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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024055461
(43)【公開日】2024-04-18
(54)【発明の名称】ＴＳＨ受容体阻害活性の測定方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20240411BHJP
C12Q 1/26 20060101ALI20240411BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 N
C12Q1/26
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022162408
(22)【出願日】2022-10-07
(71)【出願人】
【識別番号】000006770
【氏名又は名称】ヤマサ醤油株式会社
(72)【発明者】
【氏名】保科 元気
(72)【発明者】
【氏名】太田 賢志
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QQ63
4B063QR02
4B063QR48
4B063QS28
4B063QS36
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】本発明の課題は、ＴＳＢＡｂ活性測定において、これまで原理上不可避と考えられてきたＴＳＨ受容体刺激活性高値の検体でも、実態に即したＴＳＨ受容体阻害活性を評価できる、新規かつ有用な測定系を提供することにある。
【解決手段】 本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性の測定値をＴＳＨ受容体刺激活性測定値で補正することにより、ＴＳＨ受容体刺激活性高値の検体においても実態に即したＴＳＨ受容体阻害活性を評価できる測定系を見出した。
【選択図】なし
【解決手段】 本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性の測定値をＴＳＨ受容体刺激活性測定値で補正することにより、ＴＳＨ受容体刺激活性高値の検体においても実態に即したＴＳＨ受容体阻害活性を評価できる測定系を見出した。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の工程（ａ）～（ｄ）を含むことを特徴とする、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体受容体阻害活性の測定方法。
（ａ）見かけ上のＴＳＢＡｂ活性を測定する工程；
（ｂ）工程（ａ）にて見かけ上のＴＳＢＡｂ活性を測定した試料のＴＳＨ受容体刺激活性を測定する工程；
（ｃ）以下の計算式によって阻害活性指標（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｉｎｄｅｘ：ＢＩ）を算出する工程
Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｉｎｄｅｘ（ＢＩ）＝（工程（ａ）の測定値）／（工程（ｂ）の測定値）；
（ｄ）ＢＩの高低によってＴＳＨ受容体阻害活性の強弱を判定する工程；
（ａ）見かけ上のＴＳＢＡｂ活性を測定する工程；
（ｂ）工程（ａ）にて見かけ上のＴＳＢＡｂ活性を測定した試料のＴＳＨ受容体刺激活性を測定する工程；
（ｃ）以下の計算式によって阻害活性指標（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｉｎｄｅｘ：ＢＩ）を算出する工程
Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｉｎｄｅｘ（ＢＩ）＝（工程（ａ）の測定値）／（工程（ｂ）の測定値）；
（ｄ）ＢＩの高低によってＴＳＨ受容体阻害活性の強弱を判定する工程；
【請求項2】
ＴＳＨ受容体阻害型自己抗体の活性の高低をＢＩとして評価することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＢＩが閾値以上であった場合に、測定に供した試料がＴＳＨ受容体阻害型自己抗体陽性であると判定することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
ＢＩの高低によって、ＴＳＨ受容体刺激性又は阻害性自己抗体に起因する甲状腺疾患の診断、診断の補助、病状把握、または予後予測を行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
工程（ａ）の測定と工程（ｂ）の測定が、同じ測定原理によって行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
工程（ａ）の測定と工程（ｂ）の測定が、細胞中のｃＡＭＰレベルをｃＡＭＰバイオセンサーによって測定されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
工程（ｃ）に代わり、以下の工程（ｃ）’を行うことを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
（ｃ’）以下の計算式によって阻害活性指標ＢＩ’を算出する工程
ＢＩ’＝（工程（ａ）の測定値）／（工程（ｂ）の測定値）ｎ (０．７５≦ｎ≦２．０)；
（ｃ’）以下の計算式によって阻害活性指標ＢＩ’を算出する工程
ＢＩ’＝（工程（ａ）の測定値）／（工程（ｂ）の測定値）ｎ (０．７５≦ｎ≦２．０)；
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、実態に即した甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ；Thyroid Stimulating Hormone）受容体の阻害活性測定が可能な測定方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ＴＳＨ受容体は、甲状腺細胞膜上に存在するＴＳＨの受容体である。脳下垂体から分泌されたＴＳＨがＴＳＨ受容体に結合すると、その刺激により甲状腺ホルモンＴ３またはＴ４の分泌及び合成が行われる。
【0003】
甲状腺疾患の代表例であるバセドウ病（Basedow病；グレーブス病［Graves' disease］ともいう）は、ＴＳＨ受容体に対して刺激活性を有する自己抗体（Thyroid Stimulation Antibody；ＴＳＡｂ）が原因となって発症する疾患である。バセドウ病患者においては、ＴＳＡｂが、ＴＳＨ受容体を過剰に刺激することにより、甲状腺機能が亢進する。
【0004】
一方、ＴＳＨ受容体に対するＴＳＨの刺激活性を阻害する自己抗体（Thyroid Stimulation Blocking Antibody;ＴＳＢＡｂ）の存在も知られており、原発性粘液水腫（萎縮性甲状腺炎）やバセドウ病治療中で甲状腺機能低下症となった患者の一部などで検出される。ＴＳＨ受容体へのＴＳＨ刺激を阻害する性質から、ＴＳＢＡｂは甲状腺機能低下症の原因の一つと考えられている。
【0005】
甲状腺疾患患者の血液試料中のＴＳＡｂ活性を測定する方法として、例えば、ブタ甲状腺細胞を、当該患者由来の血清存在下でインキュベートし、血清中に含まれるＴＳＡｂが、ブタ甲状腺細胞膜上に存在するＴＳＨ受容体を刺激することにより産生される環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の量を測定することにより、ＴＳＡｂ活性を測定する方法が知られている。このとき、血清中には内因性ｃＡＭＰが含まれていることから、正確な定量を行うために、活性炭を用いた前処理により、内因性ｃＡＭＰの除去が行われていた（特許文献１）。同様の測定原理を応用して、ＴＳＨ添加または非添加条件における血清試料をブタ甲状腺細胞と反応させ、産生するｃＡＭＰ量を測定することで、ＴＳＨ刺激に対する阻害活性（ＴＳＢＡｂ活性）を測定する方法が知られている（非特許文献１）。しかしながら、特許文献１や非特許文献１記載のバイオアッセイにおいては、甲状腺疾患患者の血液試料、及びブタ甲状腺細胞のインキュベーション工程と、産生されたｃＡＭＰの量を測定する工程の両工程で、合計５～６時間要することから、迅速化が課題とされていた。
【0006】
近年、特許文献１記載のバイオアッセイの改良法として、カルシウムイオンを介した発光によってｃＡＭＰ等のシグナルを検出するバイオアッセイ系と、それを利用したＴＳＡｂの測定法が報告されている（特許文献２～４）。しかしながら、これらの方法には、１）依然として前処理を必要とすること、２）時間短縮は図られているものの依然として４時間程度要すること、３）バセドウ病眼症を精度良く判定できるか否か明らかでないこと、等の問題点があり、必ずしも満足できる方法とはなりえなかった。
【0007】
最近、これらの課題を克服するさらなる改良法として、ｃＡＭＰと結合して構造変化する改変型ルシフェラーゼを用いてｃＡＭＰシグナルを検出するバイオアッセイ系と、それを利用したＴＳＡｂ測定法が報告された（特許文献５）。この方法によって、前処理不要で、６０分以内でＴＳＡｂ活性を測定することが可能となった。また、この方法により未治療バセドウ病やバセドウ病眼症の精度の高い判定も可能と報告されている（非特許文献２）。
【0008】
上記ｃＡＭＰと結合して構造変化する改変型ルシフェラーゼを用いてｃＡＭＰシグナルを検出するバイオアッセイ系を応用して、ＴＳＢＡｂの活性を測定することもできる。具体的には、ＴＳＨ添加または非添加条件における血清試料をＴＳＨ受容体および改変型ルシフェラーゼ共発現細胞と反応させ、産生するｃＡＭＰ量をルシフェラーゼ活性として測定することで、血清試料にＴＳＢＡｂが含まれている場合、ＴＳＨ添加によるルシフェラーゼ活性上昇が阻害される。この阻害の程度をＴＳＢＡｂ活性として測定する。
【0009】
上記の測定法をはじめとして、ＴＳＢＡｂ活性測定法においては、ＴＳＨ受容体を発現させた動物細胞とＴＳＨ受容体の活性化状態を測定できる系を用いて、ＴＳＨ受容体の刺激活性の抑制の程度を測定することで、ＴＳＨ受容体の阻害活性を測定する方法が汎用されている。これは、ＴＳＢＡｂ活性は複合的な要因から生じるものであるため、特定の物質の存在量を測定するような方法では、正確な活性が測定できないことに起因する。
【0010】
一方、ＴＳＢＡｂ活性測定においては、迅速化の課題に加え、ＴＳＡｂ活性が高くなるに従い、ＴＳＢＡｂ活性も上昇する現象が知られており、一定のＴＳＡｂ活性以上の検体ではＴＳＢＡｂ活性を評価できないとされていた（非特許文献１）。
【0011】
ｃＡＭＰ産生量を指標としてＴＳＡｂ活性及びＴＳＢＡｂ活性を測定する場合を例に、前記の現象について説明する。以下の説明においては、図１の内容も参照されたい。前述の通り、ＴＳＢＡｂ活性測定法においては、ＴＳＨ添加または非添加条件におけるＴＳＨ受容体の活性化状態の比較から、ＴＳＨ受容体の阻害活性を測定する方法が汎用されている。ここで、ｃＡＭＰ産生量などのＴＳＨ受容体活性化状態の指標は、青天井に測定可能なものではなく、原理上上限が存在する。一定のＴＳＡｂ活性以上の検体では、指標の上限に起因して、ＴＳＡｂ活性測定値が一定の値に漸近してしまう。当該上限付近のＴＳＡｂ活性測定値を基にＴＳＨ受容体の阻害活性を測定しようとする場合、ＴＳＨ受容体の刺激活性の抑制の程度が観測されず、結果としてＴＳＨ添加時の阻害活性を適切に評価できない（図１）。
【0012】
当該現象は、ＴＳＨ受容体の刺激活性の抑制の程度を測定するＴＳＢＡｂ活性測定において、原理上不可避のものと考えられていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0013】
【特許文献1】特開２０１６－７５７０７号公報
【特許文献2】再表２０１１／００１８８５号公報
【特許文献3】特開２０１６－３２４７２号公報
【特許文献4】特開２０１７－１９２３９６号公報
【特許文献5】再表２０２０／０５０２０８号公報
【非特許文献】
【0014】
【非特許文献1】日本甲状腺学会雑誌、２０１８；９：１７２－１７９
【非特許文献2】糖尿病・内分泌代謝科、５３（５）：４７９－４８６，２０２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0015】
本発明の課題は、ＴＳＢＡｂ活性測定において、これまで不正確な測定が原理上不可避と考えられてきたＴＳＨ受容体刺激活性高値の検体でも、実態に即したＴＳＨ受容体阻害活性を評価できる、新規かつ有用な測定系を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0016】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性の測定値を、ＴＳＨ受容体刺激活性測定値で補正することにより、ＴＳＨ受容体刺激活性高値の検体においても実態に即したＴＳＨ受容体阻害活性を評価できる測定系を見出した。
【発明の効果】
【0017】
本発明の測定方法は、ＴＳＨ受容体刺激活性を有する検体や、ＴＳＡｂとＴＳＢＡｂが混在する検体においても、実態に即したＴＳＨ受容体阻害活性を評価できる。
【0018】
本発明の将来的な応用としては、本発明の測定方法を利用することによって、ＴＳＨ受容体阻害活性が関連する免疫疾患の診断、診断の補助、病状把握、予後予測をより正確に行うことが期待される。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】図１は、背景技術に記載された、ＴＳＨ受容体刺激活性が高くなるに従いＴＳＢＡｂ活性が上昇する現象を説明した図である。縦軸は、ｃＡＭＰ産生量を表している。図中、黒色の棒グラフはＴＳＨ非添加時のｃＡＭＰ産生量を表しており、灰色の棒グラフはＴＳＨ添加時のｃＡＭＰ産生量を表している。各棒グラフの下には各試料の特性（正常血清、（１）刺激活性上昇に伴いＴＳＢＡｂ活性が上昇して見える検体、（２）刺激活性高値検体、（３）ＴＳＢＡｂ活性高値検体）を記載している。図中、各棒グラフの下には、各試料のＴＳＨ受容体刺激活性を－（活性なし）～＋＋＋＋（ＴＳＡｂ高値）まで模式的に表している。その下には、当該測定系でＴＳＢＡｂ活性を測定した場合の、（見かけ上の）ＴＳＢＡｂ活性（％）を０～１００％で表している。図中、黒色破線で示したのは細胞によるｃＡＭＰ産生能の上限であり、当該測定系ではこれ以上ｃＡＭＰが産生されず、ｃＡＭＰの産生量が漸近することを表している。図中、灰色の破線部は、ＴＳＨ受容体刺激活性に比例してｃＡＭＰが産生される場合には産生されるはずであったが、実際にはｃＡＭＰ産生能の上限に達してしまったために産生されなかったｃＡＭＰを表している。
【図2】図２は、実施例１または実施例２において、ｃＡＭＰバイオセンサーおよびＴＳＨ受容体の共発現ＨＥＫ２９３細胞を、ＴＳＢＡｂ検体・ＴＳＡｂ検体１・ＴＳＨ添加検体の希釈系列試料および、反応緩衝液またはＴＳＨの存在下で反応させたときの、各試料の見かけ上のＴＳＢＡｂ活性とＳＩ値を示す。図中、縦軸ＴＳＢＡｂ％は実施例１にて測定された見かけ上のＴＳＢＡｂ活性を表す。横軸Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘは実施例２にて測定されたＴＳＨ受容体刺激活性（ＳＩ）を表す。図中、●記号はＴＳＢＡｂ検体の結果を表し、▲記号はＴＳＡｂ検体１の結果を表し、■記号はＴＳＨ添加検体の結果を表す。
【図3】図３は、実施例１または実施例２において、ｃＡＭＰバイオセンサーおよびＴＳＨ受容体の共発現ＨＥＫ２９３細胞を、健常検体・ＴＳＡｂ検体・ＴＳＨ添加検体へＴＳＢＡｂ検体希釈系列を添加した各試料および、反応緩衝液またはＴＳＨの存在下で反応させたときの、各試料の見かけ上のＴＳＢＡｂ活性とＳＩ値を示す。図中、縦軸ＴＳＢＡｂ％は実施例１にて測定された見かけ上のＴＳＢＡｂ活性を表す。横軸Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘは実施例２にて測定されたＴＳＨ受容体刺激活性（ＳＩ）を表す。図中、●記号は健常検体にＴＳＢＡｂ検体希釈系列を添加した試料の結果を表し、▲記号はＴＳＡｂ検体１にＴＳＢＡｂ検体希釈系列を添加した試料の結果を表し、■記号はＴＳＡｂ検体２にＴＳＢＡｂ検体希釈系列を添加した試料の結果を表し、◆記号はｒｈＴＳＨ受容体にＴＳＢＡｂ検体希釈系列を添加した試料の結果を表す。
【図4】図４は、実施例１または実施例３においてｃＡＭＰバイオセンサーおよびＴＳＨ受容体の共発現ＨＥＫ２９３細胞を、ＴＳＡｂ検体希釈系列・ＴＳＨ添加検体希釈系列へ健常検体・ＴＳＢＡｂ検体希釈系列を添加した各試料および、反応緩衝液またはＴＳＨの存在下で反応させたときの、各試料の見かけ上のＴＳＢＡｂ活性とＢＩを示す。図中の縦軸は、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｉｎｄｅｘ（ＢＩ）を表す。横軸は、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性を表す。図中、●記号はＴＳＡｂ検体希釈系列・ＴＳＨ添加検体希釈系列へ健常検体を添加した試料の結果を表し、▲記号はＴＳＡｂ検体希釈系列・ＴＳＨ添加検体希釈系列へ１６倍希釈したＴＳＢＡｂ検体を添加した試料の結果を表し、■記号はＴＳＡｂ検体希釈系列・ＴＳＨ添加検体希釈系列へ４倍希釈したＴＳＢＡｂ検体を添加した試料の結果を表し、◆記号はＴＳＡｂ検体希釈系列・ＴＳＨ添加検体希釈系列へ原液のＴＳＢＡｂ検体を添加した試料の結果を表す。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本発明の測定方法は、以下の工程（ａ）～（ｄ）を含むことを特徴とする、ＴＳＨ受容体阻害活性の測定方法である。
（ａ）見かけ上のＴＳＢＡｂ活性を測定する工程；
（ｂ）工程（ａ）にて見かけ上のＴＳＢＡｂ活性を測定した試料のＴＳＨ受容体刺激活性を測定する工程；
（ｃ）以下の計算式によって阻害活性指標（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｉｎｄｅｘ：ＢＩ）を算出する工程
Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｉｎｄｅｘ（ＢＩ）＝（工程（ａ）の測定値）／（工程（ｂ）の測定値）；
（ｄ）ＢＩの高低によって甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体に対する阻害性自己抗体活性の強弱を判定する工程；
（ａ）見かけ上のＴＳＢＡｂ活性を測定する工程；
（ｂ）工程（ａ）にて見かけ上のＴＳＢＡｂ活性を測定した試料のＴＳＨ受容体刺激活性を測定する工程；
（ｃ）以下の計算式によって阻害活性指標（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｉｎｄｅｘ：ＢＩ）を算出する工程
Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｉｎｄｅｘ（ＢＩ）＝（工程（ａ）の測定値）／（工程（ｂ）の測定値）；
（ｄ）ＢＩの高低によって甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体に対する阻害性自己抗体活性の強弱を判定する工程；
【0021】
本明細書において、「ＴＳＨ受容体阻害型自己抗体」とは、ＴＳＨ受容体を直接的又は間接的に阻害（不活性化）できる自己抗体、例えば、ＴＳＨのＴＳＨ受容体への結合を直接的又は間接的に阻害するアンタゴニスト（例えば、アンタゴニスト作用を有する抗ＴＳＨ受容体抗体［ＴＳＢＡｂ］）を意味する。
【0022】
本明細書において、「ＴＳＨ受容体阻害活性」とは、ＴＳＨ受容体を阻害（不活性化）する活性のことを意味する。定義から明らかであるが、ＴＳＨ受容体阻害型自己抗体はＴＳＨ受容体阻害活性を有する。
【0023】
本明細書において、ＴＳＨ受容体刺激活性測定値によって補正することなく、ＴＳＨ受容体刺激物質添加条件下のＴＳＡｂ活性とＴＳＨ受容体刺激物質非添加条件下のＴＳＡｂ活性とを測定することによって算出されるＴＳＢＡｂ活性のことを、前述の「ＴＳＨ受容体阻害活性」と区別するために、「見かけ上のＴＳＢＡｂ活性」と定義する。「見かけ上のＴＳＢＡｂ活性」は、検体中のＴＳＨ受容体刺激活性が低い場合には、「ＴＳＨ受容体阻害活性」の指標として機能し得るが、一定以上のＴＳＨ受容体刺激活性を有する検体では、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性が上昇してしまい、「ＴＳＨ受容体阻害活性」の指標として機能しないことが知られている。
【0024】
本明細書において、「ＴＳＨ受容体刺激型自己抗体」とは、ＴＳＨ受容体を直接的又は間接的に刺激（活性化）できる自己抗体（すなわち、測定対象の被験者の体内で産生され、かつ、当該被験者の体内に存在するタンパク質等の物質を標的とする抗体）、例えば、ＴＳＨ受容体に結合できるアゴニスト（例えば、アゴニスト作用を有する抗ＴＳＨ受容体抗体［ＴＳＡｂ］）を意味する。
【0025】
本明細書において、「ＴＳＨ受容体刺激活性」とは、ＴＳＨ受容体を直接的又は間接的に刺激（活性化）する活性を意味する。定義から明らかであるが、ＴＳＨ、ＴＳＡｂはＴＳＨ受容体刺激活性を有する。
【0026】
本明細書において、「Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｉｎｄｅｘ（ＢＩ）」とは、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性とＴＳＨ受容体刺激活性測定値を用いて下記式によって算出される、ＴＳＨ受容体阻害活性の指標を意味する。
ＢＩ＝（見かけ上のＴＳＢＡｂ活性の測定値）／（ＴＳＨ受容体刺激活性の測定値）
ＢＩ＝（見かけ上のＴＳＢＡｂ活性の測定値）／（ＴＳＨ受容体刺激活性の測定値）
【0027】
ＢＩは見かけ上のＴＳＨ受容体阻害性自己抗体の活性をＴＳＨ受容体刺激活性測定値で補正したＴＳＨ受容体阻害活性の指標で、ＴＳＨ受容体刺激活性測定値が高ければＢＩが低くなり、逆にＴＳＨ受容体刺激活性測定値が低ければＢＩが高くなることから、ＴＳＨ受容体刺激活性に依存しないＴＳＨ受容体阻害活性を表している。
【0028】
見かけ上のＴＳＢＡｂ活性の測定値及びＴＳＨ受容体刺激活性測定値からＢＩを算出する方法については、後述の本明細書中の記載及び実施例の記載も参照する。
【0029】
ＢＩはＴＳＨ受容体刺激活性に依存しないＴＳＨ受容体阻害活性を反映するため、実態に即したＴＳＨ受容体阻害活性を評価することができ、ＴＳＨ受容体阻害活性を有する検体とＴＳＨ刺激活性を有する検体を判別できる。
【0030】
本明細書において、下記の式によって算出される指標を、ＢＩ’と定義する。
ＢＩ’＝（見かけ上のＴＳＢＡｂ活性の測定値）／（ＴＳＨ受容体刺激活性の測定値）ｎ (０．７５≦ｎ≦２．０)
ＢＩ’＝（見かけ上のＴＳＢＡｂ活性の測定値）／（ＴＳＨ受容体刺激活性の測定値）ｎ (０．７５≦ｎ≦２．０)
【0031】
ＢＩ’は、ＢＩと同様に見かけ上のＴＳＨ受容体阻害性自己抗体の活性をＴＳＨ受容体刺激活性測定値で補正したＴＳＨ受容体阻害活性の指標であるが、ＴＳＨ受容体刺激活性の測定値について、係数ｎが設定されている。ｎを調整することで、補正の強弱等を調整することができる。
【0032】
本明細書において、ＴＳＨ受容体刺激性又は阻害性自己抗体に起因する甲状腺疾患としては、ＴＳＨ受容体刺激性自己抗体又はＴＳＨ受容体阻害性自己抗体によりＴＳＨ受容体が刺激又は阻害され、血液中の遊離型甲状腺ホルモン濃度の上昇又は低下に起因する甲状腺疾患であればよく、例えば、バセドウ病、新生児バセドウ病、甲状腺機能低下症、原発性粘液水腫（萎縮性甲状腺炎）等を挙げることができ、バセドウ病、甲状腺機能低下症、原発性粘液水腫（萎縮性甲状腺炎）を好適に例示することができる。
【0033】
本明細書において、「ｃＡＭＰバイオセンサー」とは、哺乳動物細胞中のｃＡＭＰの産生量及び／又は濃度に依存し、可視化（イメージング）及び／又は定量可能な、自身に由来する指標（例えば、酵素活性レベル、発色レベル、発光［蛍光］レベル）が変化するタンパク質を意味する。上記ｃＡＭＰバイオセンサーは、通常、ｃＡＭＰ結合領域を有し、かかるｃＡＭＰ結合領域にｃＡＭＰが結合することにより、ｃＡＭＰバイオセンサーの立体構造が変化し、不活性化状態から活性化状態への変化、不可視化状態から可視化状態への変化等のアロステリックな効果を有する。
【0034】
本発明における見かけ上のＴＳＢＡｂ活性測定方法について、特に原理が限定されるものではなく、公知の測定方法を利用することができる。ＴＳＨ受容体発現動物細胞によるｃＡＭＰ産生反応とｃＡＭＰ定量（ｃＡＭＰ抗体によるラジオイムノアッセイＲＩＡ、エンザイムイムノアッセイＥＩＡ）を組み合わせた方法、ＴＳＨ受容体とｃＡＭＰ依存性プロモーター結合ルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ細胞を用いる方法、ＴＳＨ受容体とｃＡＭＰ依存性カルシウムチャネルとアポイクオリンを共発現させた細胞を用いる方法、ＴＳＨ受容体とｃＡＭＰ結合領域を含むルシフェラーゼを共発現させた細胞を用いる方法、ＴＳＨ受容体とＮＦＡＴ依存性プロモーター結合ルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ細胞を用いる方法、ＴＧＦα切断アッセイ、βアレスチンとの会合を利用した方法、などが例示される。中でも、生体内でのＴＳＨ受容体阻害活性を反映した測定結果が得られる点から、ＴＳＨ受容体発現動物細胞を用いる方法が好ましく、操作工程が少なく簡便かつ測定が短時間で完了する点から、ＴＳＨ受容体とｃＡＭＰ結合領域を含むルシフェラーゼを共発現させた細胞を用いる方法が好適である。
【0035】
本発明におけるＴＳＨ受容体刺激活性測定方法について、特に原理が限定されるものではなく、公知の測定方法を利用することができる。ＴＳＨ受容体発現細胞（ブタ甲状腺細胞、ＴＳＨ受容体発現組み換え細胞、他）によるｃＡＭＰ産生反応とｃＡＭＰ定量（ｃＡＭＰ抗体によるラジオイムノアッセイＲＩＡ、エンザイムイムノアッセイＥＩＡ）を組み合わせた方法、ＴＳＨ受容体とｃＡＭＰ依存性プロモーター結合ルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ細胞を用いる方法、ＴＳＨ受容体とｃＡＭＰ依存性カルシウムチャネルとアポイクオリンを共発現させた細胞を用いる方法、ＴＳＨ受容体とｃＡＭＰ結合領域を含むルシフェラーゼを共発現させた細胞を用いる方法などが例示される。中でも、操作工程が少なく簡便かつ測定が短時間で完了する点から、ＴＳＨ受容体とｃＡＭＰ結合領域を含むルシフェラーゼを共発現させた細胞を用いる方法が好適である。
【0036】
本発明における見かけ上のＴＳＢＡｂ活性測定方法とＴＳＨ受容体刺激活性測定方法について、同じ測定原理を用いることもでき、異なる測定原理を用いることもできる。阻害活性測定時の刺激活性の影響を補正に用いることで、より精度高く刺激活性の影響を低減できるという観点から、同じ測定原理を用いることが好適である。
【0037】
本発明の説明のため、以下の明細書においては見かけ上のＴＳＢＡｂ活性測定方法及びＴＳＨ刺激活性の測定方法として、ｃＡＭＰバイオセンサーを採用した場合を例として記載するが、本発明の技術的思想から明らかなように、本発明は見かけ上のＴＳＢＡｂ活性測定及び／又はＴＳＨ受容体刺激活性測定法に依存するものではなく、本発明は当該活性測定法としてｃＡＭＰバイオセンサーを用いるものに限定されるものではない。
【0038】
本発明は、（ａ）見かけ上のＴＳＢＡｂ活性を測定する工程を含む。見かけ上のＴＳＢＡｂ活性測定方法としてｃＡＭＰバイオセンサーを採用した場合、ＴＳＨ受容体発現細胞を用いた、被験検体におけるｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルと、対照におけるｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルとを比較し、阻害性自己抗体の阻害活性を算定する。すなわち、測定系にＴＳＨを添加することによりＴＳＨ受容体が活性化されると、ｃＡＭＰが産生され、ｃＡＭＰバイオセンサーが活性化する一方、試料中に阻害性自己抗体が含まれるときには、ＴＳＨによるＴＳＨ受容体の活性化を阻害性自己抗体が競合的に阻害するために、ｃＡＭＰの産生量は減少し、ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルが、対照と比べて相対的に低下する。
【0039】
より具体的な例としては、試験区「ＳＴ」「ＳＢ」「ＮＴ」「ＮＢ」を下記のように設定する。
［ＳＴ］被験試料及びＴＳＨ添加区（反応緩衝液＋ＴＳＨ＋被験試料）
［ＳＢ］被験試料及びＴＳＨ非添加区（反応緩衝液＋被験試料）
［ＮＴ］対照試料及びＴＳＨ添加区（反応緩衝液＋ＴＳＨ＋健常者由来試料）
［ＮＢ］対照試料及びＴＳＨ非添加区（反応緩衝液＋健常者由来試料）
［ＳＴ］被験試料及びＴＳＨ添加区（反応緩衝液＋ＴＳＨ＋被験試料）
［ＳＢ］被験試料及びＴＳＨ非添加区（反応緩衝液＋被験試料）
［ＮＴ］対照試料及びＴＳＨ添加区（反応緩衝液＋ＴＳＨ＋健常者由来試料）
［ＮＢ］対照試料及びＴＳＨ非添加区（反応緩衝液＋健常者由来試料）
【0040】
「ＳＴ」「ＳＢ」「ＮＴ」「ＮＢ」それぞれの試験区について、ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベル測定を実施する。それぞれの活性化レベル（ルミノメーターによる発光強度など）を下記計算式に当てはめることにより、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性を算出することができる。
【0041】
（計算式）
見かけ上のＴＳＢＡｂ活性（％）＝｛１－（［ＳＴ］－［ＳＢ］）／（［ＮＴ］－［ＮＢ］）｝×１００
見かけ上のＴＳＢＡｂ活性（％）＝｛１－（［ＳＴ］－［ＳＢ］）／（［ＮＴ］－［ＮＢ］）｝×１００
【0042】
上記ｃＡＭＰバイオセンサーとしては、例えば、ｃＡＭＰ結合領域（例えば、プロテインキナーゼＡ［ＰＫＡ］の制御サブユニット由来のｃＡＭＰ結合領域、Ｅｐａｃ１由来のｃＡＭＰ結合領域）を含むレポータータンパク質（例えば、ＨＲＰ［horseradish peroxidase］；アルカリホスファターゼ；β－Ｄ－ガラクトシダーゼ；緑色発光ルシフェラーゼ［ＳＬＧ］、橙色発光ルシフェラーゼ［ＳＬＯ］、赤色発光ルシフェラーゼ［ＳＬＲ］等のルシフェラーゼ；緑色蛍光タンパク質［ＧＦＰ］、赤色蛍光タンパク質［ＤｓＲｅｄ］、シアン色蛍光タンパク質［ＣＦＰ］等の蛍光タンパク質）を挙げることができ、具体的には、ＰＫＡの制御サブユニット由来のｃＡＭＰ結合領域を含むルシフェラーゼであるGloSensor cAMP（Promega社製）や、Ｅｐａｃ１由来のｃＡＭＰ結合領域を含む赤色蛍光タンパク質であるPink Flamindo（Pink Fluorescent cAMP indicator）（文献「Harada K., et al., Sci Rep. 2017 Aug 4;7(1):7351. doi: 10.1038/s41598-017-07820-6.」参照）を挙げることができ、本実施例において、その効果が実証されているため、GloSensor cAMP（Promega社製）が好ましい。また、上記ｃＡＭＰバイオセンサーとしては、ｃＡＭＰに対する特異性が、ｃＧＭＰに対する特異性よりも高いものが好ましく、ここで、ｃＡＭＰに対する特異性を１としたときのｃＧＭＰの特異性は、例えば、１／１０以下、好ましくは１／３０以下、より好ましくは１／６０以下、さらに好ましくは１／１００以下である。
【0043】
上記ＴＳＨ受容体としては、ヒトＴＳＨ受容体阻害性自己抗体などの測定対象に反応を示す限りにおいて、その由来に制限はない。動物細胞にて発現した際にヒトのＴＳＨ受容体と近い反応性を示すことから、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等由来の細胞を例示することができる。中でも、過去にＴＳＡｂやＴＳＢＡｂ活性測定に用いられてきた細胞の由来である点から、ヒト、マウス、ラット、ブタであることが好ましく、生体内のＴＳＨ受容体に対するＴＳＡｂ活性やＴＳＢＡｂ活性をそのまま反映できる点から、ヒト由来であることがより好ましい。
【0044】
上記ＴＳＨ受容体としては、ヒトＴＳＨ受容体阻害性自己抗体などの測定対象に反応を示す限りにおいて、その改変体に制限はない。具体的には、野生型受容体の他、ヒトＴＳＨ受容体とヒトＬＨ／ＣＧ受容体によるキメラ改変体やアミノ酸変異導入改変体が例示される。
【0045】
上記哺乳動物細胞としては、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨ受容体の両方が、一過的（transient）又は安定的（stable）に発現する哺乳動物細胞であればよく、外来性のｃＡＭＰバイオセンサーを発現し、かつ、内在性のＴＳＨ受容体を発現する哺乳動物細胞（例えば、哺乳類甲状腺細胞）であっても、外来性のｃＡＭＰバイオセンサーを発現し、かつ、外来性のＴＳＨ受容体を発現する哺乳類非甲状腺細胞（例えば、ヒト胎児腎細胞由来細胞株［ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞等］、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株［ＣＨＯ細胞］、ヒト骨肉腫細胞株［Ｕ２ＯＳ細胞］）であってもよい。中でも、ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ ｃＡＭＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）と組み合わせた際に高い発光値やシグナル誘導倍率を示すことから、ヒト胎児腎細胞由来細胞株が好ましい。
【0046】
上記哺乳動物細胞としては、少なくともＧＮＡＬ遺伝子（Ｇαｏｌｆタンパク質をコードする遺伝子）をノックアウトした哺乳動物細胞であってもよく、血液試料中に含まれるＴＳＨ受容体のリガンド（ＴＳＨ刺激性又は阻害性自己抗体［例えば、ＴＳＡｂ］）の検出感度が向上し、低活性のＴＳＨ受容体のリガンドを含む血液試料についても、当該活性を正確に測定できることが期待できるため、外来性のＧαｓを発現し、かつ、ＧＮＡＳ遺伝子（Ｇαｓタンパク質をコードする遺伝子）及びＧＮＡＬ遺伝子の両方の遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞であってもよい。
【0047】
ＧＮＡＳ遺伝子やＧＮＡＬ遺伝子をノックアウトした哺乳動物細胞としては、哺乳動物細胞の染色体上に存在するＧＮＡＳ遺伝子やＧＮＡＬ遺伝子にヌクレオチドを挿入したり、前記ＧＮＡＳ遺伝子やＧＮＡＬ遺伝子のヌクレオチドを欠失することにより、哺乳動物細胞の染色体上に存在するＧＮＡＳ遺伝子やＧＮＡＬ遺伝子を破壊した哺乳動物細胞であればよく、哺乳動物細胞の染色体上に存在するＧＮＡＳ遺伝子やＧＮＡＬ遺伝子を破壊するために、相同組換えを利用してヌクレオチドを欠失させたり挿入したりすることにより遺伝子を破壊する方法を用いてもよいが、費用対効果や時間対効果の観点から、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（文献「Urnov, F.D. et al (2010) Nature Review Genetics. 11, 636-646」）や、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを改良したタンパク質（特開２０１３－９４１４８号公報）や、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ；single-guide RNA）とＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（文献「Cong et al (2013) Science 339, 819-823」）等を用いて、ＧＮＡＳ遺伝子やＧＮＡＬ遺伝子領域の２本鎖ＤＮＡを切断し、相同組換え修復時にヌクレオチドの欠失や挿入が起こることを利用して遺伝子を破壊する方法（遺伝子ターゲッティング法）を用いることが好ましく、特にｓｇＲＮＡとＣａｓ９エンドヌクレアーゼを用いた遺伝子ターゲッティング法を用いることがより好ましい。
【0048】
なお、哺乳動物細胞の染色体上に存在するＧＮＡＳ遺伝子やＧＮＡＬ遺伝子を破壊する際、標的とするヌクレオチド配列を選択するために、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）のデータベースにリンクし、以下のGene IDを基に、ヒト由来のＧＮＡＳ遺伝子やＧＮＡＬ遺伝子の塩基配列情報を参照したり、これら遺伝子のオーソログ遺伝子（チンパンジー、マウス、ラット、ウシ等）を参照することができる。
ＧＮＡＳ遺伝子（Gene ID2778）
ＧＮＡＬ遺伝子（Gene ID2774）
ＧＮＡＳ遺伝子（Gene ID2778）
ＧＮＡＬ遺伝子（Gene ID2774）
【0049】
外来性のｃＡＭＰバイオセンサー、外来性のＴＳＨ受容体、及び／又は外来性のＧαｓを発現する哺乳動物細胞は、この分野で一般的に用いられている遺伝子工学的手法により作製することができる。例えば、プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス［ＣＭＶ］のＩＥ［immediate early］遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０［Simian virus 40］の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、ＨＩＦプロモーター）と、かかるプロモーターの下流に作動可能に連結されているｃＡＭＰバイオセンサーをコードする遺伝子、ＴＳＨ受容体をコードする遺伝子、及び／又Ｇαｓをコードする遺伝子（ＧＮＡＳ遺伝子）を含むベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐｃＤＭ８、ｐＡＧＥ１０７、ｐＡＳ３－３、ｐＣＤＭ８）を、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ（Diethylaminoethyl）デキストラン法、ウイルス感染法等の方法を用いて、哺乳動物細胞へ導入（トランスフェクション）することにより得ることができる。
【0050】
本明細書において、哺乳動物細胞としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等由来の細胞を例示することができ、中でも、マウス、ブタ、又はヒト由来の細胞を好適に例示することができる。
【0051】
上記血液試料としては、血液そのものや、血液から調製された血清又は血漿を挙げることができ、血清が好ましい。
【0052】
上記ＴＳＨとしては、各種動物試料から抽出したものであっても良く、遺伝子組換法等によって人為的に合成されたものであっても良く、市販品を利用することも可能である。ＴＳＨの由来は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄類、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等などを例示することができ、中でも、ウシ、またはヒト由来のＴＳＨを好適に例示することができる。これらＴＳＨの由来は、動物細胞上に発現させるＴＳＨ受容体の由来と同一であっても良く、異なっていても良い。
【0053】
哺乳動物細胞をインキュベートする方法としては、ＴＳＨ受容体阻害性自己抗体が、添加ＴＳＨによる哺乳動物細胞におけるＴＳＨ受容体の活性化を競合阻害し、かかる競合阻害により細胞内のｃＡＭＰ産生量がＴＳＨのみを添加したＴＳＢＡｂ無添加区と比べて低下し、ｃＡＭＰバイオセンサーに結合するｃＡＭＰ産生量がＴＳＢＡｂ無添加区に比べて低下し、ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化を対象に比べて低下させることができる条件下でインキュベートする方法であればよく、インキュベート時間、インキュベート温度、インキュベート用液の種類等の条件は、哺乳動物細胞の性質や、測定対象の活性化レベルの性質も考慮して適宜選択することができる。
【0054】
上記インキュベート時間は、例えば、５分～２時間の範囲内、好ましくは１０分～１．５時間の範囲内、より好ましくは２０分～１時間の範囲内であり、上記インキュベート温度は、例えば、１４～４０℃の範囲内であり、好ましくは２０～３８℃の範囲内である。
【0055】
上記インキュベート用液としては、例えば、０．１～３０（ｖ／ｖ）％の血清（ウシ胎児血清［Fetal bovine serum；ＦＢＳ］、子牛血清［Calf bovine serum；ＣＳ］等）あるいは０．０１～１０（ｗ／ｖ）％のウシ血清アルブミン［bovine serum Albumin；ＢＳＡ］を含有する生理的水溶液、無血清の生理的水溶液を挙げることができる。かかる生理的水溶液としては、例えば、哺乳動物細胞培養用培養液；生理食塩水；リン酸緩衝化生理食塩水；トリス緩衝化生理食塩水；ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水；乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液等のリンゲル液；５％グルコース水溶液を挙げることができる。また、上記哺乳動物細胞培養用培養液としては、具体的には、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０、αＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｆ－１０、Ｍ－１９９、ＡＩＭ－Ｖ等を挙げることができる。また、上記無血清の哺乳動物細胞培養用培養液としては、例えば、市販のＢ２７サプリメント（－インスリン）（Life Technologies社製）、Ｎ２サプリメント（Life Technologies社製）、Ｂ２７サプリメント（Life Technologies社製）、Knockout Serum Replacement（Invitrogen社製）等の血清代替物を適量（例えば、１～３０％）添加した上記哺乳動物細胞培養用培養液を挙げることができる。さらに、インキュベート用液としては、特許文献１等のｃＡＭＰ検出系に関する公知文献にて慣用されている、ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えば、３－イソブチル－１－メチルキサンチン［ＩＢＭＸ］やテオフィリン等）を含有したものであってもよいが、ホスホジエステラーゼ阻害剤の存在により、バックグラウンドの値が高くなり、十分なＳ／Ｎ比が確保されず、定量的な測定が困難になる場合は、ホスホジエステラーゼ阻害剤を含有しないものが好ましい。
【0056】
上記の他、ｃＡＭＰバイオセンサーを用いた細胞内のｃＡＭＰレベルを測定する方法については、特許文献５の内容を参照し、本願明細書の記載として組み入れることができる。
【0057】
本発明は、（ｂ）工程（ａ）にて見かけ上のＴＳＢＡｂ活性を測定した試料のＴＳＨ受容体刺激活性を測定する工程を含む。ＴＳＨ受容体刺激活性測定方法としてｃＡＭＰバイオセンサーを採用した場合、ＴＳＨ受容体発現細胞を用いた、被験検体におけるｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルと、対照試料におけるｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルとを比較し、ＴＳＨ受容体刺激活性を算定する。すなわち、測定系に検体を添加することにより、検体中に含まれるＴＳＨ受容体活性化物質によってＴＳＨ受容体が活性化されると、ｃＡＭＰが産生され、ｃＡＭＰバイオセンサーが活性化する。対照検体におけるｃＡＭＰバイオセンサー活性化レベルを比較することで、検体のＴＳＨ受容体刺激活性を測定することができる。
【0058】
より具体的な例としては、試験区「ＳＢ」「ＮＢ」を下記のように設定する。
［ＳＢ］被験試料及びＴＳＨ非添加区（反応緩衝液＋被験試料）
［ＮＢ］対照試料及びＴＳＨ非添加区（反応緩衝液＋健常者由来試料）
［ＳＢ］被験試料及びＴＳＨ非添加区（反応緩衝液＋被験試料）
［ＮＢ］対照試料及びＴＳＨ非添加区（反応緩衝液＋健常者由来試料）
【0059】
「ＳＢ」「ＮＢ」それぞれの試験区について、ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベル測定を実施する。それぞれの活性化レベル（ルミノメーターによる発光強度など）を下記計算式に当てはめることにより、ＴＳＨ受容体刺激活性を算出することができる。なお、以下の明細書においても、ＴＳＨ受容体刺激活性の指標のことを、Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ＩｎｄｅｘまたはＳＩと記載することがある。
【0060】
（計算式）
ＳＩ＝ＳＢ／ＮＢ
ＳＩ＝ＳＢ／ＮＢ
【0061】
本発明は、（ｃ）以下の計算式によって阻害活性指標（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｉｎｄｅｘ：ＢＩ）を算出する工程を含む。
ＢＩ＝（見かけ上のＴＳＢＡｂ活性測定値）／（ＴＳＨ受容体刺激活性測定値）
ＢＩ＝（見かけ上のＴＳＢＡｂ活性測定値）／（ＴＳＨ受容体刺激活性測定値）
【0062】
本発明は、（ｄ）ＢＩの高低によってＴＳＨ受容体阻害活性の強弱を判定する工程を含む。すなわち、ＢＩが高い場合にはＴＳＨ受容体阻害活性が高く、ＢＩが低い場合にはＴＳＨ受容体阻害活性が低いと判定することができる。
【0063】
上記判定においては、閾値を設定し、ＢＩが閾値の上下どちらに属するかによって判定する方法が含まれる。閾値の値は活性測定の目的や母集団の特性に応じて適宜設定することが可能である。
【0064】
例えば、後述の実施例にて記載されているように、ＴＳＢＡｂ陰性検体とＴＳＢＡｂ陽性検体の両方がランダムに含まれている母集団からＴＳＢＡｂ陽性検体を弁別するような場合、ＢＩの閾値として８．０以上であればＴＳＢＡｂ陽性と判定することが例示される。
【0065】
このとき、ＢＩの高低により、ＴＳＨ刺激活性を有する検体においてのＴＳＢＡｂ混在を判別できる。ＢＩ高値であれば、ＴＳＨ刺激活性を有する検体中にＴＳＢＡｂの混在が強く示唆される。また、ＴＳＨ受容体はＴＳＨなどによる刺激なしでｃＡＭＰを産生することが知られている（恒常活性と呼ばれる）。ＴＳＨ受容体恒常活性を抑制するＴＳＨ受容体阻害性自己抗体が検体中に存在すれば、ＳＩ低値となり、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性をＳＩで除して求めるＢＩは高値となると推測される。
【0066】
閾値の設定としては、事前に閾値を設定することも可能であるが、同一の母集団から得られた測定値より特定の計算式によって算出された閾値を設定することもできる。同一の母集団から得られた測定値より算出された閾値の例としては、平均値、中央値、最頻値、平均値の１／２、中央値の１／２、最頻値の１／２、平均値の１／４、中央値の１／４、最頻値の１／４、平均値の１／１０、中央値の１／１０、最頻値の１／１０、標準偏差をσとしたときの平均値－σ、平均値－２σなどが例示されるが、限定されるものではない。
【0067】
本発明の阻害性自己抗体活性の測定法は、自己免疫にかかる疾患の診断や治療方針の参考とすることができる。自己免疫にかかる疾患には、原発性粘液水腫（萎縮性甲状腺炎）や甲状腺機能低下症、バセドウ病治療中で甲状腺機能低下症となった患者が例示される。
【0068】
例えば、バセドウ病治療中で甲状腺機能低下症となった例においては、ＢＩが高い場合には、阻害性自己抗体がＴＳＨ刺激を阻害することで甲状腺機能低下症を発症したと推測される。
【0069】
さらに、本発明は、既存の測定系、すなわち見かけ上のＴＳＢＡｂ活性の測定では診断等のできなかった、ＴＳＨ受容体恒常活性の抑制によって引き起こされる疾患の診断や病勢の把握に寄与する可能性が示唆される。
【0070】
本発明のＢＩは、甲状腺機能等に関する別の指標と組み合わせることも可能である。甲状腺機能等に関する別の指標としては、ＴＲＡｂ、ＴＳＡｂ活性、ＳＩなどが例示される。別の指標と組み合わせる具体例としては、ＴＲＡｂ、ＴＳＡｂ活性、ＳＩなど別の指標が一定の閾値に含まれる試料について、ＢＩを利用することが例示される。一方、上述の通り、ＢＩは単独でもＴＳＨ受容体阻害活性を表すことのできる指標のため、ＢＩのみでＴＳＨ受容体阻害活性を評価することも可能である。
【0071】
本発明の一態様として、前記工程（ｃ）の代わりに、以下の工程（ｃ’）を行うこともできる。
（ｃ’）以下の計算式によって阻害活性指標ＢＩ’を算出する工程
ＢＩ’＝（見かけ上のＴＳＢＡｂ活性測定値）／（ＴＳＨ受容体刺激活性測定値）ｎ (０．７５≦ｎ≦２．０)
（ｃ’）以下の計算式によって阻害活性指標ＢＩ’を算出する工程
ＢＩ’＝（見かけ上のＴＳＢＡｂ活性測定値）／（ＴＳＨ受容体刺激活性測定値）ｎ (０．７５≦ｎ≦２．０)
【0072】
ここで、上記計算式中のｎは、適宜定めることのできる係数である。
【0073】
係数ｎの設定は、ＴＳＨ受容体阻害活性高値試料と、ＴＳＨ受容体阻害活性低値試料を用意し、両試料の見かけ上のＴＳＢＡｂ活性値及びＴＳＨ受容体刺激活性値を測定し、そこから計算されるＴＳＨ受容体阻害活性高値試料のＢＩ’がＴＳＨ受容体阻害活性低値試料のＢＩ’よりも高くなる範囲で、適宜設定することができる。
【0074】
ＴＳＨ受容体阻害活性高値試料とＴＳＨ受容体阻害活性低値試料の組み合わせについては、ＴＳＢＡｂ陽性患者検体と健常者検体のような、ＴＳＨ受容体阻害活性の大小が既知の試料の組み合わせを用いることもでき、ＴＳＨ受容体阻害型自己抗体添加試料とＴＳＨ受容体阻害型自己抗体非添加試料のような、ＴＳＨ受容体阻害活性の高低が明らかな試料の組み合わせを用いることもできる。
【0075】
係数ｎは、事前に定めた数値を使用することもでき、適時設定することもできる。事前に定めた数値を用いる場合には、測定に用いる測定法と同じ見かけ上のＴＳＢＡｂ活性測定法及びＴＳＨ受容体刺激活性測定法を用いて、上記の方法によって事前に設定された係数ｎを用いることが好ましい。
【0076】
係数ｎは、後述の実施例において、ＴＳＢＡｂ陽性検体混合試料とＴＳＢＡｂ陽性検体非混合試料とを区別できることから、０．７５≦ｎ≦２．０の範囲で選択することが好ましい。当該範囲においては、活性測定の目的、活性測定に用いる試料の母集団などによって適宜選択することができる。検体の特性に関わらず広く応用可能であるという観点から、ｎは０．８０以上１．５以下であることがより好ましく、０．８５以上１．３以下であることがより好ましく、０．９０以上１．２以下であることがより好ましく、０．９５以上１．１以下であることがより好ましい。
【実施例0077】
実施例１．見かけ上のＴＳＢＡｂ活性の測定
以下に記載の方法で、モデル試料を作成し、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性を測定した。
以下に記載の方法で、モデル試料を作成し、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性を測定した。
【0078】
（モデル試料の作成）
原液または健常検体で４倍，１６倍希釈したＴＳＢＡｂ高値検体(ＴＳＢＡｂ)と、原液または健常検体で２倍，４倍希釈したＴＳＡｂ高値検体２例（ＴＳＡｂ－Ｓａｍｐｌｅ１，２）を混合したＴＳＢＡｂ－ＴＳＡｂ混合試料を調製した。また、原液または健常検体で４，１６倍希釈したＴＳＢＡｂ高値検体(ＴＳＢＡｂ)と、健常検体にリコンビナントヒトＴＳＨ（ｒｈＴＳＨ）１００，２００，４００，８００ｎｇ／ｍＬ添加した試料を混合したＴＳＢＡｂ－ＴＳＨ混合試料を調製した。用いた健常検体、ＴＳＡｂ高値検体、リコンビナントヒトＴＳＨがＴＳＨ受容体阻害活性を有していないことは確認している。本実施例にて用いた健常検体の見かけ上のＴＳＢＡｂ活性は、後述の測定法で測定したとき、－３７．０（％）であった。本実施例にて用いたＴＳＢＡｂ高値検体(ＴＳＢＡｂ)の見かけ上のＴＳＢＡｂ活性は、原液で１０２．０（％）、健常検体で４倍希釈した際に８２．９（％）であった。なお、調製した試料は反応緩衝液で４倍希釈して測定に用いた。
原液または健常検体で４倍，１６倍希釈したＴＳＢＡｂ高値検体(ＴＳＢＡｂ)と、原液または健常検体で２倍，４倍希釈したＴＳＡｂ高値検体２例（ＴＳＡｂ－Ｓａｍｐｌｅ１，２）を混合したＴＳＢＡｂ－ＴＳＡｂ混合試料を調製した。また、原液または健常検体で４，１６倍希釈したＴＳＢＡｂ高値検体(ＴＳＢＡｂ)と、健常検体にリコンビナントヒトＴＳＨ（ｒｈＴＳＨ）１００，２００，４００，８００ｎｇ／ｍＬ添加した試料を混合したＴＳＢＡｂ－ＴＳＨ混合試料を調製した。用いた健常検体、ＴＳＡｂ高値検体、リコンビナントヒトＴＳＨがＴＳＨ受容体阻害活性を有していないことは確認している。本実施例にて用いた健常検体の見かけ上のＴＳＢＡｂ活性は、後述の測定法で測定したとき、－３７．０（％）であった。本実施例にて用いたＴＳＢＡｂ高値検体(ＴＳＢＡｂ)の見かけ上のＴＳＢＡｂ活性は、原液で１０２．０（％）、健常検体で４倍希釈した際に８２．９（％）であった。なお、調製した試料は反応緩衝液で４倍希釈して測定に用いた。
【0079】
（見かけ上のＴＳＢＡｂ活性の測定）
下記（１）～（６）の手順に従い、発光強度を測定した。
（１）希釈調製済みの各試料を９６ｗｅｌｌ白色プレート（住友ベークライト社製）に２ｗｅｌｌずつ２５μＬ加えた。
（２）希釈した試料を加えた２ｗｅｌｌの片方にｒｈＴＳＨ５０ｎｇ／ｍＬを、もう片方に反応緩衝液を２５μＬずつ加え、軽く攪拌した。
（３） 発光基質（ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ ｃＡＭＰ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）含有反応緩衝液１２ｍＬに、ヒトＴＳＨ受容体とｃＡＭＰ結合領域含有ルシフェラーゼ改変体（ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ－２２Ｆ，Ｐｒｏｍｅｇａ社）の安定共発現ヒト胎児腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３細胞）を１．２５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように加えて良く混合し、調製済み細胞液を作製した。
（４）調製済み細胞液を前記９６ｗｅｌｌ白色プレートに１００μＬずつ加え、軽く攪拌した。
（５）２５℃で３０分間遮光静置した。
（６）ルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で発光強度を測定した。
下記（１）～（６）の手順に従い、発光強度を測定した。
（１）希釈調製済みの各試料を９６ｗｅｌｌ白色プレート（住友ベークライト社製）に２ｗｅｌｌずつ２５μＬ加えた。
（２）希釈した試料を加えた２ｗｅｌｌの片方にｒｈＴＳＨ５０ｎｇ／ｍＬを、もう片方に反応緩衝液を２５μＬずつ加え、軽く攪拌した。
（３） 発光基質（ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ ｃＡＭＰ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）含有反応緩衝液１２ｍＬに、ヒトＴＳＨ受容体とｃＡＭＰ結合領域含有ルシフェラーゼ改変体（ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ－２２Ｆ，Ｐｒｏｍｅｇａ社）の安定共発現ヒト胎児腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３細胞）を１．２５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように加えて良く混合し、調製済み細胞液を作製した。
（４）調製済み細胞液を前記９６ｗｅｌｌ白色プレートに１００μＬずつ加え、軽く攪拌した。
（５）２５℃で３０分間遮光静置した。
（６）ルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で発光強度を測定した。
【0080】
得られた発光強度から下記式により調製した各試料の見かけ上のＴＳＢＡｂ活性を、ＴＳＢＡｂ（％）として算出した。なお、検体とｒｈＴＳＨを加えたウェルの発光強度をＳＴ、検体と反応緩衝液を加えたウェルの発光強度をＳＢ、正常コントロールとｒｈＴＳＨを加えたウェルの発光強度をＮＴ、正常コントロールと反応緩衝液を加えたウェルの発光強度をＮＢとして表記した。
見かけ上のＴＳＢＡｂ活性（％）＝｛１－（ＳＴ－ＳＢ）／（ＮＴ－ＮＢ）｝×１００
見かけ上のＴＳＢＡｂ活性（％）＝｛１－（ＳＴ－ＳＢ）／（ＮＴ－ＮＢ）｝×１００
【0081】
ここで、見かけ上のＴＳＢＡｂ（％）が３０％であるとは、ＮＴとＮＢの発光強度変化量を１００としたとき、ＳＴとＳＢの発光強度変化量が７０％である、すわなち添加したｒｈＴＳＨ５０ｎｇ／ｍＬのＴＳＨ受容体刺激活性を３０％相当分阻害する見かけ上のＴＳＢＡｂ活性を有することを意味する。
【0082】
各試料における見かけ上のＴＳＢＡｂ活性(％)を表１に示す。なお、下記表中、ＴＳＢＡｂとある列はＴＳＢＡｂ高値検体(ＴＳＢＡｂ)を意味し、ＴＳＡｂ－Ｓａｍｐｌｅ１，２とある列は対応するＴＳＡｂ高値検体２例を意味し、rhTSH spiked Sample（ｎｇ／ｍＬ）とある列は健常検体にリコンビナントヒトＴＳＨ（ｒｈＴＳＨ）を添加した試料を意味する。Spikedと書かれた行は、ＴＳＡｂ－Ｓａｍｐｌｅでは健常検体での希釈倍率を意味し、rhTSH spiked SampleではｒｈＴＳＨ濃度（ｎｇ／ｍＬ）を意味する。ＴＳＢＡｂ×１、ＴＳＢＡｂ×４、ＴＳＢＡｂ×１６の行は、試料を調製する際に、それぞれ原液のＴＳＢＡｂ高値検体(ＴＳＢＡｂ)、健常検体で４倍希釈したＴＳＢＡｂ高値検体、健常検体で１６倍希釈したＴＳＢＡｂ高値検体と混合したことを意味する。ｎｏｒｍａｌの行は、健常検体と混合したことを意味する。すなわち、ＴＳＡｂ－Ｓａｍｐｌｅ１×４、ＴＳＢＡｂ×４の欄に８２．５とあるのは、ＴＳＢＡｂ高値検体を健常検体で４倍に希釈した試料に、４倍希釈したＴＳＡｂ高値検体１を添加して、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性(％)を測定したところ、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性(％)が８２．５％であったことを意味する。なお、当該表記法は以下の実施例においても共通である。
【0083】
【表1】
【0084】
表１の各列においては、ＴＳＢＡｂ×１など上部に位置するほどＴＳＢＡｂ検体濃度が高く、ＴＳＢＡｂ×１６など下部に位置するほどＴＳＢＡｂ検体濃度が低いことを意味する。同列の上部となるほど値が上昇していることから、ＴＳＡｂ検体やｒｈＴＳＨ添加検体へＴＳＢＡｂ検体を添加すると、添加量にしたがって見かけ上のＴＳＢＡｂ％が上昇したことが読み取れる。
【0085】
一方、ＴＳＡｂ検体やｒｈＴＳＨ添加検体で、ＴＳＡｂ濃度やＴＳＨ濃度が上昇すると、ＴＳＢＡｂが存在しないにもかかわらず、見かけ上のＴＳＢＡｂ％が上昇した。ＴＳＢＡｂが存在しない健常検体と、ＴＳＡｂ検体やｒｈＴＳＨ添加検体とを混合した結果（ｎｏｒｍａｌ行の結果）について、表１から抽出したものを、表２に示す。
【0086】
【表2】
【0087】
本実施例においては、用いた健常検体、ＴＳＡｂ高値検体、リコンビナントヒトＴＳＨがＴＳＨ受容体阻害活性を有していないことから、ＴＳＡｂ高値検体を健常検体で希釈した試料や、健常検体にｒｈＴＳＨを添加した試料は、ＴＳＨ受容体阻害活性を有していない。したがって、見かけ上のＴＳＢＡｂ％がＴＳＨ受容体阻害活性を反映している場合、上記表２に記載された試料においては、いずれの見かけ上のＴＳＢＡｂ％も低値となることが予想された。
【0088】
上記の予想に反して、ＴＳＡｂ検体４倍希釈（×４）、ＴＳＡｂ検体２倍希釈（×２）、ＴＳＡｂ検体原液（×１）とＴＳＡｂ検体濃度が上昇するに従い、見かけ上のＴＳＢＡｂ％が上昇した。ｒｈＴＳＨ添加検体においても、添加量が１００，２００，４００，８００ｎｇ／ｍＬと増加するに従って、見かけ上のＴＳＢＡｂ％が上昇した。
【0089】
多数の健常検体の見かけ上のＴＳＢＡｂ活性が０％以下であったことと、定量性が担保できる下限が１３％であったことを考慮して、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性１３％以上をＴＳＢＡｂ陽性と判定する場合、表１，２に記載のＴＳＡｂ－Ｓａｍｐｌｅ１の×２，×１条件やＴＳＡｂ－Ｓａｍｐｌｅ２の×４，×２，×１条件、ｒｈＴＳＨ ｓｐｉｋｅｄ Ｓａｍｐｌｅの１００，２００，４００，８００ｎｇ／ｍＬ条件が、ＴＳＢＡｂ非添加の試料であるにも関わらず、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性が高値となり偽陽性となってしまうことが確認された。
【0090】
実施例２．ＴＳＨ受容体刺激活性の算出
実施例１に記載の試料における発光強度から下記式により各試料のＴＳＨ受容体刺激活性（ＳＩ）を測定・算出した。なお、検体と反応緩衝液を加えたウェルの発光強度をＳＢ、正常コントロールと反応緩衝液を加えたウェルの発光強度をＮＢ、ＴＳＨ受容体刺激活性をＳＩとして表記している。
ＳＩ＝ＳＢ／ＮＢ
実施例１に記載の試料における発光強度から下記式により各試料のＴＳＨ受容体刺激活性（ＳＩ）を測定・算出した。なお、検体と反応緩衝液を加えたウェルの発光強度をＳＢ、正常コントロールと反応緩衝液を加えたウェルの発光強度をＮＢ、ＴＳＨ受容体刺激活性をＳＩとして表記している。
ＳＩ＝ＳＢ／ＮＢ
【0091】
各試料のＳＩを表３に示す。なお、本実施例にて用いた健常検体のＳＩ値は０．８であった。本実施例にて用いたＴＳＢＡｂ高値検体(ＴＳＢＡｂ)のＳＩは、原液で３．０、健常検体で４倍希釈した際に１．５、健常検体で１６倍希釈した際に１．０であった。
【0092】
【表3】
【0093】
ＴＳＡｂ検体のＴＳＡｂ濃度やＴＳＨ添加検体のＴＳＨ添加濃度の上昇に伴って、ＳＩが上昇した。ＳＩはＴＳＨ受容体への刺激活性を反映していると考えられた。また、ＳＩが一定以上の条件にＴＳＢＡｂを添加するとＳＩは低下した。ＴＳＡｂやＴＳＨによるＴＳＨ受容体刺激がＴＳＢＡｂによって阻害されてＳＩが低下したと考えられた。
【0094】
調製試料の内、ＴＳＢＡｂ検体、ＴＳＡｂ検体１、ｒｈＴＳＨ添加検体の健常検体による希釈系列の見かけ上のＴＳＢＡｂ活性とＳＩ値のプロットを図２に示す。
【0095】
図２から、ＴＳＢＡｂ検体においては、ＳＩはさほど上昇しないにも関わらず、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性はＴＳＢＡｂ濃度上昇依存的に上昇することが示された。ＴＳＢＡｂ検体における見かけ上のＴＳＢＡｂ活性とＳＩ値のプロットは、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性高値かつＳＩ低値、すなわち図２の左上の領域に移動した。さらに、ＴＳＡｂ検体１及びｒｈＴＳＨ添加検体においては、ＴＳＢＡｂを有さないにも関わらず、ＴＳＡｂやｒｈＴＳＨの濃度上昇に依存して、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性測定値が高値へ変動し、かつ、ＳＩの測定値は高値に変動した。ＴＳＡｂ検体１及びｒｈＴＳＨ添加検体における見かけ上のＴＳＢＡｂ活性とＳＩ値のプロットは、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性高値かつＳＩ高値の領域、すなわち図２の右上へと移動した。このことは、ＴＳＡｂやＴＳＨ等によるＴＳＨ受容体刺激活性によって、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性が上昇することを示している。
【0096】
健常検体・ＴＳＡｂ検体１・ＴＳＡｂ検体２・ｒｈＴＳＨ添加検体（８００ｎｇ/ｍＬ）へＴＳＢＡｂ検体の希釈系列を混合した試料の、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性とＳＩ値のプロットを図３に示す。
【0097】
ＴＳＢＡｂ検体を添加する濃度に依存して、ＴＳＡｂ検体やｒｈＴＳＨ検体の測定値が見かけ上のＴＳＢＡｂ活性高値かつＳＩ低値（左上）に変動した。
【0098】
これは、添加されるＴＳＢＡｂ検体濃度に依存して、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性／ＳＩ比、つまり実施例３にて検討するＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｉｎｄｅｘが増大することを示している。
【0099】
実施例３．Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｉｎｄｅｘ (ＢＩ)の算出
各試料の見かけ上のＴＳＢＡｂ％とＳＩから下記式により各試料のＢＩを算出した。
ＢＩ＝見かけ上のＴＳＢＡｂ％／ＳＩ
各試料の見かけ上のＴＳＢＡｂ％とＳＩから下記式により各試料のＢＩを算出した。
ＢＩ＝見かけ上のＴＳＢＡｂ％／ＳＩ
【0100】
各試料のＢＩを表４に示す。
【0101】
【表4】
【0102】
ＴＳＢＡｂ検体をＴＳＡｂ検体またはＴＳＨ添加検体に加えた試料（表４におけるＴＳＢＡｂ×１～ＴＳＢＡｂ×１６の行）では、ＢＩは８．８～３１．３であった。健常検体をＴＳＡｂ検体またはＴＳＨ添加検体に加えた試料（表４におけるｎｏｒｍａｌの行）では、ＢＩは－１５．８～７．７であった。
【0103】
表４の結果から、１６倍希釈したＴＳＢＡｂ検体をＴＳＡｂ検体またはＴＳＨ添加検体に加えた試料の結果と、健常検体をＴＳＡｂ検体またはＴＳＨ添加検体に加えた試料の結果を抜粋したものを、表５として示す。
【0104】
【表5】
【0105】
表５において、ＢＩがＴＳＨ受容体阻害活性を反映している場合、ＴＳＢＡｂ検体希釈液を添加したＴＳＢＡｂ×１６の行においてはＢＩが高くなり、ＴＳＨ受容体阻害活性を有していない、ｎｏｒｍａｌの行に記載された試料（ＴＳＡｂ高値検体を健常検体で希釈した試料及び健常検体にｒｈＴＳＨを添加した試料）においては、ＢＩが低くなることが予想された。
【0106】
表５の結果を見ると、果たして事前に予想した通り、ＴＳＢＡｂ検体希釈液を添加した試料（例えば、ＴＳＢＡｂ×１６の行に記載された試料）においてはＢＩが高くなり、健常検体と、ＴＳＡｂ検体やｒｈＴＳＨ添加検体とを混合した試料（ｎｏｒｍａｌの行に記載された試料）においては、ＢＩが低くなった。
【0107】
表５において、ＢＩ８．０以上を阻害活性陽性とすれば、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性測定では陽性判定となったＴＳＡｂ－Ｓａｍｐｌｅ１の×２，×１条件やＴＳＡｂ－Ｓａｍｐｌｅ２の×４，×２，×１条件、ｒｈＴＳＨ ｓｐｉｋｅｄ Ｓａｍｐｌｅの１００，２００，４００，８００ｎｇ／ｍＬ条件はすべて、実態に即して阻害活性陰性と判定された。
【0108】
調製試料の見かけ上のＴＳＢＡｂ活性とＢＩをＴＳＢＡｂ検体添加濃度ごとに分類したプロットを図４に示す。ＴＳＢＡｂ検体未添加群において、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性は多様であり、ＴＳＡｂ検体添加濃度の上昇に伴って見かけ上のＴＳＢＡｂ活性高値にプロットされた。したがって、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性をＴＳＨ受容体阻害活性の指標とした場合には、ＴＳＢＡｂ検体添加群と未添加群を、特定の閾値によって区別することはできなかった。一方、ＢＩをＴＳＨ受容体阻害活性の指標とした場合には、ＴＳＢＡｂ検体未添加群ではＢＩが８．０未満で、ＴＳＢＡｂ検体１６倍希釈添加群ではＢＩが８．０以上であり、ＢＩ８．０を閾値とすることで両群を判別できた。また、ＴＳＢＡｂ検体添加濃度の上昇により、ＢＩは高値にシフトした。
【0109】
見かけ上のＴＳＢＡｂ活性をＴＳＡｂ活性の値で補正したＢＩとすることで、刺激活性に依存した見かけ上のＴＳＢＡｂ活性と本来のＴＳＨ受容体阻害活性を判別できた。一方、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性では、ＴＳＡｂ検体添加濃度の上昇に伴って見かけ上のＴＳＢＡｂ活性が高値となり、実情に即したＴＳＨ受容体阻害活性は測定できなかった。
【0110】
実施例４．ＢＩ’計算におけるｎ値の検討
ＢＩ’と係数ｎの関係について、検証を行った。
ＢＩ’と係数ｎの関係について、検証を行った。
【0111】
実施例１において測定された見かけ上のＴＳＢＡｂ％、実施例２にて測定されたＳＩの測定値を用いて、下記式に従ってＢＩ’を再計算した。
ＢＩ’＝見かけ上のＴＳＢＡｂ％／ＳＩｎ
ＢＩ’＝見かけ上のＴＳＢＡｂ％／ＳＩｎ
【0112】
係数ｎとして、０．７５を使用したときのＢＩについて表６に、２．０を使用したときのＢＩについて表７に示す。
【0113】
【表6】
【0114】
【表7】
【0115】
ｎ＝０．７５とした場合、健常検体をＴＳＡｂ検体またはＴＳＨ添加検体に加えた試料では、ＢＩ’は０．６～１３．９であった。ＴＳＢＡｂ検体をＴＳＡｂ検体またはＴＳＨ添加検体に加えた試料では、ＢＩ’は１５．１～４５．４であった。ＢＩ’１４．０以上を阻害活性陽性とすれば、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性測定では陽性判定となったＴＳＡｂ－Ｓａｍｐｌｅ１の×２，×１条件やＴＳＡｂ－Ｓａｍｐｌｅ２の×４，×２，×１条件、ｒｈＴＳＨ ｓｐｉｋｅｄ Ｓａｍｐｌｅの１００，２００，４００，８００ｎｇ／ｍＬ条件はすべて、実態に即して阻害活性陰性と判定された。
【0116】
健常検体をＴＳＡｂ検体またはＴＳＨ添加検体に加えた試料では、ＢＩ’は０．１１～０．８５であった。ＴＳＢＡｂ検体をＴＳＡｂ検体またはＴＳＨ添加検体に加えた試料では、ＢＩ’は０．８７～１７．２であった。ＢＩ’０．８６以上を阻害活性陽性とすれば、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性測定では陽性判定となったＴＳＡｂ－Ｓａｍｐｌｅ１の×２，×１条件やＴＳＡｂ－Ｓａｍｐｌｅ２の×４，×２，×１条件、ｒｈＴＳＨ ｓｐｉｋｅｄ Ｓａｍｐｌｅの１００，２００，４００，８００ｎｇ／ｍＬ条件はすべて、実態に即して阻害活性陰性と判定された。
【0117】
上記の結果より、本発明の原理及び数学的に明らかではあるが、ＢＩ’の係数ｎは１である必然性はなく、１前後の値においても本発明は成立することが明らかとなった。
【0118】
実施例５．患者検体の測定
ＴＳＢＡｂ陽性検体２例または健常検体によるそれぞれの２倍・４倍希釈試料、ＴＳＨ高値検体（ＴＳＨ－１：ＴＳＨ １４３．１ μＩＵ／ｍＬ、ＴＳＨ－２：ＴＳＨ １７６．４ μＩＵ／ｍＬ）２例、ＴＳＡｂ陽性検体１６例を実施例１～３に記載の方法でそれぞれ見かけ上のＴＳＢＡｂ活性（％）、ＳＩ値、ＢＩを算出した。なお、ＴＳＨ受容体刺激活性とＴＳＨ受容体阻害活性を同時に示す検体は稀であることが知られていることから、ＴＳＡｂ陽性検体については、ＴＳＢＡｂ陰性である可能性が高いことが分かっている。
ＴＳＢＡｂ陽性検体２例または健常検体によるそれぞれの２倍・４倍希釈試料、ＴＳＨ高値検体（ＴＳＨ－１：ＴＳＨ １４３．１ μＩＵ／ｍＬ、ＴＳＨ－２：ＴＳＨ １７６．４ μＩＵ／ｍＬ）２例、ＴＳＡｂ陽性検体１６例を実施例１～３に記載の方法でそれぞれ見かけ上のＴＳＢＡｂ活性（％）、ＳＩ値、ＢＩを算出した。なお、ＴＳＨ受容体刺激活性とＴＳＨ受容体阻害活性を同時に示す検体は稀であることが知られていることから、ＴＳＡｂ陽性検体については、ＴＳＢＡｂ陰性である可能性が高いことが分かっている。
【0119】
各試料の見かけ上のＴＳＢＡｂ活性（％）、ＳＩ値、ＢＩを表８に示す。
【0120】
【表8】
【0121】
また、図５に各試料の見かけ上のＴＳＢＡｂ活性（％）とＢＩを示す。各試料の見かけ上のＴＳＢＡｂ活性について、実施例１と同じく、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性１３％以上をＴＳＢＡｂ陽性と判定した。各試料のＢＩについて、実施例３と同じく、ＢＩ８．０以上をＴＳＢＡｂ陽性と判定した。
【0122】
本実施例においては、ＴＳＢＡｂ－１、ＴＳＢＡｂ－２試料はＴＳＢＡｂ陽性であることが予想される。ＴＳＨ－１、ＴＳＨ－２、ＴＳＡｂ－１～ＴＳＡｂ－１３試料については、ＴＳＢＡｂ陰性であることが予想される。
【0123】
ＴＳＢＡｂ検体２例または健常検体によるそれぞれの２倍・４倍希釈試料のいずれも、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性は１６．０～９３．８％で陽性判定となった。ＴＳＨ高値検体の内、ＴＳＨ－１（ＴＳＨ １４３．１ μＩＵ／ｍＬ）は見かけ上のＴＳＢＡｂ活性－１２．５％で陰性であったが、ＴＳＨ－２（ＴＳＨ １７６．４ μＩＵ／ｍＬ）は見かけ上のＴＳＢＡｂ活性２０．４％で陽性判定となった。ＴＳＡｂ検体１３例の内、５例（ＴＳＡｂ－８，９，１０，１２，１３）は見かけ上のＴＳＢＡｂ活性－２１．３～９．８％で陰性判定であったが、８例（ＴＳＡｂ－１，２，３，４，５，６，７，１１）は見かけ上のＴＳＢＡｂ活性１９．７～１０９．３％と陽性判定となった。
【0124】
従来使用されてきた、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性という指標では、ＴＳＢＡｂ検体だけでなく、ＴＳＨやＴＳＡｂ検体においても陽性判定となる検体が多数存在し、両者のＴＳＨ受容体阻害活性を判別することはできなかった。
【0125】
これら各試料の内、ＴＳＡｂ検体７例（ＴＳＡｂ－１，２，３，４，５，６，７）でＳＩ値５．２～１５．１と高値であった。これらＳＩ高値のＴＳＡｂ検体７例の見かけ上のＴＳＢＡｂ活性（％）は２４．４～１０９．３％といずれも陽性判定であり、刺激活性依存的な見かけ上のＴＳＢＡｂ活性上昇による偽陽性が疑われた。
【0126】
一方、これら各試料の見かけ上のＴＳＢＡｂ活性をＳＩ値で補正したＢＩは、ＴＳＢＡｂ検体は１５．０～１１２．４、ＴＳＨ検体は－８．２～７．７、ＴＳＡｂ検体は１例を除き－１４．２～７．６であった。ＢＩ７．８以上をＴＳＨ受容体阻害活性陽性判定とした場合、ＴＳＢＡｂ検体とＴＳＨ検体またはＴＳＡｂ検体とを判別することができた。なお、ＢＩ１１．７となったＴＳＡｂ検体１１はＴＳＨ受容体刺激活性を有しており、かつＴＳＨ受容体阻害活性も有していると考えられた。
【0127】
以上の結果から、見かけ上のＴＳＢＡｂ活性をＴＳＨ受容体刺激活性測定値で補正したＢＩを用いることで、ＴＳＨ受容体への刺激活性の影響を受けないＴＳＨ受容体阻害活性の評価が可能となることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【0128】
本発明は、ＴＳＨ受容体阻害性自己抗体に起因する甲状腺疾患の診断および治療に資するものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
