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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024054410
(43)【公開日】2024-04-16
(54)【発明の名称】抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20240409BHJP
C07K 16/22 20060101ALI20240409BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240409BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240409BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240409BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240409BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240409BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240409BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240409BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20240409BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20240409BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240409BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240409BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240409BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240409BHJP
A61P 1/12 20060101ALI20240409BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240409BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20240409BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240409BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240409BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20240409BHJP
A61P 5/16 20060101ALI20240409BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C07K16/22
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12N1/21
C12N1/19
C12N1/15
C12P21/08
A61K39/395 N
A61P21/00
A61P19/08
A61P43/00 111
A61P35/00
A61K48/00
A61K35/12
A61P1/12
A61P25/00
A61P17/06
A61P9/10 101
A61P9/10
A61P37/02
A61P21/04
A61P5/16
【審査請求】未請求
【請求項の数】34
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024028737
(22)【出願日】2024-02-28
(62)【分割の表示】P 2022528850の分割
【原出願日】2021-06-01
(31)【優先権主張番号】P 2020096344
(32)【優先日】2020-06-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】503369495
【氏名又は名称】帝人ファーマ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100123593
【弁理士】
【氏名又は名称】関根 宣夫
(72)【発明者】
【氏名】松川 博昭
(72)【発明者】
【氏名】江口 広志
(72)【発明者】
【氏名】並木 直子
(72)【発明者】
【氏名】田野倉 章
(57)【要約】
【課題】既報の抗ＩＧＦ－１受容体マウス抗体ＩＧＦ１１－１６（特許文献１）と同等以上の特異性、及び、結合親和性又は活性を有する、抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体、又はそれらの作製方法を提供する。
【解決手段】マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６に由来する重鎖及び軽鎖のＣＤＲと、ヒト抗体に由来する重鎖及び軽鎖の各ＦＲとを含むと共に、少なくとも１つのＣＤＲが、マウス親抗体の対応するＣＤＲに対して、少なくとも１箇所のアミノ酸残基の置換を含む、抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
【選択図】なし
【解決手段】マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６に由来する重鎖及び軽鎖のＣＤＲと、ヒト抗体に由来する重鎖及び軽鎖の各ＦＲとを含むと共に、少なくとも１つのＣＤＲが、マウス親抗体の対応するＣＤＲに対して、少なくとも１箇所のアミノ酸残基の置換を含む、抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６に由来する重鎖及び軽鎖の各相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体に由来する重鎖及び軽鎖の各フレームワーク領域（ＦＲ）とを含むと共に、少なくとも１つのＣＤＲが、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の対応するＣＤＲに対して、少なくとも１箇所のアミノ酸残基の置換を含む、抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項2】
重鎖可変領域のフレームワーク領域１（ＦＲ－Ｈ１）の２５位のアミノ酸残基がプロリンである、請求項１に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項3】
重鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｈ１）配列として、配列番号１のアミノ酸配列、又は、配列番号１の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
重鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）配列として、配列番号３若しくは配列番号５のアミノ酸配列、又は、配列番号３若しくは配列番号５の何れか１箇所、２箇所、若しくは３箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
重鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｈ３）配列として、配列番号７のアミノ酸配列、又は、配列番号７の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｌ１）配列として、配列番号９のアミノ酸配列、又は、配列番号９の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｌ２）配列として、配列番号１１のアミノ酸配列、又は、配列番号１１の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｌ３）配列として、配列番号１３のアミノ酸配列、又は、配列番号１３の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列
を含む、請求項１又は２に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
重鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）配列として、配列番号３若しくは配列番号５のアミノ酸配列、又は、配列番号３若しくは配列番号５の何れか１箇所、２箇所、若しくは３箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
重鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｈ３）配列として、配列番号７のアミノ酸配列、又は、配列番号７の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｌ１）配列として、配列番号９のアミノ酸配列、又は、配列番号９の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｌ２）配列として、配列番号１１のアミノ酸配列、又は、配列番号１１の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｌ３）配列として、配列番号１３のアミノ酸配列、又は、配列番号１３の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列
を含む、請求項１又は２に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項4】
重鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｈ１）配列として、配列番号１と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
重鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）配列として、配列番号３又は配列番号５と８２％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
重鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｈ３）配列として、配列番号７と７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｌ１）配列として、配列番号９と８１％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｌ２）配列として、配列番号１１と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｌ３）配列として、配列番号１３と７７％以上の相同性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項１又は２に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
重鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）配列として、配列番号３又は配列番号５と８２％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
重鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｈ３）配列として、配列番号７と７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｌ１）配列として、配列番号９と８１％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｌ２）配列として、配列番号１１と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｌ３）配列として、配列番号１３と７７％以上の相同性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項１又は２に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項5】
重鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｈ１）配列として、配列番号１の３位のＴｒｐが維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列であって、当該３位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号１と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
重鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）配列として、
配列番号３の１位のＧｌｕ及び３位のＡｓｎが各々維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されると共に、６位のＡｓｎが維持され、又は、Ｓｅｒ若しくはＧｌｎに置換されたアミノ酸配列であって、当該１位、３位、及び６位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所、２箇所、若しくは３箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号３と８２％以上の相同性を有するアミノ酸配列、或いは、
配列番号５の１位のＧｌｕ及び３位のＡｓｎが各々維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されると共に、６位のＳｅｒが維持され、又は、Ａｓｎ若しくはＧｌｎに置換されたアミノ酸配列であって、当該１位、３位、及び６位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所、２箇所、若しくは３箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号５と８２％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
重鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｈ３）配列として、配列番号７の４位のＡｒｇが維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列であって、当該４位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号７と７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｌ１）配列として、配列番号９の９位のＴｒｐが維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列であって、当該９位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号９と８１％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｌ２）配列として、配列番号１１の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号１１と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｌ３）配列として、配列番号１３の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号１３と７７％以上の相同性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項１又は２に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
重鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）配列として、
配列番号３の１位のＧｌｕ及び３位のＡｓｎが各々維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されると共に、６位のＡｓｎが維持され、又は、Ｓｅｒ若しくはＧｌｎに置換されたアミノ酸配列であって、当該１位、３位、及び６位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所、２箇所、若しくは３箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号３と８２％以上の相同性を有するアミノ酸配列、或いは、
配列番号５の１位のＧｌｕ及び３位のＡｓｎが各々維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されると共に、６位のＳｅｒが維持され、又は、Ａｓｎ若しくはＧｌｎに置換されたアミノ酸配列であって、当該１位、３位、及び６位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所、２箇所、若しくは３箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号５と８２％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
重鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｈ３）配列として、配列番号７の４位のＡｒｇが維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列であって、当該４位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号７と７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｌ１）配列として、配列番号９の９位のＴｒｐが維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列であって、当該９位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号９と８１％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｌ２）配列として、配列番号１１の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号１１と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｌ３）配列として、配列番号１３の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号１３と７７％以上の相同性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項１又は２に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項6】
配列番号７１のアミノ酸配列を有するヒトＩＧＦ－１受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する、請求項１～５の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項7】
重鎖可変領域として、配列番号４３、４７、４９、５３、５５、若しくは５９のアミノ酸配列、配列番号４３、４７、４９、５３、５５、若しくは５９のアミノ酸配列において１若しくは数箇所のアミノ酸残基が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、配列番号４３、４７、４９、５３、５５、若しくは５９と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び、
軽鎖可変領域として、配列番号６５、６７、若しくは６９のアミノ酸配列、配列番号６５、６７、若しくは６９のアミノ酸配列において１若しくは数箇所のアミノ酸残基が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、配列番号６５、６７、若しくは６９と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項１～６の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
軽鎖可変領域として、配列番号６５、６７、若しくは６９のアミノ酸配列、配列番号６５、６７、若しくは６９のアミノ酸配列において１若しくは数箇所のアミノ酸残基が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、配列番号６５、６７、若しくは６９と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項１～６の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項8】
重鎖及び／又は軽鎖の定常領域として、ヒト免疫グロブリンの何れかのクラスの重鎖及び／又は軽鎖の定常領域を含む、請求項１～７の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項9】
重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ４クラスの重鎖定常領域又はその１～１０箇所のアミノ酸が置換された定常領域である、請求項１～８の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項10】
重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ１クラスの重鎖定常領域又はその１～１０箇所のアミノ酸が置換された定常領域である、請求項１～８の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項11】
ＩＧＦ－１受容体に対して平衡解離定数（ＫＤ）１×１０-7Ｍ以下の親和性で結合する、請求項１～１０の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項12】
ＩＧＦ－１受容体シグナル活性化能を有する、請求項１～１１の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項13】
筋芽細胞増殖試験において、増殖活性を有する、請求項１～１２の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項14】
ＢＩＡＣＯＲＥによる組換え可溶性ＩＧＦ－１受容体への結合性試験において、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等以上の結合親和性を有する、請求項１～１３の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項15】
正常哺乳動物において、低血糖症状を誘導せず、筋量増加作用を誘導しうる、請求項１～１４の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項16】
下垂体摘出モデル動物において、低血糖症状を誘導せず、成長板軟骨伸長作用を誘導しうる、請求項１～１５の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項17】
脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する用量において当該脊椎動物に投与された場合に、当該脊椎動物の血糖値を低下させない、請求項１～１６の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項18】
脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する有効用量に対して１０倍以上の血中曝露量においても、当該脊椎動物の血糖値を低下させない、請求項１～１６の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項19】
ＩＧＦ－１受容体シグナル活性化抑制能を有する、請求項１～１８の何れか一項に記載のヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項20】
筋芽細胞増殖試験において、ＩＧＦ－１受容体を活性化しうるリガンドであるＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、及びインスリンの少なくとも一つの増殖活性を抑制する、請求項１～１８の何れか一項に記載のヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項21】
がん細胞増殖試験において、細胞増殖を抑制する活性を有する、請求項１～２０の何れか一項に記載のヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項22】
抗ＩＧＦ－Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体が、１）～４）の少なくとも一つの特徴を有する、請求項１～２１のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ－Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
１）ＩＧＦ－Ｉ受容体活性化リガンドによる脊椎動物由来細胞の増殖を阻害する。
２）脊椎動物におけるＩＧＦ－Ｉ受容体活性化リガンドに起因する細胞増殖性疾患における細胞増殖を抑制する。
３）ＩＧＦ－Ｉ受容体活性化リガンドによる脊椎動物由来細胞の増殖を阻害する用量において、分化筋細胞でのグルコース取込みに影響しない。
４）脊椎動物におけるＩＧＦ－Ｉ受容体活性化リガンドに起因する細胞増殖性疾患における細胞増殖を抑制する用量において、当該脊椎動物の血糖値を変動させない。
１）ＩＧＦ－Ｉ受容体活性化リガンドによる脊椎動物由来細胞の増殖を阻害する。
２）脊椎動物におけるＩＧＦ－Ｉ受容体活性化リガンドに起因する細胞増殖性疾患における細胞増殖を抑制する。
３）ＩＧＦ－Ｉ受容体活性化リガンドによる脊椎動物由来細胞の増殖を阻害する用量において、分化筋細胞でのグルコース取込みに影響しない。
４）脊椎動物におけるＩＧＦ－Ｉ受容体活性化リガンドに起因する細胞増殖性疾患における細胞増殖を抑制する用量において、当該脊椎動物の血糖値を変動させない。
【請求項23】
担癌モデル動物において、血糖値に影響を与えることなく、がん細胞増殖抑制作用を誘導しうる、請求項１～２２の何れか一項に記載のヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項24】
担癌モデル動物において、がん細胞増殖抑制作用を誘導しうる有効用量に対して１０倍以上の血中曝露量においても、当該モデル動物の血糖値に影響を与えない、請求項２３に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
【請求項25】
請求項１～２４の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項26】
請求項２５に記載の核酸分子を少なくとも一つ含むクローニングベクター又は発現ベクター。
【請求項27】
請求項２６に記載のベクターが宿主細胞に導入された組換え体細胞。
【請求項28】
請求項１～２４の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体を製造する方法であって、請求項２７に記載の組換え体細胞を培養し、前記組換え体細胞から産生される当該抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体を精製する工程を含む方法。
【請求項29】
請求項１～２４の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体、請求項２５に記載の核酸分子、請求項２６に記載のベクター、或いは請求項２７に記載の組換え体細胞を有効成分として含む、医薬組成物。
【請求項30】
筋萎縮性疾患又は低身長症の治療に用いられる、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項31】
筋萎縮性疾患が、廃用性筋萎縮、サルコペニア、又はカヘキシアである、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項32】
低身長症が、ラロン型低身長症又は成長ホルモン抵抗性低身長症である、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項33】
ＩＧＦ－１受容体に関連した疾患の治療に用いられる、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項34】
ＩＧＦ－Ｉ受容体に関連した疾患が、肝臓がん、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、小児がん、先端巨大症、卵巣がん、膵臓がん、良性前立腺肥大症、乳がん、前立腺がん、骨がん、肺がん、結腸直腸がん、頚部がん、滑膜肉腫、膀胱がん、胃がん、ウィルムス腫瘍、転移性カルチノイド及び血管作動性腸管ペプチド分泌腫瘍に関連する下痢、ビポーマ、ウェルナー－モリソン症候群、ベックウィズ－ヴィーデマン症候群、腎臓がん、腎細胞がん、移行上皮がん、ユーイング肉腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、脳腫瘍、膠芽腫、非膠芽腫性脳腫瘍、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、脳室上衣腫、脈絡叢乳頭腫、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管の平滑筋再狭窄、不適切な微小血管増殖、糖尿病性網膜症、グレーヴズ病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、自己免疫性甲状腺疾患、橋本甲状腺炎、甲状腺眼症、甲状腺機能亢進症ならびにベーチェット病からなる群より選択される疾患である、請求項３３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体に関する。具体的には、ＩＧＦ－１受容体に特異的に結合する抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体に関する。
【背景技術】
【0002】
１．ＩＧＦ－１
ＩＧＦ－１は、インスリン様成長因子であり、下垂体から分泌される成長ホルモン（ＧＨ）によるＧＨ受容体の活性化を介して、主に肝臓から分泌され、ＩＧＦ－１受容体に作用することにより、各種臓器で種々の生理機能を発現する。このことからＩＧＦ－１は、種々の疾患への治療が期待される。ＩＧＦ－１は、プロインスリンのアミノ酸配列と比較して、約４０％と高い相同性を有することから、インスリン受容体にも結合して、インスリン様の作用を発現することがある。また、ＩＧＦ－１受容体は、インスリン受容体のアミノ酸配列と比較して、約６０％と高い相同性を有することから、両受容体はヘテロ二量体を形成することによっても、生理作用を発揮する。なお、インスリンは、インスリン受容体に作用することにより、強力な血糖低下作用を発現することから、血糖降下薬として治療に用いられている。
ＩＧＦ－１は、インスリン様成長因子であり、下垂体から分泌される成長ホルモン（ＧＨ）によるＧＨ受容体の活性化を介して、主に肝臓から分泌され、ＩＧＦ－１受容体に作用することにより、各種臓器で種々の生理機能を発現する。このことからＩＧＦ－１は、種々の疾患への治療が期待される。ＩＧＦ－１は、プロインスリンのアミノ酸配列と比較して、約４０％と高い相同性を有することから、インスリン受容体にも結合して、インスリン様の作用を発現することがある。また、ＩＧＦ－１受容体は、インスリン受容体のアミノ酸配列と比較して、約６０％と高い相同性を有することから、両受容体はヘテロ二量体を形成することによっても、生理作用を発揮する。なお、インスリンは、インスリン受容体に作用することにより、強力な血糖低下作用を発現することから、血糖降下薬として治療に用いられている。
【0003】
２．ＩＧＦ－１受容体
ＩＧＦ－１受容体はα鎖及びβ鎖で構成され、Ｌ１、ＣＲ、Ｌ２、Ｆｎ１、Ｆｎ２、及びＦｎ３の６つの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む膜貫通タンパク質である。ＩＧＦ－１受容体の細胞内ドメインは、チロシンキナーゼを有する。細胞外ドメインは、ＩＧＦ－１がＩＧＦ－１受容体に結合した時の当該受容体の立体構造の変化に伴う、細胞内のチロシンキナーゼの活性化に関与する。ＩＧＦ－１受容体は、ホモ二量体複合体（ホモ型）を形成して、ＩＧＦ－１が結合すると、受容体キナーゼを活性化することにより信号を送る。また、インスリン受容体とのヘテロ二量体複合体（ヘテロ型）を形成して、インスリン又はＩＧＦ－１が結合すると、受容体キナーゼを活性化することにより信号を送る。
ＩＧＦ－１受容体はα鎖及びβ鎖で構成され、Ｌ１、ＣＲ、Ｌ２、Ｆｎ１、Ｆｎ２、及びＦｎ３の６つの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む膜貫通タンパク質である。ＩＧＦ－１受容体の細胞内ドメインは、チロシンキナーゼを有する。細胞外ドメインは、ＩＧＦ－１がＩＧＦ－１受容体に結合した時の当該受容体の立体構造の変化に伴う、細胞内のチロシンキナーゼの活性化に関与する。ＩＧＦ－１受容体は、ホモ二量体複合体（ホモ型）を形成して、ＩＧＦ－１が結合すると、受容体キナーゼを活性化することにより信号を送る。また、インスリン受容体とのヘテロ二量体複合体（ヘテロ型）を形成して、インスリン又はＩＧＦ－１が結合すると、受容体キナーゼを活性化することにより信号を送る。
【0004】
３．ＩＧＦ－１の生理作用
ＩＧＦ－１は、身長や体重増加等の成長促進作用、及び、糖代謝促進や血糖低下作用等のインスリン様代謝作用が明らかにされている。ヒト組換えＩＧＦ－１であるメカセルミンは、インスリン受容体異常症の高血糖、高インスリン血症、黒色表皮腫及び多毛といった症状を改善することが認められている。また、成長ホルモン抵抗性低身長症の成長障害を改善することが認められている（非特許文献１）。
ＩＧＦ－１は、身長や体重増加等の成長促進作用、及び、糖代謝促進や血糖低下作用等のインスリン様代謝作用が明らかにされている。ヒト組換えＩＧＦ－１であるメカセルミンは、インスリン受容体異常症の高血糖、高インスリン血症、黒色表皮腫及び多毛といった症状を改善することが認められている。また、成長ホルモン抵抗性低身長症の成長障害を改善することが認められている（非特許文献１）。
【0005】
４．ＩＧＦ－１の成長促進作用
ＩＧＦ－１は、成長促進の主要な因子である（非特許文献２、非特許文献３）。実際に、ヒト組換えＩＧＦ－１であるメカセルミンは、低身長症の治療薬として臨床で用いられている。また、ＩＧＦ－１はヒト軟骨細胞のＤＮＡ合成能を亢進させることが知られている。また、ＩＧＦ－１の投与は、下垂体摘出ラットの体重を増加させ、大腿骨骨長を伸長させる。
ＩＧＦ－１は、成長促進の主要な因子である（非特許文献２、非特許文献３）。実際に、ヒト組換えＩＧＦ－１であるメカセルミンは、低身長症の治療薬として臨床で用いられている。また、ＩＧＦ－１はヒト軟骨細胞のＤＮＡ合成能を亢進させることが知られている。また、ＩＧＦ－１の投与は、下垂体摘出ラットの体重を増加させ、大腿骨骨長を伸長させる。
【0006】
５．ＩＧＦ－１の筋肉量増加作用
ＩＧＦ－１を介した細胞増殖活性の亢進は、ＩＧＦ－１受容体の持続的な活性化が必要である。ＩＧＦ－１受容体を過剰発現させた動物では筋肉量が増加している。また、ＩＧＦ－１／ＩＧＦＢＰ３の持続投与は、大腿骨近位部骨折患者の握力を亢進させ、介助なしでの座位からの立ち上がり能力を改善させる。高齢のヒト及びマウスの筋肉中のＩＧＦ－１濃度は、若齢と比較して低下することが知られているが、ＩＧＦ－１を筋組織特異的に強制発現させた高齢のマウスでは、野生型マウスと比較して、筋肉量が改善した（非特許文献４）。
ＩＧＦ－１を介した細胞増殖活性の亢進は、ＩＧＦ－１受容体の持続的な活性化が必要である。ＩＧＦ－１受容体を過剰発現させた動物では筋肉量が増加している。また、ＩＧＦ－１／ＩＧＦＢＰ３の持続投与は、大腿骨近位部骨折患者の握力を亢進させ、介助なしでの座位からの立ち上がり能力を改善させる。高齢のヒト及びマウスの筋肉中のＩＧＦ－１濃度は、若齢と比較して低下することが知られているが、ＩＧＦ－１を筋組織特異的に強制発現させた高齢のマウスでは、野生型マウスと比較して、筋肉量が改善した（非特許文献４）。
【0007】
６．筋肉量を増加させる先行品
グレリン受容体の作動薬であるアナモレリンは、廃用性筋萎縮症であるカケキシアの臨床試験において、除脂肪量を増加させた。一方、副作用として、吐き気及び血糖値の上昇が認められる。ミオスタチンは、アクチビン受容体II（ＡｃｔＲII）に作用して、Ａｋｔ／ｍＴＯＲを阻害する、骨格筋形成の負の制御因子である。抗ミオスタチン抗体であるＬＹ２４９５６５５は、全人工股関節置換術を実施した患者及び高齢者の筋肉量を増加させる。また、抗ＡｃｔＲII抗体であるビマグルマブは、神経筋疾患患者の筋肉量を増加させる。しかし、骨格筋の形成を促進させ、治療のために使用できる薬は現在のところ存在しない。
グレリン受容体の作動薬であるアナモレリンは、廃用性筋萎縮症であるカケキシアの臨床試験において、除脂肪量を増加させた。一方、副作用として、吐き気及び血糖値の上昇が認められる。ミオスタチンは、アクチビン受容体II（ＡｃｔＲII）に作用して、Ａｋｔ／ｍＴＯＲを阻害する、骨格筋形成の負の制御因子である。抗ミオスタチン抗体であるＬＹ２４９５６５５は、全人工股関節置換術を実施した患者及び高齢者の筋肉量を増加させる。また、抗ＡｃｔＲII抗体であるビマグルマブは、神経筋疾患患者の筋肉量を増加させる。しかし、骨格筋の形成を促進させ、治療のために使用できる薬は現在のところ存在しない。
【0008】
７．ＩＧＦ－１の血糖低下作用
ＩＧＦ－１のインスリン様作用として、血糖低下作用が知られている。ＩＧＦ－１は、ラット筋肉由来細胞においてグルコース取込み作用を亢進させる。また、ＩＧＦ－１の投与は、ラットの血糖値を低下させる。ＩＧＦ－１による血糖低下作用は、臨床上の副作用として低血糖症状を惹起させることが報告されている。更に、ＩＧＦ－１は、ヒトへの投与により低血糖症状を起こすことから、治療開始時は、低用量から順次適当量を投与し、投与後の血糖値等を含む各種臨床所見の観察が必要となる。
ＩＧＦ－１のインスリン様作用として、血糖低下作用が知られている。ＩＧＦ－１は、ラット筋肉由来細胞においてグルコース取込み作用を亢進させる。また、ＩＧＦ－１の投与は、ラットの血糖値を低下させる。ＩＧＦ－１による血糖低下作用は、臨床上の副作用として低血糖症状を惹起させることが報告されている。更に、ＩＧＦ－１は、ヒトへの投与により低血糖症状を起こすことから、治療開始時は、低用量から順次適当量を投与し、投与後の血糖値等を含む各種臨床所見の観察が必要となる。
【0009】
ＩＧＦ－１は、Ａｋｔのリン酸化の亢進などを介して血糖低下作用を発現する。Ａｋｔの活性型変異体は、３Ｔ３－Ｌ１細胞のグルコース取込みを亢進させる。一方、Ａｋｔ２を欠損させたマウスは、血糖値が上昇した。また、ラット筋肉由来細胞においてＡｋｔ阻害剤は、インスリン刺激によるグルコース取込みを阻害する。更に、ＩＧＦ－１は、血糖低下作用に関与するインスリン受容体を活性化させることが知られている。これらのことから、ＩＧＦ－１による血糖低下作用には、Ａｋｔの過剰な活性化及びインスリン受容体の活性化が関与することが考えられる。
【0010】
８．ＩＧＦ－１の短い血中半減期
ＩＧＦ－１の血中半減期は、短いため治療では頻回投与が必要となる。実際に、ヒト組換えＩＧＦ－１であるメカセルミンは、血中半減期が約１１時間から１６時間であり、低身長症の治療では１日１回から２回の投与が必要である。血中のＩＧＦ－１の約７０から８０％はＩＧＦＢＰ３と結合している。ＩＧＦ－１の遊離体が生理活性を示す。ＩＧＦＢＰ３との結合は、ＩＧＦ－１の血中半減期を約１０時間から１６時間に維持している。ＩＧＦ－１とＩＧＦＢＰ３の配合剤であるＩＰＬＥＸは、血中半減期が約２１時間から２６時間とＩＧＦ－１と比較して長く、１日１回の投与を可能にした薬剤である。しかし、ＩＰＬＥＸは市場から撤退している。ＩＧＦ－１の動態を改善させたＰＥＧ化ＩＧＦ－１も開発が試みられたが、治療に用いられている薬剤は存在しない。
ＩＧＦ－１の血中半減期は、短いため治療では頻回投与が必要となる。実際に、ヒト組換えＩＧＦ－１であるメカセルミンは、血中半減期が約１１時間から１６時間であり、低身長症の治療では１日１回から２回の投与が必要である。血中のＩＧＦ－１の約７０から８０％はＩＧＦＢＰ３と結合している。ＩＧＦ－１の遊離体が生理活性を示す。ＩＧＦＢＰ３との結合は、ＩＧＦ－１の血中半減期を約１０時間から１６時間に維持している。ＩＧＦ－１とＩＧＦＢＰ３の配合剤であるＩＰＬＥＸは、血中半減期が約２１時間から２６時間とＩＧＦ－１と比較して長く、１日１回の投与を可能にした薬剤である。しかし、ＩＰＬＥＸは市場から撤退している。ＩＧＦ－１の動態を改善させたＰＥＧ化ＩＧＦ－１も開発が試みられたが、治療に用いられている薬剤は存在しない。
【0011】
９．ＩＧＦ－１の作用により期待される治療効果
ＩＧＦ－１は多種の臓器に作用し、その生理機能は多岐にわたることが知られている。例えば、ＩＧＦ－１は、中枢神経系において、ＩＧＦ－１受容体の活性化を介して、ミトコンドリアの保護及び抗酸化作用による神経保護作用があることが報告されている。ＩＧＦ－１は、傷害後の神経突起の形成を促進させる。また、ＩＧＦ－１は、肝硬変の治療に有用であると考えられている。肝硬変は、肝障害又は慢性肝疾患から病態進展したものであり、肝臓の線維化を伴う疾患である。肝硬変モデル動物において、ＩＧＦ－１の投与は、肝臓の線維化を抑制した。更に、ＩＧＦ－１は、腎臓の発達、機能にも関与することが知られている。腎臓のメサンギウム細胞において、ＩＧＦ－１は、糖毒性による酸化ストレス及びアポトーシスに対して保護作用がある。ＩＧＦ－１は、腎症の治療薬として期待される。
ＩＧＦ－１は多種の臓器に作用し、その生理機能は多岐にわたることが知られている。例えば、ＩＧＦ－１は、中枢神経系において、ＩＧＦ－１受容体の活性化を介して、ミトコンドリアの保護及び抗酸化作用による神経保護作用があることが報告されている。ＩＧＦ－１は、傷害後の神経突起の形成を促進させる。また、ＩＧＦ－１は、肝硬変の治療に有用であると考えられている。肝硬変は、肝障害又は慢性肝疾患から病態進展したものであり、肝臓の線維化を伴う疾患である。肝硬変モデル動物において、ＩＧＦ－１の投与は、肝臓の線維化を抑制した。更に、ＩＧＦ－１は、腎臓の発達、機能にも関与することが知られている。腎臓のメサンギウム細胞において、ＩＧＦ－１は、糖毒性による酸化ストレス及びアポトーシスに対して保護作用がある。ＩＧＦ－１は、腎症の治療薬として期待される。
【0012】
ＩＧＦ－１の投与により改善が期待される病態には、サルコペニア、廃用性筋萎縮症、カケキシア、低身長症、ラロン症、肝硬変、肝線維化、老化、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）、神経疾患、脳卒中、脊髄損傷、心血管保護、糖尿病、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、腎症、骨粗しょう症、嚢胞性線維症、創傷治癒、筋強直性ジストロフィー、エイズ筋減弱症、ＨＩＶに伴う脂肪再分布症候群、火傷、クローン病、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖性複合免疫不全症、難聴、神経性無食欲症及び未熟児網膜症がある。このように、ＩＧＦ－１は、その多彩な生理作用から、種々の疾患の治療薬として期待される。しかし、副作用である血糖低下作用、及び短い半減期による複数回の投与が臨床で用いるための課題である。
【0013】
１０．抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体
抗体製剤は、一般的に半減期が長く、月に１回から２回の投与で有効性を示す。抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体は、インビトロ（in vitro）における短時間処理での受容体活性化作用がいくつか報告されている。例えば、抗体３Ｂ７及び抗体２Ｄ１は、インビトロにおいて５時間培養した組換えＩＧＦ－１受容体発現細胞のＤＮＡ合成を促進した（非特許文献５）。また、がん細胞株の増殖抑制活性を有する抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体１１Ａ１、１１Ａ４、１１Ａ１１、及び２４－５７は、インビトロにおいて極めて微弱であるがＩＧＦ－１受容体のチロシンのリン酸化を亢進した（非特許文献６）。また、抗体１６－１３、１７－６９、２４－５７、２４－６０、及び２４－３１は、インビトロにおいて短時間における細胞のＤＮＡ合成、及びグルコース取込みの亢進作用を有することが示されており、これらの抗体は血糖低下作用を有する可能性がある（非特許文献７）。
抗体製剤は、一般的に半減期が長く、月に１回から２回の投与で有効性を示す。抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体は、インビトロ（in vitro）における短時間処理での受容体活性化作用がいくつか報告されている。例えば、抗体３Ｂ７及び抗体２Ｄ１は、インビトロにおいて５時間培養した組換えＩＧＦ－１受容体発現細胞のＤＮＡ合成を促進した（非特許文献５）。また、がん細胞株の増殖抑制活性を有する抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体１１Ａ１、１１Ａ４、１１Ａ１１、及び２４－５７は、インビトロにおいて極めて微弱であるがＩＧＦ－１受容体のチロシンのリン酸化を亢進した（非特許文献６）。また、抗体１６－１３、１７－６９、２４－５７、２４－６０、及び２４－３１は、インビトロにおいて短時間における細胞のＤＮＡ合成、及びグルコース取込みの亢進作用を有することが示されており、これらの抗体は血糖低下作用を有する可能性がある（非特許文献７）。
【0014】
しかしながら、ＩＧＦ－１受容体チロシンリン酸化は、がん細胞増殖抑制作用を有するαＩＲ－３などの抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体でも観察されており、アゴニスト作用の指標にはならない（非特許文献５、６、８）。また、チミジンあるいはＢｒｄＵの取り込みなどＤＮＡ合成を指標とした細胞増殖アッセイにおいても、がん細胞増殖抑制作用を有する抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体でもチミジン取り込みが観察されており（非特許文献５～８）、細胞増殖活性を有するアゴニスト抗体の指標とは成り得ない。さらに、２４時間以内の短時間の評価であり、数日間の培養における細胞増殖促進に関するＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体の報告は無かった（非特許文献５～８）。ましてや、インビボ（in vivo）においてＩＧＦ－１受容体に対するアゴニスト活性を示した抗体の報告は無かった。また、ＩＧＦ－１が血糖降下作用と細胞増殖作用の両方を発揮することから、抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体を治療薬としてヒトへ投与するためには、血糖低下作用を回避することが必要であるが、これまでそのような抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体の報告は無かった。また、抗体は分子量が大きく、組織移行性が低いことが知られており脳内移行性は０．１％程度、筋肉組織移行性は２％程度である。そのため、抗体の移行性が低い組織で作用を発揮するためには、極めて低濃度域(ｐＭオーダー)で十分な薬理活性を示す抗体が必要となる。しかしながら、そのような極めて低濃度で作用し得る抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体の報告はこれまで無かった。
【0015】
斯かる背景の下、本発明者等は、インビトロにおいて極めて低濃度で筋芽細胞増殖作用を発揮し、斯かる濃度で分化骨格筋細胞の糖取り込みを誘導しない抗ＩＧＦ－１受容体モノクローナルマウス抗体ＩＧＦ１１－１６を作製することに成功している。更に、得られた該モノクローナルマウス抗体が、インビボにおいて低血糖症状を起こすことなく筋量増加作用及び成長板伸長作用を誘導することを確認している（特許文献１）。
【0016】
１１．抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体
ＩＧＦ－１受容体に結合する抗体は、ＩＧＦ－１とＩＧＦ－１受容体との結合を阻害するアンタゴニスト作用を利用して、悪性腫瘍等の治療への応用が試みられている。しかしながら、既存の抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体は単独治療において高血糖等の副作用が多いだけでなく（非特許文献９）、他の抗癌剤との併用により高血糖の発現率が上昇することから（非特許文献１０）、治療への適用は限定的なものになるものと考えられている。近年、甲状腺機能亢進症における眼症への適応でテプロツムマブ（Teprotumumab）が承認された（非特許文献１１）。
ＩＧＦ－１受容体に結合する抗体は、ＩＧＦ－１とＩＧＦ－１受容体との結合を阻害するアンタゴニスト作用を利用して、悪性腫瘍等の治療への応用が試みられている。しかしながら、既存の抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体は単独治療において高血糖等の副作用が多いだけでなく（非特許文献９）、他の抗癌剤との併用により高血糖の発現率が上昇することから（非特許文献１０）、治療への適用は限定的なものになるものと考えられている。近年、甲状腺機能亢進症における眼症への適応でテプロツムマブ（Teprotumumab）が承認された（非特許文献１１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0017】
【特許文献1】国際公開第２０１８／２２１５２１号
【非特許文献】
【0018】
【非特許文献1】ヒト ソマトメジンＣ「製剤ソマゾン（登録商標）注射用１０ｍｇ」医薬品インタビューフォーム、２０１５年５月改訂、第５版
【非特許文献2】Abuzzahab, M.J., et al., IGF-I receptor mutations resulting in intrauterine and postnatal growth retardation. N Engl J Med, 2003. 349(23): p. 2211-22.
【非特許文献3】Woods, K.A., et al., Intrauterine growth retardation and postnatal growth failure associated with deletion of the insulin-like growth factor I gene. N Engl J Med, 1996. 335(18): p. 1363-7.
【非特許文献4】Musaro, A., et al., Localized Igf-1 transgene expression sustains hypertrophy and regeneration in senescent skeletal muscle, Nature Genetics, 2001, Vol.27, No.2, pp.195-200
【非特許文献5】Xiong, L., et al., Growth-stimulatory monoclonal antibodies against human insulin-like growth factor I receptor. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992. 89(12): p. 5356-60.
【非特許文献6】Runnels, H.A., et al., Human monoclonal antibodies to the insulin-like growth factor １ receptor inhibit receptor activation and tumor growth in preclinical studies. Adv Ther, 2010. 27(7): p. 458-75.
【非特許文献7】Soos, M.A., et al., A panel of monoclonal antibodies for the type I insulin-like growth factor receptor. Epitope mapping, effects on ligand binding, and biological activity. J Biol Chem, 1992. 267(18): p. 12955-63.
【非特許文献8】Kato, H., et al., Role of tyrosine kinase activity in signal transduction by the insulin-like growth factor-I (IGF-I) receptor. Characterization of kinase-deficient IGF-I receptors and the action of an IGF-I-mimetic antibody (alpha IR-3). J Biol Chem, 1993. 268(4): p. 2655-61.
【非特許文献9】Atzori, F., et al., A Phase I Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Study of Dalotuzumab (MK-0646), an Anti-Insulin-like Growth Factor-1 Receptor Monoclonal Antibody, in Patients with Advanced Solid Tumors. Clin Cancer Res., 2011.17(19):p.6304-12.
【非特許文献10】de Bono J.S., et al., Phase II randomized study of figitumumab plus docetaxel and docetaxel alone with crossover for metastaticcastration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res., 2014.20(7):p.1925-34.
【非特許文献11】Markham. A, Teprotumumab: First Approval. Drugs, 2020. 80(5): p.509-512.
【非特許文献12】Riechman, L., Clark, M., Waldmann, H., Winter, G.: Reshaping human antibodies for therapy. Nature, 1988. 332：p.323-327.
【非特許文献13】Kabat et al., The Journal of Immunology, 1991, Vol.147, No.5, pp.1709-1719
【非特許文献14】Al-Lazikani et al., Journal of Molecular Biology, 1997, Vol.273, No.4, pp.927-948
【非特許文献15】Abhinandan, K.R. et al., Molecular Immunology, 2008, Vol.45, pp.3832-3839
【非特許文献16】Jian, Y. et al., Nucleic Acids Research, 2013, Vol.41, W34-W40
【非特許文献17】Yamada, T. et al., Therapeutic monoclonal antibodies. Keio Journal of Medicine, 2011, Vol.60, No.2, pp37-46
【非特許文献18】Burks, E. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, Vol.94, No.2, pp.412-417
【非特許文献19】Dumet, C., et al., MAbs, 2019, Vol.11, No.8, pp1341-1350
【非特許文献20】Saunders, K. O., Frontiers in Immunology, 2019, Vol.10, Article 1296
【非特許文献21】Walle et al., Expert Opin. Biol. Ther., 2007, Vol.7, No.3, pp.405-418
【非特許文献22】Silva, J-P., et al., The Journal of Biological Chemistry, 2015, Vol.290, No.9, pp.5462-5469
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0019】
本発明は、既報の抗ＩＧＦ－１受容体マウス抗体ＩＧＦ１１－１６（特許文献１）と同等以上の特異性、及び、結合親和性又は活性を有する、抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体、又はそれらの作製方法を提供することを、その目的の一つとする。
【0020】
本発明の具体的な目的としては、これらに限定される訳ではないが、例えば、既報の抗ＩＧＦ－１受容体マウス抗体ＩＧＦ１１－１６（特許文献１）と同等以上の特異性、及び、結合親和性又は活性を有するヒト化抗体を取得するための、（１）ヒトフレームワークのデザインに必須なアミノ酸の提供、（２）抗原結合部位であるＣＤＲ配列（本発明ではＫａｂａｔ法により同定）において活性維持に必須なアミノ酸部位の提供、（３）免疫原性低下のためのアミノ酸置換の提供、及び、（４）脱アミド化リスク回避のためのアミノ酸置換の提供、等が挙げられる。
【0021】
本発明を利用・応用することにより、例えば、ヒトＩＧＦ－１受容体を介して、低血糖症状を誘導すること無く、筋肉量を増加させることが可能な、抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体を得ることができる。これにより、例えばサルコペニア、廃用性筋萎縮、又はカケキシアなどの、ＩＧＦ－１受容体シグナルに関連する病態又は疾患を改善又は治療することを目的としてヒトへ投与し得る、抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体を得ることができる。また、ヒトへ投与し得る、低免疫原性や物性安定性を確保したヒト化抗体の提供が可能となる。
【課題を解決するための手段】
【0022】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６に由来する重鎖及び軽鎖の各相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体に由来する重鎖及び軽鎖の各フレームワーク領域（ＦＲ）とを含むと共に、少なくとも１つのＣＤＲが、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の対応するＣＤＲに対して、少なくとも１箇所のアミノ酸残基の置換を含む、抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２］重鎖可変領域のフレームワーク領域１（ＦＲ－Ｈ１）の２５位のアミノ酸残基がプロリンである、項［１］に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［３］重鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｈ１）配列として、配列番号１のアミノ酸配列、又は、配列番号１の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
重鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）配列として、配列番号３若しくは配列番号５のアミノ酸配列、又は、配列番号３若しくは配列番号５の何れか１箇所、２箇所、若しくは３箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
重鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｈ３）配列として、配列番号７のアミノ酸配列、又は、配列番号７の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｌ１）配列として、配列番号９のアミノ酸配列、又は、配列番号９の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｌ２）配列として、配列番号１１のアミノ酸配列、又は、配列番号１１の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｌ３）配列として、配列番号１３のアミノ酸配列、又は、配列番号１３の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列
を含む、項［１］又は［２］に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［４］重鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｈ１）配列として、配列番号１と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
重鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）配列として、配列番号３又は配列番号５と８２％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
重鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｈ３）配列として、配列番号７と７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｌ１）配列として、配列番号９と８１％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｌ２）配列として、配列番号１１と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｌ３）配列として、配列番号１３と７７％以上の相同性を有するアミノ酸配列
を含む、項［１］又は［２］に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［５］重鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｈ１）配列として、配列番号１の３位のＴｒｐが維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列であって、当該３位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号１と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
重鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）配列として、
配列番号３の１位のＧｌｕ及び３位のＡｓｎが各々維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されると共に、６位のＡｓｎが維持され、又は、Ｓｅｒ若しくはＧｌｎに置換されたアミノ酸配列であって、当該１位、３位、及び６位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所、２箇所、若しくは３箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号３と８２％以上の相同性を有するアミノ酸配列、或いは、
配列番号５の１位のＧｌｕ及び３位のＡｓｎが各々維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されると共に、６位のＳｅｒが維持され、又は、Ａｓｎ若しくはＧｌｎに置換されたアミノ酸配列であって、当該１位、３位、及び６位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所、２箇所、若しくは３箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号５と８２％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
重鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｈ３）配列として、配列番号７の４位のＡｒｇが維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列であって、当該４位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号７と７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｌ１）配列として、配列番号９の９位のＴｒｐが維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列であって、当該９位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号９と８１％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｌ２）配列として、配列番号１１の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号１１と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｌ３）配列として、配列番号１３の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号１３と７７％以上の相同性を有するアミノ酸配列
を含む、項［１］又は［２］に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［６］配列番号７１のアミノ酸配列を有するヒトＩＧＦ－１受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する、請求項１～５の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［７］重鎖可変領域として、配列番号４３、４７、４９、５３、５５、若しくは５９のアミノ酸配列、配列番号４３、４７、４９、５３、５５、若しくは５９のアミノ酸配列において１若しくは数箇所のアミノ酸残基が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、配列番号４３、４７、４９、５３、５５、若しくは５９と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び、
軽鎖可変領域として、配列番号６５、６７、若しくは６９のアミノ酸配列、配列番号６５、６７、若しくは６９のアミノ酸配列において１若しくは数箇所のアミノ酸残基が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、配列番号６５、６７、若しくは６９と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
を含む、項［１］～［６］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［８］重鎖及び／又は軽鎖の定常領域として、ヒト免疫グロブリンの何れかのクラスの重鎖及び／又は軽鎖の定常領域を含む、項［１］～［７］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［９］重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ４クラスの重鎖定常領域又はその１～１０箇所のアミノ酸が置換された定常領域である、項［１］～［８］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１０］重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ１クラスの重鎖定常領域又はその１～１０箇所のアミノ酸が置換された定常領域である、項［１］～［８］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１１］ＩＧＦ－１受容体に対して平衡解離定数（ＫＤ）１×１０-7Ｍ以下の親和性で結合する、項［１］～［１０］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１２］ＩＧＦ－１受容体シグナル活性化能を有する、項［１］～［１１］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１３］筋芽細胞増殖試験において、増殖活性を有する、項［１］～［１２］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１４］ＢＩＡＣＯＲＥによる組換え可溶性ＩＧＦ－１受容体への結合性試験において、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等以上の結合親和性を有する、項［１］～［１３］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１５］正常哺乳動物において、低血糖症状を誘導せず、筋量増加作用を誘導しうる、項［１］～［１４］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１６］下垂体摘出モデル動物において、低血糖症状を誘導せず、成長板軟骨伸長作用を誘導しうる、項［１］～［１５］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１７］脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する用量において当該脊椎動物に投与された場合に、当該脊椎動物の血糖値を低下させない、項［１］～［１６］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１８］脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する有効用量に対して１０倍以上の血中曝露量においても、当該脊椎動物の血糖値を低下させない、項［１］～［１６］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１９］ＩＧＦ－１受容体シグナル活性化抑制能を有する、項［１］～［１８］の何れか一項に記載のヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２０］筋芽細胞増殖試験において、ＩＧＦ－１受容体を活性化しうるリガンドであるＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、及びインスリンの少なくとも一つの増殖活性を抑制する、項［１］～［１８］の何れか一項に記載のヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２１］がん細胞増殖試験において、細胞増殖を抑制する活性を有する、項［１］～［２０］の何れか一項に記載のヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２２］抗ＩＧＦ－Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体が、１）～４）の少なくとも一つの特徴を有する、項［１］～［２１］のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ－Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
１）ＩＧＦ－Ｉ受容体活性化リガンドによる脊椎動物由来細胞の増殖を阻害する。
２）脊椎動物におけるＩＧＦ－Ｉ受容体活性化リガンドに起因する細胞増殖性疾患における細胞増殖を抑制する。
３）ＩＧＦ－Ｉ受容体活性化リガンドによる脊椎動物由来細胞の増殖を阻害する用量において、分化筋細胞でのグルコース取込みに影響しない。
４）脊椎動物におけるＩＧＦ－Ｉ受容体活性化リガンドに起因する細胞増殖性疾患における細胞増殖を抑制する用量において、当該脊椎動物の血糖値を変動させない。
［２３］担癌モデル動物において、血糖値に影響を与えることなく、がん細胞増殖抑制作用を誘導しうる、項［１］～［２２］の何れか一項に記載のヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２４］担癌モデル動物において、がん細胞増殖抑制作用を誘導しうる有効用量に対して１０倍以上の血中曝露量においても、当該モデル動物の血糖値に影響を与えない、項［２３］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２５］項［１］～［２４］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子。
［２６］項［２５］に記載の核酸分子を少なくとも一つ含むクローニングベクター又は発現ベクター。
［２７］項［２６］に記載のベクターが宿主細胞に導入された組換え体細胞。
［２８］項［１］～［２４］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体を製造する方法であって、項［２７］に記載の組換え体細胞を培養し、前記組換え体細胞から産生される当該抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体を精製する工程を含む方法。
［２９］項［１］～［２４］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体、項［２５］に記載の核酸分子、項［２６］に記載のベクター、或いは項［２７］に記載の組換え体細胞を有効成分として含む、医薬組成物。
［３０］筋萎縮性疾患又は低身長症の治療に用いられる、項［２９］に記載の医薬組成物。
［３１］筋萎縮性疾患が、廃用性筋萎縮、サルコペニア、又はカヘキシアである、項［３０］に記載の医薬組成物。
［３２］低身長症が、ラロン型低身長症又は成長ホルモン抵抗性低身長症である、項［２８］に記載の医薬組成物。
［３３］ＩＧＦ－１受容体に関連した疾患の治療に用いられる、項［２９］に記載の医薬組成物。
［３４］ＩＧＦ－Ｉ受容体に関連した疾患が、肝臓がん、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、小児がん、先端巨大症、卵巣がん、膵臓がん、良性前立腺肥大症、乳がん、前立腺がん、骨がん、肺がん、結腸直腸がん、頚部がん、滑膜肉腫、膀胱がん、胃がん、ウィルムス腫瘍、転移性カルチノイド及び血管作動性腸管ペプチド分泌腫瘍に関連する下痢、ビポーマ、ウェルナー－モリソン症候群、ベックウィズ－ヴィーデマン症候群、腎臓がん、腎細胞がん、移行上皮がん、ユーイング肉腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、脳腫瘍、膠芽腫、非膠芽腫性脳腫瘍、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、脳室上衣腫、脈絡叢乳頭腫、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管の平滑筋再狭窄、不適切な微小血管増殖、糖尿病性網膜症、グレーヴズ病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、自己免疫性甲状腺疾患、橋本甲状腺炎、甲状腺眼症、甲状腺機能亢進症ならびにベーチェット病からなる群より選択される疾患である、項［３３］に記載の医薬組成物。
［１］マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６に由来する重鎖及び軽鎖の各相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体に由来する重鎖及び軽鎖の各フレームワーク領域（ＦＲ）とを含むと共に、少なくとも１つのＣＤＲが、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の対応するＣＤＲに対して、少なくとも１箇所のアミノ酸残基の置換を含む、抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２］重鎖可変領域のフレームワーク領域１（ＦＲ－Ｈ１）の２５位のアミノ酸残基がプロリンである、項［１］に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［３］重鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｈ１）配列として、配列番号１のアミノ酸配列、又は、配列番号１の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
重鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）配列として、配列番号３若しくは配列番号５のアミノ酸配列、又は、配列番号３若しくは配列番号５の何れか１箇所、２箇所、若しくは３箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
重鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｈ３）配列として、配列番号７のアミノ酸配列、又は、配列番号７の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｌ１）配列として、配列番号９のアミノ酸配列、又は、配列番号９の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｌ２）配列として、配列番号１１のアミノ酸配列、又は、配列番号１１の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｌ３）配列として、配列番号１３のアミノ酸配列、又は、配列番号１３の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列
を含む、項［１］又は［２］に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［４］重鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｈ１）配列として、配列番号１と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
重鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）配列として、配列番号３又は配列番号５と８２％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
重鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｈ３）配列として、配列番号７と７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｌ１）配列として、配列番号９と８１％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｌ２）配列として、配列番号１１と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｌ３）配列として、配列番号１３と７７％以上の相同性を有するアミノ酸配列
を含む、項［１］又は［２］に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［５］重鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｈ１）配列として、配列番号１の３位のＴｒｐが維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列であって、当該３位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号１と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
重鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）配列として、
配列番号３の１位のＧｌｕ及び３位のＡｓｎが各々維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されると共に、６位のＡｓｎが維持され、又は、Ｓｅｒ若しくはＧｌｎに置換されたアミノ酸配列であって、当該１位、３位、及び６位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所、２箇所、若しくは３箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号３と８２％以上の相同性を有するアミノ酸配列、或いは、
配列番号５の１位のＧｌｕ及び３位のＡｓｎが各々維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されると共に、６位のＳｅｒが維持され、又は、Ａｓｎ若しくはＧｌｎに置換されたアミノ酸配列であって、当該１位、３位、及び６位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所、２箇所、若しくは３箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号５と８２％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
重鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｈ３）配列として、配列番号７の４位のＡｒｇが維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列であって、当該４位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号７と７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｌ１）配列として、配列番号９の９位のＴｒｐが維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列であって、当該９位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号９と８１％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｌ２）配列として、配列番号１１の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号１１と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
軽鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｌ３）配列として、配列番号１３の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号１３と７７％以上の相同性を有するアミノ酸配列
を含む、項［１］又は［２］に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［６］配列番号７１のアミノ酸配列を有するヒトＩＧＦ－１受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する、請求項１～５の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［７］重鎖可変領域として、配列番号４３、４７、４９、５３、５５、若しくは５９のアミノ酸配列、配列番号４３、４７、４９、５３、５５、若しくは５９のアミノ酸配列において１若しくは数箇所のアミノ酸残基が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、配列番号４３、４７、４９、５３、５５、若しくは５９と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び、
軽鎖可変領域として、配列番号６５、６７、若しくは６９のアミノ酸配列、配列番号６５、６７、若しくは６９のアミノ酸配列において１若しくは数箇所のアミノ酸残基が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、配列番号６５、６７、若しくは６９と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
を含む、項［１］～［６］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［８］重鎖及び／又は軽鎖の定常領域として、ヒト免疫グロブリンの何れかのクラスの重鎖及び／又は軽鎖の定常領域を含む、項［１］～［７］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［９］重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ４クラスの重鎖定常領域又はその１～１０箇所のアミノ酸が置換された定常領域である、項［１］～［８］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１０］重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ１クラスの重鎖定常領域又はその１～１０箇所のアミノ酸が置換された定常領域である、項［１］～［８］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１１］ＩＧＦ－１受容体に対して平衡解離定数（ＫＤ）１×１０-7Ｍ以下の親和性で結合する、項［１］～［１０］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１２］ＩＧＦ－１受容体シグナル活性化能を有する、項［１］～［１１］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１３］筋芽細胞増殖試験において、増殖活性を有する、項［１］～［１２］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１４］ＢＩＡＣＯＲＥによる組換え可溶性ＩＧＦ－１受容体への結合性試験において、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等以上の結合親和性を有する、項［１］～［１３］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１５］正常哺乳動物において、低血糖症状を誘導せず、筋量増加作用を誘導しうる、項［１］～［１４］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１６］下垂体摘出モデル動物において、低血糖症状を誘導せず、成長板軟骨伸長作用を誘導しうる、項［１］～［１５］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１７］脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する用量において当該脊椎動物に投与された場合に、当該脊椎動物の血糖値を低下させない、項［１］～［１６］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１８］脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する有効用量に対して１０倍以上の血中曝露量においても、当該脊椎動物の血糖値を低下させない、項［１］～［１６］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１９］ＩＧＦ－１受容体シグナル活性化抑制能を有する、項［１］～［１８］の何れか一項に記載のヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２０］筋芽細胞増殖試験において、ＩＧＦ－１受容体を活性化しうるリガンドであるＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、及びインスリンの少なくとも一つの増殖活性を抑制する、項［１］～［１８］の何れか一項に記載のヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２１］がん細胞増殖試験において、細胞増殖を抑制する活性を有する、項［１］～［２０］の何れか一項に記載のヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２２］抗ＩＧＦ－Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体が、１）～４）の少なくとも一つの特徴を有する、項［１］～［２１］のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ－Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
１）ＩＧＦ－Ｉ受容体活性化リガンドによる脊椎動物由来細胞の増殖を阻害する。
２）脊椎動物におけるＩＧＦ－Ｉ受容体活性化リガンドに起因する細胞増殖性疾患における細胞増殖を抑制する。
３）ＩＧＦ－Ｉ受容体活性化リガンドによる脊椎動物由来細胞の増殖を阻害する用量において、分化筋細胞でのグルコース取込みに影響しない。
４）脊椎動物におけるＩＧＦ－Ｉ受容体活性化リガンドに起因する細胞増殖性疾患における細胞増殖を抑制する用量において、当該脊椎動物の血糖値を変動させない。
［２３］担癌モデル動物において、血糖値に影響を与えることなく、がん細胞増殖抑制作用を誘導しうる、項［１］～［２２］の何れか一項に記載のヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２４］担癌モデル動物において、がん細胞増殖抑制作用を誘導しうる有効用量に対して１０倍以上の血中曝露量においても、当該モデル動物の血糖値に影響を与えない、項［２３］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２５］項［１］～［２４］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子。
［２６］項［２５］に記載の核酸分子を少なくとも一つ含むクローニングベクター又は発現ベクター。
［２７］項［２６］に記載のベクターが宿主細胞に導入された組換え体細胞。
［２８］項［１］～［２４］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体を製造する方法であって、項［２７］に記載の組換え体細胞を培養し、前記組換え体細胞から産生される当該抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体を精製する工程を含む方法。
［２９］項［１］～［２４］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体、項［２５］に記載の核酸分子、項［２６］に記載のベクター、或いは項［２７］に記載の組換え体細胞を有効成分として含む、医薬組成物。
［３０］筋萎縮性疾患又は低身長症の治療に用いられる、項［２９］に記載の医薬組成物。
［３１］筋萎縮性疾患が、廃用性筋萎縮、サルコペニア、又はカヘキシアである、項［３０］に記載の医薬組成物。
［３２］低身長症が、ラロン型低身長症又は成長ホルモン抵抗性低身長症である、項［２８］に記載の医薬組成物。
［３３］ＩＧＦ－１受容体に関連した疾患の治療に用いられる、項［２９］に記載の医薬組成物。
［３４］ＩＧＦ－Ｉ受容体に関連した疾患が、肝臓がん、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、小児がん、先端巨大症、卵巣がん、膵臓がん、良性前立腺肥大症、乳がん、前立腺がん、骨がん、肺がん、結腸直腸がん、頚部がん、滑膜肉腫、膀胱がん、胃がん、ウィルムス腫瘍、転移性カルチノイド及び血管作動性腸管ペプチド分泌腫瘍に関連する下痢、ビポーマ、ウェルナー－モリソン症候群、ベックウィズ－ヴィーデマン症候群、腎臓がん、腎細胞がん、移行上皮がん、ユーイング肉腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、脳腫瘍、膠芽腫、非膠芽腫性脳腫瘍、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、脳室上衣腫、脈絡叢乳頭腫、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管の平滑筋再狭窄、不適切な微小血管増殖、糖尿病性網膜症、グレーヴズ病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、自己免疫性甲状腺疾患、橋本甲状腺炎、甲状腺眼症、甲状腺機能亢進症ならびにベーチェット病からなる群より選択される疾患である、項［３３］に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【0023】
本発明の抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体は、ヒトＩＧＦ－１受容体に結合することで、ヒトＩＧＦ－１受容体を介して作用する疾患の治療又は予防に使用しうる、抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体を得ることができる。また、ヒトへ投与し得る、低免疫原性や物性安定性を確保したヒト化抗体の提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【発明を実施するための形態】
【0033】
以下、本発明を具体的な実施形態に基づき説明するが、本発明はこれらの実施形態に何ら限定されない。なお、本明細書において引用する特許公報、特許出願公開公報、及び非特許公報を含む全ての文献は、あらゆる目的において、その全体が援用により本明細書に組み込まれる。
【0034】
なお、本明細書において、濃度を示す「Ｍ」は、モル濃度を示す「ｍｏｌ／Ｌ」と同義の単位である。
【0035】
本発明は、ＩＧＦ－１受容体に特異的に結合する、抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体である。本発明の抗体は、ヒトＩＧＦ－１受容体を介して、低血糖症状を誘導すること無く、筋肉量を増加させる作用を有する。これにより、サルコペニア、廃用性筋萎縮、カケキシアなどのＩＧＦ－１受容体シグナル関与の病態又は疾患を改善又は治療することが可能である。また、本発明の抗体は、低免疫原性及び物性安定性を確保したヒト化抗体である。
【0036】
［ＩＧＦ］
本開示において「ＩＧＦ」とは、インスリン様成長因子（Insulin-like Growth Factor）のことをいい、ＩＧＦ－１とＩＧＦ－２が存在する。ＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２は、後述のＩＧＦ－１受容体（インスリン様成長因子－Ｉ受容体：Insulin-like Growth Factor-I Receptor）に結合して、細胞内に細胞分裂や代謝のシグナルを入れるアゴニスト活性を有する生体内のリガンドである。ＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２は、ＩＧＦ－１受容体と構造的に類似性のあるインスリン受容体（ＩＮＳＲ）にも弱く交差的に結合することが知られている。本明細書では、生理的機能等がよりよく知られているＩＧＦ－１を主に扱うが、ＩＧＦ－１受容体とリガンドとの結合を介する作用や疾患等の検討を行う場合には、ＩＧＦ－１とＩＧＦ－２の両者の作用を含めて記載することがある。
本開示において「ＩＧＦ」とは、インスリン様成長因子（Insulin-like Growth Factor）のことをいい、ＩＧＦ－１とＩＧＦ－２が存在する。ＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２は、後述のＩＧＦ－１受容体（インスリン様成長因子－Ｉ受容体：Insulin-like Growth Factor-I Receptor）に結合して、細胞内に細胞分裂や代謝のシグナルを入れるアゴニスト活性を有する生体内のリガンドである。ＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２は、ＩＧＦ－１受容体と構造的に類似性のあるインスリン受容体（ＩＮＳＲ）にも弱く交差的に結合することが知られている。本明細書では、生理的機能等がよりよく知られているＩＧＦ－１を主に扱うが、ＩＧＦ－１受容体とリガンドとの結合を介する作用や疾患等の検討を行う場合には、ＩＧＦ－１とＩＧＦ－２の両者の作用を含めて記載することがある。
【0037】
ＩＧＦ－１はソマトメジンＣとも呼ばれ、７０アミノ酸からなる単一ポリペプチドのホルモンである。ヒトのＩＧＦ－１の配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ番号：ＮＰ＿０００６０９、又は、ＥＭＢＬ－ＥＢＩのＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－アクセッション番号Ｐ０５０１９等を参照して入手できる。成熟型ヒトＩＧＦ－１のアミノ酸配列を配列番号８３に、対応する核酸塩基配列の一例を配列番号８４にそれぞれ示す。この７０アミノ酸からなる配列は、多くの種で保存されている。本発明においては、「ＩＧＦ－１」とのみ記載された場合は、特に断りがない限り、ホルモン活性を有するＩＧＦ－１タンパク質のことを意味する。
【0038】
ＩＧＦ－１は、肝臓細胞をはじめ生体内の種々の細胞で産生されていて、血液やその他の体液中にも存在する。従って、天然型のＩＧＦ－１は動物の体液や、動物から分離した初代培養細胞や株化細胞等を培養した培養物から精製して得ることができる。また、ＩＧＦ－１は成長ホルモンによって細胞での産生が誘導されるため、成長ホルモンが投与された動物の体液や、動物から分離した初代培養細胞や株化細胞等を成長ホルモン存在下で培養した培養物からもＩＧＦ－１を精製することで得られる。また、別の方法として、ＩＧＦ－１のアミノ酸配列をコードする核酸分子を発現ベクターに組み込んで大腸菌等の原核生物や酵母、昆虫細胞又は哺乳類由来の培養細胞等の真核細胞の宿主に導入した組換え体細胞や、ＩＧＦ－１遺伝子を導入したトランスジェニック動物やトランスジェニック植物等を用いて、ＩＧＦ－１を製造することも可能である。更に、ヒトＩＧＦ－１は研究用試薬（Enzo Life Sciences, catalog: ADI-908-059-0100; Abnova, catalog: P3452等）、医薬品（ソマゾン（登録商標）、メカセルミン、ＩＮＣＲＥＬＥＸ（登録商標）等）として入手することも可能である。用いるＩＧＦ－１のインビボ及びインビトロでの活性は、World Health OrganizationのNational Institute for Biological Standards and Control（ＮＩＢＳＣ）のＮＩＢＳＣ ｃｏｄｅ：９１／５５４のＩＧＦ－１標準物質での活性を１国際ユニット／マイクログラムとして比較することで、その比活性を評価することができる。本発明におけるＩＧＦ－１は、当該ＮＩＢＳＣ ｃｏｄｅ：９１／５５４のＩＧＦ－１と同等の比活性を有するものとして扱うものとする。
【0039】
［ＩＧＦ－１受容体］
本開示において「ＩＧＦ－１受容体」又は「ＩＧＦ－１Ｒ」とは、インスリン様成長因子－Ｉ受容体（Insulin-like Growth Factor-I Receptor）のことをいう。本明細書において「ＩＧＦ－１受容体」は、特に断りがない限り、ＩＧＦ－１受容体タンパク質を意味する。ＩＧＦ－１受容体はα鎖とβ鎖からなるサブユニットが２つ会合した構造のタンパク質である。配列番号７１に示したヒトＩＧＦ－１受容体のアミノ酸配列においては、そのアミノ酸配列のうち、３１位から７３５位のアミノ酸配列からなる部分がα鎖に相当し、β鎖は７４０位以降の配列に相当する。ＩＧＦ－１受容体のα鎖はＩＧＦ－１の結合部分を有し、β鎖は膜貫通型の構造であり、細胞内へのシグナルを伝える働きをする。ＩＧＦ－１受容体のα鎖は、Ｌ１、ＣＲ、Ｌ２、ＦｎIII－１及びＦｎIII－２ａ／ＩＤ／ＦｎIII－２ｂのドメインに分かれる。配列番号７１に示したヒトＩＧＦ－１受容体のアミノ酸配列においては、３１位から１７９位の部分がＬ１ドメイン、１８０位から３２８位の部分がＣＲドメイン、３２９位から４９１位の部分がＬ２ドメイン、４９２位から６０７位の部分がＦｎIII－１ドメイン及び６０８位から７３５位までがＦｎIII－２ａ／ＩＤ／ＦｎIII－２ｂドメインに相当する。ヒトのＩＧＦ－１受容体のアミノ酸配列は、ＥＭＢＬ－ＥＢＩのＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－アクセッション番号Ｐ０８０６９等から参照することが可能であるが、配列表の配列番号７１にも示す。
本開示において「ＩＧＦ－１受容体」又は「ＩＧＦ－１Ｒ」とは、インスリン様成長因子－Ｉ受容体（Insulin-like Growth Factor-I Receptor）のことをいう。本明細書において「ＩＧＦ－１受容体」は、特に断りがない限り、ＩＧＦ－１受容体タンパク質を意味する。ＩＧＦ－１受容体はα鎖とβ鎖からなるサブユニットが２つ会合した構造のタンパク質である。配列番号７１に示したヒトＩＧＦ－１受容体のアミノ酸配列においては、そのアミノ酸配列のうち、３１位から７３５位のアミノ酸配列からなる部分がα鎖に相当し、β鎖は７４０位以降の配列に相当する。ＩＧＦ－１受容体のα鎖はＩＧＦ－１の結合部分を有し、β鎖は膜貫通型の構造であり、細胞内へのシグナルを伝える働きをする。ＩＧＦ－１受容体のα鎖は、Ｌ１、ＣＲ、Ｌ２、ＦｎIII－１及びＦｎIII－２ａ／ＩＤ／ＦｎIII－２ｂのドメインに分かれる。配列番号７１に示したヒトＩＧＦ－１受容体のアミノ酸配列においては、３１位から１７９位の部分がＬ１ドメイン、１８０位から３２８位の部分がＣＲドメイン、３２９位から４９１位の部分がＬ２ドメイン、４９２位から６０７位の部分がＦｎIII－１ドメイン及び６０８位から７３５位までがＦｎIII－２ａ／ＩＤ／ＦｎIII－２ｂドメインに相当する。ヒトのＩＧＦ－１受容体のアミノ酸配列は、ＥＭＢＬ－ＥＢＩのＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－アクセッション番号Ｐ０８０６９等から参照することが可能であるが、配列表の配列番号７１にも示す。
【0040】
ＩＧＦ－１受容体は生体内の組織や細胞の広い範囲で発現していることが知られており、ＩＧＦ－１による細胞増殖の誘導や細胞内シグナルの活性化等の刺激を受ける。特に筋芽細胞はＩＧＦ－１のＩＧＦ－１受容体を介する作用を、細胞増殖活性を指標として評価に用いることが可能である。このことから筋芽細胞は、ＩＧＦ－１受容体に結合する抗体の作用を解析する上で有用である。また、ヒトやその他の脊椎動物のＩＧＦ－１受容体のアミノ酸配列をコードする核酸分子を発現ベクターに組み込んで、昆虫細胞又は哺乳類由来の培養細胞等の真核細胞の宿主に導入した組換え体細胞において、その細胞膜上に導入された核酸がコードするＩＧＦ－１受容体を発現させることで、ヒトやその他の脊椎動物のＩＧＦ－１受容体を発現した細胞を人工的に製造することが可能である。当該ＩＧＦ－１受容体発現細胞は抗体の結合性の解析や細胞内へのシグナルの伝達等の検討に用いることができる。
【0041】
［マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６］
マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６は、特許文献１に開示されている。ＩＧＦ１１－１６のＣＤＲ－Ｈ１のアミノ酸配列は配列番号８５、ＣＤＲ－Ｈ２のアミノ酸配列は配列番号８６、ＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列は配列番号８７、ＣＤＲ－Ｌ１のアミノ酸配列は配列番号８８、ＣＤＲ－Ｌ２のアミノ酸配列は配列番号８９、ＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は配列番号９０、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号３９（対応する核酸塩基配列の一例を配列番号４０）、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４１（対応する核酸塩基配列の一例を配列番号４２）に示す。ＩＧＦ１１－１６の軽鎖の全長アミノ酸配列を配列番号９１（対応する核酸塩基配列の一例を配列番号９２）に、重鎖の全長アミノ酸配列を配列番号９３（対応する核酸塩基配列の一例を配列番号９４）に示す。ＩＧＦ１１－１６の表現を含む抗体は、全てこのマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６を意味する。
マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６は、特許文献１に開示されている。ＩＧＦ１１－１６のＣＤＲ－Ｈ１のアミノ酸配列は配列番号８５、ＣＤＲ－Ｈ２のアミノ酸配列は配列番号８６、ＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列は配列番号８７、ＣＤＲ－Ｌ１のアミノ酸配列は配列番号８８、ＣＤＲ－Ｌ２のアミノ酸配列は配列番号８９、ＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は配列番号９０、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号３９（対応する核酸塩基配列の一例を配列番号４０）、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４１（対応する核酸塩基配列の一例を配列番号４２）に示す。ＩＧＦ１１－１６の軽鎖の全長アミノ酸配列を配列番号９１（対応する核酸塩基配列の一例を配列番号９２）に、重鎖の全長アミノ酸配列を配列番号９３（対応する核酸塩基配列の一例を配列番号９４）に示す。ＩＧＦ１１－１６の表現を含む抗体は、全てこのマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６を意味する。
【0042】
［抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体］
本発明の一側面によれば、新規な抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体が提供される（これを以下適宜「本発明の抗体」と称する。）。
本開示において「抗体」とは、ジスルフィド結合により相互結合された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨと略される）及び重鎖定常領域を含み、重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬと略される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含む。軽鎖の定常領域にはλ鎖及びκ鎖と呼ばれる２種類が存在する。重鎖の定常領域にはγ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖及びε鎖が存在し、その重鎖の違いによって、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥという抗体のアイソタイプが存在する。ＶＨ及びＶＬは、更にフレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存されている４つの領域（ＦＲ－１（ＦＲ１）、ＦＲ－２（ＦＲ２）、ＦＲ－３（ＦＲ３）、ＦＲ－４（ＦＲ４））と、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の３つの領域（ＣＤＲ－１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ－２（ＣＤＲ２）、ＣＤＲ－３（ＣＤＲ３））に細分される。ＶＨは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＦＲ－１（ＦＲ－Ｈ１）、ＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｈ１）、ＦＲ－２（ＦＲ－Ｈ２）、ＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）、ＦＲ－３（ＦＲ－Ｈ３）、ＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｈ３）、ＦＲ－４（ＦＲ－Ｈ４）の順番で配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含む。ＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＦＲ－１（ＦＲ－Ｌ１）、ＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｌ１）、ＦＲ－２（ＦＲ－Ｌ２）、ＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｌ２）、ＦＲ－３（ＦＲ－Ｌ３）、ＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｌ３）、ＦＲ－４（ＦＲ－Ｌ４）の順番で配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含む。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
本発明の一側面によれば、新規な抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体が提供される（これを以下適宜「本発明の抗体」と称する。）。
本開示において「抗体」とは、ジスルフィド結合により相互結合された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨと略される）及び重鎖定常領域を含み、重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬと略される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含む。軽鎖の定常領域にはλ鎖及びκ鎖と呼ばれる２種類が存在する。重鎖の定常領域にはγ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖及びε鎖が存在し、その重鎖の違いによって、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥという抗体のアイソタイプが存在する。ＶＨ及びＶＬは、更にフレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存されている４つの領域（ＦＲ－１（ＦＲ１）、ＦＲ－２（ＦＲ２）、ＦＲ－３（ＦＲ３）、ＦＲ－４（ＦＲ４））と、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の３つの領域（ＣＤＲ－１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ－２（ＣＤＲ２）、ＣＤＲ－３（ＣＤＲ３））に細分される。ＶＨは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＦＲ－１（ＦＲ－Ｈ１）、ＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｈ１）、ＦＲ－２（ＦＲ－Ｈ２）、ＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）、ＦＲ－３（ＦＲ－Ｈ３）、ＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｈ３）、ＦＲ－４（ＦＲ－Ｈ４）の順番で配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含む。ＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＦＲ－１（ＦＲ－Ｌ１）、ＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｌ１）、ＦＲ－２（ＦＲ－Ｌ２）、ＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｌ２）、ＦＲ－３（ＦＲ－Ｌ３）、ＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｌ３）、ＦＲ－４（ＦＲ－Ｌ４）の順番で配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含む。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
【0043】
本発明の抗体は、抗体の断片及び／又は誘導体であってもよい。抗体の断片としては、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆｖ等が挙げられる。抗体の誘導体としては、定常領域部分に人工的にアミノ酸変異を導入した抗体、定常領域のドメインの構成を改変した抗体、１分子あたり２つ以上のＦｃを持つ形の抗体、重鎖のみ又は軽鎖のみで構成される抗体、糖鎖改変抗体、二重特異性抗体、抗体又は抗体の断片化合物や抗体以外のタンパク質と結合させた抗体コンジュゲート、抗体酵素、ナノボディ、タンデムｓｃＦｖ、二重特異性タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ（Diabody）、ＶＨＨ等が挙げられる。なお、本発明において単に「抗体」という場合には、別途明記しない限り、抗体の断片及び／又は誘導体も含むものとする。
【0044】
また、モノクローナル抗体とは、古典的には単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体分子をいうが、特定のアミノ酸配列からなるＶＨとＶＬの組み合わせを含む単一種類の抗体分子のことをいう。モノクローナル抗体は、その抗体のタンパク質のアミノ酸をコードする遺伝子配列を有する核酸分子を得ることも可能であり、そのような核酸分子を用いて遺伝子工学的に抗体を作製することも可能である。また、Ｈ鎖、Ｌ鎖、それらの可変領域やＣＤＲ配列等の遺伝子情報を用いて抗体の結合性や特異性の向上のための改変等を行うことや、マウス等の動物の抗体からヒト型抗体に改変することによって治療剤に用いるために適した構造の抗体を作製することは、この分野での当業者にはよく知られた技術である。また、抗原を感作する動物として、ヒト抗体遺伝子が導入された非ヒト－トランスジェニック動物を用いることによって、ヒトモノクローナル抗体を取得することも可能である。それ以外にも、動物への感作を必要としない方法として、ヒト抗体の抗原結合領域又はその一部を発現するファージライブラリー（ヒト抗体ファージディスプレイ）を用いて、対応する抗原と特異的に結合する抗体や特定のアミノ酸配列からなるファージクローンを取得し、その情報からヒト抗体を作製する技術も当業者であれば適宜行うことができる（例えば非特許文献１７等を参照）。また、ヒト以外の動物に投与する抗体をデザインする場合には、ヒト化の技術と同様に、適宜ＣＤＲや可変領域のアミノ酸配列情報を用いて、当業者であればデザインすることが可能である。
【0045】
一態様によれば、本発明の抗体は、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６に由来する重鎖及び軽鎖の各相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体に由来する重鎖及び軽鎖の各フレームワーク領域（ＦＲ）とを含むと共に、少なくとも１つのＣＤＲが、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の対応するＣＤＲに対して、少なくとも１箇所のアミノ酸残基の置換を含む、抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体である。
【0046】
具体的に、本態様において、重鎖及び軽鎖の各相補性決定領域（ＣＤＲ）は、それぞれマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の対応するＣＤＲに由来する。ここで、マウス親抗体「ＩＧＦ１１－１６」とは、前述のように、本発明者等が以前作製した抗ＩＧＦ－１受容体モノクローナルマウス抗体である（特許文献１）。また、本開示において、マウス親抗体のＣＤＲに「由来する」とは、本態様の抗体の各ＣＤＲのアミノ酸配列が、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の対応するＣＤＲのアミノ酸配列と、通常７５％以上、中でも８０％以上、又は８５％以上、更には９０％以上の相同性（好ましくは同一性）を有すること、及び／又は、通常４アミノ酸残基以下、中でも３アミノ酸残基以下、更には２アミノ酸残基以下の違いを除いて相同（好ましくは同一）であることを意味する（非特許文献１８）。但し、本態様の抗体は、その少なくとも１つのＣＤＲが、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の対応するＣＤＲに対して、少なくとも１箇所のアミノ酸残基の置換を含むことを要件とする。また、重鎖ＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）のアミノ酸配列については、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６のＣＤＲ－Ｈ２のアミノ酸配列、或いは、後述するマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６から誘導されたヒト化抗体ｈＩＧＦ１３＿ＰＳのＣＤＲ－Ｈ２の何れかと、通常７５％以上、中でも８０％以上、又は８５％以上、更には９０％以上の相同性（好ましくは同一性）を有すること、及び／又は、通常４アミノ酸残基以下、中でも３アミノ酸残基以下、更には２アミノ酸残基以下の違いを除いて相同（好ましくは同一）であればよいものとする。
【0047】
また、重鎖及び軽鎖の各フレームワーク領域（ＦＲ）は、それぞれヒトの各クラスの免疫グロブリンの対応するＦＲに由来する。本開示において、ヒトの免疫グロブリンのＦＲに「由来する」とは、本態様の抗体の各ＦＲのアミノ酸配列が、ヒトの免疫グロブリンの対応するＦＲのアミノ酸配列と、通常８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上の相同性（好ましくは同一性）を有すること、及び／又は、通常４アミノ酸残基以下、中でも３アミノ酸残基以下、更には２アミノ酸残基以下の違いを除いて相同（好ましくは同一）であることを意味する。ヒト免疫グロブリンのフレームワークは、公共のデータベースから入手可能であり、マウス免疫グロブリンのフレームワークと相同性の高いフレームワークを選び出すことができる。なお、相同性を有するアミノ酸配列の同定には、例えばＩｇＢＬＡＳＴを使用することができる（非特許文献１６）。
【0048】
ここで、重鎖ＦＲ１の２５位のアミノ酸残基は、プロリンであることが好ましい。マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の重鎖ＦＲ１とヒト化抗体の重鎖ＦＲ１との間には幾つか異なるアミノ酸残基が存在するが、実施例３に後述するように、本発明者等の検討によれば、ヒト化抗体ではセリンである重鎖ＦＲ１の２５位のアミノ酸残基を、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同様にプロリンに置換することで、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等以上の活性（同等の程度として活性比が±２０％以内）を発揮できるので好ましい。
【0049】
上記の相同性を有する重鎖及び軽鎖の取得方法としては、例えば、本発明のヒト化抗体に由来する重鎖及び軽鎖の配列を鋳型として、抗体の進化工学的な手法を用いることが出来る。具体的にはＣＤＲへの部位特異的変異導入法やランダム変異導入法、ｃｈａｉｎシャフリング、ＣＤＲ ｗａｌｋｉｎｇなどの手法が用いられる。
【0050】
「ランダム変異導入法（random mutagenesis）」は、特定の遺伝子ＤＮＡに対してランダムな変異を導入し、変異体を作製する方法である。ＰＣＲ法による変異導入法では、ＤＮＡ増幅時に、複製の厳密度の低い条件を選択して、塩基の変異を導入する（error-prone PCR）。ＰＣＲ法で増幅されるＤＮＡの全域に対して任意の部位に変異が導入される。また、ＤＮＡシャッフリング法では、対象遺伝子をまずばらばらに切断後、ＰＣＲ法で同様に変異を導入することができる。さらにＤＮＡ合成の際に特定の合成ステップにおいていくつかの塩基を混合することで意図した領域や部位特異的にランダム変異導入することも可能である。
【0051】
「Ｃｈａｉｎ シャフリング（chain shuffling）」は、抗体可変領域のＶＨあるいはＶＬ遺伝子の一方を固定化し、他方をＶ遺伝子ライブラリーと結合させたライブラリーを構築、ファージ上に発現させ、もとの抗原に対する特異性が高い抗体可変領域の組み合わせをスクリーニングする方法である。ナイーブ／非免疫ライブラリーなどから得られた抗体のin vitro 親和性成熟では第一に選択される方法である。
【0052】
「ＣＤＲ ｗａｌｋｉｎｇ」は、ＶＨ及びＶＬ遺伝子の各ＣＤＲに対してランダム変異を導入し、その変異体の集団から選択条件を調節することにより結合の強い抗体を選択し、その選択されたＣＤＲを組み合わせて非常に高い結合力をもつクローンを得る方法である。一般的には、ＣＤＲ３のみにランダム変異を導入して検討することが多い。
【0053】
このように、一旦活性を有するヒト化親抗体を取得すれば、それを鋳型として活性を保持した新たなヒト化抗体への改変の方法論はほぼ確立されており、ＣＲＯなどで委託可能である。
【0054】
一態様によれば、本発明の抗体は、各ＣＤＲ配列として、特定のアミノ酸配列を有することが好ましい。具体的には以下のとおりである。なお、本発明においてアミノ酸配列の「同一性」（identity）とは、一致するアミノ酸残基の割合を意味し、「相同性」（similarity）とは、一致又は類似するアミノ酸残基の割合を意味する。相同性及び同一性は、例えばＢＬＡＳＴ法（ＮＣＢＩのＰＢＬＡＳＴのデフォルト条件）により決定することができる。また、ここで「類似するアミノ酸残基」とは、同様の化学的特質（例えば、電荷又は疎水性）を持つ側鎖を有するアミノ酸残基を意味する。類似するアミノ酸残基としては、例えば以下のグループが挙げられる。例えば、以下のグループに従えば、アラニンを類似のアミノ酸残基に置換する場合は、バリン、ロイシン、イソロイシン又はメチオニン残基に置換することを意味する。
【0055】
（１）脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基：アラニン（Ａｌａ又はＡ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）及びメチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）残基。
（２）脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸残基：セリン（Ｓｅｒ又はＳ）及びトレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）残基。
（３）アミド含有側鎖を有するアミノ酸残基：アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）及びグルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）残基。
（４）芳香族側鎖を有するアミノ酸残基：フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）残基。
（５）塩基性側鎖を有するアミノ酸残基：リシン（ＬｙｓまたＫ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）残基。
（６）酸性側鎖を有するアミノ酸残基：アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）残基。
（７）硫黄含有側鎖を有するアミノ酸基：システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、及びメチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）残基。
（２）脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸残基：セリン（Ｓｅｒ又はＳ）及びトレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）残基。
（３）アミド含有側鎖を有するアミノ酸残基：アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）及びグルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）残基。
（４）芳香族側鎖を有するアミノ酸残基：フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）残基。
（５）塩基性側鎖を有するアミノ酸残基：リシン（ＬｙｓまたＫ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）残基。
（６）酸性側鎖を有するアミノ酸残基：アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）残基。
（７）硫黄含有側鎖を有するアミノ酸基：システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、及びメチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）残基。
【0056】
重鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｈ１）配列としては、配列番号１のアミノ酸配列、又は、配列番号１の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列が好ましい。或いは、ＣＤＲ－Ｈ１配列は、配列番号１と８０％以上の相同性（好ましくは同一性）を有することが好ましい。中でも、ＣＤＲ－Ｈ１配列としては、配列番号１の３位のＴｒｐが維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列であって、当該３位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号１と８０％以上の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。配列番号１のアミノ酸配列に対応する核酸塩基配列の一例を配列番号２に示す。
【0057】
重鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）配列としては、配列番号３若しくは配列番号５のアミノ酸配列、又は、配列番号３若しくは配列番号５の何れか１箇所、２箇所、若しくは３箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列が好ましい。或いは、ＣＤＲ－Ｈ２配列は、配列番号３又は配列番号５と８２％以上の相同性（好ましくは同一性）を有することが好ましい。中でも、ＣＤＲ－Ｈ２配列としては、配列番号３の１位のＧｌｕ及び３位のＡｓｎが各々維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されると共に、６位のＡｓｎが維持され、又は、Ｓｅｒ若しくはＧｌｎに置換されたアミノ酸配列であって、当該１位、３位、及び６位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所、２箇所、若しくは３箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号３と８２％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。或いは、ＣＤＲ－Ｈ２配列としては、配列番号５の１位のＧｌｕ及び３位のＡｓｎが各々維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されると共に、６位のＳｅｒが維持され、又は、Ａｓｎ若しくはＧｌｎに置換されたアミノ酸配列であって、当該1位、３位、及び６位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所、２箇所、若しくは３箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号５と８２％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。配列番号３と５のアミノ酸配列に対応する核酸塩基配列の一例を、それぞれ配列番号４と６に示す。
【0058】
重鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｈ３）配列としては、配列番号７のアミノ酸配列、又は、配列番号７の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列が好ましい。或いは、ＣＤＲ－Ｈ３配列は、配列番号７と７５％以上の相同性（好ましくは同一性）を有することが好ましい。中でも、ＣＤＲ－Ｈ３配列としては、配列番号７の４位のＡｒｇが維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列であって、当該４位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号７と７５％以上の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。配列番号７のアミノ酸配列に対応する核酸塩基配列の一例を、配列番号８に示す。
【0059】
軽鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｌ１）配列としては、配列番号９のアミノ酸配列、又は、配列番号９の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列が好ましい。或いは、ＣＤＲ－Ｌ１配列は、配列番号９と８１％以上の相同性（好ましくは同一性）を有することが好ましい。中でも、ＣＤＲ－Ｌ１配列としては、配列番号９の９位のＴｒｐが維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列であって、当該９位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号９と８１％以上の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。配列番号９のアミノ酸配列に対応する核酸塩基配列の一例を、配列番号１０に示す。
【0060】
軽鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｌ２）配列としては、配列番号１１のアミノ酸配列、又は、配列番号１１の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列が好ましい。或いは、ＣＤＲ－Ｌ２配列は、配列番号１１と８５％以上の相同性（好ましくは同一性）を有することが好ましい。配列番号１１のアミノ酸配列に対応する核酸塩基配列の一例を、配列番号１２に示す。
【0061】
軽鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｌ３）配列としては、配列番号１３のアミノ酸配列、又は、配列番号１３の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列が好ましい。或いは、ＣＤＲ－Ｌ３配列は、配列番号１３と７７％以上の相同性（好ましくは同一性）を有することが好ましい。配列番号１３のアミノ酸配列に対応する核酸塩基配列の一例を、配列番号１４に示す。
【0062】
特に、本発明の抗体は、以下のＣＤＲ配列の組み合わせを有することが好ましい。即ち、ＣＤＲ－Ｈ１配列として、配列番号１のアミノ酸配列、ＣＤＲ－Ｈ２配列として、配列番号３又は配列番号５のアミノ酸配列、ＣＤＲ－Ｈ３配列として、配列番号７のアミノ酸配列、ＣＤＲ－Ｌ１配列として、配列番号９のアミノ酸配列、ＣＤＲ－Ｌ２配列として、配列番号１１のアミノ酸配列、及びＣＤＲ－Ｌ３配列として、配列番号１３のアミノ酸配列の組み合わせを有することが好ましい。
【0063】
なお、抗体におけるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、又はＣＤＲ－Ｌ３の各配列を同定する方法としては、例えばＫａｂａｔ法（非特許文献１３）やＣｈｏｔｈｉａ法（非特許文献１４）、或いはこれらの方法を更に改良した方法（非特許文献１５）などが挙げられる。これらの方法は、この領域の当業者にとっては技術常識であるが、たとえばDr. Andrew C.R. Martin‘s Groupのインターネットホームページ（http://www.bioinf.org.uk/abs/）から概要を知ることも可能である。
【0064】
さらに、実施例４で示すように、アラニンスキャンを行うことにより、ＣＤＲのアミノ酸配列の中で結合活性に重要な部位を同定することが出来る。その結果から、後述の表７及び表８に示すアミノ酸残基が極めて重要であることが明らかとなっている。少なくともこの部位のアミノ酸残基は、類似の性質を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換すると、結合性低下につながると考えられる。逆に、同様の性質を有するアミノ酸への置換により、親和性の向上を達成しうる可能性もある。一方で、アラニン置換したＣＤＲ領域５４部位のうち、４４部位はアラニン置換後も８０％以上の結合活性を示した。このことから、これらの部位におけるアミノ酸置換は、結合活性に大きな影響を与えないことが示唆される。このように、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列を検索して結合に関与する部位を同定することにより、結合性を保持したまま免疫原性を低下させたり、物性を改善したり、結合性を向上させたりすることが可能である。
【0065】
本発明の抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域として、特定のアミノ酸配列を有することが好ましい。具体的には以下のとおりである。なお、本開示において「１箇所若しくは数箇所」とは、特に断り書き無い限り、１箇所、２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、６箇所、７箇所、８箇所、９箇所、又は１０箇所の何れかを指すものとする。
【0066】
本発明の抗体は、重鎖可変領域として、配列番号４７のアミノ酸配列、又は、配列番号４７のアミノ酸配列において１若しくは数箇所のアミノ酸残基が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列を有することが好ましい。或いは、重鎖可変領域として、配列番号４７と９０％以上の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。中でも、重鎖可変領域として、ＶＨ１３＿ＰＮ（配列番号４３）、ＶＨ１３＿ＰＳ（配列番号４７）、ＶＨ２３＿ＰＮ（配列番号４９）、ＶＨ２３＿ＰＳ（配列番号５３）、ＶＨ２５＿ＰＮ（配列番号５５）、又はＶＨ２５＿ＰＳ（配列番号５９）のアミノ酸配列を有することが好ましい。配列番号４３、４７，４９，５３，５５，及び５９のアミノ酸配列に対応する核酸塩基配列の一例を、それぞれ配列番号４４、４８，５０，５４，５６，及び６０に示す。
【0067】
本発明の抗体は、軽鎖可変領域として、配列番号６７のアミノ酸配列、又は、配列番号６７のアミノ酸配列において１若しくは数箇所のアミノ酸残基が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有することが好ましい。或いは、軽鎖可変領域として、配列番号６７と９０％以上の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。中でも、軽鎖可変領域として、ＶＬ１３（配列番号６１）、ＶＬ１４（配列番号６３）、ＶＬ２２（配列番号６５）、ＶＬ２３（配列番号６７）、又はＶＬ２４（配列番号６９）のアミノ酸配列を有することが好ましい。より好ましくはＶＬ２２（配列番号６５）、ＶＬ２３（配列番号６７）、又はＶＬ２４（配列番号６９）のアミノ酸配列である。配列番号６１、６３、６５、６７，及び６９のアミノ酸配列に対応する核酸塩基配列の一例を、それぞれ配列番号６２、６４、６６、６８、及び７０に示す。
【0068】
中でも、本発明の抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域として、それぞれ上述した何れかのアミノ酸配列を有することが好ましい。特に好ましい本発明の抗体としては、重鎖可変領域としてＶＨ１３＿ＰＳ（配列番号４７）のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域としてＶＬ２３（配列番号６７）のアミノ酸配列を有する抗体（以下「ｈＩＧＦ１３＿ＰＳ」という場合がある。）、又は、重鎖可変領域としてＶＨ２５＿ＰＳ（配列番号５９）のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域としてＶＬ２３（配列番号６７）のアミノ酸配列を有する抗体（以下「ｈＩＧＦ２５＿ＰＳ」という場合がある。）である。
【0069】
本発明の抗体の重鎖及び軽鎖の各各定常領域のアミノ酸配列は、例えばヒトのＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、及びＩｇＤの各クラスのアミノ酸配列、並びにそれらの変異体のアミノ酸配列から選択することが可能である。一態様によれば、本発明の抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ４クラスの重鎖定常領域のアミノ酸配列、又はその１～１０か所のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であることが好ましい（非特許文献１９、２０）。一態様によれば、本発明の抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１クラスの重鎖定常領域のアミノ酸配列、又はその１～１０か所のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であることが好ましい（非特許文献１９、２０）。
【0070】
本発明の抗体は、ヒトＩＧＦ－１受容体と抗原抗体反応を生じる抗体である。本開示において「抗原抗体反応」とは、ＩＧＦ－１受容体に対して、抗体が平衡解離定数（ＫＤ）１×１０-7Ｍ以下の親和性で結合することをいう。本発明の抗体は、ＩＧＦ－１受容体に対して、通常１×１０-7Ｍ以下、中でも１×１０-8Ｍ以下、更には１×１０-9Ｍ以下のＫＤで結合することが好ましい。最も好ましくは１×１０-10Ｍ以下である。
【0071】
本発明の抗体は、配列番号７１のアミノ酸配列を有するヒトＩＧＦ－１受容体の細胞外ドメインに特異的に結合することが好ましい。本開示において、抗体が抗原に対して「特異性」を有するとは、抗体とその抗原との間に高い抗原抗体反応が起こることをいう。特に、本開示において「ＩＧＦ－１受容体特異的抗体」とは、ＩＧＦ－１受容体を発現させた細胞と有意に抗原抗体反応を示す濃度において、ＩＧＦ－１受容体の高次構造と高い類似性を有するＩＮＳＲに対する抗原抗体反応性が１００分の１以下である抗体をいう。
【0072】
抗原抗体反応の測定は、当業者であれば固相又は液相の系での結合測定を適宜選択して行うことが可能である。そのような方法としては、酵素結合免疫吸着法（enzyme-linked immunosorbent assay：ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（enzyme immunoassay：ＥＩＡ）、表面プラズモン共鳴法（surface plasmon resonance：ＳＰＲ）、蛍光共鳴エネルギー移動法（fluorescence resonance energy transfer：ＦＲＥＴ）、発光共鳴エネルギー移動法（luminescence resonance energy transfer：ＬＲＥＴ）等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。また、そのような抗原抗体結合を測定する際に、抗体及び／又は抗原を酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素等で標識を行い、その標識した物質の物理的及び／又は化学的特性に適した測定方法を用いて抗原抗体反応を検出することも可能である。
【0073】
一態様によれば、本発明の抗体は、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等以上のＩＧＦ－１受容体シグナル活性化能を有することが好ましい。本開示において、ＩＧＦ－１受容体シグナル活性化能が「同等」とは、ＥＣ50値が２倍以内、及び／又は、Ｅmax値が±２０％以内であることを意味する。
【0074】
一態様によれば、本発明の抗体は、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等以上の増殖活性を有することが好ましい。本開示において、増殖活性が「同等」とは、筋芽細胞増殖試験において、ＥＣ50値が１０倍以内、Ｅmax値が９０％以上であることを意味する。
【0075】
一態様によれば、本発明の抗体は、組換え可溶性ＩＧＦ－１受容体への結合親和性が、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等以上であることが好ましい。本開示において、組換え可溶性ＩＧＦ－１受容体への結合親和性が「同等」とは、BIACOREによる組換え可溶性ＩＧＦ－１受容体への結合親和性解析において、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と比較した場合に、ＫＤ値が３分の１以上から３倍以内の範囲であることを意味する。
【0076】
一態様によれば、本発明の抗体は、血中半減期が長く、動物への単回投与により筋肉量増加作用を示すことが好ましい。実際に、本発明者等の検討によれば、本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体は、後述の実施例に示すように、モルモット又はカニクイザルへ単回投与したところ、ＩＧＦ－１を持続投与したときと同程度の筋肉量増加作用を示した。
【0077】
一態様によれば、本発明の抗体は、正常哺乳動物において、低血糖症状を誘導せず、筋量増加作用を誘導しうることが好ましい。一態様によれば、本発明の抗体は、下垂体摘出モデル動物において、低血糖症状を誘導せず、成長板軟骨伸長作用を誘導しうることが好ましい。本開示において「血糖症状」とは、ヒトの場合、低血糖に伴って生じる冷や汗、動悸、意識障害、痙攣、手足の震えなどの症状を意味する。サルなどの脊椎動物においては自発運動の減少が初期症状として現れ、症状が強いと動きがほとんど無くなり、さらに血糖値が低下すると意識障害が起こり、死に至る。
【0078】
ＩＧＦ－１を脊椎動物に対して、筋肉量増加作用を示すような用量で投与すると、著しい血糖低下作用を奏し、通常は低血糖症状を誘導してしまう。しかし、一態様によれば、本発明の抗体は、脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する用量、より好ましくはその用量より１０倍以上高い用量で、脊椎動物に投与した場合でさえも、当該脊椎動物の血糖値を低下させる作用を有さない。また、一態様によれば、本発明の抗体は、脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する有効用量に対して１０倍以上の血中曝露量となるように脊椎動物に投与した場合でさえも、当該脊椎動物の血糖値を低下させる作用を有さない。実際に、本発明者等の検討によれば、本発明の抗体は、後述の実施例に示すように、モルモット及びカニクイザルにおいて１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与しても、低血糖症状を誘導しなかった。
【0079】
以上のことから、本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体は、ＩＧＦ－１で期待される、廃用性筋萎縮及び低身長症等のＩＧＦ－１受容体が関連する種々の疾患の治療薬又は予防薬となる可能性を有し、ＩＧＦ－１の問題点である、血糖低下作用を克服し、血中半減期を長期化することが可能である。
【0080】
本発明の抗体は、ＩＧＦ－１受容体の細胞外ドメインに結合することにより、ＩＧＦ－１受容体が二量体を形成したホモ型の受容体、或いはＩＧＦ－１受容体とＩＮＳＲが二量体を形成したヘテロ型の受容体を活性化させると考えられる。
【0081】
［免疫原性評価］
抗医薬品抗体（Anti-Drug Antibody：ＡＤＡ）は、治療用抗体の効果及び薬物動態に影響を及ぼし、時に重篤な副作用をもたらすことがあるため、臨床における治療用抗体の有用性及び薬効はＡＤＡの産生によって制限され得る。多くの要因が治療用抗体の免疫原性に影響を及ぼすが、治療用タンパク質中に存在するエフェクターＴ細胞エピトープの重要性が多数報告されている。Ｔ細胞エピトープを予測するためのin silicoツールとしては、Epibase（Lonza）、iTope/TCED（Antitope）、及びEpiMatrix（EpiVax）等が開発されている。これらのin silicoツールを用いることで、各アミノ酸配列中のＴ細胞エピトープの存在を予測することができ（非特許文献２１）、潜在的免疫原性の評価が可能になる。本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体に関しては、Epibase（Lonza）を用いて、潜在的免疫原性を評価した。
抗医薬品抗体（Anti-Drug Antibody：ＡＤＡ）は、治療用抗体の効果及び薬物動態に影響を及ぼし、時に重篤な副作用をもたらすことがあるため、臨床における治療用抗体の有用性及び薬効はＡＤＡの産生によって制限され得る。多くの要因が治療用抗体の免疫原性に影響を及ぼすが、治療用タンパク質中に存在するエフェクターＴ細胞エピトープの重要性が多数報告されている。Ｔ細胞エピトープを予測するためのin silicoツールとしては、Epibase（Lonza）、iTope/TCED（Antitope）、及びEpiMatrix（EpiVax）等が開発されている。これらのin silicoツールを用いることで、各アミノ酸配列中のＴ細胞エピトープの存在を予測することができ（非特許文献２１）、潜在的免疫原性の評価が可能になる。本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体に関しては、Epibase（Lonza）を用いて、潜在的免疫原性を評価した。
【0082】
［脱アミド化リスク］
タンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、脱アミド化が起こりやすいアミノ酸配列として、ＮＧ、ＮＴ、ＮＳ、及びＮＮが挙げられる。これらの配列を有するとアスパラギンの脱アミド化が起こり、アスパラギン酸へと変化する。このことにより、抗体の活性が低下してしまう恐れがあると共に、品質が均一でなくなる。このことから製造工程や保管において品質を保つために、脱アミド化リスクのあるアミノ酸を別のアミノ酸へ置換することによって活性低下を防ぎ均一性を保持することが可能である。本発明の抗体においては、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の重鎖ＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）領域にＮＳ配列（重鎖５５位及び５６位）が存在したため、重鎖５５位のアスパラギン（Ｎ）が脱アミド化してアスパラギン酸（Ｄ）へ変換されるリスクを考慮して、当該アスパラギン（Ｎ）をセリン（Ｓ）に置換した。
タンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、脱アミド化が起こりやすいアミノ酸配列として、ＮＧ、ＮＴ、ＮＳ、及びＮＮが挙げられる。これらの配列を有するとアスパラギンの脱アミド化が起こり、アスパラギン酸へと変化する。このことにより、抗体の活性が低下してしまう恐れがあると共に、品質が均一でなくなる。このことから製造工程や保管において品質を保つために、脱アミド化リスクのあるアミノ酸を別のアミノ酸へ置換することによって活性低下を防ぎ均一性を保持することが可能である。本発明の抗体においては、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の重鎖ＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）領域にＮＳ配列（重鎖５５位及び５６位）が存在したため、重鎖５５位のアスパラギン（Ｎ）が脱アミド化してアスパラギン酸（Ｄ）へ変換されるリスクを考慮して、当該アスパラギン（Ｎ）をセリン（Ｓ）に置換した。
【0083】
［物性安定性評価］
抗体の活性が長期に安定に保持されることを保証するために、温度を上昇させたり、ｐＨを変化させたりすることで物性安定性の解析を行う。本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体においては、本抗体のＰＢＳ溶液を使用して、温度を３７℃に設定し１ヶ月間インキュベーションした試料を使用して、純度が９５％以上であること及び凝集物が生じないことを確認することで、物性安定性を確認した。
抗体の活性が長期に安定に保持されることを保証するために、温度を上昇させたり、ｐＨを変化させたりすることで物性安定性の解析を行う。本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体においては、本抗体のＰＢＳ溶液を使用して、温度を３７℃に設定し１ヶ月間インキュベーションした試料を使用して、純度が９５％以上であること及び凝集物が生じないことを確認することで、物性安定性を確認した。
【0084】
［抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体のエピトープ］
一態様によれば、本発明の抗体は、ＩＧＦ－１受容体のＣＲドメインをエピトープとする。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトＩＧＦ－１受容体のアミノ酸配列（配列番号７１）のうち、アミノ酸番号３０８から３１９に相当するアミノ酸配列（ＰｒｏＳｅｒＧｌｙＰｈｅＩｌｅＡｒｇＡｓｎＧｌｙＳｅｒＧｌｎＳｅｒＭｅｔ）を有するペプチドを含むエピトープ又はその近傍に結合する。本発明の抗体は、ＩＧＦ－１受容体のＣＲドメインに結合することにより、ＩＧＦ－１受容体が二量体を形成したホモ型の受容体、或いはＩＧＦ－１受容体とＩＮＳＲが二量体を形成したヘテロ型の受容体を活性化させると考えられる。
一態様によれば、本発明の抗体は、ＩＧＦ－１受容体のＣＲドメインをエピトープとする。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトＩＧＦ－１受容体のアミノ酸配列（配列番号７１）のうち、アミノ酸番号３０８から３１９に相当するアミノ酸配列（ＰｒｏＳｅｒＧｌｙＰｈｅＩｌｅＡｒｇＡｓｎＧｌｙＳｅｒＧｌｎＳｅｒＭｅｔ）を有するペプチドを含むエピトープ又はその近傍に結合する。本発明の抗体は、ＩＧＦ－１受容体のＣＲドメインに結合することにより、ＩＧＦ－１受容体が二量体を形成したホモ型の受容体、或いはＩＧＦ－１受容体とＩＮＳＲが二量体を形成したヘテロ型の受容体を活性化させると考えられる。
【0085】
［抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化アゴニスト抗体］
本発明のアゴニスト抗体は、ヒトＩｇＧクラス又はその変異体であることが好ましく、ヒトＩｇＧ４サブクラス若しくはその変異体、又は、ヒトＩｇＧ１サブクラス若しくはその変異体であることが好ましい。１つの例では、安定化ＩｇＧ４定常領域は、Ｋａｂａｔの系により、ヒンジ領域の位置２４１においてプロリンを含む（非特許文献２２）。この位置は、ＥＵ付番方式（非特許文献１３）により、ヒンジ領域の位置２２８に対応する。ヒトＩｇＧ４では、この残基は一般的にセリンであり、セリンのプロリンへの置換で安定化を誘導することができる。１つの例では、ＩｇＧ１の定常領域にＮ２９７Ａ変異を組み入れてＦｃ受容体への結合及び／又は補体を固定する能力をできるだけ抑えることができる。また、別の態様では、定常領域にアミノ酸置換を導入することでＦｃＲｎへの結合を調節し、血中半減期を長くすることも出来る。しかし、定常領域のアミノ酸置換はこれらの例示に限定されるものではない。
本発明のアゴニスト抗体は、ヒトＩｇＧクラス又はその変異体であることが好ましく、ヒトＩｇＧ４サブクラス若しくはその変異体、又は、ヒトＩｇＧ１サブクラス若しくはその変異体であることが好ましい。１つの例では、安定化ＩｇＧ４定常領域は、Ｋａｂａｔの系により、ヒンジ領域の位置２４１においてプロリンを含む（非特許文献２２）。この位置は、ＥＵ付番方式（非特許文献１３）により、ヒンジ領域の位置２２８に対応する。ヒトＩｇＧ４では、この残基は一般的にセリンであり、セリンのプロリンへの置換で安定化を誘導することができる。１つの例では、ＩｇＧ１の定常領域にＮ２９７Ａ変異を組み入れてＦｃ受容体への結合及び／又は補体を固定する能力をできるだけ抑えることができる。また、別の態様では、定常領域にアミノ酸置換を導入することでＦｃＲｎへの結合を調節し、血中半減期を長くすることも出来る。しかし、定常領域のアミノ酸置換はこれらの例示に限定されるものではない。
【0086】
本発明のアゴニスト抗体は、ＩＧＦ－１受容体に特異的に強力に結合し、インビトロで極めて低濃度から筋芽細胞増殖の亢進作用を有する。
【0087】
本発明のアゴニスト抗体は、動物へ単回投与した場合に、ＩＧＦ－１を持続投与したときの筋肉量増加作用と、同程度の筋量増加作用を示す。また、本発明のアゴニスト抗体は、血中半減期が長く、動物への単回投与で筋肉量増加作用を示し得る。本発明では、実際に、モルモット又はカニクイザルへ単回投与した場合に、ＩＧＦ－１を持続投与したときの筋肉量増加作用と、同程度の筋量増加作用を示した。
【0088】
更に、本発明のアゴニスト抗体は、筋肉量増加作用を示す用量において、血糖低下作用を有さないという特徴を有する。ＩＧＦ－１は、筋肉量増加作用を示す用量で投与した場合、著しい血糖低下作用を有する。しかし、本発明のアゴニスト抗体は、脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する用量において、当該脊椎動物の血糖値を低下させる作用を有さない。好ましくは、本発明のアゴニスト抗体は、脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する有効用量の１０倍以上の血中曝露量となるように投与した場合でさえも、脊椎動物の血糖値を低下させる作用を有さない。本発明では、実際に、モルモット又はカニクイザルにおいて、本発明のアゴニスト抗体を筋肉量の増加を誘導する有効用量の１０倍以上の血中曝露量となるように投与した場合でさえも、血糖低下及び低血糖症状は観察されなかった。
【0089】
以上のことから、本発明のアゴニスト抗体は、サルコペニア、廃用性筋萎縮、カケキシア及び低身長症等のＩＧＦ－１受容体が関連する種々の疾患の治療薬又は予防薬となる可能性を有し、ＩＧＦ－１の問題点である、血糖低下作用を克服し、血中半減期を長期化することが可能である。
【0090】
［抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化アンタゴニスト抗体］
本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体は、その極めて高い結合性及び特異性を有する可変領域の性質を利用して、優れた活性と特異性を有する抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体とすることができる。その際の態様としては、ＩｇＧの他にＦａｂやＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨＨのような形で使用することが考えられるが、これに限定されるものでは無い。
本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体は、その極めて高い結合性及び特異性を有する可変領域の性質を利用して、優れた活性と特異性を有する抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体とすることができる。その際の態様としては、ＩｇＧの他にＦａｂやＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨＨのような形で使用することが考えられるが、これに限定されるものでは無い。
【0091】
このようにして作製された抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体は、例えばがん細胞株におけるＩＧＦ－１依存性の細胞増殖活性を抑制することを指標に評価することができる。このようにして選択された抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体は、抗ガン剤や異状な細胞増殖を伴う疾患や病態の改善及び治療薬として期待される。
【0092】
さらに他の抗原又はエピトープを認識する様々な抗体と直接又はリンカーなどを介して融合させることによって二重特異性抗体や多重特異性抗体を構築することもできる。その際の態様としては、ＩｇＧの他にＦａｂやＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨＨのような形で使用することが考えられるが、これに限定されるものでは無い。
【0093】
このようにして作製された抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体を含有した二重特異性抗体や多重特異性抗体は、例えばがん細胞株におけるＩＧＦ－１依存性の細胞増殖活性を抑制することを指標に評価することができる。このようにして選択された抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体を含有した二重特異性抗体や多重特異性抗体は、抗ガン剤や異状な細胞増殖を伴う疾患や病態の改善及び治療薬として期待される。
【0094】
本発明の抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体は、ＩＧＦ－Ｉ受容体シグナルが活性化されることで病態が誘導される疾患の治療薬として期待される。ＩＧＦ－Ｉ受容体を活性化し得るリガンドとしては、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、Ｉｎｓｕｌｉｎなどが主に挙げられるが、ＩＧＦ－１受容体とヘテロ２量体形成したＲＴＫ（受容体型チロシンキナーゼ）のリガンド（ＥＧＦなどが挙げられる）やクロストークする他の受容体のリガンド（ＴＳＨなどが挙げられる）なども含まれる。本発明の抗体は、これらのリガンドによって活性化されたＩＧＦ－１受容体シグナルを抑制する作用（アロステリックアンタゴニスト作用を有する。つまり、本発明の抗体は、ＩＧＦ－１受容体に結合することで、過剰に誘導されるＩＧＦ－１受容体シグナル活性を抑制し、ＩＧＦ－１受容体が異常に活性化されることで誘導される疾患の治療又は予防に使用しうる。シグナル活性化抑制能はマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等以上有することが好ましい。シグナル活性化抑制能が「マウス抗体ＩＧＦ１１－１６と同等」とは、筋芽細胞増殖においてＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、又はＩｎｓｕｌｉｎ等のＩＧＦ－Ｉ受容体を活性化し得るリガンドが誘導し得る最大細胞増殖活性を通常１０％以上、好ましくは２５％以上、特に好ましくは３５％以上抑制する活性を意味する。
【0095】
ＩＧＦ－１受容体が異常に活性化されることで誘導される疾患の具体例としては、肝臓がん、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、小児がん、先端巨大症、卵巣がん、膵臓がん、良性前立腺肥大症、乳がん、前立腺がん、骨がん、肺がん、結腸直腸がん、頚部がん、滑膜肉腫、膀胱がん、胃がん、ウィルムス腫瘍、転移性カルチノイド及び血管作動性腸管ペプチド分泌腫瘍に関連する下痢、ビポーマ、ウェルナー－モリソン症候群、ベックウィズ－ヴィーデマン症候群、腎臓がん、腎細胞がん、移行上皮がん、ユーイング肉腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、脳腫瘍、膠芽腫、非膠芽腫性脳腫瘍、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、脳室上衣腫、脈絡叢乳頭腫、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管の平滑筋再狭窄、不適切な微小血管増殖、糖尿病性網膜症、グレーヴズ病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、自己免疫性甲状腺疾患、橋本甲状腺炎、甲状腺眼症、甲状腺機能亢進症及びベーチェット病などが挙げられる。
これらの作用は、担癌モデル動物等を用いて確認することができる。
これらの作用は、担癌モデル動物等を用いて確認することができる。
【0096】
［局所送達ツールとしての抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体］
本発明の抗ＩＧＦ－１受容体抗体の極めて高い結合性と特異性を利用してＩＧＦ－１受容体発現細胞や発現組織などへ薬剤や抗体の局所デリバリーが可能である。その際の本発明の抗ＩＧＦ－１受容体抗体の態様としては、ＩｇＧの他にＦａｂやＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨＨのような形で使用することが考えられるが、これに限定されるものでは無い。本発明の抗ＩＧＦ－１受容体抗体と薬剤が連結された抗体薬物複合体の利用によって、薬剤が局所へ送達されることで、より低用量で特異的に薬効を発揮させることが出来、副作用の低減にもつながる。
本発明の抗ＩＧＦ－１受容体抗体の極めて高い結合性と特異性を利用してＩＧＦ－１受容体発現細胞や発現組織などへ薬剤や抗体の局所デリバリーが可能である。その際の本発明の抗ＩＧＦ－１受容体抗体の態様としては、ＩｇＧの他にＦａｂやＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨＨのような形で使用することが考えられるが、これに限定されるものでは無い。本発明の抗ＩＧＦ－１受容体抗体と薬剤が連結された抗体薬物複合体の利用によって、薬剤が局所へ送達されることで、より低用量で特異的に薬効を発揮させることが出来、副作用の低減にもつながる。
【0097】
このようにして作製された本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体を送達ツールとして連結した薬剤又は抗体は、例えば、薬剤がアポトーシス誘導剤の場合は、ＩＧＦ－１受容体発現がん細胞株におけるアポトーシスを誘導することを指標に評価することができる。このようにして選択された抗ＩＧＦ－１受容体抗体を連結した薬剤又は抗体は、抗ガン剤や異状な細胞増殖を伴う疾患や病態の改善及び治療薬として期待される。
【0098】
さらに、放射能や蛍光化合物などでラベルした本発明の抗ＩＧＦ－１受容体抗体を使用して、ＩＧＦ－１受容体を発現するがん細胞を検出することも可能である。このような診断技術を使用することで抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体による治療を効率的に行うことが出来る。
【0099】
［競合結合］
本発明の抗ＩＧＦ－１受容体抗体と、ＩＧＦ－１受容体に対して競合結合する抗体も、本発明の範囲に含まれる。本発明において「競合結合」とは、複数種のモノクローナル抗体が抗原と共存する際に、一方の抗体の抗原への結合が、他方の抗体の抗原への結合により阻害される現象を意味する。一般的には、一定量（濃度）のモノクローナル抗体に対して、別のモノクローナル抗体の量（濃度）を変えて加えていった場合に、前者の一定量のモノクローナル抗体の抗原への結合量が低下する添加量（濃度）を測定することによって測定可能である。その阻害の程度は、ＩＣ50又はＫｉという値で表すことができる。
本発明の抗ＩＧＦ－１受容体抗体と、ＩＧＦ－１受容体に対して競合結合する抗体も、本発明の範囲に含まれる。本発明において「競合結合」とは、複数種のモノクローナル抗体が抗原と共存する際に、一方の抗体の抗原への結合が、他方の抗体の抗原への結合により阻害される現象を意味する。一般的には、一定量（濃度）のモノクローナル抗体に対して、別のモノクローナル抗体の量（濃度）を変えて加えていった場合に、前者の一定量のモノクローナル抗体の抗原への結合量が低下する添加量（濃度）を測定することによって測定可能である。その阻害の程度は、ＩＣ50又はＫｉという値で表すことができる。
【0100】
本発明の抗ＩＧＦ－１受容体抗体と競合結合するモノクローナル抗体とは、本発明の抗ＩＧＦ－１受容体抗体を１０ｎＭで用いて抗原抗体結合を検出した際に、ＩＣ50が通常１０００ｎＭ以下、中でも１００ｎＭ以下、更には１０ｎＭ以下の抗体をいう。競合結合の測定を行う場合、用いる抗体の一部又は全部を酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素等で標識を行い、その標識した物質の物理的及び／又は化学的特性に適した測定方法を用いて検出することでその測定を行うことも可能である。
【0101】
［交差反応］
本発明の抗体は、他の脊椎動物のＩＧＦ－１受容体に対して交差反応を有する。交差反応とは、その抗体が抗原抗体反応をするＩＧＦ－１受容体の動物種（例えばヒト）とは異なる他の動物種のＩＧＦ－１受容体にして抗体が結合性を示すことをいう。本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体はヒト以外にモルモット、サル、ウサギなどのＩＧＦ－１受容体と交差反応性を示す。一方、マウス及びラットのＩＧＦ－１受容体には交差反応性を示さない。
本発明の抗体は、他の脊椎動物のＩＧＦ－１受容体に対して交差反応を有する。交差反応とは、その抗体が抗原抗体反応をするＩＧＦ－１受容体の動物種（例えばヒト）とは異なる他の動物種のＩＧＦ－１受容体にして抗体が結合性を示すことをいう。本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体はヒト以外にモルモット、サル、ウサギなどのＩＧＦ－１受容体と交差反応性を示す。一方、マウス及びラットのＩＧＦ－１受容体には交差反応性を示さない。
【0102】
また、本発明の抗体と交差反応しない動物の種を用いて、その細胞や動物を遺伝子工学的に改変させることにより、本発明の抗体が交差反応するＩＧＦ－１受容体を発現する細胞や動物を作製することも可能である。
【0103】
［結合親和性評価］
本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体は、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６（特許文献１）と同等以上のレベルの極めて強い結合親和性を有している。その結合親和性の評価は、たとえば、組換えＩＧＦ－１受容体の細胞外領域を抗原として使用し、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）解析によって行うことが出来る。実施例においては、BIACOREを使用して反応温度を４０℃に上げて、抗原固定量を低く抑えることで１価の結合親和性を解析しているが、この方法に限定されるものではなく、強い結合親和性を定量的に評価し得る解析方法であれば良い。
本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体は、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６（特許文献１）と同等以上のレベルの極めて強い結合親和性を有している。その結合親和性の評価は、たとえば、組換えＩＧＦ－１受容体の細胞外領域を抗原として使用し、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）解析によって行うことが出来る。実施例においては、BIACOREを使用して反応温度を４０℃に上げて、抗原固定量を低く抑えることで１価の結合親和性を解析しているが、この方法に限定されるものではなく、強い結合親和性を定量的に評価し得る解析方法であれば良い。
【0104】
［ＩＧＦ－１受容体シグナル評価］
本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体は、ＩＧＦ－１受容体シグナル活性化を１次評価系として使用することで、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６（特許文献１）と同等以上のレベルのヒト化抗体を選択することにより得られたものである。
本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体は、ＩＧＦ－１受容体シグナル活性化を１次評価系として使用することで、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６（特許文献１）と同等以上のレベルのヒト化抗体を選択することにより得られたものである。
【0105】
ＩＧＦ－１受容体シグナル活性化の評価は、市販のPathHunter（登録商標）IGF1R Functional Assay（DiscoverX社製）を使用した。本システムでは、ＩＧＦ－１受容体シグナル直下のリン酸化を酵素活性として評価することができ、基質として化学発光物質を使用し、発光強度でシグナル強度を測定する。
【0106】
具体的には、ＩＧＦ－１受容体及びＩＧＦ－１受容体の細胞内のチロシンキナーゼと結合するＳＨ２ドメインを持つアダプタープロテインＳＨＣ１－Enzyme Acceptor（ＥＡ）融合タンパク質を、ＨＥＫ２９３細胞内に強制発現させた細胞株を用いた。この細胞株は、ＩＧＦ－１受容体へのリガンド結合によって受容体の二量体化が起こり、続いて受容体がリン酸化されることにより、ＳＨ２ドメインを持つアダプタープロテインがリクルートされ、受容体シグナル伝達複合体が形成され、空間的に隣接したチロシンキナーゼとＥＡの結合が促され、活性型β－ガラクトシダーゼが再構成される。このβ－ガラクトシダーゼ活性による加水分解された基質の化学発光シグナルのレベルを測定することにより、受容体型チロシンキナーゼに対する薬剤の作用を同定することが可能である。
【0107】
マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等以上のシグナル誘導活性を有するヒト化抗体バリアントを選択したのち、二次評価のヒト筋芽細胞増殖評価を行った。ＩＧＦ－１受容体シグナルを評価する方法は、この方法に限定されるものではなく、ＩＧＦ－１受容体チロシンリン酸化を直接又は間接的に且つ定量的に検出し得る系であれば良い。
【0108】
［脊椎動物由来細胞の増殖誘導活性、筋肉量増加の誘導活性］
本発明のヒト化抗体の２次評価系としてヒト筋芽細胞増殖評価を行い、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６（特許文献１）と同等の濃度域で同等以上のアゴニスト活性を有するヒト化抗体を絞り込んだ。そのようにして選択された本発明のヒト化抗体はインビボ（in vivo）において血糖低下作用を示さず、筋量増加作用を有することが確認された。すなわち、一態様における本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体は、脊椎動物由来細胞の増殖誘導活性を有する。
本発明のヒト化抗体の２次評価系としてヒト筋芽細胞増殖評価を行い、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６（特許文献１）と同等の濃度域で同等以上のアゴニスト活性を有するヒト化抗体を絞り込んだ。そのようにして選択された本発明のヒト化抗体はインビボ（in vivo）において血糖低下作用を示さず、筋量増加作用を有することが確認された。すなわち、一態様における本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体は、脊椎動物由来細胞の増殖誘導活性を有する。
【0109】
なお、本開示において「脊椎動物由来細胞」とは、好ましくは哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類又は魚類に由来する細胞であり、より好ましくは哺乳類又は鳥類に由来する細胞であり、更により好ましくは、ヒト、サル、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ラット、又はマウスに由来する細胞である。これらの種に由来する細胞で、ＩＧＦ－１受容体を発現し、当該ＩＧＦ－１受容体に本発明の抗体が交差反応する細胞であれば、本発明の抗体によって細胞増殖が誘導されうる。また、本発明の抗体と交差反応性がある種のＩＧＦ－１受容体を発現されるように改変された細胞や動物、又は当該改変動物に由来する細胞も、本開示における「脊椎動物由来細胞」に含まれる。
【0110】
脊椎動物由来細胞のインビトロにおける増殖誘導活性を調べるための細胞としては、初代培養細胞、株化細胞、又はそれらの細胞の形質転換体細胞等を用いることが可能である。
【0111】
本開示において「初代培養細胞」とは、生物の臓器や組織から分離された細胞で、通常はある程度の継代数での継代培養が可能であるものをいう。脊椎動物由来の初代培養細胞は、脊椎動物の臓器や組織から酵素処理、物理的方法による分散又はｅｘｐｌａｎｔ法等の手法で得ることができる。また、脊椎動物から得られた臓器や組織、又はそれらの断片を用いることも可能である。それらの当該初代細胞を調製する臓器や組織としては、好ましくは甲状腺、副甲状腺や副腎等の内分泌組織、虫垂、扁桃腺、リンパ節や脾臓等の免疫組織、気管や肺等の呼吸器、胃、十二指腸、小腸や大腸等の消化器、腎臓や膀胱等の泌尿器、輸精管、睾丸や前立腺等の雄性生殖器、乳房や卵管等の雌性生殖器、心筋や骨格筋等の筋組織等が挙げられ、より好ましくは肝臓、腎臓若しくは消化器又は筋組織等であり、更により好ましくは筋組織である。本発明の抗体の増殖誘導活性を調べるために用いられる当該初代培養細胞としては、ＩＧＦ－１受容体を発現し、そのＩＧＦ－１受容体と結合するＩＧＦ－１によって増殖が誘導される細胞が用いられる。その代表としては、筋組織から分離された初代培養細胞である骨格筋筋芽細胞等が使われる。ヒトや動物由来の初代培養細胞としては、分譲や市販されているものを入手して使用することも可能である。ヒト初代培養細胞は、例えばＡＴＣＣ（登録商標）、ＥＣＡＣＣ、Ｌｏｎｚａ、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ等の機関や会社から入手できる。
【0112】
脊椎動物由来の細胞における本発明の抗体による細胞の増殖誘導活性を調べる方法としては、細胞数計測、ＤＮＡ合成量の測定、代謝酵素活性の変化量の測定等が挙げられる。細胞数計測の方法は、血球算定盤を用いた方法やコールターカウンター等の細胞数計測装置を用いた方法があり、ＤＮＡ合成量を測定する方法としては、［３Ｈ］－チミジンや５－ブロモ－２’－デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取込みによる測定方法、代謝酵素活性の変化量をみる方法としては、ＭＴＴ法、ＸＴＴ法やＷＳＴ法等の比色定量法があるが、当業者であれば適宜その他の方法等でも実施することができる。
【0113】
細胞の増殖誘導活性は、試験に用いる培養細胞に対して、本発明の抗体を反応させた場合の方が、当該抗体を反応させていない場合よりも細胞の増殖が上昇していることで判定できる。この場合、当該誘導活性の対照として、同条件で本来のＩＧＦ－１受容体のリガンドであるＩＧＦ－１を反応させた測定を行うと、その活性の評価に便利である。試験を行う培養細胞に対して、本発明の抗体及びＩＧＦ－１をそれぞれの濃度を変化させて反応させたときに、最大の増殖誘導活性の５０％を示すときの濃度をＥＣ50値として示す。ヒト骨格筋筋芽細胞を用いて増殖誘導活性を評価した場合、好ましくは本発明の抗体の細胞増殖誘導活性はＩＧＦ－１と同等以上のＥＣ50値であり、より好ましくは本発明の抗体のＥＣ50値はＩＧＦ－１の１／１０以下であり、更に好ましくは１／２０以下であり、更により好ましくは本発明の抗体のＥＣ50値はＩＧＦ－１の１／５０以下である。また、ヒト骨格筋筋芽細胞を用いて増殖誘導活性を評価した場合、本発明の抗体のＥＣ50値は、好ましくは０．５ｎＭ以下であり、より好ましくは０．３ｎＭ以下であり、更に好ましくは０．１ｎＭ以下である。
【0114】
インビボにおける増殖誘導活性を調べる方法としては、脊椎動物に本発明の抗体を投与して、投与された個体全体、又は投与された個体における臓器又は組織の質量、大きさ、細胞数等の変化を計測するか、当該脊椎動物細胞を移植された動物を用いて、当該移植を受けた個体において当該移植された脊椎動物細胞を含む移植片の質量、大きさ、細胞数等の変化を計測することで調べることができる。個体全体での計測では、体重、体長、四肢周囲長等の測定や、インピーダンス法による体組成測定、クレアチニン、身長係数等が用いられる。個体での臓器や組織、又は移植片の計測については、ヒト以外の動物では直接目的の臓器、組織又は移植片を回収し、質量、大きさや含まれる細胞数の算定等が行われる。また、非侵襲的に個体の臓器、組織又は移植片を計測する方法としては、ＤＸＡ（Dual-energy X-ray absorptiometry）法に代表されるＸ線撮影像やＣＴ、ＭＲＩによる画像解析、同位元素や蛍光物質によるトレーサーを用いた造影法等が用いられる。対象となる組織が骨格筋である場合には、筋力の変化等が指標となる。その他、当業者であれば適宜その他の方法を用いることで、本発明の抗体の脊椎動物由来細胞のインビボにおける増殖誘導活性に対する作用を調べることができる。本発明の抗体のインビボにおける脊椎動物由来細胞の増殖誘導活性を調べるためには、本発明の抗体を投与した個体と、本発明の抗体以外の抗体又は別の対照物質を投与された個体との間で、上に示した方法等での計測等を行った結果を比較することで評価することができる。
【0115】
抗体の血中動態に関して、後述の実施例１４において、本発明の抗体の設計の基となったマウス抗体ＩＧＦ１１－１６抗体（特許文献１）と本発明の抗体であるｈＩＧＦ１３＿ＰＳ及びｈＩＧＦ２５＿ＰＳ抗体のモルモット血中動態を比較しているが、ＩＧＦ１１－１６と比較して血中動態が改善していることが示された。
【0116】
本発明の抗体のインビボでの効果の１つとして、筋肉量及び／又は体長の増大効果が挙げられる。ＩＧＦ－１は骨格筋において上述の筋芽細胞の増殖や分化に作用するほか、筋線維を太くする作用もあり、そのような総合的な作用として筋肉量を増大させる効果があると考えられている。本発明の抗体もＩＧＦ－１と同様に動物に投与することによって、当該動物の筋肉量を増大させる効果を有する。
【0117】
本発明の抗体による筋肉量の増大効果を計測する方法としては、個体全体での計測では、体重、体長、四肢周囲長等の測定や、インピーダンス法による体組成測定、クレアチニン、身長係数等が用いられ、また、ＤＸＡ（Dual-energy X-ray absorptiometry）法に代表されるＸ線撮影像やＣＴ、ＭＲＩによる画像解析、同位元素や蛍光物質によるトレーサーを用いた造影法等の方法が用いられるほか、筋力の変化等も指標になる。また、ヒト以外の動物では直接筋肉を採取してその質量や大きさを計測する方法等も可能である。
【0118】
筋肉量の増加の効果は、本発明の抗体を投与された個体と当該抗体を投与されなかった個体での筋肉量の増加を比較すること、又は、一つの個体で本発明の抗体を投与する前と投与した後での筋肉量の比較を行うことで評価することができる。筋肉量の増加の効果は、本発明の抗体が投与により筋肉量の増加の差が見られれば、その効果を知ることができる。ＩＧＦ－１は骨の成長にも関与し、体長（ヒトの場合は身長）を増大させる働きもある。したがって、本発明の抗体も、動物に投与することによって体長を増大させる効果を有する。本発明の抗体による体長増大の効果は、個体の体重、体長、四肢周囲長等の測定によって計測することが可能である。
【0119】
［動物での血糖値に対する作用］
一態様によれば、本発明の抗体は、脊椎動物での血糖値に影響を及ぼさないという特徴を有する。ＩＧＦ－１は、ＩＧＦ－１受容体へのアゴニスト作用の一部として、血糖値の低下作用を起こすことが知られている。しかし、抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体として機能する本発明のアゴニスト抗体は、動物に非経口的に投与した場合に筋肉量の増加を誘導する有効用量の更に１０倍以上の血中曝露量でも、血糖値を変動させないという特徴を示す。
一態様によれば、本発明の抗体は、脊椎動物での血糖値に影響を及ぼさないという特徴を有する。ＩＧＦ－１は、ＩＧＦ－１受容体へのアゴニスト作用の一部として、血糖値の低下作用を起こすことが知られている。しかし、抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体として機能する本発明のアゴニスト抗体は、動物に非経口的に投与した場合に筋肉量の増加を誘導する有効用量の更に１０倍以上の血中曝露量でも、血糖値を変動させないという特徴を示す。
【0120】
本発明の抗体が有する、脊椎動物における血糖低下を誘導しない作用に関して、例えばインビトロで評価することもできる。脊椎動物由来細胞のインビトロにおける細胞内へのグルコース取込みに影響を及ぼさないという特徴を調べるための細胞としては、初代培養細胞、株化細胞、又はそれらの細胞の形質転換体細胞等を用いることが可能である。
【0121】
脊椎動物由来の細胞における本発明の抗体によるグルコース取込みに及ぼす影響を調べる方法としては、細胞内グルコース濃度の測定、グルコース類縁トレーサー物質の細胞内取込み量の測定、グルコーストランスポーターの変化の測定等が挙げられる。グルコース濃度の測定方法は、酵素法等の吸光度測定法があり、グルコース類縁トレーサー物質の細胞内取込み量を測定する方法としては、例えば［３Ｈ］－２’－デオキシグルコースの取込み量の測定、グルコーストランスポーターの変化をみる方法としては、細胞免疫染色法、ウエスタンブロット等があるが、当業者であれば適宜その他の方法等でも実施することができる。細胞内へのグルコース取込みに及ぼす影響は、試験に用いる培養細胞に対して、本発明の抗体を反応させた場合の細胞内へのグルコース取込みが、当該抗体を反応させていない場合と同程度であることで判定できる。この場合、当該誘導活性の対照として、同条件で本来のＩＧＦ－１受容体のリガンドであるＩＧＦ－１を反応させた測定を行うと、その活性の評価に便利である。
【0122】
脊椎動物由来細胞のインビボにおけるグルコース取込みを調べる方法としては、当該脊椎動物に本発明の抗体を投与して、投与された個体における臓器又は組織中のグルコース含量等の変化を計測することで調べることができる。個体全体での計測では、血糖値等の測定や、糖化蛋白質を指標としたヘモグロビンＡ１Ｃ等が用いられる。個体での臓器や組織中のグルコース取込み量等の測定においては、ヒト以外の動物においては直接目的の臓器又は組織を回収し、グルコース含量又はトレーサーの算定等が行われる。また、非侵襲的に個体の臓器又は組織中のグルコース取込みを測定する方法としては、Ｘ線撮影像やＣＴ、ＭＲＩによる画像解析、同位元素や蛍光物質によるトレーサーを用いた造影法等が用いられる。対象となる組織が骨格筋である場合には、グルコースクランプ等も指標となる。その他、当業者であれば適宜その他の方法を用いることで、本発明の抗体の脊椎動物由来細胞のインビボにおけるグルコース取込みに及ぼす影響を調べることができる。
【0123】
また、本発明の抗体は、脊椎動物に投与された場合、当該脊椎動物の筋肉量の増加を誘導する有効用量に対して、同一用量、好ましくは１０倍以上の用量においても、当該脊椎動物の血糖値を変動させないことを特徴とする。本発明の抗体の脊椎動物での血糖値の変化を調べるための動物としては、好ましくは哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類又は魚類に属する動物であり、より好ましくは哺乳類又は鳥類に属する動物であり、更により好ましくは、ヒト、サル、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ラット、又はマウスである。また、本発明の抗体と交差反応性がある種のＩＧＦ－１受容体を発現されるように改変された動物も、本発明の抗体の脊椎動物での血糖値の変化を調べるための動物に含まれる。血糖値の測定は、観血的方法としては比色法や電極法等が用いられ、検出のための酵素にはグルコースオキシダーゼ法（ＧＯＤ法）、グルコースデヒドロゲナーゼ法（ＧＤＨ法）等があり、非観血的方法としては光学的測定法等があるが、当業者であれば適宜その他の方法も選択することができる。血糖値はヒトの場合、空腹時血糖値の正常域は、１００ｍｇ／ｄＬ～１０９ｍｇ／ｄＬである。血糖値に対する薬剤投与による有害事象は（有害事象共通用語規準ｖ４．０）、血糖値が７７ｍｇ／ｄＬ～５５ｍｇ／ｄＬの範囲より低値となる場合は低血糖、１０９ｍｇ／ｄＬ～１６０ｍｇ／ｄＬの範囲より高値となる場合は高血糖と定義されている。薬剤投与による血糖値に及ぼす影響がないとは、薬剤投与後の血糖値が５５ｍｇ／ｄＬより上で１６０ｍｇ／ｄＬ未満の範囲内となること、より好ましくは７７ｍｇ／ｄＬより上で１０９ｍｇ／ｄＬ未満の範囲内となることである。但し、血糖値は投与する動物によって正常値やその変動の幅が異なり、またヒトであっても投与時の血糖値が必ずしも正常値の範囲であるとは限らないことから、本開示において脊椎動物の血糖値を変動させないとは、本発明の抗体を投与された脊椎動物の血糖値が溶媒投与コントロール群と比較して、好ましくは３０％以内、より好ましくは２０％以内、更により好ましくは１０％以内の変化であることをいう。
【0124】
［抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体の製法］
本発明の抗体は、ＩＧＦ－１受容体に対するマウスモノクローナル抗体ＩＧＦ１１－１６（特許文献１）をヒト化することにより取得できる。ヒト以外の動物種から得られたモノクローナル抗体を使用してそのＣＤＲ領域をＣＤＲグラフティングによってヒトフレームワークに置き換えることをヒト化という（非特許文献１２）。さらに３次元構造解析により、立体構造を維持しながら、ヒトへの免疫原性（Ｔ細胞抗原性）を低下させるためのアミノ酸置換や、脱アミド化や酸化などの翻訳後修飾リスクを回避するためのアミノ酸置換を導入することで、活性を維持しつつ製造性や臨床での安全性を確保したヒト化抗体を作製する。
本発明の抗体は、ＩＧＦ－１受容体に対するマウスモノクローナル抗体ＩＧＦ１１－１６（特許文献１）をヒト化することにより取得できる。ヒト以外の動物種から得られたモノクローナル抗体を使用してそのＣＤＲ領域をＣＤＲグラフティングによってヒトフレームワークに置き換えることをヒト化という（非特許文献１２）。さらに３次元構造解析により、立体構造を維持しながら、ヒトへの免疫原性（Ｔ細胞抗原性）を低下させるためのアミノ酸置換や、脱アミド化や酸化などの翻訳後修飾リスクを回避するためのアミノ酸置換を導入することで、活性を維持しつつ製造性や臨床での安全性を確保したヒト化抗体を作製する。
【0125】
活性を維持するために、（１）どんなヒトフレームワークのデザインが必要なのか、及び、（２）ＣＤＲ配列中のどのアミノ酸が重要なのか、に関する情報を得ることはヒト化において非常に重要である。そのようなヒト化抗体の取得方法の例は、後述の実施例１から９に記載されており、それによって得られたヒト化抗体としては、重鎖可変領域としてＶＨ１３＿ＰＮ（配列番号４３）、ＶＨ１３＿ＰＳ（配列番号４７）、ＶＨ２３＿ＰＮ（配列番号４９）、ＶＨ２３＿ＰＳ（配列番号５３）、ＶＨ２５＿ＰＮ（配列番号５５）、又はＶＨ２５＿ＰＳ（配列番号５９）を有すると共に、軽鎖可変領域としてＶＬ１３（配列番号６１）、ＶＬ１４（配列番号６３）、ＶＬ２２（配列番号６５）、ＶＬ２３（配列番号６７）、又はＶＬ２４（配列番号６９）を有するヒト化抗体が挙げられる。軽鎖可変領域として、より好ましくは、ＶＬ２２（配列番号６５）、ＶＬ２３（配列番号６７）、又はＶＬ２４（配列番号６９）を有する。しかし、本発明の抗体は、それらに限定されるものではない。
【0126】
得られた抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体について、その抗体のタンパク質のアミノ酸をコードする塩基配列を有する核酸分子を得ることも可能であり、そのような核酸分子を用いて遺伝子工学的に抗体を作製することも可能である。当該抗体の遺伝子情報におけるＨ鎖、Ｌ鎖、若しくはそれらの可変領域について、ＣＤＲ配列等の情報を参考にして、抗体の結合性や特異性の向上のための改変等を行うことができる。
【0127】
本発明の抗体を製造する方法としては、それぞれ取得したい抗体のタンパク質のアミノ酸をコードする遺伝子を導入された哺乳細胞、昆虫細胞、及び大腸菌などを培養し、得られた培養上清から常法によって抗体を精製して取得することができる。その具体的な方法としては、これに限定されるものではないが、以下のような方法が例示される。
【0128】
まず、Ｈ鎖可変領域をコードする核酸分子に、Ｈ鎖シグナルペプチドをコードする核酸分子と、Ｈ鎖定常領域をコードする核酸分子とを結合させて作製する。Ｌ鎖可変領域をコードする核酸分子に、Ｌ鎖シグナルペプチドをコードする核酸分子と、Ｌ鎖定常領域をコードする核酸分とを結合させて作製する。
【0129】
これらのＨ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子を、選択した宿主細胞で発現するのに適したベクター、例えばクローニングベクター又は発現用ベクターに組込む。ここで、Ｈ鎖遺伝子及びＬ鎖遺伝子は、両方の遺伝子が発現する形であれば、一つのベクターに組み込まれてもよく、また、それぞれ別のベクターに組み込まれてもよい。
【0130】
次に、Ｈ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子が組み込まれたベクターは、宿主細胞に導入される。宿主細胞としては、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、若しくは植物細胞等の真核細胞、又は細菌細胞が挙げられる。宿主細胞に遺伝子を導入する方法としては、リン酸カルシウムやリポフェクション法などの化学的方法、エレクトロポレーション法やパーティクルガン法などの物理的方法又はウイルスやファージなどでの感染による方法などから適宜選択することができる。Ｈ鎖遺伝子及びＬ鎖遺伝子が導入された宿主細胞は、選択をかけることなく培養に用いることもできるし、薬剤耐性や栄養要求性などの性質を用いて遺伝子が導入された組換え体細胞を選択的に濃縮することや、更に遺伝子が導入された単一の宿主細胞から樹立されたクローンの組換え体細胞を培養に用いることも可能である。
【0131】
Ｈ鎖遺伝子及びＬ鎖遺伝子が導入された宿主細胞は、適切な培地と培養条件で培養される。ここで、宿主細胞内で発現したＨ鎖遺伝子及びＬ鎖遺伝子の産物は、通常は抗体タンパク質として培地中に分泌され、当該培地を回収することで産生された抗体タンパク質を得ることができる。但し、遺伝子と宿主との組み合わせにより、必要がある場合には宿主細胞を破壊して細胞内に蓄積した抗体タンパク質を回収すること、原核細胞の場合にはペリプラズム画分から抗体タンパク質を回収することも選択できる。回収された抗体タンパク質を含む培地等の試料から抗体を精製する方法としては、塩沈法、透析や限外濾過法等による濃縮や溶媒の交換、プロテインＡ、プロテインＧ又は抗原等が固定化された担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーなどが一般に用いられるが、その他、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィーやサイズ排除クロマトグラフィー等の方法も適宜用いて精製することが可能である。これらの手順に用いられる各種の手法は、何れも当業者には周知である。
【0132】
ここで、免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖をコードする遺伝子について、望む形質を導入するための遺伝子改変を行ったり、免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖の可変領域又はＣＤＲ領域の構造情報を用いたりすることにより、抗体キメラタンパク質、低分子抗体、スキャフォールド抗体等を作製することは、当業者であれば公知の技術を用いて実施可能である。また、抗体の性能の向上や副作用の回避を目的に、抗体の定常領域の構造に改変を入れることや、糖鎖の部分での改変を行うことも、当業者によく知られた技術によって適宜行うことができる。
【0133】
［抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体を含有する薬］
本発明の抗体は、ＩＧＦ－１に関連した状態又はＩＧＦ－１受容体への作用に起因する疾患の治療薬又は予防薬又は診断薬として利用可能である。以降、治療薬・予防薬又は診断薬を総称して「薬」又は「薬剤」と記載する。
本発明の抗体は、ＩＧＦ－１に関連した状態又はＩＧＦ－１受容体への作用に起因する疾患の治療薬又は予防薬又は診断薬として利用可能である。以降、治療薬・予防薬又は診断薬を総称して「薬」又は「薬剤」と記載する。
【0134】
具体的には、ＩＧＦ－１に関連した状態又は抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体での治療又は予防の対象となる疾患としては、筋萎縮性疾患（例えば廃用性筋萎縮、サルコペニア、カケキシア等）、低身長症（例えばラロン型低身長症、成長ホルモン抵抗性低身長症等）、肝硬変、肝線維化、糖尿病性腎症、慢性腎不全、老化、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）、神経疾患、脳卒中、脊髄損傷、心血管保護、糖尿病、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、腎症、骨粗しょう症、嚢胞性線維症、創傷治癒、筋強直性ジストロフィー、エイズ筋減弱症、ＨＩＶに伴う脂肪再分布症候群、火傷、クローン病、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖性複合免疫不全症、難聴、神経性無食欲症及び未熟児網膜症、ターナー症候群、プラダー・ウィリー症候群、シルバー・ラッセル症候群、特発性低身長、肥満、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、低筋肉量、心筋虚血、低骨密度などがあげられるがこれらに限定されるものではない。
【0135】
特に、本発明の抗体は、筋萎縮性疾患（例えば廃用性筋萎縮、サルコペニア、カヘキシア等）及び／又は低身長症（例えばラロン型低身長症、成長ホルモン抵抗性低身長症等）の治療薬又は予防薬としての使用が好ましい。また、本発明の抗体は投与によって血糖値の変動を生じさせない点において優れている。本抗ＩＧＦ－１受容体抗体の一部又は全てを構成成分として融合又は連結した抗体薬や抗体薬物複合体又は診断薬での治療又は予防又は診断の対象となる疾患としては、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、小児がん、先端巨大症、卵巣がん、膵臓がん、良性前立腺肥大症、乳がん、前立腺がん、骨がん、肺がん、結腸直腸がん、頚部がん、滑膜肉腫、膀胱がん、胃がん、ウィルムス腫瘍、転移性カルチノイド及び血管作動性腸管ペプチド分泌腫瘍に関連する下痢、ビポーマ、ウェルナー－モリソン症候群、ベックウィズ－ヴィーデマン症候群、腎臓がん、腎細胞がん、移行上皮がん、ユーイング肉腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、脳腫瘍、膠芽腫、非膠芽腫性脳腫瘍、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、脳室上衣腫、脈絡叢乳頭腫、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管の平滑筋再狭窄、不適切な微小血管増殖、糖尿病性網膜症、グレーヴズ病、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、自己免疫性甲状腺疾患、橋本甲状腺炎、甲状腺眼症、甲状腺機能亢進症、及びベーチェット病が挙げられる。
【0136】
本発明の抗体を含有する薬は、本発明の抗体の他に、医薬的に許容される担体及び／又はその他の添加剤を含有する、医薬組成物の形態として製剤化してもよい。医薬的に許容される担体及び／又はその他の添加剤を用いての製剤は、例えばUniversity of the Sciences in Philadelphia, “Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th EDITION”, Lippincott Williams & Wilkins, 2000に記載の方法で実施することが可能である。
【0137】
このような薬剤の一つの形態としては、無菌の水性液又は油性液に溶解、懸濁、又は乳化することによって調製された液剤或いは凍結乾燥剤として供される。このような溶剤又は溶解液として、水性液としては注射用蒸留水、生理食塩水等が挙げられ、それに加えて浸透圧調節剤（例えば、Ｄ－グルコース、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等）が添加される場合、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（例えばエタノール）、ポリアルコール（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０）等が併用される場合もある。また、溶剤又は溶解液としては油性液が用いられる場合もあり、当該油性液の例としてはゴマ油、大豆油等があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等が併用される場合もある。このような製剤においては、適宜、緩衝剤（例えば、リン酸塩類緩衝剤、酢酸塩類緩衝剤）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、アスコルビン酸、エリソルビン酸及びそれらの塩等）、着色剤（例えば、銅クロロフィル、β－カロチン、赤色２号、青色１号等）、防腐剤（例えばパラオキシ安息香酸エステル、フェノール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム等）、増粘剤（例えばヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース及びそれらの塩等）、安定化剤（例えばヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール等）、矯臭剤（例えばメントール、柑橘香料等）の添加剤が用いられる場合がある。
【0138】
別の形態として、粘膜適応用薬剤もあげられる。この製剤においては、粘膜への吸着性、滞留性等を付与することを主な目的として、添加剤として粘着剤、粘着増強剤、粘稠剤、粘稠化剤等（例えば、ムチン、カンテン、ゼラチン、ペクチン、カラギーナン、アルギン酸ナトリウム、ローカストビンガム、キサンタンガム、トラガントガム、アラビアゴム、キトサン、プルラン、ワキシースターチ、スクラルフェート、セルロース、及びその誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリグリセリン脂肪酸エステル、アクリル酸（メタ）アクリル酸アルキル共重合体、又はその塩、ポリグリセリン脂肪酸エステル等）が含有される場合もある。しかしながら、生体に供与される治療剤又は予防剤の形態及び溶剤や添加剤はこれらに限定されるものではなく、当業者であれば適宜選択できる。
【0139】
本発明の抗体を含有する薬は、本発明の抗体の他に、既存の他の薬物（活性成分）を含んでいてもよい。また、抗体薬物複合体や二重特異性抗体・多重特異性抗体のように他の薬剤などと融合又は連結されていても良い。また、本発明の抗体を含む薬を、既存の他の薬物と組み合わせ、キットの形態としてもよい。抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体と組み合わせる活性成分として、成長ホルモン又はそのアナログ、インスリン又はそのアナログ、ＩＧＦ－２又はそのアナログ、抗ミオスタチン抗体、ミオスタチンアンタゴニスト、抗アクチビンIIＢ型受容体抗体、アクチビンIIＢ受容体アンタゴニスト、可溶性アクチビンIIＢ型受容体又はそのアナログ、グレリン又はそのアナログ、フォリスタチン又はそのアナログ、ベータ２アゴニスト、及び選択的アンドロゲン受容体モジュレーターが挙げられる。
【0140】
また、本抗ＩＧＦ－１受容体抗体を構成成分として含む抗体薬や抗体薬物複合体の調製において、本抗ＩＧＦ－１受容体抗体と組み合わされる活性成分、或いは本抗ＩＧＦ－１受容体抗体と共に含有される活性成分としては、コルチコステロイド、制吐薬、オンダンセトロン塩酸、グラニセトロン塩酸、メトクロプラミド（metoclopramide）、ドンペリドン、ハロペリドール、シクリジン、ロラゼパム、プロクロルペラジン、デキサメタゾン、レボメプロマジン、トロピセトロン、癌ワクチン、ＧＭ－ＣＳＦ阻害薬、ＧＭ－ＣＳＦ ＤＮＡワクチン、細胞に基づくワクチン、樹状細胞ワクチン、組換えウイルスワクチン、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）ワクチン、同種腫瘍ワクチン、自己腫瘍ワクチン、鎮痛薬、イブプロフェン、ナプロキセン、トリサリチル酸コリンマグネシウム、オキシコドン塩酸、抗血管形成薬、抗血栓薬、抗ＰＤ－１抗体、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、アテゾリズマブ、抗ＣＴＬＡ４抗体、イピリムマブ、抗ＣＤ２０抗体、リツキシマブ、抗ＨＥＲ２抗体、トラスツズマブ、抗ＣＣＲ４抗体、モガムリズマブ、抗ＶＥＧＦ抗体、ベバシズマブ、抗ＶＥＧＦ受容体抗体、可溶性ＶＥＧＦ受容体断片、抗ＴＷＥＡＫ抗体、抗ＴＷＥＡＫ受容体抗体、可溶性ＴＷＥＡＫ受容体断片、ＡＭＧ ７０６、ＡＭＧ ３８６、抗増殖薬、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害薬、αｖβ３阻害薬、αｖβ５阻害薬、ｐ５３阻害薬、Ｋｉｔ受容体阻害薬、ｒｅｔ受容体阻害薬、ＰＤＧＦＲ阻害薬、成長ホルモン分泌阻害薬、アンジオポエチン阻害薬、腫瘍浸潤マクロファージ阻害薬、ｃ－ｆｍｓ阻害薬、抗ｃ－ｆｍｓ抗体、ＣＳＦ－１阻害薬、抗ＣＳＦ－１抗体、可溶性ｃ－ｆｍｓ断片、ペグビソマント、ゲムシタビン、パニツムマブ、イリノテカン、及びＳＮ－３８が挙げられる。配合される本発明の抗体以外の薬物の用量としては、通常の治療に用いられる用量で行うことができるが、状況に応じて増減することも可能である。
【0141】
本発明における薬剤は、症状の改善を目的として、非経口的に投与することができる。非経口投与の場合には、例えば経鼻剤とすることができ、液剤、縣濁剤、固形製剤等を選択できる。また別の非経口投与の形態としては、注射剤とすることができ、注射剤としては、皮下注射剤、静脈注射剤、点滴注射剤、筋肉注射剤、脳室内注射剤又は腹腔内注射剤等を選択することができる。またその他の非経口投与に用いる製剤としては、坐剤、舌下剤、経皮剤、経鼻剤以外の経粘膜投与剤等も挙げられる。更に、ステントや血管内栓塞剤に含有若しくは塗布する態様で、血管内局所投与することもできる。
【0142】
本発明における治療剤又は予防剤の投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間、又は当該医薬組成物に含有される活性成分の種類等により異なるが、通常成人１人あたり、１回につき主剤を０．１ｍｇから１ｇの範囲で、好ましくは０．５ｍｇから１００ｍｇの範囲で、１週から４週間に１回、若しくは１か月から２か月に１回投与することができる。しかし、投与量及び投与回数は種々の条件により変動するため、前記投与量及び回数よりも少ない量及び回数で充分な場合もあり、また前記の範囲を超える投与量及び投与回数が必要な場合もある。
【実施例0143】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施例にも束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。
【0144】
［実施例１］マウス抗体ＩＧＦ１１－１６のヒト化抗体のデザイン：
・ヒトフレームワークの選定
Kohlerら（Nature, (1975), Vol.256, pp.495-497）のハイブリドーマ法により作製し得られたＩＧＦ－１受容体に対するマウスモノクローナル抗体ＩＧＦ１１－１６（特許文献１）の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）中の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸を、鋳型ヒト抗体に移植した。移植先となる鋳型ヒト抗体としては、マウス抗体ＩＧＦ１１－１６（マウス親抗体）のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列（それぞれ配列番号３９及び配列番号４１）に対して、それらと相同性の高いアミノ酸配列を持つヒト抗体の生殖細胞系列（germline）の中から、重鎖配列としてＶＨ－１－４６（配列番号９５）及びＶＨ－１－ｅ（配列番号９６）、重鎖Ｊ－セグメントとしてＪＨ４（配列番号９７）、軽鎖配列としてＶＫ１－Ｌ５（配列番号９８）及びＶＫ１－Ａ２０（配列番号９９）、軽鎖Ｊ－セグメントとしてＪＫ２（配列番号１００）を選択し、これらを以下の表１に示すように組み合わせた２通りのヒト化抗体フレームワークを用いた。
・ヒトフレームワークの選定
Kohlerら（Nature, (1975), Vol.256, pp.495-497）のハイブリドーマ法により作製し得られたＩＧＦ－１受容体に対するマウスモノクローナル抗体ＩＧＦ１１－１６（特許文献１）の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）中の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸を、鋳型ヒト抗体に移植した。移植先となる鋳型ヒト抗体としては、マウス抗体ＩＧＦ１１－１６（マウス親抗体）のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列（それぞれ配列番号３９及び配列番号４１）に対して、それらと相同性の高いアミノ酸配列を持つヒト抗体の生殖細胞系列（germline）の中から、重鎖配列としてＶＨ－１－４６（配列番号９５）及びＶＨ－１－ｅ（配列番号９６）、重鎖Ｊ－セグメントとしてＪＨ４（配列番号９７）、軽鎖配列としてＶＫ１－Ｌ５（配列番号９８）及びＶＫ１－Ａ２０（配列番号９９）、軽鎖Ｊ－セグメントとしてＪＫ２（配列番号１００）を選択し、これらを以下の表１に示すように組み合わせた２通りのヒト化抗体フレームワークを用いた。
【0145】
【表1】
【0146】
・ＣＤＲ領域のグラフティング及びＦＲアミノ酸置換
上記の鋳型ヒト抗体ＶＨ及びＶＬのＦＲに、マウス抗体ＩＧＦ１１－１６のＶＨ及びＶＬから必要なアミノ酸配列を移植してヒト化抗体を作製した。
上記の鋳型ヒト抗体ＶＨ及びＶＬのＦＲに、マウス抗体ＩＧＦ１１－１６のＶＨ及びＶＬから必要なアミノ酸配列を移植してヒト化抗体を作製した。
【0147】
具体的には、ＶＨについては、前述の鋳型ヒト抗体ＶＨのＣＤＲアミノ酸配列及びＦＲアミノ酸の数カ所をマウス抗体ＩＧＦ１１－１６のＶＨ中の対応するアミノ酸配列で置換し、マウス抗体ＩＧＦ１１－１６をヒト化したＶＨのアミノ酸配列をデザインし、更にそれらのアミノ酸をコードするＤＮＡの塩基配列をデザインした。
【0148】
ＶＬについては、前述の鋳型ヒト抗体ＶＬのＣＤＲアミノ酸配列及びＦＲアミノ酸の数カ所をマウス抗体ＩＧＦ１１－１６のＶＬ中のアミノ酸配列に置換し、マウス抗体ＩＧＦ１１－１６をヒト化したＶＬのアミノ酸配列をデザインし、更にそれらのアミノ酸をコードするＤＮＡの塩基配列をデザインした。
【0149】
デザインしたヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の構成を下記表２に示す。
なお、本実施例の記載及び図面中において、デザインされたヒト化抗体重鎖可変領域と重鎖定常領域とを連結して構成されるヒト化重鎖、デザインされたヒト化抗体軽鎖可変領域と軽鎖定常領域とを連結して構成されるヒト化軽鎖、更にはそれらのヒト化重鎖とヒト化軽鎖とを組み合わせて構成される完全ヒト化抗体を、使用した重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域の名称により略称する場合がある。例えば、図１Ａ中の“ＶＬ２２／ＶＨ１３＿ＰＳ”とは、ＶＬ２２を軽鎖可変領域とし、これにヒトκ鎖定常領域を連結した軽鎖と、ＶＨ１３＿ＰＳを重鎖可変領域とし、これにＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ重鎖定常領域を連結した重鎖とを組み合わせて構成されるヒト化抗体を指す。 また、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７のアミノ酸配列に対応する核酸塩基配列の一例を、それぞれ配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８に示す。
なお、本実施例の記載及び図面中において、デザインされたヒト化抗体重鎖可変領域と重鎖定常領域とを連結して構成されるヒト化重鎖、デザインされたヒト化抗体軽鎖可変領域と軽鎖定常領域とを連結して構成されるヒト化軽鎖、更にはそれらのヒト化重鎖とヒト化軽鎖とを組み合わせて構成される完全ヒト化抗体を、使用した重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域の名称により略称する場合がある。例えば、図１Ａ中の“ＶＬ２２／ＶＨ１３＿ＰＳ”とは、ＶＬ２２を軽鎖可変領域とし、これにヒトκ鎖定常領域を連結した軽鎖と、ＶＨ１３＿ＰＳを重鎖可変領域とし、これにＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ重鎖定常領域を連結した重鎖とを組み合わせて構成されるヒト化抗体を指す。 また、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７のアミノ酸配列に対応する核酸塩基配列の一例を、それぞれ配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８に示す。
【0150】
【表2】
【0151】
［実施例２］ヒト化抗体の調製：
デザインしたヒト化抗体の重鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ４サブクラスを安定化した変異体であるヒトＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ変異体の重鎖定常領域をコードするＤＮＡをそれぞれ合成し、ｐｃＤＮＡ３．４系発現ベクターに組み込み連結し、ヒト化抗体重鎖を発現するプラスミドとした。
デザインしたヒト化抗体の重鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ４サブクラスを安定化した変異体であるヒトＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ変異体の重鎖定常領域をコードするＤＮＡをそれぞれ合成し、ｐｃＤＮＡ３．４系発現ベクターに組み込み連結し、ヒト化抗体重鎖を発現するプラスミドとした。
【0152】
デザインしたヒト化抗体の軽鎖可変領域については、κ鎖定常領域を連結したヒト化抗体軽鎖領域をコードするＤＮＡを合成し、ｐｃＤＮＡ３．４系発現ベクターに組み込み、ヒト化抗体軽鎖を発現するプラスミドとした。
【0153】
これらのヒト化抗体重鎖発現プラスミドとヒト化抗体軽鎖発現プラスミドを混合して、ＥｘｐｉＣＨＯ（登録商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Thermo Fisher Scientific）を用いて細胞に導入することにより、各種抗体を発現させた。この際、ＦＷ１＿ＶＨ１を組込んだ重鎖発現プラスミドとＦＷ１＿ＶＬ１を組込んだ軽鎖発現プラスミドとを組み合わせて発現させたヒト化抗体をＦＷ１＿ｖａｒ１抗体、ＦＷ２＿ＶＨ１を組込んだ重鎖発現プラスミドとＦＷ２＿ＶＬ２を組込んだ軽鎖発現プラスミドとを組み合わせて発現させたヒト化抗体をＦＷ２＿ｖａｒ２抗体と、それぞれ命名した。ＦＷ１＿ｖａｒ９、ＦＷ１＿ｖａｒ１０、及びＦＷ１＿ｖａｒ１４に関しても、同様に実施及び命名した。ヒト化抗体は、ヒト化抗体重鎖及びヒト化抗体軽鎖発現プラスミドを導入した細胞の培養上清を、プロテインＡカラムを用いてアフィニティー精製することにより取得した。
以降のヒト化抗体の調製に関しては、上述の方法に準じて行った。
以降のヒト化抗体の調製に関しては、上述の方法に準じて行った。
【0154】
［実施例３］ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ
（登録商標）
によるＩＧＦ－１受容体活性化作用：
デザインされたヒト化抗体のＩＧＦ－１受容体に対する活性化作用を検出するために、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ＩＧＦ１Ｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｓｓａｙ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）を用いて、以下の手順によりＩＧＦ－１受容体シグナルの活性化を測定した。
デザインされたヒト化抗体のＩＧＦ－１受容体に対する活性化作用を検出するために、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ＩＧＦ１Ｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｓｓａｙ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）を用いて、以下の手順によりＩＧＦ－１受容体シグナルの活性化を測定した。
【0155】
ＩＧＦ－１受容体を発現させた細胞を、ポリ－Ｄ－リジンコート又はコラーゲン－Ｉコートされた９６ウェルプレート（Ｂｌａｃｋ／ｃｌｅａｒ又はＷｈｉｔｅ／ｃｌｅａｒ）に、９０μＬ／ウェル（２×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェル又は５×１０3ｃｅｌｌｓ／ウェル）で播種し、３７℃、５％ＣＯ2の条件でインキュベートした。翌日、各濃度の薬剤を１０μＬ／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ2の条件でインキュベートした。その翌日、培養上清を３０μＬで取り、１５μＬの基質溶液を添加して、６０分間反応させ、ルミノメーター（Ｔｒｉｓｔａｒ、ベルトールド）にて発光シグナル（ＲＬＵ）を測定した。１２．５ｎＭ抗体添加による蛍光強度から抗体０．１ｎＭ添加時の値をバックグラウンドとして差し引いた値を活性化強度とし、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の値を１としてヒト化抗体の相対値を算出した。
【0156】
結果を表３に示す。この結果からヒト化抗体（ＦＷ１＿ｖａｒ１、ｖａｒ９、ｖａｒ１０、ｖａｒ１４、及びＦＷ２＿ｖａｒ２）のＩＧＦ－１受容体活性化能が、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と比較して２０％を超えて減弱していることがわかった。
【0157】
【表3】
【0158】
そこで、ヒト化抗体の抗原結合領域であるＣＤＲ領域に関して、マウスと異なる配列部分である重鎖ＣＤＲ２領域のＡ６１、Ｑ６２、Ｑ６５、及びＧ６６をそれぞれＮ６１、Ｅ６２、Ｋ６５、及びＳ６６にアミノ酸置換しマウス親抗体と同一にしたアミノ酸置換ヒト化抗体（ＦＷ１＿ｖａｒ１０＿ＮＥＫＳ、ＦＷ１＿ｖａｒ１４＿ＮＥＫＳ）を作製し、比較対象としてマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６、ＦＷ１＿ｖａｒ１を使用して、前述と同様にＩＧＦ－１受容体活性化能を比較した。
【0159】
結果を表４に示す。その結果、活性強度の回復は観察されなかった。
【表4】
【0160】
以上の結果から、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列をマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６のＣＤＲと同一のアミノ酸配列に戻しても、その活性強度はマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等のレベル（活性強度比が±２０％以内）に回復しなかった。よって、ＣＤＲではなく、ＦＲ（フレーム領域）が活性低下に影響していることが推察された。
【0161】
そこで、ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３をそれぞれマウスのＦＲに置換したヒト化抗体を作製した。作製したヒト化抗体のマウスＦＲ置換体を表５に示す。これらの置換体のＩＧＦ－１受容体シグナル活性化を前述の通りＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）の系によって評価した。マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の可変領域とヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）の定常領域を融合させたヒトキメラＩＧＦ１１－１６抗体（Ｃｈｉｍｅｒａ）を陽性対照として、抗体濃度１６．７ｎＭにおけるシグナル強度を前述同様に比較した。結果を表５に示す。また、配列番号２９、３１、３３、３５、及び３７のアミノ酸配列に対応する核酸塩基配列の一例を、それぞれ配列番号３０、３２、３４、３６、及び３８に示す。
【0162】
【表5】
【0163】
以上の結果から、シグナル強度がヒトキメラＩＧＦ１１－１６と同等（値が±２０％以内）である置換体は、ＦＷ１＿ｖａｒ９＿ｍＦＲ－Ｈ１であり、マウス重鎖ＦＲ１がヒト化抗体の活性保持に重要であることが判った。
【0164】
そこで、次にマウス重鎖ＦＲ１の中で活性を保持するために必要なアミノ酸を同定した。マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６とヒト化抗体の重鎖ＦＲ１のアミノ酸の違いは７か所存在したため、１か所ずつマウス親抗体のアミノ酸へ置換した。作製したマウスＦＲ１アミノ酸置換ヒト化抗体を表６に示す。これらのヒト化抗体マウスＦＲ１アミノ酸置換体についてＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）の系でＩＧＦ－１受容体活性化シグナル強度を測定し、抗体濃度１６．７ｎＭにおけるシグナル強度をマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と比較した。その結果、２５位のセリンをプロリンに置換したヒト化抗体のみがマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等（活性比が±２０％以内）であった。結果を表６に示す。
【0165】
【表6】
【0166】
以上の結果から、重鎖ＦＲ１領域の２５位のプロリンが活性保持に重要であることが判った。以降のヒト化抗体の重鎖は全て２５位のＰ（プロリン、Ｐｒｏ）置換体を使用した。
【0167】
［実施例４］アラニン置換による活性維持に重要なＣＤＲ領域アミノ酸同定：
ＣＤＲ領域において、活性を保持するために必要なアミノ酸を同定する目的で、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６においてそれぞれのアミノ酸をアラニン置換し、その置換体のシグナル活性化能をＥＣ50値とＥmax値で比較し、結合活性を抗原ＥＬＩＳＡで評価した。マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と比較してＥＣ50値：２倍以内、Ｅmax値：±２０％以内を同等の活性と定義した。
ＣＤＲ領域において、活性を保持するために必要なアミノ酸を同定する目的で、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６においてそれぞれのアミノ酸をアラニン置換し、その置換体のシグナル活性化能をＥＣ50値とＥmax値で比較し、結合活性を抗原ＥＬＩＳＡで評価した。マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と比較してＥＣ50値：２倍以内、Ｅmax値：±２０％以内を同等の活性と定義した。
【0168】
ＩＧＦ－１受容体シグナル活性化能は、実施例３で記載したＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）の系で評価した。ＥＣ50値及びＥmaxは、解析ソフトＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して算出した。結合活性に関しては、組換えＩＧＦ－１受容体細胞外領域を抗原として固定した抗原ＥＬＩＳＡで測定した。具体的には、ヒトリコンビナントＩＧＦ－１Ｒ（Ｒ＆Ｄ社製）をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で０．５μｇ／ｍＬに調製した。固層化プレートに調製したヒトリコンビナントＩＧＦ－１Ｒ溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。４℃で一晩反応させ、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ（０．０２％アジ化ナトリウム含有）に置換した。ＥＬＩＳＡに使用するまで４℃で保存した。固層化プレートに被験物質溶液（５ｎＭ濃度の抗体溶液）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。室温で1時間反応させたのち、洗浄液（ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水））にて２回洗浄した。アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（３％ＢＳＡ／ＰＢＳにて２０００倍希釈した）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。室温で４５分間反応させ、洗浄液にて３回洗浄したのち、基質（ｐＮＰＰ（パラニトロフェニルリン酸））を添加して反応を開始させた。室温で１時間反応させたのちに、４０５及び５５０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度４０５ｎｍ－吸光度５５０ｎｍの差の値を算出した。この値を結合活性として解析を行った。
【0169】
作製したＩＧＦ１１－１６抗体ＣＤＲ置換体とシグナル活性化及び結合活性の測定結果を表７及び表８に示す。得られた結果から、ＣＤＲ領域において、アラニン置換することで結合活性が約１～２割に低下したアミノ酸部分、すなわちＣＤＲ－Ｌ１の位置３２のトリプトファン、ＣＤＲ－Ｈ１の位置３３のトリプトファン、ＣＤＲ－Ｈ２の位置５０のグルタミン酸、ＣＤＲ－Ｈ２の位置５２のアスパラギン及びＣＤＲ－Ｈ３の位置１０２のアルギニンの５つのアミノ酸が活性保持に極めて重要であることが同定された。また、ＣＤＲ－Ｈ１の位置３５のヒスチジン、ＣＤＲ－Ｈ２の位置５４のセリン、ＣＤＲ－Ｈ２の位置５５のアスパラギン、ＣＤＲ－Ｈ２の位置５６のセリン、ＣＤＲ－Ｈ２の位置５９のアスパラギン、及び、ＣＤＲ－Ｈ２の位置６４のフェニルアラニンはＡｌａ置換により活性が低下したことから活性保持に寄与していると考えられる。
一方、アラニン置換したＣＤＲ領域におけるアミノ酸残基５４部位のうち、４４部位はアラニン置換後も８０％以上の結合活性を示した。
一方、アラニン置換したＣＤＲ領域におけるアミノ酸残基５４部位のうち、４４部位はアラニン置換後も８０％以上の結合活性を示した。
【0170】
【表7】
【0171】
【表8】
【0172】
［実施例５］ヒト化重鎖可変領域のデザイン：
実施例３の結果から重鎖の２５位のプロリンが活性維持に重要なことが判明したため、重鎖の２５位をＰとして、ヒト化重鎖可変領域ＦＷ１＿ＶＨ１及びＦＷ２＿ＶＨ１を基本骨格としてデザインを行った。ＦＷ１＿ＶＨ１のＦＲ１を基本としてアミノ酸置換体を検討したため、ＦＷ２－ＶＨ１のＦＲ１部分はＦＷ１＿ＦＲ１と同一にするため、Ｓ１６Ａのアミノ酸置換を行った。また、免疫原性低減のためのアミノ酸置換導入は、Ｅｐｉｂａｓｅ（登録商標）（Ｌｏｎｚａ社）の免疫原性スコア解析結果に基づいて実施した。デザインされた重鎖可変領域リストを以下の表９に示す。
実施例３の結果から重鎖の２５位のプロリンが活性維持に重要なことが判明したため、重鎖の２５位をＰとして、ヒト化重鎖可変領域ＦＷ１＿ＶＨ１及びＦＷ２＿ＶＨ１を基本骨格としてデザインを行った。ＦＷ１＿ＶＨ１のＦＲ１を基本としてアミノ酸置換体を検討したため、ＦＷ２－ＶＨ１のＦＲ１部分はＦＷ１＿ＦＲ１と同一にするため、Ｓ１６Ａのアミノ酸置換を行った。また、免疫原性低減のためのアミノ酸置換導入は、Ｅｐｉｂａｓｅ（登録商標）（Ｌｏｎｚａ社）の免疫原性スコア解析結果に基づいて実施した。デザインされた重鎖可変領域リストを以下の表９に示す。
【0173】
【表9】
【0174】
［実施例６］ヒト化軽鎖可変領域のデザイン：
ヒト化軽鎖可変領域に関しては、ＦＷ１＿ＶＬ１及びＦＷ２＿ＶＬ２を基本骨格としてデザインを行った。免疫原性スコア低下のためのアミノ酸置換導入は、Ｅｐｉｂａｓｅ（登録商標）（Ｌｏｎｚａ社）の解析結果に基づいて実施した。デザインされた軽鎖可変領域リストを表に示す。
ヒト化軽鎖可変領域に関しては、ＦＷ１＿ＶＬ１及びＦＷ２＿ＶＬ２を基本骨格としてデザインを行った。免疫原性スコア低下のためのアミノ酸置換導入は、Ｅｐｉｂａｓｅ（登録商標）（Ｌｏｎｚａ社）の解析結果に基づいて実施した。デザインされた軽鎖可変領域リストを表に示す。
【0175】
【表10】
【0176】
［実施例７］脱アミド化リスクアミノ酸置換体によるヒト化抗体デザイン：
ヒト化抗体を製造する際に脱アミド化が起こると品質管理が困難となる。そのため、事前に脱アミド化リスクのあるアミノ酸は、活性に影響のない別のアミノ酸へ置換することが必要である。一般的に脱アミド化リスクのある配列としてＮＧ、ＮＴ、ＮＳ、及びＮＮが挙げられる。本ヒト化抗体の重鎖のＣＤＲ－Ｈ２領域においてＮＳ配列が存在する。故に、５５位のアスパラギン（Ｎ）が脱アミド化してアスパラギン酸（Ｄ）へ変換されるリスクを考慮してアミノ酸置換を行った。置換した重鎖のリストを表１１に示す。また、配列番号４５、５１、及び５７のアミノ酸配列に対応する核酸塩基配列の一例を、それぞれ配列番号４６、５２、及び５８に示す。
ヒト化抗体を製造する際に脱アミド化が起こると品質管理が困難となる。そのため、事前に脱アミド化リスクのあるアミノ酸は、活性に影響のない別のアミノ酸へ置換することが必要である。一般的に脱アミド化リスクのある配列としてＮＧ、ＮＴ、ＮＳ、及びＮＮが挙げられる。本ヒト化抗体の重鎖のＣＤＲ－Ｈ２領域においてＮＳ配列が存在する。故に、５５位のアスパラギン（Ｎ）が脱アミド化してアスパラギン酸（Ｄ）へ変換されるリスクを考慮してアミノ酸置換を行った。置換した重鎖のリストを表１１に示す。また、配列番号４５、５１、及び５７のアミノ酸配列に対応する核酸塩基配列の一例を、それぞれ配列番号４６、５２、及び５８に示す。
【0177】
【表11】
【0178】
［実施例８］ヒト化抗体のＩＧＦ－１受容体シグナル活性化作用による選択：
ヒト化抗体をＩＧＦ－１受容体の活性化作用に基づいて評価し、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等の活性を有するヒト化抗体を選択した。
ヒト化抗体をＩＧＦ－１受容体の活性化作用に基づいて評価し、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等の活性を有するヒト化抗体を選択した。
【0179】
抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体のＩＧＦ－１受容体に対する活性化作用を検出するために、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ＩＧＦ１Ｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｓｓａｙ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）を用いてＩＧＦ－１受容体シグナルの活性化を測定した。
【0180】
ＩＧＦ－１受容体を発現させた細胞を、ポリ－Ｄ－リジンコート又はコラーゲン－Ｉコートされた９６ウェルプレート（Ｂｌａｃｋ／ｃｌｅａｒ又はＷｈｉｔｅ／ｃｌｅａｒ）に、９０μＬ／ウェル（２×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェル又は５×１０3ｃｅｌｌｓ／ウェル）で播種し、３７℃、５％ＣＯ2の条件でインキュベートした。翌日、各濃度の薬剤を１０μＬ／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ2の条件でインキュベートした。その翌日、培養上清を３０μＬで取り、１５μＬの基質溶液を添加して、６０分間反応させ、ルミノメーター（Ｔｒｉｓｔａｒ、ベルトールド）にて発光シグナル（ＲＬＵ）を測定した。
【0181】
測定の結果、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等（マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と比較してＥＣ50値：２倍以内、Ｅmax値：±２０％以内）の活性を確認したヒト化抗体を表１２に示す。
【0182】
【表12】
【0183】
［実施例９］ヒト化抗体のヒト筋芽細胞増殖活性による選択：
ヒト化抗体をヒト筋芽細胞増殖活性に基づいて評価し、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等の活性を有するヒト化抗体を選択した。
ヒト化抗体をヒト筋芽細胞増殖活性に基づいて評価し、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等の活性を有するヒト化抗体を選択した。
【0184】
抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体のヒト筋芽細胞に対する増殖活性を検討するため、ヒト筋芽細胞に薬剤を添加して、４日後の細胞内のＡＴＰ量を測定した。
【0185】
正常ヒト骨格筋筋芽細胞（Ｈｕｍａｎ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｍｙｏｂｌａｓｔ Ｃｅｌｌｓ、ＨＳＭＭ、Ｌｏｎｚａ）を、ＳｋＢＭ－２（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ－３２４６）に１％ＢＳＡを含む培地を使用して、９６ウェルプレート（Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉ ｃｏａｔｅｄ）に、０．１ｍＬ／ウェル（２×１０3ｃｅｌｌｓ／ウェル）で播種し、３７℃、５％ＣＯ2の条件でインキュベートした。細胞播種の翌日に各種薬剤を２５μＬ／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ2の条件で４日間インキュベートした。細胞増殖の指標として細胞内のＡＴＰ量を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。４日間インキュベートした９６ウェルプレートを、培養液が５０μＬ／ウェルとなるように上清を除き、３０分以上室温にて静置した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬を５０μＬ／ウェルで添加して１０分以上反応させた後に、ルミノメーター（Ｔｒｉｓｔａｒ、ベルトールド）にて発光シグナルを測定した。
【0186】
その結果、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等（マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と比較して、ＥＣ50値：１０倍以内、Ｅmax：９０％以上）の活性を確認したヒト化抗体を表１３に示す。また、測定結果のグラフを図１Ａ～Ｆに示す。
【0187】
【表13】
【0188】
［実施例１０］免疫原性評価：
ヒト化抗体の免疫原性を解析するために、ＬｏｎｚａのＥｐｉｂａｓｅ（登録商標）ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏを使用し、免疫原性スコアを算出した。ＬｏｎｚａのＥｐｉｂａｓｅ（登録商標）ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏプラットフォームは、既に実験的に決定された１０－ｍｅｒのペプチドとＨＬＡ ｃｌａｓｓ II受容体の結合親和性とともにＨＬＡ ｃｌａｓｓ II受容体の構造特性を使用して、抗体に含まれるアミノ酸配列中に存在するＴ細胞の活性化に必要な条件である潜在的なペプチド／ＨＬＡ結合を予測し、免疫原性スコアとして算出する免疫原性予測方法である。８５種類のＨＬＡクラスIIアロタイプ（４３種のＤＲＢ１、８種のＤＲＢ３／４／５、２２種のＤＱ、１２種のＤＰ）における評価をすることで、全人口の９９％以上をカバーすることができる。免疫原性スコアは、アロタイプの結合親和性に加えて出現頻度などを加味してスコア化された。
ヒト化抗体の免疫原性を解析するために、ＬｏｎｚａのＥｐｉｂａｓｅ（登録商標）ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏを使用し、免疫原性スコアを算出した。ＬｏｎｚａのＥｐｉｂａｓｅ（登録商標）ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏプラットフォームは、既に実験的に決定された１０－ｍｅｒのペプチドとＨＬＡ ｃｌａｓｓ II受容体の結合親和性とともにＨＬＡ ｃｌａｓｓ II受容体の構造特性を使用して、抗体に含まれるアミノ酸配列中に存在するＴ細胞の活性化に必要な条件である潜在的なペプチド／ＨＬＡ結合を予測し、免疫原性スコアとして算出する免疫原性予測方法である。８５種類のＨＬＡクラスIIアロタイプ（４３種のＤＲＢ１、８種のＤＲＢ３／４／５、２２種のＤＱ、１２種のＤＰ）における評価をすることで、全人口の９９％以上をカバーすることができる。免疫原性スコアは、アロタイプの結合親和性に加えて出現頻度などを加味してスコア化された。
【0189】
結果を表１４及び表１５に示す。同様に評価したマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６及びマウス・ヒトキメラ抗体（マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の可変領域とヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）の定常領域を有する抗体）の免疫原性スコアと比較して、ヒト化抗体の免疫原性が低いことが判った。
【0190】
【表14】
【0191】
【表15】
【0192】
［実施例１１］哺乳動物ＩＧＦ－１受容体に対する結合活性評価：
ヒト（配列番号７１）、カニクイザル（配列番号７３）、ウサギ（配列番号７５）、モルモット（配列番号７７）、ラット（配列番号７９）及びマウス（配列番号８１）のＩＧＦ－１受容体に対する抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体の結合活性を検討するために、各種ＩＧＦ－１受容体を発現させた細胞を用いてＣｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ＥＬＩＳＡを実施した。
ヒト（配列番号７１）、カニクイザル（配列番号７３）、ウサギ（配列番号７５）、モルモット（配列番号７７）、ラット（配列番号７９）及びマウス（配列番号８１）のＩＧＦ－１受容体に対する抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体の結合活性を検討するために、各種ＩＧＦ－１受容体を発現させた細胞を用いてＣｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ＥＬＩＳＡを実施した。
【0193】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にリポフェクション法によりヒト（配列番号７２）、カニクイザル（配列番号７４）、ウサギ（配列番号７６）、モルモット（配列番号７８）、ラット（配列番号８０）及びマウス（配列番号８２）のＩＧＦ－１受容体遺伝子を組込んだｐＥＦ１発現ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ）を導入した。リポフェクション後に一晩以上培養させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を４×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェルで９６ウェルプレート（ポリ－Ｄ－リジンコート）に添加して、１０％緩衝ホルマリン（Ｍｉｌｄｆｏｒｍ（登録商標）１０ＮＭ、Ｗａｋｏ）を用いて固定し、３％ＢＳＡを含有したリン酸緩衝液にてブロッキングしたものをＥＬＩＳＡに使用した。
【0194】
ＥＬＩＳＡは、１％ＢＳＡ／１％ＦＢＳ／ＰＢＳにて５ｎＭに調製された各ヒト化抗体溶液を各ウェルに１００μＬ添加して３７℃にて約１時間反応させた。洗浄液にて３回洗浄した。１％ＢＳＡ／１％ＦＢＳ／ＰＢＳにて各濃度に調製された抗ヒトＩｇＧ抗体ＨＲＰコンジュゲート溶液を各ウェルに１００μＬ添加して３７℃にて約１時間反応させ、洗浄液にて３回洗浄した。各ウェルに基質（ＴＭＢ）を１００μＬ添加して反応を開始させた。約３０分後に各ウェルに１００μＬの１Ｍ硫酸を添加して４５０及び６５０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度４５０ｎｍ－吸光度６５０ｎｍの差の値を算出した。ＩＧＦ－１受容体遺伝子を導入していないＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｍｏｃｋ）に対する吸光度４５０－６５０ｎｍの差の値の値と比較することで、結合活性を解析した。
【0195】
図２にヒト、モルモット、カニクイザル、及びウサギの各ＩＧＦ－Ｒに対する反応性の結果を示す。その結果、ヒト化抗体ｈＩＧＦ１３＿ＰＳ及びｈＩＧＦ２５＿ＰＳは、ヒト、モルモット、カニクイザル及びウサギのＩＧＦ－１受容体を発現させた細胞では、Ｍｏｃｋ細胞と比較して、結合活性を２倍程度上昇させ、ヒトマウスキメラ抗体ＩＧＦ１１－１６と同等の反応性であった。一方、ラット及びマウスのＩＧＦ－１受容体を発現させた細胞に対する結合活性は、Ｍｏｃｋ細胞と同程度であった。これらのことから、ヒト化抗体ｈＩＧＦ１３＿ＰＳ及びｈＩＧＦ２５＿ＰＳは、ヒト、モルモット、カニクイザル及びウサギのＩＧＦ－１受容体には結合するが、ラット及びマウスのＩＧＦ－１受容体には結合しないことが判った。
【0196】
［実施例１２］表面プラズモン共鳴法によるＩＧＦ－１受容体に対する結合親和性：
薬剤のＩＧＦ－１受容体に対する結合特性（結合速度及び解離速度）を検討するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法により測定した。
薬剤のＩＧＦ－１受容体に対する結合特性（結合速度及び解離速度）を検討するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法により測定した。
【0197】
測定システムはＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ２００システムを使用した。センサーチップＣＭ３（ＢＲ-１００５－３６、ＧＥ）の全フローセルに、抗ヒスチジンタグモノクローナル抗体を、Ａｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＢＲ－１０００－５０、ＧＥ）及びＨｉｓ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（２８－９９５０－５６、ＧＥ）で、約３０００ＲＵ固定し、使用した。ランニングバッファーはＨＢＳ－ＥＰ＋（ＢＲ－１００６－６９、ＧＥ）を使用した。リガンドは、リコンビナントヒトＩＧＦ－１受容体ヒスチジンタグ（３０５－ＧＲ－０５０、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ、以下ＩＧＦ－１Ｒ－Ｈｉｓ）を測定システムに捕捉し使用した。アナライトは、各濃度の薬剤を使用した。リガンド陰性対照にＩＧＦ－１Ｒ－Ｈｉｓを捕捉していないフローセルを使用した。薬剤陰性対照は、ＰＢＳ（ＰＢＳ ｐＨ７．４（１ｘ）、＃１００１００４９、Ｇｉｂｃｏ）を使用した。
【0198】
測定システムの測定温度を４０℃に設定とした。フローセル（２及び４）の抗ヒスチジンタグモノクローナル抗体にＩＧＦ－１Ｒ－Ｈｉｓ（＜２×１０-8Ｍ）を１００ＲＵ以下となるように反応させた。流速３０μＬ／分とし、１０ｎＭの精製マウスＩｇＧ２ａ、κ、アイソタイプＣｔｒｌ、Ｃｌｏｎｅ：ＭＧ２ａ－５３（４０１５０２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、以下ｃｔｒｌ ＩｇＧ２ａ）を１分間反応させ、ＨＢＳ－ＥＰ＋を１０分以上流した。アナライトをＨＢＳ－ＥＰ＋で段階希釈し（０．５～８×１０-10Ｍ）、全フローセルに反応させた。
【0199】
測定条件シングルサイクルカイネティクス法を使用した。各濃度のアナライトを６００秒ずつ反応させ結合曲線を得た後、ＨＢＳ－ＥＰ＋を１２００秒反応させ解離曲線を得た。反応終了後、再生用バッファー１（０．２％ＳＤＳ）、再生用バッファー２（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2）及び再生用バッファー３（１０ｍＭ グリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５））を各１分間反応させ、測定システムのＩＧＦ－１Ｒ－Ｈｉｓを除去し洗浄した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒ２．０）を使用して、１：１ ＢｉｎｄｉｎｇのＭｏｄｅｌで解析し、解離速度定数（ｋａ、１／Ｍｓ）、結合速度定数（ｋｄ、１／ｓ）及び解離定数（ＫＤ、Ｍ）を算出した。結果を表１６に示す。
【0200】
【表16】
【0201】
ｈＩＧＦ１３＿ＰＳ及びｈＩＧＦ２５＿ＰＳのヒトＩＧＦ－１受容体に対するＫＤ値は、Ｅ－１０以下であり、抗ＩＧＦ－１受容体アゴニストヒト化抗体の最も好ましいクライテリアを満たしていることがわかった。
【0202】
［実施例１３］インビボ血糖低下作用（モルモットにおける血糖低下作用）：
抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体のインビボでの血糖低下作用の有無を確認するために、モルモットにｈＩＧＦ１３＿ＰＳ及びｈＩＧＦ２５＿ＰＳを単回投与して、継時的に血糖値を測定して、血糖低下作用の有無を検討した。血糖低下作用とは、血糖値を５０ｍｇ／ｄＬ以下に低下させる、又は低血糖症状を起こす作用とする。
抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体のインビボでの血糖低下作用の有無を確認するために、モルモットにｈＩＧＦ１３＿ＰＳ及びｈＩＧＦ２５＿ＰＳを単回投与して、継時的に血糖値を測定して、血糖低下作用の有無を検討した。血糖低下作用とは、血糖値を５０ｍｇ／ｄＬ以下に低下させる、又は低血糖症状を起こす作用とする。
【0203】
モルモットを１２時間絶食させ、各ヒト化抗体：ｈＩＧＦ１３＿ＰＳ及びｈＩＧＦ２５＿ＰＳを、１０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内投与した。モルモットは、投与２４時間後まで絶食させた。覚醒状態のモルモットを、投与前（０時間）、投与１、２、４、８、２４、４８、７２、及び１４４時間後に採血して、グルテストセンサー（三和化学研究所）を使用して血糖値を測定した。結果を図３Ａ、Ｂに示す。
【0204】
各ヒト化抗体は、溶媒のみを投与した溶媒対照群と比較して、血糖値に有意な差を認めず、投与後の血糖値は何れも５０ｍｇ／ｄＬ以上であった。このことから、各ヒト化抗体は、ＩＧＦ－１のような顕著な血糖低下作用を有さず、血糖値に影響を及ぼさないことから、ＩＧＦ－１の副作用である低血糖を克服する薬剤としての可能性が示された。
【0205】
［実施例１４］ヒト化抗体のモルモットにおける血中動態：
モルモットを１２時間絶食させ、ヒト化抗体ｈＩＧＦ１３＿ＰＳ及びｈＩＧＦ２５＿ＰＳ又はＩＧＦ１１－１６（マウス親抗体）を、１及び１０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内投与した。モルモットは、投与２４時間後まで絶食させ、２４時間後に再給餌した。覚醒状態のモルモットを、投与前（０時間）、投与２、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、及び１４４時間後に採血して、血漿中のヒト化抗体濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。
モルモットを１２時間絶食させ、ヒト化抗体ｈＩＧＦ１３＿ＰＳ及びｈＩＧＦ２５＿ＰＳ又はＩＧＦ１１－１６（マウス親抗体）を、１及び１０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内投与した。モルモットは、投与２４時間後まで絶食させ、２４時間後に再給餌した。覚醒状態のモルモットを、投与前（０時間）、投与２、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、及び１４４時間後に採血して、血漿中のヒト化抗体濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。
【0206】
具体的には、リコンビナントＩＧＦ－１Ｒ（Ｒ＆Ｄ社製）を使用して、抗原ＥＬＩＳＡにて測定を行った。定量化する際の検量線は、モルモットに投与した濃度既知の抗体を、モルモット血漿で段階希釈して標準物質とした。標準物質と血漿は１０倍から１０００倍希釈して測定を実施した。
【0207】
リコンビナントＩＧＦ－１Ｒの０．５μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を９６ウェルプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ（ＮＵＮＣ））に添加して終夜、４℃で固定した。さらに３％ＢＳＡ／ＰＢＳにてブロッキングを行い、リコンビナントＩＧＦ－１Ｒ固定プレートを作製した。一方、抗体を投与しないモルモット血漿を使用して、投与した抗体を段階希釈して標準物質とした。血漿及び標準物質を１０倍希釈して５０μＬ／ウェルでリコンビナントＩＧＦ－１Ｒ固定プレートに添加した。室温で１時間３０分反応を行い、その後、ＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０）にて洗浄操作を行った。その後、アルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（Southern Biotechnology Associates社、Ｃａｔ＃２０８７－０４）を３％ＢＳＡ／ＰＢＳにて２０００倍希釈した溶液を５０μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間反応させた。その後、PＢＳ－Ｔで洗浄操作を行い、発色基質としてｐＮｐｐ（ＷＡＫＯ社、Ｃａｔ＃１４９－０２３４２）を１００μＬ／ウェルで添加して室温で１時間インキュベーションした。その後、プレートリーダーにて４０５ｎｍ及び５５０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度４０５ｎｍ－５５０ｎｍの差の値を求めた。標準物質とした抗体濃度で検量線を描き、血漿中の抗体濃度を算出した。
【0208】
結果を図４に示す。血漿中のヒト化抗体濃度は投与用量に依存して上昇し、低用量群でも投与１４４時間目迄の血漿中ヒト化抗体濃度は、投与２４時間後と比較して約５０％以上を維持していた。ヒト化抗体の血中動態はマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と比較して持続性に優れていることが示された。
【0209】
［実施例１５］正常モルモットにおけるヒト化抗体の筋肉量増加作用：
正常モルモットにｈＩＧＦ１３＿ＰＳを静脈内へ単回投与して、２週間後の筋質量を測定し、ＩＧＦ－１の持続投与及びマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の静脈内投与した時の筋量増加作用と比較した。
正常モルモットにｈＩＧＦ１３＿ＰＳを静脈内へ単回投与して、２週間後の筋質量を測定し、ＩＧＦ－１の持続投与及びマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の静脈内投与した時の筋量増加作用と比較した。
【0210】
ｈＩＧＦ１３＿ＰＳ及びマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６を、正常モルモットの静脈内に０．１ｍｇ／ｋｇで単回投与した。陽性対照としてヒトＩＧＦ－Ｉ（メカセルミン）を、浸透圧ポンプ（アルゼット）を使用して皮下に埋め込み、１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとなるように持続投与した。コントロールとしては、溶媒のみを静脈内投与した。薬剤投与の２週間後、モルモットを麻酔下で放血致死させ、長趾伸筋を摘出し筋質量を測定した。
【0211】
その結果を図５に示す。ｈＩＧＦ１３＿ＰＳを０．１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した群は、溶媒のみを処置したコントロール群と比較して有意に筋肉量を増加させた。また、その薬効は、ヒトＩＧＦ－Ｉを１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで持続投与した群やマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６を静脈内投与した薬効強度と同程度であった。
【0212】
以上の結果から、ｈＩＧＦ１３＿ＰＳは、単回投与によりヒトＩＧＦ－１の２週間持続投与と同等の薬効を期待し得ることが示された。
【0213】
［実施例１６］ヒト化抗体の下垂体摘出モルモットにおける成長板軟骨伸長作用：
ｈＩＧＦ１３＿ＰＳの成長板軟骨増殖作用評価としてモルモット下垂体摘出（ＨＰＸ）モデルを用いて脛骨近位部の骨端線厚（Ｅｐｉｐｈｙｓｅａｌ ｌｉｎｅ ｔｈｉｃｋｎｅｓ）を評価した。モルモット下垂体摘出（ＨＰＸ）モデルは、下垂体摘出によって成長ホルモンの産生が抑制されるため、低ＩＧＦ－１状態となる。
ｈＩＧＦ１３＿ＰＳの成長板軟骨増殖作用評価としてモルモット下垂体摘出（ＨＰＸ）モデルを用いて脛骨近位部の骨端線厚（Ｅｐｉｐｈｙｓｅａｌ ｌｉｎｅ ｔｈｉｃｋｎｅｓ）を評価した。モルモット下垂体摘出（ＨＰＸ）モデルは、下垂体摘出によって成長ホルモンの産生が抑制されるため、低ＩＧＦ－１状態となる。
【0214】
ｈＩＧＦ１３＿ＰＳを０．３ｍｇ／ｋｇ及び１．０ｍｇ／ｋｇで下垂体摘出モルモットへ単回皮下投与し、２週間後の右下肢を採材した。脛骨近位部の成長板軟骨の組織標本を作製し、トルイジンブルーにより成長板軟骨の厚さ（骨端線厚）を測定した。陽性対照としてＩＧＦ－１（メカセルミン）製剤を１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで浸透圧ポンプにより皮下持続投与すると共に、ＧＨ（ソマトロピン）製剤を１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで１日１回皮下投与を行った。
【0215】
その結果を図６に示す。ＩＧＦ－１製剤投与群及びＧＨ製剤投与群では骨端線厚の増加が認められ、これらはＨＰＸにより低下した血中ＩＧＦ－１の補充、又はＨＰＸにより失われたＧＨの補充によるものと考えられた。ｈＩＧＦ１３＿ＰＳ抗体群では、下垂体摘出（ＨＰＸ）個体の血中ＩＧＦ－１濃度を上昇させること無く、用量依存的に骨端線厚を厚くすることが示された。
【0216】
以上のことより、ｈＩＧＦ１３＿ＰＳ抗体は、下垂体摘出（ＨＰＸ）処理によるＩＧＦ－１濃度低下に伴う骨端線の閉塞を、ＩＧＦ－１Ｒを介したシグナルの活性化により回復させる作用があることが示された。
【0217】
［実施例１７］ヒト化抗体のカニクイザルにおける血糖低下作用：
抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体のカニクイザルにおける血糖低下作用の有無を確認するために、カニクイザルにｈＩＧＦ１３＿ＰＳを単回投与して、継時的に血糖値を測定して、ＩＧＦ－１（１ｍｇ／ｋｇ）の単回投与時の血糖低下作用と比較した。血糖低下作用とは、溶媒投与群と比較して５０％未満に低下させる、又は低血糖症状を起こす作用とする。
抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体のカニクイザルにおける血糖低下作用の有無を確認するために、カニクイザルにｈＩＧＦ１３＿ＰＳを単回投与して、継時的に血糖値を測定して、ＩＧＦ－１（１ｍｇ／ｋｇ）の単回投与時の血糖低下作用と比較した。血糖低下作用とは、溶媒投与群と比較して５０％未満に低下させる、又は低血糖症状を起こす作用とする。
【0218】
カニクイザルに、ヒト化抗体を、１０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内又は皮下投与した。投与前（０時間）、投与後５分、３０分、１、２、４、８、及び２４時間後に採血して、メディセーフフィット（テルモ株式会社）を使用して血糖値を測定した。
【0219】
結果を図７に示す。各ヒト化抗体は、溶媒のみを投与した溶媒対照群と比較して、血糖値に差を認めず、投与後の血糖値は何れも溶媒対照群と同等レベルであった。一方、ＩＧＦ－１投与群は２時間後低血糖となり、低血糖症状を示したため、グルコースを投与して回復させた。
【0220】
［実施例１８］ヒト化抗体のカニクイザルにおける血中動態：
ヒト化抗体ｈＩＧＦ１３＿ＰＳを、１及び１０ｍｇ／ｋｇでカニクイザルへ単回静脈内又は皮下投与した。投与前（０時間）、投与２、４、８、２４、４８、７２、及び１４４時間後に採血して、血漿中のヒト化抗体濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。
ヒト化抗体ｈＩＧＦ１３＿ＰＳを、１及び１０ｍｇ／ｋｇでカニクイザルへ単回静脈内又は皮下投与した。投与前（０時間）、投与２、４、８、２４、４８、７２、及び１４４時間後に採血して、血漿中のヒト化抗体濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。
【0221】
具体的には、リコンビナントＩＧＦ－１Ｒ（Ｒ＆Ｄ社製、Ｃａｔ＃３０５－ＧＲ－０５０）を使用して抗原ＥＬＩＳＡにて測定を行った。定量化する際の検量線は、サルに投与した濃度既知の抗体をサル血漿で段階希釈して標準物質とした。標準物質と血漿は１０倍から１０００倍希釈して測定を実施した。
【0222】
リコンビナントＩＧＦ－１Ｒの０．５μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を９６ウェルプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ（ＮＵＮＣ））に添加して終夜、４℃で固定した。さらに３％ＢＳＡ／ＰＢＳにてブロッキングを行い、リコンビナントＩＧＦ－１Ｒ固定プレートを作製した。一方、抗体を投与しないサル血漿を使用して、投与した抗体を段階希釈して標準物質とした。血漿及び標準物質を１０倍希釈して５０μＬ／ウェルでリコンビナントＩＧＦ－１Ｒ固定プレートに添加した。室温で１時間３０分反応を行い、その後、ＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０）にて洗浄操作を行った。その後、アルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（Southern Biotechnology Associates社、Ｃａｔ＃２０８７－０４）を３％ＢＳＡ／ＰＢＳにて２０００倍希釈した溶液を５０μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間反応させた。その後、ＰＢＳ－Ｔで洗浄操作を行い、発色基質としてｐＮｐｐ（ＷＡＫＯ社、Ｃａｔ＃１４９－０２３４２）を１００μＬ／ウェルで添加して室温で１時間インキュベーションした。その後、プレートリーダーにて４０５ｎｍ及び５５０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度４０５ｎｍ－５５０ｎｍの差の値を算出した。標準物質とした抗体濃度で検量線を描き、血漿中の抗体濃度を算出した。
【0223】
結果を図８に示す。本結果から、ｈＩＧＦ１３＿ＰＳのカニクイザルにおける血中動態が良好であることが確認された。
【0224】
［実施例１９］ヒト化抗体のカニクイザルにおける筋肉量増加作用：
カニクイザル２個体に対して、ｈＩＧＦ１３＿ＰＳを１ｍｇ／ｋｇで静脈内投与を実施した。投与前と投与後３～４週間後においてＤＸＡ（Ｄｕａｌ Ｅｎｅｒｇｙ Ｘ－ｒａｙ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ）法によって筋肉量を測定した。
カニクイザル２個体に対して、ｈＩＧＦ１３＿ＰＳを１ｍｇ／ｋｇで静脈内投与を実施した。投与前と投与後３～４週間後においてＤＸＡ（Ｄｕａｌ Ｅｎｅｒｇｙ Ｘ－ｒａｙ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ）法によって筋肉量を測定した。
【0225】
具体的には、測定対象のサルに対して、塩酸ケタミン（Ａｒｅｖｉｐｈａｒｍａ ＧｍｂＨ、５０ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍＬ／ｋｇ）及び塩酸メデトミジン水溶液（ドミトール、Ｏｒｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、１ｍｇ／ｍＬ、０．０８ｍＬ／ｋｇ）の筋肉内投与（臀部）による全身麻酔を行い、二重エネルギーＸ線吸収測定装置（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ－Ａ、ＨＯＬＯＧＩＣ社）を用いて、脂肪量（Ｆａｔ Ｍａｓｓ、ｇ）、非脂肪量（Ｌｅａｎ Ｂｏｄｙ Ｍａｓｓ、ｇ）、骨量（Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｃｏｎｔｅｎｔ（ＢＭＣ）、ｇ）の計測を行い、非脂肪量を筋肉量として解析した。左右腕部（上肢）のＢＭＣ（骨塩量）及びＬｅａｎ＋ＢＭＣ（ｇ）を測定し、筋肉量（ｇ）を算出し、投与前の筋肉量と比較した。
【0226】
その結果、２匹共に、投与前と比較して筋量増加を示し、上肢の筋肉増加率は、投与前と比較してそれぞれ７．４％、１０．９％であった。この結果からｈＩＧＦ１３＿ＰＳの筋肉増加作用が確認された。
【0227】
さらに、カニクイザル２個体に対して、ｈＩＧＦ１３＿ＰＳを１０ｍｇ／ｋｇで皮下投与を実施した。投与前と投与後３～４週間後においてＤＸＡ（Ｄｕａｌ Ｅｎｅｒｇｙ Ｘ－ｒａｙ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ）法によって筋肉量を測定した。
【0228】
具体的には、測定対象のサルに対して、塩酸ケタミン（Ａｒｅｖｉｐｈａｒｍａ ＧｍｂＨ、５０ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍＬ／ｋｇ）及び塩酸メデトミジン水溶液（ドミトール、Ｏｒｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、１ｍｇ／ｍＬ、０．０８ｍＬ／ｋｇ）の筋肉内投与（臀部）による全身麻酔を行い、二重エネルギーＸ線吸収測定装置（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ－Ａ、ＨＯＬＯＧＩＣ社）を用いて、脂肪量（Ｆａｔ Ｍａｓｓ、ｇ）、非脂肪量（Ｌｅａｎ Ｂｏｄｙ Ｍａｓｓ、ｇ）、骨量（Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｃｏｎｔｅｎｔ（ＢＭＣ）、ｇ）の計測を行い、非脂肪量を筋肉量として解析した。左右下肢のＢＭＣ（骨塩量）及びＬｅａｎ＋ＢＭＣ（ｇ）を測定し、筋肉量（ｇ）を算出し、投与前の筋肉量と比較した。
【0229】
その結果、２匹共に、投与前と比較して筋量増加を示し、下肢の筋肉増加率は、投与前と比較してそれぞれ３．３％、１２．７％であった。この結果からｈＩＧＦ１３＿ＰＳの筋肉増加作用が確認された
【0230】
［実施例２０］ＨｅｐＧ２細胞増殖に対するＩＧＦ１１－１６の作用
マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６がＨｅｐＧ２細胞増殖に対して及ぼす濃度依存的な作用を細胞生存アッセイにより評価した。
マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６がＨｅｐＧ２細胞増殖に対して及ぼす濃度依存的な作用を細胞生存アッセイにより評価した。
【0231】
ＨｅｐＧ２細胞株をＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，１１９９５）にＦＢＳを１％添加した培地で懸濁し、コラーゲン－Ｉコート９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５６６５０）に０．２５×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェルで播種した。翌日にＢＳＡ／ＰＢＳ，ＩＧＦ－１（メカセルミン）、コントロールマウスＩｇＧ１抗体（ｍＩｇＧ１）、ＩＧＦ１１－１６抗体、及びシクツムマブ（Ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ；ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体）を、５０ｎＭから１／１０公比で希釈して添加した。２日後、細胞増殖の指標として細胞内のＡＴＰ量を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ７５７１）を使用して、マルチ検出モードマイクロプレートリーダー（ＳＰＡＲＫ、ＴＥＣＡＮ）にて発光シグナルを測定した。コントロールマウスＩｇＧ１抗体（ｍＩｇＧ１）の各濃度ポイントの値を１００％として、％ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌを算出し、グラフとして表示した（図９）。
【0232】
その結果、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６がＨｅｐＧ２細胞増殖に対して抑制作用を示すことが観察された。この結果から、ＩＧＦ１１－１６が少なくともある種のがん細胞に対してはアンタゴニストの作用を示しうると考えられた。
【0233】
［実施例２１］ＩＧＦ－１によるヒト乳がん細胞株（ＭＣＦ７）の増殖活性に対するＩＧＦ１１－１６の作用
ＩＧＦ－１によるヒト乳がん細胞株（ＭＣＦ７）増殖活性に対するＩＧＦ１１－１６の作用を評価するため、５０ｎＭ ＩＧＦ１１－１６を共存させた条件下でｈＩＧＦ－１（メカセルミン）の濃度依存的な増殖活性を、添加２日後の細胞内のＡＴＰ量によって測定した。
ＩＧＦ－１によるヒト乳がん細胞株（ＭＣＦ７）増殖活性に対するＩＧＦ１１－１６の作用を評価するため、５０ｎＭ ＩＧＦ１１－１６を共存させた条件下でｈＩＧＦ－１（メカセルミン）の濃度依存的な増殖活性を、添加２日後の細胞内のＡＴＰ量によって測定した。
【0234】
ヒト乳がん細胞株（ＭＣＦ７）を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養した。翌日、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を使用して、９６ウェルプレート（Ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｔｙｐｅ Ｉ ｃｏａｔｅｄ）に、０．１ｍＬ／ウェル（２．５×１０3ｃｅｌｌｓ／ウェル）で播種し、３７℃、５％ＣＯ2の条件でインキュベートした。細胞播種の翌日に、１％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に培地交換して、３７℃、５％ＣＯ2の条件で約８時間インキュベートした。その後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳまたはＩＧＦ１１－１６抗体を５０ｎＭ添加後、５０ｎＭから１／１０公比で希釈したＩＧＦ－１を添加し、３７℃、５％ＣＯ2の条件で２日間インキュベートした。細胞増殖の指標として細胞内のＡＴＰ量を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ７５７１）を使用して、マルチ検出モードマイクロプレートリーダー（ＳＰＡＲＫ、ＴＥＣＡＮ）にて発光シグナルを測定した。 それぞれの濃度のＩＧＦ－１添加群の０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ添加群の平均値を１００％として、５０ｎＭ ＩＧＦ１１－１６添加における変化を％ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌを算出することで表した。結果を表１７に示した。
【0235】
【表17】
【0236】
その結果、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６がＩＧＦ－１によるヒト乳がん細胞株（ＭＣＦ７）の最大活性を低減させる抑制作用を有することが示された。この結果からＩＧＦ１１－１６がアロステリックアンタゴニストの作用を有すると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【0237】
本発明は、脊椎動物のＩＧＦ－１受容体に特異的に結合し、ＩＧＦ－１受容体を介して筋肉量を増加させつつ、血糖値を低下させない抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体を提供することができるため、ＩＧＦ－１受容体に関連する疾患の治療、予防、又は診断に利用可能である。また、本発明は、ＩＧＦ－１受容体の過剰なシグナルを抑制することにより、細胞の異常増殖あるいは活性化が関係する疾患の治療、予防、又は診断にも利用可能であり、その産業上の価値は極めて高い。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】