特開 2024-50766 改変ウイルスカプシド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024050766

(43)【公開日】2024-04-10

(54)【発明の名称】改変ウイルスカプシド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/63 20060101AFI20240403BHJP

   C40B 40/06 20060101ALI20240403BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240403BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240403BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20240403BHJP

   A61K 35/763 20150101ALI20240403BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240403BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240403BHJP

【ＦＩ】

C12N15/63 Z ZNA

C40B40/06

C12N7/01

A61K35/76

A61K35/761

A61K35/763

A61P25/00

A61K48/00

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024014824

(22)【出願日】2024-02-02

(62)【分割の表示】P 2020566878の分割

【原出願日】2019-02-14

(31)【優先権主張番号】18156932.8

(32)【優先日】2018-02-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】520308374

【氏名又は名称】ビョークルン，トマス

(71)【出願人】

【識別番号】520308385

【氏名又は名称】デイヴィッドソン，マーカス

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ビョークルン，トマス

(72)【発明者】

【氏名】デイヴィッドソン，マーカス

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ウイルスベクターおよび粒子、ならびにそれらを設計し製造するための方法およびツールを提供する。
【解決手段】本発明は、カプシド上に提示されたときに、こうしたカプシドを含むウイルス粒子に所望の特性を付与する、例えばＨＳＶ ｐＵＬ２２タンパク質に由来する、ポリペプチドを同定するための方法、ならびに改善された特性を有するウイルスベクターおよびウイルス粒子を設計し、製造するための方法に関する。
【選択図】図１－１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ウイルスベクターのライブラリを製造する方法であって、
ｉ）所望の特性を有するかまたは有することが推測されるポリペプチドの群から１つ以上の候補ポリペプチドを選択すること、および前記ポリペプチドの配列を検索することと；
ｉｉ）複数の候補ポリヌクレオチドを提供することであって、各候補ポリヌクレオチドは前記候補ポリペプチドの１つのポリペプチド断片をコードし、これにより転写および翻訳時に各候補ポリペプチドは各候補ポリペプチドの１つ以上のポリペプチド断片によって表される、提供することと；
ｉｉｉ）複数のバーコードポリヌクレオチドを提供することと；
ｉｖ）カプシド遺伝子およびウイルスゲノムを含む、ウイルスベクター中にバーコードポリヌクレオチドと共に各候補ポリヌクレオチドを挿入すること、これによりそれぞれがバーコードポリヌクレオチドに作動可能に連結される単一の候補ポリヌクレオチドを含む複数のウイルスベクターを得ることであって、前記候補ポリヌクレオチドは、前記カプシド遺伝子内に挿入され、前記カプシド遺伝子は、前記ウイルスゲノムの外側にありかつ前記バーコードポリヌクレオチドは、前記ウイルスゲノム内に挿入され、前記ウイルスベクターは、検出可能なマーカーをコードするマーカーポリヌクレオチドを含む、挿入することと、
ｖ）ステップｉｖ）で得られた前記複数のウイルスベクターを増幅系で増幅することであって、各ウイルスベクターは、前記増幅系において複数のコピーで存在する、増幅することと、
ａ）参照系においてステップｖ）の前記増幅系から前記複数のウイルスベクターの少なくとも第１の部分を検索することおよび転送することであって、これにより各バーコードポリヌクレオチドを１つの候補ポリヌクレオチドにマッピングする、検索することおよび転送することと、
ｂ）前記増幅系において前記複数のウイルスベクターの第２の部分を維持すること、および複数のウイルス粒子を得るために産生系において前記第２の部分の全部または一部を任意により移すこと、
を含む、方法。

【請求項2】

所望の特性を有するウイルスベクターを設計する方法であって、請求項１に記載の方法を含みかつ、
ｖｉ）請求項１に記載のステップｖ）ｂ）の前記増幅系からウイルスベクターの一部を検索するか、または請求項１に記載のステップｖ）ｂ）の前記産生系から前記ウイルス粒子の少なくとも一部を検索し、かつ細胞集団を前記検索されたウイルスベクターまたはウイルス粒子と接触させるステップと；
ｖｉｉ）マーカー発現をモニターしかつマーカー発現が所望のパターンに従う細胞を選択するステップと；
ｖｉｉｉ）ステップｖｉｉ）で選択された前記細胞で発現される前記バーコードポリヌクレオチドを同定するステップであって、これにより前記所望の特性に関与する候補ポリヌクレオチドおよび対応する候補ポリペプチドを同定するステップと；
ｉｘ）改変カプシド遺伝子を含むウイルスベクターを設計するステップであって、前記改変カプシド遺伝子は、ステップｖｉｉｉ）で同定された前記候補ポリヌクレオチドの１つを含む、ステップ、
をさらに含む、方法。

【請求項3】

所望の特性を有するウイルス粒子を製造する方法であって、請求項１に記載の方法を含みかつ、
ｖｉ）ステップｖ）ｂ）の前記増幅系から前記複数のウイルスベクターの少なくとも一部を検索するステップまたはステップｖ）ｂ）の前記産生系から前記複数のウイルス粒子の少なくとも一部を検索するステップと；
ｖｉｉ）細胞集団をステップｖｉ）で得られた前記検索されたウイルスベクターまたはウイルス粒子と接触させるステップと；
ｖｉｉｉ）マーカー発現をモニターしかつマーカー発現が所望のパターンに従う細胞を選択するステップと；
ｉｘ）ステップｖｉｉｉ）で同定された前記細胞で発現される前記バーコードポリヌクレオチドを同定するステップであって、これにより前記所望の特性に関与する候補ポリヌクレオチドおよび対応する候補ポリペプチドを同定するステップと；
ｘ）改変カプシド遺伝子を含むウイルスベクターを設計するステップであって、前記改変カプシド遺伝子は、ステップｉｘ）で同定された前記候補ポリヌクレオチドの１つを含む、ステップと；
ｘｉ）ステップｘ）の前記ウイルスベクターを産生系で産生するステップであって、それにより前記所望の特性を有する前記ウイルスベクターまたは前記ウイルス粒子を得る、ステップ、
をさらに含む、方法。

【請求項4】

導入遺伝子を標的細胞に送達する方法であって、
ａ）改変カプシドを含みかつ導入遺伝子を封入する改変ウイルスベクターまたは改変ウイルス粒子を提供することであって、前記改変ウイルスベクターまたは前記改変ウイルス粒子は、請求項３に記載のステップｘｉ）で定義された前記ウイルスベクターまたは前記ウイルス粒子である、提供することと；
ｂ）前記改変ウイルスベクターまたは前記改変ウイルス粒子を注射部位に注射すること、
を含む、方法。

【請求項5】

ウイルスベクターのライブラリであって、各ウイルスベクターが、
ｉ）宿主細胞で前記ウイルスベクターを発現させるための骨格；
ｉｉ）カプシド遺伝子およびその中に挿入され、候補ポリペプチドのポリペプチド断片をコードする候補ポリヌクレオチド；
ｉｉｉ）マーカーポリヌクレオチド；および
ｉｖ）バーコードポリヌクレオチド
を含み、
前記候補ポリペプチドは、所望の特性を有するかまたは有することが推測される１つ以上のポリペプチドを含む所定の群から選択され、
転写および翻訳時に各候補ポリペプチドは、前記ライブラリ中の１つ以上のポリペプチド断片によって提示され、
前記候補ポリヌクレオチドは、前記ウイルスベクターの前記カプシド遺伝子内に挿入されこれによりそれは、前記カプシド上に提示されるポリペプチド断片に転写および翻訳され得、かつ前記ウイルスゲノム内に挿入されたバーコードポリヌクレオチドに作動可能に連結され、
かつ前記マーカーポリヌクレオチドは、前記ウイルスゲノム内に含まれかつ前記カプシド遺伝子は、前記ウイルスゲノムの外側にある、
ライブラリ。

【請求項6】

前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ボカウイルスまたは狂犬病ウイルスであり、好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項５に記載のウイルスベクターのライブラリ。

【請求項7】

導入遺伝子を標的細胞に送達するためのウイルス粒子をコードするウイルスベクターであって、改変カプシド遺伝子および前記標的細胞に送達される導入遺伝子を含み、
前記改変カプシド遺伝子は、前記ウイルスゲノムの外側にありかつ前記導入遺伝子の送達かつ／または前記標的細胞への標的化を改善するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、
ウイルスベクター。

【請求項8】

前記ポリペプチドが、配列番号１～配列番号５０を含むかまたはそれらからなる、請求項７に記載のウイルスベクター。

【請求項9】

標的細胞への導入遺伝子の送達のための改変ウイルス粒子であって、改変カプシドおよび宿主細胞に送達される導入遺伝子を含み、
前記改変カプシドは、天然のカプシド遺伝子および前記導入遺伝子を含む未改変ウイルス粒子と比較して前記標的細胞への前記導入遺伝子の送達、前記標的細胞への標的化、前記ウイルス粒子の感染性、および／または前記改変ウイルス粒子の逆行性輸送の１つ以上を改善し、かつ前記改変カプシド遺伝子は、前記ウイルスゲノムの外側にある、改変ウイルス粒子。

【請求項10】

前記改変カプシドが、配列番号１～配列番号５０からなる群から選択されるペプチドを含む、請求項９に記載の改変ウイルス粒子。

【請求項11】

遺伝子治療のための、請求項７または８に記載のウイルスベクターの、または請求項９または１０に記載のウイルス粒子の使用。

【請求項12】

神経系の障害などの、障害の治療の方法での使用のための、請求項７または８に記載のウイルスベクター、または請求項９または１０に記載のウイルス粒子。

【請求項13】

所望の効果を有する薬物を同定するための方法であって、
ａ）候補薬物を提供するステップ；
ｂ）前記候補薬物を細胞に投与するステップ；
ｃ）ｂ）の前記細胞への前記ウイルス粒子の送達を可能にする改変カプシドおよびマーカーポリヌクレオチドを含む改変ウイルス粒子を提供するステップ；
ｄ）前記候補薬物の存在下および非存在下で前記マーカーポリペプチドの発現および／または局在化をモニターするおよび比較するステップであって；これにより前記候補薬物が前記マーカーポリヌクレオチドの前記発現に影響を有するか否かを決定する、ステップ
を含む、方法。

【請求項14】

標的細胞へのウイルスベクターまたは粒子のトロピズムを改善するための方法であって、請求項１に記載の方法を含みかつ、
ｖｉ）ステップｖ）ｂ）の前記増幅系から前記複数のウイルスベクターの少なくとも一部を検索するステップまたはステップｖ）ｂ）の前記産生系から前記複数のウイルス粒子の少なくとも一部を検索するステップと；
ｖｉｉ）標的細胞を含む細胞集団をｖｉ）で得られた前記検索されたウイルスベクターまたはウイルス粒子とおよびマーカーを含む参照ウイルスベクターまたは参照ウイルス粒子と接触させるステップと；
ｖｉｉｉ）前記標的細胞においてマーカー発現をモニターし比較するステップと；
ｉｘ）前記参照ウイルスベクターまたは参照ウイルス粒子からの前記発現と比較して前記マーカーの発現の増加を有する前記標的細胞中の前記候補ポリヌクレオチドを同定するステップと；
ｘ）改変カプシド遺伝子を含む、トロピズムが改善されたウイルスベクターまたはウイルス粒子を設計するステップであって、前記改変カプシド遺伝子は、ステップｉｘ）で同定された前記候補ポリヌクレオチドの１つを含む、ステップ、
をさらに含む、方法。

【請求項15】

前記ポリペプチドを挿入することによって改変されたカプシドを含むウイルス粒子に所望の特性を付与するポリペプチドの１つ以上の領域を同定する方法であって、請求項１に記載の方法を含みかつ、
ｖｉ）ステップｖ）ｂ）の前記増幅系から前記複数のウイルスベクターの少なくとも一部を検索するステップまたはステップｖ）ｂ）の前記産生系から前記複数のウイルス粒子の少なくとも一部を検索するステップと；
ｖｉｉ）標的細胞を含む細胞集団をｖｉ）で得られた前記検索されたウイルスベクターまたはウイルス粒子とおよびマーカーを含む参照ウイルスベクターまたは参照ウイルス粒子と接触させるステップと；
ｖｉｉｉ）前記標的細胞におけるマーカー発現をモニターし比較するステップと；
ｉｘ）前記所望の特性に対応する前記マーカーの発現プロファイルを有する前記標的細胞において前記候補ポリヌクレオチドを同定するステップであって、これにより前記特性に関与する前記ポリペプチドの前記領域を同定する、ステップ、
をさらに含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ウイルスベクターおよび粒子ならびにそれらを設計し、製造するための方法およびツールに関する。

【背景技術】

【0002】

指向性進化によるウイルスベクターの操作により、トロピズムおよび機能が改善された強力なカプシドが大量に生成された^１～９。Ｃｒｅ－レコンビナーゼにより制限された選択および最適化のためのディープシーケンスの最近の追加は、近年このアプローチの精度および効力を改善したが、それは、実際の機能的なカプシドが表面化するまで複数世代のスクリーニングを必要とする産生中に生成される連続的感染性およびキメラによって依然として制限されている^２～４。プロセスのランダム性のため、ごくわずかなｄｅ ｎｏｖｏ配列が有効なフレーム内アミノ酸置換をコードし、さらに少数が正しく組み立てられる。このスクリーニングアプローチはまた本質的に再現性がなく、最適化を事後に行う必要がある。結果として生じるカプシドバリアントもまた、機能およびどの分子標的が関与しているかについての洞察をほとんど与えない。

【0003】

一般的に使用される代替アプローチは合理的な設計であり、体系的な変更が、カプシドの既知の特性（例えば、ＡＡＶ２カプシドからのヘパラン硫酸プロテオグリカン結合の除去）に基づいて行われるか、体系的なアミノ酸置換またはカプシド表面の高親和性ナノボディの提示を通じて行われる^{１０～１４}。このアプローチは、機能的にはより厳格であるが、それほど多様性を与えず、機能的な可能性が制限されている。

【0004】

したがって、信頼性が高く、再現性があり、かつ高い多様性を可能にする、特性が改善されたカプシドを設計するための方法が必要とされる。

【発明の概要】

【0005】

本明細書で提供される方法は、上記の欠点を克服する。所望の特性を有することがわかっているまたは有すると推測される選択されたタンパク質に、合理的かつ体系的なアプローチを適用することにより、改変ウイルス粒子をコードする改変ウイルスベクターのライブラリを発現させることができ、ここで改変ウイルス粒子は、選択されたタンパク質の断片を提示する改変カプシドを含む。適応させたスクリーニングを使用して、ウイルス粒子に所望の特性を付与するために特に有用である上記タンパク質の断片を同定できる。これらは、適応させた特性を有する改変カプシド、すなわち、同定された断片の１つを提示するカプシドを設計するために使用できる。実施例に見られるように、方法は、例えば、所与の細胞型に対してトロピズムおよび／または感染力が増大したウイルス粒子を設計するために使用できる。本発明の方法は、信頼性が高く、再現性があり、多様性が非常に高い。生成されたカプシドは、導入遺伝子を送達するために使用でき、また治療方法および遺伝子治療方法のみでなく、例えば、タンパク質ドメインの機能マッピングおよび薬物スクリーニングにおいての用途も見出す。

【0006】

本明細書では、以下のステップを含む、ウイルスベクターのライブラリを製造する方法が提供される：
ｉ）所望の特性を有するかまたは有すると推測されるポリペプチドの群から１つ以上の候補ポリペプチドを選択し、そのポリペプチドの配列を検索するステップと；
ｉｉ）複数の候補ポリヌクレオチドを提供するステップであって、各候補ポリヌクレオチドは、候補ポリペプチドのうちの１つのポリペプチド断片をコードし、これにより転写および翻訳時に各候補ポリペプチドは、各候補ポリペプチドの１つ以上のポリペプチド断片によって表される、ステップと；
ｉｉｉ）複数のバーコードポリヌクレオチドを提供するステップと；
ｉｖ）各候補ポリヌクレオチドをバーコードポリヌクレオチドと共に、カプシド遺伝子およびウイルスゲノムを含むウイルスベクターに挿入し、これによりそれぞれがバーコードポリヌクレオチドに作動可能に連結される単一の候補ポリヌクレオチドを含む複数のウイルスベクターを得るステップであって、候補ポリヌクレオチドは、カプシド遺伝子内に挿入され、カプシド遺伝子は、ウイルスゲノムの外側にあり、バーコードポリヌクレオチドは、ウイルスゲノム内に挿入され、ウイルスベクターは、検出可能なマーカーをコードするマーカーポリヌクレオチドを含む、ステップと、
ｖ）ステップｉｖ）で得られた複数のウイルスベクターを増幅系で増幅することであって、各ウイルスベクターは、増幅系において複数のコピーで存在する、ステップと、
ａ）参照系において、ステップｖ）の増幅系から複数のウイルスベクターの少なくとも第１の部分を検索し転送するステップであって、これにより各バーコードポリヌクレオチドを１つの候補ポリヌクレオチドにマッピングする、ステップと、
ｂ）増幅系において複数のウイルスベクターの第２の部分を維持し、複数のウイルス粒子を得るために産生系において第２の部分の全部または一部を任意により移すステップ。

【0007】

上記のステップｉ）～ｖ）を含み、さらに以下のステップを含む、所望の特性を有するウイルスベクターを設計する方法も提供される：
ｖｉ）上記のステップｖ）ｂ）の増幅系からウイルスベクターの一部を検索するか、または上記のステップｖ）ｂ）の産生系からウイルス粒子の少なくとも一部を検索し、かつ細胞集団を上記検索したウイルスベクターまたはウイルス粒子と接触させるステップと；
ｖｉｉ）マーカー発現をモニターし、マーカー発現が所望のパターンに従う細胞を選択するステップと；
ｖｉｉｉ）ステップｖｉｉ）で選択された細胞で発現されるバーコードポリヌクレオチドを同定するステップであって、これにより所望の特性に対応する候補ポリヌクレオチドおよび対応する候補ポリペプチドを同定する、ステップと；
ｉｘ）改変カプシド遺伝子を含むウイルスベクターを設計するステップであって、改変カプシド遺伝子は、ステップｖｉｉｉ）で同定された候補ポリヌクレオチドの１つを含む、ステップ。

【0008】

所望の特性を有するウイルス粒子を製造する方法も提供され、本方法は、上記のステップｉ）～ｖ）を含み、さらに以下のステップを含む：
ｖｉ）上記ステップｖ）ｂ）の増幅系から複数のウイルスベクターの少なくとも一部を検索するステップ、または上記ステップｖ）ｂ）の産生系から複数のウイルス粒子の少なくとも一部を検索するステップと；
ｖｉｉ）細胞集団を、ステップｖｉ）で得られた検索されたウイルスベクターまたはウイルス粒子と接触させるステップと；
ｖｉｉｉ）マーカー発現をモニターし、マーカー発現が所望のパターンに従う細胞を選択するステップと；
ｉｘ）ステップｖｉｉｉ）で同定された細胞で発現されるバーコードポリヌクレオチドを同定するステップであって、これにより所望の特性に対応する候補ポリヌクレオチドおよび対応する候補ポリペプチドを同定する、ステップと；
ｘ）改変カプシド遺伝子を含むウイルスベクターを設計するステップであって、改変カプシド遺伝子は、ステップｉｘ）で同定された候補ポリヌクレオチドの１つを含む、ステップと；
ｘｉ）ステップｘ）のウイルスベクターを増幅系または産生系で産生するステップであって、それにより所望の特性を有するウイルス粒子を得る、ステップ。

【0009】

導入遺伝子を標的細胞に送達する方法も提供され、この方法は以下を含む：
ａ）改変カプシドを含み導入遺伝子を封入する改変ウイルスベクターまたは改変ウイルス粒子を提供するステップであって、改変ウイルスベクターまたは改変ウイルス粒子は、上記のステップｘｉ）で定義されたウイルスベクターまたはウイルス粒子である、ステップと；
ｂ）改変ウイルスベクターまたは改変ウイルス粒子を注射部位に注射するステップ。

【0010】

ウイルスベクターのライブラリも提供され、各ウイルスベクターは：
ｉ）宿主細胞でウイルスベクターを発現させるための骨格；
ｉｉ）カプシド遺伝子およびその中に挿入され、候補ポリペプチドのポリペプチド断片をコードする候補ポリヌクレオチド；
ｉｉｉ）マーカーポリヌクレオチド；および
ｉｖ）バーコードポリヌクレオチド
を含み、
候補ポリペプチドは、所望の特性を有するかまたは有すると推測される１つ以上のポリペプチドを含む所定の群から選択され、
転写および翻訳時に、各候補ポリペプチドは、ライブラリ中の１つ以上のポリペプチド断片によって提示され、
候補ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターのカプシド遺伝子内に挿入され、これによりカプシド上に提示されるポリペプチド断片に転写および翻訳され、ウイルスゲノム内に挿入されたバーコードポリヌクレオチドに作動可能に連結され、
マーカーポリヌクレオチドは、ウイルスゲノム内に含まれ、カプシド遺伝子はウイルスゲノムの外側にある。

【0011】

本明細書に記載のウイルスベクターのライブラリを含む細胞または複数の細胞も提供される。

【0012】

導入遺伝子を標的細胞に送達するためのウイルス粒子をコードするウイルスベクターもまた提供され、ウイルスベクターは、改変カプシド遺伝子および標的細胞に送達される導入遺伝子を含み、
改変カプシド遺伝子はウイルスゲノムの外側にあり、導入遺伝子の送達を改善するかつ／または標的細胞への標的化を改善するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0013】

本明細書に記載されるウイルスベクターによってコードされるウイルス粒子もまた提供される。

【0014】

導入遺伝子を標的細胞に送達するための改変ウイルスベクターまたはウイルス粒子もまた提供され、改変ウイルスベクターまたはウイルス粒子は、改変カプシド遺伝子および標的細胞に送達される導入遺伝子を含み、
改変カプシドは、天然のカプシド遺伝子および導入遺伝子を含む未改変ウイルス粒子と比較して、次の１つ以上を改善する：標的細胞への導入遺伝子の送達、標的細胞への標的化、改変ウイルスベクターもしくは改変ウイルス粒子の感染性、および／または改変ウイルスベクターもしくは改変ウイルス粒子の逆行性輸送。

【0015】

遺伝子治療のための本明細書に記載されるウイルスベクター、ウイルス粒子、改変ウイルスベクターまたは改変ウイルス粒子の使用もまた提供される。

【0016】

神経系の障害などの障害の治療の方法で使用するための、本明細書に記載のウイルスベクター、ウイルス粒子、改変ウイルスベクターまたは改変ウイルス粒子も提供される。

【0017】

それを必要とする対象における、神経系の障害などの障害の治療の方法も提供され、この方法は、対象への記載されたウイルスベクター、ウイルス粒子、改変ウイルスベクターまたは改変ウイルス粒子の投与を含む。

【0018】

所望の効果を有する薬物を同定するための方法も提供され、本方法は、
ａ）候補薬物を提供するステップ；
ｂ）候補薬物を細胞に投与するステップ；
ｃ）ｂ）の細胞へのウイルス粒子の送達を可能にする改変カプシドおよびマーカーポリヌクレオチドを含む改変ウイルス粒子を提供するステップ；
ｄ）候補薬物の存在下および非存在下でマーカーポリペプチドの発現および／または局在化をモニターするおよび比較するステップ；
を含み、これにより、候補薬物がマーカーポリヌクレオチドの発現に影響を有するか否かを決定する。

【0019】

ウイルスベクターまたは粒子の標的細胞へのトロピズムを改善するための方法も提供され、この方法は、上記のステップｉ）～ｖ）を含み、
ｖｉ）ステップｖ）ｂ）の増幅系から複数のウイルスベクターの少なくとも一部を検索するステップ、またはステップｖ）ｂ）の産生系から複数のウイルス粒子の少なくとも一部を検索するステップと；
ｖｉｉ）標的細胞を含む細胞集団を、ｖｉ）で得られた検索されたウイルスベクターまたはウイルス粒子、およびマーカーを含む参照ウイルスベクターまたは参照ウイルス粒子と接触させるステップと；
ｖｉｉｉ）標的細胞におけるマーカー発現をモニターし、比較するステップと；
ｉｘ）参照ウイルスベクターまたは参照ウイルス粒子からの発現と比較してマーカーの発現の増加を有する、標的細胞中の候補ポリヌクレオチドを同定するステップと；
ｘ）改変カプシド遺伝子を含む、トロピズムが改善されたウイルスベクターまたはウイルス粒子を設計するステップであって、改変カプシド遺伝子は、ステップｉｘ）で同定された候補ポリヌクレオチドの１つを含む、ステップ、
をさらに含む。

【0020】

また、本明細書に開示されるのは、ポリペプチドを挿入することによって改変されたカプシドを含むウイルス粒子に所望の特性を付与するポリペプチドの１つ以上の領域を同定する方法であって、この方法は、上記のステップｉ）～ｖ）を含み、さらに以下のステップを含む：
ｖｉ）ステップｖ）ｂ）の増幅系から複数のウイルスベクターの少なくとも一部を検索するステップ、またはステップｖ）ｂ）の産生系から複数のウイルス粒子の少なくとも一部を検索するステップと；
ｖｉｉ）標的細胞を含む細胞集団を、ｖｉ）で得られた検索されたウイルスベクターまたはウイルス粒子、およびマーカーを含む参照ウイルスベクターまたは参照ウイルス粒子と接触させるステップと；
ｖｉｉｉ）標的細胞においてマーカー発現をモニターし、比較するステップと；
ｉｘ）所望の特性に対応するマーカーの発現プロファイルを有する、標的細胞中の候補ポリヌクレオチドを同定するステップ。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】ＢＲＡＶＥアプローチのための非常に多様なＡＡＶカプシドライブラリの作製（Ａ）文献から特定されたシナプスへの親和性が実証されている１３１のタンパク質を提示する円グラフである。これらは３つの主要な群、ウイルス由来（カプシドおよびエンベロープ）タンパク質、宿主由来タンパク質（ニューロトロフィンおよび疾患関連タンパク質、例えばタウ）、神経毒およびレクチン、に分類される。（Ｂ）１．１３１のタンパク質のＮＣＢＩ参照配列を、アミノ酸配列に翻訳し、１ａａシフティングスライディングウィンドウアプローチにより、計算的に１４ａａの長いポリペプチドに消化した。生成された６１３１４個のペプチドは合計で、４４７０８個の固有のポリペプチドからなった。２．３つの代替的リンカー：単一のアラニン（１４ａａと呼ばれる）、５つのアラニン残基（１４ａａＡ５）を有するリッジリンカー、およびａａ配列ＧＧＧＧＳ（１４ａａＧ４Ｓ）を有する柔軟なリンカー、をポリペプチドに付加した。ａａペプチドの最後の群は、２２ａａの長さおよび単一のアラニンリンカーを有して同様に生成された（２２ａａと呼ばれる）。３．合計９２３５８のアミノ酸の配列を次に、ヒト細胞での発現用にコドン最適化し、末端にオーバーハングを付加して、５８８位でＡＡＶ２ Ｃａｐ遺伝子中への方向性がある瘢痕（ｓｃａｒ）のないギブソンアセンブリクローニングを可能にした。全長１７０ｂｐの得られたオリゴはすべて、ＣｕｓｔｏｍＡｒｒａｙオリゴヌクレオチドアレイ上で並行して合成した。４．得られたオリゴヌクレオチドのプールを、Ｃｉｓ作用のＡＡＶ２ Ｒｅｐ／ＣａｐおよびＩＴＲ隣接ＣＭＶ－ＧＦＰを備えた新規ＡＡＶ産生骨格に組み込んだ。２０ｂｐのランダム分子バーコード（ＢＣ）を、ＧＦＰ遺伝子の３’ＵＴＲで同時に挿入した。５ａ．一方向のＣｒｅ組換えアプローチを使用し、その後、ｅｍＰＣＲベースのイルミナシーケンスアダプターを追加し、ペプチドのプール全体を次に、ランダムバーコードをルックアップテーブル（ＬＵＴ）のそれぞれのペプチドに連結するペアエンドシーケンスを使用して、配列決定する。得られたライブラリは、ペプチドおよびバーコードの３９３４５７０の固有の組み合わせを含んだ。５ｂ．ＬＵＴの作成と並行して、同じプラスミドライブラリを使用して、複製欠損ＡＡＶウイルスベクターのプレップを生成する。この場合、ペプチドはカプシド表面に提示され、バーコードはＡＡＶゲノムの一部としてパッケージ化される。次に、複数の並行スクリーニング実験をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で実行し、適切な選択（例えば、標的脳領域の切開）を行った後、ｍＲＮＡを抽出し、発現したバーコードの配列決定を行う。６．配列決定されたバーコードとＬＵＴとの組み合わせにより、効果を、元の１３１のタンパク質に戻ってマッピングでき、かつコンセンサスモチーフを、Ｈａｍｍｏｃｋ、隠れマルコフモデルベースのクラスター化アプローチ（７）を使用して決定できる。（Ｃ）ＡＡＶライブラリの２つの別々の産生を、１細胞あたり３コピーのプラスミド濃度（３０ｃｐｃ）または１０倍高い濃度（３０ｃｐｃ）で実行した。どのペプチドが正しいアセンブリおよびゲノムのパッケージ化を可能にするかを評価するために、ＤＮＡｓｅで両方のバッチを処理し（パッケージ化されていないゲノムを削除するため）、バッチを溶解し、調製物からのバーコードを個別にシーケンスした。発現したバーコードの多様性が非常に高いため、含まれたバーコードの重複は非常に少なかった。しかし、３ｃｐｃバッチでパッケージ化されたすべてのペプチドの絶対的な大部分を、３０ｃｐｃバッチでも回収した。（Ｄ）挿入されたペプチドの機能的寄与を評価するために、３０ｃｐｃライブラリを成体ラットの前脳に注入し、発現パターンを、同じ力価で同じ導入遺伝子（ＧＦＰ）を発現するＡＡＶ２－ＷＴベクターバッチと比較した。

【図2】ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの単一世代ＢＲＡＶＥスクリーニング（Ａ～Ｂ）最初の概念実証研究で、ＢＲＡＶＥ技術を利用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトロピズムの再導入についてスクリーニングすることにした。野生型ＡＡＶ２は、ヘパリン硫酸（ＨＳ）プロテオグリカン結合により生じる非常に高い感染力を呈する（Ｂ）。ＡＡＶ－ＭＮＭｎｕｌｌ血清型は、塩基５８７／５８８でのＮｈｅＩ制限酵素部位の挿入によりこの結合を破壊し、これによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞の感染力を大幅に低下させる（Ｂ’）。４００万個の固有にバーコード化されたカプシドバリアントのスクリーニングでは、親ＡＡＶ－ＭＮＭｎｕｌｌカプシド構造よりも大幅に改善された感染力が付与された１３２の含有タンパク質からいくつかの領域を発見した。ＨＳＶ－２表面タンパク質ｐＵＬ４４から１つのペプチドを選択し、ＡＡＶ－ＭＮＭ００１と名付けた最初の新規カプシドを生成した。このカプシドは、ＣＭＶ－ＧＦＰを個別にパッケージ化するために使用した場合、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して著しく増加したトロピズムを示した（Ｂ’’）。２番目の実験で、ＢＲＡＶＥ技術を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの初代皮質ラットニューロンの感染力を改善した。ＡＡＶ２－ＷＴおよびＡＡＶ－ＭＮＭｎｕｌｌの両方のベクターは、非常に低い初代ニューロンの感染力を呈し（Ｄ～Ｄ’）、ＡＡＶ－ＭＮＭ００１は、ある程度の改善を示す（Ｄ’’）。ＢＲＡＶＥスクリーニングを介して、ＨＳＶ－２ ｐＵＬ１タンパク質のＣ末端領域にわたりクラスター化する複数のペプチドを同定し（Ｃ）、それらは、新規のＡＡＶカプシド（ＡＡＶ－ＭＮＭ００２）で単独で使用された場合に、培養中の一次ニューロンの感染力を劇的に改善した（Ｄ’’’）。（Ｅ）ＡＡＶ２およびＡＡＶ－ＭＮＭ００１／００４／００８／００９／０１７／０２５／０２６の力価の比較。力価をゲノムコピー／細胞として示す（トランスフェクション時のＨＥＫ２９３Ｔではない）。選択したカプシドは、ＡＡＶ２と比較するために同じ製造方法で少なくとも２回製造する必要があった。黒い線は平均値を表し、２つの群は、２テールｔ検定を使用した場合、有意に異なった。ｐ≦０．０５。

【図3】ｉｎ ｖｉｖｏでの逆行性輸送のためのＡＡＶ－ＭＮＭ００４カプシドの特徴（Ａ）ＨＳＶ ｐＵＬ２２タンパク質のバイオインフォマティクス分析で、タンパク質のＣ末端領域は、すべての求心性領域（皮質、視床および黒質）への再現可能な輸送を呈し、線条体の注射部位では同じバイアスを示さなかった。（Ｂ～Ｄ）これらの特性を提示するすべてのペプチドのＨＭＭのクラスター化は、それぞれのカプシド構造の２つの重複するコンセンサスモチーフを明らかにした（Ｃ）。（Ｄ）ＡＡＶ－ＭＮＭ００４を、２つのカプシド構造のそれぞれを備えたｓｃＡＡＶ｜ＣＭＶ－ＧＦＰベクターの片側線条体注射により、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて親ＡＡＶ２と比較した。ＡＡＶ注射の５週間後に、動物を屠殺し、免疫組織化学を使用してこれらの切片をＧＦＰ染色し、ＤＡＢペルオキシダーゼ反応を用いて茶色の沈殿染色を行った。ＡＡＶ２－カプシドは、注射部位において効率的な形質導入を促進したが、ベクターの逆行性輸送はごくわずかであった。一方で、ＡＡＶ－ＭＮＭ００４カプシドは、内側嗅内皮質まで遡るすべての求心性領域への逆行性輸送を促進した。

【図4】ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で、アルツハイマー病に関与するタンパク質の機能をマッピングし理解するためのＢＲＡＶＥアプローチの利用（Ａ）興味深いことに、ｓＡＡＰ領域は、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（ＴＭＥＶ）由来のＶＰ１タンパク質の領域と有意な配列相同性を共有し、その軸索を取り込み、感染力を駆動していると考えられる。（Ｂ～Ｃ、Ｅ）より深い特徴付けの後、この領域は３つの隣接する保存されたモチーフからなり、３番目のモチーフはＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質（ニューロントロピズムを改善するためにレンチウイルスをシュードタイプするのによく使用される）およびＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質と有意な相同性を共有する。２つの新規カプシド構造が、この領域、ＡＡＶ－ＭＮＭ００９およびＡＡＶ－ＭＮＭ０１７から生成された。新規カプシドはいずれも、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて逆行性輸送を促進したが、ＡＡＶ－ＭＮＭ０１７は興味深いさらなる特性も呈した。ＡＡＶ－ＭＮＭ０１７は、非常に高い有効性で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで初代ニューロンおよび初代グリア細胞の両方に感染した。（Ｄ～Ｄ’’）ヒト初代グリア細胞での検出。（Ｄ）：ｍＣｈｅｒｒｙで染色したＡＡＶ－ＭＮＭ００１；（Ｄ’）：ＧＦＰで染色したＡＡＶ－ＭＮＭ０１７；（Ｄ’’）：共染色。

【図5】ＢＲＡＶＥを使用したＡＡＶカプシドの再シャッフルの評価およびＤＡニューロンに感染するカプシドの生成（Ａ～Ｂ）最後のＢＲＡＶＥスクリーニング実験で、線条体出力領域への注射により黒質のドーパミンニューロンへの効率的な逆行性輸送を備える新規ＡＡＶカプシドバリアントを開発することを目的とした。このスクリーニングで、近接したＣＡＶ－２カプシドタンパク質の２つの領域を同定した。興味深いことに、最初のペプチドは同じタンパク質の３番目の領域と有意な相同性を共有し（Ａ）、２番目のペプチド（Ｂ）は、レクチン大豆凝集素（ＳＡ）由来のペプチドモチーフを共有する。ＳＡもまた、シナプスからニューロンの細胞体へ効率的に輸送されるため、逆行性トレーサーとして使用できる。（Ｃ～Ｃ’）。二重蛍光免疫組織化学により、これらの細胞の大部分が実際にＴＨ陽性であり、それによりＤＡ産生性であると推定されたことを確認できた（Ｃ’’～Ｃ’’’）。同じｉｎ ｖｉｔｒｏ ｈＥＳＣ分化プロトコルを使用して、ｄｅ ｎｏｖｏカプシドバリアントのｉｎ ｖｉｔｒｏニューロントロピズムがヒト起源のニューロンでも維持されるかを評価した。実際に、初代げっ歯類ニューロンにおいて高いトロピズムを呈したいずれのバリアント（ＭＮＭ００２、００８、および０１０）も、野生型ＡＡＶバリアントよりもはるかに高いトロピズムを示した。

【図6】扁桃体基底外側の機能的解剖および不安の発症におけるその関与（Ａ）最後の実験では、ＢＲＡＶＥにより生成したＡＡＶ－ＭＮＭ００４カプシドバリアントを利用して、扁桃体基底外側から背側線条体への求心性神経の機能的寄与に関する未解決の問題に答えた。これは、逆行性誘導化学療法（ＤＲＥＡＤＤ）アプローチを使用して行った。背側線条体においてＣｒｅ－レコンビナーゼを発現するＡＡＶ－ＭＮＭ００４ベクター、およびＣｒｅ誘導性（ＤＩＯ）化学遺伝学的（ＤＲＥＡＤＤ）ベクターを、野生型ラットの扁桃体基底外側（ＢＬＡ）に両側から注射した。（Ｂ）ＤＲＥＡＤＤリガンドＣＮＯを使用して背側線条体に対して突出しているＢＬＡニューロンの活性を選択的に誘導した後、高架式十字迷路（ＥＰＭ）を使用して例証された著しい恐怖および不安の表現型を発見した。ここでは、対照動物（Ｃｒｅ遺伝子がＧＦＰに置換された）と比較して、動物はオープンアームで有意に短い時間を費やした。これは、正の刺激を促進する腹側線条体へのＢＬＡの突出の信じられている機能とは全く対照的であることを示している。（Ｃ）この増強された不安表現型は、オープンフィールドアリーナでの有意な過剰運動と、ＣＮＯチャレンジ後の過度の掘り込み、激しい発汗、および凍結エピソード（Ｄ～Ｅ）などの恐怖表現型を伴い、動物を屠殺し、ＢＬＡを、免疫組織化学を使用して、ＨＡ－タグ（ｈＭ３Ｄｑ ＤＲＥＡＤＤ発現を同定する）またはｍＣｈｅｒｒｙ（ｒＭ３Ｄｓ ＤＲＥＡＤＤを視覚化する）のいずれかで染色し、ＤＡＢペルオキシダーゼ反応を使用して茶色の沈殿染色に発色させた。

【図7】ＡＡＶ産生アプローチ（Ａ）３－プラスミドアプローチ。ＡＡＶゲノムを、トランスファープラスミドおよびパッケージングプラスミドの２つのプラスミドに分ける。アデノウイルス（Ａｄ）からの必要な遺伝子を、３番目のヘルパープラスミドを使用してトランスで供給する。トランスファープラスミドは、産生されたビリオンにパッケージ化される遺伝子配列を含む。この配列には、複製されカプシドに挿入されるＡＡＶからの反転末端反復（ＩＴＲ）が隣接する。このプラスミドは、プロモーターによって駆動される目的遺伝子（ＧＯＩ）を含み、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）およびポリアデニル化配列（ｐＡ）を有する。パッケージングプラスミドは、野生型ＡＡＶゲノムの残りの部分、すなわち通常力価を上げるための強力なプロモーターによって駆動されるＲｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子を含む。これらの遺伝子はもはやＩＴＲ配列に隣接していないため、それらは最終のＡＡＶビリオンにはパッケージされない。ヘルパープラスミドは、Ａｄ Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子およびＶＡ遺伝子を含み、これらは、すでに産生細胞株で発現され得るＡｄ遺伝子Ｅ１ａおよびＥ１ｂと一緒に、ＡＡＶの産生を可能にする。（Ｂ）２－プラスミドアプローチ。トランスファープラスミドは（Ａ）と同様であるが、ヘルパープラスミドおよびパッケージングプラスミドを１つの大きなプラスミドに統合した。これは、より少ないプラスミドを使用して複製欠損ＡＡＶウイルスを産生する能力を保持する。（Ｃ）代替的２－プラスミドアプローチ。ヘルパープラスミドは（Ａ）と同様であるが、トランスファープラスミドとパッケージングプラスミドを１つの機能的プラスミドに統合し、Ｒｅｐ／Ｃａｐ機能およびＩＴＲ隣接ゲノムの両方がＡＡＶビリオンに挿入されるが、ＡＡＶベクターは、依然として複製欠損である。これは、ヘルパープラスミドが律速であるため、力価を維持しながらはるかに少量のトランスファー／パッケージングプラスミドの利用を可能にする。それはまた、Ｃａｐ遺伝子と内部にパッケージ化されるＧＯＩの間の完全な一致を保証する。

【図8】Ｃｒｅ－レコンビナーゼにより修飾された読み出し２因子選択レジメンを、新規ＡＡＶカプシドバリアントのｉｎ ｖｉｖｏ選択に使用でき、それをここに例示する。第１の因子は、選択した特定の神経核への全身性心室内注射（ｓｙｓｔｅｍｉｃ，ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）または実質内注射などの、送達の部位である。第２の因子は、Ｃｒｅリコンビナーゼなどのリコンビナーゼ、またはＣａｓ９、Ｃａｓ１３、またはＣＰＦ１などのＤＮＡまたはＲＮＡを改変するタンパク質である。このタンパク質は、トランスジェニック動物の生成またはウイルスベクターを介してのいずれかにより供給され得る。これは、ウイルスベクターとして、特定の二次脳核に送達されて、カプシドスクリーニングのために選択された求心性のみを標識できる。本明細書では、このアプローチは、ｍＲＮＡからシーケンスされたバーコードに基づきオンターゲットおよびオフターゲットのマッピングを可能にする、新規戦略を示す。ｍＲＮＡシーケンスの価値は、感染が成功した場合にのみｍＲＮＡが形成されるため、偽陽性（組織内に保持される非感染性粒子）が除外されることである。（１）送達されたウイルスベクターライブラリは、以下の主要成分を含むゲノムを含む。ｉ）Ｉｎ ｖｉｔｒｏルックアップテーブルに基づきカプシド構造を識別できる分子バーコード（ＢＣ）。ｉｉ）シーケンシング用のライブラリ由来のｍＲＮＡの濃縮および増幅を可能にする、固有のシーケンシングプライマー結合部位（ＳＰＢＳ）。ｉｉｉ）順方向でのみ転写を停止する、合成ポリアデニル化部位（ｓｐＡ）。ｉｖ）存在量の少ない標的の場合のオンターゲット選択のためのマーカー遺伝子。ｖ）Ｃｒｅ－リコンビナーゼの存在下で不可逆的な再配向をもたらす、２組の非互換性ｌｏｘＰ組換え部位。ｖｉ）オフターゲット細胞でのシーケンシングのためにｍＲＮＡからバーコードを選択的に増幅することを可能にする、固有の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）。ｖｉｉ）オンターゲット細胞における同じタイプの増幅のための３’ＵＴＲ配列。（２）Ｃｒｅ－リコンビナーゼが存在しない場合、すなわち、オフターゲット感染後に、５’ＵＴＲおよびＳＰＢＳ部位を標的とするプライマーを使用して、ｍＲＮＡからバーコードを回収し、シーケンスできる。これは、幅広い非選択的感染力を有するカプシドバリアントのマッピングを可能にする。（３）ビリオンが目的の細胞、すなわちＣｒｅ発現細胞に感染すると、組換えが２組のｌｏｘＰ部位間で生じる。これは、マーカー遺伝子、バーコード、およびＳＰＢＳ配列の配向を逆にする。（４）オンターゲット細胞では、ｍＲＮＡの発現は、マーカー遺伝子のタンパク質への翻訳を可能にするが、ｓｐＡ配列が逆配向で活性でないため、ＳＰＢＳおよびバーコードをｍＲＮＡ ３’ＵＴＲの一部として保持する。このｍＲＮＡから、ＳＰＢＳおよび３’ＵＴＲ配列を標的とするプライマーを使用して、バーコードを選択的に濃縮し、増幅できる。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本開示は、改変ウイルス粒子をコードする改変ウイルスベクターのライブラリを設計し、製造するための合理化された体系的なアプローチを提供し、ここで改変ウイルス粒子は、選択されたタンパク質のポリペプチド断片を提示する改変カプシドを含む。適応させたスクリーニングを使用して、ウイルス粒子に所望の特性を付与するために有用である上記タンパク質の断片を同定できる。これらは、適応させた特性を有する改変カプシド、すなわち、同定された断片の１つを提示するカプシドを設計するために使用できる。実施例に見られるように、方法は、例えば、所与の細胞型に対してトロピズムが増大されたウイルス粒子を設計するために使用できる。
定義

【0023】

発現：ポリペプチドをコードする核酸配列またはポリペプチドの「発現」という用語は、ｍＲＮＡとしてのその核酸またはポリペプチド配列の転写、および／または、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の産生をもたらすその核酸配列またはポリペプチドの転写および翻訳を意味する。

【0024】

遺伝子治療：本明細書で使用される「遺伝子治療」という用語は、疾患を治療するために個体の細胞および組織に遺伝子を挿入することを指す。

【0025】

挿入：「挿入」という用語は、本明細書では、それぞれカプシド遺伝子またはタンパク質に挿入されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指すために使用される。カプシド遺伝子に挿入されるポリヌクレオチドは、カプシド遺伝子に「付加して」、所定の位置に挿入される。親カプシド遺伝子のポリヌクレオチド断片は、ポリヌクレオチドによって置き換えられず、したがって、ポリヌクレオチドが挿入されるカプシド遺伝子の長さは、挿入されたポリヌクレオチドの長さを親カプシド遺伝子の長さに足したものに等しい。同様に、所定のポリペプチドを提示するカプシドタンパク質の長さは、提示されるポリペプチドの長さに親カプシドタンパク質の長さを加えたものに等しい。

【0026】

改変：改変という用語は、ウイルス粒子、ウイルスベクター、カプシド遺伝子またはカプシドに関して本明細書で使用される。改変カプシドは、本明細書に記載のスクリーニング方法によって同定されるポリペプチドを提示するカプシドである。したがって、カプシドは、このポリペプチドの挿入によって変更された特性を有し得る。拡張すると、改変カプシド遺伝子は、ポリヌクレオチドが挿入されたカプシド遺伝子を指し、カプシド上に提示されたときにその特性を潜在的に変化させるポリペプチドをコードする。同様に、ウイルスベクターは、それが由来するウイルスベクターと比較して、ウイルスカプシド上に提示されたときにカプシド特性を変化させ得るポリペプチドをコードする追加のポリヌクレオチド配列を含む場合、改変される。ウイルス粒子は、改変カプシドを含む場合、改変される。

【0027】

作動可能に連結される：２つのポリヌクレオチドに言及するときに本明細書で使用される「作動可能に連結される」という用語は、２つのポリヌクレオチドの一方の同定が、２つのポリヌクレオチドの他方の同定を可能にすることを示す。作動可能に連結される２つのポリヌクレオチドは、物理的に同じ核酸分子の一部であり得るか、または異なる核酸分子上にあり得、すなわち、それらはトランスで作動可能に連結され得る。

【0028】

プロモーター：本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、特定の遺伝子の転写を促進するＤＮＡの領域を指す。プロモーターは典型的には、それらが制御する遺伝子の近くで、同じ鎖および上流に位置する。

【0029】

導入遺伝子：本明細書において用語「導入遺伝子」は、宿主細胞または標的細胞に導入することが望ましく、かつその細胞において天然または自然に発現しない、ポリヌクレオチドを指す。

【0030】

ウイルスゲノム：本明細書においてこの用語は、末端反復（ＴＲ）が隣接し、その結果ビリオン内にパッケージ化されるポリヌクレオチド領域（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指す。ＤＮＡウイルスの場合、末端反復は反転しており、反転末端反復（ＩＴＲ）と呼ばれる。レトロウイルスおよびレントウイルスは通常、長い末端反復（ＬＴＲ）を有する。したがって、ウイルスゲノムの外側にあるカプシド遺伝子などの遺伝子は、ウイルスゲノムと同じポリヌクレオチド分子上にあってもよいが、ＴＲ配列が隣接しておらず、したがってビリオン内にパッケージされない。
ウイルスベクターまたは粒子のライブラリ

【0031】

本発明者らは、ウイルスベクターまたはウイルス粒子のライブラリを製造する方法を開発し、そのライブラリから、所望の特性を有するウイルスベクターまたはウイルス粒子を選択できる。この方法は、所望の特性を有することが知られているまたは有することが推測される複数の候補ポリペプチドを選択すること、およびウイルス粒子上に提示された場合、このように改変されたウイルス粒子に所望の特性を付与する、それらの断片を同定することに基づく。

【0032】

したがって、本発明の方法を使用して、所望の特性を有するウイルス粒子、例えば改善されたトロピズムを有するウイルス粒子、または特定のタイプの細胞を選択的に標的とするウイルス粒子、をコードするウイルスベクターを設計することが可能である。こうしたウイルス粒子は、複数の用途、例えば遺伝子治療、特に中枢神経系（ＣＮＳ）への遺伝子導入および薬物スクリーニングに有用であり得る。

【0033】

したがって、本明細書では、以下のステップを含む、ウイルスベクターのライブラリを製造する方法が提供される：
ｉ）所望の特性を有するかまたは有することが推測されるポリペプチドの群から１つ以上の候補ポリペプチドを選択し、そのポリペプチドの配列を検索するステップと；
ｉｉ）複数の候補ポリヌクレオチドを提供するステップであって、各候補ポリヌクレオチドは、候補ポリペプチドの１つのポリペプチド断片をコードし、これにより転写および翻訳時に各候補ポリペプチドは、各候補ポリペプチドの１つ以上のポリペプチド断片によって表される、ステップと；
ｉｉｉ）複数のバーコードポリヌクレオチドを提供するステップと；
ｉｖ）各候補ポリヌクレオチドをバーコードポリヌクレオチドと共に、カプシド遺伝子およびウイルスゲノムを含むウイルスベクターに挿入し、これによりそれぞれがバーコードポリヌクレオチドに作動可能に連結される単一の候補ポリヌクレオチドを含む複数のウイルスベクターを得るステップであって、候補ポリヌクレオチドは、カプシド遺伝子内に挿入され、カプシド遺伝子は、ウイルスゲノムの外側にあり、バーコードポリヌクレオチドは、ウイルスゲノム内に挿入され、ウイルスベクターは、検出可能なマーカーをコードするマーカーポリヌクレオチドを含む、ステップと、
ｖ）ステップｉｖ）で得られた複数のウイルスベクターを増幅系で増幅することであって、各ウイルスベクターは、増幅系において複数のコピーで存在する、ステップと、
ａ）参照系において、ステップｖ）の増幅系から複数のウイルスベクターの少なくとも第１の部分を検索し、転送するステップであって、これにより各バーコードポリヌクレオチドを１つの候補ポリヌクレオチドにマッピングする、ステップと、
ｂ）増幅系において複数のウイルスベクターの第２の部分を維持し、複数のウイルス粒子を得るために産生系において第２の部分の全部または一部を任意により移すステップ。

【0034】

ウイルスベクターのライブラリも提供され、各ウイルスベクターは：
ｉ）宿主細胞でウイルスベクターを発現させるための骨格；
ｉｉ）カプシド遺伝子およびその中に挿入され、候補ポリペプチドのポリペプチド断片をコードする候補ポリヌクレオチド；
ｉｉｉ）マーカーポリヌクレオチド；および
ｉｖ）バーコードポリヌクレオチド
を含み、
候補ポリペプチドは、所望の特性を有するかまたは有することが推測される１つ以上のポリペプチドを含む所定の群から選択され、
転写および翻訳時に、各候補ポリペプチドは、ライブラリ中の１つ以上のポリペプチド断片によって提示され、
候補ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターのカプシド遺伝子内に挿入され、これによりカプシド上に提示されるポリペプチド断片に転写および翻訳され、ウイルスゲノム内に挿入されたバーコードポリヌクレオチドに作動可能に連結され、
マーカーポリヌクレオチドは、ウイルスゲノム内に含まれ、カプシド遺伝子は、ウイルスゲノムの外側にある。
候補ポリペプチドおよびポリヌクレオチド

【0035】

第１のステップでは、１つ以上の候補ポリペプチドを選択し、それらの配列を検索する。候補ポリペプチドは、カプシド表面に提示されたときにウイルス粒子に所望の特性を付与することが予想されるかまたは推測されるポリペプチドである。１つ以上の候補ポリペプチドは、例えば、本明細書で以下に記載される方法でポリペプチドの機能ドメインをマッピングすることを望む場合、１つのポリペプチドであってよく、または以下に詳述されるとおり、いくつかのポリペプチドであってもよい。

【0036】

したがって、候補ポリペプチドは、所与の特性が関与していることが知られているかまたは推測される可能性がある。例えば、カプシド上に提示されたときに所与のタイプの細胞のトロピズムを増大させる可能性のあるポリペプチドを選択するために、このタイプの細胞に輸送されることがわかっている第１のポリペプチドを選択できる。残りの候補ポリペプチドは、第１のポリペプチドとモチーフを共有する、潜在的に他のエンティティから、他のポリペプチドを同定するためのブラストクエリを実行することによって同定され得る。「エンティティ」という用語は、ここでは最も広い意味で解釈されるべきであり、生物ならびにウイルス、プリオンなどを包含する。あるいは、少なくともいくつかの条件で所望の特性を有することが知られているか推測される所与のエンティティ由来のすべてのポリペプチドを選択できる。選択された候補ポリペプチドの配列は、当業者に既知の方法により検索される。候補ポリペプチドの配列が不明である場合、これらの配列を決定するための方法が当業者に利用可能である。

【0037】

あるいは、候補ポリペプチドは、合成ライブラリ、例えばランダムペプチドライブラリなどのペプチドライブラリに由来し得る。いくつかの実施形態では、候補ポリペプチドは、それらが提示されるウイルスベクターに由来しない。いくつかの実施形態では、候補ポリペプチドには、変異体ライブラリに由来する。特定の実施形態では、変異体ライブラリは、ポリペプチドが提示されるウイルスベクターに対して天然であるポリペプチドに由来する変異体を含まない。

【0038】

次のステップでは、複数の候補ポリヌクレオチドが提供される。候補ポリヌクレオチドは、候補ポリペプチドの断片をコードする。複数の候補ポリヌクレオチドは、商業的供給業者に注文するか、使用者が設計し、合成できる。例えば、候補ポリヌクレオチドの配列は、紙にまたはインシリコで描かれ、商業的供給業者から注文されるか、または実施例１に示すように、例えばアレイ上で当技術分野で公知の方法により合成され得る。

【0039】

いくつかの実施形態では、候補ポリヌクレオチドの配列は、当技術分野で知られているように、所与の宿主細胞における転写のためにコドン最適化される。

【0040】

各候補ポリペプチドは、候補ポリヌクレオチドによってそれぞれコードされる１つ以上のポリペプチド断片によって表示される。いくつかの実施形態では、各候補ポリペプチドは、少なくとも３つのポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも３つの重複するポリペプチド断片などの、少なくとも２つのポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも２つの重複するポリペプチド断片によって表される。したがって、ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドも重複する。当業者にとって明らかであるように、異なる候補ポリペプチドに対しポリペプチド断片の数は異なる場合がある。これは単に、すべてが同じ長さを有する候補ポリヌクレオチドを設計する方が簡便であり得る場合があるためであり、同じポリペプチドの重複ポリペプチド断片をコードする候補ポリヌクレオチドの数はしたがって、対応する候補ポリペプチドの長さに対応する。他の実施形態では、候補ポリペプチドあたりのポリペプチド断片の数は、すべての候補ポリペプチドについて同じであり得るが、それらの長さは異なり得る。

【0041】

いくつかの実施形態では、所与の候補ポリペプチドに対し、所与の長さのすべての可能なポリペプチド断片が及ぶことが望ましい場合がある。そのような実施形態では、候補ポリヌクレオチドは、同じ候補ポリペプチドのポリペプチド断片をコードするすべての候補ポリヌクレオチドが、少なくともその長さの一部にわたって、例えば少なくとも１つのコドンにわたって重複するように設計される。多様性が最大となるように、同じ候補ポリペプチドのポリペプチド断片をコードする候補ポリヌクレオチドは、１つのコドンを除いて重複することが好ましく、その結果、同じ候補ポリペプチドのすべてのポリペプチド断片は１つのアミノ酸残基を除いて重複する。このようなアプローチを、実施例に例示する。

【0042】

他の実施形態では、同じ候補ポリペプチドのポリペプチド断片をコードする候補ポリヌクレオチドは、２つのコドン、３つのコドン、４つのコドン、５つのコドン、またはそれより多くを除いて重複する。好ましくは、同じ候補ポリペプチドのポリペプチド断片をコードする候補ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのコドン、例えば、少なくとも２つのコドンなど、少なくとも３つのコドンなどにわたって重複する。

【0043】

いくつかの実施形態では、ポリペプチド断片は、５～３６のアミノ酸残基、例えば５～３０アミノ酸残基の長さを有する。一実施形態では、ポリペプチド断片は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６残基の長さを有する。

【0044】

いくつかの実施形態では、ポリペプチド断片はすべて同じ長さを有する。他の実施形態では、ポリペプチド断片は異なる長さを有する。

【0045】

候補ポリペプチドのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドは、ポリペプチド断片が提示されるウイルス粒子をコードするウイルスベクターに挿入される。好ましくは、候補ポリヌクレオチドはカプシド遺伝子内に挿入される。好ましくは、カプシド遺伝子はウイルスゲノムの外側にある、すなわち、ＴＲまたはＩＴＲ配列が隣接していない。したがって、得られた改変カプシドはそれぞれ、ポリペプチド断片を提示する。カプシドは長い間徹底的に研究されており、当業者は、カプシド上に提示されるポリペプチド断片を挿入するための好適な位置を特定するのに苦労しないであろう。

【0046】

当業者には公知であるように、ウイルス粒子がＡＡＶである実施形態では、挿入部位は、好ましくは、ＶＰ１のリパーゼドメインの外側にある。また、挿入部位は好ましくは、組織活性化タンパク質（ＡＡＰ）の外側にあるべきである。挿入部位は、ＶＰ２のＮ末端にあってもよい。またそれは、組み立てられたカプシドの頂点にある、例えば、ＡＡＶ２のＣａｐ遺伝子のアミノ酸残基５８７またはＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子のアミノ酸残基５８８を中心とする場合もある。

【0047】

好ましい実施形態では、候補ポリペプチドを提示するカプシドは、他の方法では改変されていない、すなわち、そのアミノ酸配列は、他の点では天然または野生型カプシドと同一であるか、または本質的に同一である。したがって、ポリペプチドを提示するカプシドタンパク質の長さは、いくつかの実施形態では、天然の未改変カプシドタンパク質の長さより常に長い。こうした実施形態では、天然カプシドのポリペプチド断片は、候補ポリペプチドによって置き換えられず、天然カプシドのすべての残基は、候補ポリペプチドを提示する改変カプシドにも存在する。

【0048】

ウイルスベクターがＡＡＶ２である実施形態では、候補ポリペプチドのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドは、例えば、得られるポリペプチド断片がＶＰ１カプシドタンパク質の残基Ｎ５８７とＲ５８８との間に挿入されるように設計され得る。
バーコードポリヌクレオチド

【0049】

ポリペプチド断片の数、したがって候補ポリヌクレオチドの数が決定されると、複数のバーコードポリヌクレオチドがもたらされる。以下に詳述するように、バーコードポリヌクレオチドは固有のものである。当業者であれば、バーコードポリヌクレオチドは好ましくは、候補ポリヌクレオチドのいずれにも見出されない配列を有することを認識するであろう。バーコードポリヌクレオチドはまた、後のステップでのバックグラウンドノイズを回避するために、産生系として使用される細胞に天然では存在しないことが好ましい。さらに、バーコードポリヌクレオチドはまた、ライブラリが本開示の方法において発現されスクリーニングされる宿主細胞に天然に存在しない。固有のバーコードポリヌクレオチドの最小の長さは、当業者に明らかであるように、候補ポリヌクレオチドの数に依存するであろう。各候補ポリヌクレオチドは、単一のバーコードポリヌクレオチドに作動可能に連結される。したがって、バーコードポリヌクレオチドの数は、候補ポリヌクレオチドまたは断片の数に少なくとも等しい。「作動可能に連結された」は、各単一候補ポリヌクレオチド断片が直接または間接的に単一バーコードポリヌクレオチドに接続され、それにより各候補ポリペプチド断片と対応する固有のバーコードポリヌクレオチドの間の連結ももたらすことを意味する。したがって、バーコードの同定は、対応するポリヌクレオチド断片またはポリペプチド断片の同定を可能にする。いずれのバーコードポリヌクレオチド断片も、２つの異なる候補ポリヌクレオチド（かつ、これにより間接的に２つの異なる候補ポリペプチド断片）に連結され得ない。

【0050】

バーコードポリヌクレオチドを合成する方法は、当技術分野で公知である。これらはまた、商業的供給業者から注文され得る。

【0051】

候補ポリヌクレオチドおよびバーコードポリヌクレオチドの固有のペアが得られると、各ペアをウイルスベクターに挿入して、バーコードポリヌクレオチドに作動可能に連結された単一の候補ポリヌクレオチドをそれぞれ含む複数のウイルスベクターを得る。ウイルスベクターは、少なくとも一つのカプシド遺伝子を含み、それはウイルスゲノムの外側に、またはトランスで提供され得る。「ウイルスゲノム」とは、ＤＮＡ分子の末端を区切る反転末端反復（ＩＴＲ）内に位置するウイルス粒子内にパッケージされるウイルスＤＮＡの部分、またはＲＮＡ分子の末端を区切る長い末端反復（ＬＴＲ）などの末端反復（ＴＲ）内に位置する、ウイルス粒子内にパッケージされるウイルスＲＮＡの部分を意味する。ウイルスベクターはまたｒｅｐ遺伝子を含み、それはトランスで提供され得る。したがって、カプシド遺伝子（ｃａｐ）および／またはｒｅｐ遺伝子は、パッケージングプラスミドにおいて、またはヘルパープラスミドの一部として提供され得る（図７）。

【0052】

候補ポリヌクレオチドおよびバーコードポリヌクレオチドのペアは、ウイルスベクター中に同時にまたは順次挿入され得る。上で説明したように、この方法は、ウイルス粒子に所望の特性を付与するポリペプチドを同定するためにポリペプチド断片を提示する改変カプシドをスクリーニングすることを目的としているため、候補ポリヌクレオチドは、ウイルスゲノムの外側にあるカプシド遺伝子内に挿入されることが好ましい。対照的に、バーコードポリヌクレオチドは好ましくは、ウイルスゲノム内に、すなわち、長い末端反復または反転末端反復などの末端反復間に挿入される。理論に縛られることなく、この設計は、クローンの濃縮を回避し、ＰＣＲによって導入されるバイアス（配列に依存し得る）を取り除く。ＲＮＡからバーコードをシーケンシングすることにより、潜在的なＰＣＲバイアスは低減され、改変カプシドの配列から独立である。また、バーコードあたりのコピー数は、読み取りに影響しない。

【0053】

バーコードポリヌクレオチドは、マーカーポリヌクレオチドについて以下に記載されるように、プロモーターの制御下にあってもよい。好ましくは、バーコードポリヌクレオチドは、ウイルス粒子が細胞に感染したときに、それが転写され、かつ任意により翻訳され得るように、ウイルスゲノムに導入される。

【0054】

上記から、バーコードポリヌクレオチドおよび候補ポリヌクレオチドが作動可能に連結されていても、それらが同じ核酸分子上で隣接している必要はないことは明らかであろう。
マーカーポリヌクレオチド

【0055】

ウイルスベクターは、検出可能なマーカーをコードするマーカーポリヌクレオチドを含む。検出可能なマーカーは、ウイルス粒子の発現パターンをモニターすることを可能にする。

【0056】

マーカーポリヌクレオチドは、以下に詳述するとおり、所望の特性に関与する候補ポリペプチドを同定するために、転写時に、ウイルスベクターのライブラリが導入される宿主細胞において天然で生成されない安定なｍＲＮＡ分子を生じる、任意のポリヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、マーカーポリヌクレオチドは、蛍光マーカーなどの検出可能なマーカーをコードでき、それは発現時に視覚化され得るか、または他の方法で検出できる。マーカーポリヌクレオチドはまた、いくつかの実施形態では、バーコード自体であってもよい。これは、例えば、リコンビナーゼ系を発現する細胞に感染できるウイルスベクターを、本明細書において以下に記載される方法によって同定することが望ましい場合に関連し得る。リコンビナーゼ系は、ｌｏｘＰ部位と組み合わせたＣｒｅリコンビナーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１などのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であり得る。

【0057】

これは、一例として、図８に例示され、ここでリコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである。反対方向でｌｏｘＰ部位の２つのペアの間にバーコード（ＢＣ）配列を含むウイルスベクター（ここではＡＡＶベクター）が示される。ｌｏｘＰ部位内に含まれる領域は、ユニバーサルシーケンスプライマーの結合部位（ＳＰＢＳ）も含む。当技術分野で公知であるように、そのようなベクターがＣｒｅリコンビナーゼを発現する細胞で転写される場合、ｌｏｘＰ部位間の組換えが、それらの間に含まれる配列の反転をもたらす。対照的に、Ｃｒｅの発現がない場合、組換えおよび反転は生じない。２つのイベントは、ＳＰＢＳに結合するプライマーおよび５’ＵＴＲに結合するプライマーまたは３’ＵＴＲに結合するプライマーを用いるシーケンシングにより、ｍＲＮＡレベルで区別できる。５’ＵＴＲおよびＳＰＢＳに結合するプライマーでバーコードの配列決定を行うことにより、幅広い非選択的感染力を有するカプシドバリアントをマッピングできる。

【0058】

ポリアデニル化部位は、図８に例示されるように、マーカー遺伝子の下流に挿入され得る。これにより、転写は、ポリアデニル化部位が順方向転写である場合にのみ終結する。すなわち転写は、組換えがない場合、Ｃｒｅリコンビナーゼがない場合のみ終結する。したがって、そのような細胞から生じる転写物は、バーコードを欠く。対照的に、Ｃｒｅが発現される場合、転写は終結せず、転写物はバーコードを含む。したがって、転写物の配列決定は、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する細胞に由来する転写物と、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現のない細胞に由来する転写物とを区別できる。

【0059】

Ｃｒｅリコンビナーゼは、プラスミドなどのビヒクルを介して細胞中に提供され得る。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ウイルスベクター自体の中に含まれてもよい。対応するウイルス粒子に実際に感染した細胞のみが、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する。Ｃｒｅリコンビナーゼはまた、例えば、トランスジェニック動物においてライブラリをスクリーニングするときに、宿主自体によって発現され得る。

【0060】

図において「マーカー遺伝子」とマークされたボックスは任意であることを理解されたい。上で説明したように、バーコード自体がマーカーの機能を果たし得る。バーコードとは異なるマーカーが存在する実施形態では、マーカーの発現は、図に例示されるように、マーカーがプロモーターの下流で正しい方向であるように、組換えが起こる必要があり得ることに留意されたい。

【0061】

いくつかの実施形態では、マーカーポリヌクレオチドは、マーカーポリペプチドをコードする。マーカーポリペプチドは、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、抗生物質耐性遺伝子、細胞毒性遺伝子、表面受容体、β－ガラクトシダーゼ、ＴＶＡ受容体（サブグループＡのトリ白血病ウイルスの細胞受容体）、有糸分裂／癌遺伝子、トランス活性化因子、転写因子およびＣａｓタンパク質からなる群から選択できる。好適なマーカーポリペプチドまたはポリヌクレオチドの多数の例は、当業者に公知である。

【0062】

いくつかの実施形態では、バーコードポリヌクレオチドは、マーカーポリヌクレオチドとは異なり、マーカーポリヌクレオチドの３’非翻訳領域（３’-ＵＴＲ）に位置する。バーコードポリヌクレオチドは、メインマーカーとして使用されない場合であっても、追加的マーカーポリヌクレオチドの機能をなお果たす。

【0063】

いくつかの実施形態では、マーカーポリヌクレオチドは、ウイルスベクターのライブラリがスクリーニングされる標的細胞のコドン優先に基づいてコドン最適化される。

【0064】

マーカーポリヌクレオチドは、プロモーターの制御下にあってよい。したがって、いくつかの実施形態では、マーカーポリヌクレオチドは、プロモーター配列をさらに含む。プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得る。バーコードポリヌクレオチドがマーカーポリヌクレオチドでない場合、バーコードポリヌクレオチドは、マーカーポリヌクレオチドと同じプロモーターの制御下にあってよい。

【0065】

マーカーポリヌクレオチドは、細胞がリコンビナーゼ系を発現する場合にのみ、上記で説明したとおり、転写が可能であるように、プロモーターに対して配向され得る。マーカーポリヌクレオチドは、ポリアデニル化部位を含み得、これは、図８について上で説明したとおり、それが一方向でのみ転写を終結させるように配向され得る。

【0066】

プロモーターの選択は、それについてライブラリをスクリーニングしたい所望の特性の性質によって指示され得る。プロモーターの例は、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）、ハイブリッドＣＢＡ（ＣＢｈ）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、トリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＬ１（ＡＬＤＨ１Ｌ１）、シナプシン－１、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒストン１（Ｈ１）、Ｕ６スプライソソームＲＮＡ（Ｕ６）、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａｍＫＩＩ）、伸長因子１－アルファ（Ｅｆ１ａ）、フォークヘッドボックスＪ１（ＦｏｘＪ１）、またはグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターである。ＣＭＶ、Ｈ１、Ｕ６、ＣａｍＫＩＩ、Ｅｆ１ａ、ＦｏｘＪ１およびＧＦＡＰプロモーターは、中枢神経系でのポリヌクレオチドの発現に好適であることが公知である。
ウイルスベクター

【0067】

本明細書に開示される方法による改変に好適であるウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ボカウイルスおよび狂犬病ウイルスに由来するベクターを含む。好ましくは、ウイルスベクターは、導入遺伝子を標的細胞に送達するのに好適であるウイルスに由来する。導入遺伝子は、遺伝子治療方法で使用される遺伝子であり得るか、または、標的細胞で産生されることが望ましい目的産物をコードする遺伝子であり得る。
増幅系

【0068】

複数のウイルスベクターが構築されると、それは増幅系に導入される。これは、各ウイルスベクターの複数のコピーが産生されることを可能にする。増幅系は、当業者に公知であるように、目的に適した任意の細胞集団である。好ましくは、増幅系は、原核細胞集団、例えば、細菌系、例えば大腸菌である。

【0069】

増幅系は、ライブラリを維持するために使用され得る。すなわちそれは、増幅系からウイルスベクターを検索できるような条件で、ライブラリのウイルスベクターのそれぞれの少なくとも１つを含むライブラリの一部を保存するために使用できる。例えば、ライブラリを含む増幅系の細胞を、凍結し、－８０℃で保存できる。保存された増幅系からアリコートを採取して、ライブラリをさらに増幅し、当技術分野で公知の方法によりウイルスベクターを任意により検索できる。
参照系

【0070】

各候補ポリヌクレオチド（したがって各ポリペプチド断片）がどのようにバーコードポリヌクレオチドに作動可能に連結されるかを決定するために、複数のウイルスベクターの第１の部分が上記の増幅系から検索され、参照系に転送される。参照系は、そこからウイルスベクターをさらに分析できる細胞集団である。好ましくは、参照系は細菌性細胞集団である。参照系は、候補ポリヌクレオチドとバーコードポリヌクレオチドとの間の対応をマッピングするために使用される。このマッピングステップは、いくつかの方法で実行され得る。例えば、参照系からウイルスベクターを検索し、その後各ウイルスベクターの領域の配列を決定する。ここで配列決定された領域は好ましくは、少なくともバーコードポリヌクレオチドおよび候補ポリヌクレオチドを含む。

【0071】

いくつかの実施形態では、ルックアップテーブルが作製され、どのバーコードポリヌクレオチドがどの候補ポリヌクレオチドに、したがってどのポリペプチド断片に連結されるかを列挙する。これを行う方法の例を実施例１および図１Ｂに示す。Ｃｒｅ組換えの後、ｅｍＰＣＲベースのイルミナシーケンスアダプターを追加した後、ランダムバーコードポリヌクレオチドに作動可能に連結された候補ポリヌクレオチドのプール全体を、ペアエンドシーケンシングにより配列決定し、これにより各ポリペプチド断片を固有のバーコードポリヌクレオチドに連結するルックアップテーブルを得る。ルックアップテーブルを作製する他の方法は、当業者には明らかであろう。

【0072】

したがって、増幅系および参照系の並行使用は、各バーコードと各ポリペプチド断片の間の対応のマッピングと同時にウイルスベクタープレップの生成を可能にする。
産生系

【0073】

ウイルスベクターのライブラリからウイルス粒子のライブラリを製造するために、産生系が必要とされ得る。当技術分野で知られるように、産生系は、細胞を含み、ウイルス粒子を複製および／または産生するために必要なエレメントがウイルスベクター自体に含まれない場合、これらのエレメントを含むプラスミドまたはベクターをさらに含み得る。したがって、複数のウイルスベクターの一部は、上記の増幅系から検索され得、その結果この一部は、ライブラリのウイルスベクターの各々の少なくとも１つを含み、その後、産生系に移されて、複数のウイルス粒子を得ることができる。

【0074】

産生系は、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞、ＳＦ９細胞などの昆虫細胞、またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞などの酵母細胞を含むか、またはこれらから構成され得る。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒーラ細胞、初代ニューロン、誘導ニューロン、線維芽細胞、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、または胚性腎臓細胞などの胚性細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞である。

【0075】

産生系は、さらにベクター、例えば細胞中でウイルス粒子を産生するために必要なプラスミドを含み得る。図７は、ＤＮＡウイルスの産生のために例示されるいくつかのそのようなプラスミド系を示す。典型的な系は、３つのプラスミドに基づく：
－産生されたビリオンにパッケージ化された遺伝子配列を含むトランスファープラスミド。配列は、反転末端反復に隣接されて複製されカプシド中に挿入される。このプラスミドは、プロモーター、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、およびポリアデニル化配列によって駆動される目的遺伝子も含んでよい。
－多くの場合強力なプロモーターの制御下にある、ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を含むパッケージングプラスミド。
－ウイルスの産生に必要な残りの遺伝子を供給するヘルパープラスミド。ＡＡＶの場合、これらはＥ４、Ｅ２ａおよびＶＡ、任意によりＥ１ａおよびＥ１ｂであり得る。しかし、これらの遺伝子のいくつかは、宿主細胞において直接発現され得る。

【0076】

２つのプラスミドに基づく他の系は、上記のトランスファープラスミドと、ヘルパープラスミドおよびパッケージングプラスミドの両方に対応する１つのプラスミドとを含む。このような系は、簡易な方式で複製欠損ウイルスの産生を可能にする。

【0077】

本発明者らによって開発された第３のアプローチは、本明細書に開示されるスクリーニング方法に特に適している。パッケージングプラスミドおよびトランスファープラスミドは、１つの機能的プラスミドに組み合わされる。これは、Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子およびビリオンに挿入されるＴＲまたはＩＴＲ隣接ゲノムをもたらすが、それでもベクターは、確実に複製欠損である。ヘルパープラスミドは、上記のとおりであり、すなわち、それは、ウイルス産生に必要な残りの遺伝子を供給する。したがって、特定の実施形態では、産生系は、細胞、Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子ならびにＴＲまたはＩＴＲ隣接ゲノムをもたらすプラスミド、およびウイルスの産生に必要な残りの遺伝子をもたらすヘルパープラスミドを含む。
多様性

【0078】

したがって、本方法を使用して、実施例１に例解されるように、高い多様性を有するライブラリを設計することが可能である。多様性は典型的には、候補ポリペプチドのポリペプチド断片の数に比例して増加する。各ポリペプチド断片に対して異なるポリヌクレオチドを設計することにより、ライブラリの多様性をさらに高めることも可能である。同様に、天然ポリペプチドと比較して１つ以上の変異残基を含む候補ポリペプチドに対応する変異ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドも、ライブラリに含めることができる。

【0079】

いくつかの実施形態では、タンパク質の機能的ドメインを系統的にマッピングするために、たった１つのタンパク質ほどの小さいサブセットのタンパク質のポリペプチド断片を含むウイルス粒子のライブラリを得ることが望ましい場合がある。このアプローチは、実施例３に示すとおり、アルツハイマー病に関与することがわかっており、逆行性輸送をもたらすタンパク質であるＡＰＰおよびタウの領域を同定するために、発明者らによって上手く使用された。
所望の特性を有するウイルスベクターおよびウイルス粒子の設計および製造

【0080】

したがって、本開示はまた、所望の特性を有するウイルスベクターを設計し製造するための方法を提供し、本方法は、本明細書において上記のとおりステップｉ）～ｖ）を含み、さらに以下のステップを含む：
ｖｉ）上記のステップｖ）ｂ）の増幅系からウイルスベクターの一部を検索するか、または上記のステップｖ）ｂ）の産生系からウイルス粒子の少なくとも一部を検索し、かつ細胞集団を上記検索したウイルスベクターまたはウイルス粒子と接触させるステップと；
ｖｉｉ）マーカー発現をモニターし、マーカー発現が所望のパターンに従う細胞を選択するステップと；
ｖｉｉｉ）ステップｖｉｉ）で選択された細胞で発現されるバーコードポリヌクレオチドを同定するステップであって、これにより所望の特性に対応する候補ポリヌクレオチドおよび対応する候補ポリペプチドを同定するステップと；
ｉｘ）改変カプシド遺伝子を含むウイルスベクターを設計するステップであって、改変カプシド遺伝子は、ステップｖｉｉｉ）で同定された候補ポリヌクレオチドの１つを含む、ステップ。

【0081】

いくつかの実施形態では、ステップｉｘ）のウイルスベクターは、本明細書で上記のとおり、増幅系で増幅される。

【0082】

いくつかの態様では、ウイルスベクターは、宿主細胞に送達される導入遺伝子をさらに含み、これは産生系で産生され、これにより所望の特性を有するウイルス粒子を得る。

【0083】

所望の特性を有するウイルス粒子を製造する方法も提供され、本方法は、上記のステップｉ）～ｖ）を含み、さらに以下のステップを含む：
ｖｉ）ステップｖ）ｂ）の増幅系から複数のウイルスベクターの少なくとも一部を検索するステップ、またはステップｖ）ｂ）の産生系から複数のウイルス粒子の少なくとも一部を検索するステップと；
ｖｉｉ）細胞集団を、ステップｖｉ）で得られた検索されたウイルスベクターまたはウイルス粒子と接触させるステップと；
ｖｉｉｉ）マーカー発現をモニターし、マーカー発現が所望のパターンに従う細胞を選択するステップと；
ｉｘ）ステップｖｉｉｉ）で同定された細胞で発現されるバーコードポリヌクレオチドを同定するステップであって、これにより所望の特性に対応する候補ポリヌクレオチドおよび対応する候補ポリペプチドを同定するステップと；
ｘ）改変カプシド遺伝子を含むウイルスベクターを設計するステップであって、改変カプシド遺伝子は、ステップｉｘ）で同定された候補ポリヌクレオチドの１つを含む、ステップと；
ｘｉ）ステップｘ）のウイルスベクターを増幅系または産生系で産生するステップであって、それにより所望の特性を有するウイルス粒子を得る、ステップ。

【0084】

したがって、所望の特性に関与する候補ポリペプチドを同定し、この候補ポリペプチドを使用して所望の特性を有するウイルスベクターおよび粒子を設計し製造する方法が提供される。
所望の特性

【0085】

以下の実施例から明らかなように、所望の特性は、所与の用途に望ましい任意の特性であり得る。したがって、本方法は、カプシドに導入された場合に以下の特性の１つ以上を付与する候補ポリペプチドの同定に基づき、対応するウイルスベクターおよびウイルス粒子の同定ならびにその後の設計および産生を可能にする：
－シナプスなどの特定の種類の細胞に固有の構造などの、特定の細胞構造への親和性、または細胞分裂、細胞分化、ニューロンの活性化、炎症、または組織損傷などの、特定の細胞イベントに固有の構造への親和性；
－宿主細胞を取り巻く環境における輸送の改善または血液脳関門を通過する輸送の改善などの、輸送特性の改善；
－代謝肝臓を回避する能力の向上；
－免疫系を回避する能力の向上；
－免疫系を誘発する能力の向上。

【0086】

したがって、本発明の方法は、ウイルス粒子のカプシドに挿入されたときに、例えば、粒子のトロピズム、その感染力、または注射部位を取り巻く環境におけるその輸送を改変し得るポリペプチド断片を同定するために使用され得る。

【0087】

本発明者らは、本方法を使用してかつ実施例に例解されるように、ウイルスベクターライブラリを設計するためにシナプスに対して親和性を有することが知られるポリペプチドを選択した。次に、ライブラリをスクリーニングして、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトロピズムを失った変異カプシドと比較して、有意に改善された感染力を付与するポリペプチドを同定した。同じライブラリから、改変カプシドは、初代皮質ニューロンに対して改善された感染力を有するか、または改善された逆行性輸送容量を有することが確認された。

【0088】

したがって、本開示は、ポリペプチドを挿入することによって改変されたカプシドを含むウイルス粒子に対し所望の特性を改善するための方法も提供し、この方法は、上記のステップｉ）～ｖ）を含み、さらに以下のステップを含む：
ｖｉ）ステップｖ）ｂ）の増幅系から複数のウイルスベクターの少なくとも一部を検索するステップ、またはステップｖ）ｂ）の産生系から複数のウイルス粒子の少なくとも一部を検索するステップと；
ｖｉｉ）標的細胞を含む細胞集団を、ｖｉ）で得られた検索されたウイルスベクターまたはウイルス粒子、およびマーカーを含む参照ウイルスベクターまたは参照ウイルス粒子と接触させるステップと；
ｖｉｉｉ）標的細胞においてマーカー発現をモニターし、比較するステップと；
ｉｘ）所望の特性の改善に対応するマーカーの発現プロファイルを有する標的細胞において候補ポリヌクレオチドを同定するステップ。

【0089】

参照ウイルスベクターまたは参照ウイルス粒子は好ましくは、カプシドの明らかな例外を除いて、改変ウイルスベクターまたは改変ウイルス粒子と同一であり得る。好ましくは、参照ウイルスベクターまたは粒子のカプシドは改変されていない。
細胞集団および標的細胞

【0090】

次のステップでは、ウイルス粒子ライブラリを細胞集団において試験する。所望の特性の性質は、所望の特性を有する粒子を同定するために、ライブラリの複数のウイルス粒子と接触させる細胞集団の性質を決定するために重要であろう。例えば、所望の特性が、特定のタイプの細胞、例えば、中枢神経系に対して増大されたトロピズムである場合、細胞集団は、この特定のタイプの細胞を含まなければならない。

【0091】

粒子のライブラリは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで細胞集団と接触され得る。ウイルス粒子のライブラリは、例えば動物またはヒトに、例えば特定の注射部位で注射でき、または単に細胞培養物と接触されてよい。

【0092】

次に、マーカー発現をモニターし、マーカー発現が期待されるパターンまたは望ましいパターンに従う細胞を選択することが可能である。これは、当技術分野で公知である方法によって行うことができる。例えば、蛍光マーカーが使用される場合、細胞は蛍光発光についてモニターされ得、その後、発現されたバーコードを同定するために細胞からＲＮＡを抽出する。ＲＮＡはまた、標的細胞から単に抽出され得、その後、バーコードポリヌクレオチドは、配列決定によって同定され得る。

【0093】

バーコードポリヌクレオチドは、それぞれ単一のポリペプチド断片に作動可能に連結されるので、バーコードポリヌクレオチドの同定は、所望の発現パターンに関与するポリペプチド断片の同定を可能にする。次に、このポリペプチド断片を使用して、関連するポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドをカプシドに挿入することにより、改変カプシドを有する改変ウイルス粒子をコードするウイルスベクターを設計できる。このため、それは粒子の表面に提示されるようになり、これにより本明細書で上述のとおり、天然のカプシドの特性を変化させる。改変されたウイルスベクターまたは粒子は、バーコードポリヌクレオチドの存在を必要としない。あるいは、所望の特性を提示するウイルスベクターまたはウイルス粒子は、それらが試験される細胞集団から直接検索され得る。

【0094】

次に、改変ウイルス粒子は、本明細書で上述したとおり、増幅系で増幅され、かつ／または産生系で産生されてよい。
導入遺伝子の標的細胞への送達

【0095】

したがって、本明細書に開示される方法は、所望の特性を付与するポリペプチドを挿入することによって改変されたカプシド含む改変ウイルス粒子を設計するために使用され得、ここで改変ウイルス粒子は特に、導入遺伝子の標的細胞への送達によく適している。

【0096】

「導入遺伝子」という用語は、ある生物から単離され、かつ異なる生物に導入される遺伝子を含むポリヌクレオチドを指すと理解されるべきである。したがって、導入遺伝子は標的細胞に対し天然ではない。

【0097】

したがって、本改変ウイルス粒子は、標的細胞に送達される導入遺伝子を封入し得る。改変ウイルスベクターまたはウイルス粒子が注射部位に注射されると、または標的細胞を含む細胞集団と接触すると、導入遺伝子が標的細胞に送達される。改変ウイルスベクターまたは改変ウイルス粒子が注射部位から標的細胞へと輸送され得るならば、標的細胞は注射部位の近くにある必要はないことに留意されたい。「注射部位」という用語は、その広い意味で理解されるべきであり、すなわち、それは、ベクターまたは粒子が注射される、ある生物のある部位を指し得るか、または単に、ベクターまたは粒子との接触時にベクターまたは粒子を感染させることが望ましい標的細胞を含む細胞集団を指し得る。

【0098】

したがって、標的細胞に送達される改変カプシド遺伝子および導入遺伝子を含む、標的細胞に導入遺伝子を送達するための改変ウイルス粒子も本明細書に開示される。こうしたウイルス粒子をコードするウイルスベクターも開示される。

【0099】

したがって、遺伝子治療のステップを含むかまたはそのステップからなる治療方法のための、本明細書に開示される改変ウイルス粒子（以下にさらに詳述するとおり、改変カプシドを含み得る）の使用も提供される。

【0100】

好ましくは、改変ウイルス粒子は、非改変ウイルス粒子、すなわち、天然の非改変カプシド遺伝子を含むウイルス粒子と比較して、改善された特性を呈する。改善された特性は、本明細書で上記に列挙された特性のいずれかであり得る。

【0101】

改変ウイルス粒子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ボカウイルスまたは狂犬病ウイルスに由来し得る。

【0102】

改変ウイルス粒子は、本明細書に開示される改変カプシド、特に、配列番号１～配列番号５０のバリアントを含むかまたはこれらのバリアントからなるポリペプチドを含むかまたはこれらからなる改変カプシドを含んでよく、最大でも１つのアミノ酸残基が欠失、改変、または置換されている。他の実施形態では、改変カプシドは、配列番号１～配列番号５０のバリアントであるポリペプチドを含み、最大でも２つのアミノ酸残基が欠失、改変、または置換されている。他の実施形態では、改変カプシドは、配列番号１～配列番号５０のバリアントであるポリペプチドを含み、最大でも３つのアミノ酸残基が欠失、改変、または置換されている。バリアントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９または配列番号５０のバリアントであってよい。
導入遺伝子

【0103】

導入遺伝子の性質は典型的には、望まれる結果によって指示される。

【0104】

導入遺伝子は、遺伝子治療に有用な遺伝子、例えば、個体において欠損している遺伝子を置換する「置換」または「修正」遺伝子であり得る。また、導入遺伝子は、発現時に標的細胞における欠損メカニズムを補償し得る、タンパク質または転写物をコードしてもよい。導入遺伝子はまた、疾患を引き起こす遺伝子の発現をノックダウンするかまたは低減するために使用され得る。これは、導入遺伝子がサイレンシングＲＮＡをコードする場合、阻害によるものであり得る。例示として、神経系の疾患の症状を治療または緩和するために本ベクターを使用して導入遺伝子により標的化され得る遺伝子のいくつかの例を以下に列挙する。

【0105】

導入遺伝子は、ドーパミンの合成に関与する遺伝子であってよく、それはパーキンソン病の症状を緩和するのに有用であってよく、例えば、チロシンヒドロキシラーゼ、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）、または小胞モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ２）をコードする遺伝子であり得る。導入遺伝子は神経保護遺伝子でもあり得（例えば、Ｎｕｒｒ１、ＧＤＮＦ、ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ（ＮＲＴＮ）、ＣＮＤＦまたはＭＡＮＦ）、これは、例えば、パーキンソン病に罹患している患者で発現することが望ましい場合がある。導入遺伝子は、発現時に、パーキンソン病を引き起こす遺伝子（例えば、α－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）、ＬＲＲＫ２、Ｐｉｎｋ１、ＰＲＫＮ、ＧＢＡ、ＤＪ１、ＵＣＨＬ１、ＭＡＰＴ、ＡＴＰ１３Ａ２またはＶＰＳ３５など）のノックダウンまたは修正をもたらし得る。

【0106】

アルツハイマー病患者でノックダウンされるかまたは修正される可能性のある遺伝子の例は、ＡＰＰ、ＭＡＰＴ、ＳＰＥＮ１およびＰＳＥＮ２である。ハンチントン病の患者では、ＨＴＴ遺伝子（ハンチンチンをコードする）が導入遺伝子の送達によってノックダウンされるかまたは修正され得る。脊髄小脳失調症を患っている患者では、アタキシン１、２、３、７、または１０、ＰＬＥＫＨＧ４、ＳＰＴＢＮ２、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＩＯＳＣＡ、ＴＴＢＫ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、ＫＣＮＣ３、ＰＲＫＣＧ、ＩＴＰＲ１、ＴＢＰ、ＫＣＮＤ３、またはＦＧＦ１４が、導入遺伝子の送達時および発現時にノックダウンされるかまたは修正され得る。複数の系の萎縮では、ＳＮＣＡまたはＣＯＱ２が、ノックダウンまたは修正の関連標的であり得る。筋萎縮性側索硬化症では、導入遺伝子がＣ９ｏｒｆ７２、ＳＯＤ１、ＴＡＲＤＢＰまたはＦＵＳの過剰発現または修正をもたらし得る。ＳＭＮ１、ＳＭＮ２、ＵＢＡ１、ＤＹＮＣ１Ｈ１、またはＶＡＰＢは、脊髄性筋萎縮症患者のノックダウンまたは修正の標的である。ＤＭＤは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの過剰発現または修正の標的である。導入遺伝子は、統合失調症患者において、ＡＢＣＡ１３、Ｃ４Ａ、ＤＧＣＲ２、ＤＧＣＲ８、ＤＲＤ２、ＭＩＲ１３７、ＮＯＳ１ＡＰ、ＮＲＸＮ１、ＯＬＩＧ２、ＲＴＮ４Ｒ、ＳＹＮ２、ＴＯＰ３Ｂ、ＹＷＨＡＥまたはＺＤＨＨＣ８の修正を可能にし得る。ガラニン、ＮＰＹ、ソマトスタチンまたはＫＣＮＡ１は、てんかん患者における過剰発現の標的であり得る。導入遺伝子は、うつ病に罹患している個体において、ｐ１１、ＰＤＥ１１ａ、チャネルロドプシンまたは化学遺伝学的受容体の過剰発現を可能にし得る。

【0107】

導入遺伝子は、他の実施形態では、免疫原性物質であってよく、例えば、改変ウイルス粒子を使用して、免疫系の細胞を標的とし、所定のエピトープに対して個体を免疫化できる。

【0108】

本明細書に開示されるのは、改変カプシドを含む改変ウイルス粒子であり、ここで改変カプシドは、配列番号１～配列番号５０からなる群から選択される配列を含むかまたはそれらからなるポリペプチドを含むかまたはそれらからなる。改変ウイルス粒子をコードする改変ウイルスベクターも開示される。一実施形態では、改変カプシドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９または配列番号５０を含むかまたはこれらからなるポリペプチドを含む。

【0109】

こうした改変カプシドは、上記のポリペプチド断片またはそのバリアント、すなわち改変ポリペプチド断片のいずれかを含んでもよく、最大で１個（最大で２個、最大で３個など）のアミノ酸残基が欠失、改変または置換されている。

【0110】

したがって、いくつかの実施形態では、改変カプシドは、配列番号１～配列番号５０のバリアントを含むかまたはそれらからなるポリペプチドを含み、最大で１つのアミノ酸残基が欠失、改変または置換されている。他の実施形態では、改変カプシドは、配列番号１～配列番号５０のバリアントであるポリペプチドを含み、最大でも２つのアミノ酸残基が欠失、改変、または置換されている。他の実施形態では、改変カプシドは、配列番号１～配列番号５０のバリアントであるポリペプチドを含み、最大でも３つのアミノ酸残基が欠失、改変、または置換されている。バリアントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９または配列番号５０のバリアントであってもよい。

【0111】

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５１～配列番号１００からなる群から選択される配列を含むかまたはそれらからなるポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９または配列番号１００から選択される配列を含むかまたはこれらからなるポリヌクレオチドによってコードされる。

【0112】

当技術分野で知られているように、導入遺伝子は、ウイルスゲノム、すなわち、ウイルスゲノムを区切る長い末端反復または反転末端反復配列などの末端反復配列の間に挿入できる。
標的細胞

【0113】

導入遺伝子送達の標的とされる細胞は好ましくは、導入遺伝子の発現が望まれる細胞である。標的細胞は、例えば、海馬および／もしくは嗅内皮質および／もしくは小脳および／もしくは脊髄および／もしくはてんかん焦点および／もしくは側坐核および／もしくは手綱核の皮質ニューロンおよび／もしくはニューロンのニューロン；グリア細胞（特に、尾状核被殻および／もしくは黒質および／もしくは大脳皮質および／もしくは梗塞領域における）；ＤＡニューロン（特に黒質および腹側被蓋野における）；または筋細胞であってよい。

【0114】

改変ウイルスベクターのライブラリは、上記のようにスクリーニングでき、ここで選択される改善された特性は、標的細胞、特に上記に列挙された標的細胞に対する増大された感染性および／またはトロピズムである。
治療の方法

【0115】

障害の治療または予防の方法で使用するための、本明細書において開示される改変ウイルスベクター、または本明細書に開示される改変ウイルス粒子も本明細書に提供される。

【0116】

改変ウイルス粒子は、例えば、障害の治療または予防に有用であり得る導入遺伝子を送達するために標的化される細胞の感染性の増大をもたらし得る、ポリペプチドを提示する。

【0117】

したがって、それを必要とする対象に本明細書に記載の改変ウイルスベクターまたは改変ウイルス粒子を投与するステップを含む、疾患または障害の治療または予防の方法が本明細書に開示され、この改変ウイルスベクターまたは改変ウイルス粒子は、導入遺伝子を含む。好ましくは、改変ウイルス粒子は、未改変カプシドを有する対応する非改変ウイルス粒子と比較して、導入遺伝子が送達される標的細胞に対する増大されたトロピズムおよび／または感染力を有する。

【0118】

改変ウイルス粒子は、本明細書に開示される改変カプシド、特に、配列番号１～配列番号５０のバリアントを含むかまたはこれらのバリアントからなるポリペプチドを含むかまたはこれらからなる改変カプシドを含んでよく、最大でも１つのアミノ酸残基が欠失、改変、または置換されている。他の実施形態では、改変カプシドは、配列番号１～配列番号５０のバリアントであるポリペプチドを含み、最大でも２つのアミノ酸残基が欠失、改変、または置換されている。他の実施形態では、改変カプシドは、配列番号１～配列番号５０のバリアントであるポリペプチドを含み、最大でも３つのアミノ酸残基が欠失、改変、または置換されている。バリアントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９または配列番号５０のバリアントであってよい。

【0119】

必要としている対象は、疾患または障害に罹患しているか、これらに罹患している疑いがある、または罹患するリスクがある対象であり得る。

【0120】

いくつかの実施形態では、疾患は、パーキンソン病である。導入遺伝子は、チロシンヒドロキシラーゼ、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼ１（ＧＣＨ１）、または小胞モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ２）をコードし得る。そのような実施形態に好ましい標的細胞は、尾状核被殻および／または黒質におけるニューロンおよび／またはグリア細胞である。導入遺伝子は、神経保護遺伝子（例えば、Ｎｕｒｒ１、ＧＤＮＦ、ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ（ＮＲＴＮ）、ＣＮＤＦまたはＭＡＮＦ）の過剰発現をもたらし得る；そのような実施形態に好ましい標的細胞は、尾状核被殻および／または黒質におけるニューロンおよび／またはグリア細胞である。導入遺伝子は、α－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）、ＬＲＲＫ２、Ｐｉｎｋ１、ＰＲＫＮ、ＧＢＡ、ＤＪ１、ＵＣＨＬ１、ＭＡＰＴ、ＡＴＰ１３Ａ２、ＶＰＳ３５のノックダウンまたは修正をもたらし得る。そのような実施形態に好ましい標的細胞は、黒質および腹側被蓋野のＤＡニューロンである。

【0121】

他の実施形態では、疾患はアルツハイマー病であり、導入遺伝子は、ＡＰＰ、ＭＡＰＴ、ＳＰＥＮ１またはＰＳＥＮ２のノックダウンまたは修正をもたらす。そのような実施形態の好ましい標的細胞は、海馬および嗅内皮質のニューロンである。

【0122】

他の実施形態では、疾患はハンチントン病であり、導入遺伝子はＨＴＴをノックダウンするかまたは修正する。そのような実施形態に好ましい標的細胞は、尾状核被殻および／または大脳皮質のニューロンおよび／またはグリア細胞である。

【0123】

他の実施形態では、疾患は脊髄小脳失調症であり、導入遺伝子は、アタキシン１、２、３、７、または１０、ＰＬＥＫＨＧ４、ＳＰＴＢＮ２、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＩＯＳＣＡ、ＴＴＢＫ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、ＫＣＮＣ３、ＰＲＫＣＧ、ＩＴＰＲ１、ＴＢＰ、ＫＣＮＤ３、またはＦＧＦ１４をノックダウンするかまたは修正する。こうした実施形態に好ましい標的細胞は、小脳のニューロンである。

【0124】

他の実施形態では、疾患は多系統萎縮症であり、導入遺伝子はＳＮＣＡまたはＣＯＱ２をノックダウンするかまたは修正する。そのような実施形態に好ましい標的細胞は、尾状核被殻および／または黒質および／または大脳皮質のニューロンおよび／またはグリア細胞である。

【0125】

他の実施形態では、障害は筋萎縮性側索硬化症であり、導入遺伝子はＣ９ｏｒｆ７２、ＳＯＤ１、ＴＡＲＤＢＰまたはＦＵＳの過剰発現または修正をもたらす。こうした実施形態に好ましい標的細胞は、脊髄のニューロンである。

【0126】

他の実施形態では、障害は脊髄性筋萎縮症であり、導入遺伝子は、ＳＭＮ１、ＳＭＮ２、ＵＢＡ１、ＤＹＮＣ１Ｈ１またはＶＡＰＢのノックダウンまたは修正をもたらす。こうした実施形態に好ましい標的細胞は、脊髄のニューロンである。

【0127】

他の実施形態では、障害はデュシェンヌ型筋ジストロフィーであり、導入遺伝子はＤＭＤの過剰発現または修正をもたらす。こうした実施形態に好ましい標的細胞は、筋細胞である。

【0128】

他の実施形態では、障害は統合失調症であり、導入遺伝子はＡＢＣＡ１３、Ｃ４Ａ、ＤＧＣＲ２、ＤＧＣＲ８、ＤＲＤ２、ＭＩＲ１３７、ＮＯＳ１ＡＰ、ＮＲＸＮ１、ＯＬＩＧ２、ＲＴＮ４Ｒ、ＳＹＮ２、ＴＯＰ３Ｂ、ＹＷＨＡＥまたはＺＤＨＨＣ８の修正をもたらす。このような実施形態に好ましい標的細胞は、皮質ニューロンである。

【0129】

他の実施形態では、障害はてんかんであり、導入遺伝子はガラニン、ＮＰＹ、ソマトスタチンまたはＫＣＮＡ１の過剰発現をもたらす。こうした実施形態に好ましい標的細胞は、てんかん焦点にあるニューロンである。

【0130】

他の実施形態では、障害はうつ病であり、導入遺伝子はｐ１１、ＰＤＥ１１ａの過剰発現をもたらす。そのような実施形態に好ましい標的細胞は側坐核のニューロンであるか、または導入遺伝子は、チャネルロドプシンまたは化学発生受容体の過剰発現をもたらし、そのような実施形態に好ましい標的細胞は手綱核のニューロンである。
薬物スクリーニング

【0131】

本明細書に開示された方法により得られる改変ウイルスベクターおよび粒子はまた、薬物スクリーニングを含む、複数のさらなる用途に有用であり得る。

【0132】

一態様では、所望の効果を有する薬物を同定するための方法が提供され、本方法は、以下のステップを含み：
ａ）候補薬物を提供するステップ；
ｂ）候補薬物を細胞に投与するステップ；
ｃ）ｂ）の細胞へのウイルス粒子の送達を可能にする改変カプシドおよびマーカーポリヌクレオチドを含む改変ウイルス粒子を提供するステップ；
ｄ）候補薬物の存在下および非存在下でマーカーポリペプチドの発現および／または局在化をモニターするおよび比較するステップ；
これにより、候補薬物がマーカーポリヌクレオチドの発現に影響を有するか否かを決定する。

【0133】

改変ウイルス粒子は、本明細書に開示される改変カプシド、特に、配列番号１～配列番号５０のバリアントを含むかまたはこれらのバリアントからなるポリペプチドを含むかまたはこれらからなる改変カプシドを含んでよく、最大でも１つのアミノ酸残基が欠失、改変、または置換されている。他の実施形態では、改変カプシドは、配列番号１～配列番号５０のバリアントであるポリペプチドを含み、最大でも２つのアミノ酸残基が欠失、改変、または置換されている。他の実施形態では、改変カプシドは、配列番号１～配列番号５０のバリアントであるポリペプチドを含み、最大でも３つのアミノ酸残基が欠失、改変、または置換されている。バリアントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９または配列番号５０のバリアントであってよい。
タンパク質ドメインの機能マッピング

【0134】

本明細書に記載された方法により入手可能な改変ウイルスベクターおよび粒子は、タンパク質ドメインの機能的マッピングを実施するために使用され得る。これを、実施例５で例示する。

本方法により、所与のメカニズムまたは障害に関与することが知られているかまたは推測されるポリペプチドのポリペプチド断片を使用して、改変カプシドのライブラリを製造でき、ここで改変カプシドはポリペプチドの異なる領域を提示する。

【0135】

したがって、本明細書に開示されるのは、ポリペプチドの挿入により改変されたカプシドを含むウイルス粒子に所望の特性を付与するポリペプチドの１つ以上の領域を同定する方法であって、この方法は、上記のステップｉ）～ｖ）を含み、
ｖｉ）ステップｖ）ｂ）の増幅系から複数のウイルスベクターの少なくとも一部を検索するステップ、またはステップｖ）ｂ）の産生系から複数のウイルス粒子の少なくとも一部を検索するステップと；
ｖｉｉ）標的細胞を含む細胞集団を、ｖｉ）で得られた検索されたウイルスベクターまたはウイルス粒子、およびマーカーを含む参照ウイルスベクターまたは参照ウイルス粒子と接触させるステップと；
ｖｉｉｉ）標的細胞においてマーカー発現をモニターし、比較するステップと；
ｉｘ）所望の特性に対応するマーカーの発現プロファイルを有する標的細胞において候補ポリヌクレオチドを同定するステップであって、これにより、この特性に関与するポリペプチドの領域を同定する、ステップ
をさらに含む。

【0136】

そのような用途では、当業者には明らかであるように、カプシドライブラリによって提示されるポリペプチド断片の数が多いほど、かつ／または個々のポリペプチド断片間の重複が大きいほど、機能的マッピングはより正確である。したがって、いくつかの実施形態では、各ポリペプチドは、ポリペプチド断片が１つを除くすべてのアミノ酸残基によって重複するような方法で、複数のポリペプチド断片により提示される。
実施例
実施例１－非常に多様なＡＡＶライブラリの設計および生成、ならびに逆行性輸送機能のスクリーニング
材料および方法
ＡＡＶライブラリ骨格プラスミドクローニング

【0137】

バーコード化された改変ＡＡＶカプシドのクローニングに使用される骨格プラスミドを、ＧＦＰ（ｐｓｃＡＡＶ－ＧＦＰ^２４）およびｐＤＧ^２５（アデノウイルス遺伝子ＶＡ、Ｅ２ＡおよびＥ４の欠失を含む）を発現する自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターから開発した。最終的なプラスミドは、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるｅＧＦＰ発現カセット、およびマウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターを含む野生型ＡＡＶ２ゲノムを含んだ。まず、ＸｂａＩ、ＢｓｉＷＩ、およびＭｌｕＩ部位を、ｐｓｃＡＡＶ－ＧＦＰ［Ａｄｄｇｅｎｅ＃３２３９６］のＸｈｏＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入した。次に、ＮｈｅＩ部位を、鋳型として改変ｐＤＧを使用する重複拡張ＰＣＲ^２６により、ＶＰ１カプシドタンパク質のＮ５８７とＲ５８８の配列の間に導入した。ＮｈｅＩ部位の他に、最終的なＰＣＲ産物は、その後のクローニングおよびＬｏｘＰ－ＪＴＺ１７の挿入を容易にするため（Ｃｒｅ組換えおよび最終ライブラリの次世代シーケンシング用）に、ＢｓｉＷＩ部位とＭｌｕＩ部位も含んだ。最後に、改変ｐｓｃＡＡＶ－ＧＦＰを、ＸｂａＩおよびＭｌｕＩを使用して消化し、重複拡張ＰＣＲ産物を、ＭｌｕＩおよびＢｓｉＷＩによって消化し、ｐＤＧを、ＢｓｉＷＩおよびＸｂａＩによって消化した。次に、３つのＤＮＡ断片をライゲーションして、ＡＡＶライブラリの最終的な骨格プラスミドを得た。
ペプチド提示のためのタンパク質の選択

【0138】

挿入されるペプチドの候補は、既知のニューロン関連タンパク質に由来した。５つのカテゴリー、神経向性ウイルス、レクチン、ニューロトロフィン、神経毒、および神経タンパク質、に属する１３１のタンパク質を選択した。候補タンパク質の選択は、結合におけるタンパク質とニューロンとの間の既知の相互作用、ならびにＡＡＶ感染および複製プロセスの様々な段階（内在化、エンドソーム輸送、核内移行など）に基づいた。ペプチドを、大きいペプチド^{１４，２７}の挿入が可能でありかつヘパラン硫酸プロテオグリカン結合^{１２，１３}をブロックするとこれまでに報告された部位である、ＶＰ１カプシドタンパク質のＮ５８７とＲ５８８との間に組み込まれるように設計した^１１。４つの異なるペプチド構造を、Ａ－１４ａａ－Ａ、Ａ－２２ａａ－Ａ、Ａ５－１４ａａ－Ａ５、Ｇ４Ｓ－１４ａａ－Ｇ４Ｓとして設計した。これらは１４または２２アミノ酸（ａａ）残基の２つの長さのペプチドを含み、アラニン（Ａ）の１つのアミノ酸のスペーサーまたは短いリンカー（Ａ５またはＧ４Ｓ）のいずれかが隣接した^{２８，２９}。候補タンパク質からの１４ａａまたは２２ａａのすべての可能な固有のペプチドを、同定し、Ｒプログラムを使用するスライディングウィンドウアプローチによって生成した。ペプチドライブラリを、ＨＥＫ２９３細胞内での高レベル発現のためにコドン最適化を使用してオリゴヌクレオチドに逆翻訳した。
アレイオリゴヌクレオチドの合成および増幅

【0139】

９２，９１８個の固有のオリゴヌクレオチドを含む最終的なオリゴヌクレオチドプールを、Ａ－１４ａａ－Ａからのすべての可能な固有のペプチドをコードする９０ｋ ＤＮＡアレイ（カスタムアレイ）を使用して合成し、他の３つのペプチド構造からペプチドを選択した。

【0140】

オリゴヌクレオチドプールを、ＰＣＲアーティファクトを低減させる長い伸長時間でのエマルジョンＰＣＲで増幅しギブソンアセンブリ用に調製した^{１７，３０}。

【0141】

ＰＣＲミックスを、０．５μｇ／μｌ ＢＳＡ（ＮＥＢ）を添加することを除いて製造業者の推奨に従いＰｈｕｓｉｏｎ（商標） Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用して調製した。簡潔に言うと、９容量の油性界面活性剤混合物（９２．９５％の鉱油、７％のＡＢＩＬ ＷＥおよび０．０５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）をＰＣＲ混合物に加え、ＭＰ ＦａｓｔＰｒｅｐ－２４ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を使用して、４ｍ／ｓの速度で５分間ホモジナイズしてエマルジョンを作製した。エマルジョンＰＣＲに使用したＰＣＲプログラムは、９８℃で３０秒の１サイクル、９８℃で５秒の３０サイクル、６５℃で３０秒、および７２℃で２分（通常の伸長時間の８倍）、最後に７２℃で５分の１サイクル、であった。ＰＣＲ後に、各チューブに２容量のイソブタノールを追加することによりエマルジョンを破壊し、ＰＣＲ産物を含む水相を短時間の遠心分離（１６，０００ｇで２分間）により分離し、最後にＥＺＮＡ（商標）Ｃｙｃｌｅ Ｐｕｒｅ Ｋｉｔ（Ｏｍｅｇａ）を使用して精製した。
ＡＡＶライブラリのクローニングおよびバーコード化

【0142】

ギブソンアセンブリを使用して、オリゴヌクレオチドプール（ＩＴＲの外側に位置するカプシド遺伝子中に）およびバーコード（ＩＴＲの内側にあるＧＦＰの下流に）を挿入して、バーコード化されたＡＡＶプラスミドライブラリを生成した（図１）。１サイクルのＰＣＲを実行して、ギブソンアセンブリのためのオーバーハングを有するバーコード化された断片を生成した。バーコード長は２０ヌクレオチドであり、５回繰り返され結合のために静的配列が隣接する配列Ｖ－Ｈ－Ｄ－Ｂ（ＩＵＰＡＣ曖昧性コード）を使用して、曖昧性ヌクレオチドとして定義した。オリゴは、その後のＣｒｅ組換えを容易にするために、ＬｏｘＰ－ＪＴＺ１７部位も含んだ。４０μｌのギブソンアセンブリ反応（ＮＥＢ）を実施して、オリゴヌクレオチドプールおよびバーコード化断片を、１．３：１．３：１のモル比で２００ｎｇの消化ベクターに挿入した。反応物を５０℃で１時間インキュベートし、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して精製した。１μｌ（３７．４ｎｇ）の精製されたギブソンアセンブリ産生物を、製造業者のプロトコルに従い２０μｌのＭｅｇａＸ ＤＨ１０Ｂ（商標）Ｔ１Ｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）細胞に形質転換した。５つの個別の形質転換を実施し、１つのチューブにプールした。形質転換された細菌の小分画を寒天プレートにプレーティングして、形質転換の有効性を検証した。プレートから１０クローンを選択し、オリゴヌクレオチドおよびバーコードの挿入を、Ｂｓｐ１２０Ｉ、ＢｓｒＧＩ、およびＳｐｅＩ（Ｆａｓｔｄｉｇｅｓｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用する制限酵素消化により検証した。プレーティングされていない形質転換細菌を、マキシプレップとして一晩成長させ、ＺｙｍｏＰＵＲＥ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して精製した。
ＡＡＶ産生－ライブラリ

【0143】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１７５ｃｍの細胞培養フラスコに播種して、トランスフェクション前に６０～８０％の培養密度に到達させた。２５μｇ、２５０ｎｇまたは２５ｎｇのＡＡＶプラスミドライブラリ、および４６μｇのｐＨＧＴＩ－ａｄｅｎｏ１^１８をリン酸カルシウムを使用してトランスフェクトした。ＡＡＶプラスミドライブラリ：ｐＨＧＴＩ－ａｄｅｎｏ１のモル比は、それぞれ１：１、０．０１：１（３０ｃｐｃ）、または０．００１：１（３ｃｐｃ）であった。１：１の比率は、各単一の粒子がキメラ変異カプシドタンパク質を含む可能性が高い、キメラＡＡＶライブラリを受け取ると予想された。０．０１：１および０．００１：１の比率は、細胞がＡＡＶプラスミドライブラリから約１つのメンバーを受け取り^６、その後を受け取るようにすると仮定された。クリーンなＡＡＶライブラリ中で、各単一粒子は、同じ変異カプシドタンパク質および一貫したバーコードで構成された。ウイルスライブラリを、以前に記述されているように、イオジキサノール勾配を使用して回収し、精製した^３１。ＡＡＶゲノム力価を、リアルタイムＰＣＲを使用して、記載されるようにベクターＤＮＡの定量化により決定した^３２。
ＡＡＶプラスミドライブラリの配列決定

【0144】

プラスミドライブラリのペアエンドイルミナシーケンスを容易にするために、ＡＡＶプラスミドの一部をＣｒｅ－リコンビナーゼにより切り出して、挿入されたペプチド配列およびバーコードを共に近づけた（図１）。１．５μｇのＤＮＡを、６ＵのＣｒｅ－レコンビナーゼ（ＮＥＢ）と共に１００μｌの容量で３７℃で１時間インキュベートした。反応を７０℃で１０分間停止し、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５（ＺＹＭＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により精製した。産生物をＢｓｉＷＩおよびＭｕｎＩを使用して消化し、アガロースゲルで泳動し、所望の断片を選択し、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して精製した。ゲル抽出産生物を、ＰｒｅＣＲ Ｒｅｐａｉｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使用してＰｒｅＣＲ Ｒｅｐａｉｒに供した。５０μｌの反応液中で、５０ｎｇのＤＮＡ、１００μＭのｄＮＴＰおよび１Ｘ ＮＡＤ^＋を１ＸのＴｈｅｒｍｏＰｏｌバッファーにて３７℃で２０分間インキュベートした。５μｌのＰｒｅＣＲ修復ＤＮＡを、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＳＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、Ｐ５／Ｐ７イルミナプライマーＰ１１と、Ｐ１２、Ｐ１３、Ｐ１４、Ｐ１５の混合物によりＰＣＲした。この場合も、ＰＣＲにおける断片間の組換えを減らすために、エマルジョンＰＣＲを実施した。エマルションは前述のように作製した。ＰＣＲサイクルは、９８℃で３０秒を１サイクル、９８℃で５秒、６３℃で１５秒、および７２℃で３分（通常の伸長時間の８倍）を１８サイクル、ならびに７２℃で５分を１サイクルであった。エマルションを破壊し、産生物を前述のように精製し、ＰｒｅＣＲ Ｒｅｐａｉｒを実行した。前のステップからの５μｌのＰｒｅＣＲ修復ＤＮＡを、Ｎｅｘｔｅｒａ（商標）ＸＴインデックスキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、次のエマルジョンＰＣＲで使用してＮｅｘｔｅｒａ ＸＴインデックスを追加した。ＰＣＲプログラムは、９８℃で１分を１サイクル、９８℃で１５秒、６５℃で２０秒、および７２℃で３分（通常の伸長時間の８倍）を１０サイクル、ならびに７２℃で５分を１サイクルであった。Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴインデックスエマルジョンＰＣＲからの産物を精製し、ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔキット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｕｌｔｅｒ）を使用してサイズ選択した。精製されインデックス化されたＰＣＲ産物を、１５０ｂｐペアエンドシーケンシングによるＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して配列決定した。
ＲＮＡ由来のバーコードの配列決定

【0145】

全ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従いＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、脳組織、初代ニューロンおよびＨＥＫ２９３Ｔ細胞から単離した。ＲＮＡサンプルをＤＮａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ）とインキュベートして、ＤＮＡ混入を除去した。５μｇのＲＮＡを１ユニットのＤＮａｓｅ Ｉと１Ｘ ＤＮａｓｅ Ｉ反応バッファー中でインキュベートして、最終容量を５０μｌにし、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、０．５μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを加え、次いで７５℃で１０分間熱失活させた。ＤＮａｓｅ Ｉで処理されたＲＮＡを、製造業者の推奨に従いｑＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｑｕａｎｔａ）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。２μｌのｃＤＮＡを次に、プライマーＰ１６およびＰ１７を使用するＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲプログラムは、９８℃で３０秒の１サイクル、９８℃で５秒の３５サイクル、６５℃で１５秒、７２℃で３０秒、続いて７２℃で５分を１サイクルであった。バーコードを含むＰＣＲ産物を、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してゲル抽出により精製した。２０ｎｇの精製されたＤＮＡを、プライマーＰ１８と、Ｐ１２、Ｐ１３、Ｐ１４、Ｐ１５の等しい混合液を使用するＰ５／Ｐ７ ＩｌｌｕｍｉｎａアダプターＰＣＲに供した。ＰＣＲサイクルは、９８℃で３０秒を１サイクル、９８℃で５秒を１０サイクル、６５℃で１５秒、７２℃で３０秒、続いて７２℃で５分間の１サイクルであった。ＰＣＲ産物を、前述のとおりゲル抽出により精製した。続いて、Ｎｅｘｔｅｒａ（商標）ＸＴ Ｉｎｄｅｘ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してＮｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｉｎｄｅｘ ＰＣＲを実施した。ＰＣＲプログラムは、９８℃で１分の１サイクル、９８℃で１５秒の６サイクル、６５℃で２０秒、７２℃で１分、続いて７２℃で５分の１サイクルであった。ＰＣＲ産物を、ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して精製した。精製したＰＣＲ産物を、７５ｂｐのペアエンドリードによるＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ（商標）５００／５５０ Ｍｉｄ Ｏｕｔｐｕｔ Ｋｉｔ ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して配列決定した。
ウイルスライブラリの配列決定

【0146】

２つのＡＡＶバッチを産生した（産生方法については、「ＡＡＶ産生カプシド検証研究」を参照のこと）、カプシドおよびバーコードを含むプラスミドの１００倍希釈（３０ｃｐｃ）を含む１つのバッチと、同じプラスミドの１０００倍希釈（３ｃｐｃ）（「ＡＡＶ 産生－ライブラリ」中の２５０ｎｇおよび２５ｎｇに対応）。産生、精製および滴定の後に、両方のバッチをＤＮａｓｅＩで処理し、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋにより溶解させた。ウイルス溶解物を２ラウンドのＰＣＲに供して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ互換のＰ５／Ｐ７配列およびＮｅｘｔｅｒａＸＴインデックスを追加し、ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｕｌｔｅｒ）を使用して精製した。精製しインデックス化したサンプルを、７５ｂｐのペアエンドリードによるＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ（商標）５００／５５０ Ｍｉｄ Ｏｕｔｐｕｔ Ｋｉｔ ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して配列決定した。
ヒトＥＳ細胞の形質導入

【0147】

ヒトＥＳ細胞をドーパミン作動性前駆細胞に分化させた^３６。分化が開始して４２日後に、細胞を、５ｘ１０^８ｇｃ／ウェルを使用してｓｃＡＡＶ－ＧＦＰで形質導入し、一晩インキュベートした。形質導入の７２時間後に、細胞を４％ＰＦＡで固定し、Ｍａｐ－２、チロシンヒドロキシラーゼ、およびＤＡＰＩについて染色した（免疫組織化学を参照）。合計で２９の異なるＡＡＶカプシドを検証した。細胞をＣｅｌｌｏｍｉｃｓ ｒｏｐｈｏｓ Ｐｌａｔｅ ｒｕｎｎｅｒおよび共焦点顕微鏡で分析した。
データ評価ワークフロー

【0148】

完全な相互作用のないワークフローを、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒリポジトリからの複数のパッケージと共にＲ統計パッケージを使用して実装した。これらのスクリプトから、様々なユーティリティの外部アプリケーション（ｂｂｍａｐ、Ｂｌａｓｔ、Ｓｔａｒｃｏｄｅ^３７、ｂｏｗｔｉｅ２、ｓａｍｔｏｏｌｓ、Ｗｅｂｌｏｇｏ３、およびＨａｍｍｏｃｋ^３８）を呼び出し、出力を、さらなる分析のためにＲに返した。これは、https://bitbucket.org/MNM-LU/aav-libraryのＧｉｔリポジトリとして、および自己維持型のＤｏｃｋｅｒイメージＢｊｏｒｋｌｕｎｄ／ａａｖｌｉｂ：ｖ０．２として公開されている。

【0149】

簡潔に言うと、バーコードおよび配列の同定、トリミング、ならびに品質のフィルタリングを、既知の骨格配列とリードのｋｍｅｒｅマッチングを可能にする、ｂｂｍａｐソフトウェアパッケージ^３９を使用して行った。バーコードのリードの大多数を２０の長さに対して配列決定し、長さが異なるバーコードのほとんどが１９ｂｐの長さとなるため、この研究におけるすべての分析では、１８≦ＢＣ≦２２の長さフィルターを適用した。

【0150】

ペプチド配列断片を、ｂｂｍａｐソフトウェアパッケージを使用して同様に単離したが、今回はいずれの長さ制限も適用せず、次いでｂｌａｓｔｎを使用して参照ペプチドにアラインした。

【0151】

Ｒベースの分析フレームワークの主要コンポーネントは、ＭａｐＲｅｄｕｃｅプログラミング哲学の並列化された実装である^{４０，４１}。このプロセスの詳細については、^１７を参照のこと。このプロセスでは、最初にＢｏｗｔｉｅ２を使用して、合成ペプチドストレッチをタンパク質参照配列にアラインし、次に、ｂｌａｓｔｎを使用して、配列決定された断片をペプチドにマッピングし、最後に、専用のＲワークフローを実装して、ＰＣＲベースのサンプル調製において鋳型の切り替えを介して生成された誤ったリードをフィルタ処理した純粋なシーケンス結果を選択して、ＣｕｓｔｏｎＡｒｒａｙオリゴヌクレオチド合成から生じる変異を同定した。

【0152】

Ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのサンプルから、ＡＡＶ由来のバーコードをターゲットシーケンシングによって同定し、選択されたタンパク質内のそれぞれの断片およびその起源に戻ってマッピングした。次に、輸送の有効性を定量化し、最も効率的な候補を特定してマッピングした。並行して、バーコードカウントをペプチドａａ配列と共にＨａｍｍｏｃｋツール^３８に送り、コンセンサスモチーフを、Ｗｅｂｌｏｇｏ３を使用して視覚化した。
結果
ウイルスベクターライブラリの作製

【0153】

第１のステップとして、シナプスへの親和性が実証されている１３１のタンパク質を文献から特定した（図１Ａ）。これらは４つの主要な群、ウイルス由来（カプシドおよびエンベロープ）タンパク質、宿主由来タンパク質（ニューロトロフィンおよび疾患関連タンパク質、例えばタウ）、神経毒およびレクチン、に分類される。１３１のタンパク質のＮＣＢＩ参照配列を、アミノ酸配列に翻訳し、１ａａシフティングスライディングウィンドウアプローチにより計算的に１４ａａの長いポリペプチドに消化した（図１Ｂの１）。合計で生成された６１３１４個のペプチドは、４４７０８個の固有のポリペプチドを含んだ。３つの代替的リンカー：単一のアラニン（１４ａａと呼ばれる）、５つのアラニン残基（１４ａａＡ５）を有するリッジリンカー、およびａａ配列ＧＧＧＧＳ（１４ａａＧ４Ｓ）を有する柔軟なリンカー、をポリペプチドに追加した（図１Ｂの２）。ａａペプチドの最後の群を、２２ａａの長さおよび単一のアラニンリンカーを有して同様に生成した（２２ａａと呼ぶ）。合計９２３４３のａａ配列を次に、ヒト細胞での発現用にコドン最適化し、末端にオーバーハングを付加して、Ｎ５８７位でＡＡＶ２ Ｃａｐ遺伝子中への、方向性があり瘢痕（ｓｃａｒ）のないギブソンアセンブリクローニングを可能にした（図１Ｂの３）。全長１７０ｂｐの得られたオリゴをすべて、ＣｕｓｔｏｍＡｒｒａｙオリゴヌクレオチドアレイ上で並行して合成した。
ＢＲＡＶＥアプローチのための非常に多様なＡＡＶカプシドライブラリの作製

【0154】

ペプチドがＮ５８７で提示され、かつペプチド関連バーコードが同時にＡＡＶゲノムＵＴＲに挿入されるＢＲＡＶＥアプローチ用のＡＡＶライブラリを開発するために、最初に新しい骨格プラスミドを生成した。この骨格プラスミドにおいて、ＭＭＴＶプロモーターの制御下にあるＡＡＶパッケージング遺伝子（Ｒｅｐ、Ｃａｐ、およびＡＡＰ）と、変異された反転末端反復（ＩＴＲ）が隣接するＧＦＰ発現カセットとを組み合わせ、破壊された（ｇｕｔｔｅｄ）自己相補的ＡＡＶゲノムを形成した^{１５，１６}。

【0155】

ペプチド配列を組み込むために、オリゴヌクレオチドプールが挿入されたＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸Ｎ５８７にＮｈｅＩ部位を導入した^１１。この制限部位の付加は、野生型ＡＡＶ２ヘパラン硫酸プロテオグリカンの結合特性を変異させ^１２、このバリアントを、これ以降、ＡＡＶ－ＭＮＭｎｕｌｌと呼ぶ。

【0156】

得られたオリゴヌクレオチドのプールを、ＡＡＶ産生骨格に組み込んだ（図１Ｂの４）。２０ｂｐランダム分子バーコード（ＢＣ）を、４断片ギブソンアセンブリ反応を使用して、ＧＦＰ遺伝子の３’ＵＴＲに同時に挿入した。一方向のＣｒｅ組換えアプローチを使用し、その後、ｅｍＰＣＲベースのイルミナシーケンスアダプターを付加し、次に、ペプチドのプール全体を、ランダムバーコードをルックアップテーブル（ＬＵＴ）のそれぞれのペプチドに連結するペアエンドシーケンスを使用して、配列決定した（図１Ｂ５ａ）。このアプローチは、ＰＣＲ中の鋳型の切り替えを回避し、挿入された断片に対しバーコードをほぼ完全に一致させることができる（図示せず）^１７。結果として得られたライブラリは、ペプチドおよびバーコードの３９３４５７０の固有の組み合わせを含み、９０６３５の設計された断片（したがって、９８％を超える回収率）を含みバーコードによる５０Ｘのオーバーサンプリングに近かった。後者は、以下のバイオインフォマティクスプロセスにおけるノイズフィルタリング、エラー修正、および変異のマッピング（カスタムアレイで生成）に不可欠である。ＬＵＴの作製と並行して、同じプラスミドライブラリを使用して、複製欠損ＡＡＶウイルスベクターのプレップを生成する。この場合、ペプチドはカプシド表面に提示され、バーコードはＡＡＶゲノムの一部としてパッケージ化される（図１Ｂの５ｂ）。次に、複数の並行スクリーニング実験をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で実行し、適切な選択（例えば、標的脳領域の切開）を行った後、ｍＲＮＡを抽出し、発現したバーコードを配列決定した。配列決定したバーコードとＬＵＴとの組み合わせにより、効果を、元の１３１のタンパク質（図１Ｂの６）に戻ってマッピングでき、かつコンセンサスモチーフを、Ｈａｍｍｏｃｋ、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースのクラスター化アプローチ（図１Ｂの７）を使用して決定できる。
ＡＡＶライブラリの作製

【0157】

ＡＡＶ粒子ライブラリを作製するために、ＡＡＶプラスミドライブラリをアデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＨＧＴＩ－ａｄｅｎｏ１）と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクションした^１８。ＡＡＶライブラリプラスミドを、非常に低濃度で供給して、プロデューサー細胞がＡＡＶプラスミドライブラリからの少数（または単一）のカプシドバリアントを確実に生成すること^６、１９、すなわち、生成された各単一のビリオンは、同じ突然変異カプシドタンパク質のみで構成され正しいバーコードをパッケージ化することを、確実にする。１細胞あたり３または３０コピー（ｃｐｃ）のＡＡＶプラスミドライブラリを産生に使用し、力価２．５ｘ１０^１２および４．４ｘ１０^１０ＧＣ／ｍｌを有する２つのＡＡＶライブラリ（それぞれＡＡＶ－ＭＮＭｌｉｂ［３０ｃｐｃ］およびＡＡＶ－ＭＮＭｌｉｂ［３ｃｐｃ］）を得た。いずれのペプチドが正しいアセンブリおよびゲノムのパッケージ化を可能にするかを評価するために、両方のバッチをＤＮａｓｅ処理し（パッケージ化されていないゲノムを削除するため）、バッチを溶解し、プレップからバーコードを個別にシーケンスした。発現されたバーコードの多様性が非常に高いため、バーコードにおける重複は、産生物間で小さかった（図１Ｃ）。しかし、３ｃｐｃバッチにパッケージ化されたすべてのペプチドの絶対的な大部分も、３０ｃｐｃバッチで回収した（図１Ｃ）。ＡＡＶ－ＭＮＭｌｉｂ［３０ｃｐｃ］ライブラリの成体ラットの前脳への注射は、挿入されたペプチドが、ＡＡＶ２－ＷＴベクターと比較して、形質導入の広範な広がりと接続求心性領域への逆行性輸送の両方を伴う、形質導入パターンにおける著しい変化をもたらすことを明らかにした（図１Ｄ）。ニューロンのｉｎ ｖｉｖｏでの効率的な逆行性輸送を可能にする個々の新規ＡＡＶカプシド構造をスクリーニングするために、動物がＡＡＶ－ＭＮＭｌｉｂ［３０ｃｐｃ］またはＡＡＶ－ＭＮＭｌｉｂ［３ｃｐｃ］ライブラリプレップのいずれかから線条体に同じライブラリ注射を受ける、大規模な実験を実施した（図１Ｅ）。注射後８週間で、全ＲＮＡを線条体組織、眼窩前頭皮質（ＰＦＣ）、視床（Ｔｈａｌ）、中脳領域（ＳＮｐｃ）と注射された線条体（Ｓｔｒ）組織から抽出し、その後転写されたバーコードからのｃＤＮＡのＲＴ－ＰＣＲおよび超並列シーケンスを行った。異なる解剖領域において回収された固有のペプチドの分析は、挿入されたペプチドの約１３％がｉｎ ｖｉｖｏにおいて効率的な形質導入を促進し、約４％が逆行性輸送を促進することを明らかにした。

【0158】

この実施例は、本明細書に記載の方法によって生成されたライブラリを使用して、カプシド上に提示されたときにウイルス粒子に所望の特性を潜在的に付与するペプチドを同定できることを示す。
実施例２－ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの単一世代ＢＲＡＶＥスクリーニング
材料および方法
ＡＡＶ産生－カプシド検証研究

【0159】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１７５ｃｍの細胞培養フラスコに播種して、トランスフェクション前に６０～８０％の培養密度に到達させた。トランスフェクションの２時間前に、培地を２７ｍｌの新鮮なダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓと交換した。ＡＡＶを、３プラスミド系（トランスファーベクター、改変ＡＡＶカプシド、ｐＨＧＴ－１アデノウイルスヘルパープラスミド、比率１．２：１：１）を使用する標準ＰＥＩトランスフェクション^３３を使用して産生した。ＰＥＩおよびプラスミドを、３ｍｌ ＤＭＥＭ中で混合し、１５分間インキュベートした後、細胞に添加した。トランスフェクションの１６時間後に、２７ｍｌの培地を除去し、等量のＯｐｔｉＰＲＯ無血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＋Ｐ／Ｓを加えた。ＡＡＶを、トランスフェクションの７２時間後に、ポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ８０００）沈殿およびクロロホルム抽出を使用して採取し、その後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５遠心フィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でＰＢＳ交換した^３４。精製されたＡＡＶを、プロモーターまたは導入遺伝子に特異的なプライマーによるｑＰＣＲを使用して力価測定した。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ感染

【0160】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳおよびＰ／Ｓ中で培養した。初代皮質ニューロンを、前述^３５のように胚性ラット（Ｅ１８）または１日齢の新生児マウスから単離し、黒い９６ウェル平底培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ）でＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７培地中にて培養した。細胞を、２ｘ１０^６、２ｘ１０^７および２ｘ１０^８ｇｃ／ウェルで形質導入した。ＡＡＶを培地に加え、細胞を一晩インキュベートした。翌日、ＡＡＶ含有培地を新しい培地と交換した。細胞を、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＰｌａｔｅ Ｒｕｎｎｅｒ（Ｔｒｏｐｈｏｓ）を使用して、トランスフェクションの７２時間後に分析した。
研究動物

【0161】

この研究で使用した成体の雌Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（２２５～２５０ｇ）は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、温度制御された部屋で１２時間の明サイクル／１２時間の暗サイクル下で食物および水を自由に摂取できる状態で飼育した。この研究で実施されたすべての実験手順は、Ｌｕｎｄ－Ｍａｌｍｏ地域の実験動物の使用に関する倫理委員会によって承認された。
定位ＡＡＶ注射

【0162】

すべての外科的処置を、腹腔内注射された、クエン酸フェンタニル（フェンタニル）と次亜塩素酸メデトミジン（Ｄｏｒｍｉｔｏｒ）の２０：１混合液による全身麻酔下で行った。すべての定位注入のターゲット座標を、ブレグマに関連して識別した。頭蓋骨に小さい穴を開け、ベクター溶液を、ガラス毛細管（内径６０～８０μｍおよび外径１２０～１６０μｍ）を備え自動注入ポンプに接続される２５μｌハミルトンシリンジで注射した。注射を、片側（右側）または両側のいずれかで行った。ＡＡＶライブラリを、線条体の片側におよび次の座標で注射した：前後＋１．２ｍｍ、内側外側－２．４ｍｍ；背腹－５．０／－４．０ｍｍ；歯棒、－３．２ｍｍ。候補ＡＡＶベクターは、前後＋１．２ｍｍ、内側外側－２．４ｍｍ；背腹－５．０／－４．０ｍｍ、および前後＋０．０ｍｍ；中外側－３．５ｍｍ；背腹－５．０／－４．０ｍｍ；歯棒－３．２ｍｍ。ＭＮＭ－００４－ＧＦＰとＡＡＶ－２ Ｒｅｔｒｏ－ｍＣｈｅｒｒｙの比較ベクター分析、およびＭＮＭ－００４－ＧＦＰとＭＮＭ－００４ ｍＣｈｅｒｒｙの左右の比較は、前後＋１．２ｍｍ、中外側－２．４／＋２．４ｍｍ；背腹、－５．０／－４．０ｍｍで注射した。ＭＮＭ－００８、ＡＡＶ－Ｒｅｔｒｏ、およびＡＡＶ－２の間の線条体から中脳ドーパミン作動性ニューロンへの逆行性輸送の比較分析のために、ＴＨ－ｃｒｅ動物に次の座標の２つの部位でＣＴＥ－ＧＦＰベクターを一方的注射した：前後＋０．８／－０．２ｍｍ；内側外側－３．０／－３．７ｍｍ；背腹、－５．０／－５．０／－４．０ｍｍ。ＢＬＡ修飾動物には、ＭＮＭ－００４ベクターを前後＋１．２ｍｍ、内側外側－２．４ｍｍ、背腹－５．０／－４．０ｍｍ；歯棒－３．２ｍｍに、ＡＡＶ－８ベクターを前後－２．２ｍｍ、内側外側＋／－４．８ｍｍ、背腹－７．４ｍｍ、歯棒－３．２ｍｍで注射した。ＡＡＶライブラリ動物の場合、各ラットは５μｌの、ＡＡＶプラスミドライブラリの３０ｃｐｃまたは３ｃｐｃのカプシド濃度を有するＡＡＶライブラリの２．５ｘ１０^１０または４．４ｘ１０^８のベクターゲノムの用量でのベクター溶液、および通常量のｐＨＧＴＩ－ａｄｅｎｏ１プラスミドを受けた。候補ベクター動物は、注入部位ごとに２μｌのベクターを受け、ＢＬＡ修飾動物の動物には、線条体において３μｌのＭＮＭ－００４およびＢＬＡにおいて３μｌのＣｒｅ誘導性ＤＲＥＡＤＤ ＡＡＶ－８ ＤＩＯ－ｈＭ３Ｄｑ／ｒＭ３Ｄを注射した。線条体に注射されたベクター間の比較分析では、２．３ｘ１０^１２のベクターゲノムのウイルス量を、デポジット部位あたり合計量１μｌで注射した。すべての注入を、０．２ｍｌ／分の速度で行い、針を、さらに３分間留置した後ゆっくりと引き抜いた。手術後に、外科用ステープルを使用して創傷を閉じ、覚醒するまで動物を加熱マットの上に置いた。
組織処理

【0163】

注射８週間後に、脳を、その後の死後分析に従って処理した。ＲＮＡ抽出では、ＣＯ_２を使用して動物を屠殺し、脳を取り出し、脳モールドを使用して厚さ２ミリメートルのスライス片へと、冠状軸でスライスした。線条体組織、眼窩前頭皮質、視床および中脳領域を迅速に解剖し、個別にドライアイスで凍結し、ＲＮＡ抽出まで－８０℃で保存した。免疫組織化学的分析のために、動物を、ペントバルビタールナトリウムの過剰摂取（Ａｐｏｔｅｋｓｂｏｌａｇｅｔ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって深く麻酔し、５０ｍｌの生理食塩水、その後新たに調製した氷冷４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含む、ｐＨ＝７．４に調整した０．１Ｍリン酸緩衝液２５０ｍｌで経心臓的に灌流した。次に、脳を取り出し、冷ＰＦＡでさらに２時間後固定した後、さらなる処理まで少なくとも２４時間にわたり凍結保護用の２５％緩衝ショ糖中に保存した。残りのＰＦＡ固定脳を、凍結ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ ＳＭ２０００Ｒ）を使用して３５ｍｍの厚さの冠状切片に切断し、８シリーズに収集し、－２０℃にて不凍液（０．５Ｍリン酸ナトリウムバッファー、３０％グリセロール、および３０％エチレングリコール）中で保存した。
免疫組織化学

【0164】

免疫組織化学分析のために、組織切片をＴＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄（３ｘ）し、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチし組織透過性を高めるために、０．５％ＴＢＳ Ｔｒｉｔｏｎ溶液中の３％Ｈ２Ｏ２中で１時間インキュベートした。別の洗浄ステップの後、切片を５％ウシ血清でブロックし、１時間インキュベートした後、一次モノクローナル抗体と一晩インキュベートした。ＧＦＰ発現を評価するために、ニワトリ抗ＧＦＰの一次抗体（１：２００００；ａｂ１３９７０、Ａｂｃａｍ）を使用して、脳切片に対して免疫組織化学を実施した。ｒＭ３Ｄ発現ニューロンを、ＨＡタグ（マウス抗ＨＡ、Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ、カタログ番号ＭＭＳ－１０１Ｒ－２００ ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１００６４２２０、１：２０００）の染色によって識別した。ｈＭ３Ｄ発現ニューロンを、ｍＣｈｅｒｒｙの染色によって識別した（ヤギ抗ｍＣｈｅｒｒｙ、ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃａｔ＃ＬＳ－Ｃ２０４２０７、１：１０００）。一晩インキュベートした後、ＴＢＳ（ｘ３）を使用して一次抗体を洗い流し、二次抗体と２時間インキュベートした。３、３０－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）免疫組織化学では、ビオチン化抗マウス（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃａｔ＃ＢＡ－２００１ ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２３３６１８０、１：２５０）、抗ヤギ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ Ｃａｔ＃７０５－０６５－１４７ ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２３４０３９７、１：２５０）および抗ニワトリ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃａｔ＃ＢＡ－９０１０ ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２３３６１１４、１：２５０）二次抗体を使用した。蛍光顕微鏡分析またはビオチン化ヤギ抗ニワトリ（１：２５０；ＢＡ９０１０、Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。ＤＡＢ免疫組織化学では、ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ）を二次抗体のインキュベーション後に使用して、ストレプトアビジン－ペルオキシダーゼコンジュゲートを介して染色強度を増幅した後、０．０１％Ｈ_２Ｏ_２中で発色させた。
一次グリアおよび最終分化ニューロンの免疫細胞化学

【0165】

ｈＥＳＣから分化した一次グリアおよびニューロンにおけるベクター形質導入効率の分析は、免疫蛍光検出を利用した。最初に培地を除去し、細胞を１ｘＰＢＳで洗浄した。次に、細胞を含む各ウェルに１００μｌの４％ＰＦＡを加え、３７度で１０分間インキュベートした。インキュベーション後に、細胞をＰＢＳで洗浄した。次に、固定した細胞培養物を、ウェルあたり５％ＢＳＡおよび０．２５％トリトン－ｘを含むＫＰＢＳからなる１００μｌのブロッキング溶液を使用して、室温で１時間ブロックした。ブロッキング溶液を除去し、一次抗体を含むＰＢＳに置き換え、４℃で一晩インキュベートした。グリア細胞を、次の抗体を使用して識別した：ウサギ抗ＧＦＡＰ（１：１０００；ａｂ７２６０、Ａｂｃａｍ）およびウサギ抗ＩＢＡ－１（１：２０００；０１９－１９７４１、Ｗａｋｏ）。一晩インキュベートした後、ウェルをＫＰＢＳで２回洗浄し、次に、ＫＰＢＳで二次抗体と共に、室温で合計２時間インキュベートした。使用した二次抗体は、Ａｌｅｘａ結合抗ウサギ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ Ｃａｔ＃７１１－１６５－１５２ ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２３０７４４３、１：２５０）を含んだ。最後に、細胞をＫＰＢＳ中で２回洗浄し、画像分析のためにＫＢＰＳ溶液に残した。
レーザー走査型共焦点顕微鏡

【0166】

すべての免疫蛍光分析を、Ｌｅｉｃａ ＳＰ８顕微鏡を使用して行った。共焦点画像を常に、レーザーが順次モードでアクティブになるように設定されたＨｙＤ検出器を使用してキャプチャし、蛍光信号の漏れを回避した。４０５、４８８、５５２、および６５０ｎｍの波長で固体レーザーを使用して、それぞれのフルオロフォアを励起した。ピンホールを、すべての画像取得で常にＡｉｒｙ１で保持した。取得後、デコンボリューションを、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ－Ｌｕｃｙアルゴリズムを利用するＩｍａｇｅＪの「Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ」プラグイン（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ［ＢＩＧ］－ＥＰＦＬ-Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによって開発された、http://bigwww.ep.ch/）を使用して、かつＰＳＦ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（ＢＩＧ，ＥＰＦＬ-Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ http://bigwww.ep.ch/algorithms/psfgenerator/）でギブソンモデルおよびランニモデルを使用して特定のイメージング機器について計算した点像分布関数（ＰＳＦ）を適用して、実行した。
結果

【0167】

次に、ＢＲＡＶＥ技術を利用して、ＨＳ結合がＡＡＶ－ＭＮＭｎｕｌｌカプシドで変異されたときに喪失した、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対するトロピズムの再導入（図２Ｂ）をスクリーニングした（図２Ｂ’）。４００万個の独自にバーコード化されたカプシドバリアントのスクリーニングで、親ＡＡＶ－ＭＮＭｎｕｌｌカプシド構造よりも大幅に改善された感染力が付与された１３１の含有タンパク質からいくつかの領域を発見した（図示せず）。ＨＳＶ－２表面タンパク質ｐＵＬ４４から１つのペプチドを選択し、ＡＡＶ－ＭＮＭ００１と名付けた最初の新規カプシドを生成した（図２Ａ）。このカプシドは、個別にＣＭＶ－ＧＦＰパッケージ化に使用した場合、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して著しく増加したトロピズムを示した（図２Ｂ’’）。２番目の実験で、ＢＲＡＶＥ技術を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの初代皮質ラットニューロンの感染力を改善した。ＡＡＶ２－ＷＴおよびＡＡＶ－ＭＮＭｎｕｌｌの両方のベクターは、非常に低い初代ニューロンの感染力を呈し（図２Ｄ～Ｄ’）、ＡＡＶ－ＭＮＭ００１は、ある程度の改善（図２Ｄ’’）を示す。ＢＲＡＶＥスクリーニングを介して、ＨＳＶ－２ ｐＵＬ１タンパク質のＣ末端領域に集まる複数のペプチドを確認し（図２Ｃ）、それは、新規のＡＡＶカプシド（ＡＡＶ－ＭＮＭ００２）で単独で使用された場合に、培養中の一次ニューロンの感染力を劇的に改善した（図２Ｄ’’’）。単一世代のＢＲＡＶＥスクリーニングの有効性を実証する、これらの２つの概念実証研究の後で、逆行性輸送能力が改善された新規ＡＡＶカプシドを発見するために、フルスケールのｉｎ ｖｉｖｏ ＢＲＡＶＥスクリーニングを確立した（図示せず）。このスクリーニングから、すべてが複数のバーコードで表され複数の動物で見つかった１９のタンパク質から２３のペプチドを選択した。２５個のｄｅ ｎｏｖｏ ＡＡＶカプシド構造の２３個は、ＡＡＶ２－ＷＴと同等であるかまたはそれより高いパッケージング効果を可能にした（図２Ｅ）。逆行性輸送能力を有するすべてのペプチドのＨａｍｍｏｃｋの隠れマルコフモデルに基づくクラスター化を使用して、２３の血清型のそれぞれについて推定コンセンサスモチーフを決定し、指向最適化の基礎を提供できた。
Ｉｎ ｖｉｖｏでの逆行性輸送のためのＡＡＶ－ＭＮＭ００４カプシドの特徴付け

【0168】

ＨＳＶ ｐＵＬ２２タンパク質のバイオインフォマティクス分析で、タンパク質のＣ末端領域は、すべての求心性領域（皮質、視床および黒質）への再現可能な輸送を示し、一方で線条体の注射部位では、同じバイアスを示さない（図３Ａ）。これらの特性を呈するすべてのペプチドのＨＭＭクラスター化は、２つの重複するコンセンサスモチーフを明らかにした（図３Ｃ）。これらは、ＡＡＶ－ＭＮＭ００４およびＡＡＶ－ＭＮＭ０２３カプシド構造内にそれぞれ生成され、いずれもｉｎ ｖｉｖｏで同様の輸送パターンを呈し（図示せず）、ＡＡＶ－ＭＮＭ００４カプシドはより強力な輸送能力および注射部位でのより少ない広がりを示す。ＡＡＶ－ＭＮＭ００４カプシドは、内側嗅内皮質まで遡るすべての求心性領域への逆行性輸送を促進し、親ＡＡＶ２－カプシドは、注射部位において効率的な形質導入を促進したが、ベクターの逆行性輸送は、ごくわずかであった（図３Ｄ）。この作業をまとめている間に、ＡＡＶ２カプシド表面（ＡＡＶ２－Ｒｅｔｒｏ）の同じ場所に提示されると強い逆行性輸送を促進する、別のペプチドが公開された^９。Ｉｎ ｖｉｖｏで比較すると、ＡＡＶ－ＭＮＭ００４カプシドは、同じ動物の反対側の線条体にレトロペプチド（Ｒｅｔｒｏ）を注射したＡＡＶ２カプシドと比較して、非常に類似した逆行性輸送特性を呈した（図示せず）。この２つのフルオロフォアの両側注射アプローチにより、ＰＦＣ、視床の層内核、および扁桃体基底外側（ＢＬＡ）を形成する十字形対同側突出を効率的に視覚化できた。

【0169】

この実施例は、カプシド上に提示されたときに改変カプシドに所望の特性を付与するタンパク質の断片を同定することによって、改善された特性を有する改変カプシドを設計できることを示す。
実施例３－ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で、アルツハイマー病に関与するタンパク質の機能をマッピングし理解するためのＢＲＡＶＥアプローチの利用

【0170】

ＢＲＡＶＥアプローチは、ｉｎ ｖｉｖｏで体系的にタンパク質機能をマッピングする固有の可能性を提供する。したがって、このアプローチを利用して、アルツハイマー病に関与する内因性タンパク質（ＡＰＰおよびタウ）からのペプチドを提示し、これらのタンパク質由来のいずれかのペプチドがＡＡＶカプシドの逆行性輸送を促進できしたがってアルツハイマー病におけるこれらのタンパク質の提唱された細胞間コミュニケーションの根底にあるメカニズムへの洞察を提供できるかを調べた（図４）。ＡＰＰのマッピングで、ｓＡＡＰ Ｎ末端領域に１つおよびアミロイドβ領域（図示せず）に１つ、逆行性輸送を付与する２つの領域を発見した。興味深いことに、ｓＡＰＰ領域は、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（ＴＭＥＶ）由来のＶＰ１タンパク質の領域と有意な配列相同性を共有し、それはその軸索を取り込みおよび感染力を駆動していると考えられる（図４Ａ）。微小管関連タンパク質タウに由来するペプチドの機能的特性は、さらに顕著であった。このタンパク質では、中央領域が非常に効率的な逆行性輸送を伝達した。より深い特徴付けの後、この領域は、３つの隣接する保存モチーフで構成され、３番目のモチーフは、ＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質（ニューロントロピズムを改善するためにレンチウイルスをシュードタイプするのによく使用される）およびＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質（図４Ｂ～Ｃ、Ｅ）と有意な相同性を共有する。２つの新規カプシド構造、ＡＡＶ－ＭＮＭ００９およびＡＡＶ－ＭＮＭ０１７を、この領域から生成した。新規カプシドはいずれも、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて逆行性輸送を促進したが、ＡＡＶ－ＭＮＭ０１７はさらなる興味深い特性も呈した。ＡＡＶ－ＭＮＭ０１７は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで非常に高い有効性で初代ニューロンおよび初代グリア細胞の両方に感染した。この特性を使用して、ＡＡＶ－ＭＮＭ０１７をタウ関連ペプチドから生成されないニューロトロフィン系ＡＡＶ－ＭＮＭ００２カプシド（図示せず）と比較する置換実験を行った。一次ニューロン集団の３つの群を、様々な組換えタウバリアント（Ｔ４４、Ｔ３９、およびＫ１８）で前処理した。Ｔ４４バリアントは、ＭＮＭ０１７対ＭＮＭ００２の感染力の比に明らかな影響を持たず、一方、Ｋ１８はＭＮＭ０１７の感染力を高め、Ｔ３９バリアントはＡＡＭ－ＭＮＭ００２と比較して感染力を効率的にブロックした。これは、ＡＡＶ表面の提示されたタウ由来のペプチドが、全長ヒトタウタンパク質の結合活性も有するニューロンの受容体を利用していること、しかしタウの翻訳後改変がこの機能にとって重要であり得ることを示唆する。生成された２４のｄｅ ｎｏｖｏカプシド構造（ＡＡＶ－ＭＮＭ００１－０２４）のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価で、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて一次グリア細胞への改善されたトロピズムを呈するそれらのサブセット（５つ）を発見した（図示せず）。感染力のほとんどはＧＦＡＰ陽性星状膠細胞であったが、そのうちのいくつかはＩＢＡ１陽性ミクログリアにも感染した。動物モデルを使用するｄｅ ｎｏｖｏカプシド設計の主要な障害は、ヒト細胞への翻訳に関して予測不可能であることであった。ＢＲＡＶＥアプローチは、人間の脳において既知の機能を有するウイルスおよびタンパク質から天然に生じるペプチドの使用によりこれを改善すると期待される。ヒト初代グリアでは、ＡＡＶ－ＭＮＭ０１７はその優れたトロピズムを保持する（図４Ｄ～Ｄ’’）。

【0171】

この実施例は、本明細書に開示された方法によって得られた改変ウイルス粒子を使用して、タンパク質機能を研究し、機能ドメインを一致させることができることを示している。
実施例４－ＢＲＡＶＥを使用したＡＡＶカプシドの再シャッフルの評価およびＤＡニューロンに感染するカプシドの生成

【0172】

成功した複数の研究は、血清型間でのＡＡＶカプシドの再シャッフリングを利用して、指向性進化を使用する新規カプシドを生成している。ここでは、ＢＲＡＶＥを利用して、他のＡＡＶ血清型からＡＡＶ２カプシドへペプチドが挿入される可能性を研究した（図５）。興味深いことに、Ｎ５８７ ａａに及ぶ同じ領域ＡＡＶ１、２および８からのペプチドの挿入は、ＡＡＶ２カプシド中に効率よく挿入された。しかし、ＡＡＶ９由来の同じ領域は、同じ機能を付与しなかった。さらに、ＶＰ１のＮ末端ドメイン（ＡＡＶカプシド表面に提示されることがまた知られる）由来の４つの追加領域も効率的に挿入できた。これらのドメインの３つはＡＡＶ１、６、８、９間で保存され、４つ目はＡＡＶ８には存在しなかった。最後のＢＲＡＶＥスクリーニング実験で、線条体出力領域への注射からの黒質のドーパミンニューロンへの効率的な逆行性輸送を備える新規ＡＡＶカプシドバリアントを開発することを目的とした。このスクリーニングで、近接したＣＡＶ－２カプシドタンパク質の２つの領域を同定した（図５Ａ～Ｂ）。興味深いことに、最初のペプチドは同じタンパク質の３番目の領域と有意な相同性を共有し（図５Ａ）、２番目のペプチド（図５Ｂ）は、レクチン大豆凝集素（ＳＡ）由来のペプチドモチーフを共有している。ＳＡもまた、シナプスからニューロンの細胞体へ効率的に輸送されるため、逆行性トレーサーとして使用できる^２０。ＣＡＶ－２は、ｉｎ ｖｉｖｏで終点からＤＡニューロンを標的化するためによく使用されるウイルスベクターであり^２１、したがってこの特性が、得られたＡＡＶ－ＭＮＭ００８カプシドバリアントで保持されたかどうかを確認する実験を行った。ＴＨ－Ｃｒｅノックインラットの線条体に注射されたＣｒｅ誘導性ＡＡＶゲノム（ＣＭＶ－ｌｏｘＰ－ＧＦＰ）を使用して、ＡＡＶ－ＭＮＭ００８が、同じゲノムを運搬するＡＡＶ２－ＷＴカプシド（図示せず）と比較して、黒質ニューロンの感染においてより効率的であることを見出した。この特性がげっ歯類のＤＡニューロンに限定されないことを確認するために、次いでＤＡ除神経、半パーキンソン病、免疫不全ラットにおいて実験を行った。これらの動物は最初に、Ｃｒｅ発現ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の分化により生成された、ＤＡ富化神経細胞移植を受けた。ニューロン移植の６か月後に、ＡＡＶ－ＭＮＭ００８ベクターを動物の前頭皮質に注射し、それはこの領域を支配する移植ニューロンに効率的に輸送され、パッケージされた（図５Ｃ～Ｃ’’）。二重蛍光免疫組織化学により、これらの細胞の大部分が実際にＴＨ陽性であり、それによりＤＡ産生性であると推定されたことを確認できた（図５Ｃ’～Ｃ’’）。同じｉｎ ｖｉｔｒｏ ｈＥＳＣ分化プロトコルを使用して、ｄｅ ｎｏｖｏカプシドバリアントのｉｎ ｖｉｔｒｏニューロントロピズムがヒト起源のニューロンでも維持されるかを評価した。実際に、初代げっ歯類ニューロンにおいて高いトロピズムを呈したいずれのバリアント（ＡＡＶ－ＭＮＭ００２、００８、および０１０）も、野生型ＡＡＶバリアントよりはるかに高いトロピズムを示した（図示せず）。注目すべきは、ＡＡＶ－ＭＮＭ００４カプシドバリアントは、ｉｎ ｖｉｖｏでは効率的であるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの形質導入にはまったく適していなかったことである（図示せず）。また、ヒト起源のＨＥＫ２９３Ｔ細胞内でＢＲＡＶＥによりスクリーニングしたＡＡＶ－ＭＮＭ００１は、初代ラットニューロンでは効率的でなかったが、ヒトニューロンでは非常に効率的であったことも興味深く（図示せず）、げっ歯類とヒトの細胞の受容体発現または構造に差があることを示唆し、したがってヒト細胞でまたはｉｎ ｖｉｖｏのヒト化系において直接スクリーニングすることの価値を示している。

【0173】

この実施例は、ウイルス粒子のトロピズムを改善するために本方法を使用できることを示している。
実施例５－扁桃体基底外側の機能的解剖および不安の発症におけるその関与
材料および方法
条件付け場所選好テスト

【0174】

条件付け場所嫌悪におけるＢＬＡの選択的ＤＲＥＡＤＤ活性化を評価するために、２チャンバーボックスを使用し、そのボックスでは各チャンバーが、閉じられたドアを有する壁によって区切られた。各チャンバーは、同じ光強度を維持しながら、壁に視覚的な手がかりおよびチャンバーの床の触覚を用いて、他のチャンバーと異なるようにした。すべてのテストを、赤外線照明ＣＣＤカメラを使用して記録し、動物の位置を、Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ ＡＮＹ－ｍａｚｅ ５．２ソフトウェアパッケージを使用して記録した。１日目に動物を、生理食塩水を注射した後で最初に２つのチャンバーの一方に合計３時間適応させ、チャンバー内のあらゆるバイアスを制御するために群内で２つのチャンバーを交互にした。この試験を「対照」と呼ぶ。２日目に、動物を、ＣＮＯ（３ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射後に１日目とは反対側のチャンバーに入れ、チャンバー内で３時間放置した。この試験を「条件付け」試験と呼ぶ。３日目に、チャンバーを隔てているドアを外し、動物を、いかなる薬物投与なしにボックスの中に入れ、「選好テスト」と呼ぶ、あらゆる明らかな好ましいチャンバーの条件付けについて合計３時間記録した。
高架式十字迷路

【0175】

ＤＲＥＡＤＤを使用してＢＬＡの選択された活性化後の不安レベルをアッセイするために、高架式十字迷路（ＥＰＭ）を使用した。ＥＰＭでペース調整された全動物を、Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ ＡＮＹ－ｍａｚｅ ５．２ソフトウェアを使用して記録した。ＥＰＭは黒のプレキシガラス製であり、十字形状の４本のアームで構成された。アームの２つ（互いに反対側）は開放され、すなわち壁がなく、残りの２つのアームは閉鎖され、すなわち壁を有した。テスト開始１時間半前に、動物にＣＮＯ（３ｍｇ／ｋｇ）を注射した。テスト開始時に、動物を迷路の中心に配置し、合計５分間記録しながら、迷路の開閉アームを自由に探索できるようにした。次に、動物の不安レベルを決定するために、動物がオープンアームまたはクローズアームのいずれかを探索している時間を記録から定量化した。
結果

【0176】

ＢＲＡＶＥにより生成したＡＡＶ－ＭＮＭ００４カプシドバリアントを利用して、扁桃体基底外側から背側線条体への求心性神経の機能的寄与に関する未解決の問題に答えた（図６）。これは、逆行性誘導化学療法（ＤＲＥＡＤＤ）アプローチを使用して行った。背側線条体においてＣｒｅ－レコンビナーゼを発現するＡＡＶ－ＭＮＭ００４ベクター、およびＣｒｅ誘導性（ＤＩＯ）化学遺伝学的（ＤＲＥＡＤＤ）ベクターを、野生型ラットの扁桃体基底外側（ＢＬＡ）に両側から注射した（図６Ａ）。ＤＲＥＡＤＤリガンドＣＮＯを使用して背側線条体に突出しているＢＬＡニューロンの活性を選択的に誘導した後、高架式十字迷路（ＥＰＭ）を使用して例証された著しい恐怖および不安の表現型を発見した。ここで動物は、対照動物（Ｃｒｅ遺伝子がＧＦＰに置換されている）と比較して、オープンアームで大幅に短かい時間を費やした（図６Ｂ）。これは、正の刺激を促進する腹側線条体へのＢＬＡの突出の信じられている機能とは全く対照的であることを示す。これは、不安表現型を増加させ、オープンフィールドアリーナでの有意な過剰運動と、過度の掘り込み、激しい発汗、および凍結エピソードを含む恐怖表現型を伴った（図６Ｃ）。ＣＮＯチャレンジ後に、動物を屠殺し、免疫組織化学を使用して、ＢＬＡをＨＡタグ（ｈＭ３Ｄｑ ＤＲＥＡＤＤ発現を同定する）またはｍＣｈｅｒｒｙ（ｒＭ３Ｄｓ ＤＲＥＡＤＤを視覚化する）のいずれかで染色し、ＤＡＢペルオキシダーゼ反応を使用して茶色の沈殿染色に発展させた（図６Ｄ～Ｅ）。

【0177】

この実施例は、本明細書に開示される方法により得られる改変ウイルスベクターおよび粒子が、複雑な細胞メカニズムの解明を助けるために使用され得ることを示す。

【表1】

引用文献
1. Gray, S.J. et al. Directed evolution of a novel adeno-associated virus (AAV) vector that crosses the seizure-compromised blood-brain barrier (BBB). Mol Ther 18, 570-578 (2010).
2. Chan, K.Y. et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat Neurosci 20, 1172-1179 (2017).
3. Deverman, B.E. et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat Biotechnol 34, 204-209 (2016).
4. Ojala, D.S. et al. In Vivo Selection of a Computationally Designed SCHEMA AAV Library Yields a Novel Variant for Infection of Adult Neural Stem Cells in the SVZ. Mol Ther (2017).
5. Grimm, D. et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J Virol 82, 5887-5911 (2008).
6. Maheshri, N., Koerber, J.T., Kaspar, B.K. & Schaffer, D.V. Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors. Nat Biotechnol 24, 198-204 (2006).
7. Muller, O.J. et al. Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nat Biotechnol 21, 1040-1046 (2003).
8. Yang, L. et al. A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 3946-3951 (2009).
9. Tervo, D.G. et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron 92, 372-382 (2016).
10. Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M. & Nakai, H. Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing. Nat Commun 5, 3075 (2014).
11. Girod, A. et al. Genetic capsid modifications allow efficient re-targeting of adeno-associated virus type 2. Nat Med 5, 1052-1056 (1999).
12. Opie, S.R., Warrington, K.H., Jr., Agbandje-McKenna, M., Zolotukhin, S. & Muzyczka, N. Identification of amino acid residues in the capsid proteins of adeno-associated virus type 2 that contribute to heparan sulfate proteoglycan binding. J Virol 77, 6995-7006 (2003).
13. Perabo, L. et al. Heparan sulfate proteoglycan binding properties of adeno-associated virus retargeting mutants and consequences for their in vivo tropism. J Virol 80, 7265-7269 (2006).
14. Ried, M.U., Girod, A., Leike, K., Buning, H. & Hallek, M. Adeno-associated virus capsids displaying immunoglobulin-binding domains permit antibody-mediated vector retargeting to specific cell surface receptors. J Virol 76, 4559-4566 (2002).
15. McCarty, D.M. et al. Adeno-associated virus terminal repeat (TR) mutant generates self-complementary vectors to overcome the rate-limiting step to transduction in vivo. Gene Ther 10, 2112-2118 (2003).
16. McCarty, D.M., Monahan, P.E. & Samulski, R.J. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. Gene Ther 8, 1248-1254 (2001).
17. Davidsson, M. et al. A novel process of viral vector barcoding and library preparation enables high-diversity library generation and recombination-free paired-end sequencing. Sci Rep 6, 37563 (2016).
18. Streck, C.J. et al. Adeno-associated virus vector-mediated systemic delivery of IFN-beta combined with low-dose cyclophosphamide affects tumor regression in murine neuroblastoma models. Clin Cancer Res 11, 6020-6029 (2005).
19. Jordan, M., Schallhorn, A. & Wurm, F.M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res 24, 596-601 (1996).
20. Shortland, P.J., Wang, H.F. & Molander, C. Transganglionic transport of the lectin soybean agglutinin (Glycine max) following injection into the sciatic nerve of the adult rat. J Neurocytol 27, 233-245 (1998).
21. Hnasko, T.S. et al. Cre recombinase-mediated restoration of nigrostriatal dopamine in dopamine-deficient mice reverses hypophagia and bradykinesia. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 8858-8863 (2006).
22. Stahl, P.L. et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science 353, 78-82 (2016).
23. Yan, Z. et al. A novel chimeric adenoassociated virus 2/human bocavirus 1 parvovirus vector efficiently transduces human airway epithelia. Mol Ther 21, 2181-2194 (2013).
24. Gray, J.T. & Zolotukhin, S. Design and construction of functional AAV vectors. Methods Mol Biol 807, 25-46 (2011).
25. Grimm, D., Kern, A., Rittner, K. & Kleinschmidt, J.A. Novel tools for production and purification of recombinant adenoassociated virus vectors. Hum Gene Ther 9, 2745-2760 (1998).
26. Ho, S.N., Hunt, H.D., Horton, R.M., Pullen, J.K. & Pease, L.R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene 77, 51-59 (1989).
27. Michelfelder, S. & Trepel, M. Adeno-associated viral vectors and their redirection to cell-type specific receptors. Adv Genet 67, 29-60 (2009).
28. Chen, X., Zaro, J.L. & Shen, W.C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Adv Drug Deliv Rev 65, 1357-1369 (2013).
29. Reddy Chichili, V.P., Kumar, V. & Sivaraman, J. Linkers in the structural biology of protein-protein interactions. Protein Sci 22, 153-167 (2013).
30. Williams, R. et al. Amplification of complex gene libraries by emulsion PCR. Nature methods 3, 545-550 (2006).
31. Zolotukhin, S. et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Ther 6, 973-985 (1999).
32. Rohr, U.P. et al. Fast and reliable titration of recombinant adeno-associated virus type-2 using quantitative real-time PCR. J Virol Methods 106, 81-88 (2002).
33. Gray, S.J. et al. Production of recombinant adeno-associated viral vectors and use in in vitro and in vivo administration. Curr Protoc Neurosci Chapter 4, Unit 4 17 (2011).
34. Wu, X., Dong, X., Wu, Z. et al A novel method for purification of recombinant adenoassociated virus vectors on a large scale. Chinese Science Bulletin 46, 485-488 (2001).
35. Brewer, G.J. & Torricelli, J.R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc 2, 1490-1498 (2007).
36. Nolbrant, S., Heuer, A., Parmar, M. & Kirkeby, A. Generation of high-purity human ventral midbrain dopaminergic progenitors for in vitro maturation and intracerebral transplantation. Nat Protoc 12, 1962-1979 (2017).
37. Zorita, E., Cusco, P. & Filion, G.J. Starcode: sequence clustering based on all-pairs search. Bioinformatics 31, 1913-1919 (2015).
38. Krejci, A., Hupp, T.R., Lexa, M., Vojtesek, B. & Muller, P. Hammock: a hidden Markov model-based peptide clustering algorithm to identify protein-interaction consensus motifs in large datasets. Bioinformatics 32, 9-16 (2016).
39. Bushnell, B. (Berkeley, California; 2016).
40. Dean, J. & Ghemawat, S. MapReduce: simplified data processing on large clusters. Communications of the ACM 51, 107-113 (2008).
41. McKenna, A. et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome research 20, 1297-1303 (2010).
42. Edgar, R.C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics 26, 2460-2461 (2010).



項目

【項目１】

【0178】

ウイルスベクターのライブラリを製造する方法であって、
ｉ）所望の特性を有するかまたは有することが推測されるポリペプチドの群から１つ以上の候補ポリペプチドを選択し、そのポリペプチドの配列を検索するステップと；
ｉｉ）複数の候補ポリヌクレオチドを提供するステップであって、各候補ポリヌクレオチドは、候補ポリペプチドの１つのポリペプチド断片をコードし、これにより転写および翻訳時に、各候補ポリペプチドは、各候補ポリペプチドの１つ以上のポリペプチド断片によって表される、ステップと；
ｉｉｉ）複数のバーコードポリヌクレオチドを提供するステップと；
ｉｖ）各候補ポリヌクレオチドをバーコードポリヌクレオチドと共に、カプシド遺伝子およびウイルスゲノムを含むウイルスベクターに挿入し、これによりそれぞれがバーコードポリヌクレオチドに作動可能に連結される単一の候補ポリヌクレオチドを含む複数のウイルスベクターを得るステップであって、候補ポリヌクレオチドは、カプシド遺伝子内に挿入され、カプシド遺伝子は、ウイルスゲノムの外側にあり、バーコードポリヌクレオチドは、ウイルスゲノム内に挿入され、ウイルスベクターは、検出可能なマーカーをコードするマーカーポリヌクレオチドを含む、ステップと、
ｖ）ステップｉｖ）で得られた複数のウイルスベクターを増幅系で増幅することであって、各ウイルスベクターは、増幅系において複数のコピーで存在する、ステップと、
ａ）参照系において、ステップｖ）の増幅系からの複数のウイルスベクターの少なくとも第１の部分を検索し、転送するステップであって、これにより各バーコードポリヌクレオチドを１つの候補ポリヌクレオチドにマッピングする、ステップと、
ｂ）増幅系において複数のウイルスベクターの第２の部分を維持し、複数のウイルス粒子を得るために産生系において第２の部分の全部または一部を任意により移すステップ、
を含む、方法。

【項目２】

【0179】

１つ以上のポリペプチド断片が、少なくとも２つの重複するポリペプチド断片である、項目１に記載の方法。

【項目３】

【0180】

ウイルスベクターが、プラスミドである、項目１または２に記載の方法。

【項目４】

【0181】

各バーコードポリヌクレオチドを１つの候補ポリヌクレオチドにマッピングすることが、複数のウイルスベクターの各ウイルスベクターの領域の配列を決定することによって行われ、この領域は少なくともバーコードポリヌクレオチドおよび候補ポリヌクレオチドを含む、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。

【項目５】

【0182】

配列決定が、領域のイルミナ配列決定などの次世代配列決定によって行われる、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。

【項目６】

【0183】

所望の特性を有するウイルスベクターを設計する方法であって、項目１～５のいずれか一項に記載の方法を含み、さらに以下のステップを含む方法；
ｖｉ）項目１のステップｖ）ｂ）の増幅系からウイルスベクターの一部を検索するか、または項目１のステップｖ）ｂ）の産生系からウイルス粒子の少なくとも一部を検索し、かつ細胞集団を上記検索したウイルスベクターまたはウイルス粒子と接触させるステップと；
ｖｉｉ）マーカー発現をモニターし、マーカー発現が所望のパターンに従う細胞を選択するステップと；
ｖｉｉｉ）ステップｖｉｉ）で選択された細胞で発現されるバーコードポリヌクレオチドを同定するステップであって、これにより所望の特性に対応する候補ポリヌクレオチドおよび対応する候補ポリペプチドを同定するステップと；
ｉｘ）改変カプシド遺伝子を含むウイルスベクターを設計するステップであって、改変カプシド遺伝子は、ステップｖｉｉｉ）で同定された候補ポリヌクレオチドの１つを含む、ステップ。

【項目７】

【0184】

増幅系において、ステップｉｘ）で得られたウイルスベクターを増幅するステップをさらに含む、項目６に記載の方法。

【項目８】

【0185】

所望の特性を有するウイルス粒子を製造する方法であって、項目１～５に記載のいずれか一項に記載の方法を含み、さらに以下のステップを含む方法：
ｖｉ）ステップｖ）ｂ）の増幅系から複数のウイルスベクターの少なくとも一部を検索するステップ、またはステップｖ）ｂ）の産生系から複数のウイルス粒子の少なくとも一部を検索するステップと；
ｖｉｉ）細胞集団を、ステップｖｉ）で得られた検索されたウイルスベクターまたはウイルス粒子と接触させるステップと；
ｖｉｉｉ）マーカー発現をモニターし、マーカー発現が所望のパターンに従う細胞を選択するステップと；
ｉｘ）ステップｖｉｉｉ）で同定された細胞で発現されるバーコードポリヌクレオチドを同定するステップであって、これにより所望の特性に対応する候補ポリヌクレオチドおよび対応する候補ポリペプチドを同定するステップと；
ｘ）改変カプシド遺伝子を含むウイルスベクターを設計するステップであって、改変カプシド遺伝子は、ステップｉｘ）で同定された候補ポリヌクレオチドの１つを含む、ステップと；
ｘｉ）ステップｘ）のウイルスベクターを産生系で産生するステップであって、それにより所望の特性を有するウイルスベクターまたはウイルス粒子を得るステップ。

【項目９】

【0186】

導入遺伝子を標的細胞に送達する方法であって、
ａ）改変カプシドを含み、かつ導入遺伝子を封入する改変ウイルスベクターまたは改変ウイルス粒子を提供するステップであって、改変ウイルスベクターまたは改変ウイルス粒子は、項目８のステップｘｉ）で定義されたウイルスベクターまたはウイルス粒子である、ステップと；
ｂ）改変ウイルスベクターまたは改変ウイルス粒子を注射部位に注射するステップ
を含む、方法。

【項目１０】

【0187】

改変ウイルス粒子が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９または配列番号５０のバリアントを含むかまたはこれらからなるポリペプチドを含むかまたはこれらからなる改変カプシドを含み、最大で１つ、２つ、または３つのアミノ酸残基が欠失、改変、または置換されている、項目９に記載の方法。

【項目１１】

【0188】

ウイルスベクターのライブラリであって、各ウイルスベクターが：
ｉ）宿主細胞でウイルスベクターを発現させるための骨格；
ｉｉ）カプシド遺伝子およびその中に挿入され、候補ポリペプチドのポリペプチド断片をコードする候補ポリヌクレオチド；
ｉｉｉ）マーカーポリヌクレオチド；および
ｉｖ）バーコードポリヌクレオチド
を含み、
候補ポリペプチドは、所望の特性を有するかまたは有することが推測される１つ以上のポリペプチドを含む所定の群から選択され、
転写および翻訳時に、各候補ポリペプチドは、ライブラリ中の１つ以上のポリペプチド断片によって提示され、
候補ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターのカプシド遺伝子内に挿入され、これによりカプシド上に提示されるポリペプチド断片に転写および翻訳され、ウイルスゲノム内に挿入されたバーコードポリヌクレオチドに作動可能に連結され、
マーカーポリヌクレオチドは、ウイルスゲノム内に含まれ、カプシド遺伝子は、ウイルスゲノムの外側にある。

【項目１２】

【0189】

１つ以上のポリペプチド断片が、少なくとも２つの重複するポリペプチド断片である、項目１～１１のいずれか一項に記載のウイルスベクターのライブラリ。

【項目１３】

【0190】

マーカーポリヌクレオチドが、バーコードポリヌクレオチドである、項目１～１２のいずれか一項に記載のウイルスベクターのライブラリ。

【項目１４】

【0191】

ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ボカウイルスまたは狂犬病ウイルスであり、好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、項目１～１３のいずれか一項に記載のウイルスベクターのライブラリ。

【項目１５】

【0192】

ウイルスベクターが、少なくとも１つの複製遺伝子をさらに含む、項目１～１４のいずれか一項に記載のウイルスベクターのライブラリ。

【項目１６】

【0193】

ウイルスベクターが、少なくとも１つのアセンブリー遺伝子をさらに含む、項目１～１５のいずれか一項に記載のウイルスベクターのライブラリ。

【項目１７】

【0194】

候補ポリヌクレオチドが、カプシド遺伝子の５’末端とカプシド遺伝子の３’末端の間に位置する、項目１～１６のいずれか一項によるウイルスベクターのライブラリ。

【項目１８】

【0195】

マーカーポリペプチドが、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、抗生物質耐性遺伝子、細胞毒性遺伝子、表面受容体、β－ガラクトシダーゼ、ＴＶＡ受容体、有糸分裂／癌遺伝子、トランス活性化因子、転写因子およびＣａｓタンパク質からなる群から選択される、項目１～１７のいずれか一項に記載のウイルスベクターのライブラリ。

【項目１９】

【0196】

マーカーポリヌクレオチドが、プロモーター配列をさらに含む、項目１～１８のいずれか一項に記載のウイルスベクターのライブラリ。

【項目２０】

【0197】

プロモーターが、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターである、項目１～１９のいずれか一項に記載のウイルスベクターのライブラリ。

【項目２１】

【0198】

プロモーターが、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）、ハイブリッドＣＢＡ（ＣＢｈ）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、トリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＬ１（ＡＬＤＨ１Ｌ１）、シナプシン－１、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒストン１（Ｈ１）、Ｕ６スプライソソームＲＮＡ（Ｕ６）、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａｍＫＩＩ）、伸長因子１－アルファ（Ｅｆ１ａ）、フォークヘッドボックスＪ１（ＦｏｘＪ１）、またはグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターである、項目１～２０のいずれか一項に記載のウイルスベクターのライブラリ。

【項目２２】

【0199】

バーコードポリヌクレオチドが、マーカーポリヌクレオチドの３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）に位置する、項目１～２１のいずれか一項に記載のウイルスベクターのライブラリ。

【項目２３】

【0200】

宿主細胞が、ヒト細胞などの哺乳動物細胞、ＳＦ９細胞などの昆虫細胞、またはサッカロミセス・セレビシエ細胞などの酵母細胞である、項目１～２２のいずれか一項に記載のウイルスベクターのライブラリ。

【項目２４】

【0201】

宿主細胞が、ヒーラ細胞、初代ニューロン、誘導されたニューロン、線維芽細胞、胚性幹細胞、誘導された多能性幹細胞、ＳＦ９細胞などの昆虫細胞、酵母細胞または胚細胞、例えば胚性腎細胞など、例えば、ＨＥＫ２９３細胞である、項目１～２３のいずれか一項に記載のウイルスベクターのライブラリ。

【項目２５】

【0202】

候補ポリペプチドが、カプシドポリペプチドまたはエンベロープポリペプチドなどのウイルスポリペプチド；疾患または障害に関連するポリペプチド；共通の機能を共有するポリペプチド；神経毒およびレクチンから選択される、項目１～２４のいずれか一項に記載のウイルスベクターのライブラリ。

【項目２６】

【0203】

候補ポリペプチドが、所望の特性を有することが知られているかまたは有することが推測されるポリペプチドである、項目１～２５のいずれか一項に記載のウイルスベクターのライブラリ。

【項目２７】

【0204】

所望の特性が以下の１つ以上である、項目１～２６のいずれか一項に記載のウイルスベクターのライブラリ：
－シナプスなどの特定の種類の細胞に固有の構造などの特定の細胞構造への親和性、または細胞分裂、細胞分化、ニューロンの活性化、炎症、または組織損傷などの、特定の細胞イベントに固有の構造への親和性；
－宿主細胞を取り巻く環境における輸送の改善または血液脳関門を通過する輸送の改善などの、輸送特性の改善；
－代謝肝臓を回避する能力の向上；
－免疫系を回避する能力の向上；
－免疫系を誘発する能力の向上。

【項目２８】

【0205】

候補ポリヌクレオチド、マーカーポリヌクレオチドおよび／またはバーコードポリヌクレオチドが、コドン最適化される、項目１～２７のいずれか一項に記載のウイルスベクターのライブラリ。

【項目２９】

【0206】

項目１１～２８のいずれか一項に記載のウイルスベクターのライブラリを含む、細胞または複数の細胞。

【項目３０】

【0207】

導入遺伝子を標的細胞に送達するためのウイルス粒子をコードするウイルスベクターであって、改変カプシド遺伝子および標的細胞に送達される導入遺伝子を含み、
改変カプシド遺伝子はウイルスゲノムの外側にあり、導入遺伝子の送達を改善するかつ／または標的細胞への標的化を改善するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる、
ウイルスベクター。

【項目３１】

【0208】

ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ボカウイルスまたは狂犬病ウイルスである、項目３０に記載のウイルスベクター。

【項目３２】

【0209】

ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９または配列番号５０を含むかまたはこれらからなる、項目３０または３１に記載のウイルスベクター。

【項目３３】

【0210】

ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９または配列番号５０からなる群から選択される、項目３０～３２のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【項目３４】

【0211】

導入遺伝子が、ウイルスゲノムの末端反復（ＴＲ）配列間に挿入される、項目３０～３３のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【項目３５】

【0212】

注射部位への注射時に注射部位への求心性領域への逆行性輸送を促進する、項目３０～３４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【項目３６】

【0213】

項目３０～３５のいずれか一項に記載のウイルスベクターによりコードされるウイルス粒子。

【項目３７】

【0214】

導入遺伝子を標的細胞に送達するための改変ウイルスベクターまたはウイルス粒子であって、改変カプシド遺伝子および標的細胞に送達される導入遺伝子を含み、
改変カプシドは、天然のカプシド遺伝子および導入遺伝子を含む未改変ウイルス粒子と比較して、次の：標的細胞への導入遺伝子の送達、標的細胞への標的化、改変ウイルスベクターもしくは改変ウイルス粒子の感染性、および／または改変ウイルスベクターもしくは改変ウイルス粒子の逆行性輸送、の１つ以上を改善する、
改変ウイルスベクターまたはウイルス粒子。

【項目３８】

【0215】

改変カプシドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９または配列番号５０を含むかまたはこれらからなるポリペプチドを含むかまたはこれらからなる、項目３７に記載の改変ウイルスベクターまたは改変ウイルス粒子。

【項目３９】

【0216】

ペプチドが、改変カプシド上に提示される、項目３７または３８に記載の改変ウイルスベクターまたは改変ウイルス粒子。

【項目４０】

【0217】

遺伝子治療のための、項目３０～３６のいずれか一項に記載のウイルスベクターまたはウイルス粒子、または項目３７～４０のいずれか一項に記載の改変ウイルスベクターまたは改変ウイルス粒子の使用。

【項目４１】

【0218】

神経系の障害などの、障害の治療方法で使用するための、項目３０～３５のいずれか一項に記載のウイルスベクターまたはウイルス粒子、または項目３６～４０のいずれか一項に記載の改変ウイルスベクターまたは改変ウイルス粒子。

【項目４２】

【0219】

障害が、酵素欠乏症、代謝障害、凝集症（ａｇｇｒｅｇｏｐａｔｈｙ）、発癌性、ニューロンの活性亢進または活性低下、タンパク質の調節不全および誤った遺伝子スプライシングからなる群から選択される、項目４１に記載の使用のためのウイルスベクターもしくは粒子または改変ウイルスベクターもしくは粒子。

【項目４３】

【0220】

疾患が、ハンチントン病、小脳失調症、多系統萎縮症、うつ病、てんかん、筋萎縮性側索硬化症、脳卒中、血友病、脊髄性筋萎縮症、筋ジストロフィーからなる群から選択される、項目４１または４１に記載の使用のためのウイルスベクターもしくは粒子または改変ウイルスベクターもしくは粒子。

【項目４４】

【0221】

所望の効果を有する薬物を同定するための方法であって、以下のステップ：
ａ）候補薬物を提供するステップ；
ｂ）候補薬物を細胞に投与するステップ；
ｃ）ｂ）の細胞へのウイルス粒子の送達を可能にする改変カプシドおよびマーカーポリヌクレオチドを含む改変ウイルス粒子を提供するステップ；
ｄ）候補薬物の存在下および非存在下でマーカーポリペプチドの発現および／または局在化をモニターしおよび比較するステップ；
を含み、これにより候補薬物がマーカーポリヌクレオチドの発現に影響を有するか否かを決定し、
改変ウイルス粒子および／または改変カプシドは、項目１～４３のいずれか一項で定義されたとおりである、
方法。

【項目４５】

【0222】

ウイルスベクターまたは粒子の標的細胞へのトロピズムを改善するための方法であって、項目１～５のいずれか一項に記載の方法を含み、
ｖｉ）ステップｖ）ｂ）の増幅系から複数のウイルスベクターの少なくとも一部を検索するステップ、またはステップｖ）ｂ）の産生系から複数のウイルス粒子の少なくとも一部を検索するステップと；
ｖｉｉ）標的細胞を含む細胞集団を、ｖｉ）で得られた検索されたウイルスベクターまたはウイルス粒子、およびマーカーを含む参照ウイルスベクターまたは参照ウイルス粒子と接触させるステップと；
ｖｉｉｉ）標的細胞においてマーカー発現をモニターし、比較するステップと；
ｉｘ）参照ウイルスベクターまたは参照ウイルス粒子からの発現と比較して、マーカーの発現の増加を有する標的細胞中の候補ポリヌクレオチドを同定するステップと；
ｘ）改変カプシド遺伝子を含む、トロピズムが改善されたウイルスベクターまたはウイルス粒子を設計するステップであって、改変カプシド遺伝子は、ステップｉｘ）で同定された候補ポリヌクレオチドのうちの１つを含む、ステップ、
をさらに含む、方法。

【項目４６】

【0223】

ポリペプチドを挿入することによって改変されたカプシドを含むウイルス粒子に所望の特性を付与するポリペプチドの１つ以上の領域を同定する方法であって、項目１～５のいずれか一項に記載の方法を含み、
ｖｉ）ステップｖ）ｂ）の増幅系から複数のウイルスベクターの少なくとも一部を検索するステップ、またはステップｖ）ｂ）の産生系から複数のウイルス粒子の少なくとも一部を検索するステップと；
ｖｉｉ）標的細胞を含む細胞集団を、ｖｉ）で得られた検索されたウイルスベクターまたはウイルス粒子、およびマーカーを含む参照ウイルスベクターまたは参照ウイルス粒子と接触させるステップと；
ｖｉｉｉ）標的細胞においてマーカー発現をモニターし、比較するステップと；
ｉｘ）所望の特性に対応するマーカーの発現プロファイルを有する標的細胞における候補ポリヌクレオチドを同定するステップであって、これによりこの特性に関与するポリペプチドの領域を同定する、ステップ
をさらに含む、方法。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7】

【図8】

【配列表】

2024050766000001.app

【手続補正書】

【提出日】2024-02-28

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ウイルスベクターのライブラリを製造する方法であって、
ｉ）所望の特性を有するかまたは有することが推測されるポリペプチドの群から１つ以上の候補ポリペプチドを選択すること、および前記ポリペプチドの配列を検索することと；
ｉｉ）複数の候補ポリヌクレオチドを提供することであって、各候補ポリヌクレオチドは前記候補ポリペプチドの１つのポリペプチド断片をコードし、これにより転写および翻訳時に各候補ポリペプチドは各候補ポリペプチドの１つ以上のポリペプチド断片によって表される、提供することと；
ｉｉｉ）複数のバーコードポリヌクレオチドを提供することと；
ｉｖ）カプシド遺伝子およびウイルスゲノムを含む、ウイルスベクター中にバーコードポリヌクレオチドと共に各候補ポリヌクレオチドを挿入すること、これによりそれぞれがバーコードポリヌクレオチドに作動可能に連結される単一の候補ポリヌクレオチドを含む複数のウイルスベクターを得ることであって、前記候補ポリヌクレオチドは、前記カプシド遺伝子内に挿入され、前記カプシド遺伝子は、前記ウイルスゲノムの外側にありかつ前記バーコードポリヌクレオチドは、前記ウイルスゲノム内に挿入され、前記ウイルスベクターは、検出可能なマーカーをコードするマーカーポリヌクレオチドを含む、挿入することと、
ｖ）ステップｉｖ）で得られた前記複数のウイルスベクターを増幅系で増幅することであって、各ウイルスベクターは、前記増幅系において複数のコピーで存在する、増幅することと、
ａ）参照系においてステップｖ）の前記増幅系から前記複数のウイルスベクターの少なくとも第１の部分を検索することおよび転送することであって、これにより各バーコードポリヌクレオチドを１つの候補ポリヌクレオチドにマッピングする、検索することおよび転送することと、
ｂ）前記増幅系において前記複数のウイルスベクターの第２の部分を維持すること、および複数のウイルス粒子を得るために産生系において前記第２の部分の全部または一部を任意により移すこと、
を含む、方法。

【手続補正書】

【提出日】2024-02-28

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2024050766000001.xml