特開 2024-538 遺伝子特異的空間ローリングサークル増幅およびＮＧＳシーケンシング

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024000538

(43)【公開日】2024-01-05

(54)【発明の名称】遺伝子特異的空間ローリングサークル増幅およびＮＧＳシーケンシング

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20231225BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20231225BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20231225BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20231225BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6869 Z

C12Q1/686 Z

C12Q1/6844 Z

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】10

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023099995

(22)【出願日】2023-06-19

(31)【優先権主張番号】22179807

(32)【優先日】2022-06-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(71)【出願人】

【識別番号】520094891

【氏名又は名称】ミルテニー バイオテック ベー．フェー． ウント コー． カー・ゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｂ．Ｖ． ＆ Ｃｏ． ＫＧ

【住所又は居所原語表記】Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ－Ｅｂｅｒｔ－Ｓｔｒａｓｓｅ ６８， ５１４２９ Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100114890

【弁理士】

【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト

(74)【代理人】

【識別番号】100098501

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 拓

(74)【代理人】

【識別番号】100116403

【弁理士】

【氏名又は名称】前川 純一

(74)【代理人】

【識別番号】100134315

【弁理士】

【氏名又は名称】永島 秀郎

(74)【代理人】

【識別番号】100162880

【弁理士】

【氏名又は名称】上島 類

(72)【発明者】

【氏名】ロバート ピナード

(72)【発明者】

【氏名】細野 正裕

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA13

4B063QQ53

4B063QR08

4B063QR20

4B063QR32

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS24

4B063QS25

4B063QS34

4B063QS39

(57)【要約】      （修正有）

【課題】標的配列の空間位置と配列情報との両方を、高い分解能で同時に取得する方法を提供する。
【解決手段】ａ．ロケータープローブを提供するステップ、ｂ．ＲＮＡアンカー領域を有するロケータープローブをｍ－ＲＮＡ鎖にハイブリダイズするステップ、ｃ．逆転写ｃ－ＤＮＡ鎖を取得するステップ、ｄ．伸張された逆転写ｃ－ＤＮＡ鎖を取得するステップ、ｅ．環状ロケーターをＲＣＡで増殖させ、第１のロロニーを作製するステップ、ｆ．第１のロロニーの空間情報及び配列情報を取得するステップ、ｇ．一本鎖オリゴマーを取得するステップ、ｈ．環状の一本鎖オリゴマーを作製するステップ、ｉ．環状一本鎖オリゴマーをＲＣＡにより第２のロロニーとし、シーケンシングし、第１のロロニーの空間情報と第２のロロニーの配列情報をリンクさせるステップとを含む、組織サンプル上の少なくとも１本のｍ－ＲＮＡ鎖の標的配列の空間位置と配列情報とを取得する方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組織サンプル上の少なくとも１本のｍ－ＲＮＡ鎖の標的配列の空間位置と配列情報とを取得する方法であって、
ａ．ロケータープローブを提供するステップであって、前記ロケータープローブは、ａ）環状ロケーターを結合することができるロケーターアンカー領域を介して前記環状ロケーターにハイブリダイズした線状ロケーターと、ｂ）少なくとも１本のｍ－ＲＮＡ鎖に結合することができるＲＮＡアンカー領域と、ｃ）プライマー配列とを含み、前記環状ロケーターは、ＵＭＩ領域と、第１および第２のプライマー領域と、前記線状ロケーターの前記ロケーターアンカー領域に対して相補的な領域とを含む、提供するステップと、
ｂ．前記ＲＮＡアンカー領域を有する前記ロケータープローブを前記ｍ－ＲＮＡ鎖にハイブリダイズするステップと、
ｃ．前記ｍ－ＲＮＡ鎖を鋳型として使用して前記ロケータープローブの前記ＲＮＡアンカー領域を相補化し、それによって逆転写ｃ－ＤＮＡ鎖を取得するステップと、
ｄ．前記環状ロケーターを鋳型として使用して前記第１のプライマー領域を起点として前記環状ロケーターを相補化し、得られたオリゴマーを前記線状ロケーターの前記ロケーターアンカー領域とライゲーションし、それによって前記ＵＭＩ領域および前記ｍ－ＲＮＡ鎖の標的配列を含む伸張された逆転写ｃ－ＤＮＡ鎖を取得するステップと、
ｅ．前記組織サンプル上の前記第２のプライマー領域を起点として前記環状ロケーターをＲＣＡで増殖させ、少なくとも１つの第１のロロニー（Ｌは１つのみ）を作製するステップと、
ｆ．前記少なくとも１つの第１のロロニーを空間的に分析してシーケンシングし、それによって前記少なくとも１つの第１のロロニーの空間情報および配列情報を取得するステップと、
ｇ．前記伸張された逆転写ｃ－ＤＮＡ鎖を前記組織から除去し、前記伸張された逆転写ｃ－ＤＮＡ鎖を前記ｍ－ＲＮＡ鎖から脱ハイブリダイズし、一本鎖オリゴマーを取得するステップと、
ｈ．前記一本鎖オリゴマーの３’末端および５’末端に第１および第２のアダプタープライマーを提供し、プライミングされた一本鎖オリゴマーを取得し、前記プライミングされた一本鎖オリゴマーをＰＣＲにより増幅し、前記第１および第２のアダプタープライマーの互いのライゲーションにより前記プライミングされた一本鎖オリゴマーを環化し、それによって環状の一本鎖オリゴマーを作製するステップと、
ｉ．前記環状一本鎖オリゴマーをＲＣＡにより増殖させて第２のロロニーとし、前記第２のロロニーをシーケンシングし、前記第１のロロニーの前記空間情報と前記第２のロロニーの配列情報とを前記ＵＭＩ配列を介してリンクさせるステップと
を含む、方法。

【請求項2】

前記環状ロケーターが、ステップａ）において、クローズドサークルとして提供されることを特徴とする、請求項１記載の方法。

【請求項3】

前記環状ロケーターが、ステップａ）において、オープンサークルとして提供され、ステップｄ）において、前記環状ロケーターを増殖させる前に前記オープンサークルの３’末端および５’末端が互いにライゲーションされて環状ロケーターを作製することを特徴とする、請求項１記載の方法。

【請求項4】

前記オープンサークルの前記３’末端および前記５’末端がＴ４ ＤＮＡリガーゼで互いにライゲーションされ、前記環状ロケーターの前記第２のプライマー領域は、ブリッジスプリントとして機能することを特徴とする、請求項３記載の方法。

【請求項5】

ステップｄ）における前記環状ロケーターの相補化が、前記環状ロケーターの前記第１のプライマー領域をイニシエータープライマーとして使用して、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼによって実施されることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。

【請求項6】

ステップｄ）におけるライゲーションステップが、ＤＮＡリガーゼによって実施されることを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。

【請求項7】

前記ロケータープローブが、前記線状ロケーターを前記環状ロケーターに最初にハイブリダイゼーションすることによって提供されることを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。

【請求項8】

前記ロケータープローブが、前記線状ロケーターを前記少なくとも１本のｍ－ＲＮＡ鎖に最初にハイブリダイズし、次いで前記環状ロケーターを前記線状ロケーターにハイブリダイズすることによって提供されることを特徴とする、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。

【請求項9】

前記ロケータープローブが、前記線状ロケーターを前記少なくとも１本のｍ－ＲＮＡ鎖に最初にハイブリダイズし、前記ロケータープローブの前記ＲＮＡアンカー領域を逆転写ｃ－ＤＮＡ鎖に相補化させ、次いで前記環状ロケーターを前記線状ロケーターにハイブリダイズすることによって提供されることを特徴とする、請求項８記載の方法。

【請求項10】

前記３’末端および前記５’末端に第１および第２のアダプタープライマーを加える前に、前記一本鎖オリゴマーを物理的にせん断してより小さな断片にすることを特徴とする、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

背景
組織上の細胞内レベルですべての発現遺伝子を検出し、同時にこれらの遺伝子の配列および／または空間情報を得ることは困難である。

【0002】

本発明は、Ｕｎｉｑｕｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（固有分子識別子）（ＵＭＩ）プローブを含むロケーターサークル（ｌｏｃａｔｏｒ ｃｉｒｃｌｅ）（または後でライゲーションされるオープンサークル）を使用し、続いて変異または配列バリアントを含む対象領域の逆転写を使用して、メッセンジャーＲＮＡ上の特定領域を認識および増幅し、ＵＭＩの配列情報をコピーする方法を説明する。得られたＵＭＩ情報付きｃＤＮＡは、組織切片上に生成されたＲｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ（ローリングサークル増幅）（ＲＣＡ）産物のＮＧＳにより検索、抽出、およびシーケンシングされる。

【0003】

国際公開第２０２００７６９７６号は、ＦＩＳＳＥＱにより空間位置を含む核酸の配列情報を取得する方法を開示している。国際公開第２０１９１９９５７９号は、同様の目的のためのスネイル（Ｓｎａｉｌ）プローブシステムを教示している。

【0004】

発明の概要
したがって、本発明の目的は、公知技術よりも高い分解能で標的配列の空間位置と配列情報との両方を同時に取得する方法を提供することであった。

【0005】

本明細書では、以下の方法について説明する：
（１）ＵＭＩ付きハイブリッド環状／線状ＤＮＡプローブを使用して、組織上に発現するｍＲＮＡを空間的にローカライゼーションする。
（２）ＵＭＩ付き環状／線状ＤＮＡプローブがアニーリングする領域より下流の隣接領域のヌクレオチド情報を逆転写酵素でコピーする。同時に、ＵＭＩ配列を担持したハイブリッドプローブの環状部分をＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼでコピーし、得られたコピーＲＮＡ鎖を逆転写されたｃＤＮＡにライゲーションする。
（３）次いで、ＵＭＩ含有ｃＤＮＡ鎖を組織から抽出する。
（４）次いで、抽出されたＵＭＩ含有ｃＤＮＡ鎖を、既知のアダプター末端を有するＰＣＲプライマーでＰＣＲ増幅させる。
（５）ＰＣＲ産物を環化し、ＲＣＡ増幅させる。
（６）ＲＣＡ産物は、ＮＧＳによりシーケンシングすることができる。

【0006】

本発明の目的は、組織サンプル上の少なくとも１本のｍ－ＲＮＡ鎖の標的配列の空間位置および配列情報を取得する方法であって、
ａ．ロケータープローブを提供するステップであって、ロケータープローブは、ａ）環状ロケーターを結合することができるロケーターアンカー領域を介して環状ロケーターにハイブリダイズした線状ロケーターと、ｂ）少なくとも１本のｍ－ＲＮＡ鎖に結合することができるＲＮＡアンカー領域と、ｃ）プライマー配列とを含み、環状ロケーターは、ＵＭＩ領域と、第１および第２のプライマー領域と、線状ロケーターのロケーターアンカー領域に対して相補的な領域とを含む、提供するステップと、
ｂ．ＲＮＡアンカー領域を有するロケータープローブをｍ－ＲＮＡ鎖にハイブリダイズするステップと、
ｃ．ｍ－ＲＮＡ鎖を鋳型として使用してロケータープローブのＲＮＡアンカー領域を相補化し、それによって逆転写ｃ－ＤＮＡ鎖を取得するステップと、
ｄ．環状ロケーターを鋳型として使用して第１のプライマー領域を起点として環状ロケーターを相補化し、得られたオリゴマーを線状ロケーターのロケーターアンカー領域とライゲーションし、それによってＵＭＩ領域およびｍ－ＲＮＡ鎖の標的配列を含む伸張された逆転写ｃ－ＤＮＡ鎖を取得するステップと、
ｅ．組織サンプル上の第２のプライマー領域を起点として環状ロケーターをＲＣＡで増殖させ、少なくとも１つの第１のロロニー（ｒｏｌｏｎｙ）（Ｌは１つのみ）を作製するステップと、
ｆ．少なくとも１つの第１のロロニーを空間的に分析してシーケンシングし、それによって少なくとも１つの第１のロロニーの空間情報および配列情報を取得する（言い換えれば、少なくとも１つの第１のロロニーのシーケンシングによって空間座標および環状ロケーターＵＭＩを取得する）ステップと、
ｇ．伸張された逆転写ｃ－ＤＮＡ鎖を組織から除去し、伸張された逆転写ｃ－ＤＮＡ鎖をｍ－ＲＮＡ鎖から脱ハイブリダイズし、一本鎖オリゴマーを取得するステップと、
ｈ．一本鎖オリゴマーの３’末端および５’末端に第１および第２のアダプタープライマーを提供し、プライミングされた一本鎖オリゴマーを取得し、プライミングされた一本鎖オリゴマーをＰＣＲにより増幅し、第１および第２のアダプタープライマーの互いのライゲーションによりプライミングされた一本鎖オリゴマーを環化し、それによって環状の一本鎖オリゴマーを作製するステップと、
ｉ．環状一本鎖オリゴマーをＲＣＡにより増殖させて第２のロロニーとし、第２のロロニーをシーケンシングし、第１のロロニーの空間情報と第２のロロニーの配列情報とをＵＭＩ配列を介してリンクさせるステップと
を含む、方法である。

【0007】

本発明は、ランダムで予め定義されていない固有分子識別子（ＵＭＩ）と２つのプライミング領域とを持つ環状分子（図１Ａ）または開環状分子（図１Ｂ）のいずれかを含むハイブリッドプローブを使用して、所定の組織における対象遺伝子の空間的ローカライゼーションを実施する方法を対象とする。サークル／オープンサークルは、線状ＤＮＡプライマーに予め結合させておくか（図１Ａおよび図１Ｂ）、線状プライマーが直接組織上でｍＲＮＡ上の所望の領域より上流の配列に結合した後に環状ロケーターを線状ＤＮＡプライマーにハイブリダイズすることができる（図１Ｃ）。次いで、ハイブリッドプローブの環状部分は、直接組織上でオリゴヌクレオチドプライマーを使用してローリングサークル増幅（ＲＣＡ）により増幅され、所定の組織上でｍＲＮＡが発現した正確な位置にＲＣＡ産物を生じさせることができる。次いで、ＲＣＡ産物をシーケンシングすることにより、ランダムで予め定義されていないＵＭＩをデコードすることができる。

【0008】

次に、組織上に空間的にローカライゼーションされた同じｍＲＮＡ上の特定のヌクレオチド変化またはバリアントである特定の対象領域の所望の配列情報を、プライマーとしての同じハイブリッドプローブによるｍＲＮＡの逆転写によって同時にキャプチャすることができる。

【0009】

逆転写と同時に、ＵＭＩ情報は、環状鎖をコピーするように特別にデザインされたＤＮＡプライマーによって開始されるＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼによって、同じ逆転写ｃＤＮＡ鎖上でキャプチャすることができる。Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡサークルをコピーしたら、それを対象領域の配列情報をキャプチャした同じｃＤＮＡ鎖にライゲーションすることができる。オープン環状ロケータープローブが使用される場合は、この時点でクローズドサークルを形成するようにライゲーションされる。

【0010】

次いで、ＵＭＩがライゲーションされたｃＤＮＡを、組織から物理的に回収し、抽出する。

【0011】

次いで、回収されたｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの５’末端および３’末端にアニールしてＤＮＡアダプターを担持するＰＣＲプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅させる。

【0012】

次いで、ＰＣＲ増幅された産物を、２つの末端を一つにするスプリントブリッジ（ｓｐｌｉｎｔ ｂｒｉｄｇｅ）オリゴヌクレオチドプライマーを使用して環化することができる。

【0013】

次いで、サークルを、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）により増幅させる。次いで、ＲＣＡ産物をシーケンシングする。

【0014】

ＮＧＳシーケンシングにより、空間識別子ＵＭＩおよびリンクされたｍＲＮＡの目的配列を、組織位置に割り当てることができる。

【0015】

ＮＧＳシーケンシングにより、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡ上の標的対象領域、変異またはヌクレオチドバリアントを解析することができる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】ハイブリッド環状／線状ロケータープローブの３つの実施形態を示す図であり、閉じた環状部分（図１Ａ）は、ランダムＵＭＩ配列と、２つのプライミング領域１および２と、線状ロケータープローブの５’半分部分のプローブにアニーリングされるアンカー配列とを含み、図１Ｂは、このプローブのオープンサークルバージョンを示し、ロケーターサークルは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによってプロセス中に後で閉じることができ、図１Ｃは、線状プローブが最初に標的にハイブリダイズし、続いて逆転写を行うバージョンを示し、線状プローブが標的に安定的に結合したら、環状ロケーターが線状プローブにハイブリダイズされ、３つのデザインとも、線状プローブの３’半分は、シーケンシングが必要な標的ｍＲＮＡ遺伝子の対象領域より上流の特定領域にアニーリングする配列を有し、対象領域は、バリアントの差異によるヌクレオチド変化が疑われる配列を含む。

【図2a】ハイブリッドロケータープローブがどのように特定のｍＲＮＡの対象領域より上流の領域に結合し、対象領域を逆転写するかを示す図であり、ハイブリッド（クローズド）オープン環状ロケーター／線状ハイブリッドプローブを使用して、ｍＲＮＡの対象領域をｃＤＮＡに逆転写している。その後、ＵＭＩを含むロケーターサークルがコピーされ、ｃＤＮＡにライゲーションされ、ロケーターサークルが閉じられる。

【図2b】ハイブリッドロケータープローブがどのように特定のｍＲＮＡの対象領域より上流の領域に結合し、対象領域を逆転写するかを示す図であり、クローズドロケーターサークルはＲＣＡにより増幅され、ＵＭＩ部分はｉｎ ｓｉｔｕでシーケンシングされる。次いで、コピーされたＵＭＩを含むライゲーションされたｃＤＮＡ鎖は、対象領域のシーケンシングのために抽出される。

【図3】ＵＭＩ領域と対象領域特異的配列とを含むロケーターサークルがどのように、シーケンシングの前にＰＣＲによって増幅され得るかを示す図である。

【図4】組織から抽出されたｃＤＮＡ鎖がどのように、ＰＣＲプライマーにアダプター領域（Ｐ１およびＰ２）を加えることによって、ＰＣＲ増幅され、後で環化され得るかを示す図である。

【図5】Ｐ１／Ｐ２アダプター末端を有するＰＣＲ増幅産物がどのように、ＮＧＳシーケンシングによって分析するために、環化され、ＲＣＡ増幅され得るかを示す図である。

【図6】ＵＭＩ領域と「対象領域」とを照合させて対にするペアエンドシーケンシングを実施するために必要なプライマーを説明する図である。

【0017】

詳細な説明
ＲＣＡによるｍＲＮＡ分子の空間的ローカライゼーションと、それに続く同じＲＮＡ分子からの対象領域のｅｘ－ｓｉｔｕシーケンシングとには、組織上で直接行う、９ステップのプロセスからなるＲＣＡが含まれる。（１）組織上のｍＲＮＡへの線状または線状／環状ロケータープローブのハイブリダイゼーション。（２）標的ｍＲＮＡ分子にハイブリダイズしたハイブリッドロケータープローブの線状部分による下流ｍＲＮＡの対象領域の逆転写（２Ａ）およびサークル特異的オリゴヌクレオチドプライマーを有するＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼによるハイブリッドプローブの環状部分のＤＮＡ複製（２Ｂ）。（３）コピーされた環状ＵＭＩとｃＤＮＡとを接続するためのＴ４ ＤＮＡライゲーション。オープン環状ロケーターが使用される場合は、このステップでもライゲーションされる。（４）ロロニー（ＤＮＡコンカテマーナノボール）を生成するためのサークル特異的ＲＣＡプライマーを用いたＲＣＡおよび生成されたロロニー上のランダムＵＭＩのｉｎ ｓｉｔｕシーケンシング。（５）組織からのｃＤＮＡ－ＵＭＩ第１鎖の抽出。（６）第２鎖ｃＤＮＡ合成。（７）Ｐ１／Ｐ２アダプタープライマーを用いたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅。（８）ＰＣＲ増幅産物の環化およびＵＭＩと対象領域とを含むサークルのＲＣＡ増幅。（９）ＮＧＳシーケンシングならびにＵＭＩとの照合による対象領域の位置および配列の同定。

【0018】

本発明の第１の実施形態では、環状ロケーターは、ステップａ）において、クローズドサークルとして提供される。別の実施形態では、環状ロケーターは、ステップａ）において、オープンサークルとして提供され、ここで、ステップｄ）において、環状ロケーターを増殖させる前に、オープンサークルの３’末端と５’末端とが互いにライゲーションされて環状ロケーターが作製される。

【0019】

オープンサークルを有する実施形態では、オープンサークルの３’末端と５’末端とが、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて互いにライゲーションされ得、ここで、環状ロケーターの第２のプライマー領域は、ブリッジスプリントとして機能する。

【0020】

ステップｄ）（環状ロケーターの相補化）は、環状ロケーターの第１のプライマー領域をイニシエータープライマーとして使用して、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼによって実施され得る。さらに、ステップｄ）のライゲーションステップは、ＤＮＡリガーゼによって実施され得る。

【0021】

ロケータープローブは、以下の別形で提供することができる：
－ 線状ロケーターを環状ロケーターに最初にハイブリダイズする方法。
－ 線状ロケーターを少なくとも１本のｍ－ＲＮＡ鎖に最初にハイブリダイズし、次いで環状ロケーターを線状ロケーターにハイブリダイズする方法。
－ 線状ロケーターを少なくとも１本のｍ－ＲＮＡ鎖に最初にハイブリダイズし、ロケータープローブのＲＮＡアンカー領域を、逆転写ｃ－ＤＮＡ鎖に相補させ、次いで環状ロケーターを線状ロケーターにハイブリダイズする方法。

【0022】

好ましくは、一本鎖オリゴマーは、３’末端および５’末端に第１および第２のアダプタープライマーを加える前に、物理的にせん断してより小さな断片にする。

【0023】

これらの実施形態は、図面に示される。図１は、ロケータープローブのセットアップの３つの可能なデザインを示す。図１Ａでは、ＵＭＩを含む環状プローブと、対象領域特異的配列（ＳＰ）を介してサークルに予め結合された線状プローブとをハイブリダイズすることにより、ハイブリッドロケータープローブが生成される。図１Ｂでは、オープン環状プローブが使用される。図１Ａおよび図１Ｂともに予めアセンブリされたプローブは安定であり、使用前に精製される。図１Ｃでは、線状プローブが最初に使用され、線状プローブがｍＲＮＡ標的にハイブリダイズした後にロケーターサークルが加えられる。サークルのサイズは２０～４００ｂｐの長さで、対象領域ＳＰ部分は約１０～４０ｂｐであり、線状プローブと安定な二本鎖構造を形成することができる。線状プローブの３’末端は、約３０ｂｐの長さの配列からなり、組織上のｍＲＮＡの所望の標的の特定領域にハイブリダイズすることができる。

【0024】

図２は、ロケータープローブがどのように使用されるかのプロセスを示す。ステップ１では、スライド上の固定された組織において、ハイブリッドロケータープローブが加えられ、特定のｍＲＮＡの対象領域から上流の領域に結合する（点線）。本発明の一実施形態では、ステップ１において、線状プローブが最初に加えられ、特定のｍＲＮＡの対象領域から上流の領域に結合し（点線）、サークルが後で加えられる。

【0025】

次に、ステップ２Ａでは、プライマーとして使用されるロケータープローブによって、対象領域の逆転写が開始される。しかしながら、一実施形態では、逆転写が完了した時点で、環状ロケーターが加えられて線状プローブのアンカー領域にハイブリダイズする。次に、ステップ２Ｂにおいて、ロケーターサークルのＤＮＡ合成は、プライマー１領域に結合するサークル特異的プライマーによって開始される。

【0026】

次に、ロケーターサークルは、非鎖置換酵素、例えばＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼによってコピーされ、次いで、Ｔ４ ＤＮＡライゲーションによって逆転写されたｃＤＮＡ鎖に接続される（ステップ３）。オープン環状ロケータープローブバージョンが使用される場合、このステップでもＴ４ ＤＮＡライゲーションによりサークルが閉じられる。

【0027】

次に、ロケーターサークルの等温ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）が、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼと、プライマー領域２に結合したＲＣＡオリゴヌクレオチドとを用いて組織上で実施される（ステップ４）。その結果、組織上のＲＣＡ産物の位置は、組織上のランダムに生成されたＵＭＩをシーケンシングし、座標を取得することによって決定される。

【0028】

次に、ステップ５では、ロケーターサークルＲＣＡが可視化された後、組織からｃＤＮＡが抽出される。

【0029】

図３は、組織切片スライドから第１鎖ｃＤＮＡを抽出した後のワークフローを説明する。組織からｃＤＮＡが抽出され精製されると、第２鎖ｃＤＮＡ（ステップ６）と、それに続くＰＣＲ反応（ステップ７）とが、一対のプライマーＰ１およびＰ２を用いて実施される。プライマーＰ１は、環状ロケーター領域の上流に位置し、プライマーＰ２は、「対象領域」の下流に位置する。

【0030】

図４は、ＮＧＳによってシーケンシングされるＲＣＡ産物を生成するためのワークフローを説明する。ステップ８において、ＰＣＲ産物ライブラリは、サークルおよびＲＣＡ産物の生成に使用され、ＵＭＩを識別するためにシーケンシングに使用され、対象領域のＤＮＡ配列に対応される。ステップ９において、センスおよびアンチセンスの両鎖のＲＣＡは、センスおよびアンチセンスブリッジガイドを使用して独立して生成することができる。

【0031】

図５は、組織切片上のロロニーのＵＭＩシーケンシングの一例を示す。

【0032】

図６は、ＵＭＩ領域と「対象領域」とを照合させて対にするペアエンドシーケンシングを実施するのに必要なプライマーを説明する。ペアエンドシーケンシングの第１セグメントは、ペアエンドセグメント１シーケンシングプライマーＳＱ－Ｓプライマー１およびＳＱ－ＡＳプライマー１を用いて対象領域について実施される。ペアエンドシーケンシングの第２セグメントは、ペアエンドセグメント２シーケンシングプライマーＳＱ－Ｓプライマー２およびＳＱ－ＡＳプライマー２を用いてＵＭＩ領域について実施される。

【0033】

ＮＧＳシーケンシングは、変異／ヌクレオチドバリアントが標的の対象領域に存在するかどうかを決定することができ、ＵＭＩをシーケンシングすることによって、基質上の各ロロニーの位置は、後で組織の元の位置と対応させることができる。つまり、組織上の遺伝子の位置を決定し、その遺伝子に変異があるかどうかをシーケンシングで確認することができる。

【図1】

【図2a】

【図2b】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【外国語明細書】