ホーム > 特許ランキング > 国立大学法人金沢大学
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024051333
(43)【公開日】2024-04-11
(54)【発明の名称】細胞傷害性Ｔ細胞及びその作製方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/63 20060101AFI20240404BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240404BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240404BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240404BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20240404BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240404BHJP
【ＦＩ】
C12N15/63 Z
C12N5/10 ZNA
A61K35/17 Z
A61P35/00
C12N5/0783
C12N15/12
【審査請求】未請求
【請求項の数】25
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022157443
(22)【出願日】2022-09-30
(71)【出願人】
【識別番号】504160781
【氏名又は名称】国立大学法人金沢大学
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】水腰 英四郎
(72)【発明者】
【氏名】金子 周一
(72)【発明者】
【氏名】中河 秀俊
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB65
4C087NA14
4C087ZB26
(57)【要約】
【課題】hTERT由来ペプチドを提示する癌細胞をターゲットとしたTCR遺伝子改変T細胞を提供する。
【解決手段】TCR遺伝子改変T細胞は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）由来ペプチドとHLA-A24抗原との複合体に対して特異的に結合するT細胞受容体タンパク質のα鎖可変領域を含むポリペプチド及びβ鎖可変領域を含むポリペプチドを有する。
【選択図】なし
【解決手段】TCR遺伝子改変T細胞は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）由来ペプチドとHLA-A24抗原との複合体に対して特異的に結合するT細胞受容体タンパク質のα鎖可変領域を含むポリペプチド及びβ鎖可変領域を含むポリペプチドを有する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）由来ペプチドとHLA-A24抗原との複合体に対して特異的に結合するT細胞受容体タンパク質のα鎖可変領域を含むポリペプチド及びβ鎖可変領域を含むポリペプチドを有し、
上記α鎖可変領域が、以下の(i)又は(ii)のポリペプチドであり：
(i)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(ii)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
上記β鎖可変領域が、以下の(iii)又は(iv)のポリペプチドである：
(iii)配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(iv) 配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
TCR遺伝子改変T細胞。
上記α鎖可変領域が、以下の(i)又は(ii)のポリペプチドであり：
(i)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(ii)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
上記β鎖可変領域が、以下の(iii)又は(iv)のポリペプチドである：
(iii)配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(iv) 配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
TCR遺伝子改変T細胞。
【請求項2】
上記α鎖可変領域及び上記β鎖可変領域は、T細胞に導入されたポリヌクレオチドから発現したものであることを特徴とする請求項１記載のTCR遺伝子改変T細胞。
【請求項3】
上記α鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド及び上記β鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを、癌に罹患した患者のT細胞にin vitroで導入したものであることを特徴とする請求項１記載のTCR遺伝子改変T細胞。
【請求項4】
上記患者の癌細胞は、上記複合体を発現する癌細胞であることを特徴とする請求項３記載のTCR遺伝子改変T細胞。
【請求項5】
上記α鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、
[1]配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、若しくは、
[2]配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかで示される塩基配列に対して90％以上の配列同一性を有する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなり、
上記β鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、
[3]配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３４及び３６のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、若しくは、
[4]配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３４及び３６のいずれかで示される塩基配列に対して90％以上の配列同一性を有する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる
ことを特徴とする請求項２記載のTCR遺伝子改変T細胞。
[1]配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、若しくは、
[2]配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかで示される塩基配列に対して90％以上の配列同一性を有する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなり、
上記β鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、
[3]配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３４及び３６のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、若しくは、
[4]配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３４及び３６のいずれかで示される塩基配列に対して90％以上の配列同一性を有する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる
ことを特徴とする請求項２記載のTCR遺伝子改変T細胞。
【請求項6】
上記α鎖可変領域と上記β鎖可変領域は、以下の組合せ：
配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；又は
配列番号１９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
のいずれかであることを特徴とする請求項１記載のTCR遺伝子改変T細胞。
配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；又は
配列番号１９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
のいずれかであることを特徴とする請求項１記載のTCR遺伝子改変T細胞。
【請求項7】
上記（ii）における、上記配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９で示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれ配列番号３８～４６で示されるCDR3配列を含むアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１記載のTCR遺伝子改変T細胞。
【請求項8】
上記（iv）における、上記配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７で示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれ配列番号４７～５５で示されるCDR3配列を含むアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１記載のTCR遺伝子改変T細胞。
【請求項9】
上記ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）由来ペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項１記載のTCR遺伝子改変T細胞。
【請求項10】
上記複合体を発現する癌細胞に対する細胞傷害性を有することを特徴とする請求項１記載のTCR遺伝子改変T細胞。
【請求項11】
ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）由来ペプチドとHLA-A24抗原との複合体に対して特異的に結合するT細胞受容体タンパク質のα鎖可変領域を含むポリペプチド及びβ鎖可変領域を含むポリペプチド、又はこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをヒトT細胞にin vitroで導入する工程：
上記α鎖可変領域が、以下の(i)又は(ii)のポリペプチドであり：
(i)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(ii)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
上記β鎖可変領域が、以下の(iii)又は(iv)のポリペプチドである：
(iii)配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(iv) 配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
を含むTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
上記α鎖可変領域が、以下の(i)又は(ii)のポリペプチドであり：
(i)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(ii)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
上記β鎖可変領域が、以下の(iii)又は(iv)のポリペプチドである：
(iii)配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(iv) 配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
を含むTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
【請求項12】
上記ヒトT細胞は癌に罹患した患者由来のT細胞であることを特徴とする請求項１１記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
【請求項13】
上記患者の癌細胞は、上記複合体を発現する癌細胞であることを特徴とする請求項１２記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
【請求項14】
上記α鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、
[1]配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、若しくは、
[2]配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかで示される塩基配列に対して90％以上の配列同一性を有する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなり
上記β鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは
[3]配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３４及び３６のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、若しくは、
[4]配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３４及び３６のいずれかで示される塩基配列に対して90％以上の配列同一性を有する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる
ことを特徴とする請求項１１記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
[1]配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、若しくは、
[2]配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかで示される塩基配列に対して90％以上の配列同一性を有する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなり
上記β鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは
[3]配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３４及び３６のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、若しくは、
[4]配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３４及び３６のいずれかで示される塩基配列に対して90％以上の配列同一性を有する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる
ことを特徴とする請求項１１記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
【請求項15】
上記α鎖可変領域と上記β鎖可変領域は、以下の組合せ：
配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；又は
配列番号１９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
のいずれかであることを特徴とする請求項１１記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；又は
配列番号１９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
のいずれかであることを特徴とする請求項１１記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
【請求項16】
上記（ii）における、上記配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９で示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれ配列番号３８～４６で示されるCDR3配列を含むアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１１記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
【請求項17】
上記（iv）における、上記配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７で示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれ配列番号４７～５５で示されるCDR3配列を含むアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１１記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
【請求項18】
上記ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）由来ペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項１１記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
【請求項19】
上記TCR遺伝子改変T細胞は、上記複合体を発現する癌細胞に対する細胞傷害性を有することを特徴とする請求項１１記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
【請求項20】
ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）由来ペプチドとHLA-A24抗原との複合体に対して特異的に結合するT細胞受容体タンパク質のα鎖可変領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びβ鎖可変領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを機能しうる形で有し、
上記α鎖可変領域が、以下の(i)又は(ii)のポリペプチドであり：
(i)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(ii)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
上記β鎖可変領域が、以下の(iii)又は(iv)のポリペプチドである：
(iii)配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(iv) 配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
である発現ベクター。
上記α鎖可変領域が、以下の(i)又は(ii)のポリペプチドであり：
(i)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(ii)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
上記β鎖可変領域が、以下の(iii)又は(iv)のポリペプチドである：
(iii)配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(iv) 配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
である発現ベクター。
【請求項21】
上記α鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、
[1]配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、若しくは、
[2]配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかで示される塩基配列に対して90％以上の配列同一性を有する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなり
上記β鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは
[3]配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３４及び３６のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、若しくは、
[4]配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３４及び３６のいずれかで示される塩基配列に対して90％以上の配列同一性を有する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる
ことを特徴とする請求項２０記載の発現ベクター。
[1]配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、若しくは、
[2]配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかで示される塩基配列に対して90％以上の配列同一性を有する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなり
上記β鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは
[3]配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３４及び３６のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、若しくは、
[4]配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３４及び３６のいずれかで示される塩基配列に対して90％以上の配列同一性を有する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる
ことを特徴とする請求項２０記載の発現ベクター。
【請求項22】
上記α鎖可変領域と上記β鎖可変領域は、以下の組合せ：
配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；又は
配列番号１９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
のいずれかであることを特徴とする請求項２０記載の発現ベクター。
配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；又は
配列番号１９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
のいずれかであることを特徴とする請求項２０記載の発現ベクター。
【請求項23】
上記（ii）における、上記配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９で示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれ配列番号３８～４６で示されるCDR3配列を含むアミノ酸配列であることを特徴とする請求項２０記載の発現ベクター。
【請求項24】
上記（iv）における、上記配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７で示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれ配列番号４７～５５で示されるCDR3配列を含むアミノ酸配列であることを特徴とする請求項２０記載の発現ベクター。
【請求項25】
請求項１乃至１０いずれか一項記載のTCR遺伝子改変T細胞を含む、癌治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、肝細胞癌等の癌に対する免疫療法に関し、より具体的には、癌細胞に対して細胞傷害性を有する細胞傷害性Ｔ細胞及びその作製方法、並びに当該細胞傷害性Ｔ細胞を含む癌治療剤に関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子改変T細胞とは、がん細胞の抗原提示装置に結合しているがん抗原を認識するT細胞受容体（TCR）、あるいは、がん細胞を認識する抗体の標的抗原認識部分とリンパ球活性化分子との融合蛋白(Chimeric antigen receptor：CAR）遺伝子を、Tリンパ球に導入し強制発現させ、高いがん抗原への特異性を持たせた人工リンパ球を意味する。前者はTCR遺伝子改変T細胞（TCR-T）、後者はキメラ抗体受容体遺伝子改変T細胞（CAR-T）と呼ばれている。
【0003】
なかでも、TCR-Tを用いた治療方法は、ある個体において有効であった免疫反応を別の個体で利用することを可能とする治療法である。上記の方法は、腫瘍関連抗原（tumor-associated antigens、TAA）特異的TCRを用いて、進行した黒色腫の患者の治療に用いられ（非特許文献１及び２）、現在では種々の患者の臨床試験にも適用され（非特許文献３）、良好な臨床結果が期待されるものとなっている。
【0004】
本発明者等は先に、肝細胞癌患者に対してワクチンとして投与し得るHLA-A24拘束性の腫瘍抗原ペプチドを同定した（特許文献１）。一方で、本発明者等は、TCR-Tを用いた治療方法に用いるために好適なTCR遺伝子のスクリーニングのために、リンパ球から個々のTCRを迅速にクローニングして発現させる技術を見出しており、上記のペプチドをワクチンとして投与された患者由来のリンパ球への応用についても報告している（非特許文献４）。
【0005】
さらに本発明者らは、α-フェトプロテイン（α-fetoprotein、AFP）由来ペプチドワクチンを投与した肝細胞癌患者、並びに健常ドナーから、非特許文献４記載のTCRクローニングシステムを利用して、末梢血中のＴ細胞からAFP特異的TCR遺伝子を取得し、AFP特異的TCR遺伝子導入Ｔ細胞を作成し、その機能を評価、比較している（特許文献２）。特許文献２に開示されたAFP特異的TCR遺伝子導入Ｔ細胞は、α-フェトプロテインとHLA-A24を共に発現する細胞に対して細胞傷害活性を有している。
【0006】
一方、テロメラーゼサブユニットを構成するテロメラーゼ逆転写酵素（TERT）は、テロメアの長さとゲノムの安定性の維持に寄与し、正常な体細胞では発現は極めて低い、もしくは発現していないことが知られている。しかし、様々ながん種においてTERTの発現の亢進が起きており、この変化ががん細胞の不死化に関与していると考えられている。TERT発現の亢進に関与するのは、プロモーター領域の変異であることが知られている。これら変異により、ETS転写制御因子の結合領域が新たに形成されるためTERTの発現亢進が引き起こされる。
【0007】
非特許文献５には、肝細胞癌患者におけるヒトTERT（hTERT）のHLA-A*2402拘束性細胞傷害性T細胞（CTL）エピトープを同定し、hTERT特異的CTL応答を分析したことが開示されている。さらに、非特許文献６には、hTERT由来ペプチドワクチンの作製及びその有効性が確認されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】国際公開WO2005/083074号
【特許文献2】特開2017-081836号公報
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Morgan RA等、Science 2006, Vol.314, pp.126-129
【非特許文献2】Johnson LA等、Blood 2009, Vol.114, No.3, pp.535-546
【非特許文献3】Linnemann C等、J Invest Dermatol 2011, Vol.131, pp.1806-1816
【非特許文献4】Kobayashi E等、Nature Medicine, 2013, Vol.19, No.11, pp.1542-1546
【非特許文献5】Mizukoshi E等、HEPATOLOGY 2006;43: 1284-1294
【非特許文献6】Mizukoshi E等、Cancer Letters 364:98-105, 2015.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
しかしながら、hTERTの発現が亢進した癌細胞に対する傷害活性を有するTCR遺伝子改変T細胞は知られておらず、hTERT由来ペプチドを提示する癌細胞をターゲットとした癌治療の問題は未解決のままであった。
【課題を解決するための手段】
【0011】
そこで、本発明者等は、上述した実情に鑑み、テロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）由来ペプチドワクチンを投与した被検者から、本発明者等のグループが開発した迅速なTCRクローニングシステム（Kobayashi E等、Nat Med 2013;19:1542-1546）を利用して、末梢血中のT細胞からhTERT特異的TCR遺伝子を取得し、hTERT特異的TCR遺伝子導入Ｔ細胞を作製することでその機能を評価、比較した。このTCR遺伝子導入細胞はhTERTとHLA-A24を共に発現する細胞に対して優れた細胞傷害活性を有した。本発明は、この知見に基づいて得られたものである。
【0012】
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）由来ペプチドとHLA-A24抗原との複合体に対して特異的に結合するT細胞受容体タンパク質のα鎖可変領域を含むポリペプチド及びβ鎖可変領域を含むポリペプチドを有し、
上記α鎖可変領域が、以下の(i)又は(ii)のポリペプチドであり：
(i)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(ii)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
上記β鎖可変領域が、以下の(iii)又は(iv)のポリペプチドである：
(iii)配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(iv) 配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
TCR遺伝子改変T細胞。
（２）上記α鎖可変領域及び上記β鎖可変領域は、T細胞に導入されたポリヌクレオチドから発現したものであることを特徴とする（１）記載のTCR遺伝子改変T細胞。
（３）上記α鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド及び上記β鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを、癌に罹患した患者のT細胞にin vitroで導入したものであることを特徴とする（１）記載のTCR遺伝子改変T細胞。
（４）上記患者の癌細胞は、上記複合体を発現する癌細胞であることを特徴とする（３）記載のTCR遺伝子改変T細胞。
（５）上記α鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、
[1]配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、若しくは、
[2]配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかで示される塩基配列に対して90％以上の配列同一性を有する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなり
上記β鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは
[3]配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３４及び３６のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、若しくは、
[4]配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３４及び３６のいずれかで示される塩基配列に対して90％以上の配列同一性を有する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる
ことを特徴とする（２）記載のTCR遺伝子改変T細胞。
（６）上記α鎖可変領域と上記β鎖可変領域は、以下の組合せ：
配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；又は
配列番号１９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
のいずれかであることを特徴とする（１）記載のTCR遺伝子改変T細胞。
（７）上記（ii）における、上記配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９で示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれ配列番号３８～４６で示されるCDR3配列を含むアミノ酸配列であることを特徴とする（１）記載のTCR遺伝子改変T細胞。
（８）上記（iv）における、上記配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７で示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれ配列番号４７～５５で示されるCDR3配列を含むアミノ酸配列であることを特徴とする（１）記載のTCR遺伝子改変T細胞。
（９）上記ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）由来ペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする（１）記載のTCR遺伝子改変T細胞。
（１０）上記複合体を発現する癌細胞に対する細胞傷害性を有することを特徴とする（１）記載のTCR遺伝子改変T細胞。
（１）ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）由来ペプチドとHLA-A24抗原との複合体に対して特異的に結合するT細胞受容体タンパク質のα鎖可変領域を含むポリペプチド及びβ鎖可変領域を含むポリペプチドを有し、
上記α鎖可変領域が、以下の(i)又は(ii)のポリペプチドであり：
(i)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(ii)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
上記β鎖可変領域が、以下の(iii)又は(iv)のポリペプチドである：
(iii)配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(iv) 配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
TCR遺伝子改変T細胞。
（２）上記α鎖可変領域及び上記β鎖可変領域は、T細胞に導入されたポリヌクレオチドから発現したものであることを特徴とする（１）記載のTCR遺伝子改変T細胞。
（３）上記α鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド及び上記β鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを、癌に罹患した患者のT細胞にin vitroで導入したものであることを特徴とする（１）記載のTCR遺伝子改変T細胞。
（４）上記患者の癌細胞は、上記複合体を発現する癌細胞であることを特徴とする（３）記載のTCR遺伝子改変T細胞。
（５）上記α鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、
[1]配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、若しくは、
[2]配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかで示される塩基配列に対して90％以上の配列同一性を有する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなり
上記β鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは
[3]配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３４及び３６のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、若しくは、
[4]配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３４及び３６のいずれかで示される塩基配列に対して90％以上の配列同一性を有する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる
ことを特徴とする（２）記載のTCR遺伝子改変T細胞。
（６）上記α鎖可変領域と上記β鎖可変領域は、以下の組合せ：
配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；又は
配列番号１９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
のいずれかであることを特徴とする（１）記載のTCR遺伝子改変T細胞。
（７）上記（ii）における、上記配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９で示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれ配列番号３８～４６で示されるCDR3配列を含むアミノ酸配列であることを特徴とする（１）記載のTCR遺伝子改変T細胞。
（８）上記（iv）における、上記配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７で示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれ配列番号４７～５５で示されるCDR3配列を含むアミノ酸配列であることを特徴とする（１）記載のTCR遺伝子改変T細胞。
（９）上記ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）由来ペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする（１）記載のTCR遺伝子改変T細胞。
（１０）上記複合体を発現する癌細胞に対する細胞傷害性を有することを特徴とする（１）記載のTCR遺伝子改変T細胞。
【0013】
（１１）ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）由来ペプチドとHLA-A24抗原との複合体に対して特異的に結合するT細胞受容体タンパク質のα鎖可変領域を含むポリペプチド及びβ鎖可変領域を含むポリペプチド、又はこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをヒトT細胞にin vitroで導入する工程：
上記α鎖可変領域が、以下の(i)又は(ii)のポリペプチドであり：
(i)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(ii)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
上記β鎖可変領域が、以下の(iii)又は(iv)のポリペプチドである：
(iii)配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(iv) 配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
を含むTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
（１２）上記ヒトT細胞は癌に罹患した患者由来のT細胞であることを特徴とする（１１）記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
（１３）上記患者の癌細胞は、上記複合体を発現する癌細胞であることを特徴とする（１２）記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
（１４）上記α鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、
[1]配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、若しくは、
[2]配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかで示される塩基配列に対して90％以上の配列同一性を有する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなり
上記β鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは
[3]配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３４及び３６のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、若しくは、
[4]配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３４及び３６のいずれかで示される塩基配列に対して90％以上の配列同一性を有する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる
ことを特徴とする（１１）記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
（１５）上記α鎖可変領域と上記β鎖可変領域は、以下の組合せ：
配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；又は
配列番号１９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
のいずれかであることを特徴とする（１１）記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
（１６）上記（ii）における、上記配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９で示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれ配列番号３８～４６で示されるCDR3配列を含むアミノ酸配列であることを特徴とする（１１）記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
（１７）上記（iv）における、上記配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７で示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれ配列番号４７～５５で示されるCDR3配列を含むアミノ酸配列であることを特徴とする（１１）記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
（１８）上記ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）由来ペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする（１１）記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
（１９）上記TCR遺伝子改変T細胞は、上記複合体を発現する癌細胞に対する細胞傷害性を有することを特徴とする（１１）記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
上記α鎖可変領域が、以下の(i)又は(ii)のポリペプチドであり：
(i)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(ii)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
上記β鎖可変領域が、以下の(iii)又は(iv)のポリペプチドである：
(iii)配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(iv) 配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
を含むTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
（１２）上記ヒトT細胞は癌に罹患した患者由来のT細胞であることを特徴とする（１１）記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
（１３）上記患者の癌細胞は、上記複合体を発現する癌細胞であることを特徴とする（１２）記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
（１４）上記α鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、
[1]配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、若しくは、
[2]配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかで示される塩基配列に対して90％以上の配列同一性を有する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなり
上記β鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは
[3]配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３４及び３６のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、若しくは、
[4]配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３４及び３６のいずれかで示される塩基配列に対して90％以上の配列同一性を有する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる
ことを特徴とする（１１）記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
（１５）上記α鎖可変領域と上記β鎖可変領域は、以下の組合せ：
配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；又は
配列番号１９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
のいずれかであることを特徴とする（１１）記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
（１６）上記（ii）における、上記配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９で示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれ配列番号３８～４６で示されるCDR3配列を含むアミノ酸配列であることを特徴とする（１１）記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
（１７）上記（iv）における、上記配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７で示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれ配列番号４７～５５で示されるCDR3配列を含むアミノ酸配列であることを特徴とする（１１）記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
（１８）上記ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）由来ペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする（１１）記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
（１９）上記TCR遺伝子改変T細胞は、上記複合体を発現する癌細胞に対する細胞傷害性を有することを特徴とする（１１）記載のTCR遺伝子改変T細胞の製造方法。
【0014】
（２０）ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）由来ペプチドとHLA-A24抗原との複合体に対して特異的に結合するT細胞受容体タンパク質のα鎖可変領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びβ鎖可変領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを機能しうる形で有し、
上記α鎖可変領域が、以下の(i)又は(ii)のポリペプチドであり：
(i)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(ii)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
上記β鎖可変領域が、以下の(iii)又は(iv)のポリペプチドである：
(iii)配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(iv) 配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
である発現ベクター。
（２１）上記α鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、
[1]配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、若しくは、
[2]配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかで示される塩基配列に対して90％以上の配列同一性を有する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなり
上記β鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは
[3]配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３４及び３６のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、若しくは、
[4]配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３４及び３６のいずれかで示される塩基配列に対して90％以上の配列同一性を有する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる
ことを特徴とする（２０）記載の発現ベクター。
（２２）上記α鎖可変領域と上記β鎖可変領域は、以下の組合せ：
配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；又は
配列番号１９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
のいずれかであることを特徴とする（２０）記載の発現ベクター。
（２３）上記（ii）における、上記配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９で示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれ配列番号３８～４６で示されるCDR3配列を含むアミノ酸配列であることを特徴とする（２０）記載の発現ベクター。
（２４）上記（iv）における、上記配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７で示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれ配列番号４７～５５で示されるCDR3配列を含むアミノ酸配列であることを特徴とする（２０）記載の発現ベクター。
（２５）上記（１）乃至（１０）いずれかに記載のTCR遺伝子改変T細胞を含む、癌治療剤。
上記α鎖可変領域が、以下の(i)又は(ii)のポリペプチドであり：
(i)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(ii)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
上記β鎖可変領域が、以下の(iii)又は(iv)のポリペプチドである：
(iii)配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(iv) 配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
である発現ベクター。
（２１）上記α鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、
[1]配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、若しくは、
[2]配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８のいずれかで示される塩基配列に対して90％以上の配列同一性を有する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなり
上記β鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは
[3]配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３４及び３６のいずれかで示される塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、若しくは、
[4]配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３４及び３６のいずれかで示される塩基配列に対して90％以上の配列同一性を有する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる
ことを特徴とする（２０）記載の発現ベクター。
（２２）上記α鎖可変領域と上記β鎖可変領域は、以下の組合せ：
配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号２９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；又は
配列番号１９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列番号３７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組合せ；
のいずれかであることを特徴とする（２０）記載の発現ベクター。
（２３）上記（ii）における、上記配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９で示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれ配列番号３８～４６で示されるCDR3配列を含むアミノ酸配列であることを特徴とする（２０）記載の発現ベクター。
（２４）上記（iv）における、上記配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７で示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれ配列番号４７～５５で示されるCDR3配列を含むアミノ酸配列であることを特徴とする（２０）記載の発現ベクター。
（２５）上記（１）乃至（１０）いずれかに記載のTCR遺伝子改変T細胞を含む、癌治療剤。
【発明の効果】
【0015】
本発明に係るTCR遺伝子改変T細胞は、従来のAFPを標的とするTCR遺伝子改変T細胞と異なり、hTERTを標的として強い細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。したがって、本発明に係るTCR遺伝子改変T細胞は、hTERTを標的とした癌治療に極めて有効なものとなる。
【0016】
また、本発明に係るTCR遺伝子改変T細胞の製造方法によれば、従来のAFPを標的とするTCR遺伝子改変T細胞と異なり、hTERTを標的として強い細胞傷害活性を示すTCR遺伝子改変T細胞を製造することができる。したがって、本発明に係るTCR遺伝子改変T細胞の製造方法によれば、hTERTを標的とした癌治療に極めて有効なTCR遺伝子改変T細胞を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】CTL：12-78について、HepG2細胞に対する傷害活性を測定した結果を示す特性図である。
【図2】共培養したCMV遺伝子改変T細胞又はTCR遺伝子改変T細胞（12-78）とHepG2細胞とを撮像した写真である。
【図3】CTL:12-91について、MT細胞に対する傷害活性を測定した結果を示す特性図である。
【図4】共培養したCMV遺伝子改変T細胞又はTCR遺伝子改変T細胞（12-91）とHepG2細胞とを撮像した写真である。
【発明を実施するための形態】
【0018】
以下、本発明を適用した実施の形態を詳細に説明する。
【0019】
本発明に係るTCR遺伝子改変T細胞は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT、NCBI Reference Sequence: NG_009265.1）由来ペプチドとHLA-A24抗原との複合体に対して特異的に結合する機能を有する。ここで、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素とは、テロメラーゼの触媒サブユニットであり、テロメラーゼRNA構成要素（Telomerase RNA component、TERC）とともにテロメラーゼ複合体を構成する。hTERT由来ペプチドとHLA-A24抗原との複合体は、肝臓癌、脾臓癌、胃癌、直腸癌等において発現していることが知られている。
【0020】
本発明者等のグループは先に、hTERT由来のペプチドで、かつ日本人で最も良くみられるHLA-A24拘束性のペプチドを複数個同定している。それらのペプチドのペプチドワクチンとしての効果を検討したところ、hTERTのアミノ酸配列における461～469位の９個のアミノ酸からなるペプチド（VYGFVRACL：配列番号１）が非常に有効であることが見出されている。
【0021】
このhTERT由来ペプチドを肝細胞癌に対するペプチドワクチンとして使用し、その臨床的効果を検証する中で、本発明者等は、ペプチドワクチンを投与された患者では、ワクチンを投与しない患者及び健常者と比較して、hTERT特異的な細胞傷害性Tリンパ球（Cytotoxic T lymphocyte(CTL)、本明細書において「細胞傷害性T細胞」又は単に「T細胞」と記載する）が誘導され、かつその比率が高いことを見出した。本発明者等は、誘導されたCTLを単離及び増殖させて、T細胞受容体（TCR）を構成するα鎖及びβ鎖の遺伝子配列を解析した。また、得られた遺伝子を導入することで、別の個体由来の細胞でhTERT特異的な細胞傷害性の高いT細胞（TCR遺伝子改変T細胞）が取得できることを確認した。
【0022】
すなわち、本発明に係るTCR遺伝子改変T細胞は、hTERT由来ペプチドとHLA-A24抗原との複合体に対して特異的に結合するT細胞受容体タンパク質のα鎖及びβ鎖の可変領域をT細胞に導入したものである。α鎖及びβ鎖の可変領域をT細胞に導入するとは、α鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド又はその相補的なポリヌクレオチド及びβ鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド又はその相補的なポリヌクレオチドを導入する形態、α鎖の可変領域を含むポリペプチドとβ鎖の可変領域を含むポリペプチドとからなるＴ細胞受容体タンパク質をT細胞に取り込ませる形態のいずれも含む意味である。
【0023】
なお、T細胞には機能が異なるいくつかの種類があり、細胞表面上に発現した表面抗原によって分類することができる。そのうち細胞傷害性T細胞は、簡潔にはCD8+細胞であると表現することができる。また、細胞膜上に発現しているT細胞受容体（TCR）はMHC分子に結合した抗原を認識することができ、これは、TCRを構成するα鎖及びβ鎖（γ鎖及びδ鎖の場合もある）がそれぞれ、抗原-MHC複合体と特異的に結合することができる抗体に類似した可変領域を有するためであることが知られている。可変領域にはフレームワーク領域（FR1～FR4）の間に相補性決定領域（CDR1～CDR3）があり、このうちCDR3が抗原と結合すると考えられている。
【0024】
後述の実施例に示すように、hTERT由来ペプチドとHLA-A24抗原との複合体を発現する細胞に対して、優れた傷害活性を有するCTLを複数同定している。本発明に係るT細胞受容体タンパク質のα鎖及びβ鎖の可変領域は、これらCTLに含まれるα鎖及びβ鎖の可変領域に基づいている。
【0025】
これらCTLに含まれるα鎖の可変領域をコードする塩基配列及びそのアミノ酸配列を下記表１にまとめる。
【0026】
【表1】
【0027】
これらCTLに含まれるβ鎖の可変領域をコードする塩基配列及びそのアミノ酸配列を下記表２にまとめる。
【0028】
【表2】
【0029】
上記表より理解できるように、例えば、CTL名：1-57は、配列番号２及び３で規定されるα鎖の可変領域と、配列番号２０及び２１で規定されるβ鎖の可変領域を有する。CTL名：1-57以外のCTLについても、α鎖及びβ鎖の可変領域のアミノ酸配列及びこれら可変領域をコードする塩基配列を表１及び２に基づいて理解することができる。本発明に係るTCR遺伝子改変T細胞は、これら所定のCTLで同定されたα鎖の可変領域とβ鎖の可変領域との組合せが導入されたものであることが好ましい。すなわち、α鎖の可変領域とβ鎖の可変領域との組合せとしては、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（α鎖の可変領域）と配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（β鎖の可変領域）との組合せ；配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（α鎖の可変領域）と配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（β鎖の可変領域）との組合せ；配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（α鎖の可変領域）と配列番号２５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（β鎖の可変領域）との組合せ；配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（α鎖の可変領域）と配列番号２７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（β鎖の可変領域）との組合せ；配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（α鎖の可変領域）と配列番号２９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（β鎖の可変領域）との組合せ；配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（α鎖の可変領域）と配列番号３１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（β鎖の可変領域）との組合せ；配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（α鎖の可変領域）と配列番号３３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（β鎖の可変領域）との組合せ；配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（α鎖の可変領域）と配列番号３５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（β鎖の可変領域）との組合せ；及び配列番号１９で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（α鎖の可変領域）と配列番号３７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（β鎖の可変領域）との組合せのいずれかとすることが好ましい。
【0030】
ただし、本発明に係るT細胞受容体タンパク質のα鎖及びβ鎖の可変領域は、これら表１及び２に示したアミノ酸配列からなるものに限定されず、配列番号２～３７のうち奇数で示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、より好ましくは、98％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、hTERT由来ペプチドとHLA-A24抗原との複合体に対する結合活性を示すペプチドも包含する。
【0031】
また、本発明に係るT細胞受容体タンパク質のα鎖及びβ鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドは、これら表１及び２に示した、配列番号２～３７のうち偶数で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドに限定されず、これら塩基配列に対して遺伝暗号の縮重を含む塩基配列からなるポリヌクレオチドであっても良い。また、本発明に係るT細胞受容体タンパク質のα鎖及びβ鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２～３７のうち偶数で示される塩基配列に対して70％以上の配列同一性を有する塩基配列、好ましくは、80％以上の配列同一性を有する塩基配列、より好ましくは、90％以上の配列同一性を有する塩基配列、さらに好ましくは、95％以上の配列同一性を有する塩基配列、さらに好ましくは、98％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、hTERT由来ペプチドとHLA-A24抗原との複合体に対する結合活性を示すペプチドをコードするポリヌクレオチドも包含する。
【0032】
なお、アミノ酸配列間の同一性の値は、BLASTアルゴリズムを実装したBLASTNやBLASTXプログラムにより算出することができる（デフォルトの設定）。なお、同一性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の割合として算出される。一対のポリヌクレオチドにおける塩基配列間の同一性の値も同様に算出される。
【0033】
本発明に係るT細胞受容体タンパク質のα鎖及びβ鎖の可変領域が表１及び２に示したアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列からなる場合であっても、α鎖及びβ鎖の可変領域は、表１及び２に示したアミノ酸配列に含まれるCDR3を維持したアミノ酸配列であることが好ましい。すなわち、配列番号２～３７のうち奇数で示されるアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、より好ましくは、98％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列は、CDR3に相当する部分配列以外のアミノ酸が置換や欠失、挿入したアミノ酸配列であることが好ましい。CDR3は抗原との結合に関与することから、α鎖及びβ鎖の可変領域のアミノ酸配列を表１及び２に示したアミノ酸配列に含まれるCDR3を維持したアミノ酸配列とすることで、hTERT由来ペプチドとHLA-A24抗原との複合体に対する結合活性を維持できる蓋然性が高いと考えられる。
CTLに含まれるα鎖及びβ鎖の可変領域におけるCDR3配列を下記表３にまとめる。
CTLに含まれるα鎖及びβ鎖の可変領域におけるCDR3配列を下記表３にまとめる。
【0034】
【表3】
【0035】
本発明に係るTCR遺伝子改変T細胞は、一例として、上述したα鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド及びβ鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドを、定法を適用してT細胞に導入することで作製することができる。なお、導入されるポリヌクレオチドは、例えばレトロウイルスベクター等を使用する場合には、RNAの形態とすることができる。したがって、配列番号２～３７の奇数で示された塩基配列は、DNA鎖として示されているが、これらをRNA鎖として書き換えたポリヌクレオチドも、本発明の方法において使用することができる。
【0036】
本発明に係るTCR遺伝子改変T細胞の元となるT細胞として、特に限定されないが、例えば患者から取得した血液中の細胞から分離したT細胞を使用することができるが、より簡便には、末梢血単核球（PBMC）等の血液細胞をそのまま使用しても良い。あるいはまた、PBMCを、例えば培養中に抗CD3抗体、抗CD28抗体、インターロイキン2（IL-2）等による刺激を加えるT細胞の活性化操作後にそのまま使用することもできる。
【0037】
上述したα鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド及びβ鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドの導入は、当分野において通常用いられる方法を適宜利用して行うことができ、導入方法は特に限定されるものではない。例えば、上述したα鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド及びβ鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドをレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス等のウイルスベクター、プラスミド、細菌ベクター等の非ウイルスベクター等のベクター（すなわち、本発明に係る発現ベクター）に組み込んで、導入することを意図する細胞に感染させるか又は組み込むことで導入することができる。あるいはまた、エレクトロポレーション法や、トランスポゾン法等を使用して、上述したα鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド及びβ鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドを導入することもできる。
【0038】
上述したα鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド及びβ鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドを導入する際、各ポリヌクレオチドを独立したプロモーターの制御下にそれぞれ配置して、同一のベクター又は別個のベクターに挿入することができる。あるいはまた、上述したα鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド及びβ鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドを介在配列を介して連結し、単一のプロモーターを用いる一つの発現カセットとすることもできる。
【0039】
後者の方法において利用することができる介在配列としては、限定するものではないが、例えばIRES（Internal ribosome entry site）配列、2Aペプチド配列等が挙げられる（Szymczak et al., Expert Opin. Biol. Ther., 2005, 5: 627-638）。2Aペプチドは、ウイルス由来の20アミノ酸残基前後のペプチド配列であり、細胞内のプロテアーゼにより認識され、切断される。従って、2Aペプチドによって連結されたα鎖の可変領域及びβ鎖の可変領域は、細胞内で転写及び翻訳された後に切断される。
【0040】
なお、α鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド及びβ鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドを導入することで、導入された細胞内で発現したα鎖の可変領域及びβ鎖の可変領域がαβ-TCRヘテロダイマーを形成し、目的の特異性をもたらし得ることは、既に報告されている（Dembic Z. et al. (1986) Transfer of specificity by murine alpha and beta T-cell receptor genes. Nature 320:232-8）。
【0041】
ところで、本発明に係るTCR遺伝子改変T細胞は、上述したように、α鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド及びβ鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドをT細胞に導入する方法により取得されたものに限定されない。本発明に係るTCR遺伝子改変T細胞は、α鎖の可変領域及びβ鎖の可変領域を合成し、合成したα鎖の可変領域及びβ鎖の可変領域からなるαβ-TCRヘテロダイマーをT細胞に取り込ませる方法によって取得することもできる。α鎖の可変領域及びβ鎖の可変領域を合成する方法としては、特に限定されないが、例えば無細胞タンパク質合成系を適用することができる。合成したαβ-TCRヘテロダイマーをT細胞に取り込ませる方法も、特に限定されないが、目的の細胞にタンパク質を導入する方法として公知の方法（例えばShimono K等, Protein Sci. 2009 Oct;18(10):2160-71. doi: 10.1002/pro.230に記載の方法）等を挙げることができる。
【0042】
上述した本発明に係るTCR遺伝子改変T細胞は、hTERTペプチドとHLA-A24抗原とを発現する標的細胞に対して特異的に作用して、当該標的細胞に対する細胞傷害活性を示すことができる。したがって、本発明に係るTCR遺伝子改変T細胞は、hTERTペプチドとHLA-A24抗原とを発現する癌に対する治療剤として利用することができる。治療対象の癌としては、特に限定されず、hTERTの発現が亢進している癌を挙げることができる。このような癌としては、例えば、肝細胞癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、直腸癌、腎細胞癌等を挙げることができる。
【0043】
本発明に係るTCR遺伝子改変T細胞を含む治療剤は、単独で使用しても良く、また癌の治療に使用され得る他の薬剤及び治療方法と組み合わせて使用することができる。使用可能な他の薬剤及び治療方法としては、特に限定するものではないが、肝細胞癌であれば、例えばソラフェニブ等の分子標的薬、化学療法、ラジオ波焼灼療法、手術療法、肝動脈(化学)塞栓療法、放射線療法、重粒子線療法、ラジオアイソトープ治療、肝動注化学療法、ペプチドワクチン療法、他の免疫細胞療法等が挙げられる。本発明の治療剤と、上記の他の薬剤とは、同時に投与しても、別個に投与しても良く、また同じ投与経路で投与しても、異なる投与経路で投与しても良い。
【0044】
上記の治療剤はまた、単独で、又は他の有効成分と組み合わせて、医薬組成物の形態とすることもできる。医薬組成物に含まれ得る成分としては、本発明の治療剤及び他の有効成分の他に、投与形態に応じて、当分野において通常配合される、製薬上許容される担体、緩衝剤、安定化剤等が挙げられる。担体としては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、グルコース液及び緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、塩類、糖類、糖アルコール類等を添加剤として用いることもできる。尚、本発明の治療剤及び医薬組成物は、本発明の性質上、液状で投与することが意図され、従って、有効成分であるCTLの安定性を維持できる形態とすることが必要である。
【0045】
本発明の治療剤及び医薬組成物は、局所投与又は全身投与することができ、投与形態を特に限定するものではないが、例えば経静脈投与とすることができる。あるいはまた、患部若しくは患部の近辺に注射又は注入により投与しても良い。
【0046】
本発明の治療剤及び医薬組成物の投与量及び投与頻度は、患者の体重、性別、年齢、疾患の重篤度等に応じて変動するものであり、特に限定するものではないが、例えば本発明のＴ細胞を有効成分として、一回の投与量あたり約1×106～約1×1012個、好ましくは約1×108～約1×1011個の範囲の細胞を含有するものとし、１日１回～数回、２日毎、３日毎、１週間毎、２週間毎、毎月、２カ月毎、３カ月毎、６カ月毎に投与することが可能である。
【実施例0047】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0048】
細胞系
C1R-A24（HLA-A24を発現するC1Rリンパ腫亜細胞株；熊本大学エイズ学研究センター、滝口雅文先生より供与）、K562（ヒト慢性骨髄性白血病細胞；理化学研究所バイオリソースセンター細胞材料開発室-CELL BANK-より購入）、HepG2（ヒト肝癌由来細胞株；理化学研究所バイオリソースセンター細胞材料開発室-CELL BANK-より購入）及び本発明者が樹立したヒト肝癌由来細胞株であるMT細胞並びにKM細胞を使用した。C1R-A24細胞及びK562細胞は、10％ウシ胎児血清（BioWest S.A.S., Nuaille, France）を含有し、100μg/mLのストレプトマイシン及び100単位/mLのペニシリンを添加したRPMI-1640（Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japan）中に維持した。C1R-A24は500μg/mLのハイグロマイシンＢ含有培地中で選択した。HepG2細胞は、10％ウシ胎児血清を含有し、100μg/mLのストレプトマイシン及び100単位/mLのペニシリンを添加したDMEM（Wako Pure Chemical Industries Ltd.）中に維持したMT細胞及びKM細胞は、10％ウシ胎児血清を含有し、100μg/mLのストレプトマイシン及び100単位/mLのペニシリンを添加したDMEM（Wako Pure Chemical Industries Ltd.）中に維持した。
C1R-A24（HLA-A24を発現するC1Rリンパ腫亜細胞株；熊本大学エイズ学研究センター、滝口雅文先生より供与）、K562（ヒト慢性骨髄性白血病細胞；理化学研究所バイオリソースセンター細胞材料開発室-CELL BANK-より購入）、HepG2（ヒト肝癌由来細胞株；理化学研究所バイオリソースセンター細胞材料開発室-CELL BANK-より購入）及び本発明者が樹立したヒト肝癌由来細胞株であるMT細胞並びにKM細胞を使用した。C1R-A24細胞及びK562細胞は、10％ウシ胎児血清（BioWest S.A.S., Nuaille, France）を含有し、100μg/mLのストレプトマイシン及び100単位/mLのペニシリンを添加したRPMI-1640（Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japan）中に維持した。C1R-A24は500μg/mLのハイグロマイシンＢ含有培地中で選択した。HepG2細胞は、10％ウシ胎児血清を含有し、100μg/mLのストレプトマイシン及び100単位/mLのペニシリンを添加したDMEM（Wako Pure Chemical Industries Ltd.）中に維持したMT細胞及びKM細胞は、10％ウシ胎児血清を含有し、100μg/mLのストレプトマイシン及び100単位/mLのペニシリンを添加したDMEM（Wako Pure Chemical Industries Ltd.）中に維持した。
【0049】
［hTERT特異的CTLの誘導及びTCRクローニング］
hTERT由来ペプチドワクチンとして、hTERTペプチド（配列番号１）を使用した。本実施例では、血圧、脈拍の測定及び全身状態の確認を事前診断した、hTERT由来ペプチドワクチン治療の第I相臨床試験（UMIN000003511）に登録したヒト白血球抗原（HLA）-A24の患者14名から末梢血単核細胞（PBMC）を回収した。
hTERT由来ペプチドワクチンとして、hTERTペプチド（配列番号１）を使用した。本実施例では、血圧、脈拍の測定及び全身状態の確認を事前診断した、hTERT由来ペプチドワクチン治療の第I相臨床試験（UMIN000003511）に登録したヒト白血球抗原（HLA）-A24の患者14名から末梢血単核細胞（PBMC）を回収した。
【0050】
先ず、ペプチドバイアルに1mlの生理食塩水を5mlのロック付きシリンジで入れ、よく混合する。その後、溶解したペプチド溶液を1mlシリンジで回収する。そして、このシリンジを三方活栓に接続し、他方向のキャップをとり、内部をペプチド溶液で満たす。1mlのモンタナイドISA-51を5mlのロック付きシリンジにとり、ペプチド溶液を接続した三方活栓に接続する。そして、完全にエマルジョン化するまでよく混合し、一方のシリンジにペプチドワクチンを集め、三方活栓からはずす。21Gの注射針を取り付け、生理食塩水の表面に１滴垂らして拡散しないことを確認する。再度、三方活栓に接続し、ツベルクリン用注射器に500μlずつ3本に分けてペプチドワクチンを充填する。このように準備した後、被検者の左右どちらかの腋下に皮下投与する（1回につき0.03～3.0mgで、計3回の投与。被検者3人に対して0.03mgの投与量とし、被検者3人に対して0.3mgの投与量とし、被検者8人に対して3.0mgの投与量とした）。
【0051】
被検者からの末梢血単核球（PBMC）の分離は、フィコールを用いた密度勾配遠心分離によって行った。まず、Lymphoprep Tubeを2000rpm、1minで遠心し、フィコールを下に落としておく。次に、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）とヘパリン加血をLymphoprep Tubeに入れる。その後、2000rpmで20min、20℃(brake off)で遠心分離する。そして、ピペットを用いてPBMCの層を採取し、新しいファルコンチューブに入れる。チューブいっぱいまでPBSを加える。そして、1600rpmで6min、20℃(brake on)で遠心する。その後、上清を除去し、セルバンカーで懸濁してセラムチューブに保存する。
【0052】
本実施例では、得られたPBMCに対して細胞傷害性リンパ球（CTL）誘導した後、又は得られたPBMCをそのままフィコエリスリン（PE）-コンジュゲートhTERTペプチドMHCテトラマー（MBL Co., LTD., Aichi, Japan）で、続いてフルオレセインイソチオシアネート(FITC)-コンジュゲート抗-CD8抗体（MBL Co., LTD）及び7-AAD（Beckman Coulter, Inc., Indianapolis, IN, USA）で染色した。
【0053】
そして、誘導された抗原特異的CTLをFACSAria II（BD Bioscience, San Diego, CA, USA）を用いて単一細胞として検出して回収した。その後、α鎖可変領域及びβ鎖可変領域それぞれについてOne step PCR (RT→1st PCR)及び2nd PCRを実施した。増幅した核酸断片をPEG沈殿法にて精製し、1%アガロースゲルで電気泳動して増幅とシングルバンドを確認した。その後、外部委託にて増幅断片の塩基配列を決定し、得られた塩基配列をIMGT/V-QUEST（the international ImMunoGeneTics information system社製）にてα鎖可変領域及びβ鎖可変領域として確認した。
【0054】
そして、目的のα鎖可変領域とβ鎖可変領域をpMXs-IRES-GFP ベクター(liner vector)、βfragment、CαfragmentをGibson assemblyシステムでつなぎ、環状にligationされたベクターを作製した。作製したベクターを定法に従いコンピテントセル(JM109)に形質転換した。形質転換されたJM109株をLBプレートに播種し、得られたコロニーを用いたColony PCRによりα鎖可変領域とβ鎖可変領域を含む断片を増幅し、その後、1%アガロースゲルで電気泳動して増幅断片を確認した。また、PCRで増幅した断片をPEG沈殿法で精製後、外部委託により増幅断片の塩基配列を確認した後、Maxiprep法にてα鎖可変領域とβ鎖可変領域を含む断片を大量に精製した。
【0055】
以上のようにして、hTERTペプチドワクチンを投与した被検者由来のCTLから、α鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドとβ鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドをクローニングした。その結果、hTERTペプチド特異的CTLは、14名の被検者のうち5名（Pt1、Pt2、Pt3、Pt12及びPt13）で誘導された。
【0056】
［TCR遺伝子改変T細胞の作製］
PBMCへの形質導入のために、TCRα鎖及びTCRβ鎖可変領域をコードするcDNAを、同じTCR由来の配列の組合せで定常領域をコードするcDNA（ヒトPBMCよりクローニングして取得）と共にウイルスのP2A配列を介して連結してTCR発現ベクターを構築し（Leisegang M等、J. Mol. Med. 2008, July, 86(7), p.855）、次いでこれをpMXs-IRES-GFPベクター（コスモ・バイオ株式会社）中にクローニングし、Phoenix-Aレトロウイルスパッケージング細胞系（National Gene Vector Biorepository, Indianapolis, USA）にトランスフェクトした。尚、各TCRの定常領域のコドンは最適化した。得られたウイルス上清をろ過し、50μg/mlのRetroNectin（Takara Bio Inc., Shiga, Japan）をコートしたプレートに入れ、遠心分離した。
PBMCへの形質導入のために、TCRα鎖及びTCRβ鎖可変領域をコードするcDNAを、同じTCR由来の配列の組合せで定常領域をコードするcDNA（ヒトPBMCよりクローニングして取得）と共にウイルスのP2A配列を介して連結してTCR発現ベクターを構築し（Leisegang M等、J. Mol. Med. 2008, July, 86(7), p.855）、次いでこれをpMXs-IRES-GFPベクター（コスモ・バイオ株式会社）中にクローニングし、Phoenix-Aレトロウイルスパッケージング細胞系（National Gene Vector Biorepository, Indianapolis, USA）にトランスフェクトした。尚、各TCRの定常領域のコドンは最適化した。得られたウイルス上清をろ過し、50μg/mlのRetroNectin（Takara Bio Inc., Shiga, Japan）をコートしたプレートに入れ、遠心分離した。
【0057】
凍結保存されている健常者の末梢血単核球を解凍後1×106cells/wellで播種し、35U/mlのIL-2とCD3/CD28 Dynabeadsを加えた培養液で刺激した。一方、50μg/mlになるよう希釈したレトロネクチンで24wellプレートを一晩コートしておく。レトロネクチンを一晩コートしておいたプレートを500μl/wellの2％ BSA/PBSで洗浄し、目的のTCRをコードするレトロウイルスを含む培養上清を添加し、32℃で1900×g，2時間遠心してレトロウイルスをスピンロードした。
【0058】
そして、遠心後、刺激しておいた末梢血単核球を洗浄し、35U/mlのIL-2を添加した培養液で5×105cells/mlに調整し、レトロウイルスをスピンロードしたプレートに播種した。播種したプレートを32℃で1000×g、10分間遠心した後、37℃インキュベーターで細胞を培養した。その翌日も、同様に作製した新しいプレートに末梢血単核球を移し、37℃インキュベーターで培養した。さらに、その翌日、細胞培養用フラスコに35U/mlのIL-2を添加した培養液10mlでスケールアップした。
【0059】
また、末梢血単核球の刺激開始から7日後、CD3/CD28 Dynabeadsを加えて再刺激した。末梢血単核球の刺激開始から10日目に、上述した方法と同様にして、TCR遺伝子改変T細胞をテトラマー染色し、フローサイトメトリーにてTCRの発現を評価した。
【0060】
［細胞傷害活性の測定］
C1RA24細胞に対する傷害活性
本実験では、C1RA24細胞にクサビラオレンジ-ルシフェラーゼを導入したC1RA24-Luc細胞を標的細胞とした。傷害活性の測定アッセイの4～13時間前にC1RA24-Luc細胞に対してhTERTペプチドをパルスした。アッセイに際して、パルスしておいたC1RA24-Luc細胞の細胞数に対してK562細胞が40倍となるように、両細胞を混合した。
C1RA24細胞に対する傷害活性
本実験では、C1RA24細胞にクサビラオレンジ-ルシフェラーゼを導入したC1RA24-Luc細胞を標的細胞とした。傷害活性の測定アッセイの4～13時間前にC1RA24-Luc細胞に対してhTERTペプチドをパルスした。アッセイに際して、パルスしておいたC1RA24-Luc細胞の細胞数に対してK562細胞が40倍となるように、両細胞を混合した。
【0061】
一方、上述のように作製したTCR遺伝子改変T細胞を回収して細胞数を調整し、96wellプレートに2倍希釈系列を作製した。そして、TCR遺伝子改変T細胞：C1RA24-Luc細胞が50：1、25：1、12.5：1、6.25：1となるように、C1RA24-Luc細胞とK562細胞の混合液をウェルに入れ、37℃で4時間共培養した（培地：10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン含有RPMI1640 medium）。培養後、プレートを遠心して上清を取り除き、PBSとSteady-Gloを加え、室温で10分間インキュベーションして測光した（Steady-Glo Luciferase Assay System）。
【0062】
HepG2細胞に対する傷害活性
本実験では、予めRT-PCRにてhTERT遺伝子の発現を確認したHepG2ヒト肝がん由来細胞株を標的細胞とした。傷害活性の測定アッセイの前日に、8wellカバーグラスチャンバーにHepG2細胞を3×104cells/wellとなるように播種した（培地：10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン含有 フェノールレッド不含RPMI1640 medium）。測定アッセイの当日、HepG2細胞の培養液を取り除き、最終濃度が10μMになるように作製したCalcein Violet染色液（Calcein Violet 450 AM Viability Dye）を500μl/wellずつ入れ、37℃で30分間染色した。30分染色後、Calcein Violet染色液を取り除き、培養液500μl/wellで洗浄した。
本実験では、予めRT-PCRにてhTERT遺伝子の発現を確認したHepG2ヒト肝がん由来細胞株を標的細胞とした。傷害活性の測定アッセイの前日に、8wellカバーグラスチャンバーにHepG2細胞を3×104cells/wellとなるように播種した（培地：10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン含有 フェノールレッド不含RPMI1640 medium）。測定アッセイの当日、HepG2細胞の培養液を取り除き、最終濃度が10μMになるように作製したCalcein Violet染色液（Calcein Violet 450 AM Viability Dye）を500μl/wellずつ入れ、37℃で30分間染色した。30分染色後、Calcein Violet染色液を取り除き、培養液500μl/wellで洗浄した。
【0063】
一方、上述のように作製したTCR遺伝子改変T細胞は、培養後よく懸濁して回収し、遠心分離後、CD3/CD28 Dynabeadsを取り除き、6×105cells/mlの濃度に調製した。また、本実験では、陰性コントロールとしてCMV遺伝子改変T細胞を準備し、TCR遺伝子改変T細胞と同様に、6×105cells/mlの濃度となるようCMV遺伝子改変T細胞の懸濁液を調製した。
【0064】
そして、6×105cells/mlの濃度に調製したhTERT遺伝子改変T細胞とCMV遺伝子改変T細胞に、1μlの死細胞染色剤：PI（Propidium Iodide）と10μlの退色防止剤：Live Antifade Reagent, for live cell imagingを加え、よく混合したのち染色済みHepG2細胞が入っているところにそれぞれ500μl/wellずつ入れた。その後、10分間静置し、遺伝子改変T細胞を沈下させた。共焦点顕微鏡にて30秒おきに10時間細胞の様子を撮影し、撮影後に2分間の動画とした。細胞傷害性の解析は、動画を0秒とその後10秒おきにスクリーンショットを撮り、0秒時の画像で生細胞をカウント、その他の画像で死細胞をカウントし、対照群と比較した。
【0065】
MT(KM)細胞に対する傷害活性
本実験では、予めRT-PCRにてhTERT遺伝子の発現を確認したMT(KM)細胞を標的細胞とした。MT(KM)細胞を用いた傷害活性は、HepG2細胞と同様に測定した。
本実験では、予めRT-PCRにてhTERT遺伝子の発現を確認したMT(KM)細胞を標的細胞とした。MT(KM)細胞を用いた傷害活性は、HepG2細胞と同様に測定した。
【0066】
［結果］
本実施例の結果として、C1RA24細胞に対する傷害活性、HepG2細胞に対する傷害活性及びMT(KM)細胞に対する傷害活性を表４にまとめた。
本実施例の結果として、C1RA24細胞に対する傷害活性、HepG2細胞に対する傷害活性及びMT(KM)細胞に対する傷害活性を表４にまとめた。
【0067】
【表4】
【0068】
表４に示したように、供試した細胞に対する傷害活性に優れた９種類（CTL名12-78、12-91、12-3、13-4、13-47、1-57、1-80、1-112及び3-55）のTCRが同定された。同定したTCRにおけるα鎖可変領域及びβ鎖可変領域のアミノ酸配列と、これらα鎖可変領域及びβ鎖可変領域をコードする塩基配列を表５にまとめた。表５において奇数が塩基配列であり偶数がアミノ酸配列である。
【0069】
【表5】
【0070】
得られた塩基配列をIMGT/V-QUEST（the international ImMunoGeneTics information system社製）にて解析した結果を表６に示した。
【0071】
【表6】
【0072】
一例として、CTL：12-78について、HepG2細胞に対する傷害活性を測定した結果を図１に示した。図１において、横軸は処理時間を示し、縦軸は傷害活性（％）を示している。図１において12-78を含むTCR遺伝子改変T細胞による細胞傷害活性を実線で示し、比較のためCMV遺伝子改変T細胞による細胞傷害活性を破線で示した。また、CMV遺伝子改変T細胞又はTCR遺伝子改変T細胞をHepG2細胞と共培養し、100分後に撮像した写真を図２に示した。なお、図２において、右側がTCR遺伝子改変T細胞をHepG2細胞と共培養したときの写真であり、左側がCMV遺伝子改変T細胞をHepG2細胞と共培養したときの写真である。図１及び２に示すように、12-78を含むTCR遺伝子改変T細胞は、HepG2細胞に対して極めて優れた細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。
【0073】
また、CTL:12-91について、MT細胞に対する傷害活性を測定した結果を図３に示した。図３において、横軸は処理時間を示し、縦軸は傷害活性（％）を示している。図３において12-91を含むTCR遺伝子改変T細胞による細胞傷害活性を実線で示し、比較のためCMV遺伝子改変T細胞による細胞傷害活性を破線で示した。また、CMV遺伝子改変T細胞又はTCR遺伝子改変T細胞をMT細胞と共培養し、350分後に撮像した写真を図４に示した。なお、図４において、右側がTCR遺伝子改変T細胞をMT細胞と共培養したときの写真であり、左側がCMV遺伝子改変T細胞をMT細胞と共培養したときの写真である。図３及び４に示すように、12-91を含むTCR遺伝子改変T細胞は、MT細胞に対して極めて優れた細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】