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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024053345
(43)【公開日】2024-04-15
(54)【発明の名称】アルツハイマー型認知症抑制剤およびその製造方法
(51)【国際特許分類】
A61K 36/185 20060101AFI20240408BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240408BHJP
A61K 31/7048 20060101ALI20240408BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20240408BHJP
【ＦＩ】
A61K36/185
A61P25/28
A61K31/7048
A23L33/105
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022159550
(22)【出願日】2022-10-03
(71)【出願人】
【識別番号】598092270
【氏名又は名称】有限会社 坂本薬草園
(74)【代理人】
【識別番号】110002837
【氏名又は名称】弁理士法人アスフィ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】山原 條二
【テーマコード（参考）】
4B018
4C086
4C088
【Ｆターム（参考）】
4B018LB10
4B018LE03
4B018MD56
4B018ME10
4B018ME14
4B018MF01
4B018MF06
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA04
4C086EA11
4C086GA17
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA16
4C088AB12
4C088AC02
4C088AC05
4C088BA08
4C088BA10
4C088BA14
4C088BA32
4C088CA06
4C088CA09
4C088NA14
4C088ZA16
(57)【要約】
【課題】本発明は、安全であり毎日の服用も可能で健康食品としての利用もでき、アルツハイマー型認知症を抑制することができるアルツハイマー型認知症抑制剤とその製造方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明に係るアルツハイマー型認知症抑制剤は、胡麻（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）の地上部、又はその抽出物を有効成分として含むことを特徴とする。本発明に係るアルツハイマー型認知症抑制剤の製造方法は、胡麻（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）の種子を播種し、生育させる工程、及び、生育した胡麻の地上部を採取する工程を含むことを特徴とする。
【選択図】なし
【解決手段】本発明に係るアルツハイマー型認知症抑制剤は、胡麻（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）の地上部、又はその抽出物を有効成分として含むことを特徴とする。本発明に係るアルツハイマー型認知症抑制剤の製造方法は、胡麻（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）の種子を播種し、生育させる工程、及び、生育した胡麻の地上部を採取する工程を含むことを特徴とする。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
胡麻（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）の地上部、又はその抽出物を有効成分として含むことを特徴とするアルツハイマー型認知症抑制剤。
【請求項2】
前記胡麻地上部が葉である請求項１に記載のアルツハイマー型認知症抑制剤。
【請求項3】
前記地上部またはその抽出物がペダリインを含む請求項１に記載のアルツハイマー型認知症抑制剤。
【請求項4】
アルツハイマー型認知症抑制剤を製造するための方法であって、
胡麻（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）の種子を播種し、生育させる工程、及び、
生育した胡麻の地上部を採取する工程を含むことを特徴とする方法。
胡麻（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）の種子を播種し、生育させる工程、及び、
生育した胡麻の地上部を採取する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項5】
１以上の蕾が見られ且つ種子が熟するまでに採取する請求項４に記載の方法。
【請求項6】
更に、胡麻の地上部から溶媒を使って有効成分を抽出し、抽出溶液を得る工程を含む請求項４に記載の方法。
【請求項7】
前記溶媒としてアルコール系溶媒を用いる請求項６に記載の方法。
【請求項8】
更に、アルコール系溶媒抽出物を、炭化水素溶媒で抽出し、抽出残渣を得る工程を含む請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、安全であり毎日の服用も可能で健康食品としての利用もでき、アルツハイマー型認知症を抑制することができるアルツハイマー型認知症抑制剤とその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
厚生労働省発表の“一万人コホート年齢階級別の認知症有病率”をみると、６５－６９歳の認知症有病率は１．５％であるのが、８５－８９歳の認知症有病率は４４．３％にも達している（非特許文献１）。また、非特許文献２に記載の報告にも、同様の傾向が見られる。
【0003】
認知症の中でもアルツハイマー型認知症の患者数は、２０１９年の時点で全世界において５，７００万人であり、２０５０年には１億５０００万人に達すると推定されている。アルツハイマー型認知症は、長年に及ぶアミロイドβ（以下、「Ａβ」と略記する）の脳内蓄積によって誘発される。よって、Ａβ前駆物質の蓄積を早期に排除し、またＡβの凝集を阻害することがアルツハイマー型認知症の抑制に重要であると考えられる。また、Ａβと類似するｈｕｍａｎ ｉｓｌｅｔ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（以下、「ｈＩＡＰＰ」と略記する）がヒト膵臓β細胞にそれぞれ蓄積し、アルツハイマー病やＩＩ型糖尿病の発症に関連するということも言われている（非特許文献２）。
【0004】
上記の通り、アルツハイマー型認知症に対しては、長年に及ぶＡβの脳内蓄積によって誘発されることから、日常的に手軽に、長年に亘って摂取可能で安全性が高く、安価な薬剤が求められている。例えば、特許文献１～５には、Ａβ凝集阻害活性を有する天然物由来抽出物として、ブドウ種子抽出物、ウコン抽出物、ウンカリア・トメントーサ抽出物、緑茶抽出物、及びチリメンアオジソ抽出物がそれぞれ記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開第２００９／１３７８１８号パンフレット
【特許文献2】国際公開第２００７／１０９２１０号パンフレット
【特許文献3】国際公開第２００２／０４２４２９号パンフレット
【特許文献4】国際公開第２００１／０４９３０７号パンフレット
【特許文献5】特許第６７０７２５１号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】厚生労働省，“認知症施策の動向”，［ｏｎｌｉｎｅ］，［令和４年８月２３日検索］，インターネット ＜https://kouseikyoku.mhlw.go.jp/kantoshinetsu/houkatsu/000237803.pdf＞
【非特許文献2】篠原もえ子，ファルマシア，２０２２年，５８巻，８号，ｐ．７６８－７７１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
上述したように、植物由来のＡβ凝集阻害物質は知られている。しかし、日本で実際に上市されているアルツハイマー型認知症はドネペジル塩酸塩錠のみであるが、ドネペジル塩酸塩錠は重大な副作用を示し得ることに加え、アルツハイマー型認知症を根本的に治療できるものではなく、症状の進行を抑制できるものでしかない。よって、Ａβ前駆物質の生成やＡβの凝集を抑制するなど、アルツハイマー型認知症を根本的に治療できるものであり、且つ安全な薬剤が求められている。
そこで、本発明は、安全であり毎日の服用も可能で健康食品としての利用もでき、アルツハイマー型認知症を抑制することができるアルツハイマー型認知症抑制剤とその製造方法を提供することを目的とする。
そこで、本発明は、安全であり毎日の服用も可能で健康食品としての利用もでき、アルツハイマー型認知症を抑制することができるアルツハイマー型認知症抑制剤とその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、食用にも付され安全な胡麻の地上部に、アルツハイマー型認知症を根本的に抑制できる成分が含まれていることを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。
以下、本発明を示す。
【0009】
［１］ 胡麻（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）の地上部、又はその抽出物を有効成分として含むことを特徴とするアルツハイマー型認知症抑制剤。
［２］ 前記胡麻地上部が葉である前記［１］に記載のアルツハイマー型認知症抑制剤。
［３］ 前記地上部またはその抽出物がペダリインを含む前記［１］または［２］に記載のアルツハイマー型認知症抑制剤。
［４］ アルツハイマー型認知症抑制剤を製造するための方法であって、
胡麻（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）の種子を播種し、生育させる工程、及び、
生育した胡麻の地上部を採する工程を含むことを特徴とする方法。
［５］ １以上の蕾が見られ且つ種子が熟するまでに採取する前記［４］に記載の方法。
［６］ 更に、胡麻の地上部から溶媒を使って有効成分を抽出し、抽出溶液を得る工程を含む前記［４］または［５］に記載の方法。
［７］ 前記溶媒としてアルコール系溶媒を用いる前記［６］に記載の方法。
［８］ 更に、アルコール系溶媒抽出物を、炭化水素溶媒で抽出し、抽出残渣を得る工程を含む前記［７］に記載の方法。
［２］ 前記胡麻地上部が葉である前記［１］に記載のアルツハイマー型認知症抑制剤。
［３］ 前記地上部またはその抽出物がペダリインを含む前記［１］または［２］に記載のアルツハイマー型認知症抑制剤。
［４］ アルツハイマー型認知症抑制剤を製造するための方法であって、
胡麻（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）の種子を播種し、生育させる工程、及び、
生育した胡麻の地上部を採する工程を含むことを特徴とする方法。
［５］ １以上の蕾が見られ且つ種子が熟するまでに採取する前記［４］に記載の方法。
［６］ 更に、胡麻の地上部から溶媒を使って有効成分を抽出し、抽出溶液を得る工程を含む前記［４］または［５］に記載の方法。
［７］ 前記溶媒としてアルコール系溶媒を用いる前記［６］に記載の方法。
［８］ 更に、アルコール系溶媒抽出物を、炭化水素溶媒で抽出し、抽出残渣を得る工程を含む前記［７］に記載の方法。
【発明の効果】
【0010】
本発明に係るアルツハイマー型認知症の有効成分は、食用にも付される胡麻の地上部に含まれるものであるので安全であり、毎日の恒常的な摂取も可能である。また、本発明に係るアルツハイマー型認知症は、Ａβ前駆物質を低減したり、Ａβの凝集を阻害する等、アルツハイマー型認知症の原因を直接除去してアルツハイマー型認知症を根本的に予防および／または治療できると考えられる。従って本発明は、アルツハイマー型認知症の予防薬や治療薬として、産業上非常に優れている。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明に係るアルツハイマー型認知症抑制剤は、胡麻（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）の地上部、又はその抽出物を有効成分として含む。本開示において有効成分とは、本発明に係るアルツハイマー型認知症抑制剤に含まれる成分のうちアルツハイマー型認知症の抑制作用を有する成分をいい、換言すれば、本発明に係るアルツハイマー型認知症抑制剤は、アルツハイマー型認知症の抑制効果が発揮される量の胡麻の地上部又はその抽出物を含む。具体的には、特に制限されないが、例えば、本発明に係るアルツハイマー型認知症抑制剤における胡麻の地上部又はその抽出物の割合を１０質量％以上、１００質量％以下とすることができる。なお、本発明において抑制には、アルツハイマー型認知症の発症を抑制する予防の概念と、アルツハイマー型認知症の症状を緩和および／または寛容する治療の概念が含まれるものとする。
【0013】
胡麻（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）は、ゴマ科ゴマ属の一年草であり、大きさや色調など種子の形状の違いに基づくと約３０００種あると言われる。胡麻の種類は特に制限されないが、本発明者により、胡麻黒八（登録商標）の葉の優れたアルツハイマー型認知症抑制作用が実験的に確認されている。
【0014】
胡麻黒八（登録商標）は、Ｓａ Ｍｏｎｇ Ｎａｎ Ｎｅｔ Ｔｈａｅの名でミャンマーの特定地域において古くから栽培されているものであり、小粒の黒胡麻であり、その種子は、品種登録されているリグナン胡麻（登録番号：１９６９７，出願番号：２０７９０，農林水産植物の種類：Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ Ｌ．，品種名称：ＩＴＣＦＡ２００１；登録番号：１９６９８，出願番号：２０７９１，農林水産植物の種類：Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ Ｌ．，品種名称：ＩＴＣＦＡ２００２）の種子と重量や外観が非常によく似ているが、本発明者は、ゲノム解析の結果、両者ゲノム間には大きな配列の挿入や欠失が見られるなど、進化的に異なる品種であることが明らかにした。胡麻黒八とリグナン胡麻のゲノムの差異は、ＰＣＲにより検証することが可能である。
【0015】
地上部とは、胡麻種子を播種して育成したとき、地中に無く、地上から見られる部分をいうものとする。胡麻の地上部は、育成した胡麻から地下部を切断除去することにより得ることができる。
【0016】
胡麻の地上部は、例えば、本葉が２枚以上見られる株のものであることが好ましい。また、胡麻の地上部は、完熟種子が結実するまで、例えば未熟果を有するものを採取することが好ましい。また、草丈が５０ｃｍ以上のものや、１以上の蕾を有するもので開花前のもの、１以上の開花が見られるまでのもの等も採取することができる。播種から採取までの期間は適宜調整すればよいが、例えば、１ヵ月以上とすることができ、２ヵ月以上または２．５ヵ月以上が好ましく、また、５ヵ月以下とすることができ、４ヵ月以下が好ましく、３．５ヵ月以下がより好ましい。
【0017】
胡麻の地上部としては、葉が好ましい。葉としては、葉柄を含むものであっても含まないものであってもよい。葉柄を含まない葉の方が、重量あたりの有効成分の含有量は多いが、葉柄を含む葉は、採取の手間がよりかからないという利点がある。
【0018】
胡麻の地上部は、そのまま用いてもよいが、例えば、水洗、乾燥、粉砕、加水分解および抽出から選択される１以上の処理を行ってもよい。加水分解処理としては、例えば、２５±５℃、湿度９０％以上で、１時間以上、５時間以下程度処理したり、ドラム中で回転させた後に加熱して加水分解を停止させることが挙げられる。加水分解処理により、苦味を低減できる可能性がある。
【0019】
本発明に係るアルツハイマー型認知症抑制剤の有効成分の形態は特に制限されず、例えば、液状、ペースト状、及び粉末状が挙げられる。粉末には、粗粉末、マイクロパウダー、及びナノマイクロパウダーが含まれる。
【0020】
本発明に係るアルツハイマー型認知症抑制剤の形態は特に制限されないが、例えば、固形状、ゲル状、及び液状が挙げられる。より具体的には、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、トローチ剤、及び液剤などが挙げられる。
【0021】
本発明に係るアルツハイマー型認知症抑制剤は、その剤形に応じて、有効成分以外の添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、乳化剤、安定剤、吸収促進剤、分化剤、及び防腐剤が挙げられ、その配合量は特に制限されず、適宜調整すればよい。
【0022】
本発明に係るアルツハイマー型認知症抑制剤は、例えば、以下の工程を含む方法により製造することができる。
【0023】
１．胡麻の播種生育工程
本工程では、胡麻の種子を播種し、生育させる。本工程は、胡麻の通常の育て方に準じて行えばよい。例えば、胡麻の種子は、最高気温が２０℃を超えるようになってから、日本では５月中旬から６月中旬に播けばよい。具体的には、深さ１ｃｍ程の穴を開け、穴１つ当たり５～６粒の種を入れた後、土を被せて水を十分に与える。本葉が１～２枚のところで、１ヶ所に３本くらいになるよう、生育の悪いものを間引き、本葉が３～４枚のときに２本、本葉が５～６枚のときに１本になるよう間引く。
本工程では、胡麻の種子を播種し、生育させる。本工程は、胡麻の通常の育て方に準じて行えばよい。例えば、胡麻の種子は、最高気温が２０℃を超えるようになってから、日本では５月中旬から６月中旬に播けばよい。具体的には、深さ１ｃｍ程の穴を開け、穴１つ当たり５～６粒の種を入れた後、土を被せて水を十分に与える。本葉が１～２枚のところで、１ヶ所に３本くらいになるよう、生育の悪いものを間引き、本葉が３～４枚のときに２本、本葉が５～６枚のときに１本になるよう間引く。
【0024】
２．胡麻の地上部の採取工程
本工程では、生育した胡麻の地上部を採取する。具体的には、生育した胡麻の地下部から地上部を分離すればよい。採取の時期や後処理などは、上述した通りである。
本工程では、生育した胡麻の地上部を採取する。具体的には、生育した胡麻の地下部から地上部を分離すればよい。採取の時期や後処理などは、上述した通りである。
【0025】
３．抽出工程
本工程では、胡麻の地上部から溶媒を使って有効成分を抽出する。本工程は、実施しても実施しなくてもよいが、抽出により、有効成分のアルツハイマー型認知症抑制作用をより一層高めることができる可能性がある。
本工程では、胡麻の地上部から溶媒を使って有効成分を抽出する。本工程は、実施しても実施しなくてもよいが、抽出により、有効成分のアルツハイマー型認知症抑制作用をより一層高めることができる可能性がある。
【0026】
本工程で抽出に用いる溶媒は、特に制限されず適宜選択すればよいが、安全性の観点から、例えば水系溶媒が挙げられる。水系溶媒は、水、または水と水溶性有機溶媒との混合溶媒をいう。混合溶媒における水溶性有機溶媒の割合は、適宜調整すればよいが、例えば、２０質量％以上とすることができ、３０質量％以上または４０質量％以上が好ましく、５０質量％以上がより好ましい。当該割合の上限は特に制限されないが、例えば、当該割合としては９８質量％以下または９５質量％以下が好ましく、９０質量％以下または８０質量％以下がより好ましい。水溶性有機溶媒としては、例えば、メタノールやエタノール等のアルコール系溶媒；テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒；ジメチルホルムアミドやジメチルアセトアミド等のアミド系溶媒：ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒を挙げることができる。人体に害が比較的少ないという観点から、水溶性有機溶媒としてはエタノールが好適である。また、水の種類は特に制限されず、精製水、蒸留水、純水、水道水などを特に制限なく使用することができる。
【0027】
本工程における抽出条件は特に制限されず、常法を用いることができる。例えば、胡麻の地上部１ｇあたり５ｍＬ以上、１００ｍＬ以下程度の溶媒を加え、３０分間以上、１０時間以下程度抽出すればよい。抽出温度も特に制限されず、常温で抽出してもよいし、溶媒の沸点以下で抽出してもよいし、加熱還流してもよい。例えば溶媒として水を使う場合には、６０℃以上、１００℃以下で加熱してもよい。
【0028】
抽出後は、一般的な後処理を行ってもよい。例えば、抽出後の混合物から濾過や遠心分離により固形分を除去してもよい。更に、得られた溶液を、蒸留したり、濃縮したり、乾燥してもよい。乾燥方法としては、例えば、加熱乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥、スプレードライが挙げられる。また、クロマトグラフィ等により、有効成分を更に精製してもよい。
【0029】
本発明に係るアルツハイマー型認知症抑制剤の使用量は、予防的使用であるか治療的使用であるか、患者の重篤度、その他の状態、年齢、性別などに応じて適宜調整すべきであり、特に制限されない。例えば、本発明に係るアルツハイマー型認知症抑制剤は、服用する場合には固形分換算で１日あたり１０ｍｇ以上、外用の場合には１００ｍｇ以上用いることができる。本発明に係るアルツハイマー型認知症抑制剤は非常に安全なものであることから、使用量の上限は特に制限されないが、例えば、服用の場合には固形分換算で１日あたり２ｇ以下、外用の場合には５ｇ以下とすることができる。また、１日あたりの使用回数は、１回以上、５回以下程度とすることができる。
【0030】
本発明に係るアルツハイマー型認知症抑制剤は、ヒトに限らず、ヒト以外の動物にも投与可能である。投与対象動物としては、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ラマなどの家畜；競走馬などの競技動物；イヌ、ネコなどの愛玩動物；マウス、ラット、モルモット、ウサギなどの実験動物；ニワトリ、アヒル、七面鳥、駝鳥などの家禽；養殖魚などの魚介類などが挙げられる。
【0031】
本発明に係るアルツハイマー型認知症抑制剤は、極めて優れるＡβ凝集抑制効果を有する。具体的には、Ａβ前駆物質の低減、延いてはＡβ凝集体の生成抑制、遺伝子発現の正常化といった作用を示す。よって、本発明に係るアルツハイマー型認知症抑制剤は、アルツハイマー型認知症の予防薬および／または治療薬として有用である。
【実施例0032】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【0033】
実施例１： ＳＳａエキス粉末の製造
胡麻黒八（登録商標）の種子を２０１９年４月に播種し、約３ヵ月後、蕾が見られる頃の葉を採取し、６０℃で１２時間乾燥した。乾燥した葉（１００ｇ）を６０％エタノール水（１Ｌ）に加え、よく振り混ぜて、常温で一晩放置した。次いで、濾過により固形分を除去して抽出液を得た。得られた抽出液を６０℃以下で減圧濃縮することにより、抽出物粉末を得た（収量：１５．５ｇ）。以下、得られた粉末を「ＳＳａエキス粉末」という。
胡麻黒八（登録商標）の種子を２０１９年４月に播種し、約３ヵ月後、蕾が見られる頃の葉を採取し、６０℃で１２時間乾燥した。乾燥した葉（１００ｇ）を６０％エタノール水（１Ｌ）に加え、よく振り混ぜて、常温で一晩放置した。次いで、濾過により固形分を除去して抽出液を得た。得られた抽出液を６０℃以下で減圧濃縮することにより、抽出物粉末を得た（収量：１５．５ｇ）。以下、得られた粉末を「ＳＳａエキス粉末」という。
【0034】
実施例２： 動物実験
７週齢の雄性正常老化マウスＳＡＭ－Ｒと雄性老化促進モデルマウスＳＡＭ－Ｐ８（それぞれ日本エスエルシー社から入手）を、それぞれ１０匹の２群ずつに任意に分け、１週間馴化飼育した。次いで、ＳＡＭ－Ｒ ＳＳａエキス粉末投与群とＳＡＭ－Ｐ８ ＳＳａエキス粉末投与群には、ＳＳａエキス粉末５００ｍｇ／ｋｇを７日間にわたり経口投与した。それ以外、各群マウスには、通常飼料と水を自由摂取させた。その後、３０日間飼育した後、麻酔により安楽死させ、全脳を摘出し、ゲノム解析まで－８０℃で保管した。
脂質や組織などの溶解試薬（「ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ」ＱＩＡＧＥＮ社製）を脳試料（１００～１５０ｍｇ）に加え、ホモジナイザー（「ポリトロン」セントラル科学貿易社製）を使って２０～４０秒間粉砕処理した後、室温で５分間放置することにより脳試料を溶解した。次いで、クロロホルム（０．２ｍＬ）を加え、１５秒間よく攪拌した後、２～３分間静置した。４℃、１３０００ｇで１５分遠心分離したところ、水層、中間層、フェノール・クロロホルム層に分離した。ＲＮＡは水層に含まれるので、水層を別のチューブに回収し、イソプロピルアルコール（０．５ｍＬ）を加えて攪拌した後、室温で１０分間静置した。更に、４℃、１３０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を除去し、沈殿に７０％エタノール（１ｍＬ）を加えてよく攪拌後、４℃、１３０００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。アルコール分を揮発させる為に５～１０分間風乾した。純水（５０μＬ）を加え、ＲＮＡシークエンスまで－８０℃で保存した。
ＲＮＡサンプル調製キット（「ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｍＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ」Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用い、得られた総ＲＮＡから特異的なｍＲＮＡを濃縮し、これらのｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成してシークエンス用ライブラリーを作成した。次に、ｃＤＮＡライブラリーを、次世代シークエンサー（「ＮｏＶａＳｅｑ６０００」Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）にて、１００ｂｐ、Ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ，１サンプル４０００万リードでシークエンスした。
解析結果を比較する為にＳＴＡＲ＞ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ＞ｃｕｆｆｄｉｆ解析を行った。用いたマウスゲノムデータベースはＧＲＣｍ３８．９２で、遺伝子レベルおよびその構成要素であるエキソンレベルの遺伝子発現量の解析を行った。具体的には、ＳＴＡＲと呼ばれるマッピングツールを用い、参照マウス配列（ＧＲＣｍ３８．９２）にマッピングを行い、更にＣｕｆｆｌｉｎｋｓを用いてアセンブルを行い、このマッピングされたリードを遺伝子単位およびエキソン単位で数えた。更に、ｃｕｆｆｄｉｆｆを用いて、遺伝子発現量を定量し、２群間で発現量が変動している遺伝子／エキソン部位を特定した。
次にＰＣＡ（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ：主成分分析）を行い、ゲノム発現量の差を主成分軸（ＰＣ１軸とＰＣ２軸）にプロットした。その場合、ＰＣ１軸やＰＣ２軸の下に示す寄与率（アイゲンベクター）が重要で、寄与率の高い軸を基準として、２群間の比較ができる。
７週齢の雄性正常老化マウスＳＡＭ－Ｒと雄性老化促進モデルマウスＳＡＭ－Ｐ８（それぞれ日本エスエルシー社から入手）を、それぞれ１０匹の２群ずつに任意に分け、１週間馴化飼育した。次いで、ＳＡＭ－Ｒ ＳＳａエキス粉末投与群とＳＡＭ－Ｐ８ ＳＳａエキス粉末投与群には、ＳＳａエキス粉末５００ｍｇ／ｋｇを７日間にわたり経口投与した。それ以外、各群マウスには、通常飼料と水を自由摂取させた。その後、３０日間飼育した後、麻酔により安楽死させ、全脳を摘出し、ゲノム解析まで－８０℃で保管した。
脂質や組織などの溶解試薬（「ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ」ＱＩＡＧＥＮ社製）を脳試料（１００～１５０ｍｇ）に加え、ホモジナイザー（「ポリトロン」セントラル科学貿易社製）を使って２０～４０秒間粉砕処理した後、室温で５分間放置することにより脳試料を溶解した。次いで、クロロホルム（０．２ｍＬ）を加え、１５秒間よく攪拌した後、２～３分間静置した。４℃、１３０００ｇで１５分遠心分離したところ、水層、中間層、フェノール・クロロホルム層に分離した。ＲＮＡは水層に含まれるので、水層を別のチューブに回収し、イソプロピルアルコール（０．５ｍＬ）を加えて攪拌した後、室温で１０分間静置した。更に、４℃、１３０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を除去し、沈殿に７０％エタノール（１ｍＬ）を加えてよく攪拌後、４℃、１３０００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。アルコール分を揮発させる為に５～１０分間風乾した。純水（５０μＬ）を加え、ＲＮＡシークエンスまで－８０℃で保存した。
ＲＮＡサンプル調製キット（「ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｍＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ」Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用い、得られた総ＲＮＡから特異的なｍＲＮＡを濃縮し、これらのｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成してシークエンス用ライブラリーを作成した。次に、ｃＤＮＡライブラリーを、次世代シークエンサー（「ＮｏＶａＳｅｑ６０００」Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）にて、１００ｂｐ、Ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ，１サンプル４０００万リードでシークエンスした。
解析結果を比較する為にＳＴＡＲ＞ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ＞ｃｕｆｆｄｉｆ解析を行った。用いたマウスゲノムデータベースはＧＲＣｍ３８．９２で、遺伝子レベルおよびその構成要素であるエキソンレベルの遺伝子発現量の解析を行った。具体的には、ＳＴＡＲと呼ばれるマッピングツールを用い、参照マウス配列（ＧＲＣｍ３８．９２）にマッピングを行い、更にＣｕｆｆｌｉｎｋｓを用いてアセンブルを行い、このマッピングされたリードを遺伝子単位およびエキソン単位で数えた。更に、ｃｕｆｆｄｉｆｆを用いて、遺伝子発現量を定量し、２群間で発現量が変動している遺伝子／エキソン部位を特定した。
次にＰＣＡ（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ：主成分分析）を行い、ゲノム発現量の差を主成分軸（ＰＣ１軸とＰＣ２軸）にプロットした。その場合、ＰＣ１軸やＰＣ２軸の下に示す寄与率（アイゲンベクター）が重要で、寄与率の高い軸を基準として、２群間の比較ができる。
【0035】
図１に、正常老化マウスＳＡＭ－Ｒと老化促進モデルマウスＳＡＭ－Ｐ８の遺伝子発現量の差異を示すＰＣＡ図を示す。
図１の通り、寄与率（アイゲンベクター）がより大きな横軸（ＰＣ１軸）においても、正常老化マウスＳＡＭ－Ｒと老化促進モデルマウスＳＡＭ－Ｐ８とでは、遺伝子発現に大きな差異があることが分かる。
図１の通り、寄与率（アイゲンベクター）がより大きな横軸（ＰＣ１軸）においても、正常老化マウスＳＡＭ－Ｒと老化促進モデルマウスＳＡＭ－Ｐ８とでは、遺伝子発現に大きな差異があることが分かる。
【0036】
図２に、正常老化マウスＳＡＭ－Ｒと、ＳＳａエキス粉末を７日間経口投与した老化促進モデルマウスＳＡＭ－Ｐ８のゲノム発現の差異を示すＰＣＡ図を示す。
図２の通り、寄与率（アイゲンベクター）がより大きな横軸（ＰＣ１軸）において、老化促進モデルマウスＳＡＭ－Ｐ８にＳＳａエキス粉末を投与した場合には、ゲノム発現が正常老化マウスＳＡＭ－Ｒに近くなっていることが分かった。
図２の通り、寄与率（アイゲンベクター）がより大きな横軸（ＰＣ１軸）において、老化促進モデルマウスＳＡＭ－Ｐ８にＳＳａエキス粉末を投与した場合には、ゲノム発現が正常老化マウスＳＡＭ－Ｒに近くなっていることが分かった。
【0037】
実施例３： 動物実験
７週齢の雄性老化促進モデルマウスＳＡＭ－Ｐ８（日本エスエルシー社から入手）を、任意に１０匹ずつ、対照群、市販のアルツハイマー病薬であるドネペジル（商品名：アリセプト，エーザイ社製）投与群、Ａβ凝集阻害作用が知られているアクティオサイド（南京春秋生物社製）投与群、及びＳＳａエキス粉末投与群の４群に分けた。
それぞれの群に、ドネペジルを５ｍｇ／ｋｇ、アクティオサイドを１００ｍｇ／ｋｇ、ＳＳａエキス粉末を５００ｍｇ／ｋｇ、７日間連続経口投与した。それ以外、各群マウスには、通常飼料と水を自由摂取させた。その後、３０日間飼育した後、麻酔により安楽死させ、全脳を摘出し、ゲノム解析まで－８０℃で保管した。次いで、実施例２と同様にして、遺伝子レベルとエキソンレベルでのＰＣＡ分析を行った。
図３～５に、それぞれ、対照群と、ドネペジル投与群、アクティオサイド投与群、及びＳＳａエキス粉末投与群との間のＰＣＡ分析結果を示す。図３～５において、上段（１）は遺伝子レベルでのＰＣＡ分析結果であり、下段（２）はエキソンレベルでのＰＣＡ分析結果である。
７週齢の雄性老化促進モデルマウスＳＡＭ－Ｐ８（日本エスエルシー社から入手）を、任意に１０匹ずつ、対照群、市販のアルツハイマー病薬であるドネペジル（商品名：アリセプト，エーザイ社製）投与群、Ａβ凝集阻害作用が知られているアクティオサイド（南京春秋生物社製）投与群、及びＳＳａエキス粉末投与群の４群に分けた。
それぞれの群に、ドネペジルを５ｍｇ／ｋｇ、アクティオサイドを１００ｍｇ／ｋｇ、ＳＳａエキス粉末を５００ｍｇ／ｋｇ、７日間連続経口投与した。それ以外、各群マウスには、通常飼料と水を自由摂取させた。その後、３０日間飼育した後、麻酔により安楽死させ、全脳を摘出し、ゲノム解析まで－８０℃で保管した。次いで、実施例２と同様にして、遺伝子レベルとエキソンレベルでのＰＣＡ分析を行った。
図３～５に、それぞれ、対照群と、ドネペジル投与群、アクティオサイド投与群、及びＳＳａエキス粉末投与群との間のＰＣＡ分析結果を示す。図３～５において、上段（１）は遺伝子レベルでのＰＣＡ分析結果であり、下段（２）はエキソンレベルでのＰＣＡ分析結果である。
【0038】
図３と図４の通り、寄与率（アイゲンベクター）がより大きな横軸（ＰＣ１軸）において、対照群とドネペジル投与群およびアクティオサイド投与群との間の発現パターンに大きな差は認められなかった。
一方、図５の通り、対照群とＳＳａエキス粉末投与群との間には、寄与率（アイゲンベクター）がより大きな横軸（ＰＣ１軸）において、発現パターンに有意な差が認められた。また、その発現パターンは、図２に示す正常老化マウスの発現パターンに近いものであった。
即ち、ドネペジルやアクティオサイドは、おそらくＡβの凝集や認知症の発症の後に、Ａβの凝集を軽減したり症状を緩和するものであるのに対して、本発明に係るＳＳａエキス粉末から何らかの成分が吸収され、脳内ゲノム発現に何らかの影響を与え、その発現パターンを正常にしている可能性がある。
一方、図５の通り、対照群とＳＳａエキス粉末投与群との間には、寄与率（アイゲンベクター）がより大きな横軸（ＰＣ１軸）において、発現パターンに有意な差が認められた。また、その発現パターンは、図２に示す正常老化マウスの発現パターンに近いものであった。
即ち、ドネペジルやアクティオサイドは、おそらくＡβの凝集や認知症の発症の後に、Ａβの凝集を軽減したり症状を緩和するものであるのに対して、本発明に係るＳＳａエキス粉末から何らかの成分が吸収され、脳内ゲノム発現に何らかの影響を与え、その発現パターンを正常にしている可能性がある。
【0039】
実施例４： 臨床実験
ＳＳａの血漿中アミロイドβ前駆物質の低減作用に関する単施設プラセボ対照ランダム化単盲検並行群間比較試験を、倫理委員会承認の下で、以下の通り行った。
外観上健常な６５歳以上の高齢者１２名（平均年齢：６８．７５歳）を、男女３名ずつ、プラセボ群としてモロヘイヤ粉末投与群と、ＳＳａエキス粉末投与群とに分けた。なお、実施例３で、ＳＳａエキス粉末は、５００ｍ／ｋｇの投与で老化促進モデルマウスＳＡＭ－Ｐ８の脳内ゲノム発現に有用な作用を示したことから、ヒトに対しては３～４ｇ／日の摂取が必要と考えた。
ＳＳａエキス粉末投与群には、ＳＳａエキス粉末を１回１．５ｇ、朝夕の１日２回、２ヶ月間にわたり投与し、プラセボ群には、モロヘイヤ粉末を１回１．５ｇ、朝夕の１日２回、２ヶ月間にわたり投与した。
試験開始前の試験開始日の午前中と、最終投与終了から４～５時間経過後の２回、採血し、免疫沈降法と質量分析を組み合わせたＩＰ－ＭＳ（特許第６４１０８１０号公報；Ａｋｉｎｏｒｉ Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５５４，２４９－２５４，２０１８）によって、血中のアミロイドβ（Ａβ）前駆物質の量を測定した。具体的には、採血した血液をＥＤＴＡで処理した後、３，０００ｒｐｍで遠心分離し、分離した血漿を－７７～－７９℃で保管し、アミロイドβ前駆物質の測定に供した。アミロイドβ前駆物質蓄積量を表すバイオマーカー指数を表１に示す。
ＳＳａの血漿中アミロイドβ前駆物質の低減作用に関する単施設プラセボ対照ランダム化単盲検並行群間比較試験を、倫理委員会承認の下で、以下の通り行った。
外観上健常な６５歳以上の高齢者１２名（平均年齢：６８．７５歳）を、男女３名ずつ、プラセボ群としてモロヘイヤ粉末投与群と、ＳＳａエキス粉末投与群とに分けた。なお、実施例３で、ＳＳａエキス粉末は、５００ｍ／ｋｇの投与で老化促進モデルマウスＳＡＭ－Ｐ８の脳内ゲノム発現に有用な作用を示したことから、ヒトに対しては３～４ｇ／日の摂取が必要と考えた。
ＳＳａエキス粉末投与群には、ＳＳａエキス粉末を１回１．５ｇ、朝夕の１日２回、２ヶ月間にわたり投与し、プラセボ群には、モロヘイヤ粉末を１回１．５ｇ、朝夕の１日２回、２ヶ月間にわたり投与した。
試験開始前の試験開始日の午前中と、最終投与終了から４～５時間経過後の２回、採血し、免疫沈降法と質量分析を組み合わせたＩＰ－ＭＳ（特許第６４１０８１０号公報；Ａｋｉｎｏｒｉ Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５５４，２４９－２５４，２０１８）によって、血中のアミロイドβ（Ａβ）前駆物質の量を測定した。具体的には、採血した血液をＥＤＴＡで処理した後、３，０００ｒｐｍで遠心分離し、分離した血漿を－７７～－７９℃で保管し、アミロイドβ前駆物質の測定に供した。アミロイドβ前駆物質蓄積量を表すバイオマーカー指数を表１に示す。
【0040】
【表1】
【0041】
表１に示される結果の通り、ＳＳａエキス粉末投与群およびプラセボ群共に、試料摂取前のバイオマーカー指数が１以上の被験者は２／６と３３．３％を占めた。
「ＳＳａエキス粉末投与群 摂取前」と「ＳＳａエキス粉末投与群 摂取後」のバイオマーカー値の差の平均値は－１．２０７であり、「プラセボ群 摂取前」と「プラセボ群 摂取後」のバイオマーカー値の差の平均値は－０．４９２５であった。ｔ検定によれば、０．０５＜ｐ＜０．１の危険率で群間のアミロイドβ前駆物質量の差には有意傾向があった。即ち、ＳＳａエキス粉末の投与により、プラセボ群に比して、血中のアミロイドβ前駆物質が有意に低減されたことが明らかとなった。
「ＳＳａエキス粉末投与群 摂取前」と「ＳＳａエキス粉末投与群 摂取後」のバイオマーカー値の差の平均値は－１．２０７であり、「プラセボ群 摂取前」と「プラセボ群 摂取後」のバイオマーカー値の差の平均値は－０．４９２５であった。ｔ検定によれば、０．０５＜ｐ＜０．１の危険率で群間のアミロイドβ前駆物質量の差には有意傾向があった。即ち、ＳＳａエキス粉末の投与により、プラセボ群に比して、血中のアミロイドβ前駆物質が有意に低減されたことが明らかとなった。
【0042】
実施例５： 成分分析
（１）分画とＡβ凝集阻害活性
２０１９年京都の花脊産乾燥ＳＳａ葉（５００ｇ）を粗切りして、室温でｎ－ヘキサン（１Ｌ）に２時間浸漬し、濾過により固形分を分離した。ｎ－ヘキサンへの浸漬と固形分の分離を繰り返した。得られた濾液をｎ－ヘキサン分画とする。その後、分離した固形分に８０％エタノール水（１Ｌ）を加え、室温で時々かき混ぜながら、２時間浸漬し、濾過により固形分を分離した。８０％エタノール水への浸漬と固形分の分離を繰り返した。得られた濾液を１５０ｍＬまで減圧濃縮した。
得られた濃縮８０％エタノールＳＳａエキス（１５０ｍＬ）を吸着カラム（「ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ－２０」三菱ケミカル社製）に付し、メタノールで溶出することにより、クロロフィルを除去した。メタノール溶出液を減圧濃縮し、残渣に酢酸エチルを加え、濾過し、濾液を減圧濃縮することより酢酸エチル分画を得た。ｎ－ブタノール液と水を用い、同様にしてｎ－ブタノール分画と水分画を得た。各分画を減圧濃縮した。
以下の通り、Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ－Ｔを使って、各分画のＡβ凝集阻害活性を試験した。ヒト由来Ａβ（「Ｈｕｍａｎ，１－４２」Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）を０．１％アンモニア水で２５０μＭの濃度となるよう溶解した。リン酸塩緩衝液（０．０５Ｍリン酸ナトリウム＋０．１Ｍ塩化ナトリウム，ｐＨ７．４）（以下、「ＰＢＳ」と略記）に、終濃度が０．０１ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、及び０．１ｇ／Ｌとなる様に各分画の各検体を加えた。そこに終濃度２５μＭとなるようＡβ溶液を加え、３７℃で反応させた。反応開始後、０、４、８、及び２４時間目の反応液を一部採取して、蛍光測定用９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（「Ｎｕｎｃフルオロヌンクプレート」Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）の各ｗｅｌｌに２．５μＬ分注した。その後、各ｗｅｌｌに５０ｍＭグリシン－水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解した１ｍＭ Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ－Ｔ溶液（２５０μＬ）を加えた。Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ－ＴがＡβ線維のβシート構造を標識した時に発する蛍光強度を測定した。蛍光強度はマイクロプレートリーダー（「Ｗａｌｌａｃ １４２０ ＡＲＶＯ ＭＸ」Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：４２０ｎｍ，Ｅｍｉｓｓｉｏｎ：４８５ｎｍの波長条件で測定した。２４時間後の蛍光強度をもとにして、Ａβの蛍光強度を１００として各検体添加量０．０１、０．０５、及び０．１ｇ／Ｌの阻害率から、統計解析ソフトフェアＰｒｉＰｒｏｂｉｔを用いてＩＣ50値を示した。結果を表２に示す。
（１）分画とＡβ凝集阻害活性
２０１９年京都の花脊産乾燥ＳＳａ葉（５００ｇ）を粗切りして、室温でｎ－ヘキサン（１Ｌ）に２時間浸漬し、濾過により固形分を分離した。ｎ－ヘキサンへの浸漬と固形分の分離を繰り返した。得られた濾液をｎ－ヘキサン分画とする。その後、分離した固形分に８０％エタノール水（１Ｌ）を加え、室温で時々かき混ぜながら、２時間浸漬し、濾過により固形分を分離した。８０％エタノール水への浸漬と固形分の分離を繰り返した。得られた濾液を１５０ｍＬまで減圧濃縮した。
得られた濃縮８０％エタノールＳＳａエキス（１５０ｍＬ）を吸着カラム（「ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ－２０」三菱ケミカル社製）に付し、メタノールで溶出することにより、クロロフィルを除去した。メタノール溶出液を減圧濃縮し、残渣に酢酸エチルを加え、濾過し、濾液を減圧濃縮することより酢酸エチル分画を得た。ｎ－ブタノール液と水を用い、同様にしてｎ－ブタノール分画と水分画を得た。各分画を減圧濃縮した。
以下の通り、Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ－Ｔを使って、各分画のＡβ凝集阻害活性を試験した。ヒト由来Ａβ（「Ｈｕｍａｎ，１－４２」Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）を０．１％アンモニア水で２５０μＭの濃度となるよう溶解した。リン酸塩緩衝液（０．０５Ｍリン酸ナトリウム＋０．１Ｍ塩化ナトリウム，ｐＨ７．４）（以下、「ＰＢＳ」と略記）に、終濃度が０．０１ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、及び０．１ｇ／Ｌとなる様に各分画の各検体を加えた。そこに終濃度２５μＭとなるようＡβ溶液を加え、３７℃で反応させた。反応開始後、０、４、８、及び２４時間目の反応液を一部採取して、蛍光測定用９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（「Ｎｕｎｃフルオロヌンクプレート」Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）の各ｗｅｌｌに２．５μＬ分注した。その後、各ｗｅｌｌに５０ｍＭグリシン－水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解した１ｍＭ Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ－Ｔ溶液（２５０μＬ）を加えた。Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ－ＴがＡβ線維のβシート構造を標識した時に発する蛍光強度を測定した。蛍光強度はマイクロプレートリーダー（「Ｗａｌｌａｃ １４２０ ＡＲＶＯ ＭＸ」Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：４２０ｎｍ，Ｅｍｉｓｓｉｏｎ：４８５ｎｍの波長条件で測定した。２４時間後の蛍光強度をもとにして、Ａβの蛍光強度を１００として各検体添加量０．０１、０．０５、及び０．１ｇ／Ｌの阻害率から、統計解析ソフトフェアＰｒｉＰｒｏｂｉｔを用いてＩＣ50値を示した。結果を表２に示す。
【0043】
【表2】
【0044】
表２に示される結果の通り、Ａβタンパク質の凝集阻害活性はＳＳａのｎ－ブタノール分画に集約されている事が明らかとなった。
【0045】
（２）Ａβ凝集阻害活性成分とｈＩＡＰＰ凝集阻害活性成分
その塊茎部分が御節料理に使われるシソ科植物であるチョロギ等に含まれるアクティオサイドには、Ａβ凝集阻害作用が知られている（特許第６４２４７５７号公報；Ｍａｎａｍｉ Ｋｕｒｉｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７７，１３２９－１３３２，２０１３）。そこで、実施例５（１）と同様にしてフラボノイドであるペダリインとアクティオサイドのＡβ凝集阻害活性を比較した。また、ヒト膵島アミロイドポリペプチド（ｈＩＡＰＰ）はランゲルハンスの膵島におけるアミロイド形成性ペプチド沈着物成分であり、アミロイド前駆体タンパク質に由来し、Ａβと高い配列類似性を有している。そこで、ｈＩＡＰＰ凝集阻害活性についても試験した。具体的には、ＰＢＳ（０．０５Ｍ ＮａＨ2Ｐｏ4，０．１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）に終濃度が１μＭ、１０μＭ、及び１００μＭになる様に各化合物を加え、Ａβの代わりにｈＩＡＰＰ（Ｋａｒｅｂａｙ Ｂｉｏｃｈｅｍ社製）を用いた以外は実施例５（１）と同様にして、ｈＩＡＰＰ凝集阻害活性を測定した。結果を表３に示す。
その塊茎部分が御節料理に使われるシソ科植物であるチョロギ等に含まれるアクティオサイドには、Ａβ凝集阻害作用が知られている（特許第６４２４７５７号公報；Ｍａｎａｍｉ Ｋｕｒｉｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７７，１３２９－１３３２，２０１３）。そこで、実施例５（１）と同様にしてフラボノイドであるペダリインとアクティオサイドのＡβ凝集阻害活性を比較した。また、ヒト膵島アミロイドポリペプチド（ｈＩＡＰＰ）はランゲルハンスの膵島におけるアミロイド形成性ペプチド沈着物成分であり、アミロイド前駆体タンパク質に由来し、Ａβと高い配列類似性を有している。そこで、ｈＩＡＰＰ凝集阻害活性についても試験した。具体的には、ＰＢＳ（０．０５Ｍ ＮａＨ2Ｐｏ4，０．１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）に終濃度が１μＭ、１０μＭ、及び１００μＭになる様に各化合物を加え、Ａβの代わりにｈＩＡＰＰ（Ｋａｒｅｂａｙ Ｂｉｏｃｈｅｍ社製）を用いた以外は実施例５（１）と同様にして、ｈＩＡＰＰ凝集阻害活性を測定した。結果を表３に示す。
【0046】
【表3】
【0047】
表３に示される結果の通り、Ａβ凝集阻害活性が知られているアクティオサイドに比べて、ペダリインはより強いＡβ凝集阻害活性を有することが明らかとなった。また、ｈＩＡＰＰ凝集阻害活性も、アクティオサイドよりペダリインの方が強かった。
【0048】
（３）ＳＳａの好適採集時期の検討
花脊産の胡麻黒八（登録商標）を、Ａ：草丈５０～６０ｃｍの時期、Ｂ：蕾の付き始める時期、又はＣ：未熟果のできる時期に採取し、葉柄を含む葉を乾燥し、微細に粉砕した。各粉砕乾燥葉（０．４ｇ）をメタノール（５００ｍＬ）に加え、時々攪拌しつつ１２時間抽出した。混合物を濾過した後、濾液をロータリーエバポレーターで濃縮乾固した。得られた残渣をメタノール（１ｍＬ）に溶解し、以下の条件のＬＣ／ＭＳで分析した。
ＬＣ条件
カラム： ＯＤＳ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ ｃ１８ １．７・ｍ ２．１×１００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
移動相： Ａ（０．１％ギ酸含有アセトニトリル）：Ｂ（０．１％ギ酸含有Ｈ2Ｏ）＝５：９５ イニシャル → Ａ：Ｂ＝６５：３５ ８ｍｉｎ → Ｂ＝１００ １０ｍｉｎ → Ａ：Ｂ＝５：９５ １５ｍｉｎ
流速： ０．３ｍＬ／ｍｉｎ
ＭＳ条件
ＥＳＩ ＴＯＦ ｍｓ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｏｎ ｍｏｄｅ
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｖｏｌｔａｇｅ： ３．２ ｋＶ
Ｃｏｎｅ ｖｏｌｔａｇｅ： ２０ ｅＶ
Ｓｏｕｒｃｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ： １２０℃
４μＬの各試料を注入し、ペダリインのＭＳイオンを検出し、相対的組成パーセントを求めた。結果を表４に示す。
花脊産の胡麻黒八（登録商標）を、Ａ：草丈５０～６０ｃｍの時期、Ｂ：蕾の付き始める時期、又はＣ：未熟果のできる時期に採取し、葉柄を含む葉を乾燥し、微細に粉砕した。各粉砕乾燥葉（０．４ｇ）をメタノール（５００ｍＬ）に加え、時々攪拌しつつ１２時間抽出した。混合物を濾過した後、濾液をロータリーエバポレーターで濃縮乾固した。得られた残渣をメタノール（１ｍＬ）に溶解し、以下の条件のＬＣ／ＭＳで分析した。
ＬＣ条件
カラム： ＯＤＳ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ ｃ１８ １．７・ｍ ２．１×１００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
移動相： Ａ（０．１％ギ酸含有アセトニトリル）：Ｂ（０．１％ギ酸含有Ｈ2Ｏ）＝５：９５ イニシャル → Ａ：Ｂ＝６５：３５ ８ｍｉｎ → Ｂ＝１００ １０ｍｉｎ → Ａ：Ｂ＝５：９５ １５ｍｉｎ
流速： ０．３ｍＬ／ｍｉｎ
ＭＳ条件
ＥＳＩ ＴＯＦ ｍｓ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｏｎ ｍｏｄｅ
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｖｏｌｔａｇｅ： ３．２ ｋＶ
Ｃｏｎｅ ｖｏｌｔａｇｅ： ２０ ｅＶ
Ｓｏｕｒｃｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ： １２０℃
４μＬの各試料を注入し、ペダリインのＭＳイオンを検出し、相対的組成パーセントを求めた。結果を表４に示す。
【0049】
【表4】
【0050】
表４に示される結果の通り、蕾の付きはじめから未熟果の出来る時期の葉柄を含む葉に、優れたＡβ凝集阻害活性とｈＩＡＰＰ凝集阻害活性を示すペダリインが多く含まれていることがわかった。よって、アルツハイマー型認知症抑制剤のためには、胡麻黒八（登録商標）を蕾が見られる時期から未熟種子の見られる期間に採取することと決定した。
【0051】
実施例６： ゲノム解析
胡麻黒八（登録商標）の種子は、１ｇ中の種子数および色調から、いわゆるリグナン胡麻の種子と非常によく似ている。そこで、両者からＤＮＡを調製し、ゲノム解析を行った。
胡麻ゲノムの塩基数は約２億７０００万塩基であることがわかっており、我々のゲノム解析では、１品種当たり胡麻ゲノムの塩基数の約５５倍の配列データを得たので、任意のゲノム領域を５５回解析したことになる。従って、確率論的には、全てのゲノム領域が網羅されており、解析プログラムにより、読み間違いは補正できていると判断される。
ゲノム解析の結果、胡麻黒八（登録商標）とリグナン胡麻のゲノム間には大きな配列の挿入や欠失が見られるなど、胡麻黒八（登録商標）とリグナン胡麻は進化的に異なる品種であることが明らかとなった。得られた解析データより、胡麻黒八とリグナン胡麻のゲノムの差異は、ＰＣＲにより検証することが可能である。
胡麻黒八（登録商標）の種子は、１ｇ中の種子数および色調から、いわゆるリグナン胡麻の種子と非常によく似ている。そこで、両者からＤＮＡを調製し、ゲノム解析を行った。
胡麻ゲノムの塩基数は約２億７０００万塩基であることがわかっており、我々のゲノム解析では、１品種当たり胡麻ゲノムの塩基数の約５５倍の配列データを得たので、任意のゲノム領域を５５回解析したことになる。従って、確率論的には、全てのゲノム領域が網羅されており、解析プログラムにより、読み間違いは補正できていると判断される。
ゲノム解析の結果、胡麻黒八（登録商標）とリグナン胡麻のゲノム間には大きな配列の挿入や欠失が見られるなど、胡麻黒八（登録商標）とリグナン胡麻は進化的に異なる品種であることが明らかとなった。得られた解析データより、胡麻黒八とリグナン胡麻のゲノムの差異は、ＰＣＲにより検証することが可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】