特開 2024-51565 コラーゲン産生促進剤、皮膚老化予防改善剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024051565

(43)【公開日】2024-04-11

(54)【発明の名称】コラーゲン産生促進剤、皮膚老化予防改善剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 8/44 20060101AFI20240404BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20240404BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240404BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240404BHJP

   A61K 31/198 20060101ALI20240404BHJP

   A61K 31/401 20060101ALI20240404BHJP

   A61K 8/49 20060101ALI20240404BHJP

   A23L 33/175 20160101ALI20240404BHJP

   C07K 14/78 20060101ALN20240404BHJP

【ＦＩ】

A61K8/44

A61Q19/00

A61P43/00 111

A61P17/00

A61K31/198

A61P43/00 121

A61K31/401

A61K8/49

A23L33/175 ZNA

C07K14/78

【審査請求】未請求

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022157800

(22)【出願日】2022-09-30

(71)【出願人】

【識別番号】592262543

【氏名又は名称】日本メナード化粧品株式会社

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 千奈

(72)【発明者】

【氏名】奥野 凌輔

(72)【発明者】

【氏名】山羽 宏行

【テーマコード（参考）】

4B018

4C083

4C086

4C206

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B018MD19

4B018ME10

4C083AA082

4C083AA122

4C083AB032

4C083AC022

4C083AC072

4C083AC102

4C083AC122

4C083AC182

4C083AC242

4C083AC302

4C083AC352

4C083AC422

4C083AC432

4C083AC442

4C083AC482

4C083AC581

4C083AC582

4C083AC851

4C083AC852

4C083AD092

4C083AD352

4C083CC04

4C083CC05

4C083DD23

4C083DD27

4C083DD31

4C083DD41

4C083EE12

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC07

4C086MA63

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA89

4C086ZC52

4C086ZC75

4C206AA01

4C206AA02

4C206FA53

4C206MA01

4C206MA04

4C206MA83

4C206NA05

4C206NA14

4C206ZA89

4C206ZC52

4C206ZC75

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045EA50

(57)【要約】

【課題】コラーゲン産生促進剤、皮膚老化予防改善剤を提供する。
【解決手段】本発明のセリン、アルギニン、プロリン及びアラニンは、優れたコラーゲン産生促進作用及び皮膚老化予防改善作用を有していた。よって、セリン、アルギニン、プロリン及びアラニンを含有するコラーゲン産生促進剤、皮膚老化予防改善剤及びそれらを含有する化粧品、食品、医薬部外品及び医薬品に応用が可能である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

セリン、アルギニン、プロリン及びアラニンを含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。

【請求項2】

アミノ酸として、セリン、アルギニン、プロリン及びアラニンのみを含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。

【請求項3】

セリン、アルギニン、プロリン及びアラニンを含有することを特徴とする皮膚老化予防改善剤。

【請求項4】

アミノ酸として、セリン、アルギニン、プロリン及びアラニンのみを含有することを特徴とする皮膚老化予防改善剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、コラーゲン産生促進剤及び皮膚老化予防改善剤に関する。

【背景技術】

【0002】

コラーゲンは、哺乳動物組織の約１／３を占める主要な構造タンパク質であり、皮膚、骨、軟骨、腱、靭帯等の、多くのマトリックス組織の必須な成分である。そのため、コラーゲン産生が低下することにより、様々な疾患の原因となることが知られている。

【0003】

セラミドは、スフィンゴ脂質の一種であり、スフィンゴシンと脂肪酸がアミド結合した化合物群の総称である。セラミドは、細胞膜において高濃度で存在することが知られている。また、セラミドは、角質細胞間脂質の構成成分の一種であり、角化の過程において細胞外に分泌され、皮膚のバリア機能や水分保持能に重要な役割を果たしている。

【0004】

フィラグリンは、ケラトヒアリン顆粒の主成分であり、角質層上層に至る過程でアミノ酸に分解され、角質層の保湿性に重要な役割を果たすＮＭＦの主体となる。角質層におけるＮＭＦの減少は、その保湿性を低下させ乾燥を招く。尋常性魚鱗癬、老人性乾皮症、アトピー性皮膚炎等の角質層中ではアミノ酸が減少していることが知られているが、それらの皮膚ではフィラグリンの発現が低下していることが明らかにされている。したがって、角質層の保湿性維持の目的でＮＭＦの産生を高めるためにはケラチノサイトにおけるフィラグリンの産生促進が重要であると考えられる。

【0005】

皮膚は紫外線の他、乾燥、寒冷、熱、薬物等の様々な物理的及び化学的ストレスに日々曝されている。その結果、皮膚の機能低下が引き起こされ、様々な皮膚の老化現象が顕在化する。皮膚の老化現象には、シワの形成、皮膚のたるみ、はりの低下、バリア機能の低下、角質層の保湿性の低下等がある。シワには、表皮性のシワと真皮性のシワの二種類が存在することが知られている。表皮性のシワは、セラミド及びＮＭＦが減少することで、皮膚が乾燥し、表皮角質中の水分量が低下することで生じるシワである。そのため、表皮性のシワの予防改善には、セラミド及びフィラグリンの産生を促進させることが重要である。また、セラミド及びフィラグリンの産生を促進させることは、バリア機能の低下、角質層の保湿性の低下の予防改善にもなる。一方、真皮性のシワは、紫外線や加齢による真皮線維芽細胞におけるコラーゲン産生能の低下により生じるシワである。また、コラーゲン産生の低下は、皮膚のたるみ、はりの低下も生じさせる。そのため、真皮性のシワ、皮膚のたるみ、はりの低下の予防改善には、コラーゲンの産生を促進させることが重要である。セラミド、フィラグリン、コラーゲンの産生を促進させることは、上記作用により皮膚老化の予防改善に重要である。

【0006】

骨は、骨基質と呼ばれるコラーゲンを主体としたたんぱく質成分と骨塩と呼ばれるカルシウムやリンを主体としたミネラル成分からできている。骨基質であるコラーゲンは、骨の構造をつくり、骨を強くする役割を果たしている。さらに、コラーゲンが十分にないと、カルシウムを多く摂取してもカルシウムが骨に沈着せず、弱い骨となってしまう（非特許文献１）。そのため、コラーゲン産生を促進させることは、骨を丈夫にし、骨粗鬆症の予防改善に重要である。

【0007】

眼球は、眼窩プリーと呼ばれるコラーゲンを主体とした眼窩結合組織で囲まれ、安定して存在している。眼窩プリーは、加齢により菲薄化、断裂等が生じることが知られている。それにより、眼球の位置がずれ、サギングアイ症候群（加齢性斜視）となる（非特許文献２）。そのため、コラーゲン産生を促進させることは、サギングアイ症候群の予防改善に重要である。

【0008】

その他にも、コラーゲンの減少は、関節炎、腱鞘炎、歯肉退縮等の原因となることが知られている。また、創傷の治癒過程において、コラーゲンの産生量が亢進し、創傷の治癒を促進することが知られている。よって、コラーゲンの産生を促進させることは、関節炎、腱鞘炎、歯肉退縮の予防改善及び皮膚の創傷治癒にも有効である。

【0009】

本発明で用いられるセリン、アルギニン、プロリン及びアラニンは、タンパク質の構成アミノ酸であり、ヒトは通常セリン、アルギニン、プロリン及びアラニンを含むタンパク質を食品から栄養素として摂取している。各アミノ酸は、単独では、セリンは、コラゲナーゼ産生促進剤（特許文献１）、アルギニンは、匂い増強剤（特許文献２）、プロリンは、タンパク質製剤の粘度を低下させるための使用（特許文献３）、アラニンは、抗肥満用組成物（特許文献４）が報告されている。しかし、セリン、アルギニン、プロリン及びアラニンのみを組み合わせたアミノ酸組成物に関する報告はなく、コラーゲン産生促進剤及び皮膚老化予防改善剤として利用されていることは知られていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】特開平１０-１４１４

【特許文献2】特開２０１８－１２３２５２

【特許文献3】特表２０１３-５１８８５２

【特許文献4】特開２０２１－７５５７７

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】札幌医科大学保健医療学部紀要 Ｎｏ．６（２００３）１－８

【非特許文献2】神経眼科 Ｎｏ．３２（２０１５）２９１－２９５

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

コラーゲン産生促進作用及び皮膚老化予防改善作用に優れた素材が望まれているが、未だ十分満足し得るものが提供されていないのが現状である。

【課題を解決するための手段】

【0013】

このような事情により、本発明者らは鋭意検討した結果、セリン、アルギニン、プロリン及びアラニンの組み合わせに優れたコラーゲン産生促進作用及び皮膚老化予防改善作用を見いだし、本発明を完成するに至った。

【0014】

すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）セリン、アルギニン、プロリン及びアラニンを含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
（２）アミノ酸として、セリン、アルギニン、プロリン及びアラニンのみを含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
（３）セリン、アルギニン、プロリン及びアラニンを含有することを特徴とする皮膚老化予防改善剤。
（４）アミノ酸として、セリン、アルギニン、プロリン及びアラニンのみを含有することを特徴とする皮膚老化予防改善剤。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明に用いるセリンは、別名として２－アミノ－３－ヒドロキシプロピオン酸で呼ばれるアミノ酸である。本発明に用いるアルギニンは、別名として２－アミノ－５－グアニジノペンタン酸で呼ばれるアミノ酸である。本発明に用いるプロリンは、別名としてピロリジン－２－カルボン酸で呼ばれるアミノ酸である。本発明に用いるアラニンは、別名として２－アミノプロピオン酸、α―アラニンで呼ばれるアミノ酸である。セリン、アルギニン、プロリン及びアラニンは、Ｄ－及びＬ－の光学異性体いずれを用いてもよい。また、コラーゲン産生促進効果及び皮膚老化予防改善効果を損なわないことを条件として、塩又は誘導体を使用してもよい。塩は、金属塩やアミン塩等があり、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、トリエチルアミン塩、ベンジルアミン塩等が挙げられる。誘導体は、セリン、アルギニン、プロリン及びアラニンの分子が、アミノ基かカルボニル基、側鎖いずれかにおいて原子団と共有結合したものを指す。前記原子団は、Ｎ－フェニルアセチル基、４，４‘－ジメトキシトリチル基等の保護基、メチルエステル、エチルエステル、脂肪族エステル、芳香族エステル等のエステル基が含まれる。

【0016】

本発明のコラーゲン産生促進剤におけるコラーゲンは、皮膚、骨、軟骨、腱、靱帯等を構成するタンパク質のひとつで、細胞外マトリックスの主成分である。コラーゲンは機能や構造により型で分類されており、本発明におけるコラーゲンの型は特に限定されないが、Ｉ型、ＩＩＩ型、Ｖ型のコラーゲンが、好ましくはＩ型のコラーゲンが、さらに好ましくは、皮膚に存在するＩ型のコラーゲンがよい。

【0017】

本発明の皮膚老化予防改善剤における皮膚老化は、加齢により、コラーゲン、フィラグリン、セラミドの産生が低下することでもたらされるシワの形成、皮膚のたるみ、はりの低下、バリア機能の低下、角質層の保湿性の低下のことである。

【0018】

本発明におけるセリン、アルギニン、プロリン及びアラニンは、コラーゲン産生を促進すること、及びコラーゲン、フィラグリン、セラミドの低下により生じる皮膚老化を予防改善することにより、シワの形成、皮膚のたるみ、はりの低下、バリア機能の低下、角質層の保湿性の低下、骨粗鬆症、サギングアイ症候群、関節炎、腱鞘炎、歯肉退縮等の疾患の抑制及び皮膚の創傷治癒ができる。

【0019】

本発明は、コラーゲン産生促進効果及び皮膚老化予防改善効果を損なわない範囲内で、医薬品、医薬部外品、化粧品及び食品等に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤、賦形剤、皮膜剤、甘味料、酸味料等の成分が含有されていてもよい。

【0020】

本発明は、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品のいずれにも用いることができ、その剤形としては、例えば、軟膏、パップ剤、散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤、乳剤、坐剤、注射用溶液、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅、錠菓、チョコレート、ガム、飴、飲料等が挙げられる。好ましくは、患部における試料局所濃度を高められるため、外用剤の形態がよい。

【0021】

外用の場合、本発明に用いるセリン、アルギニン、プロリン及びアラニンの含有量は、固形物に換算して各アミノ酸０．０００１ｍＭ（ｍｍｏｌ／Ｌ）以上が好ましく、０．００１～１０００ｍＭがより好ましい。０．０００１ｍＭ未満では十分な効果は望みにくい。１０００ｍＭを越えると、効果の増強は認められにくく不経済である。

【0022】

内用の場合、摂取量は年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なる。通常、成人１人当たりの１日の摂取量としては、各アミノ酸２ｍｇ／ｋｇ以上が好ましく、５～５０ｍｇ／ｋｇがより好ましい。

【0023】

本発明に用いるセリン、アルギニン、プロリン及びアラニンは、アミノ酸全量に対し、セリンを２０～４０重量％、アルギニンを２０～４０重量％、プロリンを２０～３０重量％、アラニンを１０～２５重量％の割合で組み合わせることが好ましい。また、他のアミノ酸を含まないことが好ましい。

【0024】

次に本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いるコラーゲン産生促進剤の処方例及び実験例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。処方例に示す％とは重量％を示す。

【実施例0025】

（処方例１）ローション
処方 含有量（重量％）
１．Ｌ－セリン ０．１
２．Ｌ－アルギニン ０．１
３．Ｌ－プロリン ０．１
４．Ｌ－アラニン ０．１
５．１，３－ブチレングリコール ８．０
６．グリセリン ２．０
７．キサンタンガム ０．０２
８．クエン酸 ０．０１
９．クエン酸ナトリウム ０．１
１０．エタノール ５．０
１１．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
１２．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．） ０．１
１３．香料 ０．１
１４．精製水 残量
［製造方法］成分１～９及び１４と、成分１０～１３をそれぞれ均一に溶解した後、両者を混合し濾過してローションを調製する。

【0026】

（処方例２）クリーム
処方 含有量（重量％）
１．Ｌ－セリン ０．５
２．Ｌ－アルギニン ０．９
３．Ｌ－プロリン ０．６
４．Ｌ－アラニン ０．４
５．スクワラン ５．５
６．オリーブ油 ３．０
７．ステアリン酸 ２．０
８．ミツロウ ２．０
９．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
１０．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
１１．ベヘニルアルコール １．５
１２．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１３．香料 ０．１
１４．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１５．パラオキシ安息香酸エチル ０．０５
１６．１，３－ブチレングリコール ８．５
１７．精製水 残量
［製造方法］成分５～１２を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１～４及び１４～1７を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。次いで、油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１３を加え、さらに３０℃まで冷却して製品とする。

【0027】

（処方例３）乳液
処方 含有量（重量％）
１．Ｌ－セリン ０．００３
２．Ｌ－アルギニン ０．００３
３．Ｌ－プロリン ０．００２
４．Ｌ－アラニン ０．００２
５．スクワラン ５．０
６．オリーブ油 ５．０
７．ホホバ油 ５．０
８．セタノール １．５
９．モノステアリン酸グリセリン ２．０
１０．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
１１．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
１２．香料 ０．１
１３．プロピレングリコール １．０
１４．グリセリン ２．０
１５．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１６．精製水 残量
［製造方法］成分５～１１を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１～４及び１３～１６を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１２を加え、さらに３０℃まで冷却して製品とする。

【0028】

（処方例４）ゲル剤
処方 含有量（重量％）
１．Ｌ－セリン ０．８
２．Ｌ－アルギニン ０．８
３．Ｌ－プロリン ０．８
４．Ｌ－アラニン ０．８
５．エタノール ５．０
６．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
７．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．） ０．１
８．香料 ０．１
９．１，３－ブチレングリコール ５．０
１０．グリセリン ５．０
１１．キサンタンガム ０．１
１２．カルボキシビニルポリマー ０．２
１３．水酸化カリウム ０．２
１４．精製水 残量
［製造方法］成分５～８と、成分１～４及び９～１４をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。

【0029】

（処方例５）軟膏
処方 含有量（重量％）
１．Ｌ－セリン ０．８
２．Ｌ－アルギニン ０．８
３．Ｌ－プロリン ０．８
４．Ｌ－アラニン ０．６
５．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．） ２．０
６．モノステアリン酸グリセリン １０．０
７．流動パラフィン ５．０
８．セタノール ６．０
９．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
１０．プロピレングリコール １０．０
１１．精製水 残量
［製造方法］成分５～９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１～４及び１０、１１を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。

【0030】

（処方例６）散剤
処方 含有量（重量％）
１．Ｌ－セリン ５．０
２．Ｌ－アルギニン ５．０
３．Ｌ－プロリン ５．０
４．Ｌ－アラニン ５．０
５．乾燥コーンスターチ ２５．０
６．微結晶セルロース ５５．０
［製造方法］成分１～６を混合し、散剤とする。

【0031】

（処方例７）飲料
処方 含有量（重量％）
１．Ｌ－セリン １．６
２．Ｌ－アルギニン ０．９
３．Ｌ－プロリン １．２
４．Ｌ－アラニン ０．８
５．ステビア ０．０５
６．リンゴ酸 ５．０
７．アスコルビン酸ナトリウム １．０
８．香料 ０．１
９．精製水 残量
［製造方法］成分１～８を成分９の一部の精製水に撹拌溶解する。次いで、成分９の残りの精製水を加えて混合し、９０℃に加熱して５０ｍＬのガラス瓶に充填する。

【0032】

次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例を挙げる。

【実施例0033】

実験例１ コラーゲン産生促進効果の測定
ヒト皮膚線維芽細胞をφ６０ｍｍ ｄｉｓｈに播種し、コンフルエントになった後に、Ｌ－セリン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－アラニンをそれぞれ終濃度０．１ｍＭになるように添加したアミノ酸不含有培地、又は上記４種のアミノ酸をそれぞれ終濃度０．０２５ｍＭになるように、４種全てを混合した試料（以下、アミノ酸組成物１と記す）を添加したアミノ酸不含有培地で培養した。コントロールは試料未添加のアミノ酸不含有培地を使用した。２４時間培養後、総ＲＮＡの抽出を行った。細胞からの総ＲＮＡの抽出はＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ（タカラバイオ）を用いて行い、総ＲＮＡ量は分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて２６０ｎｍにおける吸光度により求めた。ｍＲＮＡ発現量の測定は、細胞から抽出した総ＲＮＡを基にしてリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法により行った。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法には、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）及びＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ライフテクノロジーズ）を用いた。すなわち、５００ｎｇの総ＲＮＡを逆転写反応後、ＰＣＲ反応（９５℃：１５秒間、６０℃：６０秒間、４０ｃｙｃｌｅｓ）を行った。その他の操作は定められた方法に従い、ＣＯＬ１Ａ１（タイプＩコラーゲン） ｍＲＮＡの発現量を、内部標準であるＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現量に対する割合として求めた。コラーゲン産生促進率を、コントロールのＣＯＬ１Ａ１ ｍＲＮＡの発現量に対する試料添加群のＣＯＬ１Ａ１ ｍＲＮＡの発現量の比率として算出した。尚、各遺伝子の発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。

【0034】

ＣＯＬ１Ａ１用のプライマーセット
ＡＧＧＡＣＡＡＧＡＧＧＣＡＴＧＴＣＴＧＧＴＴ（配列番号１）
ＴＴＧＣＡＧＴＧＧＴＡＧＧＴＧＡＴＧＴＴＣＴＧ（配列番号２）
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット
ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ（配列番号３）
ＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧ（配列番号４）

【0035】

実験結果を表１に示した。その結果、本発明のアミノ酸組成物１には、ＣＯＬ１Ａ１発現促進効果が認められた。すなわち、本発明のアミノ酸組成物１は、コラーゲン産生促進作用を有することが示され、皮膚老化予防改善作用が示された。尚、アミノ酸組成物１は、アミノ酸単独で用いるよりも高い効果を有し、４種のアミノ酸を組み合わせることにより優れた効果が示された。

【0036】

【0037】

実験例２ セラミド産生促進効果及びフィラグリン産生促進効果の測定
ヒト皮膚角化細胞をφ６０ｍｍ ｄｉｓｈに播種し、コンフルエントになった後に、Ｌ－セリン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－プロリン及びＬ－アラニンをそれぞれ終濃度１ｍＭになるように４種全てを混合した試料（以下、アミノ酸組成物２と記す）を添加したアミノ酸不含有培地で培養した。コントロールは試料未添加のアミノ酸不含有培地を使用した。６時間培養後、総ＲＮＡの抽出を行った。細胞からの総ＲＮＡの抽出はＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ（タカラバイオ）を用いて行い、総ＲＮＡ量は分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて２６０ｎｍにおける吸光度により求めた。ｍＲＮＡ発現量の測定は、細胞から抽出した総ＲＮＡを基にしてリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法により行った。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法には、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）及びＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ライフテクノロジーズ）を用いた。すなわち、５００ｎｇの総ＲＮＡを逆転写反応後、ＰＣＲ反応（９５℃：１５秒間、６０℃：６０秒間、４０ｃｙｃｌｅｓ）を行った。その他の操作は定められた方法に従い、セラミド合成の律速酵素であるＳＰＴ（セリンパルミトイルトランスフェラーゼ） ｍＲＮＡの発現量又はＦＬＧ（フィラグリン） ｍＲＮＡを、内部標準であるＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現量に対する割合として求めた。セラミド産生促進率を、コントロールのＳＰＴ ｍＲＮＡの発現量に対する試料添加群のＳＰＴ ｍＲＮＡの発現量の比率として算出した。フィラグリン産生促進率を、コントロールのＦＬＧ ｍＲＮＡの発現量に対する試料添加群のＦＬＧ ｍＲＮＡの発現量の比率として算出した。尚、各遺伝子の発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。

【0038】

ＳＰＴ用のプライマーセット
ＣＡＧＣＣＴＴＧＧＴＡＡＡＧＡＧＴＧＴＧ（配列番号５）
ＡＴＴＴＣＣＡＴＡＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＣ（配列番号６）
ＦＬＧ用のプライマーセット
ＧＧＡＴＣＡＣＴＴＧＧＡＴＡＴＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＡ（配列番号７）
ＴＧＡＧＣＣＡＡＣＴＴＧＡＡＴＡＣＣＡＴＣＡＧＡ（配列番号８）

【0039】

実験結果を表２に示した。その結果、本発明のアミノ酸組成物２には、顕著なＳＰＴ発現促進効果及びＦＬＧ発現促進効果が認められた。すなわち、本発明のアミノ酸組成物２には、セラミド産生促進作用及びフィラグリン産生促進作用が示され、皮膚老化予防改善作用が示された。

【0040】

【表2】