特開 2024-52931 細胞認識およびインテグレーションのための核酸

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024052931

(43)【公開日】2024-04-12

(54)【発明の名称】細胞認識およびインテグレーションのための核酸

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20240405BHJP

   A61K 51/04 20060101ALI20240405BHJP

   A61K 49/12 20060101ALI20240405BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240405BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240405BHJP

   A61K 47/30 20060101ALI20240405BHJP

   A61K 47/56 20170101ALI20240405BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20240405BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20240405BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240405BHJP

   C40B 40/08 20060101ALI20240405BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20240405BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240405BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20240405BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00

A61K51/04 310

A61K51/04 320

A61K49/12

A61K35/76

A61P35/00

A61P37/04

A61P43/00 121

A61K47/30

A61K47/56

A61K38/00

A61K39/00 G

C12N15/63 Z

C40B40/08

C12Q1/6869 Z

C12N15/12 ZNA

C12N15/11 Z

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024031208

(22)【出願日】2024-03-01

(62)【分割の表示】P 2021540384の分割

【原出願日】2019-09-24

(31)【優先権主張番号】62/736,323

(32)【優先日】2018-09-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/875,887

(32)【優先日】2019-07-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】504391260

【氏名又は名称】エモリー ユニバーシティー

(71)【出願人】

【識別番号】521123943

【氏名又は名称】コディカズ セラピューティック ソリューションズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】レオン バナール－ミズラチ

(72)【発明者】

【氏名】マシュー チャールズ ティンダール

(57)【要約】

【課題】標的細胞（例えば、がん細胞などの疾患を有する細胞）または細胞集団（例えば、組織）にホーミングする、それらを標的とする、それらの細胞質を通過する、および／またはそれらの核膜を通過する「ｚｉｐコード」配列、ならびにそのような標的細胞のゲノムへのそのような核酸または核酸送達システムの少なくとも一部のインテグレーションを可能にするインテグレーション配列を含む核酸配列および核酸送達構築物を提供すること。
【解決手段】本開示はまた、そのようなＺｉｐコードおよびインテグレーション配列ならびにそのような核酸構築物およびシステムに共有結合または非共有結合によってカップリングされ得る１つまたは複数のカーゴ分子を含む天然に存在しない核酸構築物および送達システムも提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

本明細書に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、その出願が全ての目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年７月１８日に出願された米国仮出願第６２／８７５，８８７号、および２０１８年９月２５日に出願された米国仮出願第６２／７３６，３２３号に基づく利益を主張する。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子出願されている配列表を含有し、配列表はその全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年９月２３日に作成され、名称は５４７７４－７０２＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは７９３，７７０バイトである。

【背景技術】

【0003】

背景
転位因子（ＴＥまたはトランスポゾン）は、ゲノム内でその位置を変化させることができるＤＮＡ配列であり、時に突然変異を生成するかまたは突然変異からの復帰を生じ、細胞の遺伝的同一性およびゲノムサイズを変更する。転位因子は、これまでがんを含む様々な疾患に関連付けられているが、疾患の発症に対するその関係は、存在する場合、よりよく理解する必要がある。例えば、がんは、米国における死因の第２位であり、がん関連死は１日あたり１，６００例を超えており、年間ではほぼ６００，０００例である。２０１５年に診断されたがんの新規症例はおよそ１６５万人であり、がんの発生率は、人口統計学的要因およびライフスタイルの要因により増加しつつある。このように、がんおよび他の慢性の感染性または加齢関連疾患の検出および処置のための感度がよく、有効で、特に細胞、組織、および／または臓器特異的な組成物および方法に対するアンメットニーズが存在する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

要旨
様々な態様では、本開示は、ｉｎ ｖｉｖｏで標的組織への構築物の移行を方向付ける（向性）デオキシリボ核酸配列を含む核酸構築物を提供する。構築物は、標的組織の細胞にインテグレートするためにトランスポゾンに由来する２つまたはそれより多くの配列、例えば３’配列および５’配列を含み得る。

【0005】

様々な態様では、本開示は、ｉｎ ｖｉｖｏでの標的組織または標的細胞への構築物の移行を方向付ける（向性）配列を含む様々な医薬組成物を記載する。一部の例では、本開示は、核酸構築物の治療有効量を含む医薬組成物であって、核酸構築物が、ａ）ｉｎ ｖｉｖｏでの予め選択された組織への前記核酸構築物の移行を方向付ける第１のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列、およびｂ）ｉｎ ｖｉｖｏでの前記予め選択された組織からの細胞のゲノムへの前記核酸構築物の領域のインテグレーションを方向付ける第２のデオキシリボ核酸配列を含み、この医薬組成物は、対象に投与するために製剤化されている、医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、前記第１のデオキシリボ核酸配列は、前記予め選択された組織からの前記細胞と同じ細胞型に由来する。一部の実施形態では、前記対象はヒトである。一部の実施形態では、前記第１のデオキシリボ核酸配列は、白血球へと移行する。一部の実施形態では、前記第１のデオキシリボ核酸配列は、膵細胞へと移行する。一部の実施形態では、前記第１のデオキシリボ核酸配列は、肺細胞へと移行する。一部の実施形態では、前記核酸構築物は、前記対象に投与した場合、前記予め選択された組織からの前記細胞の核膜を通過する。一部の実施形態では、前記第１のデオキシリボ核酸配列は、配列番号２０３～配列番号２７７および配列番号２８２のいずれか１つの少なくとも１２塩基と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、前記第１のデオキシリボ核酸配列は、長さが少なくとも４００塩基対である。一部の実施形態では、前記第１のデオキシリボ核酸配列は、長さが４００塩基対～２０，０００塩基対の間である。一部の実施形態では、前記第２のデオキシリボ核酸配列は、トランスポゾン配列と少なくとも９０％の相同性を有する。一部の実施形態では、前記トランスポゾンは、クラスＩＩトランスポゾンである。一部の実施形態では、前記クラスＩＩトランスポゾンは、遺伝子の水平伝播を介して前記予め選択された組織からの前記細胞の前記ゲノムにそれ自身をインテグレートする。一部の実施形態では、前記核酸構築物は、少なくとも１つの追加のデオキシリボ核酸配列（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも１つの追加のデオキシリボ核酸配列は、組織選択的プロモーターを含む。一部の実施形態では、前記少なくとも１つの追加のデオキシリボ核酸配列は、前記ゲノムへの組み込みのために第２のインテグレーションシグナルを含む。一部の実施形態では、前記少なくとも１つの追加のデオキシリボ核酸配列は、ペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも１つの追加のデオキシリボ核酸配列は、前記ペプチドまたはタンパク質が、前記予め選択された組織からの前記細胞に限って発現されることを確実にする配列を含む。一部の実施形態では、前記ペプチドまたは前記タンパク質は、腫瘍抑制ペプチドまたは腫瘍抑制タンパク質をコードする。一部の実施形態では、前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質は、多発性骨髄腫腫瘍抑制遺伝子である。一部の実施形態では、前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質は、膵臓がん腫瘍抑制遺伝子である。一部の実施形態では、前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質は、肺がん腫瘍抑制遺伝子である。一部の実施形態では、前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質は、網膜芽細胞腫感受性遺伝子（ＲＢ）、ウィルムス腫瘍（ＷＴ１）、神経線維腫症１型（ＮＦ１）、家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）、フォンヒッペル－リンドウ症候群（ＶＨＬ）、野生型ｐ５３、またはスーパーリプレッサーｐ５３のいずれか１つである。一部の実施形態では、前記ペプチドまたは前記タンパク質は、抗原性タンパク質をコードする。一部の実施形態では、前記抗原性タンパク質は、前記対象に投与されると前記細胞において特異的に翻訳される。一部の実施形態では、前記医薬組成物はカーゴをさらに含む。一部の実施形態では、前記カーゴはフルオロフォアまたは放射性同位体である。一部の実施形態では、前記カーゴは治療薬である。一部の実施形態では、カーゴは、前記核酸構築物に共有結合されている。一部の実施形態では、前記製剤は、ナノ粒子またはカチオン性ポリマーを含む。

【0006】

様々な態様では、本開示は、配列番号２０３～配列番号２７７または配列番号２８２のいずれか１つの少なくとも１２塩基と少なくとも９０％の配列同一性を有する第１の配列、または追加の核酸配列を含むベクターを提供する。一部の実施形態では、前記追加の核酸配列は、本明細書に記載されるトランスポゾン配列と少なくとも９０％の相同性を有する。一部の実施形態では、前記トランスポゾンは、クラスＩＩトランスポゾンである。一部の実施形態では、前記クラスＩＩトランスポゾンは、遺伝子の水平伝播を介して前記予め選択された組織からの前記細胞の前記ゲノムにそれ自身をインテグレートする。一部の実施形態では、前記ベクターは、少なくとも２つの追加の核酸配列を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも２つの追加の核酸配列は、組織選択的プロモーターおよびトランスポゾン配列を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも２つの追加の核酸配列は、少なくとも２つのトランスポゾン配列を含む。一部の実施形態では、前記追加の核酸配列は、ペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含む。一部の実施形態では、前記ペプチドまたは前記タンパク質は、腫瘍抑制ペプチドまたは腫瘍抑制タンパク質をコードする。一部の実施形態では、前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質は、多発性骨髄腫腫瘍抑制遺伝子である。一部の実施形態では、前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質は、膵臓がん腫瘍抑制遺伝子である。一部の実施形態では、腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質は、肺がん腫瘍抑制遺伝子である。一部の実施形態では、前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質は、網膜芽細胞腫感受性遺伝子（ＲＢ）、ウィルムス腫瘍（ＷＴ１）、神経線維腫症１型（ＮＦ１）、家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）、フォンヒッペル－リンドウ症候群（ＶＨＬ）、野生型ｐ５３、またはスーパーリプレッサーｐ５３のいずれか１つである。一部の実施形態では、前記ベクターは、カーゴに共有結合により連結される。一部の実施形態では、前記カーゴは、フルオロフォアまたは放射性同位体である。一部の実施形態では、前記カーゴは治療薬である。

【0007】

様々な態様では、本開示は、２つまたはそれより多くの前記ベクターのライブラリを提供する。

【0008】

様々な態様では、本開示は、がんを処置する方法であって、前記がんに罹患している対象の組織へのカーゴの移行を方向付ける核酸配列を含む核酸構築物の治療有効量を投与することを含み、組成物が、対象に投与するために製剤化されている、方法を提供する。一部の実施形態では、がんは肺がんである。一部の実施形態では、がんは多発性骨髄腫である。一部の実施形態では、がんは膵臓がんである。一部の実施形態では、前記核酸構築物は、前記対象に投与されると前記組織細胞の細胞における核膜を通過する。一部の実施形態では、前記組織への前記カーゴの移行を方向付ける前記核酸配列は、配列番号２０３～配列番号２７７または配列番号２８２のいずれか１つの少なくとも１２塩基と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態では、前記核酸構築物は、前記組織の細胞のゲノムへのインテグレーションのためにトランスポゾンを含む。一部の実施形態では、前記トランスポゾンは、長さが少なくとも４００塩基対である。一部の実施形態では、前記トランスポゾンは、長さが４００塩基対～２０，０００塩基対の間である。一部の実施形態では、前記トランスポゾンは、クラスＩＩトランスポゾンである。一部の実施形態では、前記核酸構築物は、前記組織の細胞に対して異種である少なくとも１つの追加の核酸配列を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも１つの追加の核酸配列は、組織選択的プロモーターを含む。一部の実施形態では、前記少なくとも１つの追加の核酸配列は、ペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも１つの追加の核酸配列は、標的ゲノムへの組み込みのためのインテグレーションシグナルを含む。一部の実施形態では、前記少なくとも１つの追加の核酸配列は、前記細胞を標的とするためのガイド配列を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも１つの追加の核酸配列は、ペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含む。一部の実施形態では、前記ペプチドまたは前記タンパク質は、腫瘍抑制ペプチドまたは腫瘍抑制タンパク質をコードする。一部の実施形態では、前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質は、多発性骨髄腫腫瘍抑制遺伝子である。一部の実施形態では、前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質は、膵臓がん腫瘍抑制遺伝子である。一部の実施形態では、前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質は、肺がん腫瘍抑制遺伝子である。一部の実施形態では、前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質は、網膜芽細胞腫感受性遺伝子（ＲＢ）、ウィルムス腫瘍（ＷＴ１）、神経線維腫症１型（ＮＦ１）、家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）、フォンヒッペル－リンドウ症候群（ＶＨＬ）、野生型ｐ５３、またはスーパーリプレッサーｐ５３のいずれか１つである。一部の実施形態では、前記ペプチドまたは前記タンパク質は、抗原性タンパク質をコードする。一部の実施形態では、前記抗原性タンパク質は、前記対象に投与されると前記組織の細胞において特異的に翻訳される。一部の実施形態では、前記核酸構築物は、フルオロフォアまたは放射性同位体に共有結合により連結される。一部の実施形態では、前記核酸構築物は、治療薬に共有結合により連結される。

【0009】

一部の例では、本開示は、第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列を含む核酸構築物であって、そのような第１のＤＮＡ配列が、構築物を特定の臓器、組織、および／または細胞に方向付けることが可能な標的化配列であり得、第２のＤＮＡ配列が、構築物の少なくとも領域または一部を特定の臓器または組織の細胞のゲノムにインテグレートすることが可能なインテグレーション配列であり得る、核酸構築物を提供する。一部の例では、第１の（細胞標的化／認識）および第２の（インテグレーション）ＤＮＡ配列は、Ｚｉｐコード配列（ＺＣＳ）、トランスポゾン、または転位因子の一部であり得る。そのようなＺＣＳまたはトランスポゾンは、配列番号２０３～配列番号２７７もしくは配列番号２８２のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する、またはその断片と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る細胞標的化および認識配列を含み得る。そのような断片は、少なくとも約８、１０、１２、１５、２０、２５、または３０ヌクレオチド長であり得る。一部の例では、そのようなトランスポゾンは、クラスＩＩトランスポゾンであり得る。

【0010】

一部の例では、そのような核酸構築物は、がん細胞間で遺伝子を伝播させるためのビヒクルとして役立つことができ、およびカーゴ（例えば、核酸、タンパク質、低分子、またはナノ粒子）を細胞に輸送するために使用することができ、そのような細胞は第１および／または第２の核酸配列がそれに由来する（またはそこから排泄された）細胞と同じ起源の細胞であり得る。本明細書において詳しく記載するように、ｃｔＤＮＡなどの遺伝物質の細胞（例えば、腫瘍細胞）への伝播は、細胞のクローン性の構造を変更することができ、そのような細胞（例えば、腫瘍細胞）の環境変化、例えば薬物処置に対する運命を決定し得る。

【0011】

一部の例では、本開示はまた、本明細書に記載される核酸構築物の様々な驚くべき意外な属性も提供する。そのようなユニークな属性は、向性を含み得るが、これは、本明細書において構築物が、第１の（標的化）配列および／または第２の（インテグレーション）配列が由来する細胞と同じまたは類似の起源の細胞である細胞を標的とするおよび／または細胞に侵入する能力として定義され得る。様々な例では、本明細書における核酸構築物のそのような標的化および／またはインテグレーション配列は、循環する腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）に由来し得る。本明細書に提供される構築物のそのような属性の別の例は、類似の起源の細胞と異なる組織または臓器を起源とする細胞とを識別する能力を含み得る。一例として、多発性骨髄腫（ＭＭ）腫瘍細胞を起源とするｃｔＤＮＡに由来する第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列を含む核酸構築物は、他の腫瘍、例えば膵臓がん（ＰＣ）、肺がん、または大腸がんの細胞と比較して高い特異性でＭＭ細胞のゲノムを標的とする、ゲノムに侵入する、および／またはゲノムにインテグレートすることができる。そのような特異性は、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％であり得る。さらに、そのような構築物は、異なる細胞系からのＭＭ細胞を標的とすることができる。そのため、例えば、ＭＭ特異的核酸構築物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで例えばカーゴをＭＭ細胞（例えば、ＭＭ１Ｓ細胞）に輸送するために、またはｉｎ ｖｉｖｏで対象（例えば、齧歯類またはヒト）の腫瘍のＭＭ細胞にカーゴを輸送するために使用することができる。

【0012】

本開示は、細胞（例えば、がん細胞）のゲノムへの細胞の標的化および認識および挿入をそれぞれ可能にするそのようなユニークな標的化および／またはインテグレーション配列（例えば、ＺＣＳまたはトランスポゾン）を識別するために使用することができる機能的アッセイをさらに提供する。例えば、送達システムにおいて使用するための細胞特異的認識配列および／またはゲノムインテグレーション配列を、本明細書における実施例２に記載されるように識別することができる。一部の例では、そのような標的化および／またはインテグレーション配列を生成するために使用することができるｃｔＤＮＡは、対象、例えば対象の血漿から得ることができる。そのような対象はヒトであり得る。ヒト対象は、がんなどの疾患を有すると診断されている対象であり得る。一部の態様では、本開示は、実質的に類似の起源の組織または細胞へと移行する（向性）核酸配列を識別する方法であって、（ａ）循環する腫瘍核酸を生物試料から単離し、それによって単離された腫瘍核酸のセットを生成すること、（ｂ）前記単離された循環する腫瘍核酸のセットにバーコードを付与して、それによって複数のバーコード化腫瘍核酸のセットを生成すること、（ｃ）組織向性配列のインテグレーションを可能にする条件下で細胞の集団に、複数のバーコード化腫瘍核酸からの少なくとも１つのバーコード化腫瘍核酸を添加し、それによって培養細胞集団を生成すること、（ｄ）培養細胞集団をシーケンシングして、それによって複数のシーケンシングリードを生成すること、（ｅ）シーケンシングリードをコンピューターによって解析し、バーコードを含む複数のシーケンシングリードから少なくとも１つのシーケンシングリードの存在または非存在を識別すること、および（ｆ）バーコードを含むシーケンシングリードを解析して、培養細胞集団には存在するが、細胞集団には存在しない配列の存在または非存在を識別し、それによって目的の組織または細胞に移行する核酸配列を識別することを含む方法を提供する。

【0013】

一部の実施形態では、本開示は、そのようなｃｔＤＮＡに由来し得、カーゴ（例えば、核酸、タンパク質、低分子、またはナノ粒子）を１つまたは複数の標的細胞に送達するために使用することができる、合成により生成されたトランスポゾンを提供する。一部の例では、および本明細書に記載されるように、そのような合成により生成されたトランスポゾンまたはＺＣＳ（例えば、オリゴ－ＺＣＳ）は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方において細胞、例えばがん細胞に対して高い特異性でカーゴを送達するためのツールとして使用することができる核酸構築物の一部であり得る。このように、一部の例では、そのような核酸構築物は送達システムの一部であり得る。そのような送達システムは、１つまたは複数の構成成分を有し得る。そのような構成成分は、（ｉ）ある特定の細胞、細胞集団、もしくは組織を標的とするための第１のＤＮＡ配列、およびそのような送達システムの少なくとも領域もしくは部分の、そのような標的細胞、細胞集団、もしくは組織のゲノムへのインテグレーションのための第２のＤＮＡ配列を含むＺＣＳ配列、（ｉｉ）プロモーター配列、ならびに（ｉｉｉ）１つもしくは複数のカーゴ、またはそのいずれかの組合せを含み得る。そのような１つまたは複数のカーゴは、（ａ）そのような標的細胞または組織において発現させることができる遺伝子または遺伝子断片などの１つまたは複数の核酸（例えば、ＤＮＡ）配列、および（ｂ）１つまたは複数の追加のカーゴ、例えばタンパク質、ナノ粒子、または低分子を含み得る。図１２は、本明細書に記載される送達システムの例を示す。そのようなシステムでは、標的細胞に送達されるカーゴ（本明細書では、抗原コード遺伝子などの遺伝子）を、（例えば、組織特異的）プロモーター配列およびガイド配列にカップリングすることができ、それらは第１および第２のＤＮＡ配列を含むＺＣＳおよび／またはトランスポゾンに隣接し、第１のＤＮＡ配列（例えば、標的化配列またはＺｉｐコード配列）は、細胞標的化を可能にし、第２のＤＮＡ配列は、そのようなシステムが細胞の核に達するとシステムを標的細胞のゲノムにインテグレートすることが可能である。

【0014】

一部の例では、本開示は、ある特定の特性を標的細胞に伝播することができる核酸構築物およびシステムを提供する。そのような特性は、環境内での変化に対する標的細胞の応答を含む。そのような変化は、ある特定の分子に対する曝露を含み得る。そのような分子は、薬物分子、例えば低分子またはタンパク質、例えば抗体であり得る。そのような伝播または特性の例は、患者の血漿からｉｎ ｖｉｔｒｏでのがん細胞系への薬物に対する耐性または感受性を含む。そのような驚くべき意外な特性は、１つまたは複数（例えば、２、３、４個等）のＺＣＳ（またはトランスポゾン）配列と、１つまたは複数のカーゴ分子、例えばそのような構築物またはそのような構築物の一部の標的細胞のゲノムへの送達およびインテグレーションのための治療タンパク質および／または診断タンパク質をコードする追加の核酸配列とを含む天然に存在しない核酸構築物の設計を可能にし得る。そのような標的細胞は、がん細胞であり得、カーゴ核酸は、多様な治療タンパク質、例えばがん細胞のアポトーシスのためのカスパーゼ、免疫療法の免疫細胞の認識または増強のための抗原、または他のタンパク質、例えば抗体、酵素、サイトカイン、シグナル伝達分子等をコードすることができる。

【0015】

本明細書に記載されるＺＣＳまたはトランスポゾン配列は、１つまたは複数の転位因子を含み得る。そのような転位因子としては、哺乳動物散剤性反復配列（ＭＩＲ）およびＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｌｕｔｅｕｓ（ＡＬＵ）、例えばＡＬＵｓｑ、ならびにその誘導体または機能的断片が挙げられ得る。このように、一部の例では、本開示は、腫瘍細胞などの標的細胞にカーゴを送達することが可能であり得る合成ＭＩＲオリゴヌクレオチド（オリゴ）を提供する。
参照による組み込み

【0016】

本明細書において言及した全ての刊行物、特許、および特許出願は、各々の個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個々に参照により本明細書に組み込まれることが示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

【0017】

本出願ファイルは、カラーで実行された少なくとも１つの図面を含有する。カラーの図面を含む本特許または特許出願刊行物のコピーは、申請により必要な料金を支払うことにより当局によって提供される。

【0018】

本発明の新規特色は、添付の特許請求の範囲に詳しく記載される。本発明の特色および利点のよりよい理解は、本発明の原理を利用する例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、および以下の添付の図面（本明細書においてまた「図」および「図（ＦＩＧ）」）を参照することによって得られる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】図１は、特異的腫瘍細胞認識配列（例えば、Ｚｉｐコード配列、本明細書において「ＺＣＳ」と省略もされる）を含む循環する腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）が、多発性骨髄腫細胞（ＭＭ１ｓ細胞）（ＭＭ細胞＋ＭＭ ｃｔＤＮＡとして図示する）、肺がん細胞系（Ａ５４９）（ＬＣ細胞＋ＬＣ ｃｔＤＮＡとして図示する）、および膵臓がん細胞系（ＳＰＡＣ０１）（ＰＣ細胞＋ＰＣ ｃｔＤＮＡとして図示する）において細胞膜および核膜を通過することができることを示す。

【0020】

【図2-1】図２Ａは、膵臓がん細胞におけるｃｔＤＮＡの捕捉および内部移行を実証する８枚の３Ｄ画像の時間経過を示す。

【0021】

【図2-2】図２Ｂは、膵臓がん細胞におけるｃｔＤＮＡの捕捉および内部移行を実証する８枚の単一面画像の時間経過を示す。

【0022】

【図2-3】図２Ｃは、膵細胞におけるエンドサイトーシスによるｃｔＤＮＡの捕捉および内部移行を実証する３Ｄビデオからの８枚の画像の時間経過を示す。

【0023】

【図3-1】図３Ａは、ＡＳＰＣ－１細胞におけるｃｔＤＮＡの核局在を実証する単一面ビデオから得た８枚の画像の時間経過を示す。

【0024】

【図3-2】図３Ｂは、ＭＭ１Ｓ細胞におけるｃｔＤＮＡの核取り込みを図示する単一面の４時間の時間経過から得た６枚の画像を示す。細胞膜を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）によって標識した。核はＤＡＰＩによって標識する。

【0025】

【図4】図４は、肺がんまたはＭＭ患者から抽出した標識ｃｔＤＮＡと共に培養したＡ４５９（肺がん）およびＭＭ１（多発性骨髄腫、ＭＭ）細胞を図示する。この図は、それぞれのｃｔＤＮＡが、ｃｔＤＮＡ細胞起源と類似の細胞をほぼ排他的に標的とすることを示している。

【0026】

【図5-1】図５Ａは、形質細胞の染色体へのｃｔＤＮＡインテグレーションを実証する染色体スプレッドを示す。

【0027】

【図5-2】図５Ｂは、ＤＮＡ依存的タンパク質キナーゼ（例えば、ＤＮＡＰＫｃｓ）、毛細血管拡張性運動失調症突然変異（ＡＴＭ）、ポリ－（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼＩ（ＰＡＲＰ－１）、およびラルテグラビル（インテグラーゼ阻害剤）が染色体へのｃｔＤＮＡインテグレーションに及ぼす効果を示すグラフである。

【0028】

【図5-3】図５Ｃは、ｃｔＤＮＡの染色体インテグレーションが、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）およびトランスポザーゼに依存し得ることを示す。標識ｃｔＤＮＡの組み込みは、ＤＮＡＰＫｃｓ、ＡＴＭ、ＰＡＲＰ－１、およびインテグラーゼ（ラルテグラビル）の阻害剤が存在する場合には、有意に低減された。ＰＡＲＰ－１阻害では、有意でない低減が観察された。

【0029】

【図6】図６は、コンセンサス配列（コンティグ）の識別を図示する概略図を示す。図６は、配列番号２８０～２８１をそれぞれ出現順に開示する。

【0030】

【図7】図７は、２つの細胞認識シグナル配列を示す。左の赤色の枠は、多発性骨髄腫（ＭＭ）由来のｃｔＤＮＡに存在するが膵臓がん（ＰＣ）由来のｃｔＤＮＡには存在しない２つの類似のバリアントの領域を強調する。右側の赤色の枠は、ＭＭおよびＰＣにおいて検出された追加の核酸配列（対照）を示す。

【0031】

【図8-1】図８Ａは、多発性骨髄腫、膵臓がん、および対照細胞系からの識別されたコンティグ配列の系統樹を示す。指標となるコンティグは、Ｚｉｐコード配列の局在、型、および存在を示す。

【0032】

【図8-2】図８Ｂは、染色体インテグレーション領域を示し、機構がトランスポゾンに関連し得るおよび／またはトランスポゾンによって媒介され得ることを示す。そのような指標は、ほとんどの挿入されたコンティグ配列が、高い含有量のトランスポゾンを有し得る；コンティグ配列が異なる型のトランスポゾンを有し得る；インテグレーションが立体構造依存的であり得る；ならびにコンティグおよび／またはＺＣ配列の細胞認識が受容体媒介性であり得るという知見を含む。

【0033】

【図9】図９は、全身または局所投与後の核におけるｃｔＤＮＡの局在を含む、腫瘍に存在するローダミン標識ｃｔＤＮＡ構築物の共焦点顕微鏡画像を示す。

【0034】

図９Ａは、腫瘍に直接注射した場合のローダミン標識ｃｔＤＮＡ投与の２４時間後の共焦点顕微鏡画像を示す。

【0035】

図９Ｂは、尾静脈注射した場合のローダミン標識ｃｔＤＮＡ投与の２４時間後の共焦点顕微鏡画像を示す。

【0036】

図９Ｃは、尾静脈注射した場合のローダミン標識ｃｔＤＮＡ投与の４８時間後の共焦点顕微鏡画像を示す。

【0037】

図９Ｄは、収集の２４時間前にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を尾静脈注射した、腫瘍を有する対照マウスの共焦点顕微鏡画像を示す。

【0038】

【図10】図１０は、全身または局所投与後の腫瘍に存在するローダミン標識ｃｔＤＮＡ構築物の共焦点顕微鏡画像を示す。

【0039】

図１０Ａは、収集の２４時間前にＰＢＳを尾静脈注射した、腫瘍を有する対照マウスの共焦点顕微鏡画像を示す。

【0040】

図１０Ｂは、収集の２４時間前に尾静脈注射した場合のローダミン標識ｃｔＤＮＡの共焦点顕微鏡画像を示す。

【0041】

図１０Ｃは、収集の４８時間前に尾静脈注射した場合のローダミン標識ｃｔＤＮＡの共焦点顕微鏡画像を示す。

【0042】

【図11】図１１は、組織特異的ｚｉｐコードを含む構築物の内因性のインテグレーション機構を図示する図である。

【0043】

【図12】図１２は、ｚｉｐコード領域（すなわち、細胞標的化または細胞認識配列）、インテグレーション配列またはインテグレーション領域、目的の特定のタンパク質をコードする目的の遺伝子、および必要に応じて目的のタンパク質が標的細胞集団に限って発現されることを確実にするための追加の安全性手段として作用するガイド配列を含む、本明細書に記載される送達システム（例えば、目的の遺伝子または抗原のための）の例の描写である。ダイアグラムは、細胞標的化シグナル配列およびインテグレーションシグナル配列が３’末端もしくは５’末端、またはその組合せに存在し得ることを図示する。

【0044】

【図13】図１３は、多発性骨髄腫（ＭＭ）ＺＣＳ核酸分子（配列番号２８２）およびＨＳＶ－ＴＫ遺伝子を含む遺伝子構築物の投与の４８時間後に開始して１日１回５日間投与したガンシクロビルの併用療法によって誘導された腫瘍サイズの約５０％の変化を示す。

【0045】

図１３Ａおよび図１３Ｂは、ガンシクロビルによる処置の前と５日後の腫瘍サイズの比較を示す。

【0046】

図１３Ｃは、ＭＭ ＺＩＰコード－ＨＳＶ－ＴＫによる遺伝子治療を受けた両方のマウス（マウス＃１およびマウス＃２）において測定した腫瘍体積の変化を示す。ガンシクロビルによる処置は、両方の動物において腫瘍体積の有意な低減をもたらした。

【0047】

【図14】図１４Ａおよび図１４Ｂは、ＭＭ ＺＩＰコード－ＨＳＶ－ＴＫによる遺伝子治療を受けた後、ガンシクロビル（１００μｇ／ｋｇ）による処置の４８時間後、５日後のマウス＃２からの様々な組織のＰＣＲ結果を示す。ＰＣＲ結果から、腫瘍細胞および腫瘍組織に限って単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ－１に対応するバンドが明らかに示され、それらは本研究において分析した他の臓器のいずれにおいても認められず、本明細書に開示されるＺｉｐコード配列および関連構築物の高い細胞および組織特異性を実証している。番号は、（１）分子量ラダー、（２）腫瘍、（３）肺、（４）脾臓、（５）肝臓、（６）膵臓、（７）脳、および（８）腎臓を示す。

【0048】

【図15】図１５は、組織および／または臓器特異的「Ｚｉｐコード」配列の概略図である。本開示は、そのようなＺＣＳを使用して、細胞、組織、および／または臓器特異的標的化および／または送達を可能にする細胞、組織、および／または臓器特異的「Ｚｉｐコード」配列（本明細書において「ＺＣＳ」と省略もされる）を提供する。

【0049】

【図16】図１６Ａは、多発性骨髄腫（ＭＭ）由来の循環する腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）が、細胞および組織特異的にＭＭ細胞にホーミングすることを示す。赤色で強調した領域は、ローダミン標識ＤＮＡを示し、青色の領域はＤＡＰＩ染色を示す。

【0050】

図１６Ｂは、肺がん（ＬＣ）由来の循環する腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）が、細胞および組織特異的にＬＣ細胞にホーミングすることを示す。赤色で強調した領域は、ローダミン標識ＤＮＡを示し、青色の領域はＤＡＰＩ染色を示す。

【0051】

図１６Ｃは、大腸がん（ＣＣ）由来の循環する腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）が、細胞および組織特異的にＣＣ細胞にホーミングすることを示す。赤色で強調した領域は、ローダミン標識ＤＮＡを示し、青色の領域はＤＡＰＩ染色を示す。

【0052】

図１６Ｄは、膵臓がん（ＰＣ）由来の循環する腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）が、細胞および組織特異的にＰＣ細胞にホーミングすることを示す。赤色で強調した領域は、ローダミン標識ＤＮＡを示し、青色の領域はＤＡＰＩ染色を示す。

【0053】

【図17】図１７Ａは、多発性骨髄腫（ＭＭ）由来の循環する腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）が、競合する大腸がん（ＣＣ）ｃｔＤＮＡ（緑色で示す）の存在下であっても細胞および組織特異的にＭＭ細胞にホーミングすることを示す（ＭＭ ｃｔＤＮＡを赤色で示す）。ＭＭ ｃｔＤＮＡのみがＭＭ細胞において観察され、ＣＣ ｃｔＤＮＡは観察されなかった。

【0054】

図１７Ｂは、多発性骨髄腫（ＭＭ）由来の循環する腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）が、競合する膵臓がん（ＰＣ）ｃｔＤＮＡ（緑色で示す）の存在下であっても細胞および組織特異的にＭＭ細胞にホーミングすることを示す（ＭＭ ｃｔＤＮＡを赤色で示す）。ＭＭ ｃｔＤＮＡのみがＭＭ細胞において観察され、ＰＣ ｃｔＤＮＡは観察されなかった。

【0055】

図１７Ｃは、多発性骨髄腫（ＭＭ）由来の循環する腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の色素ローダミンによる標識が、ＭＭ由来ｃｔＤＮＡが細胞および組織特異的にＭＭ細胞に蓄積する能力に影響を及ぼさなかったことを示す（ＭＭ ｃｔＤＮＡ－ローダミン構築物を赤色で示す）。

【0056】

図１７Ｄは、多発性骨髄腫（ＭＭ）由来の循環する腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の色素Ｃｙ５による標識が、ＭＭ由来ｃｔＤＮＡが細胞および組織特異的にＭＭ細胞に蓄積する能力に影響を及ぼさなかったことを示す（ＭＭ ｃｔＤＮＡ－Ｃｙ５構築物を緑色で示す）。

【0057】

【図18】図１８は、ＭＭ ｃｔＤＮＡがＭＭ細胞の染色体ＤＮＡにインテグレートしたことを示す。ＭＭ ｃｔＤＮＡを赤色の点として示す。ＭＭ ｃｔＤＮＡの染色体インテグレーションを、シーケンシングを使用して検証した。

【0058】

【図19】図１９は、例えば、腫瘍の染色体にインテグレートされたｃｔＤＮＡおよびｃｔＤＮＡ単独からの配列の配列アライメントマッチを実証することによる染色体インテグレーションの検証の概略図である。図１９は、出現順に配列番号２８０～２８１をそれぞれ開示する。

【0059】

【図20】図２０は、本開示の合成されたＭＭ特異的Ｚｉｐコードオリゴヌクレオチド構築物の概略図である。そのような構築物は、２つのＺｉｐコード配列（例えば、長さ約３００ｂｐ）を含み得、これらはいずれかの部位で翻訳エレメント（例えば、ＩＲＥＳ）、ＧＦＰコード配列、プロモーター、ルシフェラーゼコード配列、ならびに構築物に沿って分布し得、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでの構築物（またはその断片）の動きを追跡するために使用され得る１つまたは複数のローダミン色素分子を含む構築物に隣接する。

【0060】

【図21】図２１Ａは、ＺＣＳ構築物（ＭＭＺｉｐコード－ＰＧＫ－ＧＦＰ－ＭＭＺｉｐコード）のＧＦＰ（緑色、左上）の発現およびローダミンの検出が、ＭＭ細胞内でのその局在に対応したことを示しており、ＺＣＳ構築物のＭＭ細胞への効率的な送達、トランスジーンの送達、および前記トランスジーンの発現を示している。

【0061】

図２１Ｂは、線状のＰＧＫ－ＧＦＰ構築物単独を使用しても、シグナルのいかなる細胞特異的位置も示さないことを示しており、Ｚｉｐコード配列が、ＭＭＺｉｐコード－ＰＧＫ－ＧＦＰ－ＭＭＺｉｐコード構築物のＭＭ細胞特異的取り込みの原因であることを確認する。

【0062】

【図22】図２２は、ＭＭＺｉｐコード－ファージ－ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｌｕｃ構築物のＭＭ細胞への細胞取り込みの拡大画像を示す。画像の評価から、この構築物を使用してＭＭ細胞への最大１００％の遺伝子送達が示され、最大で、分析したあらゆるＭＭ細胞によってＧＦＰが生成されたことが示された。

【0063】

【図23】図２３は、ＰＣ異種移植マウスモデルにおけるＰＣ由来ＺＣＳのｉｎ ｖｉｖｏホーミング研究の結果を示す。図２３Ａは、いかなる構築物も注射しない陰性対照を示す２つの画像を、一番左の縦列に示す。図２３Ｂは、投与（尾静脈を介して）の２４時間後のＰＣ細胞におけるＰＣ由来ＺＣＳの蓄積を示す２つの画像を、中央の縦列に示す。図２３Ｃは、投与（尾静脈を介して）の４８時間後のＰＣ細胞におけるＰＣ由来ＺＣＳの蓄積を示す２つの画像を、右の縦列に示す。この動物からの肝臓および脾臓から得た組織試料は、ＰＣ由来のＺＣＳの取り込みを示さず、本開示のＺＣＳの細胞特異性を確認した。

【0064】

【図24】図２４は、ＰＣ異種移植マウスモデルにおけるＰＣ由来細胞標的化核酸配列の膵臓がん（ＰＣ）ｉｎ ｖｉｖｏホーミング研究の結果を示す。図２４Ａは、尾静脈注射した２４時間後および特に４８時間後のＰＣ細胞におけるこれらのＰＣ標的化核酸分子の有意な蓄積および取り込みを実証するデータを示す。図２４Ｂは、ＰＣ由来核酸分子を腫瘍に直接注射した場合に腫瘍細胞における取り込みが有意に低減されたことを示し、本開示の細胞標的化および／またはインテグレートする核酸分子が、全身投与した場合に改善された細胞および／または組織認識および取り込みを提供し得ることを示唆している。図２４Ｃは、ｃｔＤＮＡを注射しなかった対照実験を示す。

【0065】

【図25-1】図２５Ａは、ボルテゾミブ耐性患者の血清によって処置したボルテゾミブ感受性細胞（ＯＭＰ１およびＭＭ１）およびボルテゾミブ感受性患者の血清によって処置したボルテゾミブ耐性細胞（ＯＭＰ１およびＭＭ１）において測定した細胞生存率を示す。細胞生存率はまた、血清をＤＮアーゼによって１０分間処置した後の類似の細胞においても測定した。

【0066】

【図25-2】図２５Ｂは、ＭＭ、ならびに肺、膵臓、および大腸がん細胞系におけるローダミン標識ｃｔＤＮＡ（赤色）の核局在を示す指標となる写真を示す。

【0067】

図２５Ｃは、ベースラインｃｔＤＮＡ単独の密度と比較した、複数の細胞系および患者由来のｃｔＤＮＡの核密度測定の倍数変化を示す。図２５Ａ～２５Ｃのデータは、患者のボルテゾミブに対する臨床での感受性を、ｃｔＤＮＡを介して細胞系に伝達することができることを示す。

【0068】

【図26-1】図２６Ａは、ＡＳＰＣ１およびＭＭ１細胞におけるローダミン－ｃｔＤＮＡの細胞質局在および核局在を実証する経時的測定を示す。ＭＭ：多発性骨髄腫、ＣＣ：大腸がん、およびＰＣ：膵臓がん。

【0069】

図２６Ｂは、尾注射の４８時間後のローダミン－ｃｔＤＮＡの腫瘍局在の指標となる例を示す（ｎ＝３）。

【0070】

【図26-2】図２６Ｃは、患者のがんの型とマッチするまたはマッチしない細胞系における指標となる画像を示す。

【0071】

図２６Ｄは、患者のがんの型とマッチするまたはマッチしない細胞系におけるｃｔＤＮＡ核密度測定の倍数変化を示す。

【0072】

【図26-3】図２６Ｅは、マッチするおよびマッチしない腫瘍型ｃｔＤＮＡと細胞系との同時培養の指標となる画像を示す。

【0073】

図２６Ｆは、マッチするおよびマッチしない腫瘍型ｃｔＤＮＡと細胞系との同時培養の核密度測定の倍数変化を示す。

【0074】

【図27】図２７Ａは、ＭＭ、ＰＣ、およびＣＣ細胞系の染色分体へのｃｔＤＮＡインテグレーションの指標となる画像を示す。

【0075】

図２７Ｂは、ｃｔＤＮＡインテグレーションを有する染色分体の測定を示す（三連の実験、中期ｎ＝１０）。

【0076】

図２７Ｃは、サイトメガロウイルス－緑色蛍光タンパク質（ＣＭＶ－ＧＦＰ）をコードするカーゴ核酸配列がｃｔＤＮＡ配列に隣接し、カーゴ（ＣＭＶ－ＧＦＰ－コード）配列の細胞標的化およびゲノムインテグレーションを可能にするｃｔＤＮＡ－ＣＭＶ－ＧＦＰ－ｃｔＤＮＡ構築物と同時培養した腫瘍細胞におけるＧＦＰの発現を示す（右の画像）。左の画像（対照）は、ｃｔＤＮＡなしでＣＭＶ－ＧＦＰコードカーゴ核酸配列を使用した場合にＣＭＶ－ＧＦＰが腫瘍細胞において発現されなかったことを示し、ｃｔＤＮＡ部分がカーゴ核酸配列の細胞標的化および発現にとって必要であったことを示唆した。

【0077】

【図28-1】図２８Ａは、細胞（ＭＭ１Ｓ、ＡＳＰＣ－１、およびＨＣＴ １１６細胞）をＫＵ－５５９３３（ＡＴＭ阻害剤、１０μＭ）、ＤＮＡ－ＰＫＣＳ阻害剤Ｉ（ＤＮＡＰＫｃｓ阻害剤、３０μＭ）、ＮＵ１０２５（ＰＡＲＰ阻害剤、２００μＭ）、およびラルテグラビル（ＭＡＮＡＳＥ ＳＥＴＭＡＲ／インテグラーゼ阻害剤、１００ｎＭ）によって処置した後の、ｃｔＤＮＡインテグレーション（３連の実験、中期ｎ＝１０）を有する染色分体の数を示す。

【0078】

【図28-2】図２８Ｂは、ＴＥ－ＣＭＶ－ＧＦＰ断片との細胞同時培養物におけるＧＦＰ発現を示す。

【0079】

図２８Ｃは、ＨＳＶ－ＴＫベクター、腫瘍対照またはＴＥ－ＣＭＶ－ＨＳＶ－ＴＫを注射したマウスの腫瘍、およびＴＥ－ＣＭＶ－ＨＳＶ－ＴＫを注射したマウスの１つの指標となる例の臓器から抽出したＤＮＡのＰＣＲを示す。

【0080】

【図29-1】図２９Ａは、ボルテゾミブ感受性患者の血清、もしくはボルテゾミブ耐性患者からのｃｔＤＮＡを培養培地に添加した同じ血清によって処置した、または同じ血清をＤＮアーゼによって処置した場合のボルテゾミブ感受性細胞系ＭＭ１ｓにおいて測定した細胞生存率を示す。加えて、生存率を、ボルテゾミブ耐性血清単独または異なるボルテゾミブ耐性患者のｃｔＤＮＡと共にＭＭ１ｓ細胞の同時培養において測定した。

【0081】

図２９Ｂは、ＲＮアーゼ、ＤＮアーゼ、およびプロテイナーゼによる処置の存在下または非存在下での多発性骨髄腫（ＭＭ）、膵臓がん（ＰＣ）、および大腸がんｃｔＤＮＡからのｃｔＤＮＡのアガロースゲルを示す。

【0082】

【図29-2】図２９Ｃは、膵臓がんの全ゲノムシーケンシング（ｎ＝１０）およびＭＭエクソンシーケンシング（ｎ＝１０）から測定された腫瘍とｃｔＤＮＡとの間の一致率単一ヌクレオチドバリアントを示す。

【0083】

図２９Ｄは、異なるＭＭ細胞系および複数のＭＭ患者からのｃｔＤＮＡの指標となる画像を示す。

【0084】

【図30-1】図３０Ａは、ローダミン－膵臓がんｃｔＤＮＡを尾注射したマウスからの膵臓がん腫瘍の共焦点顕微鏡画像を示す。腫瘍を注射の２４および４８時間後に収集した。

【0085】

【図30-2】図３０Ｂは、尾注射の４８時間後にローダミン－ｃｔＤＮＡ（ＭＭ、大腸および膵臓がん）を注射した異種移植マウスの異なる臓器からの指標となる画像を示す（ｎ＝３）。

【0086】

【図31】図３１Ａは、ローダミン－ＭＭ ｃｔＤＮＡおよびＣＹ５－膵臓がんｃｔＤＮＡを尾注射したマウスからのＭＭまたは膵臓がん腫瘍の共焦点顕微鏡画像を示す。

【0087】

図３１Ｂは、ＭＭ、大腸がん、または膵臓がんを有する患者に由来するｃｔＤＮＡと共に培養したＭＭ１ｓ（ＭＭ）、ＨＴＣ１１６（大腸がん）、およびＡＳＰＣ１（膵臓がん）細胞系の共焦点顕微鏡画像を示す。

【0088】

図３１Ｃは、２つの大腸がん細胞系（ＨＴ２９およびＲＫＯ）および２つの膵臓がん細胞系（ＭＩＡおよびＰＡＮＣ１）の核におけるｃｔＤＮＡのインテグレーションを例示する指標となる中期の例を示す。

【0089】

【図32】図３２は、ＡＴＭ、ＤＮＡＰＫｃｓ、ＰＡＲＰ、およびトランスポザーゼ阻害剤によって処置した様々ながん細胞系（ＭＭ１ｓ、ＡＳＰＣ１、およびＨＴ１１６）の指標となる中期の画像を示す。

【発明を実施するための形態】

【0090】

詳細な説明
本開示の様々な実施形態が本明細書において示され、記載されているが、そのような実施形態が例として提供されることは、当業者に明白であろう。複数の変形形態、変化、および置換が、本開示から逸脱することなく当業者に想起され得る。さらに、本明細書に記載した本開示の実施形態に対する様々な代替物を用いてもよい。

【0091】

本開示は、カーゴ分子の細胞、組織、および／もしくは臓器特異的標的化、取り込み、核局在化、ならびに／またはゲノムインテグレーションのための組成物および方法を提供する（例えば、図１５を参照されたい）。そのようなカーゴ分子は、核酸配列（例えば、治療タンパク質などのタンパク質をコードするＤＮＡ配列）、アミノ酸配列（例えば、ペプチド、タンパク質、またはその断片）、および／または低分子もしくは有機分子（例えば、低分子治療薬または蛍光色素）を含み得る。そのような例において、本明細書における組成物および方法は、カーゴ（例えば、核酸分子、タンパク質、ペプチド、または低分子、例えば治療および／もしくは診断用分子等）を標的細胞に細胞特異的に送達するために使用することができる。そのような標的細胞は、原核細胞または真核細胞（例えば、腫瘍細胞）であり得る。

【0092】

本明細書に記載される組成物は、核酸構築物を含み得る。そのような核酸構築物は、カーゴ分子の細胞、組織、および／または臓器特異的標的化、取り込み、核局在、および／またはゲノムインテグレーションを提供することができる。そのような核酸構築物は、認識および／またはインテグレーション配列を含む核酸配列を含み得る。本明細書における様々な例において、そのような核酸配列は、核酸構築物の細胞特異的標的化および取り込みを提供することができるＺｉｐコード配列（本明細書において「ＺＣＳ」と省略もされる）を含み得る。そのようなＺＣＳはまた、核酸またはその一部の、細胞のゲノムへのインテグレーションを可能にするインテグレーション配列も含み得る。一部の例では、細胞標的化および／またはゲノムインテグレーションを提供するそのような核酸配列は、トランスポゾン配列であり得るか、またはトランスポゾン配列を含み得る。

【0093】

本開示の細胞標的化（認識）およびインテグレーション配列は、生物試料（例えば、対象の血液または組織試料）の核酸配列に由来し得る。そのような細胞標的化およびインテグレーション配列は、循環する腫瘍ＤＮＡ（本明細書において「ｃｔＤＮＡ」と省略もされる）に由来し得る。本開示のＺＣＳを使用して、１つまたは複数の細胞を標的とする、細胞に侵入する、および／または細胞に蓄積することができ、例えば、そのような細胞の核を標的とする、核に侵入する、および／または核に蓄積することができる。ＺＣＳは、そのようなｃｔＤＮＡにまた由来し得るインテグレーション配列を含み得る。認識／標的化およびインテグレーション配列が由来し得るこれらの１つまたは複数の細胞は、そのようなＺＣＳを生成するために使用されるｃｔＤＮＡと同じ起源の細胞であり得る。例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞の核酸分子から生じる、および／またはそれに由来するＤＮＡ分子を使用して、ＭＭ細胞にカーゴを標的化および／または送達することができる。そのようなＭＭ由来ｃｔＤＮＡ分子は、本開示のＭＭ由来標的化およびインテグレーション配列のＭＭ細胞認識、細胞取り込み、核局在、および／またはゲノム（例えば、染色体）インテグレーションを可能にする１つまたは複数の配列を含み得る。一部の例では、標的化およびインテグレーション配列は、核酸構築物の一部であり得る。

【0094】

一部の例では、本開示は、送達システムを提供する。そのような送達システムは、（ｉ）１つまたは複数の細胞標的化配列および１つまたは複数のインテグレーション配列（例えば、ＺＣＳ）を含む核酸構築物、（ｉｉ）治療および／または診断用分子、例えばペプチドまたはタンパク質をコードする１つまたは複数のカーゴ核酸配列、ならびに（ｉｉｉ）１つまたは複数の非核酸カーゴ分子、例えば低分子（例えば、治療低分子、色素等）、タンパク質、ペプチド、またはそのいずれかの組合せのうちのいずれか１つまたは複数を含み得る。このように、本開示の核酸構築物は、ある特定の核酸配列、例えばＺＣＳが細胞レベルで高い標的化特異性を提供する（例えば、ある特定の起源の細胞のみ、またはある特定の遺伝子型、組織型、および／もしくは臓器型の細胞のみを標的化し得る）という驚くべき知見により、ならびに治療タンパク質（例えば、腫瘍抑制因子、アポトーシスタンパク質、抗原性ペプチド、抗体、酵素等）などのタンパク質のゲノムインテグレーションおよびその後の発現を可能にするインテグレーション配列により、遺伝子を細胞に非常に特異的にかつ最少の侵襲性で送達するために特に有用であり得る。

【0095】

本開示は、細胞型および組織型特異的ヒト細胞標的化核酸構築物の識別、特徴付け、単離、合成、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試験のための組成物および方法を提供する。一部の例では、そのような核酸は、腫瘍細胞または腫瘍組織の１つまたは複数の領域から単離されたＤＮＡ分子を含む。そのような核酸配列（本明細書において、Ｚｉｐコード配列、ＺＣＳ、または細胞標的化シグナルとも呼ぶ）は、前記腫瘍細胞から単離された１つまたは複数のトランスポゾンの一部であり得る。一部の例では、トランスポゾン配列は、ｃｔＤＮＡに由来し得、細胞標的化配列およびゲノムインテグレーション配列を含み得るそのようなＺＣＳからなり得るか、またはそのようなＺＣＳを含み得る。他の例では、本明細書におけるトランスポゾンは、細胞標的化またはゲノムインテグレーション配列を含み得るか、またはそれからなり得る。

【0096】

本開示は、細胞標的化およびゲノムインテグレーション配列を含み得、および生物などのシステム内を循環することができ、分解酵素（例えば、ＤＮアーゼ）の活性を許容することができ、および排他的に、またはほぼ排他的に（例えば、標的細胞に関して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の特異性で）結合することができる核酸構築物であって、そのような標的細胞が、細胞標的化およびゲノムインテグレーション配列が由来する細胞と同じまたは類似（例えば、同じ臓器または組織型）の細胞であり、そのような特異性が、異なる組織または臓器型の細胞と比較される、核酸構築物を提供する。一例として、ＭＭ由来ＺＣＳは、ＭＭ細胞を標的化（かつインテグレート）することができ、膵臓がん（ＰＣ）由来ＺＣＳは、ＰＣ細胞を標的化（かつインテグレート）することができる等である。そのような認識は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏであり得、類似の起源であるが異なる細胞系の細胞間であり得、例えばＭＭ由来認識配列は異なる細胞系のＭＭ細胞を標的化してこれに侵入することができる。一部の例では、本開示の核酸構築物は、そのようなｃｔＤＮＡ分子の一部または断片を含み得る。一部の例では、核酸構築物が由来し得るｃｔＤＮＡ分子は、対象（例えば、ヒト対象）から得てもよい。そのような循環する腫瘍ＤＮＡ断片は、ある特定の細胞または細胞集団を標的とする能力を有し、細胞ゲノムへのそのインテグレーションを誘導することができる核酸配列を含み得る。様々な例では、そのような核酸配列は、トランスポゾン（トランスポゾン配列）であり得るか、またはトランスポゾンを含み得る。そのような例では、本明細書における核酸構築物は、１つまたは複数のトランスポゾン配列を含み得る。驚くべきことに、本明細書において「ｚｉｐコード」とも呼ばれるこれらの循環する腫瘍ＤＮＡ断片の特定の領域は、特異的な細胞標的化シグナルとして機能し得、その特定の細胞起源、例えばそのｚｉｐコード配列を「認識する」細胞を認識し得る。一例として、膵臓がん（ＰＣ）細胞を起源とするｃｔＤＮＡに由来する本開示のＺＣＳは、高い特異性でＰＣ細胞を標的とする能力を有し得る。そのようなｚｉｐコードシグナルは、所与の細胞型（例えば、ＭＭ細胞、ＰＣ細胞、または他の細胞型の他の任意のがん細胞）の特異的「シグネチャー」の一部であり得る。本開示の核酸構築物は、１つまたは複数のＺＣＳを含み得る。

【0097】

本開示のＺｉｐコード配列（ＺＣＳ）は、ある特定の細胞を高い特異性で標的とすることができる。本開示のＺＣＳは、１つまたは複数の他の細胞の存在下で、約５０％より高い、５５％より高い、６０％より高い、６５％より高い、７０％より高い、７５％より高い、８０％より高い、８５％より高い、９０％より高い、９１％より高い、９２％より高い、９３％より高い、９４％より高い、９５％より高い、９６％より高い、９７％より高い、９８％より高い、または約９９％より高い特異性で、ある特定の細胞の核を標的とする、核に侵入する、および核に局在することができる。一例として、ＰＣ特異的ＺＣＳは、試料中または生物（例えば、齧歯類またはヒト）中に存在し得る他の細胞と比較して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または約９９％より高い特異性でＰＣ細胞の核を標的とする、核に侵入する、および核に局在する。

【0098】

Ｚｉｐコード配列およびインテグレーション配列を含む本明細書における核酸システムおよび構築物は、細胞および組織特異的なカーゴ送達（例えば、カーゴまたは核酸構築物、例えばトランスジーンの送達）を可能にし得、このように例えば従来のカーゴ送達システム（例えば、ナノ粒子またはウイルス）と比較して、オフターゲットおよび望ましくない副作用を有意に低減し得る。本開示の方法および組成物は、がん細胞からの内因性の生物機構（例えば、循環する腫瘍ＤＮＡ）から当初単離および精製された配列に由来しており、このため有意な免疫応答を誘発しない可能性がある。本開示の方法および組成物は、慢性疾患、感染疾患、および免疫疾患を含む多様な疾患においてこの技術の応用を可能にし得る。

【0099】

本開示の核酸送達システムは、標的細胞のゲノムにインテグレートされるようになる追加の核酸配列に依存し得る１つまたは複数の細胞／組織特異的Ｚｉｐコード配列を含み得る。したがって、ヒト細胞標的化配列またはｚｉｐコード配列は、一部の例ではカーゴを特定の細胞へと方向付けるために直接使用することができ、他の例ではそれらは、例えばインテグレーション配列を使用することによって、標的細胞のゲノムにインテグレートされるようになるように操作される、より大きい構築物の一部であり得る。一部の例では、本開示の核酸構築物は、特定の細胞の標的化を可能にし得るＺｉｐコード認識配列を含む。核の内部に入ると、本開示の核酸構築物は、インテグレーション配列を介してカーゴ核酸配列のトランスポゾン様のインテグレーションを可能にし得る。

【0100】

一部の例では、本開示の核酸構築物は、細胞のゲノム内の特異的挿入部位で核酸構築物の挿入を確実にするために使用される１つまたは複数のガイド核酸配列を含み得る。本明細書における核酸送達システムは、核酸構築物、プロモーター、およびその発現が前記プロモーターの調節的制御下であり得る目的の遺伝子（例えば、治療タンパク質をコードするカーゴ核酸）を含み得る。記載のシステムの自己調節的性質を利用すると、無作為な転位および望ましくない二本鎖ＤＮＡ切断のリスクが、従来のベクターベースの技術と比較して有意に低減されると予想される。

【0101】

一部の例では、本開示の核酸構築物は、がんおよび例えば血球に関連するある特定の障害（例えば、貧血、サラセミア、血友病、または血小板障害）を含む様々な慢性、感染性、または遺伝性（例えば、遺伝子）疾患において診断およびモニタリング目的のために使用することができる。一部の例では、本明細書に開示される細胞および／または組織特異的認識配列の存在は、特定の疾患または状態のバイオマーカーとして使用することができ、特定の治療介入（例えば、化学療法、標的化治療、免疫療法、または細胞および遺伝子治療）に対する応答をモニターするために使用され得る。他の例では、ＺＣＳをコンパニオン診断として使用することができる。そのような例では、例えば細胞のゲノムへのＺＣＳのインテグレーションを、そのようなゲノムへのカーゴ核酸配列（例えば、治療遺伝子配列）のインテグレーションの程度を決定するための尺度またはマーカーとして使用することができる。他の例では、本明細書に記載される核酸構築物（または送達システム）の細胞標的化およびゲノムインテグレーションは、特定の生物効果のマーカーとして使用することができる。一例では、治療遺伝子配列のゲノムインテグレーションの程度は、送達システムのＺＣＳまたはトランスポゾン配列のインテグレーションに比例し得、このように、測定されたインテグレートされた物質の量は、治療効果、例えば細胞死滅のマーカーまたは尺度であり得る。

【0102】

一部の例では、本開示の核酸構築物は、がん、炎症疾患、自己免疫疾患等の疾患を防止および処置するための新規治療戦略の開発のために使用され得る。例えば、がんの型特異的（例えば、膵臓がん特異的、多発性骨髄腫特異的、肺がん特異的等）ＺＣＳまたはトランスポゾンを特異的に標的とする薬物分子を設計して、腫瘍細胞間の連絡を中断してもよく、このように腫瘍の不均一性を低減させることができ、これは治療介入に対する耐性を腫瘍が発達させる能力を低減させ得る。別の例では、本開示の核酸構築物を使用して、核酸構築物の投与時に対象において免疫応答を誘発することができる。そのような免疫応答は、１つまたは複数の抗原性または免疫原性のペプチドまたはタンパク質をコードするカーゴ核酸配列を含む核酸構築物を投与することによって誘発することができ、発現されると、そのような免疫原性ペプチドまたはタンパク質は、対象において免疫応答を誘発することができる。このように、一部の例では、本開示のＺＣＳを、ワクチン、例えばがんワクチンとして使用することができる。

【0103】

一部の態様では、本開示の核酸構築物は、多様なカーゴ（例えば、薬物化合物）のための送達ビヒクルとして使用され得る。一部の例では、本開示の方法および組成物を、他のモダリティ、例えばナノ粒子と組み合わせて使用して、送達をさらに増強することができる。

【0104】

一部の態様では、本開示の核酸構築物は、疾患または状態の治療および／または診断のために使用され得る。一部の例では、本明細書に記載される核酸構築物を使用して、治療的および／または診断用カーゴを、目的の特定の細胞、組織、または臓器に送達することができる。例えば、本明細書に記載されるＺｉｐコード配列を使用して、例えば化学的色素（例えば、蛍光色素）または放射活性同位体を、疾患または状態（例えば、がん）に関連する１つまたは複数の細胞に送達することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで疾患または状態を可視化および／または追跡することができる。さらに別の例では、本開示に記載されるＺｉｐコード配列を使用することによって、化学的色素（例えば、蛍光色素）、放射活性同位体、または造影剤等を腫瘍部位（例えば、原発腫瘍部位および転移部位）に高い特異性で送達することによって、腫瘍細胞をｉｎ ｖｉｖｏで可視化および追跡することができる。

【0105】

別の態様では、本開示の組成物および方法を使用して、遺伝子不安定性およびその後の細胞死を引き起こすことによって、疾患または状態（例えば、がん）を処置することができる。例えば、１つまたは複数のＺｉｐコード配列を含む核酸配列を、細胞のゲノムへの挿入を通して遺伝子不安定性を引き起こすように操作することができる。一部の例では、１つまたは複数の核酸構築物をゲノムに組み込むことができる。一部の例では、少なくとも２つの核酸構築物をゲノムに組み込むことができる。一部の例では、少なくとも２つの核酸構築物をゲノムに組み込むことができる。一部の例では、少なくとも５つの核酸構築物をゲノムに組み込むことができる。一部の例では、少なくとも１０個の核酸構築物をゲノムに組み込むことができる。このように、一部の例では、本開示の核酸構築物は、例えば細胞のゲノムに挿入された場合に、その細胞内濃度が、例えば遺伝子不安定性を引き起こすのに十分に高い場合、それ自身細胞傷害性であり得る。

【0106】

一部の例では、本明細書に記載される１つまたは複数の核酸構築物が、単一の細胞によって取り込まれ得る。一部の例では、本明細書に記載される少なくとも２つの核酸構築物が、単一の細胞によって取り込まれ得る。一部の例では、本明細書に記載される少なくとも５つの核酸構築物が、単一の細胞によって取り込まれ得る。一部の例では、本明細書に記載される少なくとも１０個の核酸構築物が、単一の細胞によって取り込まれ得る。一部の例では、本明細書に記載される少なくとも２０個の核酸構築物が、単一の細胞によって取り込まれ得る。一部の例では、本明細書に記載される少なくとも１００個の核酸構築物が、単一の細胞によって取り込まれ得る。

【0107】

一部の例では、本開示の核酸構築物は、細胞傷害性カーゴ、例えば放射活性カーゴの細胞への送達を介して細胞傷害性であり得る。一部の例では、放射標識化核酸構築物は、細胞の外部（例えば、ベータ放射線）または細胞内（例えば、アルファ放射線）のいずれかからＤＮＡ損傷を引き起こし得る。

【0108】

本開示はまた、本明細書に記載の方法および組成物と組み合わせて使用することができる合成核酸Ｚｉｐコード配列も提供する。そのような合成核酸Ｚｉｐコード配列は、ｃｔＤＮＡに由来し得る。そのような合成核酸Ｚｉｐコード配列（本明細書において「オリゴＺＣＳ」と省略もされる）は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、もしくはルシフェラーゼなどの蛍光タンパク質をコードする配列などの１つもしくは複数の他の核酸配列、１つもしくは複数のプロモーター配列、ならびに／または例えば治療用分子および／もしくは診断用分子をコードする１つもしくは複数の遺伝子を含む核酸構築物の一部であり得、１つまたは複数の遺伝子は前記プロモーターの調節的制御下にあり得る。図１２は、様々なタンパク質（例えば、ＧＦＰ、ルシフェラーゼ等）をコードする核酸配列に隣接する２つのＭＭ特異的合成ＺＣＳを含む本開示の核酸構築物を概略的に示している。

【0109】

そのような合成オリゴＺＣＳは、長さが約５０塩基対（ｂｐ）～約１０００ｂｐであり得る。オリゴＺＣＳは、長さが約１００塩基対（ｂｐ）～約９００ｂｐであり得る。オリゴＺＣＳは、長さが約２００ｂｐ～約８００ｂｐであり得る。オリゴＺＣＳは、長さが約３００ｂｐ～約７００ｂｐであり得る。オリゴＺＣＳは、長さが約４００ｂｐ～約６００ｂｐであり得る。オリゴＺＣＳは、長さが少なくとも約１００ｂｐであり得る。オリゴＺＣＳは、長さが少なくとも約２００ｂｐであり得る。オリゴＺＣＳは、長さが少なくとも約３００ｂｐであり得る。オリゴＺＣＳは、長さが少なくとも約４００ｂｐであり得る。オリゴＺＣＳは、長さが少なくとも約５００ｂｐであり得る。オリゴＺＣＳは、長さが少なくとも約１０００ｂｐであり得る。

【0110】

本明細書で使用される場合、用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において互換的に使用することができ、一般的にリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかである任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、またはリボ核酸のＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）の配列を含む。この用語はまた、化学改変ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドポリマーも指す。ポリヌクレオチドは、天然に見出され得るＤ－リボース糖および天然に見出されないＬ－リボース糖で形成することができる。

【0111】

本明細書で使用される場合、用語「ゲノム」は、一般的に、例えば、対象の遺伝情報の少なくとも一部または全体であり得る、対象からのゲノム情報を指す。ゲノムはＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかでコードされ得る。ゲノムは、コード領域（例えば、タンパク質をコードする）および非コード領域を含み得る。ゲノムは生物における全ての染色体の配列を共に含み得る。例えば、ヒトゲノムは、通常、全体で４６本の染色体を有する。これらの配列は全て、共にヒトゲノムを構成し得る。

【0112】

本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対してある特定のパーセント（％）「配列同一性」を有し、このことは、整列させた場合に、塩基またはアミノ酸のパーセンテージが同じであること、および２つの配列を比較した場合に同じ相対的位置にあることを意味する。配列同一性は、複数の異なる方法において決定することができる。配列同一性を決定するために、配列を様々な方法およびコンピュータープログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、Ｔ－ＣＯＦＦＥＥ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ等）を使用して整列させることができる。

【0113】

本明細書で使用される場合、用語「核酸システム」、「核酸送達システム」、および「核酸構築物」は本明細書において互換的に使用することができ、一般的に追加の核酸分子、ペプチド、ポリペプチド、検出可能部分（例えば、蛍光標識）、低分子部分、またはそのいずれかの組合せであり得るカーゴ部分に会合している（例えば、共有結合または非共有結合により連結された）本開示の核酸分子を含む核酸分子－カーゴコンジュゲートまたは構築物を指す。この用語はまた、遺伝子治療目的のために使用される核酸システム、例えばｚｉｐコード領域、インテグレーション領域、目的の遺伝子をコードする配列、および必要に応じてガイド配列を含むシステムも指し得る。

【0114】

本明細書で使用される場合、用語「カーゴ」は、一般的に本開示の標的特異的核酸分子にカップリングすることができる分子を指す。そのようなカーゴ分子は、核酸、タンパク質、ペプチド、低分子、放射性核種、ポリマー、またはナノ粒子であり得る。そのようなカーゴ分子は、標的特異的核酸に共有結合または非共有結合によりカップリングされ得る。一部の例では、本明細書におけるカーゴは、治療用分子であり得、本明細書において「治療用カーゴ」と呼ぶことができる。治療用分子は、例えば、標的細胞ゲノムへの挿入を通してアポトーシスを引き起こすことによって、または治療タンパク質をコードすることによって、治療的機能を有する核酸を含む。治療用カーゴは、タンパク質、例えば抗体またはその機能的結合性断片、サイトカイン、シグナル伝達分子等、および低分子、例えばキナーゼ阻害剤または他の抗がん剤をさらに含む。他の例では、カーゴは、診断用分子であり、本明細書において「診断用カーゴ」と呼ぶことができる。そのような診断用カーゴは、フルオロフォア、放射性核種、造影剤等であり得る。

【0115】

本明細書で使用される場合、用語「カップリングされた」は、一般的に第１の分子を第２の分子に共有結合または非共有結合によって結合させることを指す。本明細書における様々な例では、１つまたは複数の分子を互いにカップリングさせることができる。一例では、本開示の核酸構築物は、第１のＤＮＡ配列（例えば、細胞標的化配列）および第２のＤＮＡ配列（例えば、ゲノムインテグレーション配列）を含み得、第１のＤＮＡ配列は、ホスホジエステル結合を介して第２のＤＮＡ配列に共有結合によりカップリングさせることができる。別の例では、本明細書における送達システムは、細胞標的化およびゲノムインテグレーションのための核酸構築物、ならびに１つまたは複数の他の核酸配列、例えば治療タンパク質をコードする治療遺伝子配列、そのような遺伝子配列の発現を調節することができるプロモーター配列、および他の適切な核酸配列を含み得る。一部の例では、そのような送達システムの１つまたは複数の異なる核酸部分（例えば、核酸構築物、遺伝子配列、プロモーター等）を共有結合によりカップリングさせて、線状の核酸分子を形成することができる。図１２は、そのような線状の送達システムの例を図示している。そのような線状物の送達は、共有結合または非共有結合のいずれかによりそれにカップリングされた１つまたは複数の追加のカーゴ分子を有し得る。図２０は、様々な部分（例えば、核酸構築物配列、遺伝子配列、プロモーター等）を含む線状の核酸配列が、それにカップリングされた１つまたは複数のカーゴ分子（この場合、蛍光色素）を有するそのような送達システムの例を図示している。そのような１つまたは複数のカーゴ分子は、そのような配列の長さに沿って（例えば、図２０に描写したように）、ならびに／またはそのような核酸配列の３’および／もしくは５’末端（ｅｎｄ）（末端（ｔｅｒｍｉｎｉ））で核酸配列にカップリングさせることができる。

【0116】

本明細書で使用される場合、用語「細胞型」は、一般的に属または種内の形態学的または表現型が異なる細胞形態の間を識別するために使用される分類を指す。多細胞生物は、複数の広く異なる特殊な細胞型、例えばヒトでは、膵細胞、肺細胞、筋細胞、および皮膚細胞を含有し得るが、これらは外観および機能の両方が異なるがなおも遺伝的に同一である。細胞は、それらが含有する遺伝子の示差的調節により、同じ遺伝子型であるが異なる細胞型の細胞であり得る。特定の細胞型の分類は、顕微鏡法、細胞表面マーカー、機能性、または他の適切な方法を使用することを通して行うことができる。

【0117】

用語「約」は、数値または範囲の文脈において本明細書で使用される場合、特に明記していなければ、列挙または主張される数値または範囲の±１０％を指す。

【0118】

用語「少なくとも」、「より大きい」、または「より大きいかまたはそれに等しい」が、一連の２つまたはそれより多くの数値における第１の数値の前にある場合は常に、用語「少なくとも」、「より大きい」、または「より大きいかまたはそれに等しい」は、その一連の数値における数値の各々に当てはまる。例えば、１、２、または３より大きいかまたはそれに等しいは、１より大きいかもしくはそれに等しく、２より大きいかもしくはそれに等しく、または３より大きいかもしくはそれに等しいことと等価である。

【0119】

用語「以下」、「未満」、または「未満またはそれに等しい」が、一連の２つまたはそれより多くの数値における第１の数値の前にある場合は常に、用語「以下」、「未満」、または「未満またはそれに等しい」が、その一連の数値における数値の各々に当てはまる。例えば、３、２、もしくは１未満またはそれに等しいは、３未満もしくはそれに等しく、２未満もしくはそれに等しく、または１未満もしくはそれに等しいことと等価である。

【0120】

用語「薬学的に許容される塩」は、一般的に本開示の化合物の生理学的および薬学的に許容される塩、例えば親化合物の生物活性を保持するが、それに対する毒性作用を付与しない塩を指す。オリゴマーの場合、薬学的に許容される塩およびその使用の例は、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２８７，８６０号に詳しく記載されている。

【0121】

用語「対象」は、本明細書で使用される場合、一般的に動物界の生きているメンバーを指す。対象は、疾患または障害に罹患していても、罹患していることが疑われていてもよい。対象は、自然に疾患に罹患している個体を含む種のメンバーであり得る。対象は哺乳動物であり得る。哺乳動物の非制限的な例としては、齧歯類（例えば、マウスおよびラット）、霊長類（例えば、キツネザル、サル、類人猿、およびヒト）、ウサギ、イヌ（例えば、コンパニオン犬、介助犬、または使役犬、例えば警察犬、軍用犬、競技用犬、およびショー用の犬）、ウマ（例えば、競走馬および役馬）、ネコ（例えば、ペットとしてのネコ）、家畜（例えば、ブタ、ウシ、ロバ、ラバ、水牛、ヤギ、ラクダ、およびヒツジ）、ならびにシカが挙げられ得る。対象はヒトであり得る。対象は、非哺乳動物、例えば七面鳥、アヒル、またはニワトリであり得る。対象は農場動物（例えば、ブタ、ヤギ、またはウシ）であり得る。対象は、本明細書に提供されるキット、方法、およびシステムを使用して診断および／または処置することができる疾患または状態に罹患しているまたは罹患しやすい、生きている生物であり得る。対象は、医療従事者（例えば、プライマリケア医）によって処置またはモニタリングされる患者であり得る。あるいは、対象は、患者でなくてもよい。

【0122】

用語「診断」は、本明細書で使用される場合、一般的に疾患（例えば、自己免疫疾患、炎症性自己免疫疾患、がん疾患、感染疾患、免疫疾患、腸内菌共生バランス失調疾患等）が対象に存在し得る相対的確率を指す。同様に、用語「予後」は一般的に、ある特定の将来の転帰が疾患状態に関連して対象に起こり得る相対的確率を指す。

【0123】

用語「実質的に同じ」は、組織向性核酸の文脈において本明細書で使用される場合、特に明記していなければ、機能または能力が類似または同一であることを意味する。
細胞型および組織型特異的腫瘍認識核酸配列（すなわち、Ｚｉｐコード配列またはＺＣＳ）

【0124】

本開示は、分子（例えば、核酸分子）の細胞、組織、および／もしくは臓器特異的標的化、取り込み、ならびに／または核局在化のための組成物および方法を提供する。そのような分子は、Ｚｉｐコード配列（ＺＣＳ）のような核酸配列を含み得る。そのようなＺＣＳは、がん細胞の核を標的とする、核に侵入する、および核に局在化することができる。本開示のがん細胞特異的ＺＣＳは、ｃｔＤＮＡに由来し得る。ｃｔＤＮＡは、がん細胞を起源とし得る。がん細胞は、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病、膵臓がん、肺がん、大腸がん（例えば、結腸直腸がん）、または脳がんを含むがこれらに限定されない、任意の型のがん（例えば、血液のがん、骨髄を起源とするがん、固形腫瘍等）の細胞であり得る。このように、そのような１つまたは複数のＺＣＳを含む本明細書に記載される核酸構築物は、様々なカーゴ、例えば核酸配列（例えば、治療用分子および／または診断用分子をコードする遺伝子）のための特異的標的化および送達構築物、ならびに／または標的化および送達ビヒクルとして使用することができる。

【0125】

本開示のＺＣＳは、１つまたは複数の細胞型および／もしくは組織型特異的腫瘍細胞認識ならびに／または染色体インテグレーション配列を含み得る。これらの配列は、ＺＣＳが細胞を細胞特異的に認識することを可能にし得る。例えば、ＰＣ特異的ＺＣＳは、ＰＣ特異的ＺＣＳが高い特異性（例えば、＞９５％特異性）でＰＣ細胞の核を標的とする、核に侵入する、核に蓄積する、および／または核に局在化することを可能にし得る１つまたは複数のＰＣ特異的認識および／またはインテグレーション配列（本明細書においてそれぞれ、「認識シグナル」および「インテグレーションシグナル」とも呼ぶ）を含み得る。

【0126】

本開示の細胞特異的ＺＣＳは、同じおよび／または他の細胞または細胞型に関して特異性を有するＺＣＳの存在下であっても、高い細胞特異性を示し得る。例えば、ＰＣ特異的ＺＣＳは、ＭＭ特異的ＺＣＳの存在下でＰＣ細胞の核への高い取り込み、蓄積、局在化、およびＰＣ細胞の染色体へのインテグレーションを示し得る（例えば、図１７Ａ～１７Ｄを参照されたい）。

【0127】

一部の例では、本開示は、組成物、例えば配列番号１～配列番号２７７のいずれか１つまたは複数と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、またはその断片と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含む医薬組成物を提供する。一部の例では、単離された核酸配列は、長さが少なくとも２００塩基対であり得る。一部の例では、単離された核酸配列は、長さが少なくとも４００塩基対であり得る。一部の例では、前記核酸配列は、長さが約２００塩基対～約８００塩基対の範囲であり得る。一部の例では、前記核酸配列は、長さが約４００塩基対～約２，０００塩基対の範囲であり得る。一部の例では、前記核酸配列は、長さが約４００塩基対～約５，０００塩基対の範囲であり得る。一部の例では、前記核酸配列は、長さが約１，５００塩基対～約７，２００塩基対の範囲であり得る。一部の例では、前記核酸配列は、長さが約１，９００塩基対～約５，８００塩基対の範囲であり得る。一部の例では、前記核酸配列は、長さが約２，０００塩基対～約１０，０００塩基対の範囲であり得る。一部の例では、前記核酸配列は、長さが約５，０００塩基対～約１５，０００塩基対の範囲であり得る。一部の例では、前記核酸配列は、長さが約６００塩基対～約１６，９００塩基対の範囲であり得る。一部の例では、前記核酸配列は、長さが約８，０００塩基対～約１８，０００塩基対の範囲であり得る。一部の例では、前記核酸配列は、長さが約１０，０００塩基対～約２０，０００塩基対の範囲であり得る。一部の例では、前記核酸配列は、長さが約４００塩基対～約２０，０００塩基対の範囲であり得る。

【0128】

一部の例では、本開示は、配列番号１～配列番号２７７、または配列番号２８２と比較して少なくとも１つの核酸塩基置換改変を含有する、配列番号１～配列番号２７７、または配列番号２８２と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有する単離された核酸を含む組成物を提供する。一部の例では、本開示の単離された核酸配列は、配列番号１～配列番号２７７、または配列番号２８２と比較して少なくとも１０個の核酸塩基置換改変を含み得る。一部の例では、本開示の単離された核酸配列は、配列番号１～配列番号２７７、または配列番号２８２と比較して少なくとも５０個の核酸塩基置換改変を含み得る。一部の例では、本開示の単離された核酸配列は、配列番号１～配列番号２７７、または配列番号２８２と比較して少なくとも１００個の核酸塩基置換改変を含み得る。一部の例では、本開示の単離された核酸配列は、配列番号１～配列番号２７７、または配列番号２８２と比較して少なくとも２５０個の核酸塩基置換改変を含み得る。一部の例では、本開示の単離された核酸配列は、配列番号１～配列番号２７７、または配列番号２８２と比較して約１～約２０個の核酸塩基置換改変を含み得る。一部の例では、本開示の単離された核酸配列は、配列番号１～配列番号２７７、または配列番号２８２と比較して約２０～約１００個の核酸塩基置換改変を含み得る。一部の例では、本開示の単離された核酸配列は、配列番号１～配列番号２７７、または配列番号２８２と比較して約５０～約２５０個の核酸塩基置換改変を含み得る。一部の例では、本開示の単離された核酸配列は、配列番号１～配列番号２７７、または配列番号２８２と比較して約１５０～約５００個の核酸塩基置換改変を含み得る。一部の例では、本開示の単離された核酸配列は、配列番号１～配列番号２７７、または配列番号２８２と比較して約２５０～約７００個の核酸塩基置換改変を含み得る。一部の例では、本開示の単離された核酸配列は、配列番号１～配列番号２７７、または配列番号２８２と比較して約５００～約７５０個の核酸塩基置換改変を含み得る。一部の例では、本開示の単離された核酸配列は、配列番号１～配列番号２７７、または配列番号２８２と比較して約５００～約１，０００個の核酸塩基置換改変を含み得る。

【0129】

一部の例では、本開示の核酸構築物およびシステムは、核酸に結合された（例えば、共有結合により連結またはコンジュゲートされた）少なくとも１つの検出可能部分（例えば、蛍光標識または放射活性標識）を含み得る。そのような場合、検出可能部分は、核酸の３’もしくは５’末端、またはその任意の適した組合せに連結することができる。検出可能部分は、フルオロフォア、例えば蛍光色素または量子ドットを含み得る。一部の例では、検出可能部分は、低分子（例えば、蛍光色素）を含み得るが、他の例では検出可能部分は、蛍光標識化ポリペプチド、蛍光標識化核酸プローブ、および／または蛍光標識化ポリペプチド複合体を含み得る。一部の例では、検出可能部分は、任意の色素分子、例えばＱｕａｓａｒ Ｄｙｅ（例えば、Ｑ５７０およびＱ６７０）であり得る。検出剤または部分はまた、追加の標識化プローブ（例えば、標識化ポリペプチドまたは抗体）にさらにコンジュゲートすることができる非標識化プローブでもあり得る。一部の例では、例えば検出可能部分を、コンジュゲート部分によって核酸に間接的にコンジュゲートまたは結合させてもよい。本明細書に記載されるように、検出可能部分は、核酸に直接コンジュゲートまたは結合され得る低分子（例えば、色素）であり得る。検出可能部分は、例えばクリックケミストリーを使用して核酸のコンジュゲート部分（例えば、ハプテン基、アジド基、アルキン基、またはテトラジン）に結合され得る蛍光標識化タンパク質または分子であり得る。

【0130】

一部の例では、本明細書に記載される蛍光低分子は、ローダミン、ロードール、フルオレセイン、チオフルオレセイン、アミノフルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、クロロフルオレセイン、メチルフルオレセイン、スルホフルオレセイン、アミノロードール、カルボキシロードール、クロロロードール、メチルロードール、スルホロードール；アミノローダミン、カルボキシローダミン、クロロローダミン、メチルローダミン、スルホローダミン、チオローダミン、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニン、シアニン２、シアニン３、シアニン３．５、シアニン５、シアニン５．５、シアニン７、オキサジアゾール誘導体、ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール、ベンゾオキサジアゾール、ピレン誘導体、カスケードブルー、オキサジン誘導体、ナイルレッド、ナイルブルー、クレジルバイオレット、オキサジン１７０、アクリジン誘導体、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー、アリールメチン誘導体、オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン、テトラピロール誘導体、ポルフィン、フタロシアニン、ビリルビン１－ジメチルアミノナフチル－５－スルホネート、１－アニリノ－８－ナフタレンスルホネート、２－ｐ－トルイジニル（ｔｏｕｉｄｉｎｙｌ）－６－ナフタレンスルホネート、３－フェニル－７－イソシアナトクマリン、Ｎ－（ｐ－（２－ベンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミド、スチルベン、ピレン、６－ＦＡＭ（フルオレセイン）、６－ＦＡＭ（ＮＨＳエステル）、５（６）－ＦＡＭ、５－ＦＡＭ、フルオレセインｄＴ、５－ＴＡＭＲＡ－カダバリン、２－アミノアクリドン、ＨＥＸ、ＪＯＥ（ＮＨＳエステル）、ＭＡＸ、ＴＥＴ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＡＲＭＡ（商標）（ＮＨＳエステル）、ＴＥＸ６１５、ＡＴＴＯ（商標）４８８、ＡＴＴＯ（商標）５３２、ＡＴＴＯ（商標）５５０、ＡＴＴＯ（商標）５６５、ＡＴＴＯ（商標）Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ（商標）５９０、ＡＴＴＯ（商標）６３３、ＡＴＴＯ（商標）６４７Ｎ、ＴＹＥ（商標）５６３、ＴＹＥ（商標）６６５、またはＴＹＥ（商標）７０５を含み得る。

【0131】

蛍光部分は、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｑ５７０、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５９４、Ａｌｅｘａ６４７、Ａｌｅｘａ６８０、Ａｌｅｘａ７５０、Ａｌｅｘａ７９０、Ａｔｔｏ４８８、Ａｔｔｏ５３２、Ａｔｔｏ６４７Ｎ、テキサスレッド、ＣＦ６１０、ヨウ化プロピジウム、Ｑｕａｓａｒ５７０（Ｑ５７０）、Ｑｕａｓａｒ６７０（Ｑ６７０）、ＩＲＤｙｅ７００、ＩＲＤｙｅ８００、インドシアニングリーン、パシフィックブルー色素、パシフィックグリーン色素、またはパシフィックオレンジ色素を含み得る。

【0132】

一部の例では、蛍光部分は、量子ドット（ＱＤ）を含み得る。量子ドットは、ナノスケール半導体発光材料であり得る。例示的なＱＤとしては、これらに限定されないが、ＣｄＳ量子ドット、ＣｄＳｅ量子ドット、ＣｄＳｅ／ＣｄＳコア／シェル量子ドット、ＣｄＳｅ／ＺｎＳコア／シェル量子ドット、ＣｄＴｅ量子ドット、ＰｂＳ量子ドット、および／またはＰｂＳｅ量子ドットが挙げられる。本明細書で使用される場合、ＣｄＳｅ／ＺｎＳは、ＺｎＳシェルがＣｄＳｅコア表面でコーティングされていること（「コア－シェル」量子ドット）を意味し得る。コア－シェルＱＤのシェル材料は、より高いバンドギャップを有し、コアＱＤ表面を不動態化し、それによってコアＱＤより高い量子収率およびより高い安定性およびより広い応用が得られ得る。本明細書に提供される量子ドットは、ＱＤｏｔ５２５、ＱＤｏｔ５４５、ＱＤｏｔ５６５、ＱＤｏｔ５８５、ＱＤｏｔ６０５、またはＱＤｏｔ６５５を含み得る。一部の例では、本明細書に記載される核酸は、量子ドット、例えばＱＤｏｔ５２５、ＱＤｏｔ５４５、ＱＤｏｔ５６５、ＱＤｏｔ５８５、ＱＤｏｔ６０５、またはＱＤｏｔ６５５を含み得る。本明細書に記載のプローブはＱＤｏｔ５２５を含み得る。本明細書に記載のプローブはＱＤｏｔ５４５を含み得る。本明細書に記載のプローブはＱＤｏｔ５６５を含み得る。本明細書に記載のプローブはＱＤｏｔ５８５を含み得る。本明細書に記載のプローブはＱＤｏｔ６０５を含み得る。本明細書に記載のプローブはＱＤｏｔ６５５を含み得る。

【0133】

一部の例では、核酸は、コンジュゲート部分を含み得る。コンジュゲート部分は、５’末端、３’末端、または核酸の長さに沿った内部位置に結合し得る。コンジュゲート部分は、ヌクレオチドアナログ（例えば、ブロモデオキシウリジン）であり得る。コンジュゲート部分は、コンジュゲート官能基であり得る。コンジュゲート官能基は、アジド基またはアルキン基であり得る。プローブは、クリックケミストリーなどの化学反応または他の任意のバイオコンジュゲーション反応を通してさらに誘導体化され得る。クリックケミストリーは、１，２，３－トリアゾールをもたらす、アルキンおよびアジドの銅（Ｉ）触媒化［３＋２］－ヒュスゲン１，３－双極子付加環化であり得る。クリックケミストリーは、上記の反応の銅フリーのバリアントであり得る。クリックケミストリーは、ｔｒａｎｓ－シクロオクタジエンとテトラジンとの間の逆電子要請型ディールス－アルダー反応であり得る。

【0134】

一部の例では、コンジュゲート部分は、本明細書で使用される場合、ハプテン基を含み得る。ハプテン基は、ジゴキシゲニン、２，４－ジニトロフェニル、ビオチン、アビジンを含み得るか、またはアゾール、ニトロアリール化合物、ベンゾフラザン、トリテルペン、ウレア、チオウレア、ロテノン、オキサゾール、チアゾール、クマリン、シクロリグナン、ヘテロビアリール化合物、アゾアリール化合物、もしくはベンゾジアゼピンから選択される。ハプテン基は、ビオチンを含み得る。コンジュゲート部分を含む核酸はさらに、第２の核酸、蛍光部分（例えば、量子ドットなどの色素）、またはコンジュゲートパートナー、例えばポリマー（例えば、ＰＥＧ）、高分子（例えば、炭水化物、脂質、ポリペプチド）等に連結され得る。

【0135】

一部の態様では、本明細書に記載される検出可能な標識または部分は、光学顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、またはクロマトグラフィーによって検出され得る。プローブの検出可能な標識の検出は、プローブまたはその一部（例えば、検出可能な標識）を放射線源（例えば、光源、例えばレーザー）によって刺激することを含み得る。プローブの検出可能な標識の検出はまた、酵素反応も含み得る。

【0136】

一部の例では、検出可能な標識は、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）または単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）を介して本明細書に開示の核酸構築物の分布の可視化を可能にする放射活性標識（例えば、放射活性同位体）であり得る。それらの核検出方法論を、コンピューターＸ線断層撮影（ＣＴ）とカップリングさせてもよい（例えば、ＰＥＴ／ＣＴまたはＳＰＥＣＴ／ＣＴ）。一部の例では、検出可能部分は、少なくとも１つの元素の放射性同位体を含み得る。例示的な適切な放射標識としては、これらに限定されないが、本明細書に記載される放射標識が挙げられる。一部の例では、放射性同位体は、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^６４Ｃｕ、^６７Ｇａ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１５３Ｓｍ、^１７７Ｌｕ、^６７Ｃｕ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８Ｆ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１５３Ｓｍ、^１６６Ｈｏ、^１７７Ｌｕ、^１４９Ｐｍ、^９０Ｙ、^２１３Ｂｉ、^１０３Ｐｄ、^１０９Ｐｄ、^１５９Ｇｄ、^１４０Ｌａ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^１６９Ｙｂ、^１７５Ｙｂ、^１６５Ｄｙ、^１６６Ｄｙ、^６７Ｃｕ、^１０５Ｒｈ、^１１１Ａｇ、^８９Ｚｒ、^２２５Ａｃ、および^１９２Ｉｒを含む。

【0137】

本開示の一部の態様では、放射活性同位体は、キレート剤を使用して本明細書に記載される核酸分子に結合することができる。例示的なキレート部分としては、２，２’，２’’－（３－（４－（３－（１－（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）－１－オキソ－５，８，１１，１４，１７，２０，２３－ヘプタオキサ－２－アザペンタコサン－２５－イル）チオウレイド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－２，５，８－トリイル）三酢酸；２，２’，２’’－（３－（４－（３－（１－（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）－１－オキソ－５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５－ウンデカオキサ－２－アザヘプタトリアコンタン－３７－イル）チオウレイド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－２，５，８－トリイル）三酢酸；２，２’－（７－（４－（３－（１－（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）－１－オキソ－５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５－ウンデカオキサ－２－アザヘプタトリアコンタン－３７－イル）チオウレイド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－１，４－ジイル）二酢酸；２，２’，２’’－（３－（４－（３－（１－（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）－３，７－ジオキソ－１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９－ヘプタオキサ－２，８－ジアザヘントリアコンタン－３１－イル）チオウレイド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－２，５，８－トリイル）三酢酸；２，２’，２’’－（３－（４－（３－（１－（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）－３，７－ジオキソ－１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，３８，４１－ウンデカオキサ－２，８－ジアザトリテトラコンタン－４３－イル）チオウレイド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－２，５，８－トリイル）三酢酸；２，２’，２’’－（３－（４－（３－（２５，２８－ジオキソ－２８－（（６－（６－（ピリジン－２－イル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ピリジン－３－イル）アミノ）－３，６，９，１２，１５，１８，２１－ヘプタオキサ－２４－アザオクタコシル）チオウレイド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－２，５，８－トリイル）三酢酸；２，２’，２’’－（３－（４－（３－（３７，４０－ジオキソ－４０－（（６－（６－（ピリジン－２－イル）－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ピリジン－３－イル）アミノ）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３－ウンデカオキサ－３６－アザテトラコンチル）チオウレイド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－２，５，８－トリイル）三酢酸；２，２’，２’’－（３－（４－（１－（４－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）－３－オキソ－６，９，１２，１５，１８，２１，２４－ヘプタオキサ－２－アザヘプタコサン－２７－アミド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－２，５，８－トリイル）三酢酸；２，２’，２’’－（２－（４－（１－（４－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェノキシ）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３－ウンデカオキサヘキサトリアコンタン－３６－アミド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－１，４，７－トリイル）三酢酸；２，２’，２’’－（３－（４－（３－（５－アミノ－６－（（４－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジル）アミノ）－６－オキソヘキシル）チオウレイド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－２，５，８－トリイル）三酢酸；２，２’－（７－（４－（３－（５－アミノ－６－（（４－６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジル）アミノ）－６－オキソヘキシル）チオウレイド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－１，４－ジイル）二酢酸；２，２’，２’’－（３－（４－（３－（５－アミノ－６－（（５－アミノ－６－（（４－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジル）アミノ）－６－オキソヘキシル）アミノ）－６－オキソヘキシル）チオウレイド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－２，５，８－トリイル）三酢酸；および２，２’，２’’－（３－（４－（３－（５－アミノ－６－（（５－アミノ－６－（（５－アミノ－６－（（４－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジル）アミノ）－６－オキソヘキシル）アミノ）－６－オキソヘキシル）アミノ）－６－オキソヘキシル）チオウレイド）ベンジル）－１，４，７－トリアゾナン－２，５，８－トリイル）三酢酸が挙げられ得る。

【0138】

一部の例では、本開示の核酸分子を、細胞および／または組織特異的標的化のために粒子（例えば、ナノ粒子）または小胞（例えば、エクソソーム）に会合（例えば、コンジュゲートまたは共有結合による連結）してもよい。例えば、カーゴ含有ナノ粒子またはエクソソームを、非常に特異的なカーゴ送達を可能にするその表面上の細胞標的化核酸分子によって官能化することができる。

【0139】

一部の例では、本開示は、配列番号１～配列番号２７７、または配列番号２８２と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む単離された核酸、および異種核酸配列を含むベクターを提供する。一部の例では、異種配列は、インテグレーションシグナルをさらに含む。一部の例では、異種配列は、目的の遺伝子をコードする配列、例えば免疫原をコードする配列またはゲノムから発現させることができるタンパク質をコードする配列をさらに含む。そのようなタンパク質配列は、タンパク質の組織特異的発現をさらに促進するために組織選択的プロモーターの制御下であり得る。

【0140】

本開示の一部の態様では、本明細書に記載される核酸配列およびシステムは、特定の機能に関連し得る様々な部分を含み得る。例えば、本開示のシステムは、細胞標的化シグナル、インテグレーションシグナル、ガイド配列、および目的の遺伝子をコードする部分を含む目的の遺伝子（例えば、トランスジーン）のための核酸送達システムであり得る。必要に応じて、本開示の送達構築物は、核酸配列の３’および５’末端を識別するために１つまたは両方の末端でバーコード配列（例えば、ＰＡＣｂｉｏ配列）を含み得る。例えば図１２のダイアグラムは、細胞標的化シグナル配列が、本明細書に記載される核酸送達システムの３’末端および５’末端に存在し得ることを図示している。構築物はまた、インテグレーションシグナル配列も含み得、そのようなインテグレーションシグナル配列の存在は、そのような核酸配列またはその少なくとも一部のゲノムへのインテグレーションを促進することができる。一部の例では、本明細書に記載されるＺＣＳまたはトランスポゾンは、細胞標的化配列およびインテグレーション配列を含む。一部の例では、本開示の送達システムは、図１２および図２０に示すように、目的の遺伝子の両端で、このように両側で目的の遺伝子、例えばＺＣＳまたはトランスポゾンに隣接する少なくとも１つの追加の配列を含み得る。

【0141】

本開示の一部の実施形態では、ＺＣＳは、１つまたは複数のトランスポゾン、例えばクラスＩＩトランスポゾンからなり得るか、またはそれを含み得る。そのような例では、トランスポゾンは、ある特定の細胞、細胞集団、もしくは組織（例えば、血球、肺組織、膵組織、大腸組織等）を標的とすることが可能な、ならびに／またはそれ自身および／もしくは追加のカーゴ核酸分子を標的細胞のゲノムにインテグレートすることが可能な任意の分子であり得る。一部の例では、トランスポゾンは核酸である。そのような核酸はＤＮＡを含み得るか、またはＤＮＡからなり得る。本開示のトランスポゾンがＤＮＡ配列である例では、トランスポゾンは、配列番号２０３～配列番号２７７、または配列番号２８２のいずれか１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、もしくは１００％の配列同一性、またはその断片と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。そのような断片は、少なくとも約８、１０、１２、１５、２０、２５、または３０ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、トランスポゾンは、配列番号２０３～配列番号２７７または配列番号２８２のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み得るか、またはそれからなり得る

【化1】

配列番号２８２）一例では、配列番号２８２に記載の核酸配列からなるかまたはそれを含む核酸構築物は、他の起源または組織の細胞と比較して非常に選択的に多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞を標的とすることができ、ＭＭ細胞のゲノムにインテグレートすることができる。そのような核酸構築物を使用して、カーゴ分子をＭＭ細胞に方向付けることができる。

【0142】

一部の例では、本開示の送達システムは、核酸送達システムの３’または５’末端のいずれかで少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または別の適切な数の細胞標的化配列を含み得る。本開示の組成物は、複数のそのような送達システムを含み得、各々の送達システムは１つまたは複数の細胞型を標的とすることができる。このように、本開示の方法および組成物を使用して、１つもしくは複数の異なる標的細胞、１つもしくは複数の異なる標的細胞集団、および／または１つもしくは複数の異なる標的組織を同時に標的とすることができる。

【0143】

一部の例では、配列の１つの部分（例えば、半分）を、目的の遺伝子の５’末端に連結させ、配列の他の部分（例えば、半分）を目的の遺伝子の３’末端に連結させることができる。一部の例では、配列を、目的の遺伝子に直接または間接的に連結させることができる。例えば、一部の例では、第１の配列を、目的の遺伝子を含む核酸配列の５’末端に直接連結させることができ、第２の配列を、目的の遺伝子を含む核酸配列の３’末端に間接的に連結させることができる。一部の例では、本開示の組成物は、１つの末端（例えば、３’末端）で目的の遺伝子に直接連結し、他方の末端（例えば、５’末端）でＺＣＳまたはトランスポゾン配列に直接連結し、このようにトランスポゾンまたはＺＣＳ配列と目的の遺伝子とを間接的に接続するガイド配列を含み得る（例えば、図１２、図２０を参照されたい）。

【0144】

一部の例では、細胞標的化シグナル配列およびインテグレーションシグナル配列は、細胞および／または組織特異的であり、このように１つまたは複数の標的細胞集団および／または１つまたは複数の標的組織における目的の遺伝子の発現を可能にする。一部の例では、本開示の核酸システムは、目的の遺伝子をコードする核酸配列をさらに含む。目的の遺伝子は、ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳において細胞によって使用されるリボ核酸（すなわち、ｍＲＮＡ）をコードし得る。言い換えれば、目的の遺伝子は、異種タンパク質またはポリペプチドをコードし得る。

【0145】

さらなる例では、本開示は、１つまたは複数のガイド核酸配列を含み得る核酸構築物および核酸送達システムを提供する。そのようなガイド核酸は、インテグレーションシグナル配列、ガイドＲＮＡ、ガイドＤＮＡ、またはその組合せであり得る。そのようなガイド核酸配列は、例えばそのような構築物または送達システムをゲノムインテグレーションのために細胞のゲノム内の特定の位置に方向付けるために使用することができる。このように一部の例では、本明細書におけるガイド核酸配列を使用して、細胞（例えば、がん細胞）のゲノム内の特異的インテグレーション部位を選択することができる。

【0146】

目的の遺伝子は、特定の機能を実施するタンパク質またはポリペプチドをコードし得る。例えば、目的の遺伝子は、細胞によって生成されていないタンパク質またはポリペプチドをコードし得る。目的の遺伝子は、治療的処置のために抗原としてさらに使用することができる治療タンパク質をコードし得る。あるいは、目的の遺伝子は、遺伝子治療において使用することができる治療タンパク質をコードし得る。そのような治療タンパク質は、本開示の核酸システムによって標的にされる細胞の成長および／または生存を低減させる、防止する、および／または取り除くことができる。そのような細胞はがん細胞であり得る。標的細胞は、疾患または状態に関連してもよく、目的の遺伝子の標的細胞特異的発現は、本明細書に記載されるＺｉｐコード配列を使用することによって達成することができる。一部の例では、本開示の送達システムは、目的の遺伝子をコードする配列の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または別の適切な数を含み得る。

【0147】

一部の例では、目的の遺伝子のインテグレーションは、遺伝子座特異的または遺伝子座非特異的であり得る。本開示の一部の態様では、目的の遺伝子を細胞において発現させることができ、得られた内因性または外因性の治療タンパク質を細胞内に保持することができる。さらに別の態様では、本発明の治療タンパク質を、細胞から放出させることができる。一部の例では、目的の遺伝子を発現させることができる速度は、どのプロモーターを使用するか、および／または目的の遺伝子が標的細胞のゲノムに遺伝子座特異的にインテグレートされるか否かに応じて変化し得る。一部の用途では、タンパク質を構成的プロモーターから発現させることが望ましい場合がある。他の例では、タンパク質を誘導型プロモーターから発現させることが望ましい場合がある。

【0148】

本開示の一部の態様では、目的の遺伝子は、対象において欠如しているかまたは機能が損なわれている内因性のタンパク質または機能的ＲＮＡ分子をコードし得る。一部の例では、遺伝子に突然変異、例えばがん性の突然変異を有する対象を、欠如しているまたは機能的に損なわれているタンパク質を供給することによって本発明によって処置することができる。

【0149】

一部の態様では、本開示の組成物および方法は、細胞内で特定の機能を実施し得る分子の細胞、組織、または臓器特異的送達のために使用され得る。例えば、一部の例では、本開示の核酸構築物を使用して、ある特定の機能を示すタンパク質をコードする目的のある特定の遺伝子を送達することができる。さらに別の例では、本明細書に記載の組成物を使用して、ある特定の標的遺伝子を不活化することができる。例えば、本明細書に記載される組成物を使用して、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介してその標的遺伝子を沈黙化するために使用され得る干渉ＲＮＡ、例えば低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を標的細胞に送達することができる。

【0150】

一部の例では、カーゴは核酸であり得る。そのような核酸は、目的の遺伝子であり得る。そのような目的の遺伝子は、ある特定の機能を示し、特定の生物効果、例えば治療効果を引き起こすことができる１つまたは複数のタンパク質をコードし得る。一部の例では、カーゴは、ケラチン７、ヒトコレシストキニンＡ受容体（膵臓がんの起源である膵管細胞）、ヒト精巣上体タンパク質４（ＨＥ４、卵巣がん）、ＧＡＴＡ２およびＷＡＳＰ（造血幹細胞）、前立腺特異抗原、ＧＦＡＢ（星細胞）、ＣＤ２０およびＣＤ１９（Ｂリンパ球）であり得るか、または標的細胞に送達されるトランスジーンはそれらをコードし得る。一部の例では、目的の遺伝子は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＣＤ２０、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＣＤ３８、ＳＬＡＭ７、ＣＤ５２、ＣＤ３０、ＣＤ１９、ＣＤ３、ＰＤ１、またはＰＤＬ１をコードし得る。一部の例では、本明細書に開示される目的の遺伝子は、核因子－カッパＢ（ＮＦ－カッパＢ）、もしくはｐ５３（例えば、野生型ｐ５３またはスーパー抑制因子ｐ５３）、またはそのいずれかの組合せをコードし得る。一部の例では、本明細書に開示される目的の遺伝子は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ、例えば、ＲＳＶ－ＡおよびＲＳＶ－Ｂ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デングウイルス（ＤＥＮＶ）、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）および２型（ＨＳＶ－２）、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）に由来する抗原などの細菌抗原、またはヘマグルチニン融合ペプチド（ＨＡ－ｆｐ）エピトープ、ヘマグルチニン疎水性ポケットペプチド（ＨＡ－ｈｐ）エピトープ、ヘマグルチニンヘリックスＡエピトープ、ノイラミニダーゼエピトープ、Ｍ２エクトドメイン（Ｍ２ｅ）エピトープ、およびヌクレオタンパク質（ＮＰ）エピトープを含むインフルエンザ由来抗原をコードし得る。

【0151】

一部の例では、本開示の組成物および方法は、ガイド配列として機能し得、ゲノムの特定の標的部位で核酸配列の挿入を可能にし得るある特定の核酸配列を含み得る。

【0152】

本開示の一部の態様では、本明細書に記載される組成物は、標的細胞、１つもしくは複数の標的細胞集団、または１つもしくは複数の標的組織において目的の遺伝子の発現を調節し得るプロモーター（例えば、転写プロモーター）を含み得る。一部の例では、転写プロモーターは、その各々が標的細胞内で生成される１つまたは複数の因子（例えば、ｐ１６、ｐ２１、またはｐ５３）に応答して活性化される。目的の遺伝子は、転写プロモーターに作動可能に連結され、その調節的制御下であり得る。他の例では、本明細書に記載されるプロモーターは、組織特異的であり得、ＳＰ１、ＥＴＳ１、および／またはＥＴＳ２を含む転写因子による活性化に応答し得る。一部の例では、転写プロモーターは、ｐ２１^{ｃｉｐ１／ｗａｆ１}プロモーター、ｐ２７^ｋｉｐ１プロモーター、ｐ５７^ｋｉｐ２プロモーター、ＴｄＴプロモーター、Ｒａｇ－１プロモーター、Ｂ２９プロモーター、Ｂｌｋプロモーター、ＣＤＥ１９プロモーター、ＢＬＮＫプロモーター、ＨＳＰ（例えば、ＨＳＰ７０）プロモーター、ＴＹＲプロモーター、および／またはλ５プロモーターを含み得る。一部の例では、プロモーターは、グロビンプロモーターであり得る。一部の例では、プロモーターは、アルファ－グロビン、ベータ－グロビン、またはガンマ－グロビンプロモーターであり得る。

【0153】

本開示の一部の態様では、核酸は、天然もしくは非天然のヌクレオチドアナログもしくは塩基、またはその組合せを含み得る。非天然のヌクレオチドアナログまたは塩基は、リボース部分、ホスフェート部分、ヌクレオシド部分、またはその組合せの１つまたは複数において改変を含み得る。非天然のヌクレオチドアナログまたは塩基は、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）改変、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、または２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホロアミダイトを含み得る。本開示の核酸は、１つまたは複数の脱塩基部位をさらに含み得る。脱塩基部位は、検出可能部分によってさらに官能化され得る。

【0154】

本明細書で使用される場合、用語「転写プロモーター」は、特定の遺伝子の転写を開始する核酸配列の領域を指す。プロモーターは一般的に、遺伝子の転写開始部位近傍で、ＤＮＡの同じ鎖上の上流（アンチセンス鎖の３’領域に対して、同様に鋳型鎖および非コード鎖とも呼ぶ）に位置する。プロモーターは、長さが約１００～１０００塩基対であり得る。プロモーターは、特定のＤＮＡ配列、ならびにＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼを動員する転写因子と呼ばれるタンパク質のための安全な初回結合部位を提供する応答エレメントを含有する。これらの転写因子は、特異的プロモーターに結合して遺伝子発現を調節する対応するヌクレオチドの特異的活性化因子またはリプレッサー配列を有する。プロセスはより複雑であり、ＲＮＡポリメラーゼＩＩがプロモーターに結合するためには少なくとも７つの異なる因子が必要である。プロモーターは、他の調節領域（エンハンサー、サイレンサー、境界エレメント／インスレーター）と協調して作用し、所与の遺伝子の転写レベルを方向付けることができる重要なエレメントを表す。真核生物転写プロモーターは、複数の必須のエレメントを含み、これらは集合的にコアプロモーター（すなわち、転写を開始するために必要なプロモーターの最小部分）を構成する。それらのエレメントは一般的に、（１）転写開始部位（ＴＳＳ）、（２）ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（特に、メッセンジャーＲＮＡをコードする遺伝子のプロモーターにおけるＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合部位）、（３）基本転写因子結合部位（例えば、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）のための結合部位であるコンセンサス配列ＴＡＴＡＡＡを有するＴＡＴＡボックス）、（４）Ｂ認識エレメント（ＢＲＥ）、（５）調節エレメントを含有するおよそ２５０ｂｐの近位プロモーター、（６）転写因子結合部位（例えば、ＢＭＡＬ１１－ＣｌｏｃｋおよびｃＭｙｃを含む塩基性ヘリックスループヘリックス（ｂＨＬＨ）転写因子の結合部位である配列ＣＡＣＧＴＦを有するＥ－ボックス）、ならびに（７）追加の調節エレメントを含有する遠位プロモーターを含む。本明細書で使用される場合、用語「転写プロモーター」は、転写開始部位から離れた調節エレメントを指す用語「エンハンサー」とは異なる。真核生物プロモーターはしばしば、以下のクラスに従って分類される：（１）ＡＴベースのクラス、（２）ＣＧベースのクラス、（３）ＡＴＣＧコンパクトクラス、（４）ＡＴＣＧバランスクラス、（５）ＡＴＣＧミドルクラス、（６）ＡＴＣＧレスクラス、（７）ＡＴレスクラス、（８）ＣＧスパイククラス、（９）ＣＧレスクラス、および（１０）ＡＴスパイククラス。Ｇａｇｎｉｕｃ ａｎｄ Ｉｏｎｅｓｃｕ－Ｔｉｒｇｏｖｉｓｔｅ， ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３：５１２ （２０１２）を参照されたい。真核生物プロモーターは、「単方向性」または「二方向性」であり得る。単方向性プロモーターは、単一の遺伝子の転写を調節し、ＴＡＴＡボックスの存在によって特徴付けられる。二方向性プロモーターは、二方向性遺伝子対（すなわち、互いの方向を向く５’末端を有する反対鎖上にコードされた２つの隣接する遺伝子）における遺伝子の５’末端の間のＤＮＡの短い（＜１キロ塩基対（ｋｂｐ））遺伝子間領域である。二方向性遺伝子はしばしば、機能的に関連し、それらが単一のプロモーターを共有することから、同時調節および同時発現させることができる。単方向性プロモーターとは異なり、二方向性プロモーターは、ＴＡＴＡボックスを含有しないが、ＧｐＣアイランドを含有し、１つの側のドミナントのＣおよびＡと、他方の側のＧおよびＴとの中点付近で対称性を示す。ＣＣＡＡＴボックスは、ＮＲＦ－１、ＧＡＢＰＡ、ＹＹ１、およびＡＣＴＡＣＡｎｎＴＣＣＣ（配列番号２７８）モチーフと同様に二方向性プロモーターにおいて共通である。

【0155】

本明細書で使用される場合、用語「転写因子」は、転写プロモーター内の特異的配列に結合し、それによってプロモーターの近位および下流で作動可能である核酸の転写を調節する配列特異的ＤＮＡ結合因子を指す。転写因子は、転写を促進する活性化剤、およびＲＮＡポリメラーゼの動員または結合を防止することによって転写を遮断するリプレッサーを含む。

【0156】

本明細書で使用される場合、用語「自殺遺伝子」は、ｐ５３媒介性アポトーシス細胞死滅を誘導するタンパク質を生成する遺伝子のクラスを指す。本開示の発現構築物およびシステムにおいて使用することができる自殺遺伝子としては、カスパーゼ、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＢＡＸ、ＤＮＡ断片化因子（ＤＦＦ）４０、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、およびシトシンデアミナーゼ、ならびにＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＢＡＸ、ＤＦＦ４０、ヘルペスＨＳＶ－ＴＫ、およびシトシンデアミナーゼの誘導型バリアントが挙げられる。

【0157】

単離された核酸は、トランスポゾン機能性、例えばクラスＩＩトランスポゾンを有し得る。
生物試料のスクリーニングによる細胞特異的がんＺｉｐコード配列の検出

【0158】

一部の例では、本開示は、生物試料中の細胞型および組織型特異的無細胞ヒト細胞標的化配列（時に１つまたは複数のＺＣＳを含む）を検出することによって、対象（例えば、齧歯類またはヒト）におけるがんをスクリーニングする方法を提供する。一部の例では、本開示は、対象の生物試料を得ること；プローブを前記生物試料と接触させて、プローブと核酸配列との間のハイブリダイゼーションを検出することによって、配列番号１～配列番号２７７または配列番号２８２と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列が、前記生物試料中に存在するか否かを検出すること；および前記核酸が前記ハイブリダイゼーションによって検出されるか否かに基づいて前記対象の前記生物試料の健康状態を特徴付けることを含む方法を提供する。他の例では、本開示は、対象の生物試料を得ること；逆転写、ポリヌクレオチド増幅、またはシーケンシングから選択される１つまたは複数のプロセスによって、前記生物試料中の配列番号１～配列番号２７７、または配列番号２８２と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列のレベルを定量すること；コンピューターシステムにおいて、前記核酸配列の前記定量レベルを参照と比較すること；および前記核酸が前記１つまたは複数のプロセスによって検出されるか否かに基づいて前記対象の前記生物試料の健康状態を特徴付けることを含む方法を提供する。

【0159】

一部の例では、単離された核酸配列は、長さが少なくとも２００塩基対であり得る。一部の例では、単離された核酸配列は、長さが少なくとも４００塩基対であり得る。一部の例では、前記核酸配列は、長さが約２００塩基対～約８００塩基対の範囲であり得る。一部の例では、前記核酸配列は、長さが約４００塩基対～約２，０００塩基対の範囲であり得る。一部の例では、前記核酸配列は、長さが約４００塩基対～約５，０００塩基対の範囲であり得る。一部の例では、前記核酸配列は、長さが約１，５００塩基対～約７，２００塩基対の範囲であり得る。一部の例では、前記核酸配列は、長さが約１，９００塩基対～約５，８００塩基対の範囲であり得る。一部の例では、前記核酸配列は、長さが約２，０００塩基対～約１０，０００塩基対の範囲であり得る。一部の例では、前記核酸配列は、長さが約５，０００塩基対～約１５，０００塩基対の範囲であり得る。一部の例では、前記核酸配列は、長さが約６００塩基対～約１６，９００塩基対の範囲であり得る。一部の例では、前記核酸配列は、長さが約８，０００塩基対～約１８，０００塩基対の範囲であり得る。一部の例では、前記核酸配列は、長さが約１０，０００塩基対～約２０，０００塩基対の範囲であり得る。一部の例では、前記核酸配列は、長さが約４００塩基対～約２０，０００塩基対の範囲であり得る。
疾患または状態のｉｎ ｖｉｖｏでの処置

【0160】

様々な態様では、本開示のヒト細胞標的化核酸配列を使用して、投与後に特定の細胞、細胞集団、組織、または臓器をｉｎ ｖｉｖｏで（すなわち、生きている生物または対象において）標的とすることができる。一部の例では、および特定の細胞、細胞集団、組織、または臓器に対するその高い特異性のために、本開示のヒト細胞標的化核酸配列は、生物または対象内の特定の位置にそれらのカーゴを送達するために、カーゴと組み合わせて使用され得る。一部の例では、そのようなカーゴの送達は、治療および／または診断目的のために、例えば疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害の発症をｉｎ ｖｉｖｏで高い特異性で処置および／または検出するために使用することができる。一部の例では、本開示のヒト細胞標的化核酸配列は、高度に標的化された処置を可能にし得る。一部の例では、本開示のヒト細胞標的化核酸配列は、疾患もしくは状態、または疾患もしくは状態の促進因子を含む疾患もしくは状態の発症の高度に特異的な検出を可能にし得る。一部の例では、疾患または状態の診断は非侵襲性であり得、このように特定の疾患または状態は、侵襲性の方法（例えば、手術）を使用することによって生きている生物または対象において検出され得る。

【0161】

本明細書において以下にさらに詳細に記載するように、例えばカーゴは、治療タンパク質、またはタンパク質、ペプチドおよび低分子薬、または多様な検出可能部分、例えば本明細書に開示されるヒト細胞標的化核酸配列のｉｎ ｖｉｖｏ追跡を可能にする蛍光標識もしくは放射活性標識をコードする核酸分子を含み得る。

【0162】

そのモジュール性の性質により（例えば、図１２または図２０を参照されたい）、本開示のヒト細胞標的化核酸配列およびシステムを使用して、慢性、代謝、および感染性の疾患または状態、例えばがんまたは糖尿病を含み得る多様な疾患および状態を防止、処置、および／または診断することができる。

【0163】

様々な態様では、本開示のヒト細胞標的化核酸配列は、医薬組成物として製剤化され、全身および局所投与を含む多様な投与経路を使用して対象の生物に投与され得る。投与されると、ヒト細胞標的化核酸配列は対象の生きている生物内に分布し、循環中および臓器取り込みの際に、蛍光色素または放射活性同位体などの検出可能部分によって放出されたシグナルの検出を介して検出され得る。細胞、細胞集団、組織、または臓器による細胞標的化核酸配列がｉｎ ｖｉｖｏで取り込まれると、細胞標的化核酸配列は、本明細書に記載されるカーゴを標的部位または複数の標的部位に送達し得る。特定の細胞、細胞集団、組織、または臓器に対するその高い特異性のために、本開示の核酸構築物は、標的部位に主に蓄積し、そのため、多様なカーゴに関して非常に特異的な送達ビヒクルであり得る。がんの処置におけるｚｉｐコード配列の使用

【0164】

多くのがん、特にいくつかの型の固形腫瘍は、正常な組織における薬物の負の副作用を管理しながらそのような腫瘍において有効な薬物を十分に高いレベルで達成することが難しいために、処置することが難しい。その結果、他の組織における負の副作用レベルを最小限にしながら腫瘍における薬物のより高い有効用量を達成するためには、薬物を例えば固形腫瘍を特異的に標的とすることが必要である。その上、急速に成長しつつあるがん性細胞に対して薬物を特異的に標的にすることも必要である。典型的ながんの薬物レジメンはしばしば、用量制限毒性のために制限され、一部の抗体－薬物コンジュゲートは、標的部位以外での毒性を制限するために薬物を特定の腫瘍に標的とするために使用されるが、そのような特異的治療は多くの固形腫瘍では利用できない。本明細書では、カーゴ、例えば薬物を細胞に特異的に送達することができる核酸構築物および送達システムを提供する。ある特定の例では、ｚｉｐコードそのものを含む核酸構築物は、治療応答を保有するかまたは誘導する。

【0165】

本開示は、がん性細胞または疾患を有する細胞にホーミングする、細胞を標的とする、細胞に方向付ける、細胞に蓄積する、細胞の細胞質および核に侵入することができる無細胞腫瘍ＤＮＡ特異的試料に由来する１つまたは複数の細胞／組織特異的ＺＣＳを含み得る、あるクラスの細胞標的化核酸配列を記載する。本開示のそのような細胞標的化核酸は、１つまたは複数のヒト細胞型を特異的に標的とすることができる。このように、それらはがん性のまたは疾患を有する細胞を処置するために直接、または活性薬、核酸構築物、もしくは分子の担体として使用することができる。１つまたは複数の特定のがん性のまたは疾患を有する領域、組織、構造、または細胞に特異的にホーミングする、それらを標的とする、それらに方向付けられる、それらに蓄積する、それらにおける細胞質および核に侵入することができる核酸配列は、より少ないオフターゲット効果およびおそらくより少ない負の効果を有し得る。

【0166】

本開示はまた、治療目的およびイメージング目的のいずれかまたは両方のために使用することができる活性剤または検出可能剤を、特定の領域、組織、構造、または細胞に送達することができる新規種類の担体も提供する。本明細書で使用される場合、活性剤または検出可能剤は、１つまたは複数の本開示のＺｉｐコード配列を含む核酸配列に連結することができる。

【0167】

本開示はまた、対象の状態を処置する方法であって、対象の領域、組織、または細胞に、例えば特定の標的細胞、例えば多発性骨髄腫、膵臓がん、または肺がん細胞の細胞質または核内にホーミングする、標的とする、移行する、方向付けられるＺＣＳを対象に投与することを含む方法も提供する。一部の例では、投与された核酸構築物は、対象の標的細胞の核を通過して、対象の細胞にインテグレートされるようになり得る。

【0168】

一部の実施形態では、方法は、それを必要とする対象に、必要に応じて治療用カーゴを含み得るＺＣＳ核酸構築物の有効量を投与することを含む。

【0169】

用語「有効量」は、本明細書で使用される場合、処置される疾患または状態の症状の１つまたは複数をある程度緩和する、投与される作用剤または化合物の十分量を指す。結果は、疾患の徴候、症状、もしくは原因の低減および／もしくは軽減、または生物システムの他の任意の所望の変更であり得る。そのような作用剤または化合物を含有する組成物は、予防的処置、増強処置、および／または治療的処置のために投与することができる。任意の個々の症例における適正な「有効」量は、用量漸増研究などの技術を使用して決定され得る。一部の例では、核酸Ｚｉｐコード配列の治療有効量（例えば、疾患または障害を防止および／または処置するための）は、約１ピコグラム（ｐｇ）～約１ｇであり得る。ＺＣＳの治療有効量は、約１ナノグラム（ｎｇ）～約１００ｍｇであり得る。ＺＣＳの治療有効量は、約１００ｎｇ～約１０ｍｇであり得る。ＺＣＳの治療有効量は、約１マイクログラム（μｇ）～約１０ｍｇであり得る。ＺＣＳの治療有効量は、約１００μｇ～約１ｍｇであり得る。

【0170】

ＺＣＳまたは１つもしくは複数のＺＣＳを含む構築物は、１つもしくは複数の他のＺＣＳまたは１つもしくは複数のＺＣＳを含む構築物と組み合わせて投与され得る。ＺＣＳまたは１つもしくは複数のＺＣＳを含む構築物は、１つまたは複数の他の治療用分子（例えば、低分子薬、免疫療法剤（例えば、免疫チェックポイント遮断剤）、治療抗体等）と組み合わせて投与され得る。

【0171】

本開示の方法、組成物、およびキットは、状態の症状を防止、処置、停止、逆転、または改善する方法を含み得る。処置は、本開示のシステムを含む核酸構築物またはＺＣＳによって、対象（例えば、疾患または状態に罹患している個体、家畜動物、野生動物、または実験動物）を処置することを含み得る。疾患は、がんまたは腫瘍であり得る。疾患を処置する場合、本開示の核酸分子は、腫瘍またはがん性細胞と接触し得る。対象はヒトであり得る。対象は、ヒト；非ヒト霊長類、例えばチンパンジーおよび他の類人猿およびサル種；農場動物、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ；ペット動物、例えばウサギ、イヌ、およびネコ；齧歯類を含む実験動物、例えばラット、マウスおよびモルモット等であり得る。対象は任意の年齢の対象であり得る。対象は、例えば高齢の成体、成体、青年、前青年、子供、小児、乳児、および子宮内胎児であり得る。

【0172】

処置は、疾患の臨床発症前に対象に提供され得る。処置は、疾患の臨床発症後に対象に提供され得る。処置は、疾患の臨床発症の１日後、１週間後、６ヶ月後、１２ヶ月後、または２年後またはそれより後に対象に提供され得る。処置は、疾患の臨床発症後、１日より長く、１週間より長く、６ヶ月より長く、１２ヶ月より長く、または２年より長くまたはそれより長く対象に提供され得る。処置は、疾患の臨床発症後、１日未満の間、１週間未満の間、１ヶ月未満の間、６ヶ月未満の間、１２ヶ月未満の間、または２年未満の間、対象に提供され得る。処置はまた、臨床試験においてヒトを処置することも含み得る。本明細書に記載のＺＣＳを使用する処置は、ＺＣＳまたは１つもしくは複数のＺＣＳを含む構築物を、１日に１回または複数回投与することを含み得る。一部の例では、そのような毎日投与は、ＺＣＳまたは１つもしくは複数のＺＣＳを含む構築物の同じまたは異なる量を含み、および／あるいは本明細書に記載される１つまたは複数の他の治療用分子を含む。

【0173】

処置は、医薬組成物、例えば本開示を通して記載される医薬組成物の１つまたは複数を対象に投与することを含み得る。処置は、本開示の核酸分子または核酸送達システムを対象に、静脈内で、皮下で、筋肉内で、吸入により、皮内で、局所適用で、経口で、舌下で、髄腔内で、経皮で、鼻腔内で、腹腔内経路を介して、または例えば大脳室内経路を介して、脳に直接送達することを含み得る。処置は、核酸分子－活性剤複合体または核酸送達システム－活性剤複合体を対象に、静脈内で、皮下で、筋肉内で、吸入により、皮内で、局所適用で、経口で、髄腔内で、経皮で、鼻腔内で、非経口で、経口で、腹腔内経路を介して、鼻で、舌下で、または脳に直接投与することを含み得る。

【0174】

一部の実施形態では、本開示は、がんまたは腫瘍を処置する方法であって、それを必要とする対象に、本開示の核酸送達システムの有効量を投与することを含む方法を提供する。本開示の核酸分子（または核酸分子－カーゴコンジュゲート）によって処置することができるがんまたは状態の一例は、固形腫瘍または血液腫瘍である。本開示のシステムを含む核酸構築物またはＺＣＳによって処置することができるがんまたは状態のさらなる例としては、トリプルネガティブ乳がん、乳がん、乳がんの転移、ＥＲ／ＰＲ陽性乳がん、本明細書に記載される任意のがんの転移、大腸がん、大腸がんの転移、肉腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん、例えばカポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、肛門がん、虫垂がん、小児星細胞腫、星細胞腫、小児非定型奇形腫様／ラブドイド（ｒｈａｂｄｉｏｄ）腫瘍、ＣＮＳ非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、皮膚がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、骨肉腫、軟骨腫、軟骨肉腫、原発性および転移性骨がん、悪性線維性組織球腫、小児脳幹神経膠腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、脳および脊髄の腫瘍、中枢神経系胎児性腫瘍、小児中枢神経系胎児性腫瘍、中枢神経系胚細胞腫瘍、小児中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、小児頭蓋咽頭腫、上衣腫、小児上衣腫、乳がん、気管支腫瘍、小児気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、原発不明癌、心臓腫瘍、小児心臓腫瘍、原発性リンパ腫、子宮頸がん、胆管癌、脊索腫、小児脊索腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性腫瘍、大腸がん、結腸直腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非浸潤性乳管癌、子宮内膜がん、食道がん、鼻腔神経芽細胞腫、小児鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼のがん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、卵管がん、骨の線維性組織球腫、胆嚢がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、卵巣がん、精巣がん、妊娠性絨毛疾患、神経膠腫、ヘアリーセル白血病、頭頸部がん、肝細胞がん、組織球症、ランゲルハンス細胞組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、黒色腫、黒色腫の転移、島細胞腫瘍、膵臓内分泌腫瘍、腎臓がん、腎細胞腫瘍、ウィルムス腫瘍、小児腎腫瘍、口唇および口腔がん（ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ ｃａｎｃｅｒ）、肝臓がん、肺がん、非ホジキンリンパ腫、マクログロブリン血症（ｍａｃｒｏｇｌｏｄｕｌｉｎｅｍｉａ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、男性乳がん、メルケル細胞癌、原発不明転移性頭頸部扁平上皮がん、ＮＵＴ遺伝子を伴う正中線管癌、口腔がん（ｍｏｕｔｈ ｃａｎｃｅｒ）、多発性内分泌腫瘍症候群、小児多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、多発性骨髄腫、骨髄増殖性腫瘍、慢性骨髄増殖性腫瘍、鼻腔および副鼻腔のがん、鼻咽頭がん、神経芽腫（ｎｅｕｏｒｂｌａｓｔｏｍａ）、非小細胞肺がん、中咽頭がん、低悪性度腫瘍、膵臓がん、膵臓神経内分泌腫瘍、乳頭腫症、小児乳頭腫症、パラガングリオーマ、副鼻腔および鼻腔のがん、副甲状腺がん、陰茎がん、褐色細胞腫、咽頭がん（ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、下垂体腫瘍、胸膜肺芽種、小児胸膜肺芽種、原発性腹膜がん、前立腺がん、直腸がん、妊娠関連がん、横紋筋肉腫、小児横紋筋肉腫、唾液腺がん、セザリー症候群、小細胞肺がん、小腸がん（ｃａｎｅｒ）、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、精巣がん、咽頭がん（ｔｈｒｏａｔ ｃａｎｃｅｒ）、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺がん、腎臓、腎盂、および尿道の移行上皮がん、子宮がん、尿道がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、膣がん、血管腫瘍、ならびに外陰がんが挙げられる。

【0175】

例示的な癌細胞試料としては、これらに限定されないが、肛門がん、虫垂がん、胆管がん（すなわち、胆管癌）、膀胱がん、脳腫瘍、肺がん、乳がん、子宮頸がん、大腸がん、原因不明がん（ＣＵＰ）、食道がん、眼のがん、卵管がん、消化管がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、髄芽腫、黒色腫、口腔がん（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺疾患、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、直腸がん、皮膚がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、精巣がん、咽頭がん（ｔｈｒｏａｔ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺がん、子宮がん、膣がん、または外陰がんから得られる細胞試料が挙げられ得る。

【0176】

がん性細胞試料は、血液悪性腫瘍から得た細胞を含み得る。血液悪性腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、またはホジキンリンパ腫を含み得る。血液悪性腫瘍は、Ｔ細胞に基づく血液悪性腫瘍であり得る。血液悪性腫瘍は、Ｂ細胞に基づく血液悪性腫瘍であり得る。例示的なＢ細胞に基づく血液悪性腫瘍としては、これらに限定されないが、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、高リスクＣＬＬ、非ＣＬＬ／ＳＬＬリンパ腫、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、非バーキット高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、またはリンパ腫様肉芽腫症が挙げられ得る。例示的なＴ細胞に基づく血液悪性腫瘍としては、これらに限定されないが、非特定型末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）、未分化大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、芽球性ＮＫ細胞リンパ腫、腸管症型Ｔ細胞リンパ腫、血液脾臓ガンマ－デルタＴ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、鼻型ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、処置関連Ｔ細胞リンパ腫、またはヘアリーセル白血病が挙げられ得る。
Ｚｉｐコード配列媒介性遺伝子送達は標的細胞の表現型を変更することができる

【0177】

本開示の方法および組成物は、標的細胞および／または標的細胞集団の表現型を変更するために有用であり得る。一部の例では、対象における標的細胞の表現型の変更は、治療介入に対する対象の治療応答および／または臨床応答を改善し得る。

【0178】

本明細書に記載されるヒト細胞標的化配列（Ｚｉｐコード）は、目的の１つまたは複数の遺伝子に連結させることができ、このようにウイルスベクターシステムを必要とすることなく、それらの遺伝子の細胞および／または組織特異的送達のために使用され得る。一部の例では、目的の遺伝子は、標的細胞において発現されると、細胞がこれまで非応答性であったかまたはそれに対して細胞が耐性機構を発達させた細胞外刺激に対して細胞を応答性にすることができる表面受容体などの特定のタンパク質またはポリペプチドをコードし得る。このように、本開示の方法および組成物を使用して、ある特定の細胞外刺激または外因性刺激に対する細胞における耐性機構を逆転させるか、または細胞の応答性を誘導することができる。例えば、目的の遺伝子は、表面受容体、例えばエストロゲン受容体（ＥＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）および／もしくは３（ＨＥＲ３）、または分化抗原群（ＣＤ）表面タンパク質（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ１３８、ＣＤ３４、ＰＤ１、ＣＤ３８、またはＳＬＡＭ７）を含む他の表面マーカー（またはバイオマーカー）をコードし得る。そのような人為的に導入された遺伝子の発現は、細胞の表現型を、例えばＨＥＲ陰性からＨＥＲ２陽性へと変化させ得る。一部の例では、例えばＨＥＲ２陽性原発腫瘍は、トラスツズマブなどの抗ＨＥＲ２抗体の投与を含む抗ＨＥＲ２治療に対して応答を示さないかまたは非常に限定的な応答のみを示すＨＥＲ２陰性の遠位病変を発生させ得る。このように、本開示の方法および組成物を使用して、ＨＥＲ２陰性腫瘍をＨＥＲ２陽性腫瘍へと変換することができ、このように、抗ＨＥＲ２処置に対するその感受性を増加させることができる。別の例として、腫瘍細胞は、標的化治療または化学療法、例えばゲムシタビンに応答してある特定の経路（例えば、ヌクレオチド合成またはＤＮＡ修復）をダウンレギュレートし、このようにこれらの処置アプローチを回避することにより低い応答率および全生存をもたらし得る。したがって、本開示の方法および組成物を使用して、それらの耐性機構を逆転させ、治療薬分子と組み合わせて、処置に対する腫瘍の感受性を有意に増加させ得るある特定のタンパク質を過剰発現させることができる。

【0179】

本開示のさらなる態様では、本明細書に記載される組成物を使用して、標的細胞における免疫調節タンパク質の発現を増加させることができる。例えば、本開示の核酸構築物およびシステムを使用して、免疫チェックポイント、例えばプログラム細胞死受容体－１（ＰＤ－１）および／またはプログラム細胞死受容体リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）の生成を増加させることができる。その上、本開示の核酸配列は、ＣＴＬＡ－４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ－３、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＴＣＲ、Ｂ２Ｍ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、生体タンパク質生成に関与する遺伝子、肝臓におけるアルブミン、ヘモグロビンサブユニットベータ遺伝子、ヘモグロビンサブユニットアルファ１遺伝子、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、ＣＣＲ５、グルココルチコイド（ＧＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ５２、ＢＣＬ１１Ａ、アルファ－Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、イズロネート－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、第９因子、ＰＤ－１／ＴＣＲ－Ａ／ＴＣＲ－Ｂ、ＴＣＲ／ＣＳ－１、ＴＣＲ、ＣＥＰ２９０、ＴＣＲ／Ｂ２Ｍ、ＣＢＬＢ、ＴＧＦｂＲ、ジストロフィン、ＣＦＴＲ、ｓｅｒｐｉｎａ１、ＩＬ２Ｒｇ、またはＨＢＶが挙げられるがこれらに限定されないタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。
ネオ抗原のＺｉｐコード配列媒介性のおよび細胞特異的生成

【0180】

本開示のヒト細胞標的化配列を使用して、標的細胞、標的細胞集団、および／または標的組織においてネオ抗原を生成させることができ、次にこれらを、それらのネオ抗原に対して親和性を示す特異的に設計した薬物分子（例えば、治療抗体または抗体－薬物コンジュゲート）によって標的とすることができる。言い換えれば、本開示のＺＣＳを使用して、薬物に対する標的細胞の感受性を増加させるかまたは人為的に誘導し、このように新規かつ有効な処置選択肢を提供することができる。本明細書に記載されるように、ネオ抗原は一般的に、腫瘍特異的な突然変異遺伝子によってコードされる抗原として理解される。

【0181】

本開示の一部の態様では、方法および組成物は、免疫治療アプローチの有効性を増加させるために有用であり得る。例えば、現行の免疫療法の標的化のみでは、有望な転帰を示すのは一部の患者（およそ１５～２５％）に過ぎない。対象自身の免疫系が腫瘍細胞をより有効に認識して攻撃する能力を増強するために本明細書に記載される組成物を使用する一例は、腫瘍細胞を免疫系に異物と認識させることが可能なネオ抗原をがん細胞において生成させることによることであり得る。例えば、本明細書に記載される組成物をまた使用して、対象がそれに対して自然免疫または後天性免疫を有し得る（例えば、過去にその特定の抗原に対してワクチン接種されている）腫瘍細胞において細菌またはウイルスの発現を誘導することができ、このようにメモリーＢ細胞がそれぞれの細菌またはウイルス抗原を発現するがん細胞を認識および破壊することが可能になり得る。

【0182】

本明細書に開示される方法および組成物は、既存の薬物、例えばＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸を標的とする免疫チェックポイント阻害剤、または他の免疫チェックポイント剤、例えば細胞傷害性Ｔリンパ球関連分子４（ＣＴＬＡ－４）またはＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、またはＢ７／Ｈ３と組み合わせて使用され得る。現在利用可能な免疫療法は、高い突然変異負荷（例えば、喫煙によって引き起こされる肺がん）を有する、および免疫系のＴ細胞が異物として検出することができる表面のネオ抗原の存在が増加している腫瘍では、より有効であることが示されている。このように、免疫細胞が認識することができる非天然のポリペプチド断片（すなわち、ネオ抗原）の量を人為的に増加させるために本開示の組成物を使用することは、がんおよび他の疾患の防止および処置に関する免疫療法の有効性を増加させ得る。

【0183】

他の例では、本開示は、対象における標的細胞に対する免疫応答を誘発するために、対象（例えば、齧歯類またはヒト）のそのような標的細胞にウイルス、細菌、真菌、または他の外来抗原を送達するために使用することができる核酸構築物および送達システムを提供する。一部の例では、そのような標的細胞はがん細胞であり得る。そのような外来抗原は、例えば細胞標的化配列、インテグレーション配列、およびそのような外来抗原をコードするカーゴ核酸配列を含む本開示の送達システムを使用することによって、そのような標的配列に送達することができる。カーゴ核酸配列は、標的細胞のゲノムへのそのような配列のインテグレーションの際に標的細胞によって発現させることができる。
Ｚｉｐコード配列媒介性のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の生成

【0184】

一部の態様では、本開示のヒト細胞標的化配列は、Ｚｉｐコード配列を含むことができ、標的細胞において内因性または人工受容体を発現させるために使用され得る。一部の例では、人工受容体は、特定の標的細胞集団（例えば、Ｔリンパ球）において発現され得るキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る。特定の標的細胞または細胞集団に対する高い特異性および自己インテグレート能によって、Ｚｉｐコード配列は、ＣＡＲ遺伝子の効率的かつ再現可能なインテグレーションのための標的化配列として使用することが可能となり得る。多様なウイルスベクターシステム（例えば、アデノウイルスまたはレンチウイルスベクター）を使用してＴ細胞においてＣＡＲ（すなわち、ＣＡＲ Ｔ細胞）を生成するための現在利用可能なアプローチは、一般的にＴ細胞集団内のｅｘ ｖｉｖｏ ＣＡＲ遺伝子インテグレーションの高い不均一性により臨床での有用性が限定的であり、複数のバッチ生成と比較すると、低い再現性をもたらす。このように、本明細書に記載される組成物および方法を使用して、臨床的に適切な細胞集団（例えば、Ｔ細胞）内でＣＡＲ遺伝子トランスフェクションの有効性および均一性を増加させることができる。
Ｚｉｐコード配列は腫瘍成長および疾患の再発を防止する

【0185】

本明細書に記載される核酸Ｚｉｐコード配列（ＺＣＳ）をまた使用して、腫瘍の成長および疾患の再発を防止することができる。一部の例では、本開示のＺＣＳを使用して、がんを有するまたはがんを有することが疑われる対象に投与した場合に、循環する腫瘍核酸分子に結合することができ、および／または循環する腫瘍核酸分子を捕捉することができる。

【0186】

本開示の組成物および方法は、がんの型特異的ＺＣＳの単離および／または合成を可能にする。同じ腫瘍型に由来する循環する腫瘍核酸分子に対するこれらのＺＣＳの特異性により、本開示のＺＣＳを対象における循環する腫瘍核酸分子と接触させると、ハイブリダイゼーション複合体が形成され得る。これによって、循環する腫瘍核酸分子（例えば、ｃｔＤＮＡ）がその目的地である組織または臓器に到達するのを防止することができ、このように、転移形成の頻度、腫瘍細胞間の細胞クロストーク、ならびに腫瘍の成長および発達に関連する他の機構を防止または低減し得る。

【0187】

一部の例では、本明細書に記載される腫瘍特異的コンセンサス配列またはコンセンサスＺＣＳを使用して、対象におけるがんを防止する、および／またはがん性疾患の再発を防止することができる。本明細書に記載の方法の汎用性は、実質的にいかなる腫瘍型にも使用することができるＺＣＳの生成および／または合成を可能にし得る。

【0188】

一部の例では、本開示のＺＣＳは、循環する腫瘍核酸分子の結合または捕捉を改善することを可能にし得る１つまたは複数の分子にコンジュゲートする、結合する、または連結させることができる。そのような分子は、特定の腫瘍型に関連する循環する腫瘍核酸分子に対するＺＣＳの結合親和性を増強する分子を含み得る。これらの分子は、ＺＣＳの生体分布、薬物動態、および／または薬力学を変更する化学部分をさらに含み得る。一部の例では、循環する腫瘍核酸分子の循環からの除去が、例えば排泄、代謝的（例えば酵素的）変換または不活化を介して増強または加速されるように、ＺＣＳを改変することができる。

【0189】

ＺＣＳを使用して、対象における循環する腫瘍核酸分子の生体分布、および前記対象の血液中の循環する腫瘍核酸分子の量を決定することができる（例えば、色素によって標識され得る結合またはハイブリダイズしたＺＣＳの量を測定することによって）。
カーゴ送達のための核酸ＺＣＳの使用

【0190】

本明細書に開示される核酸配列およびシステムは、イメージング、研究、治療、セラノスティクス、薬剤、化学療法薬、キレート療法、標的化薬物送達、および放射線療法において使用される作用剤にコンジュゲートすることができる。

【0191】

一部の実施形態では、細胞型または組織型特異的ＺＣＳを、検出可能剤、例えばフルオロフォア、近赤外線色素、造影剤、ナノ粒子、金属含有ナノ粒子、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ剤、金属、放射性同位体、色素、放射性核種キレート剤、またはイメージングにおいて使用することができる別の適切な材料にコンジュゲートまたは融合する。一部の例では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の検出可能剤を、細胞型または組織型特異的ＺＣＳに連結させることができる。放射性同位体の非制限的な例としては、アルファ放射体、ベータ放射体、陽電子放射体、およびガンマ放射体が挙げられる。一部の例では、金属または放射性同位体は、アクチニウム、アメリシウム、ビスマス、カドミウム、セシウム、コバルト、ユーロピウム、ガドリニウム、イリジウム、鉛、ルテチウム、マンガン、パラジウム、ポロニウム、ラジウム、ルテニウム、サマリウム、ストロンチウム、テクネチウム、タリウム、およびイットリウムからなる群から選択される。一部の例では、金属は、アクチニウム、ビスマス、鉛、ラジウム、ストロンチウム、サマリウム、またはイットリウムである。

【0192】

一部の例では、フルオロフォアは、波長６５０ｎｍ～４０００ｎｍの間の電磁放射線を放射する蛍光剤であり、そのような放射は、そのような作用剤を検出するために使用される。本開示のコンジュゲート分子として使用することができる蛍光色素の非制限的な例としては、ＤｙＬｉｇｈｔ－６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ－７５０、ＶｉｖｏＴａｇ－７５０、ＤｙＬｉｇｈｔ－８００、ＩＲＤｙｅ－８００、ＶｉｖｏＴａｇ－６８０、Ｃｙ５．５、またはインドシアニングリーン（ＩＣＧ）が挙げられる。一部の例では、近赤外線色素はしばしば、シアニン色素（例えば、Ｃｙ７、Ｃｙ５．５、およびＣｙ５）を含む。本開示のコンジュゲート分子として使用するための蛍光色素の追加の非制限的な例として、アクリジン（ａｃｒａｄｉｎｅ）オレンジまたはイエロー、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７９０、７５０、７００、６８０、６６０、および６４７）およびそのいずれかの誘導体、７－アクチノマイシンＤ、８－アニリノナフタレン－１－スルホン酸、ＡＴＴＯ色素およびそのいずれかの誘導体、オーラミン－ローダミン染料およびそのいずれかの誘導体、ベンズアントロン（ｂｅｎｓａｎｔｒｈｏｎｅ）、ビマン、９－１０－ビス（フェニルエチニル）アントラセン、５，１２－ビス（フェニルエチニル）ナフタセン、ビスベンズイミド、ブレインボウ、カルセイン、カルボキシフルオレセイン（ｃａｒｂｏｄｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）およびそのいずれかの誘導体、１－クロロ－９，１０－ビス（フェニルエチニル）アントラセンおよびそのいずれかの誘導体、ＤＡＰＩ、ＤｉＯＣ６、ＤｙＬｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒおよびそのいずれかの誘導体、エピココノン、エチジウムブロミド、ＦｌＡｓＨ－ＥＤＴ２、Ｆｌｕｏ色素およびそのいずれかの誘導体、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅおよびそのいずれかの誘導体、フルオレセインおよびそのいずれかの誘導体、Ｆｕｒａおよびそのいずれかの誘導体、ＧｅｌＧｒｅｅｎおよびそのいずれかの誘導体、ＧｅｌＲｅｄおよびそのいずれかの誘導体、蛍光タンパク質およびそのいずれかの誘導体、ｍアイソフォームタンパク質およびそのいずれかの誘導体、例えばｍＣｈｅｒｒｙ、ヘタメチン（ｈｅｔａｍｅｔｈｉｎｅ）色素およびそのいずれかの誘導体、ヘキスト（ｈｏｅｓｃｈｓｔ）染色、イミノクマリン、インディアンイエロー、インド－１およびそのいずれかの誘導体、ｌａｕｒｄａｎ、ルシファーイエローおよびそのいずれかの誘導体、ルシフェリンおよびそのいずれかの誘導体、ルシフェラーゼおよびそのいずれかの誘導体、メルコシアニン（ｍｅｒｃｏｃｙａｎｉｎｅ）およびそのいずれかの誘導体、ナイル色素およびそのいずれかの誘導体、ペリレン、フロキシン、フィコ色素およびそのいずれかの誘導体、ヨウ化プロピジウム、ピラニン、ローダミンおよびそのいずれかの誘導体、リボグリーン、ＲｏＧＦＰ、ルブレン、スチルベンおよびそのいずれかの誘導体、スルホローダミンおよびそのいずれかの誘導体、ＳＹＢＲおよびそのいずれかの誘導体、シナプト－ｐＨｌｕｏｒｉｎ、テトラフェニルブタジエン、トリス四ナトリウム、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｔｉｔａｎ Ｙｅｌｌｏｗ、ＴＳＱ、ウンベリフェロン、ビオラントロン、黄色蛍光タンパク質、およびＹＯＹＯ－１が挙げられる。他の適した蛍光色素としては、これらに限定されないが、フルオレセインおよびフルオレセイン色素（例えば、フルオレセインイソチオシアニンまたはＦＩＴＣ、ナフトフルオレセイン、４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン、６－カルボキシフルオレセインまたはＦＡＭ等）、カルボシアニン、メロシアニン、スチリル色素、オキソノール色素、フィコエリスリン、エリスロシン、エオジン、ローダミン色素（例えば、カルボキテトラメチル－ローダミンまたはＴＡＭＲＡ、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、リサミンローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミンＧｒｅｅｎ、ローダミンＲｅｄ、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）等）、クマリンおよびクマリン色素（例えば、メトキシクマリン、ジアルキルアミノクマリン、ヒドロキシクマリン、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）等）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｄｙｅ（例えば、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ５００、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ５１４等）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ－Ｘ、ＳＰＥＣＴＲＵＭ ＲＥＤ、ＳＰＥＣＴＲＵＭ ＧＲＥＥＮ、シアニン色素（例えば、ＣＹ－３、Ｃｙ－５、ＣＹ－３．５、ＣＹ－５．５等）、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ色素（例えば、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ３５０、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ４８８、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ５３２、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ５４６、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ５６８、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ５９４、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ６３３、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ６６０、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ６８０等）、ＢＯＤＩＰＹ色素（例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５等）、ＩＲＤｙｅ（例えば、ＩＲＤ４０、ＩＲＤ ７００、ＩＲＤ ８００等）等が挙げられる。追加の適切な検出可能剤は、ＰＣＴ／ＵＳ第１４／５６１７７号に記載されている。放射性同位体の非制限的な例としては、アルファ放射体、ベータ放射体、陽電子放出体、およびガンマ放射体が挙げられる。一部の例では、金属または放射性同位体は、アクチニウム、アメリシウム、ビスマス、カドミウム、セシウム、コバルト、ユーロピウム、ガドリニウム、イリジウム、鉛、ルテチウム、マンガン、パラジウム、ポロニウム、ラジウム、ルテニウム、サマリウム、ストロンチウム、テクネチウム、タリウム、およびイットリウムからなる群から選択される。一部の例では、金属は、アクチニウム、ビスマス、鉛、ラジウム、ストロンチウム、サマリウム、またはイットリウムである。一部の実施形態では、放射性同位体は、アクチニウム－２２５または鉛－２１２である。

【0193】

本開示は、放射線増感剤または光増感剤にコンジュゲートされた細胞型または組織型特異的ヒト細胞標的化核酸配列を提供する。放射線増感剤の例としては、これらに限定されないが、ＡＢＴ－２６３、ＡＢＴ－１９９、ＷＥＨＩ－５３９、パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ゲムシタビン、エタニダゾール、ミソニダゾール、チラパザミン、および核酸ベースの誘導体（例えば、ハロゲン化プリンまたはピリミジン、例えば５－フルオロデオキシウリジン）が挙げられる。光増感剤の例としては、これらに限定されないが、照射されると熱を生成する蛍光分子またはビーズ、ナノ粒子、ポルフィリンおよびポルフィリン誘導体（例えば、クロリン、バクテリオクロリン、イソバクテリオクロリン、フタロシアニン、およびナフタロシアニン）、メタロポルフィリン、メタロフタロシアニン、アンゲリシン、カルコゲンピリリウム（ｃｈａｌｃｏｇｅｎａｐｙｒｒｉｌｌｉｕｍ）色素、クロロフィル、クマリン、フラビンおよび関連化合物、例えばアロキサジンおよびリボフラビン、フラーレン、フェオホルビド、ピロフェオホルビド、シアニン（例えば、メロシアニン５４０）、フェオフィチン、サフィリン、テトラフィリン、プルプリン、ポルフィセン、フェノチアジニウム、メチレンブルー誘導体、ナフタルイミド、ナイルブルー誘導体、キノン、ペリレンキノン（例えば、ヒペリシン、ヒポクレリン、およびセルコスポリン）、ソラレン、キノン、レチノイド、ローダミン、チオフェン、バーディン、キサンテン色素（例えば、エオジン、エリスロシン、ローズベンガル）、ポルフィリンの二量体およびオリゴマー型、ならびにプロドラッグ、例えば５－アミノレブリン酸が挙げられる。都合のよいことには、このアプローチは、治療剤（例えば、薬物）と電磁エネルギー（例えば、放射線または光）の両方を同時に使用して、疾患を有する細胞（例えば、がん細胞）の非常に特異的な標的化を可能にする。

【0194】

一部の態様では、本開示の組成物および方法を使用して、標的細胞においてＤＮＡ損傷および／またはゲノム不安定性を誘導することができる。例えば、放射活性標識化核酸構築物を使用して、疾患または状態に関連する細胞内に放射線誘導ＤＮＡ損傷を引き起こすことができる。一部の例では、核酸構築物の特定の治療量の投与は、例えば腫瘍組織において増殖中の細胞の測定可能な低減を引き起こし得る。
細胞型および組織型特異的Ｚｉｐコード配列を含む医薬組成物

【0195】

本開示は、本明細書に記載される１つまたは複数のＺＣＳを含む医薬組成物を提供する。本開示の医薬組成物は、本明細書に記載される細胞標的化および／またはゲノムインテグレーション核酸配列（例えば、ＺＣＳ）の１つまたは複数を含む任意の核酸構築物と、他の化学および／または薬学的に許容される構成成分、例えば担体、安定化剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、濃化剤、抗酸化剤、溶解剤、緩衝剤、オスモライト、塩、界面活性剤、アミノ酸、カプセル化剤、充填剤、凍結保護剤、および／または賦形剤との組合せであり得る。組成物は、本明細書に記載される任意の核酸構築物またはＺＣＳの生物への投与を容易にすることができる。組成物は、様々な形態、ならびに例えば静脈内、皮下、筋肉内、直腸内、エアロゾル、非経口、眼科、肺、経皮、膣、眼、鼻、経口、舌下、吸入、皮膚、気管内、鼻腔内、および局部投与（例えば、黒色腫において使用する場合）を含む経路によって、医薬組成物として治療有効量を投与することができる。医薬組成物は、局所または全身に、例えば本明細書に記載される核酸分子の臓器への直接注射を介して、必要に応じてデポーによって投与することができる。

【0196】

非経口注射は、ボーラス注射または連続注入のために製剤化することができる。本明細書に記載される医薬組成物は、油性または水性ビヒクル中の滅菌懸濁液、溶液、またはエマルジョンとしての非経口注射にとって適切な形状であり得、処方剤、例えば懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤を含有し得る。非経口投与のための医薬製剤は、本明細書に記載されるヒト細胞標的化核酸配列の水溶性型の水溶液を含む。本明細書に記載されるヒト細胞標的化核酸配列の懸濁液は、油性注射用懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、脂肪油、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド、またはリポソームを含む。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストランを含有し得る。懸濁液はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために、適切な安定化剤、または本明細書に記載されるそのような核酸分子の溶解度を増加させおよび／もしくは凝集を低減させる作用剤も含有し得る。あるいは、本明細書に記載される核酸分子および核酸－カーゴ構築物は、使用前に適切なビヒクル、例えば滅菌発熱物質フリー水によって復元するための凍結乾燥または粉末形態であり得る。一部の例では、核酸構築物またはＺＣＳは、組織に直接注射される。本明細書に記載される核酸構築物またはＺＣＳを対象に投与して、臓器、例えば膵臓または細胞、例えば多発性骨髄腫の細胞にホーミングする、それらを標的とする、それらへと移行する、それらに侵入することができる。

【0197】

本開示の核酸分子および核酸－カーゴ構築物は、外科的手順の間に、臓器または臓器組織または細胞、例えば肺または膵臓に直接適用することができる。本明細書に記載されるヒト細胞標的化核酸配列を含む核酸構築物またはＺＣＳは、局部投与することができ、多様な局部投与可能な組成物、例えば、溶液、懸濁液、ローション、ゲル、ペースト、薬用スティック、バーム、クリーム、および軟膏に製剤化することができる。そのような医薬組成物は、溶解剤、安定化剤、等張性増強剤、緩衝剤、および保存剤を含有し得る。

【0198】

本明細書に提供される処置の方法または使用の実践において、本明細書に記載される核酸構築物またはＺＣＳの治療有効量を、がんに罹患している対象に医薬組成物として投与することができる。一部の実施形態では、対象はヒトなどの哺乳動物である。治療有効量は、疾患の重症度、対象の年齢および相対的健康、使用する化合物の効力、ならびに他の要因に応じて広く異なり得る。

【0199】

医薬組成物は、活性化合物を薬学的に使用することができる調製物に加工することを容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理的に許容される担体を使用して製剤化することができる。製剤は、選択した投与経路に応じて改変することができる。本明細書に記載される核酸分子または核酸送達システムを含む医薬組成物は、例えば組換え系においてペプチドを発現させることによって、ペプチドを精製することによって、核酸分子を凍結乾燥することによって、混合、溶解、造粒、糖衣錠の作製、粉末化、乳化、カプセル化、捕捉、または打錠するプロセスによって、製造することができる。医薬組成物は少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤、ならびに本明細書に記載の化合物を、遊離の塩基または薬学的に許容される塩の形態として含み得る。

【0200】

本明細書に記載の化合物を含む本明細書に記載の核酸および核酸システム（例えば、カーゴ部分に結合したＺＣＳ）を調製する方法は、本明細書に記載される核酸構築物またはＺＣＳを１つまたは複数の不活性な薬学的に許容される賦形剤または担体と共に製剤化して、固体、半固体、または液体組成物を形成することを含む。固体組成物は、例えば散剤、錠剤、分散顆粒剤、カプセル剤、カシェ剤、および坐剤を含む。これらの組成物はまた、微量の非毒性の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、および他の薬学的に許容される添加剤も含有し得る。

【0201】

薬学的に許容される賦形剤の非制限的な例は、例えばその各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ Ｅｄ （Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．： Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ， Ｊｏｈｎ Ｅ．， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ， Ｈ．Ａ． ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎ， Ｌ．， Ｅｄｓ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ
Ｆｏｒｍｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８０；；およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｅｄ． （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ １９９９）に見出され得る。
核酸配列のｉｎ ｖｉｖｏ取り込み

【0202】

本開示の核酸分子および核酸コンジュゲート（例えば、カーゴ部分に結合したＺＣＳ）の特定の細胞、細胞集団、組織、または臓器への取り込みは、ｅｘ ｖｉｖｏ（例えば、組織染色、蛍光、ＰＣＲ等を介して）またはｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、組織試料（例えば、血液試料、生検）、非侵襲性イメージング等）で決定され得る。同様に、カーゴ送達の有効性は、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで決定され得る。ｅｘ ｖｉｖｏ分析は、分析前に臓器の収集および収集した組織の固定（例えば、４％ホルムアルデヒドを使用して）を含む。組織試料は、顕微鏡法、分光法、フローサイトメトリー、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む多様な分析方法、および超音波、電磁放射線（例えば、ＵＶ／ＶＩＳ、Ｘ線）、または放射活性の測定を介して分析され得る。例えば、組織取り込みは、細胞、細胞集団、組織、もしくは臓器試料の発光もしくは生物発光を測定することによって、または細胞、細胞集団、組織、もしくは臓器試料の放射活性を測定することによって、および取り込み値、例えば１グラムあたり（またはモルあたりまたは体積あたり）のパーセント注射用量を計算することによって決定され得る。
実施形態

【0203】

実施形態１．一部の実施形態では、本開示は、がん性細胞によって放出された循環する腫瘍ＤＮＡに由来する単離された核酸配列の治療有効量を含む医薬組成物であって、前記単離された核酸配列が、前記がん性細胞と同じ細胞型の細胞である細胞を標的化し、前記医薬組成物が、対象に投与するために製剤化されている、医薬組成物を提供する。

【0204】

実施形態２．前記細胞がヒト細胞である、実施形態１に記載の医薬組成物。

【0205】

実施形態３．前記単離された核酸配列が肺細胞を標的とする、実施形態１に記載の医薬組成物。

【0206】

実施形態４．前記単離された核酸配列が膵細胞を標的とする、実施形態１に記載の医薬組成物。

【0207】

実施形態５．前記単離された核酸配列が白血球を標的にする、実施形態１に記載の医薬組成物。

【0208】

実施形態６．前記単離された核酸配列が、前記細胞に投与されると前記細胞の核膜を通過する、実施形態１に記載の医薬組成物。

【0209】

実施形態７．前記単離された核酸配列が、配列番号２０３～配列番号２７７、または配列番号２８２のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有する、実施形態６に記載の医薬組成物。

【0210】

実施形態８．前記単離された核酸配列が核膜を通過後、前記対象のゲノムにそれ自身をインテグレートする、実施形態７に記載の医薬組成物。

【0211】

実施形態９．前記単離された核酸配列が、長さが少なくとも４００塩基対である、実施形態１に記載の医薬組成物。

【0212】

実施形態１０．前記単離された核酸配列が、長さが４００塩基対～２０，０００塩基対の間である、実施形態１に記載の医薬組成物。

【0213】

実施形態１１．前記がん性細胞によって放出された前記循環する腫瘍ＤＮＡがトランスポゾンを含む、実施形態１に記載の医薬組成物。

【0214】

実施形態１２．前記トランスポゾンがクラスＩＩトランスポゾンである、実施形態１１に記載の医薬組成物。

【0215】

実施形態１３．前記単離された核酸配列が、前記クラスＩＩトランスポゾンに由来する、実施形態１２に記載の医薬組成物。

【0216】

実施形態１４．前記単離された核酸配列が、前記細胞に対して異種である少なくとも１つの追加の核酸配列を含む核酸構築物の一部である、実施形態１に記載の医薬組成物。

【0217】

実施形態１５．前記少なくとも１つの追加の核酸配列が、組織選択的プロモーターを含む、実施形態１４に記載の医薬組成物。

【0218】

実施形態１６．前記少なくとも１つの追加の核酸配列が、ペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含む、実施形態１４に記載の医薬組成物。

【0219】

実施形態１７．前記少なくとも１つの追加の核酸配列が、標的ゲノムへの組み込みのためのインテグレーションシグナル配列を含む、実施形態１４に記載の医薬組成物。

【0220】

実施形態１８．前記少なくとも１つの追加の核酸配列が、前記細胞を標的とするためのガイド配列を含む、実施形態１４に記載の医薬組成物。

【0221】

実施形態１９．前記少なくとも１つの追加の核酸配列が、ペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含む、実施形態１４に記載の医薬組成物。

【0222】

実施形態２０．前記ペプチドまたは前記タンパク質が、腫瘍抑制ペプチドまたは腫瘍抑制タンパクをコードする、実施形態１９に記載の医薬組成物。

【0223】

実施形態２１．前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、多発性骨髄腫腫瘍抑制遺伝子である、実施形態２０に記載の医薬組成物。

【0224】

実施形態２２．前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、膵臓がん腫瘍抑制遺伝子である、実施形態２０に記載の医薬組成物。

【0225】

実施形態２３．前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、肺がん腫瘍抑制遺伝子である、実施形態２０に記載の医薬組成物。

【0226】

実施形態２４．前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、網膜芽細胞腫感受性遺伝子（ＲＢ）、ウィルムス腫瘍（ＷＴ１）、神経線維腫症１型（ＮＦ１）、家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）、フォンヒッペル－リンドウ症候群（ＶＨＬ）、野生型ｐ５３、またはスーパーリプレッサーｐ５３のいずれか１つである、実施形態２０に記載の医薬組成物。

【0227】

実施形態２５．前記ペプチドまたは前記タンパク質が抗原性タンパク質をコードする、実施形態１９に記載の医薬組成物。

【0228】

実施形態２６．前記抗原性タンパク質が、前記対象に投与されると前記細胞において特異的に翻訳される、実施形態２５に記載の医薬組成物。

【0229】

実施形態２７．カーゴをさらに含む、実施形態１に記載の医薬組成物。

【0230】

実施形態２８．前記カーゴが、フルオロフォアまたは放射性同位体である、実施形態２７に記載の医薬組成物。

【0231】

実施形態２９．前記カーゴが治療薬である、実施形態２７に記載の医薬組成物。

【0232】

実施形態３０．前記製剤が、ナノ粒子またはカチオン性ポリマーを含む、実施形態２７に記載の医薬組成物。

【0233】

実施形態３１．一部の実施形態では、本開示は、ａ）３’核酸配列を含む第１の領域であって、前記３’細胞核酸配列ががん細胞から単離されたトランスポゾンに由来する第１の領域、ｂ）遺伝子コード配列を含む第２の領域、およびｃ）５’核酸配列を含む第３の領域であって、前記５’細胞核酸配列が前記がん細胞から単離された前記トランスポゾンに由来する第３の領域を含む遺伝子送達システムを提供する。

【0234】

実施形態３２．前記トランスポゾンに由来する前記３’細胞核酸配列または前記５’核酸配列が、細胞標的化シグナルを含む、実施形態３１に記載の遺伝子送達システム。

【0235】

実施形態３３．前記トランスポゾンに由来する前記３’細胞核酸配列または前記５’核酸配列が、細胞インテグレーションシグナルを含む、実施形態３１に記載の遺伝子送達システム。

【0236】

実施形態３４．前記第１の領域が、必要に応じたガイド配列をさらに含む、実施形態３１に記載の遺伝子送達システム。

【0237】

実施形態３５．前記第２の領域が、前記目的の遺伝子の発現を駆動する組織特異的プロモーターをさらに含む、実施形態３１に記載の遺伝子送達システム。

【0238】

実施形態３６．一部の実施形態では、本開示は、がん性細胞によって放出された循環する腫瘍ＤＮＡに由来する配列を含む単離された核酸であって、前記単離された核酸配列は、前記がん性細胞と同じ細胞型の細胞である細胞によって取り込まれる、単離された核酸を提供する。

【0239】

実施形態３７．前記がん性細胞と同じ細胞型の細胞ではない第２の細胞型によって取り込まれない、実施形態３６に記載の単離された核酸。

【0240】

実施形態３８．前記細胞の核膜を通過する、実施形態３６に記載の単離された核酸。

【0241】

実施形態３９．肺細胞によって取り込まれる、実施形態３６に記載の単離された核酸。

【0242】

実施形態４０．膵細胞によって取り込まれる、実施形態３６に記載の単離された核酸。

【0243】

実施形態４１．肺細胞によって取り込まれる、実施形態３６に記載の単離された核酸。

【0244】

実施形態４２．配列番号１～配列番号２７７、または配列番号２８２と少なくとも８０％の類似性を有する配列を有する、実施形態３６に記載の単離された核酸。

【0245】

実施形態４３．配列番号１～配列番号２７７、または配列番号２８２と少なくとも８０％の類似性を有する配列を有し、配列番号１～配列番号２７７、または配列番号２８２と比較して少なくとも１つの置換改変を含有する、実施形態４２に記載の単離された核酸。

【0246】

実施形態４４．一部の実施形態では、本開示は、実施形態３６に記載の単離された核酸配列および異種核酸配列を含むベクターを提供する。

【0247】

実施形態４５．一部の実施形態では、本開示は、実施形態３６に記載の２つまたはそれより多くの単離された核酸配列を含む２つまたはそれより多くの単離された核酸配列のライブラリを提供する。

【0248】

実施形態４６．一部の実施形態では、本開示は、がん性細胞によって放出された循環する腫瘍ＤＮＡに由来する配列を含む単離された核酸であって、前記がん性細胞と同じ細胞型の細胞である細胞の核膜を通過し、前記細胞のゲノムにそれ自身をインテグレートする、単離された核酸を提供する。

【0249】

実施形態４７．前記がん性細胞と同じ細胞型の細胞ではない第２の細胞型によって取り込まれない、実施形態４６に記載の単離された核酸。

【0250】

実施形態４８．肺細胞のゲノムにそれ自身をインテグレートする、実施形態４６に記載の単離された核酸。

【0251】

実施形態４９．膵細胞のゲノムにそれ自身をインテグレートする、実施形態４６に記載の単離された核酸。

【0252】

実施形態５０．肺細胞のゲノムにそれ自身をインテグレートする、実施形態４６に記載の単離された核酸。

【0253】

実施形態５１．配列番号２０３～配列番号２７７、または配列番号２８２と少なくとも８０％の類似性を有する配列を有する、実施形態４６に記載の単離された核酸。

【0254】

実施形態５２．配列番号２０３～配列番号２７７、または配列番号２８２と少なくとも８０％の類似性を有し、配列番号２０３～配列番号２７７、または配列番号２８２と比較して少なくとも１つの置換改変を含有する、実施形態５１に記載の単離された核酸。

【0255】

実施形態５３．一部の実施形態では、本開示は、実施形態４６に記載の単離された核酸配列および異種核酸配列を含むベクターを提供する。

【0256】

実施形態５４．一部の実施形態では、本開示は、実施形態４６に記載の２つまたはそれより多くのヒト核酸トランスポゾン配列を含む２つまたはそれより多くの単離された核酸配列のライブラリを提供する。

【0257】

実施形態５５．一部の実施形態では、本開示は、ａ）対象の生物試料を得ること、ｂ）プローブを前記生物試料と接触させて、プローブと核酸配列との間のハイブリダイゼーションを検出することによって、配列番号１～配列番号２７７、または配列番号２８２と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列が前記生物試料中に存在するか否かを検出すること、およびｃ）前記核酸が前記ハイブリダイゼーションによって検出されるか否かに基づいて、前記対象の前記生物試料の健康状態を特徴付けることを含む方法を提供する。

【0258】

実施形態５６．前記核酸がデオキシリボ核酸である、実施形態５５に記載の方法。

【0259】

実施形態５７．前記核酸が無細胞デオキシリボ核酸である、実施形態５５に記載の方法。

【0260】

実施形態５８．前記核酸配列が、長さが少なくとも４００塩基対である、実施形態５５に記載の方法。

【0261】

実施形態５９．前記核酸配列が、長さが４００塩基対～２０，０００塩基対の間である、実施形態５８に記載の方法。

【0262】

実施形態６０．前記健康状態ががんである、実施形態５５に記載の方法。

【0263】

実施形態６１．前記がんが膵臓がんである、実施形態６０に記載の方法。

【0264】

実施形態６２．前記がんが骨髄腫である、実施形態６０に記載の方法。

【0265】

実施形態６３．前記生物試料が尿、唾液、または喀痰である、実施形態５５に記載の方法。

【0266】

実施形態６４．前記生物試料が組織学用組織である、実施形態５５に記載の方法。

【0267】

実施形態６５．前記プローブが前記核酸配列の領域と相補的である、実施形態５５に記載の方法。

【0268】

実施形態６６．一部の実施形態では、本開示は、ａ）対象の生物試料を得ること、ｂ）逆転写、ポリヌクレオチド増幅、またはシーケンシングから選択される１つまたは複数のプロセスによって、前記生物試料中の配列番号１～配列番号２７７、または配列番号２８２と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列のレベルを定量すること、ｃ）コンピューターシステムにおいて、前記核酸配列の前記定量レベルを参照と比較すること、およびｄ）前記核酸が前記１つまたは複数のプロセスによって検出されるか否かに基づいて前記対象の前記生物試料の健康状態を特徴付けることを含む方法を提供する。

【0269】

実施形態６７．前記核酸がデオキシリボ核酸である、実施形態６６に記載の方法。

【0270】

実施形態６８．前記核酸が無細胞デオキシリボ核酸である、実施形態６６に記載の方法。

【0271】

実施形態６９．前記核酸配列が、長さが少なくとも４００塩基対である、実施形態６６に記載の方法。

【0272】

実施形態７０．前記核酸配列が、長さが４００塩基対～２０，０００塩基対の間である、実施形態６６に記載の方法。

【0273】

実施形態７１．前記健康状態ががんである、実施形態６６に記載の方法。

【0274】

実施形態７２．前記がんが膵臓がんである、実施形態７１に記載の方法。

【0275】

実施形態７３．前記がんが骨髄腫である、実施形態７１に記載の方法。

【0276】

実施形態７４．前記がんが肺がんである、実施形態７１に記載の方法。

【0277】

実施形態７５．前記生物試料が尿、唾液、または喀痰である、実施形態６６に記載の方法。

【0278】

実施形態７６．前記生物試料が、組織学用組織である、実施形態６６に記載の方法。

【0279】

実施形態７７．一部の実施形態では、本開示は、がんを処置する方法であって、ヒトトランスポゾン配列に由来する核酸配列およびカーゴを含む医薬組成物の有効量を、前記がんに罹患している対象に投与することを含み、組成物が対象に投与するために製剤化されている、方法を提供する。

【0280】

実施形態７８．がんが肺がんである、実施形態７７に記載の方法。

【0281】

実施形態７９．がんが多発性骨髄腫である、実施形態７７に記載の方法。

【0282】

実施形態８０．がんが膵臓がんである、実施形態７７に記載の方法。

【0283】

実施形態８１．前記単離された核酸配列が、前記細胞に投与されると前記細胞の核膜を通過する、実施形態７７に記載の方法。

【0284】

実施形態８２．前記ヒトトランスポゾンに由来する前記核酸配列が、配列番号１～配列番号２７７、または配列番号２８２のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有する、実施形態７７に記載の方法。

【0285】

実施形態８３．前記ヒトトランスポゾンに由来する前記核酸配列が、核膜を通過後、前記対象のゲノムにそれ自身をインテグレートする、実施形態７７に記載の方法。

【0286】

実施形態８４．前記ヒトトランスポゾンに由来する前記核酸配列が、長さが少なくとも４００塩基対である、実施形態７７に記載の方法。

【0287】

実施形態８５．前記ヒトトランスポゾンに由来する前記核酸配列が、長さが４００塩基対～２０，０００塩基対の間である、実施形態７７に記載の方法。

【0288】

実施形態８６．前記ヒトトランスポゾンがクラスＩＩトランスポゾンである、実施形態７７に記載の方法。

【0289】

実施形態８７．前記ヒトトランスポゾンに由来する前記核酸配列が、前記細胞に対して異種である少なくとも１つの追加の核酸配列を含む核酸構築物の一部である、実施形態７７に記載の方法。

【0290】

実施形態８８．前記少なくとも１つの追加の核酸配列が、組織選択的プロモーターを含む、実施形態８７に記載の方法。

【0291】

実施形態８９．前記少なくとも１つの追加の核酸配列が、ペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含む、実施形態８７に記載の方法。

【0292】

実施形態９０．前記少なくとも１つの追加の核酸配列が、標的ゲノムへの組み込みのためのインテグレーションシグナル配列を含む、実施形態８７に記載の方法。

【0293】

実施形態９１．前記少なくとも１つの追加の核酸配列が、前記細胞を標的とするためのガイド配列を含む、実施形態８７に記載の方法。

【0294】

実施形態９２．前記少なくとも１つの追加の核酸配列が、ペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含む、実施形態８７に記載の方法。

【0295】

実施形態９３．前記ペプチドまたは前記タンパク質が、腫瘍抑制ペプチドまたは腫瘍抑制タンパクをコードする、実施形態９２に記載の方法。

【0296】

実施形態９４．前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、多発性骨髄腫腫瘍抑制遺伝子である、実施形態９３に記載の方法。

【0297】

実施形態９５．前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、膵臓がん腫瘍抑制遺伝子である、実施形態９３に記載の方法。

【0298】

実施形態９６．前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、肺がん腫瘍抑制遺伝子である、実施形態９３に記載の方法。

【0299】

実施形態９７．前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、網膜芽細胞腫感受性遺伝子（ＲＢ）、ウィルムス腫瘍（ＷＴ１）、神経線維腫症１型（ＮＦ１）、家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）、フォンヒッペル－リンドウ症候群（ＶＨＬ）、野生型ｐ５３、またはスーパーリプレッサーｐ５３のいずれか１つである、実施形態９３に記載の方法。

【0300】

実施形態９８．前記ペプチドまたは前記タンパク質が抗原性タンパク質をコードする、実施形態８９に記載の方法。

【0301】

実施形態９９．前記抗原性タンパク質が、前記対象に投与されると前記細胞において特異的に翻訳される、実施形態９８に記載の方法。

【0302】

実施形態１００．前記組成物がカーゴをさらに含む、実施形態７７に記載の方法。

【0303】

実施形態１０１．前記カーゴが、フルオロフォアまたは放射性同位体である、実施形態１００に記載の方法。

【0304】

実施形態１０２．前記カーゴが治療薬である、実施形態１００に記載の方法。

【0305】

実施形態１０３．前記製剤が、ナノ粒子またはカチオン性ポリマーを含む、実施形態７７に記載の方法。

【0306】

実施形態１０４．一部の実施形態では、本開示は、核酸構築物の治療有効量を含む医薬組成物であって、医薬組成物が、ａ）ｉｎ ｖｉｖｏでの予め選択された組織への前記核酸構築物の移行を方向付ける第１のデオキシリボ核酸配列、およびｂ）ｉｎ ｖｉｖｏでの前記予め選択された組織からの細胞のゲノムへの前記核酸構築物の領域のインテグレーションを方向付ける第２のデオキシリボ核酸配列を含み、医薬組成物が、対象に投与するために製剤化されている、医薬組成物を提供する。

【0307】

実施形態１０５．前記第１のデオキシリボ核酸配列が、前記予め選択された組織からの前記細胞と同じ細胞型に由来する、実施形態１０４に記載の医薬組成物。

【0308】

実施形態１０６．前記対象がヒトである、実施形態１０４に記載の医薬組成物。

【0309】

実施形態１０７．前記第１のデオキシリボ核酸配列が白血球に移行する、実施形態１０４に記載の医薬組成物。

【0310】

実施形態１０８．前記第１のデオキシリボ核酸配列が膵細胞に移行する、実施形態１０４に記載の医薬組成物。

【0311】

実施形態１０９．前記第１のデオキシリボ核酸配列が肺細胞に移行する、実施形態１０４に記載の医薬組成物。

【0312】

実施形態１１０．前記核酸構築物が、前記対象に投与した場合に、前記予め選択された組織からの前記細胞の核膜を通過する、実施形態１０４に記載の医薬組成物。

【0313】

実施形態１１１．前記第１のデオキシリボ核酸配列が、配列番号２０３～配列番号２７７および配列番号２８２のいずれか１つの少なくとも１２塩基と少なくとも９０％の同一性を有する、実施形態１０４に記載の医薬組成物。

【0314】

実施形態１１２．前記第１のデオキシリボ核酸配列が、長さが少なくとも４００塩基対である、実施形態１０４に記載の医薬組成物。

【0315】

実施形態１１３．前記第１のデオキシリボ核酸配列が、長さが４００塩基対～２０，０００塩基対の間である、実施形態１０４に記載の医薬組成物。

【0316】

実施形態１１４．前記第２のデオキシリボ核酸配列が、トランスポゾン配列と少なくとも９０％の相同性を有する、実施形態１０４に記載の医薬組成物。

【0317】

実施形態１１５．前記トランスポゾンがクラスＩＩトランスポゾンである、実施形態１１４に記載の医薬組成物。

【0318】

実施形態１１６．前記クラスＩＩトランスポゾンが、遺伝子の水平伝播を介して前記予め選択された組織からの前記細胞の前記ゲノムにそれ自身をインテグレートする、実施形態１０５に記載の医薬組成物。

【0319】

実施形態１１７．前記核酸構築物が、少なくとも１つの追加のデオキシリボ核酸配列を含む、実施形態１０４に記載の医薬組成物。

【0320】

実施形態１１８．前記少なくとも１つの追加のデオキシリボ核酸配列が、組織選択的プロモーターを含む、実施形態１１７に記載の医薬組成物。

【0321】

実施形態１１９．前記少なくとも１つの追加のデオキシリボ核酸配列が、前記ゲノムへの組み込みのための第２のインテグレーションシグナルを含む、実施形態１１７に記載の医薬組成物。

【0322】

実施形態１２０．前記少なくとも１つの追加のデオキシリボ核酸配列が、ペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含む、実施形態１１７に記載の医薬組成物。

【0323】

実施形態１２１．前記少なくとも１つの追加のデオキシリボ核酸配列が、前記ペプチドまたはタンパク質が前記予め選択された組織からの前記細胞に限って発現されることを確実にする配列を含む、実施形態１２０に記載の医薬組成物。

【0324】

実施形態１２２．前記ペプチドまたは前記タンパク質が、腫瘍抑制ペプチドまたは腫瘍抑制タンパク質をコードする、実施形態１２０に記載の医薬組成物。

【0325】

実施形態１２３．前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、多発性骨髄腫腫瘍抑制遺伝子である、実施形態１２２に記載の医薬組成物。

【0326】

実施形態１２４．前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、膵臓がん腫瘍抑制遺伝子である、実施形態１２２に記載の医薬組成物。

【0327】

実施形態１２５．前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、肺がん腫瘍抑制遺伝子である、実施形態１２２に記載の医薬組成物。

【0328】

実施形態１２６．前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、網膜芽細胞腫感受性遺伝子（ＲＢ）、ウィルムス腫瘍（ＷＴ１）、神経線維腫症１型（ＮＦ１）、家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）、フォンヒッペル－リンドウ症候群（ＶＨＬ）、野生型ｐ５３、またはスーパーリプレッサーｐ５３のいずれか１つである、実施形態１２２に記載の医薬組成物。

【0329】

実施形態１２７．前記ペプチドまたは前記タンパク質が抗原性タンパク質をコードする、実施形態１２０に記載の医薬組成物。

【0330】

実施形態１２８．前記抗原性タンパク質が、前記対象に投与されると前記細胞において特異的に翻訳される、実施形態１２７に記載の医薬組成物。

【0331】

実施形態１２９．カーゴをさらに含む、実施形態１０４に記載の医薬組成物。

【0332】

実施形態１３０．前記カーゴが、フルオロフォアまたは放射性同位体である、実施形態１２７に記載の医薬組成物。

【0333】

実施形態１３１．前記カーゴが治療薬である、実施形態１２７に記載の医薬組成物。

【0334】

実施形態１３２．前記カーゴが前記核酸構築物に共有結合されている、実施形態１２７に記載の医薬組成物。

【0335】

実施形態１３３．前記製剤が、ナノ粒子またはカチオン性ポリマーを含む、実施形態１２７に記載の医薬組成物。

【0336】

実施形態１３４．一部の実施形態では、本開示は、配列番号２０３～配列番号２７７および配列番号２８２のいずれか１つの少なくとも１２塩基と少なくとも９０％の同一性を有する第１の配列、ならびに追加の核酸配列を含むベクターを提供する。

【0337】

実施形態１３５．前記追加の核酸配列が、トランスポゾン配列と少なくとも９０％の相同性を有する、実施形態１３４に記載のベクター。

【0338】

実施形態１３６．前記トランスポゾンがクラスＩＩトランスポゾンである、実施形態１３５に記載のベクター。

【0339】

実施形態１３７．前記クラスＩＩトランスポゾンが、遺伝子の水平伝播を介して前記予め選択された組織からの前記細胞の前記ゲノムにそれ自身をインテグレートする、実施形態１３６に記載のベクター。

【0340】

実施形態１３８．少なくとも２つの追加の核酸配列を含む、実施形態１３４に記載のベクター。

【0341】

実施形態１３９．前記少なくとも２つの追加の核酸配列が、組織選択的プロモーターおよびトランスポゾン配列を含む、実施形態１３８に記載のベクター。

【0342】

実施形態１４０．前記少なくとも２つの追加の核酸配列が、少なくとも２つのトランスポゾン配列を含む、実施形態１３８に記載のベクター。

【0343】

実施形態１４１．前記追加の核酸配列が、ペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含む、実施形態１３４に記載のベクター。

【0344】

実施形態１４２．前記ペプチドまたは前記タンパク質が、腫瘍抑制ペプチドまたは腫瘍抑制タンパク質である、実施形態１４１に記載のベクター。

【0345】

実施形態１４３．前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、多発性骨髄腫腫瘍抑制遺伝子である、実施形態１４２に記載のベクター。

【0346】

実施形態１４４．前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、膵臓がん腫瘍抑制遺伝子である、実施形態１４２に記載のベクター。

【0347】

実施形態１４５．前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、肺がん腫瘍抑制遺伝子である、実施形態１４２に記載のベクター。

【0348】

実施形態１４６．前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、網膜芽細胞腫感受性遺伝子（ＲＢ）、ウィルムス腫瘍（ＷＴ１）、神経線維腫症１型（ＮＦ１）、家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）、フォンヒッペル－リンドウ症候群（ＶＨＬ）、野生型ｐ５３、またはスーパーリプレッサーｐ５３のいずれか１つである、実施形態１４２に記載のベクター。

【0349】

実施形態１４６．カーゴに共有結合により連結されている、実施形態１３４に記載のベクター。

【0350】

実施形態１４７．前記カーゴが、フルオロフォアまたは放射性同位体である、実施形態１４６に記載のベクター。

【0351】

実施形態１４８．前記カーゴが治療薬である、実施形態１４６に記載のベクター。

【0352】

実施形態１４９．一部の実施形態では、本開示は、実施形態１３４に記載の２つまたはそれより多くのベクターのライブラリを提供する。

【0353】

実施形態１５０．一部の実施形態では、本開示は、がんを処置する方法であって、前記がんに罹患している対象の組織へのカーゴの移行を方向付ける核酸配列を含む核酸構築物の有効量を投与することを含み、組成物が対象に投与するために製剤化されている、方法を提供する。

【0354】

実施形態１５１．前記がんが肺がんである、実施形態１５０に記載の方法。

【0355】

実施形態１５２．前記がんが多発性骨髄腫である、実施形態１５０に記載の方法。

【0356】

実施形態１５３．前記がんが膵臓がんである、実施形態１５０に記載の方法。

【0357】

実施形態１５４．前記核酸構築物が、前記対象に投与されると、前記組織細胞の細胞における核膜を通過する、実施形態１５０に記載の方法。

【0358】

実施形態１５５．前記組織への前記カーゴの移行を方向付ける前記核酸配列が、配列番号２０３～配列番号２７７、および配列番号２８２のいずれか１つの少なくとも１２塩基と少なくとも９０％の同一性を有する、実施形態１５０に記載の方法。

【0359】

実施形態１５５．前記核酸構築物が、前記組織の細胞のゲノムへのインテグレーションのためにトランスポゾンを含む、実施形態１５０に記載の方法。

【0360】

実施形態１５６．前記トランスポゾンが、長さが少なくとも４００塩基対である、実施形態１５５に記載の方法。

【0361】

実施形態１５７．前記トランスポゾンが、長さが４００塩基対～２０，０００塩基対の間である、実施形態１５５に記載の方法。

【0362】

実施形態１５８．前記トランスポゾンがクラスＩＩトランスポゾンである、実施形態１５５に記載の方法。

【0363】

実施形態１５９．前記核酸構築物が、前記組織の細胞に対して異種である少なくとも１つの追加の核酸配列を含む、実施形態１５５に記載の方法。

【0364】

実施形態１６０．前記少なくとも１つの追加の核酸配列が組織選択的プロモーターを含む、実施形態１５９に記載の方法。

【0365】

実施形態１６１．前記少なくとも１つの追加の核酸配列が、ペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含む、実施形態１５９に記載の方法。

【0366】

実施形態１６２．前記少なくとも１つの追加の核酸配列が、標的ゲノムへの組み込みのためのインテグレーションシグナルを含む、実施形態１５９に記載の方法。

【0367】

実施形態１６３．前記少なくとも１つの追加の核酸配列が、前記細胞を標的とするためのガイド配列を含む、実施形態１５９に記載の方法。

【0368】

実施形態１６４．前記少なくとも１つの追加の核酸配列が、ペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含む、実施形態１５９に記載の方法。

【0369】

実施形態１６５．前記ペプチドまたは前記タンパク質が、腫瘍抑制ペプチドまたは腫瘍抑制タンパク質をコードする、実施形態１６４に記載の方法。

【0370】

実施形態１６６．前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、多発性骨髄腫腫瘍抑制遺伝子である、実施形態１６５に記載の方法。

【0371】

実施形態１６７．前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、膵臓がん腫瘍抑制遺伝子である、実施形態１６５に記載の方法。

【0372】

実施形態１６８．前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、肺がん腫瘍抑制遺伝子である、実施形態１６５に記載の方法。

【0373】

実施形態１６９．前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、網膜芽細胞腫感受性遺伝子（ＲＢ）、ウィルムス腫瘍（ＷＴ１）、神経線維腫症１型（ＮＦ１）、家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）、フォンヒッペル－リンドウ症候群（ＶＨＬ）、野生型ｐ５３、またはスーパーリプレッサーｐ５３のいずれか１つである、実施形態１６５に記載の方法。

【0374】

実施形態１７０．前記ペプチドまたは前記タンパク質が抗原性タンパク質をコードする、実施形態１６４に記載の方法。

【0375】

実施形態１７１．前記抗原性タンパク質が、前記対象に投与されると、前記組織の細胞において特異的に翻訳される、実施形態１７０に記載の方法。

【0376】

実施形態１７２．前記核酸構築物が、フルオロフォアまたは放射性同位体に共有結合により連結されている、実施形態１５０に記載の方法。

【0377】

実施形態１７３．前記核酸構築物が、治療薬に共有結合により連結されている、実施形態１５０に記載の方法。

【0378】

実施形態１７４．一部の実施形態では、本開示は、実質的に類似の起源の組織または細胞へと移行する核酸配列を識別する方法であって、（ａ）循環する腫瘍核酸を生物試料から単離して、それによって単離された腫瘍核酸のセットを生成すること、（ｂ）前記単離された循環する腫瘍核酸のセットにバーコードを付与して、それによって複数のバーコード化腫瘍核酸を提供すること、（ｃ）組織向性配列のインテグレーションを可能にする条件下で細胞の集団に、複数のバーコード化腫瘍核酸からの少なくとも１つのバーコード化腫瘍核酸を添加し、それによって培養細胞集団を生成すること、（ｄ）培養細胞集団をシーケンシングして、それによって複数のシーケンシングリードを生成すること、（ｅ）シーケンシングリードをコンピューターによって解析し、バーコードを含む複数のシーケンシングリードから少なくとも１つのシーケンシングリードの存在または非存在を識別すること、および（ｆ）バーコードを含むシーケンシングリードを解析して、培養細胞集団には存在するが、細胞集団には存在しない配列の存在または非存在を識別し、それによって目的の組織または細胞へと移行する核酸配列を識別することを含む、方法を提供する。

【実施例0379】

以下の実施例は、本開示のある特定の態様を詳しく記載するために含められ、本開示の範囲を制限するために使用されるものではない。

【0380】

（実施例１）
多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺がん、および膵臓がんを有する患者の血清中の組織起源を反映するｃｔＤＮＡの識別

【0381】

ウイルス抽出ＤＮＡキット（ＱＩＡａｍｐ ＵｌｔｒａＳｅｎｓ Ｖｉｒｕｓ Ｋｉｔ、Ｑｕｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）の後にローリングサークル増幅（Ｇｅｎｏｍｉｐｈｉ Ｖ２，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、がん患者の循環中に見出される大きいＤＮＡ断片（およそ１０ｋＢより大きい）を抽出した。多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する患者２人からのＣＤ１３８（＋）選別細胞、末梢血白血球（ＰＢＬ）細胞、および血清試料の突然変異全体像の配列を、診断時および４サイクルの処置後に再度比較した。

【0382】

試料をさらに処理してシーケンシングした。簡単に説明すると、ＭＭを有する患者は、非ＭＭ患者（すなわち、肺がんまたは膵臓がん）からの対照試料と比較して、診断試料中のｃｔＤＮＡをより高いレベルで有した（図１）。全ての試料に対して約５０×１０^６個のリード／エクソンのカバレッジの平均深度で、ベースコールと各々の位置での正規化配列深度との対比較を実施した。ｖａｒｓｃａｎアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｄｋｏｂｏｌｄｔ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｖａｒｓｃａｎ）を使用して、腫瘍またはＰＢＬにおいてｃｔＤＮＡあたり平均で２３，１４６個のコード単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）および２４，０００個のコードＳＮＶが識別され、このようにｃｔＤＮＡを、全エクソームの突然変異解析の良好な起源として特徴付けた。さらに、増幅したｃｔＤＮＡと、腫瘍またはＰＢＬからの非増幅ＤＮＡのＳＮＶの数の比較によって、本発明者らは、本発明者らの増幅方法によって導入された（増幅エラー）のはＳＮＶの約０．０３％であったことを決定することができた。

【0383】

次に、ｃｔＤＮＡにおける体細胞突然変異の検出レベル（ＬＯＤ）を上昇させると、体細胞突然変異の８９．８％が、ＣＤ１３８（＋）細胞に由来する診断ＤＮＡに存在し、７％が生殖系列突然変異であり、３％はｃｔＤＮＡにおいて見出されない突然変異であることが見出された。

【0384】

（実施例２）
細胞認識およびゲノムインテグレーションシグナルの識別

【0385】

本実施例は、細胞および／または組織認識（Ｚｉｐコード）ならびに細胞の核への移行時の細胞のゲノムへの核酸のインテグレーションを可能にする核酸配列の識別を実証する（例えば、図６～図７を参照されたい）。

【0386】

細胞認識シグナル（ＣＲＳ）およびインテグレーションシグナル（ＩＳ）を識別するプロセスを、並行実験で実施した。第１の実験（Ａ）は、循環する腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、例えば実施例１に記載される循環する腫瘍ＤＮＡの３’および５’末端に位置するＤＮＡの配列を識別することに重点を置いた。第２の実験（Ｂ）は、標的細胞ゲノムへの組み込みを生じる、および標的細胞ゲノムにインテグレートすることが可能であるＤＮＡを識別することに重点を置いた。

【0387】

Ａ．ｃｔＤＮＡの３’および５’末端に位置するＤＮＡの配列の識別

【0388】

試料の処理。ｃｔＤＮＡを、多発性骨髄腫患者６人、膵臓がん患者１人、および対照として健康なボランティア１人から抽出した。次に、Ａｂｍ ＤＮＡライブラリ調製キットを使用して、ｃｔＤＮＡの両端を修復し、「Ａ」テーリングを実施した。このプロセスの終了後、特異的ＰＡＣＢｉｏ配列バーコード（ＧＣＧＣＴＣＴＧＴＧＴＧＣＴ（配列番号２７９））を、核酸配列のいずれかの末端にライゲーションした。これらのステップの後、試料を、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターライゲーションを使用するライブラリ調製にかけた。全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ機器を使用して１億コピーの深度カバレッジで実施した。

【0389】

ＷＧＳデータの解析。ヒトミトコンドリアゲノムに対して整列した全てのリードを除去した。リードをサブサンプリングした後、Ｓｐａｄｅｓを使用してアセンブルし、それによって全体で１７００万個のコンティグを得た。アセンブルしたコンティグを、ＣＤ－ＨＩＴを使用して９９％同一性でクラスター化した。全ての多発性骨髄腫試料を含有するが、対照も膵臓がん試料も含有しないクラスターの重心を選択することによって、３’または５’末端のいずれかにＰａｃＢｉｏバーコードも有する残りのコンティグは１８０個となった。

【0390】

Ｂ．細胞および核膜を通過することが可能で細胞ゲノムにインテグレートすることが可能であるＤＮＡ配列の識別。多発性骨髄腫細胞系からの細胞、多発性骨髄腫患者（７７２）から抽出したドナーｃｔＤＮＡ、および抽出したｃｔＤＮＡと同時培養した多発性骨髄腫細胞系からの細胞（７７２）を使用して全ゲノムシークエンシングを実施した。Ｋｍｅｒを、それらの３つの細胞腫からのｆａｓｔｑ ｆｉｌｅ中の全てのリードに関して生成した。次に、７７２の同時培養物およびドナーｃｔＤＮＡ試料に存在するが、多発性骨髄腫細胞系の形質細胞試料には存在しないｋ－ｍｅｒを含有するもの（ｂｏｗｔｉｅ２を介してマッピングする）を維持することによって、コンティグをさらにフィルタリングした。これらのステップ後、コンティグの数は７５に低減された。

【0391】

細胞認識シグナルの識別

【0392】

この目的のため、実験（Ａ）で見出されたリードを、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）を使用して、実験（Ｂ）において識別された７５個のコンティグと整列させ、コールされたバリアントを、ｓａｍｔｏｏｌｓ／ｂｃｆｔｏｏｌｓを使用して識別した。次に、コールされたバリアントに基づいて、コンセンサス配列（コンティグ）を各試料についてｂｃｆｔｏｏｌｓを使用して識別し、対照または膵臓がんと比較した場合に多発性骨髄腫に対してのみ特異的である多様性の領域を発見した。骨髄腫において突然変異していないが、膵臓がんまたは対照ｃｔＤＮＡにおいて高度に突然変異している領域を、可能性がある細胞認識シグナルである目的の領域としてラベルした。

【0393】

（実施例３）
循環する腫瘍ＤＮＡは細胞膜および核膜を通過することができる

【0394】

ＭＭ、肺がん、または膵臓がんを有する患者からのｃｔＤＮＡを、ＣＸ－ローダミンによって共有結合により標識した。培地に１００ｎｇ ｃｔＤＮＡをロードした後、細胞を図３Ｂに示す異なる時点で収集した。ＭＭでは、ｃｔＤＮＡの出現が細胞質において導入後３０分もの早期に観察され、核局在が２４時間後に観察された。膵臓がん細胞系の場合、ｃｔＤＮＡの細胞質内部移行は１５分以内、核局在は５０分以内に観察された（図２Ａ～２Ｃおよび図３Ａ～３Ｂ）。興味深いことに、本発明者らの３Ｄおよび単一面ビデオは、細胞内部移行後にｃｔＤＮＡがＧＦＰ（＋）細胞膜に取り囲まれることを明白にし、ｃｔＤＮＡ内部移行がエンドサイトーシスによって媒介されることを示唆する。

【0395】

（実施例４）
ｃｔＤＮＡはＤＮＡ損傷を誘導する

【0396】

ＭＭ細胞およびその対応するｃｔＤＮＡを評価し、ｃｔＤＮＡが、あらゆる細胞の核膜を通過することが可能ではないことが観察された。一部の例では、核の断片化が観察され、細胞質または核に導入されたｃｔＤＮＡの負荷量が、標的細胞の運命を決定することができることを示唆した。興味深いことに、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断が識別され、これらの細胞における陽性のＨ２ＡＸ病巣によって確認された。

【0397】

（実施例５）
ｃｔＤＮＡは、その細胞起源と類似である細胞のみを標的とする

【0398】

本実施例は、標的細胞と同じ起源からのｃｔＤＮＡが標的細胞の核膜に急速に侵入するが、同じｃｔＤＮＡが異なる起源からの細胞（例えば、細胞型または組織）の核には侵入しないことを実証する。

【0399】

ＭＭ、肺がん、または膵臓がんを有する患者から得た標識化ｃｔＤＮＡを、マッチするがん細胞系（すなわち、ＭＭ、肺がん、または膵臓がん細胞系）の培養培地に添加した。以下の実施例に示すように、ｃｔＤＮＡは導入後２４時間で核において検出された。

【0400】

しかし、ｃｔＤＮＡを、それぞれのｃｔＤＮＡが由来するがんの型とは異なる細胞系に添加すると、ｃｔＤＮＡは、細胞質および核に移行することができなかったことが見出された。このことは、細胞の認識においてある程度の特異性が存在することを示唆している。さらに、およびいかなる理論にも拘束されないが、血清からのｃｔＤＮＡ抽出は非常にストリンジェントな手順であることから、ｃｔＤＮＡを有する細胞膜（エクソソーム）またはタンパク質の断片ではなくｃｔＤＮＡの配列または固有の改変（例えば、ＤＮＡメチル化パターン）が、細胞認識を駆動し得ると仮定された。

【0401】

このように、これらの結果は、ＭＭ細胞からのｃｔＤＮＡがＭＭ細胞の核に検出されたが、ＭＭ由来ｃｔＤＮＡは、肺がんまたは膵臓がん細胞の核内に局在しなかったことを実証している。同様に、肺がん患者（腺癌）からのｃｔＤＮＡはＭＭ細胞の核に検出されたが、腺癌由来ｃｔＤＮＡはＭＭまたは膵臓がん細胞には移行しなかったかまたは導入されなかったことが示された。最後に、膵臓がん患者からのｃｔＤＮＡは、膵臓がん細胞の細胞質および核に限って導入されたが、肺がんまたは多発性骨髄腫細胞系には導入されなかったことが示された（例えば、図１、図４を参照されたい）。

【0402】

追加の実験では、腫瘍由来ｃｔＤＮＡは腫瘍特異的に腫瘍細胞にホーミングして、それぞれのｃｔＤＮＡが由来する腫瘍細胞のみが標的にされることが実証された。図１６Ａは、多発性骨髄腫（ＭＭ）由来の循環する腫瘍細胞ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）が、細胞および組織特異的にＭＭ細胞にホーミングすることを示している。赤色で強調した領域は、ローダミン標識化ＤＮＡを示し、青色の領域はＤＡＰＩ染色を示す。図１６Ｂは、肺がん（ＬＣ）由来の循環する腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）が、細胞および組織特異的にＬＣ細胞にホーミングすることを示している。赤色で強調した領域は、ローダミン標識化ＤＮＡを示し、青色の領域はＤＡＰＩ染色を示す。図１６Ｃは、大腸がん（ＣＣ）由来の循環する腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）が、細胞および組織特異的にＣＣ細胞にホーミングすることを示している。赤色で強調した領域は、ローダミン標識化ＤＮＡを示し、青色の領域はＤＡＰＩ染色を示す。図１６Ｄは、大腸がん（ＰＣ）由来の循環する腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）が、細胞および組織特異的にＰＣ細胞にホーミングすることを示している。赤色で強調した領域は、ローダミン標識化ＤＮＡを示し、青色の領域はＤＡＰＩ染色を示す。

【0403】

これらの結果は、腫瘍由来ｃｔＤＮＡが腫瘍細胞に腫瘍特異的にホーミングして、それぞれのｃｔＤＮＡが由来する腫瘍細胞のみが標的にされるという驚くべき知見を実証している。このように、本明細書に記載されるＺｉｐコード配列を、細胞、組織、および／または臓器特異的標的化構築物として使用して、治療用および／または診断用カーゴを細胞に非常に特異的に送達することができる。
Ｚｉｐコード配列の細胞特異的取り込みは、競合するｃｔＤＮＡの存在下で影響を受けない

【0404】

第１の腫瘍型のｃｔＤＮＡに由来するＺｉｐコード配列の細胞（例えば、起源の細胞）特異的取り込みが、第２の腫瘍型に由来するｃｔＤＮＡの存在下で影響を受けないことを実証する実験を設計した。

【0405】

図１７Ａは、多発性骨髄腫（ＭＭ）由来の循環する腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）が、競合する大腸がん（ＣＣ）ｃｔＤＮＡ（緑色で示す）の存在下であっても、ＭＭ細胞に細胞および組織特異的に（ＭＭ ｃｔＤＮＡを赤色で示す）ホーミングすることを示す。ＭＭ ｃｔＤＮＡのみがＭＭ細胞において観察され、ＣＣ ｃｔＤＮＡは観察されなかった。図１７Ｂは、多発性骨髄腫（ＭＭ）由来の循環する腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）が、競合する膵臓がん（ＰＣ）ｃｔＤＮＡ（緑色で示す）の存在下であっても、ＭＭ細胞に細胞および組織特異的に（ＭＭ ｃｔＤＮＡを赤色で示す）ホーミングすることを示す。ＭＭ ｃｔＤＮＡのみがＭＭ細胞において観察され、ＰＣ ｃｔＤＮＡは観察されなかった。
カーゴをｃｔＤＮＡにコンジュゲートしても、細胞の取り込みおよび核局在に影響を及ぼさない

【0406】

カーゴ（例えば、蛍光色素などの分子）のｃｔＤＮＡへのコンジュゲーションが、ｃｔＤＮＡ分子がその起源の腫瘍細胞に局在化してそのような細胞の核にさらに局在化する能力に影響を及ぼさないことを実証する実験を設計した。

【0407】

図１７Ｃは、多発性骨髄腫（ＭＭ）由来の循環する腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を色素ローダミンで標識しても、ＭＭ由来ｃｔＤＮＡがＭＭ細胞に細胞および組織特異的に蓄積する能力に影響を及ぼさなかったことを示す（ＭＭ ｃｔＤＮＡ－ローダミン構築物を赤色で示す）。図１７Ｄは、多発性骨髄腫（ＭＭ）由来の循環する腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を、色素Ｃｙ５で標識しても、ＭＭ由来ｃｔＤＮＡがＭＭ細胞に細胞および組織特異的に蓄積する能力に影響を及ぼさなかったことを示す（ＭＭ ｃｔＤＮＡ－Ｃｙ５構築物を緑色で示す）。

【0408】

（実施例６）
ｃｔＤＮＡは形質細胞の染色体にインテグレートする

【0409】

第１のＭＭ患者からのローダミン標識化ｃｔＤＮＡを、異なるＭＭ患者に由来する形質細胞の培養物に入れた。２４時間後、細胞の細胞周期をカリケアミシンによって１時間停止させ、染色体スプレッドを実施した。次に、細胞ＤＮＡをＤＡＰＩ染色によって標識した。図５Ａに示すように、ｃｔＤＮＡ標識化バンドは染色体の複数の領域、中期あたり平均で５つのインテグレーション部位で組み込まれる。

【0410】

ｃｔＤＮＡの標的細胞ゲノムへのインテグレーションは、非相同末端結合修復システムのメンバーの存在を必要とし得、非相同末端結合修復を使用するトランスポゾン媒介性機構を介して機能し得る。

【0411】

さらなる評価のために、ＭＭ細胞および肺がん細胞系からの染色体スプレッドを、ＭＭ患者から得て共有結合により標識したｃｔＤＮＡと共に培養した。結果は、ローダミンバンドが形質細胞の染色体に組み込まれたことを示した。標識化ｃｔＤＮＡの組み込みは、ＤＮＡＰＫｃｓ（ＤＮＡ－ＰＫＣＳ阻害剤Ｉ、２００ｎＭ）、ＡＴＭ（ＫＵ－５５９３３）、またはＭａｎａｓｅ ＳＥＴＭＡＲ／インテグラーゼ（ラルテグラビル、３０ｎＭ）阻害剤を使用した場合には有意に低減されたが、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ阻害剤（ＰＡＲＰ、ＮＵ１０２５、２００ｎＭ）を使用した場合には低減は弱かった（図５Ｂ）。加えて、図５Ｃは、ｃｔＤＮＡの染色体インテグレーションが非相同末端結合（ＮＨＥＪ）およびトランスポザーゼに依存し得ることを示している。標識化ｃｔＤＮＡの組み込みは、ＤＮＡＰＫｃｓ、ＡＴＭ、ＰＡＲＰ－１、およびインテグラーゼ（ラルテグラビル）の阻害剤が存在する場合には、有意に低減された。ＰＡＲＰ－１阻害では、有意ではない低減が観察された。

【0412】

ｃｔＤＮＡに由来する配列番号９９を有するコンティグ配列は、ｃｔＤＮＡおよび形質細胞の同時培養の間に形質細胞のゲノムに挿入されることが意外にも見出された。

【0413】

例えば、図１８は、ＭＭ ｃｔＤＮＡがＭＭ細胞の染色体ＤＮＡにインテグレートされたことを示す（ＭＭ ｃｔＤＮＡを赤色の点で示す）。ＭＭ ｃｔＤＮＡの染色体インテグレーションを、本研究においてシーケンシングを使用して検証した。図１９は、例えば腫瘍染色体にインテグレートされたｃｔＤＮＡとｃｔＤＮＡ単独からの配列アライメントマッチを実証することによる染色体インテグレーションの検証を概略的に示している。

【0414】

（実施例７）
ｃｔＤＮＡの５’および３’末端はしばしば転位因子を含有し、そのような転位因子（ＺＣＳ）からの領域は１つまたは複数の細胞集団を特異的に標的とする

【0415】

本実施例は、ｃｔＤＮＡの５’および３’末端がしばしば、アダプター（ＰＡＣｂｉｏ）をｃｔＤＮＡの両方の末端に結合させて、５’および３’末端を標識することによって転位因子（ＴＥ）を含有し、それによってシーケンシングの際にｃｔＤＮＡの開始および終了の認識を可能にすることを示している。次いで、ライゲーションを行った後、通常のＩｌｌｕｍｉｎａベースのライブラリ調製方法論を行った。

【0416】

ＰＡＣｂｉｏバーコードを、ＭＭ患者４人（ＭＭ ２０２５、ＭＭ ９１０、ＭＭ ２０２４、およびＭＭ ７７２）、膵臓がん患者１人、および対照（健康なボランティア）から得たｃｔＤＮＡの５’および３’末端にライゲーションした。ＰＡＣｂｉｏ標識化ｃｔＤＮＡに、Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリ調製キット（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡライブラリ調製キット）を使用して標準的なライブラリ調製を行った。目的の配列を、ＰＡＣｂｉｏバーコードの存在に関して検索することによって識別した。配列の識別および選別後、ｄｅ ｎｏｖｏアセンブリを実施した。次に、連続する（すなわち、コンティグ）配列を、試料間で比較し、９９％より高い配列類似性で全てのＭＭ試料に共通であった一群のコンティグを識別した。図８Ａ～８Ｂは、各試料のコンティグ上でコールされたバリアントに由来するコンセンサス配列を使用するクラスタリング解析の結果を示す。ＭＭ試料は、対照または膵臓がんと比較して共にクラスター化し、ＭＭコンティグの構造が互いに非常に類似であり、ＭＭ細胞に限って存在することを示唆した。循環するＤＮＡの抽出および複数回の増幅方法を実施することによって、骨髄腫のような疾患では、循環する腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）が腫瘍ゲノムの９７％を反映することも示された。

【0417】

全てのコンティグのトランスポゾンの存在、位置、および型を分析および識別するためのＧｉｒｉ ｒｅｐｂａｓｅソフトウェア。分析結果は、全てのコンティグが高い含有量のトランスポゾンを有することを実証した。興味深いことに、コンティグの大多数は、トランスポゾンの位置および型を示す指標となるコンティグにおいて示されるように、配列の最末端でトランスポゾンを有する（図６）。

【0418】

（実施例８）
ｃｔＤＮＡ配列は、異種移植片モデルにおいて腫瘍細胞を特異的に標的化し、オフターゲット組織での取り込みを回避する

【0419】

本実施例は、がん由来のＺＣＳを含むヒト細胞標的化核酸配列が、ｉｎ ｖｉｖｏで同じ起源の腫瘍細胞を特異的に標的とするが、オフターゲット組織の取り込みは非常に低いかまたは示さないことを実証する。

【0420】

ｃｔＤＮＡが特異的標的組織をｉｎ ｖｉｖｏで認識する能力を評価するために、ヒト由来膵細胞系ＭＴ５を使用する異種移植片マウスモデルを開発した。具体的には、細胞１００万個を、免疫欠損ＢＮＸマウスの両側の背側に注射した。腫瘍体積がおよそ０．５ｃｍに達すると、マウスを特定の実験アームに割付した。コホート＃１および＃２のマウスにローダミン標識化膵臓がん患者由来ｃｔＤＮＡを尾静脈注射した。腫瘍を注射の２４および４８時間後にそれぞれ収集した。コホート＃３には、腫瘍収集の２４時間前に腫瘍にローダミン－ｃｔＤＮＡ構築物の直接注射を行った。コホート＃４は、陰性対照であり、腫瘍収集の２４時間前にＰＢＳの尾注射を行った。収集時に、腫瘍および選択した臓器（肝臓、肺、および脾臓）を単離し、凍結切片を行った。組織スライドをパラホルムアルデヒド（４ｖ／ｖ％）によって固定し、その後４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）によって染色した。

【0421】

共焦点顕微鏡法は、ローダミン標識化ｃｔＤＮＡ構築物の様々なレベルが腫瘍に存在するが他の組織には存在しなかったことを実証した。収集の４８時間前に注射した場合（図９Ｃ、図１０Ｃ）、腫瘍細胞は、ＰＢＳのみを投与した対照マウス（図９Ｄ、図１０Ａ）と比較して、尾静脈注射を介して（図９Ｂ、図１０Ｂ）、および直接腫瘍注射（図９Ａ）を介して投与した２４時間後に収集した腫瘍細胞と比較して標識化ｃｔＤＮＡのかなり高い濃度を示した。同様に、ローダミン－ｃｔＤＮＡ構築物の核局在は、投与の２４時間後に収集した腫瘍（図９Ａ～図９Ｂ）と比較して、注射の４８時間後に収集した腫瘍（図９Ｃ）では有意に高かった。肝臓、肺、または脾臓などの潜在的排泄臓器におけるローダミン－ｃｔＤＮＡ取り込みの評価では、それらの臓器におけるローダミン－ｃｔＤＮＡ構築物の検出可能な取り込みを示さなかった。

【0422】

このように、これらの結果は、同じ起源の腫瘍組織（この場合、膵臓がん）に関してｃｔＤＮＡの高い特異性を実証する。ｉｎ ｖｉｖｏモデルは、膵臓がん患者から得たｃｔＤＮＡが、肝臓または他の細網内皮系を含む他の臓器におけるいかなる取り込みも示すことなく、膵臓がん細胞を排他的に標的とすることを示している。したがって、ｃｔＤＮＡのＺｉｐコード配列は、同じ起源の組織の非常に特異的な標的化を可能にし得る。

【0423】

（実施例９）
複数の疾患を処置およびモニタリングするためのＺＩＰコード遺伝子送達の使用

【0424】

本実施例は、複数の疾患を処置およびモニタリングするためにＺＩＰコード遺伝子送達を使用することが、ウイルスベクター送達システムを用いる既存の技術に優るどのように有意な利点を提供し得るかを実証する。

【0425】

循環するＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が、細胞間の遺伝情報の交換を可能にすることはこれまでに示されている。上記の以前の実施例に示すように、ｃＤＮＡはさらに、標的細胞の核に侵入することが可能で、染色体にインテグレートすることが実証された（例えば、図１１を参照されたい）。これは、脂質膜内包（例えば、エクソソーム、マイクロ小胞）を必要とすることなく起こり得る。その上、ｃＤＮＡ細胞標的化が同じ起源の細胞に関して選択的であることは、上記で示された。例えば、肺を起源とするｃＤＮＡは、肺組織からの（またはそれに由来する）細胞の核膜のみに侵入するが、他の組織型からの細胞の核膜には侵入しないことが示された。その上、ｃＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こすことによって核への侵入時にゲノム不安定性を生じ、このように細胞ゲノムへのそのインテグレーションを促進する。

【0426】

オフターゲット突然変異誘発のリスクなどの、従来のウイルスベクターシステムを遺伝子送達ビヒクルとして使用する欠点を考慮すると、新たに識別された組織／細胞特異的認識配列（すなわち、Ｚｉｐコード配列）を使用する本開示の新規アプローチは、組織標的化および／またはカーゴ送達の際のオフターゲット効果の有意な低減を提供し得る。

【0427】

（実施例１０）
疾患診断および処置モニタリングのためのＺｉｐコード配列の使用

【0428】

本開示の細胞および組織特異的核酸配列（すなわち、ＺＣＳ）は、疾患の診断および病期分類において、ならびに治療介入に対する応答をモニタリングするために有用であり得る。例えば、腫瘍を有する対象から抽出したｃｔＤＮＡは、疾患の病期および重症度のバイオマーカーとして役立ち得る。

【0429】

対象から抽出したｃｔＤＮＡを、細胞および組織特異的認識シグナルおよびインテグレーションシグナルに関して分析する。検出されたこれらの認識およびインテグレーションシグナルを含む核酸配列の血清１ｍＬあたりの量を使用して、疾患の病期を評価することができる。例えば、ｃｔＤＮＡ由来ＺＣＳの濃度は、転移性疾患の病期に関連し得る。

【0430】

さらに、対象の血液において識別された細胞型および組織型特異的認識シグナルならびにその濃度は、原発腫瘍の組織起源および可能性がある転移部位または転移ニッチ形成に関する情報を提供することができる。

【0431】

投与されると、標的組織の細胞における本明細書に記載される核酸構築物の取り込みが、対象の血液試料のＰＣＲを介してモニタリングされる。循環する核酸構築物の低減は、標的組織におけるその取り込みの尺度である。あるいは、および上記のように、放射標識化核酸構築物の使用は、全身投与後の構築物のｉｎ ｖｉｖｏ追跡（例えば、目的の標的組織における取り込み）に関する非侵襲性のアプローチを提供する。

【0432】

（実施例１１）
治療薬としての細胞特異的Ｚｉｐコード配列

【0433】

本実施例は、本開示のＺＣＳを、治療的および／または診断用カーゴ（例えば、治療タンパク質またはポリペプチド、低分子治療薬、放射性核種）の細胞および／または組織特異的送達のために使用することができることを実証する。具体的には、本実施例は、治療タンパク質をコードする目的の遺伝子の細胞特異的送達およびインテグレーションを実証する。

【0434】

細胞特異的認識配列およびゲノムインテグレーション配列は、実施例２において上記のように識別される。治療タンパク質（例えば、表面抗原ＣＤ１９）をコードする目的の遺伝子は、３’および５’末端でインテグレーションシグナル配列に隣接し、次にこれに細胞認識配列（例えば、図１２を参照されたい）が隣接して、治療核酸構築物を生成することができる。

【0435】

標的化およびインテグレーションシグナルを識別するために使用したｃｔＤＮＡと同じ組織型または起源の細胞を、治療核酸構築物と共にインキュベートする。ＣＤ１９コードトランスジーンの場合では、細胞を収集し、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用してＣＤ１９表面発現に関して分析する。細胞をまた、抗ＣＤ１９抗体によって染色し、細胞あたりの発現密度を決定し、これは、核酸構築物のインテグレーション効率の尺度として間接的に役立つ。

【0436】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ結果で示された核酸構築物の成績に基づき、核酸送達システムのいくつかのパラメーターを、様々な認識およびインテグレーション配列によるｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を数ラウンド実施することによって、必要に応じて増強された細胞特異的標的化およびタンパク質発現のためのガイド配列を使用することによって、最適化することができる。

【0437】

（実施例１２）
腫瘍細胞特異的Ｚｉｐコード配列は、腫瘍に自殺遺伝子を送達し、腫瘍退縮を誘導する

【0438】

本実施例は、本開示の腫瘍特異的ＺＣＳが、ほぼ排他的に腫瘍細胞を標的として蓄積することを実証する。その上、そのような腫瘍特異的ＺＣＳは、自殺遺伝子を腫瘍に送達し、腫瘍サイズの有意な低減を誘導する。本実施例は、多発性骨髄腫（ＭＭ）ＺＩＰコード配列が、多発性骨髄腫異種移植片モデルにおいて自殺遺伝子を腫瘍細胞に送達し、腫瘍の退縮を誘導することをｉｎ ｖｉｖｏで実証する。

【0439】

本実施例では、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（例えば、ＨＳＶ－ＴＫ）を、がん治療の自殺遺伝子として使用した。ヒト単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ１型遺伝子（例えば、ＨＳＶｔｋ）を、哺乳動物腫瘍細胞における条件的致死マーカーとして使用した。酵素であるチミジンキナーゼ－１に転写および翻訳されると、この酵素は、ヌクレオシドアナログ（例えば、ガンシクロビル、ゲムシタビン等）を毒性のＤＮＡ複製阻害剤へと変換することができる。このように、本明細書に提示される研究では、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）遺伝子を、本明細書に開示される腫瘍特異的ＺＣＳを使用して腫瘍を有するマウスのがん細胞に移入した後に、ガンシクロビル（ＧＣＶ）による処置を行った。
腫瘍異種移植片モデル

【0440】

ヒト由来多発性骨髄腫細胞系（例えばＭＭ１ｓ）の細胞およそ５００万個をＢＮＸマウス２匹の背側に注射することによって、腫瘍を誘導した。腫瘍体積が２ｃｍに達すると、マウスに、ＣＭＶ－ＨＳＶ－ＴＫ含有核酸断片にライゲーションしたＭＭ ｚｉｐコード配列（配列番号２８２）２μｇを注射した。注射の４８時間後、両方のマウスを、ガンシクロビル（１００μｇ／ｋｇ）によって毎日腹腔内処置した。腫瘍測定は、電子キャリパーを使用して毎日実施した。腫瘍体積は、腫瘍の長径および短径ならびに腫瘍の幅の測定に基づいて計算した（例えば、図１３を参照されたい）。
結果

【0441】

腫瘍測定は、両方の動物において腫瘍サイズの一定の低減を実証した。マウス＃１は、不明原因により処置の４日後に死亡した。図１３Ａおよび図１３Ｂは、ガンシクロビル処置を５日間行った後にＨＳＶ－ＴＫ遺伝子送達によって処置したマウス＃２において観察された腫瘍体積の変化を示す。図１３Ｃおよび以下の表１は、ガンシクロビルによる処置と組み合わせて遺伝子治療を行った両方の動物において測定された腫瘍体積の変化を示す。
表１－治療遺伝子送達実験における腫瘍体積の測定

【表1】

【0442】

これらの結果から、本開示に提供したＺｉｐコード配列の特異性が明らかに検証された。ＭＭ標的化Ｚｉｐコード配列は、ＭＭ腫瘍を標的化し、ｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて機能的トランスジーンを送達した。その後に投与したヌクレオシドアナログであるガンシクロビルとの併用療法は、腫瘍サイズの有意な低減を明らかに実証し、ＺＩＰコード配列が自殺遺伝子を腫瘍細胞に送達したことを示した。

【0443】

（実施例１３）
多発性骨髄腫（ＭＭ）特異的Ｚｉｐコード配列は、ＭＭ腫瘍細胞に対して非常に特異的である

【0444】

本実施例は、本開示の多発性骨髄腫（ＭＭ）特異的ＺＣＳが、腫瘍を有するマウスの他の組織と比較して、腫瘍細胞をほぼ排他的に標的化し、蓄積することを実証する。

【0445】

腫瘍異種移植片を誘導し、腫瘍を有するマウスを、実施例１２に上記のように遺伝子治療－ヌクレオシドアナログの組合せを使用して処置した。

【0446】

動物を安楽死させ、腫瘍、肺、および他の臓器を含む臓器を得た。各臓器からの組織試料を、ＰＣＲ分析のために調製し、各組織において発現された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ－１（ＨＳＶ－ＴＫ－１）のレベルを評価した。

【0447】

図１４Ａおよび図１４Ｂは、ＭＭ Ｚｉｐコード－ＨＳＶ－ＴＫによる遺伝子治療後で、ガンシクロビル（１００μｇ／ｋｇ）による処置の４８時間後、５日後のマウス＃２からの様々な組織のＰＣＲ結果を示す。ＰＣＲ結果は、腫瘍細胞および腫瘍組織に限って単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ－１に対応するバンドを示すが、本研究において分析した他の臓器のいずれにおいてもバンドを示さないことを明らかに示し、本明細書に開示されるＺｉｐコード配列および関連構築物の高い細胞および組織特異性を実証している。数字は、（１）分子量ラダー、（２）腫瘍、（３）肺、（４）脾臓、（５）肝臓、（６）膵臓、（７）脳、および（８）腎臓を示す。

【0448】

これらのデータは、本開示のｚｉｐコード配列の高い細胞および組織特異性を実証する。それぞれの細胞および／または組織起源に対して観察された高い特異性により、本明細書に記載されるｚｉｐコード核酸配列を使用して改善された遺伝子送達ならびに遺伝子治療および診断方法論が可能となり得る。

【0449】

（実施例１４）
多発性骨髄腫（ＭＭ）特異的Ｚｉｐコード配列は、ＭＭ細胞にトランスジーンを送達し、その後のトランスジーン発現を可能にする

【0450】

本実施例は、本明細書に記載の多発性骨髄腫（ＭＭ）特異的Ｚｉｐコード配列が、トランスジーンをＭＭ細胞に送達し、その後のトランスジーン発現を可能にすることを実証する。

【0451】

図２０は、本開示のＭＭ特異的Ｚｉｐコード配列構築物を概略的に示している。そのような構築物は、いずれかの側に翻訳エレメント（例えば、ＩＲＥＳ）、ＧＦＰコード配列、プロモーター、ルシフェラーゼコード配列、ならびに構築物のルシフェラーゼコード部分および／またはＩＲＥＳコード部分に結合した１つまたは複数のローダミン色素に隣接する２つのＺｉｐコード配列（例えば、長さ約３００ｂｐ）を含み、構築物（またはその断片）のｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでの移動を追跡するために使用した。

【0452】

図２０に記載されるＭＭ特異的Ｚｉｐコード構築物を、それがトランスジーンをＭＭ腫瘍細胞に送達し、トランスジーンをその後発現させる能力に関して評価した。

【0453】

図２１Ａは、ＺＣＳ構築物（ＭＭＺｉｐコード－ＰＧＫ－ＧＦＰ－ＭＭＺｉｐコード）のＧＦＰ（緑色、左上）発現およびローダミン検出が、ＭＭ細胞内のその位置に対応したことを示し、ＺＣＳ構築物のＭＭ細胞への効率的な送達、トランスジーンの送達、および前記トランスジーンの発現を示している。これは、本開示のＺＣＳ構築物を、前記トランスジーンの効率的な遺伝子送達およびその後の発現のために使用することができることを実証する。

【0454】

Ｚｉｐコード配列を含まない線状のＰＧＫ－ＧＦＰ構築物を含む陰性対照構築物は、いかなるトランスジーン発現も示さなかった。図２１Ｂは、線状のＰＧＫ－ＧＦＰ構築物単独の使用では、シグナルのいかなる細胞特異的位置も示さないことを示し、Ｚｉｐコード配列が、ＭＭＺｉｐコード－ＰＧＫ－ＧＦＰ－ＭＭＺｉｐコード構築物のＭＭ細胞特異的取り込みの原因であることを確認している。

【0455】

図２２は、ＭＭＺｉｐコード－ファージ－ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｌｕｃ構築物のＭＭ細胞への細胞取り込みの拡大画像を示す。画像の評価から、この構築物を使用してＭＭ細胞への最大１００％の遺伝子送達が示され、これは分析したあらゆるＭＭ細胞までによるＧＦＰの生成によって示された。

【0456】

これらの結果は、本明細書に記載されるＺｉｐコード配列を非常に特異的かつ非常に効率的な遺伝子送達構築物として使用することができることを実証している。これらの構築物は、標的細胞の核に局在するのみならず、前記トランスジーンの効率的な染色体インテグレーションおよびそのその後の発現を可能にする。したがって、本明細書に記載されるＺｉｐコード配列は、様々な適用のための遺伝子送達構築物として、例えば多様な疾患に適用可能な治療および／または診断構築物として使用することができる。重要なことに、そのような効率的かつ特異的な遺伝子送達は、送達ベクター（例えば、ウイルスベクター）を使用することなく達成することができる。

【0457】

（実施例１５）
膵臓（ＰＣ）由来Ｚｉｐコード配列は、ｉｎ ｖｉｖｏで膵臓がん細胞を標的化し、膵臓がん細胞において核局在を示す

【0458】

本実施例は、本明細書に開示されるＰＣ由来Ｚｉｐコード配列が、ｉｎ ｖｉｖｏで膵臓腫瘍細胞を標的化し、高い核局在を示すことを実証する。

【0459】

ヒト由来膵臓がん細胞およそ５００万個をＢＮＸマウス２匹の背側に注射することによって、腫瘍を誘導した。腫瘍体積が２ｃｍに達した後、マウスに、ＰＣ由来Ｚｉｐコード配列構築物２μｇを注射した。

【0460】

図２３は、ＰＣ異種移植片マウスモデルにおけるＰＣ由来ＺＣＳのｉｎ ｖｉｖｏホーミング研究の結果を示す。図２３Ａは、いかなる構築物も注射しない陰性対照を示す２枚の画像を一番左の縦列に示す。図２３Ｂは、投与（尾静脈を介して）の２４時間後のＰＣ細胞におけるＰＣ由来ＺＣＳの蓄積を示す２枚の画像を中央の縦列に示す。図２３Ｃは、投与（尾静脈を介して）の４８時間後のＰＣ細胞におけるＰＣ由来ＺＣＳの蓄積を示す２枚の画像を右の縦列に示す。この動物の肝臓および脾臓から得た組織試料は、ＰＣ由来ＺＣＳの取り込みを示さず、本開示のＺＣＳの細胞特異性を確認した。

【0461】

その上、本明細書における尾静脈を介しての構築物の投与によって示される全身投与により、ＰＣ細胞においてこれらの構築物の高い取り込みおよび核局在が起こることが示された。図２４は、ＰＣ異種移植片マウスモデルにおけるＰＣ由来ＺＣＳの膵臓がん（ＰＣ）ｉｎ ｖｉｖｏホーミング研究の結果を示す。図２４Ａは、尾静脈注射した２４時間後、および特に４８時間後のＰＣ細胞における有意な蓄積および取り込みを実証するデータを示す。図２４Ｂは、ＰＣ由来ＺＣＳを腫瘍に直接注射すると、腫瘍細胞における取り込みが有意に低減したことを示しており、ｃｔＤＮＡに由来するＺＣＳが、全身投与した場合に改善された細胞および／または組織認識および取り込みを提供し得ることを示唆している。図２４Ｃは、ｃｔＤＮＡを注射しなかった対照実験を示す。

【0462】

このデータは、本明細書に記載される構築物の高い細胞、組織、および／または臓器特異性を実証する。これらの結果はさらに、これらの構築物のｉｎ ｖｉｖｏでのゲノム送達およびインテグレーションを示し、これらの構築物の治療的および／または診断的有用性を示している。

【0463】

（実施例１６）
Ｚｉｐコード配列は、免疫原性ペプチドまたはタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ生成のためのがんワクチンとして使用することができる

【0464】

本実施例は、本明細書に開示される核酸Ｚｉｐコード配列を使用して、がんに罹患している対象におけるがん細胞に対して免疫応答を誘発することが可能な１つまたは複数の免疫原性ペプチドをコードする核酸配列を前記がん細胞に送達することができることを実証する。

【0465】

核酸配列をコードする免疫原性ペプチドを送達するために使用される核酸Ｚｉｐコード配列を、実施例１および２に記載のように得る。Ｚｉｐコード配列を使用して、１つまたは複数の細胞認識および染色体インテグレーションシグナルを含む１つまたは複数のＺｉｐコード配列が隣接する、１つまたは複数の免疫原性ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸構築物（例えば、Ｚｉｐコード構築物）を生成する。

【0466】

Ｚｉｐコード構築物は、がんに罹患しているまたは罹患することが疑われる対象に投与される。Ｚｉｐコード構築物は、対象に投与されるとがん細胞にホーミングする。Ｚｉｐコード構築物は、がん細胞のゲノムにインテグレートされ、その後、がん細胞によって免疫原性ペプチドまたはタンパク質が発現される。免疫原性分子の発現は、ＧＦＰコード配列を含む構築物を使用して追跡される。がん細胞によって生成された免疫原性ペプチドまたはタンパク質は、対象において免疫応答を誘発する。がんは、サイズが有意に低減され、その後まもなく取り除かれる（例えば、がん／がん細胞の存在は検出不能となる）（例えば、核のイメージングおよび／または標識化Ｚｉｐコード配列を使用するイメージングによって決定した場合）。

【0467】

このデータは、本明細書に記載される構築物ががん性疾患を防止および／または処置するためのがんワクチンとして使用することができることを示している。

【0468】

（実施例１７）
オリゴヌクレオチドＺｉｐコード配列（オリゴ－ＺＣＳ）、核酸構築物、および送達システムの合成、特徴付け、および精製

【0469】

本実施例は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドＺｉｐコード配列（オリゴ－ＺＣＳ）、核酸構築物、および送達システム、例えば配列番号１～２０２を有する単離されたコンセンサス配列のいずれか、および／または配列番号２０３～２７７、または２８２を有する自己インテグレート核酸配列のいずれかの任意の１つまたは複数を含むかまたはそれからなるものの合成、特徴付け、および精製を実証する。

【0470】

一般的に、二本鎖核酸配列は、社外の供給業者が化学または酵素的に合成した。受領時に、核酸分子を、例えば脱塩法を使用して精製し、その後に配列および構造を分析的に確認した。

【0471】

（実施例１８）
本明細書に記載される核酸Ｚｉｐコード配列を使用するがんおよびがんの再発の防止

【0472】

本実施例は、１つまたは複数のＺｉｐコード配列を含む本明細書に記載される核酸構築物を使用して、処置後のがんの形成を防止する、および／またはがんの再発を防止することができることを実証する。

【0473】

本研究は、本開示のＺｉｐコード配列（例えば、オリゴ－ＺＣＳ）を使用して、対象の体（例えば、循環系および／または他の臓器もしくは組織）における腫瘍関連核酸分子を結合および／または捕捉することによって、がんの形成を防止することができることを実証する。対象は齧歯類またはヒトである。

【0474】

この目的のために、膵臓がん患者のｃｔＤＮＡに由来する膵臓がん（ＰＣ）特異的ＺＣＳ分子を、膵臓がんを発症するリスクを有する対象の群に（例えば、処置の成功後および再発を防止するために）投与する（例えば、医薬組成物として）。（ＰＣ）特異的ＺＣＳを投与した対象のコホートは、有意に低いＰＣの発症率（例えば、再発率）を示す。

【0475】

これらの対象の血清試料の分析から、（ＰＣ）特異的ＺＣＳが、対象における循環する腫瘍由来核酸分子に結合して捕捉することが示され、この治療機構を介して疾患の防止を達成することができることを示唆している。

【0476】

このように、本明細書に記載されるＺＣＳは、がんの処置のためのみならず、がんの防止のためにも使用することができる。いかなる理論にも拘束されないが、本明細書に記載されるＺＣＳは、循環する腫瘍ＤＮＡに結合して捕捉し、それによって、（ｉ）そのようなｃｔＤＮＡが遠位組織および／または臓器に到達するのを防止または低減させ、転移形成を阻害する、および（ｉｉ）原発腫瘍の成長および増殖を阻害または低減する（例えば、細胞間クロストーク、腫瘍血管系の形成を阻害または低減すること等によって）と仮定される。

【0477】

（実施例１９）
全般的実験方法

【0478】

本実施例は、本明細書に記載される標的（例えば、細胞）特異的核酸分子の構築、分析、および評価のために本明細書に使用される実験方法を記載する。
臨床検体および試料の調製

【0479】

多発性骨髄腫（ＭＭ）および膵臓がん（ＰＣ）患者１０人、肺がん患者４人、および大腸がん患者４人のレトロスペクティブな血漿試料を、Ｗｉｎｓｈｉｐ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの組織および獲得バンクにおいて利用可能な保存試料から得た。多発性骨髄腫患者１０人は、ボルテゾミブ含有レジメンによって処置され、または膵臓がん患者はゲムシタビンによって処置され、使用した試料を、その疾患状態（応答または進行性の疾患）に従って選択した。ＭＭにおける応答は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａを使用して決定し、膵臓がん患者ではＲＥＣＩＳＴ基準を使用した。血漿は、遠心分離法を使用して単離した。血液を１５００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。上清を回収して保存した。
細胞系およびアポトーシス研究

【0480】

多発性骨髄腫（ＯＰＭ、ＲＰＭＩ、ＪＫ６Ｌ、ＫＭＳ１１、ＫＭＳ１２、ＪＪＮ３、およびＭＭ１Ｓ）、膵臓がん（ＡＳＰＣ１、ＰＡＮＣ１、ＭＩＡ）、大腸がん（ＨＣＴ－１１６、ＲＫ８、およびＨＣＴ）、および肺がん（Ａ５４９）細胞系を、１０％ウシ胎児血清、１％Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および５０μｇ／ｍｌペニシリン－ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地中で成長させた。

【0481】

アポトーシス研究の場合、細胞１０^４個を、滴定用量のボルテゾミブ（用量：０．１５、０．２５、０．５、０．７５０、１、１．５、および２．５ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから得た）またはゲムシタビンによって処置した。２４時間後、細胞を、ＹＯ－ＰＲＯ－１およびヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって染色した。生存細胞を、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ ５０００Ａ自動獲得分析システム（ＰＩ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して測定し、ＹＯ－ＰＲＯ－１、およびヨウ化プロピジウム陰性細胞を定量した。
ｃｔＤＮＡ抽出および免疫蛍光標識

【0482】

循環する腫瘍ＤＮＡを、施設内で開発したｃｔＤＮＡ単離および増幅キットを使用して血漿から得た。ＤＮＡを、増幅ステップを除き、製造元のプロトコールに従って抽出した。ｃｔＤＮＡの蛍光標識は、Ｌａｂｅｌ ＩＴ（登録商標）核酸標識、Ｃｘ－ローダミン、またはＣＹ５を使用して実施した。
免疫蛍光

【0483】

細胞約１０^６個を、１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ培地１ｍｌ中でローダミンまたはＣＹ５標識化ＤＮＡと共に、本明細書に記載の異なる時点でインキュベートした。生存細胞イメージングのために、細胞膜を、ｃｅｌｌＬｉｇｈｔ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ－ＧＦＰ、Ｂａｃｍａｎ ２．０プロトコール（ＴｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号１０６０７）に従って標識した。示した写真は、三連の実験からの代表的な画像である。染色体スプレッドおよびｃｔＤＮＡバンド形成の識別

【0484】

ＭＭ、ＰＣ、大腸がん（ＣＣ）、および肺がんを有する３人の異なる患者からのローダミン標識化ｃｔＤＮＡを、ＭＭ、ＰＣ、ＣＣ、および肺がん（ＬＣ）の培養培地に添加した。細胞約１０^６個を、培養培地１．５ｍＬ中で１００ｎｇ／ｍＬローダミン－ｃｔＤＮＡ構築物と同時培養した。培養２４時間後、細胞を１５ｍｌチューブに移し、コルセミド１５μＬ（１０μｇ／ｍＬ）と共に培地１０ｍＬ中、３７℃で２０分間インキュベートした後、収集した。遠心分離して培地を除去後、細胞を、予め加温した０．０７５Ｍ ＫＣｌ １０ｍＬ中に再懸濁させ、３７℃で２０分間インキュベートした。固定液（２ｍＬ、３：１メタノール：酢酸）を添加して１０分間インキュベートした後、遠心分離および吸引した。次に、試料を固定液１０ｍＬに再懸濁させ、室温で１０分間インキュベートした後、固定液によってさらに２回洗浄した。スライドをＴｈｅｒｍｏｔｒｏｎ中で調製し、温度および湿度を最適な中期スプレッドとなるように制御する。ＤＡＰＩ褪色防止剤１０μｌ液滴３滴を各スライドに添加し、カバーガラスを載せた。倍率２０倍で視野あたり少なくとも細胞２５個が可視化可能となるまで、固定した細胞を、３μＬの連続マイクロピペッティングを使用してスライドに一度に載せた。室温で１時間乾燥後、核を４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）によって染色した。接触および重なり合う細胞を除いて、実験あたり中期の核１０個を計数した。ローダミンバンドが組み込まれた染色体の数を計数した。
非相同末端結合修復、代替経路、およびトランスポザーゼ阻害剤によるｃｔＤＮＡインテグレーションの評価

【0485】

細胞約１０^６個のＭＭ１ｓ、ＰＡＮＣ１、およびＨＣＴ－１１６細胞を、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復系の阻害剤、例えばＫＵ－５５９３３（ＡＴＭ阻害剤、１０μＭ）およびＤＮＡ－ＰＫＣＳ阻害剤Ｉ（３０μＭ）、代替修復経路の阻害剤、例えばポリＡＤＰリボースポリメラーゼ阻害剤ＮＵ１０２５（ＰＡＲＰ、２００μＭ）、およびインテグラーゼ／トランスポザーゼ阻害剤（ラルテグラビル、１００ｎＭ）によって２時間処置した。阻害剤による処置後、ローダミン標識化ｃｔＤＮＡ構築物を培養培地に添加し２４時間おいた。次に、細胞を停止させ、染色体スプレッドを上記のように得た。少なくとも２０個の中期を計数した後、細胞あたりのインテグレーション部位の計数を得た（図３２）。異種移植片の実験

【0486】

異種移植片モデルを、ヒト由来膵細胞系（ＭＴ５）、ＭＭ細胞系（ＭＭ１Ｓ）、および大腸がん（ＨＣＴ－１１６）を使用して開発した。この目的のため、それぞれの細胞系の腫瘍細胞およそ１００万個を、Ｊ：ＮＵ（００７８５０）非近交系ヌードマウスの背部両側に注射した。腫瘍体積が約０．５ｃｍに達した後、マウスを特定の実験群に割付した。マウス３匹にローダミン標識化ｃｔＤＮＡ構築物の尾注射を行い、腫瘍を、それぞれ注射の２４時間および４８時間後に収集した。第４のマウスには、ローダミンのみ（標的特異的ｃｔＤＮＡ、すなわちＺＣＳにカップリングされていない）を尾注射し、第５のマウスにはＰＢＳ（対照）を注射した。収集時に、腫瘍および臓器（肝臓、肺、小腸および大腸、膵臓、ならびに脾臓）に凍結切片のための解剖を行った。各スライドを４％パラホルムアルデヒドによって固定し、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）によって染色した後、カバーガラスを載せた。
全ゲノムシーケンシング

【0487】

ｃｔＤＮＡを、本実施例において上記の方法を使用して多発性骨髄腫（ＭＭ）患者５人および膵臓がん（ＰＣ）患者１０人から抽出した。ＣＤ１３８（＋）細胞からのＤＮＡをＢｌｏｏｄ＆Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、ＭＤ）を使用して抽出し、膵臓がん原発性腫瘍ＤＮＡを、腫瘍スライドの再検討および腫瘍含有領域のコア抽出後にＦＦＰＥ試料から得た。得られたこれらの試料におけるＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ＦＦＰＥ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＭＤ）を使用して抽出した。抽出後、ｃｔＤＮＡを、ＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングのためのＡＢＭ ＤＮＡライブラリ調製キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｉｎｃ．Ｃａｎａｄａ）に従ってＰＡＣＢＩＯアダプター（ＧＣＧＣＴＣＴＧＴＧＴＧＣＴ（配列番号２７９））にライゲーションした。その後、ＰＡＣＢｉｏ標識化ｃｔＤＮＡに、ライブラリ調製のための標準的な方法を行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａプロトコールを使用してシーケンシングした。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｉｎｃが、ライブラリ調製および全ゲノムシーケンシングを実施した。平均標的カバレッジは５０倍であった。解析のために、ヒトミトコンドリアゲノムに割付された全てのリードを除去した。全ゲノムシーケンシングの未加工データを、Ｓｐａｄｅｓソフトウェアを使用して処理し、ｄｅ ｎｏｖｏアセンブリを実施した。この解析によって、全体で１７００万個のコンティグが得られた。次に、アセンブルしたコンティグを、ＣＤ－ＨＩＴを使用して腫瘍型毎に９９％の同一性でクラスター化した。全てのＭＭ試料を含有するがＰＣ試料を含有しない、およびその逆のクラスターの重心を選択した。それらのコンティグから、ＰａｃＢｉｏバーコードを３’または５’末端のいずれかに含有する配列のみを選択した。転位因子（ＴＥ）の識別

【0488】

コンティグ配列（コンティグ）を解析し、コンティグにおける転位因子様領域の位置の決定を可能にするＣＥＮＳＯＲ ＧｉｒｉおよびＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ法を使用して、ＴＥを識別および分類した。
トランスポゾン線状化ベクター

【0489】

全てのＭＭ試料によって共有される突然変異を含有するトランスポゾンの配列

【化2】

（配列番号２８２）は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ（ＩＤＴ）によって生成された。このオリゴは、ポリＴセグメントの克服を可能にするために２つのブロックで生成した。同様に、ＥｃｏＲＩ相補性部位を末端に付加し、ＣＭＶ－緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶＴＫ）線状化ベクターとのライゲーションを促進した。

【0490】

（実施例２０）
ボルテゾミブまたはゲムシタビンによって処置した多発性骨髄腫（ＭＭ）および膵臓がん（ＰＣ）患者からの血漿は、薬物感受性または耐性をＭＭまたはＰＣ細胞系に伝播する

【0491】

本実施例は、ボルテゾミブまたはゲムシタビンによってそれぞれ処置した多発性骨髄腫（ＭＭ）および膵臓がん（ＰＣ）患者由来の血漿が、それらの患者において観察された薬物感受性または薬物耐性をｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＭまたはＰＣ細胞に伝播することができることを実証する。

【0492】

この実験に関して、ＭＭまたはＰＣ患者から得た血漿を、ボルテゾミブまたはゲムシタビンに対するその応答状態に従って抽出した。次に、ボルテゾミブに対するＭＭ感受性細胞系（ＯＰＭ１およびＭＭ１ｓ）およびゲムシタビンに対するＰＣ感受性細胞系（ＭＩＡ）を、対応する薬物に対する耐性を既に示している患者の血漿と共に２４時間培養した。次に、ボルテゾミブまたはゲムシタビンの滴定用量を培養培地に添加し、細胞の生存を２４時間後に測定した。

【0493】

これらの結果は、ボルテゾミブに対して耐性の患者の血漿を添加すると、ＭＭ１ｓおよびＯＰＭ１の耐性の増加をもたらしたことを実証する（図２５Ａ、右上および左上のグラフ）。これに対し、ボルテゾミブ耐性ＭＭ細胞系（ＲＰＭＩ、ＪＫ６Ｌ）を、ボルテゾミブに応答した患者の血漿と共に培養すると、細胞はボルテゾミブに対するその感受性を有意に回復した（図２５Ａ、右下および左下のグラフ）。これらの知見は、膵細胞（ＰＡＮＣ１およびＭＩＡ）をゲムシタビン感受性および耐性患者の血漿と同時培養した場合に確認された。

【0494】

その上、ｃｔＤＮＡが患者の血漿によって誘導された処置に対する応答の伝達に寄与したか否かを調べるために、上記と同じ患者の血漿をＤＮアーゼによって処置した。データは、この処置が、処置に対する細胞の固有の感受性を回復したことを示している（図２９Ａ）。薬物応答の細胞への伝達に対するｃｔＤＮＡの関与をさらに検証するために、ボルテゾミブ耐性細胞から無細胞ｃｔＤＮＡを抽出し、ボルテゾミブ感受性患者のＤＮアーゼ処置血漿を含有する培地に添加した（図２９Ａ）。さらに、ボルテゾミブ耐性患者から抽出したｃｔＤＮＡを異なるボルテゾミブ耐性患者の血清に添加すると、ボルテゾミブ耐性の有意な増加が観察された（図２９Ａ）。図２５Ｃは、ベースラインｃｔＤＮＡ単独の密度と比較した複数の細胞系および患者由来のｃｔＤＮＡの核密度測定の倍数変化を示す。図２５Ａ～２５Ｃのデータは、ボルテゾミブに対する患者の臨床感受性がｃｔＤＮＡを介して細胞系に伝達され得ることを示している。

【0495】

併せて考慮すると、これらの知見は、細胞（例えば、腫瘍細胞）が、情報、例えば薬物処置に対する細胞の運命を定義する情報を伝播することができる遺伝物質をｃｔＤＮＡが伝達することができることを示唆している。これらのデータは、本明細書に記載されるＺＣＳを使用してカーゴ分子を標的細胞に非常に特異的に送達することができることも実証している。いかなる理論にも拘束されないが、本明細書に記載されるＺＣＳ構築物の高い細胞特異性（例えば、ＭＭ細胞に対するＭＭ由来ＺＣＳの特異性）は、本明細書に記載される、薬物処置患者のＭＭ由来ｃｔＤＮＡからの薬物耐性情報のｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＭＭ細胞への伝播を可能にする同じ機構に基づくと仮定される。
（実施例２１）
ｃｔＤＮＡは、ｃｔＤＮＡ細胞起源に類似する腫瘍細胞に組み込まれる

【0496】

本実施例は、ｃｔＤＮＡがｃｔＤＮＡ細胞起源に類似する腫瘍細胞に組み込まれることを実証する。

【0497】

この目的のために、ＭＭおよび膵細胞系における薬物処置に対する応答（例えば、耐性、感受性等）の伝達におけるｃｔＤＮＡの役割が遺伝物質の水平伝播によるか否かを評価した。このように、ヒト患者から得たｃｔＤＮＡがＤＮＡを実際に表し、それぞれのがん患者における腫瘍のゲノムを反映することを最初に確認した。ＭＭ、膵臓がん、および大腸がんを有する患者の血漿から得られたそのようなＤＮＡは、ＤＮアーゼによる処置のみがこれらのウェスタンブロットにおいて認められたバンドを分解したことを実証している（図２９Ｂ）。その上、ＭＭからの１０対の腫瘍およびｃｔＤＮＡエクソンシーケンシングならびにＰＣからの全ゲノムシーケンシングは、高い類似率を実証し、この場合、突然変異全体像の約９０％の類似率であった（図２９Ｃ）。これらの知見に基づき、ｃｔＤＮＡによって媒介される遺伝子の水平伝播（ＨＧＴ）を、ＭＭ患者４人、ＰＣ患者３人、大腸がん患者３人、および肺がん（ＬＣ）患者１人のローダミン標識化ｃｔＤＮＡを使用して評価し、次にこれらを、ｃｔＤＮＡ腫瘍型にマッチする異なる細胞系ＭＭ１Ｓ、ＡＳＰＣ１、ＨＣＴ１１６、およびＡ５４９の培養物にそれぞれ導入した（図２５Ｂ）。図２９Ｄは、異なるＭＭ細胞系および複数のＭＭ患者からのｃｔＤＮＡの指標となる画像を示す。

【0498】

これらの結果は、２４時間後、ｃｔＤＮＡがほとんどの実験条件において高レベルで核に局在したことを実証した。同様に、必ずしもあらゆる単一のｃｔＤＮＡががん細胞系によって捕捉されなかったことも観察され、一部のｃｔＤＮＡ断片が、がん細胞間での移行および伝播を可能にし得る、例えば情報の交換を可能にし得る固有の特徴を有し得ることを示唆した。

【0499】

次に、ｃｔＤＮＡが固形（ＰＣ）腫瘍および血液（ＭＭ）腫瘍細胞の核に到達するために必要な時間を評価した。膵細胞系ＡＳＰＣ１を使用して、ＰＣ患者からのｃｔＤＮＡが細胞膜を急速に標的化して（例えば、ローダミン標識化ｃｔＤＮＡが膜および細胞内部にも局在することを示す、図２６ＡのＡＳＰＣ１パネルの左上の画像を参照されたい）、数分以内に内部移行し、約１０分後に核に到達することが識別された。その上、ＭＭ１ｓ細胞（「ＭＭ１Ｓ」と標識化される画像パネルによって示される）は、ｃｔＤＮＡを２時間以内に取り込み（図２６ＡのＭＭＭ１Ｓパネルの一番左の画像）、約６時間後にｃｔＤＮＡの細胞質への内部移行を示し、核には８時間という早期に到達し、最大の核局在化は約２４時間で起こった（図２６ＡのＭＭＭ１Ｓパネルの一番右の画像）ことを示した。
（実施例２２）
ｃｔＤＮＡは、ｃｔＤＮＡの細胞起源に類似する腫瘍異種移植片に優先的に移行する

【0500】

本実施例は、ｃｔＤＮＡが、それらが起源とする同じ腫瘍型に類似する腫瘍異種移植片へと優先的に移行することを実証し、これは本明細書において「向性」と呼ばれ得る。

【0501】

この実験に関して、ヒト由来膵臓がん（ＭＴ５）、ＭＭ（ＭＭ１ｓ）、および大腸がん（ＨＣＴ－１１６）細胞系を使用する異種移植片モデルを開発した。全ての腫瘍異種移植片実験を実施する前に予備実験を実施して、腫瘍部位でのｃｔＤＮＡの最高濃度の時期を決定した。この目的のために、ＰＣ異種移植片を有するマウス３匹に、ローダミン標識化ＰＣ由来ｃｔＤＮＡを尾静脈注射した。この研究から、ローダミン－ｃｔＤＮＡ構築物の注射後４８時間での最大腫瘍局在化が識別された（図３０Ａ）。

【0502】

次に、ＭＭ、ＰＣ、およびＣＣ（腫瘍型毎にｎ＝５）のマウス腫瘍異種移植片に、対応する診断を有するローダミン－ｃｔＤＮＡ（それぞれのがんに罹患している患者から得たｃｔＤＮＡ）を注射した（腫瘍型毎にｎ＝３）。対照異種移植片マウス２匹に、対照としてローダミン単独を注射した。４８時間後、腫瘍および様々な臓器（肝臓、脾臓、肺、腎臓、大腸、および膵臓）を収集して凍結切片を作製した。標識化ｃｔＤＮＡの濃度を調べる共焦点顕微鏡法から、対照マウスと比較して腫瘍において高濃度であることが実証された（図２６Ｂおよび図３０Ｂ）。ｃｔＤＮＡの生体分布の評価では、他のいかなる臓器においてもいかなる免疫蛍光も示されず、所与のｃｔＤＮＡのその自身の起源細胞に対する高い特異性を実証した。
（実施例２３）
ｃｔＤＮＡはｃｔＤＮＡの細胞起源とは異なる細胞型の細胞である細胞に組み込まれない

【0503】

本実施例は、ｃｔＤＮＡが、ｃｔＤＮＡの細胞起源とは異なる細胞型の細胞には組み込まれないまたは有意に組み込まれないことを実証する。

【0504】

腫瘍細胞の循環する腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）特異的標的化は、ｃｔＤＮＡがｃｔＤＮＡのその起源とする細胞と類似である細胞に対して選択的な向性を有し得る可能性を生じた。したがって、このことを、ｃｔＤＮＡを抽出した患者の診断とはミスマッチである細胞系の同時培養を実施することによって試験した。２つのＭＭ細胞系を、ＰＣ、ＬＣ、またはＣＣ患者に由来するｃｔＤＮＡと同時培養すると、ｃｔＤＮＡが細胞膜辺縁部にクラスター化し、内部移行できなかったことを示した（図２６Ｃおよび図２６Ｄ）。膵臓がんおよび大腸がん細胞系を、ミスマッチ腫瘍型から抽出したｃｔＤＮＡと同時培養した他の実験でも、類似のデータが得られた。

【0505】

これらの驚くべき予想外の知見を、細胞系の腫瘍型がマッチするまたはミスマッチである患者からのｃｔＤＮＡを含有する培養培地に添加して、ｃｔＤＮＡの核局在を測定することによってさらに検証した。ｃｔＤＮＡをＣＹ５またはローダミンのいずれかによって標識後、ｃｔＤＮＡを、ＭＭ（ＭＭ１ｓおよびＪＫ６Ｌ）、ＣＣ（ＨＴ２９およびＨＣＴ－１１６）、ならびにＰＣ（ＰＡＮＣ１およびＰＡＮＣ１）細胞系と２４時間同時培養した。図２６Ｅおよび図２６Ｆは、ｃｔＤＮＡ起源および細胞系腫瘍型がマッチした場合、ｃｔＤＮＡが細胞の核に有意に蓄積することを示す。これに対し、細胞系およびｃｔＤＮＡの腫瘍型がミスマッチである場合、ｃｔＤＮＡは細胞の外部に留まる。

【0506】

類似の起源の細胞の特異的細胞標的化（向性）に関するｃｔＤＮＡの特性をｉｎ ｖｉｖｏで再現するために、ｃｔＤＮＡの選択的向性を、２つの異種移植片モデル（ＭＭおよびＰＣ）において試験した。各動物の尾にローダミン標識化ＭＭ ｃｔＤＮＡおよびＣＹ５標識化ＰＣ ｃｔＤＮＡを注射することによって三連の実験を実施した。腫瘍の顕微鏡法から、ローダミン－ＭＭ ｃｔＤＮＡ（赤色の蛍光）がＭＭ異種移植片を標的とするが、ＰＣの異種移植片を標的化できなかったことが実証された。同様に、ＣＹ５標識化ＰＣ
ｃｔＤＮＡ（黄色の蛍光）は、ＰＣ異種移植片において高度に濃縮されたが、ＭＭ－ｃｔＤＮＡは濃縮されなかった（図３１Ａ）。

【0507】

併せて考慮すると、これらのデータは、ｃｔＤＮＡがｉｎ ｖｉｖｏでその細胞起源と類似のがん細胞型を選択的に標的とするという強い証拠を提供する。
（実施例２４）
ｃｔＤＮＡの染色体インテグレーション

【0508】

本実施例は、ｃｔＤＮＡが細胞およびそのような細胞の核を標的化して侵入するのみならず、ｃｔＤＮＡの細胞起源に類似するそのような細胞の染色体にもインテグレートされ得ることを実証する。

【0509】

本研究では、ｃｔＤＮＡの断片が、それらが核に到達すると細胞ゲノムにインテグレートすることが可能であるか否かを評価した。この目的のために、ＭＭ（ＭＭ１ｓ、ＲＰＭＩ、ＯＰＭ１）、ＰＣ（ＭＩＡ、ＡＳＰＣ１、ＰＡＮＣ１）およびＣＣ（ＨＣＴ－１１６、ＨＣＴ－１１、ＲＫＯ）細胞系の中期染色体スプレッドを、ｃｔＤＮＡを培養培地に添加することによって実施した（腫瘍型毎にＮ＝３）。図２７Ａおよび図２７Ｂ、ならびに図３１Ｂおよび図３１Ｃに示すように、いくつかの染色分体に組み込んだ複数のローダミン－ｃｔＤＮＡバンドが識別された。

【0510】

細胞ゲノムへのｃｔＤＮＡのインテグレーションをさらに確認するために、全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）を、本明細書に記載されるように３つの異なる実験条件で実施した：細胞系（ＭＭ、ＰＣ、およびＣＣ）、細胞系と類似のがんの診断を有する対象から抽出したｃｔＤＮＡ、およびその対応する腫瘍細胞系と同時培養したｃｔＤＮＡ。ｃｔＤＮＡ断片の配列を、ｄｅ ｎｏｖｏアセンブリによって生成し、これによって約１７００万個のコンティグ配列（コンティグ）を得た。次にコンティグのリストを、ＭＭ、ＰＣ、またはＣＣにおいて９９％より高い配列相同性を有する配列を有するコンティグを選択すること、およびその重心領域が各腫瘍カテゴリーにクラスター化する能力によってフィルタリングした（コンティグ毎にｎ＝１８０）。このコンティグの配列を、同時培養ｃｔＤＮＡ細胞系および細胞系単独に存在するＫ－ｍｅｒと共にマッピングした後、細胞ゲノムにインテグレートされたｃｔＤＮＡ断片を識別した。Ｃｉｒｃｕｓプロットは、ＭＭ１ｓおよびＡＳＰＣ１細胞系におけるいくつかのコンティグの挿入およびその対応する挿入部位を実証する。最後に、ｃｔＤＮＡが遺伝物質を標的細胞に輸送してインテグレートする能力を、ＧＦＰをコードするＣＭＶ－ＧＦＰベクターの各々の側にＭＭ ｃｔＤＮＡ分子が隣接するように、線状化ＣＭＶ－ＧＦＰベクターをその中央に導入したＭＭ ｃｔＤＮＡと同時培養したＭＭ１ｓ細胞におけるＧＦＰ発現を評価することによってさらに検証した。図２７Ｃは、サイトメガロウイルス－緑色蛍光タンパク質（ＣＭＶ－ＧＦＰ）をコードするカーゴ核酸配列がｃｔＤＮＡ配列に隣接し、カーゴ（ＣＭＶ－ＧＦＰ－コード）配列の細胞標的化およびゲノムインテグレーションを可能にするｃｔＤＮＡ－ＣＭＶ－ＧＦＰ－ｃｔＤＮＡ構築物と同時培養した腫瘍細胞におけるＧＦＰの発現を示す（右の画像）。左の画像（対照）は、ｃｔＤＮＡなしでＣＭＶ－ＧＦＰコードカーゴ核酸配列を使用した場合に、腫瘍細胞においてＣＭＶ－ＧＦＰが発現されなかったことを示しており、ｃｔＤＮＡ部分がカーゴ核酸配列の細胞標的化および発現にとって必要であったことを示唆している。

【0511】

このように、これらのデータは、ｃｔＤＮＡががん細胞間の遺伝物質の水平伝播を媒介することができることを示している。このように、これらのデータは、本明細書に記載されるｃｔＤＮＡおよびそれに由来する核酸、例えば、標的化配列およびインテグレーション配列を含むＺＣＳを使用して、おそらく目的の遺伝子を標的細胞に導入するためにウイルスベクターまたは他の従来の方法を使用する必要なく、標的遺伝子（例えば、治療標的遺伝子）を、非常に細胞特異的に細胞に輸送することができることを示している。

【0512】

加えて、ｃｔＤＮＡの細胞標的化の特異性を、ｃｔＤＮＡおよび細胞型が腫瘍診断とマッチする条件と、ｃｔＤＮＡが細胞系の腫瘍型とマッチしない条件での挿入数を比較することによって調べた。

【0513】

これらの研究は、ｃｔＤＮＡの細胞起源、例えば同じがん型等にマッチする細胞のゲノムにおけるｃｔＤＮＡ挿入の有意な増加を確認し、ｃｔＤＮＡの組織標的化の選択性を検証した。
（実施例２５）
５’および３’トランスポゾンはｃｔＤＮＡの挿入を媒介する

【0514】

本実施例は、５’および３’トランスポゾンが標的細胞、例えばｃｔＤＮＡが由来する細胞と同じがんの型の細胞のゲノムへのｃｔＤＮＡの挿入を媒介することができることを実証する。

【0515】

転位因子（ＴＥ）は、原核生物および少数の例の真核生物（昆虫および植物）において観察されるＨＧＴの機構において重要な役割を果たし得る。このため、転位因子の阻害が、染色分体へのｃｔＤＮＡのインテグレーションを低減または防止することができるか否かを調べた。この目的に関して、細胞を、トランスポザーゼ阻害剤であるラルテグラビルによって２時間処置した後に、ｃｔＤＮＡを培養培地に添加した。対照に関して、ＡＴＭ阻害剤（ＫＵ－５５９３３）、ＤＮＰｋｃ阻害剤（ＤＮＡ－ＰＫＣＳ阻害剤Ｉ）およびＰＡＲＰ阻害剤（ＮＵ１０２５）を使用した。図２８Ａは、ＭＭ（ＭＭ１Ｓ）、ＰＣ（ＡＳＰＣ－１）、およびＣＣ（ＨＣＴ １１６）細胞系の染色体へのローダミン（ローダミン標識化ｃｔＤＮＡからの）バンドの組み込みレベルを実証する。データは、ｃｔＤＮＡのインテグレーションが、対照またはＰＡＲＰ阻害剤（ＮＵ１０２５、２００μＭ）処置細胞と比較した場合に、ＤＮＡＰＫｃｓ阻害剤（ＤＮＡ－ＰＫＣＳ阻害剤Ｉ、３０μＭ）、ＡＴＭ阻害剤（ＫＵ－５５９３３、１０μＭ）、またはトランスポザーゼ阻害剤（ラルテグラビル、１００ｎＭ）によって有意に低減されたことを示し、転位因子が細胞のゲノムへのｃｔＤＮＡの挿入において役割を果たし得ることを確認する。これらの結果に基づいて、細胞ゲノムへのインテグレーションにおいて役割を果たし得るｃｔＤＮＡ断片の配列特徴を識別するために一連の実験を設計した。この目的のために、各ｃｔＤＮＡ断片の５’末端および３’末端を標識するためにＰＡＣＢＩＯプローブに予めライゲーションされているＭＭ ｃｔＤＮＡ試料５例およびＰＣ ｃｔＤＮＡ試料１０例をシーケンシングした。ＭＭおよびＰＣ配列の識別のためのアルゴリズムに従って、ｃｔＤＮＡ ｄｅ ｎｏｖｏアセンブリから生成されたコンティグリストを、本明細書に記載される同時培養実験からのｃｔＤＮＡ挿入として識別された配列と比較することによって、どのｃｔＤＮＡ断片が細胞ゲノムへのｃｔＤＮＡの挿入において役割を果たし得るかを調べた。これらの分析により、細胞ゲノムに埋もれたまたは埋もれていないコンティグが識別された。ＤＮＡ配列におけるＴＥ含有量を検出および分類することが可能な複数のソフトウェアを使用して、ｃｔＤＮＡ断片を、細胞ゲノムへのそのインテグレーション能、ＴＥの含有量、およびコンティグ配列におけるＴＥの局在化に従って分類した。解析から、細胞ゲノムにインテグレートされたｃｔＤＮＡ断片ではＴＥが高度に濃縮され、その局在は主に、５’および３’末端に向かうほど濃縮されることが実証された。加えて、挿入されなかったｃｔＤＮＡ断片は、ＴＥが有意に欠如していることを実証し、存在する場合であっても、ｃｔＤＮＡ断片の末端のいずれにも有意に局在しなかった。原核細胞および植物において観察されたＨＧＴにおけるＴＥの重要な役割と、がん細胞における本明細書に記載した知見を組み合わせると、ＴＥはがん細胞間での遺伝子の伝播において有意な役割を果たし得ることを示唆している。このように、これらのＴＥ配列を、ｃｔＤＮＡまたはｃｔＤＮＡ由来構築物において使用して、目的の核酸または遺伝子（例えば、治療遺伝子、アポトーシス遺伝子等）を標的細胞に輸送することができる。

【0516】

インテグレートされたｃｔＤＮＡ断片のその後の解析から、それらの断片に存在する転位様因子の約４０％を構成する２つの型のＴＥの識別が可能となった。それらの約半数は、ＭＩＲレトロトランスポゾンであり、残りの半分はＡＬＵｓｑであった。興味深いことに、ＭＩＲは、遺伝子編集において広く使用されているＴＥである、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｇｙｐｓｙエレメントと非常に類似の転位因子（ＴＥ）由来インスレーターである。遺伝物質のがん細胞間での伝播におけるＭＩＲの役割をさらに検証するために、ＴＥを化学合成し、線状化サイトメガロウイルス－緑色蛍光タンパク質（ＣＭＶ－ＧＦＰ）断片にライゲーションした（図２８Ｂ）。ライゲーションおよび精製後、ＴＥ－ＣＭＶ－ＧＦＰ
ＤＮＡをＭＭ細胞系培養物（ＭＭｓ１）に添加し、生存イメージングを実施した。結果から、１２時間以内に、ＭＭ１ｓ細胞がＧＦＰを発現したことが実証され、合成されたＴＥがカーゴ遺伝物質を細胞ゲノムに伝播およびインテグレートすることが可能であることを示唆している（図２８Ｂ、右の画像、緑色蛍光は細胞内でのＧＦＰ生成を示す）。この結果は、ＴＥをＣＭＶ－ＨＳＶＴＫにライゲーションして、ＭＭ異種移植片マウスの尾に注射した場合にｉｎ ｖｉｖｏでさらに検証された。腫瘍および種々のマウス臓器のＰＣＲから、腫瘍組織のみに存在するＨＳＶＴＫ遺伝子が検出された（図２８Ｃ）。これらの結果は、ｃｔＤＮＡにおける高濃度のＴＥおよびラルテグラビル処置細胞において観察されたインテグレーションの欠如と組み合わせると、ＴＥががん細胞間のｃｔＤＮＡの水平の遺伝子伝播を媒介する上で中心的な役割を果たすことを示唆している。このように、そのような転位因子を含む核酸構築物を使用して、ウイルスベクターおよび／またはＴＡＬＥＮもしくはＣＲＩＳＰＲなどの遺伝子編集ツールを使用する必要なく、目的の遺伝子を細胞において非常に細胞特異的に発現させることができる。

【0517】

本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、記載してきたが、そのような実施形態は単なる例として提供されることは当業者に明らかであろう。本発明から逸脱することなく、数多くの変形形態、変化、および置換が当業者に想起されるであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替物を本発明の実践において用いてもよいと理解すべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにその均等物はそれによって含まれると意図される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目１)
核酸構築物の治療有効量を含む医薬組成物であって、前記核酸構築物が、
ａ）ｉｎ ｖｉｖｏでの予め選択された組織への前記核酸構築物の移行を方向付ける第１のデオキシリボ核酸配列、および
ｂ）ｉｎ ｖｉｖｏでの前記予め選択された組織からの細胞のゲノムへの前記核酸構築物の領域のインテグレーションを方向付ける第２のデオキシリボ核酸配列
を含み、
前記医薬組成物が、対象に投与するために製剤化されている、医薬組成物。
(項目２)
前記第１のデオキシリボ核酸配列が、前記予め選択された組織からの前記細胞と同じ細胞型に由来する、項目１に記載の医薬組成物。
(項目３)
前記対象がヒトである、項目１に記載の医薬組成物。
(項目４)
前記第１のデオキシリボ核酸配列が白血球に移行する、項目１に記載の医薬組成物。
(項目５)
前記第１のデオキシリボ核酸配列が膵細胞に移行する、項目１に記載の医薬組成物。
(項目６)
前記第１のデオキシリボ核酸配列が肺細胞に移行する、項目１に記載の医薬組成物。
(項目７)
前記核酸構築物が、前記対象に投与した場合に、前記予め選択された組織からの前記細胞の核膜を通過する、項目１に記載の医薬組成物。
(項目８)
前記第１のデオキシリボ核酸配列が、配列番号２０３～配列番号２７７および配列番号２８２のいずれか１つの少なくとも１２塩基と少なくとも９０％の同一性を有する、項目１に記載の医薬組成物。
(項目９)
前記第１のデオキシリボ核酸配列が、長さが少なくとも４００塩基対である、項目１に記載の医薬組成物。
(項目１０)
前記第１のデオキシリボ核酸配列が、長さが４００塩基対～２０，０００塩基対の間である、項目１に記載の医薬組成物。
(項目１１)
前記第２のデオキシリボ核酸配列が、トランスポゾン配列と少なくとも９０％の相同性を有する、項目１に記載の医薬組成物。
(項目１２)
前記トランスポゾンがクラスＩＩトランスポゾンである、項目１１に記載の医薬組成物。
(項目１３)
前記クラスＩＩトランスポゾンが、遺伝子の水平伝播を介して前記予め選択された組織からの前記細胞の前記ゲノムにそれ自身をインテグレートする、項目１２に記載の医薬組成物。
(項目１４)
前記核酸構築物が、少なくとも１つの追加のデオキシリボ核酸配列を含む、項目１に記載の医薬組成物。
(項目１５)
前記少なくとも１つの追加のデオキシリボ核酸配列が、組織選択的プロモーターを含む、項目１４に記載の医薬組成物。
(項目１６)
前記少なくとも１つの追加のデオキシリボ核酸配列が、前記ゲノムへの組み込みのための第２のインテグレーションシグナルを含む、項目１４に記載の医薬組成物。
(項目１７)
前記少なくとも１つの追加のデオキシリボ核酸配列が、ペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含む、項目１４に記載の医薬組成物。
(項目１８)
前記少なくとも１つの追加のデオキシリボ核酸配列が、前記ペプチドまたはタンパク質が前記予め選択された組織からの前記細胞に限って発現されることを確実にする配列を含む、項目１４に記載の医薬組成物。
(項目１９)
前記ペプチドまたは前記タンパク質が、腫瘍抑制ペプチドまたは腫瘍抑制タンパク質をコードする、項目１７に記載の医薬組成物。
(項目２０)
前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、多発性骨髄腫腫瘍抑制遺伝子である、項目１９に記載の医薬組成物。
(項目２１)
前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、膵臓がん腫瘍抑制遺伝子である、項目１９に記載の医薬組成物。
(項目２２)
前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、肺がん腫瘍抑制遺伝子である、項目１９に記載の医薬組成物。
(項目２３)
前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、網膜芽細胞腫感受性遺伝子（ＲＢ）、ウィルムス腫瘍（ＷＴ１）、神経線維腫症１型（ＮＦ１）、家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）、フォンヒッペル－リンドウ症候群（ＶＨＬ）、野生型ｐ５３、またはスーパーリプレッサーｐ５３のいずれか１つである、項目１９に記載の医薬組成物。
(項目２４)
前記ペプチドまたは前記タンパク質が抗原性タンパク質をコードする、項目１７に記載の医薬組成物。
(項目２５)
前記抗原性タンパク質が、前記対象に投与されると前記細胞において特異的に翻訳される、項目２４に記載の医薬組成物。
(項目２６)
カーゴをさらに含む、項目１に記載の医薬組成物。
(項目２７)
前記カーゴが、フルオロフォアまたは放射性同位体である、項目２６に記載の医薬組成物。
(項目２８)
前記カーゴが治療薬である、項目２６に記載の医薬組成物。
(項目２９)
前記カーゴが前記核酸構築物に共有結合されている、項目２６に記載の医薬組成物。
(項目３０)
製剤が、ナノ粒子またはカチオン性ポリマーを含む、項目２６に記載の医薬組成物。
(項目３１)
配列番号２０３～配列番号２７７および配列番号２８２のいずれか１つの少なくとも１２塩基と少なくとも９０％の同一性を有する第１の配列、ならびに追加の核酸配列を含むベクター。
(項目３２)
前記追加の核酸配列が、トランスポゾン配列と少なくとも９０％の相同性を有する、項目３１に記載のベクター。
(項目３３)
前記トランスポゾンがクラスＩＩトランスポゾンである、項目３１に記載のベクター。(項目３４)
前記クラスＩＩトランスポゾンが、遺伝子の水平伝播を介して前記予め選択された組織からの前記細胞の前記ゲノムにそれ自身をインテグレートする、項目３３に記載のベクター。
(項目３５)
少なくとも２つの追加の核酸配列を含む、項目３１に記載のベクター。
(項目３６)
前記少なくとも２つの追加の核酸配列が、組織選択的プロモーターおよびトランスポゾン配列を含む、項目３５に記載のベクター。
(項目３７)
前記少なくとも２つの追加の核酸配列が、少なくとも２つのトランスポゾン配列を含む、項目３５に記載のベクター。
(項目３８)
前記追加の核酸配列が、ペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含む、項目３１に記載のベクター。
(項目３９)
前記ペプチドまたは前記タンパク質が、腫瘍抑制ペプチドまたは腫瘍抑制タンパク質をコードする、項目３８に記載のベクター。
(項目４０)
前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、多発性骨髄腫腫瘍抑制遺伝子である、項目３９に記載のベクター。
(項目４１)
前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、膵臓がん腫瘍抑制遺伝子である、項目３９に記載のベクター。
(項目４２)
前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、肺がん腫瘍抑制遺伝子である、項目３９に記載のベクター。
(項目４３)
前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、網膜芽細胞腫感受性遺伝子（ＲＢ）、ウィルムス腫瘍（ＷＴ１）、神経線維腫症１型（ＮＦ１）、家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）、フォンヒッペル－リンドウ症候群（ＶＨＬ）、野生型ｐ５３、またはスーパーリプレッサーｐ５３のいずれか１つである、項目３９に記載のベクター。
(項目４４)
カーゴに共有結合により連結されている、項目３１に記載のベクター。
(項目４５)
前記カーゴが、フルオロフォアまたは放射性同位体である、項目４４に記載のベクター。
(項目４６)
前記カーゴが治療薬である、項目４４に記載のベクター。
(項目４７)
項目３１に記載の２つまたはそれより多くのベクターのライブラリ。
(項目４８)
がんを処置する方法であって、
前記がんに罹患している対象の組織へのカーゴの移行を方向付ける核酸配列を含む核酸構築物の有効量を投与することを含み、組成物が対象に投与するために製剤化されている、方法。
(項目４９)
前記がんが肺がんである、項目４８に記載の方法。
(項目５０)
前記がんが多発性骨髄腫である、項目４８に記載の方法。
(項目５１)
前記がんが膵臓がんである、項目４８に記載の方法。
(項目５２)
前記核酸構築物が、前記対象に投与されると、組織細胞の細胞における核膜を通過する、項目４８に記載の方法。
(項目５３)
前記組織への前記カーゴの移行を方向付ける前記核酸配列が、配列番号２０３～配列番号２７７および配列番号２８２のいずれか１つの少なくとも１２塩基と少なくとも９０％の同一性を有する、項目４８に記載の方法。
(項目５４)
前記核酸構築物が、前記組織の細胞のゲノムへのインテグレーションのためにトランスポゾンを含む、項目４８に記載の方法。
(項目５５)
前記トランスポゾンが、長さが少なくとも４００塩基対である、項目５４に記載の方法。
(項目５６)
前記トランスポゾンが、長さが４００塩基対～２０，０００塩基対の間である、項目５４に記載の方法。
(項目５７)
前記トランスポゾンがクラスＩＩトランスポゾンである、項目５４に記載の方法。
(項目５８)
前記核酸構築物が、前記組織の細胞に対して異種である少なくとも１つの追加の核酸配列を含む、項目４８に記載の方法。
(項目５９)
前記少なくとも１つの追加の核酸配列が組織選択的プロモーターを含む、項目５８に記載の方法。
(項目６０)
前記少なくとも１つの追加の核酸配列が、ペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含む、項目５８に記載の方法。
(項目６１)
前記少なくとも１つの追加の核酸配列が、標的ゲノムへの組み込みのためのインテグレーションシグナルを含む、項目５８に記載の方法。
(項目６２)
前記少なくとも１つの追加の核酸配列が、前記細胞を標的とするためのガイド配列を含む、項目５８に記載の方法。
(項目６３)
前記少なくとも１つの追加の核酸配列が、ペプチドまたはタンパク質をコードする配列
を含む、項目６０に記載の方法。
(項目６４)
前記ペプチドまたは前記タンパク質が、腫瘍抑制ペプチドまたは腫瘍抑制タンパク質をコードする、項目６３に記載の方法。
(項目６５)
前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、多発性骨髄腫腫瘍抑制遺伝子である、項目６４に記載の方法。
(項目６６)
前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、膵臓がん腫瘍抑制遺伝子である、項目６４に記載の方法。
(項目６７)
前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、肺がん腫瘍抑制遺伝子である、項目６４に記載の方法。
(項目６８)
前記腫瘍抑制ペプチドまたは前記腫瘍抑制タンパク質が、網膜芽細胞腫感受性遺伝子（ＲＢ）、ウィルムス腫瘍（ＷＴ１）、神経線維腫症１型（ＮＦ１）、家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）、フォンヒッペル－リンドウ症候群（ＶＨＬ）、野生型ｐ５３、またはスーパーリプレッサーｐ５３のいずれか１つである、項目６４に記載の方法。
(項目６９)
前記ペプチドまたは前記タンパク質が抗原性タンパク質をコードする、項目６０に記載の方法。
(項目７０)
前記抗原性タンパク質が、前記対象に投与されると、前記組織の細胞において特異的に翻訳される、項目６９に記載の方法。
(項目７１)
前記核酸構築物が、フルオロフォアまたは放射性同位体に共有結合により連結されている、項目４８に記載の方法。
(項目７２)
前記核酸構築物が、治療薬に共有結合により連結されている、項目４８に記載の方法。(項目７３)
実質的に類似の起源の組織または細胞へと移行する核酸配列を識別する方法であって、
（ａ）循環する腫瘍核酸を生物試料から単離して、それによって単離された腫瘍核酸のセットを生成すること、
（ｂ）前記単離された循環する腫瘍核酸のセットにバーコードを付与して、それによって複数のバーコード化腫瘍核酸を提供すること、
（ｃ）組織向性配列のインテグレーションを可能にする条件下で、細胞の集団に、前記複数のバーコード化腫瘍核酸からの少なくとも１つのバーコード化腫瘍核酸を添加し、それによって培養細胞集団を生成すること、
（ｄ）前記培養細胞集団をシーケンシングして、それによって複数のシーケンシングリードを生成すること、
（ｅ）前記シーケンシングリードをコンピューターによって解析し、前記バーコードを含む前記複数のシーケンシングリードから少なくとも１つのシーケンシングリードの存在または非存在を識別すること、および
（ｆ）前記バーコードを含む前記シーケンシングリードを解析して、前記培養細胞集団には存在するが、前記細胞集団には存在しない配列の存在または非存在を識別し、それによって目的の前記組織または前記細胞へと移行する前記核酸配列を識別すること
を含む、方法。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25-1】

【図25-2】

【図26-1】

【図26-2】

【図26-3】

【図27】

【図28-1】

【図28-2】

【図29-1】

【図29-2】

【図30-1】

【図30-2】

【図31】

【図32】

【配列表】

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【外国語明細書】