
イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー（タグ配列を利用した方法及びFAD補酵素結合型グル
コース脱水素酵素に特異的なポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を用いる方法も含
む）、などが挙げられる。

【0048】

また、FAD結合型グルコース脱水素酵素は、本発明のポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ又は
その翻訳領域）を用いた組換えＤＮＡ技術によって取得できる。例えば前記ポリヌクレオ
チドを有するベクターからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型と
してｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を行うことによりｉｎ ｖｉｔｒｏでFAD結合型グルコース脱水
素酵素を作成することができる。またポリヌクレオチドを公知の方法により適当な発現ベ
クターに組換えれば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、哺乳動物
細胞等の真核細胞で、ポリヌクレオチドがコードしているFAD結合型グルコース脱水素酵
素を大量に発現させる事ができる。また宿主に対応して、同一アミノ酸配列であるが、コ
ドンユーセージを最適化したポリヌクレオチドを導入しても良い。また糖鎖の要、不要、
その他のペプチド修飾の必要性に応じて、適宜宿主は選択することができる。

【0049】

FAD結合型グルコース脱水素酵素をｉｎ ｖｉｔｒｏ発現させて生産させる場合には、前
記のポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼが結合できるプロモーターを有するベクタ
ーに挿入して組換えベクターを作成し、このベクターを、プロモーターに対応するＲＮＡ
ポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻
訳系に添加すれば、FAD結合型グルコース脱水素酵素をｉｎ ｖｉｔｒｏで生産することが
できる。ＲＮＡポリメラーゼが結合できるプロモーターとしては、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６な
どが例示できる。これらのプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８
、ｐＴ３／Ｔ７１８、ｐＴ７／３１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩなどが例示できる。

【0050】

本発明の組換えFAD結合型グルコース脱水素酵素は以上に記載された方法で製造するこ
とができる。このようなFAD結合型グルコース脱水素酵素は、電子受容体存在下でグルコ
ースを脱水素する反応を触媒する酵素であるから、この反応による変化が利用できる用途
であれば、特に制限されない。例えば、生体物質を含む試料中のグルコースの測定及び測
定用試薬、消去用試薬へ使用するなどの医療分野、臨床分野への使用が可能であり、補酵
素結合型グルコース脱水素酵素を使用した物質生産においても使用可能である。

【0051】

本発明のグルコース測定試薬組成物は、全てを混合して単一の試薬としてもよく、相互
に干渉する成分が存在する場合には、各成分を適宜な組み合せとなる様に分割してもよい
。また、これらは、溶液状、もしくは粉末状試薬として調製してもよく、さらにこれらを
濾紙もしくはフィルムなどの適当な支持体に含有させ試験紙もしくは分析用フィルムとし
て調製してもよい。なお、過塩素酸などの除タンパク剤やグルコース定量を含有する標準
試薬を添付してもよい。本組成物中の酵素の量は、１試料当り０．１から５０単位程度が
好ましい。グルコースを定量するための検体は、例えば血漿、血清、髄液、唾液、尿など
が挙げられる。

【0052】

本発明のバイオセンサは、酵素として本発明のFAD結合型グルコース脱水素酵素を含む
反応層に使用し、試料液中のグルコース濃度を測定するグルコースセンサである。例えば
、絶縁性基板上にスクリーン印刷などの方法を利用して作用極、その対極及び参照極から
なる電極系を形成し、この電極系上に接して親水性高分子と酸化還元酵素と電子受容体と
を含む酵素反応層を形成することによって作製される。このバイオセンサの酵素反応層上
に基質を含む試料液を滴下すると、酵素反応層が溶解して酵素と基質が反応し、これにと
もなって電子受容体が還元される。酵素反応終了後、還元された電子受容体を電気化学的
に酸化させ、このとき、このバイオセンサは得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度
を測定することが可能である。また、この他に、発色強度あるいはｐＨ変化などを検知す
る方式のバイオセンサも構築可能である。

【0053】

バイオセンサの電子受容体としては、電子の授受能に優れた化学物質を用いることがで
きる。電子の授受能に優れた化学物質とは、一般的に「電子伝達体」、「メディエータ」
あるいは「酸化還元媒介剤」と呼ばれる化学物質であり、これらに該当する化学物質とし
て、例えば、特表２００２-５２６７５９に挙げられた電子伝達体や酸化還元媒介剤など
を利用してもよい。具体的には、オスミウム化合物、キノン化合物、フェリシアン化合物
等が挙げられる。

【0054】

FAD結合型グルコース脱水素酵素の活性測定においては、該酵素を、好ましくは終濃度
０．１～１．０ｕｎｉｔ／ｍＬになるように適宜希釈して用いる。なお、該酵素の酵素活
性単位（ｕｎｉｔ）は１分間に１μｍｏｌのグルコースを酸化する酵素活性である。本発
明のFAD結合型グルコース脱水素酵素の酵素活性は、次の方法で測定できる。

【0055】

［酵素活性測定法］
０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．０ｍＬ、１．０Ｍ Ｄ－グルコース
１．０ｍＬ、３ｍＭ ２，６－ジクロロフェノールインドフェノール（以下ＤＣＩＰとい
う）０．１４ｍＬ、３ｍＭ １－メトキシ－５－メチルフェナジウムメチルサルフェイト
０．２ｍＬ、水０．６１ｍＬを３ｍＬ石英セル（光路長１ｃｍ）に添加し、恒温セルホル
ダー付き分光光度計にセットして３７℃で５分間インキュベート後、酵素溶液０．０５ｍ
Ｌを添加後、ＤＣＩＰの６００ｎｍにおける吸光度変化（ΔＡＢＳ／ｍｉｎ）を測定する
。ＤＣＩＰのｐＨ７．０におけるモル吸光係数を１６．３×１０³ｃｍ^-1Ｍ^-1とし、１分
間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性が実質的に該酵素活性１ｕｎｉｔと等価
であることから、吸光度変化より該酵素活性を次式に従って求めた。

【0056】

【数1】

【0057】

本酵素のタンパク濃度の測定においては、該酵素を、好ましくは終濃度０．２～０．９
ｍｇ／ｍＬ になるように適宜希釈して用いる。本発明におけるタンパク濃度は、日本バ
イオ・ラッド（株）から購入できるタンパク濃度測定キットであるＢｉｏ－Ｒａｄ Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙを用い、取扱説明書に従って、牛血清アルブミン（ＢＳＡ，和光
純薬工業（株）製，生化学用）を標準物質として作成した検量線から換算して求めること
ができる。

【0058】

尚、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除
いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば
、遺伝子工学及び分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel,
F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New Yo
rk, N.Y, 1995などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法又はそれらと
実質的に同様な方法や改変法に基づき実施可能である。さらに、この発明における用語は
基本的にはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、ある
いは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。

【0059】

以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。尚、本発明の技術的範囲はこれら
の記載によって何等制限されるものではない。又、本明細書中に引用される文献に記載さ
れた内容は、本明細書の一部として本明細書の開示内容を構成するものである。

【実施例0060】

（アスペルギルス・オリゼNBRC5375株由来FAD結合型グルコース脱水素酵素と推定される
遺伝子の大腸菌へのクローニング）
（１）菌体培養
グルコース（ナカライ社製）１％（Ｗ／Ｖ）、脱脂大豆（昭和産業社製）２％（Ｗ／Ｖ
）、コーンスティープリカー（サンエイ糖化社製）０．５％（Ｗ／Ｖ）、硫酸マグネシウ
ム七水和物（ナカライ社製）０．１％（Ｗ／Ｖ）及び水からなる液体培地をｐＨ６．０に
調整し、１００ｍＬを５００ｍＬ容の坂口フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートク
レーブした。冷却したこの液体培地に、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）
ＮＢＲＣ５３７５株を接種し、２８℃で４８時間振とう培養した後、遠心分離機を用いて
、湿菌体１５．５ｇを回収した。
（２）アスペルギルス・オリゼ ＮＢＲＣ５３７５株のFAD結合型グルコース脱水素酵素活
性確認
（１）で得られた菌体を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、海砂
Ｂ（ナカライ社製）を用いて菌体を磨砕後、遠心して上清を回収し、無細胞抽出液とした
。
前述の酵素活性測定法に従い、無細胞抽出液のFAD結合型グルコース脱水素酵素活性を
確認したところ、無細胞抽出液当たり、０．００４３Ｕ／ｍＬのFAD結合型グルコース脱
水素酵素活性を確認した。
（３）全ＲＮＡの単離
（１）で得られた菌体のうち湿菌体０．３１ｇを液体窒素により凍結した後、粉砕し、
ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。
（４）ＲＴ－ＰＣＲ
TaKaRa RNA LA PCR Kit(AMV)Ver.1.1（タカラバイオ社製）を使用し、下記条件でＲＴ
－ＰＣＲを行い、約１．８ｋｂｐのFAD結合型グルコース脱水素酵素と想定される遺伝子
を含むＰＣＲ産物を取得した。
テンプレート ：（３）で抽出した全ＲＮＡ
プライマー ：
プライマー１ ：5'-tgggatcctatgctcttctcactggcat-3'（配列番号６）
プライマー２ ：5'-gccaagcttctaagcactcttcgcatcctccttaatcaagtc-3' （配列番号７）
尚、プライマー１及び２は、上記のDOGAN (Database of the Genomes Analyzed at NIT
E) （ウェブサイトhttp://www.bio.nite.go.jp/dogan/Top）で公開されているアスペルギ
ルス・オリゼＮＢＲＣ１００９５９株の遺伝子解析結果よりAO０９０００５０００４４９
（「コリン脱水素酵素」と推定されている）の塩基配列を元に合成した。
その理由は、本発明者等により見出されたアスペルギルス・テレウスのFAD結合型グル
コース脱水素酵素遺伝子の塩基配列情報に基づき、上記AO０９０００５０００４４９がコ
リン脱水素酵素遺伝子ではなく、アスペルギルス・オリゼのFAD結合型グルコース脱水素
酵素遺伝子と推測された為である。
反応条件 ：逆転写反応４２℃、３０分（１サイクル）
変性９９℃、５分 （１サイクル）
冷却５℃、５分（１サイクル）
変性９４℃、２分（１サイクル）
変性９４℃、３０秒、アニーリング４５℃、３０秒、伸長反応７２℃、１分３０秒（２５
サイクル）
伸長反応７２℃、５分（１サイクル）
（５）FAD結合型グルコース脱水素酵素と推定される遺伝子を含むプラスミドの調製
（４）で得られたＰＣＲ増幅断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIで切断し、同制
限酵素処理したｐＵＣ１８ベクター（タカラバイオ社製）に、DNA Ligation Kit Ver.2.1
（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションし、FAD結合型グルコース脱水素酵素と推
定される遺伝子を含むプラスミドを調製した。
（６）形質転換体の作製
（５）で得られたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌ
ｌ（タカラバイオ社製）に導入して形質転換した。アンピシリンナトリウム（和光純薬社
製）含有のＬＢプレートで、３７℃で一晩培養した後、ダイレクトＰＣＲにて、生育した
コロニー１個に、FAD結合型グルコース脱水素酵素と推定される遺伝子を含んだプラスミ
ドが導入されていることを確認し、アンピシリンナトリウム含有のＬＢプレートで形質転
換体を取得した。

【実施例0061】

（アスペルギルス・オリゼNBRC5375株由来FAD結合型グルコース脱水素酵素と推定される
遺伝子のアスペルギルス・オリゼへのクローニング）
（１）染色体ＤＮＡの抽出
実施例1の（１）で得られた湿菌体のうち０．２５ｇを液体窒素により凍結した後、粉
砕し、常法により染色体ＤＮＡを抽出した。
（２）FAD結合型グルコース脱水素酵素と推定される遺伝子のクローニング
使用する宿主としては、アスペルギルス・オリゼ NS4株を使用した。本菌株は、公知文
献１（Biosci. Biotech. Biochem.,61(8),1367-1369,1997）にあるように、1997年（平成
9年）に醸造試験所で育種され、転写因子の解析、各種酵素の高生産株の育種などに利用
され、分譲されているものが入手可能である。
本菌株に対し、公知文献２（Aspergillus属の異種遺伝子発現系、峰時俊貴、化学と生
物、38、12、P831-838、2000）に記載してあるアスペルギルス・オリゼ由来のアミラーゼ
系の改良プロモーターを使用し、その下流に（１）で得られた染色体ＤＮＡを鋳型として
、DOGAN (Database of the Genomes Analyzed at NITE) （ウェブサイト
http://www.bio.nite.go.jp/dogan/Top）で公開されているAO０９０００５０００４４９
の塩基配列を元に合成した以下のプライマー：
1. gene1F:
5'-(acgcgtcgac)tgaccaattccgcagctcgtcaaaatgctcttctcactggcattcctga-3'（配列番号８
）
2. gene1R:
5'-(gtg)ctaagca ctcttcgcat cctccttaat caagtcgg-3'（配列番号９）
（Fは５'側、Rは3'側、括弧内：制限酵素切断部位、下線部：enoA 5'-UTR、その他：ORF
）
を用いて増幅したFAD結合型グルコース脱水素酵素と推定される遺伝子を結合させること
で、本遺伝子が発現可能なベクターを調製した。
形質転換は、基本的には公知文献２及び公知文献３（清酒用麹菌の遺伝子操作技術、五
味勝也、醸協、P494-502，2000）に記載の方法に準じて実施することで形質転換体を取得
した。