(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024054847
(43)【公開日】2024-04-17
(54)【発明の名称】酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの溶液中安定化法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/573 20060101AFI20240410BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20240410BHJP
C12N 9/16 20060101ALI20240410BHJP
【ＦＩ】
G01N33/573 A
G01N33/531 B
C12N9/16 B
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023172412
(22)【出願日】2023-10-04
(31)【優先権主張番号】P 2022160886
(32)【優先日】2022-10-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000006770
【氏名又は名称】ヤマサ醤油株式会社
(72)【発明者】
【氏名】荒井 智
(57)【要約】
【課題】溶液中において酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＣＰ－５ｂ）を安定的に保管できる方法を見出す。
【解決手段】ＴＲＡＣＰ－５ｂを溶液中で保管する際、溶液にモリブデン化合物またはタングステン化合物を共存させることによって、ＴＲＡＣＰ－５ｂの酵素反応性および抗体反応性における安定性を大きく向上させることが可能となる。このことにより、溶液状態での中長期間の常温保管であっても、酒石酸抵抗性ホスファターゼを失活させることなくＴＲＡＣＰ－５ｂを安定状態で保存流通させることが可能になる。さらに、溶液状態での保管が可能となることから、凍結乾燥品のような使用前の溶解操作も不要となる。
【選択図】なし
【解決手段】ＴＲＡＣＰ－５ｂを溶液中で保管する際、溶液にモリブデン化合物またはタングステン化合物を共存させることによって、ＴＲＡＣＰ－５ｂの酵素反応性および抗体反応性における安定性を大きく向上させることが可能となる。このことにより、溶液状態での中長期間の常温保管であっても、酒石酸抵抗性ホスファターゼを失活させることなくＴＲＡＣＰ－５ｂを安定状態で保存流通させることが可能になる。さらに、溶液状態での保管が可能となることから、凍結乾燥品のような使用前の溶解操作も不要となる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
モリブデン化合物またはタングステン化合物を含有する酒石酸抵抗性ホスファターゼ５ｂ溶液。
【請求項2】
モリブデン化合物が、モリブデン、モリブデン酸塩、りんモリブデン酸、酸化モリブデンおよび塩化モリブデンから選ばれる１種または２種以上である、請求項１記載の酒石酸抵抗性ホスファターゼ５ｂ溶液。
【請求項3】
タングステン化合物が、タングステン、タングステン酸塩、りんタングステン酸および酸化タングステンから選ばれる１種または２種以上である、請求項１記載の酒石酸抵抗性ホスファターゼ５ｂ溶液。
【請求項4】
酵素反応または抗原抗体反応を利用した測定法によりサンプル中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂを測定するためのキットであって、標準溶液として、モリブデン化合物またはタングステン化合物を含有する酒石酸抵抗性ホスファターゼ５ｂ溶液が添付されていることを特徴とする、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ測定用キット。
【請求項5】
酵素反応または抗原抗体反応を利用した測定法が、酵素活性測定法（Ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ）、免疫選択的酵素活性測定（Ｉｍｍｕｎｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ：ＩＳＥＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、化学発光酵素免疫測定法（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＣＬＥＩＡ）またはラテックス光学測定法（Ｌａｔｅｘ ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＬＰＩＡ）による測定法である、請求項４記載のキット。
【請求項6】
溶液中で、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂと、モリブデン化合物またはタングステン化合物を共存させることにより、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂの酵素活性および／または抗体反応性を安定化させる方法。
【請求項7】
モリブデン化合物が、モリブデン、モリブデン酸塩、りんモリブデン酸、酸化モリブデンおよび塩化モリブデンから選ばれる１種または２種以上である、請求項６記載の方法。
【請求項8】
タングステン化合物が、タングステン、タングステン酸塩、りんタングステン酸および酸化タングステンから選ばれる１種または２種以上である、請求項６記載の方法。
【請求項9】
溶液中で、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂと、モリブデン化合物またはタングステン化合物を共存させた後、さらに当該溶液を２５～３７℃で８～４８時間の条件で前処理することを特徴とする、請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願発明は、溶液中における酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの安定化法に関する。
【背景技術】
【0002】
血清中に存在するホスファターゼには、前立腺由来酸性ホスファターゼ、破骨細胞由来酸性ホスファターゼ、赤血球由来酸性ホスファターゼ、血小板由来酸性ホスファターゼなどの種々の由来のものが知られている。とくに、反応中に酒石酸を添加した場合においても、その酵素活性が阻害されない、血清中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼは、Ｔａｒｔｒａｔｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ５（ＴＲＡＣＰ－５）と呼ばれる。
【0003】
ＴＲＡＣＰ－５はさらに、３５－３７ｋＤａのモノマーとして発現するものと、約２３ｋＤａと約１６ｋＤａの２つのサブユニットがジスルフィド結合したものがあり、前者はＴＲＡＣＰ－５ａ、後者はＴＲＡＣＰ－５ｂとに分類される。以下、本明細書では、酒石酸抵抗性ホスファターゼ含有５ａを「ＴＲＡＣＰ－５ａ」、酒石酸抵抗性ホスファターゼ含有５ｂを「ＴＲＡＣＰ－５ｂ」と表現する場合がある。
【0004】
酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼのうち、ＴＲＡＣＰ－５ａはマクロファージ等に、ＴＲＡＣＰ－５ｂは破骨細胞に由来する。中でもＴＲＡＣＰ－５ｂは破骨細胞の機能を評価するための指標、たとえば骨吸収のマーカーとして重要と考えられていることから、ＴＲＡＣＰ－５ａおよびＴＲＡＣＰ－５ｂのうち、ＴＲＡＣＰ－５ｂを選択的に測定する方法がこれまで検討されてきた。
【0005】
また、ＴＲＡＣＰ－５ｂを選択的に測定する方法としては、ＴＲＡＣＰ－５ｂの酵素活性を測定する方法と、ＴＲＡＣＰ－５ｂの濃度を定量する方法が存在する。酵素活性を測定する方法としては、測定対象試料と酵素基質を直接反応させる酵素活性測定法や、測定対象試料と抗ＴＲＡＣＰ－５ｂ抗体を反応させて、試料中のＴＲＡＣＰ－５ｂを抗体で捕捉したところに酵素基質を反応させる免疫選択的酵素活性測定（Ｉｍｍｕｎｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｓｓａｙ、ＩＳＥＡ）がある。一方で、ＴＲＡＣＰ－５ｂの濃度を定量する方法としては、２種類の抗ＴＲＡＣＰ－５ｂ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による方法などがある。
【0006】
そして、上記のようなＴＲＡＣＰ－５ｂを選択的に測定する方法に用いる標準物質を得る方法としては、生体由来のＴＲＡＣＰ－５ｂを大腿骨骨頭部から抽出する方法や（特許文献１）、リコンビナントタンパク質のＴＲＡＣＰ－５ｂをカイコ絹糸腺から得る方法（特許文献２）などがある。また、リコンビナントＴＲＡＣＰ－５ａをカテプシンＫやカテプシンＬなどのシステインプロテアーゼを用いて切断し、ＴＲＡＣＰ－５ｂを得る方法もある。（非特許文献１）
【0007】
ＴＲＡＣＰ－５ｂの測定法における標準物質には、長期的な安定性が求められる。ユーザビリティーの観点からは、溶液中で長期的な安定性を示すことが求められるが、現在市販されているＴＲＡＣＰ－５ｂ測定法における標準物質は、凍結乾燥品が主流であり（ニットーボーメディカル社の「オステオリンクスＴＲＡＰ－５ｂ」、ＩＤＬ社の「Ｂｏｎｅ Ｔｒａｐ」など）、使用時に水で溶解する操作の煩雑さや、溶解後の安定性の低さ、溶解時に用いる水量の誤差による精度低下などの問題を有していることから、溶液状での安定性向上が切望されている。
【0008】
また、ＴＲＡＣＰ－５ｂの酵素活性を測定する方法においては酵素活性の安定化、抗体で捕捉したＴＲＡＣＰ－５ｂの酵素活性を測定する方法においては酵素活性と抗体反応性の両方の安定化、抗体を用いてＴＲＡＣＰ－５濃度を定量する方法においては、抗体反応性の安定化が求められるが、酵素活性と抗体反応性を同時に安定化させる方法は見出されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】特開２００４－２６８０５
【特許文献2】ＷＯ２００８／０８１９９２
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Proteolytic excision of a repressive loop domain in tartrate-resistant acid phosphatase by cathepsin K in osteoclasts. J Biol Chem. 2005 Aug 5; 280 (31): 28370-81
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
したがって本願発明の課題は、溶液中において酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＣＰ－５ｂ）を安定的に保管できる方法を見出すことにある。
【課題を解決するための手段】
【0012】
上記課題を本願発明者は鋭意検討を行った結果、ＴＲＡＣＰ－５ｂを溶液中で保管する際、溶液にモリブデン化合物またはタングステン化合物を共存させることによって、ＴＲＡＣＰ－５ｂの酵素反応性および抗体反応性における安定性を大きく向上させることが可能であることを見出し、本願発明を完成させた。
【0013】
すなわち本願発明は、モリブデン化合物またはタングステン化合物を含有する酒石酸抵抗性ホスファターゼ５ｂ溶液であり、また、酵素反応または抗原抗体反応を利用した測定法によりサンプル中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂを測定するためのキットであって、標準溶液として、モリブデン化合物またはタングステン化合物を含有する酒石酸抵抗性ホスファターゼ５ｂ溶液が添付されていることを特徴とする、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ測定用キットに関するものであり、さらに、溶液中で、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂと、モリブデン化合物またはタングステン化合物を共存させることにより、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂの酵素活性および／または抗体反応性を安定化させる方法に関するものである。
【発明の効果】
【0014】
本願発明によれば、ＴＲＡＣＰ－５ｂの酵素活性および抗体反応性を、モリブデン化合物またはタングステン化合物を共存させない場合に比べて、大きく安定化させることができる。このことにより、溶液状態での中長期間の常温保管であっても、酒石酸抵抗性ホスファターゼを失活させることなくＴＲＡＣＰ－５ｂを安定状態で保存流通させることが可能になるとともに、測定時の反応も常温はもちろん、全自動免疫測定機で適用される３７℃～４２℃の温度帯でも支障なく行うことができる。
【0015】
さらに、溶液状態での保管が可能となることから、凍結乾燥品のような使用前の溶解操作が不要となり、溶解後の急激な活性低下の懸念もなくなることから、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂの免疫学的測定・酵素学的測定の操作性、汎用性を従来よりも向上させることが可能になる。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本願発明は、溶液中で、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂと、モリブデン化合物またはタングステン化合物を共存させることにより、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂの酵素活性および／または抗体反応性を安定化させる方法に関する。
【0017】
また、本願発明は、モリブデン化合物またはタングステン化合物を含有する酒石酸抵抗性ホスファターゼ５ｂ溶液に関する。
【0018】
また、本願発明は、酵素反応または抗原抗体反応を利用した測定法によりサンプル中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂを測定するためのキットであって、標準溶液として、モリブデン化合物またはタングステン化合物を含む酒石酸抵抗性ホスファターゼ５ｂ溶液が添付されていることを特徴とする、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ測定用キットに関する。
【0019】
本願発明における酒石酸抵抗性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＣＰ－５ｂ）は、生体組織から単離精製されたネイティブのタンパク質であっても、組換えＤＮＡ技術を用いて調製したリコンビナントタンパク質であっても使用可能である。組換えＤＮＡ技術を用いたリコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂの調製は、公知の方法に従って行うことができる。公知の方法としては例えば非特許文献１や、特許文献２に記載の方法などを挙げることができる。
【0020】
すなわち、リコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂの調製方法の一例として、組換えＤＮＡ技術を用いてＴＲＡＣＰ－５ｂを微生物や昆虫細胞などに直接発現させ、これを得ることができるほか、ＴＲＡＣＰ－５ａを合成し、当該リコンビナントＴＲＡＣＰ－５ａのループドメイン部位をプロテアーゼを用いて切断、２つのサブユニットに分離することで、リコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂを得ることもできる。
【0021】
リコンビナントＴＲＡＣＰ－５ａの切断に用いる前記プロテアーゼとしては、システインプロテアーゼを用いることができる。システインプロテアーゼの具体例としては、カテプシンＫ、カテプシンＬ、パパインなどを挙げることができ、中でもカテプシンＫまたはカテプシンＬを用いることが好ましい。プロテアーゼによる切断後は、ＴＲＡＣＰ活性の至適ｐＨがアルカリ側へシフトしていること、比活性が切断前に比べて高くなっていることを以て、ＴＲＡＣＰ－５ｂ活性を有することを確認することができる。また、プロテアーゼによる切断後に還元処理してＳＤＳ電気泳動を行うことにより２つのサブユニットの形成を確認できることを以て、ＴＲＡＣＰ－５ｂの生成を確認することができる。
【0022】
本明細書においては、上記手順によって調製され、ＴＲＡＣＰ－５ｂ活性を有することが確認された酵素を総称して「リコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂ」と記載する。好ましくは、ＴＲＡＣＰ－５ａを合成し、当該リコンビナントＴＲＡＣＰ－５ａのループドメイン部位をプロテアーゼを用いて切断して得られるＴＲＡＣＰ－５ｂのことを指し、中でも、より好ましくはプロテアーゼとしてシステインプロテアーゼを用いて調製されたもの、さらに好ましくは、システインプロテアーゼとしてカテプシンＫ、カテプシンＬまたはパパインを用いて調製されたものを言う。
【0023】
本願発明は、ＴＲＡＣＰ－５ｂを、モリブデン化合物またはタングステン化合物と共存させることを特徴とする。
【0024】
モリブデン化合物としては、水溶性の形態のものを使用することができ、例えば、モリブデン標準液のようなモリブデン単体や、モリブデンを含む化合物であるモリブデン酸塩、りんモリブデン酸、酸化モリブデン、塩化モリブデンなどを挙げることができる。モリブデン酸塩としては、モリブデン酸ナトリウム、モリブデン酸アンモニウム、モリブデン酸カリウムなどのような水溶性モリブデン酸塩を用いるのが好ましい。また、これらの化合物の任意の水和物や溶媒和物であっても良い。中でも、モリブデン酸ナトリウム、モリブデン酸カリウム、モリブデン酸アンモニウムのような水溶性モリブデン酸塩またはりんモリブデン酸であることが好ましい。なお、モリブデン化合物は、例えば上記に挙げた中から１種のみを用いても良いし、２種以上を組み合わせて用いても良い。
【0025】
タングステン化合物としては、水溶性の形態のものを使用することができ、例えば、タングステン標準液のようなタングステン単体や、タングステンを含む化合物であるタングステン酸塩、りんタングステン酸、酸化タングステンなどを挙げることができる。タングステン酸塩としては、タングステン酸ナトリウム、タングステン酸アンモニウム、タングステン酸カリウムなどのような水溶性タングステン酸塩を用いるのが好ましい。また、これらの塩の任意の水和物や溶媒和物であっても良い。また、これらの塩の任意の水和物や溶媒和物であっても良い。中でも、タングステン酸ナトリウム、タングステン酸カリウム、タングステン酸アンモニウムのような水溶性タングステン酸塩またはりんタングステン酸であることが好ましい。なお、タングステン化合物は、例えば上記に挙げた中から１種のみを用いても良いし、２種以上を組み合わせて用いても良い。
【0026】
溶液中のモリブデン化合物またはタングステン化合物の使用濃度は、特に制限されるものではないが、ＴＲＡＣＰ－５ｂ含有溶液中、０．０５～５０ｍＭの範囲から設定することができ、好ましくは０．０５～３０ｍＭの範囲であってもよく、より好ましくは０．１～２０ｍＭの範囲であってもよく、さらに好ましくは０．１～１０ｍＭの範囲であっても良い。
【0027】
また、ＴＲＡＣＰ－５ｂ溶液中には、モリブデン化合物またはタングステン化合物のほかに、スクロース、トレハロース、マンニトール、デキストランなどの糖類を添加してもよい。モリブデン化合物またはタングステン化合物に加えて糖類をさらに共存させることにより、安定化作用をより高めることが可能となる。
【0028】
ＴＲＡＣＰ－５ｂ溶液中には、上記に加えて、さらに、ウシ血清アルブミン、フィッシュゼラチン、ウシ乳由来カゼインなどの共存タンパク質や、ポリビニルプロピレンなどのようなブロッキング効果を有する合成ポリマーを添加してもよいし、添加しなくてもよい。
【0029】
本願発明の酒石酸抵抗性ホスファターゼ５ｂ含有溶液の調製に用いる希釈液のｐＨは、特に制限されるものではないが、ｐＨ５．０～ｐＨ９．０が好ましく、特にｐＨ６．０～７．５が好ましい。
【0030】
本願発明の酒石酸抵抗性ホスファターゼ５ｂ含有溶液の調製は、水またはＭＥＳなどの緩衝液に、モリブデン化合物（例えば、モリブデン酸ナトリウムなど）またはタングステン化合物（例えば、タングステン酸ナトリウム）を前記濃度になるように溶解したのち、酒石酸抵抗性ホスファターゼ５ｂを所定量（例えば、１～１０００ｎｇ／ｍＬ）溶解することで実施することができる。なお、溶解する順番は、特に制限されるものではなく、酒石酸抵抗性ホスファターゼ５ｂを先に溶解してもよく、あるいは同時であってもかまわない。
【0031】
本願発明の酒石酸抵抗性ホスファターゼ含有溶液は、調製した後、保管の前に２５～３７℃で８～４８時間ほど置き、温度負荷による前処理を行っても良い。当該前処理を行うことにより、酒石酸抵抗性ホスファターゼ活性を上昇させることができ、例えばＩＳＥＡ法による測定で、保管後の安定化効果をより強くすることができる場合がある。
【0032】
本願発明の酒石酸抵抗性ホスファターゼ含有溶液は、ボトルやアンプルなど各種の容器に充填し、保管することができる。容器の素材としては、強度などの点から流通に適し、タンパク質等を過度に吸着しない素材であれば任意のものを使用することができ、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタラート等の樹脂や、必要に応じて表面がシリコンコートされたガラスなどを使用することができる。
【0033】
このようにして調製した酒石酸抵抗性ホスファターゼ含有溶液は、抗原抗体反応を利用した免疫学的手法によりサンプル中の酒石酸抵抗性ホスファターゼ５ｂを測定するためのキットの酒石酸抵抗性ホスファターゼ５ｂの標準溶液として有用である。
【0034】
本願発明のキットは、酵素活性測定法（Ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ）、免疫選択的酵素活性測定（Ｉｍｍｕｎｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ：ＩＳＥＡ）、免疫比濁法（Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＴＩＡ）、免疫比朧法（Ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＮＩＡ）、酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ） 酵素結合免疫吸着測定法（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（Ｆｌｕｏｒｏ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＦＩＡ）、ラテックス光学測定法（Ｌａｔｅｘ ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＬＰＩＡ）、化学発光測定法（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＣＬＩＡ）、化学発光酵素免疫測定法（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＣＬＥＩＡ）、電気化学発光測定法（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＣＬＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（Ｒａｄｉｏ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）などの測定キットであってもよく、中でも、ＴＲＡＣＰ－５ｂの酵素活性を測定する方法としては酵素活性測定法（Ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ）、免疫選択的酵素活性測定（Ｉｍｍｕｎｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ：ＩＳＥＡ）によるものであることが好ましく、ＴＲＡＣＰ－５ｂの濃度を定量する方法としては酵素結合免疫吸着測定法（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、化学発光酵素免疫測定法（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＣＬＥＩＡ）またはラテックス光学測定法（Ｌａｔｅｘ ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＬＰＩＡ）によるものであることが好ましい。
【0035】
キットの構成としては、採用したアッセイに適する試薬を適宜含有すればよいが、本願発明のモリブデン化合物またはタングステン酸化合物を共存させた酒石酸抵抗性ホスファターゼ含有溶液を標準溶液として含むほか、必要に応じて抗ＴＲＡＣＰ－５ｂ抗体を結合した固相化担体、標識抗ＴＲＡＣＰ－５ｂ抗体、標識第２抗体、酵素反応基質液、酵素反応停止液、洗浄液などが添付されてもよい。
【0036】
酵素活性測定法、免疫選択的酵素活性測定（ＩＳＥＡ）における酵素基質は、酸性ホスファターゼの活性測定に使用できるものであればよく、ｐ－Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｉｓｏｄｉｕｍ Ｓａｌｔ（ｐ－ＮＰＰ）、２－Ｃｈｌｏｒｏ－４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＣＮＰＰ、ＢＯＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、９－（４－Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ Ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ Ｏｘｙｍｅｔｈｙｌｅｎｅ）－１０－ｍｅｔｈｙｌ ａｃｒｉｄａｎ，ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（ＡＰＳ－５、Ｌｕｍｉｇｅｎ社）、Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ３－（４－ｍｅｔｈｏｘｙｓｐｉｒｏ ｛１，２－ｄｉｏｘｅｔａｎｅ－３，２’－（５’－ｃｈｌｏｒｏ）ｔｒｉｃｙｃｌｅ ［３．３．１．１（３，７）］ｄｅｃａｎ｝－４－ｙｌ） ｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＣＳＰＤ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）、Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ４－ｃｈｌｏｒｏ－３－（ｍｅｔｈｏｘｙｓｐｉｒｏ ｛１，２－ｄｉｏｘｅｔａｎｅ－３，２’－（５’－ｃｈｌｏｒｏ）ｔｒｉｃｙｃｌｏ［３．３．１．１（３，７）］ｄｅｃａｎ｝－４－ｙｌ） ｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＣＤＰ－Ｓｔａｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）、Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ３－（４－ｍｅｔｈｏｘｙｓｐｉｒｏ ｛１，２－ｄｉｏｘｅｔａｎｅ－３，２’－ｔｒｉｃｙｃｌｏ［３．３．１．１（３，７）］ｄｅｃａｎ｝－４－ｙｌ） ｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＡＭＰＰＤ、Ｔｒｏｐｉｘ社）、４－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－（３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｐｈｅｎｙｌ）ｓｐｉｒｏ ［１，２－ｄｉｏｘｅｔａｎｅ－３，２’－ａｄａｍａｎｔａｎｅ］， ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（Ｌｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤ、Ｌｕｍｉｇｅｎ社）などを挙げることができる。あるいは、アクセス基質液（ベックマン・コールター社）、ルミホス５３０及びルミホス４３０（富士フィルム和光純薬）のような、４－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－（３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｐｈｅｎｙｌ）ｓｐｉｒｏ ［１，２－ｄｉｏｘｅｔａｎｅ－３，２’－ａｄａｍａｎｔａｎｅ］， ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔを成分として含む発光基質溶液や、粉末状の４－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－（３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｐｈｅｎｙｌ）ｓｐｉｒｏ ［１，２－ｄｉｏｘｅｔａｎｅ－３，２’－ａｄａｍａｎｔａｎｅ］， ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（ＢＯＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を任意のバッファー、例えば２－Ａｍｉｎｏ－２－ｍｅｔｈｙｌ－１－ｐｒｏｐａｎｏｌバッファー（０．７５Ｍ， ｐＨ ９．６）などに溶かして用いる場合などを挙げることができる。
【0037】
溶液中で、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂと、モリブデン化合物またはタングステン化合物を共存させる本願発明の方法により、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂの酵素活性および／または抗体反応性を安定化させることができる。
【0038】
酵素活性を安定化させるとは、ＩＳＥＡや酵素活性測定法による酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂの測定において、ＴＲＡＣＰ－５ｂ含有溶液を３７℃で７日間保管したとしても、モリブデン化合物またはタングステン化合物を添加しなかった場合と比較して、測定値の低下が抑制され、活性測定に十分使用可能な活性が維持されていることをいう。より限定された例としては、その測定値（ＲＬＵまたは吸光度）が、温度負荷による前処理の有無にかかわらず、保管前における測定値と比べて５５％以上保たれていることを指す。
【0039】
抗体反応性を安定化させるとは、ＥＬＩＳＡによる酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂの測定において、ＴＲＡＣＰ－５ｂ含有溶液を３７℃で７日間保管したとしても、モリブデン化合物またはタングステン化合物を添加しなかった場合と比較して、測定値の低下が抑制され、活性測定に十分使用可能な活性が維持されていることをいう。より限定された例としては、その測定値（吸光度）が、温度負荷による前処理の有無にかかわらず、保管前における測定値と比べて６０％以上保たれていることを指す。
【実施例0040】
以下、本願発明を実施例等により説明するが、本願発明はこれらによって何ら制限されるものではない。なお、本実施例中では、例えば「Ｄａｙ１サンプル測定時の吸光度」や「Ｄａｙ１サンプル測定時のＲＬＵ値」を、単に「Ｄａｙ１」と略して記載する場合がある。
【0041】
（実施例１）金属化合物によるリコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂの安定化効果の検証（１）
（１－１）リコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂの調製
リコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂの調製は、非特許文献１記載の方法を参考に、下記のように実施した。
（１－１）リコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂの調製
リコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂの調製は、非特許文献１記載の方法を参考に、下記のように実施した。
【0042】
ヒト型リコンビナントＴＲＡＣＰ－５ａ遺伝子を組み込んだバキュロウィルスを昆虫細胞Ｓｆ－９に感染させ、培養上清中にコンビナントＴＲＡＣＰ－５ａを分泌させた。培養上清を陽イオン交換カラムクロマトグラフィーで精製してリコンビナントＴＲＡＣＰ－５ａを得た。一方で、ヒト型リコンビナントカテプシンＫ遺伝子を組み込んだバキュロウィルスを昆虫細胞Ｓｆ－９に感染させ、培養上清中にリコンビナントカテプシンＫを分泌させた。培養上清を陽イオン交換カラムクロマトグラフィーで精製してリコンビナントカテプシンＫを得た。
【0043】
以上のようにして得たリコンビナントＴＲＡＣＰ－５ａとリコンビナントカテプシンＫを用いて、リコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂの作製を行った。酸性ｐＨ下で活性化させたリコンビナントカテプシンＫとリコンビナントＴＲＡＣＰ－５ａを混合して３７℃で２時間反応させ、ＴＲＡＣＰ－５ａを切断してＴＲＡＣＰ－５ｂを生成させた。プロテアーゼインヒビターカクテル（ナカライテスク）を加えてカテプシンＫの反応を停止したあと、抗ＴＲＡＣＰ－５抗体ＲＴＰ１５Ａ４（自社）を結合させた抗体カラムで精製し、リコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂを得た。
【0044】
還元処理してＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施したところ、約２３ｋＤａと約１６ｋＤａの２つのサブユニットのバンドを検出し、酵素活性測定により切断前に比べて比活性が上昇し、かつ至適ｐＨピークが上昇することから、ＴＲＡＣＰ－５ｂであることを確認できた。
【0045】
（１－２）安定性評価用サンプルの調製および測定
ｐＨ６．０の希釈液とｐＨ７．４の希釈液に金属化合物を添加し、さらにリコンビナント ヒトＴＲＡＣＰ－５ｂを２０ｎｇ／ｍＬになるように加えて安定性評価用サンプルとした。ｐＨ６．０の希釈液の組成は、１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＭＥＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０とした。ｐＨ７．４の希釈液の組成は、１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０を用いた。
ｐＨ６．０の希釈液とｐＨ７．４の希釈液に金属化合物を添加し、さらにリコンビナント ヒトＴＲＡＣＰ－５ｂを２０ｎｇ／ｍＬになるように加えて安定性評価用サンプルとした。ｐＨ６．０の希釈液の組成は、１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＭＥＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０とした。ｐＨ７．４の希釈液の組成は、１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０を用いた。
【0046】
評価に用いる金属化合物は、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物、塩化亜鉛、塩化ガリウム（ＩＩＩ）、モリブデン（ＶＩ）酸二ナトリウム四水和物、塩化マグネシウム六水和物を用いた。金属化合物を添加しない希釈液についても安定性評価用サンプルを作製した。
【0047】
それぞれの安定性評価用サンプルをポリプロピレンチューブに分注し、３７℃処理を加えないサンプル（Ｄａｙ０サンプル）、３７℃処理を１日間加えたサンプル（Ｄａｙ１サンプル）、同じく７日間加えたサンプル（Ｄａｙ７サンプル）を得た。いずれのサンプルとも、処理直後に凍結保存し、ＥＬＩＳＡとＩＳＥＡによる測定の直前に融解して用いた。
【0048】
ＥＬＩＳＡおよびＩＳＥＡのプロトコールは下記の通りとした。
【0049】
（ＥＬＩＳＡプロトコール）
抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体 ＲＴＰ１５Ａ４（自社製）を９６ウェルマイクロプレートに固相し、安定性評価用サンプルを希釈して１００μＬ／となるように添加して、３７℃３０分撹拌して反応させた。希釈液の組成は１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０とした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、ビオチン標識抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体ＲＴＰ１Ｃ６（自社製）を１００μＬ添加して、３７℃で３０分撹拌して反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、ＨＲＰ－ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を希釈して１００μＬ添加して、３７℃で３０分撹拌して反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、テトラメチルベンジジン－過酸化水素混合液を加えて２５℃で１０分反応させ、０．５Ｍ 硫酸で反応停止した後、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ）を用いて主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍの吸光度を測定した。Ｄａｙ０、Ｄａｙ１、Ｄａｙ７の各サンプルの吸光度から、Ｄａｙ７の対Ｄａｙ０比および対Ｄａｙ１比を算出して安定性を評価した。
抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体 ＲＴＰ１５Ａ４（自社製）を９６ウェルマイクロプレートに固相し、安定性評価用サンプルを希釈して１００μＬ／となるように添加して、３７℃３０分撹拌して反応させた。希釈液の組成は１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０とした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、ビオチン標識抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体ＲＴＰ１Ｃ６（自社製）を１００μＬ添加して、３７℃で３０分撹拌して反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、ＨＲＰ－ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を希釈して１００μＬ添加して、３７℃で３０分撹拌して反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、テトラメチルベンジジン－過酸化水素混合液を加えて２５℃で１０分反応させ、０．５Ｍ 硫酸で反応停止した後、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ）を用いて主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍの吸光度を測定した。Ｄａｙ０、Ｄａｙ１、Ｄａｙ７の各サンプルの吸光度から、Ｄａｙ７の対Ｄａｙ０比および対Ｄａｙ１比を算出して安定性を評価した。
【0050】
（ＩＳＥＡプロトコール）
抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体 ＲＴＰ１５Ａ４（自社製）を９６ウェル白色マイクロプレートに固相し、安定性評価用サンプルを希釈して１００μＬ添加して、３７℃で３０分撹拌して反応させた。希釈液の組成は１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０を用いた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、酵素反応緩衝液（０．８Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．０、５０ｍＭ 酒石酸ナトリウム、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０）を７０μＬ添加し、続いてＬｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤを含む基質液（ベックマン・コールター）を３０μＬ添加して、３７℃で１０分反応させた。１Ｍ 水酸化ナトリウムを１００ μＬ／添加して反応停止したのち、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ）で発光測定した。Ｄａｙ０、Ｄａｙ１、Ｄａｙ７の各サンプルのＲＬＵからＤａｙ０比およびＤａｙ１比を算出して安定性を評価した。
抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体 ＲＴＰ１５Ａ４（自社製）を９６ウェル白色マイクロプレートに固相し、安定性評価用サンプルを希釈して１００μＬ添加して、３７℃で３０分撹拌して反応させた。希釈液の組成は１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０を用いた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、酵素反応緩衝液（０．８Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．０、５０ｍＭ 酒石酸ナトリウム、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０）を７０μＬ添加し、続いてＬｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤを含む基質液（ベックマン・コールター）を３０μＬ添加して、３７℃で１０分反応させた。１Ｍ 水酸化ナトリウムを１００ μＬ／添加して反応停止したのち、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ）で発光測定した。Ｄａｙ０、Ｄａｙ１、Ｄａｙ７の各サンプルのＲＬＵからＤａｙ０比およびＤａｙ１比を算出して安定性を評価した。
【0051】
（１－３）ＥＬＩＳＡによる評価
下記表１および２に、各サンプルのＲＬＵ値およびＤａｙ７サンプルのＲＬＵ値／Ｄａｙ１サンプルのＲＬＵ値の比を示す。表１はｐＨ６．０、表２はｐＨ７．４の条件で測定した時の結果を示している。
下記表１および２に、各サンプルのＲＬＵ値およびＤａｙ７サンプルのＲＬＵ値／Ｄａｙ１サンプルのＲＬＵ値の比を示す。表１はｐＨ６．０、表２はｐＨ７．４の条件で測定した時の結果を示している。
【0052】
【表1】
【0053】
【表2】
【0054】
結果、ｐＨ６．０の安定性評価用サンプルにおいては、モリブデン酸ナトリウムを加えた条件５で、対Ｄａｙ０比がＤａｙ１で９５．７％、Ｄａｙ７で７８．７％を示し、Ｄａｙ７／Ｄａｙ１の値は８２．２％を示し、他条件に比べて高い安定性を示した（表１）。
【0055】
ｐＨ７．４の安定性評価用サンプルにおいては、モリブデン酸ナトリウムを加えた条件５でＤａｙ０比がＤａｙ１で７２．９％、Ｄａｙ７で４６．１％を示し、Ｄａｙ７／Ｄａｙ１の値は６３．３％を示し、他条件に比べて高い安定性を示した（表２）。
【0056】
（１－４）ＩＳＥＡによる評価
下記表３および４に、各サンプルのＲＬＵ値およびＤａｙ７サンプルのＲＬＵ値／Ｄａｙ１サンプルのＲＬＵ値（以下、「Ｄａｙ７／Ｄａｙ１」のように表す場合がある）を示す。表３はｐＨ６．０、表４はｐＨ７．４の条件で測定した時の結果を示している。
下記表３および４に、各サンプルのＲＬＵ値およびＤａｙ７サンプルのＲＬＵ値／Ｄａｙ１サンプルのＲＬＵ値（以下、「Ｄａｙ７／Ｄａｙ１」のように表す場合がある）を示す。表３はｐＨ６．０、表４はｐＨ７．４の条件で測定した時の結果を示している。
【0057】
【表3】
【0058】
【表4】
【0059】
ＩＳＥＡでは、塩化コバルト、塩化マンガン、モリブデン酸ナトリウムを加えた条件において、３７℃処理０日から１日の間で酵素活性の上昇が発生したため、Ｄａｙ７／Ｄａｙ１のＲＬＵ比を用いて安定性を評価した。
【0060】
結果、ｐＨ６．０の安定性評価用サンプルにおいては、モリブデン酸ナトリウムを加えた条件５でＤａｙ７／Ｄａｙ１の値は１０７．９％を示し、他条件に比べて高い安定性を示した（表３）。またｐＨ７．４の安定性評価用サンプルにおいては、モリブデン酸ナトリウムを加えた条件５でＤａｙ７／Ｄａｙ１の値は９４．１％を示し、他条件に比べて高い安定性を示した（表４）。
【0061】
（実施例２）２５℃ ２４時間前処理した場合の金属化合物によるリコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂ安定化効果の検証
実施例１のＩＳＥＡの結果によれば、調製直後からの時間経過（Ｄａｙ０→Ｄａｙ１）に伴うＴＲＡＣＰ－５ｂ活性の上昇がみられたため、金属化合物を加えたリコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂ溶液の調製後に温度負荷の前処理操作を加えて、ＴＲＡＣＰ－５ｂ活性の上昇を促進することにより、保存期間中の活性変動が小さくなると予想されたことから、当該予想について検討した。
実施例１のＩＳＥＡの結果によれば、調製直後からの時間経過（Ｄａｙ０→Ｄａｙ１）に伴うＴＲＡＣＰ－５ｂ活性の上昇がみられたため、金属化合物を加えたリコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂ溶液の調製後に温度負荷の前処理操作を加えて、ＴＲＡＣＰ－５ｂ活性の上昇を促進することにより、保存期間中の活性変動が小さくなると予想されたことから、当該予想について検討した。
【0062】
（２－１）安定性評価用サンプルの調製および測定
ｐＨ６．０の希釈液に各金属化合物を添加し、さらにリコンビナントヒトＴＲＡＣＰ－５ｂを２０ｎｇ／ｍＬになるように加えてポリプロピレンチューブに分注し、２５℃で約２４時間静置して処理したものを安定性評価用サンプルとした。調製後に凍結し、３７℃温度負荷処理を仕掛けるまで保存した。以後、当該２５℃で約２４時間静置する処理を「２５℃前処理」と記載する。
ｐＨ６．０の希釈液に各金属化合物を添加し、さらにリコンビナントヒトＴＲＡＣＰ－５ｂを２０ｎｇ／ｍＬになるように加えてポリプロピレンチューブに分注し、２５℃で約２４時間静置して処理したものを安定性評価用サンプルとした。調製後に凍結し、３７℃温度負荷処理を仕掛けるまで保存した。以後、当該２５℃で約２４時間静置する処理を「２５℃前処理」と記載する。
【0063】
ｐＨ６．０の希釈液の組成は、１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＭＥＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０とした。
金属化合物は、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物、塩化亜鉛、塩化ガリウム（ＩＩＩ）、モリブデン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物、塩化マグネシウム六水和物を用いた。金属化合物を添加しない希釈液についても安定性評価サンプルを作製した。
金属化合物は、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物、塩化亜鉛、塩化ガリウム（ＩＩＩ）、モリブデン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物、塩化マグネシウム六水和物を用いた。金属化合物を添加しない希釈液についても安定性評価サンプルを作製した。
【0064】
２５℃前処理済の安定性評価用サンプルを、ポリプロピレンチューブにさらに小分けして、３７℃処理しないか（Ｄａｙ０）、または３７℃処理を１日間（Ｄａｙ１）または７日間（Ｄａｙ７）加えたのち速やかに凍結保存した。測定の直前に融解してＥＬＩＳＡとＩＳＥＡによる測定を行った。
【0065】
ＥＬＩＳＡおよびＩＳＥＡのプロトコールは下記の通りとした。
（ＥＬＩＳＡプロトコール）
抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体 ＲＴＰ１５Ａ４（自社製）を９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に固相し、安定性評価用サンプルを希釈して１００μＬとなるように添加して、３７℃３０分撹拌して反応させた。希釈液の組成は１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０とした。また、この組成に５０ｍＭ ＥＤＴＡ ２Ｎａを添加した希釈液でも同様の測定を実施した。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、ビオチン標識抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体ＲＴＰ１Ｃ６（自社製）を１００μＬとなるように添加して、３７℃３０分撹拌して反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、ＨＲＰ－ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を希釈して１００μＬとなるように添加して、３７℃３０分撹拌して反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、テトラメチルベンジジン－過酸化水素混合液を加えて２５℃１０分反応させ、０．５Ｍ 硫酸で反応停止したのち、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ）を用いて主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍの吸光度を測定した。Ｄａｙ０、Ｄａｙ１、Ｄａｙ７の各サンプルの吸光度からＤａｙ０比およびＤａｙ１比を算出して安定性を評価した。
（ＥＬＩＳＡプロトコール）
抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体 ＲＴＰ１５Ａ４（自社製）を９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に固相し、安定性評価用サンプルを希釈して１００μＬとなるように添加して、３７℃３０分撹拌して反応させた。希釈液の組成は１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０とした。また、この組成に５０ｍＭ ＥＤＴＡ ２Ｎａを添加した希釈液でも同様の測定を実施した。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、ビオチン標識抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体ＲＴＰ１Ｃ６（自社製）を１００μＬとなるように添加して、３７℃３０分撹拌して反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、ＨＲＰ－ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を希釈して１００μＬとなるように添加して、３７℃３０分撹拌して反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、テトラメチルベンジジン－過酸化水素混合液を加えて２５℃１０分反応させ、０．５Ｍ 硫酸で反応停止したのち、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ）を用いて主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍの吸光度を測定した。Ｄａｙ０、Ｄａｙ１、Ｄａｙ７の各サンプルの吸光度からＤａｙ０比およびＤａｙ１比を算出して安定性を評価した。
【0066】
（ＩＳＥＡプロトコール）
抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体 ＲＴＰ１５Ａ４（自社製）を９６ウェル白色マイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に固相し、安定性評価用サンプルを希釈して１００μＬ添加して、３７℃３０分撹拌して反応させた。希釈液の組成は１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０を用いた。また、この組成に５０ｍＭ ＥＤＴＡ ２Ｎａを添加した希釈液でも同様の測定を実施した。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、酵素反応緩衝液（０．８Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．０、５０ｍＭ酒石酸ナトリウム、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０）を７０μＬ添加し、続いてＣＤＰ－Ｓｔａｒ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）にＳａｐｐｈｉｒｅ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を１０％（ｖ／ｖ）になるように加えた基質液を３０μＬ添加して、３７℃１０分反応させた。１Ｍ 水酸化ナトリウムを１００μＬ添加して反応停止したのち、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ）で発光測定した。Ｄａｙ０、Ｄａｙ１、Ｄａｙ７の各サンプルのＲＬＵからＤａｙ０比およびＤａｙ１比を算出して安定性を評価した。
抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体 ＲＴＰ１５Ａ４（自社製）を９６ウェル白色マイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に固相し、安定性評価用サンプルを希釈して１００μＬ添加して、３７℃３０分撹拌して反応させた。希釈液の組成は１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０を用いた。また、この組成に５０ｍＭ ＥＤＴＡ ２Ｎａを添加した希釈液でも同様の測定を実施した。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、酵素反応緩衝液（０．８Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．０、５０ｍＭ酒石酸ナトリウム、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０）を７０μＬ添加し、続いてＣＤＰ－Ｓｔａｒ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）にＳａｐｐｈｉｒｅ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を１０％（ｖ／ｖ）になるように加えた基質液を３０μＬ添加して、３７℃１０分反応させた。１Ｍ 水酸化ナトリウムを１００μＬ添加して反応停止したのち、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ）で発光測定した。Ｄａｙ０、Ｄａｙ１、Ｄａｙ７の各サンプルのＲＬＵからＤａｙ０比およびＤａｙ１比を算出して安定性を評価した。
【0067】
（２－２）ＥＬＩＳＡによる評価
下記表５および６に、各サンプルのＲＬＵ値を示す。表５はＥＤＴＡ添加なし、表６はＥＤＴＡ添加時の結果を示す。
下記表５および６に、各サンプルのＲＬＵ値を示す。表５はＥＤＴＡ添加なし、表６はＥＤＴＡ添加時の結果を示す。
【0068】
【表5】
【0069】
【表6】
【0070】
結果、モリブデン酸ナトリウムを加えた条件５では、対Ｄａｙ０比がＤａｙ１で８８．４％、Ｄａｙ７で７８．３％を示し、他条件に比べて高い安定性を示した（表５）。
なお、サンプルの希釈時にＥＤＴＡ添加することにより、例えばモリブデン酸ナトリウムを加えた条件５ではＤａｙ０比がＤａｙ１で１０１．８％、Ｄａｙ７で１０４．０％を示し、より高い安定性を示した（表６）。
なお、サンプルの希釈時にＥＤＴＡ添加することにより、例えばモリブデン酸ナトリウムを加えた条件５ではＤａｙ０比がＤａｙ１で１０１．８％、Ｄａｙ７で１０４．０％を示し、より高い安定性を示した（表６）。
【0071】
（２－３）ＩＳＥＡによる評価
下記表７および８に、各サンプルのＲＬＵ値を示す。表７はＥＤＴＡ添加なし、表８はＥＤＴＡ添加時の結果を示す。
下記表７および８に、各サンプルのＲＬＵ値を示す。表７はＥＤＴＡ添加なし、表８はＥＤＴＡ添加時の結果を示す。
【0072】
【表7】
【0073】
【表8】
【0074】
抗体反応時にＥＤＴＡを加えない測定において、モリブデン酸ナトリウムを加えた条件５では、Ｄａｙ０比がＤａｙ７で１０９．３％を示し、他条件に比べて明らかに高い安定性を示した。
【0075】
抗体反応時にＥＤＴＡを加えた測定において、モリブデン酸ナトリウムを加えた条件５では、Ｄａｙ０比がＤａｙ７で９７．０％を示し、他条件に比べて明らかに高い安定性を示した。
【0076】
以上より、抗体反応時のＥＤＴＡの有無に関係なく、モリブデン酸ナトリウムによるＴＲＡＣＰ－５ｂの安定化効果が示された。
【0077】
（実施例３）ジオキセタン系以外の基質によるＩＳＥＡで安定化効果の検証
実施例１および２のＩＳＥＡによる測定では、発光基質としてそれぞれジオキセタン系化合物であるＬｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤおよびＣＤＰ－Ｓｔａｒを使用したが、ジオキセタン系化合物以外の基質における効果を確認するため、検討を行った。基質としては、発色基質パラニトロフェニルリン酸（ｐ－ＮＰＰ）および発光基質ＡＰＳ－５を使用した。
実施例１および２のＩＳＥＡによる測定では、発光基質としてそれぞれジオキセタン系化合物であるＬｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤおよびＣＤＰ－Ｓｔａｒを使用したが、ジオキセタン系化合物以外の基質における効果を確認するため、検討を行った。基質としては、発色基質パラニトロフェニルリン酸（ｐ－ＮＰＰ）および発光基質ＡＰＳ－５を使用した。
【0078】
（３－１）安定性評価用サンプルの調製および測定
安定性評価用のサンプルは、実施例２と同様のものを準備した。
ＩＳＥＡのプロトコールは下記の通りとした。
（ＩＳＥＡプロトコール）
抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体 ＲＴＰ１５Ａ４（自社製）を９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に固相し、安定性評価用サンプルを希釈して１００μＬ添加して、３７℃３０分撹拌して反応させた。希釈液の組成は１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０を用いた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、
（１）基質にｐ－ＮＰＰを用いた測定
パラニトロフェニルリン酸（ｐ－ＮＰＰ）を５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した酵素反応緩衝液（０．８Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．０、５０ｍＭ 酒石酸ナトリウム、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０）を１００μＬ添加した。１Ｍ 水酸化ナトリウムを１００μＬ添加して反応停止したのち、マイクロプレートリーダーを用いて主波長４０５ｎｍの吸光度を測定した。Ｄａｙ０、Ｄａｙ１、Ｄａｙ７の各サンプルの吸光度（ブランクを差し引いた値）からＤａｙ０比およびＤａｙ１比を算出して安定性を評価した。
（２）基質にＡＰＳ－５を用いた測定
酵素反応緩衝液（０．８Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．０、５０ｍＭ 酒石酸ナトリウム、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０）を７０μＬ添加し、続いてＡＰＳ－５（富士フィルム和光純薬）を３０μＬ添加して、３７℃１０分反応させた。１Ｍ 水酸化ナトリウムを１００ μＬ添加して反応停止したのち、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ）で発光測定した。Ｄａｙ０、Ｄａｙ１、Ｄａｙ７の各サンプルのＲＬＵからＤａｙ０比およびＤａｙ１比を算出して安定性を評価した。
安定性評価用のサンプルは、実施例２と同様のものを準備した。
ＩＳＥＡのプロトコールは下記の通りとした。
（ＩＳＥＡプロトコール）
抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体 ＲＴＰ１５Ａ４（自社製）を９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に固相し、安定性評価用サンプルを希釈して１００μＬ添加して、３７℃３０分撹拌して反応させた。希釈液の組成は１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０を用いた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、
（１）基質にｐ－ＮＰＰを用いた測定
パラニトロフェニルリン酸（ｐ－ＮＰＰ）を５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した酵素反応緩衝液（０．８Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．０、５０ｍＭ 酒石酸ナトリウム、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０）を１００μＬ添加した。１Ｍ 水酸化ナトリウムを１００μＬ添加して反応停止したのち、マイクロプレートリーダーを用いて主波長４０５ｎｍの吸光度を測定した。Ｄａｙ０、Ｄａｙ１、Ｄａｙ７の各サンプルの吸光度（ブランクを差し引いた値）からＤａｙ０比およびＤａｙ１比を算出して安定性を評価した。
（２）基質にＡＰＳ－５を用いた測定
酵素反応緩衝液（０．８Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．０、５０ｍＭ 酒石酸ナトリウム、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０）を７０μＬ添加し、続いてＡＰＳ－５（富士フィルム和光純薬）を３０μＬ添加して、３７℃１０分反応させた。１Ｍ 水酸化ナトリウムを１００ μＬ添加して反応停止したのち、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ）で発光測定した。Ｄａｙ０、Ｄａｙ１、Ｄａｙ７の各サンプルのＲＬＵからＤａｙ０比およびＤａｙ１比を算出して安定性を評価した。
【0079】
（３－２）ＩＳＥＡによる評価
下記表９および１０に、各サンプルの吸光度およびＲＬＵ値を示す。表９はｐ－ＮＰＰを発色基質として、表１０はＡＰＳ－５をそれぞれ発光基質として使用したときの結果を示す。
下記表９および１０に、各サンプルの吸光度およびＲＬＵ値を示す。表９はｐ－ＮＰＰを発色基質として、表１０はＡＰＳ－５をそれぞれ発光基質として使用したときの結果を示す。
【0080】
【表9】
【0081】
【表10】
【0082】
表９、１０に示すように、ジオキセタン系化合物以外の発光基質を用いた場合でも、モリブデン酸化合物を添加することによりＴＲＡＣＰ－５ｂの安定性が向上した。
【0083】
（実施例４）モリブデン化合物濃度と安定化効果の関係、および各種モリブデン化合物における安定化効果の検証
添加するモリブデン化合物に関する検討として、モリブデン酸ナトリウム濃度とＴＲＡＣＰ－５ｂ安定化効果の検証、およびモリブデン酸ナトリウム以外のモリブデン試薬の安定化効果について検証した。
添加するモリブデン化合物に関する検討として、モリブデン酸ナトリウム濃度とＴＲＡＣＰ－５ｂ安定化効果の検証、およびモリブデン酸ナトリウム以外のモリブデン試薬の安定化効果について検証した。
【0084】
（４－１）安定性評価用サンプルの調製および測定
ｐＨ６．０の希釈液に各モリブデン酸試薬を添加し、さらにリコンビナントヒトＴＲＡＣＰ－５ｂを２０ｎｇ／ｍＬになるように加えて安定性評価用サンプルとした。
ｐＨ６．０の希釈液は１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＭＥＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０を用いた。モリブデン試薬は、モリブデン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物（０．０１ｍＭ、０．１ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭの４段階）、モリブデン酸（ＶＩ）アンモニウム四水和物、リンモリブデン酸、モリブデン標準液を用いた。モリブデン試薬を添加しない希釈液についても安定性評価サンプルを作製した。
ｐＨ６．０の希釈液に各モリブデン酸試薬を添加し、さらにリコンビナントヒトＴＲＡＣＰ－５ｂを２０ｎｇ／ｍＬになるように加えて安定性評価用サンプルとした。
ｐＨ６．０の希釈液は１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＭＥＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０を用いた。モリブデン試薬は、モリブデン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物（０．０１ｍＭ、０．１ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭの４段階）、モリブデン酸（ＶＩ）アンモニウム四水和物、リンモリブデン酸、モリブデン標準液を用いた。モリブデン試薬を添加しない希釈液についても安定性評価サンプルを作製した。
【0085】
安定性評価用サンプルをポリプロピレンチューブにさらに４本に小分けして、１本は前処理前のサンプルとして凍結保存し、残り３本は３７℃で約２４時間静置して前処理を行い、引き続き３７℃処理なし０日間（Ｄａｙ０）、３７℃処理を１日間（Ｄａｙ１）または７日間（Ｄａｙ７）加えたのちにそれぞれ凍結保存し、後日融解してＥＬＩＳＡとＩＳＥＡによる測定を行った。
【0086】
ＥＬＩＳＡおよびＩＳＥＡのプロトコールは下記の通りとした。
【0087】
（ＥＬＩＳＡプロトコール）
抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体 ＲＴＰ１５Ａ４（自社製）を９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に固相し、安定性評価用サンプルを希釈して１００μＬとなるように添加して、３７℃３０分撹拌して反応させた。希釈液の組成は１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０とした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、ビオチン標識抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体ＲＴＰ１Ｃ６（自社製）を１００μＬとなるように添加して、３７℃３０分撹拌して反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、ＨＲＰ－ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を希釈して１００μＬとなるように添加して、３７℃３０分撹拌して反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、テトラメチルベンジジン－過酸化水素混合液を加えて２５℃１０分反応させ、０．５Ｍ 硫酸で反応停止したのち、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ）を用いて主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍの吸光度を測定した。Ｄａｙ０、Ｄａｙ１、Ｄａｙ７の各サンプルの吸光度からＤａｙ０比を算出して安定性を評価した。また、Ｄａｙ０、Ｄａｙ１、Ｄａｙ７の各サンプルの吸光度から活性化前の吸光度に対する比を算出し、こちらも安定化の指標とした。
抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体 ＲＴＰ１５Ａ４（自社製）を９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に固相し、安定性評価用サンプルを希釈して１００μＬとなるように添加して、３７℃３０分撹拌して反応させた。希釈液の組成は１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０とした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、ビオチン標識抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体ＲＴＰ１Ｃ６（自社製）を１００μＬとなるように添加して、３７℃３０分撹拌して反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、ＨＲＰ－ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を希釈して１００μＬとなるように添加して、３７℃３０分撹拌して反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、テトラメチルベンジジン－過酸化水素混合液を加えて２５℃１０分反応させ、０．５Ｍ 硫酸で反応停止したのち、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ）を用いて主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍの吸光度を測定した。Ｄａｙ０、Ｄａｙ１、Ｄａｙ７の各サンプルの吸光度からＤａｙ０比を算出して安定性を評価した。また、Ｄａｙ０、Ｄａｙ１、Ｄａｙ７の各サンプルの吸光度から活性化前の吸光度に対する比を算出し、こちらも安定化の指標とした。
【0088】
（ＩＳＥＡプロトコール）
抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体 ＲＴＰ１５Ａ４（自社製）を９６ウェル白色マイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に固相し、安定性評価用サンプルを希釈して１００μＬ添加して、３７℃３０分撹拌して反応させた。希釈液の組成は１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０を用いた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌでウェルを洗浄後、酵素反応緩衝液（０．８Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．０、５０ｍＭ 酒石酸ナトリウム、０．１％ プロクリン９５０）を７０μＬ添加し、続いてＣＤＰ－Ｓｔａｒ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）にＳａｐｐｈｉｒｅ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を１０％（ｖ／ｖ）になるように加えた基質液を３０μＬ添加して、３７℃１０分反応させた。１Ｍ 水酸化ナトリウムを１００μＬ添加して反応停止したのち、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ）で発光測定した。Ｄａｙ０、Ｄａｙ１、Ｄａｙ７の各サンプルのＲＬＵからＤａｙ０比を算出して安定性を評価した。
抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体 ＲＴＰ１５Ａ４（自社製）を９６ウェル白色マイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に固相し、安定性評価用サンプルを希釈して１００μＬ添加して、３７℃３０分撹拌して反応させた。希釈液の組成は１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０を用いた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌでウェルを洗浄後、酵素反応緩衝液（０．８Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．０、５０ｍＭ 酒石酸ナトリウム、０．１％ プロクリン９５０）を７０μＬ添加し、続いてＣＤＰ－Ｓｔａｒ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）にＳａｐｐｈｉｒｅ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を１０％（ｖ／ｖ）になるように加えた基質液を３０μＬ添加して、３７℃１０分反応させた。１Ｍ 水酸化ナトリウムを１００μＬ添加して反応停止したのち、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ）で発光測定した。Ｄａｙ０、Ｄａｙ１、Ｄａｙ７の各サンプルのＲＬＵからＤａｙ０比を算出して安定性を評価した。
【0089】
（４－２）ＥＬＩＳＡによる評価
下記表１１に、各サンプルの吸光度値を示す。
下記表１１に、各サンプルの吸光度値を示す。
【0090】
【表11】
【0091】
結果、吸光度の前処理前に対する比において、Ｄａｙ７の値はモリブデン酸ナトリウム０．１ｍＭで６５．３％、１ｍＭで９５．５％、１０ｍＭで８７．８％となり、０．１～１０ｍＭで安定化効果を示した。０．０１ｍＭでは効果がみられなかった。
【0092】
吸光度の前処理後Ｄａｙ０比において、Ｄａｙ７の値はモリブデン酸ナトリウム０．１ｍＭで７７．６％、１ｍＭで１０３．５％、１０ｍＭで８９．６％となり、０．１～１０ｍＭで安定化効果を示した。０．０１ｍＭでは効果がみられなかった。
【0093】
また、モリブデン酸ナトリウム以外のモリブデン、モリブデン化合物を用いた検討に関して、モリブデン酸アンモニウム、リンモリブデン酸、モリブデン標準液では、吸光度の前処理前に対する比において、Ｄａｙ７の値はそれぞれ９３．３％、１１４．６％、６９．５％となり、無添加に比べていずれも高い安定化効果を示した。吸光度のＤａｙ０比のＤａｙ７の値はそれぞれ９７．７％、１１５．１％、９０．０％となり、無添加に比べていずれも安定化効果を示した。
【0094】
（４－３）ＩＳＥＡによる評価
下記表１２に、各サンプルのＲＬＵ値を示す。
下記表１２に、各サンプルのＲＬＵ値を示す。
【0095】
【表12】
【0096】
結果、ＲＬＵのＤａｙ０比において、Ｄａｙ７の値はモリブデン酸ナトリウム０．１ｍＭで６１．４％、１ｍＭで８６．４％、１０ｍＭで８４．５％となり、０．１～１０ｍＭで安定化効果を示した。０．０１ｍＭでは効果がみられなかった。
【0097】
モリブデン酸アンモニウム、リンモリブデン酸、モリブデン標準液において、吸光度のＤａｙ０比のＤａｙ７の値はそれぞれ８６．９％、１１１．７％、６１．５％となり、無添加に比べていずれも安定化効果を示した。
【0098】
（実施例５）抗体を介さない酵素活性測定における安定化効果
抗体を介さない酵素活性測定における安定化効果について検証した。
抗体を介さない酵素活性測定における安定化効果について検証した。
【0099】
（５－１）安定性評価用サンプルの調製および測定
安定性評価用のサンプルは、実施例４と同様のものを準備した。
酵素活性測定のプロトコールは下記の通りとした。
（活性測定プロトコール）
（１）基質にｐ－ＮＰＰを用いた測定
９６ウェルＵ底マイクロプレート（ＩＷＡＫＩ）にサンプル原液を１０μＬ添加し、パラニトロフェニルリン酸（ｐ－ＮＰＰ）を５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した酵素反応緩衝液（０．８Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．０、５０ｍＭ 酒石酸ナトリウム、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０）を１００μＬ添加して、３７℃１時間反応させた。 １Ｍ 水酸化ナトリウムを１００μＬ添加して反応停止したのち、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ）で４０５ｎｍの吸光度を測定した。Ｄａｙ０、Ｄａｙ１、Ｄａｙ７の各サンプルの吸光度（ブランクを差し引いた値）からＤａｙ０比を算出して安定性を評価した。
安定性評価用のサンプルは、実施例４と同様のものを準備した。
酵素活性測定のプロトコールは下記の通りとした。
（活性測定プロトコール）
（１）基質にｐ－ＮＰＰを用いた測定
９６ウェルＵ底マイクロプレート（ＩＷＡＫＩ）にサンプル原液を１０μＬ添加し、パラニトロフェニルリン酸（ｐ－ＮＰＰ）を５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した酵素反応緩衝液（０．８Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．０、５０ｍＭ 酒石酸ナトリウム、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０）を１００μＬ添加して、３７℃１時間反応させた。 １Ｍ 水酸化ナトリウムを１００μＬ添加して反応停止したのち、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ）で４０５ｎｍの吸光度を測定した。Ｄａｙ０、Ｄａｙ１、Ｄａｙ７の各サンプルの吸光度（ブランクを差し引いた値）からＤａｙ０比を算出して安定性を評価した。
【0100】
（２）基質にＣＤＰ－Ｓｔａｒを用いた測定
９６ウェルＵ底白色マイクロプレート（コーニング）にサンプル原液を１０μＬ添加し、酵素反応緩衝液（０．８Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．０、５０ｍＭ 酒石酸ナトリウム、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０）を７０μＬ添加し、続いてＣＤＰ－Ｓｔａｒ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）にＳａｐｐｈｉｒｅ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を１０％（ｖ／ｖ）になるように加えた基質液を３０μＬ添加して、３７℃１０分反応させた。１Ｍ 水酸化ナトリウムを１００μＬ添加して反応停止したのち、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ）で発光測定した。Ｄａｙ０、Ｄａｙ１、Ｄａｙ７の各サンプルのＲＬＵからＤａｙ０比を算出して安定性を評価した。
（５－２）ｐ－ＮＰＰを使用したときの評価
下記表１３に、基質としてｐ－ＮＰＰを使用した時の、各サンプルの吸光度値を示す。
９６ウェルＵ底白色マイクロプレート（コーニング）にサンプル原液を１０μＬ添加し、酵素反応緩衝液（０．８Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．０、５０ｍＭ 酒石酸ナトリウム、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０）を７０μＬ添加し、続いてＣＤＰ－Ｓｔａｒ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）にＳａｐｐｈｉｒｅ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を１０％（ｖ／ｖ）になるように加えた基質液を３０μＬ添加して、３７℃１０分反応させた。１Ｍ 水酸化ナトリウムを１００μＬ添加して反応停止したのち、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ）で発光測定した。Ｄａｙ０、Ｄａｙ１、Ｄａｙ７の各サンプルのＲＬＵからＤａｙ０比を算出して安定性を評価した。
（５－２）ｐ－ＮＰＰを使用したときの評価
下記表１３に、基質としてｐ－ＮＰＰを使用した時の、各サンプルの吸光度値を示す。
【0101】
【表13】
【0102】
結果、吸光度の前処理前比において、Ｄａｙ７の値はモリブデン酸ナトリウム０．１ｍＭで５４．４％、１ｍＭで９７．６％、１０ｍＭで１０９．９％となり、０．１～１０ｍＭで高い安定化効果を示した。０．０１ｍＭでも、無添加と比較すると一応の安定化効果を示したが、安定化効果は弱かった。
【0103】
Ｄａｙ０比においては、Ｄａｙ７の値はモリブデン酸ナトリウム０．１ｍＭで５４．４％、１ｍＭで８８．０％、１０ｍＭで８９．３％となり、０．１～１０ｍＭで高い安定化効果を示した。０．０１ｍＭでも無添加と比較すると安定化効果を示した。
【0104】
モリブデン酸アンモニウム、リンモリブデン酸、モリブデン標準液において、吸光度の前処理前比のＤａｙ７の値はそれぞれ１０９．９％、１０３．８％、５９．８％となり、無添加に比べていずれも安定化効果を示した。Ｄａｙ０比のＤａｙ７の値はそれぞれ９１．６％、９９．６％、６４．８％となり、無添加に比べていずれも安定化効果を示した。
（５－３）ＣＤＰ－Ｓｔａｒを使用したときの評価
下記表１４に、発光基質としてＣＤＰ－Ｓｔａｒを使用した時の、各サンプルのＲＬＵ値を示す。
（５－３）ＣＤＰ－Ｓｔａｒを使用したときの評価
下記表１４に、発光基質としてＣＤＰ－Ｓｔａｒを使用した時の、各サンプルのＲＬＵ値を示す。
【0105】
【表14】
【0106】
結果、ＲＬＵの前処理前比において、Ｄａｙ７の値はモリブデン酸ナトリウム０．１ｍＭで８１．９％、１ｍＭで１０１．４％、１０ｍＭで１０９．９％となり、０．１～１０ｍＭで高い安定化効果を示した。０．０１ｍＭでも無添加と比較すると一応の安定化効果を示したが、安定化効果は弱かった。
【0107】
Ｄａｙ０比においては、Ｄａｙ７の値はモリブデン酸ナトリウム０．１ｍＭで７０．７％、１ｍＭで９１．０％、１０ｍＭで９１．０％となり、０．１～１０ｍＭで高い安定化効果を示した。０．０１ｍＭでも無添加と比較すると安定化効果を示した。
【0108】
モリブデン酸アンモニウム、リンモリブデン酸、モリブデン標準液において、吸光度の前処理前比のＤａｙ７の値はそれぞれ１０６．１％、１１１．９％、９０．０％となり、無添加に比べていずれも安定化効果を示した。Ｄａｙ０比のＤａｙ７の値はそれぞれ９３．５％、１０４．９％、７０．９％となり、無添加に比べていずれも安定化効果を示した。
【0109】
（実施例６）モリブデン酸ナトリウムと糖類（スクロース）の共存効果
モリブデン酸化合物による安定化向上効果をさらに高めるための方法として、スクロースを共存させたときの効果を検証した。
モリブデン酸化合物による安定化向上効果をさらに高めるための方法として、スクロースを共存させたときの効果を検証した。
【0110】
（６－１）安定性評価用サンプルの調製および測定
標準液希釈液の基本組成は１％ ＰＶＰ Ｋ３０、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０とした。その後、下記４条件の希釈液を調製した。
標準液希釈液の基本組成は１％ ＰＶＰ Ｋ３０、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０とした。その後、下記４条件の希釈液を調製した。
【0111】
条件１：スクロース無し・モリブデン無し、
条件２：１０％スクロース・１ｍＭモリブデン、
条件３：１０％スクロース・モリブデン無し、
条件４：スクロース無し・１ｍＭモリブデン
条件２：１０％スクロース・１ｍＭモリブデン、
条件３：１０％スクロース・モリブデン無し、
条件４：スクロース無し・１ｍＭモリブデン
【0112】
各条件の希釈液に、リコンビナント ヒトＴＲＡＣ－５ｂを２０ｎｇ／ｍＬになるように加え、ポリプロピレンチューブに分注して２５℃保存（０、１、４、７日間）した後で凍結保存（－８０℃）し、各条件をまとめてＩＳＥＡ（１Ｃ６、Ｌｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤ）で測定した。残存活性としてＲＬＵのＤａｙ０比を算出して安定性を評価した。ＩＳＥＡのプロトコールは、実施例１と同様とした。
【0113】
（６－２）ＩＳＥＡによる評価
下記表１５に、ＩＳＥＡにおける各サンプルのＲＬＵ値を示す。
下記表１５に、ＩＳＥＡにおける各サンプルのＲＬＵ値を示す。
【0114】
【表15】
【0115】
結果、モリブデン酸ナトリウムとスクロースを組み合わせた条件２では、ＲＬＵのＤａｙ０比がＤａｙ７で１０３．６％、Ｄａｙ１比がＤａｙ７で９７．５％を示し、どちらも加えない条件（条件１）やどちらか一方を加えた条件（条件３、４）に比べて高い安定化効果を示した。
【0116】
（実施例７）骨由来ネイティブＴＲＡＣＰ－５ｂに対するモリブデン酸ナトリウムの安定化効果
モリブデン酸化合物による安定化向上効果が、リコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂだけでなくネイティブのＴＲＡＣＰ－５ｂでもみられるか検証した。同時に希釈液中のＢＳＡの有無の影響についても検証した。
モリブデン酸化合物による安定化向上効果が、リコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂだけでなくネイティブのＴＲＡＣＰ－５ｂでもみられるか検証した。同時に希釈液中のＢＳＡの有無の影響についても検証した。
【0117】
（７－１）骨由来ネイティブＴＲＡＣＰ－５ｂ精製の方法
骨由来ネイティブＴＲＡＣＰ－５ｂの調製は、文献記載の方法（特開２００４－２６８０５）を参考に、下記のように実施した。
骨由来ネイティブＴＲＡＣＰ－５ｂの調製は、文献記載の方法（特開２００４－２６８０５）を参考に、下記のように実施した。
【0118】
インフォームドコンセント実施後に外科的手術により摘出されたヒト大腿骨骨頭部７０ｇを液体窒素中で凍結させ、ハンマーで粉砕後、プロテアーゼインヒビター等を含む緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，３００ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００，０．０２％ ＮａＮ３，ｐＨ７．５）中に懸濁させ、超音波ホモジナイザーにてホモジナイズした。２００００Ｇで３０分遠心分離して上清を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５で透析したのち、２００００Ｇで３０分遠心分離した。上清をＣＭ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにアプライして、ＮａＣｌを含むＨＥＰＥＳ緩衝液の直線濃度勾配で樹脂に吸着させたタンパク質を溶出した。酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性は、ｐ－ＮＰＰを用いた酵素活性測定を行って算出し、活性の高いフラクションをプールした。それをヘパリンセファロースカラムにアプライして、ＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ｐＨ７．５の直線塩濃度勾配により樹脂に吸着したタンパク質を溶出した。
【0119】
酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ高活性のフラクションをプールし、濃縮して得た試料を還元処理してＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施したところ、約２３ｋＤａと約１６ｋＤａの２つのサブユニットのバンドを検出し、酵素活性測定により切断前に比べて比活性が上昇し、かつ至適ｐＨピークが上昇することから、ＴＲＡＣＰ－５ｂであることを確認できた。
【0120】
（７－２）安定性評価用サンプルの調製および測定
ｐＨ６．０の希釈液にモリブデン酸ナトリウムを添加し（０．１ｍＭ）、さらにヒト大腿骨由来ＴＲＡＣＰ－５ｂを１０ｎｇ／ｍＬになるように加えて安定性評価用サンプルとした。ｐＨ６．０の希釈液は１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＭＥＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０を用いた。モリブデン酸ナトリウムを添加しない希釈液についても安定性評価サンプルを作製した。
ｐＨ６．０の希釈液にモリブデン酸ナトリウムを添加し（０．１ｍＭ）、さらにヒト大腿骨由来ＴＲＡＣＰ－５ｂを１０ｎｇ／ｍＬになるように加えて安定性評価用サンプルとした。ｐＨ６．０の希釈液は１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＭＥＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０を用いた。モリブデン酸ナトリウムを添加しない希釈液についても安定性評価サンプルを作製した。
【0121】
安定性評価用サンプルをポリプロピレンチューブにさらに４本に小分けして、１本は活性化前のサンプルとして凍結保存し、残り３本は３７℃で約２４時間静置して前処理を行い、引き続き３７℃処理を行わないか（Ｄａｙ０）、３７℃処理を１日間（Ｄａｙ１）または７日間（Ｄａｙ７）加えたのちにそれぞれ凍結保存し、後日融解してＥＬＩＳＡとＩＳＥＡによる測定を行った。
骨由来ＴＲＡＣＰ－５ｂの代わりにリコンビナントヒトＴＲＡＣＰ－５ｂを２０ｎｇ／ｍＬにして上記と同様の条件で安定性評価用サンプルを調製し、ＥＬＩＳＡとＩＳＥＡによる測定を行った。
骨由来ＴＲＡＣＰ－５ｂの代わりにリコンビナントヒトＴＲＡＣＰ－５ｂを２０ｎｇ／ｍＬにして上記と同様の条件で安定性評価用サンプルを調製し、ＥＬＩＳＡとＩＳＥＡによる測定を行った。
【0122】
ＥＬＩＳＡおよびＩＳＥＡのプロトコールは実施例４と同様とした。
（７－３）ＥＬＩＳＡによる評価
下記表１６に、ＥＬＩＳＡにおける各サンプルの吸光度値を示す。
（７－３）ＥＬＩＳＡによる評価
下記表１６に、ＥＬＩＳＡにおける各サンプルの吸光度値を示す。
【0123】
【表16】
【0124】
結果、骨由来のネイティブＴＲＡＣＰ－５ｂにおいて、モリブデン酸ナトリウムを添加するとＤａｙ７の吸光度の前処理前比は８１．５％、Ｄａｙ７の吸光度のＤａｙ０比は９２．２％を示し、モリブデン酸ナトリウムを含まない場合に比べて高い安定化効果を示した。
（７－４）ＩＳＥＡにおける評価
下記表１７に、ＩＳＥＡにおける各サンプルのＲＬＵ値を示す。
（７－４）ＩＳＥＡにおける評価
下記表１７に、ＩＳＥＡにおける各サンプルのＲＬＵ値を示す。
【0125】
【表17】
【0126】
結果、骨由来のネイティブＴＲＡＣＰ－５ｂにおいて、モリブデン酸ナトリウムを添加するとＤａｙ７のＲＬＵのＤａｙ０比は１０３．０％を示し、モリブデン酸ナトリウムを含まない場合に比べて高い安定化効果を示した。
【0127】
（実施例８）各種調製法によるリコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂに対するモリブデン酸ナトリウムの安定化効果
リコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂの調製に当たり、カテプシンＫのほか、カテプシンＬまたはパパインを用いた場合の、モリブデン化合物の添加による安定化効果を検討した。
リコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂの調製に当たり、カテプシンＫのほか、カテプシンＬまたはパパインを用いた場合の、モリブデン化合物の添加による安定化効果を検討した。
【0128】
（８－１）各種リコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂ精製の方法
非特許文献1の方法にしたがって、リコンビナントヒトカテプシンＬ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、リコンビナントヒトカテプシンＫ（自社製造）、パパイン（ナカライテスク）の各システインプロテアーゼを用いて、リコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂの作製を行った。各システインプロテアーゼとリコンビナントＴＲＡＣＰ－５ａを混合して３７℃で２時間反応させ、ＴＲＡＣＰ‐５ａを切断してＴＲＡＣＰ－５ｂを生成させた。プロテアーゼインヒビターカクテル（ナカライテスク）を加えて各システインプロテアーゼの反応を停止した。
（８－２）安定性評価用サンプルの調製および測定
上記のようにして得られたカテプシンＬ切断５ｂ、パパイン切断５ｂと、カテプシンＫ切断で得たＴＲＡＣＰ－５ｂについて、モリブデン化合物による安定化効果を検証した。
ｐＨ６．０の希釈液にモリブデン酸ナトリウムを添加し（１ｍＭ）、さらにカテプシンＬ切断５ｂ、パパイン切断５ｂ、カテプシンＫ切断５ｂをそれぞれ１０ｎｇ/ｍＬになるように加えて安定性評価用サンプルとした。ｐＨ６．０の希釈液は１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＭＥＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０の他、ＢＳＡを含まない希釈液として５０ｍＭ ＭＥＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０を用いた。モリブデン酸ナトリウムを添加しない希釈液でも安定性評価サンプルを作製した。
非特許文献1の方法にしたがって、リコンビナントヒトカテプシンＬ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、リコンビナントヒトカテプシンＫ（自社製造）、パパイン（ナカライテスク）の各システインプロテアーゼを用いて、リコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂの作製を行った。各システインプロテアーゼとリコンビナントＴＲＡＣＰ－５ａを混合して３７℃で２時間反応させ、ＴＲＡＣＰ‐５ａを切断してＴＲＡＣＰ－５ｂを生成させた。プロテアーゼインヒビターカクテル（ナカライテスク）を加えて各システインプロテアーゼの反応を停止した。
（８－２）安定性評価用サンプルの調製および測定
上記のようにして得られたカテプシンＬ切断５ｂ、パパイン切断５ｂと、カテプシンＫ切断で得たＴＲＡＣＰ－５ｂについて、モリブデン化合物による安定化効果を検証した。
ｐＨ６．０の希釈液にモリブデン酸ナトリウムを添加し（１ｍＭ）、さらにカテプシンＬ切断５ｂ、パパイン切断５ｂ、カテプシンＫ切断５ｂをそれぞれ１０ｎｇ/ｍＬになるように加えて安定性評価用サンプルとした。ｐＨ６．０の希釈液は１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＭＥＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０の他、ＢＳＡを含まない希釈液として５０ｍＭ ＭＥＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０を用いた。モリブデン酸ナトリウムを添加しない希釈液でも安定性評価サンプルを作製した。
【0129】
安定性評価用サンプルをポリプロピレンチューブにさらに４本に小分けして、１本は活性化前のサンプルとして凍結保存し、残り３本は３７℃で約２４時間静置して前処理を行い、引き続き３７℃処理を行わないか（Ｄａｙ０）、３７℃処理を２日間（Ｄａｙ２）または８日間（Ｄａｙ８）加えたのちにそれぞれ凍結保存し、後日融解してＥＬＩＳＡとＩＳＥＡによる測定を行った。
【0130】
ＥＬＩＳＡおよびＩＳＥＡのプロトコールは実施例４と同様とした。前処理前、前処理後Ｄａｙ０、Ｄａｙ２、Ｄａｙ８の各サンプルの吸光度（ＥＬＩＳＡ）またはＲＬＵ（ＩＳＥＡ）から吸光度比とＲＬＵ比（前処理前比及び前処理後Ｄａｙ０比）を算出して安定性を評価した。
【0131】
（８－３）ＥＬＩＳＡによる効果
下記表１８に、ＥＬＩＳＡにおける各サンプルの吸光度を示す。
下記表１８に、ＥＬＩＳＡにおける各サンプルの吸光度を示す。
【0132】
【表18】
【0133】
結果、カテプシンＬで切断することで得られたリコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂは、モリブデン酸ナトリウム１ｍＭの条件における吸光度のＤａｙ０比の値がＤａｙ９で１１４．５％、Ｄａｙ９／Ｄａｙ１の値が９１．７％を示し、モリブデン酸ナトリウムを添加しない条件に比べて高い安定化効果を示した。パパインで切断することで得られたリコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂはモリブデン酸ナトリウム１ｍＭの条件において吸光度のＤａｙ０比の値がＤａｙ９で１０５.１％、Ｄａｙ９／Ｄａｙ１の値が８８．３％を示し、モリブデン酸ナトリウムを添加しない条件に比べて高い安定化効果を示した。すなわち、プロテアーゼとしてカテプシンＫのほか、カテプシンＬやパパインで切断することによって得られたリコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂを使用した場合でも、モリブデン酸化合物を添加することにより高い安定化効果がみられた。
【0134】
（８－４）ＩＳＥＡによる効果
下記表１９に、ＩＳＥＡにおける各サンプルのＲＬＵ値を示す。
下記表１９に、ＩＳＥＡにおける各サンプルのＲＬＵ値を示す。
【0135】
【表19】
【0136】
結果、カテプシンＬで切断することで得られたリコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂは、モリブデン酸ナトリウム１ｍＭの条件においてＲＬＵのＤａｙ０比の値がＤａｙ９で１１７．７％、Ｄａｙ９／Ｄａｙ１の値が８０．６％を示し、モリブデン酸ナトリウムを添加しない条件に比べて高い安定化効果を示した。パパインで切断することで得られたリコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂは、モリブデン酸ナトリウム１ｍＭの条件においてＲＬＵのＤａｙ０比の値がＤａｙ９で９４．６％、Ｄａｙ９/Ｄａｙ１の値が７９．７％を示し、モリブデン酸ナトリウムを添加しない条件に比べて高い安定化効果を示した。すなわち、プロテアーゼとしてカテプシンＫのほか、カテプシンＬやパパインで切断することによって得られたリコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂを使用した場合でも、モリブデン酸化合物を添加することにより高い安定化効果がみられた。
【0137】
（実施例９）金属化合物によるリコンビナントＴＲＡＣＰ－５ｂの安定化効果の検証（２）
【0138】
（９－１）安定性評価用サンプルの調製および測定
ｐＨ６．０の希釈液に金属化合物を添加し、さらにリコンビナントヒトＴＲＡＣＰ－５ｂを２０ｎｇ／ｍＬになるように加えて安定性評価用サンプルとした。ｐＨ６．０の希釈液の組成は、１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＭＥＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０とした。評価に用いる金属化合物は、モリブデン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物、オルトバナジン酸（Ｖ）ナトリウム、タングステン（ＶＩ）酸ナトリウム二水和物、過マンガン酸カリウムを用いた。金属化合物を添加しない希釈液についても安定性評価用サンプルを作製した。
ｐＨ６．０の希釈液に金属化合物を添加し、さらにリコンビナントヒトＴＲＡＣＰ－５ｂを２０ｎｇ／ｍＬになるように加えて安定性評価用サンプルとした。ｐＨ６．０の希釈液の組成は、１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＭＥＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０とした。評価に用いる金属化合物は、モリブデン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物、オルトバナジン酸（Ｖ）ナトリウム、タングステン（ＶＩ）酸ナトリウム二水和物、過マンガン酸カリウムを用いた。金属化合物を添加しない希釈液についても安定性評価用サンプルを作製した。
【0139】
安定性評価用サンプルをポリプロピレンチューブにさらに４本に小分けして、１本は活性化前のサンプルとして凍結保存し、残り３本は３７℃で約２４時間静置して前処理を行い、引き続き３７℃処理を行わないか（Ｄａｙ０）、３７℃処理を２日間（Ｄａｙ２）または８日間（Ｄａｙ８）加えたのちにそれぞれ凍結保存し、後日融解してＥＬＩＳＡとＩＳＥＡによる測定を行った。
【0140】
ＥＬＩＳＡおよびＩＳＥＡのプロトコールは実施例４と同様とした。前処理前、前処理後Ｄａｙ０、Ｄａｙ２、Ｄａｙ８の各サンプルの吸光度（ＥＬＩＳＡ）またはＲＬＵ（ＩＳＥＡ）から吸光度比とＲＬＵ比（前処理前比及び前処理後Ｄａｙ０比）を算出して安定性を評価した。
【0141】
（９－２）ＥＬＩＳＡによる効果
下記表２０に、ＥＬＩＳＡにおける各サンプルの吸光度を示す。
下記表２０に、ＥＬＩＳＡにおける各サンプルの吸光度を示す。
【0142】
【表20】
【0143】
結果、タングステン化合物であるタングステン酸ナトリウムを添加することにより（条件６、７）、タングステン酸ナトリウム１０ｍＭの条件で吸光度の前処理前比がＤａｙ８で８１．８％、吸光度の前処理後Ｄａｙ０比が９４．６％を示した。また、タングステン酸ナトリウム１ｍＭの条件では、吸光度の前処理前比がＤａｙ８で８７．４％、また前処理後Ｄａｙ０比で９７．１％を示し、タングステン酸ナトリウムを添加しない条件に比べて高い安定化効果を示した。
【0144】
（９－３）ＩＳＥＡによる効果
下記表２１に、ＩＳＥＡにおける各サンプルのＲＬＵを示す。
下記表２１に、ＩＳＥＡにおける各サンプルのＲＬＵを示す。
【0145】
【表21】
【0146】
結果、タングステン化合物であるタングステン酸ナトリウムを添加することにより（条件６、７）、タングステン酸ナトリウム１０ｍＭの条件でＲＬＵの前処理前比がＤａｙ８で１７７．６％、吸光度の前処理後Ｄａｙ０比が１１１．９％を示し、タングステン酸ナトリウム１ｍＭの条件では吸光度の前処理前比がＤａｙ８で１６０．２％と前処理後Ｄａｙ０比で１０２．２％を示し、タングステン酸ナトリウムを添加しない条件に比べて高い安定化効果を示した。無添加の場合（条件１）と比べて高い安定化効果が得られた。
【0147】
（実施例１０）長期の冷蔵保存における安定化効果
【0148】
（１０－１）安定性評価用サンプルの調製および測定
ｐＨ６．０の希釈液に各モリブデン酸試薬を添加し、さらにリコンビナントヒトＴＲＡＣＰ－５ｂを１３．３ｎｇ／ｍＬになるように加えて安定性評価用サンプルとした。
ｐＨ６．０の希釈液の組成は、１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＭＥＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０とした。モリブデン試薬としては、モリブデン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物を１ｍＭとなるように添加し、安定性評価用サンプルを作製した。対照として、モリブデン試薬を添加しない希釈液についても安定性評価サンプルを作製した。
ｐＨ６．０の希釈液に各モリブデン酸試薬を添加し、さらにリコンビナントヒトＴＲＡＣＰ－５ｂを１３．３ｎｇ／ｍＬになるように加えて安定性評価用サンプルとした。
ｐＨ６．０の希釈液の組成は、１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＭＥＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０とした。モリブデン試薬としては、モリブデン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物を１ｍＭとなるように添加し、安定性評価用サンプルを作製した。対照として、モリブデン試薬を添加しない希釈液についても安定性評価サンプルを作製した。
【0149】
モリブデン試薬（モリブデン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物）を添加した安定性評価用サンプルは、３７℃で２４時間インキュベートしたのちに、ポリプロピレンチューブに小分けし、一部を－８０℃で凍結保存し、残りは冷蔵保存した。モリブデン試薬を添加しない安定性評価用サンプルは、３７℃インキュベートを行わずに小分けし、一部を－８０℃で凍結保存し、残りは冷蔵保存した。保存開始日（Ｄａｙ０）、７日目（Ｄａｙ７）、１６日目（Ｄａｙ１６）、３７日目（Ｄａｙ３７）、６９日目（Ｄａｙ６９）、９８日目（Ｄａｙ９８）、１４６日目（Ｄａｙ１４８）、１８３日目（Ｄａｙ１８３）に、モリブデン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物を添加した安定性評価用サンプルと、モリブデン試薬を添加しない安定性評価用サンプルのそれぞれについて、ＥＬＩＳＡとＩＳＥＡによる測定を行った。
【0150】
ＥＬＩＳＡおよびＩＳＥＡのプロトコールは下記の通りとした。
【0151】
（ＥＬＩＳＡプロトコール）
抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体 ＲＴＰ１５Ａ４（自社製）を９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に固相し、安定性評価用サンプルを希釈して１００μＬとなるように添加したのち、３７℃３０分撹拌して反応させた。希釈液の組成は１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０とした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、ビオチン標識抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体ＲＴＰ１Ｃ６（自社製）を１００μＬとなるように添加して、３７℃３０分撹拌して反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、ＨＲＰ－ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を希釈して１００μＬとなるように添加し、３７℃３０分撹拌して反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、テトラメチルベンジジン－過酸化水素混合液を加えて２５℃３０分反応させた。０．５Ｍ 硫酸で反応停止したのち、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ）を用いて主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍの吸光度を測定した。各サンプルの吸光度から（冷蔵品吸光度）/（凍結品吸光度）の比を算出して、安定性を評価した。
抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体 ＲＴＰ１５Ａ４（自社製）を９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に固相し、安定性評価用サンプルを希釈して１００μＬとなるように添加したのち、３７℃３０分撹拌して反応させた。希釈液の組成は１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０とした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、ビオチン標識抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体ＲＴＰ１Ｃ６（自社製）を１００μＬとなるように添加して、３７℃３０分撹拌して反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、ＨＲＰ－ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を希釈して１００μＬとなるように添加し、３７℃３０分撹拌して反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、テトラメチルベンジジン－過酸化水素混合液を加えて２５℃３０分反応させた。０．５Ｍ 硫酸で反応停止したのち、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ）を用いて主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍの吸光度を測定した。各サンプルの吸光度から（冷蔵品吸光度）/（凍結品吸光度）の比を算出して、安定性を評価した。
【0152】
（ＩＳＥＡプロトコール）
抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体 ＲＴＰ１５Ａ４（自社製）を９６ウェル白色マイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に固相し、安定性評価用サンプルを希釈して１００μＬ添加したのち、３７℃３０分撹拌して反応させた。希釈液の組成は１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０とした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌでウェルを洗浄後、酵素反応緩衝液（０．８Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．０、５０ｍＭ 酒石酸ナトリウム、０．１％ プロクリン９５０）を７０μＬ添加し、続いてＣＤＰ－Ｓｔａｒ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）にＳａｐｐｈｉｒｅ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を１０％（ｖ／ｖ）になるように加えた基質液を３０μＬ添加して、３７℃１０分反応させた。１Ｍ 水酸化ナトリウムを１００μＬ添加して反応停止したのち、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ）で発光測定した。各サンプルのＲＬＵから冷蔵品ＲＬＵ／凍結品ＲＬＵの比を算出して安定性を評価した。
抗ＴＲＡＣＰ－５モノクローナル抗体 ＲＴＰ１５Ａ４（自社製）を９６ウェル白色マイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に固相し、安定性評価用サンプルを希釈して１００μＬ添加したのち、３７℃３０分撹拌して反応させた。希釈液の組成は１％ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ Ｐｒｏｃｌｉｎ９５０とした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌでウェルを洗浄後、酵素反応緩衝液（０．８Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．０、５０ｍＭ 酒石酸ナトリウム、０．１％ プロクリン９５０）を７０μＬ添加し、続いてＣＤＰ－Ｓｔａｒ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）にＳａｐｐｈｉｒｅ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を１０％（ｖ／ｖ）になるように加えた基質液を３０μＬ添加して、３７℃１０分反応させた。１Ｍ 水酸化ナトリウムを１００μＬ添加して反応停止したのち、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ）で発光測定した。各サンプルのＲＬＵから冷蔵品ＲＬＵ／凍結品ＲＬＵの比を算出して安定性を評価した。
【0153】
（１０－２）ＥＬＩＳＡによる評価
下記表２２に、各サンプルの吸光度値及び吸光度比を示す。
下記表２２に、各サンプルの吸光度値及び吸光度比を示す。
【0154】
【表22】
【0155】
結果、吸光度比 （冷蔵品吸光度）/（凍結品吸光度）の値において、モリブデン試薬を添加しない安定性評価用サンプルでは吸光度比が経時的な低下傾向を示し、１８３日目では６８．８％まで低下した。一方、モリブデン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物を添加した安定性評価用サンプルは０日目から１８３日目までの間で８５．４～９８．１％の範囲で安定した推移を示した。
【0156】
（１０－３）ＩＳＥＡによる評価
下記表に、各サンプルのＲＬＵ値及びＲＬＵ比を示す。
下記表に、各サンプルのＲＬＵ値及びＲＬＵ比を示す。
【0157】
【表23】
【0158】
結果、ＲＬＵ比 （冷蔵品ＲＬＵ）/（凍結品ＲＬＵ）の値において、モリブデン試薬を添加しない安定性評価用サンプルでは吸光度比が経時的な低下傾向を示し、１８３日目では２９．４％まで低下した。一方、モリブデン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物を添加した安定性評価用サンプルは０日目から１８３日目までの間で９５．５％～１０９．１％の範囲で安定した推移を示し、無添加に比べて安定化効果を示した。