特開 2024-55041 ＳＯＣＥ異常症を治療又は予防するための医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024055041

(43)【公開日】2024-04-18

(54)【発明の名称】ＳＯＣＥ異常症を治療又は予防するための医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/711 20060101AFI20240411BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240411BHJP

   A61P 9/04 20060101ALI20240411BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240411BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240411BHJP

【ＦＩ】

A61K31/711

A61P43/00 111

A61P43/00 105

A61P9/04

A61K48/00

C12N15/113 Z ZNA

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022161627

(22)【出願日】2022-10-06

(71)【出願人】

【識別番号】502437894

【氏名又は名称】学校法人大阪医科薬科大学

(74)【代理人】

【識別番号】100121728

【弁理士】

【氏名又は名称】井関 勝守

(74)【代理人】

【識別番号】100165803

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 修平

(72)【発明者】

【氏名】朝日 通雄

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 淳平

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZA361

4C084ZB211

4C084ZC411

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA36

4C086ZB21

4C086ZC41

(57)【要約】

【課題】従来のＳＴＩＭ阻害剤を用いること無く、ＳＯＣＥを抑制できて、ＳＯＣＥの異常な亢進に起因する疾病（ＳＯＣＥ異常症）を治療又は予防できるようにする。
【解決手段】本発明に係るＳＯＣＥ異常症を治療又は予防するための医薬組成物は、ＳＴＩＭ２のプレｍＲＮＡのイントロン９に結合可能なオリゴヌクレオチドを含む。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＳＴＩＭ２のプレｍＲＮＡのイントロン９に結合可能なオリゴヌクレオチドを含む、ＳＯＣＥ異常症を治療又は予防するための医薬組成物。

【請求項2】

前記オリゴヌクレオチドは、ｈｎＲＮＰ ＭがＳＴＩＭ２のプレｍＲＮＡのイントロン９に結合することを競合的阻害する、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記オリゴヌクレオチドは、ＡＴＣＣＴＡＣＴの配列を含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記オリゴヌクレオチドは、ＣＡＡＡＴＣＣＴＡＣＴＧＣ（配列番号１）、ＡＴＣＣＴＡＣＴＧＣＧＡＴ（配列番号２）、又はＴＡＣＡＡＡＴＣＣＴＡＣＴ（配列番号３）のいずれかの配列を含む、請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記ＳＯＣＥ異常症は、心不全である、請求項１に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＳＯＣＥ異常症を治療又は予防するための医薬組成物に関し、特にＳｔｉｍ２の発現を制御するオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

ストア作動性カルシウム流入（ｓｔｏｒｅ－ｏｐｅｒａｔｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｅｎｔｒｙ：ＳＯＣＥ）は、細胞内の小胞体のカルシウムイオンの枯渇を感知して、形質膜がカルシウムチャネルを介して細胞外からのカルシウムイオンの流入を促す現象である。小胞体内のカルシウムが枯渇すると、カルシウムセンサーであるＳＴＩＭ分子の構造が変化し、細胞膜に局在するＯｒａｉ１というカルシウムチャネルに結合し活性化させることにより、細胞内にカルシウムが流入することが知られている（例えば、非特許文献１を参照）。

【0003】

このような機構は、筋細胞や神経細胞のような興奮細胞のみならず、血球細胞、上皮細胞、内皮細胞等の非興奮性細胞にも備わっている普遍的な機構である。この機構により、カルシウムが枯渇した小胞体にカルシウムが再充填されるが、持続的細胞内カルシウムシグナルの発生にも関与する。上記機構は、例えば、筋肉細胞のような興奮細胞の場合、小胞体内のカルシウム濃度を高く維持できるので、筋肉の収縮弛緩に重要な役割を果たしており、一方、免疫細胞のような非興奮性細胞の場合、細胞内カルシウムが持続的に上昇するため、炎症性サイトカインの分泌や成熟化等に重要な機構である。

【0004】

ＳＯＣＥの持続的な活性の亢進は様々な病態と関係していることが知られている。特に、心不全、癌、アレルギー性疾患、肺高血圧症、自己免疫疾患、線維化症等の病態では、ＳＯＣＥ活性が亢進していることが報告されているため、ＳＯＣＥ活性を抑制することにより、これらの疾病を治療できる可能性も考えられている。

【0005】

ＳＯＣＥに関わるＳＴＩＭ分子には、ＳＴＩＭ１とＳＴＩＭ２という二つのサブタイプが存在していることが知られており、それぞれ複数のスプライシング変異体を有している。特にＳＴＩＭ２遺伝子は、選択的スプライシングにより、ＳＴＩＭ２．１又はＳｔｉｍ２．２が生成される（例えば非特許文献２及び３を参照）。なお、ＳＴＩＭ２．１はＳＯＣＥを抑制し、ＳＴＩＭ２．２はＳＯＣＥを活性化することが知られている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，２０１０ Ｎｏｖ １６；３（１４８）：ｐｅ４２．

【非特許文献2】Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１５ Ａｐｒ ２１；Ｖｏｌ．６，ｐ１－１２．

【非特許文献3】Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅｒｃｈ，２０１９ Ｎｏｖ ３０；Ｖｏｌ．６８（ｓｕｐｐｌ ２）：Ｓ１６５－Ｓ１７２．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

上記の通り、ＳＴＩＭ分子はＳＯＣＥ活性に関連するため、例えば従来のＳＴＩＭ阻害剤等の化合物を利用して、ＳＯＣＥを抑制することによって上記疾病を治療することも考えられるが、このような化合物を利用すると、ＳＯＣＥを抑制するＳＴＩＭ２．１の作用も抑制するおそれがあり、さらには予測できない副作用が生じるおそれも考えられるため、臨床応用するのは難しい。

【0008】

本発明は前記問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、従来のＳＴＩＭ阻害剤を用いること無く、ＳＯＣＥを抑制できて、ＳＯＣＥの異常な亢進に起因する疾病（ＳＯＣＥ異常症）を治療又は予防できるようにすることにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、ＳＴＩＭ２のスプライシングを制御する因子としてのｈｎＲＮＰ Ｍが、ＳＴＩＭ２のプレｍＲＮＡのイントロン９に結合することで、特にＳＴＩＭ２．２を生成させる選択的スプライシングが生じる一方で、当該因子が結合できない場合、特にＳＴＩＭ２．１の発現が増大し且つＳＴＩＭ２．２の発現が低減することを見出して本発明を完成した。

【0010】

具体的に、本発明に係るＳＯＣＥ異常症を治療又は予防するための医薬組成物は、ＳＴＩＭ２のプレｍＲＮＡのイントロン９に結合可能なオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする。

【0011】

本発明に係る医薬組成物によると、ＳＴＩＭ２のプレｍＲＮＡのイントロン９に結合可能なオリゴヌクレオチドを含むため、当該オリゴヌクレオチドが、ＳＴＩＭ２のイントロン９に対するスプライシング制御因子であるｈｎＲＮＰ Ｍの結合を阻害するので、ＳＴＩＭ２の正常なスプライシングを阻害する。これにより、ＳＯＣＥを活性化するＳＴＩＭ２．２の発現が低減し、一方ＳＯＣＥを抑制するＳＴＩＭ２．１の発現が増大して、ＳＯＣＥが亢進する細胞においてＳＯＣＥを抑制することができる。その結果、ＳＯＣＥ活性の異常な亢進に起因するＳＯＣＥ異常症を治療又は予防することができる。

【0012】

本発明に係る医薬組成物において、前記オリゴヌクレオチドは、ｈｎＲＮＰ ＭがＳＴＩＭ２のプレｍＲＮＡのイントロン９に結合することを競合的阻害するものであり得る。

【0013】

本発明に係る医薬組成物において、前記オリゴヌクレオチドは、ＡＴＣＣＴＡＣＴの配列を含むものであってもよい。

【0014】

本発明に係る医薬組成物において、前記オリゴヌクレオチドは、ＣＡＡＡＴＣＣＴＡＣＴＧＣ（配列番号１）、ＡＴＣＣＴＡＣＴＧＣＧＡＴ（配列番号２）、又はＴＡＣＡＡＡＴＣＣＴＡＣＴ（配列番号３）のいずれかの配列を含むものであってもよい。

【0015】

本発明に係る医薬組成物において、前記ＳＯＣＥ異常症は、例えば心不全である。

【発明の効果】

【0016】

本発明に係るＳＯＣＥ異常症を治療又は予防するための医薬組成物によると、ＳＴＩＭのスプライシングを制御することにより、ＳＯＣＥを抑制するＳＴＩＭ２．１の発現を増大させることでＳＯＣＥ活性の異常な亢進を抑制できるため、当該ＳＯＣＥの異常な亢進に起因する疾病（ＳＯＣＥ異常症）を治療又は予防できる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１は、ＳＴＩＭ２の選択的スプライシングを説明するためのモデル図である。

【図2】図２は、本発明の一実施形態に係る医薬組成物に含まれるオリゴヌクレオチドの作用を説明するためのモデル図である。

【図3】図３は、実施例１において行ったマウス心臓の抽出液から得たサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥによりポリアクリルアミドゲル上で分離し、ゲルを銀染色した結果を示す写真である。

【図4】図４は、ＳＴＩＭ２のプレｍＲＮＡ上のイントロン９の塩基配列を示し、ｈｎＲＮＰ Ｍが結合可能と考えられる配列部位を示す図である。

【図5】図５の（ａ）は、実施例３において行った電気泳動のゲル写真であり、図５の（ｂ）は、（ａ）の結果から総Ｓｔｉｍ２ＲＮＡのうちのＳｔｉｍ２．１の量比を定量した結果を示すグラフである。

【図6】図６の（ａ）は、実施例４において行った電気泳動のゲル写真であり、図６の（ｂ）は、（ａ）の結果から総Ｓｔｉｍ２量に対するＳｔｉｍ２．１の量比を定量した結果を示すグラフである。

【図7】図７は、実施例５において行ったＳＯＣＥ活性の測定結果を示すグラフである。

【図8】図８は、実施例６において行ったマウスの心機能評価の結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0018】

以下、本発明を実施するための形態を説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。

【0019】

本発明の一実施形態は、ＳＯＣＥ異常症を治療又は予防するための医薬組成物であり、ＳＴＩＭ２のプレｍＲＮＡのイントロン９に結合可能なオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするものである。

【0020】

本実施形態において、ＳＯＣＥ異常症とは、ＳＯＣＥの持続的な活性の亢進に関連する疾患を意味し、例えば心不全、癌、アレルギー性疾患（アトピー性皮膚炎等）、肺高血圧症、自己免疫疾患、及び線維化症等を含む。

【0021】

本実施形態において、ＳＴＩＭ２は、ＳＴＩＭ（Ｓｔｒｏｍａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）分子のサブユニットである。図１に示すように、ＳＴＩＭ２のプレｍＲＮＡは選択的スプライシングを受けることで、ＳＴＩＭ２．１又はＳＴＩＭ２．２が生成される。具体的に、ＳＴＩＭ２のプレｍＲＮＡにおいて、エクソン９を含むようにスプライシングされた場合は、ＳＴＩＭ２．１が生成され、エクソン９を含まないようにスプライシングされた場合は、ＳＴＩＭ２．２が生成される。これらのうちＳＴＩＭ２．１はＳＯＣＥを抑制する一方、ＳＴＩＭ２．２はＳＯＣＥを活性化することが知られている。

【0022】

上記のような選択的スプライシングには、スプライシング調節因子であるｈｎＲＮＰ Ｍが関与していることが本発明者らにより今回見出された。具体的に、後の実施例にて詳細に説明するが、ｈｎＲＮＰ ＭがＳＴＩＭ２のプレｍＲＮＡにおけるイントロン９に結合すると、エクソン９の取り込みが抑制され、すなわちエクソン９を含まないような選択的スプライシングがなされる。その結果、ＳＴＩＭ２．１の生成が減少し、一方ＳＴＩＭ２．２の生成が増大することとなる。そうして、ＳＯＣＥが活性化することとなる。

【0023】

本実施形態に係る医薬組成物は、このようなＳＴＩＭ２．１が減少する一方でＳＴＩＭ２．２が増大するような選択的スプライシングを阻害して、ＳＴＩＭ２．１の生成を増大させることによってＳＯＣＥを抑制するために、ｈｎＲＮＡ ＭがＳＴＩＭ２のプレｍＲＮＡにおけるイントロン９に結合するのを阻害するオリゴヌクレオチドを含む。該オリゴヌクレオチドは、ＳＴＩＭ２のプレｍＲＮＡのイントロン９に結合可能なオリゴヌクレオチドであり、すなわち該イントロン９のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。該オリゴヌクレオチドは、ＳＴＩＭ２のプレｍＲＮＡのイントロン９に結合することによって、ｈｎＲＮＡ Ｍがイントロン９に結合することを阻害する。従って、オリゴヌクレオチドは、ＳＴＩＭ２のプレｍＲＮＡのイントロン９のうち特にｈｎＲＮＡ Ｍが結合する配列に、結合することが好ましい。これにより、ｈｎＲＮＰ ＭがＳＴＩＭ２のプレｍＲＮＡのイントロン９に結合することを競合的に阻害することができる。

【0024】

後の実施例で詳細に説明するが、ｈｎＲＮＰ Ｍは、ＳＴＩＭ２のプレｍＲＮＡのイントロン９のうちＡＧＴＡＧＧＡＴの配列に結合すると考えられるため、オリゴヌクレオチドはその配列に相補的な配列であるＡＴＣＣＴＡＣＴの配列を含むことが好ましい。さらに、オリゴヌクレオチドは、ＣＡＡＡＴＣＣＴＡＣＴＧＣ（配列番号１）、ＡＴＣＣＴＡＣＴＧＣＧＡＴ（配列番号２）、又はＴＡＣＡＡＡＴＣＣＴＡＣＴ（配列番号３）の配列を含むことが好ましい。

【0025】

オリゴヌクレオチドは、本技術分野において通常用いられる化学的又は生物学的技術を利用して作製することができ、特に化学的な固相法を利用することで簡便に合成可能である。オリゴヌクレオチドは、例えば周知のホスホロアミダイト法等を利用して合成することができる。

【0026】

本実施形態に係る医薬組成物は、上記のようなオリゴヌクレオチドを含むものであればよく、その含有量は特に制限されない。例えば、オリゴヌクレオチドは、以下に限定されないが、医薬組成物の全重量を基準として、５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、９５重量％又は１００重量％で含まれるものとすることができる。なお本実施形態に係る医薬組成物がオリゴヌクレオチドを１００重量％で含まない場合には、それ以外の成分として、後述する製剤添加物を含むことができる。また、オリゴヌクレオチドは、生体内での安定性の向上等のために、本技術分野において通常行われ得る修飾がなされていてもよく、ＰＥＧ等とともにコンジュゲートを形成した形態であってもよい。

【0027】

本実施形態において医薬組成物の剤形は特に制限されない。例えば経口薬とすることができるし、注射薬とすることもできる。経口薬としては、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、水剤もしくは舌下剤などが挙げられるが、これらに限定されない。また本実施形態に係る医薬組成物の投与方法は特に制限されず、経口投与および非経口投与から選択することができる。

【0028】

本実施形態に係る医薬組成物は、オリゴヌクレオチドと医薬的に許容し得る製剤添加物とを組み合わせて、それらを公知の方法で製剤化することができる。例えば、オリゴヌクレオチドに、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、および結合剤などを適宜組み合わせて製剤化することができる。このようにして製剤化した医薬組成物は、例えば経口投与用又は注射投与用として用いることができる。なお製剤添加物は上記の例に制限されず、当技術分野において使用される製剤添加物として考えられるものは全て含まれる。

【実施例0029】

以下に、本発明に係るＳＴＩＭ２のプレｍＲＮＡのイントロン９に結合可能なオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物について詳細に説明するための実施例を示す。

【0030】

実施例１：スプライシング調節因子の同定
まず、ＳＴＩＭ２分子のスプライシングを調節する因子の同定を以下に示す通りに行った。

【0031】

スプライシング調節因子は特定のエクソンの前後のイントロンに結合し、当該エクソンの包含を促進したり抑制したりすることが知られている。従って、ＳＴＩＭ２のプレｍＲＮＡの特にイントロン８及びイントロン９上に結合するスプライシング調節因子をＲＮＡプルダウン法と質量分析とを組み合わせることで同定を行った。そのためにまず、マウスゲノムＤＮＡからＳＴＩＭ２のイントロン８及びイントロン９をＴ７プロモーターの配列が組み込まれたオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲ法により増幅し、クローニングベクターｐＴＡ２ベクターに挿入した。その後、Ｔ７プロモーターとマウスＳＴＩＭ２のイントロン８及びイントロン９の配列のみを制限酵素により切り出し、精製を行った。精製したＴ７プロモーターとマウスＳＴＩＭ２のイントロン８及びイントロン９をＣＵＧＡ（登録商標）７ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ニッポン・ジーン社製）を用いてＲＮＡを合成した。合成したＲＮＡをＰｉｅｒｃｅ ＲＮＡ ３’ Ｅｎｄ Ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いデチオビオチン標識化し、Ｐｉｅｒｃｅ Ｍａｇｎｅｔｉｃ ＲＮＡ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｌｌ－Ｄｏｗｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて心臓に圧負荷を与える横行大動脈縮窄術又は偽手術を施し１週間経過したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス心臓の抽出液から結合タンパク質を特異的に回収した。回収したサンプルはＳＤＳ－ＰＡＧＥによりポリアクリルアミドゲル上で分離し、ゲルを銀染色ＭＳキット（富士フイルム和光純薬社製）にて銀染色し圧負荷により増加・減少するバンドを切り出した。切り出したゲル断片は脱色し、システイン残基の還元処理及びアルキル化などを行い、トリプシンによりゲル内消化を施した。消化されたペプチド断片を抽出し、脱塩処理の後、ｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳで質量を測定した。電気泳動の結果を図３に示す。

【0032】

図３において、ＴＡＣは横行大動脈縮窄術を施したマウス心臓抽出液から得たサンプル、Ｓｈａｍは偽手術を施したマウス心臓抽出液から得たサンプルの結果である。これらを比較して、特にＮｏ．１、２及び５のバンドにおいて変化が見られた。これらのバンドについて、質量分析した結果、Ｎｏ．５がｈｎＲＮＰ Ｍであることが分かった。

【0033】

実施例２：ＳＴＩＭ２プレＲＮＡのイントロン９におけるｈｎＲＮＰ Ｍの結合部位の推定
次に、同定されたｈｎＲＮＰ Ｍが、ＳＴＩＭ２プレＲＮＡのイントロン９のどの部位に結合するかについて、以下の通りに調べた。

【0034】

インターネット上で提供されている任意のＲＮＡ配列上に結合するＲＮＡ結合タンパク質の候補を提示するサービスであるＲＢＰｍａｐ（Ｐａｚ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１４）を用い、ＳＴＩＭ２のプレｍＲＮＡのイントロン９（配列番号４、図４を参照）上に結合するｈｎＲＮＰ Ｍの結合配列を予測した。その結果、ｈｎＲＮＰ Ｍの結合配列はＧＧＴＴＧＧＴＴであったため、ＳＴＩＭ２のプレｍＲＮＡ上のイントロン９の塩基配列で結合可能な箇所が、５か所あることが分かった（図４の四角で囲まれた配列）。

【0035】

実施例３：ｈｎＲＮＰ Ｍの結合部位の同定
まず、ＳＴＩＭ２のプレｍＲＮＡのイントロン９上のｈｎＲＮＰ Ｍ結合部位を同定するためにＳＴＩＭ２ミニ遺伝子を作製した。マウスゲノムＤＮＡを鋳型にＳＴＩＭ２のエクソン８からエクソン１０のＤＮＡ配列をオリゴＤＮＡを用いて常法で増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターにクローニングした。作製したｐｃＤＮＡ３．１－ｍＳＴＩＭ２ミニ遺伝子を鋳型に、予測された結合部位５か所（図４において四角で囲まれた配列）それぞれのＧをＣに、ＴをＡに置換する部位特異的変異導入をＰＣＲにより行い、部位置換した変異体５つのミニ遺伝子を作製した。また、マウスｃＤＮＡを鋳型に、マウスｈｎＲＮＡ ＭをＰＣＲにより増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングしてマウスｈｎＲＮＡ Ｍ発現ベクター作製した。

【0036】

マウス横紋筋由来筋芽細胞株であるＣ２Ｃ１２細胞を、終濃度１０％ＦＢＳを添加したダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で３７℃、５％ＣＯ_２存在下で培養し、６ウェルプレート上に５×１０^４細胞になるように継代した。２４時間後、変異体を含む作製したｐｃＤＮＡ３．１－ｍＳＴＩＭ２ミニ遺伝子とｐｃＤＮＡ３．１－ｍｈｎＲＮＰ Ｍをそれぞれ１μｇずつＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００遺伝子導入試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて遺伝子導入し、終濃度２％になるようにＦＢＳを添加したダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で２４時間培養した。培養後、内在性のＳＴＩＭ２ ｍＲＮＡを除外する目的でＳＴＩＭ２ ｓｉＲＮＡ（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｒｅ－Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｓｉＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ ＩＤ：ｓ１００２９１，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１０μＭをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて導入した。４８時間培養後、ＲＮＡｚｏｌ ＲＴ ＲＮＡ単離試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ 社製）によりＲＮＡを単離精製し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製）を使用し逆転写を行った。合成した１０ｎｇのｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、ＳＴＩＭ２．１およびＳＴＩＭ２．２の検出を行った。ＰＣＲ反応は９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を３５サイクル行い増幅した。増幅したＤＮＡを３％アガロースゲルで電気泳動を行いエチジウムブロマイドによりＤＮＡを染色し検出した。その結果を図５に示す。図５の（ａ）は電気泳動のゲル写真であり、（ｂ）は（ａ）の電気泳動により得られたバンドの強度から総Ｓｔｉｍ２ＲＮＡのうちのＳｔｉｍ２．１の量比を定量した結果を示すものであり、変異１～５は、それぞれ図４の四角１～５に囲まれた配列に変異を入れた場合の結果である。

【0037】

図５に示すように、結合可能な箇所の５か所いずれかに変異を導入して、それぞれのスプライシング効率を比較検討すると、２つ目の位置に変異を入れたＳＴＩＭ２のみ、顕著にＳｔｉｍ２．１の発現量が多く、すなわちエクソン９を除くようなスプライシングが抑制された。このことから、２番目の結合可能配列がｈｎＲＮＰ Ｍの結合箇所と考えられた。

【0038】

実施例４：アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＳＴＩＭ２のスプライシング制御に与える影響の検討
ＳＴＩＭ２の上記２番目の結合可能配列がｈｎＲＮＰ Ｍの結合箇所と考えられるため、この結合を阻害できるアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製した。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして、結合可能配列に対応するＡＴＣＣＴＡＣＴの両端にそれぞれ３塩基及び２塩基加えた「ＣＡＡＡＴＣＣＴＡＣＴＧＣ」（アンチセンスオリゴ１：配列番号１）、ＡＴＣＣＴＡＣＴの一方に５塩基加えた「ＡＴＣＣＴＡＣＴＧＣＧＡＴ」（アンチセンスオリゴ２：配列番号２）、ＡＴＣＣＴＡＣＴの他方に５塩基加えた「ＴＡＣＡＡＡＴＣＣＴＡＣＴ」（アンチセンスオリゴ３：配列番号３）を作製した。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドによってＳＴＩＭ２のスプライシング制御に影響があるかについて調べるために、以下の通り試験をした。

【0039】

マウス横紋筋由来筋芽細胞株であるＣ２Ｃ１２細胞を終濃度１０％ＦＢＳを添加したダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で３７℃、５％ＣＯ_２存在下で培養し、６ウェルプレート上に５×１０^４細胞になるように継代した。２４時間後、ｐｃＤＮＡ３．１－ｍｈｎＲＮＰ Ｍを１μｇ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００遺伝子導入試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて遺伝子導入し、終濃度２％になるようにＦＢＳを添加したダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で２４時間培養した。培養後、上記のアンチセンスオリゴ１～３又はコントロールのスクランブルオリゴヌクレオチド
（ＣＡＡＡＴＣＣＴＡＣＴＧＣ：配列番号５）１μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００遺伝子導入試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて導入した。４８時間培養後、ＲＮＡｚｏｌ ＲＴ ＲＮＡ単離試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ 社製）によりＲＮＡを単離精製し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製）を使用し逆転写を行った。合成した１０ｎｇのｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、ＳＴＩＭ２．１およびＳＴＩＭ２．２の検出を行った。ＰＣＲ反応は９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を３５サイクル行い増幅した。増幅したＤＮＡを３％アガロースゲルで電気泳動を行いエチジウムブロマイドによりＤＮＡを染色し検出した。その結果を図６に示す。図６の（ａ）は電気泳動のゲル写真であり、（ｂ）は（ａ）の電気泳動で得られたバンドの強度から総Ｓｔｉｍ２量に対するＳｔｉｍ２．１の量比を定量した結果を示す。

【0040】

図６に示すように、スクランブルオリゴヌクレオチドを処理した場合と比較して、アンチセンスオリゴ１～３を処理した場合、ＳＴＩＭ２．１のＳＴＩＭ２．２に対する比率が増加し、ＳＴＩＭ２のスプライシング制御が確認できた。すなわち、上記結合可能配列に対応するＡＴＣＣＴＡＣＴを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドによって、スプライシング制御ができて、ＳＴＩＭ２．２の発現を抑制し、ＳＴＩＭ２．１の発現を増大することができる。

【0041】

実施例５：アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＳＯＣＥ活性への影響の検討
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドによってスプライシング制御ができたため、次に当該オリゴヌクレオチドがＳＯＣＥ活性に影響を与えるかについて検討した。その試験について以下に説明する。

【0042】

Ｃ２Ｃ１２細胞に対して、実施例４の試験と同様にアンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴ１）又はスクランブルオリゴヌクレオチドを遺伝子導入してから４８時間培養後、２ｍＭのＣａＣｌ_２、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１１５ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、０．３４ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、０．４４ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、４．１７ｍＭのＮａＨＣＯ_３、０．８ｍＭのＭｇＣｌ_２を含む培地で洗浄し、細胞内カルシウムイオン測定試薬であるＦｌｕｏ ４－ＡＭ（同仁化学研究所社製）２μＭを３０分間細胞培養用インキュベーター内で取り込ませ、その後Ｃａ^２＋を含まない２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１１５ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、０．３４ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、０．４４ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、４．１７ｍＭのＮａＨＣＯ_３、０．８ｍＭのＭｇＣｌ_２を含む培地で洗浄し、オールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ７００（キーエンス社製）にてカルシウムイオン動態を５秒間隔で測定した。測定開始から１分後に、小胞体へのカルシウムの取り込みを阻害する終濃度１μＭタプシガルギンを含む培地を添加し、測定開始から１６分後に終濃度１μＭタプシガルギン、２ｍＭのＣａＣｌ_２を含む培地を添加しＳＯＣＥ活性を測定した。その結果を図７に示す。なお、ＳＯＣＥ活性を測定は、オールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ７００で５秒間隔で細胞を撮影し、撮影した画像の細胞一つ一つに対してＦｌｕｏ ４－ＡＭで発せられる蛍光強度で計測した。図７のグラフは、測定開始時（Ｆ０）の値で以降の時間で得られた画像の蛍光強度で割った値（Ｆ／Ｆ０）を時間軸でプロットしたものである。

【0043】

細胞内でカルシウムイオンを貯蔵する小胞体からのカルシウムイオンの細胞質への放出は自然に行われるため、小胞体へのカルシウムイオンの取り込みのみをタプシガルギンで抑制することで小胞体内のカルシウムイオンを枯渇することができる。図７のグラフにおいて、測定開始から５分の時点で見られるピークは小胞体のカルシウムイオンが細胞質へ放出されたために増加したことを示している。細胞質へ放出されたカルシウムイオンは細胞外へ排出され、小胞体への取り込みは阻害されているため、測定開始から１５分で蛍光強度は測定開始時のレベルに落ち着く。この際、ＳＴＩＭとＯＲＡＩ１のポアが形成されていると考えられ、測定培地中にカルシウムイオンを添加することで細胞内へＳＯＣＥとしてカルシウムイオンが取り込まれ、この際のカルシウムイオンの取り込みが蛍光強度の増加として測定されている。

【0044】

図７に示すように、スクランブルオリゴヌクレオチドを導入した場合と比較して、アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入することにより、測定培地中へのカルシウムイオン添加後のＳＯＣＥは抑制された。これは、ｈｎＲＮＰ ＭがＳＴＩＭ２のイントロン９に結合するのをアンチセンスオリゴヌクレオチドが抑制することにより、エクソン９を含有するＳＴＩＭ２．１の割合が増加するためであると考えられる。すなわち、ＳＯＣＥを抑制するＳＴＩＭ２．１の比率が上昇することにより、ＳＯＣＥが抑制されたためと考えられる。

【0045】

実施例６：マウス心不全モデルにおけるアンチセンスオリゴによる治療効果の検討）
上述の通り、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより、スプライシング制御によりＳＯＣＥを抑制するＳＴＩＭ２．１の発現を増大できることがわかったため、次に、実際にＳＯＣＥの異常な亢進に起因する疾病に対して治療効果が見られるかを検討した。ここでは、マウスモデルを用いて心不全の治療効果について評価した。以下にその試験について説明する。

【0046】

Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに上記のアンチセンスオリゴ１又はコントロールとしてのスクランブルオリゴヌクレオチドを０．３ｍｇ／ｋｇとなるよう手術３日前に尾静脈から投与した。アンチセンスオリゴ１及びスクランブルオリゴヌクレオチドはマウス生体内細胞用ｓｉＲＮＡ導入試薬であるＴｒａｎｓＩＴ－ＱＲ Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｉｒｕｓ社製）を用いて投与した。マウス心不全モデルは横行大動脈縮窄術による心臓圧負荷モデルを先のマウスに施すことにより作製した。本施術では首下の皮膚からの切開、胸骨舌骨筋および胸骨頭筋下から切断なしに気管を露出させ胸骨の一部を切断することにより大動脈弓を露出させ６－０の非吸収性縫合糸で縮窄し、左心室に負荷を与え心肥大及び心不全を誘導する。手術は三種混合麻酔薬（１０ｍｌ／ｋｇ，ｉｐ）投与下で行った。手術２週間後に再度アンチセンスオリゴ１又はスクランブルオリゴヌクレオチドを０．３ｍｇ／ｋｇとなるよう同様に尾静脈から投与した。手術４週間後の心機能を超音波診断装置ＳＳＡ－６６０Ａ Ｘａｒｉｏ（東芝メディカルシステムズ社製）を用いて評価した。なお、評価の指標には、左室内径拡張期（ＬＶＩＤ；ｄ）、左室内径収縮期（ＬＶＩＤ；ｓ）及び左室内径短縮率（ＦＳ）を用いた。その結果を図８に示す。

【0047】

図８に示すように、スクランブルオリゴヌクレオチドを投与した場合と比較して、アンチセンスオリゴ１を投与した場合、左室内径収縮期が小さくなり、左室内径短縮率が増大し、すなわち心機能が改善した。このため、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、心不全等の心疾患の治療や予防に効果があると考えられる。

【0048】

以上の結果より、本発明に係るオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物によると、ＳＴＩＭ分子を抑制することでＳＯＣＥ活性の異常な亢進を抑制できるため、当該ＳＯＣＥの異常な亢進に起因する疾病（ＳＯＣＥ異常症）を治療又は予防できる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

2024055041000001.xml