(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024056367
(43)【公開日】2024-04-23
(54)【発明の名称】逆転写反応用組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 9/10 20060101AFI20240416BHJP
【ＦＩ】
C12N9/10 ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】21
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022163190
(22)【出願日】2022-10-11
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．Ｔｒｉｔｏｎ
３．ＮＯＮＩＤＥＴ
４．ＩＧＥＰＡＬ
５．ＥＭＵＬＧＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000003160
【氏名又は名称】東洋紡株式会社
(72)【発明者】
【氏名】小林 哲大
(72)【発明者】
【氏名】大地 健介
【テーマコード（参考）】
4B050
【Ｆターム（参考）】
4B050CC07
4B050DD01
4B050KK01
4B050KK05
4B050KK09
4B050KK14
4B050KK18
4B050LL03
(57)【要約】
【課題】 安定性に優れた逆転写反応用組成物を提供すること。
【解決手段】 本発明の逆転写反応用組成物は、逆転写活性を有する酵素及びＭＰＣポリマーを含むことを特徴とする。ＭＰＣポリマーは、アニオン性官能基を有するモノマーを構成単位として含むＭＰＣポリマーであることが好ましく、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、アニオン性官能基を有するビニルモノマーとを構成単位として含む共重合体のＭＰＣポリマーであることが更に好ましい。
【選択図】 なし
【解決手段】 本発明の逆転写反応用組成物は、逆転写活性を有する酵素及びＭＰＣポリマーを含むことを特徴とする。ＭＰＣポリマーは、アニオン性官能基を有するモノマーを構成単位として含むＭＰＣポリマーであることが好ましく、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、アニオン性官能基を有するビニルモノマーとを構成単位として含む共重合体のＭＰＣポリマーであることが更に好ましい。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＭＰＣポリマー及び逆転写活性を有する酵素を含む、逆転写反応用組成物。
【請求項2】
ＭＰＣポリマーが、アニオン性官能基を有するモノマーを構成単位として含む、請求項１に記載の逆転写反応用組成物。
【請求項3】
ＭＰＣポリマーが、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、アニオン性官能基を有するビニルモノマーとを構成単位として含む共重合体である、請求項１又は２に記載の逆転写反応用組成物。
【請求項4】
逆転写活性を有する酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）由来の逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）由来の逆転写酵素、及びヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）由来の逆転写酵素からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の逆転写反応用組成物。
【請求項5】
ＭＰＣポリマーの濃度が、組成物全体に対して０．０００２％以上である、請求項１又は２に記載の逆転写反応用組成物。
【請求項6】
更に多価アルコールを含む、請求項１又は２に記載の逆転写反応用組成物。
【請求項7】
多価アルコールが、グリセロール、グリコール、及び糖アルコールからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項６に記載の逆転写反応用組成物。
【請求項8】
更に２価陽イオンを含む、請求項１又は２に記載の逆転写反応用組成物。
【請求項9】
２価陽イオンが、マグネシウムイオン及びマンガンイオンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項８に記載の逆転写反応用組成物。
【請求項10】
更にデオキシヌクレオチドを含む、請求項１又は２に記載の逆転写反応用組成物。
【請求項11】
更にＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１又は２に記載の逆転写反応用組成物。
【請求項12】
更に界面活性剤を含む、請求項１又は２に記載の逆転写反応用組成物。
【請求項13】
界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項１２に記載の逆転写反応用組成物。
【請求項14】
３７℃で４日間保管した場合に６０％以上の残存活性率を示す、請求項１又は２に記載の逆転写反応用組成物。
【請求項15】
ＲＴ－ＰＣＲ反応に用いられる、請求項１又は２に記載の逆転写反応用組成物。
【請求項16】
マスターミックス試薬として用いられる、請求項１又は２に記載の逆転写反応用組成物。
【請求項17】
逆転写活性を有する酵素をＭＰＣポリマーと共存させることを特徴とする、逆転写活性を有する酵素の安定化方法。
【請求項18】
ＭＰＣポリマーが、アニオン性官能基を有するモノマーを構成単位として含む、請求項１７に記載の安定化方法。
【請求項19】
ＭＰＣポリマーが、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、アニオン性官能基を有するビニルモノマーとを構成単位として含む共重合体である、請求項１７又は１８に記載の安定化方法。
【請求項20】
逆転写活性を有する酵素を含有する溶液中においてＭＰＣポリマーを共存させる、請求項１７又は１８に記載の安定化方法。
【請求項21】
逆転写活性を有する酵素を含有する溶液を３７℃で４日間保管した場合の残存活性率を６０％以上にする、請求項１７又は１８に記載の安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、逆転写活性を有する酵素の安定性を向上させる方法、及びそれにより得られる逆転写反応用組成物等に関する。
【背景技術】
【0002】
逆転写酵素はＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する酵素であり、遺伝子工学や分子生物学では必要不可欠な酵素である。例えば、モロニ―マウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ：ＭＭＬＶ）逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（Ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｓｌａｓｔｏｓｉｓｖｉｒｕｓ：ＡＭＶ）逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ１型：ＨＩＶ－１）逆転写酵素、またそれらの改変体が市販されている。これらの酵素は核酸増幅法と組み合わせることで、数コピーの標的ＲＮＡを可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅することができ、研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。
【0003】
代表的な核酸増幅法であるＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。この増幅に使用される酵素、ＤＮＡポリメラーゼの反応はＤＮＡに特異的であるため、対象がＲＮＡの場合、逆転写酵素によって、一度ＤＮＡに変換する逆転写（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；ＲＴ）を実施してから上記増幅反応を行う必要がある。この逆転写反応とＰＣＲを組み合わせた反応をＲＴ－ＰＣＲと呼び、ＲＴ－ＰＣＲには、（１）ＲＴ、ＰＣＲを非連続に実施する２ステップＲＴ－ＰＣＲ、（２）ＲＴ、ＰＣＲを連続的に実施する１ステップＲＴ－ＰＣＲが存在する。
【0004】
逆転写反応には逆転写酵素以外にも、緩衝剤、マグネシウム等の補因子、デオキシヌクレオチドが通常必要とされる。そのため、市販の逆転写酵素は、例えば、緩衝剤、塩、界面活性剤などを含む５０％程度のグリセロール溶液中で保存され、使用時に緩衝剤及びマグネシウムなどを含む反応Ｂｕｆｆｅｒと混合して用いられる試薬の形態として販売されたり、又は緩衝剤及びマグネシウム等を含む反応Ｂｕｆｆｅｒと酵素が最初からすべて混合されて1液化（マスターミックス化）されており、使用時にそのまま用いることが可能な試薬の形態などで販売されている。これらの逆転写反応は一般に、核酸増幅法とは独立して実施され、その後、核酸増幅法と組み合わされる。また、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製のＴａｑＰａｔｈ １－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，ＣＧのように逆転写反応のマスターミックスにＤＮＡポリメラーゼが含有され、ＲＴ－ＰＣＲ用のマスターミックス試薬として、ＲＴ、ＰＣＲを連続的に実施する１ステップＲＴ－ＰＣＲに利用される試薬等も存在する。
【0005】
このような逆転写酵素試薬は一般的に－２０℃から－８０℃で保存される。そして、逆転写酵素は、耐熱性であるＤＮＡポリメラーゼに比べ、安定性が低いことが多く、逆転写酵素の失活が実験の再現性の低下などにつながることが知られている。しかし、一般的にこれらの試薬は使用時には４℃などで融解または一時保管されるため、何回か使用した後は酵素が徐々に失活し、試薬の再購入や再調製を検討する必要があり、多大なる労力及びコストがかかっていた。
【0006】
このような逆転写活性を有する酵素の失活は、ＲＮＡの発現解析など逆転写反応を行う研究において時間、労力、費用の面で負担を大きくする。また、ＲＮＡウイルス検査などのＲＮＡをターゲットとする検査を行う必要がある臨床の現場では、このような逆転写活性を有する酵素の失活が誤った診断につながるため、これらの酵素の安定化が強く望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は上記従来技術に鑑みてなされたものであり、逆転写活性を有する酵素の安定性を向上させ、例えば、長期に保存しても安定な逆転写反応用組成物を提供することを目的とする。安定性の向上した逆転写反応用組成物とすることで、例えば、－２０℃から－８０℃よりも高い温度で一定期間保管されても逆転写活性を有する酵素の失活を抑えることができ、逆転写反応を行う実験や試験の再現性を高めることができる。また、逆転写活性を有する酵素を含む試薬の再購入・再調製を抑えることで、無駄な費用と手間等を減らし、低コストで実験、試験を実施することができるようになる。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者は、上記事情に鑑み、鋭意研究を行った結果、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを含むポリマー（ＭＰＣポリマー）、特にはアニオン性官能基を有するモノマーを構成単位として含む共重合体のＭＰＣポリマーを、逆転写活性を有する酵素と共存させることで、逆転写活性を有する酵素の保存安定性を向上させることができることを見出し、本発明に到達した。
【0009】
代表的な本願発明は、以下の通りである。
［項１］ ＭＰＣポリマー及び逆転写活性を有する酵素を含む、逆転写反応用組成物。
［項２］ ＭＰＣポリマーが、アニオン性官能基を有するモノマーを構成単位として含む、項１に記載の逆転写反応用組成物。
［項３］ ＭＰＣポリマーが、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、アニオン性官能基を有するビニルモノマーとを構成単位として含む共重合体である、項１又は２に記載の逆転写反応用組成物。
［項４］ 逆転写活性を有する酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）由来の逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）由来の逆転写酵素、及びヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）由来の逆転写酵素からなる群より選択される少なくとも１種である、項１～３のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項５］ ＭＰＣポリマーの濃度が、組成物全体に対して０．０００２％以上である、項１～４のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項６］ 更に多価アルコールを含む、項１～５のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項７］ 多価アルコールが、グリセロール、グリコール、及び糖アルコールからなる群より選択される少なくとも１種である、項６に記載の逆転写反応用組成物。
［項８］ 更に２価陽イオンを含む、項１～７のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項９］ ２価陽イオンが、マグネシウムイオン及びマンガンイオンからなる群より選択される少なくとも１種である、項８に記載の逆転写反応用組成物。
［項１０］ 更にデオキシヌクレオチドを含む、項１～９のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項１１］ 更にＤＮＡポリメラーゼを含む、項１～１０のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項１２］ 更に界面活性剤を含む、項１～１１のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項１３］ 界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、項１２に記載の逆転写反応用組成物。
［項１４］ ３７℃で４日間保管した場合に６０％以上の残存活性率を示す、項１～１３のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項１５］ ＲＴ－ＰＣＲ反応に用いられる、項１～１４のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項１６］ マスターミックス試薬として用いられる、項１～１５のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項１７］ 逆転写活性を有する酵素をＭＰＣポリマーと共存させることを特徴とする、逆転写活性を有する酵素の安定化方法。
［項１８］ ＭＰＣポリマーが、アニオン性官能基を有するモノマーを構成単位として含む、項１７に記載の安定化方法。
［項１９］ ＭＰＣポリマーが、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、アニオン性官能基を有するビニルモノマーとを構成単位として含む共重合体である、項１７又は１８に記載の安定化方法。
［項２０］ 逆転写活性を有する酵素を含有する溶液中においてＭＰＣポリマーを共存させる、項１７～１９のいずれかに記載の安定化方法。
［項２１］ 逆転写活性を有する酵素を含有する溶液を３７℃で４日間保管した場合の残存活性率を６０％以上にする、項１７～２０のいずれかに記載の安定化方法。
［項１］ ＭＰＣポリマー及び逆転写活性を有する酵素を含む、逆転写反応用組成物。
［項２］ ＭＰＣポリマーが、アニオン性官能基を有するモノマーを構成単位として含む、項１に記載の逆転写反応用組成物。
［項３］ ＭＰＣポリマーが、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、アニオン性官能基を有するビニルモノマーとを構成単位として含む共重合体である、項１又は２に記載の逆転写反応用組成物。
［項４］ 逆転写活性を有する酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）由来の逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）由来の逆転写酵素、及びヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）由来の逆転写酵素からなる群より選択される少なくとも１種である、項１～３のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項５］ ＭＰＣポリマーの濃度が、組成物全体に対して０．０００２％以上である、項１～４のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項６］ 更に多価アルコールを含む、項１～５のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項７］ 多価アルコールが、グリセロール、グリコール、及び糖アルコールからなる群より選択される少なくとも１種である、項６に記載の逆転写反応用組成物。
［項８］ 更に２価陽イオンを含む、項１～７のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項９］ ２価陽イオンが、マグネシウムイオン及びマンガンイオンからなる群より選択される少なくとも１種である、項８に記載の逆転写反応用組成物。
［項１０］ 更にデオキシヌクレオチドを含む、項１～９のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項１１］ 更にＤＮＡポリメラーゼを含む、項１～１０のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項１２］ 更に界面活性剤を含む、項１～１１のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項１３］ 界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、項１２に記載の逆転写反応用組成物。
［項１４］ ３７℃で４日間保管した場合に６０％以上の残存活性率を示す、項１～１３のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項１５］ ＲＴ－ＰＣＲ反応に用いられる、項１～１４のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項１６］ マスターミックス試薬として用いられる、項１～１５のいずれかに記載の逆転写反応用組成物。
［項１７］ 逆転写活性を有する酵素をＭＰＣポリマーと共存させることを特徴とする、逆転写活性を有する酵素の安定化方法。
［項１８］ ＭＰＣポリマーが、アニオン性官能基を有するモノマーを構成単位として含む、項１７に記載の安定化方法。
［項１９］ ＭＰＣポリマーが、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、アニオン性官能基を有するビニルモノマーとを構成単位として含む共重合体である、項１７又は１８に記載の安定化方法。
［項２０］ 逆転写活性を有する酵素を含有する溶液中においてＭＰＣポリマーを共存させる、項１７～１９のいずれかに記載の安定化方法。
［項２１］ 逆転写活性を有する酵素を含有する溶液を３７℃で４日間保管した場合の残存活性率を６０％以上にする、項１７～２０のいずれかに記載の安定化方法。
【発明の効果】
【0010】
本発明によって、逆転写活性を有する酵素の安定性を向上させることができ、例えば、長期に保存しても安定な逆転写反応用組成物を提供することができる。逆転写活性を有する酵素の失活を抑えることで、逆転写反応に用いる試薬の再購入・再調製の手間を低減し、低コストでの逆転写反応を行う実験や試験を可能にする。また、逆転写活性を有する酵素の失活による再現性低下を防ぐことができ、安定した実験結果、試験結果を得ることが可能になる。研究用途だけでなく、臨床分野にも大いに寄与し得る。
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
【0012】
本発明は、逆転写活性を有する酵素（特には、保存安定性が低いことが知られている逆転写酵素）の安定性を向上させた組成物に関する。本発明における逆転写酵素とは、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成しうる能力を有する酵素であれば特に限定されない。保存安定性が低いことが知られている逆転写酵素としては、例えば、レトロウイルスなどから得られるＲＮＡからｃＤＮＡを合成しうる逆転写酵素が挙げられ、具体的には、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ：ＭＭＬＶ）由来の逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（Ａｖｉａｎｍｙｅｌｏｂｓｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ：ＡＭＶ）由来の逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ１型：ＨＩＶ－１）由来の逆転写酵素等を好ましい例として挙げることができるが、これらに限定されない。なお本明細書において、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）由来の逆転写酵素という場合、野生型のＭＭＬＶ由来の逆転写酵素だけではなく、逆転写活性が失われていないその逆転写酵素の改変体も含み、他の起源に由来する逆転写酵素の場合も同様であり得る。逆転写活性を有する酵素は、市販の逆転写酵素であってもよく、例えば、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅなどが挙げられる。中でも、本発明の高い安定化効果が得られ易いという観点から、逆転写活性を有する酵素は、ＭＭＬＶ由来の逆転写酵素が好ましいが、特に限定されるものではない。
【0013】
本明細書において、逆転写酵素の改変体とは、その由来である野生型の逆転写酵素のアミノ酸配列に対して、例えば８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、なかでも好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、且つ、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成しうる能力が失われておらず逆転写活性を有するものをいう。ここで、アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、当該分野で公知の任意の手段で行うことができる。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、一例として、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉにおいてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出することが可能である。また、本発明に用いられ得る改変体は、その由来である野生型逆転写酵素のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加（以下、これらを纏めて「改変」又は「変異」等ともいう）したアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、且つ、野生型逆転写酵素と同様にＲＮＡをｃＤＮＡに変換する活性を有するものであってもよい。ここで１又は数個とは、例えば、１～８０個、好ましくは１～４０個、よりこのましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個であり得るが、特に限定されない。
【0014】
本発明の逆転写反応用組成物における上記逆転写酵素の量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、０．０１５～５０Ｕ／μｌとすることができ、０．１５～５Ｕ／μｌとすることが好ましい。本発明によれば、このような量の逆転写酵素を含む場合であっても安定性の低下が高度に抑制され、所定期間保存された後でも実用上十分なレベルで逆転写活性を発揮し得る。
【0015】
本発明におけるＭＰＣポリマーとは、以下の一般式（１）で表される２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）を構成単位として含む重合体をいう。
【化1】
【0016】
本発明に用いられるＭＰＣポリマーは、ＭＰＣのホモポリマーであってもよいし、ＭＰＣ及び他のモノマーを構成単位として含むコポリマー（共重合体）であってもよい。より確実に本発明の効果が得られ易いという観点から、ＭＰＣポリマーはコポリマーであることが好ましい。コポリマーは、ランダムコポリマーであってもよいし、ブロックコポリマーであってもよいし、ランダム部分とブロック部分とを含むコポリマーであってもよい。このようなコポリマーのＭＰＣポリマーは、例えば、特定の重合開始剤の存在下、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）とメタクリル酸（ＭＡｃ）とを重合させたものが挙げられるが、ＭＡｃの代わりに又はＭＡｃに加えて、共重合可能な他のビニルモノマー等を重合させたものであってもよく、特に限定されない。共重合可能な他のビニルモノマーとしては、例えば、アクリル酸、ビニルホスホン酸、ビニルスルホン酸、メタリルスルホン酸、２－アクリロイルオキシエチルコハク酸、２－メタクリロイルオキシエチルフタル酸、（メタ）アクリル酸ｎ－ブチル、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ペンチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸ヘプチル、（メタ）アクリル酸オクチル、（メタ）アクリル酸ノニル、（メタ）アクリル酸デシル、（メタ）アクリル酸ウンデシル、（メタ）アクリル酸ドデシル、（メタ）アクリル酸トリデシル、（メタ）アクリル酸テトラデシル、（メタ）アクリル酸ペンタデシル、（メタ）アクリル酸セチル、（メタ）アクリル酸ヘプタデシル、（メタ）アクリル酸ステアリル、（メタ）アクリル酸ベンジル、２－ヒドロキシエチルメタクリレート、スチレン、α－メチルスチレン、メチル核置換スチレン、クロロ核置換スチレン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、エチレン、プロピレン、イソブチレン、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、エチルビニルエーテル、ｎ－ブチルビニルエーテル、ジエチルイタコネート、ジ－ｎ－ブチルイタコネートを挙げることができ、或いは、多価アルコールと（メタ）アクリル酸とのエステル化反応により得られるビニルモノマー等であってもよい。多価アルコールと（メタ）アクリル酸とのエステル化反応により得られるビニルモノマーとしては、例えば、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、トレイトールモノ（メタ）アクリレート、エリトリトールモノ（メタ）アクリレート、キシリトールモノ（メタ）アクリレート、アラビトールモノ（メタ）アクリレート、マンニトールモノ（メタ）アクリレート、ガラクチトールモノ（メタ）アクリレート、ソルビトールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられるが、これらに限定されない。また共重合可能な他のビニルモノマーとしては、前記のようなビニルモノマーを、例えば、ハロゲン原子、アルコキシ基、アリール基、アリールオキシ基、複素環基等で置換したビニルモノマーなどであってもよい。ＭＰＣポリマーがコポリマーである場合、上記のような他のモノマーを１種類だけ含むものであってもよいし、２種類以上含むものであってもよい。
【0017】
好ましい実施形態において、本発明に用いられるＭＰＣポリマーは、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン及びアニオン性官能基を有するモノマーを構成単位として含むＭＰＣポリマーであり得る。アニオン性官能基としては、例えば、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、ホスホン酸基、ホスフィン酸基等を挙げることができる。好ましくは、ＭＰＣポリマーは、アニオン性官能基を有するビニルモノマーを構成単位として含み、より好ましくは、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、ホスホン酸基、及びホスフィン酸基からなる群より選択される少なくとも１つのアニオン性官能基を有するビニルモノマーを構成単位として含むＭＰＣポリマーであり得る。アニオン性官能基を有するビニルモノマーとしては、例えば、メタクリル酸、アクリル酸、ビニルホスホン酸、ビニルスルホン酸、メタリルスルホン酸、２－アクリロイルオキシエチルコハク酸、２－メタクリロイルオキシエチルフタル酸、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、トレイトールモノ（メタ）アクリレート、エリトリトールモノ（メタ）アクリレート、キシリトールモノ（メタ）アクリレート、アラビトールモノ（メタ）アクリレート、マンニトールモノ（メタ）アクリレート、ガラクチトールモノ（メタ）アクリレート、ソルビトールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられるが、これらに限定されない。一つの好ましい実施形態において、本発明に用いるＭＰＣポリマーは、水酸基又はカルボキシル基を有するモノマーを少なくとも１つの構成単位として含むＭＰＣポリマーであり、より好ましくは、メタクリル酸を少なくとも１つの構成単位として含むＭＰＣポリマーである。このようなアニオン性の側鎖を持つビニルモノマーを構成単位に含むＭＰＣポリマーを使用することで、より高い安定化効果を得ることができるので好ましい。
【0018】
一例として、本発明に用いられるＭＰＣポリマーにおいて、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）と共にＭＰＣポリマーを構成する他のモノマーは、以下の一般式（２）で表されるビニルモノマーであり得る。
（上記式中、Ｒは、水素原子、又は水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、ホスホン酸基、若しくはホスフィン酸基で置換されていてもよい炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルケニル基、炭素数１～６のアルキニル基、炭素数１～６のアルキルオキシ基、炭素数６～１２のアリール基、若しくは炭素数７～２０のアラルキル基を示す。）
【化2】
（上記式中、Ｒは、水素原子、又は水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、ホスホン酸基、若しくはホスフィン酸基で置換されていてもよい炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルケニル基、炭素数１～６のアルキニル基、炭素数１～６のアルキルオキシ基、炭素数６～１２のアリール基、若しくは炭素数７～２０のアラルキル基を示す。）
【0019】
一つの実施形態において、本発明に用いられるＭＰＣポリマーは共重合体（コポリマー）であることが好ましく、上記一般式（２）で表されるビニルモノマーを構成単位として含む共重合体であることがより好ましい。なかでも、一般式（２）において、Ｒが、水素原子であるか、又は水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、ホスホン酸基、及びホスフィン酸基からなる群より選択される少なくとも１つのアニオン性官能基で置換されている、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルケニル基、炭素数１～６のアルキニル基、炭素数１～６のアルキルオキシ基、炭素数６～１２のアリール基、若しくは炭素数７～２０のアラルキル基から選択される炭素鎖であるビニルモノマーを構成単位として含む共重合体のＭＰＣポリマーであることが好ましい。ここで、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキルオキシ基等は、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。一つの好ましい実施形態では、本発明の用いられるＭＰＣポリマーは、一般式（２）において、Ｒが、水素原子であるか、又は水酸基及びカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも１つのアニオン性官能基で置換されている炭素数１～６のアルキル基であるビニルモノマーを構成単位として含む共重合体のＭＰＣポリマーであり得る。例えば、前記一般式（２）において、Ｒが２個以上の水酸基及び／又はカルボキシル基で置換されている炭素数１～６のアルキル基であるビニルモノマーを構成単位として含むＭＰＣポリマーなども本発明に好適に使用することができる。
【0020】
本発明に用いられるＭＰＣポリマーは、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを任意の割合で含むポリマーであり得る。例えば、ＭＰＣポリマーは、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンモノマーの構成単位を３０モル％以上含むものであってよく、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンモノマーを構成単位として、好ましくは３５～９９モル％、より好ましくは４０～９０モル％、更に好ましくは４５～８５モル％含むＭＰＣポリマーであるのがよい。本発明のＭＰＣポリマーが、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンモノマーと他のビニルモノマー（例えば、アニオン性官能基を有するビニルモノマー）とを構成単位として含むコポリマーである場合、そのモル比も特に限定されないが、例えば、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンモノマー：他のビニルモノマー（例えば、アニオン性官能基を有するビニルモノマー）のモル比は３５～９９：１～６５であり得、好ましくは、４０～９０：１０～６０、より好ましくは４５～８５：１５～５５程度であるのがよい。
【0021】
本発明に用いられるＭＰＣポリマーは、任意の長さのポリマーであり得る。より確実に効果が得られ易いという観点から、好ましくは、重量平均分子量１０，０００～１，０００，０００程度、より好ましくは、重量平均分子量３０，０００～８００，０００程度、更に好ましくは、重量平均分子量１００，０００～７００，０００程度のＭＰＣポリマーを用いるのがよい。ＭＰＣポリマーは疎水性であっても親水性であってもよいが、溶液中において逆転写活性を有する酵素を安定化させ易いという観点から、水溶性のＭＰＣポリマーであることが好ましい。
【0022】
ＭＰＣポリマーを合成する際の重合開始剤としては、通常のラジカル重合開始剤であれば特に限定されるものではなく、例えば、スクシニックパーオキサイド、２，２’－アゾビスイソブチロニトリル、過酸化ベンゾイル、ジイソプロピルペルオキシジカーボネート、ｔ－ブチルペルオキシ－２－エチルヘキサノエート、ｔ－ブチルペルオキシピバレート、ｔ－ブチルペルオキシジイソブチレート、過硫酸塩又は過硫酸－亜硫酸水素塩等を適宜使用することができる。重合開始剤の使用量は、全原料モノマー１００質量部に対して０．０１～１０質量部が好ましく、０．１～５質量部がより好ましい。
【0023】
ＭＰＣポリマーを合成する際の重合条件は、特に限定されないが、好ましくは３０～８０℃、特に好ましくは４０～７０℃において、２～７２時間にわたり重合反応を行う条件である。この際、重合反応をより円滑に行なうために溶媒を用いてもよく、該溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ｔ－ブタノール、ベンゼン、トルエン、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、クロロホルム又はこれらの混合物を挙げることができる。また、得られるＭＰＣポリマーの精製は公知の方法により行うことができる。
【0024】
本発明に用いるＭＰＣポリマーは上記のように合成したものを用いてもよいが、市販のものを用いてもよい。例えば、ＭＰＣポリマーとして、日油製のリピジュア（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ）シリーズのＭＰＣポリマーを用いることができるが、特に限定されるものではない。例えば日油製のＬｉｐｉｄｕｒｅ－ＢＬ４００シリーズのＭＰＣポリマー（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ－ＢＬ４０１、ＢＬ４０２、ＢＬ４０３、ＢＬ４０５、ＢＬ４０６、ＢＬ４０７、ＢＬ４０８などが挙げられるが特に限定されない）は、アニオン性側鎖を有するＭＰＣポリマーとして知られており、本発明に好適に使用することができる。
【0025】
本発明の逆転写反応用組成物におけるＭＰＣポリマーの濃度は特に限定されるものではないが、例えば、０．０００２％以上であればよい。より高い安定化効果が得られ易いという観点からは、好ましくは、０．００２％以上、より好ましくは０．０１％以上、更に好ましくは０．１％以上であればよい。本発明の組成物中におけるＭＰＣポリマーの上限値は特に限定されないが、例えば１０％以下、より好ましくは５％以下であり得る。本発明の逆転写反応用組成物は、１種類のＭＰＣポリマーを含むものであってもよいが、２種類以上のＭＰＣポリマーを含むものであってもよく、２種類以上のＭＰＣポリマーを含む場合はそれらの総量が上記濃度範囲となるように調整することが好ましい。
【0026】
さらに、本発明の逆転写反応用組成物は、多価アルコールを含んでいてもよい。多価アルコールとしては、グリセロール；プロピレングリコール、トリエチレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ポリエチレングリコール等のグリコール；ソルビトール、キシリトール、トレハロース等の糖アルコールが挙げられるが、特に限定されるものではない。好ましくは、グリセロール、ソルビトール、キシロース、及びトレハロースからなる群より選択される少なくとも一種の多価アルコールである。多価アルコールをさらに含むことにより、より一層高い安定化効果を得ることができる。
【0027】
本発明の逆転写反応用組成物における多価アルコールの濃度は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、１０％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは２５％以上で、より良好な安定化効果を得ることが可能となる。上限は特に限定されないが、一例として、７５％以下とすることができ、５０％以下であることがより好ましい。
【0028】
さらに、本発明の逆転写反応用組成物は、界面活性剤を含んでいてもよい。界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性イオン性界面活性剤、陽イオン性活性剤のいずれを用いてもよい。具体的に、界面活性剤としては、、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０），Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ、ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０、Ｂｒｉｊｉ３５、Ｂｒｉｊｉ５８、トリトンＸ－１００（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）、トリトンＸ－１１４（ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４）、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、Ｅｍｕｌｇｅｎ４２０などが挙げられるが、特に限定されない。好ましくは、非イオン界面活性剤であり、より好ましくは、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０），Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ、ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０、Ｂｒｉｊｉ３５、Ｂｒｉｊｉ５８、トリトンＸ－１００（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）、トリトンＸ－１１４（ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４）等のポリオキシエチレン鎖を有する非イオン界面活性剤である。界面活性剤を用いる場合、本発明の逆転写反応用組成物中における界面活性剤の濃度は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、０．０００１％以上、より好ましくは０．００１％以上、さらに好ましくは０．０１％以上で、より良好な安定化効果を得ることが可能となる。上限は特に限定されないが、一例として、１％以下とすることができる。
【0029】
さらに、本発明の逆転写反応用組成物は、逆転写反応に必要な因子を含むことが好ましい。逆転写反応に必要な因子とは、緩衝剤、塩、マグネシウムなどの２価イオン（２価の陽イオン）、デオキシヌクレオチド、オリゴヌクレオチドなどが挙げられるが、特に限定されない。好ましくは、逆転写酵素の他にマグネシウムやデオキシヌクレオチドを含み、逆転写反応のマスターミックス試薬として使用することができる逆転写反応用組成物であり得るが、特に限定されない。本発明によれば、長期保存しても逆転写活性を有する酵素の失活を高度に抑えることができるので、このようなマスターミックス試薬として好適に利用され得る。
【0030】
さらに、本発明の逆転写反応用組成物は、核酸増幅反応に必要な因子を含んでいてもよい。核酸増幅反応に必要な因子とは、例えば核酸増幅反応としてＰＣＲを行う場合は緩衝剤、塩、２価陽イオン（好ましくは、マグネシウムイオン又はマンガンイオン）、デオキシヌクレオチド、核酸増幅用のＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられるが、特に限定されない。好ましくは、逆転写活性を有する酵素の他に、マグネシウムイオンを発生させる成分（例えばマグネシウム塩）、デオキシヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼを含み、ＲＴ－ＰＣＲ反応のマスターミックス試薬として使用することができる逆転写反応用組成物であり得るが、特に限定されない。本発明によれば、長期保存しても逆転写活性を有する酵素の失活を高度に抑えることができるので、このようなマスターミックス試薬として好適に利用され得る。
【0031】
本発明の逆転写反応用組成物に含まれ得る２価陽イオンの量は、本発明の効果を奏する限り限定されないが、例えば、１～５０ｍＭ、好ましくは２～２０ｍＭであり得る。また、本発明の逆転写反応用組成物に含まれ得るデオキシヌクレオチドの量もまた、本発明の効果を奏する限り限定されないが、例えば、０．２～２ｍＭ、好ましくは０．５～１ｍＭであり得る。更に、本発明の逆転写反応用組成物に含まれ得るＤＮＡポリメラーゼの量もまた本発明の効果を奏する限り限定されないが、例えば、０．０２～２Ｕ／μｌ、好ましくは０．１～０．５Ｕ／μｌであり得る。
【0032】
本発明の逆転写反応用組成物は、例えば、逆転写酵素の通常の保管温度である－２０℃から－８０℃よりも高い温度で一定期間保管されても（例えば、４℃より高い温度、又は１０℃以上、１５℃以上、２０℃以上、２５℃以上、３０℃以上、若しくは３５℃以上の温度で、３時間、６時間、１２時間、１日間、２日間、若しくは３日間保管されても）、逆転写酵素の失活が抑えられ、実用上十分なレベルで逆転写活性を発揮し得る。例えば、本発明のＭＰＣポリマーを含む逆転写反応用組成物は、ＭＰＣポリマーを含まない場合と比較して、３７℃で４日間保存後であっても逆転写活性の低下が抑えられ、好ましくは３７℃で７日間保存後であっても逆転写活性の低下が抑えられ、より好ましくは３７℃で１４日間保存後であっても逆転写活性の低下が抑えられ、更に好ましくは３７℃で３３日間保存後であっても逆転写活性の低下が抑えられ、更により好ましくは３７℃で３５日間保存後であっても逆転写活性の低下が抑えられた組成物であり得る。特に好ましい実施形態では、本発明の逆転写反応用組成物は、上記のような温度及び期間の条件で保存された場合に、例えば、調製直後の逆転写活性と比較して、５６％以上の残存活性率を示す組成物であり、好ましくは６０％以上の残存活性、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは７５％以上、更により好ましくは８０％以上の残存活性率を示す組成物であり得る。調製直後の逆転写活性と比較した場合の活性残存率は、後述の実施例に記載の方法と同様にして測定することができる。
【0033】
後述の試験例の結果に示されるように、ＭＰＣポリマーを共存させることにより、逆転写活性を有する酵素の安定性を向上させることができる。従って、本発明は更に別の観点から、逆転写活性を有する酵素をＭＰＣポリマーと共存させることにより、逆転写活性を有する酵素を安定化する方法をも提供する。とりわけ、逆転写活性を有する酵素が溶液中に存在する場合に安定性が低下し易い傾向があることが分かっているが、本発明によれば、このような場合であっても逆転写活性を有する酵素の失活を高度に抑えることができる。
【0034】
従って、好ましい実施形態において、前記方法は、逆転写活性を有する酵素を含有する溶液中においてＭＰＣポリマーを共存させることを特徴とする方法であり得る。
この実施態様において使用されるＭＰＣポリマーの種類や量、逆転写活性を有する酵素の種類や量、その他任意に含んでいてもよい多価アルコール、２価陽イオン、デオキシヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、界面活性剤などの種類や量等は、前記の逆転写反応用組成物において詳述したものと同様であり得る。
この実施態様において使用されるＭＰＣポリマーの種類や量、逆転写活性を有する酵素の種類や量、その他任意に含んでいてもよい多価アルコール、２価陽イオン、デオキシヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、界面活性剤などの種類や量等は、前記の逆転写反応用組成物において詳述したものと同様であり得る。
【0035】
以下、実施例をもって、本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【0036】
実施例１
ＭＰＣポリマーの作製
２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）３０．９６ｇ（０．１０５ｍｏｌに相当）、及びメタクリル酸（ＭＡｃ）９．０４ｇ（０．１０５ｍｏｌに相当）を純水１６０ｇに溶解し、温度計と冷却管を付けた５００ｍＬの４つ口フラスコに入れて３０分間窒素を吹き込んだ。その後、７０℃でスクシニックパーオキサイド種１．５６ｇ加えて７時間重合反応させた。反応終了後、透析膜精製し、無色透明のＭＰＣポリマー水溶液を得た。得られたＭＰＣポリマーは、カルボキシル基を有するメタクリル酸を構成モノマーとして含む共重合体に相当する。ここで調製したＭＰＣポリマーは重量平均分子量が約２００，０００～５００，０００であった。
ＭＰＣポリマーの作製
２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）３０．９６ｇ（０．１０５ｍｏｌに相当）、及びメタクリル酸（ＭＡｃ）９．０４ｇ（０．１０５ｍｏｌに相当）を純水１６０ｇに溶解し、温度計と冷却管を付けた５００ｍＬの４つ口フラスコに入れて３０分間窒素を吹き込んだ。その後、７０℃でスクシニックパーオキサイド種１．５６ｇ加えて７時間重合反応させた。反応終了後、透析膜精製し、無色透明のＭＰＣポリマー水溶液を得た。得られたＭＰＣポリマーは、カルボキシル基を有するメタクリル酸を構成モノマーとして含む共重合体に相当する。ここで調製したＭＰＣポリマーは重量平均分子量が約２００，０００～５００，０００であった。
【0037】
実施例２
逆転写酵素を含む組成物の安定化
以下のように組成物における逆転写酵素の安定性を評価した。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌの溶液に表１に示した濃度になるよう各種添加剤（実施例１で調製したＭＰＣポリマー、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ－ＢＬ４０５（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとアニオン性側鎖を有するビニルモノマーを構成単位として含むＭＰＣポリマー）、又は非イオン性界面活性剤である、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ、ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０、若しくはＴｗｅｅｎ－２０）を加え、酵素希釈液を調製した。それらの酵素希釈液で、ＭＭＬＶ由来の逆転写酵素であるＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ製）を５Ｕ／μＬとなるように希釈し、調製直後と３７℃で４日後の逆転写酵素活性を測定し、調製直後に対する３７℃４日後の活性残存率を求めた。
逆転写酵素を含む組成物の安定化
以下のように組成物における逆転写酵素の安定性を評価した。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌの溶液に表１に示した濃度になるよう各種添加剤（実施例１で調製したＭＰＣポリマー、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ－ＢＬ４０５（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとアニオン性側鎖を有するビニルモノマーを構成単位として含むＭＰＣポリマー）、又は非イオン性界面活性剤である、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ、ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０、若しくはＴｗｅｅｎ－２０）を加え、酵素希釈液を調製した。それらの酵素希釈液で、ＭＭＬＶ由来の逆転写酵素であるＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ製）を５Ｕ／μＬとなるように希釈し、調製直後と３７℃で４日後の逆転写酵素活性を測定し、調製直後に対する３７℃４日後の活性残存率を求めた。
【0038】
逆転写酵素活性の測定は以下のように実施した。酵素活性が強い場合には、緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１ｍＭ ＤＴＴ）でサンプルを希釈して測定を行った。
【0039】
［逆転写酵素活性測定法］
（１）下記のＡ液１０μｌ、Ｂ液１２μｌ、Ｃ液５μｌ、Ｄ液５μｌ、滅菌水１２μｌ、３Ｈ－ｄＴＴＰ１μｌ、及び酵素溶液５μｌをマイクロチューブに加えて、４２℃にて１０分間反応する。
（２）その後氷冷し、Ｅ液１５０μｌを加えて、攪拌後更に３分間氷冷する。
（３）この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ 塩酸およびエタノールで十分洗浄する。
（４）フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製Ｔｒｉ－Ｃａｒｂ２８１０ ＴＲ）で計測し、ｄＴＴＰの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件で１０分当りの１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを酸不溶性画分（即ち、Ｅ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込む酵素量とする。
（１）下記のＡ液１０μｌ、Ｂ液１２μｌ、Ｃ液５μｌ、Ｄ液５μｌ、滅菌水１２μｌ、３Ｈ－ｄＴＴＰ１μｌ、及び酵素溶液５μｌをマイクロチューブに加えて、４２℃にて１０分間反応する。
（２）その後氷冷し、Ｅ液１５０μｌを加えて、攪拌後更に３分間氷冷する。
（３）この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ 塩酸およびエタノールで十分洗浄する。
（４）フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製Ｔｒｉ－Ｃａｒｂ２８１０ ＴＲ）で計測し、ｄＴＴＰの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件で１０分当りの１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを酸不溶性画分（即ち、Ｅ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込む酵素量とする。
【0040】
（試薬）
Ａ液：２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ 塩化マグネシウム、５０ｍＭ ジチオスレイトール、３７５ｍＭ 塩化カリウム
Ｂ液：１ｍｇ／ｍｌ ＰｏｌｙＡ ＲＮＡ
Ｃ液：１ｐｍｏｌ／μｌ Ｏｌｉｇｏ ｄＴ２０
Ｄ液：１０ｍＭ ｄＴＴＰ
Ｅ液：６６ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、６６６ｍＭ 過塩素酸ナトリウム
Ａ液：２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ 塩化マグネシウム、５０ｍＭ ジチオスレイトール、３７５ｍＭ 塩化カリウム
Ｂ液：１ｍｇ／ｍｌ ＰｏｌｙＡ ＲＮＡ
Ｃ液：１ｐｍｏｌ／μｌ Ｏｌｉｇｏ ｄＴ２０
Ｄ液：１０ｍＭ ｄＴＴＰ
Ｅ液：６６ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、６６６ｍＭ 過塩素酸ナトリウム
【0041】
【表1】
【0042】
表１には酵素希釈に用いた酵素希釈液に含まれる添加剤濃度と各組成で３７℃４日保管後における活性の残存率を示す。添加剤なしの場合は、活性残存率が半分以下にまで落ちており、また、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０、ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０、Ｔｗｅｅｎ－２０などの界面活性剤だけを添加した場合には、活性残存率は僅かに改善するものの、まだ十分ではないことが分かる。一方、実施例１で調製したＭＰＣポリマー、また市販のＭＰＣポリマーであるＬＩＰＩＤＵＲＥ－ＢＬ４０５を添加した組成物では、活性残存率が改善しており、特に０．００２％以上のＭＰＣポリマーを添加することで約６０～８５％程度まで著しく活性残存率が改善することが認められた。この結果から、逆転写酵素を含む組成物にＭＰＣポリマーを添加することで安定性が向上することが示された。
【0043】
実施例３－１
ＲＴ－ＰＣＲマスターミックス試薬としての安定化（１）
各種添加剤を加えたＲＴ－ＰＣＲマスターミックスを調製し、３７℃で保存後の反応性を評価することで逆転写酵素の安定性を評価した。反応性はインフルエンザＲＮＡからの逆転写反応とそれに続くＰＣＲ反応で検出するＲＴ－ＰＣＲの系を用い、保存後のＲＴ－ＰＣＲマスターミックスを用いて得られたＣｔ値と用事調製したＲＴ－ＰＣＲマスターミックスのＣｔ値と比較することで評価した。
ＲＴ－ＰＣＲマスターミックス試薬としての安定化（１）
各種添加剤を加えたＲＴ－ＰＣＲマスターミックスを調製し、３７℃で保存後の反応性を評価することで逆転写酵素の安定性を評価した。反応性はインフルエンザＲＮＡからの逆転写反応とそれに続くＰＣＲ反応で検出するＲＴ－ＰＣＲの系を用い、保存後のＲＴ－ＰＣＲマスターミックスを用いて得られたＣｔ値と用事調製したＲＴ－ＰＣＲマスターミックスのＣｔ値と比較することで評価した。
【0044】
ＲＴ－ＰＣＲマスターミックスは、表２のように調製した。添加剤には実施例１で調製したＭＰＣポリマー、又は陰イオン性界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、コール酸ナトリウム、若しくはデオキシコール酸ナトリウム、両性イオン性界面活性剤であるＣＨＡＰＳをそれぞれ表３の濃度になるように加えた。逆転写活性を有する酵素としては、ＭＭＬＶ由来の逆転写酵素であるＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅを使用した。
【0045】
【表2】
【0046】
【表3】
【0047】
上記のようにして調製した各反応液を３７℃で７日間、又は３３日間保管した後、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ－ＰＣＲ反応の反応液は表４のように調製し、表５の反応サイクルでＲＴ－ＰＣＲを実施した。反応は、用事調製の添加剤を含まないＲＴ－ＰＣＲマスターミックスでも実施し、用事調製の添加剤を含まないＲＴ－ＰＣＲマスターミックス（保存前（０日目）の逆転写反応用組成物に相当）とのＣｔの差（ΔＣｔ）を表６にまとめた。増幅が見られなかったものには「増幅せず」と記載した。
【表4】
【表5】
【表6】
【0048】
上記結果に示されるように、添加剤なし（条件１）やドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ＣＨＡＰＳを含んだＲＴ－ＰＣＲマスターミックス（条件５～８）では、３７℃での長期保管によりΔＣｔが大きくなり、３７℃３３日後にはΔＣｔが１０程度大きくなっている。これは３７℃での長期保管により逆転写酵素が失活し、反応性が悪くなったためと考えられる。一方、ＭＰＣポリマーを含むＲＴ－ＰＣＲマスターミックス（条件２～４）は、３７℃３３日後にもΔＣｔが１～４程度に抑えられており、逆転写酵素の失活が高度に抑えられていることが示唆された。
【0049】
実施例３－２
ＲＴ－ＰＣＲマスターミックスとしての安定化（２）
実施例３－１と同様にして、各種添加剤を加えたＲＴ－ＰＣＲマスターミックス試薬を調製し、３７℃で保存後の反応性を評価することで逆転写酵素の安定性を評価した。
ＲＴ－ＰＣＲマスターミックスとしての安定化（２）
実施例３－１と同様にして、各種添加剤を加えたＲＴ－ＰＣＲマスターミックス試薬を調製し、３７℃で保存後の反応性を評価することで逆転写酵素の安定性を評価した。
【0050】
ＲＴ－ＰＣＲマスターミックスは、実施例３－１の表２と同じようにして調製した。添加剤には実施例１で調製したＭＰＣポリマー、市販されているＭＰＣポリマーであるＬＩＰＩＤＵＲＥシリーズをそれぞれ０．３５６％になるように加えた。
【0051】
上記のようにして調製した各反応液を３７℃で１４日間保管した後、上記実施例３－１と同様にしてＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。具体的には、反応液を上記実施例３－１の表４のように調製し、同じく実施例３－１の表５の反応サイクルでＲＴ－ＰＣＲを実施した。反応は、用事調製で添加剤を含まないＲＴ－ＰＣＲマスターミックスでも実施し、用事調製の添加剤を含まないＲＴ－ＰＣＲマスターミックス（保存前（０日目）の逆転写反応用組成物に相当）とのＣｔの差（ΔＣｔ）を表７にまとめた。
【0052】
【表7】
【0053】
上記結果に示されるように、ＭＰＣポリマーを添加したＲＴ－ＰＣＲマスターミックス試薬では３７℃１４日後でも、添加剤なしの場合に比べてΔＣｔが明らかに小さく、逆転写酵素の安定性が改善している結果となった。特に、実施例１で調製したアニオン性官能基を有するモノマーを含むＭＰＣポリマー、及びＬＩＰＩＤＵＲＥ－ＢＬ４０１，４０２，４０５，４０６，４０７，４０８は、ΔＣｔが小さく、高い安定化効果が確認された。ＬＩＰＩＤＵＲＥ－ＢＬ２００シリーズ（ＢＬ２０６Ｆ、ＢＬ２０３）は親水性の側鎖を有するモノマーを構成単位に含むＭＰＣポリマー、ＢＬ４００シリーズ（ＢＬ４０１、ＢＬ４０２、ＢＬ４０５、ＢＬ４０６、ＢＬ４０７、ＢＬ４０８）はアニオン性の側鎖を有するモノマーを構成単位に含むＭＰＣポリマー、ＢＬ８００シリーズ（ＢＬ８０２、ＢＬ８０３）は親水・疎水性の側鎖を有するモノマーを構成単位に含むＭＰＣポリマーとして知られている。この結果から、ＭＰＣポリマーの中でも特に、アニオン性の官能基を有するモノマーを構成単位に含むＭＰＣポリマーが、とりわけ逆転写酵素の安定化効果が高いことが示された。
【0054】
実施例３－３
ＲＴ－ＰＣＲマスターミックスでの安定化（３）
実施例３－１と同様にして、各種添加剤を加えたＲＴ－ＰＣＲマスターミックス試薬を調製し、３７℃で保存後の反応性を評価することで逆転写酵素の安定性を評価した。
ＲＴ－ＰＣＲマスターミックスでの安定化（３）
実施例３－１と同様にして、各種添加剤を加えたＲＴ－ＰＣＲマスターミックス試薬を調製し、３７℃で保存後の反応性を評価することで逆転写酵素の安定性を評価した。
【0055】
ＲＴ－ＰＣＲマスターミックスは、表８のように調製した。添加剤としては、実施例１で調製したＭＰＣポリマーを０．３５６％になるように加えたもの、又は加えていないものを調製した。
【0056】
【表8】
【0057】
上記のようにして調製した各反応液を３７℃で３５日間保管した後、上記実施例３－１と同様にしてＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。具体的には、反応液は上記実施例３－１の表４のように調製し、同じく実施例３－１の表５の反応サイクルでＲＴ－ＰＣＲを実施した。反応は、用事調製の添加剤を含まないＲＴ－ＰＣＲマスターミックスでも実施し、この用事調製の添加剤を含まないＲＴ－ＰＣＲマスターミックス（保存前（０日目）の逆転写反応用組成物に相当）とのＣｔの差（ΔＣｔ）を表９にまとめた。増幅が見られなかったものには「増幅せず」と記載した。
【0058】
【表9】
【0059】
上記結果に示されるように、ＭＰＣポリマーを含む組成物では、３７℃で３５日間保存後も高い安定性効果が確認でき、逆転写活性酵素の失活が高度に抑制されていることが示された。ＭＰＣポリマーと組み合わせて用いる多価アルコールは、ソルビトール、トレハロース、又はスクロースのどれを用いても、大きな差は見られなかった。
以上の結果から、逆転写活性を有する酵素と共に、ＭＰＣポリマー、なかでもアニオン性官能基を有するモノマーを含むＭＰＣポリマーを共存させることにより、マスターミックス試薬として長期保存された場合でも高い安定性が得られることが明らかとなった。
以上の結果から、逆転写活性を有する酵素と共に、ＭＰＣポリマー、なかでもアニオン性官能基を有するモノマーを含むＭＰＣポリマーを共存させることにより、マスターミックス試薬として長期保存された場合でも高い安定性が得られることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【0060】
本発明は逆転写活性を有する酵素の安定性を向上させ、長期に安定な逆転写反応用組成物を提供する。安定性が向上した本発明の逆転写反応用組成物を使用することで、例えば、－２０から－８０℃よりも高い温度で一定期間保存されたとしても、逆転写酵素の活性低下を抑えることができ、逆転写反応を行う実験や試験の再現性を高めることができる。また逆転写反応に用いる試薬の再購入・再調製の頻度を抑えることで、低コストで実験、試験を実施することができる。本発明は、ＲＮＡを用いた遺伝子発現解析に際して特に有用であり、研究用途のみならず臨床診断や環境検査等にも利用できる。
【配列表】